Historia de la población, filogeografía y genética de conservación del último mega-herbívoro

neotropical, el tapir de las tierras bajas (Tapirus terrestris)

Benoit de Thoisy Anders Gonçalves da Silva, Manuel Ruiz-García, Andrés Tapia, Oswaldo Ramirez, Margarita Arana,
Viviana Quse, César Paz-y-Miño, Mathias Tobler, Carlos Pedraza and Anne Lavergne

Antecedentes
Un debate central en la biogeografía neotropical se refiere a la importancia de los eventos climáticos y
geológicos del Pleistoceno en la generación de riqueza de especies actuales [1, 2, 3, 4]. La evidencia
molecular a través de varios taxones apoya un escenario en el que la mayoría de los eventos de
divergencia y especiación observados ocurrieron antes del Pleistoceno [5], y están asociados con eventos
paleogeográficos del Mioceno tardío [6, 7]. Los estudios más recientes, sin embargo, sugieren un papel
más significativo para los ciclos climáticos del Pleistoceno que lo que se había planteado anteriormente
[4]. En este trabajo contribuimos a este debate explorando la filogeografía y la historia de la población del
mamífero terrestre más grande de la Amazonía, el tapir de tierras bajas (Tapirus terrestris) cuyo género
tiene una historia en América del Sur confinada al Pleistoceno.

Tapirs (Perissodactyla, Tapiridae, Tapirus) formaba parte de una comunidad de grandes navegadores
neotropicales que desaparecieron en gran medida al final del Pleistoceno [8, 9, 10]. Como último
representante de esta comunidad, los tapires son actores clave en la dinámica forestal como dispersores de
semillas y depredadores funcionalmente importantes [11, 12], a menudo llamados 'jardineros' forestales o
'arquitectos' [13]. El género Tapirus tiene cuatro especies existentes, el tapir malayo (T. indicus) en el sur
de Asia, y tres especies neotropicales: el tapir de montaña (T. pinchaque) en las montañas centrales de los
Andes, el tapir de Baird (T. bairdii) en Central America; y el tapir de tierras bajas (T. terrestris) que ocupa
la distribución más amplia, desde Venezuela hasta el norte de Argentina, y desde el bosque atlántico
brasileño hasta las estribaciones subandinas ecuatorianas, y variedad de hábitats (por ejemplo, bosques
húmedos y pantanosos, bosques secos y húmedos, sabanas, y una amplia gama de humedales) [14].
El conocimiento actual sobre la historia evolutiva del tapir de las tierras bajas se basa en un registro fósil
bien estudiado para la parte sur de su rango [15, 16, 17] pero un registro fósil más escasamente explorado
en la región amazónica. Por otra parte, solo un estudio se centró en la estimación de las fechas de
divergencia de Tapirus utilizando la variación de secuencia en el gen mitocondrial citocromo oxidasa II
[18]. Las inferencias del registro fósil indican que el género se generalizó en el Neártico durante el
Pleistoceno temprano [8] y migró a América del Sur entre 3,1 y 2,7 millones de años antes del presente
(Mi BP) durante el Gran Intercambio biótico estadounidense [19, 20, 21]. La especie sudamericana más
antigua, T. merriami, está registrada en la Era de Mamíferos Terrestres de Sudamérica (SALMA) en el
Plioceno [22]. Luego, durante el Ensenadan SALMA, varias otras especies de Tapirus co-ocurrieron en el
registro fósil, lo que sugiere una ola de diversificación dentro de América del Sur [15, 17, 23, 24, 25, 26].
Este patrón sigue en el SALMA de Lujanian, cuando el género probablemente experimentó un segundo
período de diversificación, con varias especies que ocurren simpátricamente: T. olivaresi, T cristatellus,
T. mesopotamicus, T. rioplatensis, T. tarijensis [27]. Los primeros registros fósiles de T. terrestris se
informan en este período (80-130 Ky BP), en la región de Mesopotamia del norte de Argentina [16, 24,
28, 29]. Otros registros son más recientes, en el sudoeste de la Amazonia brasileña (30-45 Ky BP [15]) y
en el norte de Uruguay (6-15 Ky BP [17]).
Los datos morfológicos sugieren que T. terrestris, T. pinchaque y T. mesopotamicus (extinto) forman un
grupo monofilético, y T. bairdii forma un grupo monofilético con especies extintas de Tapirus de América
del Norte [24]. Por lo tanto, el registro fósil en combinación con los análisis morfológicos indican que el
Tapirus se diversificó en América del Sur durante los últimos 2.5 My BP, de manera similar a otros
taxones norteamericanos recientemente llegados [21], con T. terrestris probablemente emergiendo a fines
del Pleistoceno. Se pueden hacer otras dos inferencias a partir del registro fósil. Primero, como en otras
especies de Amazonia de tierras bajas [ej., [30]], el origen del tapir de diversificación y propagación del
tapir es probable en la Amazonia occidental, donde los fósiles de varias especies diferentes de Tapirus (de
los cuales solo T. terrestris permanecen), se supone que tienen ocurrió en simpatría en los últimos 100 Ky
BP [15], lo que indica el importante papel de esta región en la diversificación neotropical durante el
Pleistoceno medio y tardío. En segundo lugar, los registros fósiles más tempranos de tapir de tierras bajas
se informan para el Pleistoceno tardío en el rango meridional de la distribución actual del género [19], lo
que indica que la expansión del rango del tapir de tierras bajas fue rápida.
Se han propuesto varios mecanismos de diversificación para el Pleistoceno [31], que conducen a
divergencia alopátrica o parapátrica. La hipótesis del Refugio propone que una serie de cambios
climáticos alternos causados por ciclos de Croll-Milankovitch combinados con los Andes y otros terrenos
de mayor elevación permiten la formación de refugios de bosque húmedo intercalados por áreas de
bosque seco y praderas abiertas. Dentro de los refugios, las especies de tierras bajas de bosque
permanecieron aisladas, creando una oportunidad para la especiación alopátrica, evidenciada en los
centros actuales de endemismo de especies [32, 33, 34]. Se ha demostrado que estos refugios durante los
períodos de enfriamiento climático explican la divergencia en otras partes del mundo [por ejemplo, [35]],
y la hipótesis es uno de los estudios biogeográficos más comúnmente probados en la Amazonia [por
ejemplo, en monos: [ 36, 37]]. Sin embargo, la existencia de refugios de selva tropical en la Amazonia es
controvertida [38, 39], y los centros de endemismo, no coinciden bien entre los taxones [40]. Además, la
divergencia alopátrica en refugios de selva tropical no parece un mecanismo probable para explicar la
divergencia del tapir de tierras bajas ya que la distribución de la especie varía en América del Sur [13],
incluidas grandes áreas de sabana [31]. La divergencia alopátrica dentro de la Amazonia también se ha
formulado según la hipótesis de que se produce como resultado del flujo restringido de genes a través de
grandes ríos dentro de la cuenca del Amazonas. Este modelo de 'barrera del río' predice linajes
independientes que ocurren en bancos opuestos como resultado del flujo restringido de genes [41, 42].
Los datos geológicos sugieren que el río Amazonas alcanzó su flujo actual durante el Pleistoceno tardío
[43], y la evidencia molecular propone que el río Amazonas ha sido una barrera significativa para varios
taxones, incluidos los monos [37] y los carnívoros [44, 45]. Bajo este escenario, se esperaría que el río
separara los linajes independientes del tapir de las tierras bajas a ambos lados de sus bancos.

Finalmente, es posible que haya divergencia en la parapatría en lugar de la alopatría [5]. La hipótesis del
gradiente propone que la divergencia puede ocurrir a través de gradientes ambientales empinados sin
barreras físicas al flujo de genes y predice que los linajes hermanos se encuentran en hábitats adyacentes
[46]. En la Amazonia, pruebas específicas han rechazado la hipótesis del gradiente en roedores [47] y en
aves [48]. Sin embargo, las estribaciones andinas proporcionan el fuerte cambio en el ecotono asumido
por la hipótesis del gradiente, una característica que se ha utilizado para explicar por qué la región es un
punto de acceso para la diversificación en ausencia de barreras geográficas [49]. En el caso del género
Tapirus, la ocurrencia de tapires de montaña y de tierras bajas en hábitats adyacentes a lo largo del
gradiente altitudinal de los Andes [50] indica que es posible un modelo de gradiente de diversificación
[51]. Para probar esta hipótesis, es necesario demostrar que estas especies son taxones hermanos [47].

Aquí, examinamos la variación genética en el citocromo b (cytb) para investigar el tapir de las tierras
bajas del Tapirus terrestris y el historial poblacional. Examinamos cómo la información molecular con
respecto a la historia temprana del género puede explicar la variabilidad en los datos fósiles y contribuir a
la comprensión de los procesos de diversificación en el Neotrópico. El tapir de tierras bajas también es
una especie cada vez más amenazada [52], con una distribución que incluye varias unidades
ecogeográficas comúnmente utilizadas para identificar áreas prioritarias para la conservación de la
biodiversidad [53]. Hasta la fecha, no está claro qué tan bien este esquema de conservación refleja la
historia del tapir y el probable éxito de los esfuerzos de conservación para diferentes linajes del tapir. En
este sentido, aplicamos enfoques coalescentes para: (i) determinar el momento más probable de
divergencia entre linajes de tapir cytb de tierras bajas; (ii) determinar la estructura de la población de tapir
cytb de tierras bajas y explorar los eventos paleogeográficos que pueden haber contribuido a esta
estructura; (iii) investigar la historia demográfica de la especie; y (iv) examinar cómo la historia evolutiva
inferida se refleja actualmente en áreas de prioridad de conservación.

Resultados
Secuencia de la variación, las relaciones filogenéticas y divergencia de citas
Un total de 1.068 bases inequívocas del gen cytb se secuenciaron a partir de tres tapires de montaña de los
Andes Central, Colombia, y 45 tapires ampliamente en la muestra a través de la gama de distribución de
las especies (Figura 1). En las secuencias Tapir, observamos 64 sitios polimórficos (61 transiciones y
transversiones 3), y un sesgo en contra de guanidina (C: 28,59%, T: 28,66%, A: 29,79%, G: 12,97%).
Treinta y cinco haplotipos fueron identificados con una diferencia media por pares de 0.995%, H d de
0.988 ± 0.007, y π de 0.009325 ± 0.004825. Los haplotipos Hte 2 y Hte 13 se encontraron en más de un
sitio de muestreo: Guayana Francesa y Bolivia, y Perú y frontera de Colombia / Brasil, respectivamente
(Tabla 1). Finalmente, se observaron dos sitios polimórficos (que definen dos haplotipos) entre las tres
secuencias de tapir de montaña.

Figura 1
Sitios de muestreo de tapir de llanura baja (Tapirus terrestris) y tapir de montaña (T. pinchaque). Se
indica el tamaño de la muestra por sitio y las regiones ecogeográficas para cada sitio de muestreo [13].
Los números se referencian en la Tabla 1.

Tabla 1
Identificación de la muestra, origen geográfico y unidad ecogeográfica [13], y haplotipos asociados con
sus frecuencias respectivas
La red de haplotipos Unión Mediana (Figura 2) y las genealogías de genes inferidas por parsimonia
máxima, máxima verosimilitud y enfoque coalescente bayesiano (Figura 3) infieren de manera
consistente una estructura de cuatro clados. En el enfoque bayesiano, los cuatro clados tenían valores de
probabilidad posteriores> 0.9, y todos los clados están representados en los árboles de consenso estrictos
derivados de la máxima parsimonia y las inferencias de máxima verosimilitud. Clade I agrupa los
haplotipos encontrados en el oeste de la Amazonía: el sureste de la Amazonía peruana, la Amazonía
ecuatoriana, la Amazonía colombiana y la Amazonía brasileña occidental. Clade II, similar al clado I,
incluye haplotipos muestreados en la Amazonía ecuatoriana y colombiana, el este de Perú y el este de
Colombia. Clade III agrupa haplotipos del norte de la Amazonía: Atlántico Norte de Colombia, Llanos de
Venezuela y Colombia y Guayana Francesa. Clade IV incluye todos los haplotipos encontrados en el sur
de la Amazonia, incluidos Brasil (excepto la Amazonia occidental), Argentina y Bolivia, y algunos del
este de la Amazonía peruana. Clade IV tenía la distribución geográfica más amplia, con haplotipos que
ocurren en tres de nuestras cuatro regiones geográficas definidas (ver Métodos). Finalmente, hubo poco
apoyo para la monofilia recíproca de los tapires de tierras bajas y de montaña. En la red de haplotipos, los
haplotipos de tapir de montaña se agruparon con clado II, y en los análisis bayesianos, la hipótesis de que
los tapires de montaña tienen una posición basal tenía una probabilidad posterior de 0,26.
Usando un marco de inferencia bayesiano, tomamos dos enfoques para medir el tiempo de divergencia
entre los cuatro clados identificados. En el primer enfoque, utilizamos datos de fósiles para calibrar el
reloj molecular con el momento de la división Rhinocerontidae y Tapiridae, y una división bien conocida
dentro de Rhinocerontidae. La tasa de sustitución media inferida fue 5,6 × 10-3 sustituciones / sitio /
millón de años, lo que lleva a la conclusión de que la divergencia entre las especies asiáticas y las
sudamericanas ocurrió antes que el Plioceno (mediana de 19.26 My BP, 95% de mayor probabilidad
posterior) : 8.4-35.1 Mi BP). Se estima que todos los clados dentro del tapir de tierras bajas divergieron
en algún momento entre mediados del Plioceno y mediados del Pleistoceno. En particular, se estima que
el clado I divergió entre 0.8 y 4.0 My BP (mediana = 2.12 My BP, 95%: 0.8-4.0), seguido de la división
entre clade II y clade III (mediana = 1.5 My BP, 95% HPD: 0.8-4.0), y el clado IV entre 0.6 y 4.3 My BP
(mediana = 2.0 My BP, 95% HPD: 0.6-4.3). Dentro de los cuatro clados, solo unos pocos subclades
fueron fuertemente respaldados, con eventos de divergencia que van desde mediados hasta finales del
Pleistoceno (95% HPD: 0.2-1.4 My BP). En el segundo análisis, establecimos un previo fuerte sobre la
tasa de mutación en base a las estimaciones de las tasas de mutación de Perissodactyl cytb [54]. Este
enfoque infirió una tasa de sustitución media de 2.5 × 10-2 sustituciones / sitio / millón de años (95%
HPD: 1.6-3.5 × 10-2), lo que lleva a una estimación de tMRCA de tapir de tierras bajas en el Pleistoceno
medio y tardío ( mediana = 0.33 Mi BP, 95% HPD: 0.19-0.57 Mi BP). Bajo este escenario, la división
entre los clados I y II ocurrió antes del inicio del último Máximo Glacial (LGM) (medio = 0.25 Mi BP,
95% HPD: 0.1-0.4); mientras que se estima que los clados III y IV surgieron más recientemente,
posiblemente durante el LGM (mediana = 0.16 Mi BP, 95% HPD: 0.08-0.14 Mi BP).

Estructura de la población y diversidad

Probamos la partición de la variación genética en tres grupos de muestreo diferentes de acuerdo con: (1)
los cuatro clados filogenéticos, como se describe anteriormente; (2) cuatro regiones geográficas: las
estribaciones andinas, la Amazonia occidental, el sur de la Amazonia y el norte de la Amazonia, que
reflejan en gran medida la distribución geográfica de los haplotipos dentro de los clados; y, (3)
ecorregiones (Figura 1). Usando AMOVA, encontramos una estructuración significativa de la variación
genética para las tres hipótesis de estructuración de la población (Tabla 2). En la primera agrupación, el
67,9% de la variación observada se encontró entre los grupos (Φ CT = 0,68, p ≤ 0,0001) y dio lugar a una
diferenciación poblacional significativa (p ≤ 0,001) en todas las comparaciones por pares con índices que
varían de 0,55 (clado III vs. clado IV) a 0.66 (clado I contra clado IV y clado I contra clado II). La
diversidad de genes y nucleótidos varió entre estos cuatro clados, con valores de diversidad de
nucleótidos más bajos registrados para los clados III y IV (Tabla 3). Agrupando muestras por las cuatro
regiones geográficas se encontró 25.53% de la variación observada entre los grupos (Φ CT = 0.255, p ≤
0.0001) (Tabla 2). Los índices de diversidad de nucleótidos fueron mayores en los dos grupos de la región
occidental de la Amazonia: las estribaciones andinas y la Amazonia occidental (Tabla 3). El grupo del sur
de la Amazonia tenía índices significativos de diferenciación poblacional por parejas (p <0.001) para
todos los demás grupos, y lo mismo se observó entre los grupos de la Amazonia norteña y los
precordilleros andinos. Finalmente, se observaron niveles similares de variación entre grupos a los
registrados para la agrupación geográfica cuando se particionó por ecorregiones (Φ CT = 0,246, p ≤
0,001) (Tabla 2). Las estimaciones de la diversidad de nucleótidos también variaron entre las unidades
ecorregionales, con la mayor diversidad encontrada en la ecorregión del bosque lluvioso (Tabla 3). En
contraste, aunque se observaron bajos niveles de estructura genética en la mayoría de los sitios de
muestreo, las poblaciones del bosque tropical seco argentino y de los llanos venezolanos se aislaron
significativamente de las poblaciones en otras ecorregiones (Tabla 3).
 Tabla 2
Estadísticas Pair por parejas entre muestras agrupadas de acuerdo con los clados filogenéticos, las
regiones geográficas y las regiones ecogeográficas.

Por encima de la diagonal: Índice de fijación (Kimura 2-parameters). Debajo de la diagonal: valores p
asociados.

Tabla 3
Estimaciones de diversidad genética y desviación del equilibrio para cada una de las tres agrupaciones de
muestras: clados filogenéticos, regiones geográficas y unidades ecogeográficas.
Historia demográfica
Exploramos la historia demográfica del tapir de las tierras bajas en las mismas tres agrupaciones
diferentes de muestras: (1) filogenético; (2) geográfico, y (3) ecogeográfico. En la agrupación
filogenética, encontramos valores negativos significativos para F de Fu (Fs = -11.26, p ≤ 0.0001) y D de
Tajima (D = -1.55, p ≤ 0.05) para el clado IV, lo que indica la expansión de la población (Tabla 3). Esto
fue reflejado por la inferencia de Bayesian skyline plot (BSP) de un aumento del tamaño de la población
de dos veces que ocurre 15-20 Ky BP en este clado (datos no mostrados). En el clado I, solo F de Fu (Fs
= -3.01, p ≤ 0.05) fue significativamente negativo. En la agrupación geográfica, observamos valores
negativos significativos para la prueba Fs de Fu (Fs = -4.56, p = 0.001) y la D de Tajima (D = -1.61, p ≤
0.01) solo para el grupo de la Amazonia sur. En la agrupación ecorregional, se observaron valores
negativos significativos solo con la prueba de Fs de Fu, en el Alto Amazonas (Fs = -3.92, p = 0.05) y en
los bosques secos del sur (Fs = -2.37, p = 0.01).

Filogeografía
SAMOVA se usó para identificar agrupaciones genéticas diferenciadas al máximo e identificar
potenciales rupturas filogeográficas. En K = 2, los sitios de muestreo del noroeste del continente (Figura
1: sitios 2, 4, 6 y 7) se agruparon por separado de todos los demás sitios de muestreo (Φ CT = 0,24, p ≤
0,0001). En K = 3, las agrupaciones fueron (i) muestras occidentales: Amazonía colombiana (sitios 2 y 7),
Amazonia brasileña occidental (sitio 3), Amazonía ecuatoriana (sitio 4), Amazonía peruana (sitio 6), (ii)
muestras septentrionales : Guayana Francesa (sitio 1), Llanos venezolanos (sitio 8) y el oeste de
Colombia (sitio 10); y (iii) muestras del sur: Bolivia (sitio 9), sur de Perú (sitio 5), Argentina (sitio 12) y
Brasil (sitio 11) (Φ CT = 0.29, p ≤ 0.0001). En K = 4, el sitio de muestreo de la Guayana Francesa (sitio
1) está agrupado por separado de los otros dos sitios de muestreo del norte (sitios 8 y 10; Φ CT = 0.32, p
≤ 0.0001). En K = 5 a 8, los sitios de muestreo de la región alta del Amazonas se separan de acuerdo con
las separaciones de las cuencas fluviales (ríos Napo, Amazonas, Ucayali y Marañón). En K> 8, las
muestras bolivianas (sitio 9) y argentinas (sitio 12) se agrupan por separado.

Para probar las diferentes hipótesis biogeográficas propuestas, comparamos un modelo nulo de
divergencia alopátrica entre las cuatro áreas geográficas con modelos de colonización basados en
diferentes efectos del gradiente y los mecanismos de divergencia de barrera fluvial (Figura 4). La
genealogía gene reconstruida tuvo un Slatkin y Maddison (1989) s = 4. Para ambas hipótesis alternativas,
el modelo nulo fue rechazado a una p ≤ 0.01 bajo una amplia variedad de etapas de generación y tamaños
de población efectivos (Tabla 4).
 Figura 4
Hipótesis filogeográficas: (i) la hipótesis nula de la divergencia alopátrica dentro de las cuatro regiones
geográficas principales (haplotipos agrupados por ubicación del sitio de muestreo independientemente de
la relación filogenética recuperada); y dos hipótesis alternativas: (ii) divergencia entre los clados I y II
(identificados a partir de relaciones filogenéticas), separando la Amazonia occidental de tierras bajas
(clado II) de las estribaciones andinas (clado I), seguido de la divergencia de los clados III y IV del clado
II. conduciendo a la colonización de las regiones al norte y al sur del río Amazonas, respectivamente; y,
(iii) separarse de una población ancestral de la Amazonia occidental de las tierras bajas que conduce a la
colonización de las regiones al norte y sur del río Amazonas, seguido de una división posterior de la
Amazonia occidental de las tierras bajas y las poblaciones de las colinas andinas.

Tabla 4
Distribución inferida de los valores de s [119] calculada bajo una hipótesis biogeográfica compleja en
comparación con una hipótesis nula de diferenciación alopátrica.

a suponiendo un tiempo de generación de 8 años, que da 10.000 años BP y 3.1 mi BP para 1.250 y
375.000 generaciones, respectivamente. Los valores

S se obtienen de 1,000 árboles simulados bajo un modelo nulo de divergencia alopátrica (escenario b en
la Figura 4). Se obtuvieron valores similares para el escenario c en la Figura 4. Los árboles se simularon
bajo coalescencia neutra sin migración en tiempos de generación variables y tamaños de población
efectivos. Observado s = 4.
Discusión
El papel de los eventos climáticos y geológicos del Cuaternario en la promoción de la divergencia y el
aumento de las tasas de especiación es objeto de intenso debate [1, 2, 3]. En el Neotropics, la
filogeografía y la historia de la población de los mamíferos se han investigado en varios taxones,
incluidos los murciélagos [55], los carnívoros [44, 45, 56, 57], los primates [36, 37, 58], los roedores y los
marsupiales [59] , 60, 61]. Aquí, intentamos contribuir a esta discusión explorando la historia evolutiva y
la estructura y dinámica genética de la población del tapir de las tierras bajas, un habitante generalista y
una especie ampliamente dispersa cuyos antepasados probablemente llegaron al continente durante el
Cuaternario temprano [19]. Al hacerlo, intentamos específicamente estimar el momento de la divergencia
e identificar los eventos climáticos y geológicos que potencialmente contribuyeron a dar forma a la
biogeografía del tapir de las tierras bajas, y apuntamos a proporcionar datos relevantes para la
conservación de esta especie cada vez más amenazada.

Estimación del tiempo de divergencia entre las poblaciones

En promedio, el ADN mitocondrial muta a un ritmo más rápido que el ADN nuclear [62], lo que hace que
se convierta en una herramienta conveniente para reconstruir la historia reciente de poblaciones y
especies [5]. Aplicamos tanto el enfoque novedoso de Ho y colegas [63] como el método más tradicional
basado en datación de nodos interespecíficos utilizando datos fósiles [64] para estimar la tasa de mutación
y, por lo tanto, el momento de divergencia de los clados de tapir sudamericanos. Las estimaciones de la
tasa de mutación fueron un orden de magnitud mayores con la primera que con el último método, y dieron
lugar a estimaciones medias significativamente diferentes de tMRCA, como se ve por la falta de
superposición en la altura del árbol 95% HPD (0.1 - 0.4 y 0.8 - 4.0 BP, respectivamente). Tales
diferencias se han informado y discutido en otra parte [65, 66, 67] y en general se atribuyen a las
diferencias en las tasas de mutación intra e interespecífica [64, 68]. En consecuencia, no somos capaces
de juzgar a priori la importancia relativa de los eventos climáticos o geológicos que ocurren en el
Pleistoceno tardío versus el Pleistoceno temprano en la formación de la historia del tapir de las tierras
bajas.

Para decidir qué estimación es más precisa, deberíamos probar la hipótesis de que las tasas de mutación
intra e interespecífica han convergido [68]. En el caso de que se haya producido la convergencia, se
espera que la aplicación de datos fósiles para informar el momento de la divergencia de los nodos de
árboles interespecíficos resulte en estimaciones precisas de la tasa de mutación. Si no se ha producido la
convergencia, se espera que la calibración de fósiles subestime significativamente la tasa de mutación
[63] y se espera que el método de Ho y colegas [63] resulte en estimaciones más precisas de la tasa de
mutación. Desafortunadamente, sin muestras antiguas de ADN para medir específicamente la tasa de
sustitución, no es posible probar la hipótesis de convergencia. Sin embargo, creemos que otras líneas de
evidencia indican que la convergencia entre las tasas de mutación intra e interespecíficas no ha ocurrido.
En particular, se ha argumentado que las tasas intra e interespecíficas de mutación en vertebrados
deberían converger dentro de 2 Mi de dos linajes que se separan [68], estableciendo un tiempo máximo
para que ocurra la convergencia. También se ha demostrado para pingüinos Adelia, una especie con
tiempo de generación similar al tapir de tierras bajas, que la convergencia de tasas intra e interespecíficas
no se ha alcanzado después de separar 44 Ky de dos linajes [69], estableciendo así una edad mínima de
separación antes de que se espera que ocurra la convergencia.

Un examen de los datos disponibles para los tapires de tierras bajas contenidos dentro del período anterior
resalta una brecha inexplicada entre los datos moleculares previamente publicados y las evidencias
fósiles. El trabajo molecular previo estimó que los tapires de las tierras bajas surgieron en el Pleistoceno
temprano, poco después de que sus antepasados cruzaran el Panamana Isthumus [18], lo que sugeriría que
la convergencia entre las tasas de mutación probablemente haya ocurrido. Sin embargo, un examen del
registro fósil actual parece inconsistente con esta observación. El registro fósil incluye varias especies de
tapir descritas para el período ca. 2 Mi BP en Sudamérica, particularmente en Argentina y Uruguay, pero
ninguna está clasificada como T. terrestris [15, 24]. En cambio, el primer fósil no ambiguo descrito como
T. terrestris está fechado entre 80-88 Ky BP [15, 24]. Esto significa que hay una brecha de casi 2 My
entre el fósil de tapir de tierras bajas descrito más temprano y el momento de aparición del tapir de tierras
bajas previamente estimado [18].

La incongruencia observada podría deberse a registros fósiles demasiado escasamente estudiados, aunque
esto probablemente no se deba a la amplia distribución de los tapires ni a los extensos estudios
paleontológicos [14, 15, 16, 17, 19, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 70], o, a una gran sobreestimación anterior
de la edad del tapir de tierras bajas. Esta última alternativa se basa en la similitud de las estimaciones de
divergencia de este estudio con las de los carnívoros neotropicales cuyos antepasados también llegaron
durante el Gran Intercambio biótico estadounidense [45, 57, 71]. Por lo tanto, parece más parsimonioso
aceptar que el ancestro de los tapires modernos de tierras bajas surgió alrededor de 0.19 y 0.57 My BP
(mediana = 0.35 My BP, 95% HPD 0.19-0.57 My BP), como se calculó sin calibración de un nodo
externo. Esto daría mayor importancia a los eventos climáticos y / o geológicos hacia el final del
Pleistoceno en la conducción de la diversidad neotropical de lo propuesto anteriormente [18].

Nuestras conclusiones, sin embargo, se basan únicamente en un gen mitocondrial y un tamaño de muestra
relativamente pequeño, y por lo tanto están sujetos a grandes variaciones coalescentes y de muestreo. Sin
embargo, nuestros datos sugieren nuevas hipótesis sobre la historia del tapir de las tierras bajas y, por lo
tanto, los posibles mecanismos que actúan para dar forma a la diversidad neotropical, que puede ser
probada utilizando múltiples genes nucleares y muestras adicionales.

Biogeografía de tapir de tierras bajas

Nuestros análisis de filogeografía estadística nos permitieron rechazar un modelo nulo de divergencia
alopátrica en cuatro regiones biogeográficas principales de la Amazonía, como se sugiere para otros
taxones [30]. Sin embargo, no distinguió entre las dos hipótesis alternativas de la biogeografía de la
población (Figura 4). El muestreo de genes nucleares múltiples a través de loci adicionales permitirá
estimaciones más precisas del árbol de la especie y posiblemente distinguirá entre las hipótesis. Sin
embargo, el rechazo de la hipótesis nula sugiere que la historia del tapir de las tierras bajas puede ser
compleja y potencialmente incluye colonización separada y eventos de expansión poblacional.

La reconstrucción filogenética infirió dos clados de tapir de tierras bajas profundamente divergentes en el
oeste de la Amazonia (clados I y II), con tapires de montaña divergiendo de uno de estos linajes. El papel
de la Amazonia occidental en la historia del tapir de las tierras bajas ha sido un misterio en gran parte
debido a la escasez de fósiles descritos para la región. Un informe reciente caracterizó al menos tres
especies de tapires en simpatría en la región de Acre y Rondônia [15], lo que llevó a la hipótesis de que la
región es un centro de origen para los tapires [24]. Nuestro análisis filogeográfico, junto con la
observación de una gran diversidad genética en esta región (Tabla 3), respalda este escenario, sugiriendo
una historia similar a la informada en primates [37, 58], carnívoros [56] y roedores [72], y se suma a los
informes que afirman que la Amazonia occidental ha jugado un papel importante en la divergencia y la
especiación en el Neotrópico [32, 49, 73].

Lo que ha llevado al oeste de la Amazonía a ser una región de gran diversidad aún no está claro, y
probablemente solo se dilucidará con datos adicionales sobre la geología de la región. La falta de barreras
geográficas obvias socava las hipótesis de divergencia alopátrica para explicar la estructura observada y
la diversificación en la Amazonia occidental [31]. Una hipótesis alternativa es que el gradiente altitudinal
de las estribaciones andinas junto con los ciclos glaciales del Pleistoceno [51, 74] ha conducido a
divergencia parapátrica entre los linajes del tapir, un modelo de divergencia también propuesto para otros
taxones en la Amazonía occidental y las estribaciones andinas [eg, [ 30]]. En la superficie, esta hipótesis
cuenta con el apoyo de las distribuciones adyacentes de tapires de montaña y tierras bajas a lo largo de un
gradiente altitudinal desde bosques de tierras bajas a hábitats montañosos subtropicales [46]. Aquí, el
análisis bayesiano indica poco apoyo para monofilia recíproca de tapir de tierras bajas y de montaña, lo
que favorece una relación parafilética. Esto sugiere tres escenarios: primero, la divergencia se produjo en
un período relativamente corto de tiempo y no podemos capturar la relación real con nuestros datos [75];
segundo, tapires de montaña especiados por parafilia; y tercero, los tapires de montaña son un ecotipo de
tapir de tierras bajas, similar a lo que se observa en los renos [76]. En todos los casos, los tapires de
montaña y de tierras bajas son taxones hermanos, lo que sugiere un modelo de divergencia en gradiente.
Los resultados son consistentes con patrones filogeográficos reportados para otras especies en la misma
región [ej., [71]], apoyando así el escenario de que factores externos (p. Ej., Climáticos o geológicos)
fueron significativos en la configuración de la historia de los taxones en esta región [77]. ] Sin embargo,
se ha demostrado que los mecanismos externos son innecesarios para explicar la estructura biogeográfica
genética, ya que la naturaleza intrínseca del proceso genealógico por sí solo puede producir una estructura
espacial significativa en la variación genética [78, 79]. En este sentido, el trabajo futuro debería
concentrarse en probar si las secciones independientes del genoma tienen firmas biogeográficas similares
para descartar de manera concluyente los factores genealógicos estocásticos en la determinación de la
estructura observada en la diversidad genética [79].

La distribución espacial de los otros clados cytb (clados III y IV) sugiere que las regiones al norte y al sur
del río Amazonas están ocupadas en gran parte por linajes independientes derivados de los que se
encuentran en gran parte en el oeste de la Amazonia. Se pueden sugerir dos escenarios principales de
dispersión para explicar este patrón. Primero, suponiendo que la Amazonia occidental es el origen de la
dispersión, dos eventos de migración separados e independientes llevaron a la colonización de las dos
regiones. Alternativamente, un linaje colonizó un área (por ejemplo, el clado III sale del oeste de
Amazonia para colonizar el norte de Amazonia) y posteriormente originó una nueva ola de colonización
que ocupó la segunda área del archipiélago de Marajó (por ejemplo, el clado IV sale del norte de
Amazonia colonizar el sur de la Amazonia, posiblemente a través de las islas). En ambos casos, y
asumiendo factores extrínsecos, se requiere una barrera al flujo de genes para evitar la mezcla y por lo
tanto la dilución de la estructura genética observada, ya que los límites geográficos de las distribuciones
de linajes se superponen a lo largo del río Amazonas. Aunque los tapires de las tierras bajas son
nadadores bien conocidos, se ha informado que el río es una barrera para los jaguares (Panthera onca),
otro nadador similarmente grande y capaz [45]. Por lo tanto, es plausible que el río sea la barrera predicha
para dar cuenta de la distribución geográfica actual de estos dos linajes.

Finalmente, el clado IV, que incluye todas las muestras del sur de la región amazónica (Bolivia y
Argentina), varios haplotipos hallados en Perú, haplotipos de Río Negro (norte de la Amazonía) y un
haplotipo de Bolivia que es compartido con la Guayana Francesa, tiene una distribución geográfica
inusualmente amplia en comparación con los haplotipos de los otros tres clados. Este patrón generalmente
se interpreta como resultado de una expansión de rango rápido [1], una hipótesis que es respaldada por el
BSP y las pruebas de Fu y Tajima. Aunque el origen geográfico de esta expansión sigue siendo una
pregunta abierta, BSP estima que la expansión comenzó alrededor del final del último máximo glacial
(LGM), suponiendo que las tasas de mutación intra e interespecífica no han convergido. Esto sugeriría
que el LGM redujo significativamente el tamaño de la población del tapir de las tierras bajas, de manera
similar a lo que se ha reportado para carnívoros [71] y ungulados [80]. Alternativamente, la expansión
también coincide con la extinción de la megafauna herbívora neotropical y, por lo tanto, una disminución
de la competencia interespecífica puede haber permitido que las poblaciones de tapir de las tierras bajas
se expandieran hacia un hábitat previamente no disponible.

La historia biogeográfica del tapir de tierras bajas, por lo tanto, no está completamente resuelta. El trabajo
futuro debería explorar los posibles roles de la Amazonia occidental, el río Amazonas y el LGM en la
formación de la historia y biogeografía del tapir de las tierras bajas. Aunque los factores externos pueden
no haber contribuido por completo a la estructura observada [78, 79], la filogeografía comparativa
mediante la observación de patrones similares en todos los taxones [71, 80] proporciona una indicación
de que más que los efectos coalescentes y de muestreo estocásticos están contribuyendo a la distribución
de variación genética en esta especie.
Diversidad de la población, estructura e implicaciones de conservación
Los tapires de las tierras bajas están experimentando un rápido declive en el bosque atlántico brasileño y
en los llanos colombianos y venezolanos, y ya se han reportado extinciones locales en Argentina y el sur
y este de Brasil [13]. Esta disminución se atribuye a la pérdida de hábitat y la caza de subsistencia, y ha
dado lugar a una inclusión 'vulnerable' de la especie en la Lista Roja de la UICN [52] y al desarrollo de un
plan de acción de conservación [81]. Sin embargo, un elemento clave para cualquier plan de acción
exitoso es una comprensión clara de la historia, la dinámica y la estructura de la población de una especie
[82, 83, 84]. A pesar de que solo examinamos un locus de mtDNA, lo que puede limitar nuestras
conclusiones, nuestros resultados comienzan a dilucidar tal comprensión, proporcionando información
valiosa para la conservación del tapir. En primer lugar, una evaluación integral reciente del estado basada
en la sostenibilidad del hábitat ha asignado una baja probabilidad de supervivencia a largo plazo para las
poblaciones periféricas (es decir, los llanos colombianos y venezolanos y los grupos de bosques secos del
sur) [13]. Para estas mismas poblaciones, encontramos niveles más bajos de diversidad haplotípica (Tabla
3) que las observadas en otras áreas. Esto podría deberse a la disminución informada de la población, pero
también es plausible que tengan una menor diversidad genética porque se encuentran en la periferia del
rango [85]. En cualquier caso, es probable que estas poblaciones alberguen una diversidad única, como
sugieren los resultados de SAMOVA, y por lo tanto, son importantes en términos de conservación de la
diversidad genética [79].

En segundo lugar, encontramos poco apoyo para el uso de ecorregiones en la delimitación de las áreas de
prioridad de conservación del tapir de las tierras bajas. Las ecorregiones sudamericanas se han definido
sobre la base de la riqueza de especies, la diversidad beta y el endemismo [86]. Los tapires habitan en una
amplia gama de hábitats, y así ocurren en varias ecorregiones, desde sabanas y bosques hasta tierras bajas
y bosques montanos bajos, y como herbívoros generalistas tienen una dieta amplia, alimentándose
oportunísticamente en una amplia variedad de plantas y frutas [ 87, 88]. Los estudios sobre jaguares [45],
zorros cangrejeros [57] y ahora tapires de tierras bajas indican que la estructura genética poblacional de
los grandes mamíferos neotropicales no refleja necesariamente los límites ecorregionales, lo que socava la
utilidad de estas regiones para predecir unidades significativas evolutivas y manejo Unidades (MU) [89]
para vertebrados neotropicales grandes. En cambio, observamos una superposición geográfica en cuatro
clados filogenéticos, lo que impide la delimitación de UDE; y regiones ocupadas por varios linajes
independientes, lo que hace que el estado de MU sea inapropiado. Sin embargo, la Amazonia occidental
es un área importante para la conservación del tapir debido a su endemismo de linaje y representantes de
otros linajes.

Conclusiones
En este estudio, derivamos una serie de nuevas hipótesis para explicar la biogeografía y la historia del
tapir de las tierras bajas. Las fortalezas de estas hipótesis incluyen que complementan el registro fósil, los
patrones de espejo reportados para taxones simpátricas y describen alternativas específicas para explicar
la distribución espacial observada de linajes. En particular, proponemos que los tapires de montaña y de
tierras bajas son nativos de América del Sur, y los tapires de montaña pueden haber especiado del tapir de
las tierras bajas por parafilia a lo largo del pronunciado gradiente ambiental proporcionado por las
estribaciones andinas en el oeste de la Amazonia. A diferencia del trabajo molecular anterior pero similar
al registro fósil, proponemos que la divergencia entre los tapires de tierras bajas ocurrió durante el
Cuaternario tardío, posiblemente como consecuencia de períodos de glaciaciones que producen cambios
significativos en el hábitat por enfriamiento, desecación o cambios dinámicos en el río cuencas [70].
También proponemos que los eventos de dispersión independientes condujeron a la colonización de las
regiones al norte y al sur del río Amazonas y estos linajes se han mantenido en gran medida separados
debido a la barrera que representa el río. Finalmente, nuestros datos sugieren que una expansión de la
población ocurrió después del LGM. Sin embargo, se requiere un examen más completo basado en genes
nucleares y muestras adicionales para obtener estimaciones más precisas de la tMRCA y para probar si la
estructura geográfica observada es de hecho el resultado de factores extrínsecos. Las estimaciones más
precisas también nos pondrán en una mejor posición para juzgar si los efectos geológicos y climáticos han
dado forma a la diversidad genética del tapir de las tierras bajas, ya sea al final del Pleistoceno o antes.
Finalmente, similar a otros grandes mamíferos neotropicales, el tapir de tierras bajas exhibe bajos niveles
de estructuración genética a escala continental. Desde una perspectiva de conservación, nuestros datos
cuestionan la utilidad de las regiones ecogeográficas para establecer prioridades de conservación. En su
lugar, vemos que la Amazonía occidental y las poblaciones de la periferia emergen como un importante
puerto de linajes tanto mayores como jóvenes, y con una diversidad potencialmente única,
respectivamente. Más estudios a través de especies y hábitats a grandes escalas espaciales pueden ayudar
a identificar regiones evolutivas a través de los taxones que pueden ser más adecuadas para la
planificación de conservación en el Neotrópico.

Métodos
Muestreo y secuenciación de ADN
El ADN genómico se extrajo con un protocolo estándar de fenol-cloroformo [90] de 12 cabellos y 33
tejidos de animales sacrificados por cazadores o capturados para estudios ecológicos en toda la
distribución de tapires de las tierras bajas, incluidos Colombia, Venezuela, Brasil, Ecuador, Perú,
Guayana Francesa, Bolivia y Argentina. Además, incluimos tres muestras de pelo de tapir de montaña (T.
pinchaque) de Colombia (Figura 1, Tabla 1).

Dos fragmentos superpuestos de la secuencia objetivo cytb se amplificaron por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando los cebadores L7 - CB2 y CB1 - H6. H6 y L7 se diseñaron para
Perissodactyls [91], y CB1 (5'-GCCCTTATCCTCTCTAGTTTG-3 ') y CB2 (5'-
AATCGGAGGACAACCAGTTG-3') se diseñaron para este estudio. La amplificación procedió durante
30 ciclos de 94 ° C durante 0,5 min, 52 ° C durante 1 min y 72 ° C durante 1 min. Los productos
amplificados fueron 1.079 pb para L7 / CB2 y 313 pb para CB1 / H6; ambas cadenas se secuenciaron
directamente usando los cebadores de PCR. Se obtuvieron alineaciones de secuencia usando MEGA 4.0
[92] y se verificaron manualmente. Ambas secuencias de nucleótidos y aminoácidos se verificaron en
busca de irregularidades que pudieran indicar homólogos nucleares [93]. Todas las secuencias nuevas se
depositaron en GenBank (números de acceso GQ259910 a GQ259957). Elegimos cytb porque los datos
resultantes de la variabilidad genética del ADN mitocondrial se utilizan comúnmente para estudiar la
historia natural de las especies y los patrones de dispersión [44, 45, 57, 94, 95] y son marcadores
adecuados para investigar Unidades Evolutivamente Significativas (ESU) y unidades de Manejo (MU)
[96, 97]. Debido a que el genoma mitocondrial es haploide y heredado por vía materna, se espera que la
clasificación del linaje estocástico progrese más rápidamente que para los genes nucleares. Por lo tanto, la
clasificación incompleta es una preocupación menor para los loci mitocondriales que para los loci
nucleares, lo que los hace ideales para estimar los árboles de especies de taxones estrechamente
relacionados [98] e investigar la especiación en ciernes [99].

Análisis filogenético y estimaciones del tiempo de divergencia.

Se utilizaron enfoques múltiples para estimar las relaciones filogenéticas entre los haplotipos observados.
Primero, estimamos la red de haplotipos utilizando el conjunto completo de secuencias de Tapirus
terrestris y T. pinchaque, utilizando la red 4.5.0. http://www.fluxus-engineering.com y el algoritmo de red
de Median Joining [100].
Para reconstruir el árbol genético de la especie, usamos DNASP 5.1 [101] para identificar todos los
haplotipos únicos en nuestra muestra. La genealogía genética fue inferida por enfoques de máxima
parsimonia y máxima verosimilitud utilizando las implementaciones de PAUP [102] y RAxML,
respectivamente, del portal de CIPRES http://www.phylo.org/sub_sections/portal. También generamos un
árbol UPGMA usando $ SC: MESQUITE $ ESC: [103] basado en distancias por pares calculadas usando
un modelo F84 de sustitución de nucleótidos [104] usando haplotipos únicos para cada sitio de muestreo.
Se utilizó un consenso estricto para obtener la topología final en ≤ 100 árboles recuperados de cada
método. Finalmente, utilizamos un enfoque coalescente bayesiano, implementado en BEAST 1.4.7 [105],
utilizando los mismos parámetros que se detallan a continuación para estimar el tiempo de divergencia de
los clados de tapir de las tierras bajas. Las estimaciones del tiempo hasta los ancestros comunes más
recientes (tMRCA) para los diferentes clados se infirieron con BEAST 1.4.7 utilizando un enfoque con
calibración basado en la edad de los registros fósiles [64] y un enfoque basado en inferencias
independientes de la mutación Tapiridae cytb tasas [63] con el fin de dar cabida a los temas debatidos
recientemente sobre la datación molecular de divisiones filogenéticas relativamente recientes [66, 67,
68].

En el primer enfoque, las secuencias de citt de tapir malayo (número de acceso: AF145734) y varios
Rhinocerotidae: Dicerorhinus sumatrensis (AJ245723), Diceros bicornis (X56283), Ceratotherium simum
(Y07726), Rhinoceros sondaicus (AJ245725), R. unicornis ( X97336) se usaron como grupos externos.
Usando MRMODELTEST 2.2 [106] determinamos que el modelo GTR de sustitución de nucleótidos con
variación de tasa de distribución gamma entre sitios y nueve categorías de velocidad (GTR + Γ) fue el
modelo de sustitución de nucleótidos más adecuado para nuestro conjunto de secuencias completo. En
lugar de utilizar una tasa de sustitución fija, impusimos monofilia para cada especie y establecimos
fuertes priors en los nodos correspondientes a los ancestros comunes más recientes de Dicerotina y
Ceratomorpha. Específicamente, establecemos el previo a una distribución normal con la media
(desviación estándar) de 17.1 Mi BP (± 2.5) y 46.7 Mi BP (± 3.7), respectivamente. Estas fechas se basan
en evidencia fósil [107, 108] y genética [91]. La media armónica de la verosimilitud del modelo, f (X /
Mi), correspondiente a la fase estacionaria, se comparó entre estrategias de reloj molecular [109]:
exponencial relajada, constante, no correlacionada, exponencial no correlacionada, usando la ecuación
2LnB10 para calcular factores bayesianos ( BF) en TRACER 1.4.1 [110]. Un BF> 10 proporcionó un
fuerte apoyo para un reloj molecular relajado. Dos ejecuciones independientes (20,000,000 generaciones
con los primeros 2,000,000 descartados como valores de quemados y parámetros muestreados cada 100
generaciones) con un crecimiento exponencial poblacional previo coalescente y un reloj molecular
relajado con tasas evolutivas de rama no correlacionadas muestreadas de una distribución exponencial
[111] fueron conjunto.
En el segundo enfoque, no usamos outgroups y puntos de calibración externos, sino que establecimos un
previo uniforme en la tasa de sustitución (0.015 - 0.035 sustituciones / sitio / millón de años), que abarca
la variación en la tasa de sustitución observada para cytb en Perisodáctilos [ 54]. Además, establecemos la
altura del árbol antes de una distribución exponencial con una media de 2.5 y un desplazamiento de
0.0014, lo que significa que la altura del árbol puede variar desde 14 Ky BP hasta 9.5 My BP, pero
aumenta la altura de los árboles ≤ 3 My BP. Este previo incorpora de manera efectiva nuestra
incertidumbre sobre los orígenes de las especies de tapir sudamericanas existentes. Una compensación de
14 Ky BP es la fecha mínima para la cual los fósiles de especies existentes han sido identificadas
inequívocamente [15] y 9.5 Mi BP es la edad del primer fósil de Tapirus en América del Norte [8], sin
embargo estimaciones previas sugieren que tierras bajas y montañas el tapir divergió poco después de
ingresar a Sudamérica a fines del Plioceno [18]. Como se describió anteriormente, determinamos que el
modelo HYK + I era el modelo de sustitución de nucleótidos más adecuado para nuestras 48 secuencias;
y utilizando BF, determinamos que las secuencias se comportaban de acuerdo con un reloj molecular
estricto en lugar de un reloj relajado, y que un tamaño de población constante anterior tenía un mejor
ajuste que un crecimiento exponencial previo. Para cada modelo, muestreamos la distribución posterior
40,000,000 de veces, registrando cada 1,000 pasos para un total de 40,000 puntos de datos, los primeros
10,000 puntos de datos se descartaron como burn-in.
En todos los casos, los resultados del modelo se inspeccionaron visualmente utilizando TRACER V 1.4.1
para garantizar una mezcla adecuada de la MCMC y que todos los parámetros tenían valores de ESS por
encima de 1,000. El árbol final para cada enfoque, incluidas las estimaciones de divergencia y su 95% de
densidades posteriores más altas (HPD), se calcularon en TREEANNOTATOR 1.4.5. Se usaron valores
de probabilidad posteriores para evaluar el grado de apoyo de cada nodo en el árbol, y se informó la suma
máxima del árbol de credibilidad del clado [111].

Diversidad y estructura genética de la población

La estructura de la población se investigó de acuerdo con tres escenarios hipotéticos: (i) las poblaciones
se definieron según los clados fuertemente compatibles identificados en la reconstrucción del árbol
genético; (ii) las poblaciones se definieron según cuatro amplias regiones geográficas, parcialmente
sugeridas por clados filogenéticos: piedemonte andino, Amazonia occidental, Amazonia norte y
Amazonia sur, incluyendo Bolivia y Argentina (Tabla 1); y (iii) las poblaciones se definieron de acuerdo
con unidades ecogeográficas (Tabla 1, [13]), que combinan ecorregiones [86] y hábitats regionales
utilizados para la identificación de áreas prioritarias para la conservación de la biodiversidad [53].

Para cada uno de estos escenarios, se usaron DNASP 5.1 [101] y ARLEQUIN 3.1 [112] para examinar el
polimorfismo del sitio de nucleótidos, la diversidad haplotípica (H d) y la diversidad de nucleótidos (π) de
cada grupo de muestras. La variación genética se particionó y los índices de fijación se estimaron usando
un análisis de varianza molecular (AMOVA), como se implementó en ARLEQUIN. Por parejas Φ Las
pruebas de significación de CT también se calcularon usando ARLEQUIN.

Historia demográfica
Se utilizaron dos enfoques para examinar los patrones históricos de crecimiento de la población en el tapir
de las tierras bajas. Bajo la suposición de la neutralidad, las desviaciones en Tajima's D [113] y Fu's Fs
[114] se usaron para probar una expansión reciente de la población o un cuello de botella [115]. En
segundo lugar, se usaron parcelas Bayesianas del horizonte (BSP) [116] para inspeccionar visualmente
los cambios en N e con el tiempo. Los BSP se construyeron en BEAST 1.4.7 [105] utilizando los mismos
antecedentes que los descritos más ocho cambios por pasos fijos en N e. Muestreamos la distribución
posterior con un MCMC de 80,000,000 generaciones, registramos cada 1,000 pasos para un total de
80,000 puntos de datos, los primeros 20,000 se descartaron como burn-in. El tamaño de la población
efectiva escalada se convirtió al tamaño efectivo de la población, N e, suponiendo un tiempo de
generación de 10 años [81] y la tasa de mutación calculada en BEAST (sección anterior).

Filogeografía
Se utilizó un análisis espacial de la varianza molecular, tal como se implementó en el programa
SAMOVA 1.0 [117], para definir las particiones de los sitios de muestreo que están diferenciadas al
máximo entre sí sin una suposición a priori sobre la estructura de la población. El método se basa en un
procedimiento de recocido simulado que maximiza la proporción de varianza genética que puede
explicarse por las diferencias entre los grupos de poblaciones, evaluadas con el coeficiente de variación
genética (Φ CT) entre los grupos estimados por AMOVA [118]. Los análisis se basaron en 100 pasos de
recocido simulados con un número de grupos (K) que aumentó de 1 a 12, lo que nos permitió identificar
el agrupamiento de las muestras que produjeron la CT mayor y más significativa para una K.

Para examinar más a fondo la historia biogeográfica y los mecanismos implicados en la divergencia del
tapir de tierras bajas, utilizamos MESQUITE 2.72 [103] para calcular Slatkin y Maddison s [119] en el
árbol de genes recuperados y dos escenarios hipotéticos, sugeridos por la red de haplotipos y el
genealogía génica observada (Figura 4): (i) una división entre las estribaciones andinas y la Amazonia
occidental baja (hipótesis del gradiente), seguida por un evento de expansión hacia el este y sur dividido
en dos frentes por el río Amazonas (hipótesis del río); (ii) un evento de expansión hacia el este dividido
en dos frentes por el río Amazonas (barrera fluvial) y dividido entre las estribaciones andinas y la llanura
amazónica occidental (gradiente). Ambos escenarios están asociados con un patrón de aislamiento por
distancia, pero difieren en el tiempo relativo de los eventos. Para probar el significado de los s observados
para la genealogía de genes observados bajo cada una de estas hipótesis, generamos distribuciones nulas
para el estadístico de prueba simulando 1,000 árboles de genes bajo un proceso coalescente neutral sin
migración bajo una hipótesis nula de fragmentación alopátrica y calculados para cada árbol genético bajo
cada una de nuestras hipótesis alternativas de árbol de población [120]. Para rechazar la hipótesis nula de
la fragmentación alopátrica, en la que las muestras se agruparon según el escenario geográfico descrito
anteriormente, deberíamos observar una s significativamente menor entre el árbol genético recuperado y
nuestras hipótesis que entre los árboles generados simulados bajo una fragmentación alopátrica y nuestras
hipótesis. Elegimos el escenario de fragmentación alopátrica porque es considerado como el principal
modo de diversificación en vertebrados [49], y nos permite probar específicamente un modelo de refugia
de diversificación, ya que estos grupos reflejan supuestos refugios de la Amazonia [31]. Finalmente, dado
que el proceso coalescente depende del tamaño efectivo de la población y el número de generaciones
[121], probamos 10,000 y 3,100,000 años para tMRCA, y N e de 10,000 y 1,000,000, para un total de
cuatro escenarios. Se prueban diez mil años y 3,100,000 años porque se refieren al final del último
máximo glacial y al surgimiento del istmo de Panamá, respectivamente. Se eligieron los tamaños de
población efectivos porque reflejan nuestra incertidumbre sobre el tamaño de la población del censo de
tapir [13] y cómo podrían traducirse en tamaños efectivos de población. Además, estos valores abarcan la
estimación Ne basada en BSP [116] por nuestra inferencia de la tasa de mutación obtenida de BEAST en
los cuatro clados.