Exposición de Avanzada

La isotachoforesis (ITP) es una de las técnicas fundamentales de separación electroforética, donde

los componentes cargados se separan en un campo eléctrico debido a sus diferencias en sus
movilidades electroforéticas.
La isotachoforesis (ITP) es una técnica electrocinética simple y muy robusta que puede lograr una
preconcentración de un millón de veces y una separación y extracción eficientes basadas en la
movilidad iónica.
hemos demostrado el aplicación de ITP a la separación y detección sensible de moléculas iónicas no
marcadas (por ejemplo, toxinas, ADN, ARNr, miARN) con poca o ninguna muestra preparación y
extracción y purificación de ácidos nucleicos de matrices complejas que incluyen cultivo celular,
orina y sangre.

Articulo traducción

LE : el electrolito líder
TE: el electrolito final

Las técnicas electrocinéticas son un elemento básico de las aplicaciones de microescala debido
a su capacidad única para realizar una variedad de fluidos y electroforéticos. Procesos en
sistemas simples y compactos sin partes móviles. La isotachoforesis (ITP) es una técnica
electrocinética simple y muy robusta que puede lograr una preconcentración de un millón de veces
y una separación y extracción eficientes basadas en la movilidad iónica. Por ejemplo, hemos
demostrado aplicación de ITP a la separación y detección sensible de moléculas iónicas no
marcadas (por ejemplo, toxinas, ADN, ARNr, miARN) con poca o ninguna preparación para
extracción y purificación de ácidos nucleicos de matrices complejas que incluyen cultivo celular,
orina y sangre.
ITP logra el enfoque y la separación utilizando un campo eléctrico aplicado y dos amortiguadores
dentro de un sistema de canales fluidicos. Para analitos aniónicos, el tampón de electrolito líder
(LE) se elige de modo que sus aniones tengan una movilidad electroforética efectiva más alta
que los aniones del electrolito final (TE) buffer (La movilidad efectiva describe la velocidad de
deriva observable de un ion y tiene en cuenta el estado de ionización del ion, como se describe en
detalle por Persat et al.13). Después de establecer una interfaz entre el TE y el LE, se aplica un
campo eléctrico de tal manera que los iones LE se alejan de la región ocupada por iones TE. Los
iones de muestra de movilidad efectiva intermedia corren por delante de los iones TE, pero no
pueden superar a los iones LE, por lo que enfoque en la interfaz LE-TE (en adelante, la
"interfaz ITP"). Además, el TE y el LE forman regiones de baja y alta conductividad,
respectivamente que establecen un fuerte gradiente de campo eléctrico en la interfaz ITP. Este
gradiente de campo preconcentra las especies de muestra a medida que se enfocan. Apropiado la
elección de TE y LE da como resultado el enfoque y la purificación de especies objetivo de otras
especies no enfocadas y, finalmente, la separación y segregación de especies de muestra.
Aquí revisamos los principios físicos subyacentes a ITP y discutimos dos modos estándar de
operación: modos "pico" y "meseta". En modo pico, los iones de muestra relativamente diluidos se
enfocan juntos dentro de picos estrechos superpuestos en la interfaz ITP. En modo de meseta, iones
de muestra más abundantes alcanzar una concentración en estado estacionario y segregarse en zonas
adyacentes tipo meseta ordenadas por su movilidad efectiva. Modos pico y meseta surgen de la
misma física subyacente, pero representan regímenes distintos diferenciados por la concentración
inicial de analito y / o la cantidad de tiempo asignado para la acumulación de muestras.
Primero describimos en detalle un experimento modelo en modo pico y luego demostramos un
ensayo en modo pico para la extracción de ácidos nucleicos de E. cultivo de células de coli.
Concluimos presentando un ensayo en modo de meseta, donde usamos una especie de trazador no
focalizador (NFT) para visualizar la separación y realizar cuantificación de aminoácidos.

1. La PTI forma un límite móvil agudo entre iones de carga similar. La técnica se puede
realizar con muestras aniónicas o catiónicas, pero adaptamos esta introducción a la
PTI aniónica y tenga en cuenta que los mismos principios se aplican a la PTI catiónica.
Elegimos amortiguadores LE y TE de modo que los iones LE tengan mayor magnitud
movilidad electroforética efectiva. La movilidad electroforética efectiva, μ = U / E, es la
constante de proporcionalidad entre la electricidad aplicada campo, E, y velocidad de deriva
de iones, U. Establecemos una interfaz difusa entre LE y TE y aplicamos un campo
eléctrico dirigido desde zona LE de alta conductividad a la zona TE de baja conductividad.
El sistema establece rápidamente un fuerte gradiente en el campo eléctrico en la interfaz
ITP, debido al perfil de conductividad no uniforme. Según su nombre (del griego, "isos"
significa "igual", "takhos" significa "velocidad"), los iones TE y LE viajan a la misma
velocidad uniforme, como resultado del campo eléctrico no uniforme y la conservación de
la corriente (esta es la llamada "condición ITP", ver Figura 1).

La interfaz ITP se autoafila: los iones LE que se difunden en la zona TE experimentan un

fuerte flujo de restauración y regresan a la zona líder (y viceversa para iones TE en la zona
LE). Los iones de muestra se centran en esta interfaz si su movilidad efectiva en la zona TE
es mayor que la de los TE coiones, y si su movilidad efectiva en la zona LE es menor que la
de los coiones LE (ver Figura 1). El autoafilado, el enfoque y las propiedades de ITP
contribuyen a la robustez de esta técnica y hacen que ITP sea relativamente insensible a las
perturbaciones de la interfaz (por ejemplo, debido al flujo impulsado por la presión o
cambios en la geometría, como contracciones, expansiones y giros).

En el modo pico ITP (ver Figura 2a y Videos 1-2), las concentraciones de iones de muestra
son en todo momento significativamente más bajas que las de iones LE y TE
concentraciones y, por lo tanto, contribuyen de manera insignificante a la conductividad
local. La distribución de los iones de muestra está determinada por el autoafilado
interfaz entre zonas vecinas (aquí TE y LE) y el valor de la movilidad efectiva de la
muestra en relación con estas zonas múltiples. Los iones de muestra se enfocan dentro de
la misma región estrecha de interfaz ITP que los picos superpuestos en gran medida. La
interfaz y los anchos de pico, así como el factor de preconcentración asociado, escala
inversamente con la corriente aplicada (ver experimentos en la Figura 2b).
Figura 2. Diluir el foco de iones de muestra en ITP "modo pico". a) Dos especies distintas
diluidas (csample << cLE) se enfocan en modo pico en la interfaz formada entre las zonas
LE y TE. Únicamente el LE y el TE determinan el campo eléctrico, ya que las especies de
muestra no contribuyen significativamente a la corriente. Los iones de muestra se mezclan
con TE (en una inyección semi-infinita) y se enfocan juntos en un pico aproximadamente
gaussiano en la interfaz ITP. Criterio de enfoque (mostrado como desigualdades) se aplica a
 especies fuertemente ionizadas. b) Experimentos que muestran Alexa Fluor 488 (AF488)
enfocado en modo pico para un rango de corrientes aplicadas (ver también Video 1). El
ancho máximo de la muestra es inversamente proporcional a la corriente (para una
dispersión advectiva insignificante debido a flujo electroosmótico). La interfaz de
autoafilado es resistente a la dispersión debido al flujo impulsado por presión (ver Video 2).
Los iones de muestra se enfocan dentro de la misma región estrecha de interfaz ITP que los
picos superpuestos en gran medida. La interfaz y los anchos de pico, así como el factor de
preconcentración asociado, escala inversamente con la corriente aplicada (ver experimentos
en la Figura 2b).
Para concentraciones de muestra iniciales suficientemente altas y suficiente tiempo de
acumulación, los iones de muestra alcanzan un valor de concentración umbral. Por especies
completamente ionizadas, este valor está determinado por la función reguladora de
Kohlrausch (KRF). Para electrolitos débiles, está determinado por Alberty y las funciones
de Jovin.
En el modo de meseta, como se muestra en la Figura 3 y el Video 3, los iones de muestra se
separan y purifican en zonas de uniformidad local y concentración constante en un orden
determinado por su movilidad efectiva. Los iones muy diluidos aún pueden enfocarse en
modo pico entre zonas de meseta. En ITP, los iones de muestra pueden introducirse en una
inyección finita entre el TE y el LE (ver Figura 3) o mezclarse alternativamente con el TE y
/ o el LE (Ver Figura 2). Nos referimos a mezclar en la zona TE como inyección "semi-
infinita", que puede usarse para acumular iones de analito continuamente. La acumulación
continua de muestras aumenta la sensibilidad en los ensayos en modo pico y meseta. Sin
embargo, las inyecciones finitas son más comunes en modo de meseta. Esto es probable
porque las altas concentraciones iniciales de analito en inyección semi-infinita pueden
aumentar sustancialmente la conductividad de TE y menores tasas de enfoque. Además, la
purificación completa no es posible en inyección semi-infinita (ya que permanece una
concentración finita en TE).

Figura 3. Muestra de iones en un foco de concentración suficientemente alta en "modo de meseta"

y gobierna la conductividad local. Normalmente presentamos muestra iones en una inyección finita
entre el TE y el LE. En esta modalidad, los iones de muestra se separan y ordenan de acuerdo con
su electroforesis efectiva movilidad. Para especies fuertemente ionizadas, las concentraciones de TE
y zona de meseta están determinadas por la regulación de Kohlrausch función (KRF, un conjunto
invariable inicialmente por la zona LE). Los iones diluidos continúan enfocándose en modo pico
entre las zonas de meseta entre corchetes movilidad efectiva El criterio de enfoque (mostrado como
desigualdades) se aplica a especies fuertemente ionizadas.

2. Dispositivo de limpieza y preparación

Para los ensayos presentados en este protocolo, usamos chips microfluídicos de vidrio
grabados en húmedo isotrópicamente (sección transversal en forma de D) con un diseño de
canales cruzados (ver Figura 1). El siguiente protocolo de limpieza y preparación está
optimizado para canales de borosilicato y sílice fundida, pero también se puede utilizar con
chips de vidrio / PDMS. Realice este procedimiento de limpieza antes de los experimentos
para garantizar la repetibilidad de ejecución y ejecución exitosa Aplicación de
 recubrimientos dinámicos necesarios para suprimir el flujo electroosmótico (EOF). La
omisión de este protocolo puede dar como resultado una fuerte dispersión del Interfaz ITP
1. Para descontaminar el canal, llene los depósitos Norte, Este y Sur con 10-20 μL de lejía
al 10% y aplique vacío en el depósito Oeste por 2 min. Si utiliza un caddie de chip
Caliper estándar, el vacío se puede aplicar de manera efectiva simplemente conectando
el extremo ancho de 200 μL (sin filtro) pipetee la punta al depósito del chip y conecte la
línea de vacío a un tubo de 2 mm de diámetro interno.
2. Vacíe los depósitos y enjuague el canal (como en el paso 1) con hidróxido de sodio 1 M
durante 2 minutos. Esto graba suavemente las paredes del canal, produciendo una
superficie de borosilicato limpia para ayudar a establecer propiedades de superficie
uniformes.
3. Vacíe los depósitos y límpielos con agua desionizada (DI), luego enjuague el canal con
LE durante ~ 2 min. Durante este período, las propiedades de la superficie y los
recubrimientos dinámicos se equilibran dentro del canal.
3. Fluoróforo enfocado en modo pico ITP
1. Prepare 1 ml de LE que consta de HCl 100 mM, tris 200 mM y 1% de PVP.
2. Prepare 1 ml de TE que consta de HEPES 100 mM y tris 200 mM. Combine 90 μl de TE
con 10 μl de 1 μM Alexa Fluor 488 (AF488)
3. Después de enjuagar con LE como se describe en la Parte 2, vacíe el depósito West y
limpie algunas veces con DI para diluir cualquier LE restante en el reservorio. Llene este
depósito con 20 μL de TE que contenga AF488.
4. Coloque el electrodo positivo en el depósito Este y el electrodo de tierra (negativo) en el
depósito Oeste y aplique 2 μA (corriente constante). El pico de la muestra migrará a una
velocidad constante desde el depósito Oeste al depósito Este (ver Figura 1) y el voltaje
entre estos depósitos aumentarán a medida que la conductividad baja TE llene el canal.
4. Extracción y purificación de ácidos nucleicos de E. coli cultivada.
La capacidad de enfocar selectivamente las especies iónicas hace que la PTI sea una técnica ideal
para la preparación de muestras biológicas. Purificamos ácidos nucleicos de lisado celular no
tratado seleccionando un anión posterior con una magnitud de movilidad efectiva inferior al ácido
nucleico objetivo pero superior al coiónico Inhibidores de la PCR (p. Ej., Detergentes aniónicos,
proteínas y disolventes orgánicos, incluso si están presentes en altas concentraciones). Inhibidores
catiónicos de PCR (p. Ej., Álcali metales y proteínas y detergentes catiónicos) migran en la
dirección opuesta y también se quedan atrás. ITP extrae y enfoca el nucleico objetivo ácidos del
reservorio de muestra, dejando atrás especies inhibidoras de PCR más lentas (ver Figura 4).
1. Obtenga una muestra o cultivo de células de E. coli a una densidad superior a 108 UFC /
ml.
2. Transfiera 1 ml de cultivo celular a un tubo de microcentrífuga de cierre seguro y a un
sedimento mediante centrifugación a 4000 g durante 6 min.
3. Vuelva a suspender el sedimento en 80 μL de agua libre de ARNasa y agregue 10 μL de
agente de lisis que consiste en tricina 10 mM, bis-tris 10 mM, EDTA 2 mM, 0.1% Triton-X
y 5 mg / ml de lisozima. Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos. a temperatura
ambiente (protocolo de lisis adaptado de Bercovici et al.11).
4. Agregue 10 μL de hidróxido de sodio 1 M para elevar el pH del lisado a ~ 12.5. Accione
suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que la solución se aclare, en ese
momento la lisis está completa.
 5. Combine 10 μL de lisado con 90 μL de tricina 50 mM y bis-tris 100 mM. Esta solución
ahora se puede usar como TE.
6. Prepare 1 ml de LE que consiste en bis-tris 500 mM, HCl 250 mM, PVP al 1% y 1X SYBR
Green II. Llene el chip microfluídico con LE como descrito en la Parte 3.
7. Para extraer el ácido nucleico purificado para el análisis fuera del chip después de ITP,
reemplace el contenido del reservorio Este con un PCR compatible LE que contiene bis-tris
50 mM, HCl 25 mM y PVP al 0,1%. Aplique 1000 V entre los pozos Este y Oeste para
comenzar el experimento. La corriente entre estos depósitos disminuirá.
8. Al final del experimento, la muestra eluye en el depósito LE. Coincidiendo con esta
elución, la corriente versus el tiempo para este sistema típicamente alcanza un valor de
meseta (ya que la resistencia ahora está dominada por iones TE distribuidos uniformemente
dentro del canal). Mezcle suavemente el depósito contenido por pipeteo repetido y extraer
un volumen de 5 μL para análisis por RT-PCR cuantitativa.

5. Separación de aminoácidos con el modo de meseta catiónico ITP y el trazador sin

enfoque (NFT) para visualización

ITP se puede utilizar para separar y enfocar pequeños iones en mesetas adyacentes y
detectables entre el TE y el LE. Esto permite la detección y identificación basada en
propiedades fisicoquímicas, como conductividad local, absorbancia UV, detección de
temperatura o índice de refracción. Aquí Demostramos un ensayo de seguimiento no
focalizador (NFT) en el que se agrega una especie fluorescente y coiónica a la LE. Esta
especie fluorescente no enfoque, pero su concentración se adapta a un campo eléctrico
local y por lo tanto permite la visualización de zonas de meseta purificadas (ver Figura 5).
1. Prepare 1 ml de LE que consta de etanolamina 100 mM, tricina 200 mM y PVP al 1%,
y 100 μM del fluoróforo catiónico Rodamina 6G
2. Prepare 1 ml de TE que consiste en tris 20 mM, tricina 40 mM. Prepare la muestra
mezclando 90 μL de TE con 10 μL de 50 mM de arginina y 50 mM de lisina
3. Dispense 20 μL de LE en los reservorios Oeste y Norte y muestree en el reservorio
Este. Aplique vacío en el depósito sur durante 1 minuto.
4. Enjuague bien el este con DI y reemplácelo con TE (TE sin muestra).
5. Aplique 500 Voltios entre los depósitos Este y Oeste.
Figura 5. Ensayo del trazador no focalizador (NFT) para la separación y detección de aminoácidos
no marcados. a) Esquema del ensayo NFT. Un finito La inyección de iones de muestra se introduce
en el canal Este. Mezclamos el LE con un fluoróforo catiónico trazador con movilidad efectiva más
baja que la TE iones (μtracer <μTE). Se dice que el fluoróforo actúa como un "marcador de baja
velocidad". A medida que el fluoróforo se electromigra desde el LE a zonas ahora ocupado por
mesetas de muestra y TE, experimenta un campo eléctrico más alto y, por lo tanto, aumenta su
concentración. Este cambio de concentración. crea pasos en el isotachopherogram. b) Separación de
dos aminoácidos, arginina y lisina, usando el ensayo NFT con Rhodamine 6G como trazador
fluorescente de baja velocidad. El ligero pico entre TE y arginina es común en la PTI, no se
entiende bien y aquí no interfiere con detectar o cuantificar las mesetas.

6. Resultados representativos
Mostramos isotachopherograms de experimentos en modo pico en la Figura 2b y experimentos de
extracción de ácido nucleico en la Figura 4. En modo pico Experimentos con un indicador
fluorescente (por ejemplo, AF488, SYBR Green II), la intensidad de fluorescencia global se puede
integrar y comparar con un curva de calibración para obtener información de concentración
cuantitativa. Además, en los experimentos de extracción de ácido nucleico, se permite que la
muestra se eluya en el depósito LE y extraído con una pipeta para análisis cuantitativo por RT-
PCR10,12. Mostramos isotachopherograms en modo meseta para amino separación de ácidos en la
Figura 5. La intensidad de fluorescencia (relativa a la intensidad de la zona LE o TE) se puede usar
para la identificación de la zona, mientras que los anchos de la zona Habilitar la cuantificación.
Figura 1. La isotachoforesis (ITP) es una técnica electrocinética utilizada en aplicaciones
microfluídicas para la detección sensible y la separación de iones. ITP Ofrece capacidades de
separación, enfoque selectivo y preconcentración. Además, es extremadamente robusto e insensible
a las perturbaciones físicas por su naturaleza autoafilante. Los iones de muestra se enfocan
selectivamente entre un electrolito inicial (LE) y uno posterior (TE) y viajan a través del microcanal
a una velocidad constante determinada por la velocidad de los iones principales en la zona LE. Los
iones de muestra se enfocan si son electroforéticos efectivos la movilidad está entre corchetes por la
movilidad efectiva de los iones LE y TE. El esquema muestra un modelo de experimento ITP donde
la muestra se enfoca continuamente entre las zonas LE y TE.
Figura 4. Preparación de lisado y extracción de ácido nucleico con modo pico ITP. El ácido
nucleico se extrae del cultivo de células de E. coli usando lisis alcalina asistida por lisozima y
purificada por enfoque electroforético selectivo a través de ITP. TE mezclado con lisado (marrón)
contiene nucleico objetivo ácido (verde), proteínas y potenciales químicos inhibidores de la PCR.
La selección adecuada de iones finales y principales permite un enfoque selectivo de ácido nucleico
objetivo mientras deja atrás los inhibidores de la PCR. El pico total de ácido nucleico ITP a menudo
adquiere una forma no ideal, como se muestra aquí en el recuadro imagen. Como demostración de
este ensayo, extrajimos ácido nucleico total de bacterias gramnegativas, Escherichia coli (lisadas
con sodio solución de hidróxido sola), NA purificado de lisado usando ITP, recolectó el material
genético extraído y realizó análisis de qRT-PCR para verificar purificación exitosa de 16S rRNA
(rojo) y 16S rDNA (verde) del cultivo bacteriano. Ciclos de umbral de control negativo para 16S
rRNA (azul) y 16S rDNA (amarillo) fueron cada uno por encima de 30 ciclos. Realizamos qRT-
PCR usando el kit Power SYBR Green RNA-to-CT de 1 paso de Applied Biosistemas con 150 nM
hacia adelante (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) y hacia atrás (5'-CACAAAGTGGTAAG
CGCCCTC), en los cebadores condiciones de ciclismo térmico recomendadas.
Figura 5. Ensayo del trazador no focalizador (NFT) para la separación y detección de aminoácidos
no marcados. a) Esquema del ensayo NFT. Un finito La inyección de iones de muestra se introduce
en el canal Este. Mezclamos el LE con un fluoróforo catiónico trazador con movilidad efectiva más
baja que la TE iones (μtracer <μTE). Se dice que el fluoróforo actúa como un "marcador de baja
velocidad". A medida que el fluoróforo se electromigra desde el LE a zonas ahora ocupado por
mesetas de muestra y TE, experimenta un campo eléctrico más alto y, por lo tanto, aumenta su
concentración. Este cambio de concentración. crea pasos en el isotachopherogram. b) Separación de
dos aminoácidos, arginina y lisina, usando el ensayo NFT con Rhodamine 6G como trazador
fluorescente de baja velocidad. El ligero pico entre TE y arginina es común en la PTI, no se
entiende bien y aquí no interfiere con detectar o cuantificar las mesetas.
DISCUSION:
Los métodos ITP presentados aquí permiten la detección y manejo rápido, sensible y robusto de
moléculas iónicas. El principal desafío en el uso de ITP es la elección adecuada de los tampones LE
y TE. En la ITP aniónica, generalmente elegimos el cloruro como el anión principal porque es un
ácido fuerte con muy alto movilidad absoluta y por lo tanto tiene propiedades muy predecibles. Por
lo tanto, la elección del tampón en la PTI aniónica generalmente se reduce a elegir un TE adecuado
y contraión. Para experimentos de enfoque selectivo, la elección de TE es crítica para la exclusión
de iones contaminantes. En aplicaciones donde contaminantes no están presentes, una movilidad
efectiva de TE más baja conduce a una tasa de enfoque más rápida. Recomendamos utilizar el
siguiente TE aniónico relativamente bien comportados iones: MES, MOPS, HEPES, tricina. La
elección del contraión afecta tanto al pH del sistema como a la movilidad efectiva del TE. Los
contraiones comunes son tris (pKa 8.1) y bis-tris (pKa 6.4). Para los ensayos que requieren un pH
más bajo o más alto, recomendamos piridina (pKa 5.25) y etanolamina (pKa 9.5), respectivamente.
En las Tablas 1 y 2, para ITP aniónica y catiónica, respectivamente, resumimos varios ejemplos
útiles de tampones. Tomamos HCl como el ion aniónico LE y sodio como el ion catiónico LE, y
suponemos una fuerza iónica 100 mM del tampón LE.
El lector notará que la fuerza iónica del tampón en nuestros protocolos (y en las Tablas 1–2)
siempre es mayor o igual a 10 mM. Mientras que en teoría La física de ITP se aplica a una fuerza
iónica inferior a 10 mM, contaminantes naturales (por ejemplo, ácido carbónico de la reacción entre
el agua y la atmósfera dióxido de carbono) cerca del nivel de 1 mM a menudo limitan el uso
práctico de tampones de baja fuerza iónica.
Observamos que el mecanismo de transducción de señales no se limita a los ensayos presentados en
este protocolo. Como se discutió brevemente en la Parte 5, en modo de meseta Las zonas
purificadas se pueden detectar a través de cambios en la conductividad local, la absorbancia UV, la
temperatura o el índice de refracción. En nuestro propio grupo, tenemos desarrolló un método que
utiliza anfolitos portadores fluorescentes para la detección sensible y la identificación de analitos
desconocidos. En modo pico experimentos, se pueden usar sondas específicas para etiquetar
analitos enfocados. En un ejemplo, utilizamos balizas moleculares: sondas de oligonucleótidos que
fluorescen tras la hibridación con su secuencia objetivo: para detectar moléculas de ADN o ARN
objetivo con alta especificidad.
Si bien ITP es relativamente resistente a la dispersión causada por el flujo impulsado por presión y
EOF, un EOF excesivo puede provocar el estancamiento de la interfaz de ITP, donde la velocidad
media de EOF se vuelve igual a la velocidad de ITP.14 Tal EOF fuerte ocurre especialmente en
condiciones de pH alto y bajo iónico fuerza. Por esta razón, recomendamos el uso de tampones con
pH 8 o inferior y con fuerza iónica del orden de 100 mM si es conveniente. En nuestro experiencia,
PVP es el recubrimiento más efectivo para la supresión de EOF en chips de borosilicato. Sin
embargo, debido a sus propiedades de tamizado, PVP puede no ser apropiado para algunas
aplicaciones, como enfocar el ADN genómico. En experimentos, observamos que la adición de PVP
puede reducir en gran medida ADN genómico movilidad absoluta (hasta el punto donde no se
enfoca). En estos casos, un recubrimiento de silanol como Sigmacote en conjunción con un El
tensioactivo (por ejemplo, Triton-X 100) también puede ser eficaz para reducir la EOF.