Revista de Ciencia Cromatográfica, vol.

42, marzo de 2004

Separación e identificación de componentes de cannabis

mediante diferentes técnicas de cromatografía plana (TLC, AMD,
OPLC)

N. Galand 1, *, D. Ernouf 2, F. Montigny 3, J. Dollet 1, y J. Pothier 1, *

1 UFR des Sciences Pharmaceutiques, Laboratoire de Pharmacognosie, 31 Avenue Monge F-3720 Tours, Francia; 2 UFR des Sciences Pharmaceutiques, Laboratoire

de Toxicologie, 31 Avenue Monge, F 37200 Tours, Francia; y 3 UFR des Sciences Pharmaceutiques, Plateau d'Analyse Chimique, 31 Avenue Monge, F-37200 Tours,

Francia

metabolitos reactividades cruzadas.

Resumen
Además, se ha recomendado una amplia variedad de metodologías para la

El uso de cannabis es ilícito en numerosos países, y el consumo creciente ha llevado
a una multiplicación de estudios científicos. Se pueden utilizar nuevos métodos de
cromatografía plana, como el desarrollo múltiple automatizado (AMD) y las técnicas
de cromatografía laminar de rendimiento óptimo (OPLC) como sustituto de la
cromatografía tradicional de capa fina para la identificación y cuantificación de los
componentes del cáñamo indio. Cada método ofrece su propia ventaja: alta
resolución sin difusión ni estiramiento puntual para AMD y velocidad, eficiencia y la
posibilidad de trabajar en modo semipreparativo para OPLC.
determinación de muestras de marihuana o plantas de cannabis: TLC (11), OPLC
(12), HPLC (13), GC y GC – MS (14,15), capilar electrocromatografía (16), método
fluoroinmunológico con resolución temporal (17) e inmunoensayo (18). La mayoría
de estas técnicas requieren instrumentos pesados ​y costosos y mucho tiempo.
La cromatografía plana es un método adecuado para seleccionar simultáneamente
numerosas muestras directamente de las plantas. Se ha convertido en una técnica
moderna con la comercialización de numerosos adsorbentes y nuevos dispositivos
con cámaras de desarrollo automatizadas como OPLC y AMD, que son alternativas
interesantes al TLC clásico.

OPLC abre la posibilidad de analizar un número importante de muestras en muy

Introducción
Debido al uso cada vez mayor del cannabis, se ha hecho necesario disponer de
una amplia gama de métodos eficientes para la identificación de sus componentes
y, en particular, para la caracterización del "compuesto narcótico". ∆ 9- tetrahidrocannabinol
( ∆ 9- THC). Los análisis pueden llevarse a cabo a partir de plantas o fluidos
biológicos. En muestras de orina, sangre y saliva, ∆ 9- THC y metabolitos principales,
como el 11-nor- ∆ 9- El ácido THC-9-carboxílico, a menudo puede ser requerido (1).
Los cannabinoides se pueden detectar mediante numerosos y diversos métodos
analíticos, incluidos los inmunoensayos (EMIT, ensayo de inmunosorción
enzimática, polarización de fluorescencia y radioinmunoensayo) (2,3,4,5,6),
técnicas de cromatografía plana [capa delgada clásica cromatografía (TLC),
cromatografía laminar de rendimiento óptimo (OPLC) y desarrollo múltiple
automatizado (AMD)], cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)
(7,8,9) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) –MS (10). En general,
existe una buena correlación cuantitativa entre estos métodos y pocas
discrepancias, incluso en la región límite, especialmente si los límites a través de
las técnicas de inmunoensayo son bajos, a pesar de las diferencias
poco tiempo. Además, este método puede usarse en modo semipreparativo para
purificar productos por elución directa gracias al hecho de que la migración es lineal
en correlación con el tiempo. h Los valores de Rf son reproducibles, y cada
compuesto se eluye en un tiempo definido.
AMD presenta la mejor resolución sin difusión puntual y sin oxidación
porque la microcámara está saturada con, por ejemplo, metanol bajo una
atmósfera de nitrógeno. El objetivo de este estudio fue comparar el
rendimiento de las técnicas TLC, AMD y OPLC para la identificación y
cuantificación de los componentes del cannabis.
Experimental
Las soluciones estándar de ∆ 9- THC ∆ 9- El THC y el cannabinol (CBN) se
compraron de Sigma-Aldrich Chimie (Saint Quentin Fallavier, Francia). Debido a
que el cannabidiol (CBD) no está disponible, se aisló de la resina de cannabis
mediante OPLC en el modo semipreparativo (consulte la sección Semipreparativa
OPLC aplicada al aislamiento del CBD estándar).

* * Autores a los que debe dirigirse la correspondencia: correos electrónicos nicole.galand@univ-tours.fr o pothier@univ-tours.fr.
Todas las soluciones estándar se prepararon en 0,5 mg / 1 ml en

130 Se prohíbe la reproducción (fotocopia) del contenido editorial de esta revista sin el permiso del editor.
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metanol La resina de cannabis (0,1 g) se extrajo agitando a temperatura ambiente escaneado desde m / z 35-450. Los datos cromatográficos se obtuvieron utilizando el
durante 20 minutos con 10 ml de hexano. El filtrado se evaporó hasta sequedad y el software HP Chemstation (Hewlett-Packard).
residuo se disolvió en 1 ml de tolueno. Se extrajo una muestra de cáñamo (0,5 g)
durante 10 minutos con 20 ml de hexano. Después de la filtración, el extracto se
evaporó al vacío y el residuo se disolvió en tolueno. Todos los solventes se
compraron de Carlo Erba Reactifs (Val de Reuil, Francia) y luego se destilaron. Se Resultados y discusión

utilizó un Linomat IV (Camag, Muttenz, Suiza) para las aplicaciones de muestra. Un

TLC-MAT Desaga (Bionisis, Le Plessis-Robinson, Francia), OPLC50 (Bionisis) y TLC

AMD (Camag) se utilizaron para los estudios cromatográficos. TLC y AMD se Comparación de varios eluyentes utilizados en TLC para la separación

realizaron el 10- × 20 plantillas (gel de sílice prerrevestido HPTLCF 254) de cannabinoides

La TLC es un método adecuado para seleccionar diferentes muestras. En la
literatura, los eluyentes que se utilizan principalmente son eluyente A,

(Merck Art. 11764) (VWR International SAS, Fonterlaysous Bois, Francia). OPLC isooctano-acetato de etilo-ácido acético (30: 10: 1, v / v / v) (20); eluyente B, éter de

se realizó en un HTSorb BSLA 011 y HT Sorb BSLA 003 (Bionisis). Los petróleo-éter dietílico (90:10) (21); eluyente C, acetona-cloruro de

cromatogramas se derivaron mediante pulverización con reactivo de sal B Fast metileno-diisopropil-éter-hexano (1: 1: 3: 20, v / v / v / v) (22); eluyente D, tolueno –

Blue (19). cloroformo – metanol (100: 10: 1, v / v / v) (23); eluyente E, hexano-dioxano (90:10, v /

Para la TLC clásica y la TLC-MAT, el eluyente utilizado fue hexano-éter dietílico v) doble migración (24); y eluyente F, hexano-éter dietílico (80:20, v / v) (19). Los

(80:20, v / v). Para la DMAE, el gradiente de elución fue acetona (100) (botella 1), eluyentes A y B dan como resultado una separación limpia entre ∆ 9-

diisopropiléter (100) (botella 2), hexano (100) (botellas 3–6) y migración durante 20
pasos. Para OPLC, el eluyente era isooctano-éter dietílico (90:10, v / v). La presión THC y CBN pero no entre ∆ 9- THC y CBD. Con el eluyente C, los cannabinoides

externa fue de 50 bares, velocidad de flujo de 100 µL / min, volumen instantáneo de principales se separan, pero las manchas se estiran.

75 µL, volumen de eluyente de 1000 µL y tiempo de migración de 607 s. La

instrumentación GC – MS utilizada consistió en un sistema Hewlett-Packard (GC HP Los mejores resultados se obtuvieron con eluyente F, hexano-éter dietílico (80:20, v /

5890 serie II con una MS cuadrupolo HP5989A) (Palo Alto, CA). Un HP-5MS de 15 m × v) (Tabla I), que permitió una separación limpia de ∆ 8-

0,25 mm × THC ∆ 9- THC, CBN y CBD (Figura 1). La separación de los cannabinoides. ∆ 9- El
TLC clásico de THC, CBN y CBDby no es fácil porque estos derivados poseen

Columna capilar de 0.25 µm y un gas portador de helio (99.99%) a un caudal de 1.3 estructuras químicas con sustitutos muy cercanos. Además, los pesos

mL min. –1 fueron usados. La temperatura del inyector se mantuvo a 250ºC, y todas moleculares de ∆ 9- El THC y el CBD son iguales (314.47), y el peso molecular del

las inyecciones se realizaron en el modo sin división. La temperatura del horno GC CBN es muy cercano (310.44).

se mantuvo a 50ºC durante 1 minuto y luego se programó a 250ºC a 10ºC mín. –1 y

mantenido por 10 min. La línea de transferencia GC – MS se mantuvo a 280ºC, la
ionización electrónica a 70eV y el espectro de masas.

Tabla I. h Rf y colores con reactivo de sal azul rápido de

cannabinoides

h Rf
Colores con
1 2 3 44 55 66
Cannabinoides TLC-MAT AMD OPLC Fast Blue salt B
Figura 2. AMD de los cannabinoides: (1) 7 µL de extracto de cannabis, (2) 1 µL de CBD, (3) 1

CBN 59 73 23 Violeta µL de CBN, (4) 2 µL de resina de cannabis, (5) 3 µL ∆ 9 9 THC y (6) 5 µL de extracto de

∆ 9- THC 66 76 28 púrpura cannabis.

CBD 73 79 34 rojo naranja

1 2 3 44 55 66 77

1 2 3 44
Figura 1. TLC-MAT de cannabinoides: (1) 1 µL de CBD, (2) 7 µL de extracto de cannabis, (3) 2

µL ∆ 8- THC, (4) 1 µL CBN, (5) 2 µL resina de cannabis, (6) 3 µL ∆ 9- THC y (7) 7 µL de extracto de Figura 3. OPLC de cannabinoides: (1) 1 µL de CBN, (2) 2 µL de resina de cannabis, (3) 3 µL ∆ 9-
cannabis. THC y (4) 1 µL de CBD.

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El análisis de los cromatogramas reveló dos grupos diferentes de
cannabinoides, un primer grupo, el menos polar, compuesto de CBD, CBN y ∆ 9- THC
(superior h Valores de Rf) y un segundo, que consistía en muchos compuestos con
menor h Rf. El límite de detección con el reactivo de sal Fast Blue fue de 0.25 µg
para ∆ 9- THC, CBD y CBN.
Se probaron diferentes eluyentes: isooctano, heptano, hexano y pentano-éter
dietílico (90:10, v / v). La comparación entre estos cuatro alcanos mostró que la
capacidad de separación disminuyó cuando la cadena que contenía carbono se
alargó. Después de este estudio tradicional de TLC, estos compuestos se
estudiaron con métodos cromatográficos planos modernos como AMD y OPLC,
con el objetivo de optimizar su separación e identificación.
AMD
El "gradiente universal" norte º1 con metanol, cloruro de metileno y hexano es
demasiado polar. Por lo tanto, era necesario disminuir la polaridad
reemplazando el metanol con cloruro de metileno.
Primero, se probaron dos gradientes. El gradiente de elución 1A fue cloruro de
metileno (100), cloruro de metileno (100), cloruro de metileno-hexano (50: 5),
hexano (100), hexano (100) y hexano (100) durante 25 pasos.
El gradiente de elución 1B era éter dietílico (100) -hexano (50:50), hexano
(100), hexano (100) y hexano (100).
Estos dos eluyentes son interesantes para revelar la mayoría de los componentes del
cannabis, pero no se separan ∆ 9- THC con CBN y CBD muy claramente.
En AMD, la mejor separación de los tres compuestos interesantes se realizó en
TLC de alto rendimiento con el gradiente de elución 1C acetona (100), diisopropiléter
(100), hexano (100), hexano (100) y hexano (100) durante 20 pasos (Tabla I) (Figura
2). La visualización de los componentes químicos se realizó mediante la
pulverización de reactivo de sal B Fast Blue (19). Los diferentes cannabinoides
fueron identificados por sus h Rf y el color de las manchas (púrpura para ∆ 9- THC, rojo
anaranjado para CBD y violeta para CBN).
OPLC
OPLC analítico
Aplicando el eluyente clásico TLC hexano-éter dietílico (80:20, v / v), OPLC dio una
separación clara, pero las diferentes franjas tomaron un
Figura 4. ( Arriba) MS – GC de CBD obtenido del cáñamo de cannabis mediante OPLC en modo semipreparativo y (abajo)
MS de CBD de la biblioteca NIST.
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Forma de "zigzag" porque la viscosidad de los eluyentes era demasiado baja y las placas
de gel de sílice no estaban permeadas de manera homogénea en el interior de su
estructura. Para resolver este problema, se aumentó la viscosidad reemplazando el
hexano con un homólogo más alto, como el isooctano, que no cambia el poder de
elución del eluyente, pero aumenta la presión interna, lo que lleva a una mayor h Valores
de Rf, mejorando así considerablemente la forma de la franja: los mejores resultados se
obtuvieron con isooctano-éter dietílico (90:10, v / v) como eluyente (Tabla I) (Figura 3).
Además, el hexano-dietiléter (80:20, v / v) utilizado en el modo semipreparativo ofrece la
ventaja de evaporarse fácilmente debido a su baja viscosidad.
OPLC semipreparativo aplicado al aislamiento de CBD estándar
CBN y ∆ 9- El THC se obtuvo de Sigma-Aldrich. Debido a que no fue posible obtener
CBD, este compuesto se aisló de la resina de cannabis mediante OPLC en el modo
semipreparativo. En la literatura, pocos trabajos han reportado esta técnica. En
primer lugar, este método había sido probado en opio (25) y xantinas a partir de
extractos de hojas de té (26). En el caso del extracto de cannabis, se muestran dos
series de compuestos. El primero tiene un h Rf por encima de 50, que se realiza fácil y
rápidamente, y el segundo tiene un h Rf por debajo de 50. Para esto último, era
necesario aumentar la polaridad del eluyente. El objetivo de este trabajo era obtener
un compuesto puro de la resina de cannabis mediante el acoplamiento del
cromatógrafo con un colector de fracciones. El extracto se aplicó en línea con
Linomat IV y se eluyó con hexano-éter dietílico (90:10, v / v). La migración del
eluyente se realizó durante el tiempo requerido para comenzar el proceso de elución.
Debido a que OPLC permite la migración lineal en relación con el tiempo, fue capaz
de determinar el instante en que se recolectó CBD. Gracias a OPLC, fue posible
obtener CBD puro.
La ventaja de OPLC en comparación con TLC en el modo semipreparativo es que
no es necesario raspar ni eluir las bandas. En OPLC, los componentes pueden
eluirse de la placa y obtenerse puros mediante acoplamiento con un colector de
fracciones. Cada fracción de elución se evaluó mediante TLC analítica con
hexano-éter dietílico (80:20, v / v) como eluyente. Después de la derivación con el
reactivo Fast Blue salt B (19), se obtuvieron cuatro fracciones, dando solo una
mancha en TLC. El control del estudio estructural realizado por el análisis GS-MS
permitió la identificación de un compuesto presente en la muestra como CBD (Figura
4).
Análisis estructural de CBD
A partir de los datos cromatográficos obtenidos por GC – MS,
los compuestos orgánicos se identificaron por computadora. Los
fragmentos de masa de referencia estándar enumerados en la
biblioteca del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología
(NIST) se compararon con los resultados específicos obtenidos
aquí. El cromatograma de iones totales obtenido mostró un
compuesto principal. Una búsqueda en la biblioteca espectral
de la base de datos indicó que esta sustancia podría ser "2-
[3-metil-6- (1-metil-etenil) -ciclohex-2-en-1-il] -5-pentilbenceno-
1,3-diol (figura 1). El compuesto identificado también se
conoce bajo el sinónimo CBD. Esta suposición está
totalmente de acuerdo con el espectro de masas del CBD
investigado por Baptista (27).
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Además, los cromatogramas mostraron otras sustancias con bajas concentraciones,
que pueden asignarse como hidrocarburos alifáticos y etilénicos.
Desafortunadamente, estos compuestos no pueden identificarse con certeza debido
a su pobre resolución de espectros de masas.
Conclusión
Las técnicas modernas de cromatografía plana son confiables porque son
automáticas y económicas, permiten una mejor resolución que el TLC clásico y
pueden reemplazar potencialmente métodos más lentos y costosos (GC-MS), lo
que aumenta la productividad del laboratorio gracias a su capacidad de analizar
varias muestras al mismo tiempo (hasta 20).
Por lo tanto, con TLC tradicional, fue posible separar D 9-
THC, CBD y CBN de resina de cannabis y hierba de cáñamo indio, pero este método
no ofrecía una separación limpia de los compuestos más polares; Se pueden obtener
cuatro puntos para extractos de cannabis con TLC clásico y ocho puntos para la resina
con AMD. AMD ofrece alta resolución sin ningún estiramiento de puntos, cuya
focalización brinda la posibilidad de realizar la dosificación mediante densitometría de
escáner.
Estas dos técnicas modernas, OPLC y AMD, son reproducibles porque están
completamente automatizadas. Pueden proporcionar información interesante
sobre la composición de diferentes muestras de cáñamo indio y abrir la
posibilidad de determinar el origen geográfico de diferentes muestras.
Los beneficios de la OPLC en comparación con la TLC son numerosos, a saber, la
eficiencia, la reproducibilidad, el pequeño consumo de eluyente en desarrollo y un
retraso de análisis más corto. En consecuencia, las manchas tienen una forma y
difusión más regulares y el estiramiento no es tan pronunciado como en TLC. Otra
ventaja importante de OPLC en comparación con TLC es la posibilidad de extender
este método a la cromatografía semipreparativa, en la que no es necesario raspar ni
eluir las bandas porque los componentes pueden drenarse de la placa y obtenerse
puros mediante el acoplamiento de OPLC a un colector.
Un beneficio adicional de las técnicas cromatográficas planas versu s HPLC y GC
reside en el hecho de que es posible detectar en las muestras de cannabis otros
productos adictivos que pertenecen a diferentes clases químicas (p. Ej., Alcaloides, como
opiáceos y derivados; cocaína y nicotina) mezclados en una sola muestra de cannabis.
mediante el uso de reactivos específicos (p. ej., yodoplatinato o Dragendorff, en el caso
de alcaloides).
TLC, OPLC y AMD también pueden proporcionar información interesante con
respecto a la composición de varias muestras de cáñamo y ofrecen la posibilidad de
determinar su origen.
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