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Propuesta para extracción de colágeno soluble en ácido (CSA) de escamas de

tilapia del Nilo

Article · September 2017

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Carlos A Ramirez Angel Andrade

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Coloquio de Investigación Multidisciplinaria 2017 ISSN 2007-8102

Propuesta para extracción de colágeno soluble en ácido (CSA)

de escamas de tilapia del Nilo
A. C. Rodríguez Aranda1, R. López Villaseñor1, C. A. Ramírez Barragán2 y J. A. Andrade Ortega2*
1Licenciaturaen Biología, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de
Guadalajara, Autopista Guadalajara-Nogales Km. 15.5, Predio “Las agujas” Nextipac, C.P. 45110, Zapopan,
Jalisco, México.
2Centro de Investigación en Biomateriales, Departamento de Madera, Celulosa y Papel, CUCEI, Universidad de

Guadalajara, Autopista Guadalajara-Nogales KM 15.5, Predio “Las agujas” Nextipac, C.P. 45110, Zapopan,
Jalisco, México.
*aandrade@dmcyp.cucei.udg.mx
Área de participación: Ingeniería Química

Resumen
A la fecha existen varios métodos reportados en la literatura para la extracción de colágeno soluble en ácido
(CSA) a partir de las escamas de pescados. En el presente trabajo se comparan 3 metodologías para la
extracción de CSA de escamas de tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus): dos citados por la literatura
consultada (M1 y M2) y una propuesta (M3). Para la determinación del contenido de colágeno extraído se utilizó
el método propuesto por Woessner [1961], el cual se realiza por la cuantificación de hidroxiprolina (OH-Prol),
mediante espectroscopía UV-Vis a 557 nm. Los resultados destacan el método propuesto (M3) por ser del que
se obtiene la mayor cantidad de CSA (20.4%) sobre los otros dos probados (4.3 y 7.8% para M1 y M2
respectivamente).

Palabras clave: Colágeno, hidroxiprolina, escamas, tilapia.

Abstract

Today there are several methods reported in the literature for extracting acid soluble collagen (CSA) from fish
scales. In the present work, three methodologies for the extraction of CSA from Nile tilapia (Oreochromis
niloticus) scales were compared: two cited by the literature (M1 and M2) and one method proposed (M3). To
determine the CSA content was used the method proposed by Woessner [1961], based in the quantification of
hydroxyproline (OH-Prol) by UV-Vis spectroscopy at 557 nm. The results indicate that the proposed method
(M3) is the one with the highest amount of CSA (20.4%) extracted over the other two tested (4.3 and 7.8% for
M1 and M2 respectively).

Key words: Collagen, hydroxyproline, scale, tilapia.

Introducción
El desarrollo de nuevos materiales de origen natural es actualmente una de las áreas de investigación de gran
auge, lo que ha derivado en la búsqueda de diversas fuentes para su obtención. Debido a su bajo costo y a su
alta disponibilidad una de las opciones para obtener estos biomateriales es a partir de subproductos o desechos
orgánicos que tradicionalmente se descartan. Además de la abundancia y el bajo costo que representa usar
materiales de descarte, estos subproductos se eligen por sus características físicas, químicas o biológicas.

Una de las fuentes de alimentación del ser humano más importante es la de origen marino, que adicionalmente
produce una enorme cantidad de residuos, como por ejemplo la cascara de camarón, las conchas de
crustáceos y las escamas de pescado [Huang y col., 2011; Pati y col., 2010].

pp. 1059 - 1066; Ingeniería Química 1059

rec. 13/ago/2017, acc. 22/sep/2017
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Dentro de la gran variedad de sustancias químicas y materiales biológicos que se pueden obtener de desechos
de origen marino se encuentra una con gran demanda comercial: el colágeno; el cual tiene muchas
aplicaciones: en la industria biomédica, de los cosméticos, de nutracéuticos y con fines clínicos [Delgado, 2013;
Ghaly y col., 2013; Hofman y col., 2011; Villanueva y col., 2001; Huanca y col., 2014; Kumar y col., 2011].

El colágeno es el mayor componente del tejido animal, forma parte de la familia de las proteínas fibrosas, su
principal función es la de soporte estructural y celular. La molécula de colágeno (Figura 1) está constituida por
WUHV FDGHQDV SROLSHSWtGLFDV GHQRPLQDGDV FDGHQDV Į GRV FDGHQDV Į LGpQWLFDV GHVLJQDGDV FRPR Į, \ XQD
FDGHQDĮ GLIHUHQWHĮ,TXHVHHQUROOan sobre sí mismas formando una supercadena de una longitud de 300
nm, un diámetro de 1.5 nm y un peso molecular de 300 kDa [Gómez-Lizárraga y col., 2011]. La anterior
secuencia está compuesta por unidades repetitivas de tres aminoácidos, esta unidad repetitiva es Gly-X-Y, en
donde la posición X está ocupada por el aminoácido prolina y en la posición Y generalmente se encuentra el
aminoácido hidroxiprolina. La hidroxiprolina constituye aproximadamente entre el 10 y 14 % de la composición
del colágeno y se encuentra exclusivamente en este tipo de proteínas (colágenas) [Dull y Henneman, 1963;
Platt y col.,1964]. Por lo anterior, es posible cuantificar la concentración de colágeno a partir de la determinación
de hidroxiprolina [Colgrave y col., 2008].

Figura 1. Estructuras de colágeno, tomadas y modificadas de Lehninger & Nelson, (1995)

y Gatta, Badea, & Saczuk, (2010).

La hidroxiprolina (OH-Prol) cuya estructura química se muestra en la figura 2, puede ser cuantificada por varios
métodos, como por ejemplo, cromatografía de columna. Sin embargo, el método más utilizado es un ensayo
colorimétrico basado en la reacción de hidroxiprolina oxidada con p-dimetilaminobenzaldehído (reactivo de
Ehrlich) [Hofman y col., 2011] /D XQLGDG UHSHWLWLYD TXH FRQIRUPD ODV FDGHQDV Į SRVHHQ XQ DPLQRiFLGR GH
hidroxiprolina que se repite “n” veces a lo largo de las cadenas, es a partir de este razonamiento que se hace
uso de un factor de conversión (7.46), para calcular la concentración del colágeno [Gómez-Lizárraga y col.,
2011].

Figura 2. Estructura de hidroxiprolina.

Las escamas de pescado han sido motivo de innumerables estudios desde finales del siglo XIX hasta la
actualidad con diferentes objetivos. Están compuestas por fibras de colágeno, principalmente colágeno tipo I,

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cuya composición varía de acuerdo al pez del cual proviene y por hidroxiapatita, el principal componente
mineral de los huesos de los vertebrados y razón por la cual una de sus principales aplicaciones está en el
campo de los biomateriales, como reparador de tejidos duros y en la fabricación de implantes [Delgadillo, 2013;
Zhang y col., 2011].

Potaros y col. [2009] mencionan que hay tres métodos principales de extracción de colágeno con los cuales se
obtiene: colágeno solubilizado en sal neutro, colágeno solubilizado en ácido y colágeno solubilizado en pepsina.
Debido a ello, es más propio hablar de colágenos. En este trabajo se propone y prueba una metodología para
obtener la mayor cantidad de colágeno soluble en ácido (CSA) de escamas de tilapia del Nilo (Oreochromis
niloticus), la cual se comparó contra dos métodos propuestos en la literatura: Pati y col. [2010] y Duan y col.
[2009]. La cantidad de CSA fue evaluada mediante la cuantificación de hidroxiprolina por el método de
Woessner [1961], con algunas modificaciones.

Materiales y Métodos
Materiales
Se emplearon los siguientes reactivos químicos: Ácido clorhídrico, J. T. Baker®. Fenol, Almek®, ácido cítrico
marca Sigma®, EDTA 2Na marca Fisher®, Tris Base marca Sigma®, ácido clorhídrico marca Analytyka®,
cloramina T marca Sigma-Aldrich®, hidroxiprolina (tras-4-hydroxy-l-proline) marca Aldrich®, 4-(Dimetilamino)-
benzaldehído marca Aldrich®, acido perclórico, propanol marca Merck®, 2-Etoxietanol marca Química Vager®,
ácido perclórico marca Merck®. Material y equipo de laboratorio convencional; Espectrofotómetro UV-Vis Marca
Ocean Optics USB4000.

Métodos

La figura 3 muestra de manera esquemática los métodos utilizados para la obtención de CSA.

Obtención de colágenos de escamas de tilapia

El método (M1) propuesto por Pati y col. [2010] con algunas modificaciones, consistió en: Desproteinización: se
eliminan las proteínas no constitutivas de colágeno y otros residuos superficiales, usando una solución ajustada
a pH 7.5 de NaCl 1.0M, Tris-HCl 0.05M, EDTA 20mM en agitación mecánica por 48 horas. Decationización:
para remover compuestos minerales, las escamas se trataron con una solución de EDTA 0.44M (pH 7.5),
durante 48 horas, en agitación magnética constante y manteniendo una temperatura por debajo de 15 ºC.
Extracción y recuperación de colágeno: las escamas recuperadas de la etapa anterior, se trataron con una
solución de ácido acético 0.5M por 72 horas, en agitación mecánica, a una temperatura por debajo de los 15 ºC.
Después, se separó el licor del material sólido (escamas), la fracción líquida contiene el colágeno soluble en
ácido. Finalmente se hizo un cambio de pH con NaOH 1M, llevándolo de ácido a neutro para precipitar el
colágeno, se centrifugó, liofilizó y se secó en estufa de vacío a 40 ºC por 24 horas.

El método (M2) propuesto por Duan y col. [2009] se realizó con ligeras modificaciones. Desproteinización: para
eliminar las proteínas no constitutivas de colágeno y otros residuos superficiales se usó una solución de NaOH
0.1M por 6 horas. Decationización: las escamas provenientes de la etapa anterior se trataron con una solución
de EDTA 0.44M (pH 7.5), durante 24 horas, en agitación magnética y a una temperatura por debajo de 15 ºC.
Extracción y recuperación de colágeno: las escamas provenientes de la etapa anterior se trataron con una
solución de ácido acético 0.5M por 96 horas, en agitación mecánica, a una temperatura por debajo de 15 ºC.
Después, se separó el licor del material sólido (escamas), la fracción líquida contiene el colágeno soluble en
ácido. Finalmente se hizo un cambio de pH con NaOH 1M, llevándolo de ácido a neutro para precipitar el
colágeno, se centrifugó, liofilizó y se secó en estufa de vacío a 40 ºC por 24 horas.

El método (M3) está basado en el propuesto por Duan y col.[2009], con varias modificaciones: Se invirtió el
orden de los procesos, como primer paso se realizó la decationización (mismas condiciones descritas para M2),
posteriormente la desproteinización fue por un tiempo de 3 horas, y para la extracción ácida de colágeno se
sustituyó el ácido acético por ácido cítrico; después de las primeras 24 horas en agitación, se retiró el
sobrenadante que contenía hidroxiapatita, se continuó con el tratamiento ácido durante 48 horas más, para
obtener el colágeno, mediante el mismo procedimiento descrito para M2.

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Figura 3. Esquema general de los métodos empleados para la obtención de los diferentes CSA.

Determinación de hidroxiprolina

Las muestras de colágeno fueron hidrolizadas en HCl 6N en ampolletas selladas, luego se ajustó el pH de la
solución entre 6 y 7 con NaOH 1N y HCl 0.1N. De la solución anterior se tomaron 0.2 mL y se colocaron en un
tubo de ensayo, se agregó 1 mL de solución oxidante 0.05 M (cloramina T, 2-metoxietanol, amortiguador de
citratos), ácido perclórico 3.15 N para eliminar la cloramina T, se mezcló durante 5 minutos y finalmente se
agregó una solución de p-dimetilaminobenzaldehído al 20%. La solución anterior se mezcló y se calentó a 60°C
durante 20 minutos en un baño maría; después de lo cual se enfrió bajo chorro de agua por 5 min. Enseguida
se midió la absorbancia de las soluciones a una longitud de onda 557nm en un espectrofotómetro Ocean Optics
USB4000. La curva de calibración se realizó usando cantidades conocidas de un estándar de hidroxiprolina
para formar soluciones de 0 a 20 μg/mL

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Determinación de contenido de colágeno soluble en ácido (CSA)

Para la cuantificación del contenido de CSA se siguió el método descrito en la Norma Técnica Colombiana NTC
3750, (ICONTEC 1995) [Serrano Gaona, 2011] donde el contenido de colágeno en la muestra es igual al
contenido de hidroxiprolina multiplicado por 7.46.

Resultados y discusión
Los métodos de extracción utilizados en este trabajo, fueron aquellos en los que se habían reportado para
obtener colágeno soluble en ácido, a partir de escamas de pescado; que a diferencia de la extracción en pieles,
incluye una etapa importante en el proceso de extracción: la desmineralización, ya que de ella depende la
disponibilidad en mayor o menor medida de la proteína para su extracción.

Curva de calibración para determinación de hidroxiprolina

Los valores de absorbancia de las soluciones estándar de hidroxiprolina leídas a 557 nm aparecen en la tabla 1;
con estos valores se construyó la gráfica que se muestra en la figura 4.

Tabla 1. Concentraciones de la curva de calibración hidroxiprolina.

Concentración Absorbancia
(ppm) (u.a.)
0 0.0000
1 0.0846
3 0.2235
5 0.3560

Figura 4. Curva de calibración utilizada para calcular la concentración

de hidroxiprolina en muestras de colágeno.

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Determinación de contenido de hidroxiprolina

Se determinó la cantidad de hidroxiprolina a partir de las mediciones de la absorbancia de las muestras y su

lectura en la curva de calibración (Figura 4). Se obtuvo la ecuación linealizada (Eq. 1) con un valor de
R2=0.9897, el cual se consideró como adecuado. Una vez obtenidos los valores de absorbancia de las muestras
digeridas, se calculó el contenido de proteína en las escamas mediante el despeje de la Ecuación 1, para
generar la Ecuación 2.

y = 0.1207x - 0.1357 [1]

x = (y + 0.1357) / 0.1207 [2]

Donde:
y es el valor de absorbancia de cada muestra.
x es el contenido de hidroxiprolina en (μg/ml).

Determinación de contenido de colágeno soluble en ácido (CSA)

Los resultados de la cuantificación del contenido de CSA se presentan en la tabla 2. Los valores se calcularon
multiplicando por 7,46 las concentraciones de hidroxiprolina [Serrano Gaona, 2011]

Tabla 2. Cuantificación del contenido de Hidroxiprolina en muestras de colágeno de escamas de tilapia

del Nilo.

Absorbancia, Concentración de Contenido de Desviación Coeficiente de

Muestra
u.a. hidroxiprolinaȝJP/ colágeno, % estándar variación, %
M1a 0.059 1.6131

M1b 0.056 1.5882 11.9 ±0.0209 ±1.3

M1c 0.054 1.5717

M2a 0.085 1.8285

M2b 0.086 1.8368 13.7 ±0.0083 ±0.5

M2c 0.087 1.8451

M3a 0.205 2.8227
M3b 0.186 2.6653 20.3 ±.0.0934 ±3.4

M3c 0.185 2.6570

Los resultados muestran que la metodología propuesta M3, es capaz de extraer la mayor cantidad de CSA con
20.3%, lo cual, supera por mucho a las otras dos metodologías reportadas en la literatura y que fueron
realizadas en este trabajo con fines comparativos (M1, con 11.9% y M2 con 13.7% de CSA). La magnitud en la
diferencia de las concentraciones obtenidas es de 50% más con respecto a M2 y hasta 70% más que para M1.

Considerando que en la eliminación de la proteína superficial de la escama de pescado se emplean NaOH 1N

en todos los procedimientos, se aprecia una relación entre el tiempo de la desproteinización y la cantidad de
CSA obtenido, es decir, a mayor tiempo menor cantidad de CSA obtenido.

En el caso de la M3, el que se diera inicio con un proceso de desmineralización empleando una solución de
EDTA a la mitad de las concentraciones empleadas en M1 y M2, pudo contribuir a minar el entramado de
metaloproteinas de la escama de pescado y nos permitiera obtener una mayor cantidad de CSA. La
modificación en la concentración en la solución decationizadora en el método propuesto se debió a datos

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observados en los trabajos de Wang y Regenstein [2009], sobre el efecto de HCl, ácido cítrico y pretratamiento
con EDTA en la extracción de gelatina en escamas de carpa, siendo la concentración de 0.2 M con EDTA-2Na,
mostraba mejores resultados en remoción de compuestos minerales como el calcio y presentaba mejores
rendimientos en recuperación de gelatina y resistencia en los geles analizados.

Sin embargo, esto difícilmente pudo afectar la región de telopéptido (zona de unión entre cadenas de colágeno
mediante enlaces covalentes de aldehído con lisina e hidroxilisina [Quintero y zapata, 2017]) como para
alcanzar las concentraciones de CSA reportadas para M3; incluso con una etapa adicional de desmineralización
con ácido cítrico (que retira la hidroxiapatita). De igual manera, no encontramos una relación que nos permita
diferenciar entre usar ácido acético y cítrico como para justificar los valores obtenidos.

De tal manera que el efecto observado puede ser el resultado de la sinergia entre el orden de las etapas y la
característica de cada una de ellas, dado, que esa es la única diferencia entre procesos. Aunado a esto, es
importante tomar en cuenta que las principales fuentes de extracción de colágeno a partir de pescados,
tradicionalmente han sido de pieles y huesos; por lo que los estudios con las escamas son relativamente más
recientes y están enfocados en la extracción de colágeno, principalmente con enzimas como la pepsina y
utilizan métodos diferentes para el análisis de la proteína [Kumar y col., 2011]. Es quizás, debido a ello, que la
información sobre la cantidad de CSA a partir de escamas, y sobre todo, de escamas de tilapia del Nilo
(Oreochromis niloticus) aún es limitada [Ikoma y col., 2003; Huanca y col., 2014; Acosta y col., 2015].

Los resultados de este trabajo, representan una importante contribución para el grupo de peces Oreochromis,
uno de los más importantes en la acuicultura en nuestro país, lo que significa un mayor aprovechamiento de
recursos generalmente considerados de descarte y que se sabe, son ricos en proteínas y minerales

Trabajo a futuro
Llevar a cabo análisis electroforéticos de las muestras de colágenos obtenidos de las diferentes metodologías,
complementando la caracterización de este material que pueda apoyar en describir la calidad de la proteína
obtenida.

Conclusiones
Los resultados revelan que las metodologías empleadas M1, M2 y M3 permiten la obtención de CSA en las
siguientes cantidades: 11.9 %, 13.7 % y 20.3% de colágeno respectivamente. A partir de las escamas de tilapia
del Nilo. La metodología propuesta por nuestro grupo de trabajo (M3) es la que reporta la mayor cantidad de
CSA extraído (20.3%).

La metodología propuesta M3, parece deber su eficiencia básicamente a la sinergia entre el orden de las etapas
y la característica de cada una de ellas, dado, que esa es la única diferencia entre procesos.

Lo anterior sugiere la posibilidad de aprovechar de manera más optimizada las escamas de pescado, residuos
generalmente considerados basura, como fuente de CSA e impulsar el desarrollo de nuevos biomateriales a
partir de colágeno como: compositos, membranas y andamios celulares por mencionar, algunos ejemplos; y de
paso combatir la problemática de manejo de residuos que generalmente terminan en vertederos como fuentes
de infección y malos olores

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