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08 Espectrofotometria PDF
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RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
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de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman
un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
400 nm 700 nm
Luz visible
Longitud de onda (metros)
Frecuencia (hertz)
energía (electrón-voltios)
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La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400
nm. Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como
quemadura común. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples
enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros
heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta
es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de
compuestos orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal y el
disolvente- que alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos
de los espectros UV.
La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio.
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La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a
través de la solución del cromóforo y de la concentración de éste.
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Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de
luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay
espectrofotómetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta
con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro
caso se trabajará con los de un solo haz.
Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al
que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la
intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia
es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la
absorbancia de ésta.
ESPECTROFOTīMETRO
OH
Detector
NO 2
p-Nitrofenol Muestra
Rendija salida
Prisma dispersión
Rendija entrada
Fuente luminosa
ON/OFF
Ajuste 0% T
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Clorofila a
Absorción de los
Clorofila b
del cloroplasto
Espectros de absorción de
pigmentos
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Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones
de diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de
ellas el valor de absorbancia a λmax. Estos valores de absorbancia se
representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentración en el eje de
ordenadas (eje de y). Se observará que, a bajas concentraciones, el aumento de
concentración se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona
de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la
linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las medidas
son poco fiables.
1.6. Objetivos
Espectos de absorción
Ley de Lambert-Beer
Espectrofotómetro.
Agitador de tubos de ensayo.
Balanza.
pHmetro.
Tijeras
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Frasco lavador con agua destilada.
Recipientes para muestras biológicas de 50 ml.
Papel de filtro.
Papel de parafilm.
Rotulador para vidrio.
Pipetas Pasteur de plástico (cuatro).
Guantes de latex.
Cubetas de plástico para medir en el espectrofotómetro.
2.3. Reactivos
Espectos de absorción
Glucosa
Glucosa oxidasa
Peroxidasa
Fenol
4 amino-antipirina
Tampón fosfato
Nitrito potásico
Sulfanilamida
Dicloruro de N-naftol-1-etilendiamino
Ácido clorhídrico