Conceptos básicos en Inmunohematología

Dr E Muñiz-Diaz
Laboratorio de Inmunohematología
Banc de Sang i Teixits
Barcelona (España)
 Inmunohematología
• La IH es la parte de la Hematología que se ocupa de los
procesos inmunes relacionado con las células sanguíneas.

• Estos procesos están producidos por anticuerpos (Acs) que

reaccionan con antígenos (Ags) presentes en la membrana
de las células sanguíneas.

• Los Acs son inmunoglobulinas: las de clase IgG e IgM son

las más habituales.

• Los antígenos (Ags) son estructuras de la membrana

(proteinas, glúcidos, lípidos, o combinaciones de ellos) con
capacidad inmunogénica: capaces de desencadenar una
respuesta inmune.
 Inmunohematología
• Los Ags y los Acs son los grandes protagonistas de la IH, y los
estudios inmunohematológicos realizados para el diagnóstico
de los procesos inmunes de la sangre se basan en poner en
evidencia la reacción Ag-Ac.

Reacción Ag-Ac

Ags en los Anticuerpos Aglutinación

Hematíes Hemólisis
 Inmunohematología. Antígenos.

•La parte del Ag que reacciona con el Ac es el determinante antigénico

o epítopo.

•Cada antígeno está constituido por un número variable de epítopos.

 Inmunohematología. Antígenos.
G
• Los Ags presentes en R
los hematies son los U
Ags eritrocitarios. P
Los Ags codificados por
O
un mismo Gen, o por genes
S homólogos muy próximos
• Los Ags de las entre sí
plaquetas son los Ags S
plaquetarios. A
N
G
• Los Ags de los U
granulocitos son los Í Sistema de
antígenos N grupo sanguíneo
granulocitarios. E
O
S
 Inmunohematología. Anticuerpos.

• Los Acs son proteinas

plasmáticas que se producen
en respuesta a un antígeno.

• Al realizar un proteinograma
aparecen varias bandas, con
2 grandes fracciones
correspondientes a la
albúmina y a las globulinas
(α1, α2, ß1, ß2 y γ).

• Los Acs se sitúan en la

fracción denominada γ, y por
su relación con la inmunidad
se denominan
Inmunoglobulinas (Ig).
 Inmunoglobulinas

• Las Igs está formadas por 4

Región Fc
cadenas, dos pesadas y dos
ligeras, debido a su peso
molecular, que están unidas
por puentes disulfuro.

• Cada cadena tiene una región

constante en todas las Igs y
una variable.

• Se conocen 5 clases de Igs

(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) que
Región Fab
se diferencian entre sí por la
cadena pesada.
Inmunoglobulinas
 Importancia clínica de los Acs
• Los Acs más importantes en
transfusión e IH son los de
clase IgG e IgM, y muy de
lejos, IgA.

• Los Acs de clase IgG son

“incompletos” porque no son
capaces de aglutinar
espontáneamente a los
hematies.

• Los Acs de clase IgM son

“completos o aglutinantes”
porque son capaces de
aglutinar espontáneamente a
los hematíes.
 Clasificación de los Acs según su origen

• Naturales. Aparecen sin estimulación detectable.

La mayoría son IgM, o bien mezclas de IgG+IgM.

– Regulares. Aparecen siempre que se carece del antígeno

correspondiente (ABO).
– Irregulares. No siempre aparecen cuando no se posee el
Ag (P1, Le, E...).

• Inmunes. Se detectan después de un estímulo

antigénico (transfusión, embarazo...). Son casi
siempre IgG.

– También son Acs irregulares.

 Clasificación de los Acs según el Ag
contra el que van dirigidos
• Aloanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag extraño no
presente en la persona que lo
produce.
– Los Acs dirigidos contra los
Ags eritrocitarios. Anti-Rh(D)
en un indivíduo Rh(D-).

• Autoanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag propio.
– Son los responsables de los
procesos autoinmunes.
Procesos en IH que exigen la detección de Acs

• IH eritrocitaria
– Pruebas de compatibilidad transfusionales Aloanticuerpos
– Enfermedad hemolítica del RN Aloanticuerpos
– Anemia hemolítica autoinmune Autoanticuerpos

• IH plaquetaria
– Trombocitopenia neonatal aloinmune Aloanticuerpos
– Púrpura postransfusional Aloanticuerpos
– Púrpura trombocitopénica autoinmune (PTAI) Autoanticuerpos

• IH granulocitaria
– Neutropenia neonatal aloinmune Aloanticuerpos
– Lesión pulmonar aguda-AT (TRALI) Aloanticuerpos
– Neutropenias autoinmunes Autoanticuerpos
 Una regla básica en el diagnóstico
inmunohematológico

La detección de un aloanticuerpo en el suero de un
paciente exige, siempre que sea factible, la confirmación
de la ausencia del correspondiente antígeno.
– Por ej. Una gestante portadora de anti-D debe ser Rh(D-).

1. Investigaremos la presencia de anticuerpos en su suero

• Suero problema + hematies de grupo conocido Rh(D+ y D-)

2. Comprobaremos la ausencia del Ag en la gestante

• Ac conocido (anti-RhD) + hematíes de la gestante

 La reacción Ag-Ac es la base del
diagnóstico inmunohematológico
• Los resultados posibles de
la reacción Ag-Ac pueden
ser:
– Aglutinación
– Hemólisis. Aglutinación

• Las técnicas empleadas

para poner en evidencia
estos fenómenos son
Hemólisis →
fundamentalmente las
técnicas serológicas.
 Técnicas serológicas: Aglutinación
Es el agregado de hematíes que se forma cuando las
moléculas de Ac se unen a los determinantes antigénicos
(Ags) de múltiples células adyacentes.

– Algunas moléculas son capaces de unirse a los Ags y de interaccionar con

otras moléculas induciendo la aglutinación final (IgM).

– Otras moléculas sólo se unen a su antígeno pero no son capaces de hacerlo

con sus vecinas y de producir la aglutinación (IgG).
 Técnicas serológicas: Aglutinación

La aglutinación es un
proceso químico reversible
que se produce en dos
fases:
– Fase de Sensibilización: unión del
Ac con el Ag.
– Fase de Aglutinación: formación
de puentes entre las células
sensibilizadas hasta constituir la
red que conduce a la aglutinación.

Son muchos los factores que

inciden en estas dos fases y
que podemos manipular para
aumentar, o disminuir, la
aglutinación.
 Factores que afectan a la fase de
Sensibilización
1. Temperatura.

2. pH.

3. Tiempo de incubación.

4. Tipo de anticuerpo: clase de Ig.

5. Proporción de Ag y Ac.

6. Constante de afinidad del anticuerpo.

1. Temperatura
– Los Acs IgG reaccionan de
forma óptima a 37ºC
(“calientes”).
– Los Acs IgM reaccionan de
forma óptima a 4ºC o a TªA.
(“fríos”).

2. pH
– El pH óptimo para la reacción
está entre 6.9 y 7.2.
– Algunos Acs necesitan de un 5. Proporción de Ag y Anticuerpo
medio ácido para actuar.
– Tiene que haber una relación
entre el número de moléculas
3. Tiempo de incubación de Ac y el de lugares
– El estado de equilibrio sin antigénicos.
potenciadores es de 15 a 60
min.

4. Tipo de Anticuerpo 6. Constante de afinidad del Ac

– IgM: aglutinante en solución – A mayor afinidad del Ac mayor
salina. es la velocidad de asociación y
más lenta la disociación.
– IgG: no aglutinante. Habrá
que potenciar la aglutinación.
 Factores que afectan a la fase de
Aglutinación
1. Intensidad iónica del
medio (Potencial Z). 2. Tipo de Ac
• El potencial Z es la • Los IgM siempre aglutinan.
diferencia de potencial entre • Los IgG raramente (según la
el hematíe cargado localización del epítopo del Ag).
negativamente y la nube de
cargas positivas del medio.
• Es el responsable de la +
fuerza de repulsión de los + CARGA POSITIVA:
hematíes. + + + CATIONES DEL MEDIO

+
+ + +
CARGA NEGATIVA:
SIALOGLICOPROTEINAS
HEMATIE + +
DE LA MEMBRANA
+ + +
+
++
+
 Ausencia de
aglutinación

nube de
iones
+ Ig G
anticuerpo
+ incompleto
+ +
+ +++
+ + +
+ ++ + + +
14 nm + + +
+ ++ 25 nm
+ + +
+ ++ ++ +
++ ++ +
+ + ++
+
+
35 nm

Ig M
anticuerpo
completo

Aglutinación
 Potenciadores de la reacción Ag-Ac
Souciones de baja fuerza iónica (LISS)
- Aceleran la fase de sensibilización al disminuir la carga negativa.
- Suele requerir una sustancia no iónica para evitar la hemólisis (Glicina).

Albúmina
- Reduce la repulsión entre células (potencial Z) favoreciendo la aglutinación.
- Hace posible que Acs IgG sean capaces de unir hematíes adyacentes.

Enzimas
- Bromelina, ficina, papaina,tripsina, pronasa y neurominidasa.
- Reducen la carga negativa. Hacen aglutinantes a los Acs IgG.
- Mejoran el acceso a los lugares antigénicos.

Moléculas cargadas positivamente

- Son polímeros que aportan un exceso de carga positiva: polybrene, sulfato de
protamina, poli-L-Lisina, que pueden producir una aglutinación espontánea.
- Pueden dar falsos positivos.
PEG
- Es un polímero soluble que potencia la reacción Ag-Ac eliminando el agua que hay
alrededor de los hematíes.
- Útil para la detección de Acs de clase IgG.
El test de la antiglobulina (Test de “Coombs”)
En 1945 Coombs, Mourant y Race diseñaron una técnica
para poner en evidencia a los Acs que no eran capaces de
aglutinar directamente a los hematies (IgG).

1. La base es la utilización de un suero anti-Inmunoglobulina

humana o, anti-C, (suero antiglobulina) que actúa como un
puente de enlace entre los Acs que se han fijado.

2. Originalmente se empleó para demostrar anticuerpos Rh(D)

incompletos o no aglutinantes (IgG) en el suero.

3. Posteriormente, para detectar la sensibilización in vivo de

hematíes por anticuerpos, o factores del C, (autoanticuerpos)
en pacientes afectos de Anemia hemolítica autoinmune.

Es el test más importante en Inmunohematología

 ¿Cómo se obtiene la antiglobulina humana?

Inyección
plasma humano o de
Igs específicas

Suero de Coombs:
anticuerpos contra las
fracciones Fc de las Igs humanas

Antiglobulina Poliespecifica / Polivalente: Anti-Igs (mayorit. IgG) + C3d

Antiglobulina Monoespecifica: Anti IgG, anti IgM, anti IgA, anti C3d
Aplicaciones de la técnica de la antiglobulina

Prueba directa Prueba indirecta

AHAI: autoacs. Tipificación:

-Ac conocido y Ag desconocido.
Hemólisis inducida por
fármacos.
Detección e identificación
de Acs:
EHRN: RN con CD+.
-Ac desconocido y Ag
conocido.
Reacciones aloinmunes:
- Ac fijado a hematíes Pruebas cruzadas.
transfundidos.
 TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA

Test directo:

Indicaciones:
Anemia hemolítica autoinmune
Enfermedad hemolítica del recién nacido
Hemólisis por fármacos
Reacció hemolítica post-transfusional
 TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA

Test indirecto:

suero hematies hematies anticuerpos aglutinación

paciente reactivo sensibilizados anti-IgG y/o C’

Indicaciones:
Detección e identificación de anticuerpos anti-eritrocitarios
Pruebas de compatibilidad pre-transfusional
Tipificación de antígenos eritrocitarios que no son visualizados
por aglutinación directa
Sensibilización: reacción Ag-Ac
El suero antiglobulina se une al fragmento Fc de los Acs IgG
El suero antiglobulina actúa como puente entre los Acs IgG
favoreciendo la aglutinación
Aglutinación final
 Comparación entre el Coombs Directo
e Indirecto

Coombs Directo Coombs Indirecto

Detecta Acs (IgG) y/o C Detecta Acs (IgG) y/o C fijados
directamente fijados a los a los hematíes, procedentes del
hematíes en estudio. suero en estudio.
La sensibilización se ha producido La sensibilización de los hematíes
espontáneamente en el organismo del se ha provocado al incubar el suero
paciente. en estudio con los mismos.
La técnica requiere 1 paso. La técnica requiere 2 pasos.

Los hematíes son examinados La prueba exige una incubación previa

directamente con la antiglobulina (suero+hematíes) antes de añadir la
humana. antiglobulina humana.
 Métodos para observar la Aglutinación

La técnica en tubo Es la técnica estándar

Ventajas
Se pueden añadir aditivos
Permite la manipulación
Es visible la hemólisis

Desventajas
La aglutinación es inestable
Requiere experiencia en la
manipulación y lectura cuidadosa 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 0
 Métodos para observar la Aglutinación

Aglutinación en columna / tarjeta La columna contiene gel, microesferas...

Utilizan aditivos (LISS) para potenciar la reacción Ag-Ac y reducir el tiempo

de incubación.
La reacción es semipermanente y puede evaluarse horas-días después.

Ventajas
Entrenamiento mínimo y poca
manipulación.
Se requieren pocos reactivos.

Desventajas
Requiren equipamiento
Muy sensibles
Equipamiento en la técnica de
aglutinación en columna
Prinicipio de la aglutinación en Gel
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K

Hematíes K+

Hematíes K-
 Métodos para observar la Aglutinación

Técnica en fase sólida en microplacas

8 Se utilizan microplacas
de plástico con 96 pocillos.

8 Permite automatización.

8 Muy útil para grandes

series.
 Técnica en Fase Sólida (Microplaca)

•Hematíes o estromas
eritrocitarios de composición
antigénica conocida, fijados en los
pocillos de una
microplaca.

•Se añade el suero a estudiar y se

incuba; posteriormente
se lava la placa para eliminar el
exceso de anticuerpo.

•El anticuerpo fijado se detecta

añadiendo un reactivo de
antiglobulina conjugado en enzima
o con hematíes
sensibilizados recubiertos con
antiglobulina.
 Técnica en Fase Sólida (Microplaca)

Ventajas:
- Sensibilidad parecida al PEG
- Larga caducidad
- Lectura de resultados automatizable.

Desventajas:
- La fase de lavado de las microplacas es delicado.
- Se puede automatizar, pero encarece los costes.
- No es práctica para muestras aisladas.
- Ideal para series largas de muestras.
 El Complemento
• Es un sistema de 25-30 proteinas séricas y de la membrana que
actúan en cascada para producir diversos efectos biológicos,
entre ellos la lisis de los hematíes.

• Se encuentran en estado inactivo o de proenzimas, y tras su

activación se convierten en enzimas activos.

• La activación se produce:

– por vía clásica: reacción Ag-Ac

– por vía alternativa: bacterias, virus, proteinas o carbohidratos ajenos.

• Nueve componentes están numerados de C1 a C9.

Activación completa del Complemento

• C1qrs rompe C4 y C2 en 2 fragmentos: C4a y C4b y C2a y C2b.

• C4b y C2a se unen para formar la C3 covertasa que rompe C3 en C3a y C3b.
• C3 convertasa se une a C3b para formar la C5 convertasa que rompe C5 en dos
fragmentos, etc.
• El complejo de proteinas de “ataque” lo forman el grupo de C5 a C9 que acaban
produciendo agujeros en la misma y la hemólisis subsiguiente.
Activación incompleta del
Complemento (C3d)
Receptor macrofágico para el receptor Fc

Macrófago

Fc de Igs
Jk a

Hematíe
 Receptor macrofágico para C3b

Macrófago

Ca ++
Ca ++
C1s C1r
C1q

C4b
C2a
C3b
Jka Jka

Hematie
 Reacción transfusional
IgG
Reacción Habitualmente extravascular
retardada Anti-Jka y anti-Jkb

Activación incompleta del C

Reacción Intravascular / Extravascular

inmediata anti-A y anti-B

IgM
Activación completa del C
 KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

Técnicas moleculares. Aplicaciones

La técnica más común es la PCR: PCR-ASRA, PCR-ASP, Discriminación
alélica con tecnología Taqman.

1. En pacientes transfundidos o con Coombs directo positivo

podemos determinar el genotipo. (Ej. Hemoglobinopatías).

2. Definir las variantes RhD y confirmar el carácter positivo o

negativo de la muestra.

3. Confirmar el grupo ABO en las discordancias sérico-hemáticas.

4. Buscar donantes con determinados genotipos (Ej. Dombrock)

cuando no se dispone de antisueros.

5. Determinar la zigosidad exacta de células de Panel (Ej. Fy(a+b-)

puede ser Fya/Fya, Fya/Fy, Fya/Fyx.

6. Análisis del genotipo fetal: RhD, Rhc, K. Permite aplicar un

programa profiláctico racional.
Gracias por su atención

Barcelona vista desde el Parque Güell