Evolución del microscopio
✓ Uno de los principales hitos de la biología celular.
✓ Uno de los más antiguos es el de Leeuwenhoek (describe
células unicelulares), el de Hooke (primer microscopio
compuesto, describe “celdillas”)
✓ Tenemos microscopios ópticos y electrónicos.
Tipos de microscopios
✓ Se clasifican en dos grandes grupos: microscopio óptico y el
microscopio electrónico.
✓ Los microscopios ópticos se caracterizan por tener una
fuente luminosa (la luz blanca). Se dividen en simples (lupa)
y compuestos (estos se dividen a su vez en fotónico, campo
oscuro, contraste de fases y fluorescencia)
✓ Los microscopios electrónicos se caracterizan por tener una
fuente de iluminación basado en un haz de electrones
(incide sobre la muestra y así se obtienen las imágenes). Se
dividen en microscopios de transmisión, barrido, digital y
efecto túnel o cuántico)
✓ Uno de los grandes desafíos en la utilización de microscopios
(que nos permite visualizar tejidos y células) es obtener una
imagen grande (aumento) y nítida (alta resolución)
✓ Aumento: Magnificación que logra el equipo sobre la muestra
(se representa 40x, 100x, etc)
✓ Resolución: Distancia mínima a la cual el equipo puede
mostrar dos puntos como entidades separadas. (cuanto más
juntos estén y los vemos como puntos distintos, mayor será
la resolución del instrumento)
✓ Glóbulos rojos miden aprox. 7-8 micrómetros.
o Microscopio óptico o de campo claro:
1. Ocular: lente situada cerca del ojo del observador.
Capta y amplía la imagen formada en los objetivos
(pueden ser 1 o 2 oculares)
2. Objetivo: lente situada cerca de la preparación.
Amplía la imagen de esta. Están sujetos en un revólver.
(son aprox. 4 objetivos) Hay objetivos secos y de
inmersión
3. Condensador: lente que concentra los rayos
luminosos sobre la preparación, permite aumentar o
disminuir la cantidad de luz que incide sobre nuestra
muestra.
4. Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el
condensador.
5. Foco: dirige los rayos hacia el condensador
6. Tubo: es una cámara oscura unida al brazo mediante
una cremallera que sostiene al lente ocular y al
revolver
7. Revolver: Tambor que sostiene a las lentes objetivos
y que rota para utilizar un objetivo u otro.
8. Tornillos macro y micrométrico: son tornillos de
enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo.
El macrométrico lo hace mediante grandes
desplazamientos (enfoque grueso) y el micrométrico
con pequeños, permite ajustar el enfoque (enfoque
fino)
9. Platina: es una plataforma horizontal con un orificio
central, sobre el que se coloca la preparación que
permite el paso de los rayos procedentes de la fuente
de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven
para sujetar el portaobjetos sobre la platina la cual
puede tener un mecanismo llamado “charriot” guiado
 por dos tornillos de desplazamiento que permite mover
la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a
derecha y viceversa.
10. Base o pie: es la parte inferior del microscopio que
permite el sostén de este.
- Permite visualizar muestras vivas.
- Las lentes son las responsables de mejorar el aumento de
nuestra muestra.
- Sistema óptico (Lentes oculares): Donde nosotros posamos
la vista. Existen distintos tipos de oculares y cada uno tiene
un número junto a una “x” (10x, 15x, 20x)
- Sistema óptico (Lentes objetivos): Tienen un sistema de
amortiguación (mantiene la integridad de las muestras al no
dañarlas) Tienen un anillo coloreado que indica los aumentos
(4x, 10x, 20x, 40x, 60x, 100x)
- Aumento total: Aumento ocular x Aumento objetivo.
- Poder de resolución (R): Capacidad de distinguir
separadamente 2 puntos muy cercanos entre sí.
- Límite de resolución (d): Distancia mínima entre 2 puntos
para distinguirlos separadamente. (en microscopio óptico es
de 200 nm y el electrónico 2 A. El microscopio de Hooke es
5 micrómetros y Leeuwenhoek 1,4 micrómetros)
d= 𝜆/2𝐴𝑁 (AN= Apertura numérica o n*senθ)
n= c/v= velocidad de la luz en el vacío/velocidad de la luz en
el medio entre el espécimen y el lente objetivo)
- Límite de resolución y poder de resolución son inversamente
proporcionales.
- Apertura numérica: Capacidad de los lentes (tanto objetivo
como condensador, por eso es 2AN) de iluminar la muestra
(para captar las haces de luz o electrones que vienen de
nuestra fuente de iluminación y de hacerla incidir sobre la
muestra)
- Con el aceite de inmersión obtenemos una mejor resolución
(gracias a su alto índice de refracción, lo cual permite que
la mayor cantidad o el 100% de haces de luz llegue a la
muestra) Además de dar una mejor resolución, está en el
mayor aumento del microscopio (NO modifica el aumento,
sino que viene en el objetivo de mayor aumento)
o Microscopio electrónico de transmisión
- Podemos ver otras estructuras que no eran visibles con el
microscopio óptico.
- Se obtienen regiones electrondensas y electronlúcidas. Esto
se relaciona a la cantidad de electrones que van a incidir
sobre la muestra. Se transmiten los electrones en las
regiones electronlúcidas y no se transmiten en las regiones
electrondensas.
o Microscopio electrónico de barrido
- Da imágenes en 3D.
- Tiene “detectores” que localizan los electrones que inciden
sobre la muestra, se hace un escaneo sobre la superficie y
eso permite obtener la imagen en 3D.
- Está al vacío.
Procesamiento histológico
- Es el proceso previo a la tinción.
- Fijación: En formalina.
- Grosor cortes: 3-5 micrómetros.
Tinción hematoxilina y eosina
- De las técnicas más utilizadas en el laboratorio.
- Permite visualizar y diferenciar entre el núcleo y el
citoplasma.
- Colorante se construye en base a metales (aluminio o fierro)
los cuales actúan como mordientes (actúan como puente
entre el colorante y la muestra)
- Hematoxilina: Forma un complejo hemalumbre catiónico
(básico) y es afín con lo ácido. Ej: Núcleo.
- Eosina (auxocromos ácidos): Afinidad por grupos básicos
(aminos) de las proteínas citoplasmáticas. Tiene carboxilos
(grupos ácidos) Ej: Citoplasma por gran cantidad de
proteínas.
Células troncales embrionarios
- Los blastocistos tienen la capacidad de reproducirse
indefinidamente mientras mantengan la pluripotencialidad y
de diferenciarse en células de las tres capas germinales.
- Yamanaka: Obtuvo fibroblastos y los reprogramó, para
expresar factores de transcripción que generalmente están
presentes solo en células embrionarias. Estas células
reprogramadas las llamó IPS (células pluripotenciales
inducidas) Y a partir de estas, pudo obtener distintos linajes
de células embrionarias. “Es posible restaurar la capacidad
de algún órgano”
- Nude mice: Ratón que carece de timo, no hay rechazo
inmunológico.
Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
- Permite identificar proteínas.
- Se basan en la utilización de anticuerpos (tienen una porción
variable, que es la que reconoce el antígeno y una porción
constante)
- En el primer esquema (IHQ), se ve la utilización de otro
anticuerpo, el cual es uno secundario (es genérico) que
reconoce al primario (es específico). Este anticuerpo
secundario va a estar conjugado, en este caso a una enzima
(peroxidasa) que interactúa con un sustrato y dará un
producto coloreado (normalmente color café). Este producto
va a precipitar en el lugar donde tenemos a nuestra proteína
identificada.
- En este caso, se utilizaron anticuerpos primarios comerciales
(en otras técnicas como ELISA se utilizan muestras
humanas que reconocen anticuerpos)
- La inmunofluorescencia es directa, es decir, solo hay un
anticuerpo en juego. (es una variante de la
inmunohistoquímica) Su anticuerpo está unido directamente
a un fluoróforo, donde este se va a excitar y va a emitir
fluorescencia. Se utilizan filtros según los colores que
queremos ver.
GFP
- El GFP (Proteína fluorescente verde) viene de una medusa.
- Es una técnica más de biología molecular que celular.
- Existe una manipulación genética en que se fusionan dos
secuencias (de la proteína de interés + proteína fluorescente
verde)
- Se obtiene como resultado una proteína fusionada, la cual
al expresarse se verá verde.
- Nos permite ver proteínas en seres vivos.
- mCherry: tiñe rosado.
Análisis de ácidos nucleicos
- Nos permite expresar, sobreexpresar e inhibir genes.
- Sobreexpresión de genes: 3 grandes técnicas; una está
basada en la transducción (incorporación de genes a través
de vectores virales como el retrovirus o lentivirus, este se
integra al DNA, por lo tanto, se mantiene en el tiempo y no
se pierde a medida de que la célula se divide); otro sistema
es utilizando la transducción con adenovirus (no se incorpora
en el DNA, por lo que se pierde en el tiempo); la otra técnica
es a través de plasmidios (DNA de doble hebra circular que
se incorpora en nuestras células y tejidos de interés, no se
propaga en el tiempo y se va perdiendo mientras la célula
se divide)
- Silenciamiento de genes: Tenemos dos sistemas; el uso de
Knockdown con RNAt o ShRNA (RNA corto de doble hebra
con forma de horquilla, el cual es complementario con una
secuencia en el RNAm, al formarse esta doble hebra de
RNAm es reconocida por una proteína llamada RISC que
degrada el segmento del RNAt y no se produce la proteína);
Cas9 Knockout (se pueden hacer mutaciones e insertar
genes, actuando como tijeras moleculares, si cortamos y
silenciamos el gen, estamos induciendo una mutación
creando un codón de término lo que provoca que el mRNA
no se podrá traducir y se formará una proteína truncada)
 HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
- Otra técnica de fluorescencia con microscopio de
fluorescencia.
- Se agrega una sonda específica para proteínas y al
visualizarlo con el microscopio va a mostrar fluorescencia.
Tras finalizar el 3er ciclo, obtuve: 2 copias del gen de interés
(doble hebra), y 6 copias de longitud variable (doble hebra).
Tras finalizar un 4to ciclo: 8 copias del gen de interés, 8
copias de longitud variable.

Se repiten los ciclos… a medida que aumentan los ciclos,

aumentan demasiado las copias del gen de interés pero las
copias de longitud variable no tanto.

Finalmente, los llevaré a electroforesis en gel de AGAROSA

- FISH permite visualizar alteraciones genéticas, se utiliza en

clínica.

APUNTES

Resumen

1. Técnica PCR

----> Utiliza:

• Termociclador (realiza ciclos de tºs específicas)

• ADN templado: ADN con gen de interés
• Cebadores o primers: puntos de partida para la
replicación de ADN
• Nucléotidos libres (desoxinucléotidos de A, G, T y C)
• Polimerasas termoestables

Todo esto está dentro del tubo de PCR

---->Pasos:

• Ciclo 1:
- Desnaturalización del ADN (95ºC)
- Anillamiento (55-65ºC): usan los partidores/cebadores
- Elongación (72ºC): se colocan las ADN pol en cada hebra
desnaturalizada. Se observa que no solo se elonga el
fragmento de interés sino también parte del ADN que no
necesito.

• Ciclo 2: se repiten los mismos pasos.

• Ciclo 3: se repiten los mismos pasos

----> Luego de varios ciclos obtengo:

- Copias del gen de interés
- Copias de longitud variable.