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Extracción y caracterización de ficobiliproteínas de Arthrospira (Spirulina)

maxima por UV-Vis y HPLC

Article · October 2019

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Van Dan Castro-Gerónimo Enrique Méndez-Bolaina

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Rosa V García Rodríguez

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Extracción y caracterización de ficobiliproteínas de Arthrospira

(Spirulina) maxima por UV-Vis y HPLC
Castro Gerónimo Van Dan1,4, Méndez Bolaina Enrique1,2,
Chamorro Cevallos Germán Alberto3 y García Rodríguez Rosa Virginia1,4

Resumen— Introducción. La C-Ficocianina (C-PC) es una ficobiliproteína presente en Spirulina maxima, consiste en
dos subunidades homólogas α y β, que inhiben la lipoperoxidación microsomal interaccionando con radicales peroxílicos.
Objetivos. Realizar la extracción y caracterización de ficobiliproteínas de Spirulina maxima mediante espectrofotometría
UV-Vis y HPLC. Metodología. Spirulina maxima se sometió a ultracongelación, descongelación y ultracentrifugación,
posteriormente se realizaron lecturas en espectrofotómetro. La muestra se liofilizó y se corroboró la presencia de C-PC
mediante HPLC. Resultados. Se obtuvo un rendimiento del 23.55% y un contenido de C-PC de 0.1567 mg/mL. Se
observaron en espectro de HPLC dos picos de las subunidades α y β a 4.2 min y 4.4 min correspondientes a C-PC.
Conclusión. Se realizó la extracción de ficobiliproteínas de Spirulina maxima mediante ciclos de ultracongelación (-196°C),
descongelación (30°C) y ultracentrifugación (10,000 RPM). Se identificó la C-PC mediante Uv-Vis a 620 y 650 nm,
obteniendo los cromatogramas de ficocianobilina por HPLC.

Palabras clave—Ficobiliproteínas, Spirulina maxima, extracción, lipoperoxidación.

Introducción
La Arthrospira (Spirulina) maxima es una cianobacteria utilizada como suplemento alimenticio por su alto
contenido de nutrientes (Ferreira, 2011). El término Spirulina ha sido utilizado para referirse indistintamente a dos
géneros, Arthrospira y Spirulina, así como a dos especies de cianobacterias, S. platensis y S. máxima, como producto
de los análisis que se han hecho sobre la composición bioquímica de Arthrospira, se ha determinado que contiene
proteínas, vitaminas, ácidos grasos, minerales, carbohidratos, ácidos nucleicos y pigmentos (Ramírez, 2006).
En años recientes, la Spirulina ha atraído la atención como una fuente potencial de compuestos con actividad
farmacológica. Se han desarrollado estudios que prueban sus efectos biológicos ensayados en modelos animales y
humanos, entre los cuales se incluyen la actividad antioxidante, prevención de anemia ferropénica, inhibición de la
infección por Herpes Zoster, disminución en la replicación del VIH, producción incrementada de anticuerpos, efectos
antiinflamatorios, prevención de la proliferación de células neoplásicas y propiedades hipoglicémicas,
hipoglucemiantes, antihipertensivas, mejora en la desnutrición, antihiperlipémico y disminución de la toxicidad por
metales pesados (Hoseini et al., 2013; Kulshreshtha et al., 2008; Lee et al., 1998).
Diversos estudios se han enfocado en el potencial antioxidante de la Spirulina. Se ha encontrado que induce
la actividad de enzimas antioxidantes, ayudando a prevenir la peroxidación lipídica y el daño al ácido
desoxirribonucleico (DNA por sus siglas en inglés), atrapando las especies radicalarias libres. Estas propiedades han
sido atribuidas a las ficobiliproteínas, las cuales se dividen en tres grupos: ficoeritrina (PE), C-Ficocianina (C-PC) y
aloficocianina (APC). Las ficobiliproteínas son macromoléculas componentes del aparato fotosintético de las
cianobacterias y consisten de proteínas unidas covalentemente a las ficobilinas. (Chamorro et al., 2002, Ramírez,
2006). Estas proteínas son solubles en agua, tienen un color brillante y son altamente fluorescentes. Además, exhiben
características cualitativas y cuantitativas únicas en su tipo, incluyendo un amplio espectro de absorción de luz visible
y un alto coeficiente de absorción (Chattopadhyay et al., 2012). La C-PC es un pigmento encontrado en cianobacterias
y algas eucariotas como Rhodophyta y Cryptomonadas, así como en Arthrospira, su función principal es colectar luz
eficientemente cuando la clorofila absorbe y transfiere pobremente los quantum de fotones y transferir la energía
fotónica a la clorofila en la membrana tilacoidal (Liron et al., 2014, MacColl, 2004).
La C-PC consiste en dos subunidades homólogas, que son dos cadenas α y β de tipo globina que se encuentran
enlazadas covalentemente por un enlace tioéter (Figura 1).

1
Centro de Investigaciones Biomédicas-Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Veracruzana, Veracruz, CP. 91190,
México.
2
Maestría en Ciencias en Procesos Biológicos-Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Veracruzana, Prolongación de
Oriente 6 #1009, Col. Rafael Alvarado, CP. 94340, Orizaba, Veracruz, México.
3
Laboratorio de la Reproducción y la Fertilidad. Instituto Politécnico Nacional. Av. Luis Enrique Erro S/N, Unidad
Profesional Adolfo López Mateos, Zacatenco, Alcaldía Gustavo A. Madero, CP. 07738, Ciudad de México, México.
4
Unidad de Servicios de Apoyo en Resolución Analítica, Universidad Veracruzana, Veracruz, CP. 91190, México.

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Figura 1. Estructura de la C-PC. (A) Estructura cristalina de la C-PC de la cianobacteria Spirulina platensis
en su forma de hexámero. (B) Representación esquemática del ensamblaje de la C-PC, la cual está compuesta por
dos subunidades proteínicas (cadenas α y β). Una molécula de ficocianobilina está enlazada a la subunidad α y 2
moléculas de ficocianobilina están enlazadas a la subunidad β. (C) Estructura química de la ficocianobilina, grupo
cromógeno de la C-PC. Imagen tomada de PDB ID 1GHo (2011).

Estas cadenas forman agregados que se ensamblan como trímeros (α 3 β3) o hexámeros (α6 β6), la última es la
forma funcional de la C-PC y usualmente forma bloques dentro del complejo denominado proteína antena (Padyana
et al., 2001; Scheer et al., 2008). Estos grupos cromóforos inhiben la peroxidación lipídica microsomal como
consecuencia de su interacción con los radicales peroxílicos (Romay et al., 2001). La ficocianobilina es el pigmento
tetrapirrólico que constituye el grupo prostético de la C-PC y la APC, esta corresponde a la de un sistema conjugado
por cuatro anillos pirrólicos, denotadas por las letras A-D. Para esta estructura pueden existir dos estereoisómeros (Z
y E) en la posición 3 (Llopiz et al., 2016) (Figura 2, PubChem CID 6438349).

Figura 2. Estructura de la ficocianobilina, el grupo prostético de las ficobiliproteínas C-PC y APC. El

sistema tetrapirrólico está conformado por cuatro anillos (A, B, C y D) que dan lugar a un compuesto con
insaturaciones conjugadas (Tomado de Llopiz et al., 2016).

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En un principio se creía que la C-PC no era fotosensible (Abeliovich et al., 1972); sin embargo, las evidencias
indican que es sensible a la luz y debe mantenerse en oscuridad (Wang et al., 2014). Así mismo, debe extraerse entre
4 y 5°C debido a que es termosensible y su pureza disminuye con el paso del tiempo (Gantar et al., 2012).
La concentración de C-PC en extractos crudos se cuantifica mediante la siguiente ecuación:

‫ܣ‬͸ʹͲ݊݉ െ ͲǤͶ͹Ͷሺ‫ܣ‬͸ͷͲ݊݉ሻ
ሾ‫ ܥ‬െ ܲ‫ܥ‬ሿ ൌ
ͷǤ͵Ͷ

La C-PC, principal biliproteína de las cianobacterias verde-azules, posee múltiples propiedades

farmacológicas. Su proceso de purificación puede estar influido por factores relacionados con el crecimiento de la
cianobacteria, tales como, la intensidad luminosa y la agitación, la forma de suministrar los nutrientes y su
concentración, el pH y la temperatura (Jespersen et al., 2004;.Marín-Prida J et al., 2015).
Las ficobiliproteínas son moléculas coloridas, por lo que sus máximos de absorción se encuentran en la región
visible del espectro. El proceso de extracción y purificación de la C-PC es monitoreado por las absorbancias a 620 y
650 nm. Dichas absorbancias son las longitudes de onda a las cuales se encuentran los máximos de absorbancia para
la C-PC y la aloficocianina, respectivamente. La relación de absorbancia entre estas longitudes indica el factor de
separación y es una medida entre la cantidad de C-PC y aloficocianina (Rito-Palomares et al., 2001).

Descripción del Método

Extracción de ficobiliproteínas de Arthrospira (Spirulina) maxima
Se obtuvo una muestra de Arthrospira (Spirulina) maxima de la marca comercial Spiral Springs©
presentación polvo fino liofilizado y se tomó una alícuota de 5 g. la cual se resuspendió en solución PBS 25 mM con
agitación mecánica por 2 minutos. Posteriormente se llevó a congelación con nitrógeno líquido (-196°C) por 2 h y
transcurrido ese lapso se sometió a descongelación en baño María (30°C) por 30 minutos para asegurar la ruptura
celular. Las muestras se mantuvieron con protección fotónica para evitar la desnaturalización de las ficobiliproteínas.
Posterior a la descongelación, se centrifugó a 10,000 RPM en ultracentrífuga refrigerada (4°C) (Hermle Labortechnik)
en tubos de 1.5 ml con protección fotónica por 30 minutos, se recuperó el sobrenadante azul indicador de
ficobiliproteínas y dicha colecta se sometió nuevamente al ciclo de centrifugación arriba mencionado.
El sobrenadante colectado se recuperó en tubos protegidos de radiación fotónica y se realizaron lecturas en
espectrofotómetro para calcular el factor de separación, medido como la relación de absorbancia A620/A650. La muestra
fue almacenada a -20°C protegido de la radiación lumínica. Consecutivamente, la muestra se liofilizó a -50°C y
0.0133 mBar por 36 h hasta la obtención de un polvo fino color azul celeste, sin presencia aparente de grumos o
aglutinaciones. El extracto en polvo se pesó en balanza analítica y se resguardó en congelación a -20°C, protegido de
la luz.
Para corroborar la presencia de la C-PC en el extracto de ficobiliproteínas se sometió a la caracterización por
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) en el laboratorio de cromatografía de la Unidad de Servicios de
Apoyo en Resolución Analítica. Las condiciones de inyección fueron las siguientes: Detector: PS 335 DAD Columna
Varian C8 (250 mm x 4.6 mm x 1/4”), flujo de 0.7 mL/min con fase móvil de ACN H+/H 2O con un tiempo de corrida
de 10.5 minutos y lecturas a absorbancias 580 nm y 640 nm, correspondientes a las longitudes de onda de excitación
y emisión para el detector.

Resultados
Rendimiento de la extracción de ficobiliproteínas.
Se procesó un total de 31.5 g de Spirulina (Arthrospira) maxima en polvo fino para la extracción de 7.42 g de
polvo liofilizado de ficobiliproteínas con una apariencia granulada y de color azul turquesa, característico de la
presencia de C-PC, obteniendo un rendimiento del 23.55%. Se realizaron mediciones espectrofotométricas por
triplicado del extracto de ficobiliproteínas a las absorbancias de 620 y 650 nm donde la C-PC absorbe en su máximo
punto para obtener las absorbancias medias calculadas (tabla I).

Tabla I. Valores de las absorbancias medias calculadas de las lecturas espectrofotométricas a 620 y 650 nm.
Absorbancia 1ª lectura 2ª lectura 3ª lectura Absorbancia media calculada
620 nm 1.154 1.071 1.168 1.131
650 nm 0.633 0.584 0.645 0.620

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Se calculó el factor de separación de C-PC con la ecuación de relación de absorbancia (A620/A650) respecto
de la muestra total de Arthrospira (Spirulina) maxima obteniendo los siguientes índices:

݉݃ ‫ܣ‬͸ʹͲ݊݉ െ ͲǤͶ͹Ͷሺ‫ܣ‬͸ͷͲ݊݉ሻ
ሾ‫ ܥ‬െ ܲ‫ܥ‬ሿ ቀ ቁൌ
݈݉ ͷǤ͵Ͷ
݉݃ ሾͳǤͳ͵ͳ െ ͲǤͶ͹ͶሺͲǤ͸ʹͲሻ
ሾ‫ ܥ‬െ ܲ‫ܥ‬ሿ ቀ ቁ ൌ
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݉݃ ሾͳǤͳ͵ͳ െ ͲǤʹͻ͵ͺሿ
ሾ‫ ܥ‬െ ܲ‫ܥ‬ሿ ቀ ቁ ൌ
݈݉ ͷǤ͵Ͷ
݉݃
ሾ‫ ܥ‬െ ܲ‫ܥ‬ሿቀ ቁ ൌ ͲǤͳͷ͸͹
݈݉

Se obtuvo un índice de contenido de C-PC de 0.1567 mg/ml respecto con el contenido total de Arthrospira
(Spirulina) maxima en el proceso de extracción modificado de ficobiliproteínas.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución

Se realizó la caracterización proteíca por HPLC del extracto de ficobiliproteínas en columna Varian C8
(250 mm x 4.6 mm x 1/4”), flujo de 0.7 mL/min con fase móvil de ACN H+/H2O con un tiempo de corrida de 10.5
minutos y lecturas a absorbancias 580 nm y 640 nm. Se observan dos picos característicos de las subunidades α y β a
4.2 y 4.4 min correspondientes al grupo cromóforo ficocianobilina (figura 3).

Figura 3. Cromatograma del extracto de ficobiliproteínas. Se observan 2 picos característicos

correspondientes a las subunidades de la C-PC.

La C-PC, principal biliproteína de las cianobacterias verde-azules, posee múltiples propiedades

farmacológicas. Su proceso de purificación puede estar influido por factores relacionados con el crecimiento de la
cianobacteria, tales como, la intensidad luminosa y la agitación, la forma de suministrar los nutrientes y su
concentración, el pH y la temperatura (Marín-Prida J et al., 2015).
Las ficobiliproteínas son moléculas coloreadas, por lo que sus máximos de absorción se encuentran en la
región visible del espectro. El proceso de extracción y purificación de la C-PC es monitoreado por las absorbancias a

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620 y 650 nm. Dichas absorbancias son las longitudes de onda a las cuales se encuentran los máximos de absorbancia
para la C-PC y la aloficocianina, respectivamente. La relación de absorbancia entre estas longitudes indica el factor
de separación y es una medida entre la cantidad de C-PC y aloficocianina (Rito-Palomares et al., 2001).
Debido a que la C-PC y las ficobiliproteínas son termosensibles, los procedimientos reportados para su
extracción sugieren técnicas como el ultrasonido, la prensa de French, la congelación-descongelación, la extracción
en medio ácido, la ruptura por ósmosis, los abrasivos, la extracción acuosa y demás métodos mecánicos. La ruptura
celular se realiza a bajas temperaturas y en soluciones como el buffer de fosfatos (PBS por sus siglas en inglés). Estas
condiciones disminuyen la actividad de las proteasas intracelulares que pueden modificar la estructura primaria de las
proteínas. El PBS se emplea como vehículo neutro para células ya que no modifica el perfil de expresión y
funcionamiento celular normal y es empleado como diluyente para métodos de desecación de diversas biomoléculas,
ya que el contenido acuoso presentes en el buffer se adhiere permitiendo inmovilizarla a una superficie sólida. Esta
monocapa de agua evita que la biomolécula sea desnaturalizada o bien, sufra modificaciones conformacionales en el
proceso de desecación (Patel A et al., 2005, Glazer AN et al., 1973).

Comentarios Finales
Resumen de resultados
A partir de la biomasa de Arthrospira (Spirulina) maxima, se obtuvo un polvo liofilizado con un rendimiento
del 23.55% de ficobiliproteínas y un índice de contenido de C-PC de 0.1567 mg/mL mediante lecturas en
espectrofotómetro UV-Vis para obtener las absorbancias medias calculadas. Posteriormente, se observaron en espectro
de HPLC dos picos de las subunidades α y β del grupo cromóforo con un tiempo de retención de 4.2 min y 4.4 min
correspondientes al grupo prostético ficocianobilina.

Conclusiones
Se realizó la extracción de ficobiliproteínas de Arthrospira (Spirulina) maxima mediante ciclos de
ultracongelación (-196°C), descongelación (30°C) y ultracentrifugación (10,000 RPM). Se cuantificó la presencia de
C-PC mediante UV-Vis a 620 y 650 nm mediante espectrofotometría UV-Vis y se obtuvieron los cromatogramas de
las subunidades homólogas de ficocianobilina por HPLC. La extracción de estas biomoléculas posibilita su evaluación
en modelos preclínicos que evalúen su potencial antioxidante en biomodelos experimentales.

Recomendaciones
El proceso de extracción empleado fue modificado al emplear una fuerza relativa centrífuga (RFC por sus
siglas en inglés) de 11,200 en lugar de los 36,280 RFC recomendados para los ciclos de centrifugación y así conseguir
una separación óptima de los componentes de la membrana celular de interés en el ficobilisoma. Por otra parte, el
proceso de ultracongelamiento se llevó de los -80° Celsius a los -196° Celsius, asistido por cámara de nitrógeno
líquido, lo cual pudo mejorar la conservación de los tejidos celulares microbianos al ser una congelación inmediata
que inmoviliza la cinética enzimática lisosomal, sin embargo, se recomienda evaluar diferentes condiciones de
inyección en el equipo de HPLC, esto para optimizar la resolución de las señales de retención de las subunidades del
grupo cromóforo, pues al ser un extracto que contiene principalmente C-PC y APC, las señales pueden mostrar
empalme en sus señales cromatográficas.

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