2014

USP 37 FARMACOPEA
,
AME RICA
DE LOS ESTADOS UNIDOS DE

NF 32 FORMULARIO NACIONAL

Volumen 1 Autorizados por la Convención de la Farmacopea de

los Estados Unidos de América. Preparados por el Consejo
de Expertos y sus Comités de Expertos

Oficial desde el 7º de mayo de 20 74

La designación "USP NF 2014" en la cubierta de esta publicación es sólo para

fines de identificación. La publicación contiene dos compendios separados: la
Farmacopea de los Estados Unidos de América, Trigésima Séptima Revisión, y el
Formulario Nacional, Trigésima Segunda Edición.

THE UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION

12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852,
Estados Unidos de América
 GUÍA DE IMPLEMENTACIÓN DEL PERÍODO DE SEIS MESES

La Farmacopea de los Estados Unidos de América-Formulario Nacional y sus suplementos son oficiales a los seis meses
después de su publicación al público. Los compendios USP-NF, publicados el 1 º de noviembre de cada año, son oficiales
desde el 1 º de mayo del siguiente año. Se ha adoptado la implementación de este plazo de seis meses para que los usuarios
dispongan de más tiempo para lograr que sus métodos y procedimientos cumplan con los requisitos nuevos y revisados de
USP-NF.
La tabla siguiente indica las fechas oficiales de los compendios USP-NF y sus suplementos. Los compendios de USP 36-NF
31, de 201 3 y sus suplementos, Anuncios de Revisión Intermedia (IRA, por sus siglas en inglés) y Boletines de Revisión (Revision
Bulletins) de la mencionada edición, serán oficiales hasta el lº de mayo de 2014, fecha en la que los compendios USP 37-NF
32 serán oficiales.

Fecha de
Publicación Publicación Fecha Oficial Oficial hasta
USP 37-NF 32 1º de noviembre de 1° de mayo de 2014 1ºde mayo de 2015 (excepto cuando sean reemplazados por suple-
2013 mentas IRAs v Boletines de Revisión)
Primer Suplemento de 1º de febrero de 2014 1º de agosto de 2014 1ºde mayo de 2015 (excepto cuando sean reemplazados por el
USP 37-NF 32 Seaundo Sunlemento IRAs y Boletines de Revisión)
Segundo Suplemento de 1º de junio de 2014 1º de diciembre de 1ºde mayo de 2015 (excepto cuando sean reemplazados por IRAs y
USP 37-NF 32 2014 Boletines de Revisión)
USP 38-NF 33 1º de noviembre de 1º de mayo de 2015 1ºde mayo de 2016 (excepto cuando sean reemplazados por suple-
2014 mentas IRAs Y Boletines de Revisión)

La siguiente tabla proporciona detalles de los IRAs que aplicarán a los compendios de USP 37-NF 32.

Fecha de Publicación Fecha de Entrega de Fecha de Publicación

IRA de PF los Comentarios de IRA Fecha Oficial de IRA
40(1) 2 de enero de 2014 31 de marzo de 2014 30 de mayo de 2014 1º de iulio de 2014
40(2) 3 de marzo de 2014 31 de mayo de 2014 31 de iulio de 2014 1º de septiembre de 2014
40(3) 1º de mayo de 2014 31 de iulio de 2014 26 de septiembre de 2014 1 º de noviembre de 2014
4014) 1º de iulio de 2014 30 de seotiembre de 2014 26 de noviembre de 2014 1º de enero de 2015
4015) 2 de seotiembre de 2014 30 de noviembre de 2014 30 de enero de 2015 1º de marzo de 2015
4016) 3 de noviembre de 2014 31 de enero de 2015 27 de marzo de 2015 1º de mayo de 2015

Los Boletines de Revisión publicados en el sitio Web de la USP serán oficiales a partir de la fecha especificada en el Boletín de
Revisión.

OBSERVACIONES Y ADVERTENCIAS

En relación con los Derechos de Patentes o Marcas de los EE.UU.-La inclusión en la Farmacopea de los Estados Unidos o en el
Formulario Nacional de una monografía sobre cualquier fármaco respecto al cual puedan existir derechos de patentes o de
marcas no se considerará, ni pretende ser, una garantía de derecho o privilegio protegido por dicha patente o marca, ni una
autoridad para ejercer dicho derecho o privilegio. Tales derechos y privilegios están adjudicados al propietario de la patente o
marca y ninguna otra persona podrá ejercerlos sin permiso expreso, autoridad o licencia otorgados por el propietario de
dicha patente o marca. ·
Con relación al Uso de Textos de la USP o del NF-Se destaca el hecho de que los derechos de autor de los textos de la USP
y el NF están debidamente protegidos. Los autores y demás personas que deseen usar partes del texto deberán solicitar
permiso al Secretario de la junta Directiva de la Convención de la USP (USPC).
Copyright © 2014 The United States Pharmacopeial Convention
12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852
Todos los derechos reservados.
ISSN: 1930-2924
ISBN: 978-1-936424-25-2
Impreso en los Estados Unidos de América por United Book Press, lnc., Baltimore, Maryland
USP 37-NF 32 Contenido iii

Contenido

VOLUMEN 1 Artículos Nuevos que Aparecen en USP 3 7 Ausentes

en USP 36 y sus Suplementos .......... xxxviii

Artículos Incluidos en USP 36 Ausentes

en USP 3 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxix
Misión y Prefacio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Lista Detallada .......................... xi

Integrantes del Ciclo de Revisión

2010-2015 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XV Advertencias
Funcionarios ............................ xv Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . 1

junta Directiva .......................... xv

Capítulos Generales
Consejo de Expertos ...................... xv
Ver página 2 9 para detalles del contenido
Comités de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi
Pruebas y Valoraciones Generales . . . . . . . . . . . 33
Grupos Asesores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiii
Requisitos Generales para Pruebas y
In Memóriam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiii Valoraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Miembros de la United States Equipos para Pruebas y Valoraciones . . . . . . . . . 53
Pharmacopeial Convention,
a partir del 31 de mayo de 2013 .. xxiv Pruebas Microbiológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Reconocimiento para los Donantes de Pruebas y Valoraciones Biológicas . . . . . . . . . . . 92

Materiales de Referencia Pruebas y Valoraciones Químicas. . . . . . . . . . . 1 71
y Monografías en 2012 ............ xxx
Pruebas y Determinaciones Físicas . . . . . . . . . . 341

Acta Constitutiva .................. xxxii Información General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 637

Gobierno de la USP ................ xxxiii Suplementos Dietéticos. . . . . . . . . . . . . . . . . 1639

Estatutos ............................. xxxiii

Normas y Procedimientos ................ xxxiii

Reactivos, Indicadores y
Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1101
Políticas de la USP ...................... xxxiii
Especificaciones de Reactivos . . . . . . . . . . . . . 1 706

Indicadores y Papeles Indicadores . . . . . . . . . 1 779

Incorporaciones .................. xxxvii Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1781
Artículos Incorporados a USP 37 mediante Soluciones Amortiguadoras . . . . . . . . . . . . 1781
Suplementos ......................... xxxvii
iv Contenido USP 37-NF 32

Soluciones Calorimétricas . . . . . . . . . . . . . 1 783 Índice

Soluciones Reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 783 Índice Combinado de USP 37 y NF 32 ....... 1-1
Soluciones Volumétricas. . . . . . . . . . . . . . . 1 792

Columnas Cromatográficas . . . . . . . . . . . . . . 1801

VOLUMEN 3
Tablas de Referencia
Envases para Dispensar Cápsulas y Tabletas. . 1805 Guía para los Capítulos Generales. . . . vii
Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos
de la USP y del NF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1815
Advertencias
Solubilidades Aproximadas de Artículos de la
Advertencias y Requisitos Generales .......... xi
USP y del NF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1878

Pesos Atómicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1887

Tabla Alcoholimétrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1892

Tabla de Viscosidad Intrínseca . . . . . . . . . . . . 1894

U5P 37
Equivalencias de Temperatura . . . . . . . . . . . . 1896

Monografías
Índice Monografías Oficiales de USP 37, 1-Z . . . . . . 3831
Índice Combinado de USP 3 7 y NF 32 . . . . . . . 1-1

Índice
Índice Combinado de USP 37 y NF 32 ....... 1-1

VOLUMEN 2
VOLUMEN 4
Guía para los Capítulos Generales. . . . vii
Guía para los Capítulos Generales. . . . vii

Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales .......... xi
Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales .......... xi

U5P 37
Suplementos Dietéticos
Monografías Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 581 7
Monografías
Monografías Oficiales de USP 3 7, A-H . . . . . . 1899
USP 37-NF 32 Contenido v

Excipientes
NF 32
Excipientes USP y NF, Agrupados por
Categoría . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6446

Incorporaciones
Monografías
Artículos Incorporados a NF 32 mediante
Suplementos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6443 Monografías Oficiales de NF 32. . . . . . . . . . . 6455

Artículos Nuevos que Aparecen en NF 32 Ausentes

en NF 31 y sus Suplementos . . . . . . . . . . . 6443 Índice
Artículos Nuevos que Aparecen en NF 32 . . . 6443 Índice Combinado de USP 3 7 y NF ~) 1- 1
Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6444
1
 USP 37
Misión y Prefacio
USP 37-NF 32 y sus
Suplementos
Este apartado brinda información sobre la Convención de
la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP), así
como también información general sobre la 37.ª revisión de
la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP 37) y la
32.ª edición del Formulario Nacional (NF 32) y sus Suplemen-
tos. Los textos de USP 37-NF 32 serán oficiales a partir del
1 º de mayo de 2014, los textos del Primer Suplemento de
USP 3 7-NF 32 serán oficiales a partir del 1º de agosto de
2014 y los textos del Segundo Suplemento de USP 37-NF 32
serán oficiales a partir del 1 º de diciembre de 2014, a me-
nos que se indique algo diferente.
DECLARACIÓN DE LA MISIÓN
Los compendios USP-NF se publican en cumplimiento con
la misión de la USP: Mejorar la salud en todo el mundo a
través de normas públicas y programas relacionados que ayu-
den a garantizar la calidad, seguridad y beneficio de los medi-
camentos y alimentos.
HISTORIA
En la Cámara de Senadores del Capitolio de los Estados
Unidos, once médicos se reunieron el 1 º de enero de
1820 para establecer una farmacopea para los Estados Uni-
dos. Estos profesionales buscaban crear un compendio de
los mejores medicamentos que ya estuviesen completa-
mente establecidos, darles nombres útiles y proporcionar re-
cet?s para su preparación. Casi un año después, el 15 de
d1c1embre de 1820, se publicó la primera edición de la Far-
macopea de los Estados Unidos de América. Con el tiempo, la
naturaleza de la Farmacopea de los Estados Unidos de América
(l!SP) pasó de ser u~ co~pendio de recetas a un compen-
dio ~e normas para 1dent1dad y calidad que por lo general
implican el uso de materiales de referencia como estándares
de comparación en pruebas y valoraciones específicas. Con
el tiempo, también se ha cambiado el cronograma de publi-
cación de la USP. Desde 1820 hasta 1942 la USP se publicó
cada 1 O años, mientras que desde 1942 hasta 2000 cada
cinco años, y a partir de 2002 anualmente.
En 1888, la American Pharmaceutical Association (Asocia-
ción Farmacéu~ica de lm Est?dos Unidos) publicó el primer
Formulano Naoonal ba¡o el titulo Formulario Nacional de Pre-
paraciones No Oficiales (NF, por sus siglas en inglés). Tanto la
USP como el NF fueron reconocidos en la Ley Federal de
Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos de 1906,
y nuevamente en la Ley Federal de Alimentos, Medicamen-
tos y Cosméticos de 1938 (Ley FD&C). En 1975 la USP ad-
quirió el Formulario Nacional (NF) que contiene actualmente
normas de excipientes, y que también requiere el uso de
materiales de referencia. La USP continúa desarrollando los
compendios USP y NF mediante el trabajo del Consejo de
Experto~, publicando una obra que proporciona normas
para art1culos basada en los avances de las ciencias analíticas
y metrológicas. Así como evolucionan éstas y las ciencias
afines, lo mismo sucede con la USP y el NF.
Misión y Prefacio vii
CONTENIDO DE LOS COMPENDIOS U5P-NF
Lo.s co.mpendios USP-NF conti~nen monografías de sus-
tancias (ingredientes) y preparaciones (productos) para artí-
culos of1c1ales reconocidos en los compendios USP-NF. Los
términos sustancia oficial, preparación oficial y artículo oficial
se d~f1nen en las Advertencias y Requisitos Generales (Adver-
tenoas Generales). Salvo escasas excepciones, todos los artí-
culos sobre los qu~ existen monografías en los compendios
USP-NF se comerc1al1zan legalmente en los Estados Unidos o
están contenidos en artículos que se comercializan
legalmente.
Una m.~nog~a~ía de USP-NF de una sustancia, producto o
prep~rac1on of1c1al puede constar de varios componentes,
1nclu1do el nombre del artículo, la definición, las condiciones
de ~~vas.a,do, almacen~mie_~to y ot:os requisitos, y una es-
pec1f1cac1on. La espec1f1cac1on consiste en una serie de prue-
bas universales (descripción, identidad/identificación, impu-
rezas, valoración) y pruebas específicas, uno o más
procedimientos analíticos para cada prueba y criterios de
aceptación. Los ingredientes se definen como fármacos o
excipientes. Un excipiente es todo componente, distinto de
la sustancia o las sustancias activas, agregado intencional-
mente a la formulación de una forma farmacéutica. Los ex-
cipientes no son necesariamente inertes. Los fármacos y ex-
cipientes pueden ser sintéticos, semisintéticos, obtenidos de
la r;aturaleza .(fuente natu~al) o fabricados empleando tecno-
log1a recombinante. Los farmacos que consisten en molécu-
las de mayor tamaño y las mezclas que requieren una
p:ue_ba de pote~cia por lo gene_ral se denominan productos
b1olog1cos o art1culos b1otecnologicos.
Los capítulos generales proporcionan los procedimientos
q.~e se citan ~on frecuen~ia, a veces con criterios de acepta-
c1on, con el fin de compilar en un solo lugar información
repe_titiva qu~ se aplica a muchas monografías. Las mono-
graf1as y C?p1tulos generales, nuevos, eliminados y revisados,
y el material obsoleto que ha sido eliminado de esta edición
se indican en el apartado Incorporaciones.
Organización de los Compendios U5P-NF-Los com-
pendios USP-NF se publican en cuatro volúmenes. El Volu-
men 1 incluye secciones de preliminares (Misión y Prefacio,
Integrantes, sitios Web y páginas del Gobierno de la USP e
Incorporaciones/Lista Detallada). Asimismo, incluye Adverten-
cias y Requisitos Generales, Capítulos Generales, capítulos ge-
nerales de Suplementos Dietéticos, Reactivos y Tablas de Refe-
rencia. El Volumen 2 incluye monografías de la USP
correspondientes a las letras A-H y el Volumen 3 incluye mo-
nografías de la USP correspondientes a las letras 1-Z. El Volu-
men 4 incluye mon.ografías de Suplementos Dietéticos, lncor-
poraoones del NF/L1sta Detallada, Excipientes y monografías
del NF. Para facilitar el uso y referencias convenientes, todos
los cuatro volúmenes incluyen el índice completo, así como
las Advertencias y Requisitos Generales y la Guía para los Capí-
tulos Generales. Los capítulos generales específicos para los
suplementos dietéticos se incluyen por orden numérico con
los demás capítulos generales en la USP. Las monografías de
excipiente.s, se presentan por lo general en el NF, pero pue-
den tamb1en aparecer en la USP, con la referencia cruzada
 viii Misión y Prefacio
correspondiente cuando también son fármacos. El apartado
Exop1entes (Volumen 4) presenta una tabla de los excipientes
organizados por categoría funcional.
Revisiones de USP-NF-Los compendios USP-NF se revi-
san en forma continua. Las revisiones se presentan anual-
mente, como Revisiones de Normas en USP-NF y en los Su-
plementos semestrales, y como Revisiones Aceleradas en el
sitio Web de la USP [Fe de Erratas, Anuncios de Revisión Inter-
media (lnterim Revision Announcement (IRA)) y Boletines de
Revisión (Revision Bulletins)J.
Revisiones de Normas-El proceso de Revisión de Normas
de la USP requiere de la publicación de una propuesta de
revisión en el Pharmacopeial Forum (PF) durante un período
de notificación y comentarios de 90 días y, después de la
aprobación del Comité de Expertos pertinente de la USP, de
la p11h!iucióri dP !¡¡ rPvisión en los próximos compendios
USP-NF o Suplemento, según corresponda.
Revisiones Aceleradas-Se usa el proceso de Revisión Ace-
lerada para oficializar revisiones de USP-NF en forma más
rápida que a través del proceso de Revisión de Normas de la
USP. Las Revisiones Aceleradas, que incluyen la Fe de Erratas,
los Anuncios de Revisión Intermedia y los Boletines de Revisión,
se public~n er: el sitio w.eb de la U?P, no siempre requieren
not1f1cac1on n1 comentarios y permiten que una revisión se
oficialice antes de la publicación de los próximos compen-
dios USP--NF o Suplemento. Ver la USP Guideline on Use of
Accelerated Processes far Revisions to the USP-NF (Guía de la
USP sobre el Uso de los Procesos Acelerados para las Revisiones
de USP-NF), publicada en el sitio Web de la USP.
Fe de Erratas-Las Erratas son contenido erróneamente
publicado en una publicación de la USP que no refleja con
exactitud la intención de los requisitos oficiales o vigentes
tal como los aprobara el Consejo de Expertos. Por lo gene-
ral, son cambios que no tienen un impacto amplio sobre las
normas. Las correcciones de las Erratas no están sujetas a
comentarios públicos y se comunican a las r,artes interesa-
das mediante su publicación en la sección 'Official Text"
(Texto Oficial) del sitio Web de la USP. Las erratas ya no se
publican en los compendios impresos USP-NF ni en sus Su-
plementos, sino que se publican en el sitio Web de la USP.
Las correcciones de las Erratas se oficializan el primer día del
mes posterior a su publicación. Las correcciones de las Erra-
tas se incorporan en los siguientes compendios USP-NF o
Suplemento disponibles y se marcan en el texto impreso
conforme a lo descrito más adelante.
Anuncios de Revisión Intermedia (IRA)-Un IRA aparece en
el PF primero como un Anuncio de Revisión Intermedia Pro-
puesto (Proposed lnterim Revision Announcement) con un pe-
riodo de comentarios de 90 días. Cuando no existen co-
mentarios significativos, el IRA se oficializa en la sección de
"Official Text" (Texto Oficial) del sitio Web de la USP, con la
fecha oficial indicada. Los IRA se incorporan en los siguientes
compendios USP-NF o Suplemento disponibles.
Boletines de Revisión-Si las circunstancias requieren la pu-
blicación rápida de un texto oficial, puede publicarse una
revisión o aplazamiento a través de un Boletín de Revisión.
Los Boletines de Revisión se publican en el sitio Web de la
USP con la fecha oficial indicada. Los Boletines de Revisión se
incorporan en los siguientes compendios USP-NF o Suple-
mento disponibles.
Pharmacopeial Forum (PF)-EI PF es la publicación oficial
de la USP que se usa como vehículo de notificación y co-
mentarios públicos. Las propuestas de revisión se incluyen
en los apartados Revisiones en Proceso (ln-Process Revisions) o
en el Anuncio de Revisión Intermedia Propuesto (ver más
arriba) y representan borradores de revisiones que se espera
alcancen la condición de oficiales, supeditadas a la revisión
final y aprobación del Comité de Expertos pertinente.
El PF está disponible únicamente en línea y sin costo al-
guno. El acceso gratuito al PF tiene como propósito facilitar
la participación abierta y pública en el proceso de revisión
de los compendios USP-NF. El PF incluye los cambios y adi-
ciones propuestos a los compendios USP-NF, incluyendo la
USP 37
Armonización en Etapa 4 y los artículos de Estímulos (Stimuli)
para los que la USP busca comentario público. Todas las
propuestas, incluidos los IRA, tienen un periodo de comen-
tarios de 90 días.
Suplementos-Los Suplementos de USP-NF se rigen por
un programa de publicación estándar anual: el Primer Suple-
mento se publica en febrero y se oficializa el 1 º de agosto. El
Segundo Suplemento se publica en junio y se oficializa el 1 º
de diciembre. Los usuarios de los productos impresos de la
USP deben conservar los Suplementos y verificar la sección
de "Official Text" (Texto Oficial) del sitio Web de la USP
para contar con el texto oficial actualizado. La versión en
línea de los compe_nd}os USP-NF se actualiza con cada Suple-
mento o con la rev1s1on anual. Cada vez que se publica una
nueva edición· o Suplemento durante la suscripción vigente,
se publica una nueva versión electrónica. El Indice de cada
Suplemento es acumulativo e incluye citas de la revisión
anual y, en el caso del Segundo Suplemento, citas del Primer
Suplemento. Los dos Suplementos se incluyen en la siguiente
edición anual, junto con las nuevas revisiones oficiales que
hayan sido adoptadas con posterioridad al Segundo Suple-
mento de la edición previa de los compendios.
Traducciones de USP-NF-Los compendios USP-NF se en-
cuentran disponibles en ediciones en español, ruso y chino.
El mantenimiento de la edición en español sigue el mismo
enfoque de revisión que la edición en inglés; las demás tra-
ducciones están basadas en revisiones anteriores de los com-
pendios USP-NF.
Estándares de Referencia USP-EI uso de los Estándares
de Referencia USP promueve la calidad uniforme de los me-
dicamentos y sustenta la fiabilidad y uniformidad para aqué-
llos que llevan a cabo los análisis para el cumplimiento de
las normas y demás usuarios de los compendios USP-NF,
incluidos fabricantes, compradores y autoridades reglamen-
tarias. Los Estándares de Referencia USP se citan en procedi-
mientos específicos tanto en monografías como en capítulos
generales. La USP oficializa este material a través de estudios
meticulosos de caracterización y de análisis colaborativos,
seguidos por la revisión y aprobación del uso farmacopeico
del material de referencia por parte de los Comités de Ex-
pertos. 9e1 Consejo de Expertos. El C_atálogo USP, que lista la
coleccion de Estandares de Referencia USP, se encuentra dis-
ponible en el sitio Web de la USP (www.usp.org). Este pro-
grama se beneficia de una amplia contribución voluntaria de
materiales adecuados y de datos de prueba pertinentes por
parte de fabricantes de productos farmacéuticos.
Texto Sombreado y Símbolos-El texto sombreado se
usa para identificar el texto que ha sido modificado, agre-
gado o eliminado desde su última publicación. Los símbolos
identifican el inicio y el final de cada revisión o de texto no
armonizado. La siguiente tabla resume los tipos de símbolos
y los subíndices relacionados que se usan en las publicacio-
nes de la USP:
Tipo de Revisión Símbolo Subíndice
Anuncio de •texto nuevoec1RA01.¡"1. (IRA Ol -jul-2014)*
Revisión lnter- 2014)
media
Boletín de •texto nuevoe (RB01-e11e (BR Ol -ene-2014)*
Revisión 2014)
Texto eliminado • .(IRAOl-¡ul-2014) 0 (IRA 01-jul-2014)*
·•1S(USP37) Ü 1 S (USP37)*
6 .t..(USPV) USP37**
Texto adoptado •texto nuevo.,, 1usrJ1) 1 S o 25 (edición
en los anual de la USP)*
Suplementos
* Un número o fecha en subíndice indica el IRA, el Boletín de Revisión o
el Suplemento donde la revisión apareció por primera vez.
** Un ejemplo de una revisión que se oficializó en los compendios
USP-NF sería •u1rJ1.
 USP 37 Misión y Prefacio ix

Tipo de Revisión Símbolo Subíndice ción, prevalecerá el lenguaje del texto oficial, de manera
Texto adoptado &texto nuevo ... (u1nn Edición anual de la única e independiente de los Comentarios.
en USP-NF USP** . Presentaciones Impresas y Electrónicas-Los compen-
Armonización +texto nacional remanen- dios USP-NF y sus dos Suplementos se encuentran disponi-
te o texto no armoniza- bles en version impresa, en memoria flash USB y en formato
do+ electrónico en linea. El formato electrónico en línea permite
Erratas •texto nuevoe rrnR01- 1u1 (ERR 01-jul-2014) a usuarios individuales registrados acceder a la USP-NF a
2012
través de la Internet. La versión en memoria flash USB
* Un número o fecha en subíndice indica el IRA, el Boletín de Revisión o
brinda a los usuarios acceso directo a los compendios
USP-NF en sus computadoras sin necesitar acceso a la Inter-
el Suplemento donde la revisión apareció por primera vez.
** Un ejemplo de una revisión que se oficializó en los compendios
net. Los formatos electrónicos se actualizan en forma acu-
mulativa para integrar el contenido de los Suplementos. El
USP-NF sería &u1Pi1.
formato en línea de la USP-NF se actualiza utilizando íconos
La siguiente tabla presenta los símbolos y fechas oficiales
a
vinculados texto oficial en el sitio Web de la USP [Boletines
de Revisión (Revision Bulletins), Anuncios de Revisión Inter-
para los IRA y los Suplementos de los compendios USP 37-NF media (IRAs), Fe de Erratas y Armonización en Etapa 6] que
32. aún no ha sido publicado en los compendios USP-NF o sus
Suplementos.
Fechas Oficiales y Símbolos
Para los Anuncios de Revisión Intermedia y los Suplementos de los
Compendios USP 37-NF 32 ÓRGANOS DE GOBIERNO, DE ESTABLECIMIENTO DE
NORMAS Y DE ASESORAMIENTO DE LA USP
Anuncio de
Revisión In-
Suple- termedia
Los órganos de gobierno, de establecimiento de normas y
mento Propuesto Fecha Oficial Símbolos
de asesoramiento de la USP incluyen la Convención de la
USP, la junta Directiva, el Consejo de Expertos y sus Comi-
40(1) 1 º de julio de • Y•(IRA 01-¡ul-2014)
tés de Expertos, Paneles de Expertos y personal. Otros cuer-
2014
pos de voluntarios incluyen Foros de Partes Interesadas,
1 º de agosto de •y.1 S(USPF) Equipos de Proyecto y Grupos de Asesoramiento, que ac-
2014 túan en calidad de asesores brindando su opinión a los ór-
40(2) 1º de septiembre • Y•(IRA 01-sep-2014) ganos de $]Obierno, de establecimiento de normas y de ad-
de 2014 ministracion de la USP.
40(3) 1º de noviembre •ye(IRA 01-nov-2014) Convención de la USP-La composición de la Conven-
de 2014 ción de la USP se determina de manera tal que se asegure
2 1 º de diciembre de •y.2s (U51'37) una representación global de todos los sectores del sistema
2014 de salud, con énfasis en los profesionales del cuidado de la
40(4) 1º de enero de • Y•<IRA 01-ene-2015)
salud, dado el legado de los mismos en la USP (ver la sec-
2015 ción Historia). Los Delegados de las organizaciones miembro
40(5) 1 º de marzo de • Y•(IRA Ol-mar-2015)
de la Convención con derecho a voto eligen al Presidente,
al Tesorero y a otros miembros de la Junta Directiva así
2015
• como también al Consejo de Expertos. También adoptan las
40(6) 1ºde mayo de Y•<IRA 01-rnay-2015)
resoluciones que guían la dirección estratégica de la USP y
2015
enmiendan los Estatutos de la USP. La Convención de la
Asimismo, en la versión en línea de los compendios USP se reúne una vez cada cinco años; la última reunión se
USP-NF, las monografías y Capítulos Generales que han sido llevó a cabo en abril de 201 O en Washington, D.C. La sec-
revisados, pero que aún no se han publicado en los com- ción Integrantes incluye un listado actualizado de los Delega-
pendios USP-NF ni sus Suplementos (p.ej., como Revisiones dos de la Convención de la USP con derecho a voto.
Aceleradas) incluirán íconos vinculados a la página en el sitio junta Directiva-La Junta Directiva de la USP es respon-
Web de la USP donde se puede revisar el nuevo texto ofi- sable de la gestión de los asuntos comerciales, las finanzas y
cial. Estos íconos también estarán vinculados a las Revisiones los bienes de la USP. Durante los cinco años que dura su
Aceleradas [p.ej., Boletines de Revisión (Revision Bul/etins), gestión, la Junta define la dirección estratégica de la USP
Anuncios de Revisión Intermedia (IRAs) y Fe de Erratas] y Ar- mediante ·una planeación estratégica y decisiones que ata-
monización en Etapa 6 (ver a continuación la sección Activi- ñen a operaciones y políticas clave. Un listado con los nom-
dades de Armonización). bres de los miembros de la Junta Directiva del ciclo
Comentarios-Para las revisiones que se publican para su 2010-2015 figura en la sección Integrantes.
revisión y comentarios públicos en el PF, la propuesta puede Consejo de Expertos del Consejo de Expertos-El Con-
oficializarse o, en su defecto, republicarse en el PF para revi- sejo de Expertos es el órgano gue establece las normas de la
sión y comentarios adicionales. Si se reciben comentarios USP. A partir de esta publicacion, éste se compone de 26
adicionales, estos son considerados e incorporados por el miembros, cada uno de los cuales preside un Comité de
Comités de Expertos según corresponda. Para los casos en Expertos. Los miembros del Consejo de Expertos son elegi-
los que las propuestas se oficialicen sin necesidad de repu- dos para periodos de cinco años por la Convención de la
blicación en el PF, se publica un resumen de los comentarios USP o, para los Presidentes de Comités de Expertos creados
recibidos junto con las respuestas pertinentes del Comité de en medio de un ciclo, son elegidos por el Consejo de Exper-
Expertos en el apartado Comentarios del sitio Web de la USP tos en funciones y rigen hasta completar el ciclo. Estos Presi-
al momento de la publicación de la revisión. dentes eligen a su vez a los miembros de sus Comités de
Los Comentarios no forman parte del texto oficial y no Expertos. Los Comités de Expertos son responsables del con-
están destinados para su aplicación por parte de autoridades tenido de las publicaciones oficiales autorizadas de la USP
reglamentarias, sino gue explican los fundamentos de las (ver la Figura 7). El Comité Ejecutivo del Consejo de Exper-
respuestas del Comite de Expertos a los comentarios públi- tos incluye a todos los Presidentes de los Comités de Exper-
cos. En caso de discrepancia entre el contenido de los Co- tos y proporciona directivas generales, constituye un órgano
mentarios y el texto oficial, el texto oficial prevalecerá. En de apelaciones y cumple con otras funciones que respaldan
caso de controversia o cuestionamiento sobre la interpreta- las operaciones del Consejo de Expertos.
Paneles de Expertos-El Presidente del Consejo de Ex-
pertos puede nombrar Paneles de Expertos para que colabo-
x Misión y Prefacio USP 37

2010-2015
Calidad de Cuidados
de la Salud Consejo de Expertos Estándares de Referencia

1-Nornenctatura: -¡
1 Seguridad y 1

l---
1 Etiquetado
[ T. Reinders 1 Capítulos Generales
--·------

Apoyo para Análisis -----~

Quimico Microbiología Estadísticas
Información
Terapéutica y L__Tc_·W:..:.o"°z.:-:ni°"ak'---....J -~~~=--~ '--'-J._Ak_e_rs_~ R. Singer
Formularios
N J Braden Análisis
Toxicología
Físico
Í. Preparación! G. An1idoí1 R. O_~terf~~ _J
, Magistral 1

1
, G. Davidson

Suplementos Dietéticos y
USP Químicos USP Productos Biológicos wtg;¡¡;mmum Alimentos
Monografías Monografías Suplementos Ingredientes
Monografías Monografías Excipientes
Productos Productos
Moléculas Moléculas Biológicos y
Dietéticos Alimenticios
Biológicos y
Pequeñas 1 Pequeñas 2 Biotecnología 1 Biotecnología 2 L. Block D. Gorecki A. Ebert
G. Van Buskirk E. Parente M. Mulkerrin J. Huxsoll

Monografías Monografías
Moléculas Moléculas
Pequeñas 3 Pequeñas 4
B. Olsen M. (utrera

MC Químicos MC Productos Biologicos MC Excipientes MC Herba/ Medicines Compendium

Asia nenta
ur~~ 1 b1r~~~f~l)
Químicos Quimicos Pro uctos Sur Asia
(Sur Asia) (América Latina) Biológicos (India) (China)
A.R. Gomas l. Santoro D. Patankar J. Tu S.S. Handa Z. ian
Químicos
(Europa E.)
Presidente, por determinar
~XEC21/G Co,1c1lofExperls\BIN\ 201).05

Figura 1. Consejo de Expertos de la USP para el periodo 201 0-2015

ren con el Consejo de Expertos mediante recomendaciones su oficina central de Rockville, Maryland, EE.UU. y alrededor
a Comités de Expertos específicos en respuesta a un en- del mundo, incluyendo los laboratorios en Hyderabad, India;
cargo específico consecuente con el Plan de Trabajo del Co- Shangai, China; y San Pablo, Brasil; una oficina de gestión
mité de Expertos. Los Paneles de Expertos se encuentran en de cuentas en Basilea, Suiza; un sitio de capacitación en
constante formación y sus temas y miembros se presentan Acera, Ghana; y una oficina de Promoción de la Calidad de
en la sección de Integrantes. los Medicamentos [Promotin9 the Quality of Medicines,
Foros de Partes Interesadas y Equipos de Proyecto-La (PQM, por sus siglas en ingles)] en Addis Ababa, Etiopía.
USP ha formado varios Foros de Partes Interesadas y Equipos
de Proyecto a nivel nacional e internacional para intercam- NORMAS Y PROCEDIMIENTOS
biar información acerca del uso e implementación de las
normas de la USP. Los Foros de Partes Interesadas puede
formar Equipos de Proyecto para trabajar en temas seleccio- Documentos Rectores-Las normas de los compendios
nados. A continuación se presenta una lista actualizada de USP-NF gozan de un gran reconocimiento porque son nor-
los Foros de Partes Interesadas de la USP. mas autorizadas, tienen fundamento científico y se estable-
Foros de Partes Interesadas en América del Norte (Es- cen a través de un proceso transparente y fiable. Ver la sec-
tados Unidos de América y Canadá) ción Acta Constitutiva en este libro; los Estatutos y las
• Prescripción/No prescripción Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos están dispo-
• Suplementos Dietéticos nibles en la página web de la USP (www.usp.org). Colecti-
• Excipientes vamente, estos documentos sirven como principios rectores
• Ingredientes Alimenticios de las actividades referentes al establecimiento de normas
• Medicamentos Veterinarios para el personal y los colaboradores voluntarios de la USP.
Foros Internacionales de Partes Interesadas Conflictos de Intereses-Las disposiciones de la USP res-
• India pecto de los Conflictos de Intereses exigen que todos los
• México miembros del Consejo de Expertos, sus Comités de Exper-
• Brasil tos, los Paneles de Expertos, la Junta Directiva y el personal
• Otros que trabaje en puestos clave declaren cualquier interés eco-
La USP también realiza Simposios Científicos y sobre Nor- nómico o de otro tipo que pudiera interferir con sus funcio-
mas en los Estacjos Unidos, India, China, América Latina, nes como voluntarios de la USP. A los miembros de la Junta
Medio Oriente/ Africa del Norte y en otras regiones del Directiva, del Consejo de Expertos y de sus Comités de Ex-
mundo. pertos se les requiere servir a la USP en su capacidad indivi-
dual de expertos, sin responder a ningún interés externo y
Personal-La USP cuenta con una plantilla superior a no se les permite tomar parte en la discusión final ni votar
800 científicos, profesionales y empleados administrativos en en ningún caso en los que surja un conflicto de intereses o
 USP 37 Misión y Prefacio xi

Una parte interesada, miembro de un Com1te de Expertos \E()

de la USP o personal de la USP propone el desarrollo de una
monografía o capítulo general nuevo o revsión de uno vigente.

1 La propuesta se publica en el Pharmacope1a/ Forum (PF)

~rante un periodo de 90 días para recibir comentarios públicos.

i
~-------·-·---------------------------------

El EC determina si una propuesta debería avanzar basándose en el

carácter y relevancia de los comentarios pUblicos, y decide si ésta
se somete a la etapa de Remisión. Aplazamiento. o Cancelación.

(Remisión) (Aplazamiento) (Cancelación)

Una propuesta puede remitirse Una propuesta aplazada puede Una propuesta cancelada puede presentarse
para votación en su forma remitirse en una fecha futura de nuPvo en PI PFdespués de una
original o modificada. o presentarse de nuevo en el PF. reevaluación por el personal de la USP y el EC.

El EC vota sobre una propuesta.

(Aprobada) (No Aprobada)

La propuesta se publica en los próximos La propuesta puede cancelarse, someterse
compendios USP-NF o Suplemento y a votación con modficaciones en una
se oficializa según la fecha indicada. fecha futura o presentarse de nuevo en el PF.

Figura 2. Proceso de Revisión Pública para el Establecimiento de Normas de la USP

parezca haberlo. Los miembros de los Paneles de Expertos
únicamente proveen asesoría y pueden discutir y votar sobre
temas que reflejen los puntos de vista de partes interesadas
externas, siempre que se haya revelado todo interés y cual-
quier conflicto notorio de forma oportuna y adecuada y que
éste haya sido comunicado al Comité de Expertos pertinente
junto con las recomendaciones del Panel de Expertos.
Confidencialidad y Divulgación de Documentos-Los
miembros del Consejo de Expertos, los Comités de Expertos
y Paneles de Expertos firman acuerdos de confidencialidad,
de conformidad con la Política de Confidencialidad de la
USP y las disposiciones de confidencialidad de las Normas y
Procedimientos del Consejo de Expertos. La Política de Divul-
gación de Documentos de la USP, disponible en el sitio Web
de la USP, contribuye a lograr la transparencia en el proceso
de establecimiento de normas haciendo que la información
se encuentre a disposición del público y a la vez protege a
los fabricantes y a otros que presenten informacion confi-
dencial ante la USP.
Autoridad de Publicación-Los compendios USP-NF se
publican de conformidad con los Propósitos del Artículo 11
de los Estatutos de la USP, el cual indica que "El propósito
por el que se forma la Convención se establece en el Acta
Constitutiva e incluye el desarrollo y la difusión de normas
públicas para medicamentos y otros artículos, así como la
participación en programas relacionados con la salud pú-
blica".
PROCESO DE REVISIÓN DE LOS COMPENDIOS USP-NF
Participación Pública-Si bien el Consejo de Expertos de
la USP constituye el órgano encargado de tomar decisiones
en última instancia sobre las normas de USP-NF, estas nor-
mas se desarrollan mediante un proceso excepcional de par-
ticipación pública e interacción sustancial entre la USP y sus
partes interesadas, tanto a nivel nacional como interna-
cional. La participación en el proceso de revisión es el resul-
tado del apoyo que brindan muchos individuos y grupos,
así como organizaciones científicas, técnicas y comerciales.
Actualizaciones a los Compendios USP-NF-La USP
tiene varios mecanismos para actualizar los compendios
USP-NF con nuevas monografías o revisiones a monografías
vigentes. Un mecanismo es el modelo de donante, en el
cual una monografía o capítulo de información general es
presentado de forma voluntaria a la USP por fabricantes u
otras partes interesadas. En este caso, el donante presenta la
información mediante una Solicitud de Revisión. La USP ha
preparado un documento titulado Pautas para la Presenta-
ción de Monografías a fin de facilitar la presentación de mo-
nografías [disponible en www.usp.org, buscar en Mono-
graph Submission Guidelines (Pautas para la Presentación de
Monografías). Asimismo, la USP actualiza las normas a través
de los proi:edimientos desarrollados por los laboratorios de
la USP. Los laboratorios de la USP pueden desarrollar proce-
dimientos individuales de identificación, valoración e im-
puerzas para su inclusión en una norma propuesta. La USP
también colabora con otras farmacopeas para incorporar
normas ya desarrolladas a los compendios USP-NF. Todas las
normas independientemente de la fuente, se presentan en
forma de una propuesta en el PF para su revisión y comen-
tario público. La Figura 2 muestra el proceso de revisión y
comentario público y el desarrollo de las normas.
Trabajo Conjunto con la Administración de Alimentos
y Medicamentos de los Estados Unidos (Food and Drug
Administration o FDA)-Conforme a lo especificado por la
ley de los EE.UU., la USP trabaja con el secretario del De-
partment of Health and Human Services (Secretaría de Salud
y Asuntos Sociales), principalmente a través de la FDA. La
USP trabaja de distintas formas con dicha agencia, pero la
interacción principal se da mediante el Programa de Enlaces
de la FDA. El cual permite que representantes de este orga-
nismo participen en las reuniones de los Comités de Exper-
tos y de los Paneles de Expertos, con lo que se facilita la
interacción entre el personal científico de la FDA y los Comi-
tés de Expertos. El personal de los Centros de la FDA res-
ponsable de revisar las actividades farmacopeicas propor-

xii Misión y Prefacio
ciona oportunidades y vínculos específicos para el inter-
cambio de comentarios. El Dr. Paul Seo del Center for Drug
Evaluation and Research (Centro de Evaluación e Investiga-
ción de Medicamentos) es el contacto principal para los te-
mas farmacopeicos entre la FDA y la USP. La USP trabaja
mediante otras formas con la FDA. Entre las demás activida-
des que la USP lleva a cabo con la FDA se incluyen la cola-
boración sobre temas específicos tales como la moderniza-
ción de monografías y las actividades de trabajo en el
ámbito internacional.
RECONOCIMIENTO LEGAL
Reconocimiento de USP-NF-Los compendios USP-NF
están reconocidos por la legislación y se usan en muchos
paises del mundo. En _los Estados Unidos~ l_a Ley F~&C (Ley
sobre Alimentos, Medicamentos y Cosmet1cos) define el ter-
mino "compendio oficial" para referirse a la USP oficial, al
NF oficial, a la Farmacopea Homeopática de los Estados Uni-
dos de América oficial o a cualquiera de sus suplementos.
Según se indica a continuación (y en la sección 2.30 de las
Advertencias Generales), las normas USP-NF desempeñan un
papel en las disposiciones sobre adulteración y rotulación
incorrecta (misbranding) de la Ley FD&C [las cuales se apli-
can también a productos biológicos, que constituyen un
subconjunto de medicamentos bajo la Public Health Service
Act (Ley de Servicios de Salud Pública)]. La USP no desem-
peña ningún papel en la imposición del cumplimiento de
estas ni otras provisiones que reconozcan las normas de los
compendios USP-NF, al ser aquélla una responsabilidad de
la FDA y demás autoridades gubernamentales en los Estados
Unidos de América y demás países.
De conformidad con las disposiciones pertinentes de la
Ley FD&C, un medicamento será considerado como rotu-
lado incorrectamente (misbranded) a menos que porte en la
etiqueta, excluyendo cualquier otro nombre comun, el nom-
bre "establecido", que por lo general es el nombre farmaco-
peico (ver la sección Nomenclatura más adelante). Un medi-
camento con un nombre reconocido en USP-NF debe
cumplir con los requisitos de identidad/identificación de su
monografía o será considerado adulterado, rotulado inco-
rrectamente, o ambos. Los medicamentos también deben
cumplir con las normas farmacopeicas de contenido, calidad
y pureza (valoraciones y pruebas para impurezas), a menos
que declaren todos los aspectos en los que difieren. La FDA
requiere que los nombres de los artículos que no son oficia-
les se distingan y diferencien claramente de cualquier otro
nombre reconocido en un compendio oficial. Los medica-
mentos con un nombre reconocido en USP-NF también se
considerarán rotulados incorrectamente a menos que cum-
plan con las normas farmacopeicas de envasado y
etiquetado.
Medicamentos-El objetivo de la USP es contar con mo-
nografías de fármacos y medicamentos en los compendios
USP-NF para todos los medicamentos aprobados por la FDA,
incluyendo los productos biológicos, y sus ingredientes. La
USP también desarrolla monografías para productos tera-
péuticos legalmente comercializados no aprobados por la
FDA; p.ej., medicamentos anteriores a 1938, medicamentos
de venta libre comercializados bajo el sistema de Monogra-
fías de Medicamentos de Venta Libre de la FDA (FDA OTC
Monograph System), suplementos dietéticos y preparaciones
magistrales. Cuando corresponda, el cumplimiento de lo es-
tipulado en una monografía de USP-NF, será obligatorio en
todo momento durante la vida de un artículo, desde su pro-
ducción hasta su caducidad.
Productos Biológicos-En los Estados Unidos de Amé-
rica, todos los productos biológicos se consideran un sub-
conjunto de medicamentos, independientemente de que es-
tén aprobados por la FDA de conformidad con la Ley FD&C
[y se les conceda una solicitud de medicamento nuevo
(NDA, por sus siglas en inglés)] o de conformidad con la
Public Health Service Act [la Ley PHS, por la que reciben
1
USP 37
una licencia de productos biológicos (BLA, por sus siglas en
inglés)]. Como resultado, todos los productos biológicos
considerados por la Ley PHS están sujetos a los requisitos
reglamentarios para medicamentos de la Ley FD&C, lo que
significa que tienen que cumplir con las disposiciones sobre
adulteración y rotulación incorrecta (misbranding) de la Ley
FD&C, incluyendo los requisitos farmacopeicos de USP-NF.
Lo anterior se aplica de la misma manera a los productos
biológicos aprobados por la vía "351 (a)" de larga data de la
Ley PHS, así como por la nueva vía "351 (k)" para productos
biosimilares agregada por la reforma de la legislación de sa-
lud de 201 O (Biologics Price Competition and lnnovation
Act, Title VII, Subtitle A of the Patient Protection and Afford-
able Care Act, Public Law 111-148 [Ley sobre Innovación y
Precios Competitivos para Productos Biológicos, Título VII, ·
Subtítulo A de la Ley de Protección y Cuidados de la Salud
Accesibles para el Paciente, Ley Pública 111-148]).
Dispositivos Médicos-El Artículo 201 (h) de la Ley
FD&C define como dispositivo a un instrumento, aparato,
artículo similar, o componente de los mismos, reconocido
en USP-NF. La Sección 502(e) de la Ley FD&C, en ausencia
de una designación de la FDA, define el nombre establecido
de un dispositivo como el título oficial en un compendio
oficial. A pesar de estas disposiciones reglamentarias, no se
cuenta con un reconocimiento del papel de la USP para
establecer normas farmacopeicas para dispositivos médicos
comp~rable al que existe para medicamentos y P~?ductos
biolog1cos. De acuerdo con la Ley de Moderrnzaoon de la
Administración de Alimentos y Medicamentos de 1997, el
Center for Devices and Radiological Health (Centro para Dis-
positivos y Salud Radiológica) reconoce normas nacionales e
internacionales, entre las que se incluyen algunas pruebas y
valoraciones de la USP para dispositivos médicos.
Suplementos Dietéticos-Las enmiendas a la Ley FD&C
de la Ley de Salud y Educación sobre Suplementos Dietéti-
cos de 1994 establecen que se puede considerar a un suple-
mento dietético mal etiquetado (misbranded) si dicho suple-
mento está cubierto por las especificaciones de un
compendio oficial (es decir, los compendios USP-NF), de-
clara cumplir con dichas especificaciones y no cumple con
las mismas. En esto difiere de un producto farmacéutico,
para el cual la conformidad con la norma farmacopeica apli-
cable es obligatoria sin necesidad de aseverarlo.
Preparaciones Magistrales-La preparación magistral
implica la preparación, mezclado, ensamblaje, alteración,
envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo u
otro artículo, derivado de una orden de un profesional de la
salud o como iniciativa a dicha orden, basándose en los
patrones rutinarios de administración regularmente observa-
dos. La USP proporciona capítulos generales y monografías
para preparaciones magistrales. Las monografías para prepa-
raciones magistrales incluyen fórmulas (ingredientes y canti-
dades), instrucciones específicas para preparar correcta-
mente la preparación en cuestión, información de envasado
y almacenamiento, información de etiquetado, pH, fechas
límites de uso basadas en estudios de estabilidad y valora-
ciones detalladas (en la mayoría de las monografías). Las
normas en los compendios USP-NF para preparaciones ma-
gistrales pueden hacerse cumplir a nivel estatal (debido a
que, tradicionalmente, la práctica farmacéutica/preparación
magistral está regulada por los consejos es~atales de ~arma­
cia), y por la FDA (puesto que las preparaoones magistrales
sujetas a regulación por parte de la FDA como medicamen-
tos, se mantienen sujetas a las disposiciones sobre adulte~a­
ción y rotulación incorrecta de la Ley FD&C, la cual requiere
el cumplimiento con las normas de USP-NF).
Nomenclatura-La USP, como miembro del Consejo de
la USAN (United States Adopted Names), trabaja para deter-
minar los nombres de fármacos y sustancias biológicas. La
autoridad de la USP para desarrollar nombres comunes ofi-
ciales está reconocida en la Sección 502(e) de la Ley FD&C
(véase también la política de la FDA sobre nombres estable-
cidos estipulada en el Título 21 del CFR, 29_9.4): pe confor-
midad con las reglas de la USP y con la leg1slac1on federal
 USP 37
aplicable, el nombre oficial es el título de un artículo reco-
nocido en los compendios USP o NF, el cual se determina al
momento de publicar una monografía para el artículo y que
incluye el nombre del artículo en el título de la monografía.
Los Comités de Expertos de la USP no pueden completar su
trabajo con una monografía aplicable sino hasta después de
que la FDA ha autorizado un medicamento o producto bio-
lógico o el Conse¡·o USAN le haya asignado un nombre. La
FDA y los tribuna es consideran que los nombres comunes
aprobados por la FDA son nombres provisorios que se usan
únicamente hasta que la USP designa un nombre. En 1962,
el Congreso otorgó a la FDA la autoridad para cambiar un
nombre designado por la USP. Si la FDA determina que un
nombre designado por la USP es excesivamente complejo o
que carece de utilidad por cualquier otra razón, dicha agen-
cia puede llevar a cabo un proceso de reglamentación me-
diante notificación y comentarios de conformidad con la
sección 508 de la Ley FD&C, y designar un nombre oficial
distinto para su uso en los compendios USP y NF. En con-
traste con el papel de la USP para designar nombres genéri-
cos, la designación de nombres comerciales patentados o
registrados (marca) es responsabilidad exclusiva de la FDA
en su interacción con los solicitantes.
El Comité de Expertos en Nomenclatura de la USP, prede-
cesor del Comité de Expertos en Nomenclatura, Seguridad y
Etiquetado para el ciclo 2010-2015, se formó en 1986 para
crear nombres reconocidos apropiados para las formas far-
macéuticas y los productos farmacéuticos combinados, y
para desarrollar políticas de nomenclatura. Hoy en día, el
Comité de Expertos en Nomenclatura, Seguridad y Etique-
tado coordina su trabajo con el Consejo de la USAN y, en la
gran mayoría de los casos, conserva el nombre existente
provisto por la USAN o por la FDA. El Comité de Expertos
en Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado también establece
la Guía de Pronunciación, que utiliza la USAN.
El Consejo de la USAN comenzó en 1 961 proporcionando
los nombres de los ingredientes de los medicamentos antes
de su comercialización. La USP participa en esta actividad
junto con la American Medical Association (Asociación Mé-
dica de los Estados Unidos), la American Pharmacists Associ-
ation (Asociación de Farmacéuticos de los Estados Unidos) y
la FDA. Las conclusiones del Consejo se incorporan en el
USP Dictionary of USAN and lnternational Drug Names (ver la
sección USP Oictionary más adelante).
Nombres Químicos y Números de Registro CAS-Los
subtítulos químicos que aparecen en las monografías son los
nombres empleados en los índices del Chemical Abstracts
Service (Servicio de Resúmenes Químicos; CAS, por sus si-
glas en inglés) de la American Chemical Society (Sociedad
Química de los Estados Unidos). Sólo se incluyen en las mo-
nografías cuyos títulos especifican sustancias que constituyen
entidades químicas definibles. El primer subtítulo es la forma
invertida del nombre químic9 sistemático desarrollado por el
CAS para los propósitos del Indice Colectivo (Collective ln-
dex o CI). El segundo subtítulo, que se presenta en forma
no invertida, es un nombre IUPAC preferido (PIN) sancio-
nado y empleado por la lnternational Union of Pure and
Applied Chemistry (Unión Internacional de Química Pura y
Aplicada o IUPAC). Los nombres IUPAC preferidos también
son usados por la Organización Mundial de la Salud (OMS).
En ocasiones, se proporciona un tercer subtítulo por razones
históricas o cuando el sinónimo emplea una convención no-
minal alternativa pero equivalente. Las monografías con sub-
títulos químicos generalmente incluyen también los números
de registro CAS. Estos números entre corchetes funcionan
de manera independiente de la nomenclatura como indica-
dores numéricos invariables de sustancias químicas singula-
res, no ambiguas, en el registro CAS y, por consiguiente,
son convenientes y gozan de un uso difundido.
Misión y Prefacio xiii
ACTIVIDADES DE ARMONIZACIÓN
Grupo de Debate Farmacopeico-La USP armoniza las
monografías de excipientes y los capítulos generales farma-
copeicos en el Grupo de Debate Farmacopeico (PDG, por
sus siglas en inglés). Este grupo incluye representantes de la
Farmacopea Europea, de la Farmacopea japonesa y de la
Farmacopea de los Estados Unidos, así como de la OMS
(como observador). De acuerdo con la definición del PDG,
"un capítulo general farmacopeico u otro documento farma-
copeico está armonizado cuando una sustancia o un pro-
ducto farmacéutico, que se analiza según el procedimiento
armonizado del documento, produce los mismos resultados
y se llega a la misma decisión respecto de aceptarlo o re-
chazarlo". El capítulo de información general (1196), Armo-
nización Farmacopeica. proporciona: (1) la Declaración de
Políticas del PDG; (2) los Procedimientos de Trabajo del PDG
y una definición de cada etapa de armonización; (3) un de-
bate; (4) un informe de estado; y (5) un glosario. El sitio
Web de la USP contiene más información sobre el PDG,
incluyendo monografías y capítulos generales que han com-
pletado las etapas de 1-6 del proceso de armonización far-
macopeica que resulta en texto aprobado de Armonización
en Etapa 6 de USP.
Otras Actividades de Armonización-La USP participa
en diversas actividades de armonización que incluyen a to-
das las farmacopeas independientes. Estas actividades, ac-
tualmente en desarrollo, se enfocan en Buenas Prácticas Far-
macopeicas, así como fármacos y medicamentos
armonizados.
OTROS COMPENDIOS DE LA USP
USP Medicines Compendium-EI USP Medicines Compen-
dium (MC) es un compendio en línea que incluye monogra-
fías, capítulos generales y materiales de referencia para me-
dicamentos químicos y biológicos adecuados y sus
ingredientes, aprobados por las autoridades reglamentarias
nacionales en cualquier país. El propósito del MC es ayudar
a garantizar que estos medicamentos sean de buena calidad
mediante el ofrecimiento de normas públicas y materiales
de referencia pertinentes y actualizados. Las normas del MC
están disponibles para fabricantes, compradores, autoridades
reglamentarias nacionales y demás interesados, para asegu-
rar el cumplimiento de un medicamento con las normas del
MC mediante análisis. El MC no incluye normas para alimen-
tos o para medicamentos/suplementos dietéticos tradiciona-
les. El MC está disponible en www.usp-mc.org
USP on Compounding: A Cuide for the Compounding
Practitiof!er-EI USP on Compounding es un compendio elec-
trónico que incluye todos los capítulos generales que se en-
cuentran en los compendios USP-NF relacionados con la
preparación magistral, además de capítulos generales de
sustento a los que se hace referencia en los capítulos de
preparación magistral y en las Advertencias y Requisitos Gene-
rales USP-NF. El propósito de USP on Compounding es pro-
porcionar acceso conveniente a los capítulos generales para
los profesionales encargados de la preparación magistral.
USP Herbal Medicines Compendium-EI USP Herba/ Medi-
cines Compendium (HMC) es un compendio en línea que
ayudará a garantizar la calidad de los ingredientes botánicos
usados en los medicamentos botánicos. Las monografías del
HMC proporcionan especificaciones de calidad-pruebas,
procedimientos y criterios de aceptación-con procedimien-
tos analíticos validados y materiales de referencia relaciona-
dos que facilitan la evaluación del cumplimiento. El HMC
puede ayudar a fabricantes de ingredientes, fabricantes de
productos botánicos, agencias reglamentarias y otras partes
interesadas en la evaluación del cumplimiento de los ingre-
dientes botánicos medicinales con normas públicas indepen-
dientes y para controlar la calidad de artículos que se co-
xiv Misión y Prefacio
mercializan internacionalmente. El HMC está disponible en
hmc.usp.org.
USP Dietary Supplements Compendium-EI Oietary Supple-
ments Compendium combina, en dos volúmenes, las normas
USP-NF para suplementos dietéticos, normas e información
del Food Chemicals Codex, documentos reglamentarios y de
la industria, así como otras herramientas y recursos. Se pu-
blica cada dos años en una edición impresa de tapa dura.
Food Chemica/s Codex-EI Food Chemicals Codex (FCC) es
un compendio reconocido internacionalmente de normas de
monografías y pruebas de pureza y calidad para ingredien-
tes alimenticios, p.ej. conservantes, saborizantes, colorantes
y nutrientes. El FCC se publica cada dos años, con suple-
mentos cada seis meses, y está disponible en formato im-
preso y electrónico. Las revisiones propuestas al FCC están
disponibles para su revisión y comentario público a través
del FCC forum, al cual se puede acceder de manera gratuita
en forum.foodchemicalscodex.org.
OTROS RECURSOS DE LA USP
Chromatographic Columns-Esta exhaustiva publicación
de referencia, previamente titulada "Chromatographic Rea-
gents (Reactivos Cromatográficos)", ofrece información deta-
USP 37
liada, necesaria para llevar a cabo los procedimientos croma-
tograf1cos 1nclu1dos en USP-NF. La publicación
Chromatographic Columns lista los nombres comerciales de
los reactivos para columna citados en todas las propuestas
de procedimientos analíticos nuevos o revisados para croma-
tografía de gases o de líquidos publicados en el PF desde
1980. La publicación Chromatographic Columns también
ayuda a mantener un registro de los reactivos que se usaron
para validar los procedimientos analíticos que se han oficiali-
zado. El listado de reactivos para columna con sus marcas se
actualiza bimestralmente y se publica en el sitio Web de la
USP.
USP Dictionary-EI USP Oictionary of USAN and /nterna-
tional Drug Names ofrece, en un solo volumen, los Nombres
Adoptados en lo~ Estados Unidos (USAN, por sus siglas en
ingles) para los farmacos; los nombres USP-NF oficiales· las
denominaciones comunes, los nombres comerciales y quími-
cos; las fórmulas gráficas; las fórmulas y los pesos molecu-
la;es; los númer_os de registro CAS y las designaciones por
cod1go; los fabricantes de fármacos; y las categorías farma-
cológicas y terapéuticas. El USP Oictionary ayuda a asegurar
la exactitud de los siguientes puntos: etiquetado del pro-
ducto; informes, artículos y correspondencia; solicitudes re-
glamentarias de la FDA y prospectos de productos farma-
céuticos. Se publica anualmente. (Ver Nomenclatura.)
USP 37 Integrantes /Comités xv

Integrantes
Ciclo de Revisión
2010-2015
Funcionarios de la Convención de la USP, Junta
Directiva, Consejo de Expertos, Comités de
Expertos, Paneles de Expertos y Grupos Asesores

Marilyn K. Speedie, Ph.O.

Representante del Sector Farmacia
Funcionarios (2010-2015) Minneapolis, MN
Timothy R. Franson, B.S. Pharm., M.O. Jeffrey L. Sturchio, Ph.O.
Presidente Representante At Large
Washington, DC New York, NY
René H. Bravo, M.O., F.A.A.P. Thomas R. Temple, R.Ph., M.S.
Presidente Saliente Representante At Large
San Luis Obispo, CA Des Moines, IA
John E. Courtney, Ph.O. Gail R. Wilensky, Ph.O.
Tesorero Representante At Large
Bethesda, MD Bethesda, MD
Susan S. de Mars, J.O. Roger L. Williams, M.O.
Secretaria Director Ejecutivo
Rockville, MD (ex-officio)
Rockville, MD

Junta Directiva (2010-2015) Consejo de Expertos (2010-2015)

Ouane M. Kirking, Pharm.O., Ph.O.
Presidente Roger- L. Williams, M.O.
Representante del Sector Farmacia Presidente, Consejo de Expertos
Ann Arbor, MI Rockville, MD
Carolyn H. Asbury, Ph.O., Sc.M.P.H. James E. Akers, Ph.O.
Representante del Interés Público Presidente, Capítulos Generales-Microbiología
New York, NY Leawood, KS
Robert L. Buchanan, Ph.O. Gregory E. Amidon, Ph.O.
Representante At Large Presidente, Capítulos Genera/es-Análisis Físico
College Park, MD Ann Arbor, MI
Michael O. Maves, M.O., M.B.A. Lawrence H. Block, Ph.O.
Representante del Sector Medicina Presidente, Monografías-Excipientes
Millwood, VA Pittsburgh, PA
Thomas E. Menighan, B.S. Pharm., M.B.A., Se.O., Matthew W. Borer, Ph.O.
F.A.Ph.A. Presidente, Estándares de Referencia
Representante At Large lndianapolis, IN
Washington, DC Michael A. Cutrera, M.Sc.
Robert M. Russell, M.O. Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 4
Representante del Sector Medicina Lan~horne, PA
Arlington, MA Gig1 S. Oavidson, B.S.Pharm., OICVP
Kiran Mazumdar-Shaw Presidente, Preparación Magistral
Representante At Large Raleigh, NC
Bangalore, India James E. OeMuth, Ph.O.
Presidente, Capítulos Generales-Formas Farmacéuticas
xvi Comités /Integrantes USP 37

Madison, WI
Andrew G. Ebert, Ph.D.
Presidente, Monografías-Ingredientes Alimenticios Paneles de Expertos para el Comité
Sandy Springs, GA Ejecutivo del Consejo de Expertos
Mary G. Foster, Pharm.D., BFA
Presidente, Capítulos Genera/es-Envasado,
Almacenamiento y Distribución Panel de Expertos para la Traducción al Español
Philadelphia, PA Presidente
ENRIQUE FEFER, PH.D.,
Antony Raj Gomas, Ph.D. Peggy Casanova, M.Sc.; Ofelia Espejo, Ph.D.; Lidiette
Presidente, USP Medicines Compendium-Sur Asia Fonseca González, M.Sc.; José Juarez Eyzaguirre, Ph.D.;
Hyderabad, India Monica l. Hirschhorn, Ph.D.; José María Parisi, M.Sc.;
Dennis K.J. Gorecki, B.S.P., Ph.D. Luisa Fernanda Ponce D'León Quiroga, Ph.D.; Osear
Presidente, Monografías-Suplementos Dietéticos Quattrocchi, M.Sc.; Caroline R. Weinstein-Oppenheimer,
Saskatoon, SK, Canada Ph.D.
Jean F. Huxsoll, Ph.D.
Presidente, Monografias-Productos Biológicos y
Biotcrnologia 2 Comités de Expertos de la Farmacopea
Emeryville, CA
Michael G. Mulkerrin, Ph.D. de los Estados Unidos de América
Presidente, Monografías-Productos Biológicos y
Biotecnología 1 Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado
Redwood City, CA THOMAS P. REINDERS, PHARM.D., Presidente
Bernard A. Olsen, Ph.D. Loyd V. Allen, Ph.D.; Mary B. Baker, M.B.A., Pharm.D.;
Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 3 Lawrence H. Block, Ph.D.; Dawn M. Boothe, D.V.M.,
West Lafayette, IN Ph.D.; David H. Campen, M.O.; Mrunal S. Chapekar,
Robert E. Osterberg, Ph.D. Ph.D.; Stephanie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.; Steven J.
Presidente, Toxicología Dentali, Ph.D.; Dennis E. Doherty, M.O.; Abraham G.
Vienna, VA Hartzema, Pharm.D., Ph.D., MSPH; William M. Heath, B.
Ernest Parente, Ph.D. S. Pharm, MBA; William M. Heller, Ph.D.; Kent T.
Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 2 johnson, M.S.; Donald S. MacLean, Ph.D.; joan C. May,
Overland Park, KS Ph.D.; Ginette A. Pepper, R.N., Ph.D., FAAN; joanne G.
Dhananjay Patankar, Ph.D. Schwartzberg, M.O.; Debora J. Simmons, R.N., M.S.N.; R.
Presidente, USP Medicines Compendium-Productos William Soller, Ph.D.; Kailas Thakker, Ph.D.; Thomas Tice,
Biológicos Ph.D.; Theodore G. Tong, Pharm.D.; jeanne Tuttle, B.S.
Bangalore, India Pharm.; Ping Wang, M.S.; Anthony Wong, M.O., Ph.D.
Thomas P. Reinders, Pharm.D.
Presidente, Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado Panel de Expertos en Directrices Modelos para
Richmond, VA Medicare-CONCLUIDO
Maria lnes R.M. Santoro, Ph.D. DAVID H. CAMPEN, M.O., Presidente
Presidente, USP Medicines Compendium-América Latina Nancy jo Braden, M.O.; Chester B. Good, M.O., MPH;
Sao Paulo, Brasil Roy Guharoy, Pharm.D., MBA; Raymond Hohl, M.D.,
Robert R. Singer, M.Sc. Ph.D.; Arthur l. jacknowitz, Pharm.D.; Ronald P.
Presidente, Estadística jordan, R.Ph., APhA; Rice C. Leach, M.D., MSHSA;
Union City, CA David B. Lorber, M.D., FCCP; Raymond C. Love,
Jiasheng Tu, Ph.D. Pharm.D., FASHP; Philip Marcus, M.D., MPH; Gary
Presidente, USP Medicines Compendium-Asia Oriental Matzke; joel S. Mindel, M.D.; Mark Noga, Pharm.D.;
Nanjing, Jiangsu, China Charles D. Ponte, Pharm.D.; N. Lee Rucker, MSPH;
Glenn A. Van Buskirk, Ph.D. Melody Ryan, Pharm.D., MPH; joanne G.
Presidente, Monografías-Moléculas Pequeñas 1 Schwartzberg, M.D.; Brian K. Solow, M.D.; Robert L.
Basking Ridge, NJ Talbert, Pharm.D.; Dennis P. West, Ph.D.
Wesley E. Workman, Ph.D.
Presidente, Capítulos Genera/es-Análisis Biológico Panel de Expertos en Etiquetado de Envases de
Chesterfield, MO Medicamentos de Venta Bajo Receta
Timothy J. Wozniak, Ph.D. jOANNE G. SCHWARTZBERG, M D Y GERALD MCEVOY, PHARM.D
Presidente, Capítulos Genera/es-Análisis Químico Ca-Presidentes
lndianapolis, IN Cindy Brach, MPP; joan E. Kapusnik-Uner, Pharm.D.;
Sandra Leal, Pharm.D.; Linda L. Lloyd, M.Ed.; Melissa
A. Madigan, Pharm.D.; Daniel G. Morrow, Ph.D.; Ruth
Comités de Expertos (2010-2015) M. Parker, M.O.; Thomas P. Reinders, Pharm.D.;
William H. Shrank, M.D.; Patricia E. Sokol, R.N., j.D.;
[Nota-El siguiente listado de Comités de Expertos in- Darren K. Townzen, MBA; jeanne Tuttle, Pharm.D.;
cluye los Paneles de Expertos que asesoran a Comités de Michelle D. Wiest, Pharm.D.; Michael S. Wolf, Ph.D.,
Expertos específicos. El listado de Paneles de Expertos y MPH
sus miembros representa a aquellos Paneles formados y Panel de Expertos en Pronunciación
aprobados en su totalidad hasta septiembre de 2012. WILLIAM M. HELLER, PH.D' Presidente
Los Paneles de Expertos se forman y desintegran con- Mary B. Baker, Pharm.D.; Stephanie Y. Crawford,
Ph.D.; Kent T. Johnson, M.S.; David F. Long, Ph.D.;
tinuamente durante todo el ciclo de revisión de la USP, Joan C. May, Ph.D.; Anthony Palmieri, Ph.D.; Thomas
por lo que en un futuro se publicarán otras listas de P. Reinders, Pharm.D.
miembros.)
Monografías-Moléculas Pequeñas 1
GLENNA VAN BUSKIRK, PH.D' Presidente
jay C. Brumfield, Ph.D.; Elizabeth B. Cariello; David A.
Fay, Ph.D.; Rupa lyer, M.S.; Amy j. Karren, N.R.C.M.;
USP 37
Assad J. Kazeminy, Ph.D.; Huiyi Li, Ph.D.; Raphael M.
Ornaf, Ph.D.; jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; David F. Schuck,
Ph.D.; Nhan L. Tran, Ph.D.; Danny L. Tuck, Ph.D.
Monografías-Moléculas Pequeñas 2
ERNEST PARENTE, PH.D' Presidente
Mahmoud M. H. Al Omari, Ph.D.; Allan D. Bokser, Ph.D.;
Shrikant N. Dhumal, Ph.D.; Tina M. Engel, Ph.D.; Maria
lnes R.M. Santoro, Ph.D.; Dennis A. Stephens, Ph.D.;
Luciano Virgili, Ph.D.; Yuwen Wang, Ph.D.; Bo Wen,
Ph.D.; joseph E. Yakupkovic, Ph.D.; Patrick N. Yat, Ph.D.;
Louis W. Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Acetaminofeno
DAVID A. FAY, PH.D., Presidente
Greg J. Davies; Tina M. Engel, Ph.D.; Saulius A. Gylys;
Clifford j. Herman, Ph.D.; Poonam Pall, M.S.; Greg A.
Roberts, M.A.; David H. Rogers, Ph.D.; Gregory K.
Webster, Ph.D.; Kylen W. Whitaker, Ph.D.
Monografías-Moléculas Pequeñas 3
BERNARD A. ÜLSEN, PH.D., Presidente
Richard A. Blessing, M.S.; Thomas A. Broadbent, Ph.D.;
Nicholas Cappuccino, Ph.D., M.B.A.; lan Chung, Ph.D.;
john E. Daniels, M.S., M.B.A.; jeffrey S. Fleitman, Ph.D.;
Yuri Goldberg, Ph.D., D.Sc.; Pauline M. Lacroix, M.Sc.;
julie K. Lorenz, Ph.D.; Mark G. Papich, D.V.M., M.S.;
Donald M. Parsons, Ph.D.; David G. Reed, M.B.A.;
Thomas W. Rosanske, Ph.D.; joseph G. Stowell, Ph.D.;
Cathy L. Wood
Monografías-Moléculas Pequeñas 4
MICHAEL A. CUTRERA, M.Sc., Presidente
Lakshmi Prasad Alaparthi, Ph.D.; Mark S. Bailey; josep M.
de Ciurana; Alain Duguet, Ph.D.; Quanyin Gao, Ph.D.;
jerome M. Lewis, M.B.A., Ph.D.; Osear Liu, Ph.D.; Eugene
J. McGonigle, Ph.D.; Marian L. Meyer, M.B.A., Ph.D.;
Colin Minchom, Ph.D.; Patrick A. Noland, M.S.; Vijaya
Ramesh, B.Pharm.; Hemant Kumar Sharma, Ph.D.;
Michael J. Skibic, M.S.; William J. Taraszewski, Ph.D.;
Michiel M. Van Oort, Ph.D.; Martin J. Williamson, Ph.D.;
Steve S. Zigler, Ph.D.
Monografías-Productos Biológicos y Biotecnología 1
MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D., Presidente
jan Amstrup, Ph.D.; Parastoo Azadi, Ph.D.; Christopher J.
Burns, Ph.D.; Frederic Carriere, Ph.D.; Charles S. Craik,
Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.; Helene Gazzano-
Santoro, Ph.D.; Anne Munk jespersen; Kristian johansen,
Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Harold
N. Rode, Ph.D.; Martin Schiestl, Ph.D.; Yeowon Sohn,
Ph.D.
Panel de Expertos en Valoraciones Biológicas de
Eritropoyetina
CHRISTOPHER J. BURNS, PH.D. Y MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D.,
Ca-Presidentes
jan Amstrup, Ph.D.; Evangelos Bakopanos, Ph.D.; jill A.
Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Helene Gazzano-Santoro,
Ph.D.; Martin Schiestl, Ph.D.
Panel de Expertos en Glucagón
HAROLD RODE, PH.D., Presidente
jan Amstrup, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.; Adrian
F. Bristow, Ph.D.; Anne M. jespersen; Elizabeth Clark
Kramer, Ph.D.
Panel de Expertos en Insulina
HAROLD RODE, PH.D., Presidente
jan Amstrup, Ph.D.; Wilfried P. Arz, Ph.D.; Matthew
W. Borer, Ph.D.; Chris j. Burns, Ph.D.; Helene
Gazzano-Santoro, Ph.D.; Morten Hach, M.S.; Anne M.
jespersen; Elizabeth Clark Kramer, Ph.D.; Martin
Schiestl, Ph.D.
Integrantes /Comités xvii
Panel de Expertos en Heparinas de Bajo Peso
Molecular
El AINF GRAY, PH.D. Y EDWARD K. CHESS, PH.D., Ca-
Presidentes
Christopher P. Bryant, Ph.D.; lshan Capila, Ph.D.;
Venkatesan S. Chidambaram, Ph.D.; Soby M. Fennell;
Gyongyi S. Gratzl, Ph.D.; Kristian johansen, Ph.D.;
Barbara Mulloy, Ph.D.; Anna K.Y. Nordin; Bruna
Parma, M.Sc.; Patrick A. Rousseau, Ph.D.; Zachary
Shriver, Ph.D.; Christian Viskov, Ph.D.
Panel de Expertos en Preparaciones Farmacéuticas
Enzimáticas
FREDERIC CARRIERE, PH.D., Presidente
Anisha Akula, Ph.D.; Gregory M. Beck, Ph.D.; Charles
S. Craik, Ph.D.; Luigi Ghidorsi; Andreas Koerner;
Thomas Langdon; Claus Middelberg, f'h.D.; Henry
Francis Motkowski, M.A.; Tibor Sipos, Ph.D.
Panel de Expertos en Péptidos Terapéuticos
MICHAEL R. DEFELIPPIS, PH.D., Presidente
lvo F. Eggen, Ph.D.; Brian P. Gregg, M.B.A.; Marion
King, Ph.D.; Narendra R. Patel, M.Sc.; Marie-Aimee
Plancquaert, Ph.D.; Harold Rode, Ph.D.; Raimon
Rubires, Ph.D.; Firuz Shakoori, Ph.D.; Ved P. Srivastava,
Ph.D.; Aleksander Swietlow, Ph.D.; Michael S.
Verlander, D.Phil.
Panel de Expertos en Heparinas no Fraccionadas
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Edward K. Chess, Ph.D.; Huihong Fan, Ph.D.; Gyongyi
S. Gratzl, Ph.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Kristian johansen,
Ph.D.; jian Liu, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Zachary
Shriver, Ph.D.; Pearle Torralba, Ph.D.; Christian Viskov,
Ph.D.
Monografías-Productos Biológicos y Biotecnología 2
jEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente
Merry L. Bain, M.S.; Barbara E. Blum, Ph.D., M.P.H.;
Pamela Clark, M.D., j.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Deepak jain,
Ph.D.; Christopher Masan, Ph.D., FRCS; Brian K.
Nunnally, Ph.D.; Nicole M. Provost, Ph.D.; William E.
Tente, M.S.; Darin J. Weber, Ph.D.; Earl K. Zablackis,
Ph.D.
Panel de Expertos en Análisis de Proteínas
Plasmáticas
TIMOTHY K. HAYES, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; joseph Bertolini, Ph.D.; Elaine
Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Dorothea Sesardic,
Ph.D.; Derek G. Toth, M.S.; Peter J. Vandeberg, Ph.D.
Panel de Expertos en Factores de Coagulación Der-
ivadÓs de Plasma y Recombinantes
jEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; Gretchen A. Elliott, M.S.; Elaine
Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Michael jankowski
Panel de Expertos en Tejidos y Productos Der-
ivados de Tejidos
DEEPAK jAIN, PH.D. y WILLIAM E. TENTE, M.S., Ca-Presidentes
Merry L. Bain, M.S.; Barbara E. Blum, Ph.D., M.P.H.;
Robert Buehler, Ph.D.; Frederick Cahn, Ph.D.; Shannon
L.M. Dahl, Ph.D.; Steven Goldstein, Ph.D.; john E.
Kemnitzer, Ph.D.; Alyce Linthurst janes, Ph.D.;
Timothy Neja, M.B.A; Darin J. Weber, Ph.D.; Wesley E.
Workman, Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Químico
TIMOTHY J WüZNIAK, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Christopher Burgess,
Ph.D.; Geoffrey P.R. Carr, Ph.D., FRSC; Pei Chen, Ph.D.;
Thomas J. DiFeo, Ph.D.; john W. Dolan, Ph.D.; Edward j.
Fletcher; john P. Hammond, FRSC; John V. Hinshaw,
Ph.D.; Paul R. Keller, Ph.D.; Nancy Lewen; Todd D.
xviii Comités / Integrantes
Maloney, Ph.D.; Nuno Matos; Ganapathy Mohan, Ph.D.;
Greg A. Pennyroyal; Melissa M. Phillips, Ph.D.; Osear A.
Quattrocchi, M.Sc.; Mark C. Roman, Ph.D.; Timothy L.
Shelbourn, M.S., M.B.A.; Teri C. Soli, Ph.D.; Daniel D.
Traficante, Ph.D.; Bruno A.R. Vrebos, Ph.D.
(761) Panel de Expertos en Resonancia Magnética
Nuclear (NMR)
DANIEL D. TRAFICANTE, PH.D., Presidente
Andreas Kaerner, Ph.D.; Andrew C. Kolbert, Ph.D., M.
T.M.; Yue Luo, Ph.D.; Joseph Ray, Ph.D.; Susan
Reutzel-Edens, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A.,
M.S.; Christina Szabo, Ph.D.; Fred Xi, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas Elementales
NANCY LEWEN, Presidente
Charles Barton, Ph.D., DABT; Courtney M. Callis,
MPH, DABT; Steven J. Dentali, Ph.D.; Anna M. Fan,
Ph.D., DABT; Edward James Fletcher; Bruce A. Fowler,
Ph.D., A.T.S.; Roland Frotschl; Assad J. Kazeminy,
Ph.D.; Richard Ko, Pharm.D., Ph.D.; Melissa M.
Phillips, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A., M.S.
Panel de Expertos en Adulteración Intencional de
Suplementos Dietéticos con Fármacos
MARK c. ROMAN, PH.D., Presidente
Joseph Betz, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; Hans Geyer,
Ph.D.; Hwee-Ling Koh, Ph.D.; Cynthia L. Morris-
Kukoski, Pharm.D.; James Neal-Kababick, B.S.; Darryl
M. Sullivan; Nicole T. Vu, Ph.D.
Panel de Expertos en Espectrometría de Masas
PAUL R. KELLER, PH.D., Presidente
Parastoo Azadi, Ph.D.; Timothy R. Baker, Ph.D.;
Geoffrey P.R. Carr, Ph.D., FRSC; Roy Dobson, Ph.D.;
Kenneth D. Greis, Ph.D.; Douglas E. Kiehl, M.S.; Mike
S. Lee, Ph.D.; Jun Wheeler, Ph.D.; Li Zang, Ph.D.
Panel de Expertos en Modernización de Pruebas
de Identificación
NANCY LEWEN, Presidente
Michelle R. Adamson; Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.;
Geoffrey P.R. Carr, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; Jonathan
W. DeVries, Ph.D.; Maryna Dmitriieva, Ph.D.; Michael
Hornig, Ph.D.; Bernard A. Olsen, Ph.D.; Jeffrey S.
Rohrer, Ph.D.; Anne M. Warner, Ph.D.
Panel de Expertos en Disolventes Residuales
OSCAR A QUATTROCCHI, M.Sc., Presidente
Coleman C. Chasteen, M.S.; John V. Hinshaw, Ph.D.;
Elizabeth C. Hoogendoorn, M.S.; Bruce P. Johnson,
Ph.D.; Eric C. Kesslen, Ph.D.; Elizabeth Kovacs; Paul W.
Lockwood, M.S.; Gregory P. Martin, M.S.; Ganapathy
Mohan, Ph.D.; Yuwen Wang, Ph.D.
Panel de Expertos en Atributos del Agua Estéril
Envasada-CONCLUIDO
ANTHONY c. BEVILACQUA, PH.D., Presidente
Dennis R. Jenke, Ph.D., M.B.A.; Max S. Lazar; Timothy
J. McGovern, Ph.D.; Rostyslaw O. Slabicky; Teri C. Soli,
Ph.D.
Panel de Expertos en Agua para Uso Analítico
TERI C. Süll, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc.,
M.Sc.; Max S. Lazar; Nancy Lewen; Bruno Rossi, M.S.
Panel de Expertos en Agua para Uso Farmacéutico
TERI C. Süll, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc.,
M.Sc.; Max S. Lazar; Rostyslaw O. Slabicky
Panel de Expertos en Espectrometría de
Fluorescencia de Rayos X-CONCLUIDO
TIMOTHY L. SHELBOURN, M.B.A., M.S., Presidente
Lora L. Brehm; W. Tim Elam; George J. Havrilla;
Andrew J. Jensen; Riitta Kaijansaari, M.Sc.; John 1.H.
USP 37
Patterson, Ph.D.; Rene E. Van Grieken, Ph.D.; Bruno A.
R. Vrebos, Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Físico
GREGORY E. AMIDON, PH.D., Presidente
Fahad Al-Jenoobi, Ph.D.; Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.;
Shaukat Ali, Ph.D.; Graham Buckton, Ph.D., O.Se., FRSC;
David J. Goldfarb, Ph.D.; Bruno C. Hancock, Ph.D.; Ravi
Harapanhalli, Ph.D.; Xiaorong He, Ph.D., M.B.A.; Stephen
W. Hoag, Ph.D.; Ronald G. lacocca, Ph.D.; Gregory P.
Martin, M.S.; Richard Meury; Prabu Nambiar, M.B.A.,
Ph.D.; James A Ponto, M.S.; Sally W. Schwarz, M.S.;
Changquan C. Sun, Ph.D.; Kevin A. Swiss, Ph.D.; Allen C.
TempTeton, Ph.D.; Dale Ene Wurster, Ph.D.; Geoff G.Z.
Zhang, Ph.D.
(1059) Panel de Expertos en Desempeño de
Excipientes
GREGORY E. AMIDON, PH.D. Y ERIC A. SCHMITT, PH.D, Co-
Presidentes
Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Lawrence H. Block, Ph.D.; Patrick Deluca, Ph.D.; Carl
Frey, M.S.; Xiaorong He, Ph.D., M.B.A.; Stephen W.
Hoag, Ph.D.; M. Sherry Ku, Ph.D.; Michelle A. Long,
Ph.D.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Prabu Nambiar,
Ph.D., M.B.A.; James A. Ponto, M.S.; Kent Sternitzke,
Ph.D.; Kevin A. Swiss, Ph.D.; Sean V. Taylor, Ph.D.
Panel de Expertos en (821) Identificación y Valora-
ción de Radionucleidos, (1821) Teoría y Práctica
de la Radioactividad y (1823) Medicamentos para
Tomografía de Emisión de Positrones
SALLY w. SCHWARZ, M.S., Presidente
James W. Brodack, Ph.D.; Cathy Sue Cutler, Ph.D.;
Jonathan M. Fitzsimmons, Ph.D.; Paula M. Jacobs,
Ph.D.; Thijs Kroon, Pharm.D.; )erome M. Lewis, Ph.D.;
Roger Moroney, M.S.; james A. Ponto, M.S.; Duann V.
Thistlethwaite, B.S.; Steven S. Zigler, Ph.D.
Panel de Expertos en Buenas Prácticas de
Documentación
KIM C. HUYNH-BA, M.S., Presidente
Kathleen V. Brady, B.S.; Frank J. Diana, Ph.D.; Lisa Ann
Fink, MBA; Craig Hamilton, Ph.D.; Judy Lin, M.S.;
Anjan K. Mittal, M.Pharm; James A. Shea, Ph.D.; Kevin
A. Swiss, Ph.D.
Panel de Expertos en Medicamentos para
Tomografía de Emisión de Positrones-Prepara-
ción Magistral-CONCLUIDO
STEVEN S. ZIGLER, PH.D., Presidente
SamueJ C. Augustine, Pharm.D., FAPhA; Marc
Berridge, Ph.D.; Joseph C. Hung, Ph.D., BCNP; Donald
R. Kinney; Maxim Kiselev, Ph.D.; Neale Scott Mason,
Ph.D.; Steve Mattmuller, M.S., R.Ph.; Sally W.
Schwarz, M.S.; )ean-Luc Vanderheyden, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas en Productos
Farmacéuticos
PRABU NAMBIAR, PH.D., M.B.A., Presidente
Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Steven W. Baertschi, Ph.D.; Judy P. Boehlert, Ph.D.;
Robert G. Bui~e,. Ph.D.; Greg J. Davies: Xi~orong He,
Ph.D., M.B.A., K1m C. Huynh-Ba, M.S., M1chael
Koberda, Ph.D.; Robert E. Osterberg, Ph.D.; Ernest
Parente, Ph.D.; David H. Rogers, Ph.D.; Mary W.
Seibel; Kevin A. Swiss, Ph.D.
Panel de Expertos en Microscopía Electrónica de
Barrido
RONALD G. IACOCCA, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Marc Mamak, Ph.D.; Richard Meury;
James P. Vitarelli, Ph.D.
USP 37
Panel de Expertos en Validación y Verificación
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente
Kimber L. Barnett, Ph.D.; Christopher Burgess, Ph.D.;
Paul D. Curry, Ph.D.; Joachim Ermer, Ph.D.; Gyongyi
S. Gratzl, Ph.D.; John P. Hammond, FRSC; Joerg
Herrmann, Ph.D.; Elizabeth Kovacs; David J. LeBlond,
Ph.D.; Rosario LoBrutto, Ph.D.; Anne K. McCasland-
Keller, Ph.D.; Pauline L. McGregor, Ph.D.; Phil
Nethercote, Ph.D.; Allen C. Templeton, Ph.D.; David
P. Thomas, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel
Panel de Expertos en Pesas y Balanzas
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente
Dirk Ahlbrecht; Cesar D. Bautista, Jr., Ph.D.; Klaus
Fritsch, Ph.D.; Robert Mielke; David Sebastian
Pattavina, M.S.; Allen C. Templeton, Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Biológico
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Robert G. Bell, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.;
Gary C. du Moulin, Ph.D.; Barry D. Garfinkle, Ph.D.;
Timothy K. Hayes, Ph.D.; Christopher Janes, Ph.D.;
Kenneth R. Miller, Ph.D.; Anthony R. Mire-Sluis, Ph.D.;
Elizabeth l. Read, M.D.; Anthony A.G. Ridgway, Ph.D.;
John A. Saldanha, Ph.D.; Junzhi Wang, Ph.D.; Teruhide
Yamaguchi, Ph.D.; Lynn C. Yeoman, Ph.D.
(1050) Panel de Expertos en Evaluación de la
Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos
Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano
o Animal
ROBERT G. BELL, PH.D., Presidente
Johannes Bluemel, Ph.D.; Jeri Ann Boose, Ph.D.;
Houman Dehghani, Ph.D.; Yuling L. Li, Ph.D.;
Raymond Nims, Ph.D.; Mark Plavsic, Ph.D.; Michael
Rubino, Ph.D.
(1102-1105) Panel de Expertos en Métodos de
Pruebas Inmunológicas-CONCLUIDO
KENNETH R. MILLER, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Yadira Hernandez Rodriguez,
Ph.D.; Rakesh Kakkar, Ph.D.; Kelledy Manson; Hersh
Mehta, Ph.D.; Patrick Niven; Steven J. Swanson, Ph.D.
(1240) Panel de Expertos en Pruebas Virales para
Plasma Humano Destinado como Intermediario de
Fabricación
JüHN A SALDANHA, PH.D., Presidente
Albrecht Groener, Ph.D.; Mary Gustafson, Ph.D.;
Douglas C. Lee, Ph.D.; Hannelore M. Willkommen,
Ph.D.
Panel de Expertos en Capítulos Generales sobre
Valoraciones Biológicas
ROBERT R. SINGER, M.Sc., Presidente
Janice D. Callahan, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini,
Ph.D.; David M. Lansky, Ph.D.; David J. LeBlond,
Ph.D.; Karen J. Roberts, R.Ph.; Timothy Schofield, M.A.
Panel de Expertos en Crioconservación
JAMES MOLDENHAUER, M.S., Presidente
Allison Hubel, Ph.D.; Elizabeth l. Read, M.D.; Yvonne
A. Reid, Ph.D.; Glyn Stacey, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas Glicoconjugadas
CHRISTOPHER JüNES, PH.D., Presidente
Paolo Costantino; Didier A. Giffroy, Ph.D.; Suresh
Karupothula, Ph.D.; Jeremy P. Kunkel, Ph.D.;
SureshBabu Rajan, M.Pharm; Nei~ Ravenscroft, Ph.D.;
Mary L. Retzlaff, Ph.D.; Marsha R1chmond, Ph.D.;
Philippe Talaga, Ph.D.
Panel de Expertos en Análisis de Glicoproteínas y
Glicanos
CHRISTOPHER JONES, PH.D., Presidente
Integrantes / Comités xix
Parastoo Azadi, Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.;
Gary Rogers, Ph.D.; Jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; Martin
Schiestl, Ph.D.; Jihong Wang, Ph.D.; Zhuchun Wu,
Ph.D.; Rebecca A. Zangmeister, Ph.D.
Panel de Expertos en Medición de Proteína de
Células Hospederas
ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Svetlana Bergelson, Ph.D.; John S.
lvancic, Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Kesh Prakash,
Ph.D.; Martin Schiestl, Ph.D.; Martin Vanderlaan,
Ph.D.; David C. Wylie, Ph.D.
Panel de Expertos en lnmunogenicidad
ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente
Viswanath Devanarayan, Ph.D.; Boris Gorovits, Ph.D.;
Shalini Gupta, Ph.D.; Eugene Koren, M.D., Ph.D.;
Valerie Quarmby, Ph.D.; Susan Richards, Ph.D.; Gopi
Shankar, Ph.D.; An Song, Ph.D.; Meena
Subramanyam, Ph.D.; Steven J. Swanson, Ph.D.;
Bonnie Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Anticuerpos Monoclonales
Recombinantes de Uso Terapéutico
ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente
Michel P. Byrne, Ph.D.; Mary E.M. Cromwell, Ph.D.; Jill
A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Michael R. DeFelippis,
Ph.D.; Siegfried Giess, Ph.D.; Steffen Cross; Alka
Kamra, Ph.D.; joseph Kutza, Ph.D.; Kenneth R. Miller,
Ph.D.; Michael G. Mulkerrin, Ph.D.; Martin Schiestl,
Ph.D.; Dieter Schmalzing, Ph.D.; Yeowon Sohn, Ph.D.;
Robin Christopher Thorpe, Ph.D.; David C. Wylie,
Ph.D.
Panel de Expertos en ADN Residual en Productos
Obtenidos por Biotecnología
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Pascal R. Anger; Jon R. Barman; Audrey Chang, Ph.D.;
Thomas E. Haemmerle, Ph.D.; Scott Kuhns, Ph.D.;
Junzhi Wang, Ph.D.; Weihong Wang, Ph.D.; Judith
Zhu-Shimoni, Ph.D.
Panel de Expertos en Medición de Proteína Total
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Methal Albarghouthi, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.;
Olivier C. Germay, Ph.D.; Anne M. Jespersen; Lars
Nygaard, M.S.; Wendy R. Safell-Clemmer, M.S.; Martin
Schiestl, Ph.D.; William M. Skea, Ph.D.; Lynn C.
Yeoman, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas Para Uso Humano--
Vacunas Virales
BARRY D. GARFINKLE, PH.D., Presidente
John G. Aunins, Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Mark
Galinski; Lucy Gisonni-Lex; John D. Grabenstein,
Ph.D.; Joan C. May, Ph.D.; Brian K. Nunnally, Ph.D.;
Cecile Maria Ponsar, Ph.D.; Silke M. Schepelmann,
Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D.
Capítulos Generales-Formas Farmacéuticas
JAMES E. DEMUTH, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Paul D. Curry, Jr., Ph.D.; Mario A.
Gonzalez, Ph.D.; Vivian A. Gray; Ralph A. Heasley, Ph.D.;
Anthony J. Hickey, Ph.D., O.Se.; Michael E. Houghton;
Munir A. Hussain, Ph.D.; Johannes Kraemer, Ph.D.; David
F. Long, Ph.D.; John W. Mauger, Ph.D.; Jolyon P.
Mitchell, Ph.D., FRSC; Beverly Nickerson, Ph.D.; Alan F.
Parr, Pharm.D., Ph.D.; Guirag Poochikian, Ph.D.; Calen
W. Radebaugh, Ph.D., R.Ph.; John G. Shabushnig, Ph.D.;
Raymond D. Skwierczynski, Ph.D.; Jasan A. Suggett,
Ph.D., M.B.A.; Kailas Thakker, Ph.D.; Thomas R. Tice,
Ph.D.; Sailesh Varia, Ph.D.; Mehran Yazdanian, Ph.D.
(1) Panel de Expertos en Inyectables
JüHN G. SHABUSHNIG, PH.D., Presidente
 xx Comités /Integrantes
Dale S. Aldrich; Lori Alquier, M.S.; Diane J. Burgess,
Ph.D.; David F. Driscoll, Ph.D.; David F. Long, Ph.D.;
Thomas R. Tice, Ph.D.; Martín Woodle, Ph.D.
(771) Panel de Expertos en Preparaciones
Oftálmicas
ASHIM K. MITRA, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Cynthia M. Bach, M.S.; Jeffrey S.
Fleitman, Ph.D.; Seshadri Neervannan, Ph.D.; Stacey
M. Platzer; George W. Tin, Ph.D.
(787) Panel de Expertos en Partículas en Inyec-
tables Biofarmacéuticos
DALE S. ALDRICH, Presidente
Mary E.M. Cromwell, Ph.D.; Paul D. Curry, Ph.D.;
Jolyon P. Mitchell, Ph.D., FRSC; Linda O. Narhi, Ph.D.;
Alla Polozova; John G. Shabushnig, Ph.D.; Satish K.
Singh, Ph.D.; Lisa A. Wenzler Savin, Ph.D.
Panel de Expertos en Cápsulas Rellenas con
Líquido
VIVIAN A. GRAY, Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; jean-Luc Colín, Ph.D.; Michael A.
Cutrera, M.Sc.; joe Fotso, Ph.D.; Munir A. Hussain,
Ph.D.; Vi N. Schmidt, M.S.; Edward Shneyvas, Ph.D.;
Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala, M.Pharm.
Panel de Expertos en Pruebas de Desempeño de
Formas Farmacéuticas Semisólidas
KAILAS THAKKER, PH.D., Presidente
Eric Beyssac, Ph.D.; Robert G. Buice, Ph.D.; Bryan
Crist; James E. De Muth, Ph.D.; Geoffrey N. Grove,
Ph.D.; L. Thomas Hall, Ph.D.; John S. Heaney;
Matthew Kersey, Ph.D.; Hans-Juergen Knitter; Patricia
L. Lee, M.S.; Patrick C. Mahn; Sam G. Raney, Ph.D.;
William M. Rosenthal; Steve W. Shaw
Panel de Expertos en los Criterios de Solubilidad
para Fármacos de Uso Veterinario
MARIO A. GONZALEZ, PH.D., Presidente
Mike Apley, DVM, Ph.D.; Bryan Crist; Robert P.
Hunter, M.S., Ph.D.; Mark G. Papich, M.S., D.V.M.;
Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; Jim E. Riviere, DVM,
Ph.D., O.Se.
Panel de Expertos en el Uso de Enzimas en la
Prueba de Disolución de Cápsulas de Gelatina
VIVIAN A. GRAY, Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; joan M. Dalla Riva Toma, Ph.D.;
Luigi Ghidorsi; Jian-Hwa Guo, Ph.D.; Feixue Han,
Ph.D.; Jian-Hwa Han, Ph.D.; Christopher T. Hosty;
Jianmei D. Kochling, Ph.D.; Johannes Kraemer, Ph.D.;
Thomas Langdon; Steven R. Leinbach; Gregory P.
Martín, M.S.; Steven M. Meyerhoffer, Ph.D.; Richard
C. Moreton, Ph.D.; Krishnaswamy S. Raghavan, Ph.D.;
Ed Shneyvas, Ph.D.; Stephen C. Tindal; Madhusudan
Vudathala, M.Pharm.; Hu Wang, M.S.
Panel de Expertos en Inspección Visual de
Parenterales
RUSSELL E. MADSEN, M.S., Presidente
Dale S. Aldrich; John D. Ayres, M.D., J.D.; Roy Cherris;
John G. Shabushnig, Ph.D.; Deborah Shnek, Ph.D.
Capítulos Generales-Microbiología
)AMES E. AKERS, PH.D., Presidente
James P. Agalloco, M.S., M.B.A.; Dilip Ashtekar, Ph.D.;
Anthony M. Cundell, Ph.D.; Russell E. Madsen, M.S.;
Karen Z. McCullough, M.S.; Jianghong Meng, Ph.D.;
Leonard W. Mestrandrea, Ph.D.; Rainer F. Newman, M.S.;
Donald C. Singer, M.S.; Scott V.W. Sutton, Ph.D.;
Edward C. Tidswell, Ph.D.
(81) Panel de Expertos en Valoración Microbiana-
Antibióticos-CONCLUIDO
THOMAS B. MAY, PH.D., Presidente
USP 37
David L. Gibbs, Ph.D.; Amy J. Karren, RM/SM; Nilesh
Prabhakar Shinde, M.S.; Brenda Sullivan
Panel de Expertos en Modernización de Valora-
ciones Microbiológicas
)AMES E. AKERS, PH.D., Presidente
Mark R. Coleman, Ph.D.; Gerald M. jensen, Ph.D.;
Ronald G. Lauback; Jeremy Lebel; Fred J. Marsik,
Ph.D.; Edgar L. Mendaros; Elizabeth A. Monnot-Chase,
Ph.D.; jorn Thyme, D.V.M.; Glenn A. Van Buskirk,
Ph.D.
Capítulos Generales-Envasado, Almacenamiento y
Distribución
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Chris Chandler, Pharm.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.;
Shirley A. Feld, M.Sc.; Dana M. Guazzo, Ph.D.; Dennis R.
Jenke, M.B.A., Ph.D.; Daniel J. Malinowski; Daniel L.
Norwood, M.S.P.H., Ph.D.; Kevin E. O'Donnell; Devinder
Pal, M.Pharm.; Diane M. Paskiet; Michael A. Ruberto,
Ph.D.; Marv D. Shepherd, Ph.D.; Sarah Skuce; Kola
Stucker, M.S.; Li Xiong, Ph.D.
(671) Panel de Expertos en Envases-Pruebas de
Desempeño
DAN J. MALINOWSKI, Presidente
Yisheng Chen, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Mary
G. Foster, Pharm.D., BFA; Hugh E. Lockhart, Ph.D.;
Dennis P. O'Reilly; Frank D. Witulski, M.S.; Li Xiong,
Ph.D.
(1118) Panel de Expertos en Dispositivos de
Monitoreo-Tiempo, Temperatura y Humedad-
CONCLUIDO
CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Presidente
Thaddeus Prusik Ph.D.; Robert H. Seevers, Ph.D.;
David A. Ulrich, M.S.; lsmail Uysal, Ph.D.
(1207) Panel de Expertos en Envasado de
Productos Estériles
DANA M. GUAZZO, PH.D., Presidente
james P. Agalloco, M.S., M.B.A.; james E. Akers, Ph.D.;
Peter Buus; Shu-chen Chen; Ronald Forster, Ph.D.; Lee
E. Kirsch, Ph.D.; Ronald Mueller; Donald C. Singer,
M.S.; David Walker
(1664) Panel de Expertos en Límites y Buenas
Prácticas de Lixiviables
DANIEL L. NORWOOD, PH.D., Presidente
Michael N. Eakins, Ph.D.; Dennis R. jenke, Ph.D.,
M.B.A.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; james O. Mullís,
M.S.; Lee M. Nagao, Ph.D.; Diane M. Paskiet; Michael
A. Rub'erto, Ph.D.; Cheryl Stults, Ph.D.
Panel de Expertos en Buenas Prácticas de
Distribución
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Gregory E. Amidon, Ph.D.; Glaucia K. Braga, Ph.D.;
Chris Chandler, Pharm.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.;
Shirley A. Feld, M.Sc.; Patricia C. Kienle, R.Ph., M.P.A.;
William A. Mixon, M.S.; Richard C. Moreton, Ph.D.;
Devinder Pal, M.Pharm.; Marv D. Shepherd, Ph.D.;
Sarah M. Skuce
Estándares de Referencia
MATTHEW w. BORER, PH.D., Presidente
Bianca Avramovitch, Ph.D.; Adrian F. Bristow, Ph.D.;
Antony Raj Gomas, Ph.D.; Shaohong Jin; Catherine A.
Rimmer, Ph.D.; lffaaz M. Salahudeen, Ph.D.; Ma
Shuangcheng, Ph.D.; Ralph E. Sturgeon, Ph.D.; Robert L.
Watters, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel
Estadística
ROBERT R. SINGER, M.Sc., Presidente
USP 37
Bruno Boulanger, Ph.D.; Richard K. Burdick, Ph.D.; J.
David Christopher, M.S.; David J. LeBlond, Ph.D.;
Anthony G. Okinczyc, M.P.H., M.B.A.; Dennis Sandell,
Ph.D.; Timothy Schofield, M.A.; Charles Y. Tan, Ph.D.;
Harry Yang, Ph.D.
Panel de Expertos en Capítulos Generales sobre
Valoraciones Biológicas
ROBERT R. SINGER, M.Sc, Presidente
janice D. Callahan, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini,
Ph.D.; David M. Lansky, Ph.D.; David J. LeBlond,
Ph.D.; Karen J. Roberts, R.Ph.; Timothy Schofield, M.A.
Toxicología
ROBERT E. ÜSTERBERG, PH.D., Presidente
Charles Barton, Ph.D.: joseph F. Borzelleca, Ph.D.; john
Doull, Ph.D., M.D.; Marion Ehrich, Ph.D.; Gregory L.
Erexson, Ph.D., DABT; Bruce A. Fowler, Ph.D., ATS; Bo Li,
Ph.D.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; Michel Mikhail,
Ph.D.; jeffrey P. Smith, Ph.D.
Comité de Expertos del Formulario
Nacional
Monografías-Excipientes
LAWRENCE H. BLOCK, PH.D., Presidente
Kenneth S. Alexander, Ph.D., Ed.Sp.; Fernando A. Alvarez-
Nunez, Ph.D.; Shireesh P. Apte, Ph.D.; Tim D. Cabelka,
Ph.D.; Brian A.C. Carlin, Ph.D.; Richard N. Cawthorne,
Ph.D.; jian-Hwa Guo, Ph.D.; Felicitas Guth, Ph.D.; Mary
C. Houck, Ph.D.; M. Sherry Ku, Ph.D.; William J. Lambert,
Ph.D.; Philip H. Merrell, Ph.D.; Richard C. Moreton,
Ph.D.; Eric J. Munson, Ph.D.; Paul B. Myrdal, Ph.D.; Franz
K. Penz, Ph.D.; Yihong Qiu, Ph.D.; Venkatramana Rao,
Ph.D.; Sibichen J. Thekveli, Ph.D.; jiasheng Tu, Ph.D.;
Richard H. Wendt, Ph.D.
(1197) Panel de Expertos en Buenas Prácticas de
Distribución para Excipientes Farmacéuticos a
Granel
GREGORY E. AMIDON, PH.D. Y RICHARD C. MORETON, PH.D.,Co-
Presidentes
Loyd V. Allen, Ph.D.; Lawrence H. Block, Ph.D.;
William Dale Carter, M.S.; Zak T. Chowhan, Ph.D.;
Marc Fages; Elizabeth Ferguson-Brown; Mary G.
Foster, Pharm.D., BFA; Linda A. Herzog, M.B.A.; Ashok
V. Katdare, Ph.D.; Zakiya Kurdi, Ph.D.; Edward G.
Malawer, Ph.D., CQA; Frank Milek, Ph.D.; Becca
Mitchell; Dwight Mutchler; Carnet E. Peck, Ph.D.;
Mike Schultz, R.Ph.; Alexa Smith, M.S.; Glenn
Sokoloski; Kelly Taylor; jiasheng Tu, Ph.D.
Panel de Expertos en Glicerina
TIM D. CABELKA, PH.D., Presidente
Lawrence H. Block, Ph.D.; Carlos E. Bortolotto, B.S.;
Frances K. Byrne, M.S.; Balaji V. Kadri, M.Pharm.,
M.Sc., MBA; Tanja Natterer; Marian J. Rinken, Ph.D.;
Gwen E. Rucker, B.S.; David A. Sharknas, B.S.; Hong
Zhou, Ph.D.
Panel de Expertos en Povidonas
BERNHARD D. FUSSNEGGER, PH.D. Y CARL PERINI, M.S., Co-
Presidentes
Lawrence H. Block, Ph.D.; Feng Chen, Ph.D.; David j.
Filiar, MBA; Edward G. Malawer, Ph.D.; Syed A.A.
Rizvi, Ph.D.; john W. Spink, Ph.D.; Fan Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Talco
LAWRENCE H. BLOCK, PH.D' Presidente
Detlef Beckers, Ph.D.; jocelyne Ferret, Ph.D.; Gregory
P. Meeker, M.S.; Aubrey Miller, M.D., M.P.H.; Robert
Integrantes /Comités xxi
E. Osterberg, Ph.D.; Dilip M. Patil, M.S.; Julie W. Pier,
M.S.; Steve Riseman, Ph.D.; Martin S. Rutstein, Ph.D.;
Gary P. Tomaino; Drew Van Orden, M.S., M.A.; james
S. Webber, Ph.D.
Comité de Expertos de la USP y del
Dietary Supplements Compendium
Monografías-Suplementos Dietéticos
DENNIS K.J GORECKI, B.S P, PH.D, Presidente
Marilyn L. Barrett, Ph.D.; joseph M. Betz, Ph.D.; Michael
S. Bradley, M.S.; josef A. Brinckmann; james R. Brooks,
Ph.D.; Robert L. Chapman, Ph.D.; De-an Guo, Ph.D.; Bill
J. Gurley, Ph.D.; Sukhdev Swami Handa, Ph.D.; David C.
Hopp, Ph.D.; Scott A. jordan, Ph.D.; joy A. joseph, M.S.;
A. Douglas Kinghorn, Ph.D., O.Se.; Richard Ko, Pharm.D.,
Ph.D.; Raimar Lobenberg, Ph.D.; Tieraona Low Dog,
M.D.; Gail B. Mahady, Ph.D.; Robin J. Marles, Ph.D.;
Guido F. Pauli, M.D., Ph.D.; Zhongzhi Qian, M.S.; Eike
Reich, Ph.D.; Paul L. Schiff, jr., Ph.D.; Fabio M.B. Soldati,
Ph.D.; Edward H. Waysek, Ph.D.; Wayne R. Wolf, Ph.D.
Panel de Expertos para la Revisión de Arginina
JAMES R. BROOKS, PH.D., Presidente
Marilyn Barrett, Ph.D.; Louis Cantilena, M.D.; Rebecca
B. Costello, Ph.D.; johanna T. Dwyer, O.Se., RD; Mary
L. Hardy, M.D.; Scott A. jordan, Ph.D.; Robin Marles,
Ph.D.; Ronald J. Maughan, Ph.D.; Robert Osterberg,
Ph.D.; Bruce E. Rodda, Ph.D.; Robert R. Wolfe, Ph.D.;
jorge Zuniga, Ph.D.
Panel de Expertos para la Revisión de Beta-
Alanina
RICHARD Ko, PHARM.D., PH.D., Presidente
Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Rebecca B. Costello,
Ph.D.; William J. Evans, Ph.D.; Mary L. Hardy, M.D.;
Scott A. jordan, Ph.D.; Ronald J. Maughan, Ph.D.;
janet W. Rankin, Ph.D.; Abbie E. Smith, Ph.D.
Panel de Expertos en Revisiones de la Basadas
en Evidencia
TIERAONA Low DOG, M.D., Presidente
Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Stephanie Chang, M.D.,
M.P.H.; Mei Chung, Ph.D.; Rebecca B. Costello, Ph.D.;
Dennis K.J. Gorecki, Ph.D.; Scott A. jordan, Ph.D.
Panel de Expertos en Suplementos Dietéticos de
Liberación Prolongada
jOY A jOSEPH, M.S., Presidente
Charles Barton, Ph.D.; joseph F. Borzelleca, Ph.D.;
Michael S. Bradley, M.S.; james R. Brooks, Ph.D.;
Marion Ehrich, Ph.D.; Vivian A. Gray; Carol S.
johnston, Ph.D.; Raimar Loebenberg, Ph.D.; Alexander
G. Schauss, Ph.D.; Elizabeth A. Yetley, Ph.D.
Panel de Expertos en Herbal Medicines Compen-
dium-Asia Oriental
ZHONGZHI QIAN, M.S., Presidente
Kai shun Bi, Ph.D.; Shilin Chen, Ph.D.; De-an Guo,
Ph.D.; Shen ji, Ph.D.; Brad WC Lau, M.S., Ph.D.; Clara
Bik San Lau, Ph.D.; Ping Li, Ph.D.; Rui Chao Lin, Ph.D.;
Shangmei Shi, B.S.; Pengfei Tu, Ph.D.; Zheng-Tao
Wang, Ph.D.; Yang-Chang Wu, Ph.D.; Shishan Yu,
Ph.D.; Zhao Zhonzhen, Ph.D.
Panel de Expertos en Herbal Medicines Compen-
dium-Sur Asia
SUKHDEV SWAMI HANDA, PH.D., Presidente
Amit Agarwal; C.K. Katiyar, Ph.D.; Rasadah Mat Ali,
Ph.D.; D.G. Naik, Ph.D.; Sankaran Natarajan, Ph.D.;
M.K. Raina, Ph.D.; Neeraj Tandon, Ph.D.
xxii Comités / Integrantes
Comité de Expertos del Food Chemicals
Codex
Monografías-Ingredientes Alimenticios
ANDREW G. EBERT, PH.D., Presidente
Michael H. Auerbach, Ph.D.; janet L. Ba/son, M.S.; Hans
K. Biesa/ski, M.D., Ph.D.; Simon Brooke-Taylor, Ph.D.;
Richard C. Cantrill, Ph.D.; junshi Chen, M.D.; Grady W.
Chism, Ph.D.; Roger A. Clemens, Dr.P.H.; jonathan W.
DeVries, Ph.D.; john W. Finley, Ph.D.; Car/ Frey, M.S.;
Einat Haleva, Ph.D.; Lori L. Klopf, Ph.D.; Diane B. McColl,
J.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; joseph A. Scimeca, Ph.D.;
Fereidoon Shahidi, Ph.D.; Karina R. Vega-Villa, Ph.D.;
Liangli Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Ingredientes Alimenticios-
Adulterantes Intencionales
jONATHAN w. DEVRIES, PH.D., Presidente
Susan M. Brown, M.E.A.; Henry Chin, Ph.D.; Karen
Everstine, Ph.D., M.P.H.; Shaun Kennedy; Petra Lutter,
Ph.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; john Spink, Ph.D.;
Saskia van Ruth, Ph.D.; Car/ Winter, Ph.D.; Yongning
Wu, M.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Comité de Expertos de la USP y del USP
on Compounding
Preparación Magistral
GIGI S. DAVIDSON, B.S.PHARM., DICVP, Presidente
Loyd V. A/len, Ph.D.; Lisa D. Ashworth, R.Ph.; Gus S.
Bassani, Pharm.D.; Edmund J. Elder, jr., Ph.D.; Maria do
Carmo M. Garcez, B.S.Pharm.; Deborah R. Houston,
Pharm.D.; Patricia C. Kienle, M.P.A.; Keisha D. Lovoi, B.S.
Pharm.; Linda F. McE/hiney, Pharm.D.; Wil/iam A. Mixon,
M.S.; David W. Newton, Ph.D.; Alan F. Parr, Pharm.D.,
Ph.D.; Regina F. Peacock, Ph.D.; Robert P. Shrewsbury,
Ph.D.; Keith St. John, M.S.
Panel de Expertos en Preparación Magistral con
Fármacos Peligrosos
PATRICIA c. KIENLE, M.P.A., Presidente
Thomas H. Connor, Ph.D.; Melissa A. McDiarmid,
M.D., MPH; Kenneth R. Mead, Ph.D.; Martha
Polovich, Ph.D.; Lucille A. Power; james T. Wagner
Panel de Expertos en Preparación Magistral-
Preparaciones Estériles
JAMES E. AKERS, PH.D. Y GiGI S. DAVIDSON, B.S. PHARM.,
DICVP, Ca-Presidentes
Michael W. Anneken, B.S. Pharm., R.Ph.; Byron
Ashworth; jeffrey A. Clanton, M.S.; Cynthia Ti/son
Culmo, B.S.; Gordon M. E/y; Brenda S. jensen, CPhT,
M.B.A.; Patrick A. Lester, B.S. Pharm., DVM, M.S.;
Paul N. Limberis, B.S.; Lisa A. McCartney, BAAS;
Elizabeth A. Monsees, RN, MSN, MBA; Barbara M.
Sou/e, RN, MPA, B.S.; Marc H. Stranz, Pharm.D.;
William A. Stuart, B.S.; Vaiyapuri Subramaniam,
Pharm.D.; Angela W. Yaniv, Pharm.D.
Comités de Expertos del USP Medicines
Compendium
USP Medicines Compendium-Productos Biológicos
DHANAN)AY PATANKAR, PH.D., Presidente
Sriram V. Akundi, Ph.D.; Mahesh K. Bhalgat, Ph.D.; jasan
B. Bock, Ph.D.; Daniel Silva Guedes, Ph.D.; Gye Mee
jang, M.S.; Sridevi Khambhampaty, Ph.D.; Young-Phil
Lee, Ph.D.; Rustom S. Mody, Ph.D.; Venkata Ramana,
USP 37
Ph.D.; Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.; Li Shi, Ph.D.;
Dongmei Su, Ph.D.; Meenu Wadhwa, Ph.D.
Panel de Expertos en Proteínas Terapéuticas
RUSTOM S. MODY, PH.D., Presidente
Sriram V. Akundi, Ph.D.; Sanjay Bandyopadhyay, Ph.D.;
Himanshu S. Gadgil, Ph.D.; Jaby jacob, Ph.D.; Suresh
Karupothu/a, Ph.D.; Dhananjay Patankar, Ph.D.; Venkata
Ramanna, Ph.D.; M.K. Sahib, Ph.D.; Alok Sarma, Ph.D.;
Gul Raj Soni, Ph.D.; Utpal Tatu, Ph.D.; Meenu Wadhwa,
Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas
MAHESH K. BHALGAT, PH.D., Presidente
Sunil Gairola, Ph.D.; Gaurav Gupta, Ph.D.; Sunil Gupta,
M.D.; Mei Mei Ho, Ph.D.; K. Anand Kumar, Ph.D.; K.R.
Mani, Ph.D.; Ashok Panwar, Ph.D.; Y.U.B. Rao, Ph.D.;
Ashwani Kumar Sahu, M.Sc.; Anil Sood, M.Sc.; Ajay
Kumar Tahlan, M.D.
USP Medicines Compendium-Asia Oriental
jlASHENG Tu, PH.D., Presidente
Ying Chen; Zhonggui He, Ph.D.; Fangwen Shuai;
Qiaofeng Tao, Ph.D.; Hao Wang, Ph.D.; Weibing Wang;
Yue-Sheng Wang, Ph.D.; Hongyan Xie; Luo Zhuoya,
Ph.D.
USP Medicines Compendium-América Latina
MARIA INES R.M. SANTORO, PH.D., Presidente
Maria A/ice Bockelmann, Ph.D.; Mauro Cesar de Faria, B.
Se., MBA; Elizabeth lgne Ferreira, Ph.D.; José Aparício
Brittes Funck, Ph.D.; Ana María Camero Collado, B.Sc.;
Silvia Susana Giarcovich, Ph.D.; Patricia Soledad Carreña
González, M.Sc.; María Catalina Díaz Gutiérrez, B.Sc.;
Osear Quattrocchi, M.Sc.; jaime-Humberto Rojas, M.Sc.;
Graciela Aguilar Gil Samaniego, B.Sc.; Silvia Storpirtis,
Ph.D.; Gerson Antonio Pianetti, Ph.D.; Filipe Soares
Quirino da Silva, Ph.D.; Monica da Luz Carvalho Soares,
Ph.D.
USP Medicines Compendium-Sur Asia
ANTONY RAJ GOMAS, PH.D., Presidente
Dale Adkisson, M.S.; Rajiv Desai, Ph.D.; Manish
Gangrade, Ph.D.; Sushil Gangwal, Ph.D.; Farnaz Malik,
Ph.D.; Petla Naidu, Ph.D.; Sheikh M. Rahman, Ph.D.;
Zahid Saeed, B.Pharm.; Mohammad Tahir Siddique,
M.Sc., MBA; Sukhdev Singh, M.Sc.; Saji Thomas, Ph.D.
Enlaces Gubernamentales ante los
Comités· de Expertos y los Paneles de
Expertos
Enlaces de la Administración de Alimentos y Medica-
mentos de los EE.UU. (FDA)
Rajiv Agarwal, Ph.D.; Ali Al-Hakim, Ph.D.; Om Anand, Ph.D.;
Howard A. Anderson, Ph.D.; juan Arciniega, D.Sc.; Anamitro
Banerjee, Ph.D.; Shastri Bhamidipati, Ph.D.; jonathan Bray,
B.S.; Lucinda F. Buhse, Ph.D.; Teresa T. Cain, Ph.D.; john H.
Callahan, Ph.D.; Steven Casper, Ph.D.; Wiley Chambers,
M.D.; jane Chang, Ph.D.; john F. Cipo/lo, Ph.D.; Carolyn
Cohran, Ph.D.; Thomas Colatsky, Ph.D.; jerry Cott, Ph.D.;
Mike Darj, Ph.D.; Mamata De, Ph.D.; lan DeVeau, Ph.D.;
William Doub, Ph.D.; Patrick Faustino, Ph.D.; Daniel Folmer,
Ph.D.; Michael Scott Furness, Ph.D.; Zongming Gao, Ph.D.;
Tapash Ghosh, Ph.D.; Devinder S. Gil/, Ph.D.; Lil/ie D. Gol-
son, Pharm.D.; Edisa Gozun, Pharm.D.; Dennis Guilfoyle,
Ph.D.; Yin Guo, Ph.D.; Abhay Gupta, Ph.D.; Michael
Hadwiger, Ph.D.; Bruce D. Harris, Ph.D.; William Hess; CAPT
Carol Holquist, R.Ph.; David Hussong, Ph.D.; Robert /ser,
M.S.; )oseph E. jablonski, Ph.D.; Lauren jackson, Ph.D.;
USP 37
David S. Kaplan, Ph.D.; john F. Kauffman, Ph.D., M.B.A.;
Michael C. Kennedy, Ph.D.; Mansoor A. Khan, R.Ph., Ph.D.;
Loice C. Kikwai, Ph.D.; Robert H. King, Ph.D.; Donald N.
Klein, Ph.D.; Bogdan Kurtyka, Ph.D.; Stephen E. Langille,
Ph.D.; Carla S.R. Lankford, M.D., Ph.D.; Pamela L. Lee, J.D.;
Sau L. Lee, Ph.D.; Robín Levis, Ph.D.; Tsai-lien Lin, Ph.D.;
Richard Lostritto, Ph.D.; Ragine Maheswaran, Ph.D.; lngrid
Markovic, Ph.D.; Ewa Marszal, Ph.D.; Marilyn N. Martinez
Pelsor, Ph.D.; Dorota Matecka, Ph.D.; judith McMeekin,
Pharm.D.; Jeffrey B. Medwid, Ph.D.; Randa Melhem, Ph.D.;
John Metcalfe, Ph.D.; Yana Mille, R.Ph.; Tahseen Mirza,
Ph.D.; Amit K. Mitra, Ph.D.; Sanja Modric, D.V.M., Ph.D.;
Magdi M. Mossoba, Ph.D.; Laxma Nagavelli, Ph.D.; Terrance
W. Ocheltree, Ph.D., R.Ph.; Mickey Parish, Ph.D.; Suhas
Patankar, Ph.D.; S. Prasad Peri, Ph.D.; Frank Perrella, Ph.D.;
Vaikunth Prabhu, Ph.D.; CAPT Kimberly Rains, Pharm.D.;
Rahdika Rajagopalan, Ph.D.; Shanaz Read, Ph.D.; Barbara
Rellahan, Ph.D.; Brian D. Rogers, Ph.D.; Allen Rudman,
Ph.D.; R. Duane Satzger, Ph.D.; Peter ~choll, Ph._D_.; Paul
Schwartz, Ph.D.; Pauí Seo, Ph.D.; Ham1d R. Shaf1e1, Ph.D.;
Rakhi Shah, Ph.D.; Glen jon Smith, M.S.; jannavi Srinivasan,
Ph.D.; Maria Stevens-Riley, Ph.D.; Yichun Sun, Ph.D.; Patrick
G. Swann, Ph.D.; Neeru Takiar, M.S.; jennifer Thomas, j.D.;
Paula R. Trumbo, Ph.D.; Saleh A. Turujman, Ph.D.; Luis
Valerio, Ph.D.; Willie F. Vann, Ph.D.; Perry Wang, Ph.D.;
Mark Weinstein, Ph.D.; Russell Wesdyk, M.B.A.; Karen L.
Wheless, M.S.; Steven Wolfgang, Ph.D.; Keith Wonnacott,
Ph.D.; Li Xia, Ph.D.; Maria E. Ysern, M.Sc.; Mei-ying W. Yu,
Ph.D.; Peí Zhang, M.D.; jinglin Zhong, Ph.D.; Susan Zuk
Otros Enlaces Gubernamentales
Brazilian Pharmacopeial Commission
Gerson Pianetti, Ph.D.; Monica Soares, Ph.D.
U.S. Centers for Disease Control and Prevention
Melissa Schaefer, M.D.; Nadine Shehab, Pharm.D., MPH
Chinese Pharmacopoeial Commission
Zhongping Guo; Peng Han
Federal Commission for the Protection against
Sanitary Risk (COFEPRIS), Mexico
Gregorio Tecuapetia
Dutch Healthcare lnspectorate
Riekert Bruinink, Pharm.D.
European Food Safety Authority
jordi Serratosa, Ph.D.
Health Canada
Matthew Bauder; jeffrey Skene, M.Sc.
National lnstitute for Quality Control in Health
(INCQS), Brazil
Filipe Silva, Ph.D.
U.S. National lnstitute of Standards and Technol-
ogy (NIST)
Val R. Miller, Ph.D.
Integrantes / Comités xxiii
Grupos Asesores
[Nota-El Director Ejecutivo puede nombrar organis-
mos asesores para apoyar la labor del Consejo de Ex-
pertos y de la Convención, y para asesorar al personal
interno en asuntos relacionados con políticas. El
siguiente listado de Grupos Asesores y sus miembros
representa a aquellos Grupos formados y aprobados en
su totalidad hasta septiembre de 2012. Los Grupos
Asesores se forman y desintegran continuamente du-
rante todo el ciclo de revisión de la USP, por lo que en
un futuro se publicarán otras listas de miembros.]
Grupo Asesor para Titular Monografías-CONCLUIDO
Robert S. Beardsley, R.Ph., Ph.D.; Michael Cohen, R.Ph.;
Marjorie Coppinger; Mary jo Goolsby, Ed.D., M.S.N., C.A.E.;
Chandraprakash Kasireddy, Ph.D.; Barbara Kochanowski,
Ph.D.; Murray Kopelow, M.D., F.R.C.P.C.; Gary Matzke,
Pharm.D.; Linda F. McElhiney, Pharm.D., R.Ph.; David
Newton, Ph.D.; Annette Perschke, R.N., M.S.N.; Marjorie
Phillips, M.S.; Peter H. Rheinstein, j.D., M.S.; Elliott M.
Sogol, P~p., R.~h.; Vaiyap~ri ?ubramaniam, Pharm.D.,
M.S.; Ph1l1p Trav1s; Mark W1ggins, M.S.
Grupo Asesor de Leche Descremada en Polvo
ROBERT MAGALETIA, PH.D., Presidente
Grant Abernethy, Ph.D.; Marti Bergana, Ph.D.; Sneh
Bhandari, Ph.D.; John H. Callahan, Ph.D.; jack Cappozzo,
M.S.; Claire Chang, B.S.B.E.; Kuanglin Chao, Ph.D.; Frank
Delaglio, Ph.D.; jonathan DeVries, Ph.D.; Gerard Downey,
Ph.D.; George Greene; Einat Haleva, Ph.D.; james M.
Harnly, Ph.D.; Peter de B. Harrington, Ph.D.; Steven
Holroyd, Ph.D.; William J. Hurst; Gregory A. lsraelson;
]os.eph E. ]ablonski, Ph.p.; Lauren ]ackson, Ph.D.; ]ason
Ke1th, M.S.; Moon S. K1m, Ph.D.; Petra Lutter, Ph.D.;
Andrew Mackey, Ph.D.; Carmen Martin-Hernandez;
Anitra Payne; ]ianwei Qin; ]oseph P. Romano; Catherine
Shaw; Paul Wehling; Zhuohong Xie; ]inchuan Yang,
Ph.D.; Steven Zbylut, Ph.D.; Caro! Zyrbko, Ph.D.
In Memóriam
La USP extiende su reconocimiento a los siguientes
Voluntarios Expertos quienes fallecieron durante el ciclo
2010-2015:
Robert G. Bursey, Ph.D. (Monografías-Comité de
Expertps de Ingredientes Alimenticios);
Ranga Velagaleti, Ph.D. (Monografías-Comité de
Expertos de Ingredientes Alimenticios)
 xxiv Miembros / Integrantes USP 37

Miembros y Delegados de
la Convención de la
Farmacopea de los Estados
Unidos a partir del 31 de
mayo de 2013
Instituciones Académicas y
Asociaciones Vinculadas-
Asociaciones Académicas
American Association of Colleges of Nursing, Ginette A.
Pepper, Ph.D.
American Association of Colleges of Osteopathic Medicine, An-
thony J. Silvagni, D.O., Pharm.D., M.Sc., FACOFP, FAFPE
American Association of Colleges of Pharmacy, Lucinda L.
Maine, Ph.D., R.Ph.
Association of American Medica/ Colleges, David W.
Nierenberg, M.D.
Association of American Veterinary Medica/ Colleges, Deborah
T. Kochevar, D.V.M., Ph.D.
Association of Faculties of Pharmacy of Canada, Raimar Loe-
benberg, Ph.D.
Instituciones Académicas y
Asociaciones Vinculadas-
Universidades y Facultades de
Medicina de los Estados Unidos
Baylor College of Medicine, Stephen B. Greenberg, M.D.
Bastan University School of Medicine, Carol T. Walsh, Ph.D.
Brody School of Medicine at East Carolina University, Abdel A.
Abdel-Rahman, Ph.D., FAHA
Case Western Reserve University School of Medicine, Robert
Findling, M.D.
Chicago Medica/ School at Rosalind Franklin University of Medi-
cine and Science, Ann K. Snyder, Ph.D.
Columbia University College of Physicians and Surgeons, Ru-
dina Odeh-Ramadan, Pharm.D.
Creighton University School of Medicine, Peter W. Abel, Ph.D.
Dartmouth Medica/ School, Lionel D. Lewis, M.D.
East Tennessee State University james H. Qui/len College of
Medicine, Kenneth E. Ferslew, Ph.D.
Eastern Virginia Medica/ School, Thomas T. Lynch, Pharm.D.
Emory University School of Medicine, Frank J. Gordon, Ph.D.
Florida State University College of Medicine, Graham A.
Patrick, Ph.D.
Georgetown University School of Medicine, Thomas G.
Sherman, Ph.D.
Howard University College of Medicine, Robert E. Taylor, M.D.,
Ph.D., FACP
Indiana University School of Medicine, David R. jones, Ph.D.
joan C. Edwards School of Medicine Marshall University, Gary
O. Rankin, Ph.D.
johns Hopkins University School of Medicine, Daniel M. Ashby,
M.S., FASHP
Keck School of Medicine of University of Southern California,
Paul D. Holtom, M.D.
Loma Linda University School of Medicine, John N. Buchholz,
Ph.D.
Louisiana State University School of Medicine, Kurt J. Varner,
Ph.D.
Louisiana State University School of Medicine at Shreveport,
Henry R. McKnight, B.S., M.S., Pharm.D.
Layo/a University Chicago Stritch School of Medicine, jawed
Fareed, Ph.D.
Mayo Medica/ School, Peter J. Post, Pharm.D., R.Ph.
Medica/ University of South Carolina College of Medicine,
Kenneth D. Tew, Ph.D.
Meharry Medica/ College School of Medicine, Clivel G.
Charlton, Ph.D.
Mercer University School of Medicine, Wayne Glasgow, Ph.D.
Michigan State University College of Human Medicine, Rami B.
lbrahim, M.Sc., Pharm.D., BCPS, BCOP
Morehouse School of Medicine, Ward Kirlin, Ph.D.
Mount Sinai School of Medicine, joel S. Mindel, M.D., Ph.D.
New York Medica/ College, Mario A. lnchiosa, Ph.D.
New York University School of Medicine, Lewis S. Nelson,
M.D.
Northeastern. Ohio Universities College of Medicine, Lawrence
A. Frazee, Pharm.D., R.Ph., BCPS
Northwestern University Feinberg School of Medicine, Steven
M. Belknap, M.D.
Ohio State University College of Medicine, Robert J. Weber,
Pharm.D., M.S.
Pennsylvania State University College of Medicine, Kelly D.
Karpa, Ph.D., R.Ph.
Ponce School of Medicine, Lean Ferder, M.D.
Saint Louis University School of Medicine, Heather Macarthur,
Ph.D., B.Sc.
San juan Bautista School of Medicine, Marielis E. Rivera Ruiz,
Ph.D.
Southern 11/inois University School of Medicine, Carl Faingold,
Ph.D.
SUNY at Buffalo School of Medicine and Biomedical Sciences,
Paul J. Kostyniak, Ph.D., DABT
SUNY Downstate Medica/ Center College of Medicine, Jacob V.
Aranda, M.D., Ph.D., FRCPC
SUNY Upstate Medica/ University, David F. Lehmann, M.D.,
Pharm.D.
Temple University School of Medicine, Alan Cowan, Ph.D.
Texas A&M Health Science Center College of Medicine, D.
Samba Reddy, Ph.D., R.Ph.
 USP 37
Texas Tech University Hea/th Sciences Center School of Medi-
cine, Peter Syapin, Ph.D.
The Warren Alpert Medica/ School of Brown University, Wayne
D. Bowen, Ph.D.
Thomas jefferson University jefferson Medica/ College, Walter
Kraft, M.O., M.S., FACP
Tufts University School of Medicine, Ross W. Thompson, M.S.,
R.Ph.
Uniformed Services University of the Health Sciences, Louis R.
Cantilena, M.O., Ph.D.
Universidad Central del Caribe Schoo/ of Medicine, Harry
Mercado, M.O.
University of Alabama at Birmingham School of Medicine,
Richard ). Whitley, M.O.
University of Arizona College of Medicine, Hillary A. Franke,
M.O., M.S.
University of Arkansas far Medica/ Sciences College of Medicine,
Paul L. Prather, Ph.D., B.S.
University of California Davis Schoo/ of Medicine, Timothy E.
Albertson, M.O., M.P.H., Ph.D.
University of California San Francisco School of Medicine, Kerry
C. Cho, M.O.
University of Chicago Pritzker School of Medicine, Michael L.
Maitland, M.O., Ph.D
University of Cincinnati College of Medicine, Marianne F. lvey,
Pharm.D., M.P.H., FASHP
University of Connecticut Health Center Schoo/ of Medicine,
Pamela O. Bali Hoppi, R.Ph., CCN
University of Hawaii john A. Burns School of Medicine, Abby
Collier, Ph.D., B.Sc.
University of 11/inois College of Medicine at Chicago, Randal A.
Skidgel, Ph.D.
University of lowa Carver College of Medicine, Raymond ).
Hohl, M.O., Ph.D.
University of Kansas School of Medicine, Sam ). Enna, Ph.D.
University of Kentucky College of Medicine, Lisa A. Cassis,
Ph.D.
University of Louisville School of Medicine, Peter P. Rowell,
Ph.D.
University of Maryland School of Medicine, Margaret M.
McCarthy, Ph.D.
University of Massachusetts Medica/ School, Roy Guharoy,
Pharm.D., M.B.A., FCP, FCC, FASHP
University of Medicine and Dentistry of New jersey-New jersey
Medica/ School, Deborah Lazzarino, Ph.D.
University of Medicine and Dentistry of New jersey-Robert
Wood johnson Medica/ School, Susan Goodin, Pharm.D.,
FCCP, BCOP
University of Miami Miller Schoo/ of Medicine, Joshua D. Len-
chus, O.O., R.Ph., FACP
University of Michigan Medica/ School, Paul F. Hollenberg,
Ph.D.
University of Mississippi School of Medicine, Deborah S. Minor,
Pharm.D., FAHA
University of Missouri-Kansas City Schoo/ of Medicine, James
M. Wooten, Pharm.D.
University of Nebraska College of Medicine, L. Charles Murrin,
Ph.D.
University of Nevada Schoo/ of Medicine, lain L. Buxton,
Pharm.D.
University of New Mexico Health Sciences Center Schoo/ of
Medicine, Arti Prasad, M.O.
University of North Dakota School of Medicine and Hea/th
Sciences, James E. Porter, Ph.D.
University of Oklahoma College of Medicine, Pramod K.
Chetty, M.O.
University of Pennsylvania Schoo/ of Medicine, Patrick J.
Brennan, M.O.
University of Pittsburgh School of Medicine, Dennis P.
Swanson, M.S.
University of Puerto Rico School of Medicine, Miguel A.
Marrero, M.O.
University of South Alabama College of Medicine, Jack A. Di-
Palma, B.S., M.O.
Integrantes / Miembros xxv
University of South Carolina Schoo/ of Medicine, Kenneth B.
Walsh, Ph.D.
University of South Florida Morsani College of Medicine, Shu-
feng Zhou, M.O., Ph.D.
University of Tennessee, Memphis College of Medicine, Trevor
W. Sweatman, Ph.D.
University of Texas Medica/ Schoo/ at Houston, Gary C.
Rosenfeld, Ph.D.
University of Utah Schoo/ of Medicine, Richard J. Sperry, M.O.,
Ph.D.
University of Virginia Schoo/ of Medicine, john S. Lazo, Ph.D.
University of Washington Schoo/ of Medicine, Ellen Cosgrove,
M.O.
University of Wisconsin School of Medicine and Public Health,
F. Michael Hoffmann, Ph.D.
Vanderbilt University School of Medicine, C. Michael Stein,
M.O.
Virginia Commonwealth University Schoo/ of Medicine,
Dominic A. Sica, M.O.
Wake Forest University Schooi of Medicine, Kathy P. Bricker,
Pharm.D., BCPS
Washington University School of Medicine in St. Louis, Evan D.
Kharasch, M.O., Ph.D.
Wayne State University School of Medicine, Stephen A. Lerner,
M.O.
West Virginia University School of Medicine, Douglas D.
Glover, M.O.
Wright State University Boonshoft School of Medicine, Khalid
M. Elased, Ph.D., R.Ph.
Ya/e University Schoo/ of Medicine, Seth Powsner, M.O.
Instituciones Académicas y
Asociaciones Vinculadas-
Universidades y Facultades de
Farmacia de los Estados Unidos
Albany College of Pharmacy and Hea/th Sciences, Mehdi Bo-
roujerdi, Ph.D.
Auburn University Harrison Schoo/ of Pharmacy, William R. Ra-
vis, Ph.D.
Butler University College of Pharmacy and Health Sciences, Su-
dip K. Das, Ph.D.
Campbell University School of Pharmacy, Antaine Al-Achi,
M.S.Pharm., Ph.D., M.S.
Chicago State University College of Pharmacy, Duc P. Do,
Ph.D.
Creighton University Schoo/ of Pharmacy and Hea/th
Professions, J. Christopher Bradberry, Pharm.D.
Drake University College of Pharmacy and Hea/th Sciences,
Robert P. Soltis, Ph.D.
Duquesne University Mylan Schoo/ of Pharmacy, Lawrence H.
Block, Ph.D.
Ernest Mario Schoo/ of Pharmacy at Rutgers University, Long-
qin Hu, Ph.D.
Ferris State University College of Pharmacy, Kim E. Hancock,
Ph.D.
Florida A & M University College of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, Mandip Sachdeva, Ph.D.
Hampton University School of Pharmacy, Chengon Du, Ph.D.,
M.P.H.
Howard University College of Pharmacy, Nursing and Allied
Hea/th Sciences, Emmanuel O. Akala, Ph.D.
/daho State University College of Pharmacy, Kevin W.
Cleveland, Pharm.D.
Lake Erie College of Osteopathic Medicine School of Pharmacy,
Sachin S. Devi, B.Pharm., Ph.D.
Loma Linda University School of Pharmacy, W. William
Hughes, Ph.D.
Long /stand University Arnold and Marie Schwartz College of
Pharmacy and Health Sciences, David R. Taft, B.S.Pharm.,
Ph.D.

xxvi Miembros / Integrantes
Massachusetts Col/ege of Pharmacy and Health Sciences-
Boston, David A. Williams, Ph.D.
Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences School
of Pharmacy-Worcester, Reema R. Zeineldin, Ph.D.
Mercer University College of Pharmacy and Health Sciences, J.
Grady Strom, Ph.D.
Midwestern University Chicago College of Pharmacy, Huzefa
Master, Pharm.D.
Midwestern University College of Pharmacy-Glendale, Bill J.
Bowman, Ph.D., R.Ph.
North Dakota State University College of Pharmacy, Nursing
and Allied Sciences, Jagdish Singh, Ph.D.
Northeastern University Bouve College of Health Sciences
Schoo/ of Pharmacy, Mansoor M. Amiji, Ph.D.
NOVA Southeastern University College of Pharmacy, Hamid H.
Omidian, Ph.D., M.Sc., B.Sc.
Ohio Northern Universily Raabe Col/ege ot Pharmacy, Jon E.
Sprague, Ph.D., R.Ph
Oregon State University Co/lege of Pharmacy, J. Mark
Christensen, Ph.D.
Pacific University College of Hea!th Professions School of
Pharmacy, Susan M. Stein, R.Ph., M.S.
Palm Beach Atfantic University Gregory Schoo/ of Pharmacy,
Adwoa O. Nornoo, B.Pharm., M.S., Ph.D.
Purdue University School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Stephen R. Byrn, Ph.D.
Roseman University of Health Sciences College of Pharmacy,
Mark C. Decerbo, Pharm.D., BCPS, BCNSP
Samford University McWhorter School of Pharmacy, John J.
Arnold, Ph.D., B.S.
Shenandoah University Bernard }. Dunn Schoo/ of Pharmacy,
Nina Hengen, M.O., Ph.D.
South Carolina College of Pharmacy, Donna S. Harrison,
Pharm.D.
South Dakota State University College of Pharmacy, David L.
Helgeland, B.S.Pharm., M.B.A., Ed.D.
South University Schoo/ of Pharmacy, S. Craig Dyar, Ph.D.
Southern 11/inois University Edwardsville Schoo/ of Pharmacy,
William M. Kolling, Ph.D.
Southwestern Oklahoma State University Schoo/ of Pharmacy,
Shelly Stockton, Ph.D.
St. john's University College of Pharmacy and Allied Health
Professions, Abu Serajuddin, Ph.D.
St. Louis College of Pharmacy, Wendy C. Duncan, Ph.D.
SUNY at Buffalo School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Wayne K. Anderson, Ph.D.
Temple University Schoo/ of Pharmacy, Michael Borenstein,
Ph.D.
Texas Southern University College of Pharmacy and Health
Sciences, Dong Liang, Ph.D.
Texas Tech University Health Sciences Center School of
Pharmacy, Arthur A. Nelson, Ph.D., R.Ph.
The Ohio State University College of Pharmacy, Robert W.
Brueggemeier, Ph.D.
The University of Arizona College of Pharmacy, Michael Ma-
yersohn, Ph.D.
The University of lowa College of Pharmacy, Mickey L. Wells,
Ph.D.
The University of Louisiana at Monroe College of Pharmacy,
Sami M. Nazzal, Ph.D.
The University of North Carolina at Chapel Hill Eshe/man
Schoo/ of Pharmacy, Dennis M. Williams, Pharm.D.
The University of Toledo College of Pharmacy, Kenneth S.
Alexander, R.Ph., Ph.D.
Tauro University California College of Pharmacy, Alison
McCormick, Ph.D.
University of Arkansas for Medica/ Sciences College of
Pharmacy, Mark Estes, Pharm.D.
University of California San Diego Skaggs School of Pharmacy
and Pharmaceutical Sciences, Philip O. Anderson,
Pharm.D.
University of California San Francisco Schoo/ of Pharmacy,
Leslie Z. Benet, Ph.D.
•
USP 37
University of Cincinnati james L. Winkle College of Pharmacy,
Pankaj B. Desai, Ph.D.
University of Colorado Schoo/ of Pharmacy, Peter J. Rice,
Pharm.D., Ph.D.
University of Connecticut School of Pharmacy, Peter J. Tycz-
kowski, R.Ph., M.B.A.
University of Florida College of Pharmacy, Veronika
Butterweck, Ph.D.
University of Georgia College of Pharmacy, Svein Oie, Ph.D.
University of Houston College of Pharmacy, F. Lamar Pritchard,
Ph.D.
University of 11/inois at Chicago College of Pharmacy, Jerry L.
Bauman, Pharm.D., FCCP, FACC
University of Kansas Schoo/ of Pharmacy, Christian Schoneich,
Ph.D.
University of Kentucky College of Pharmacy, Heidi Mansour,
Ph.D., R.Ph.
University of Maryland School of Pharmacy, Natalie D.
Eddington, Ph.D.
University of Michigan College of Pharmacy, James G.
Stevenson, Pharm.D.
University of Minnesota College of Pharmacy, Marilyn K. Spee-
die, Ph.D.
University of Mississippi Schoo/ of Pharmacy, Michael A.
Repka, D.D.S., Ph.D.
University of Missouri-Kansas City Schoo/ of Pharmacy, Cydney
E. McQueen, Pharm.D.
University of Nebraska Medica/ Center College of Pharmacy,
Michael F. Powell, B.S. Pharm, M.S.
University of New Mexico College of Pharmacy, Donald A.
Godwin, Ph.D.
University of Oklahoma College of Pharmacy, Loyd V. Allen Jr.,
Ph.D.
University of Pittsburgh Schoo/ of Pharmacy, Michael A. Ze-
maitis, Ph.D.
University of Rhode lsland College of Pharmacy, David R.
Worthen, Ph.D., ].D.
University of Southern California Schoo/ of Pharmacy, Stan G.
Louie, Pharm.D.
University of Tennessee Health Science Center College of
Pharmacy, Laura A. Thoma, Pharm.D., B.S.
University of Texas at Austin College of Pharmacy, Saloman A.
Stavchansky, Ph.D.
University of the Pacific Thomas }. Long Schoo/ of Pharmacy
and Health Sciences, Xiaoling Li, Ph.D.
University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia College
of Pharmacy, Daniel A. Hussar, Ph.D.
University of Utah College of Pharmacy, ]ohn W. Mauger,
Ph.D.
University of Washington Schoo/ of Pharmacy, Thomas K. Haz-
let, Pharm.D., Dr.P.H.
University of Wisconsin-Madison Schoo/ of Pharmacy, Barry E.
Gidal, Pharm.D.
University of Wyoming School of Pharmacy, Kurt Dolence,
Ph.D.
Virginia Commonwealth University/Medical College of Virginia
Schoo/ of Pharmacy, Howard T. Karnes, Ph.D.
Washington State University College of Pharmacy, Danial E.
Baker, Pharm.D., FASHP, FASCP
Wayne State University Eugene Applebaum College of
Pharmacy and Hea/th Sciences, Sheila M. Wilhelm,
Pharm.D.
West Virginia University Schoo/ of Pharmacy, Arthur l. Jackno-
witz, Pharm.D.
Western University of Health Sciences Co/lege of Pharmacy, Su-
nil Prabhu, Pharm.D., R.Ph.
Wilkes University Nesbitt School of Pharmacy, Harvey A.
Jacobs, Ph.D.
Xavier University of Louisiana College of Pharmacy, Tarun K.
Mandal, Ph.D.
 USP 37
Instituciones Académicas y
Asociaciones Vinculadas-
Universidades y Facultades de
Medicina Osteopática de los
Estados Unidos
NOVA Southeastern University College of Osteopathic Medicine,
Nicole Cook, Ph.D., M.P.H.
Organizaciones de Consumidores
y Otras Organizaciones que
Representan el Interés Público
AARP, N. Lee Rucker, M.S.P.H.
Alzheimer's Association, William Thies, Ph.D.
American Autoimmune Related Diseases Association, Virginia T.
Ladd, R.T.
American Cancer Society, Mark Clanton, M.D., M.P.H.
American Diabetes Association, Sue Kirkman, M.D.
American Health Quality Association, Kenneth Mishler, R.Ph.,
Pharm.D.
American Heart Association, Robert Lee Page 11, Pharm.D.,
M.S.P.H., FCCP, FAHA, FASHP, FASCP, BCPS, CGP
Arthritis Foundation, John H. Klippel, M.D.
Center far Science in the Public lnterest, David G. Schardt,
M.S.
Consumers Union, Lisa L. Gill, B.A.
ECR/ lnstitute, Jeffrey C. Lerner, Ph.D.
lnstitute far Safe Medication Practices, Louis Martinelli, Ph.D.,
Pharm.D.
National Consumers League, Rebecca Burkholder, J.D.
National Council on Patient lnfarmation and Education,
William R. Bullman, M.A.M.
National Organization far Rare Disorders, Diane E. Dorman
National Osteoporosis Foundation, Amy Porter
William f. Clinton Foundation, Rodger W. Stringham, Ph.D.
Organismos, Divisiones y
Asociaciones Gubernamentales
Vinculados
Agency far Healthcare Research and Quality, Scott R. Smith,
Ph.D.
Argentine Pharmacopoeia, Héctor A. Giuliani, Pharm.D.
Association of Food and Drug Officials, Cynthia T. Culmo
Brazilian Pharmacopoeia Commission, Gerson A. Pianetti
Brazil's National lnstitute of Quality Control in Health, Filipe
Soares Quirino Silva, Ph.D.
Centers far Disease Control and Prevention, Cindy P.
Dougherty, Pharm.D.
Centers far Medicare & Medicaid Services, ]effrey A. Kelman,
M.D.
Chinese Pharmacopoeia Commission, Wang Lifeng
Department of Veterans Affairs Veterans Health Administration,
Timothy J. Stroup, R.Ph.
European Directorate far the Quality of Medicines and
HealthCare, Susanne Keitel
FDA Center far Biologics Evaluation and Research, Christopher
C. Joneckis, Ph.D.
FDA Center far Devices and Radiological Health, Marilyn M.
Lightfoote, M.D., Ph.D.
FDA Center far Drug Evaluation and Research, Paul R. Seo,
Ph.D.
FDA Center far Food Safety and Applied Nutrition, Daniel E.
Folmer, Ph.D.
FDA Center far Veterinary Medicine, Sanja Modric, D.V.M.,
Ph.D.
Integrantes / Miembros xxvii
Federal Service on Surveillance in Healthcare of Russian Federa-
tion, Valentina F. Kosenko, Ph.D., Pharm.
Food and Drugs Authority, Ghana, Eric Karikari-Boateng, M.S.
Food, Medicine and Hea/th Care Administration and Control
Authority of Ethiopia, Yehulu Denekew Alamneh, B.Sc.,
M.A.
Health Canada, Biologics and Genetic Therapies Directorate,
Chantal Cazeault, B.Sc.
Health Canada, Food Directorate, Barbara Lee
Health Canada, Natural Hea/th Products Directorate, Scott
Sawler, B.Sc., LLB, LLM, M.B.A.
lndian Pharmacopoeia Commission, G.N. Singh, Ph.D.,
M.Pharm.
lndonesian Pharmacopoeia Commission, Augustine Zaini, M.S.
lnternational Trade Administration-U.S. Department of
Commerce, Jeffrey L. Gren
japan's Ministry of Hea/th Labour and Welfare,
Pharmaceuticals and Medica/ Devices Agency, lssei
Takayama
fardan Food and Drug Administration, Reema lssa Alotoum
Morocco's Directorate of Medicines and Pharmacy, Laila
Hakkou
National Association of Boards of Pharmacy, Elizabeth Scott
Russell, B.S.Pharm.
National Centre far Expertise of Drugs, Medica/ Products and
Medica/ Equipment, Ardak U. Tulegenova, Ph.D.
National Drug Authority of Uganda, Gordon Katende
Sematiko
National Health Surveillance Agency, Lais Santana Dantas, B.S.
National /nstitute of Standards and Technology, Robert L.
Watters, Ph.D.
National lnstitutes far Food and Drug Control, Yunlong Li
National lnstitutes of Health, Robert DeChristoforo, R.Ph.,
M.S., FASHP
Permanent Commission of the Pharmacopoeia of the United
Mexican States, Maria del Carmen Becerril-Martinez
Pharmacopoeia of Chinese Taipei, Chi-Fang Lo, Ph.D., M.S.
Pharmacy Council of India, Bhojraj Suresh, M.Pharm., Ph.D.,
D.Sc.
Philippine Pharmacopeia, Maria Lourdes C. Santiago,
B.S.Pharm., M.S.Pharm.
Tanzania Food and Drugs Authority, Yonah H. Mwalwisi
Thai Pharmacopoeia Committee, Sirichai Krabesri,
B.Sc.Pharm., M.Pharm.
The Pharmacy Board of Sierra Leone, Wiltshire C.N. Johnson,
B.Pharm. (Hons) USL., M.Sc (Brad UK), MPSSL,
FPCPharm
Therapeutic Goods Administration of Australia, Vivienne Christ,
B.App.Sc., MASM
Ukrainian Scientific Pharmacopoeial Center far Quality of Medi-
cines, Oleksandr l. Gryzodub, Ph.D.
United States Agency far lnternational Development, Anthony
F. Bonf
United States Air Force-Office of the Surgeon General, Deborah
Myers, R.Ph., M.B.A.
United States Army-Office of the Surgeon General, Carol W.
Labadie, Pharm.D.
United States Department of Health and Human Services,
Donald Wright, M.D., M.P.H.
United States Food and Drug Administration-Office of the
Commissioner, Carlos L. Pena, Ph.D., M.S.
United States Public Health Service-Office of the Surgeon Gene-
ral, Christina H. Lee, Pharm.D.
Vietnamese Pharmacopoeia Commission, Luc Thi Thu Hang,
Ph.D.
Otras Asociaciones Profesionales
y Científicas de Profesionales de
la Salud
AACC lnternational, Amy Hope
Academy of Managed Care Pharmacy, Edith A. Rosato, R.Ph.,
IOM
xxviii Miembros /Integrantes
Academy of Nutrition and Dietetics, Kathryn M. Camp, M.S,
RO, CSP, LN
American Academy of Allergy, Asthma and lmmuno!ogy,
Michael R. Nelson, M.O., Ph.O.
American Academy of Neurology, Henry J. Kaminski, M.O.
American Academy of Nurse Practitioners, jan Towers, Ph.O.,
NP-C
American Academy of Ophthalmology, Wiley A. Chambers,
M.O.
American Academy of Pediatrics, Hank Farrar, M.O.
American Academy of Physician Assistants, Marie-Michele
Leger, M.P.H., PA-C
American Academy of Veterinary Pharmaco!ogy and
Therapeutics, Carol A. Davis, Ph.D.
American Association of Critical-Care Nurses, Denise
Buonocore, R.N., M.S.N., CCRN, APRN-BC
American A>C>OLiation of Pharmaceuticaf Scientists, john Lisack
jr., CAE
American Botanica/ Council, Mark Blumenthal
American Chemical Society, Denise L. Creech
American College of C/inical Pharmacology, Stephen N. Keith,
M.O., M.S.P.H.
American College of Clinical Pharmacy, C. Edwin Webb,
Pharm.0., M.P.H.
American Co/lege of Physicians, B~ia~ L. Strom, M.O ..
American Dental Education Assoc1at1on, Vahn A. Lew1s,
Pharm.0., Ph.D.
American Geriatrics Society, Todd P. Semla, M.S., Pharm.D.,
BCPS, FCCP, AGSF
American Medica! Association, Barry D. Oickinson, Ph.D.
American Nurses Association, Rita Munley Gallagher, Ph.O.,
R.N.
American Optometric Association, Jimmy O. Bartlett, O.O.
American Pharmacists Association, Thomas E. Menighan,
R.Ph., M.B.A., FAPhA
American Public Hea/th Association, Oeborah K. Walker, Ed.O.
American Society far Clinicaf Pharmacology and Therapeutics,
Patricia W. Slattum, Pharm.0., Ph.D.
American Society far Microbio!ogy, Alice S. Weissfeld, Ph.D.
American Society far Nutrition, Robert M. Russell, M.O.
American Society far Parenteral and Entera! Nutrition, Todd W.
Canada, Pharm.D., BCNSP, FASHP
American Society far Pharmaco!ogy and Experimental
Therapeutics, jan M. Kitzen, Ph.D.
American Society far Quality, Oonald C. Singer, M.S.
American Society of Anesthesiologists, H.A. Tillmann Hein,
M.O., Ph.D.
American Society of Consu/tant Pharmacists, Thomas R. Clark,
R.Ph., MHS, CGP
American Society of Health-System Pharmacists, Paul W. Abra-
mowitz, Pharm.D., FASHP
American Veterinary Medica! Association, Donald C. Sawyer,
D.V.M., Ph.D.
Argentine Association of Industrial Pharmacy and Biochemistry,
Federico Montes de Oca, M.B.A.
Calibration and Validation Group, Herman Lam, Ph.D.
Canadian Pharmacists Association, Jeff Poston, Ph.D.
Canadian Society far Pharmaceutical Sciences, Neal M. Davies,
B.Sc. Pharm., Ph.D., R.Ph.
Drug !nformation Association, Susan. Cantr~ll . South Carolina Medica/ Association, Stephen lmbeau, M.O.,
European Federation far Pharmaceut1ca/ Soences, Hendnk J. de
Jong, Ph.D.
!nfusion Nurses Society, Mary C. Alexander, C.R.N.I., M.A.,
R.N., CAE, FAAN
/nstitute of Food Technologists, William Fisher, M.S.
lnternational Academy of Compounding Pharmacists, Matthew
Kopacki, B.S.Pharm.
lnternational Council of Nurses, David C. Benton, RGN, RMN,
BSC, MPhil, FFNF, FRCN
lnternational Society far Pharmaceutical Engineering, Stephen
M. Tyler, M.S.
USP 37
National Alliance of State Pharmacy Associations, Rebecca P.
Snead, R.Ph., B.S.Pharm.
National Community Pharmacists Association, Carolyn C. Ha,
Pharm.O.
National Pharmaceutical Association, Barry A. Bleidt, Ph.D.,
Pharm.0.
National Pharmacy Technician Association, Michael J.
Johnston, CPhT
New jersey Pharmaceutica/ Quality Control Association,
Barbara J. Ferguson, B.A.
Pan American Pharmaceutical Federation, Maria Elena
Girard-Cuesy
Parenteral Drug Association, /ne., Richard M. Johnson, M.Sc.
Regu!atory Affairs Professionals Society, Sherry L. Keramidas,
Ph.D., CAE
Society of Critica/ Care Medicine, Timothy G. Buchman, Ph.D.,
M.O., FACS, FCCM
Society of Nuclear Medicine, Jeffrey P. Norenberg, Pharm.0.
Western Compendia! Discussion Group, Assad J. Kazeminy,
Ph.D.
Asociaciones Profesionales y
Científicas de Profesionales de la
Salud-Sociedades Médicas
Estatales de los Estados Unidos
California Medica! Association, Charles W. Maas, M.O.,
M.P.H.
Connecticut State Medica/ Society, Eric B. Einstein, M.O.
Hawaii Medica/ Association, ]one G. Flanders, O.O.
!llinois State Medica! Society, Roy E. Weiss, M.O., Ph.D.
Indiana State Medica! Association, Daría Schooler, M.O., R.Ph.
lowa Medica! Society, Harold W. Miller, M.O.
Kansas Medica! Society, Tracie Collins, M.O., M.P.H.
Maine Medica! Association, Stevan Gressitt, M.O.
Massachusetts Medica/ Society, Bruce G. Karlin, M.O.
MedChi-Maryland State Medica! Society, Peter H. Rheinstein,
M.O., J.O., M.S.
Medica/ Association of the State of Alabama, Allan R.
Goldstein, M.O.
Medica! Society of New jersey, ]oseph N. Micale, M.O.
Medica! Society of the District of Columbia, Kim A. Bullock,
M.O.
Medica/ Society of the State of New York, Richard S. Blum,
M.O.
Minnesota Medica/ Association, Robert K. Meiches, M.O.,
M.B.A.
Missouri State Medica! Association, Thomas L. Holloway
Montana Medica! Association, ]ean Branscum
New Mexico Medica! Society, jerry D. Mclaughlin, M.O ..
North Dakota Medica! Association, Robert (Rob) W. Beatt1e,
M.O.
Pennsylvania Medica! Society, Ralph Schmeltz, M.O., FACP,
FACE
Puerto Rico Medica/ Association, Rolance G. Chavier-Roper,
M.O.
Rhode !stand Medica! Society, Peter A. Hollmann, M.O.
FACP, FAAAI
South Dakota State Medica/ Association, Edward P.
Amundson, M.O.
Tennessee Medica! Association, ]ohn J. lngram 111, M.O.
Texas Medica/ Association, Kevin H. McKinney, M.O., FACE,
FACP
Utah Medica/ Association, Michelle S. McOmber, B.S., M.B.A.
West Virginia State Medica! Association, Kevin W. Yingling,
M.O., R.Ph., FACP
Wisconsin Medica! Society, Thomas M. Oerrig, M.O.
 USP 37
Asociaciones Profesionales y
Científicas de Profesionales de la
Salud-Asociaciones
Farmacéuticas Estatales de los
Estados Unidos
Alabama Pharmacy Association, Louise F. jones
Alaska Pharmacists Association, Amber L. Briggs, Pharm.D.
Arizona Pharmacy Alliance, Kelly Ridgeway
Arkansas Pharmacists Association, Kristen G. Riddle, Pharm.D.
California Pharmacists Association, jon R. Roth, CAE
Colegio de Farmaceuticos de Puerto Rico, Milagros Morales,
R.Ph.
Colorado Pharmacists Society, Val Kalnins, R.Ph.
Connecticut Pharmacists Association, Peter J. Sposato, R.Ph.,
B.C.N.P.
Oe/aware Pharmacists Society, Kenneth (Kevin) Musto, R.Ph.
Florida Pharmacy Association, Michael A. Moné, j.D., R.Ph.,
FAPhA
Georgia Pharmacy Association, james "Jim" R. _Brace_well
Hawaii Pharmacists Association, Ronald T. Tan1guch1,
Pharm.D.
ldaho State Pharmacy Association, Pam Eaton
11/inois Pharmacists Association, Norman A. Hoback,
B.S.Pharm.
Indiana Pharmacists A/liance, Amy Hyduk, Pharm.D., M.B.A.
/owa Pharmacy Association, Thomas R. Temple, R.Ph., M.S.
Kansas Pharmacists Association, Michael Larkin
Kentucky Pharmacists Association, Matt Martin, Pharm.D.
Louisiana Pharmacists Association, Randall Brooks, B.S.
Maine Pharmacy Association, Laurier A. Lamie, R.P_h.
Maryland Pharmacists Association, Matthew G. Sh1moda,
Pharm.D.
Massachusetts Pharmacists Association, Steven D. Geoffroy,
R.Ph.
Michigan Pharmacists Association, joseph Ringer, M.B.A.
Mississippi Pharmacists Association, Kimsey O. Cooper,
Pharm.D.
Missouri Pharmacy Association, Ron L. Fitzwater, CAE, M.B.A.
Montana Pharmacy Association, Lori Morin, M.B.A., Pharm.D.
Nebraska Pharmacists Association, Samuel C. Augustine,
Pharm.D., FAPhA
New Hampshire Pharmacists Association, Elizabeth A.
Robertson, R.Ph.
New jersey Pharmacists Association, Steve H. Zlotnick,
Pharm.D.
New Mexico Pharmacists Association, William G. Troutman,
Pharm.D.
North Carolina Association of Pharmacists, Stephen F. Eckel,
Pharm.D., M.H.A.
North Oakota Pharmacists Association, Michael D. Schwab
Ohio Pharmacists Association, Amelia S. Bennett, R.Ph.
Ok/ahoma Pharmacists Association, Wiley L. Williams, j.D.
Oregon State Pharmacy Association, jennifer L. Davis,
Pharm.D., R.Ph.
Pennsylvania Pharmacists Association, George R. Haynes,
Pharm.D., Ph.D.
Pharmacy Society of Wisconsin, Terry L. Audley, R.Ph.
Rhode /stand Pharmacists Association, john Grossomanides,
Pharm.D.
South Carolina Pharmacy Association, jennifer L. Baker,
Pharm.D.
South Oakota Pharmacists Association, Leonard J. Petrik,
Pharm.D.
Tennessee Pharmacists Association, Baeteena M. Black, D.Ph.
Texas Pharmacy Association, Eric H. Frankel, MSE, Pharm.D.
Utah Pharmacists Association, Reid L. Barker
Virginia Pharmacists Association, Maria~ne R. R<;>llings, R.~h.
Washington O.C. Pharmaceut1cal Assoc1at1on, M1chael J. K1m,
Pharm.D.
Integrantes / Miembros xxix
Washington State Pharmacy Association, jeff Rochan,
Pharm.D.
West Virginia Pharmacists Association, Patty johnston, B.S.
Wyoming Pharmacy Assocmt1on, W1ll1am H. Rathburn, R.Ph.
Asociaciones de Fabricantes,
Comerciales y Afiliadas
American Chemistry Council, Michael P. Walls, Esq.
American Herba/ Products Association, Steven J. Dentali, Ph.D.
American Hospital Association, john R. Combes, M.D.
Animal Hea/th lnstitute, Richard A. Carnevale, V.M.D.
Biotechnology lndustry Organization, Earl S. Dye, Ph.D.
Bulk Drug Manufacturers Association, Airra Krishna Reddy,
B.Sc.
Compressed Gas Association, Michael B. Tiller, B.S., B.A.
Consumer Hea/th Products Canada, David S. Skinner
Consumer Hea/thcare Products Association, john Punzi, Ph.D.
Council far Responsible Nutrition, Douglas MacKay, N.D.
Egyptian Chamber of Pharmaceutical lndustry, Abdulla Molok-
hia, Ph.D.
Flavor and Extract Manufacturers Association, john H. Cox,
J.D.
Food Marketing lnstitute, Catherine M. Polley, R.Ph.
Generic Pharmaceutical Association, David R. Gaugh, R.Ph.
Grocery Manufacturers Association, Shannon M. Cole, M.S.,
PMP
Healthcare Distribution Management Association, Karen J.
Ribler
lndian Drug Manufacturers' Association, Daara B. Patel,
B.Com., D.l.M.M.
lntemational Dairy Foods Association, jon Gardner, B.S.
lntemational Federation of Pharmaceutica/ Manufacturers and
Associations, Odette Morin, Ph.D.
lntemational Food Additives Council, Haley C. Stevens, Ph.D.
lntemational Generic Pharmaceutica/ A/liance, Nicholas
Cappuccino, Ph.D.
lntemational Pharmaceutica/ Excipients Council of the
Americas, Priscilla Zawislak
Mexico's National Chamber of the Pharmaceutical /ndustry,
J. Rivelino Flores, M.Sc.
National Association of Chain Drug Stores, Alex J. Adams,
Pharm.D.
Personal Care Products Council, Halyna Breslawec, Ph.D., B.S.
Pharmaceutical Care Management Association, Greg S.
johnson, B.A.
Pharmaceutical Research and Manufacturers of America, Gina
Maria A. Marsee
The joint Commission, Crystal A. Riley, Pharm.D., R.Ph.
The jordanian Association of Manufacturers of Pharmaceuticals
& Medica/ Appliances, Hanan J. Sboul, M.B.A., CAE
Organismos No Gubernamentales
para el Establecimiento de
Normas y Determinación de
Conformidad
Accreditation Council far Pharmacy Education, Dimitra V. Trav-
los, Pharm.D., BCPS
American Type Culture Collection, Elizabeth J. Kerrigan, B.A.
AOAC lntemational, E. james Bradford, Ph.D.
Association far the Advancement of Medica/ lnstrumentation,
joseph Carl Lewelling, B.A., M.A.
Chilean Pharmacopeia Foundation, Caroline R.
Weinstein-Oppenheimer, Ph.D.
Clinical and Laboratory Standards lnstitute, Luann Ochs,. M.S.
Pharmacy Compounding Accreditation Board, joe Cabale1ro,
R.Ph.
URAC, jane A. Webster, B.S.N., M.B.A.
xxx Donantes / Integrantes USP 37

Reconocimiento para los

Donantes de Materiales de
Referencia y de
Monografías en 2012
La USP reconoce y agradece el apoyo de las empresas que Emerald Kalama Chemical, LLC
han participado en el establecimiento de las normas USP Enzymotec, Ltd.
mediante el aporte de información para el desarrollo de Excella GMBH
nuevas monografías o la donación de candidatos a materia- Ex ova
les de referencia. La siguiente lista incluye a las empresas Fermic, S.A. de C.V.
que aportaron monografías propuestas en 2012 o que do- Forest Laboratories, lnc.
naron candidatos a materiales de referencia establecidos Fresenius Kabi Oncology, Ltd.
como Estándares de Referencia USP durante 2012. Fuji Chemical Industries (USA) lnc.
Abbvie Galderma lnternational SAS
Acidchem lnternational Sdn Bhd Gattefosse Corporation SAS
ACS Dobfar GlaxoSmithKline
Actavis Glenmark Generics, Ltd.
Ajinomoto Aminoscience LLC Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co., Ltd.
Aker BioMarine AS Hoffman-LaRoche, lnc.
Albermarle Corporation ICL Performance Products
Alps Pharmaceutical lndustry, Co., Ltd. lndena, SPA
Angelini lnovo Biologic, lnc.
Apotex, lnc. lpca Laboratories, Ltd.
Arch Pharmalabs, Ltd. Johnson & ]ohnson
Arista Industries, lnc. Jubilant Lite Sciences, Ltd.
AstraZeneca Pharmaceuticals, lnc. KD Pharma GMBH
Aurobindo Pharma, Ltd. Laboratorios Miret, S.A.
BASF Corporation Lancaster Laboratories, lnc.
Bayer Pharm AG Linnea S.A.
Berlex Laboratories Loba Feinchemis GMBH
BioVittoria, Ltd. Lundbeck, lnc.
Boehringer lngelheim Lupin Pharmaceuticals, lnc.
Bristol-Myers Squibb Lusochimica SPA
Calyx Chemicals and Pharma, Ltd. Mateo Worldwide Corporation
Cambrex Charles City, lnc. Medichem S.A.
Cambrex Profarmaco Milano S.r.I. Megafine Pharma, Ltd.
Caraco Pharmaceutical Laboratories, Ltd. Merck & Co., lnc.
Cedarburg Hauser Pharmaceuticals Mitsubishi Gas Chemical America, lnc.
CF Pharma, Ltd. Mylan Pharmaceuticals, lnc.
Chattem Chemicals, lnc. Natural Remedies, Pvt. Ltd.
Chemigas, Ltd. Naturex, lnc.
Chemo lndustriale Chemica, S.r.I. Neuland Laboratories, Ltd.
Chirogate lnternational, lnc. Norquay Technology, lnc.
CHP Carbohydrate Pirna GMBH Novartis Pharmaceuticals Corporation
Cipla, Ltd. Novo Nordisk
Colorcon, lnc. Nutrition 21
Corden Pharma Latina, SPA Octal Pertochemical, LLC FZC
Cosma, SPA Omega Protein, lnc.
Covidien/Mallinckrodt Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Ltd.
Croda, lnc. Otsuka Pharmaceuticals Co., Ltd.
Dandreon Corporation Palsgaard A/S
Daiichi Sankyo Co., Ltd. Par Pharmaceutical Companies, lnc.
DMV-Fonterra Excipients Patheon, lnc.
Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Pfizer
DSM Nutritional Products, lnc. Pharmacosnos A/S
DuPont Tate & Lyle Bioproducts Piramal Healthcare, Ltd.
Egis Pharmaceuticals PLC Posh Chemicals Pvt., Ltd.
Eisai, lnc Procter & Gamble Pharmaceuticals, lnc.
Eli Lilly and Company Productos Aditivos, S.A.
EMD Millipore Corporation PureCircle
USP 37 Integrantes / Donantes xxxi

Qufu Shengren Pharmaceutical Co., Ltd. Strem Chemicals, lnc.

Quimica Sintetica S.A. Sun Pharmaceutical, Ltd.
Quingdao Fuso Refining and Processing Co., Ltd. Symbiotec Pharmalab, Pvt., Ltd.
Ranbaxy Pharmaceuticals, lnc. Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.
Reckitt Benckiser Healthcare, Ltd. Teva Pharmaceutical Industries, lnc.
Sandoz, lnc. Vertellus Specialties, lnc.
Sanofi-Aventis Vivimed Labs, Ltd.
ScinoPharm Taiwan, Ltd. Zhejiang Apeloa jiayuan Pharmaceutical Co., Ltd.
Shasun Pharmaceuticals, Ltd. Zhejiang Medicine Co., Ltd.
Sicor S.r.I. Zhejiang Orient Phytic Acid Co., Ltd.
Sifavitor S.r.I. Zhejiang Xianju junye Pharmaceutical Co., Ltd.
Smilax Laboratories, Ltd. Zydus Pharmaceuticals, lnc.
xxxii Acta Constitutiva USP 37

Acta Constitutiva
En mayo de 1900 la Convención le ordenó a la junta
Directiva que constituyera la asociación de la USP conforme
a la legislación del Distrito de Columbia (Estados Unidos de
América). La creación de la asociación se vio retrasada de-
bido a que la legislación del Distrito de Columbia exigía que
la mayoría de los funcionarios firmantes del Certificado de
Constitución fueran residentes del Distrito, por lo que fue
necesario designar representantes que cumplieran con tal
requisito. No obstante, se procedió a elaborar el Acta Cons-
titutiva, que se firmó e inscribió definitivamente el 11 de
julio de ese mismo año. A continuación figura el texto del
certificado original:

Certificado de Constitución

Por el presente, los suscriptos, ciudadanos de los Estados Unidos, mayores de edad y en su mayoría ciudadanos del
Distrito de Columbia, constituyen una asociación que se denominará The United States Pharmacofeial Convention, según lo
dispuesto en los artículos 545 a 552 inclusive, de las Leyes Revisadas de los Estados Unidos para e Distrito de Columbia y su
enmienda aprobada por Ley del Congreso, aprobada el día 23 de abril de 1884.
Esta Asociación se constituye por un plazo de novecientos noventa y nueve años. Su objeto es promover y fomentar la
ciencia y el arte de la medicina y la farmacia mediante la realización de investigaciones, experimentos y otros procedimientos
adecuados destinados a seleccionar y denominar materiales que puedan utilizarse apropiadamente como medicamentos y
fármacos, incluyendo fórmulas para su preparación; establecer normas y directivas uniformes para quienes practican la
medicina y la farmacia en los Estados Unidos, que les permitan determinar con exactitud la identidad, el contenido y la
pureza de tales medicamentos y fármacos, y otros propósitos afines y similares; e imprimir y distribuir en general, a intervalos
adecuados, las mencionadas fórmulas y los resultados de dichas selecciones, denominaciones y determinaciones de índole
similar, entre los miembros de esta Asociación, farmacéuticos y médicos generalmente de los Estados Unidos, así como entre
quienes tengan interés en la farmacia y en la medicina.
La administración y control de los asuntos, fondos y bienes de la Asociación durante su primer año de existencia estarán
a cargo de una junta Directiva, integrada por los siete miembros siguientes:

ALBERT E. EBERT GEORGE W. SLOAN

SAMUEL A.D. SHEPPARD HORATIO C. WOOD
WILLIAM S. THOMPSON CHARLES RICE
CHARLES E. DOHME

En fe de lo cual firmamos y sellamos el presente documento este séptimo día del mes de julio del año 1900.
WILLIAM S.THOMPSON [SELLO] MURRAY G. MOTIER [SELLO]
G. LLOYD MAGRUDER [SELLO] WILLIAM M. MEW [SELLO]
jOHN T. WINTER [SELLO] FRANK M. CRISWELL [SELLO]
THOMAS C. SMITH [SELLO]
USP 37 Gobierno de la USP xxxiii

Gobierno de la USP

Estatutos

Los Estatutos de USP para el período 201 0-2015 están disponibles en el sitio electrónico http://www.usp.org/about-usp/
/eadership/bylaws.

Normas y Procedimientos

Las Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos para el período 2010-2015 están disponibles en el sitio electró-
nico http://www.usp.org/about-usp/leadership/policies-rules/rules-procedures-20 70-20 75-council-experts.

Políticas de la USP

Las políticas de la USP están disponibles en el sitio electrónico http://www.usp.org/about-usp/leadership/policies-rules.

 FARMACOPEA DE LOS
USP 37 ESTADOS
, UNIDOS DE
AME RICA

Oficial desde el 1ºde mayo de 2014

TRIGÉSIMA SÉPTIMA REVISIÓN

© 2014 The United States Pharmacopeial Convention
12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852
Todos los derechos reservados.
USP 37 Incorporaciones xxxvii

Incorporaciones
Artículos Incorporados a USP 37 mediante
Suplementos

Primer Suplemento (1 º de agosto de 2013)

CAPÍTULOS GENERALES

(208) Valoración de Actividad Anti-Factor Xa y Anti-Factor lla
para Heparinas No Fraccionadas y de Bajo Peso Molecular
(1106) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y Validación de
lnmunoensayos para Detectar Anticuerpos Antifármacos
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos
(1229 .1) Esterilización con Vapor de Agua por Contacto Di-
recto
(1229.2) Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos
Acuosos
(1 724) Medicamentos Semisólidos-Pruebas de Desempeño
(2232) Contaminantes Elementales en Suplementos
Dietéticos

SUPLEMENTOS DIETÉTICOS

Gymnema Extracto Purificado de Gymnema

Extracto Nativo de Gymnema Gymnema en Polvo

MONOGRAFÍAS DE USP

Amlodipino y Clorhidrato de Benazepril, Cápsulas Fluconazol para Suspensión Oral

Amoxicilina y Ácido Clavulánico, Tabletas de Liberación Clorhidrato de lrinotecán, Inyección
Prolongada Latanoprost
Aripiprazol Lopinavir y Ritonavir, Tabletas
Clorhidrato de Atomoxetina Clorhidrato de Nicardipino
Ciprofloxacino, Tabletas de Liberación Prolongada Quinapril e Hidroclorotiazida, Tabletas
Citrato de Difenhidramina e lbuprofeno, Tabletas Ribavirina, Cápsulas
Clorhidrato de Dorzolamida, Solución Oftálmica Vigabatrina
Famciclovir
 1

xxxviii Incorporaciones USP 37

Segundo Suplemento (1 º de diciembre de 2013)

CAPÍTULOS GENERALES

(2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad de Productos (1229.3) Monitoreo de la Biocarga

(1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas-Información (1660) Envases de Vidrio-Evaluación de la Durabilidad de la
General y Glosario Superficie Interna
(1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas-Análisis por ln-
munotransferencia

SUPLEMENTOS DIETÉTICOS

L-5-Metiltetrahidrofolato de Calcio Salvia China en Polvo

Luteína, Cápsulas Valeriana, Tintura
Salvia China

MONOGRAFÍAS DE USP

Atomoxetina, Cápsulas Moxidectina

Biotina, Cápsulas Citrato de Orfenadrina, Aspirina y Cafeína, Tabletas
Biotina, Tabletas Oxcarbazepina, Tabletas
Carbidopa y Levodopa, Tabletas de Desintegración Oral Bromuro de Pancuronio, Inyección
Acetato de Cinc, Solución Oral Pioglitazona y Glimepirida, Tabletas
Colecalciferol, Cápsulas Pioglitazona y Clorhidrato de Metformina, Tabletas
Filgrastim Ritonavir, Cápsulas
Propionato de Fluticasona, Aerosol para Inhalación Ritonavir, Solución Oral
Propionato de Fluticasona, Polvo para Inhalación Ritonavir, Tabletas
Lamivudina, Solución Oral Rivastigmina
Levetiracetam, Tabletas de Liberación Prolongada Sipuleucel-T
Lomustina Torsemida, Tabletas
Lomustina, Cápsulas

Artículos Nuevos que Aparecen en USP 37 Ausentes en USP 36 y sus

Suplementos

[NOTA-Los artículos que se incluyen en esta lista se marcan en el libro éon los siguientes símbolos • •usm. Esto se aplica
tanto a los artículos nuevos como a secciones de artículos existentes que han tenido revisiones.]

CAPÍTULOS GENERALES

(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno (1911) Reometría

(735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X

SUPLEMENTOS DIETÉTICOS

N-Acetilglucosamina Ésteres de Astaxantina

Extracto en Polvo de Hojas de Albahaca Santa Quercetina
Hojas de Albahaca Santa Rutina
Hojas de Albahaca Santa en Polvo
USP 37 Incorporaciones xxxix

MONOGRAFÍAS DE USP

Cápsico, Tintura Clorhidrato de Moexipril

Carbidopa y Levodopa, Tabletas de Liberación Prolongada Clorhidrato de Moexipril, Tabletas
Cianocobalamina, Tabletas Clorhidrato de Moexipril e Hidroclorotiazida, Tabletas
Sulfato de Codeína, Solución Oral Clorhidrato de Prometazina y Clorhidrato de Fenilefrina,
Clorhidrato de Dexmedetomidina Solución Oral
Doxiciclina, Cápsulas de Liberación Prolongada Clorhidrato de Prometazina, Clorhidrato de Fenilefrina y
Escitalopram, Solución Oral Fosfato de Codeína, Solución Oral
lmiquimod Clorhidrato de Selegilina, Cápsulas
Levofloxacino, Tabletas Temozolomida, Suspensión Oral
Loratadina, Tabletas Masticables Topiramato, Cápsulas
Lumefantrina Triclocarbán
Clorhidrato de Memantina Zanamivir
Clorhidrato de Memantina, Tabletas

Artículos Incluidos en USP 36 Ausentes en USP 37

CAPÍTULOS GENERALES
(16) Métodos Automatizados de Análisis (1146) Prácticas de Envasado-Reenvasado de Medicamentos
(6,81) Reenvasado en Envases Unitarios y en Envases de Dosis Sólidos Orales en Envases de Dosis Única
Unica de Formas Farmacéuticas Sólidas y Líquidas No Estéri-
les

MONOGRAFÍAS DE USP
Clorhidrato de Bacampicilina Menotrofinas
Clorhidrato de Bacampicilina para Suspensión Oral Menotrofinas para Inyección
Clorhidrato de Bacampicilina, Tabletas Troleandomicina
Estradiol, Implantes Troleandomicina, Cápsulas
Estradiol, Suspensión Inyectable
 xi Lista Detallada USP 37

LISTA DETALLADA

Advertencias Generales, Monografías, Capítulos Generales, Reactivos y

Tablas Afectadas por Cambios que Aparecen en USP 37

Los números de página se refieren a USP 37. Nota-Las siguientes listas indican, entre paréntesis, seguido del título de la sección
o subsección, sí la sección es nueva o sí la subsección se agregó o eliminó de una sección ya existente. Las entradas que aparecen
sin ninguna designación de la forma "nueva," "agregada," o "eliminada," tienen cambios en la redacción que se incluyeron en el
texto oficial existente.

Estándar Certificado de Oxígeno (nuevo), 1739

Advertencias Generales Estándar Certificado de Oxígeno al 21 % (nuevo),
1740
Advertencias Generales, 1 Estándar Certificado de Oxígeno al 93% (nuevo),
7. Título y Revisión, 3. Cumplimiento de las 1740
Normas, 4. Monografías y Capítulos Generales, L-lsoleucina (nuevo), 1749
5. Componentes de las Monografías, 6. Prácti- Sulfanilamida, 1769
cas y Procedimientos de Prueba, 8. Términos y o-Tolidina, 1774
Definiciones y 7O. Conservación, Envasado, Al- Solyciones Volumétricas
macenamiento y Etiquetado Acid9 Perclórico, Décimo Normal (O, 1 N)
en Acido Acético Glacial, 1793
Capítulos Generales Hidróxido de Potasio, Normal (1 N), 1 795
Nitrito de Sodio, Décimo Molar (O, 1 M), 1798

Pruebas y Valoraciones Generales Tablas de Referencia

Pruebas y Valoraciones Químicas Especificaciones del Envase para Cápsulas y
(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción Tabletas
de Nitrógeno (nuevo), 212 Carbidopa y Levodopa, Tabletas de Liberación
(571) Vaíoración de Vitamina A, 324 Prolongada, 1 806
Métodos Químicos y Métodos Cromatográfícos Cianocobalamina, Tabletas, 1806
(581) Valoración de Vitamina D, 330 Clorhidrato de Memantina, Tabletas, 1808
Clorhidrato de Moexipril, Tabletas, 1808
Pruebas y Determinaciones Físicas Clorhidrato de Moexipril e Hidroclorotiazida, Ta-
(645) Conductividad del Agua, 391 bletas, 1808
Introducción, Especificaciones del Instrumento y Clorhidrato de Selegilina, Cápsulas, 1808
Parámetros de Funcionamiento y Agua a Granel Doxiciclina, Cápsulas de Liberación Prolongada,
(735) Espectrometría de Fluorescencía de Rayos X 1809
(nuevo), 463 Levofloxacino, Tabletas, 1811
Loratadina, Tabletas Masticables, 1811
Información General Topiramato, Cápsulas, 1814
Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos de
(1121) Nomenclatura, 1198 la U,SP y del NF
(1197) Buenas Prácticas de Distribución para Exci- Acido Láurico, 1819
pientes Farmacéuticos a Granel, 1 385 .A:torvastatina Cálcica, 1824
Sección 7: Introducción y Alcance; Sección 2: Clorhidrato de Dexmedetomidina, 1833
Calidad, Organización y Documentación; Sec- Clorhidrato de Memantina, 1834
ción 4: Bienes Devueltos, Despacho, Transporte, Clorhidrato de Moexipril, 1835
Importación, Adulteración y Rastreabílídad; Sec- Clorhidrato de Raloxifeno, 1836
cion 5: Excipientes Usados en la Preparación Clorhidrato de Ziprasidona (anhidro), 1837
Magistral en Farmacias; y Apéndice: Definicio- Clorhidrato de Ziprasidona (monohidrato), 1837
nes y Acrónimos Dapsona, 1841
(1911) Reometría (nuevo), 1632 lmiquimod, 1853
Leucovorina Cálcica, 1855
Lumefantrina, 1856
Reactivos, Indicadores y Triclocarbán, 1875
Soluciones Zanamivir, 1877

Monografías (USP 37)

Reactivos
Adenosina, 1969, ,
INFORMA,CION QUIMICA
Especificaciones de Reactivos DEFINICION
~cetato de Amilo, 1 707 IDENTIFICACIÓN
Acido Silicotúngstico, n-Hidrato, 1713 Absorción en el Infrarrojo, Prueba A; y
Cloruro Ferroso Tetrahidrato (nuevo), 1732 Prueba B (agregada)
Estándar Certificado de Nitrógeno (nuevo), 1739
USP 37 Lista Detallada xli

VALORACIÓN Impurezas Orgánicas, Procedimiento 7; e Im-

Procedimiento purezas Orgánicas, Procedimiento 2
IMPUREZAS (agregada) ,
Impurezas Orgánicas PRUEBAS ESPECIFICAS
PRUEBAS ESPECIFICAS Determinación de Agua, Método la
Intervalo o Temperatura de Fusión REQUISITOS ADICIONALES
(eliminada) Envasado y Almacenamiento, Etiquetado
REQUISITOS ADICIONALES (agregada) y Estándares de Referencia USP
Estándares de Referencia USP Atovacuona, 2236
Aire Medicinal, 1975 IMPUREZAS
IDENTIFICACION Compuestos Relacionados
Prueba f) (agregada) y Prueba B (agregada) Cloruro de Bencet9nio, 2301
VALORACION IDENTIFICACION
Procedimiento Prueba C,(agregada)
IMPUREZAS VALORACION
Introducción (agregada), Límite de Dióxido Procedimiento
de Carbono, Límite de Monóxido de Car~ono, IMPUREZAS
Límite de Dióxido de Azufre y Límite de Oxido Impurezas Orgánicas: Límite de Compuestos
Nítrico y Dióxi9o de Nitrógeno de Amonio (eliminada)
PRUEBAS ESPECIFICAS REQUISITOS ADICIONALES
Olor (eliminada) Estándares de Referencia USP
REQUISITOS ADICIONALES Cápsico, Tintura (nueva), 2487
Envasado y Almacenamiento y Etiquetado Carbidopa, 25Q4
Clorhidrato dE; Alfuzosina, 1997 VALORACION
DEFINICION Procedimiento
IDENTIFICACIÓN Carbidopa y Levotjopa, Tabletas, 2505
Prueba C, (agregada) IDENTIFICACION
VALORACION Prueba B,(agregada)
Procedimiento VALORACION
IMPUREZAS Procedimiento
Impurezas Orgánicas PRUEBAS DE DESEMPEÑO
REQUISITOS ADICIONALES Disolución
Estándares de Referencia USP Carbidopa y Levodopa, Tabletas de Liberación
Clorhidrato de Alfuzosina, Tabletas de Liberación Prolongada (nueva), 2508
Prolongada, 1998 _ Cefazolina, 2575 ,
PRUEBAS DE DESEMPENO IDENTIFICACION
Disolución Absorción en el Infrarrojo, Prueba A (agre-
Aloe, 2004 , gada) y frueba B
DEFINICION VALORACION
IDENTIFICACIÓN Procedimiento
Prueba A, Prueba B (agregada), Prueba C y IMPUREZAS
Prueba D, (eliminada) Impurezas Orgánicas (agregada)
VALORACION Cefazolina Sódica, ,2580
Contenido de ¿.taína (agregada) IDENTIFICACION
PRUEBAS ESPECIFICAS Prueba A
Determinación de Agua, Método 111 (elimi- VALORACIÓN
nada), Pérdida por Secado (agregada) y Ca- Procedimiento
racterísticas Botánicas IMPUREZAS
REQUISITOS ADICIONALES Impurezas Orgánicas
Estándares de Referencia USP (agregada) Cefdinir para Suspel)sión Oral, 2586
Clorhidrato de Anagrelida, 2164 PRUEBAS ESPECIFICAS
IMPUREZAS pH
Impurezas Orgánicas Clorhidrato de Cetirizina y Clorhidrato de Pseudo-
Anastrozol, 2198 efedrina, Tabletas de Libera_s:ión Prolongada, 2654
VALORACION PRUEBAS DE DESEMPENO
Procedimiento Disolución
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
Impurezas Orgánicas Etiquetado (agregada)
REQUISITOS ADICIONALES Cianocobalamina, Tabletas (nueva), 2660
Estándares de Referencia USP <;iprofloxacino y Dexametasona, Suspensión
Aspirina, Alúmina y Óxido de Magnesio, Tabletas, Otica, 2713
2217 IMPUREZAS
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Compuestos Relacionados de Dexametasona
Disolución Citalopram, Solución Oral, 2724
Atorvastatina CálJ=ica, 2.?32 IMPUREZAS
INFORMA,CION QUIMICA Impurezas Orgánicas
DEFINICION REQUISITOS ADICIONALES
IDENTIFICACIÓN Estándares de Referencia USP
Absorción, en el Infrarrojo, Prueba A Citalopram, Tal;lletas, 2726
VALORACION VALORACION
Procedimiento Procedimiento
OTROS COMPONENTES IMPUREZAS
Contenido de Propilenglicol (agregada) Impurezas Orgánicas
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
 1

xlii Lista Detallada USP 37

Clorhidrato de ,Clonidina, 2790 Límite de Hidrocarburos de Bajo Punto de

VALORACION Ebullición
Procedimiento Famotidina, 3383 ,
IMPUREZAS IDENTIFICACION
Impurezas Orgánicas Absorción en el Infrarrojo, Prueba A
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Estándares de Referencia USP Impurezas Orgánicas
Bisulfato de Clopidogrel, 2794 Flutamida, 357;4
IMPUREZAS VALORACION
Impurezas Orgánicas y Límite de Compuesto Procedimiento
Relacionado C de Clopidogrel (agregada) IMPUREZAS
REQUISITOS ADICIONALES Impurezas Orgánicas
Estándares de Referencia USP PRUEBAS ESPECIFICAS
Cloroxilenol, 2843 Intervalo o Temperatura de Fusión
IDENTIFICACIÓN (eliminada)
Prueba B,(agregada) REQUISITOS ADICIONALES
VALORACION Estándares de Referencia USP
Procedimiento Fumarato de Form,oterol, 3604
IMPUREZAS IDENTIFICACION
Impurezas Orgánicas Prueba B,(agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS VALORACION
Intervalo o Temperatura de Fusión Procedimiento
(eliminada) IMPUREZAS
REQUISITOS ADICIONALES Impurezas Orgánicas y Límite de Compuesto
Estándares de Referencia USP Relacionado I de Formoterol
Sulfato de Codeína, Solución Oral (nueva), 2879 REQUISITOS ADICIONALES
Mesilato de Deferoxamina, 2925 Etiquetado (eliminada) y Estándares de Refe-
VALORACION rencia USP
Procedimiento Griseofulvina, Tabletas, 3718
IMPUREZAS PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Impurezas Orgánicas Disolución
REQUISITOS ADICIONALES REQUISITOS ADICIONALES
Envasado y Almacenamiento Etiquetado
Andamiaje de, Dermis Bovina, 2932 Heparina, Soh,ición para Desbloqueo, 3746
DEFINICION , DEFINICIOt-J
PRUEBAS ESPECIFICAS VALORACION
Evaluación Histológica, Determinación de Pro- Potencia del Anti-Factor /la y Cloruro de
teínas, Análisis de Lípidos, Pérdida por Se- Sodio
cado, Electroforesis en Gel, Fuerza de Reten- Heparina Sód~~ 3747
ción de Sutura, Análisis Térmico, Inspección DEFINICION ,
Visual y Contenido de Plata (agregada) IDENTIFICACION
Matriz Dérmic;a Acelular Bovina, 2936 Espectro de RMN de H 1, Prueba A; Identidad
DEFINICION Cromatográfica, Prueba B; Cociente entre
PRUEBAS ESPECÍFICAS Antifactor Xa y Antifactor /la, Prueba C; De-
Evaluación Histológica, Determinación de Pro- terminaciones de Peso Molecular, Prueba D
teínas, Análisis de Lípidos, Pérdida por Se- (agregada); e Identificación-Pruebas Gene-
cado, Electroforesis en Gel, Fuerza de Reten- rales, Soqio, Prueba E
ción de Sutura, Análisis Térmico, Inspección VALORACION
Visual y Contenido de Plata (agregada) Potencia del Anti-Factor /la
Clorhidrato de Dexmedetomidina (nueva), 2974 IMPUREZAS
Doxiciclina, Cápsulas de Liberación Prolongada Límite de Galactosamina en Hexosamina To-
(nueva), 3151 tal, Impurezas Nucleotídicas e Impurezas
Oxalato de Escitalopram, 3286 Proteicas
VALORACION REQUISITOS ADICIONALES
Procedimiento Estándares de Referencia USP
IMPUREZAS Heparina Sód[ca, Inyección, 3752
Pureza Enantiomérica e Impurezas Orgánicas DEFINICION
REQUISITOS ADICIONALES VALORACIÓN
Estándares de Referencia USP Potencia del Anti-Factor /la
Escitalopram, Solución Oral (nueva), 3288 REQUISITOS ADICIONALES
Escitalopram, ,Tabletas, 3290 Envasado y Almacenamiento
DEFINICION Hipromelosa, 3,820
PRUEBAS DE DESEMPEÑO VALORACION
Disolución Procedimiento
IMPUREZAS IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas Metales Pesad9s, Método 111
REQUISITOS ADICIONALES PRUEBAS ESPECIFICAS
Etiquetado (agregada) y Estándares de Refe- pH y Viscosidad-Métodos del Viscosímetro
rencia USP Capilar y Métodos del Reómetro Rotatorio
Clorhidrato de Esmolol, 3294 REQUISITOS ADICIONALES
IMPUREZAS Envasado y Almacenamiento
, Impurezas Orgánicas lmiquimod (nueva), 3848
Eter, 3352 Lamivudina, 401? ,
IMPUREZAS INFORMA,CION QUIMICA
DEFINICION
USP 37 Lista Detallada xliii

VALORACIÓN Envasado y Almacenamiento

Procedimiento Clorhidrato de Me}oclopramida, 4354
OTROS COMPONENTES IDENTIFICACION
Contenido de Metano/ (agregada) Prueba A, Prueba By Prueba C (eliminada)
IMPUREZAS VALORACION
Otros Compuestos Relacionados Procedimiento
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Etiquetado (agregada) y Estándares de Refe- Pureza Cromatográfica (eliminada) e Impure-
rencia USP zas Orgánicas (agregada)
Lamivudina y Zidovudina, Tabletas, 4021 REQUISITOS ADICIONALES
IMPUREZAS Envasado y Almacenamiento y Estándares de
Impurezas Orgánicas Referencia USP
Levofloxacino, Tabletas (nueva), 4079 Clorhidrato de Moexipril (nueva), 4424
Lidocaína, Ungüen,to, 4092 Clorhidrato de Moexipril, Tabletas (nueva), 4426
IDENTIFICACION Clorhidrato de Moexipril e Hidroclorotiazida, Ta-
Prueba B,(agregada) bletas (nueva), 4428
VALORACION Nimodipino, 4567
Procedimiento DEFINICION
REQUISITOS ADICIONALES VALORACIÓN
Envasado y Almacenamiento y Estándares de Procedimiento
Referencia USP Nitrofurantoína, Cápsulas, 1577
Clorhidrato de Lid9caína, Gel, 4095 PRUEBAS DE DESEMPENO
IDENTIFICACION Disolución
Prueba B,(agregada) Olanzapina y Fjuoxetina, Cápsulas, 4625
VALORACION VALORACION
Procedimiento Procedimiento
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Envasado y Almacenamiento y Estándares de Impurezas Orgánicas
Referencia USP Oxibenzona, 4705,
Loratadina, Tabletas Masticables (nueva), 4141 IDENTIFICACION
Lumefantrina (nueva), 4160 Prueba B
Clorhidrato de Memantina (nueva), 4241 VALORACIÓN
Clorhidrato de Memantina, Tabletas (nueva), Procedimiento
4243 Oxígeno, 4724 , ,
Mentol, 4249, INFORMACIO[)J QUIMICA
DEFINICION , IDENTIFICACION
IDENTIFICACION Prueba A,y Prueba B
Prueba~ y Prueba B (agregada) VALORACION
VALORACION Procedimiento
Procedimiento (agregada) IMPUREZAS
IMPUREZAS Introducción (agregada), Límite de Dióxido
Pureza Cromatográfica (eliminada) y Com- de Carbono y Límite de Monóxido de
puestos Relacionados (agregada) Carbono ,
REQUISITOS ADICIONALES PRUEBAS ESPECIFICAS
Estándares de Referencia USP (agregada) Olor (eliminada)
Clorhidrato de Mepivacaína, 4253 REQUISITOS ADICIONALES
IDENTIFICACION Envasado y Almacenamiento y Etiquetado
Prueba B Oxígeno al 93 por,Ciento, 4724
VALORACIÓN IDENTIFICACION
Procedimiento Prueba A,y Prueba B
IMPUREZAS VALORACION
Impurezas Orgánicas y 2,6-Dimetilanilina Procedimiento
(agregada) IMPUREZAS
REQUISITOS ADICIONALES Introducción (agregada), Dióxido de Carbono
Estándares de Referencia USP y Monóxido dt; Carbono
Meropenem pqra Inyección, 4266 PRUEBAS ESPECIFICAS
VALORACION Olor (eliminada)
Procedimiento REQUISITOS ADICIONALES
IMPUREZAS Envasado y Almacenamiento y Etiquetado
Impurezas Orgánicas Pectina, 4786
Metilcelulosa, 4317 IMPUREZAS
INTRODUCCION Metano/ (Alcohol Metílico), Etanol (Alcohol) e
VALORACIÓN /sopropanol (2-Propanol)
Procedimiento REQUISITOS ADICIONALES
PRUEBAS ESPECÍFICAS Estándares de Referencia USP
Viscosidad-Métodos del Viscosímetro Capi- Penicilina G Potásica, Tabletas, 4803
lar, Métodos del Reómetro Rotatorio y pH PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Metocarbamol, lnxección, 4351 Disolución
IDENTIFICACION PRUEBAS ESPECÍFICAS
Prueba B,(agregada) Pérdida por Secado (eliminada)
VALORACION Clorhidrato de Prometazina y Clorhidrato de Fe-
Procedimiento nilefrina, Solución Oral (nueva), 5016
IMPUREZAS Clorhidrato de Prometazina, Clorhidrato de Fe-
Límite de Aldehídos nilefrina y Fosfato de Codeína, Solución Oral
REQUISITOS ADICIONALES (nueva), 5019
xliv Lista Detallada USP 37

Clorhidrato de Ropinirol, 5198 Límite de Compuesto Relacionado C de Clo-

IDENTIFICACION ruro de Trospium
Prueba B e Identificación-Pruebas Generales, Clorhidrato di; Veraparnilo, 5727
Cloruros, Prueba C DEFINICIOt'-J
IMPUREZAS VALORACION
Impurezas Orgánicas, Procedimiento 7 (agre- Procedimiento
gada), Impurezas Orgánicas, Procedimiento 2 PRUEBAS ESPECÍFICAS
(agregada) e Impurezas Orgánicas, Procedi- Intervalo o Temperatura de Fusión
miento 3 (agregada) (eliminada)
REQUISITOS ADICIONALES Clorhidrato de Verapamilo, Cápsulas de Libera-
Etiquetado (agregada) y Estándares de Refe- ción Prolongada, 5728 _
rencia USP PRUEBAS DE DESEMPENO
Ropinirol, Tabletas, 5202 Disolución
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
Impurezas Orgánicas Etiquetado (agregada)
RFQUISITOS ADICIONALES Vitamina A, Preparación Oral Líquida, 5754
Estandares de Referencia USP DEFINICIOt--J
Secobarbital Sódic9, Cápsulas, 5234 VALORACION
IDENTIFICACION Vitamina A
Prueba A,y Prueba B Zanamivir (nueva), 5793
VALORACION
Valoración de Barbitúricos (eliminada) y Pro- Monografías (Suplementos
cedimiento (agregada]
PRUEBAS DE DESEMPENO Dietéticos)
Uniformidad de Unidades de Dosificación
IMPUREZAS N-Acetilglucosamina (nueva), 581 7
Impurezas Orgánicas (agregada) Hojas de Albahaca Santa (nueva), 5834
Clorhidrato de Selegilina, Cápsulas (nueva), 5239 Hojas de Albahaca Santa en Polvo (nueva), 5836
Salicilato de Sodio, 5298 Extracto en Polvo de Hojas de Albahaca Santa
IDENTIFICACION (nueva), 5838
Absorción en el Infrarrojo, Prueba A Esteres de Astaxantina (nueva), 5848
(agregada) Equinácea Angustifolia, 5950
REQUISITOS ADICIONALES DEFINICION ,
Estándares de Referencia USP (agregada) IDENTIFICACION
Tacrolimus, 5379 Prueba A, prueba B y Prueba C
IMPUREZAS COMPOSICION
Impurezas Orgánicas, Procedimiento 2 Contenido de Fenoles Totales
REQUISITOS ADICIONALES CONTAMINANTES
Estándares de Referencia USP Metales Pesados, Método JI/ (eliminada) e
Clorhidrato de Tamsulosina,, Cápsulas, 5399 Impurezas Elementales-Procedimientos
PRUEBAS DE DESEMPENO (agregada)
Disolución REQUISITOS ADICIONALES
Temozolomida, 5439 Estándares de Referencia USP
IMPUREZAS Equinácea Angustifolia en Polvo, 5954
Impurezas Orgánicas DEFINICION ,
Temozolomida, Suspensión Oral (nueva), 5440 IDENTIFICACION
Tioguanina, Tablet9s, 5536 Prueba A, prueba B y Prueba C
IDENTIFICACION COMPOSICION
Prueba A,y Prueba B (agregada) Contenido de Fenoles Totales
VALORACION CONTAMINANTES
Procedimiento Metales Pesados, Método /JI (eliminada) e
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Impurezas Elementales-Procedimientos
Disolución (agregada)
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
Impurezas Orgánicas (agregada) Estándares de Referencia USP
REQUISITOS ADICIONALES Extracto en Polvo de Equinácea Angustifolia,
Envasado y Almacenamiento y Estándares de 5958 ,
Referencia USP DEFINICION ,
Tizanidina, Tabjetas, 5551 IDENTIFICACION
VALORACION Prueba A, prueba B (agregada) y Prueba C
Procedimiento COMPOSICION
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Contenido de Fenoles Totales
Disolución CONTAMINANTES
IMPUREZAS Metales Pesados, Método JI (eliminada) e
Impurezas Orgánicas Impurezas Elementales-Procedimientos
Tobramicina, Soluciqn para Inhalación, 5559 (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS REQUISITOS ADICIONALES
Absorbancia, pH y Osmolalidad y Estándares de Referencia USP
Osmolaridad Equinácea Pálida, ?961
Topiramato, Cápsulas (nueva), 5586 IDENTIFICACION
Triclocarbán (nueva), 5634 Prueba A, prueba B y Prueba C
Cloruro de Trospiu,m, 5672 COMPOSICION
IDENTIFICACION Contenido de Feno/es Totales
Prueba C (agregada) CONTAMINANTES
IMPUREZAS
USP 37
Metales Pesados, Método 111 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Equinácea Páljda en Polvo, 5964
DEFINICION ,
IDENTIFICACION
Prueba A, prueba B y Prueba C
COMPOSICION
Contenido de Fenoles Totales
CONTAMINANTES
Metales Pesados, Método 111 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Extracto en Polvo 9e Equinácea Pálida, 5967
IDENTIFICACION
Prueba A, prueba B y Prueba C (agregada)
COMPOSICION
Contenido de Fenoles Totales
CONTAMINANTES
Metales Pesados, Método 11 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Equinácea Pucpúrea en Polvo, 5970
DEFINICION ,
IDENTIFICACION
Prueba A, prueba B y Prueba C
COMPOSICION
Contenido de Fenoles Totales
CONTAMINANTES
Metales Pesados, Método 111 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Extracto en Polvo 9e Equinácea Purpúrea, 5973
IDENTIFICACION
Prueba A, prueba By Prueba C (agregada)
COMPOSICION
Contenido de Fenoles Totales
CONTAMINANTES
Metales Pesados, Método 11 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Equinácea Purpúre,a, Partes Aéreas, 5977
IDENTIFICACION
Prueba A Y, Prueba B
COMPOSICION , , Contenido de lsoflavonas
Contenido de Acido Chicórico y Acido
Caftárico
CONTAMINANTES
Metales Pesados, Método 111 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Raíz de Equinácea ,Purpúrea, 5980
IDENTIFICACION
Prueba A, prueba B y Prueba C
COMPOSICION
Lista Detallada xlv
Contenido de Fenoles Totales
CONTAMINANTES
Metales Pesados, Método 111 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Quercetina (nueva), 6124
Rutina (nueva), 6127
Extracto de S~renoa, 6153
DEFINICION
IDENTIFICACIÓN
Cromatogrpfía de Gases, Prueba A
COMPOSICION ,
Contenido de Acidos Grasos y Contenido de
Alcoholes de C,adena Larga y Esteroles
PRUEBAS ESPECIFICAS
Grasas y Aceites Fijos, Materia lnsaponificable
(eliminada)
Trébol Rojo, 6,166
DEFINICION ,
IDENTIFICACION
Prueba A, Prueba B (agregada), Prueba C
(agregada),y Prueba D
COMPOSICION
Contenido de /soflavonas
CONTAMINANTES
Metales Pesados (eliminada) e Impurezas
Elementales-J?rocedimientos (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Características Botánicas
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Trébol Rojo en Polyo, 6169
IDENTIFICACION
Prueba A, Prueba B (agregada), Prueba C
(agregada),y Prueba D
COMPOSICION
Contenido de lsoflavonas
CONTAMINANTES
Metales Pesados (eliminada) e Impurezas
Elementales-J?rocedimientos (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Características Botánicas
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Extracto en P9lvo de Trébol Rojo, 6172
DEFINICION
IDENTIFICACIÓN
Cromatografía en Capa Delgada, Prueba A;
Cromatografía en Capa Delgada, Prueba B
(agregada); y Prueba de Identificación por
HPLC, PruetJa C
COMPOSICION
CONTAMINANTES
Metales Pesados, Método 11 (eliminada) e
Impurezas Elementales-Procedimientos
(agregada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
Trébol Rojo, Tabletas, 6175
CONTENIDO
Contenido de lsoflavonas
REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP
USP 37
Advertencias y Requisitos
Aplicables a las Normas, Pruebas,
Valoraciones y Otras Especificaciones
de la Farmacopea de los Estados Unidos
1. Título y Revisión ....................... 3
2. Estado Oficial y Reconocimiento
Legal ................................... 3
2. in. Texto Oficial ........................... 3
2.20. Artículos Oficiales ....................... 3
2.30. Reconocimiento Legal .................... 3
3. Cumplimiento de las Normas ........... 4
3.1 O. Aplicabilidad de las Normas ................ 4
3.20. Indicación de Cumplimiento ................ 4
4. Monografías y Capítulos Generales ..... 5
4.1 O. Monografías ........................... 5
4.20. Capítulos Generales ...................... 5
5. Componentes de las Monografías ...... 5
5.1 O. Fórmulas Moleculares ..................... 5
5.20. Sustancias Agregadas ..................... 5
5.30. Descripción y Solubilidad .................. 6
5.40. Identidad ............................. 6
5.50. Valoración ............................. 6
5.60. Impurezas y Sustancias Extrañas ............. 7
5.70. Pruebas de Desempeño ................... 7
5.80. Estándares de Referencia USP ............... 7
6. Prácticas y Procedimientos de
Prueba ................................. 7
6.1 O. Prácticas Seguras de Laboratorio ............. 7
6.20. Procedimientos Automatizados .............. 7
6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados ............................. 7
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes .............. 7
6.50. Preparación de Soluciones ................. 8
6.60. Unidades Necesarias para Completar una
Prueba .................................. 8
Advertencias Generales 1
Generales
6.70. Reactivos .............................. 8
6.80. Equipo ............................... 8
7. Resultados de Pruebas ................. 9
7.1 O. Interpretación de los Requisitos .............. 9
7.20. Reglas para Redondeo .................... 9
8. Términos y Definiciones ................ 9
8.1 O. Abreviaturas ........................... 9
8.20. Aproximadamente ...................... 9
8.30. Contenido de Alcohol ................... 1O
8.40. Pesos Atómicos ....................... 1O
8.50. Determinaciones con Blancos ............. 1O
8.60. Concomitantemente .................... 10
8.70. Desecador ........................... 1O
8.80. Logaritmos ........................... 1O
8.90. Cepas Microbianas ..................... 1O
8.100. Inapreciable .......................... 1O
8.11 O. No menos de (NLT) y No más de (NMT) ..... 1O
8.120.' Olor ............................... 10
8.130. Por ciento ........................... 1O
8.140. Concentraciones Porcentuales ............. 1O
8.150. Presión ............................. 1O
8.160. Tiempo de Reacción .................... 1O
8.1 70. Peso Específico ....................... 1O
8.180. Temperaturas ........................ 1O
8.190. Tiempo ............................. 1O
8.200. Transferir ............................ 1O
8.21 O. Vacío .............................. 1O
8.220. Desecador al Vacío ..................... 1O
8.230. Agua .............................. 1O
8.240. Pesos y Medidas ...................... 1O
9. Prescripción y Dispensación ........... 12
9 .1 O. Uso de Unidades tvfétricas ................ 12
9.20. Cambios en Volumen .................... 12
2 Advertencias Generales USP 37

1 O. Conservación, Envasado, Almacena- 10.1 O. Envasado y Almacenamiento .............. 12

1 0.40. Etiquetado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
miento y Etiquetado ................... 12
 USP 37
ADVERTENCIAS Y
REQUISITOS GENERALES
La sección de Advertencias y Requisitos Generales (en lo
sucesivo, Advertencias Generales) presenta las suposiciones
básicas, definiciones y condiciones que se usan por defecto
para la interpretación y aplicación de la Farmacopea de los
Estados Unidos de America (USP, por sus siglas en inglés) y
del FormulC!r!o Nacional (NF, por sus siglas en inglés).
Los requ1s1tos establecidos en estas Advertencias Generales
se aplican a todos los artículos reconocidos en la USP y en el
NF (en lo sucesivo, los "compendios") y a todos los capítu-
los generales, a menos que se especifique algo diferente.
Cuando los requisitos de una monografía individual sean di-
ferentes a los de las Advertencias Generales o de un capítulo
general, los requisitos de la monografía se aplicarán y reem-
plazarán a los requisitos de las Advertencias Generales o del
capítulo general, aunque la monografía no haga mención
expresa de las diferencias.
Cambio en la redacción:
1. TÍTULO Y REVISIÓN
El título completo de esta publicación (que consiste en
cuatro volúmenes e incluye sus Suplementos) es: Farmacopea
de los Estados Unidos de América, Trigésima Séptima Revisión
y Formulario Nacional, Trigésima Segunda Edición. Estos títu-
los pueden abreviarse a USP 37, a NF 32, y a USP 37-NF 32.
La Farmacopea de los Estados Unidos, Trigésima Séptima Revi-
sión, y el Formulario Nacional, Trigésima Segunda Edición,
reemplazan a todas las revisiones anteriores. Cuando se em-
plean las siglas "USP", "NF" o "USP-NP' sin ningún otro
calificativo, las mismas se refieren únicamente a USP 3 7, NF
32, y a sus Suplementos, durante el tiempo que estos com-
pendios estén vigentes. Los mismos títulos, sin ninguna dis-
tinción, se aplican tanto a la presentación impresa como a
la electrónica de este contenido. Aunque la USP y el NF se
publican en forma conjunta y comparten estas Advertencias
Generales, cada uno de ellos constituye por sí mismo un
compendio separado.
Esta revisión es oficial a partir del 1 º de mayo de 2014, a
menos que se indique algo diferente mediante un texto
específico.
Los Suplementos de la USP y el NF se publican
periódicamente.
Los lnterim Revision Announcements (Anuncios de Revisión
Intermedia) son revisiones de la USP y del NF que se publi-
can en el sitio Web de la USP. Los lnterim Revision Announce-
ments contienen revisiones oficiales y sus fechas de entrada
en vigencia. Asimismo, el sitio Web de la USP, en el apar-
tado "New Official Text" (Nuevo Texto Oficial) incluye
anuncios de disponibilidad de nuevos Estándares de Referen-
cia USP y anuncios de pruebas o procedimientos que se
mantienen en suspenso por falta de los Estándares de Refe-
rencia USP requeridos.
Los Revision Bul/etins (Boletines de Revisión) son revisiones
del texto oficial o aplazamientos que requieren de publica-
ción expedita. Se publican en el sitio Web de la USP y, por
lo general, se oficializan inmediatamente, a menos que se
indique algo distinto en el Boletín de Revisión.
La Errata (Fe de Erratas) comprende las correcciones a ar-
tículos publicados erróneamente que no han sido aprobados
por el Consejo de Expertos y que no reflejan los requisitos
oficiales. ••vsP11
Advertencias Genero/e~ 3
2. ESTADO OFICIAL Y RECONOCIMIENTO LEGAL
2.1 O. Texto Oficial
El Texto Oficial es el texto contenido en la USP y el NF,
incluidas las monografías, los capítulos generales y estas Ad-
vertencias Generales. Las revisiones al texto oficial se presen-
tan en los Suplementos, lnterim Revision Announcements y Re-
vision Bulletins. Los capítulos generales con numeración del
1000 al 1999 se consideran explicativos y están destinados a
definir, describir o informar sobre un tema en particular. No
contienen requisitos obligatorios aplicables a ningún artículo
oficial a menos que sean referidos por las Advertencias Gene-
rales, una monografía o un capítulo general con numeración
inferior a 1000. Los capítulos generafes con numeración su-
perior a 2000 aplican únicamente a artículos destinados
p~ra, s.u uso como ingredientes dietéticos y suplementos
d1etet1cos.
2.20. Artículos Oficiales
Un artículo oficial es un artículo reconocido en la USP o el
NF. Se considera que un artículo está reconocido e incluido
en un compendio cuando se publica su monografía en el
compendio y se le asigna una fecha oficial a la misma en
forma específica o general.
El título especificado en una monografía es el título oficial
para ese artículo. Los nombres que se consideren sinónimos
de títulos oficiales no pueden ser utilizados para sustituir a
los nombres oficiales.
Los artículos oficiales incluyen tanto sustancias oficiales
como productos oficiales. Una sustancia oficial es un fármaco,
excipiente, ingrediente dietético u otro ingrediente, o un
componente de un dispositivo terminado para el cual el tí-
tulo de la monografía no incluye indicación alguna sobre la
naturaleza de la forma terminada.
Un producto oficial es un producto farmacéutico, suple-
mento dietético, preparación magistral, o dispositivo termi-
nado para el cual se provee una monografía.
2.30. Reconocimiento Legal
Los compendios USP y NF están reconocidos por las legis-
laciones y reglamentaciones de muchos países del mundo.
Las autor¡dades reguladoras pueden hacer cumplir las nor-
mas presentadas en la USP y el NF; no obstante, debido a
que el reconocimiento de los compendios USP y NF puede
variar de país a país, se recomienda que los usuarios conoz-
can las legislaciones y reglamentaciones aplicables. En los
Estados Unidos, de acuerdo con la Federal Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y
Cosméticos o FDCA), tanto la USP como el NF están recono-
cidos como compendios oficiales. Un medicamento con un
nombre reconocido en USP-NF debe cumplir con las normas
farmacopeicas de identidad o se le considerará adulterado,
rotulado incorrectamente (misbranded) o ambos. Ver, p.ej.,
la FDCA § 501 (b) y 502(e)(3)(b); ver también las reglamen-
taciones de la FDA, el Título 21 del CFR § 299.5(a&b). Para
evitar que se les considere adulterados, los medicamentos
deben cumplir además con las normas farmacopeicas de
contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el
etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento
difiere. Ver, p.ej., FDCA § 501 (b) y Título 21 del CFR §
299.5(c). Asimismo, para evitar que se les considere rotula-
dos incorrectamente, los medicamentos reconocidos en los
compendios USP-NF deben también envasarse y etiquetarse
de conformidad con las normas farmacopeicas. Ver la FDCA
§ 502(g).
 4 Advertencias Generales
Un suplemento dietético que dec!ara cumplir con las es-
pecificaciones de USP se considerara como u.n. a/1men~o in-
correctamente rotulado (misbranded food) s1 incumpliera
con las mismas. Ver la FOCA § 403(s)(2)(D).
La ejecución de las normas USP es responsabilidad de la
FDA y demás autoridades gubernar:rientale~ en los EE.UU. y
demás países. La USP no desempena ningun papel en la
ejecucion de las normas.
Cambio en la redacción:
3. CUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS
3. 1 O. Aplicabilidad de las Normas
Las normas para un artículo reconocido en '"'l?s comp~n­
dios (USP-NF).., 115p 11 se expresan en la monograf1a del arti-
culo, en los capítulos generales aplicables y en las Adverten-
cias Generales. La identidad, contenido, calidad y pureza de
un artículo se determinan mediante pruebas, procedimien-
tos y criterios de aceptación oficiales, incluidos ya sea ~n su
monografía, en las Advertencias Generales o ~n los cap1tulos
generales aplicables, a menos que_ se exc_eptue en algu~a
otra parte de Jos compendios. Esta perm1t1da la adopc1on .
temprana de las normas revisadas. Cuando las normas revi-
sadas para un artículo existente hayan sido publicadas como
"texto oficial" aprobado (conforme a lo aprobado en la _sec-
ción 2.1 O) pero aún no sean oficiales ~~eis meses ~espues de
su publicación, a menos que se espec1f_1q~e algo distinto; ver
"fecha oficial," sección 2.20), el cumpl1m1ento con la norma
revisada no excluirá una determinación o indicación de
cumplimiento con las normas_'"'~armacop~ic;as.o.usP11, a menos
que la USP especifique algo distinto proh1b1endo la adop-
ción temprana en una norma en particular.
Las normas en la monografía, capítulo(s) general(es) y Ad-
vertencias Generales pert~nentes son aplicables er:i_ todo mo-
mento de Ja vida del articulo, desde su producc1on hasta su
caducidad. Las especi!ica~iones del fabri~a~t~ y l~s buenas .
prácticas de fabricacion (incluyendo, p.ej., 1nic1at1v_as de Cali-
dad por Diseño), por lo general, se desarrollan y siguen para
asegurar que el artículo cumpli:á con_ las normas farmaco-
peicas hasta su fecha de caducidad, siempre que se alma-
cene de acuerdo con las instrucciones dadas al respecto. Por
consiguiente, se espera que todo artículo ?ficial cumpla co!1
las normas farmacopeicas_ en c~so _de analizarse, y to<;Jo art1~
culo oficial analizado segun se 1nd1ca en la monograf1a perti-
nente debe cumplir con tales normas para demostrar el
cumplimiento. . _
En ocasiones, las normas farmacope1cas toman el caracter
de procedimientos estadísticos c:ua_ndo implican_ ur:iidades
múltiples y, posibl~mente, un_ diseno d~ proced1m1en~o se-
cuencial que permite al usuario determina~ qye el articulo
analizado cumple o no con la_ norma . La s1_m1/1tud con_ pro-
cedimientos estadísticos podna sugerir un intento de infe-
rencia para algún grupo de unidades má_s grande, pero en
todos los casos las declaraciones sobre s1 se ha cumplido
con la norma f~rmacopeica sólo aplica a las unidades anali-
zadas. Los compendios no indican ni prohíben_ l~s repeticio-
nes las mediciones múltiples, el rechazo estad1st1co de valo-
res 'aberrantes o las extrapolaciones de los resultados a
poblaciones más grandes! .n! tampoco la. necesidad y fre-.
cuencia adecuada del anal1s1s de las partidas. La frecuencia
del análisis y el muestreo se deja libre a las prefere_n_c~as o
instrucciones de aquéllos que llevan a cabo los anal1s1s P?ra
determinar el cumplimiento con las normas y a los ciernas
usuarios de USP-NF, incluidos fabricantes, compradores o
autoridades regluladoras.
Los productos oficiales se prepara~ de acuerdo con ~c;s
principios reconocidos de buenas practicas de fabncac1on y
a partir de ingredientes que cumplan con. las normas _de USP
o NF, siempre que existan normas para dichos 1ngred1entes
(para suplementos dietéticos, ver la secci?n 3._l 0-,2~).
Las sustancias oficiales se elaboran segun pnnc1p1os reco-
nocidos de buenas prácticas de fabricación con ingredientes
que cumplen con las especificaciones establecidas para ase-
USP 37
gurar que las sustancias resultantes cumplan con los requisi-
tos de las monografías oficiales.
3.10.10. Aplicabilidad de las Normas a Productos
Farmacéuticos, Fármacos y Excipientes
Las normas correspondientes de los compendios USP o NF
se aplican a cualquier artículo comercializado en los Estados
Unidos que (1) se reconozca en el compendio y (2) que se
destine o etiquete para su uso como medicamento o como
ingrediente de un medicamento. '"'Dichos artículos (produc-
tos farmacéuticos, fármacos y excipientes) incluyen medica-
mentos para humanos ~ya sea ~füpensados. con receta, "de
venta libre" o de otro tipo), as1 como medicamentos para
animales ..o.usP31 Las normas correspondientes se aplican a di-
chos artículos independientemente de que se agregue o no
Ja denominación "USP" o "NF". Las normas se aplican por
igual a los artículos con títulos oficiales o nombres deriv_ados
por transposiciones de las palabras que componen Jos t1tulos
oficiales, o por transpos1c1on en el orde_n de lo~ r:iombres de
dos o más ingredie~tes activos en_ los Mu_los of1c1ales, o
cuando se usen sinonimos con la 1ntenc1on o efecto de su-
gerir un grado significativo de identidad con el título o
nombre oficial.
3.10.20. Aplicabilidad de las Normas a Dispositivos
Médicos, Suplementos Dietéticos y a sus Componentes e
Ingredientes .
Un artículo reconocido en la USP o el NF debe cumplir
con las normas farmacopeicas si el artículo_ es u.n. dispo_si~ivo
médico componente destinado para un d1spos1t1vo medico,
suplem~nt~ dietético, ingrediente di.~tético, u otro ingre-
diente destinado para su 1ncorporac1on en un suplemento
dietético, y si declara en su etiquetado el cumplimiento con
los compendios USP o NF. .
En general, los suplementos dietéticos se elaboran con_ in-
gredientes que cumplen con las normas de los c;ompend1os
USP NF o Food Chemicals Codex. Cuando no existen tales
nor(nas,' las sustancias pueden usarse en suplemen~os di~t.é­
ticos siempre que hayan mostrado ser de grado a/1ment1c10
de calidad aceptable utilizando otros procedimientos
adecuados.
3.20. Indicación de Cumplimiento
Un producto farmacéutico, fármaco o excipiente puede
usar Ja denominación "USP" o "NF" junto a su título oficial
o en otra parte de la etiqueta únicamen_t~ cuando: (1) exi_ste
una monografía en el compendio espec1f1cado y (2) el a_rt1-
culo cumple con la identidad estipulada en el compendio
correspondiente. _ . _
Cuando se determina que un producto farmaceut1co_, far-
maco o excipiente difiere de las normas L(SP o NF pertinen-
tes de contenido, calidad, o pureza al aplicar las pruebas,
procedimientos y criterios de acepta~ión es_tablec1dos. en_ el
compendio correspondiente, estas d1ferenc1as deben indi-
carse de forma clara en la etiqueta.
Cuando un producto farmacéutico, fármaco o excipi~nte
no cumple con la identidad estipulada en !oscorr:ipen<;J1os
USP o NF o se le ha agregado una sustancia que 1nterf1ere
con las pruebas y procedimientos estab/ecid?s'. se le debe
asignar un nombre diferent.e y totalmente d1st1r:ito de cual-
quier otro nombre reconoodo en los compendios. USP o NF.
Un dispositivo médico, suplemento d1etet1co o 1ngred1~nte
o_ componente de un dispo~itiv'? _m~,dico,,° s~ple,i;n_ento d1e-
tetico puede usar la denominaoon . USP o_ NF JUnto a su
título oficial o en otra parte de la_ etiqueta, urncam.ente .
cuando: (1) existe una monograf1a en el compendio especi-
ficado y (2) el artículo cumple con las normas de_ la mono-
grafía y demás normas aplicables en el compendio
correspondiente.
La denominación "USP" o "NF" en la etiqueta de un artí-
culo no debe ni puede interpretarse como un aval por P?rte
de Ja USP ni tampoco debe interpretarse c_omo una confir-
mación por parte de Ja USP de que tal articulo cumple con
las normas pertinentes de la USP. La USP puede 1rnc1ar una
acción legal si se declara o presenta un articulo como ~n
artículo oficial en uno de Jos compendios de la USP y esta
determina que tal aseveración no fue hecha de buena fe.
 USP 37
La denominación "USP-NF" puede usarse en la etiqueta
de un artículo, siempre que dicha etiqueta también lleve
una frase tal como "Cumple con las normas NF publicadas
por la USP", indicando el compendio particular que corres-
ponde aplicar.
Cuando se usan las siglas "USP " "NF " o "USP-NF" en la
etiqueta de un artículo para indic~r que' el artículo cumple
con las normas farmacopeicas, las siglas deben aparecer
junto al título oficial del artículo. Las siglas no deberán apa-
recer dentro de símbolos, como por ejemplo círculos, cua-
drados etc., y deberán estar en letras mayúsculas.
Si un suplemento dietético no cumple con todos los re-
quisitos farmacopeicos aplicables, pero contiene uno o más
ingredientes dietéticos u otros ingredientes reconocidos en
los compendios USP o NF, se puede indicar que tales ingre-
dientes individuales cumplen con las normas USP o NF o
que son de calidad USP o NF siempre y cuando la denomi-
nación se limite a los ingredientes individuales y no se insi-
núe que el suplemento dietético cumple con las normas en
USP.
Cambio en la redacción:
4. MONOGRAFÍAS Y CAPÍTULOS GENERALES
4.10. Monografías
Las monografías establecen el nombre, definición, especi-
ficaciones y demás requisitos relacionados con el envasado,
almacenamiento y etiquetado del artículo. Las especificacio-
nes consisten en pruebas, procedimientos y criterios de
aceptación que ayudan a asegurar la identidad, contenido,
calidad y pureza del artículo. Para los requisitos generales
relacionados con secciones específicas de la monografía, ver
la sección 5, Componentes de las Monografías.
Debido a que, en ocasiones, las monografías no propor-
cionan normas para todas las características relevantes, algu-
nas sustancias oficiales pueden ajustarse a las normas USP o
NF, pero diferir en lo que respecta a propiedades no norma-
lizadas que son relevantes para su uso en preparaciones es-
pecíficas. Para asegurar la intercambiabilidad en esos casos,
se recomienda a los usuarios comprobar la equivalencia fun-
cional o determinar tales caractensticas antes de su uso.
4.10.10. Aplicabilidad de los Procedimientos de Prueba
Una sola monografía puede incluir distintas pruebas, pro-
cedimientos y/o criterios de aceptación que reflejen atribu-
tos de diversos artículos del fabricante. Tales alternativas
pueden presentarse para distintos casos de formas polimórfi-
cas, impurezas, hidratos y disoluciones. Las monografías in-
dican las pruebas, procedimientos y/o criterios de acepta-
ción que se deben usar, así como el etiquetado requerido.
Una prueba en una monografía puede contener y requerir
procedimientos múltiples. Sin embargo, se pueden incluir
múltiples procedimientos en monografías particulares especí-
ficamente con el objetivo de asegurar la disponibilidad de
un procedimiento adecuado para un producto en particular.
En dichos casos, se incluirá en la monografía una declara-
ción de etiquetado que indique la aplicación adecuada de
los procedimientos. No se requiere una declaración en el
etiquetado si se usa la Prueba 1 .
"-4.10.11. Pruebas de Disolución, Desintegratión y
Liberación de Fármacos
la monografía puede incluir múltiples pruebas de Disolu-
ción, Desintegración o Liberación de Fármacos. El ordén en
el que se presentan estas pruebas en la monograffa se basa
en el orden en el que fueran aprobadas por eí Comité de
Expertos pertinente para su inclusión en la monografía. la
Prueba 1 no es necesariamente la prueba para el producto
innovador o para el producto de referencia. El cumplimiento
con alguna de las pruebas no garantiza la bioequivalencia ni
la biodisponibilidad ..... usm
4.10.20. Criterios de Aceptación
Los criterios de aceptación consideran errores analíticos y
variaciones inevitables durante la fabricación y preparación
magistral, así como el deterioro hasta un grado considerado
Advertencias Generales 5
aceptable en condiciones prácticas. La existencia de criterios
de aceptación farmacopeicos no constituye razón para ase-
verar que una sustancia oficial cuya pureza se aproxima al
100 por ciento "excede" la calidad farmacopeica. De igual
manera, el hecho de que un artículo se haya preparado
usando criterios más estrictos que los especificados en la
monografía no constituye una razón válida para aseverar
que el artículo "excede" los requisitos farmacopeicos.
Un producto oficial debe formularse con la intención de
suministrar el 100 por ciento de la cantidad de cada ingre-
diente declarado en la etiqueta. Cuando debido a requisitos
legales aplicables, se requiera que la cantidad mínima de
una sustancia presente en un suplemento dietético sea ma-
yor que el criterio de aceptación inferior permitido por la
monografía, el criterio de aceptación superior de la mono-
grafía puede incrementarse en una cantidad
correspondiente.
Los criterios de aceptación especificados en las monogra-
fías individuales y en los capítulos generales para preparacio-
nes magistrales se basan en los atributos de calidad que se
espera podrían caracterizar un artículo preparado magistral-
mente a partir de fármacos e ingredientes a granel de
acuerdo con los procedimientos establecidos o con los prin-
cipios reconocidos de buenas prácticas de preparación ma-
gistral descritos en estos compendios.
4.20. Capítulos Generales
A cada capítulo general se le asigna un número que apa-
rece entre paréntesis angulares junto al título (p.ej.: Croma-
tografía (621 )). Los capítulos generales pueden contener lo
siguiente:
• Descripciones de pruebas y procedimientos para su apli-
cación en monografías individuales,
• Descripciones y especificaciones de condiciones y prác-
ticas de preparacion magistral,
• Información general para la interpretación de requisitos
farmacopeicos,
• Descripciones de prácticas generales de almacena-
miento farmacéutico, dispensación y envasado, o
• Guías generales para fabricantes de sustancias oficiales o
productos oficiales.
Cuando una monografía hace referencia a un capítulo ge-
neral, los criterios de aceptación pueden presentarse des-
pués de dos puntos.
Algunos capítulos pueden servir como descripciones gene-
rales introductorias de una prueba o técnicas analíticas. Ade-
más, pueden hacer referencia a otros capítulos generales
que contengan técnicas, detalles de los procedimientos y,
en ocasiones, criterios de aceptación.
Cambio ftn la redacción:
5. COMPONENTES DE LAS MONOGRAFÍAS
5.10. Fórmulas Moleculares
Las fórmulas moleculares de los ingredientes activos que
se usan en la definición del contenido requerido de un artí-
culo farmacopeico tienen por objeto designar las entidades
químicas, tal como aparecen en el nombre químico com-
pleto del artículo, con una pureza absoluta (100 por ciento).
5.20. Sustancias Agregadas
las sustancias agregadas se presumen inadecuadas para
su inclusión en un artículo oficial y por lo tanto quedan
prohibidas siempre que: (1) excedan la cantidad mínima re-
querida para lograr el efecto deseado; (2) su presencia
afecte la biodisponibilidad, la eficacia terapéutica o la seguri-
dad del artículo oficial; o (3) interfieran con las pruebas o
valoraciones prescritas para determinar el cumplimiento de
las normas farmacopeicas.
El aire contenido en el envase de un artículo oficial puede
extraerse o reemplazarse por dióxido de carbono, helio, ar-
gón o nitrógeno, o una mezcla de estos gases, siempre que
sea apropiado. No es necesario declarar en el etiquetado el
uso de alguno de dichos gases.
 6 Advertencias Generales
5.20.1 O. Sustancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes
en Sustancias Oficiales
Las sustancias oficiales pueden contener únicamente las
sustancias agregadas específicas permitidas por la monogra-
fía individual. Si se permite tal adición, la etiqueta debe indi-
car los nombres y las cantidades de las sustancias
agregadas.
5.20.20. Sustancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes
en Productos Oficiales
A menos que se especifique algo diferente en la monogra-
fía individual, pueden agregarse sustancias y excipientes
adecuados tales como agentes antimicrobianos, bases far-
macéuticas, transportadores, recubrimientos, saborizantes,
conservantes, estabilizantes y vehículos a un producto oficial
para mejorar su estabilidad, utilidad o apariencia, o para fa-
cilitar su preparación.
Se pueden emplear excipientes y sustancias agregadas ex-
clusivamente para impartir color a los productos oficiales,
excepto para aquéllos destinados a la administración paren-
teral u oftálmica, siempre que cumplan con las reglamenta-
ciones de la FDA para el uso de colorantes y que sean ade-
cuadas en todos los otros aspectos. (Ver también Sustancias
Agregadas en Inyectables (1 )).
En la preparación de ungüentos y supositorios, se pueden
variar las proporciones de las sustancias que constituyen la
base para mantener la consistencia adecuada en diferentes
condiciones climáticas, siempre que no se varíe la concen-
tración de los ingredientes activos y que no se afecte la
biodisponibilidad, la eficacia terapeutica o la seguridad de la
preparación.
5.20.20.1. En Preparaciones Magistrales
Las preparaciones magistrales para las que se proporciona
una composición completa deben contener únicamente los
ingredientes indicados en las fórmulas, a menos que se ex-
ceptúe específicamente en este documento o en la mono-
grafía individual. Se pueden presentar desviaciones en los
procesos especificados o en los métodos de preparación ma-
gistral, pero no en sus ingredientes o proporciones, siempre
que la preparación final cumpla con las normas pertinentes
y se prepare siguiendo el proceso especificado.
Cuando la monografía de una preparación magistral exige
una cantidad de un ingrediente expresada con respecto a la
sustancia seca, no es necesario secar el ingrediente antes de
utilizarlo, siempre que se tome debida cuenta del agua u
otras sustancias volátiles presentes en la cantidad utilizada.
Existen formulaciones de alcohol especialmente desnatura-
lizado que se usan de acuerdo con los estatutos y reglamen-
taciones federales de la Interna! Revenue Service, (IRS, por
sus siglas en inglés, Oficina de Recaudación de Impuestos
del Gobierno de los Estados Unidos). Una formulación apro-
piada de alcohol especialmente desnaturalizado puede susti-
tuir al Alcohol en la fabricación de preparaciones farmaco-
peicas destinadas para uso interno o para uso tópico,
siempre que el desnaturalizante sea volátil y no quede en el
producto terminado. Un producto terminado destinado a
aplicación tópica sobre la piel puede contener alcohol espe-
cialmente desnaturalizado, siempre que el desnaturalizante
sea un ingrediente normal en la preparación o una sustancia
agregada permitida; en ambos casos, el desnaturalizante se
debe identificar en la etiqueta de la preparación tópica.
Cuando se indique un proceso en la monografía individual,
toda preparación elaborada magistralmente con alcohol des-
naturalizado debe ser idéntica a la que se obtiene mediante
el proceso indicado.
5.20.20.2. En Suplementos Dietéticos
Pueden agregarse ingredientes adicionales a los productos
de suplementos dietéticos siempre que tales ingredientes:
(1) cumplan con los requisitos reglamentarios aplicables y
(2) no interfieran con las valoraciones y las pruebas prescri-
tas para determinar el cumplimiento de las normas
farmacopeicas.
USP 37
5.30. Descripción y Solubilidad
Una prueba cuantitativa de solubilidad se considerará
como una rrueba de pureza, únicamente cuando se des-
cribe y designa como tal en una monografía.
Una monografía puede incluir información relacionada
con la descripción del artículo. La información de "descrip-
ción y solubilidad" correspondiente a un artículo también
aparece en la tabla de referencia Descripción y Solubilidad
Relativa de Artículos de la USP y del NF. La tabla de referencia
indica sólo las propiedades de los artículos que cumplen con
las normas de la monografía. La tabla de referencia está
destinada principalmente para aquéllos que usan, elaboran y
dispensan fármacos y/o artículos relacionados. Aunque la in-
formación proporcionada en las monografías y la informa-
ción en la tabla de referencia puede ayudar indirectamente
a la evaluación preliminar de un artículo, dicha información
no constituye en sí misma una norma o prueba de pureza.
La solubilidad aproximada de una sustancia farmacopeica
se indica mediante uno de los siguientes términos
descriptivos:
Partes de Disolvente
Requeridas para
Término Descriptivo 1 Parte de Soluto
Muy soluble Menos de 1
Fácilmente soluble De 1a10
Soluble De 10 a 30
Moderadamente soluble De 30 a 100
Poco soluble De 100 a 1000
Muv ooco soluble De 1000 a 1O 000
Prácticamente imoluble o Mayor que o igual a
Insoluble 10000
5.40. Identidad
La prueba farmacopeica bajo el título Identidad o Identifi-
cación se proporciona como una ayuda para verificar la
identidad de los artículos según se indica, p.ej., en la eti-
queta de sus envases, y para establecer si se trata del artí-
culo nombrado en USP-NF. La prueba de Identidad o Identi-
ficación para un artículo en particular puede comprender
uno o más procedimientos. Cuando se lleva a cabo una
prueba farmacopeica de Identidad o Identificación, se deben
cumplir todos los requisitos de todos los procedimientos es-
pecificados para satisfacer los requisitos de la prueba. El in-
cumplimiento de un artículo con los requisitos de una
prueba de Identidad o Identificación prescrita (es decir, que
no cumpla con los requisitos de todos los procedimientos
especificados que componen dicha prueba) indica que el
artículo está rotulado incorrectamente y/o adulterado.
5.50. Valoración
Las pruebas de valoración para preparaciones ma9istrales
no han sido concebidas para evaluar una preparacion ma-
gistral antes de su dispensación, sino como pruebas oficiales
para casos en los que exista duda o controversia acerca de
la conformidad de la preparación con las normas oficiales.
5.50.1 O. Unidades de Potencia (Biológica)
Para las sustancias que no pueden ser caracterizadas com-
pletamente por medios químicos y físicos, puede ser necesa-
rio expresar la actividad en unidades de potencia biológica,
definidas por un estándar de referencia designado como pa-
trón oficial.
Las unidades de potencia biológica definidas por la Orga-
nización Mundial de la Salud (OMS) mediante Estándares
Biológicos Internacionales y Preparaciones Biológicas Inter-
nacionales de Referencia se denominan Unidades Internacio-
nales (UI). Las monografías se refieren a las unidades defini-
das mediante Estándares de Referencia USP como "Unidades
USP". Para los productos biológicos, existan o no Unidades
Internacionales o Unidades USP (ver Productos Biológicos
(1041)), las unidades de potencia se definen mediante los
correspondientes Estándares de los Estados Unidos (U.S.
Standards) establecidos por la FDA.
 USP 37
5.60. Impurezas y Sustancias Extrañas
Las pruebas para determinar la presencia de sustancias ex-
trañas e impurezas se eslablecen para limitarlas a cantidades
que no sean objetables en las condiciones normales de em-
pleo del artículo (ver también •impurezas en Fármacos y Pro-
ductos Farmacéuticos (1086)) .• usm
Además de las pruebas prescritas en la monografía indivi-
dual, se deben aplicar otras pruebas y criterios de acepta-
ción adecuados para detectar y controlar impurezas que pu-
dieran resultar de cambios en los métodos de
procesamiento o que provengan de fuentes externas,
cuando su presencia no concuerde con las buenas prácticas
de fabricación o las buenas prácticas farmacéuticas
aplicables.
5.60.10. Otras Impurezas en los Artículos de la USP y el
NF
Cuando una monografía de los compendios USP o NF in-
cluye una valoración o prueba de impurezas orgánicas cro-
matográfica, diferente de una prueba de disolventes resi-
duales, y el procedimiento de la monografía no detecta una
impureza presente en la sustancia, se deben expresar la can-
tidad e identidad de la impureza, si fueran ambas conoci-
das, bajo el encabezado Otra(s) lmpureza(s) en el etiquetado
(certificado de análisis) de la sustancia oficial.
La presencia en una sustancia oficial de cualquier impu-
reza no declarada en el etiquetado constituye una desvia-
ción de la norma si el contenido es de O, 1% o mayor. La
suma de las Otras Impurezas combinada con las impurezas
detectadas por los métodos de la monografía no puede ex-
ceder del 2,0% (ver Impurezas Comunes (466)), a menos
que en la monografía se indique algo diferente.
Las siguientes categorías de fármacos quedan excluidos de
los requisitos de Otras Impurezas:
• productos de fermentación y derivados semisintéticos
obtenidos a partir de ellos,
• radiofármacos,
• productos biológicos,
• productos obtenidos por biotecnología,
• péptidos,
• productos botánicos y
• productos crudos de origen animal o vegetal.
No debe incluirse ninguna sustancia conocida como tó-
xica en Otras Impurezas.
5.60.20. Disolventes Residuales en los Artículos de la USP
y el NF
Todos los artículos de los compendios USP y NF están su-
jetos al control pertinente de disolventes residuales, incluso
cuando la prueba no esté indicada en la monografía indivi-
dual. Los disolventes que se empleen durante los procesos
de fabricación deben ser de calidad adecuada. Asimismo, se
debe tomar en consideración la toxicidad y el nivel residual
de cada disolvente y limitar los disolventes conforme a los
principios definidos y los requisitos especificados en Disol-
ventes Residuales (467), según los métodos generales indica-
dos en dicho capítulo u otros métodos adecuados.
5.70. Pruebas de Desempeño
Cuando las determinaciones de uniformidad de contenido
se hayan efectuado usando la misma metodología analítica
especificada en la Valoración, tomando debida cuenta de las
diferencias en la preparación de la muestra, el promedio de
todas las determinaciones individuales de uniformidad de
contenido puede usarse como el resultado de la Valoración.
5.80. Estándares de Referencia USP
Los Estándares de Referencia USP son materiales auténti-
cos que han sido aprobados como adecuados para su uso
como estándares de comparación en las pruebas y valora-
ciones de la USP o el NF. (Ver Estándares de Referencia USP
(11)). •Cuando una prueba o valoración de los compendios
USP o NF indique el uso de un Estándar de Referencia USP,
sólo se considerarán concluyentes los resultados obtenidos
usando el Estándar de Referencia USP especificado .• usm
Cuando un procedimiento exija el uso de un artículo oficial
y no de un Estándar de Referencia USP como material de
referencia, se debe utilizar una sustancia que satisfaga todos
Advertencias Generales 7
los requerimientos indicados para dicho artículo en la mo-
nografía oficial. Si alguna norma nueva de la USP o del NF
requiere el uso de un Estándar de Referencia USP nuevo que
aún no esté disponible, dicha parte de la norma que con-
tiene el requisito no será oficial hasta que el material de
referencia USP especificado esté disponible.
Salvo que la etiqueta del estándar de referencia indique
una potencia o contenido específicos, se asume que el es-
tándar de referencia tiene una pureza del 100,0% para la
ªf licación oficial. A menos que se indique algo diferente en
e procedimiento de la monografía individual o en un capí-
tulo general, los Estándares de Referencia USP deben usarse
de acuerdo con las instrucciones de sus etiquetas.
Cambio en la redacción:
6. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA
6.10. Prácticas Seguras de Laboratorio
Al realizar procedimientos farmacopeicos, se deben seguir
prácticas seguras de laboratorio, las cuales incluyen medidas
precautorias, equipo de protección y prácticas de trabajo
acordes a las sustancias químicas y procedimientos usados.
Antes de realizar cualquier procedimiento descrito en los
compendios, el analista debería conocer los peligros asocia-
dos con las sustancias químicas y las técnicas y medios de
protección contra dichos riesgos. Estos compendios no tie-
nen como objetivo describir tales peligros o medidas de
protección.
6.20. Procedimientos Automatizados
Los procedimientos automatizados y manuales que em-
plean los mismos fundamentos químicos se consideran equi-
valentes.
6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados
Se pueden usar métodos y/o procedimientos alternativos
que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud,
sensibilidad, precisión, selectividad o adaptabilidad a la au-
tomatización o a la reducción de datos computarizados o en
otras circunstancias especiales. Dichos métodos y procedi-
mientos alternativos se deben validar según se describe en
el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopei-
cos (1225) y se debe demostrar que proporcionan resultados
equivalentes o mejores. Solamente aquellos resultados obte-
nidos por los métodos y procedimientos suministrados en
los compendios serán concluyentes.
Se recomienda remitir a la USP los procedimientos alter-
nativos para su evaluación como reemplazos potenciales o
para agre~arlos a las normas (ver la sección 4.10.
Monograf1as).
En ciertos capítulos generales se indica que el texto en
cuestión está armonizado con el texto correspondiente de la
Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa y que estos
textos son intercambiables. Por ello, si el cumplimiento de
un requisito de una sustancia o preparación fuera determi-
nado usando un método intercambiable de una de estas
farmacopeas, también debería cumplir los requisitos de la
USP. Sin embargo, si apareciera una diferencia, o en el caso
de controversia, sólo el resultado obtenido mediante el pro-
cedimiento y/o método dado en la USP será concluyente.
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes
A menos que se especifique algo diferente, todos los cál-
culos se efectúan con respecto a la sustancia "tal como se
encuentra".
Se pueden realizar los procedimientos de las pruebas so-
bre la sustancia sin secar o sin incinerar y calcular los resul-
tados con respecto a la sustancia seca, anhidra o incinerada
siempre que la monografía indique una prueba para Pérdida
por Secado, Determinación de Agua o Pérdida por Incineración,
respectivamente. Cuando la presencia de humedad u otro
material volátil puede interferir con el procedimiento, la mo-
nografía individual especifica que es necesario secar la sus-
tancia con anterioridad, paso que es obligatorio.
 8 Advertencias Generales
La expresión "exenta de disolventes" significa que se de-
ben corregir los cálculos por la presencia de disolventes co-
nocidos, según se determinan usando los métodos descritos
en Disolventes Residuales (467), a menos que la monografía
proporcione una prueba de límite de disolventes residuales.
La expresión "previamente secada(o)" sin otro calificativo
si9nifica que la sustancia se debe secar según se indica en
Perdida por Secado (731) o Determinación de Agua (921) (de-
terminación gravimétrica).
Cuando se indique secar al vacío sobre un desecante, se
debe utilizar un desecador al vacío, una pistola para secado
al vacío u otro instrumento apropiado para secado al vacío.
6.40.10. Incinerar hasta Peso Constante
"Incinerar hasta peso constante" significa que deberá con-
tinuarse la incineración a 800 ± 25º, a menos que se indique
algo diferente, hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
gunda de las cuales se realiza después de un periodo adicio-
nal acorde con la naturaleza y cantidad del residuo, no difie-
ran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada.
6.40.20. Secado hasta Peso Constante
"Secado hasta peso constante" significa que deberá conti-
nuarse el secado hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
gunda de las cuales se realiza después de un periodo adicio-
nal de secado acorde con la naturaleza y cantidad del
residuo, no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia
tomada.
6.50. Preparación de Soluciones
6.50.1 O. Filtración
Cuando en un procedimiento se indica "filtrar" sin otro
calificativo, el líquido se debe pasar a través de un papel de
filtro adecuado o dispositivo equivalente hasta que el fil-
trado sea transparente. Dados los posibles efectos del filtro,
se pueden desechar los volúmenes iniciales del filtrado.
6.50.20. Soluciones
A menos que se especifique de otro modo, todas las solu-
ciones deben prepararse con Agua Purificada. Las soluciones
para mediciones cuantitativas deben prepararse usando ana-
litos medidos o pesados con exactitud (ver la sección 8.20.
Aproximadamente).
Una expresión tal como "(l en 1O)" significa que 1 parte
en volumen de un líquido debe diluirse con "'1>.usP3? una canti-
dad suficiente de diluyente o disolvente para que el volu-
men de la solución final sea de 1 O partes medidas en volu-
men. Expresiones similares a "(20:5:2)" significan que los
números respectivos de partes, medidas en volumen, de los
líquidos señalados deben mezclarse, a menos que se indique
algo diferente.
6.50.20.1. Ajuste de Soluciones
Cuando un procedimiento exige una concentración espe-
cífica, se puede usar una solución con otra normalidad o
molaridad, siempre que se tenga en cuenta la diferencia en
la concentración y no se aumente el error de la medición.
•En las pruebas y valoraciones se pueden tomar cantida-
des proporcionalmente mayores o menores que los especifi-
cados de las sustancias a analizar y los correspondientes Es-
tándares de Referencia, siempre y cuando las mediciones
resulten con una exactitud equivalente o mejor ••usPJ1
A menos que se indique algo diferente, las concentracio-
nes de analitos deben prepararse de modo que queden den-
tro del diez por ciento (10%) del valor indicado. En el caso
particular de que un procedimiento se adapte al intervalo
de trabajo de un instrumento, las concentraciones de las
soluciones pueden diferir del valor indicado en más de diez
por ciento (10%), realizando los cambios apropiados en los
cálculos asociados. Todo cambio realizado debe quedar den-
tro del intervalo validado del instrumento.
Cuando se indica el ajuste del pH mediante un ácido o
base y no se indica la concentración, se pueden usar con-
centraciones apropiadas de dicho ácido o base.
6.50.20.2. Soluciones Reactivo
La información acerca de las Soluciones Reactivo (SR) se
encuentra en el apartado Soluciones Reactivo en la sección
Reactivos, Indicadores y Soluciones de los compendios
USP 37
USP-NF. El uso de una Solución Reactivo alternativa o cam-
bios en la Solución Reactivo utilizada puede requerir de
validación.
6.50.20.3. Soluciones Indicadoras
Cuando se especifica el uso de una SR indicadora en un
procedimiento, se deben agregar aproximadamente 0,2 mL
ó 3 gotas de dicha solución, a menos que se indique algo
diferente.
6.60. Unidades Necesarias para Completar una Prueba
A menos que se especifique algo diferente, se debe tomar
un número suficiente de unidades para asegurar un resul-
tado analítico adecuado.
6.60.1 O. Tabletas
Cuando en el procedimiento de una monografía de Table-
tas se indica pesar y reducir a polvo fino no menos de un
cierto número de Tabletas, se entiende que se debe pesar y
reducir a polvo un número contado de Tabletas. La porción
tomada de Tabletas reducidas a polvo debe ser representa-
tiva del total de Tabletas y pesada con exactitud.
6.60.20. Cápsulas
Cuando en el procedimiento de una monografía de Cáp-
sulas se indique vaciar, tan completamente como sea posi-
ble, el contenido de no menos de cierto número de Cápsu-
las, se entiende que se debe abrir cuidadosamente un
número contado de Cápsulas y se debe retirar cuantitativa-
mente, combinar, mezclar y pesar con exactitud el conte-
nido de las mismas. La porcion tomada del contenido de las
Cápsulas debe ser representativo del contenido total de las
Cápsulas y pesado con exactitud.
6.70. Reactivos
La ejecución adecuada de las pruebas y valoraciones far-
macopeicas y la confiabilidad de los resultados dependen,
en parte, de la calidad de los reactivos utilizados en estos
procedimientos. A menos que se especifique algo diferente,
se deben usar reactivos que cumplan con lo establecido en
las especificaciones de la edición vigente de Reagent Chemi-
cals publicada por la American Chemical Society (ACS).
Cuando tales especificaciones no existan o cuando por dis-
tintas razones la pureza requerida de un reactivo fuera dife-
rente, se suministran especificaciones farmacopeicas de reac-
tivos de calidad aceptable (ver la sección Reactivos,
Indicadores y Soluciones en USP-NF). Los reactivos no trata-
dos por ninguna de estas especificaciones deben ser de
grado adecuado para la realización del método de valora-
ción o prueba en cuestión.
La inclusión en los compendios de estos reactivos, indica-
dores y soluciones empleadas como reactivos, no implica
que tales sustancias tengan utilidad terapéutica. Cualquier
referencia a la USP o el NF en sus etiquetados debe incluir
también el término "reactivo" o "grado reactivo". La USP
puede proveer reactivos en caso de que no se encuentren
comercialmente disponibles.
6.80. Equipo
A menos que se indique algo diferente, la especificación
de un tamaño o tipo definido de recipiente o de aparato es
sólo una recomendación. Es posible usar otras dimensiones
o tipos siempre que sean adecuados para el uso pretendido.
6.80. 1O. Aparatos de Medición
Cuando se indique el uso de matraces volumétricos u
otros dispositivos para medir, pesar o clasificar en forma
exacta, se deben emplear estos equipos u otros que posean,
al menos, una exactitud equivalente.
6.80.10.1. Pipeta
Cuando se especifica el uso de una pipeta, ésta se puede
sustituir por una bureta adecuada. Cuando se indica el uso
de una pipeta calibrada "para contener", ésta se puede sus-
tituir por un matraz volumétrico adecuado.
6.80.10.2. Protección contra la Luz
Cuando se indique el uso de recipientes con protección
actínica o resistentes a la luz, se pueden utilizar recipientes
especialmente tratados para proteger el contenido contra la
luz, o recipientes transparentes que se hayan recubierto o
envuelto adecuadamente para volverlos opacos.
 USP 37
6.80.20. Instrumentos
Es posible sustituir el instrumento especificado por otro
instrumento siempre que el instrumento sustituto se base en
los mismos principios fundamentales de operación y tenga
una sensibilidad y exactitud equivalente o mayor; tales ca-
racterísticas se deben calificar como apropiadas. Si se men-
cionara una marca o un proveedor de un material, un ins-
trumento o una pieza de equipo, o el nombre y la dirección
de un fabricante o distribuidor (por lo general pueden apa-
recer como notas al pie de página), esta información se
brinda sólo por conveniencia y no implica aprobación, aval
o certificacion.
6.80.20.1. Columnas y Tubos Cromatográficos
El término "diámetro" se refiere al diámetro interno (DI).
6.80.20.2. Otros Tipos de Tubos y Tuberías
El término "diámetro" se refiere al diámetro externo (DE).
6.80.20.3. Baño de Vapor
Cuando se indique el uso de un baño de vapor, se usa
vapor vivo fluente u otra fuente de calor regulado a una
temperatura equivalente.
6.80.20.4. Baño de Agua
A menos que se especifique algo diferente, un baño de
agua requiere agua en ebullición vigorosa.
~.80.30. Dispositivos de Medición de Temperatura
Los dispositivos de medición de temperati.lra adecuados
para las pruebas ~armacopeicas cump4é~ con E!Specitii::acio;.
nes que son rastreables a un estándar del NIST (1nstttuto
Nacional de Normas y Tecnología de los,Ei.1JU,) o ~tJll¡f¡il.
lente•. losdi~os·itlvos de rnedi~ón de ~peM~rlll .P,tleden
ser deJ tipo liquido en vidrio o ~n tipo de 1ndic~ofrde
temp&Mturaanálog<? o di9italt tal;corrro.unc~~sitÍ\llo·de
temperatur¡¡i .con. res1stenc;;1a, .term1stor o teri:no~f\¡ La está~~
darizacíón de termómetros se lleva a cab(:) e . u~nc~
de estable<;:ida,i:;cm .Mna.tel"!lPe
~~~o~~l~~~=!~~~d::1f: :para.
7. RESULTADOS DE PRUEBAS
7.10. Interpretación de los Requisitos
Los resultados analíticos observados en el laboratorio (o
los calculados a través de determinaciones experimentales)
se comparan con .los cri!erios de aceptación espec.if~cados
para deter~inar s1 el articulo cumple con los requ1s1tos
farmacope1cos. . .
El valor de informe, que por lo general se obtiene combi-
nando valores de varias determinaciones individuales, se
compara con los criterios de acep.ta~ión. El valor de informi:;
es el resultado final de un proced1m1ento completo de medi-
ción, según se ha documentado.
Cuando los criterios de aceptación se expresan de forma
numérica en estas Advertencias Generales mediante la espe-
cificación de un límite superior y/o inferior, los valores per-
mitidos incluyen a los valores especificados, pero no los va-
Ejemplos de Redondeo de Valores Numéricos
para Comoaración con los Requisitos
Requisito Farmacooeico Valor Sin Redondear
Límite de valoración ~98,0% 97,96%
97,92%
97 95%
Límite de valoración Sl 01,5% 101,55%
101,46%
10145%
Prueba de límite S0,02% 0,025%
0,015%
0027%
Prueba de límite S3 ppm 3,5 ppm
3,4 ppm
2,5 ppm
Advertencias Generales 9
lores fuera del límite o límites. Los criterios de aceptación se
consideran significativos hasta el último dígito señalado.
7.10.5. Concentraciones Nominales en Ecuaciones
Cuando se especifica una "concentración nominal", calcu-
lar la concentración basándose en la cantidad declarada en
la etiqueta. En los procedimientos de valoración, la correc-
ción por contenido de agua típicamente se indica en la De-
finición y en la etiqueta del Estándar de Referencia USP. Para
otros procedimientos, la corrección por contenido y/o po-
tencia valorados se realiza antes de usar la concentracion en
la ecuación provista en la monografía.
7.10.10. Equivalencia en Procedimientos Volumétricos
Las instrucciones de los procedimientos volumétricos con-
cluyen con una declaración de equivalencia entre el peso
deí analito y cada mL de solución volumétrica normalizada.
En tales equivalencias, se entenderá que el número de cifras
significativas en la concentración de la solución volumétrica
corresponde al del número de cifras significativas en el peso
del analito. Siempre que corresponda, se deben hacer co-
rrecciones en todas las valoraciones volumétricas basándose
en la determinación con un blanco (ver Volumetría (541) ).
7.20. Reglas para Redondeo
Los valores observados o calculados deben redondearse al
mismo número de decimales que el expresado para el lí-
mite. No deberá efectuarse el redondeo antes de concluir
los cálculos correspondientes para obtener el valor de in-
forme. Los cálculos intermedios (p.ej., la pendiente de la
curva de linealidad) pueden redondearse para propósitos de
informe, pero si se requiere realizar cálculos adicionales se
deben utilizar los valores originales sin redondear. Los crite-
rios de aceptación son números fijos y no se redondean.
Cuando se requiere redondear una cifra, se considera so-
lamente el dígito que se encuentra a la derecha del último
lugar decimal en la expresión del límite. Si este dígito es
menor de 5, se elimina sin cambiar el dígito que lo precede.
Si este dígito es igual o mayor a 5, se elimina y el d1gito
que lo precede se aumenta en 1 .
f.imllío ·en mrftla«lón~
8. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
8.1 O. Abreviaturas
• ER corresponde a un Estándar de Referencia USP.
• SC corresponde a una Solución Calorimétrica.
• SR se refiere a una Solución Reactivo.
• SV corresponde a una Solución Volumétrica estandari-
zada de conformidad con las instrucciones provistas en
la monografía individual o en la sección Reactivos, Indi-
cadores y Soluciones de USP-NF.
8.20. Aproximadamente
El término "aproximadamente" indica una cantidad que
puede variar dentro del 1 0%.
Resultado Redondeado Cumule
98,0% Sí
97,9% No
980% Sí
101,6% No
101,5% Sí
101 5% Sí
0,03% No
0,02% Sí
003% No
4 ppm No
3 ppm Sí
3 ppm Sí
 1 O Advertencias Generales
Si se especifica una medición como "medida con exacti-
tud" o "pesada con exactitud" se deben seguir las especifi-
caciones de los capítulos generales Aparatos Volumétricos
(31) y "'Balanzas (41 ),,.usm, respectivamente.
8.30. Contenido de Alcohol
Los porcentajes de alcohol, como los indicados en Conte-
nido de Alcohol, son porcentajes en volumen de C2HsOH a
15,56º. Cuando se exige el uso de alcohol, alcohol etílico o
etanol en una fórmula, prueba o valoración, se debe usar el
artículo de la monograf1a Alcohol de la USP. Cuando se hace
referencia a "C2H 5 0H", significa etanol absoluto (100 por
ciento). Cuando un procedimiento exige alcohol deshidra-
tado, alcohol absoluto o alcohol anhidro, se debe usar el
artículo de la monografía Alcohol Deshidratado de la USP.
8.40. Pesos Atómicos
Los pesos atómicos usados para calcular pesos molecu-
lares y los factores en las valoraciones y en otras partes
donde éstos aparezcan, son los establecidos por la Commis-
sion on Atomic Weights and lsotopic Abundances de la IU-
PAC (Comisión de Pesos Atómicos y Abundancias Isotópicas
de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada).
8.50. Determinaciones con Blancos
Cuando se indique realizar "cualguier corrección necesa-
ria" por medio de una determinacion con un blanco, tal
determinación debe efectuarse usando las mismas cantida-
des de los mismos reactivos tratados de la misma manera
que la solución o mezcla que contiene la porción de sustan-
cia en análisis, pero omitiendo dicha sustancia.
8.60. Concomitantemente
El término "concomitantemente" indica que las determi-
naciones o mediciones deben efectuarse en sucesión
inmediata.
8.70. Desecador
La instrucción "en un desecador" indica el uso de un reci-
piente cerrado herméticamente, de tamaño y diseño ade-
cuados, que mantiene una atmósfera de bajo contenido de
humedad mediante un desecante adecuado, por ejemplo,
cloruro de calcio anhidro, perclorato de magnesio, pentó-
xido de fósforo o gel de sílice. Ver también la seccion 8.220.
Desecador al Vacío.
8.80. Logaritmos
Los logaritmos empleados son logaritmos en base 1 O.
8.90. Cepas Microbianas
Cuando se cita e identifica una cepa microbiana por el
número de catálogo ATCC, la cepa específica debe em-
plearse directamente o, si se hacen cultivos sucesivos, no
deben usarse más de cinco pasajes a partir de la cepa
original.
8.100. Inapreciable
El término "inapreciable" indica una cantidad que no ex-
cede de 0,50 mg.
8.110. No menos de (NLT) y No más de (NMT)
Las siglas en inglés "NLT" (not less than) significan y se
traducen como "no menos de". Las siglas en inglés "NMT"
(not more than) significan y se traducen como "no más
de".
8.120. Olor
Los términos "inodoro," "prácticamente inodoro," "con
un débil olor característico" y expresiones semejantes, indi-
can la evaluación de una cantidad adecuada de material re-
cientemente abierto después de la exposición al aire durante
15 minutos. La asignacion de un olor es sólo descriptiva y
no deberá considerarse como una norma de pureza para un
lote particular de un artículo.
8.130. Por ciento
La expresión "por ciento" usada sin otros calificativos
significa:
• Porcentaje peso en peso, para mezclas de sólidos y
semisólidos;
• Porcentaje peso en volumen, para soluciones o suspen-
siones de sólidos en líquidos;
USP 37
• Porcentaje volumen en volumen, para soluciones de lí-
quidos en líquidos; y
• Porcentaje peso en volumen, para soluciones de gases
en líquidos.
Por ejemplo, una solución al 1 por ciento se prepara disol-
viendo 1 g de un sólido o semisólido, o 1 mL de un líquido,
en disolvente suficiente para obtener 100 mL de solución.
8.140. Concentaciones Porcentuales
Las concentraciones porcentuales se expresan según se in-
dica a continuación:
• Porcentaje Peso en Peso (p/p) se define como el número
de g de un soluto en 100 g de solución.
• Porcentaje Peso en Volumen (p/v) se define como el nú-
mero de g de un soluto en 100 mL de solución.
• Porcentaje Volumen en Volumen (v/v) se define como el
número de mL de un soluto en 100 mL de solución.
8.150. Presión
La presión se determina usando un manómetro o baró-
metro adecuado, calibrado en términos de la presión ejer-
cida por una columna de mercurio de la altura indicada.
8.160. Tiempo de Reacción
El tiempo de reacción es de 5 minutos a menos que se
especifique algo diferente.
8.170. Peso Específico
El Peso específico es el peso de una sustancia en aire a
25º dividido por el peso de un volumen igual de agua a la
misma temperatura.
8.180. Temperaturas
A menos que se indique algo diferente, las temperaturas
se expresan en grados centígrados (Celsius) y todas las me-
diciones se hacen a 25º. Cuando se especifica calor mode-
rado, se indica toda temperatura no mayor de 45º (113º F).
8.190. Tiempo
A menos que se especifique algo diferente, las reglas para
redondeo, según se describen en la sección 7.20. Reglas
para Redondeo, se aplican a todos los tiempos especificados.
8.200. Transferir
El término "transferir" indica una manipulación
cuantitativa.
8.21 O. Vacío
El término "al vacío" especifica la exposición a una pre-
sión menor de 20 mm de mercurio (2,67 kPas), a menos
que se indique algo diferente.
8.220. Desecador al Vacío
Un "desecador al vacío" es un desecador gue mantiene
una atmósfera de baja humedad a una presion reducida de
no más de 20 mm de mercurio (2,67 kPas) o a la presión
indicada en la monografía individual.
8.230. Agua
8.230.1 O. Ag·ua como Ingrediente de un Producto Oficial
Cuando aparece como un ingrediente en un producto ofi-
cial, el agua cumple con los requisitos de la monografía de
agua adecuada en la USP o el NF.
8.230.20. Agua en la Fabricación de Sustancias Oficiales
En la fabricación de sustancias oficiales, se puede usar
agua que cumpla con los requisitos para agua potable
(drinking water) establecidos en las reglamentaciones de la
U.S. Environmental Protection Agency (Agencia de Protec-
ción Ambiental de Estados Unidos).
8.230.30. Agua en un Procedimiento Farmacopeico
Cuando se exige agua en un procedimiento farmaco-
peico, se entiende que debe emplearse el artículo Agua Puri-
ficada de la USP, a menos que se especifique algo diferente.
Las definiciones de Agua de Alta Pureza y Agua Exenta de
Dióxido de Carbono se encuentran en Envases-Vidrio (660).
Las definiciones de otros tipos de agua se encuentran en
Agua para Uso Farmacéutico (1231 ).
8.240. Pesos y Medidas
En general, se emplea el Sistema Internacional de Unida-
des (SI) para pesos y medidas, de acuerdo con lo estable-
cido y revisado por la Conférence générale des poids et mesu-
res (Conferencia General de Pesos y Medidas). A los fines de
USP 37 Advertencias Generales 11

los compendios, el término "peso" se considera como sinó- Unidades Símbolo Comentarios
nimo de "masa". microlitro ul --
La molalidad se representa por medio del símbolo m pre- Tempera- 1 1

cedido por un número que es el número de moles de soluto tura

contenidos en 1 kilogramo de disolvente.
La molaridad se representa por medio del símbolo M pre- Celsius e --
cedido por un número que es el número de moles de soluto Cantidad
contenidos en una cantidad de disolvente suficiente para de Sus-
preparar 1 litro de solución. tanda
La normalidad se representa por medio del símbolo N Históricamente referido
precedido por un número que es el número de equivalentes como peso molecular
de soluto contenidos en una cantidad de disolvente sufi- en gramos o peso
ciente para preparar 1 litro de solución mol mol atómico en aramos
•Listado de Símbolos y Prefijos comúnmente usados para mili mol mmol
unidades métricas del SI y otras unidades: micromol u mol
------- -- ·¡--- femtomol fmol
~·---- ,--· .. ------ -----·-·~------

T---· ------- - - - - -

1
~----
Unidades Símbolo Comentarlos 1
ambién referido como
Lonaitud peso equivalente en
metro m
1
gramos. Se usa en el
centímetro cm cálculo de concentra-
ción de sustancia en
milímetro mm
unidades de normali-
Anteriormente referido dad. Esta unidad ac-
micrómetro um como micrón tualmente ya no
Anteriormente se usaba representa la de uso
el símbolo mµ (para preferido en química
nanómetro nm milimicrón) eauivalente Ea analítica o metroloaía.
Ánastrom Á laual a O 1 nm mili-
Masa equivalen-
kiloaramo ka te mEa
aramo a Presión osmótica de
miliaramo ma una solución, relacio-
nada con la caneen-
El símbolo µg se usa en
tración de una
la USP y el NF para re-
os mol Os mol sustancia
presentar microgra-
mas, pero los miliosmol mOsmol
microgramos se pue- Presión
den representar como oascal Pa
"mcg" para propósi- kilooascal kPa
tos de etiquetado y libras por psi
prescripción. El térmi- pulgada
no "gamma", simboli- cuadrada
zado por la letra
milímetro Igual a 133,322 Pa
griega y, se usa con
de mer-
frecuencia para desig-
curio mm Ha
nar al microgramo en
microgra- la literatura de bioquí- Unidades
mo ua mica. eléctricas
nanoaramo na amoerio A
oicoaramo voltio V
ºª También referido como milivoltio mV
la unidad de masa hercio Hz Unidad de frecuencia
atómica unificada y es kilohercio kHz
igual a 1/12 veces la meaahercio MHz
masa de un átomo no electronvol-
enlazado de carbono- tio eV
dalton Da 12.
kiloelec-
kilodalton kDa tronvoltio keV
Tiemoo megaelec-
seaundo s tronvoltio MeV
minuto min Radiación
hora h Unidad del SI para la
Volumen actividad de radionu-
1 les igual a 1000 becauerelio Ba eleidos
cm 3 (centímetros cú- kilobecque-
litro L bicos). relio kBa
decilitro dl megabec-
1 mL es igual a 1 cmi, auerelio MBa
en ocasiones se cieno- gigabec-
mililitro ml mina ce. auerelio GBa
 1 2 Advertencias Generales USP 37

Unidades Símbolo Comentarios 10.40. Etiquetado

Unidad para la activi- El término "eti51uetado:' se refie_re a ~odas las etiqu,etas o
dad de radionucleidos marbetes y dem~s materiales escritos, impresos o graficos
que no forma parte que aparezcan directamente sobre el envase primario de un
curio Ci del SI. a_rtículo, sobre ? , dentro del empaque o envoltorio, secunda-
milicurio mCi rio, con excepc1on de los embalajes externos destinados
p~ra el transporte. El término "etiqueta" designa la parte del
microcurio u(i
etiquetado que se encuentra sobre el envase primario.
nanocurio nCi ~os embal~jes para el transporte que contengan un solo
Otros articulo se etiquetan por lo menos con la identificación del
aceleración producto (excepto los artículos controlados), el número de
debida a Usada para expresar la lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacena-
la grave- velocidad de centrifu- miento y distribución, salvo que dicho envase sea también
dad º- a ación. el envase primario o la parte exterior del empaque desti-
revolucio- Usada para expresar la nado al consumidor.
nes por velocidad de centrifu- Además de los requisitos de etiquetado establecidos en
minuto rom aación. es~os compendios, los artículos están sujetos al cumpli-
miento de otras normas de etiquetado que puedan promul-
gar entidades gubernamentales.
Prefijos Seleccionados del SI 10.~~.1 O. Cantidad de Ingrediente por Unidad de Dosifi-
cac1on
Nombre Símbolo Factor
El _contenido de un producto farmacéutico se expresa en
oioa G 109 la et1qu~~a del envase en términos de porcentaje, microgra-
mea a M 106 mos, miligramos o gramos del fármaco, o de su parte tera-
kilo k 103 péuticamente activa, de acuerdo con la forma usada en el
deci d 10-1 título del artfcl!lo, _ª· menos que s~ indique algo diferente en
centi e l-0-2 la monograf1a md1v1dual. En el etiquetado se indican los
10-3
nombres y cantidades equivalentes tanto del fármaco como
mili m
de su parte activa.
micro u lfr-6 Los artículos oficiales en cápsulas, tabletas u otras unida-
nano n H)-11 des de dosificaci~n deberán etiquetarse de forma tal que
nico o 10-12 expresen la cantidad de cada ingrediente activo o nutriente
femto f 10-15 reconocido c~ntenido en cad~ unidad; excepto cuando se
trate de soluciones o suspensiones orales envasadas en dosis
..t.USP31 ~ni~as, ya sea que éstas se suministren como preparaciones
9. PRESCRIPCIÓN Y DISPENSACIÓN h9~1das o prepar~c.i~mes líquidas reconstituidas a partir de
9.10 Uso de Unidades Métricas
solidos, por la ad1c1on de un volumen dado de un diluyente
Las prescripciones de artículos farmacopeicos se escribirán específico, cuyas etiquetas indicarán la cantidad de cada in-
usa~do unidades métricas para indicar la cantidad y/o con-
grediente activo o nutriente reconocido extraíble en las con-
tenido deseados, a menos que se indique algo diferente en diciones indicadas en Volumen de Entrega (698). Para los
la monografía individual (ver también la sección 5.50.1 O. pr<;>ductos farma~~uti~~s oficiales que no se presentan en
Uni~ades de Potencia [Biológica]). Si la prescripción de una
unidad.es de d~s1f1cac1on se debe expresar en el etiquetado
cantidad se hace en otro sistema de medidas, se debe dis- la cantidad de ingrediente activo por mililitro o por gramo
per:sar sólo u,n~ cantidad equivalente a la prescrita usando º·el porcentaje de cada ingrediente (ver 8.140. Concentra-'
Clones Porc~'!tuales), excepto en_ el caso de los líquidos ora-
el sistema metrico. No se deben usar unidades del sistema les, o los solidos que se ~econst1tuyan P?ra producir líguidos
apotecario en el etiquetado. orales, que se pueden etiquetar alternativamente en termi-
9.20 Cambios en Volumen no~ de la cantidad de ingrediente activo por 5 mL del lí-
En la dispensación de medicaciones prescritas pueden ob- q_u_1do o del preparado reconstituido. A menos que se espe-
viar~e los pegu~ños cambios de volumen que s~ producen c1f1qu_e a~go _diferente en un~ monograyía o en un capítulo,
debido a variaciones en la temperatura ambiente. tales md1cac1ones de contenido o cantidad deberán decla-
rarse sólo en unidades métricas. Ver también 5.50.1 O. Uni-
dades de Potencia (Biológica).
Cambio en la redacdón:
10.40.20. Uso de Ceros al Comienzo y al Final de una
10. CONSERVACIÓN, ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y Cantidad
ETIQUETADO Con el fin de minimizar la posibilidad de errores en la
"'[NOTA-Se han omitido las disposiciones relacionadas dispensación y administración de medicamentos cuando la
con el almac~namiento y envasado previamente tratadas en cantidad de ingrediente activo se exprese en nú;,,eros ente-
las Advertencias Generales, excepto la breve disposición pro- r?s, se de_be _indicar sin coma decimal seguida de ceros (por
puesta a continuación en el apartado 10.10; para compo- e1_emplo, 1~d1car 4 mg [no 1,0 mg]). La cantidad de ingre-
nentes de enyasado y condiciones de almacenamiento, ver diente activo que sea un numero decimal menor de 1 se
el nuevo capitulo general (659). De manera similar las dis- escribirá con un cero antes de la coma decimal (por ejem-
posiciones relacionadas con el etiquetado también 'están plo: 0,2 mg [no ,2 mg]).
s!e!1do trasladadas a un nuevo capítulo general (7) y se omi- 10.40.30. Etiquetado de Sales de Fármacos
tiran en un futuro.] .... usm Es un principio establecido que los artículos oficiales de-
10.1 O. "'Envasado y Almacenamiento ben t~ner un ún~co título oficial. Con el o_bjeto de ahorrar
!odos los artíc~l<;>s en los compendios USP o NF están espacio en l~s et19u_etas, y_dado que los s1mbolos químicos
s~letos a los requ1s!tos de envasado y almacenamiento espe-
de las sales morganicas mas comunes son conocidos por los
cificados ~n el capitulo general Requisitos de Envasado y Al- profesionales de la salud como sinónimos de sus formas es-
".1acenam1ento (659), a Tenas que se provean requisitos dis- critas, se p~rmiten l_a~ siguientes alternativas para el etique-
tintos en una monograf1a espec1fica ..a.usPJ1 tado de art1culos of1c1ales que son sales: HCI para clorhi-
drato'. HBr Pª!ª bromhidrato; Na para sodio y K para
potasio. Los s1mbolos Na y K se usan para abreviar el nom-
bre de las sales de ácidos orgánicos; sin embargo, estos sím-
 USP 37
bolos no deben usarse cuando se emplea la preposición
"de" en el título oficial, es decir cuando se denominan ofi-
cialmente "de sodio" o "de potasio" (con el metal al co-
mienzo de la denominación oficial en inglés), (p.ej., Feno-
barbital Sódico, que se denomina Phenobarbital Sodium en
inglés, se puede abreviar a Fenobarbital Na, pero no se de-
berá escribir Salicilato de Na para abreviar Salicilato de So-
dio, el cual se denomina Sodium Salicylate en inglés).
10.40.40. Etiquetado de los Productos con Vitaminas
La etiqueta de los productos farmacéuticos oficiales debe
indicar su contenido de vitaminas expresado en unidades
métricas por unidad de dosificación. Los contenidos de vita-
mina A, D y E también se pueden expresar en Unidades
USP. Las cantidades de vitamina A expresadas en unidades
métricas hacen referencia a las cantidades equivalentes de
retino! (alcohol de vitamina A). La etiqueta de los suplemen-
tos nutricionales debe incluir un número identificatorio de
lote, de control o de partida.
10.40.50. Etiquetado de los Productos Botánicos
La etiqueta de una hierba u otro producto botánico desti-
nado para uso como suplemento dietético contiene la le-
yenda "Si está embarazada o en período de lactancia, con-
sulte a un profesional de la salud antes de usar este
producto".
10.40.60. Etiquetado de Preparaciones Parenterales y
Tópicas
La etiqueta de una preparación para uso parenteral o tó-
pico debe especificar el nombre de todas las sustancias
agregadas (ver 5.20. Sustancias Agregadas y ver Etiquetado
en Inyectables (1 )) y, en caso de preparaciones para uso pa-
renteral, también debe especificar sus cantidades o propor-
ciones, excepto en el caso de sustancias agregadas sólo para
ajustar el pH o para lograr isotonicidad, para las cuales
puede mencionarse simplemente su presencia y la razón por
la cual se agregan.
10.40. 70. Etiquetado de Electrólitos
La concentración y dosificación de electrólitos para tera-
pias de reemplazo (p.ej., cloruro de sodio o cloruro de pota-
sio), debe especificarse en la etiqueta en miliequivalentes
(mEq). Asimismo, la etiqueta del producto debe indicar la
cantidad del ingrediente o ingredientes, expresada en térmi-
nos de peso o concentración porcentual.
10.40.80. Etiquetado de Alcohol
El contenido de alcohol en una preparación líquida debe
especificarse en la etiqueta como porcentaje (v/v) de
C2HsOH.
10.40.90. Cápsulas y Tabletas Especiales
La etiqueta de cualquier Cápsula o Tableta destinada para
una administración que no sea la ingestión oral de la unidad
entera, debe llevar una indicación bien visible sobre el modo
de uso.
10.40.1 OO. Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso
(N. del T. Las expresiones "fecha de caducidad", "fecha
de expiración" y "fecha de vencimiento" son equivalentes.)
La etiqueta de un producto farmacéutico oficial, o de un
suplemento nutricional o dietético oficial, debe llevar una
fecha de caducidad. Todos los productos deben exhibir la
fecha de caducidad de manera tal que pueda ser leída por
una persona común en las condiciones normales de compra
y uso. La fecha de caducidad debe aparecer en forma pro-
minente, contrastando claramente con el fondo, o grabada
en relieve con nitidez, y debe ser fácilmente comprendida
(p.ej., "EXP 6/08," "Exp. Junio de 2008", o "Caduca el 6/
08"). [NOTA-Para obtener información adicional, consultar
los Voluntary Codes and Guidelines of the Self-Medication ln-
dustry de la Consumer Healthcare Products Association.]
Las monografías para ciertas preparaciones especifican
cómo se debe determinar la fecha de caducidad que apa-
rece en la etiqueta. En ausencia de un requisito específico
en las monografías individuales de un producto farmacéu-
tico o un suplemento nutricional, la etiqueta debe llevar una
fecha de caducidad asignada para dicha formulación y em-
paque en particular del artículo, con la siguiente excepción:
Advertencias Generales 1 3
no es necesario exhibir la fecha de caducidad en el caso de
productos farmacéuticos o suplementos nutricionales enva-
sados en envases destinados a la venta sin receta médica, en
cuyo etiquetado no se establezcan limitaciones de dosifica-
cion y que se mantengan estables durante un período de no
menos de 3 años, siempre que se almacenen en las condi-
ciones prescritas.
En el caso de artículos oficiales que deban exhibir una
fecha de caducidad, tales artículos deben dispensarse en un
envase, o a partir de un envase, etiguetado con fecha de
caducidad, y la fecha de dispensacion del producto debe ser
anterior a la fecha de caducidad declarada. La fecha de ca-
ducidad identifica el período durante el cual se estima que
el artículo cumple con los requisitos de la monografía oficial,
siempre que se conserve en las condiciones de almacena-
miento prescritas. La fecha de caducidad limita el tiempo
durante el cudl un artículo puede ser dispensado o usado.
En los casos en que se indica sólo el mes y el año de caduci-
dad, se entiende que la fecha se refiere al último día del
mes indicado. La fecha límite de uso es la fecha después de
la cual no se debe utilizar un artículo. Basándose en la infor-
mación provista por el fabricante y las Advertencias Genera-
les, el dispensador debe colocar una fecha límite de uso
adecuada en la etiqueta del envase del artículo recetado
para limitar el uso del mismo por parte del paciente. La
fecha límite de uso colocada en la etiqueta no debe ser
posterior a la fecha de caducidad del envase del fabricante.
Para los artículos que requieran ser reconstituidos antes de
su uso, se debe colocar en el etiquetado una fecha límite de
uso apropiada para el producto reconstituido.
Para todas las otras formas farmacéuticas en las que se
deba determinar el período posterior a la dispensación du-
rante el cual es prudente que un paciente conserve un me-
dicamento prescrito, el dispensador debe tener en conside-·
ración, además de cualquier otro factor relevante: la
naturaleza del medicamento; el envase en el que fue enva-
sado por el fabricante y su fecha de caducidad; las caracte-
rísticas del envase para el paciente, si el artículo se reenvasa
para su dispensación; las condiciones de almacenamiento
esperadas o inusuales a las que el artículo puede ser ex-
puesto y el período estimado para la duración del trata-
miento. Considerando todo lo anterior, el dispensador debe
colocar en la etiqueta de un envase de unidades múltiples
una fecha límite de uso adecuada, a fin de limitar la utiliza-
ción del artículo por parte del paciente. A menos que se
especifique algo diferente en la monografía individual, o en
ausencia de datos de estabilidad, esa fecha límite de uso no
podrá ser posterior a: (a) la fecha de caducidad indicada en
el envase del fabricante, o (b) un año a partir del momento
en que se dispense el medicamento, lo que represente un
período menor. Para formas farmacéuticas líquidas y sólidas
no estériles que están envasadas en envases unitarios y de
dosis únicá, la fecha límite de uso debe ser de 1 año a partir
de la fecha de envasado del medicamento en envases unita-
rios o de dosis única, o la fecha de caducidad indicada en el
envase del fabricante, lo que represente un período menor,
a menos que los datos de estabilidad o el etiquetado del
fabricante indiquen algo diferente.
El dispensador debe mantener las instalaciones donde se
envasan y almacenan las formas farmacéuticas a una tempe-
ratura cinética media no mayor de 25º. El material de plás-
tico usado para envasar debe brindar una mejor protección
que la que ofrece el cloruro de polivinilo, que no brinda una
adecuada protección contra la permeación de la humedad.
Se deben guardar registros de la temperatura del lugar
donde se almacenan las formas farmacéuticas y de los mate-
riales plásticos usados en el envasado.
10.40. l 00.1. Preparaciones Magistrales
La etiqueta del envase o empaque que contiene una pre-
paración magistral oficial debe llevar una fecha límite de
uso. La fecha límite de uso es la fecha después de la cual no
debe usarse la preparación magistral. Debido a que las pre-
paraciones magistrales están destinadas a administrarse in-
mediatamente o luego de un período de almacenamiento

14 Advertencias Generales
corto, las fechas límite de uso pueden determinarse basán-
dose en criterios distintos a los utilizados para determinar las
fechas de caducidad de los productos farmacéuticos fabrica-
dos en forma industrial.
La monografía de una preparación magistral oficial in-
cluye, por lo general, un requisito de límite de uso que es-
pecifica el período desde la fecha de preparación durante el
cual, en condiciones de almacenamiento adecuadas, se
puede usar la preparación. En caso de que no haya datos de
estabilidad aplicables a un fármaco y preparación específi-
•
USP 37
cos, se han desarrollado recomendaciones de fecha límite de
uso máxima para preparaciones magistrales no estériles en-
vasadas en envases impermeables y resistentes a la luz, al-
macenadas a temperatura ambiente controlada, a menos
que se especifique algo diferente (ver Criterios de Estabilidad
y Determinación de la Fecha Límite de Uso en Estabilidad de
Preparaciones Magistrales en el capítulo de pruebas generales
Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)).
"'•USP37
USP 37 Guía de los Capítulos Generales /Diagrama de Capítulos 15

Diagramas de Capítulos

Capítulos Generales USP

Artículos Oficíales Generalmente Aplícables

Fármacos Activos
No Complejos Elementos Básicos
Ver Diagrama 1

• <1058> Calif1cac1ón de Instrumentos Analíticos

Sustancias Obtenidas por
• < 1097> Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel
Biotecnología
Ver Diagrama 2
f <1151> Formas Farmacéuticas

• <1196> Armonización Farmacope1ca

• <1224> Transferencia de Procedimientos Analíticos

Excipientes f <1225> Validación de Procedimientos Farmacopeicos
Ver Diagrama 3
• <1226> Verificación de Procedimientos Farmacope1cos

Medicamentos Activos No
Complejos Distribución de Medicamentos
Ver Diagrama 4 Ver Diagrama 9

Medicamentos de Sustancias
Obtenidas por Biotecnología Microbiología
Ver Diagrama 5 Ver Diagrama 10

Vacunas [Nota: Esta Tabla y los

Ver Diagrama 6 Diagramas 1-13 que se
presentan a continuación
tienen la finalidad de ser una
guía de los capítulos en esta
Sangre y Hemoderivados
Ver Diagrama 7 publicación. Es probable que
no incluyan la información
completa y no pretenden
Productos de Terapia Génica y cumplir con las expectativas
Celular de los artículos o limitar la
Ver Diagrama 8 aplicación de las pruebas a
cualquier artículo en USP-NF.]

Ingredientes de Suplementos
Dietéticos
Ver Diagrama 11

Productos de Suplementos
Dietéticos
Ver Diagrama 12

Preparación Magistral
Ver Diagrama 13

Dispositivos Médicos

t <691 > Algodon

• <861> Suturas Diámetro
• <871> Suturas,Sujec1on de Agujas
 1

16 Diagrama 1 / Guía de los Capítulos Generales USP 37

Descripción Caracterización
Fisicoquímica
• <659> Requisitos de Envases y Almacenamiento
' <268> Porosidad Mediante Adsorción-Desorción
Identificación
+ , de Nitrógeno
<301 > Capacidad Neutralizante de Ácido
• <181> ldentificacíón-Bases Orgánícas Nitrogenadas •T <429> Medición del Tamaño de Partícula por
Difracción de Luz
• <191> Identificación Pruebas Generales <616> Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento
• < 193> Identificación Tetraciclinas • <631> Color y Acromatismo

I < 197> Pruebas de Identificación Espectrofotométrica

<201> Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada
; <641> Totalidad de la Disolución
<651 > Temperatura de Solidificación

• <401> Grasas y Aceites Fijos <695> Cristalinidad

<699> Densidad de Sólidos
• <541 > Volumetria
<721> Intervalo de Destilación
<621 > Cromatografia
<731> Pérdida por Secado
<731> Pérdida por Secado

1f :~::: :::~~~s~:::
<735> Espectrometrfa de Fluorescencia de Rayos X
<736> Espectrometría de Masas

de Resonancia Magnética Nuclear

<735> Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
<741> Intervalo o Temperatura de Fusión
<761> Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
<776> Microscopía óptica
<781> Rotación Óptica
<785> Osmolalidad y Osmolaridad
..,.. <851 > Espectrofotometría y Dispersión de Luz <786> Estimación de la Distribución del Tamaño

+1
<941 > Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente
Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP}
de Partícula par Tamizado Analítico
<791> pH
<811> Finura de Polvos
1-' <1119> Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano
<821 > Radioactividad
f <1120> Espectroscopia Raman <831 > Indice de Refracción
• <1761> Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear <841 > Peso Específico
<846> Área Superficial Específica
<881> Resistencia a Ja Tensión
Valoración
<911> Viscosidad-Métodos del Víscosímetro Capilar
+
! <11> Estándares de Referencia USP
<81 > Antibióticos. Valoraciones Microbiológicas
"!" <351> Valoración de Esteroides
<912> Métodos del Reómetro Rotatorio
<913> Métodos del Viscosímetro de Bola Rodante
<941 > Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente
<361 >Valoración de Barbítúricos Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP)
<391> Valoración de Epinefrina <1119> Espectroscopia en el lnfarrojo Cercano

1 <425> Antibióticos- Valoración Yodométrica

<451 > Volumetría con Nítrito
<1120> Espectroscopia Raman
<1171> Análisis por Solubilidad de Fases

t
<1761 > Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia Magnética
<511> Valoración de un Esteroide Aislado Nuclear
<541 > Volumetria <1911> Reometría
<621> Cromatografla

!
<735> Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
<736> Espectrometría de Masas
<801> Polarografía
<851 > Espectrofotometría y Dispersión de Luz
< 1120> Espectroscopía Raman Equipamiento

<21> Termómetros
<31:> Aparatos Volumétricos
<41 > Pesas y Balanzas
<1051:> Limpieza de Material de Vidrio
Impurezas <1251 :> Pesada en una Balanza Analitica

Disolventes

¡
Orgánicas Inorgánicas
Residuales
Contenido de Agua
<223> Dimetilanilina <206> Aluminio • <467> Disolventes Residuales
1
<461 > Determinación de Nitrogéno <211> Arsénico + <621> Cromatografía
<466> Impurezas Comunes <221> Cloruros y Sulfatos • <731 > Pérdida por Secado

!
<541> Volumetria
<621 > Cromatografía <231 > Metales Pesados
<232> lmpurezas Elementales Limites <731> Pérdida por Secado
<781 > Rotación Óptica
<801 > Polarografía <233> Impurezas Elementales-Procedimientos <891> Análisis Térmico

<851 > Espectrofotometría y Dispersión <241> Hierro <921> Determinación de Agua

1 de Luz <251> Plomo
• <1086> Impurezas en Fármacos y <261 > Mercurio
Productos Farmacéuticos <281> Residuo de Incineración
<291 > Selenio
<471 >Combustión en Matraz con Oxígeno
<730> Espectroquímica de Plasma
<733> Pérdida por Incineración
<735> Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
USP 37 Guío de Jos Capítulos Generales / Diagrama 2 1 7

Diagrama 2. Sustancias Obtenidas por Biotecnología

Descripción Fisicoquimica Caracterización

• <11 > Estandarcs de Referencia USP • < 111 > Diseño y Análisis de Valoraciones 81ológ1cas
• <621 >Cromatografía • <621 > Cromr1togr;:ifía
• <726> Electroforesis • < 726> Electroforesis
• <736> Especlrornelrí<-1 de MAS<-1<; • <7:36> Espectrometr1a de Masas
• <761 >Espectroscopia de Resonancia Magnétíca Nuclem • <761 > Espectroscopia de Resonancia Mngnét1ca Nuclear
• <786> Estimación de la D1stribuc1ón del Tamaño de Part1cula por • <851> Espcctrofotometrin y Dispers1on de Luz
Tamizado Analítico • < 1030> Capítulos de Valoraciones B1ológ1cas lnform<.ic1or
• <831 >indice de Refracción General y Glosario
• <851> Espectrofotometria y Dispersión de Luz • <1032> Diseño y Desarrollo de Valoraciones B1olog1cas
• <1045> Art1culos Obtenidos por B1otecno:ogia • <1033> Validacíón de Valoraciones B1ológ1cas
•<1052> Artícu•os Obtenidos por Biotecnología Anál1s1s de Aminoac1dos • <1034> Análisis de Valoraciones B1ológ1cas
• <1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología
Nuclear • <1053> Electroforesis Capilar • <1048> Calidad de Productos Biotecnológicos Anál1s1s de la Cons-
• ·-1C54> /\r;1c,ik.J::c. Oblernoos por G1cte,-rmlog1J lso8le1,;rr1i:o11fuqcJe trucc1on Expresable en Cekilas Usadas PrvGucucn
• <1055> Art1culos Obtenidos por Biotecnología Mapeo de Péptidos de Productos Proteínicos Obtenidos con Recomb1nante

¡ <I0'.'13>
<10:)2.~ • <1052> Articulas Obtenidos por B1otecr1o:ogía Arialis1s
• <1056> Artículos Obtenidos por B1otecnologia Electroforesis
en Gel de Pol1acnlamida de Arn1noac1dos

l
<1034>
• < 1045> por º'º'°°''º"'"'d
T<1052> Art1cu!os Obtenidos por Biotec,1olc,aia
de Ammaaodos
< 1053> Electroforesis Capilar
<1054> Articulas Obtenidos por B1otecnolog1a
lsoelectroenfoque
< 1055> Articulas Obtenidos por 81otecnclog1a
Mapeo de Peot1dos
<1056> Articulas Obtenidos por B1otecnolog1a
Electroforesis en Gel de Pol1acnlam1da
•<1057> Artículos Obtenidos por Biotecnologia
1
Valoración de Proteínas Totales
<1102> Métodos de Pruebas lnmunológ1cas-
Consideraciones Gencru!es
<1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por
lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
<1104> Métodos de Pruebas lnmunológ1cas Análisis por
lnmunotransterenc1a
<1125> Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos -Generalidades
<1126> Tecnicas Basadas en Ac1dos Nucleicos Extracción,
<1127> ~~~~Tg~~n¿a~:J~;~~a;~~~os Nucleicos
Amplít1cac1ón
<1761> ~~;;;~~e~~Zi~~rEspectroscopía de Resonancia
• ""1053> Electroforesís Capilar
• <1057> Artículos Obtenidos por Biotecnolog1a Valorac1on de
l Proteinas Totales • <1054> Artículos Obtenidos por B1otecnologia· lsoelectroenfoque
'<1065> Cromatografía Jónica • <1055> Articulas Obtenidos por B1otecnologia Mapeo de Pept1dos
• <1761> Ar!icaciones de la Espectroscopía de Resonanci;:i • <1056> Artículos Obtenidos por Biotecnologla-Electrofores1s
Magnétíca Nuclear en Gel de Pollacrilam1da
• <1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología Valoración de
, Proteínas Totales
Equipamiento • <1084> Análisis de Glicoproteínas y Gllcanos Consideraciones
' Generales
• <21> Termometros • <1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas Consideraciones
• <31 >Aparatos Volumetricos Generales
• <41 > Pesas y Balanzas • <1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por
lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA}
•<1251> Pesada en una Balanza Analítica
f <1 í04> Métodos de Prueb~s Inmunológicas-Análisis por
1 lnmunotransferenc1a
T <1105> Métodos de Pruebas !nmunologicas- Resonancia de
Pfasmón Superficial
• <1125> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Generalidades
Impurezas
• <1126> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Extraccíón,
1 Deteccion y Secuenc1ación
e <1127> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Ampllf1cac1ón
• <1128> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Micromatrices
Relacionadas con el Proceso • <1129> Técnicas Basadas en Ac1dos Nucleicos Gcnot1pificación
• <1130> Técnicas Basadas en Ac1dos Nucleicos Enfoques para

Seguridad

Pruebas de M1crobiario
i
•
<11 > Estándares de Referencia USP
<63> Pruebas de Micoplasma
<81 > Antíb1ót1cos Valoraciones M1crob1ológicas
<111> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
<130> Atributos de Calidad de la Proteína A
e
Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Anál1s1s de ADN
Resídual)
<1181> Microscopía Electrónica de Barrido
• <1761 >Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia
Magnética Nuclear

<62> Examen Microbiológico de Productos No Estériles • <231> Metales Pesados

Relacionadas con el Producto
<B 3> ~~~:~:~ ~: ~\~~p~~~~!smos Especificos • <232> Impurezas Elementales -Límites
<71 > Pruebas de Esterilidad :, <233> !~purezas Elementales--Procedim1entos
¡ <11 > Estándares de Referencia USP

!
<85> Pruebas de Endotoxmas Bacterianas <467> Disolventes Residuales
<111> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
<87> Pruebas de Reactividad B1ológíca, In Vitro • <503> Ácido Acético en Péptidos
<621> Cromatografía
<88> Pruebas de Reactiv1dad Biológica, !n Vivo • <541 > Volumetría
<726> Electroforesis
<í 113> Caracter1zac1ón, Identificación y T1p1fícac1ón de • <621 > Cromatografía
<736> Espectrometría de Masas
Cepas Microbianas • <726> Electroforesis
<761> Espectroscopía de Resonancia ~agnét1ca Nuclear
<1130> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques • <730> Espectroquímica de Plasma
<1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas
Detectar Tra7as de Ácidos Nucleicos (Análisis• <731> Pérdida por Secado
Cons1derac1ones Generales
ADN Residual) • <736> Espectrometría de Masas
<1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por
< 1180> Plasma Humano • <761 > Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

!
: lnmunoadsorción Ligado a Enzímas {ELISA)
<1211> Ester1!1zac1ón y Garant1a de Esterilidad de • <851> Espectrofotometria y Dispersión de Luz
<1104> Métodos de Pruebas lnmunológrcas-Análísis por
Artículos • <921 > Determinación de Agua lnmunotransferenc1a
<1229> Esterilización de Farmacopeicos
e<1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología <1761 >Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia
e<1052> Artículos Obtenidos por Biotecno!ogía--Análisis de Aminoácidos Magnética Nuclear
Valoración •<1053> flectroforesis Capilar
+<1054> Artículos Obtenidos por Biotecnología lsoelectroenfoque
• <11> F:standares de Referencia USP •<1055> Artículos Ohterndos por B1otecnología-Mapeo de Pépticios
• < 111 > Díseño y Ana:1sis de Valoraciones Biológicas
•<1056> Artículos Obtenidos por Biotecnologia ·Electroforesis en Gel de Poliacrilamída
• < 121 > Valoraci~n de Insulina •<1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales
• <208> Valorac1on de Actividad Anti-Factor Xa Y Anti-Factor •<1084> Análísís de Glicoproteínas y Glícanos Consideraciones Generales
~~~~~a~::u~:i~as No Fraccionadas Y de Baío + <1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas Cons1derac1ones Generales
e <541> Volumetna '<1103> Métodos de Pruebas !nmunológ1cas-Ensayo por lnmunoadsorc1ón Ligado
• <621> Cromatografia a Enz1mns (ELISA)
e <726> Eiectroforests •<1104> Métodos de Pruebas lnmunológ1cas--Anál1s1s por
• <136> Espectrometría de Masas lnmunotransferencía
• <761> Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear •<1130> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Enfoques para Detectar Trazas de Ac1dos Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
e <781> Rotación Óptrca •<1761> Apl1cac1ones de la Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
• <851> Espectrofotometria y D1spersion de Luz
<1030> Capítulos de Valoraciones B1ológ1cas Información General y Glosario
<1032> Diseño y Des8rrol!o de V;.ilorélc1ones Biológw;:is
<1033> Validación de Valoraciones B1ológ1cas
<1034> Analís1s de Valoraciones B1ológ1cas
<1045> Articulas Obtenidos por B1otecnologia
<1052> Articulas Obtenidos por B1otecnolog1a Análisis de Aminoac1dos
<1053> Electroforesis Capilar
<1054> Artículos Obtenidos por 81otecnologia lsoelectroenfoque
<1055> Art1culos Obtenidos por B1otecnologia Mapeo de Pépt1dos
<1056> Articulas Obtenidos por Biotecnologia Electroforesís en Gel de Pollacrílam1da
<1057> Arliculos Obterndus por B1otecnología Valorac1on de Proteínas Totales
<1102> Metodos de Pruebas lrmunológ1cas Cons1derac1ones Generales
<1103> Melados de Pruebas lnmunolog1cas Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
• < 1105> Métodos de Pruebas Inmunológicas Resonancia de Plasmón Superficial
• <1761> Aplicaciones de la fspectroscop1a de Resonancia Magrét1ca Nuclear
18 Diagrama 3 / Guía de los Capítulos Generales USP 37

Diagrama 3. Excipientes

Pruebas Universales Pruebas Específicas

Caracterización Fisicoquimica
Descripción
e <1091> Etiquetado de Ingredientes Inactivos
e <268> Porosidad Mediante Adsorción Oesorc1ón de Nitrógeno
• <429> Med1cion del T amano de Part1cula por D1fracc1ón de Lu¿
• <616> Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento
• <631> Color y Acromatismo
Identificación • <641> Totalidad de la 01soluc1ón
• <651> Temperatura de Solid1f1cac1ón
• < 181 > ldent1f1cac1ón Bases Orqarnc<1~ N1troqenddas • <695> Cristal1r11dad
• < 191> ldent1f1cacion Prueb<>s Generale~ • <699> Dens1d8d de Sólidos
• < 197> Pruebas de ldentff1c8c1on Espectrofotométrica • <-721> Intervalo de Destilación
• <731 > Perdida por Secado
• <201 >Prueba de ldent1fic;mon por Cromatogratia en Capé! Delgada

! <401 > Grasas y Aceites FIJOS

<621> Cromatografía
•
•
•
""735> Fsp~1fr1ynptrh de Fluoresr:enc1a de Royos X
<741> Intervalo o Jemperatura de Fusión
<761> Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

:•
<731 > Pérdida por Secado
• <776> Óptica
<735> Espectrometría de Fluorescenc1a de Rayos X • <781'"> Rotacion
<736> Espectrometria de Masas • <785> Osmolalidad y Osmolandad
<781 >Rotación Óptica • <786> Estimación de ia Distnbuc1ón del Tamaño de Partícula por

• <851> Espectrofotometría y D1spers1ón de Luz

Tamizado Analítico

•
•
<941 > Caractenzac1ón de Solidos
por Difracción de Rayos X Sobre
<1119> Espectroscopía en el lnfrarro¡o Cercano
•
•
•
<791> pH
<811 > Finura de Polvos
<821> Radioacl1v1dad
• <831> Indice de Refracción
• <841> Peso Especifico
• <846> Area Superficial Especifica
• <881> Res1stenc1a a la Tensión
Valoración • <911 > Viscos1dad~Metodos del Viscosimetro Capilar
• <912> Métodos del Reómetro Rotatono
• <311> Valoración de Alg1natos • <913> Métodos de! Viscosimetro de Bola Rodante
• <941> Caractenzac1ón de Sólidos Cnstalmos y Parcialmente
• <345> Valoración de Addo CítncofCitrato y Fosfato
Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP)
• <1045> Aiticulos Obtenidos por 81otecno!ogía
• <425> Antibióticos ,Valoración Yodométrica
+ <1119> Espectroscopía en el !nfrarro¡o Cercano
• <431 > Determinación de Grupos Metoxilo • <i 174> Fluidez de Polvos
• <1761> Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <541 > Volumetria • <1911> Reometria

• <621 > Cromatografía

e <801 > Po!arografía

• <851 > Espectrofotometria y Dispersión de Luz

Equipamiento
• <21> Termómetros
• <31> Aparatos Volumétricos
• <41> Pesas y Balanzas
Impurezas • <1051 > Limpieza de Material de Vídrio
e <1251> Pesada en una Balanza Análitica

Disolventes Agua para Uso Farmacéutico

Orgánicas Inorgánicas
Residuales
~ • <541 > Volurnetna

•
<226> 4-Epianhidrotetraciclina

<461> Determ1nac1ón de N1trogéno

•

•
<206> Aluminio

<211 > Arsernco I <228> óxido de Etileno.y 01oxano e <643> Carbono Orgánico Total

¡ <466> Impurezas Comunes

<621> Cromatografía
•

e
<221 > Cloruros y Sulfatos

<231 > Metales Pesados

•
•
, <467> Disolventes Residuales

<621 > Cromatografía

<731> Pérdida por Secado
•
•
•
•
<645> Conductividad de! Agua
<791'"> pH
<891> Análisis Térmico
<921> Determinación de Agua
• <781> Rotación Óptica • <232> Impurezas Elementales-Límites
• <801 > Polarografía • <233> Impurezas E!ementales-Procedim1entos • <1230> Agua pard Uso en Hemodiális1s

+ 1

1
<851 > Espectrofotometria y
D1spers1ón de Luz
• <241 > Hierro
•
•
<1231-.,_ Agua para Uso Farmacéutfco
Ver Microb1ofogía (Diagrama 10)
• <251 > Plomo
• <1086> en Farmacos y
de
Farmacéuticos e <261 >Mercurio

• <281> Residuo de lnc1nerac1ón Funcionalidad/Seguridad/

BPF
• <291> Selenio
• <301> Capacidad Neutralízante de Ácido
• <471> Combustión en Matraz con Oxigeno
• .,.1059> Desemper'io de Excipientes
• <730> Espectroquím1ca de Plasma •<1074> Guías
de los
• <733> Pérdida por lncmerac1ón •<1078> Buenas de Fabricación para Excipientes
Fannaceuticos a Granel
• <735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
• <1080> Exc1p1entes Farmacéuticos a Granel-Certificado de Análisis
• < 1081 > Consistencia del Gel de Gelatina
• < 1097> Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel
• <1174> Flu1deL de Polvos
• <1195> Gwa sobrp, C;:imb1os S1gnrt1cat1vos en Exc1p1entes
Fmmaceut1cos a Granel
• <1197> Buenas Practicas de Drstnbuc1ón para Exc1p1en:es Farmacéuticos
a Granel
USP 37 Guía de los Capítulos Generales / Diagrama 4 19

Diagrama 4. Medicamentos Activos No Complejos

Pruebas Universales Pruebas Específicas

Descripción Equipamiento
e <1121> Nomenclatura • <21> Termometros

• <3í >Aparatos Volumétricos

ldentif1cac1ón • <4 í > Pesas y Balanzas

•e <107~· Pr~JPbéls de lcte11t1kac1on E:spectrofotometrica • < 1251 > Pesadn en una Balanza Analit1ca

• <201 > Prueb;i de lrlent1f1cac1on por Cromatografía en Capa Delgada

• <501 >Sales de Bases Orgánicas Nitrogenadas

Contenido de Agua
• <621> Cromatografía
e <735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
• <541 > Volumetria
• <736> Espectrometria de Masas
• <731> Perdida por Secado
• <851> Espectrofotornetria y Dispersión de Luz
• <891> Análisis Termrco

• <921 > Detemunactón de Agua

Valoración
Pruebas de Desempeño
• <81 > Antibióticos Valoraciones Microbiológicas

• <341 > Agentes Ant1microb1anos Contenido

Tópica
• <351> Valoración de Esteroides Mucosa
• <3> Medicamentos Tópicos y Trans~
• <361> Valoración de Barbitúricos dérmicos-Pruebas de Calidad
Esterilidad de Producto
• <391 > Valoración de Epinefrina Oftálmica 'f <85> Prueba de Endotox1nas Bacterianas • <724> liberación de Fármacos

••
• <415> Valoración de Gases Medícinales

•+
<87> Pruebas de React1v1dad
+ <451 > Volumetría con Nitrito
1
<751> Particu!as Metálicas en
Ungüentos Oftálmicos
Biológica, In Vitro
<88> Pruebas de React1vidad
•<791> pH
•<1724> Medicamentos Sem1sol1dos
• <501 > Sales de Bases Orgánícas Nitrogenadas Pruebas de Desempeño
<771 > Unguentos Oftálmicos 1 Biológica. In Vivo
• <541 > Volumetría

+ <611> Determinación de Alcohol • <785> Osmolalidad y Osmolaridad • <151> Prueba de Pirógenos

lnhalatoria

•
• <381> Tapones Elastoméncos
1
<789> Particu!as en Soluciones 1 para Inyectables
• <601> Aerosoles, Atomizadores

•
• <621> Cromatografía Oftálmicas • <729> D1stnbución del Tamaño de
Nasales, Inhaladores de Dosis
<791> pH Glóbulos en Emulsiones
• <801> Polarografia Fija e Inhaladores de Polvo Seco
~ Inyectables de Lípidos
•
•
<851> Espectrofotometria y Dispersión de Luz
<1065> Cromatografía lórnca
• Ver M1crob1ofog1a (Diagrama 10)
¡
1
<788> Partículas en Inyectables
<791> pH
• <791> pH
• <1601> Productos Nebulización-
Ótica • <1113> Caracterización, Jdent1ficac1ón y Pruebas de Ca1racleri1oaciór
! T1pificac1ón de Cepas Microbianas
Nasal • <1788> Método para la Determ1nac1ón de Partículas
Impurezas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas
• <601> Aerosoles, Atomizadores
Nasales, Inhaladores de Dosis Oral
Orgánicas Fija e Inhaladores de Polvo Seco
e <791> pH • <2> Medicamentos Orales- Pruebas de Calidad de Productos
• <413> Análisis de Impurezas en
• <301> Capacidad Neutralizante de Acido
Gases Medicinales Uretral
•
¡
<461 > Determinación de N1trogéno

• <466> Impurezas Comunes

f <701 >Desintegración
.<71í> D1soluc1ón

<724> L1berac1ón de Fármacos

• <621 >Cromatografía Vaginal
+ 1
<781 > Rotación Óptica
•

í,
<905> Uniformidad de Unidades de Dosificación

<1005> Em1s1ón Acust1ca

~ <801 > Polarografia
• <851 > Espectrofotometria y Dispersión de Luz
t.::1086> Impurezas en Farmacos y Productos Farmacéuticos
Inorgánicas
Rectal T <1087> D1soluc1ón Intrínseca Aparente Procedimientos de Pruebas
de Disolución para Disco Rotatorio y Disco Estacionario
• <1088> Evaluación Jn Vivo e In Vitro de Formas Farmacéuticas
9 <1090> Evaluación de Desempeño del Producto Farmaceut1co-
[ 81odísponibil1dad. B1oequivalenc1a y Disolución
• <1092> Procedimiento de Disolución Desarrollo y Validación

• <1216> Fnabriidad de las Tabletas

• <232> Impurezas Elementales Limites • <1217> Fuerza de Ruptura de las Tabletas
• <233> Impurezas Elementales Procedimientos
• <281> Residuo de Incineración
• <730> Espectroquimica de Plasma
• <733> Pérdida por lncmeración
e <735> Espectromelria de Fluorescencia de Rayos X
Orofarí ngea

Disolventes Residuales

• <467> Disolventes Residuales

• <621 > Cromatografia

 •
20 Diagrama 5 / Guía de los Capítulos Generales USP 37

Diagrama 5. Medicamentos de Sustancias Obtenidas por Biotecnología

ldentificacion Seguridad Fis1coquimica

• <11,• Est;:indares de Referencia USP • <11 > Estandares de Referencia USP • <11> Estandares de Referenua USP
• <121> Valorac1on de lnsul1'1a • <61> Examen M1crob1olog1co de Productos No • <621> Cromatografía
• < 123>Pruebas de Identidad B1ológ1ca de Glucagon Esteriles· Pruebas de Recuento M1crobrano • <726> Electroforesis
• <191> ldent1frcac1on Pruebas Generales • <62> Examen M1crob1ológ1co de Productos No Esteriles • <736> Espectrometr1a de Masas
Pruebas de Microorganismos Espec1f1cos
•
•
<197> Pruebas de ldent1frcac1ón Espectrofotométrica
<621 > Cromatografia
+ <63> Pruebas de M1coplasma
•
•
<761 > Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
<785> Osmolal1dad y Osmolaridad
• <71 > Pruebas de Esterilidad
• <726> Flectrofores1s • <786> Est1macion de la 01stribuc1on del Tamaño
• <73C> Espectrometríd de fv'tasas • <85> Prueba de Endotoxinas Bacterianas de Part1cula por Tamizado Anal1t1co
• < 761 > Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclea • <87> Pruebas de React1v1dad B1ológ1ca. Jn V1tro e <791> pH
• <8t)1-, Espectrofotometria y D1spers1ón de Luz • <88> Pruebas de Reachvidad 81olog1ca. ln Vivo • Índice de Refracción
• < 1030> de Valoraciones 81olog1cas •<151> Prueba de Pirógenos • Espectrofotometría y D1spers1ón de Luz

•
• < 1033::- Val1dac1on de Valoraciones B1ológ1cas
•<3,11 > Aaentes Antim1croh1anos Contenido
•<1050> Fvaluac1on de la Seguridad Viral en Productos
• <1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología

81otecnológ1cos Obtenidos de Lineas Celulares

• <-1034> Anai1s1s ae Valoraciones Biológ1cas
de Origen Humano o Animal
•<1106> Ensayos de lnmunogenietdad Diseño y Validac1ór

lsoelectroenfoque
de lnmunoensayos para üetectar Anticuerpos
Antifármacos
•<1111> Examen M1crob1ológico de Productos No Estériles
1 Criterios de Aceptación para Preparaciones
¡ Jsoelectroenfoque
<1055> Arti.culos Obten1.dos por B1otecnologia-
Mapeo de Pépl!dos
<1056> Articulas Obtenidos por Biotecnología~
• <1055> Articulas Obtenidos por B1otecnologia ~< 1113 > ~:~:~~;¡~~~~~/ 1~~~~~f~c~~~ónd~ Uso Farmacéutico Electroforesis en Gel de Pollacnlamida
• <1057> Artículos Obtenidos por B1otecnologia
Mapeo de Péptidos
de Cepas Microbianas Valoracion de Protemas Totales
• < 1056> Artículos Obtenidos 1
•<1130> Basadas en Ácidos Nucleicos • <1065> Cromatografía lórnca
1 Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos
• <1084> Análisis de Glicoproteinas y G!icanos·
1 Nucleicos {Análisis de ADN Residual)
Consideraciones Generales
+<1211 > Esterilización y Garantía de Esterilidad de Articulas
• <1761> Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia
1 Farmacopeicos
por Magnética Nuclear
•<1229> Estenlizac1ón de Artículos Fannacopeicos
Impurezas
por lnmunotransferencia
e <1761> Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Valoración
Magnética Nuclear Relacionadas con el Producto
• <11> Estándares de Referencia USP
Caracterización • <111> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas <11> Estándares de Referencia USP
• <111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas ! <121> Valoración de Insulina <111> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
T<208> Valoración de Actividad Anti-Factor Xa y :

i
• <621 > Cromatografía Anti~Factor <621 > Cromatografía
!la para Heparinas No Fraccionadas y de Bajo <726> Electroforesis
' <726> Electroforesis
Peso Molecular <736> Espectrometria de Masas
• <736> Espectrometria de Masas

9 <761 > Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <851 > Espectrofotometria y Dispersión de Luz
e <1030> Capítulos de Valoraciones Biologicas-
lnformac1ón General y Glosario
!
<761> Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <541 > Volumetría
<1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas··
• <621> Cromatografía
Consideraciones Generales
• <726> Electroforesis <1103> Melados de Pruebas Inmunológicas Ensayo por
' <736> Espectrometría de Masas !nmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)

+
• <1032>
<1033>
Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas
Validación de Valoraciones Biológicas
• <761> Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear •<1104> Métodos de Pruebas lnmunológicas-

i < i 034>
<1045>
Análisis de Valoraciones Biológicas
Artículos Obtenidos por B1otecnología
<1052> Articulas Obtenidos por Biotecnología-
• <781> Rotación Óptica
'<851> Espectrofotometría y Dispersión de Luz
• <1030> Capítulos de Valoraciones Biológicas
Información General y Glosario
~1761> lnd~~~~~~~~i~~~~~ía de
Magnética Nuclear

, Análisis de Aminoécidos Relacionadas con el Proceso

'<1032> Diseño y Desarrollo de Valoraciones
' < 1053> Electroforesis Capilar
1 Biológicas
• <1054> Artículos Obtenidos por B1otecnologia • <11> Estándares de Referencia USP
• <1033> Validación de Valoraciones Biológicas
lsoe!ectroenfoque • <61 > Examen Microbiológico de Productos No Esténles Pruebas de Recuento Microbiano
• < 1055> Artículos Obtenidos por Biotecnología • <1034> Análisis de Valoraciones Biológicas • <62> Examen Microbiológico de Productos No Estériles· Pruebas de MKroorgarnsmos
e <1045> Articules Obtenidos por Biotecnología
~~fc~~o~e~~~~\~~~
Especificas
• <1056> por Biotecno!ogia • <1052> Artículos Obtenidos por Biotecnologia- • <63> Pruebas de M1cop!asma
Electroforesis en Gel de Pohacnlamida Aná!is1s de Aminoácidos • <90> Suero Fetal Bovino - Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
• <1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología • <1053> Electroforesis Capilar • <111> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
Valoración de Proteínas Totales • <130> Atributos de Calídad de la Proteína A
• <1054> Artículos Obtenidos por Biotecnología
• <1084> Anál1s1s de G!icoproteínas y Glicanos • <231> Metales Pesados
lsoelectroenfoque
•
Cons1derac1ones Generales
<1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas
Consideraciones Generales
t <1055> Artículos Ob:enidos por Biotecnología,
Mapeo de Pept1dos
• <232> Impurezas Elementales Limites
• <233> Impurezas Elementales Procedimientos
• <467> Disolventes Residuales
• <1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por • <1056> Articulas Obtenidos por Biotecnología • <503> Ácido Acético en Péptidos
1
lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
Electroforesis en Gel de Poliacri!am1da 9 <541; Volumetria
• <1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología • <621 > Cromatografía
• < 1104> Métodos de Pruebas Inmunológicas Anál1s1s
Valoración de Proteínas Totales • <726> Electroforesis
por lnmunotransferenc1a
• <1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas • <730> Espectroquirnica de Plasma
• <1105> Métodos de Pruebas lnm,,nnlnrnce'
• <731> Pérdida por Secado
Resonancia de Plasmón i Consideraciones Generales
• <736> Espectrometría de Masas
• <1181> Microscopía Electrónica de • <1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas
Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a • <761> Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <1761> la Espectroscopia de Resonancia
Enzimas (EUSA) • <851> Espectrofotometría y Dispersión de Luz
Nuclear
• <921> Determinación de Agua
• <1105> Métodos de Pruebas Inmunológicas-
•<1024> Suero Bovino
Equipamiento Resonancia de Plasmón Superficial
•<1045> Artículos Obtenidos por B1otecnologia
• <1125> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos
<21> Termómetros •<1052> Artículos Obtenidos por 81otecnolog1a Anál1s1s de Aminoácidos
Generalidades
<31> Volumétricos •<1053> Electroforesis Capilar
e <1126> Técnicas Basadas en Ac1dos Nucleicos-
•<1054> Artículos Obtenidos por Biotecnología lsoelectroenfoque
• <41> yBalanzas
•<1251> Pesada en una Balanza Analítica •<1055> Artículos Obtenidos por Biotecnología--Mapeo de Péptidos
e<1056> Artículos Obtenidos por Biotecnología Electroforesis en Gel de Pohacnlam1da
Amplificación
Pruebas Misceláneas e<1057> Artículos Obtenidos por B1otecnolog1a~-Valorac1ón de Proteínas Totales
e <1129> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos •<1084> Anélisis de Glicoproteínas y Gllcanos-Considerac1ones Generales
Genotipificación
• <1> Inyectables •<1102> Metodos de Pruebas Inmunológicas Consideraciones Generales
• <660> Envases ,V1dno • <1761> Aplicaciones de la Espectroscopía de
•<1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por lnmunoadsorción
• <661> Envases Plast1cos Resonancia Magnetica Nuclear
Ligado a Enzimas (ELISA)
• <671> Envases Pruebas de Desempeño •<1104> Métodos de Pruebas Inmunológicas Anélisis por lnmunotransferenc1a
• <788> Part1culas en Inyectables <1113> Cara~tenzacrón, ldent1~icac1ón y Tipíficacrón de Cepas Microbianas
:
<1125> Técnicas Basadas en Ac1dos Nucleicos Generalidades
Descripción •<1126> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Extracción, Detección y Secuenc1ac1ón
•<1127> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Ampl1ficac1ón

•e•
•<1128> Técnicas Basadas en
•<1129> Técnicas Basadas en
<791> pH •<1130> Técnicas Basadas en
• < 1041 > Productos B1olog1cos de Ac1dos Nucleicos
e < 1121 > Nomenclatura •<1761> Aplicaciones de la
Ac1dos Nucleicos M1cromatrices
Ac1dos Nucleicos Genot1p1f1cac1on
Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas
ADN Residual)
de Resonancia Magnet1ca Nuclear
USP 37 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama 6 21

Diagrama 6. Vacunas

Caracterización
Descripción F1sicoquimica
• <111> Diseno y Anal1s1s de Valoraciones 81olog1cas
• <791>pH • <621 >Cromatografía
• <1041> Productos Biológicos • <621 >Cromatografía
• <726> Electroforesis
• <1121> Nomenclatura • <726> Electroforesis • < 136> Espectrometm1 de Masas
• <736> Espectrometria de Masas • <761> de Resonancia Magnet1ca Nuclear
Identificación •""-1030> 81ológ1cas
• <761> Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear

•
<621 > Cromatografía
<726> Electroforesis
• <786> Estimación de !a Distribución del Tamaño de
Partícula por Tamizado Analítico
•
:
<1032>
<1033>
• <736> de Masas • <791> pH •<1034> Anál1s1s cie Valoraciones 81ológ1cas
• <761> de Resonancia Magnet1ca Nuclear •<1045> Articulas Obtenidos
e <1030> Capítulos de Valoraciones B1olog1cas • <851> Espectrofotometria y D1spers1ón de Luz
•<1052> Artículos Obtenidos
lnformac1on General y Glosario • <1045> Artículos Obtenidos por Biotecnolog1a
• <1032'> Diseño y Desarrollo de Valoraciones 81olog1cas • <1052> Articulas Obtenidos por 81otecnología •<1053> Electrc>fonesis
• <- 1U3J~ \/a1idac1on dt: Va1o:ac1oncs B1ológ1cds An,Jl1'.>1s de Arn1nuác:dos •<105rl', Art1etlios
• <1034> Anál1s1s de Valoraciones B1ológ1cas • <1053> Electroforesis Captlar !soelectroenfoque
e <1045> Artículos Obtenidos por B1otecnología
e <1054> Artículos Obtenidos por 81otecnolog1a •<1055> Artículos Obtenidos por Biotecnología
• <1052:- Artículos Obtenidos por Biotecnología Análisis de Aminoácidos Mapeo de
/soelectroenfoque
•<::1056> Articulas B1otecnologia
• <1053> Electroforesis Capilar • <1055> Artículos Obtenidos por 81otecnologia- Electroforesis en Poliacnlamída
• <1054> Artículos Obtenidos por Biotecnologia !soelectroenfoque Mapeo de Péptidos •<1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología
• <1055> Articulas Obtenidos por B1otecnología Mapeo de Péptidos
~ < 1056> Artículos Obtenidos por Biotecnolog1a ' Valoración de Proteínas Totales
• <1056> Artículos Obtenidos por Biotecnología
Electroforesis en Gel de Poliacnlamida •<1084> Anál!s1s de Glícoproteínas y Glicanos
¡ Electroforesis en Gel de Pol1acnlamida
• <1057> Artículos Obtenidos por Biotecnologia Consideraciones Generales
•<1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología
¡ Valoración de Proteínas Totales •<1102> Métodos de Pruebas lnrnunológicas-
Valoración de Proteínas Totales
Considerac1ones Generales
•<1102> Métodos de Pruebas !nmunolc.gicas- Consideraciones Generales • <1065> Cromatografia lónica
+<1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por
•<1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por
' <1084> Análisis de Glicoproteínas y Gllcanos !nrnunoadsorc1ón Ligado a Enzimas (ELISA)
lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
Consideraciones Generales •<1104> Métodos de Pruebas Inmunológicas Análisis por
•<1104> Métodos de Pruebas Inmunológicas -Anáhs1s por
!nmunotransferencia • <1238> Vacunas para Uso Humano Vacunas ; lnrnunotransferencia
• <1126> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Extracción,
' Detección y Secuenciación
Bacterianas
r<1105> ~~~~~~~~= ~~u~~~~12~~~~~~~1:r-
1<1127> T~cnicas Basadas en Ac~dos Nucleicos-Ar:iplificación •<1126> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos -Extracción,
:
Equipamiento : Detección y Secuencra_c1ón
<1128> Tecnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-M1cromatrices •<í 127> Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-Ampl1ficac1ón
•<1129> Técnicas Basadas en Ácidos Nucle1cos-Genotipificac1ón • <21 > Termómetros +<1235> Vacunas para Uso Humano Consideraciones
e<1235> Vacunas para Uso Humano Consideraciones Generales 1 Generales
• <31 >Aparatos Volumétricos
• <1238> Vacunas para Uso Humano- Vacunas Bacterianas •<1238> Vacunas para Uso Humano-Vacunas Bacterianas
• <41 > Pesas y Balanzas •<1761> Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia
•<1761> Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia
• <1251> Pesada en una Balanza Analítica Magnética Nuclear
Magnética Nuclear

Seguridad Valoración

i <111> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas

l
<11> Estándares de Referencia USP
Pruebas Misceláneas <621 > Cromatografía
<63> Pruebas de Micoplasma
<71> Pruebas de Esterilidad
<1 > Inyectables
• :;;~: ~~ep~~~:~~=~~ia de Masas
<85> Pruebas de Endotoxmas Bacterianas • <761 > Espectroscopia de Resonan~ia Magnética Nuclear

<88> Pruebas de Rea~t.1vidad Biológica, In.Vivo

• <660> Envases ··Vidrio
f <851 > Espectrofotometria y Dispersión de Luz

¡
• <661 > Envases-Plásticos <1030> Capítulos de Valoraciones Bíológ1cas-
<90> Suero Fetal Bovino- Atributos de Calidad y
lnformac1ón General y Glosario
Pruebas de Funcionalidad • <671> Envases-Pruebas de Desempeño <1032> Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas
<151> Prueba de Pirógenos • <788> Partículas en Inyectables • <1033> Validación de Valoraciones Bio!ógícas

i
<341> Agentes Antimicrob1anos-Contenido • <1660> Envases de Vidrío Evaluación de la Durabilidad • <1034> Anál1s1s de Valoraciones Biológicas
<1024> Suero Bovino de la Superficie Interna <1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología
<1113> Caracteri~ac1ón_ Identificación y Tipificación de
< 1052> ~~!~i~~~sd~~~~~~sc~~sBiotecnología
+ Cepas Microbianas
<1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de

i Artículos Farmacope1cos
<1229> Esterilización de Artículos F~rmacopeicos
<1237> Métodos de Pruebas Virológ1cas
r
<1053>
'<1054>

+ <1055>
Electroforesis Capilar
Artículos Obtenidos por Biotecnología-
lsoelectroenfoque
Artículos Obtenidos por Biotecnología
1 Mapeo de Péptídos
Impurezas t.<1056> Articulos Obtenidos por Biotecnologia-
Electrofores1s en Gel de Poliacrilamida
• <1057> Articulas Obtenidos por Biotecnología
Relacionadas con el Producto Valoración de Proteínas Totales
Relacionadas con el Proceso • <1105> Metodos de Pruebas Inmunológicas
• <111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas Resonancia de Plasmón Superficial

t 1
<81> Ant1b1óticos Valoraciones Microbiológicas
<90> Suero Fetal ~o~ino Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
•
;
•
<621 > Cromatografía
< 726 > Electroforesis
< 736 > Espectrometría de Masas
• <1235> Vacunas para Uso Humano
Consideraciones Generales
•<1237> Métodos de Pruebas

i <111> Diseño y Anahs1s de Valoraciones Biológicas <761 > Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear •<1238> Vacunas para Uso HmnRno~ v'RnmR<
Bacterianas
<621 > Cromatografía <1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas Consideraciones
<726> Electroforesis Generales • <1761> Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia
<731> Pérdida por Secado • <1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por Magnetica Nuclear
• <736> Espectrometría de Masas ; lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA)
, <761> Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear • <1104> Métodos de Pruebas tnmunológJCas Análisis por lnmunotransferenc1a
; <921> Determinación de Agua • <1235> Vacunas para Uso Humano Consideraciones
<1024> Suero Bovmo Generales
• <1045> Artículos Obtenidos por 81otecnología • <1237> Métodos de Pruebas V1rológicas
• <1052> Artículos Obtenidos por 81otecnología--Anál1s1s de Aminoácidos <1238> Vacunas para Uso Humano- Vacunas Bacterianas
:
• <1053> Electroforesis Capilar <1761> Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <1054> Artículos Obtenidos por B1otecnolog1a- lsoelectroenfoque
• <1055> Artículos Obtenidos por Biotecnología Mapeo de Pépt1dos
• <1056> Articulos Obtenidos por 81otecnología- Electroforesis en Gel de Pollacrilamida
•<1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología Valoración de Proteínas Totales
•<1084> Anál1s1s de Glicoproteinas y Glicanos--Consideraciones Generales
•<1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas Cons1derac1ones Generales
•<1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas Ensayo por lnmunoadsorc1ón Ligado a Enzimas {ELISA)
• <1104> Métodos de Pruebas lnmunoiógicas Anál1s1s por lnmunotransferenc1a
•<1126> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Extracción. Detección y Secuenc1ac1ón
•<1127> Técnicas Basadas en Ácidos Nucle1cos-Ampllficación
•<1130> Técnicas Basadas en Ac1dos Nucleicos Enfoques para Detectar Trazas de Actdos Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
<1237> Métodos de Pruebas V!íológ1cas
:
< 1238> Uso Humano Vacunas Bacterianas
•<1761> la Especlroscopi;:i de Resonancia Magnética Nuclear
22 Diagrama 7 / Guía de los Capítulos Generales
---j Descripción 1 H
• <631> Color y Acromatismo
•• <695> Cnstalin1dad
<791 > pH
•
<1041 > Productos Biológícos
• < 1121 > Nomenclatura
H ~---~
Pruebas Misceláneas 1 • <111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
•
•
<1> Inyectables
<660> Envases V1dno
• <661 > Envases Plásticos
• <671 > Envases-Pruebas de Desempeño
• <788> Partículas en Inyectables
• <1660> Envases de Vidno Evaluación de la
Ourab1hdad de !a Superficie Interna
_J Identificación 1 <1054> Artículos Obten~dos por B~otecnologia lsoelectroenfoque
''----,--------'
+<11> Estándares de Referencia USP
• <191 > Identificación-Pruebas Generales
~<197> Pruebas de Identificación Espectrofotométrica
.<621> Cromatografía
+ <726> Electroforesis
•<736> Espectrometría de Masas
+<761> Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
9<851 > Espectrofotometria y Dispersión de Luz
+ <1030> Capítulos de Valoraciones Biológícas-
1 Información General y Glosaría
• <1032> Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas
t <1033> Vali~a~ión de Valor.ac1one~ Biol.ógicas
• <1034> Análls1s de Valoraciones B1ológ1cas
• <1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología
• <1052> Artículos Obtenidos por Biotecnología
1 Análisis de Aminoácidos
~ <1053> Electroforesis Capilar
+ 1-------~
I
<1054> Artículos Obtenidos por B1otecnologia-
lsoelectroenfoque
• <1055> Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Mapeo de Péptidos
• <1056> Artículos Obtenidos por Biotecnología-
, Electroforesis en Gel de Poliacrilamlda
• <1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Valoración de Proteínas Totales
• <1065> Cromatografía lóníca
• <1102> Métodos de Pruebas lnmunológ1cas-
Cons1deraciones Generales
• <1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas ·Ensayo por
lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (EUSA)
• <1104> Métodos de Pruebas !nmunologicas-Ana!isis
por fnmunotransferenc1a
• <1761> Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia
Magnética Nuclear
USP 37
Diagrama 7. Sangre y Hemoderivados
Equipamiento 1 H'r-___F_is_ic_o_q_u_ím_ic_a___~I
~---
e
<21 > Termómetros
e
•, <11> Estándares de Referencia USP
• <621> Cromatografía
•
<31 >Aparatos Volumetncos
<41 > Pesas y Balanzas : :;;~: ~~epc~~~;~~=:~ia
de Masas
j
9<1251> Pesada en una Balanza Ana!it1ca • <761> Espectroscopia de Resonancia Magnétrca Nuclear
<785> Osmolalldad y Osmolandad
<791>pH
<851 > Espectrofotometria y Dispersión de Luz
1 Caracterización 1 <1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología
'~--- <1052> Articulas Obtenidos por B1otecnologia · Anáhs1s
• ""621 > C'ronvitowafía
'
t "'- de Amino8cidos
1053> Electroforesis Capilar
•<726> Electroforesis
•
•
<736> Espectrometria de Masas
<761> Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <1054> Artículos Obtenidos por B1otecnologia !soe!ectroenfoque
f <1055> Articulas Obtenidos por Biotecnología· Mapeo de
•<851> Espectrofotometría y Dispersión de Luz
Pépt1dos
•<1030> Capítulos de Valoraciones B1o!óg1cas-
• <1056> Artículos Obtenidos por 81otecnologia Electroforesis
lnformac1ón General y Glosario
1 en Gel de Poliacn!amida
• <1032> Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas
• <1057> Artículos Obtenidos por B1otecnología Valoración de
• <1033> Val1dac1ón de Valoraciones Biológicas
Proteínas Totales
• <1034> An81isis de Valoraciones Biológicas
• <.1761:::- Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <1045> Artículos Obtenídos por Biotecnología
• <1052> Articulas Obtenidos por Biotecnología~Análisis de Aminoácidos
• <1053> Electroforesis Capilar
: <1055> Articulos Obte111dos por 81otecnología Mapeo de Péptidos Seguridad 1
<1056> Artículos Obtenidos por B1otecnología~
+ <11 > Estándares de Referencia USP
:
+ Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
<1057> Articu!os Obtenidos por Biotecnología-
Valoración de Proteínas Totales
• <1102> Métodos de Pruebas lnmunológicas-
•
~
<51 >Pruebas de Eficacia Antimicrobiana
<61 > Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas
de Recuento Microbiano
1
T
Consideraciones Generales
<1103"'" Métodos de P~uebas Inmunológicas-Ensayo por
lnmunoadsorc1ón Ligado a Enzimas (EUSA)
e <1104> Métodos de Pruebas Inmunológicas-Análisis
••
+
<62> Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas
de Microorgarnsmos Especificas
<71 > Pruebas de Esterilidad
<85> Pruebas de Endotoxinas Bacterianas
i
, por lnmunotransferencia
• <1105> Métodos de Pruebas lnmunológ1cas- <87> Pruebas de Reactív:dad B'.ológica, In Vitro
t
Resonancia de Plasmón Superficial
<88> Pruebas de Reactivrdad Biológica. In Vivo
<1125> Técn.ica~ Basadas en Ácidos Nuclei.co.s·
Generalidades < 151 > Pruebas de P1rógenos
< 1130> T écmcas Basadas en Áctdos Nucleicos • <341 > Agentes Antim1crobianos-Contenido
Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos
f<1035> Indicadores Biológicos para Esterilización
' Nucleicos (Análisis de ADN Residual)
•<1761 >Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia f<1111 > Examen Microbiológico de Productos No Estériles:
' Cntenos de Aceptación para Preparaciones Farmaceútícas
Magnética Nuclear
, y Sustancias de Uso Farmacéutico
LJ Valoración 1 •<1113> Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas
•
•
•
<11> Estándares de Referencia USP
<111> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
<208> Valoración de Actividad Anti-Factor Xa y Anti-Factor
t ' Microbianas
<1116> Contra! Microbiológico y Monítoreo de Ambientes de
Procesamiento Aséptico
t<1180> Plasma Humano
lla para Heparinas No Fraccionadas y de Bajo •<1211 > Esterilización y Garantía de Esterilidad de
Peso Molecular 1 Artículos Farmacopeicos
• <621> Cromatografía
• <726> Electroforesis
• <736> Espectrometria de Masas
! <1229> Estenlización de Artículos Farmacopeicos
<1237> Metodos de Pruebas Virológicas
• <761> Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
• <851> Espectrofotometría y Dispersión de Luz
~<1030:::- Capítulos de Valoraciones Biológicas _J Impurezas
···1~-~-~
1
Información Genera! y Glosaría
• <1032> Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas
•<1033> Validación de Valoraciones Biológicas
1 Relacionadas con el Producto 1
•<1034> Análisis de Valoraciones Biológicas
•<1045:::- Artículos Obtenidos por Biotecnología
•<1052> Artículos Obtenidos por Biotecnología- • <11> Estándares de Referencia USP
t <111> Diseño~ Anáhsis ~e
i
Análisis de Aminoácidos
•<1053> Electroforesís Capilar 1 1 Valoracmnes.B1olog1cas
•<1054> Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Relacionadas con el Proceso <621 > Cromatografía
<?26> Electroforesis
lsoelectroenfoque '--------------~ <736> Espectrometna de Masas
•<1055> Artículos Obtenidos por B1otecno!ogía- • <11> Estándares de Referencia USP • <761> Espectroscopia de Resonancia
Mapeo de Péptidos • <111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Magnética Nuclear
•<1056> Artículos Obtenidos por Biotecnología~ ! Biológicas .<1102> Métodos de Pruebas lnmunológicas-
E!ectrofores1s en Gel de Pol1acrilamida 9 <621> Cromatografía Consideraciones Generales
f<1057> Articulas Obtenidos por Biotecnología- : <726> El~c'.roforesis • <1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Valoración de Proteínas Totales <731> Perdida por Secado Ensayo por !nmunoadsorción Ligado
•<1105> Métodos de Pruebas Inmunológicas- <736> Espectrometria de Masas a Enzimas (ELISA)
Resonancia de Plasmón Superficial ~ <761> Espect~oscopía de Resonancia e<11Q4:::- Métodos de Pruebas lnmunológicas-
•<1761> Aplicaciones de la Espectroscopia de , Magnética Nude~r . . An81isis por lnmunotransferenc1a
Resonancia Magnética Nuclear • <851> Espectrofot?metna y D1spers1on de Luz •<1761> Aplicaciones de la Espectroscopía
• <921> Determinación de Agua de Resonancia Magnética Nuclear
•<1045> Artículos Obtenidos por 81otecnología
• <1052> Artículos Obtemdos por Biotecnología,
Análísís de Aminoácidos
• <1053> Electroforesis Capilar
•<1054> Artículos Obtenidos por Biotecnologia !soelectroenfoque
•<1055> Articulas Obtenidos por Biotecnologia Mapeo de Péptldos
•<1056> Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electrofores1s en Gel de Pohacnlam1da
•<1057> Artículos Obtenidos por B1otecnologia Valoración de Proteinas Totales
•<1102> Métodos de Pruebas !nmunolog1cas-Cons1deraciones Generales
•<1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas-Ensayo por !nmunoadsorc1ón Ligado a
Enzimas {ELISA)
•<1104> Métodos de Pruebas lnmunolog1cas-Anáhs1s
1 por !nmunotransferenc1a
•<1761> Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
USP 37 Guía de los Capítulos Generales /Diagrama 8 23

Diagrama 8. Productos de Terapia Génica y Celular

Pruebas Universales Pruebas Especificas

Identificación Funcionalidad

• <11> Estándares de Referencia USP • <881> Res1stem1.J 3 '8 TPn:-;1t1'1

• <1030> Capitulas de Va1orac1ones 81ológ1cas Información
Genernl y Glosario Agua
e <1032> D1serio y Desarrollo de Valoraciones B1olog1cas
• <1033> Validación de Valoraciones B1ológ1cas
•<1231.,.1\gua p;Fa Liso Farmacéutico
• <1034> Anal1s1s de Va1orac1ones B1olog1ca:o
e <1102> :\1étodos rle Pruebcis lnmunol0qwns Ccir1siderac1ones

• <1103> Metodos de Pruebas lnmun0loq1r:;::is por

lnmunu'1dsorc1ón Ligado a Ennrnas
• <1104> Metodos de Pruebas lnmunolog1cas
1nrnunotransferenc1a
• <87-~ f)r,1E-·!1dc: di=; f~f-)8di'Jlt~<'ld B1olu1j:cn 1··1 V1\rn
por • <f38:- Pr1JCdJd~", dE l\P.c1Ct1v1dad ¡~1ulog1ca In Vivo
•<1ín1 H1nr:nmn,Jt1h1i1rLcirl rlP l•l<; M:1tp11rliPs lJs;irlos pn Fr1VdSPS dP.
Medicamentos. D1spos1t1vo~ Med1cos P. Implantes
•<í 134-~ Pruebas de Seris1bilizac1ón

Cuestiones Microbiológicas y de Esterilidad

Valoración • <61> Examer Microb1ológ1co de Productos No Estériles Pruebas de
1 Recuento Microbiano

•'•
• <621> Cromatograf1a
e <726> Llectrofores1s <63> Pruebas
• <1030> Capítulos de Valoracíones Bíológícas-lnformacrón General y Glosario
• <85> Prueba de Endotoxinas Bacterianas
• <1032> Diseño y Desarrollo de Va!orac1ones Biológicas
' <151> Prueba de Pirógenos
•
•
<1033> Validación de Valoraciones Biológicas
<1034> Análisis de Valoraciones Biológicas
+ <161> Equipos para Transfusión e Infusión y D1spos1t1vos Médicos S1m1lares
•<1050> Evaluación de la Viral en Productos Biotecnológicos
t <1102> Métodos de Pruebas Inmunológicas Consideraciones Generales Obtenidos de lineas de Ongen Humano o Animal
•<1113> Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
• <1103> Métodos de Pruebas Inmunológicas ~Ensayo por
lnmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) •<1416> Control M1crob1olóa1co y Monitoreo de Ambientes de
Procesamiento
e<1208> Pruebas de Esterilidad ,Val1dac1ón de Sistemas Aisladores
e <1211 > Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacope1cos
+<1227> Validación de Recuperación Microbiana en Articulas Farmacopeicos
•<1229> Estenll78CÍón de Artículos Farmacope1cos
•<1229 3-:. Monitoreo de la Biocarga
Cuestiones de
Producción Equipamiento

:•
Caracterización
<1> Inyectables
e <21 > Termómetros • de Valoraciones Biológicas
<90> Suero Fetal Bovino Atributos de Calidad y Pruebas
de Func1onal1dad
• <3 í > Aparatos Volumétricos
•<41> Pesas Balanzas
e<1051> de Material de Vidrio
•
• <726> Electroforesis
<92::- Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la • <785> Osrnolalidad y Osmolandad
Fabricación de Terapia Celular •<1251> Pesada en una Balanza Analítica • <788> Particulas en Inyectables
' <797::- Preparación Magistral - Preparaciones Estériles e <791> pH

•
e
<1024> Suero Bovino
• <905> Urnform1dad de Urnd8des de Dos1ficac1ón
• <911> V1scos1dad-Métodos del Viscos1rnetro Capilar

•
<1041 > Productos Biológicos • <912> Métodos del Reómetro Rotatorio
<1043> Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Genicos y de Ingeniería Tisular • <913> Métodos del Viscosímetro de Bola Rodante

i
•<1027> Citometría de Flujo
<1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología
•<1030> Capítulos de Valoración Biolog1ca Información General y Glosario
<1046> Productos de Terapia Génica y Celular
• <1032> Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas
• <1047> Productos de Terapia Génica • <1033> Validación de Valoraciones 81ológ1cas
e <1074> Guias para la Evaluación de la Seguridad Biológica de los Excipientes • <1034> Análisis de Valoraciones
•<1046> Productos de
e <1126> Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos Extracción, Detección y Secuenciación •<1048> Calidad de Anal1s1s de !a Construcción
Expresable en Células Usadas para la Producción de Productos
Prote1nicos Obte1lidos con ADN Recombinante
• <1127> Técnicas B;:isadas en Acidos Nucleicos Ampllficac1ón
•<1049> Calidad de Productos Pruebas de Estabilidad de
• <1237> Métodos de Pruebas V1rológtcas Productos B1otecnológ1cos o

•<
•<1052> Articulas Obtenidos por B1otecnología··Anál1s1s de Aminoácidos
1053>
•<1054>
Electroforesis
Artículos por Brotecrrolo,qía lsoEolectroE,nfoque
•<1055> Artkulos Obten:dos por Mapeo de
•<1056> A1iiculos Obtenidos por Electroforesis en Gel de

por Biotecnología -Valoración de Proteínas

Cuestiones del Producto Totales
e <381> Tapones Elastoméricos rara Inyectables •<1084> Anal1s1s de Glícoproteínas y Glicanos Consideraciones Generales
•<1102> Métodos de Pruebas lnrnunológ1cas Cons1derac1ones
•' <1046> Productos de Terapia Genica y Celular Generales
•<1103> Métodos de Pruebas l11rnuno!og1cas por
e <1086> Impurezas en Farmacos y Productos Farmaceut1cos
lnm11noadsorc1on Ltgado a Enzimas
• <1 i21> Nomenclatura •<1104> Métodos de Pruebas !nmunologrcas Anal1s1s por
1nmunotransferenc1a
• <1151> Formas Farmacéuticas
e<1126> Tecn1cas Basadas en Ac1dos Nucleicos E:xtracc1on, Detecc1on
Secuenc1nc1on
•<1127> 6"1sndas en AC1Cin:, Nucleicos Ampltf1cac1on
e<1í28> Tec•11cas Basadils er1 Audos Nucleicos M1cromatnces
e<1129> Tecrncas 8.--Jsadas Audos Nucle1cos-Genot1p1f1cación
e<1130"' Tecr1cas Basadas en Ácidos Nucleicos Enfoques para Detectar Trazas
Je ADN Res1duai)
e< 1237>
24 Diagrama 9 / Guía de los Capítulos Generales
Diagrama 9. Distribución de Medicamentos
Transportista
<1079> Buenas Prácticas de Almacenamiento
y Distribución para Medicamentos
<1118> Dispositivos de Monitoreo-Tiempo,
I Temperatura y Humedad
• <1177> Buenas Prácticas de Envasado
Reenvasador
<87> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
<88> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
<659> Requisitos de Envases y Almacenamiento
<660> Envases-Vidrio
<661 > Envases-Plásticos
<671 > Envases-Pruebas de Desempeño
<698> Volumen de Entrega
<735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
<755> Llenado Mínimo
<1066> Ambientes Físicos que Promueven el Uso
Seguro de los Medicamentos
<1079> Buenas Prácticas de Almacenamiento
y Distribución para Medicamentos
<1118> Dispositivos de Monitoreo-Tiempo,
Temperatura y Humedad
<1136> Envasado y Reenvasado Envases Unitarios
<1177> Buenas Prácticas de Envasado
<1178> Buenas Prácticas de Reenvasado
<1660> Envases de Vidrio Evaluación de la Durabilidad
de la Superficie Interna
• Educación
USP 37
Fabricante
t <87> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
• <88> Pruebas de React1vidad Biológ1ca, In Vivo
• <381> Tapones Elastoméricos para Inyectables
<659> Requisitos de Envases y Almacenamiento
<660> Envases-Vidrio
f <661> Envases-Plásticos
<670> Envases Componentes Auxiliares
•• <671 > Envases Pruebas de Desempeño
<698> Volumen de Entrega
:f
<735> Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
<755> Llenado Minimo
<1079> Buenas Prácticas de Almacenamiento y Distribución para Medicamentos
<1118> Dispositivos de Monitoreo-Tiempo, Temperatura y Humed;:id
<1136> Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios
1
<1177> Buenas Prácticas de Envasado
<1191 > Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación
<1660> Envases de Vidrio-Evaluación de la Durabilidad
de la Superficie Interna
Mayorista Distribución de Muestras
<1079> Buenas Prácticas de Almacenamiento • <1079> Buenas Prácticas de Almacenamiento
y Distribución para Medicamentos 1 y Distribución para Medicamentos
<1118> Dispositivos de Monitoreo-Tiempo, • <1118> Dispositivos de Monitoreo-Tiempo, Temperatura
Temperatura y Humedad y Humedad
< 1177> Buenas Prácticas de Envasado + <1151> Formas Farmacéuticas
~ <1177> Buenas Prácticas de Envasado
Farmacia Médico
<17> Etiquetado de Envases para Venta bajo Receta
Médica • <1066> Ambientes Físicos que Promueven el Uso Seguro
de los Medicamentos
<87> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
<88> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo e <1191> deConsideraciones
Dispensación
sobre Estabilidad en la Práctica
<381> Tapones Elastoméricos para Inyectables
<659> Requisitos de Envases y Almacenamiento
<660> Envases-Vidrio
<661 > Envases-Plásticos
<671 > Envases-Pruebas de Desempeño
<1066> Ambientes Físicos que Promueven el Uso Seguro de los Medicamentos
<1079> Buenas Prácticas de Almacenamiento y Distribución para Medicamentos
<1118> Dispositivos de Monitoreo -Tiempo, Temperatura y Humedad
<1136> Envasado y Reenvasado--Envases Unitarios
<1177> Buenas Practicas de Envasado
<1191> Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación
<1265> Información Escrita de los Medicamentos Recetados-Guias
<1660> Envases de Vidrio- Evaluación de la Durabilidad
de la Superficie Interna
Paciente
USP 37 Guía de los Capítulos Generales / Diagrama 1O 25

Diagrama 1O. Microbiología

Productos No Estériles Productos Estériles

Recuento Microbiano Limites de Endotoxinas

, <61> Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano ~ <85> Prueba de Endotoxinas Bactenanas

<610> Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos para Productos Nasales

f e Inhaladores No Estériles
<1111 >Examen Microbiológico de Productos No Est~ri!es: Criterios de Aceptación 1
Pruebas de Esterilidad
' <71 > Pruebas de Esterilidad
1 para Preparaciones Farmaceúticas y Sustancias de Uso Farmacéutíco
•<111:1> (":¡:¡rnctenzac1ón Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
'<2021> Pruebas de Recuento M1crob1ano Suplementos Nutnc1ona1es y Dietéticos
•<2023> Atributos Microbio!ógicos de los Suplementos Nutricionales y Oietéticos No Estériles •<1208> Pruebas de Esteriliciad Validación de Sistemas Aisladores

Ausencia de Micoplasma
Microorganismos Objetables
• <63> Pruebas para Micoplasmas
<62> Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de e<1113> Caracterización, Identificación y Tipificacíón de Cepas Microbianas
Microorganismos Específicos
<63> Pruebas para Micoplasmas
<610> Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos para Productos Nasales
e Inhaladores No Estériles Procesamiento Aséptico
<1111> Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación
para Preparaciones Farmaceútícas y Sustancias de Uso Farmacéutico
<1113> Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas <1113> Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Mícrobianas
<2022> Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la Ausencia de Microorganismos <1116> Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de
Especificos--Suplementos Nutricionales y Dietéticos Procesamiento Aséptico
<1208> Pruebas de Esterilidad Validación de Sistemas Aisladores
<1211 > Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
Esterilización Final <1229> Esterilización de Artículos Farmacopeicos
<1222> Productos Farmacéutícos con Esterilización Terminal····Liberación Paramétrica <1229.3> Monitoreo de la Biocarga
<1229> Esterilización de Artículos Farmacopeicos

Calor Húmedo
Filtración
, <55> Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia
:
. <1035> Indicadores Biológicos para Esterilización
• <1209> Esterilización--lndicadores e Integradores Químicos y Fisicoquimicos < 1211 > Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
• <1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Fannacopeicos <1229> Esterilízación de Artículos Farmacopeicos
• <1229> Esterilización de Artículos Farmacopeicos <1229.3> Monitoreo de la Biocarga
• <1229.1> Esterilización con Vapor por Contacto Directo
• <1229.2> Esterilización con Calor Húmedo de Líquidos Acuosos
• <1229.3> Monitoreo de la Biocarga

Montaje
Calor Seco <1116> Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de
Procesamiento Aséptico
• <55> Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia
<1207> Envasado de Productos Estériles -Evaluación de Integridad
9<1035> Indicadores Biológicos para Esterilización
<1229> Esterilización de Artículos Farmacopeicos
e<1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Fannacopeicos
•<1229> Esterilización de Artículos Fannacopeicos
BFS
e <1116> Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de
Radiación Procesamiento Aséptico

t <55> Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia FFS

+<1035> Indicadores Biológicos para Esterilización
• <1116> Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de
e<1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
Procesamiento Aséptico
•<1229> Esterilización de Artículos Farmacopeicos
9<1229.3> Monitoreo de la Biocarga
SFS
Óxido de Etileno
• <1116> Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de
Procesamiento Aséptico
• <55> Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia
9 <1035> Indicadores Biológicos para Esterilización
Otros
• <1209> Esterilización-Indicadores e Integradores Químicos y Fisicoquímicos
• <1211 > Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos 9 <1072> Desinfectantes y Antisépticos
• <1229> Esterilización de Artículos Farmacopeicos • <1112> Determinación de Actividad de Agua en Productos
Farmacéuticos No Estériles
• <1116> Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de
Procesamiento Aséptico

• <1117> Óptimas Prácticas de Laboratorio Microb1o!ógico

• <1223> Validación de Métodos Microbiológicos Alternativos
26 Diagrama 11 / Guía de los Capítulos Generales USP 37

Diagrama 11. Ingredientes de Suplementos Dietéticos

Botánicos No Botánicos

Descripción Complejos
<561> Artículos de Origen Botánico Ver Sustancias Obtenidas por Biotecnología
+ <563> Identificación de Artículos de Origen Botánico (Diagrama 2).
' <565> Extractos Botánicos
• <776> Microscopia Óptica No Complejos
9 <1181> Microscopia Etectrónica de Barrido
Identificación Minerales

I
• <197> Pruebas de Identificación Espectrofotométrica • Ver Fármacos Activos No Complejos
• <201 > Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada (Diagrama 1).
<561> Artículos de Origen Botánico
<563> Identificación de Artículos de Origen Botánico Aminoácidos
<621> Cromatografía
<735> Espectrometría de F!uorescencia de Rayos X Ver Fármacos Activos No Complejos
<776> Microscopia Óptica (Diagrama 1).
<1181 > Microscopia Electrónica de Barrido
Metabolitos
Contenido
Ver Fármacos Activos No Complejos
(Diagrama 1).
<541 > Volumetría
<561 >Artículos de Origen Botánico Vitaminas
<621 >Cromatografía
<851> Espectrofotometría y Dispersión de Luz
Valoración
Seguridad/Pureza <91 > Valoración de Pantotenato de Calcio

• <211> Arsénico <171> Valoración de Actividad de Vitamina 812

'j
<231 > Metales Pesados <411 > Valoración de Ácido Fólico
<251> Plomo <441 > Valoración de Niacina o Niacinamida
<261 > Mercurio <531 >Valoración de Tiamina
<281 > Residuo de Incineración
<551> Valoración de Alfa Tocoferol
<451> Volumetria con Nitrito
<571> Valoración de Vitamina A
• <561> Artículos de Origen Botánico
<581> Valoración de Vitamina D
• <565> Extractos Botánicos
<591> Determinación de Cinc
• <611 > Determinación de Alcohol
<735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
• <730> Espectroquímica de Plasma
J. <735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
+ <1113> Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas Ver Fármacos Activos No Complejos
• <2021> Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutrícionales y Dietéticos (Diagrama 1).
• <2022> Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la Ausencia de Microorganismos
· Específicos - Suplementos Nutricionales y Dietéticos
• <2023> Atributos Microbiológicos de los Suplementos Nutricionales y Dietéticos No Estériles
t <2232> Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos

Caracterización Fisicoquímica

<401> Grasas y Aceites Fijos

<561> Artículos de Origen Botánico
<621 >Cromatografía
<735> Espectrometna de Fluorescencia de Rayos X

1
<736> Espectrometría de Masas
<761> Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
<851 > Espectrofotometna y D1spers1ón de Luz
<1065> Cromatograf1a lónica
<1761 > Aplicaciones de la Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

Otros

• <2030> Información Complementaria para Artículos de Origen Botánico

USP 37 Guía de los Capítulos Generales /Diagrama 12 27

Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietéticos

Pruebas Universales Pruebas Específicas

Descripción Equipamiento
• <1151> Formas Farmacéuticas
• <21> Termómetros
Identificación • <31 >Aparatos Volumétricos
• <41 > Pesas y Balanzas
<191> Identificación Pruebas Generales
~ <197> Pruebas de Identificación Espectrofotométrica • <1051> Umpieza de Material de Vidrio
+ <201> Prueba de Identificación por Cromatografla en Capa Delgada • <1251> Pesada en una Balanza Analítica
! <563> Identificación de Articulas de Origen Botánico • <2750> Prácticas de Fabricación para Suplementos Dietéticos
<621 > Cromatografía

f
<735> Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
Pruebas de Desempeño
<736> Espectrometna de Masas
<776> M1croscop1a Óptica ¡ <1216> Friabilidad de las Tabletas

!
<851 > Espectrofo1ometroa y Dispersión de Luz
<1065> Cromatografía lómca <2040> Desintegración y Disolución de Suplementos Dietéticos

<2091 >Variación de Peso de Suplementos Dietéticos

Valoración/Contenido <2750> Prácticas de Fabricación para Suplementos Dietéticos

<91 > Valoración de Pantotenato de Calcio

<171> Valoración de Actividad de Vitamina B,, Seguridad/Pureza
<411> Valoración de Ácido Fálico
• <211 > Arsénico
<441> Valoración de Niacina o Niacinamida
'. <231> Metales Pesados
<531 > Valoración de Ti amina •' <251 > Plomo

i
<541> Volumetrfa <261> Mercurio

<551> Valoración de Alfa Tocoferol <451> Volumetria con Nitrito

<561> Artículos de Origen Botánico
<561> Artículos de Origen Botánico
.¡ <565> Extractos Botánicos
<571> Valoración de Vitamina A
<730> Espectroquimica de Plasma
<581> Valoración de Vitamina D
<621> Cromatografía
<730> Espectroquímica de Plasma
<735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
¡ <735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
<1113> Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas
Microbianas
<2021 > Pruebas de Recuento Microbiano····Suplementos
i Nutricionales y Dietéticos
<851> Espectrofotometria y Dispersión de Luz

Impurezas
t1
<2022> Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la
Ausencia de Microorganismos Especificas-Suplementos
Nutricionales y Dietéticos

t <2023> Atributos Microbiológicos de los Suplementos Nutricionales

Orgánicas

<466> Impurezas Comunes

¡ y Dietéticos No Estériles
<2030> Información Complementaria para Artículos de
Origen Botánico
<2232> Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos

j
<621 > Cromatografía • <2750> Prácticas de Fabricación para Suplementos Dietéticos
<781 > Rotación Óptica

<801> Polarografia

1
<851 > Espectrofotometria y Dispersión de Luz
• <1086> Impurezas en Fármacos y Productos
Farmacéuticos

Inorgánicas

<281> Residuo de Incineración

<730> Espectroquimica de Plasma
<733> Pérdida por Incineración
• <735> Espectrometria de Fluorescencia de Rayos X
e <2232> Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos

Disolventes Residuales

• <467> Disolventes Residuales

• <621 > Cromatografia
 1

28 Diagrama 1 3 / Guía de los Capítulos Generales USP 37

Diagrama 13. Preparación Magistral

Global Caracterización Equipamiento

Fisicoquímica
• <795> Preparación Magistral Preparaciones No Estériles
1
• <21> Termómetros
• <7g7> Preparación Magistral Preparaciones Estériles ' <11> Estándares de Referencia USP
• <31> Aparatos Volumetncos
• • <621> Cromatograf1a

e
Estudios
<1160> Cálculos Farn1acéut1cos en la Preparación Magistral
•
•
<726> Electroforesis
<736> Espectrometría de Masas
•
•

•
<41 :> Pesas y Balanzas
<197> Pruebas de Identificación Espectrofotom8trica

<621> Cromatografia
de Prescnpc1ones • "'- 761 > Esriectrr1sroria de Res0n;,n11a \~agri4t1ra
• ,_.1 ín'.l> Gar<'mtH de Calidad en In Preparación Magistral Nuclear e <726:> Electroforesis
• <1231> Agua para Usn Farmacéut1co • <786> Est1mac1ón de la D1stribuc1on del Tamaño de
t <730:> Espedroquímica de Plasma
Part1cula por Tamizado Analítico
9 <1265> lnformac1on Escrita de los Medicamentos Recetados Guias e <736> Espectrometría de Masas
' <831> Índice de Refracción
• <761:> Espectroscopia de Resonancia Magnética
Descripcíón +
~
<851> Espectrofotometria y Dispersión de Luz

<1761 > Apl1cac1ones de la Espectroscopía de

•
Nuclear
<851> Espectrofo!ometría y Dispersión de Luz

• <1121> Nomenclatura Resonancia Magnética Nuclear f <1015> Aparatos Automatizados de Síntesis

Radioquímica
• <1045> Artículos Obterndos por Biotecnología
Seguridad
Identificación • <1052> Articulas Obtenidos por Biotecnología--
• <11 > Estándares de Referencia USP Análisis de Aminoácidos

• <11 >Estándares de Referencia USP
• <191 > Identificación Pruebas Generales
' <197> Pruebas de ldentíftcación Espectrofotométrica
' <201> Prueba de ldent1ficac1ón por Cromatografía en
Capa Delgada
• <621> Cromatografía
• <726> Electroforesis
t <61> Examen Microbiológico de Productos No
Estériles Pruebas de Recuento Microbiano
• <62> Examen M1crobiológ1co de Productos No
Estériles: Pruebas de Microorganismos Especlficos
t <71> Pruebas de Esterilidad
t <85> Prueba de Endotoxinas Bacterianas
I <87> Pruebas de Reactividad Bío!ógica. In Vitro
• <1053> Electroforesis Capilar
• <1054:> Artículos Obtenidos por Biotecnología··
!soelectroenfoque
• <1055> Articulas Obtenidos por B1otecnología-
Mapeo de P8ptidos
• <1056:> Artículos Obtenidos por Biotecnología-
! Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
• <1057> Artículos Obtenidos por Biotecnología-

•
<88> Pruebas de React1v1dad Biológica, In Vivo Valoración de Proteínas Totales
• <736> Espectrometría de Masas
•<1031> Biocompatib11idad de los Materiales Usados en <1176> Balanzas y Aparatos Volumétricos para
• <761 >Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear Envases de Medicamentos, D1spos1tivos Médicos Prescripciones

• <851> Espectrofotometría y D1spers1ón de Luz e Implantes ' <1251> Pesada en una Balanza Analítica
• <1065> Cromatoqrafia lónica •<1066> Ambientes Físicos .que Promueven el Uso • <1761 :>Aplicaciones de la Espectroscopía de
- Seguro de los Medicamentos
Resonancia Magnetica Nuclear
e <1761 > Apl1cac1ones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear •< 1113> Caracterización, Identificación y Tipificacíón de
Cepas Microbianas
9<1229> Esterilización de Artículos Farmacopeicos

Valoración
Impurezas
• <11> Estándares de Referencia USP
• <541 > Volumetría
• <621 > Cromatografía Relacionadas con el Proceso j Relacionadas con el Producto
+ <726> Electroforesis
+
+ <736> Espectrometría de Masas
' <11 :> Estándares de Referencia USP <11> Estándares de Referencia USP

'
•
<761 > Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
<781> Rotación Óptica
' <81 :>Antibióticos Valoraciones Microbiológicas
• <111:> Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
• <231> Metales Pesados '
j <111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Bíológ1cas

<621 > Cromatografía

• <851 > Espectrofotometría y Dispersión de Luz <726:> Electroforesis

• <541 :> Volumetría
1! <736> Espectrometria de Masas
1

• <1761> Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear

• <621> Cromatografia
' <761> Espectroscopia de Resonancia Magnética
• <726> Electroforesis
1
Nuclear
• <730> Espectroquím1ca de Plasma e<1761> Apl!caciones de la Espectroscopía de
Envasado Resonancia Magnética Nuclear
• <731 >Pérdida por Secado
• <659> Requisitos de Envases y Almacenamiento
• <736> Espectrometría de Masas
• <660> Envases Vidrio
• <761 > Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
• <661> Envases Plásticos
• <671> Envases--Pruebas de Desempeflo + <851 :> Espectrofotometría y D1spers1ón de Luz

• <1136> Envasado y Reenvasado Envases Unitanos • <921 > Determmación de Agua

t <1151> Formas Farmacéuticas f <1045> Articulas Obtenidos por Biotecnología

• <1191 > Consideraciones sobre Estab1l1dad en la Práctica de Dispensación
+ <1052:> Artículos Obtenidos por Biotecnologia-Anáhsis de Ammoác1dos
' <1053:> Electroforesis Capilar
•<1660> Envases de V1dr10 Evaluación de la Durabilidad de la Superficie Interna • <1054> Articulas Obtenidos por Biotecnología lsoe!ectroenfoque

• <1055> Artículos Obtenidos por B1otecnología-Mapeo de Pept1dos

t <1056> Artículos Obtenidos por Biotecnología- Electroforesis en Gel de Poliacnlam1da
• <1057:> Artículos Obtenidos por Biotecnologia- Valoración de Proteínas Totales
• <1761> Apl1cac1ones de la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
USP 37
Guía para los Capítulos
Generales
(Para obtener la lista alfabética completa de los capítulos generales de esta Farmacopea, consulte "Capítulos Generales" en el
PRUEBAS V VALORACIONES GENERALES
Requisitos Generales para
Pruebas y Valoraciones
(1) Inyectables ............................. 33
(2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad de
Productos ............................. 39
(3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de
Calidad de Producto ..................... 45
(11) Estándares de Referencia USP ............... 50
Equipos para Pruebas y Valoraciones
(1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta
Bajo Receta Médica ..................... 53
(21) Termómetros .......................... 56
(31) Aparatos Volumétricos .................... 56
(41) Pesas y Balanzas ........................ 57
Pruebas Microbiológicas
(51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana ........... 58
(55) Indicadores Biológicos-Pruebas de Resistencia .. 60
(61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles:
Pruebas de Recuento Microbiano ........... 63
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles:
Pruebas de Microorganismos Específicos ...... 70
(63) Pruebas para Micoplasmas ................. 78
(71) Pruebas de Esterilidad .................... 84
Pruebas y Valoraciones Biológicas
(81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas ..... 92
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas .......... 111
(87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro ..... 117
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo ..... 119
(90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y
Pruebas de Funcionalidad ................ 125
(91) Valoración de Pantotenato de Calcio ......... 129
(92) Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la
Fabricación de Productos de Terapia Celular ... 1 31
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas ... 1 35
(115) Valoración de Dexpantenol ............... 151
(121) Valoración de Insulina .................. 153
(123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón .. 155
(130) Atributos de Calidad de la Proteína A ....... 158
(151) Prueba de Pirógenos ................... 166
(161) Equipos para Transfusión e Infusión y
Dispositivos Médicos Similares ........... 168
(1 71) Valoración de Actividad de Vitamina B12 . • . . . 168
Guía para los Capítulos Generales 29
índice.)
Pruebas y Valoraciones Químicas
Pruebas de Identificación
(181) Identificación-Bases Orgánicas Nitroge-
nadas ............................. 171
(191) Identificación-Pruebas Generales .......... 1 72
(193) ldentificación-Tetraciclinas .............. 175
(197) Pru~b?s de Identificación Espectrofoto-
metnca ............................ 176
(201) Prueba de Identificación por Cromatografía en
Capa Delgada ....................... 1 77
Pruebas de Límite
(206) Aluminio ............................ 1 78
(207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro de
Enoxaparina Sódica ................... 179
(208) Valoración de Anti-Factor Xa y Anti-Factor
lla para Heparinas No Fraccionadas y Heparinas
de Bajo Peso Molecular ................ 185
(211) Arsénico ............................ 189
(221) Cloruros y Sulfatos .................... 191
(223) Dimetilanilina ........................ 191
(226) 4;-Epianhidrotetraciclina ................. 192
(228) Oxido de Etileno y Dioxano .............. 193
(231) Metales Pesados ...................... 195
(232) Impurezas Elementales-Límites ........... 198
(233) Impurezas Elementales-Procedimientos ..... 200
(241) Hierro .............................. 205
(251) Plomo ............................. 205
(261) Mercurio ............................ 206
(267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio ...... 209
(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción
de Nitrógeno ....................... 212
(271) Prueba para Sustancias Fácilmente Carbo-
nizables ........................... 216
(281) Residuo de Incineración ................. 216
(291) Selenio ............................. 21 7
Otras Pruebas y Valoraciones
(301) Capacidad Neutralizante de Ácido ......... 218
(311) Valoración de Alginatos ................. 219
(341) Agentes Antim[crobianos-Contenido ....... 220
(345) Valoración de Acido Cítrico/Citrato y Fosfato .. 223
(351) Valoración de Esteroides ................. 224
(361) Valoración de Barbitúricos ............... 225
(371) Valoración de Cobalamina con Marcador
Radioactivo ......................... 225
(381) Tapones Elastoméricos para Inyectables ...... 226

30 Guía para los Capítulos Generales
(391) Valoración de Epinefrina ................. 232
(401) Grasas y Aceite,s Fijos ................... 233
(411) Valoración de Acido Fálico ............... 248
(41 3) Anáiisis de Impurezas en Gases Medicinales ... 248
(415) Valoración de Gases Medicinales ........... 249
(425) Antibióticos-Valoración Yodométrica ....... 252
(429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción
de Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
(431) Determinación de Grupos Metoxilo ........ 259
(441) Valoración de Niacina o Niacinamida ....... 260
(451) Volumetría con Nitrito .................. 263
(461) Determinación de Nitrógeno ............. 264
(466) Impurezas Comunes ................... 265
(467) Disolventes Residuales .................. 266
(471) Combustión en Matraz con Oxígeno ....... 282
(481) Valoración de Riboflavina ................ 282
(501) ?a les dl· Ba::.e> Orgánica:-. í\Jitrogenada> ...... 283
(503) Acido Acético en Péptidos ............... 284
(511) Valoración de un Esteroide Aislado ......... 285
(525) Dióxido de Azufre ..................... 285
(531) Valoración de Tia mina .................. 291
(541) Volumetría . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292
(551) Valoración de Alfa Tocoferol .............. 295
(561) Artículos de Origen Botánico ............. 296
(563) Identificación de Artículos de Origen
Botánico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 O
(565) Extractos Botánicos .................... 321
(571) Valoración de Vitamina A ................ 324
(581) Valoración de Vitamina D ................ 330
(591) Determinación de Cinc ................. 340
Pruebas y Determinaciones Físicas
(601) Aerosoles, Atomizadores Nasales, Inhaladores
de Dosis Fija e Inhaladores de Polvo Seco ... 341
(61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico
Alternativos para Productos Nasales
e Inhaladores No Estériles ............... 370
(611) Determinación de Alcohol ............... 372
(616) Densidad Aparente y Densidad por Asenta-
miento de los Polvos .................. 374
(621) Cromatografía ........................ 377
(631) Color y Acromatismo ................... 387
(641) Totalidad de la Disolución ............... 389
(643) Carbono Orgánico Total ................. 389
(645) Conductividad del Agua ................. 391
(651) Temperatura de Solidificación ............. 394
(659) Requisitos de Envases y Almacenamiento ..... 396
(660) Envases--Vidrio ....................... 399
(661) Envases-Plásticos ..................... 405
(670) Envases-Componentes Auxiliares .......... 412
(671) Envases-Pruebas de Desempeño .......... 414
(691) Algodón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
(695) Cristalinidad ......................... 421
(696) Caracterización de Sólidos Cristalinos por Micro-
calorimetría y Calorimetría de Disolución .... 421
(698) Volumen de Entrega ................... 424
(699) Densidad de Sólidos ................... 427
(701) Desintegración ....................... 429
(711) Disolución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431
(721) Intervalo de Destilación ................. 441
(724) Liberación de Fármacos ................. 442
(726) Electroforesis ......................... 447
(729) Distribución del Tamaño de Glóbulos en Emul-
siones Inyectables de Lípidos ............ 451
(730) Espectroquímica de Plasma .............. 454
(731) Pérdida por Secado .................... 462
(733) Pérdida por Incineración ................ 462
(735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X .. 463
(736) Espectrometría de Masas ................ 468
(741) Intervalo o Temperatura de Fusión ......... 474
(751) Partículas Metálicas en Ungüentos
Oftálmicos ......................... 476
(755) Llenado Mínimo ...................... 477
1
USP 37
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética
Nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
(771) Ungüentos Oftálmicos . . . . . . . . . 488
(776) Microscopja Optica .................... 488
(781) Rotación Optica ...................... 491
(785) Osmolalidad y Osmolaridad .............. 492
(786) Estimación de la Distribución del Tamaño de
Partícula por Tamizado Analítico .......... 495
(788) Partículas en Inyectables ................ 499
(789) Partículas en Soluciones Oftálmicas ......... 503
(791) pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504
(795) Preparación Magistral-Preparaciones No
Estériles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506
(797) Preparación Magistral-Preparaciones
Estériles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 5
(801) Polarografía ......................... 565
\8 1 1) Finura de Polvos ...................... 569
(821) Radioactividad ........................ 570
(823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Posi-
trones para Uso en Preparaciones Ma5.1istrales,
, Investigación Clínica y Estudios Cientrficos ... 581
(831) Indice de Refracción ................... 592
(841) ~eso Específico ....................... 592
(846) Area Superficial Específica ................ 593
(851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz ...... 597
(861) Suturas-Diámetro .................... 606
(871) Suturas-Sujeción de Agujas .............. 606
(881) Resistencia a la Tensión ................. 607
(891) Análisis Térmico ...................... 608
(905) Uniformidad de Unidades de Dosificación .... 612
(911) Viscosidad-Métodos del Viscosímetro
Capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 616
(912) Métodos del Reómetro Rotatorio .......... 618
(91 3) Método del Viscosímetro de Bola Rodante .... 623
(921) Determinación de Agua ................. 625
(941) Caracterización de Sólidos Cristalinos
y Parcialmente Cristalinos por Difracción
de Rayos X sobre Polvo (DRXP) ........... 629
INFORMACIÓN GENERAL
(1005) Emisión Acústica ..................... 637
(1 01 O) Datos Analíticos-Interpretación y Trata-
miento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 641
(1015) Aparatos Automatizados de Síntesis
Radioquímica ....................... 657
(1024) Suero Bovino ........................ 659
(1027) Citometría de Flujo ................... 673
(1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas-Infor-
mación General y Glosario ............. 691
(1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados en
Ehvases de Medicamentos, Dispositivos
Médicos e Implantes ................. 703
(1032) Diseño y Desarrollo de Valoraciones Bioló-
gicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 714
(1033) Validación de Valoraciones Biológicas ...... 734
(1034) Análisis de Valoraciones Biológicas ......... 751
(1035) Indicadores Biológicos para Esterilización .... 765
(1041) Productos Biológicos .................. 770
(1043) Materiales Auxiliares para Productos Celulares,
Génicos y de Ingeniería Tisular .......... 771
(1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología ...... 780
(1046) Productos Derivados de Células y Tejidos .... 796
(1047) Productos de Terapia Génica ............ 829
(1048) Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis de
la Construcción Expresable en Células Usadas
para la Producción de Productos Proteínicos
Obtenidos con ADN Recombinante ....... 861
(1 049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas
de Estabilidad de Productos Biotecnológicos
o Biológicos ........................ 864
(1050) Evaluacion de la Seguridad Viral en Productos
Biotecnológicos Obtenidos de Líneas
Celulares de Origen Humano o Animal .... 869
USP 37
(1051) Limpieza de Material de Vidrio ........... 883
(1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Análisis de Aminoácidos ............... 884
(1053) Electroforesis Capilar .................. 898
(1054) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
lsoelectroenfoque .................... 905
(1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Mapeo de Péptidos .................. 908
(1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida ..... 915
(1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Valoración de Proteínas Totales .......... 922
(1058) Calificación de Instrumentos Analíticos ..... 927
(1059) Desempeño de Excipientes .............. 933
(1061) Color-Medición Instrumental ........... 955
(1065) Cromatografía lónica .................. 958
(1066) Ambientes Físicos que Promueven el Uso Seguro
de los Medicamentos ................. 961
(1072) Desinfectantes y Antisépticos ............ 969
(1074) Guías para la Evaluación de la Seguridad
Biológica de los Excipientes ............. 975
(1078) Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes
Farmacéuticos a Granel ................ 979
(1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento y
y Distribución para Medicamentos ........ 997
(1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel-
Certificado de Análisis ................ 1007
(1081) Consistencia del Gel de Gelatina ......... 1016
(1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos-
Consideraciones Generales ............ 1016
(1086) Impurezas en Fármacos y Productos
Farmacéuticos ..................... 1027
(1087) Disolución Intrínseca Aparente-Procedi-
mientos de Pruebas de Disolución para
Disco Rotatorio y Disco Estacionario ..... 1030
(1088) Evaluación In Vivo e In Vitro de Formas
Farmacéuticas ..................... 1035
(1090) Evaluación de Desempeño del Producto Farma-
céutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia
y Disolución ...................... 1047
(1091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos ...... 1056
(1092) Procedimiento de Disolución: Desarrollo
y Validación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 056
(1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos
a Granel ......................... 1065
(1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Consideraciones Generales ............ 1079
(1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a
Enzimas (ELISA) .................... 1087
(1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Análisis por lnmunotransferencia ........ 1099
(1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Resonancia de Plasmón Superficial ....... 1111
(1106) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y
Validación de lnmunoensayos para Detectar
Anticuerpos Antifármacos ............. 1128
(1111) Examen Microbiológico de Productos No
Estériles: Criterios de Aceptación para
Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias
de Uso Farmacéutico ................ 1146
(1112) Determinación de Actividad de A9ua en
Productos Farmacéuticos No Esteriles ..... 1147
(111 3) Caracterización, Identificación y
Tipificación de Cepas Microbianas ....... 1150
(1116) Control Microbiológico y Monitoreo de
,Ambientes de Procesamiento Aséptico .... 1155
(111 7) Optimas Práticas de Laboratorio Microbioló-
gico ............................ 1169
(1118) Dispositivos de Monitoreo-Tiempo, Tempe-
ratura y Humedad .................. 11 76
(1119) Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano .... 1182
(1120) Espectroscopía Raman ................ 1189
(1121) Nomenclatura ...................... 1198
Guía para los Capítulos Generales 31
(1125) Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-
Generalidades .... ,· ................ 1200
(1126) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Extracción, Detección,y Secuenciación ..... 1206
(1127) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Amplificación ..... ,. ................ 121 7
(1128) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Micromatrices .... ,· ................ 1 228
(1129) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Genotipificación ... ,· ................ 1235
(1130) Técnicas Basadas en Acidos Nuclei~os-
Enfoques para Detectar Trazas de Acidos Nucleicos
(Análisis de ADN Residual) ............. 1240
(1136) Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios .... .
..................................... 1243
(1151) Formas Farmacéuticas ................ 1253
(1160) Cálculos Farmacéuticos en la Preparación
Magistral de Prescripciones ............ 1282
(1163) Garantía de Calidad en la Preparación
Magistral ......................... 1297
(11 71) Análisis por Solubilidad de Fases ......... 1 304
(1174) Fluidez de Polvos .................... 1307
(1176) Balanzas y Aparatos Volumétricos para Prescrip-
ciones ........................... 1311
(1177) Buenas Prácticas de Envasado ........... 1313
(11 78) Buenas Prácticas de Reenvasado . . . . . . . . . 1 316
(1180) Plasma Humano .................... 1 319
(1181) Microscopía Electrónica de Barrido ....... 1 344
(1184) Pruebas de Sensibilización ............. 1 349
(1191) Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica
de Dispensación .................... 1 360
(1195) Guía sobre Cambios Significativos en Excipientes
Farmacéuticos a Granel ............... 1 365
(1196) Armonización Farmacopeica ............ 1377
(1197) Buenas Prácticas de Distribución para Exci-
pientes Farmacéuticos a Granel ......... 1 385
(1207) Envasado de Productos Estériles-Evaluación
de Integridad ...................... 1409
(1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas
Aisladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1412
(1209) Esterilización-Indicadores e Integradores
Químicos y Fisicoquímicos ............ 1417
(1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad de
Artículos Farmacopeicos .............. 1419
(1216) Friabilidad de las Tabletas .............. 1425
(121 7) Fuerza de Ruptura de las Tabletas ........ 1426
(1222) Productos Farmacéuticos con Esterilización
Terminal-Liberación Paramétrica ....... 1429
(1223) Validación de Métodos Microbiológicos
Alternativos ....................... 1433
(1224) Transferencia de Procedimientos Analíticos .. 1437
(1225). Validación de Procedimientos Farma-
copeicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1440
(1226) Verificación de Procedimientos Farma-
copeicos ......................... 1445
(1227) Validación de Recuperación Microbiana en
Artículos Farmacopeicos .............. 1447
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos ... 1451
(1229 .1) Esterilización con Vapor de Agua por
Contacto Directo ................. 1457
(1229.2) Esterilización con Calor Húmedo de
Líquidos Acuosos ................. 1460
(1229. 3) Monitoreo de la Biocarga ............ 1465
(1230) Agua para Uso en Hemodiálisis .......... 1469
(1231) Agua para Uso Farmacéutico ........... 1470
(1235) Vacunas para Uso Humano-Consideraciones
Generales ........................ 1500
(1237) Métodos de Pruebas Virológicas ......... 1518
(1238) Vacunas para Uso Humano-Vacunas Bac-
terianas .......................... 1540
(1241) Interacciones Agua-Sólido en Sistemas
Farmacéuticos ..................... 1554
(1251) Pesada en una Balanza Analítica ......... 1559
(1265) Información Escrita de los Medicamentos
Recetados-Guías ................... 1 564
32 Guía para los Capítulos Generales
(1601) Productos para Nebulización-Pruebas de
Caracterización ....................
(1644) Teoría y Práctica de Mediciones de
Conductividad Eléctrica de Soluciones ....
(1660) Envases de Vidrio-Evaluación de la
Durabilidad de la Superficie Interna ......
(1 724) Medicamentos Semisólidos-Pruebas de
Desempeño .......................
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de
Resonancia Magnética Nuclear .........
(1 788) Métodos para la Determinación de Partículas
en Inyectables y Soluciones Oftálmicas ....
(1911) Reometría .........................
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS
(2021) Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos
Nutricionales y Dietéticos ............. 1639
USP 37
(2022) Procedimientos Microbiológicos para Comprobar
1566 la Ausencia de Microorganismos Específicos-
Suplementos Nutricionales y Dietéticos ... 1644
1570 (2023) Atributos Microbiológicos de los Suplementos
Nutricionales y Dietéticos No Estériles .... 1651
1577 (2030) Información Complementaria para Artículos de
Origen Botánico .................... 1654
1583 (2040) Desintegración y Disolución de Suplementos
Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1664
1596 (2091) Variación de Peso de Suplementos
Dietéticos ........................ 1672
1617 (2232) Contaminantes Elementales en Suplementos
1632 Dietéticos ........................ 1673
(2750) Prácticas de Fabricación para Suplementos
Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1680
 USP 37 Requisitos Generales/ (1) Inyectables 33

Capítulos Generales
Pruebas y Valoraciones Generales

Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones

(1) INYECTABLES

INTRODUCCIÓN

Los artículos parenterales son preparaciones destinadas a la inyección a través de la piel u otro tejido externo, en lugar de la
vía alimentaria, administrando las sustancias activas que contienen directamente en un vaso sanguíneo, órgano, tejido o lesión,
usando la fuerza de la gravedad u otra fuerza. Los artículos parenterales se preparan meticulosamente mediante métodos dise-
ñados para garantizar el cumplimiento de los requisitos establecidos por la Farmacopea en lo referente a esterilidad, pirógenos,
partículas y otros contaminantes. Cuando corresponde, contienen inhibidores del crecimiento de microorganismos. Una inyec-
ción es una preparación destinada para la administración parenteral, y/o para reconstituir o diluir un artículo antes de su admi-
nistración parenteral.

NOMENCLATURA V DEFINICIONES

Nomenclatura1

La siguiente nomenclatura corresponde a cinco tipos generales de preparaciones apropiadas y destinadas para la administra-
ción parenteral. Pueden contener amortiguadores del pH, conservantes y otras sustancias agregadas.
1. Inyección de [FÁRMACO]-Preparaciones líquidas que son fármacos o sus soluciones. [NOTA-En los títulos de las monogra-
fías y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexación, este nombre aparece en forma invertida, como [FÁRMACO},
Inyección.]
2. [FÁRMACO] para Inyección-Sólidos secos que al agregarles vehículos adecuados constituyen soluciones que cumplen con
todos los requisitos para Inyecciones.
3. Emulsión Inyectable de [FÁRMACO]-Preparaciones líquidas de fármacus disueltos o dispersos en un medio emulsionante
adecuado. [NOTA-En los títulos de las monografías y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexación, este nombre
aparece en forma invertida, como [FÁRMACO], Emulsión Inyectable.]
4. Suspensión Inyectable de [FÁRMACO]-Preparaciones líquidas de sólidos suspendidos en un medio líquido adecuado.
[NOTA-En los títulos de las monografías y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexación, este nombre aparece
en forma invertida como [FÁRMACO}, Suspensión Inyectable.]
5. [FÁRMACO] para Suspensión Inyectable-Sólidos secos que al añadirles vehículos adecuados constituyen preparaciones que
cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables.

1 El Comité de Nomenclatura de Fármacos de la USP ha adoptado esta nomenclatura para implementarla mediante revisiones suplementarias de USP 34-NF 29.
Para los títulos de las monografías oficiales vigentes de la forma [FÁRMACO] Estéril que no hayan sido revisados todavía, la siguiente nomenclatura continúa en uso
en esta Farmacopea: (1) los fármacos, o sus soluciones o emulsiones, aptas para inyección, llevan títulos de la forma [FÁRMACO], Inyección; (2) los sólidos secos o
líquidos concentrados que no contengan amortiguadores del pH, diluyentes ni otras sustancias agregadas y que, al añadir los disolventes adecuados, constituyen
soluciones que cumplen con los requisitos para Inyecciones en todos los aspectos, y que se distinguen mediante títulos de la forma [FÁRMACO] Estéril; (3) las
mismas preparaciones descritas en (2) excepto que éstas contienen uno o más amortiguadores del pH, diluyentes, u otras sustancias agregadas, y que se
identifican por títulos de la forma [FÁRMACO] para Inyección; (4) sólidos suspendidos en un medio líquido adecuado y que no son para inyección por vía
intravenosa o intratecal, se identifican por títulos de la forma [FÁRMACO], Suspensión Estéril; y (5) sólidos secos que, al agregarles vehículos adecuados, forman
preparaciones que cumplen con todos los requisitos para las Suspensiones Estériles y se distinguen por títulos de la forma [FÁRMACO! Estéril para Suspensión.
 •
34 (1) Inyectables / Requisitos Generales USP 37

Definiciones

PRODUCTOS BIOLÓGICOS

Las definiciones Farmacopeicas de preparaciones estériles para uso parenteral no se aplican generalmente en el caso de pro-
ductos biológicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Bio!Ogicos (1041 )).

INGREDIENTES

Vehículos y Sustancias Agregadas

Vehículos Acuosos-Los vehículos para Inyecciones acuosas cumplen con los requisitos de la Prueba de Pirógenos (151) o
de la Prueba de Endotoxinas BactPrianm (85), según corresponda. El Agua para lnyecrión se emplea generalmente como vehícu-
lo, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. El cloruro de sodio se puede agregar en cantidades
suficientes para convertir la solución resultante en isotónica; y la Inyección de Cloruro de Sodio, o la Solución de Ringer Inyectable,
pueden reemplazar parcial o totalmente al Agua para Inyección, a menos que se especifique algo diferente en la monografía
individual. Para condiciones aplicables a otros adyuvantes, ver Sustancias Agregadas en este capítulo.
Otros Vehículos-Los aceites fijos empleados como vehículos para Inyecciones no acuosas son de origen vegetal, son ino-
doros o prácticamente inodoros, y no tienen ningún olor que sugiera rancidez. Cumplen con los requisitos de la prueba para
Parafina Sólida en Aceite Minero/, manteniéndose, el baño frío a 1 Oº, tienen un Índice de Saponificación entre 185 y 200 (ver
Grasas y Aceites Fijos (401 )), tienen un Índice de Yodo entre 79 y 141 (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )), y cumplen con los requi-
sitos de las pruebas siguientes.
Materia lnsaponificable (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No más de 1,5%
Índice de Acidez (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No más de 0,2
Índice de Peróxido (ver Grasas y Aceites Fijos (401 )): No más de 5,0
Determinación de Agua, Método le (921 ): No más de O, 1 %
Límite de Cobre, Hierro, Plomo y Níquel-[NoTA-La prueba para níquel se requiere únicamente si el aceite ha sido sometido
a hidrogenación o si se ha usado un catalizador de níquel durante el procesamiento.] Proceder según se indica en la sección
Trazas de Metales en Grasas y Aceites Fijos (401 ). No se encuentra más de 1 ppm de cobre; no se encuentra más de 1 ppm de
hierro; no se encuentra más de 1 ppm de plomo; y no se encuentra más de 1 ppm de níquel.
Los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos de ácidos grasos se pueden emplear como vehículos, siempre que sean líquidos,
se mantengan transparentes cuando se enfrían a 1 Oº y presenten un Índice de Yodo no mayor de 140 (ver Grasas y Aceites Fijos
(401 )).
Se pueden emplear estos y otros vehículos no acuosos, siempre que sean seguros, en el volumen de la Inyección administra-
da y siempre que no interfieran con la eficacia terapéutica de la preparación o con su respuesta a las valoraciones y pruebas
especificadas.
Sustancias Agregadas-Se pueden agregar sustancias adecuadas para aumentar la estabilidad o la utilidad de las inyeccio-
nes, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, siempre que sean inocuas en las cantidades admi-
nistradas y no interfieran con la eficacia terapéutica o con las respuestas a las valoraciones o pruebas especificadas. No se pue-
den agregar colorantes a una solución destinada a la administración parenteral con el único propósito de conferir color a la
preparación terminada (ver además Sustancias Agregadas en Advertencias Generales y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51)).
Debe tenerse especial cuidado en la elección y empleo de sustancias agregad;¡is en las preparaciones para inyección que se
administran en un volumen superior a 5 mL. A menos que se especifique algo diferente, prevalecen los siguientes límites máxi-
mos: 0,01 % para agentes que contengan mercurio y para compuestos tensoactivos catiónicos; 0,5% para clorobutanol, creso!,
fenol y sustancias de tipo similar; y 0,2% para dióxido de azufre, o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito, o metabisulfi-
to de potasio o de sodio.
A las preparaciones destinadas para inyección que se presenten en envases multidosis, independientemente del método de
esterilización empleado, se les debe agregar una sustancia o una mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento
de microorganismos, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) hay instrucciones diferentes en la mono-
grafía individual; (2) la sustancia contiene un radionucleido con una vida media física de menos de 24 horas; o (3) los ingre-
dientes activos son antimicrobianos. Tales sustancias se emplean en concentraciones que impidan el crecimiento o la existencia
de los microorganismos en las preparaciones para inyección. Tales sustancias cumplen además con los requisitos de Pruebas de
Eficacia Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ). Los procesos de esterilización han de ser usados aun-
que se empleen dichas sustancias (ver además Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )). Se pue-
de extraer el aire del envase, o desplazarlo con un gas químicamente inerte. Cuando así se especifique en una monografía, el
etiquetado debe incluir información sobre la sensibilidad al oxígeno del artículo.
 USP 37 Requisitos Generales/ (1) Inyectables 35

ETIQUETAS Y ETIQUETADO

Etiquetado

NOTA-Ver las definiciones de "etiqueta" y "etiquetado" en la sección 10.40, Etiquetado del apartado 1O. Conservación, Enva-
sado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales.
La etiqueta indica el nombre de la preparación; en el caso de una preparación líquida, el contenido porcentual de fármaco o
la cantidad de un fármaco en un volumen especificado; en el caso de una preparación seca, la cantidad de ingrediente activo;
la vía de administración; una declaración de las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad; el nombre y el domi-
cilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor; y un número de lote identificativo. El número de lote puede proporcio-
nar todo el historial de fabricación del envase específico, incluyendo todas las operaciones de fabricación, llenado, esteriliza-
ción y etiquetado.
Cuando una monografía individual permita variar las concentraciones de los ingredientes activos en la preparación parente-
ral de gran volumen, se indica la concentración de cada ingrediente nombrado en el título oficial como si fuera parte del título
oficial, es decir, Dextrosa 5%, Inyección; o Dextrosa (5%) y Cloruro de Sodio (0,2%), Inyección.
El etiquetado incluye la siguiente información si no se especifica la fórmula completa en la monografía individual: (1) En el
caso de una preparación líquida, el contenido porcentual de cada ingrediente o la cantidad de cada ingrediente en un volu-
men especificado, salvo que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado o para hacer isotónica la solución se puedan
declarar por el nombre y una indicación acerca de su efecto; y (2) en el caso de una preparación seca u otra preparación a la
que se va a agregar un diluyente antes de utilizarla, la cantidad de cada ingrediente, la composición del diluyente o diluyentes
recomendados [sólo el nombre o nombres, si la fórmula se especifica en la monografía individual], la cantidad que se va a
emplear para alcanzar una concentración específica de ingrediente activo y el volumen final de la solución así obtenida, una
breve descripción del aspecto físico de la solución reconstituida, instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solución
reconstituida y una fecha de caducidad que limite el período durante el cual se espera que la solución reconstituida tenga la
potencia requerida o declarada si se ha almacenado según se indica.
Los envases de Inyecciones destinadas a diálisis, hemofiltración o soluciones de irrigación y que contienen un volumen de
más de 1 L declaran que el contenido no está destinado para infusión intravenosa.
Las Inyecciones destinadas para uso veterinario declaran ese fin.
El envase se etiqueta de modo que una superficie suficiente del envase quede sin cubrir en toda su longitud o circunferencia
para permitir la inspección del contenido.

CONTENIDO DE SUSTANCIA ACTIVA Y VOLUMEN TOTAL DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS INYECTABLES MONODOSIS Y

MULTIDOSIS

Para productos farmacéuticos inyectables monodosis y multidosis, el contenido de sustancia activa por el volumen total de-
be ser la expresión principal y prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida inmediatamente por el contenido de
sustancia activa por mL entre paréntesis. Para envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido de sustancia
activa por fracción de mL debe ser la única expresión de contenido. El contenido por mL debe expresarse como mg/mL, y no
como mg/l ml.
Los siguientes formatos son aceptables para contenidos de más de 1 mL:
Contenido total de sustancia activa/volumen total: 500 mg/l O mL
Contenido de sustancia activa/mL: 50 mg/mL
o
Contenido total de sustancia activa/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL
Contenido de sustancia activa/mL: 5000 Unidades/mL
El siguiente formato es aceptable para contenidos de menos de 1 mL: 12,5 mg/0,625 mL
Existen, no obstante, algunas excepciones para la expresión del contenido de sustancia activa por volumen total. En algunos
casos, la expresión principal y prominente del contenido total de un fármaco por envase puede no ser efectiva en la preven-
ción de errores en la administración y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Un ejemplo de ello es el uso de la lidocaína u
otros medicamentos similares empleados como anestésicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por por-
centaje (p.ej., 1%, 2%), o un anestésico local en combinación con epinefrina que se expresa como una relación (p.ej.,
1:100 000). En tales casos, se debe expresar el contenido total de sustancia activa: por ejemplo, 1%(100 mg/l O mL). Los sóli-
dos secos, los cuales deben ser reconstituidos, deben también seguir este formato, con la excepción de que sólo se debe indi-
car el contenido total del fármaco y no el contenido de sustancia activa/volumen total o el contenido de sustancia activa/ml.

Aluminio en Preparaciones Parenterales de Gran Volumen (PPGV), Preparaciones Parenterales de

Pequeño Volumen {PPPV) y Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de
Nutrición Parenteral Total {NPT)

(a) El contenido de aluminio de las PPGV usadas en terapia de NPT no debe exceder de 25 ~tg por L (µg/L).
 36 (1) Inyectables / Requisitos Generales USP 37

(b) El prospecto del envase de las PPGV usadas en terapia de NPT debe declarar que el producto farmacéutico no contiene
más de 25 pg de aluminio por L. Esta información debe incluirse en la sección "Precauciones" del etiquetado de todas las
PPGV usadas en terapia de NPT.
(c) Si la cantidad máxima de aluminio en las PPPV y en los EGF es 25 pg por L (pg/L) o menos, en lugar de declarar la canti-
dad exacta de aluminio que contiene cada uno, tal como en el párrafo (d), la etiqueta del envase primario de las PPPV y
los EGF usados en la preparación de preparaciones parenterales de NPT (con las excepciones que se indican más adelante)
pueden declarar: "No contiene más de 25 µg/L de aluminio". Si la PPPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del
envase primario puede declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto ad-
junto, la concentración de aluminio no será más de 25 µg/L".
(d) El nivel máximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todas las PPPV
y los EGF usados en la preparación de artículos parenterales para NPT y emulsiones inyectables. El contenido de aluminio
debe declararse de la siguiente manera: "No contiene más de_ µg/L de aluminio". La etiqueta del envase primario de
todas las PPPV y los EGF que son polvos liofilizados usados en la preparación de soluciones de NPT deben declarar lo si-
guiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las ínstrucciones del prospecto adjunto, la concentración de aluminio
no será más de_ ~tg/L." Este contenido máximo de aluminio debe declararse como el más alto entre los tres niveles si-
guientes:
(1) El nivel más alto de las partidas producidas durante los últimos tres años.
(2) El nivel más alto de las últimas cinco partidas.
(3) El nivel máximo con respecto a los niveles históricos, pero sólo hasta completar la producción de las primeras cinco
partidas después del 26 de julio de 2004.
El prospecto adjunto en los envases de todas las PPGV, PPPV y los EGF usados en la preparación de productos para NPT
debe contener una declaración de advertencia. Esta advertencia debe estar incluida en la sección "Advertencias" del etiqueta-
do y debe declarar lo siguiente: "ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser tóxico. El aluminio puede
alcanzar niveles tóxicos con la administración parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en
particular tienen mayor riesgo debido a la inmadurez de sus riñones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de
calcio y fosfato que contienen aluminio. Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos
prematuros, que reciben niveles de aluminio por vía parenteral mayores de 4 µg a 5 µg por kg por día, acumulan aluminio a
niveles asociados con la toxicidad ósea y del sistema nervioso central. La acumulación en los tejidos puede ocurrir incluso con
niveles más bajos de administración de productos para NPT".

ENVASADO

Envases para Inyecciones

Los envases, incluyendo los cierres, para preparaciones para inyecciones no deben ejercer sobre el contenido ninguna acción
física o química que pueda alterar de alguna manera la concentración, calidad o pureza más allá de los requisitos oficiales en
condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso. Los envases deben estar hechos de un
material que permita la inspección del contenido. Por lo general, el tipo de vidrio preferible para cada preparación parenteral
se indica en la monografía individual. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se pueden em-
plear envases plásticos para envasar las inyecciones (ver Envases-Plásticos (661 )).
Para definiciones de envases monodosis y multidosis, ver las secciones 10.20.70 y 10.20.11 O, respectivamente, en las Adver-
tencias y Requisitos Generales. Los envases cumplen con los requisitos establecidos en Envases-Vidrio (660) y Envases-Plásticos
(661). .
Los envases deben estar cerrados o sellados de tal modo que impidan la contaminación o la pérdida del contenido. La vali-
dación de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminación por penetración de microorganismos o de
impurezas químicas o físicas. Además, el envase debe ser capaz de mantener las cantidades totales y relativas o concentracio-
nes especificadas de solutos y del vehículo cuando se expone a condiciones extremas previstas en la fabricación y procesa-
miento, almacenamiento, transporte y distribución. Los cierres para envases multidosis deben permitir la extracción del conte-
nido sin quitar o destruir el cierre. El cierre debe permitir la penetración de una aguja y el cerramiento de inmediato luego de
retirarla, protegiendo el envase de la contaminación. La validación de la integridad del envase multidosis debe incluir una veri-
ficación de que un envase de ese tipo impide la contaminación microbiana o la pérdida del contenido del producto en las
condiciones previstas de múltiples entradas y usos.
Los envases para venoclisis en tándem (piggyback containers) son por lo general envases de infusión intravenosa empleados
para administrar una segunda infusión a través de un conector de algún tipo o a través de un inyector en el equipo de admi-
nistración del primer líquido, evitándose así la necesidad de inyectar en otro sitio al paciente. Los envases para venoclisis en
tándem son también conocidos como envases de infusión secundaria.

Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección

El uso de un sistema de cierre negro en un vial [p.ej., una tapa negra de fácil desprendimiento adherida al casquillo (tapa
"flip-off") y un casquillo negro para sostener el cierre elastomérico] o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre
 USP 37 Requisitos Generales/ (1) Inyectables 37

el estrechamiento del cuello de una ampolla se reserva sólo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección y está
prohibido su uso en cualquier otra inyección.

Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes

Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales
con una declaración de advertencia impresa en los casquillos o en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la
tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o
la tapa) la declaración: "Advertencia: Agente Paralizante" o "Agente Paralizante" (dependiendo del tamaño del sistema de cie-
rre). Alternativamente, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripción, de manera que permita la visualización
de la declaración de advertencia sobre el casquillo de cierre.

Envases para Sólidos Estériles

Los envases, incluyendo los cierres, para sólidos secos destinados para uso parenteral no deben ejercer sobre el contenido
ninguna acción física o química que altere de alguna manera el contenido, la calidad o la pureza más allá de los requisitos
oficiales, en condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso.
Un envase para un sólido estéril debe permitir la adición de un disolvente adecuado y la extracción de porciones de la solu-
ción o suspensión resultante de tal modo que se mantenga la esterilidad del producto.
Cuando la Valoración en una monografía indica un procedimiento para la Solución muestra, donde se deba tomar el conteni-
do total extraíble de un envase monodosis con una jeringa y aguja hipodérmica, se extraerá ese contenido en la forma más
completa posible con una jeringa hipodérmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a ex-
traer, y provista con una aguja número 21 de una longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la precaución de expe-
ler cualquier burbuja de aire, y se descargará en un recipiente para dilución y valoración.

Contenido del Envase

Cada envase de inyección debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de fár-
maco. Dicha extracción se debe realizar de acuerdo a las instrucciones del etiquetado, si fueran provistas.

DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE INYECCIÓN EN LOS ENVASES

Esta sección está armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas
farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a esta sección armonizada. Una porción del presen-
te texto (ver más adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; está marcada con
símbolos (•.) para especificar este hecho.
Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las prepara-
ciones viscosas y aceitosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosa-
mente justo antes de extraer el contenido. El contenido seguidamente se enfría a una temperatura de 20-25ºC antes de medir
el volumen. •Las formulaciones de sólidos estériles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de
retirar su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o solucio-
nes, según sea apropiado .•
Envases Monodosis-Seleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 1O mL o más, 3 envases si el volumen nominal es
más de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Tomar individualmente el contenido
total de cada envase seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y
provista con una aguja número 21 de longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire de la jerin-
ga y la aguja, y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada "para
contener" más que "para verter" los volúmenes marcados) de un tamaño tal que el volumen que se va a medir ocupe al me-
nos el 40% de su volumen graduado. Alternativamente, el volumen del contenido, en mL, puede calcularse como la masa, en
g, dividida por la densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de una cantidad suficiente
de envases puede combinarse para obtener el volumen requerido para la medición, siempre que, para cada envase, se emplee
un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 1O mL o más se puede determinar abriéndolos
y vaciando el contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado.
El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de enva-
ses con un volumen nominal de 2 mL o menos, no es menor que la suma de los volúmenes nominales de los envases que se
toman colectivamente.
Envases Multidosis-Para Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un número específico de dosis de un volu-
men determinado, seleccionar 1 envase y proceder según se indica para los envases monodosis, empleando el mismo número
de conjuntos diferentes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos
de la dosis indicada.
 1

38 (l > Inyectables / Requisitos Generales USP 37

Inyecciones en Cartuchos o Jeringas Prellenadas-Seleccionar 1 envase si el volumen es 1O mL o más, 3 envases si el

volumen nominal es más de 3 mL y menos de 1O mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Si fuera necesario,
equipar los envases con los accesorios requeridos para su uso (aguja, émbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados
tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la aguja, empujando el émbolo en forma lenta y continua. Determi-
nar el volumen, en mL, calculado como la masa, en g, divida por la densidad.
El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal.
Soluciones Intravenosas de Gran Volumen-Para soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a
una probeta graduada seca, de una capacidad tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen
nominal de la probeta. Medir el volumen transferido.
El volumen no es menor que el volumen nominal.

Etiquetado en los Casquillos y las Tapas de Sobresello

Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fácilmente las indicaciones del eti-
quetado que comunican mensajes de seguridad importantes críticos para evitar situaciones de amenaza de muerte inminente
y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser sencillas, concisas y des-
provistas de toda información no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no deben incluir ninguna
información para que aquéllos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr este propósito se requie-
re un enfoque sistemático para el etiquetado de los productos inyectables, tal que asegure que los casquillos y tapas de sobre-
sello-un área de estos productos debe ser de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de estos medica-
mentos-sean reservados para comunicar mensajes críticos de seguridad. En consecuencia:
1. Sólo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (círculo) del casquillo y/o la tapa de sobresello
de un vial que contenga un producto inyectable. La indicación precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la
tapa pero puede aparecer solamente en la tapa, si el casquillo de sobresello es transparente y la indicación precautoria
debajo de la tapa es fácilmente legible. Una indicación precautoria es aquélla destinada a prevenir una situación de ame-
naza de muerte inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si fuera necesario.
Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias son los siguientes, entre otros: "Advertencia-Agente Paralizante" y
"Diluir Antes de Usar". El texto de la indicación precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea fácilmente
visible en condiciones normales de uso.
2. Si no es necesaria una indicación precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello,
debe quedar en blanco.
3. Otras declaraciones o características que incluyen, entre otros, números o letras de identificación, como por ejemplo nú-
meros de códigos, números de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en
la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (círculo) de los casquillos o las tapas de sobresello
de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o características en la falda del cas-
quillo no deben distraer o interferir con la indicación precautoria de la superficie superior.
Oficial a partir del 1º de diciembre de 2013

Envasado y Almacenamiento

El volumen de inyección en envases monodosis proporciona la cantidad especificada para administración parenteral de una
vez y en ningún caso es más que el volumen suficiente para permitir la extracción y administración de 1 L.
Las preparaciones destinadas para administración intrarraquídea, intracisternal o peridural se envasan sólo en envases mono-
dosis.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, un envase multidosis contiene un volumen de Inyec-
ción suficiente para permitir la extracción de no más de 30 ml.
Las siguientes inyecciones están exentas de la restricción de 1 L de los requisitos anteriores relacionados con el envasado:
1. Inyecciones envasadas para uso extravascular como soluciones de irrigación o diálisis peritoneal.
2. Inyecciones envasadas para uso intravascular como nutrición parenteral o como líquido de reemplazo o sustitución para
ser administrado en forma continua durante una hemofiltración.
Las inyecciones envasadas para uso intravascular que pudieran usarse como líquido durante una hemodiálisis u otros proce-
sos de reemplazo mediante administración intermitente, continua o en bolo, deben cumplir con la restricción de 1 L a menos
que se trate de una excepción mencionada anteriormente.
Cuando se declara que las inyecciones están destinadas para uso veterinario, éstas están exentas de los requisitos de envasa-
do y almacenamiento en lo referente a las limitaciones para envases monodosis y de las limitaciones de volumen para los enva-
ses multidosis.
 USP 37 Requisitos Generales/ (2) Medicamentos Orales 39

MATERIA EXTRAÑA Y PARTÍCULAS

Los artículos destinados a la administración parenteral deben prepararse de una manera diseñada para excluir partículas, se-
gún se define en Partículas en Inyectables (788), y otras materias extrañas, según corresponda para la forma farmacéutica. Cada
envase final de todas las preparaciones parenterales debe inspeccionarse en la medida de lo posible para detectar la presencia
de materia extraña y partículas observables (de ahora en adelante denominadas "partículas visibles") en su contenido. El pro-
ceso de inspección debe estar diseñado y calificado para asegurar que todos los lotes de todas las preparaciones parenterales
estén prácticamente exentos de partículas visibles. La calificación del proceso de inspección debe realizarse en referencia a las
partículas en el rango visible de un tipo que puede surgir del proceso de fabricación o llenado. Debe desecharse todo envase
cuyo contenido presente indicios de partículas visibles. La inspección para detectar partículas visibles puede realizarse cuando
se lleva a cabo la inspección para detectar otros defectos críticos, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuan-
do se caracteriza el aspecto de un producto liofilizado.
Cuando la naturaleza del contenido o el sistema de cierre del envase permite solamente una inspección limitada del conteni-
do total, la inspección del 100% de un lote debe completarse con la inspección de contenidos reconstituidos (p.ej., secos) o
contenidos extraídos (p.ej., de un envase ámbar oscuro) de una muestra de envases del lote.
Todas las Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis y las Inyecciones de pequeño volumen están sujetas a los
procedimientos microscópicos o de oscurecimiento de luz y a los límites de partículas subvisibles especificados en Partículas en
Inyectables (788), a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Un artículo envasado como Inyec-
ción, ya sea de gran volumen o de pequeño volumen, cumple con los requisitos expuestos para Inyecciones de pequeño volu-
men cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos, si la monografía individual incluye una prueba para
Partículas en Inyectables (788); cumple con los requisitos expuestos en Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis
cuando la etiqueta del envase indica que contiene más de 100 mL.

ESTERILIDAD

Pruebas de Esterilidad-Las preparaciones para inyección cumplen con los requisitos en Pruebas de Esterilidad (71 ).

SOLUCIONES RECONSTITUIDAS

Los sólidos secos cuyas soluciones reconstituidas se preparan para inyección llevan títulos de la forma [FÁRMACO] para Inyec-
ción. Ya que estas formas farmacéuticas se reconstituyen en el momento en el que las usará el profesional de salud intervinien-
te, no se incluyen las pruebas y normas para la solución reconstituida para su administración en las monografías individuales
para sólidos secos o líquidos concentrados estériles. Sin embargo, a los efectos de garantizar la calidad de las preparaciones
inyectables en el momento de ser administradas, se proporcionan las siguientes pruebas no destructivas para demostrar la apti-
tud de las soluciones reconstituidas cuando se preparan inmediatamente antes de usar.
Totalidad y Transparencia de la Solución-Reconstituir la solución según se indica en el etiquetado suministrado por el
fabricante para la forma farmacéutica seca estéril.
A: El sólido se disuelve completamente, sin dejar ningún residuo visible como materia no disuelta.
B: La solución reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua
Purificada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar.
Partículas-Reconstituir la solución según se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante para la forma farmacéu-
tica seca estéril: la solución está esencialmente libre de partículas extrañas que se puedan observar en una inspección visual.

(2) MEDICAMENTOS ORALES-PRUEBAS DE CALIDAD DE

PRODUCTOS

INTRODUCCIÓN

La administración oral es la vía de administración más común para medicamentos. Todos los medicamentos orales conllevan
a la acción local y/o sistémica en la cavidad oral y/o en el tracto gastrointestinal. Los medicamentos orales se dividen en dos
categorías principales: sólidos y líquidos. Los medicamentos orales sólidos incluyen, entre otros, cápsulas, tabletas, gránulos y
polvos. De manera similar, los medicamentos orales líquidos incluyen, entre otros, soluciones, suspensiones y emulsiones. Las
definiciones y descripciones de estas formas farmacéuticas, así como información abreviada sobre su composición y procesos
de fabricación se encuentran en el capítulo Formas Famacéuticas (1151 ). 1

1 [NOTA-Todas las referencias a los capítulos a partir del 10001 son únicamente para propósitos informativos y para su uso como recurso útil. Estos capítulos no
son obligatorios a menos que su aplicación se indique explícitamente.]
40 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales USP 37

El presente capítulo general í2) se centra en las pruebas de calidad de productos que generalmente son necesarias para me-
dicamentos orales para una sola molécula o una combinación de moléculas pequeñas de ingredientes activos. Este capítulo no
contempla los productos biológicos en formas farmacéulic.a~ ~ólidas. En este capitulo, los terminos "tármaco" e "ingrediente
activo" se usan de manera intercambiable. El contenido de este capítulo no necesariamente se aplica a medicamentos destina-
dos para un uso distinto a la administración oral. Por ejemplo, el capítulo no trata las formas farmacéuticas oromucosas. Algu-
nas de las pruebas indicadas en este capítulo se pueden llevar a cabo durante el proceso u omitirse como pruebas de rutina
basándose en la validación del proceso. Sin embargo, una vez que el producto esté en el mercado, éste debe cumplir con los
requisitos farmacopeicos de la USP al momento del muestreo y análisis.
El capítulo (2) provee un marco de sustento para nuevas monografías individuales; éstas se consideran documentos de
"avance" y no pretenden apartarse de las monografías individuales (no reemplazan a las monografías individuales). Además, el
capítulo (2) provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes y consolidadas de manera coherente y
concisa. Cuando exista una monografía, ésta contendrá todas las pruebas requeridas para la forma farmacéutica. Cuando no
exista la monografía de un medicamento específico, el capítulo general proveerá las pruebas de calidad específicas disponibles
corno recurso para los fabricantes hasta que la USP desarrolle las monografías particulares requeridas para la forma farmacéuti-
ca. Cuando esté disponible un procedimiento de prueba validado para el medicamento específico, éste se identifica en un ca-
pítulo general con un número inferior a (l 000). Para aquéllos casos en los que no sea posible recomendar un procedimiento
validado pero se cuente con información para la prueba de calidad y/o de desempeño del producto, dicha información estará
descrita en un capítulo informativo con un número superior a (l 000).

Pruebas de Calidad y de Desempeño de Medicamentos

Las pruebas, los procedimientos analíticos y los criterios de aceptación de una monografía para medicamentos orales se divi-
den en dos categorías: (1) aquéllas que evalúan los atributos generales de calidad del producto y (2) aquéllas que evalúan el
desempeño del producto, el cual es un atributo específico de calidad generalmente vinculado a los estudios de biodisponibili-
dad y de bioequivalencia (ver el capítulo Evaluación de Desempeño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia
y Disolución (l 090)). 1 Las pruebas de calidad del medicamento pretenden evaluar atributos tales como identificación, conteni-
do (valoración), impurezas (pruebas universales), uniformidad del contenido de la dosis, pH, llenado mínimo, contenido de
alcohol, contenido volátil y contenido microbiano (pruebas específicas). Las pruebas de desempeño de medicamentos están
diseñadas para evaluar la liberación de fármacos in vitro a partir de las formas farmacéuticas, p.ej., Disolución (711) y Liberación
de Fármacos (724). Para medicamentos orales líquidos en solución, el desempeño se considera óptimo, por lo que no se inclu-
ye una prueba de desempeño en la monografía.
Cada uno de estos atributos es importante para adquirir un entendimiento primario de la calidad y desempeño de un medi-
camento. Por ende, constituyen los cimientos para la monografía. Un producto oficial debe cumplir con todas las pruebas de
calidad de medicamentos y las pruebas de desempeño de medicamentos incluidas en su monografía correspondiente.
[NOTA-Las pruebas de disolución, específicamente la similitud del perfil de disolución entre contenidos mayores y conteni-
dos menores de un producto de un fabricante dado y el perfil de similitud entre el producto genérico y el producto de referen-
cia, se emplean para el otorgamiento de bioexenciones. Ver el capítulo (1090). 1]

PRUEBAS DE CALIDAD DE PRODUCTOS PARA MEDICAMENTOS ORALES

Las pruebas de calidad para medicamentos orales se dividen en dos categorías: (1) pruebas universales que se aplican a to-
dos los medicamentos orales y que se deben incluir en la monografía, y (2) pru~bas específicas cuya inclusión debe considerar-
se para tipos específicos de productos orales.

PRUEBAS UNIVERSALES

Los atributos de calidad del producto para formas farmacéuticas orales son importantes para asegurar que los productos co-
mercializados cumplan con los requisitos mínimos de calidad. Las pruebas universales deben aplicarse a todas las formas far-
macéuticas orales y deben incluir Descripción, Identificación, Contenido (prueba de valoración) e Impurezas (orgánicas, inorgáni-
cas y disolventes residuales).

DESCRIPCIÓN

La descripción tiene un carácter general y no constituye una norma por sí misma. Ésta comunica la aparición de un artículo
que cumple con los estándares de la monografía.
 USP 37 Requisitos Generales / (2> Medicamentos Orales 41

IDENTIFICACIÓN

La prueba de identificación se define en las Advertencias y Requ1S1tos Generales, 5.40 y se incluye en una monografía pdrd
ayudar a confirmar que el artículo contiene el fármaco declarado en la etiqueta mediante una identificación positiva del fárma-
co o de las sustancias en un medicamento.
Un método para confirmar la identidad consiste en comparar el tiempo de retención de la muestra con el obtenido en in-
yecciones estándar en un procedimiento cromatográfico de valoración. Otros métodos que a menudo se usan para confirmar
ortogonalmente la identidad del ingrediente activo son: Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada (201 ), Prue-
bas de Identificación Espectrofotométrica (197), Resonancia Magnética Nuclear (761 ), Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano
(1119) 1 y Espectroscopía Raman (1120), 1 entre otros. El procedimiento analítico debe ser capaz de distinguir entre el ingredien-
te activo y todos los excipientes que están presentes o de los productos de degradación potenciales que pudieran estar presen-
tes. Se debe tener cuidado de asegurar que el sistema cromatográfico separa el artículo de otros fármacos, impurezas y aditi-
vos estrechamente relacionados. La absorción en el infrarrojo y en el ultravioleta también se pueden usar para la identificación
(ver el capítulo (197)), cuando se haya demostrado que el procedimiento es selectivo para el fármaco mediante un estudio de
validación o verificación apropiado. Los resultados de la prueba de identificación deben compararse con los resultados obteni-
dos de un estándar de referencia adecuado preparado de manera similar.

VALORACIÓN

La valoración es una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar la potencia (contenido) del medica-
mento. Cuando se justifica una valoración no específica (p.ej., volumetría), se debe asegurar mediante otros procedimientos
analíticos de sustento la capacidad de detectar cualquier especie interferente. En general, la aceptación a priori de una varia-
ción de ±10% en los límites de un atributo de calidad (p.ej., valoración) a partir de la cantidad declarada esperada (100%) en
la mayoría de los casos pretende tomar en cuenta la variabilidad de la fabricación y la estabilidad durante la vida útil, y se basa
principalmente en la noción de que tal variación en un atributo de calidad tiene una menor probabilidad de ocasionar un im-
pacto adverso perceptible en el resultado clínico deseado. Los criterios de aceptación de 95,0%-105,0% se usan con justifica-
ción (p.ej., para medicamentos con un índice terapéutico estrecho). También se aceptan las valoraciones de actividad y las
valoraciones de contenido absoluto siempre que se justifique.

IMPUREZAS

El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproduc-
tos sintéticos y otras impurezas inorgánicas y orgánicas. Los límites de dichas impurezas están indicados en las monografías del
fármaco y de los excipientes. Existe la posibilidad de que ocurra degradación durante la fabricación del producto y durante su
vida útil, la cual, entre otros factores, puede resultar de la degradación del fármaco o de interacciones entre el fármaco y los
excipientes. Los procedimientos y criterios de aceptación deben limitar específicamente los materiales tóxicos. Ver los requisi-
tos específicos en las Advertencias Generales de la USP, 5.60 Impurezas y Sustancias Extrañas. [NOTA-Para información adicio-
nal, consultar el capítulo Impurezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos (1 086). 1]

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA TABLETAS

Además de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para table-
tas, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación.

CONTENIDO VOLÁTIL

La prueba y el método específico dependen de la naturaleza del artículo. Se debe tener consideración especial a las formas
farmacéuticas cuyo contenido de agua pudiera ser un potencial atributo de calidad y a los productos en los que se emplean
disolventes para la fabricación del medicamento.
Cuando la presencia de humedad u otro material volátil pueda tornarse crítica, los analistas deben determinar la cantidad de
disolventes volátiles no unidos o de materia volátil de cualquier tipo separado mediante Pérdida por Secado (731) u otra técnica
adecuada (p.ej., actividad del agua). Para sustancias que parecen contener agua como el único componente volátil, el procedi-
miento provisto en el capítulo Determinación de Agua (921) puede ser apropiado. Para los medicamentos, los analistas también
deben consultar el capítulo Disolventes Residuales (467).

DESINTEGRACIÓN

La desintegración es un atributo esencial de los sólidos orales, excepto para aquéllos destinados a ser masticados antes de
tragarlos y para los productos de liberación retardada o prolongada. Esta prueba mide el tiempo que tarda en desintegrarse la
unidad de dosificación en un medio acuoso y se describe en detalle en el capítulo (701 ). Para algunas formas farmacéuticas,
 1

42 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales USP 37

p.ej., tabletas efervescentes, tabletas de desintegración, tabletas solubles, entre otros, la Farmacopea Europea describe en gran
detalle la prueba de desintegración. La prueba de desintegración para algunas de las formas farmacéuticas de este capítulo se
incluye para proveer información de integridad. Para información sobre procedimientos detallados, consultar el capítulo (701)
o la Farmacopea Europea. Siempre que se incluye, la prueba de desintegración se usa únicamente como una prueba de control
de calidad y no como una prueba de desempeño del producto, y debe cumplir con las especificaciones de la monografía. Una
prueba de desintegración podrá usarse como una prueba de desempeño del producto únicamente cuando la desintegración
se haya correlacionado con la disolución de una forma farmacéutica (Pauta Q6A de la ICH, disponible en www.ich.org). Para
todos los demás casos, se deberá considerar una prueba de disolución como una prueba de desempeño del producto.

fRIABILIDAD DE LAS TABLETAS

El procedimiento de prueba se aplica a la mayoría de las tabletas comprimidas sin cubierta. La friabilidad determina la capa-
cidad de las tabletas para soportar las tensiones mecánicas y su resistencia a la formación de astillas y a la abrasión en la super-
ficie. [NOTA-Para información adicional, consultar el capítulo Friabilidad de las Tabletas (1216).1]

FUERZA DE RUPTURA DE LAS TABLETAS

La fuerza de ruptura de las tabletas mide la integridad mecánica de las tabletas, que es la fuerza requerida para provocar que
fallen (es decir, que se rompan) en un plano específico. [NOTA-Para información adicional, ver el capítulo Fuerza de Ruptura de
las Tabletas (1217). 1]

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

La uniformidad de unidades de dosificación debe demostrarse mediante uniformidad de contenido o variación de peso. La
uniformidad de contenido se basa en la valoración del contenido individual de fármacos en un número de unidades de dosifi-
cación para determinar si los contenidos individuales son lo suficientemente cercanos a la cantidad declarada. La variación de
peso se puede usar como alternativa para estimar la uniformidad del contenido ante ciertas condiciones (ver el capítulo Unifor-
midad de Unidades de Dosificación (905)).

TABLETAS SIN CUBIERTA

Las tabletas sin cubierta incluyen tabletas de una sola capa que resultan de una sola compresión de partículas y tabletas de
capas múltiples que constan de capas concéntricas o paralelas obtenidas mediante compresión sucesiva de partículas de com-
posición diferente. Los excipientes usados generalmente no tienen el propósito específico de modificar la liberación del fárma-
co en los fluidos digestivos. Las tabletas sin cubierta incluyen, entre otras, las siguientes: tabletas efervescentes, tabletas buca-
les, tabletas sublinguales, tabletas masticables, tabletas de desintegración, tabletas de desintegración oral, bolos, tabletas solu-
bles, tabletas para solución oral y tabletas para suspensión oral. Los bolos, que son tabletas grandes y alargadas destinadas
para administrarse en animales, deben considerarse tabletas sin cubierta y deben cumplir con los requisitos de calidad del pro-
ducto. Para las tabletas sin cubierta, la desintegración debe analizarse según lo indicado en el capítulo (701 ).
TABLETAS BUCALES, SUBLINGUALES Y DE DESINTEGRACIÓN ORAL (DE DISPERSIÓN ORAL)
Estas formas farmacéuticas se estudiarán en el nuevo capítulo Medicamentos para Mucosas-Pruebas de Calidad de Productos
(4), el cual se publicará en un futuro. Se citan en este capítulo sólo para propósitos informativos y para proveer información
completa.
TABLETAS MASTICABLES
Las tabletas masticables no requieren cumplir con la prueba de desintegración. Las tabletas masticables (intactas) deben so-
meterse a la prueba de disolución, como una prueba de desempeño del producto (cuando se cite en la monografía), debido a
que podrían ser tragadas por un paciente sin haberlas masticado apropiadamente. En general, las condiciones de la prueba de
disolución para tabletas masticables deben ser las mismas que para las tabletas no masticables de la misma fracción o ingre-
diente activo.
TABLETAS DE DESINTEGRACIÓN O DE DISPERSIÓN
Se trata de tabletas destinadas para ser dispersadas en agua antes de su administración para proporcionar una dispersión
homogénea.
Finura de la dispersión: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una
dispersión sin grumos que pasa a través de un tamiz Nº 25 (71 O µm).
TABLETAS PARA SOLUCIÓN ORAL Y TABLETAS PARA SUSPENSIÓN ORAL
Finura de la dispersión: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una
dispersión sin grumos que pasa a través de un tamiz Nº 25 (71 O µm).
 USP 37 Requisitos Generales/ (2) Medicamentos Orales 43

TABLETAS RECUBIERTAS

Las tabletas recubiertas son tabletas cubiertas con una o más capas de mezclas de varias sustancias tales como resinas sintéti-
cas o naturales, gomas, gelatinas, diluyentes inactivos e insolubles, azúcares, plastificantes, polioles, ceras, materia colorante
autorizada por la autoridad competente y, en ocasiones, sustancias saborizantes y sustancias activas. Las tabletas recubiertas
con azúcar o película incluyen, entre otras: tabletas con cubierta simple, tabletas de liberación prolongada y tabletas de libera-
ción retardada. Cuando sea aplicable, se debe realizar una prueba de desintegración según lo descrito en el capítulo (701 ).
No existen pruebas de calidad adicionales específicas para tabletas de liberación prolongada ni para tabletas de liberación
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA CÁPSULAS

Además de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para cáp-
sulas, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación.
Las pruebas de calidad del producto que se consideran específicas al tipo de cápsula incluyen aquéllas para contenido volátil
(capítulos (731) y (921 )). Las cápsulas de una pieza a menudo se usan para administrar un fármaco como solución o suspen-
sión. Las cápsulas de dos piezas constan de dos piezas telescópicas de tapa y cuerpo de diversos tamaños estándar y se usan
para administrar material sólido como polvo, gránulos o tabletas pequeñas. Las cápsulas de liberación modificada incluyen,
entre otras: cápsulas de liberación retardada y cápsulas de liberación prolongada.
Desintegración: Proceder según se indica en el capítulo (701 ), Cápsulas de Gelatina Blanda para cápsulas de una pieza y Cáp-
sulas de Gelatina Dura para cápsulas de dos piezas. La desintegración para cápsulas de liberación modificada se describe en
sumo detalle en la Farmacopea Europea.
No existen pruebas de calidad adicionales específicas para cápsulas de liberación prolongada ni para cápsulas de liberación
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA GRÁNULOS

Además de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para grá-
nulos, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación.
Los gránulos son formas farmacéuticas sólidas que están compuestas de aglomeraciones de partículas más pequeñas. Los
gránulos incluyen, entre otros: gránulos efervescentes, gránulos recubiertos, gránulos de liberación prolongada y gránulos de
liberación retardada.
Las pruebas que se consideran específicas para el tipo de gránulos incluyen contenido volátil (capítulos (731) y (921 )). La
desintegración para gránulos efervescentes se describe en sumo detalle en la Farmacopea Europea. Basándose en la naturaleza
del artículo y en criterios científicos, podrían ser aplicables pruebas adicionales, incluida la finura de polvos, entre otras.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA POLVOS

Los polvos orales deben indicar lo siguiente: "Sólo para Uso Oral". Las pruebas que se consideran específicas para el tipo de
polvo incluyen: Llenado Mínimo (755) y contenido volátil (capítulos (731) y (921 )).
El capítulo Llenado Mínimo (755) presenta especificaciones aplicables a los polvos orales.
Basándose en la naturaleza del artículo y en criterios científicos, podrían ser aplicables pruebas adicionales, incluidos el pH en
soluciones acuosas, la finura de polvos, los límites microbanos, entre otros.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA LÍQUIDOS

Las pruebas de calidad del producto recomendadas para un medicamento líquido incluyen las pruebas universales descritas
anteriormente y las pruebas específicas incluidas más adelante. La mayoría de las pruebas de calidad para líquidos requieren la
evaluación de productos monodosis para estimar el atributo de calidad. Las instrucciones específicas para realizar las pruebas
de calidad para productos monodosis o multidosis se proveen en la monografía o en el capítulo general. Por ejemplo, la varia-
ción de peso se puede usar cuando se controla adecuadamente la aptitud de mezclado para las sustancias activas y los exci-
pientes en la mezcla para asegurar su distribución uniforme, como en el caso de las soluciones.

VOLUMEN DE ENTREGA

Cuando la formulación líquida se envasa en un envase multidosis, se debe cumplir con el capítulo Volumen de Entrega (698).
 44 (2) Medicamentos Orales / Requisitos Generales USP 37

DETERMINACIÓN DE ALCOHOL

Si la formulación líquida contiene una cantidad de alcohol, se debe incluir el capítulo Determinación de Alcohol (611 ). Los
límites pueden ser una concentración absoluta, en porcentaje, o relativos a un contenido declarado.

PH

Los productos orales líquidos generalmente son formulaciones acuosas que son susceptibles a cambios en el pH derivados de
la exposición al C0 2 atmosférico. El ingreso de C0 2 atmosférico y el cambio en el pH de los productos orales líquidos única-
mente es relevante para los productos acuosos. Aunque es menos crítico que para las preparaciones oftálmicas, el pH de una
formulación líquida puede afectar el sabor y la estabilidad. El intervalo de pH conforme a lo descrito en el capítulo pH (791) se
indica en la monografía.

CONTENIDO MICROBIANO

La presencia de ciertos microorganismos en preparaciones no estériles tiene el potencial de reducir o incluso inactivar la acti-
vidad terapéutica del producto, y tiene el potencial de afectar adversamente la salud del paciente. Algunos productos orales
líquidos pueden estar sujetos a un control microbiológico extremo, mientras que otros no requieren control alguno. La necesi-
dad de especificaciones microbianas para un producto oral líquido dado depende de su formulación y uso y se indica en la
monografía.
[NOTA-Para información adicional, ver el capítulo Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación pa-
ra Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111 ). 1 ]

ANTIOXIDANTE

Se debe realizar una prueba de liberación. La prueba para vida útil podría no ser necesaria cuando los datos de desarrollo y
estabilidad así lo justifiquen (Pauta Q6A de la ICH).

SUSTANCIAS EXTRAÍBLES

Cuando los datos de estabilidad y desarrollo no presentan evidencia significativa de productos extraíbles, se puede proponer
la eliminación de esta prueba. Cuando los datos demuestren la necesidad de criterios de aceptación para soluciones orales-
tapón de goma, recubrimiento interno de la tapa, frasco de plástico-se deben recopilar datos tan pronto como sea posible
durante el proceso de desarrollo (Pauta Q6A de la ICH).

TIPOS DE FORMAS FARMACÉUTICAS LÍQUIDAS

Las pruebas de calidad específicas para estas formas farmacéuticas se proveen en sus respectivas monografías.
SOLUCIONES ORALES Y POLVOS Y GRÁNULOS PARA SOLUCIÓN
Las pruebas para formulaciones "para Solución" se llevan a cabo en una solución bien mezclada del medicamento reconsti-
tuido según se indica en el etiquetado.
EMULSIONES, SUSPENSIONES Y POLVOS Y GRÁNULOS PARA SUSPENSIÓN
Las pruebas para formulaciones "para Suspensión" se llevan a cabo en una suspensión bien mezclada del medicamento re-
constituido según se indica en el etiquetado. Las pruebas de calidad del producto para suspensiones debe incluir al menos una
prueba de capacidad de suspensión.
POLVOS Y GRÁNULOS PARA JARABES Y POLVOS PARA GOTAS ORALES
Después de su disolución o suspensión, cumplen con los requisitos de la monografía para la forma farmacéutica final. El con-
tenido volátil (capítulos (731) y (921 )) puede ser una prueba de calidad adicional para polvos y gránulos para reconstitución.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA FORMAS FARMACÉUTICAS ORALES MISCELÁNEAS

PRODUCTOS ORALES LIOFILIZADOS

Determinación de Agua (921 ), Método Ja: Los productos orales liofilizados cumplen con la prueba. Los límites se aprueban
según lo indicado en la monografía específica.
 USP 37 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 45

(3) MEDICAMENTOS TÓPICOS Y TRANSDÉRMICOS-PRUEBAS DE

CALIDAD DEL PRODUCTO

INTRODUCCIÓN

Los medicamentos de aplicación tópica se dividen en dos categorías generales: medicamentos que se aplican para generar
una acción local y los que se aplican para conseguir efectos sistémicos después de su absorción a través de la piel en el torrente
sanguíneo. La acción localizada puede presentarse en la superficie del sitio de aplicación (p.ej., estrato córneo, epitelio ocular),
en los tejidos subyacentes (p.ej., epidermis y/o dermis) y en tejidos subcutáneos (p.ej., músculo o articulación).
Los medicamentos de aplicación tópica incluyen, entre otros, cremas, geles, ungüentos, pastas, suspensiones, lociones, es-
pumas, atomizadores, aerosoles, soluciones y sistemas transdérmicos de liberación de fármacos (STD, también conocidos co-
mo parches). Las definiciones y descripciones de estas formas farmacéuticas, así como una breve información sobre su compo-
sición y/o proceso de fabricación, se encuentran disponibles en el capítulo Formas Farmacéuticas (1151 ).
Los procedimientos y criterios de aceptación aceptables para analizar los medicamentos de aplicación tópica se pueden divi-
dir en dos clases: aquellos que evalúan los atributos generales de calidad del producto y aquellos que evalúan el desempeño
del producto. Los atributos de calidad del producto incluyen: descripción, identificación, valoración (contenido), impurezas,
propiedades fisicoquímicas, uniformidad de unidades de dosificación, contenido de agua, pH, viscosidad aparente, límites mi-
crobianos, contenido de conservantes antimicrobianos, contenido de antioxidantes, esterilidad, cuando corresponda, así como
otras pruebas específicas de cada producto. Las pruebas de desempeño del producto evalúan la liberación de fármacos y de-
más atributos que afectan la liberación de los fármacos de la forma farmacéutica terminada.
Aunque la mayoría de los productos de aplicación tópica son semisólidos, líquidos o suspensiones, los STD son dispositivos
que se aplican sobre la piel y varían en su composición y método de fabricación. Los STD liberan sus ingredientes activos me-
diante diversos mecanismos, los cuales pueden ser pasivos o activos. Este capítulo abarca únicamente las pruebas relacionadas
con STD pasivos.

PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA MEDICAMENTOS DE APLICACIÓN TÓPICA

Pruebas Universales

Las pruebas universales (ver Guía Q6A de la ICH-Specifications: Test Procedures and Acceptance Criterio for New Drug Substan-
ces and New Drug Products: Chemical Substances (Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para
Nuevos Fármacos y Nuevos Medicamentos: Sustancias Químicas), disponible en www.ich.org) se listan a continuación y se
aplican a todos los medicamentos de aplicación tópica.
Descripción: Se debe proporcionar una descripción cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptación deben incluir
el aspecto final aceptable de la forma farmacéutica terminada y del envase. El examen visual debe identificar los cambios de
color, migración adhesiva (es decir, flujo frío) para STD, separaciones, cristalización, entre otros, que sean específicos del medi-
camento. La descripción debe especificar el contenido o la cantidad declarada en la etiqueta del artículo. Esta última no es una
prueba farmacopeica, pero forma parte de la especificación del fabricante para el medicamento.
Identificación: Las pruebas de identificación se discuten en las Advertencias y Requisitos Generales, 5.40. Las pruebas de
identificación deben establecer la identidad del o los fármacos presentes en -el artículo y deben distinguir entre compuestos
con estructuras estrechamente relacionadas que pudieran estar presentes. Las pruebas de identidad deben ser específicas para
el o los fármacos (p.ej., espectroscopía en el infrarrojo). Los métodos de espectrofotometría en el Infrarrojo Cercano (NIR, por
sus siglas en inglés) o Raman también podrían ser aceptables para la identificación del producto farmacéutico (ver Espectrosco-
pía en el Infrarrojo Cercano (1119) y Espectroscopía Raman (1120)). La identificación mediante un tiempo de retención cromato-
gráfico único no es específica.
Valoración: Se debe usar una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar el contenido del medica-
mento. Para los casos en los que se justifica el uso de una valoración no específica, p.ej., Volumetría (541 )), se deben usar otros
procedimientos analíticos de respaldo para conseguir la especificidad general.
Impurezas: El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del medicamento pueden presentar impurezas del proce-
so, subproductos sintéticos, impurezas asociadas con el adhesivo (p.ej., monómeros residuales), disolventes residuales (ver Di-
solventes Residuales (467)), metales pesados (ver Metales Pesados (231 )), entre otras impurezas inorgánicas y orgánicas, las cua-
les deben ser evaluadas y controladas. Asimismo, se deben evaluar y controlar las impurezas producidas por la degradación del
fármaco, así como aquéllas producidas durante el proceso de fabricación del medicamento.

Pruebas Específicas

Además de las pruebas universales citadas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas específicas para cada
caso en particular.
 •
46 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales USP 37

Uniformidad de Unidades de Dosificación: Esta prueba se aplica a los STO y a las formas farmacéuticas en envases unita-
rios (ver Uniformidad de Unidades de Dosificación \905 ).
Contenido de Agua: Cuando resulte apropiado, se debe incluir una prueba de contenido de agua (ver Determinación de
Agua (921 )). Esta prueba por lo general depende de la formulación. Por lo tanto, no se incluye en la monografía oficial del
medicamento, pero forma parte de la especificación del fabricante para el producto.
Límites Microbiológicos: El examen microbiológico de productos farmacéuticos no estériles se realiza de conformidad
con los métodos provistos en los capítulos generale> Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Micro-
biano (61) y Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos (62), a menos que se haya
demostrado que la formulación posee por sí misma propiedades antimicrobianas. Los criterios de aceptación para medicamen-
tos no estériles basados en el recuento total de microorganismos aerobios (TAMC, por sus siglas en inglés) y en el recuento
total de hongos filamentosos y levaduras (TYMC, por sus siglas en inglés) se proporcionan en el capítulo Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111 ).
Contenido de Conservantes Antimicrobianos: Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de conser-
vantes antimicrobianos en productos multidosis. Dichos criterios deben basarse en los niveles de conservante antimicrobiano
necesarios para mantener la calidad microbiológica del producto durante todas las etapas de su uso y vida útil propuestos (ver
Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )).
Contenido de Antioxidantes: Si el medicamento contiene antioxidantes, se deben establecer pruebas para determinar su
contenido, a menos que se pueda detectar su degradación por oxidación empleando otro método de prueba, como por ejem-
plo, una prueba de impurezas. Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de antioxidantes. Dichos criterios
deben basarse en los niveles de antioxidante necesarios para mantener la estabilidad del producto durante todas las etapas de
su uso y vida útil propuestos.
Esterilidad: Dependiendo del uso de la forma farmacéutica (p.ej. preparaciones oftálmicas, productos que se aplicarán a
heridas abiertas o áreas con quemaduras), se deberá demostrar la esterilidad del producto según corresponda (ver Pruebas de
Esterilidad (71 )).
pH: Cuando corresponda, el pH de los medicamentos de aplicación tópica deberá analizarse al momento de liberar la par-
tida y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas. Algunos medicamentos de apli-
cación tópica contienen cantidades muy limitadas de agua o fase acuosa, por lo que no se requiere la medición de su pH.
Esta prueba por lo general depende de la formulación. Por lo tanto, no se incluye en la monografía oficial del medicamento,
pero forma parte de la especificación del fabricante para éste.
Tamaño de Partícula: Por lo general, la determinación y el control del tamaño de partícula de los fármacos activos en
medicamentos de aplicación tópica se llevan a cabo en la etapa de desarrollo de la formulación. No obstante, los medicamen-
tos de aplicación tópica deben ser examinados para detectar cualquier alteración del tamaño de partícula (es decir, apariencia
de las partículas, cambios de forma, tamaño, estado, hábito o agregación de las partículas) del fármaco que pudiera ocurrir
durante el procesamiento y almacenamiento del producto. Dichos exámenes se deben realizar al momento de la liberación de
la partida y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas, debido a que los cambios
visiblemente observables (macro y microscópicamente) podrían comprometer la integridad y/o el desempeño del medicamen-
to. Estos tipos de pruebas por lo general dependen de la formulación. Por tanto, no se incluyen en las monografías oficiales
pero forman parte de la especificación del fabricante para el medicamento.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA MEDICAMENTOS OFTÁLMICOS

Las formas farmacéuticas oftálmicas deben cumplir con los requisitos del cap_ítulo Pruebas de Esterilidad (71 ). Si los ingredien-
tes específicos usados en la formulación no son susceptibles a las técnicas de esterilización de rutina, se pueden usar ingredien-
tes que cumplan con los requisitos de esterilidad descritos en Pruebas de Esterilidad (71 ), junto con una fabricación aséptica.
Cada preparación oftálmica para usos múltiples debe contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para destruir o
impedir la proliferación de los microorganismos que se introducen accidentalmente cuando el envase se abre durante el uso
del producto (ver Sustancias Agregada en Ungüentos Oftálmicos (771 )), a menos que se indique algo distinto en la monografía
individual o a menos que la fórmula misma sea bacteriostática y/o el sistema de administración promueva la bacteriostasis. La
preparación oftálmica terminada debe estar exenta de partículas grandes y debe cumplir con los requisitos de Pérdida y Partí-
culas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (771 ). Los envases primarios para preparaciones oftálmicas deben ser estériles al mo-
mento de llenarlos y cerrarlos. Es obligatorio sellar los envases primarios para preparaciones oftálmicas con un cierre que evi-
dencie la alteración intencional para asegurar la esterilidad al momento del primer uso.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA MEDICAMENTOS SEMISÓLIDOS DE APLICACIÓN TÓPICA

Viscosidad Aparente
La viscosidad es una medida de la resistencia de la formulación al flujo, además de una evaluación de las propiedades reoló-
gicas de la forma farmacéutica (p.ej., formas farmacéuticas semisólidas). Debido a que únicamente los fluidos newtonianos po-
seen una viscosidad medible que no depende de la velocidad de cizallamiento, las formas farmacéuticas semisólidas que no
son newtonianas presentan una vicosidad aparente.
 USP 37 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 47

La viscosidad aparente de los medicamentos semisólidos se debe analizar al momento de la liberación de la partida e, inicial-
mente, en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para establecer las especificaciones para el monitoreo entre par-
tidas y de vida útil. Se deben desarrollar procedimientos de mediciór1 de acuerdo a lo indicado en Viscosidad 1911 ;. Para ~emi­
sólidos tixotrópicos y/o que presentan cambios irreversibles en la viscosidad después del cizallamiento, se debe prestar especial
atención a los procedimientos de preparación de la muestra para minimizar la variabilidad en las mediciones de viscocidad
aparente ocasionadas por el historial variable de cizallamiento (p.ej., velocidad y temperatura de mezclado, operación de llena-
do, manipulación de las muestras). Además, en el caso de algunos productos, puede ser necesario contar con especificaciones
de viscosidad aparente para más de un conjunto de condiciones (p.ej., etapa de proceso a granel, producto final envasado,
velocidades altas y bajas de cizallamiento, diferentes temperaturas).
Se deben establecer especificaciones de viscosidad aparente, basadas en datos obtenidos durante el desarrollo del producto
y el análisis de la vida útil, para la liberación de la partida y durante toda la vida útil propuesta.
La prueba de viscosidad aparente depende de la formulación y/o del proceso. Por lo tanto, no se incluye en la monografía
oficial del medicamento, pero forma parte de la especificación del fabricante para el medicamento. Asimismo, las especificacio-
nes de viscosidad aparente para formas farmacéuticas semisólidas pueden variar al momento de la liberación de la partida y
durante la prueba de estabilidad. Aunque la viscosidad aparente del medicamento terminado al momento de la liberación de
la partida debe cumplir con las especificaciones de desarrollo del mismo, para la prueba de estabilidad, las especificaciones de
viscosidad aparente para el medicamento deben basarse en la evaluación estadística del producto durante su vida útil.

Uniformidad en los Envases

Los medicamentos semisólidos de aplicación tópica pueden presentar una separación física durante los procesos de fabrica-
ción y durante la vida útil. Para asegurar la integridad del medicamento, es fundamental evaluar la uniformidad del producto
terminado al momento de la liberación de la partida y durante la vida útil.

PRODUCTOS ENVASADOS EN TUBOS

La uniformidad de contenido dentro de los tubos puede evaluarse de la siguiente manera.

Retirar o cortar con cuidado el sello de la parte inferior del tubo y realizar un corte vertical desde la parte inferior hasta la
parte superior del tubo. Cortar con cuidado alrededor del borde superior del tubo, abrir las dos solapas y sujetarlas de modo
que el producto quede expuesto.
Inspeccionar el producto visualmente para determinar si hay separación de fases, cambios en la apariencia física y la textura,
así como otras propiedades descritas en la prueba de Descripción. Si no se observa separación de las fases o cambios en la apa-
riencia física y la textura, y si el producto cumple con los criterios de aceptación de Descripción proceder según se indica más
adelante. Si el producto presenta una separación de fases y/o cambios en la apariencia física o la textura, el producto no cum-
ple con la prueba de uniformidad de contenido del tubo.
Los procedimientos descritos a continuación se pueden modificar dependiendo de la sensibilidad del procedimiento cuanti-
tativo usado para valorar los fármacos presentes en la fórmula.
Para Productos Multidosis Que Contienen 5 g o Más:
Procedimiento 7-
1. Después de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de las partes superior, me-
dia e inferior de un solo tubo. Las muestras deben tener un tamaño suficiente para llevar a cabo al menos una determina-
ción mediante valoración de los ingredientes activos. Llevar a cabo la valoración de los ingredientes activos en cada por-
ción del producto y evaluar los resultados de prueba usando los CriteriÓs de Aceptación A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptación A, analizar 3 tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptación B.
Procedimiento 2-
1. Después de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de las partes superior, me-
dia e inferior de dos tubos. Las muestras deben tener un tamaño suficiente para llevar a cabo al menos una determinación
mediante valoración de los ingredientes activos. Llevar a cabo la valoración de los ingredientes activos en cada porción de
los tubos y evaluar los resultados de prueba usando los Criterios de Aceptación A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de Aceptación A, analizar 2 tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de Aceptación B.
Para Productos Multidosis Que Contienen Menos de 5 g de Producto:
1. Analizar las porciones superior e inferior de 2 tubos usando el Procedimiento 7 o el Procedimiento 2 descritos anteriormen-
te. Evaluar los resultados usando los Criterios de Aceptación A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de Aceptación A, analizar 2 tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
procedimiento 1 descrito anteriormente y evaluar los 8 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptación
B.
Criterios de Aceptación para la Prueba de Uniformidad de Contenido del Tubo (Envase): Al determinar la desviación
estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) de múltiples tubos, determinar primero la varianza a partir de las tres medicio-
nes de cada tubo y del promedio entre todos los tubos. La RSD se calcula usando esta varianza promedio.
 48 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales USP 37

Criterios de Aceptación A-Todos los resultados de la valoración están dentro del intervalo de 90%-110% de la cantidad
declarada del producto y la RSD es no más de 6% o lo indicado en las especificaciones del producto o en la monografía oficial.
Si la RSD es mayor de 6%, usar los Criterios de aceptación B.
Criterios de aceptación 8-Ningún resultado de la valoración está fuera del intervalo de 90%-110% de la cantidad declarada
del producto y la RSD de los 12 resultados es no más de 6% o lo indicado en las especificaciones del producto o en la mono-
grafía oficial.

PRODUCTOS ENVASADOS EN ENVASES DIFERENTES A LOS TUBOS

Para los productos semisólidos que se envasan en envases diferentes a los tubos, para los que no se pueda usar el método de
muestreo anteriormente presentado, se pueden aceptar otros métodos como el descrito más adelante para un tarro.
1 . Seleccionar una jeringa adecuada cuya longitud sea suficiente para alcanzar el fondo del recipiente.
2. Retirar y colocar aparte el émbolo de la jeringa, y cortar la parte inferior del cuerpo de la jeringa. El muestreo se debe
llevar a cabo desde un punto a la izquierda/derecha de una línea media de la superficie del tarro a fin de conservar una
región intacta en el otro costado para cualquier investigación adicional (Ver la Figura 7).

PARTE SUPERIOR

PARTE MEDIA

PARTE INFERIOR

Figura 1. Muestreo de un tarro.

3. Presionar lentamente el cuerpo de la jeringa hacia el interior del envase hasta alcanzar el fondo. Luego, hacer girar el cuer-
po de la jeringa que contiene el núcleo de la muestra y retirar la jeringa del envase.
4. Insertar el émbolo de la jeringa en el cuerpo y extrudir cuidadosamente el núcleo de la muestra sobre una superficie lim-
pia en tres porciones iguales que representen a las partes superior, media e inferior del envase.
5. Retirar una muestra apropiada, que sea representativa de la porción media de las partes superior, media e inferior de las
muestras del envase, y analizar de acuerdo con las instrucciones citadas en Productos Envasados en Tubos.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA SISTEMAS TRANSDÉRMICOS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS

LOS STD o parches se formulan con una capa de adhesivo para asegurar el contacto íntimo con la piel y para permitir la
administración de la dosis deseada de fármaco. El adhesivo de los STD debe permitir el fácil desprendimiento de la capa pro-
tectora antes de su uso, se debe adherir adecuadamente a la piel humana durante la aplicación, debe mantener su adhesión a
la piel durante el periodo de uso prescrito y debe permitir el fácil retiro del STD al final de su uso sin dejar residuo u ocasionar
daños a la piel u otros efectos indeseados. Asimismo, los adhesivos deben ser capaces de mantener el desempeño del STD
durante toda la vida útil del medicamento.
Por lo general, se emplean tres tipos de pruebas de desprendimiento para STD: prueba de desprendimiento (a partir de un
sustrato estándar), prueba de desprendimiento de la capa protectora y prueba de adherencia.
Los criterios de aceptación son específicos para cada producto y se definen para asegurar que las propiedades de adhesión
de cada partida de STD estén dentro del intervalo definido por el diseño del producto y que sean uniformes entre partidas
basándose en las especificaciones de desarrollo del producto o en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto
durante la vida útil del mismo.

Prueba de Desprendimiento

Esta prueba mide la fuerza requerida para retirar (desprender) un STD adherido a una superficie de un sustrato estándar
(p.ej., acero inoxidable pulido). El STO se aplica al sustrato usando las técnicas especificadas para aplicación y se acondiciona a
una temperatura y tiempo específicos. Luego, el STD se desprende del sustrato con un instrumento que permite controlar el
ángulo de desprendimiento (p.ej., 90 ó 180 grados) y la velocidad de desprendimiento (p.ej., 300 mm/minuto), mientras se
registra la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El
producto no cumple con la prueba si la fuerza promedio de desprendimiento está fuera del intervalo aceptable determinado
 USP 37 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 49

durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida
útil del mismo.

Prueba de Desprendimiento de la Capa Protectora

Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la capa protectora de la capa adhesiva del STD. La prueba se lleva a cabo
con una muestra de producto terminado. La muestra de prueba se acondiciona usando procedimientos específicos (tempera-
tura y tiempo). Luego, la capa protectora se desprende del STD con un instrumento que permite controlar el ángulo de des-
prendimiento (p.ej., 90 ó 180 grados) y la velocidad de desprendimiento, mientras se registra la fuerza de desprendimiento.
Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si la
fuerza promedio de desprendimiento está fuera del intervalo aceptable determinado durante el desarrollo del producto y/o
basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.

Prueba de Adherencia

Se han desarrollado diversos métodos para analizar la adherencia, los cuales incluyen, por ejemplo, el método de adherencia
a sonda y el método de bola rodante. Queda a criterio del fabricante de STD decidir qué método es el más adecuado para
cada producto farmacéutico.

MÉTODO DE ADHERENCIA A SONDA

Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la punta de la sonda de prueba de la capa adhesiva del STO. Esta prueba
emplea un instrumento diseñado para crear una unión entre la punta de una sonda de prueba de acero inoxidable con una
geometría definida y el STD, usando una fuerza controlada (ligera presión) y condiciones de prueba específicas (es decir, velo-
cidad, tiempo de contacto, presión de contacto, temperatura). Luego, mientras se controla la velocidad de desprendimiento
de la sonda, la prueba mide el perfil de la fuerza requerida para separar la punta de la sonda del STD y la fuerza máxima reque-
rida para romper la unión (adherencia). Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El
producto no cumple con la prueba si el resultado de prueba promedio (perfiles de fuerza y/o adherencia) está fuera del inter-
valo aceptable determinado durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de
producto durante la vida útil del mismo.

MÉTODO DE BOLA RODANTE

Esta prueba mide la distancia recorrida por una bola definida sobre la capa de adhesivo del STO usando condiciones defini-
das y parámetros que dependen de las propiedades adherentes de la capa de adhesivo. Esta prueba emplea una configuración
diseñada para rodar una bola (de material, peso, tamaño y superficie definidos) desde una rampa (con un ángulo y longitud
definidas) sobre la capa de adhesivo (con orientación definida) en condiciones de prueba específicas (temperatura) (ver la
ASTM 03121 para más detalles). La distancia recorrida por la bola sobre la capa de adhesivo se mide usando un dispositivo de
medición adecuado. Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto no cum-
ple con la prueba si la distancia promedio recorrida está fuera del intervalo aceptable determinado durante el desarrollo del
producto y/o basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.

Prueba de Fugas

Esta prueba se aplica únicamente a STD de tipo moldeado-llenado-sellado (en reservorios o bolsas). El STD de tipo moldea-
do-llenado-sellado se debe fabricar manteniendo un enfoque de cero tolerancia para fugas, debido al potencial de pérdida de
dosis ante la presencia de las mismas.
Es necesario implementar métodos de control durante el proceso para examinar los STD en búsqueda elementos que pudie-
ran ocasionar fugas, los cuales requieren un desarrollo importante por parte de los fabricantes de STO.

ANÁLISIS DURANTE EL PROCESO

Se debe examinar durante el proceso de fabricación la presencia de fugas o el potencial de fugas por perforación, cortadura
o sello defectuoso de un STO generado por fallas tales como burbujas de aire, salpicaduras del gel o mala alineación de la capa
posterior y de la capa protectora. A menos que se implemente una tecnología analítica automatizada de proceso, se debe lle-
var a cabo un análisis durante el proceso para identificar estos defectos usando los siguientes procedimientos de prueba:
Inspección Visual:
1. Examinar aleatoriamente un número específico de STD, el cual se define basándose en el tamaño de la partida.
2. Inspeccionar cada STD muestreado visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas.
3. El producto no cumple con la prueba si alguno de los STD examinados presenta una fuga.
50 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos /Requisitos Generales USP 37

Integridad del Sello:

Los sellos de los sistemas transdérmicos deben someterse a pruebas de estrés para asegurar que la presión aplicada no fuerce
la apertura del sello, lo cual generaría una fuga.
1. Examinar aleatoriamente un número específico de STO, el cual se define basándose en el tamaño de la partida.
2. Inspeccionar cada STO muestreado visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas.
3. Colocar cada STO sobre una superficie rígida y plana y colocar encima un peso de 1 3,6 kg. Dejar que el peso descanse
encima del STO durante 2 minutos. Una vez retirado el peso, inspeccionar visualmente el STO para detectar fugas.
4. El producto no cumple con la prueba si el número de STO que presentan fugas es mayor que el límite aceptable estableci-
do por el fabricante.
Prueba del Producto Envasado:
Los STO pueden presentar fugas después de haber sido envasados en sus envases primarios debido a la misma operación de
envasado o debido a la apertura del envase por parte del usuario. En consecuencia, los STO deben ser analizados para detectar
fugas después de su fabricación y de su envasado en el material de envasado primario.
1. Analizar aleatoriamente un número específico de STO, el cual se define basándose en el tamaño de partida, después de
colocarlos en su material de envasado primario.
2. Retirar los STO muestreados de su envase e inspeccionarlos visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas
3. Luego, limpiar cada STO muestreado uniformemente con un hisopo humedecido con un disolvente. Es necesario limpiar
tanto el lado posterior como el lado de la capa protectora del STO. Asimismo, se debe limpiar la superficie interna de la
bolsa. Luego, retirar el hisopo y valorar el contenido de fármaco.
4. El producto no cumple con la prueba si la cantidad total de fármaco del STO, y su bolsa correspondiente, excede el límite
aceptable establecido por el fabricante.

(11) ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP

Los Estándares de Referencia provistos por la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (Estándares de
Referencia USP o ER) son muestras bien caracterizadas de fármacos y alimentos específicos (fármacos, productos biológicos,
excipientes, suplementos dietéticos, ingredientes alimenticios, impurezas, productos de degradación, reactivos y estándares de
verificación de desempeño). Cuando los ER USP se aprueban como aptos para su uso como estándares de comparación en las
pruebas o valoraciones documentales (es decir, como componentes de las monografías) en la Farmacopea de los Estados Unidos
(USP) o en el Formulario Nacional (NF), también adquieren estatus oficial y reconocimiento legal en los Estados Unidos de Amé-
rica. Es responsibilidad del usuario evaluar la aptitud de los ER para su uso en otras aplicaciones. Los ER USP oficiales son los
estándares primarios en jurisdicciones que los reconocen como tales y, cuando corresponda, se calibran con respecto a mate-
riales de referencia internacionales tales como los provistos por la Organización Mundial de la Salud. Los ER USP no están desti-
nados para uso terapéutico. Los ER USP se ofrecen para propósitos de metrología legal y pueden ayudar a asegurar la compa-
rabilidad de los resultados y la trazabilidad a las unidades del Sistema Internacional de Unidades (SI) independientemente del
estado de certificación. Los ER USP son Materiales de Referencia conforme a lo definido en el Vocabulario Internacional de Me-
trología-Conceptos Básicos y Generales y Términos Asociados (VIM): 3ra edición, 2007.

TIPOS DE ESTÁNDARES DE REF.ERENCIA

Estándares de Referencia para Artículos USP o NF

Los Estándares de Referencia para los artículos oficiales en USP o NF se ofrecen como materiales puros o como mezclas de
sustancias químicas que constituyen un reflejo de los fármacos o excipientes correspondientes. El uso de estos materiales se
especifica en la monografía del artículo. Por lo general, estos materiales son necesarios para la Valoración y/o las pruebas de
Identificación. La evaluación de la aptitud de un ER USP para usos distintos a los especificados en una monografía es responsa-
bilidad del usuario. El valor de propiedad o el valor de cálculo del Estándar de Referencia se declara en la etiqueta y se debe
incluir en los cálculos usados en la monografía y en los capítulos generales aplicables. Para los Estándares de Referencia que no
cuentan con un valor de propiedad o un valor de cálculo declarado en la etiqueta o en la documentación adjunta, se debe
asumir que el Estándar de Referencia es 100,0% puro para las aplicaciones cuantitativas farmacopeicas.

Estándares de Referencia de Impurezas

Los Estándares de Referencia de impurezas pueden incluir lo siguiente:
• Impurezas orgánicas que pueden surgir durante los procesos de fabricación o durante la vida útil de un artículo y pueden
incluir materiales iniciales, productos intermedios, subproductos, reactivos, catalizadores y/o productos de degradación.
 USP 37 Requisitos Generales/ (11) Estándares de Referencia USP 51

• Impurezas inorgánicas que normalmente resultan de un proceso de síntesis y que pueden incluir reactivos, catalizadores,
metales pesados o sales inorgánicas
• Disolventes residuales que pueden ser líquidos orgánicos o inorgánico' r¡ue 'ie usan rara preparar solucione<> o <>11'ipensio-
nes durante la síntesis de un artículo
Los Estándares de Referencia de Impurezas pueden presentarse como materiales purificados de un solo componente o como
mezclas de más de una impureza. Otras opciones para controlar impurezas pueden incluir la presentación del artículo oficial
con un contenido de impurezas declarado, el uso de tiempos de retención y factores de respuesta cromatográfica relativos, o
la provisión de valores teóricos tales como las absortividades UV a longitudes de onda seleccionadas.
En ediciones anteriores de la farmacopea, las impurezas se designaban por sus nombres químicos. Para facilitar la búsqueda
y el orden en el índice, los nombres químicos de las impurezas se han reemplazado gradualmente por la denominación "ER
Compuesto Relacionado Y de X," donde X es el nombre del artículo oficial e Y es una letra secuencial del alfabeto. La designa-
ción de esta letra no concuerda necesariamente con los esquemas de denominación usados por otras farmacopeas. Asimismo,
los Estándares de Referencia de mezclas de impurezas se pueden designar según el uso al que están destinados, como por
ejemplo "ER Aptitud del Sistema de X". Los nombres converxionales y los nombres químicos se reproducen en el catálogo y
en la etiqueta del ER.

Materiales de Referencia Certificados

Los Materiales de Referencia Certificados de USP (MRC) son Estándares de Referencia que proporcionan valores de propieda-
des certificados con incertidumbres asociadas y trazabilidad metrológica, de conformidad con las Guías 30-35 de la lnternatio-
nal Organization for Standardization (ISO). El uso correcto de estos MRC respalda la trazabilidad de los resultados a las unida-
des del SI y la capacidad de comparabilidad de los procedimientos.

Estándares de Referencia USP para Productos Biológicos

La USP ofrece ER para productos biológicos y materiales auxiliares. Por diversas razones, que incluyen razones históricas, y
conforme se indica en la Sección 5.50.1 O Unidades de Potencia (Biológica) en las Advertencias y Requisitos Generales, los ER USP
para productos biológicos pueden diferir en la cantidad de unidades de potencia, por definición, o en otros aspectos de los
demás estándares reconocidos internacionalmente. A menos que así se indique en la monografía, los estándares de referencia
internacionales generalmente no son intercambiables y se requieren ER USP para las pruebas y valoraciones de USP-NF.

Estándares de Referencia NF

Se pretende designar y etiquetar como "Estándares de Referencia USP" a los Estándares de Referencia actualmente etiqueta-
dos como "Estándares de Referencia NF", conforme a la consolidación de la USP y el NF dentro de la USP a partir del 2 de
Enero de 1975. Cuando sea necesario un Estándar de Referencia USP, se puede usar la sustancia correspondiente etiquetada
como un "Estándar de Referencia NF".

Transición de Sustancias Auténticas a Estándares de Referencia USP

En el pasado, la USP desarrollaba a manera de servicio materiales de referencia altamente caracterizados no requeridos para
su uso en monografías o capítulos generales de USP-NF, los cuales se distriquían como Sustancias Auténticas (SA). Las SA son
sustancias químicas altamente caracterizadas que se analizan mediante estudios en colaboración y se ponen a disposición co-
mo un servicio primariamente para los laboratorios analíticos, clínicos, farmacéuticos y de investigación. Estos materiales pue-
den usarse en la identificación, el desarrollo de métodos, la evaluación del desempeño de métodos, u otras aplicaciones que
sean adecuadas y estén validadas por el usuario. La USP dejará de lanzar materiales etiquetados como "Sustancias Auténticas".
Todos los materiales de referencia liberados al mercado, independientemente que se requiera o no su uso en una monografía
o capítulo general de USP-NF, serán "Estándares de Referencia USP".

Referencias Visuales Auténticas

Las Referencias Visuales Auténticas son Estándares de Referencia USP, pero a diferencia de los materiales de referencia quími-
cos, las Referencias Visuales Auténticas (RVA) no se usan en análisis químicos. Las RVA son imágenes visuales usadas por los
analistas para comparar ciertos artículos de prueba y asegurar que cumplen con los requisitos farmacopeicos. Las RVA se incor-
poran por referencia en la monografía.

Estándares de las Pruebas de Verificación de Desempeño USP

Estos materiales se proporcionan para analizar y, cuando fuese adecuado, facilitar el ajuste de la operación de un instrumen-
to para asegurar que los resultados obtenidos son exactos y/o precisos o que proporcionan resultados aceptables. El uso de
52 (11) Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 37

estos Estándares de Referencia se describe generalmente en los capítulos de pruebas generales asociados y en la información
relacionada.

APLICACIONES DE LOS ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP

Las aplicaciones oficiales de los ER USP se especifican en las monografías y capítulos generales de USP-NF. Incluyen lo si-
guiente:
• usos cuantitativos en valoraciones de fármacos y formulaciones, pruebas de límite, o blancos y controles
• usos cualitativos, (p.ej., pruebas de identificación, pruebas de aptitud del sistema, o marcadores de picos cromatográfi-
cos)
• usos específicos del método, (p.ej., estándares de verificación de desempeño, RVA, estándares de punto de fusión y el set
de conteo de partículas)
Según se describió con anterioridad, la USP también ofrece Sustancias Auténticas que no se especifican para su uso en una
monografía o capítulo general de USP, las cuales se usan a criterio del usuario.

ENVASADO

La cantidad de material por envase individual de ER USP depende de la aplicación farmacopeica del estándar y es, por lo
general, suficiente para varias determinaciones. Algunos estándares (principalmente materiales con requisitos importantes de
manipulación o materiales que estén disponibles únicamente en pequeñas cantidades) se proporcionan en envases de un solo
uso. Dichos productos de un solo uso por lo general son liofilizados y su contenido se declara en unidades de masa o actividad
por envase. Cuando así se declara, el contenido del envase debe reconstituirse en su totalidad sin la necesidad de pesarlo nue-
vamente. Las instrucciones de reconstitución se proveen en la etiqueta o en las monografías en que se usa el estándar.

ETIQUETADO

El texto de la etiqueta proporciona toda la información requerida para el almacenamiento y uso correctos de los ER USP en
las aplicaciones de las monografías. La etiqueta incluye instrucciones de uso, advertencias de seguridad, información requerida
para las sustancias controladas y un valor de propiedad o un valor de cálculo para los estándares con aplicaciones cuantitativas.
Para los estándares de verificación de desempeño, se proveen intervalos de aceptación. Cuando resulta necesario, los ER USP
están acompañados de documentación adicional, como por ejemplo Hojas de Datos Técnicos o Cromatogramas Típicos.
A menos que se indique algo distinto en el procedimiento de la monografía individual o en un capítulo general, los ER USP
se deben usar de acuerdo con las instrucciones en la etiqueta del Estándar de Referencia. Las Hojas de Datos de Seguridad de
los Materiales para todos los materiales de referencia USP están disponibles en el sitio Web de la USP.
Aunque los ER USP se vuelven a analizar de acuerdo con un programa predefinido para determinar la aptitud continua de
uso, los ER USP no presentan una fecha de caducidad en la etiqueta. Un lote de ER USP puede usarse en sus aplicaciones oficia-
les siempre que se publique como "Current Lot" (Lote Vigente) en la versión vigente del USP Reference Standards Catalog
(Catálogo de Estándares de Referencia USP) o que no haya alcanzado su Fecha de Uso Válida. Al agotarse, se designa a este
lote en el catálogo como "Previous Lot" (Lote Anterior) y se le asigna una "Valid Use Date" (Fecha de Uso Válida). La USP
publica bimestralmente el Catálogo de Estándares de Referencia. Se puede encontrar la versión vigente del catálogo en el sitio
Web de la USP: www.usp.org. Es responsabilidad del usuario constatar antes de su uso que el lote del Estándar de Referencia
USP en cuestión tiene un estatus oficial como "Current Lot" (Lote Vigente) o como "Previous Lot" (Lote Anterior) dentro de la
Fecha de Uso Válida. ·

USO ADECUADO

Muchas pruebas y valoraciones farmacopeicas están basadas en la comparación de una muestra de prueba con un ER USP.
En estos casos, las mediciones se realizan en preparaciones de la muestra de prueba y del Estándar de Referencia. Cuando se
indica que se debe preparar en diluciones sucesivas, o de otro modo, una Solución estándar o una Preparación estándar para
realizar una determinación cuantitativa, está previsto que la sustancia del Estándar de Referencia se pese con exactitud (ver
Pesas y Balanzas (41) y Aparatos Volumétricos (31) ). También se deben tomar en cuenta los errores potenciales asociados con el
pesaje de masas pequeñas (ver también la Sección 6.50.20.1 Ajuste de Soluciones en las Advertencias y Requisitos Generales).
Según se indicó anteriormente, los Estándares de Referencia que se definen basándose en el contenido por envase son una
excepción.
Las instrucciones de uso de los ER USP incluyen lo siguiente:
•Tal Como se Encuentra (As Is): Usar sin tratamiento previo ni corrección por sustancias volátiles. Ésta es la opción de
preferencia y se escoge siempre que los datos validados indiquen que el contenido de sustancias volátiles es constante
con el transcurrir del tiempo.
• Secar Antes de Usar (Dry Before Use): Usar inmediatamente después de secar en las condiciones indicadas. El secado no
debe realizarse en el envase original. Se debe transferir una porción del material a un recipiente de secado distinto.
 USP 37 Aparato/ (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos 53

• Determinar Volumétricamente el Contenido de Agua al Momento de su Uso (Determine Water Content Titrimetri-
cally At Time of Use): Usar con una corrección por el contenido de agua o la pérdida por secado determinada en una
porción separada del material. Cuando se requiere de una determinación volumétrica de agua a! momento de usar el Es-
tándar de Referencia, proceder según se indica en el Método 1 en Determinación de Agua (921 ). Para ello se aceptan méto-
dos instrumentales o microanalíticos. Cuando se usen cantidades habituales (aproximadamente 50 mg del Estándar de
Referencia), valorar volumétricamente con una solución del reactivo diluida de 2 a 5 veces. Cuando requiera la determina-
ción de la pérdida por secado de una porción separada del ER USP, proceder según se indica en la etiqueta. Se pueden
usar tamaños de muestra más pequeños que los requeridos en el capítulo de pruebas generales Pérdida por Secado (731)
para un ER USP, siempre que el usuario pueda obtener un resultado suficientemente exacto.
Siempre que las instrucciones de uso declaradas requieran de secado o de una corrección por sustancias volátiles, se lo debe
realizar al momento del uso. Se deben controlar los detalles experimentales adicionales mediante los Procedimientos Operati-
vos Estándares del usuario y las buenas prácticas de laboratorio.

ALMACENAMIENTO

Los ER USP deben almacenarse en la configuración de envasado provista por la USP (p.ej., viales que se envasan en bolsas
selladas herméticamente). Cuando se especifiquen condiciones de almacenamiento especiales, se deben seguir las instruccio-
nes de la etiqueta. Los viales sin abrir se deben almacenar según se indica en la etiqueta. Es responsabilidad del usuario asegu-
rar que el contenido de los viales abiertos continúe siendo adecuado para el uso provisto y que se mantenga tanto la asigna-
ción de valores como la información de incertidumbre.

Equipos para Pruebas y Valoraciones

(17) ETIQUETADO DE ENVASES DE MEDICAMENTOS DE VENTA BAJO

RECETA

INTRODUCCIÓN

El uso erróneo de medicamentos ocasiona más de un millón de eventos adversos por año en los Estados Unidos. En lo que
respecta a medicamentos recetados, la mejor (y generalmente la única) fuente de información para los pacientes es la etiqueta
del envase del medicamento de venta bajo receta y, aunque en ocasiones el paciente dispone de otra información escrita y
asesoramiento verbal, la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta debe satisfacer las obligaciones profesiona-
les del médico que receta y del farmacéutico. Estas obligaciones incluyen proveer al paciente aquella información que resulte
esencial y necesaria para entender la forma segura y apropiada de uso del medicamento y el apego al esquema prescrito de
medicación.
El entendimiento inadecuado de las instrucciones de uso del medicamento recetado y de la información auxiliar en los enva-
ses dispensados se ha generalizado. Diversos estudios han descubierto que el 46% de los pacientes no entienden una o más
instrucciones de posología, mientras que el 56% malinterpreta una o más de las advertencias auxiliares. El problema se acen-
túa en pacientes con un bajo nivel de alfabetismo o semi analfabetos, así como en pacientes que reciben varios medicamentos
con esquemas de administración innecesariamente complejos o no estandarizados. Un estudio demostró que los pacientes con
bajo nivel de alfabetismo son 34 veces más propensos a malinterpretar las advertencias en las etiquetas de los medicamentos
recetados. Sin embargo, incluso los pacientes con un nivel adecuado de alfabetismo a menudo malinterpretan las instrucciones
y advertencias comunes de los medicamentos recetados. Asimismo, existen grandes discrepancias entre las advertencias auxi-
liares y las instrucciones adicionales indicadas por cada médico para el mismo medicamento recetado. A menudo, la evidencia
específica para sustentar una declaración auxiliar es poco clara y los pacientes en muchas ocasiones ignoran dicha información.
Sin embargo, aún se requieren mayores estudios con respecto a la necesidad esencial y al beneficio que proporciona la infor-
mación auxiliar en la etiqueta (tanto texto como íconos) para mejorar el entendimiento del paciente sobre el uso seguro y
apropiado de sus medicamentos en comparación con el uso de un lenguaje simplificado y explícito únicamente.
La falta de normas universales para el etiquetado de envases de medicamentos de venta bajo receta que se dispensan es una
causa importante por la que el paciente malinterpreta las instrucciones, no las sigue de manera adecuada y comete errores de
medicación. El 18 de mayo de 2007, el Comité de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos de la USP estableció un Panel
Asesor con los siguientes objetivos: 1) determinar el contenido y formato óptimos de las etiquetas de los medicamentos de
 1

54 (17) Etiquetado de Envases de Medicamentos /Aparato USP 37

venta bajo receta para promover el uso seguro de medicamentos mediante la revisión crítica de factores que promueven u
ocasionan que el paciente no entienda las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta y 2) crear normas universa-
les para etiquetas de medicamentos de venta ba10 receta con respecto al formato/apariencia y el contenido/lenguaje.
En noviembre de 2009, el Panel Asesor en Alfabetización en Salud y Etiquetado de Envases de Medicamentos Recetados pre-
sentó sus recomendaciones al Comité de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos, el cual a su vez solicitó a la USP desarro-
llar normas para etiquetas centradas en el paciente en lo referente a formato, apariencia, contenido y lenguaje de las instruc-
ciones en los medicamentos de venta bajo receta a fin de promover el entendimiento por parte de los pacientes. Dichas reco-
mendaciones conforman el fundamento de este capítulo general.
Nota-Estas normas no se aplican cuando personal autorizado, que actúa dentro del marco de su profesión, administra un
medicamento de venta bajo receta a un paciente.

NORMAS PARA ETIQUETAR ENVASES DE MEDICAMENTOS RECETADOS QUE PROMUEVAN EL

ENTENDIMIENTO EN LOS PACIENTES

Organizar la etiqueta del medicamento de venta bajo receta de una manera centrada en el paciente: La información
debe organizarse de la manera que mejor refleje la forma en que la mayoría de los pacientes buscan y entienden las instruccio-
nes de uso de los medicamentos. El etiquetado del envase de los medicamentos de venta bajo receta debe presentar al pacien-
te únicamente la información más importante requerida para entender el uso seguro y efectivo.
Se deben enfatizar las instrucciones y demás información importante para los pacientes: Presentar de manera promi-
nente la información crítica para los pacientes sobre el uso seguro y efectivo del medicamento. En la parte superior de la eti-
queta, se debe especificar el nombre del paciente, el nombre del medicamento (especificar el nombre genérico y comercial
completos) y la dosis, además de instrucciones de uso explícitas y claras en lenguaje sencillo.
Las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta deben seguir un formato estándar de modo que el paciente
pueda estar seguro de que cada elemento se encontrará en un orden reglamentado cada vez que reciba un medicamento re-
cetado.
Otra información menos crítica aunque importante (p.ej., nombre y número telefónico de la farmacia, nombre del médico
que receta, fecha de llenado, fecha de rellenado, fecha de caducidad, número de receta médica, cantidad de medicamento,
descripción física e información auxiliar basada en evidencia) no debe predominar sobre la información crítica para el paciente.
Esta información menos crítica se debe colocar lejos de las instrucciones de dosificación (p.ej., en la parte inferior de la etiqueta
o en otra ubicación menos prominente) puesto que distrae a los pacientes e interfiere con su reconocimiento y entendimiento.
Lenguaje simplificado: El lenguaje de la etiqueta debe ser claro, conciso y familiar, y se debe usar de forma estandarizada.
Se deben usar únicamente términos y cláusulas comunes. No se deben usar palabras poco familiares (incluyendo términos en
latín) ni jerga médica.
No se recomienda el uso de fórmulas o software de legibilidad para simplificar extractos de texto como los presentados en
las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta. En su lugar, se deben usar cláusulas simplificadas y estandarizadas,
redactadas de tal forma que aseguren el fácil y correcto entendimiento de las instrucciones (mediante retroalimentación obte-
nida de muestras de diversos consumidores).
Proveer instrucciones explícitas: Las instrucciones de uso (es decir, la SIG o signatura) deben separar claramente la dosis
misma del esquema de administración de cada dosis a fin de transmitir explícitamente el número de unidades de dosificación
y el momento en que deben administrarse (p.ej., periodos (partes) específicos del día, tales como la mañana, el medio día, la
tarde y antes de acostarse). Las instrucciones deben incluir detalles específicos sobre los periodos de administración. No se de-
ben usar caracteres alfabéticos en lugar de números. Por ejemplo, se debe escribir "Tomar 2 tabletas por la mañana y 2 table-
tas por la tarde" en lugar de "Tomar dos tabletas dos veces al día").
Siempre que sea posible, se deben usar instrucciones estandarizadas (p.ej., se debe escribir "Tomar 1 tableta por la mañana
y 1 tableta por la tarde" si la prescripción indica b.i.d.). Por lo general, se deben evitar instrucciones ambiguas basadas en
intervalos de dosificación tales como dos veces al día o 3 veces al día, o en intervalos por horas tales como cada 12 horas,
puesto que dichas instrucciones se consideran implícitas más que explícitas, pueden requerir destreza con los números y la
interpretación del paciente puede ser distinta de la intención del médico que expidió la receta. Aunque puede parecer que las
instrucciones expresadas en horas específicas (p.ej., 8 a.m. y 1 O p.m.) se entienden con más facilidad que las instrucciones am-
biguas e implícitas, en realidad son menos fáciles de entender y pueden presentar mayores problemas de seguimiento debido
a los patrones de vida de cada individuo, tales como el horario de trabajo, que los intervalos de tiempo más generales como
por la mañana, por la tarde, después del desayuno, con el almuerzo, o antes de dormir. El uso uniforme de la misma termino-
logía ayudará a evitar confusiones en los pacientes.
Se deben evitar instrucciones ambiguas tales como "tomar según lo indicado" a menos que se proporcionen instrucciones
complementarias claras y asesoramiento (p.ej., instrucciones de uso que no quepan en la etiqueta del envase del medicamento
de venta bajo receta). La etiqueta del envase debe incluir una indicación clara que refiera al paciente a dichos materiales com-
plementarios.
Incluir el propósito de uso: Si el propósito del medicamento se incluye en la receta médica, también debe incluirse en la
etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta, a menos que el paciente prefiera la omisión del mismo. Se debe
preguntar a los pacientes cuáles son sus preferencias al momento de remitir las recetas médicas para dispensar. Los factores de
confidencialidad y el uso aprobado por la FDA (p.ej. uso declarado en la etiqueta frente a uso alternativo) pueden restringir la
USP 37 Aparato/ (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos 55

inclusión del propósito en las etiquetas. La evidencia actual respalda la inclusión del propósito de uso en un lenguaje claro y
simple (p.ej., "para la presión sanguínea alta" en lugar de "para la hipertensión").
Limitar la información auxiliar: LJ información auxiliar que aparezca en la etiqueta del envase del medicamento de venta
bajo receta debe basarse en evidencia científica y redactarse en lenguaje explícito minimizado para evitar distraer a los pacien-
tes con información innecesaria. La mayoría de los pacientes, en particular aquellos con un nivel bajo de alfabetismo, prestan
poca atención a la información auxiliar. La información debe presentarse de manera estandarizada y debe ser crítica para que
el paciente entienda y use el medicamento de forma segura (p.ej., advertencias y alertas críticas para la administración). Con
frecuencia, los pacientes malinterpretan los íconos. Asimismo, los íconos que ofrecen imágenes abstractas para transmitir men-
sajes que sean difíciles de descifrar pueden ser poco efectivos para promover el entendimiento en comparación con el uso ex-
clusivo de texto simplificado. Deben usarse únicamente aquellos íconos que, basándose en estudios con consumidores, mejo-
ren el entendimiento del paciente sobre su uso correcto. La información auxiliar basada en evidencia, tanto texto como íconos,
debe estandarizarse de modo que pueda aplicarse de manera uniforme y que no dependa de la preferencia individual del mé-
dico que receta.
Tener en cuenta el dominio limitado del inglés: Cuando >ea po>ible, las instruccione> de uso en la etiqueta del envase del
medicamento de venta bajo receta deben proveerse en el idioma preferido del paciente; de otro modo, existiría el riesgo de
que los pacientes con un dominio limitado del inglés malinterpretaran las instrucciones, lo cual podría llevar a errores de medi-
cación y resultados adversos para la salud. Además, siempre que sea posible, las instrucciones de uso deben proporcionarse
también en inglés a fin de facilitar el asesoramiento; el nombre del medicamento debe estar en inglés para que el personal de
emergencia y demás intermediarios tengan rápido acceso a la información.
Las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta deben traducirse usando procesos de traducción de alta calidad. A
continuación se proporciona un ejemplo de proceso de traducción de alta calidad:
• La traducción es realizada por un traductor capacitado cuya lengua materna es el idioma de destino
• La revisión de la traducción es realizada por un segundo traductor capacitado quien resuelve cualquier diferencia con el
primer traductor
• La revisión de la traducción es revisada por un farmacéutico cuya lengua materna es el idioma de destino quien resuelve
las diferencias con los traductores previos
• Se prueba la comprensión con la audiencia a la que está destinada
Cuando no es posible contar con un proceso de traducción de alta calidad, las etiquetas deben imprimirse en inglés y se de-
ben usar los servicios de un intérprete capacitado siempre que sea posible para asegurar la comprensión del paciente. El uso de
traducciones generadas por computadora debe limitarse a programas de calidad demostrada debido a que las instrucciones de
dosificación pueden carecer de uniformidad y representar riesgos potenciales. La estandarización de las instrucciones traduci-
das y los avances tecnológicos son necesarios para asegurar la exactitud y seguridad del etiquetado de los envases de medica-
mentos de venta bajo receta para pacientes con un dominio limitado del inglés.
Mejorar la legibilidad: Las etiquetas deben contar con un diseño y formato que permita su fácil lectura. En la actualidad, no
existe evidencia firme que sustente la superioridad en cuanto a legibilidad de los tipos de letra serif frente a los tipos de letra
sans serif, por lo que se pueden usar tipos de letra no estrecha de cualquier tipo.
Se debe optimizar la tipografía usando las siguientes técnicas:
• Impresión en alto contraste (p.ej., impresión en negro sobre fondo blanco).
• Tipos de letra familiares, simples y no estrechas con suficiente espacio dentro y entre caracteres (p.ej., Times Roman o
Arial).
• Uso de mayúsculas (es decir, siguiendo las reglas del inglés: primera letra en mayúscula seguida de palabras en minúscu-
las, con excepción de nombres propios).
•Tipo de letra grande (p.ej, Times Roman de mínimo 12 puntos o Arial de 11 puntos) para información crítica. Tomar en
cuenta que el tamaño de punto no representa el tamaño de letra real, por lo que 2 tipos de letra con el mismo tamaño
nominal de punto pueden tener en realidad tamaños de letra distintos. La altura x, que es la altura de la x minúscula del
tipo de letra, se ha utilizado como un indicador más exacto del tamaño aparente en lugar del tamaño de punto. Por
ejemplo, para un tamaño de punto dado, la altura x y el tamaño aparente de Arial son en realidad mayores que las de
Times Roman. No usar tipografía menor que Times Roman de 1 O puntos o el tamaño de letra equivalente de otra fuente.
Los adultos de mayor edad, particularmente, tienen dificultades para leer impresiones pequeñas.
• Usar un espacio en blanco adecuado entre líneas de texto (25%-30% del tamaño de punto).
• Usar espacios en blanco para distinguir entre secciones de la etiqueta, tales como instrucciones de uso frente a informa-
ción de la farmacia.
• Usar sólo texto orientado horizontalmente.
Existen otras medidas que también pueden mejorar la legibilidad:
• De ser posible, minimizar la necesidad de girar el envase para leer líneas de texto.
• Nunca truncar o abreviar la información crítica.
• El uso de resaltado, negrillas y otras marcas tipográficas deben mantener la legibilidad (p.ej., impresión en alto contraste y
color claro para el resaltado) y deben enfatizar la información central para el paciente o aquella información que facilite el
seguimiento (p.ej., número de dispensaciones adicionales).
• Limitar el número de colores usados para el resaltado (p.ej., no más de uno o dos).
• Usar renglones separados para distinguir los tiempos de dosificación.
 56 (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos / Aparato USP 37

Tener en cuenta los impedimentos visuales:

• Ofrecer un acceso alternativo para pacientes con impedimentos visuales (p.ej., sistemas táctiles, auditivos o visuales mejo-
rados que puedan emplear tecnologías de asistencia avanzadas).

(21) TERMÓMETROS

Los dispositivos para medir la temperatura adecuados para las pruebas de la Farmacopea deben ser rastreables y cumplir con
las especificaciones de las normas del NIST. Pueden ser de dos tipos: dispositivos de vidrio de columna líquida o dispositivos
con indicador de temperatura digital o analógico, como por ejemplo un dispositivo de resistencia, un termistor o un termopar.
Los indicadores de temperatura analógicos o digitales constan de una sonda de temperatura que contiene un sensor. La son-
da está conectada a un medidor que convierte la señal en ohmios o milivoltios en un lectura de temperatura. En este tipo de
indicadores, la parte de la sonda de temperatura que se sumerge en el medio para medir su temperatura está fabricada de un
material inerte. La calibración de los indicadores de temperatura analógicos y digitales se realiza con un estándar de tempera-
tura rastreable a las normas NIST, con una frecuencia de ensayo predeterminada. Es sumamente importante seleccionar el dis-
positivo de medición de temperatura según las condiciones en las que se va a utilizar.
Los termómetros de vidrio de columna líquida pueden calibrarse por inmersión total, parcial o completa y, en la medida de
lo posible, cada termómetro se debería emplear según las condiciones de inmersión en las que se calibró. La calibración de los
termómetros se realiza según una frecuencia predeterminada con un estándar de temperatura rastreable a las normas NIST.
Ver la versión vigente de la norma El de la ASTM (Asociación Estadounidense de Ensayos y Materiales). La calibración de los
termómetros de vidrio de columna líquida por inmersión total implica la inmersión del termómetro hasta el extremo superior
de la columna líquida dejando el resto de la columna y la cámara de expansión superior expuestas a la temperatura ambiente.
La calibración de los termómetros por inmersión parcial implica la inmersión hasta la línea de inmersión indicada en el frente
del termómetro dejando el resto de la columna expuesta a la temperatura ambiente. La calibración por inmersión completa
implica la inmersión de todo el termómetro sin que quede ninguna parte de la columna expuesta a la temperatura ambiente.
Si se utilizan otras condiciones de inmersión, es necesario realizar una corrección por columna emergente a fin de obtener lec-
turas de temperatura correctas.

(31) APARATOS VOLUMÉTRICOS

La mayoría de los aparatos volumétricos disponibles en los Estados Unidos están calibrados a 20º, a pesar de que la tempera-
tura que predomina en general en los laboratorios se aproxima más a los 25º. Para minimizar el error volumétrico, la tempera-
tura debería ser la misma para los aparatos volumétricos, el material que se está preparando, los disolventes que se utilizan
para preparar las soluciones volumétricas, el área en la cual se preparan y el ajuste de volumen final.
Uso-Para lograr el grado de precisión requerido en muchas valoraciones farmacopeicas que incluyen mediciones volumé-
tricas e indican que una cantidad sea "medida con exactitud", los aparatos deben elegirse y usarse con cuidado. El tamaño de
una bu reta debe ser tal que el volumen de la solución volumétrica no represen.te menos del 30% del volumen nominal. Cuan-
do se deben medir menos de 1O mL de solución volumétrica, en general se requiere una bureta de 1 O mL o una microbureta.
El diseño de los aparatos volumétricos es un factor importante para asegurar la exactitud. Por ejemplo, la longitud de la por-
ción graduada de las probetas graduadas no debe ser menor a cinco veces el diámetro interno y los picos de las buretas y de
las pipetas deberían restringir la velocidad del flujo de salida a no más de 500 µL por segundo.
Estándares de Exactitud-Las tolerancias de capacidad para los matraces volumétricos, las pipetas de transferencia y las
buretas son las mismas aceptadas por el Instituto Nacional de Normas y Tecnología (National lnstitute of Standards and Tech-
nology) (Clase A), 1 según se indica en las tablas adjuntas. Usar aparatos volumétricos de Clase A a menos que se especifique
algo diferente en la monografía individual. Para aparatos volumétricos de plástico las tolerancias de capacidad aceptadas son
Clase B. 2
Las tolerancias de capacidad para las pipetas de medición (es decir, graduadas) de hasta 1 O mL inclusive, son algo mayores
que las tolerancias para las pipetas de transferencia de los mismos tamaños, es decir, 1O µL, 20 µL y 30 µL para las pipetas de
2 mL, 5 mL y 1 O mL, respectivamente.
Las pipetas calibradas "para verter", graduadas y de transferencia, se deben escurrir en posición vertical y luego apoyar las
puntas contra la pared del recipiente receptor para escurrirlas por completo. Las lecturas de volumen en las buretas deberían
estimarse con una exactitud de 0,01 mL para buretas de 25 mL y 50 mL, y con una exactitud de 0,005 mL para buretas de
5 mL y 1 O ml. Las pipetas calibradas "para contener" se utilizan en casos especiales, generalmente para medir líquidos visco-

1 Ver ASTM 288-06, ASTM E287-02, ASTM El 189-00 y ASTM E969-02.

2 Ver ASTM E 288, Fed. Spec. NNN-F-289 y Estándar ISO 384.
USP 37 Aparatos/ (41) Balanzas 57

sos, como jarabes; sin embargo, se puede usar un matraz volumétrico en lugar de una pipeta "para contener". En tales casos,
la pipeta o el matraz deberían lavarse después del vaciado y los lavados agregarse a la porción medida.
Matraces Volumétricos
Volumen nominal, mL 10 25 50 100 250 500 1000
Límite de error, mL 0,02 0,03 0,05 0,08 0,12 0,20 0,30
Límite de error, % 0,20 0,12 0,10 0,08 0,05 0,04 0,03

Pipetas de Transferencia
Volumen nominal, mL 1 2 5 10 25 50 100
Límite de error, mL 0,006 0,006 0,01 0,02 0,03 0,05 0,08
Límite de error, % 0,60 0,30 0,20 0,20 0,12 0,10 0,08

Bu retas
Volumen nominal, mL 1O (tipo "micro") 25 50
Subdivisiones, mL 0,02 0,1 0,1
Límite de error, mL 0,02 0,03 0,05

(41 ) BALANZAS

Este capítulo establece los requisitos para balanzas que se usan para materiales que deben ser pesados con exactitud (ver
Advertencias Generales, 8.20). A menos que se especifique algo diferente, cuando las sustancias deban ser "pesadas con exacti-
tud", la pesada se debe realizar usando una balanza que esté calibrada dentro de su intervalo operativo y que cumpla con los
requisitos de repetibilidad y exactitud definidos. Para balanzas que se usan en otras aplicaciones, su repetibilidad y exactitud
deben valorarse en conjunto con los requisitos para su uso.
Con respecto a los principios teóricos de estos requisitos, ver el capítulo de información general Pesada en una Balanza Analí-
tica (1251 ), ya que puede ser una fuente útil, aunque no obligatoria.

REPETIBILIDAD

La repetibilidad se evalúa pesando una pesa de prueba no menos de 1 O veces. [NOTA-La pesa de prueba debe estar dentro
del intervalo operativo de la balanza, pero no es necesario que la pesa esté calibrada. Debido a que, dentro de la capacidad de
la balanza, la repetibilidad es prácticamente independiente de la masa de muestra, no se requiere usar un peso de prueba pe-
queño, ya que éste podría resultar difícil de manejar.]
La repetibilidad es satisfactoria si el doble de la desviación estándar del valor pesado dividido por el valor nominal de la pesa
usada no excede de O, 10%. Si la repetibilidad obtenida es menos de 0,41 d, donde des el menor intervalo de la escala, reem-
plazar la desviación estándar por 0,41 d. En este caso la repetibilidad es satisfactoria si el doble de 0,41 d dividido por el valor
nominal de la pesa utilizada no excede de O, 10%.

EXACTITUD

La exactitud de una balanza es satisfactoria si su valor de pesada, cuando se prueba con pesas adecuadas, está dentro del
O, 10% del valor del peso de prueba.
Una pesa de prueba es adecuada cuando tiene una masa entre 5% y 100% de la capacidad de la balanza. El error máximo
permisible de la pesa de prueba (emp), o alternativamente, la incertidumbre en la calibración de la pesa no debe ser más de
un tercio del límite de exactitud para la prueba. [NOTA-Las siguientes normas son aplicables: ASTM E617 (disponible en
http://www.astm.org) y OIML R 111 (disponible en http://www.oiml.org).]
 58 (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana / Pruebas Microbiológicas USP 37

Pruebas Microbiológicas

(51) PRUEBAS DE EFICACIA ANTI MICROBIANA

Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a las formas farmacéuticas no estériles para protegerlas del desa-
rrollo microbiano o de microorganismos que se introducen sin ser advertidos durante el proceso de fabricación o después de
éste. En el caso de artículos estériles dispensados en envases multidosis, los conservantes antimicrobianos se agregan para inhi-
bir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la extracción reiterada de dosis individuales.
Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas prácticas de fabricación o solamente para re-
ducir la población microbiana viable de un producto no estéril o para controlar la biocarga antes de la esterilización de formu-
laciones multidosis durante la fabricación. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacéuticas oficiales cumplen con
los requisitos para Sustancias Agregadas en Ingredientes y Procesos de las Advertencias Generales.
Todos los agentes antimicrobianos útiles son sustancias tóxicas. Para la máxima protección de los pacientes, la concentra-
ción del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar
tóxico para los seres humanos.
La concentración de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al mínimo si los ingredientes activos de la
formulación poseen eficacia antimicrobiana intrínseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida
por la adición de un conservante anti microbiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones dispensadas en envases mul-
tidosis o para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada
para formas farmacéuticas multidosis orales y tópicas y para otras formas farmacéuticas, como por ejemplo oftálmicas, óticas,
nasales, de irrigación y líquidos de diálisis (ver Formas Farmacéuticas (1151 )).
Este capítulo estipula pruebas para demostrar la actividad de protección antimicrobiana. Los conservantes antimicrobianos
deben estar indicados en la etiqueta. Las pruebas y criterios de eficacia se aplican al producto en su envase original cerrado, en
el que fue distribuido por el fabricante.

CATEGORÍAS DE PRODUCTOS
Para los fines de las pruebas, los artículos farmacopeicos han sido divididos en cuatro categorías (ver Tabla 7). Los criterios
de eficacia antimicrobiana para estos productos se establecen en función de la ruta de administración.
Tabla 1. Categorías de Productos Farmacopeicos
Categoría Descripción del Producto
1 Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos áticos, productos nasales estériles y productos
oftálmicos preparados con bases o vehículos acuosos.
2 Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estéri-
les y emulsiones, incluyendo aquellos que se aplican a membranas mucosas.
3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos.
4 Antiácidos preparados con una base acuosa.

ORGANISMOS DE PRUEBA

Emplear cultivos de los siguientes microorganismos 1 : Candida albicans (ATCC Nº 10231 ), Aspergillus niger (ATCC Nº 16404),
Escherichia co/i (ATCC Nº 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC Nº 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538). Los micro-
organismos viables empleados en la prueba no deben haber sufrido más de cinco pasajes desde su extracción del cultivo origi-
nal de ATCC. Para los fines de la prueba, un pasaje se define como la transferencia de organismos desde un cultivo establecido
a un medio nuevo. Todas las transferencias se cuentan. En el caso de organismos mantenidos mediante técnicas de siembra en
lote, cada ciclo consistente en congelar, descongelar y revivir a los microorganismos en un medio nuevo se considera como
una sola transferencia. Para el almacenamiento de cultivos a largo plazo, se debe emplear una técnica de siembra a partir de
cultivo madre. Los cultivos recibidos de ATCC se deben revivir de acuerdo con las instrucciones. Si han sido desarrollados en
caldo, las células son precipitadas mediante centrifugación. Resuspender en 1 /20 el volumen del caldo de mantenimiento nue-
vo y agregar un volumen igual de 20% (v/v en agua) de glicerol estéril. Las células desarrolladas en agar pueden rasparse de la
superficie y transferirse al caldo con glicerol al 10%. Dispensar alícuotas pequeñas de la suspensión en viales estériles. Almace-
nar los viales en nitrógeno líquido o en un congelador mecánico a no más de -50º. En los casos en que se requiera un vial para
siembra madre, se puede retirar y emplear para inocular una serie de cultivos de trabajo. Los cultivos de trabajo entonces pue-
den ser empleados de forma periódica (todos los días en el caso de bacterias y levaduras) para iniciar el cultivo de inóculos.

1 Disponible en American Type Culture Collect1on, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 59

MEDIOS

La promoción del crecimiento de todos los medios empleados en la prueba debe ser evaluada. Emplear los microorganismos
indicados más arriba en Organismos de Prueba.

PREPARACIÓN DE INÓCULOS
Antes de la prueba, inocular la superficie de un volumen apropiado de un medio de agar sólido proveniente de un cultivo
madre de cada microorganismo especificado revivido recientemente. Las condiciones de cultivo para el inóculo se describen
en la Tabla 2 en la que los medios apropiados son el Medio de Agar Sabouraud-Dextrosa o de Digerido de Caseína-Soja (ver
Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62)).
Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solución salina SR estéril, lavando el desarrollo de la superfi-
cie, colocándolo en un recipiente apropiado y agregando suficiente solucion salina SR estéril para obtener un recuento micro-
biano de aproximadamente 1 x 108 unidades formadoras de colonias (ufc) por mL. Para cosechar las células de A. niger, em-
plear solución salina SR estéril con 0,05% de polisorbato 80 y agregar suficiente solución salina SR estéril para obtener un re-
cuento de aproximadamente 1 x 1 0 8 ufc por mL.
Alternativamente, los organismos de cultivo madre pueden desarrollarse en un medio líquido apropiado (es decir, Caldo de
Digerido de Caseína-Soja o Caldo de Sabouraud-Dextrosa) y las células se pueden cosechar mediante centrifugación, luego
lavar y resuspender en solución salina SR estéril para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 1 0 8 ufc por
mL. [NOTA-El cálculo de la concentración de inóculo se puede realizar mediante mediciones turbidimétricas para los microor-
ganismos de desafío. Refrigerar la suspensión si no se va a emplear dentro de las 2 horas.]
Determinar el número de ufc por mL en cada suspensión, utilizando las condiciones de los medios y los tiempos de incuba-
ción para recuperación microbiana indicados en la Tabla 2 para confirmar el cálculo inicial de ufc por ml. Este valor sirve para
calibrar el tamaño del inóculo empleado en la prueba. Las suspensiones bacterianas y de levaduras se deben utilizar dentro de
las 24 horas de cosechadas, pero la preparación de hongos puede ser almacenada en refrigeración hasta 7 días.

PROCEDIMIENTO

La prueba puede realizarse ya sea en cinco recipientes originales si hay suficiente volumen de producto disponible en cada
recipiente y el recipiente del producto puede ser inoculado asépticamente (es decir, aguja o jeringa a través de un tapón de
goma elastomérico), o en cinco recipientes bacteriológicos estériles con tapa de tamaño apropiado a los que se ha transferido
un volumen suficiente de producto. Inocular cada recipiente con uno de los inóculos preparados y normalizados y mezclar. El
volumen del inóculo empleado es de entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto. La concentración de microorganismos de
prueba agregada al producto (Categorías 7; 2 y 3) es tal que la concentración final de la preparación de prueba luego de la
inoculación está comprendida entre 1 x 10 5 y 1 x 1 0 6 ufc por mL de producto. En los productos de la Categoría 4 (antiácidos),
la concentración final de la preparación de prueba luego de la inoculación está comprendida entre 1 x 1 0 3 y 1 x 1O 4 ufc por
mL de producto.
La concentración inicial de microorganismos viables en cada preparación de prueba se calcula a partir de la concentración
de microorganismos de cada inóculo normalizado determinado mediante el método de recuento de placas.
Incubar los recipientes inoculados a 22,5 ± 2,5º. Tomar muestras de cada recipiente en los intervalos apropiados especifica-
dos en la Tabla 3. Registrar todos los cambios observados en apariencia en estos intervalos. Determinar mediante el procedi-
miento de recuento en placas el número de ufc presentes en cada preparaci'ón de prueba en los intervalos correspondientes
(ver Procedimiento en Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62)). Incorporar un inacti-
vador (neutralizante) del antimicrobiano específico en el recuento en placas o en la dilución apropiada preparada para el re-
cuento en placas. Estas condiciones se determinan en el estudio de validación para dicha muestra a partir de las condiciones
de los medios y los tiempos de incubación para recuperación microbiana indicados en la Tabla 2. Empleando las concentracio-
nes calculadas de ufc por mL presentes al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores en 109 10 de la concentración de ufc
por mL de cada microorganismo en los intervalos de prueba correspondientes y expresar los cambios en términos de reduccio-
nes logarítmicas.
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de lnóculos
lnóculo Recuperación
Temperatura Tiempo Microbiana
Organismo Medio Apropiado de Incubación de Incubación Tiempo de Incubación
Escherichia coli Caldo Digerido de Caseína y Soja; 32,5 ± 2,5" 18 a 24 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 8739) Agar Digerido de Caseína y Soja ...

Pseudomonas aeruginosa Caldo Digerido de Caseína y Soja; 32,5 ± 2,5' 18 a 24 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 9027) Agar Digerido de Caseína y Soja
Staphylococcus aureus Caldo Digerido de Caseína y Soja; 32,5 ± 2y 18 a 24 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 6538) Agar Digerido de Case1na y Soja
 1

60 (51) Pruebas de Eficacia Anti microbiana / Pruebas Microbiológicas USP 37

Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de lnóculos (Continuación)

lnóculo Recuperación
Temperatura Tiempo Microbiana
Organismo Medio Apropiado de Incubación de Incubación Tiempo de Incubación
Candida albicans Agar Sabouraud Dextrosa; 22,5 ± 2,5º 44 a 52 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 10231) Caldo Sabouraud Dextrosa
Aspergillus niger Agar Sabouraud Dextrosa; 22,5 ± 2,5° 6 a 1O días 3 a 7 días
(ATCC Nº 16404) Caldo Sabouraud Dextrosa

CRITERIOS DE EFICACIA
ANTI MICROBIANA

Los requisitos de eficacia antimicrobiana se cumplen si se cumplen los criterios especificados en la Tabla 3 (ver Cifras Signifi-
cativas y Tolerancias en las Advertencias Generales). La expresión "ningún incremento" se define como no más de 0,5 unidades
de log 10 por encima del valor medido previamente.
Tabla 3. Criterios para Microorganismos Evaluados
En productos de la Categoría 7
Bacterias: A los 7 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento calculado
en el inicio; a los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 3,0 del recuento
inicial; y a los 28 días ningún incremento del recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días respecto del recuento inicial.
Filamentosos:
En productos de la Categoría 2
Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 desde el recuento inicial; y
a los 28 días ningún incremento del recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto del recuento inicial.
Filamentosos:
En productos de la Categoría 3
Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 del recuento inicial; y a los
28 días ningún incremento del recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto del recuento inicial.
Filamentosos:
En productos de la Categoría 4
Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos: Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto del recuento inicial.

(55) INDICADORES BIOLÓGICOS-PRUEBAS DE RESISTENCIA

RECUENTO TOTAL DE ESPORAS. VIABLES

Para indicadores biológicos en portador de papel, retirar tres muestras del indicador biológico pertinente de sus envases in-
dividuales originales. Desmenuzar el papel hasta reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba en
un vaso estéril de 250 mL de un mezclador adecuado que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada, y mez-
clando durante el tiempo que se considere adecuado para obtener una suspensión homogénea. No es inusual que se requie-
ran tiempos de mezclado de 15 minutos o más para obtener una recuperación óptima. Transferir a un tubo estéril de 16 mm x
125 mm con tapa de rosca una alícuota de 1O mL de la suspensión. Si se trata de un Indicador Biológico para Esterilización por
Vapor, Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la suspensión en un baño de agua de 95º a 100º durante 15 minutos
(choque térmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza los 95º. Si se trata de un Indicador Biológico
para Esterilización por Calor Seco, Portador de Papel y de un Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de
Papel, calentar el tubo que contiene la suspensión en un baño de agua de 80º a 85º durante 1O minutos, comenzando a medir
el tiempo cuando la temperatura de la suspensión de esporas alcance los 80º. Enfriar rápidamente en un baño de hielo-agua
de Oº a 4º. Transferir a tubos adecuados dos alícuotas de 1 mL y hacer diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada estéril;
las diluciones se seleccionan por medio de cálculos de manera que se obtengan preferentemente entre 30 y 300 colonias, pero
no menos de 6, en cada una de las placas del par cuando se tratan según se describe a continuación. Cuando el indicador
biológico tiene una concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar más placas en
cada dilución. Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 mL de cada dilución seleccionada en
cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de
Medio Agar con Digerido de Caseína y Soja que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45º y 50º. Agitar por rota-
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (55) Indicadores Biológicos 61

ción suave para obtener una suspensión homogénea y dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a una tempera-
tura entre 55º y 60º para el Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel, y a una temperatura entre 30º y
35º para el Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel y para el Indicador Biológico para Esterili-
zación por Calor Seco, Portador de Papel, o a la temperatura de recuperación óptima especificada por el fabricante. Examinar las
placas después de transcurridas 24 y 48 horas, registrando el número de colonias para cada placa, y usar el número de colo-
nias observado después de 48 horas para calcular los resultados. Calcular el número promedio de esporas por muestra a partir
de los resultados, usando el factor de dilución apropiado. La prueba es válida si el logaritmo del número de esporas por porta-
dor a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del número después de 24 horas en cada caso. Para Indicador Biológico
para Esterilización por Vapor, Autocontenido, extraer asépticamente los tres portadores del envase y proceder según se indica en
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, retirar asép-
ticamente los tres portadores de su empaque o envase original. Colocar cada portador en un recipiente estéril apropiado que
contenga 1 00 mL de Agua Purificada enfriada y someter a ultrasonido o agitar en un agitador de vaivén durante un tiempo
apropiado. Para una recuperación óptima se pueden requerir 15 minutos o más. Se debe llevar a cabo un estudio previo que
garantice que el método de recuperación produzca como resultado una recuperación de por lo menos 50% a 300% del re-
cuento viable de esporas declarado. Transferir a un tubo estéril de 16 mm x 125 mm con tapa de rosca una alícuota de 1 O mL
de la suspensión. Calentar los tubos que contienen suspensiones de Bacil/us atrophaeus, Bacil/us subtilis y Bacil/us coagulans en-
tre 80º y 85º durante 1 O minutos. Calentar los tubos que contienen una suspensión de Geobacillus stearothermophilus entre 95º
y 1 00º durante 15 minutos. Comenzar a medir el tiempo cuando se alcance la temperatura más baja de los intervalos indica-
dos. Enfriar rápidamente en un baño de hielo-agua de Oº a 4º. Transferir dos alícuotas de 1 mL a tubos adecuados y hacer
diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada. Las diluciones seleccionadas deben ser aquellas que preferiblemente rindan
entre 30 y 300 colonias, pero no menos de 6, en cada par de placas cuando se traten según se describe a continuación. Cuan-
do el indicador biológico tiene una concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar
más placas en cada dilución. Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 ml de cada dilución
seleccionada en cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 1 00 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar la alícuota
a cada placa conteniendo 20 mL de agar que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45º y 50º. Agitar por rota-
ción suave para obtener una suspensión homogénea.
Para G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans, usar Medio de Agar Digerido de Caseína y Soja, e incubar
las placas aeróbicamente en posición invertida a las siguientes temperaturas respectivas para cada microorganismo: de 55º a
60º, de 30º a 35º y de 48º a 52º, o a la temperatura óptima especificada por el fabricante del indicador biológico. Examinar las
placas después de transcurridas 24 y 48 horas. Registrar el número de colonias observado en cada placa. Calcular el número
promedio de esporas por portador a partir de los resultados, usando el factor de dilución apropiado. La prueba es válida si el
logaritmo del número de esporas por portador a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del número después de 24
horas en cada caso.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas, usando
G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans como indicadores biológicos, preparar una dilución seriada apro-
piada de la suspensión original de esporas en Agua Purificada enfriada contenida en un tubo estéril de 16 mm x 125 mm con
tapa de rosca y efectuar los procedimientos de recuentos de esporas viables especificados en Indicadores Biológicos para Esterili-
zación por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel.

DETERMINACIÓN DEL VALOR D

Efectuar todas las pruebas descritas en esta sección bajo condiciones asépticas, usando equipo estéril para microorganismos
no termofílicos. La determinación del Valor D para G. stearothermophilus y B. coagulans se puede realizar en un ambiente con-
trolado pero no clasificado.

Aparatos
El equipo de prueba para la determinación de la resistencia microbiana se describe en detalle en la norma ISO 18472, Sterili-
zation of Health Care Products-Biological and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilización de Productos para el Cuidado de
la Salud-Indicadores Biológicos y Químicos-Equipo de Prueba). 1 Los detalles de los Resistómetros para Evaluación de Indicado-
res Biológicos (BIER, por sus siglas en inglés) individuales varían según su diseño y el proceso de esterilización particular con el
que se usan conjuntamente. Siempre y cuando el desempeño del BIER cumpla con los requisitos de la norma ISO para exposi-
ción del indicador biológico, se aceptan diferencias en el diseño.

1 ANSl/AAMl/ISO 18472:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilización de Productos para el Cuida-
do de la Salud-Indicadores Biológicos y Químicos-Equipo de Prueba). Association far the Advancement of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road,
Suite 220, Arlington, VA 22201-4795
 62 (55) Indicadores Biológicos/ Pruebas Microbiológicas USP 37

Procedimiento

Realizar las pruebas del valor D para cada set de condiciones de esterilización aplicable según indique la etiqueta del indica-
dor biológico envasado en análisis. Tomar un número suficiente de grupos de muestras de indicadores biológicos en sus enva-
ses individuales originales, constando cada grupo de no menos de 5 muestras. El número de grupos proporciona un intervalo
de observaciones desde no menos de un valor D declarado por debajo del tiempo de supervivencia declarado, hasta no menos
de un valor D declarado por encima del tiempo de muerte declarado. Colocar cada grupo en portamuestras separados ade-
cuados que permitan exponer cada muestra a la condición de esterilización indicada en una ubicación específica en la cámara
de esterilización del BIER. Controlar los parámetros de funcionamiento del aparato BIER, usando portamuestras sin muestras.
Seleccionar una serie de tiempos de esterilización en incrementos a partir del menor tiempo para las muestras a analizar. Las
diferencias en los tiempos de esterilización a lo largo de las series son tan constantes como sea posible y la diferencia entre los
tiempos adyacentes no es mayor de 75% del valor D declarado.
Los procedimientos de prueba para el uso de resistómetros BIER en la evaluación de la resistencia microbiana se definen en
una serie de normas ISO bajo la serie 111 38. 2 · 3· 4 · 5 Se debe seguir la norma apropiada para el indicador biológico. Los métodos
de prueba y los portadores usados con el BIER se pueden adaptar a las características específicas del indicador biológico. El
método y aparatos usados para portadores de papel pueden diferir de los de otros portadores y serán sustancialmente diferen-
tes de los usados para suspensiones de indicadores biológicos.
Las condiciones de exposición para el valor D de portadores de materiales alternativos son iguales a las condiciones usadas
para determinar el valor D de portadores de papel. Si la etiqueta del fabricante permite el uso del portador de indicador bioló-
gico con múltiples métodos de esterilización, entonces los datos sobre el valor D, tiempo de supervivencia y tiempo de muerte
tendrán que ser proporcionados por el fabricante para cada método de esterilización. Es posible que los indicadores biológicos
inoculados en portadores distintos de los de papel se usen para métodos de esterilización y descontaminación por gas o vapor
tales como dióxido de cloro y peróxido de hidrógeno en fase de vapor.
Las condiciones físicas estándar para la evaluación de indicadores biológicos para uso con dióxido de cloro o peróxido de
hidrógeno en fase de vapor no han sido definidos. En el caso de dióxido de cloro, la concentración del gas, la humedad relati-
va y la temperatura son condiciones críticas del control del proceso que se pueden medir con exactitud. El fabricante de los
indicadores biológicos comercializados para uso con dióxido de cloro debería declarar las condiciones bajo las cuales se llevó a
cabo la determinación del valor D en forma tal que el usuario pueda, cuando menos, discernir la resistencia de un lote de
indicadores biológicos en comparación con sus propias condiciones de uso anticipadas. La situación con el peróxido de hidró-
geno en fase de vapor es más compleja. Diversos fabricantes de equipos han propuesto diferentes condiciones de descontami-
nación o esterilización. Por esa razón, no existe un proceso estándar para efectuar la descontaminación o esterilización de su-
perficie con peróxido de hidrógeno en fase de vapor. Como consecuencia, no existen métodos industriales estándar de evalua-
ción de indicadores biológicos para peróxido de hidrógeno en fase de vapor y se ha informado que podría no haber una corre-
lación directa entre la concentración de vapor y la velocidad o incluso la eficacia de inactivación del indicador biológico. Adi-
cionalmente, resulta difícil evaluar con exactitud la humedad relativa, que a menudo se define como un parámetro crítico para
el proceso, en presencia de peróxido de hidrógeno en forma de vapor. Por estas razones es preferible considerar la resistencia
de los indicadores biológicos como una medida relativa o comparativa del fabricante, más que como un verdadero valor D.
Por lo tanto, dependiendo del equipo y de los procesos empleados, podría ser imposible para un usuario final duplicar las
pruebas de resistencia del indicador biológico efectuadas por el fabricante.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas efectuar
las determinaciones del valor D para cada uno de los microorganismos que se proporcionan como una suspensión líquida de
esporas. La prueba se efectúa usando diluciones seriadas apropiadas basadas en ·el título declarado de esporas de la suspensión
en Agua Purificada en un tubo estéril.
Cuando la suspensión se coloca sobre o en un sustrato como un tapón elastomérico o un producto formulado, su resistencia
puede diferir de la determinada en Agua Purificada. La diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores biológicos y
las medidas apropiadas hechas antes del uso en actividades de validación de la esterilización.

Recuperación

Después de completar el procedimiento de esterilización para el Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco, Portador
de Papel, el Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel o el Indicador Biológico para Esterilización

2 ANSl/AAMl/ISO 11138-1 :2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators--Part 1: General requirements, 2nd ed. (Esterilización de Productos de
Salud-indicadores Biológicos-Parte 7: Requisitos generales, 2º ED.). Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Sui-
te 220, Arlington, VA.
3 ANSl/AAMl/ISO 11138-2:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators--Part 2: Biological lndicators far Ethylene Oxide Sterilization Proces-
ses, 3rd ed. (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-indicadores Biológicos-Parte 2: Indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización con Óxido de
Etiieno, 3° Ed.) Association far the Advancement of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
4 ANSl/AAMl/ISO 11138-3:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators--Part 3: Biological lndicators for Moist Heat Sterilization Processes.
(Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-indicadores Biológicos-Parte 3: indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización por Calor Húmedo.) Asso-
ciation far the Advancernent of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
5 ANSl/AAMl/ISO 11138-4:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 4: Biological lndicators for Dry Heat Sterilization Processes.
(Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-indicadores Biológicos-Parte 4: Indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización por Calor Seco.) Associa-
tion far the Advancernent of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Suite 220, Arl1ngton, VA.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 63

por Vapor, Portador de Papel, según corresponda y dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas, retirar aséptica-
mente cada tira y agregarla a un medio apropiado (ver Medios en Pruebas de Esterilidad 171 \) para sumergir el indicador bioló-
gico por completo en un tubo adecuado. Para cada muestra del Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido,
se sumerge la tira de papel en el medio autocontenido según las instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo determina-
do no mayor de 4 horas. Incubar cada tubo a la temperatura óptima de recuperación especificada por el fabricante. Observar
cada tubo con medio inoculado a intervalos apropiados durante un total de 7 días después de la inoculación. (Cuando se ob-
serva crecimiento en cualquier momento de la observación en particular, se puede suspender la incubación de dicha muestra.)
Tomar nota del número de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en ningún momento.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, la recupera-
ción de esporas de los portadores de indicador biológico seguirá los procedimientos de recuperación descritos en Recuento To-
tal de Esporas Viables. Los métodos de determinación del valor D para indicadores biológicos en portador de papel se pueden
usar para calcular el valor D de portadores diferentes al papel. Las condiciones de incubación para los microorganismos que se
pueden usar para indicadores b1olog1cos en portadores diferentes al papel se describen en la sección Recuento Total dr Esporas
Viables.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas, los méto-
dos de recuperación después de la exposición a las condiciones de esterilización son aquellos descritos en la sección Recuento
Total de Esporas Viables para suspensiones líquidas y cuando se hace una determinación del valor D por calor seco a partir de
suspensiones de B. atrophaeus, se siguen los mismos procedimientos de recuperación descritos en Indicador Biológico para Este-
rilización por Vapor, Portador de Papel.
Cuando se usa C. sporogenes como indicador biológico, los métodos para la preparación e inoculación, así como los méto-
dos y medios de recuperación, deben adaptarse al uso de este formador de esporas anaeróbico.

Cálculos

La determinación de los valores D de los indicadores biológicos se puede efectuar usando el Método de Spearman-Karber
Limitado, el Método de la Curva de Supervivencia o los procedimientos de Stumbo-Murphy-Cochran. 6• 7• 8 Para determinar los
valores D, es preferible usar el mismo método definido por el fabricante del indicador biológico. El uso de un método distinto
puede producir diferencias que son más un artefacto del método que una variación en el desempeño del indicador biológico.

Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte

Tomar dos grupos, cada uno integrado por 1 O muestras del indicador biológico pertinente, en sus envases individuales origi-
nales. Colocar las muestras de un grupo en un portamuestras adecuado que permita exponer cada muestra a las condiciones
de esterilización en una ubicación específica en la cámara BIER.
Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido, ingresar a la cámara y retirar los portamuestras con las
1 O muestras. Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcurrió un tiempo sustancial, para some-
ter el segundo portamuestras con 1 O muestras a condiciones similares a las primeras pero durante el tiempo de muerte reque-
rido.
El Tiempo de supervivencia y el tiempo de muerte para todos los indicadores biológicos con monografías se describe en la co-
rrespondiente monografía oficial bajo el encabezamiento de cada uno.

(61 > EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO

ESTÉRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO

INTRODUCCIÓN
Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán el recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que pue-
den desarrollarse en condiciones aeróbicas.
Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con una especifica-
ción establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a conti-
nuación, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo.

6 Pflug, 1.). Syflabus far an fntroductory Course in the Microbio!ogy and Engineerinq of SteofiLalion Processes, 4th ed. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services,
1980.
7 Pflug, l.)., and G.M. Smith. The Use of Biological lndicators tor Monitoring Wet-Heat Sterili1ation Processes, in Sterilization of Medica/ Products, ed. E.R.L. Gaugh-
ran and K. Kereluk. New Brunswick, NJ: johnson and )ohnson, 1977, 193--230.
8 Holcomb, R.G., and l.j. Pflug. The Spearman-Karber Method of Analyzing Quantal A'5ay Microbial Destruction Data, in Microbio/oqy and Fngineering Sterifization
ProceS1es, ed. l.). Pflug. St. Paul. MN: rnvironmental Sterili1ation Services, 1979.
64 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Microbiológicas USP 37

Los métodos no son aplicables a productos que contengan microorganismos viables como ingredientes activos.
Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluidos los métodos automatizados, siempre que se haya
demostrado su equivalencia con el método Farmacopeico.

PROCEDIMIENTOS GENERALES

Realizar la determinación en condiciones diseñadas para evitar la contaminación microbiana extrínseca del producto a exa-
minar. Las precauciones a tomar para evitar la contaminación deben ser tales que no afecten a ningún microorganismo que
deba detectarse en la prueba.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible. Si
se usan inactivadores para este fin, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos.
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar la ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado.

MÉTODOS DE RECUENTO

Usar, según se indica, el método de Filtración por Membrana o uno de los Métodos de Recuento en Placa. El Método del Núme-
ro Más Probable (NMP) es generalmente el método de recuento microbiano menos exacto; sin embargo, para algunos grupos
de productos con biocarga muy baja, puede resultar el método más apropiado.
La elección de un método se basa en factores tales como la naturaleza del producto y el límite de microorganismos requeri-
do. El método seleccionado debe permitir el análisis de un tamaño de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la
especificación. Se debe establecer la aptitud del método seleccionado.

PRUEBA DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO, APTITUD DEL MÉTODO DE RECUENTO Y

CONTROLES NEGATIVOS

Consideraciones Generales

Se debe establecer la aptitud de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar.
Se debe confirmar la aptitud si se introduce un cambio en la realización de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados del análisis.

Preparación de Cepas de Prueba

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o preparar según se indica más abajo. Las técnicas de mante-
nimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar, por separado,
cada cepa bacteriana y fúngica de prueba según se indica en la Tabla 7.
Tabla 1. Preparación y Uso de Microorganismos de Prueba
Aptitud del Método de Recuento en
Promoción del Crecimiento Presencia del Producto
Recuento Total Recuento To-
Recuento Total de de Hongos Fila- Recuento Total de tal de Hongos
Preparación de Ce- Microorganismos Ae- mentosos y Le- Microorganismos Filamentosos y
Microorganismo pas de Prueba robios vaduras Aerobios Levaduras
Staphy/acoccus aureus por Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
ejemplo ATCC 6538, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 9518, CIP 4.83 o gerido de Caseína y de Caseína y Soja So 100 Digerido de Caseína y
NBRC 13276 Soja 30º-35º ufc Soja So 1 00 ufc
18-24 horas 30º-35º So 3 días 30º-35º So 3 días
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
por ejemplo ATCC 9027, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 8626, CIP 82.118 gerido de Caseína y de Caseína y Soja So 1 00 Digerido de Caseína y
o NBRC 13275 Soja 30º-35º ufc Soja So 1 00 ufc
18-24 horas 30º-35º So 3 días 30º-35º So 3 días
Bacillus subtilis por ejem- Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
plo ATCC 6633, NCIMB na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
8054, CIP 52.62 o NBRC gerido de Caseína y de Caseína y Soja So 100 Digerido de Caseína y
3134 Soja 30º-35º ufc Soja So 100 ufc
18-24 horas 30º-35º So 3 días 30º-35º So 3 días
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 65

Tabla 1. Preparación y Uso de Microorganismos de Prueba (Continuación)

Aptitud del Método de Recuento en
Promoción del Crecimiento Presencia del Producto
Recuento Total Recuento To-
Recuento Total de de Hongos Fila- Recuento Total de tal de Hongos
Preparación de Ce- Microorganismos Ae- mentosos y Le- Microorganismos Filamentosos y
Microorganismo pas de Prueba robios vaduras Aerobios Levaduras
Candida albicans por ejem- Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Caseína Agar Sabouraud Agar Digerido de Caseí- Agar Sabouraud
plo ATCC 1 0231, NCPF sa o Caldo Sabouraud y Sojas 100 ufc Dextrosa s 1 00 na y Soja s 100 ufc Dextrosa s 100
3179, JP 48.72 o NBRC Dextrosa 20º-25º 2-3 30º-35º s 5 días ufc 20º-25º s 5 30º-35º s 5 días NMP: ufc 20º-25º s 5
1594 días días no aplica días
Aspergillus brasi/iensis por Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Caseína Agar Sabouraud Agar Digerido de Caseí- Agar Sabouraud
ejemplo ATCC 16404, sa o Agar Papa Dextro- y Sojas 100 ufc Dextrosa s 100 na y Soja s 100 ufc Dextrosa s 1 00
IMI 149007, IP 1431.83 sa 20º-25º 30º-35º s 5 días ufc 20º-25º s 5 30º-35º s 5 días NMP: ufc 20º-25ºS 5
o NBRC 9455 5-7 días o hasta alean- días no aplica días
zar una buena esporu-
lación

Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para realizar
las suspensiones de prueba; para suspender esporas de A. brasiliensis, se puede añadir 0,05% de polisorbato 80 a la solución
amortiguadora. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura
entre 2º y 8º. Como alternativa para la preparación y posterior dilución de una suspensión fresca de las células vegetativas de
A. brasiliensis o B. subtilis, preparar una suspensión estable de esporas y luego usar un volumen apropiado de la suspensión de
esporas para la inoculación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º du-
rante un período validado.

Control Negativo

Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la prepa-
ración de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.

Promoción del Crecimiento de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes indicados.
Inocular porciones/placas de Caldo Digerido de Caseína y Soja y Agar Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no
más de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 7, empleando una porción/placa individual de medio para cada
uno. Inocular placas de Agar Sabouraud Dextrosa con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos indica-
dos en la Tabla 7, empleando una placa individual de medio para cada uno. Incubar de acuerdo con las condiciones descritas
en la Tabla 7.
Para medios sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de 2 a partir del valor calculado para un
inóculo estandarizado. Para un inóculo recién preparado, se produce un cr~cimiento de microorganismos comparable al obte-
nido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Los medios líquidos son adecuados si se pro-
duce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio
analizada y aprobada previamente.

Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

El método para preparar la muestra depende de las características físicas del producto a examinar. Si ninguno de los procedi-
mientos que se describen a continuación resultara satisfactorio, se debe desarrollar un procedimiento alternativo adecuado.
Productos Solubles en Agua-Disolver o diluir (por lo general se prepara una dilución 1 en 1O) del producto a examinar
en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo Di-
gerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el mismo diluyente, si
fuera necesario.
Productos No Grasos Insolubles en Agua-Suspender el producto a analizar (por lo general se prepara una dilución 1 en
1O) en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo
Digerido de Caseína y Soja. Se puede añadir un agente tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80, para favorecer la
suspensión de sustancias poco humectables. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el
mismo diluyente, si fuera necesario.
 66 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Microbiológicas USP 37

Productos Grasos-Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo esterilizado por filtración o mezclarlo con la
cantidad mínima necesaria de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril no inhibitorio que se calienta, si fuera
necesario, a no más de 40º o, en casos excepcionales, a no más de 45º. Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mante-
ner la temperatura en un baño de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado precalentado para obtener
una dilución 1 en 1O del producto original. Mezclar cuidadosamente, manteniendo la temperatura durante el menor tiempo
necesario para la formación de una emulsión. Se puede preparar una serie de diluciones decimales adicionales empleando el
diluyente seleccionado que contenga una concentración adecuada de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril
no inhibitorio.
Líquidos o Sólidos en Forma de Aerosol-Transferir el producto asépticamente a un aparato con filtro de membrana o un
recipiente estéril para un muestreo posterior. Usar el contenido completo o una cantidad definida de dosis fijas de cada envase
analizado.
Parches Transdérmicos-Retirar las láminas protectoras ("cubiertas de protección") de los parches transdérmicos y colo-
carlas, con el adhesivo hacia arriba, sobre bandejas de vidrio o plástico estériles. Cubrir la superficie adhesiva con un material
poroso estéril adecuado (p.ej., gasa estéril) para prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferirlos a un volumen
adecuado del diluyente seleccionado que contenga inactivadores tales como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la preparación
vigorosamente por lo menos durante 30 minutos.

INOCULACIÓN Y DILUCIÓN

Agregar a la muestra, preparada según las instrucciones previas, y a un control (sin incluir material de la prueba) un volumen
suficiente de suspensión microbiana para obtener un inóculo de no más de 100 ufc. El volumen de la suspensión del inóculo
no debe exceder del 1% del volumen del producto diluido.
Para demostrar una recuperación microbiana aceptable del producto, se debe usar el factor de dilución más bajo posible de
la muestra preparada para la prueba. Si esto no fuera posible debido a la actividad antimicrobiana o la baja solubilidad, deben
desarrollarse otros protocolos adecuados. Si la inhibición del crecimiento por la muestra no puede evitarse de cualquier otra
manera, la alícuota de suspensión microbiana puede agregarse después de la neutralización, la dilución o la filtración.

NEUTRALIZACIÓN/ELIMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra preparada, diluida según se indica en Inocula-
ción y Dilución e incubada siguiendo el procedimiento descrito en Recuperación de Microorganismos en Presencia del Producto,
con el número de microorganismos recuperados a partir de la preparación de control.
Si se inhibe el crecimiento (reducción en un factor mayor de 2), modificar el procedimiento para la prueba de recuento par-
ticular con el objeto de garantizar la validez de los resultados. La modificación del procedimiento puede incluir, por ejemplo,
(1) Un aumento en el volumen del diluyente o medio de cultivo;
(2) Incorporación de agentes neutralizantes generales o específicos en el diluyente;
(3) Filtración por membrana; o
(4) Una combinación de todas las medidas anteriores.
Agentes Neutralizantes-Los agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de los agentes antimicro-
bianos (ver la Tabla 2). Pueden añadirse al diluyente seleccionado o al medio, preferentemente antes de la esterilización. Si se
usan, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos mediante un blanco con neutralizador
y sin el producto. ·
Tabla 2. Agentes Neutralizantes Comunes/Métodos para
Sustancias de Interferencia
Agentes Neutrallzantes
Sustancia de Interferencia Potenciales/Método
Glutaraldehído, mercuriales Sulfito ácido de sodio (Bisulfito de sodio)
Fenólicos, alcohol, aldehídos, sorbato Dilución
Aldehídos Glicina
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas Lecitina
CAC, yodo, parabenos Polisorbato
Mercuriales Tioglicolato
Mercuriales, halógenos, aldehídos Tiosulfato
EDTA (edetato) Iones de Mg o Ca

Si no se encuentra un método de neutralización adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el microorganis-
mo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta información permite deducir que no es probable que
el artículo se contamine con esa determinada especie de microorganismo. No obstante, es posible que el producto inhiba sola-
mente algunos microorganismos especificados en este capítulo pero que no inhiba otros no incluidos entre las cepas de prue-
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 67

ba o aquellos para los cuáles éstas no son representativas. En consecuencia, realizar la prueba con el factor de dilución más alto
compatible con el crecimiento microbiano y el criterio de aceptación específico.

RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS EN PRESENCIA DEL PRODUCTO

Para cada uno de los microorganismos en la lista, realizar pruebas individuales. Contar sólo los microorganismos de la cepa
de prueba agregada.
Filtración por Membrana-Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 pm. Escoger el
tipo de material del filtro de manera que la eficiencia en la retención de bacterias no se vea afectada por los componentes de
la muestra a investigar. Usar un filtro de membrana para cada uno de los microorganismos mencionados.
Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilu-
ción y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana (que preferiblemente represente 1 g del producto, o menos si se
espera un gran número de ufc) al filtro de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volu-
men adecuado de diluyente.
Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA), transferir el filtro de membrana a la superficie del
Agar Digerido de Caseína y Soja. Para determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL),
transferir la membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar las placas según se indica en la Tabla 1. Realizar el
recuento.
Métodos de Recuento en Placa-Aplicar los métodos de recuento en placa al menos por duplicado para cada medio y
usar el recuento medio del resultado.
Método de Vertido en Placa-Para placas de Petri de 9 cm de diámetro, agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada
según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana y
de 15 a 20 ml de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la temperatura de ambos medios a
no más de 45º. Si se emplean placas de Petri más grandes, aumentar la cantidad del medio de agar proporcionalmente. Em-
plear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 1.
Incubar las placas según se indica en la Tabla 1. Tomar la media aritmética de los recuentos obtenidos en cada medio y
calcular el número de ufc en el inóculo original.
Método de Extensión en Superficie-Agregar de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa a
cada placa de Petri de 9 cm de diámetro, aproximadamente a 45º, y dejar solidificar. Si se emplean placas de Petri más gran-
des, aumentar el volumen del agar proporcionalmente. Secar las placas, por ejemplo, en un gabinete con flujo de aire laminar
o en una incubadora. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 1. Esparcir un
volumen medido de no menos de O, 1 mL de la muestra, preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y
Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento
según se indica en Método de Vertido en Placa.
Método del Número Más Probable (NMP)-La precisión y exactitud del Método del NMP son menores que las del méto-
do de Filtración por Membrana o el Método de Recuento en Placa. Los resultados no confiables se obtienen particularmente para
el recuento de hongos filamentosos. Por estas razones, el Método del NMP se reserva para el RTMA en situaciones en las que no
haya otro método disponible. Si se justifica el empleo del método, proceder de la siguiente manera:
Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales en serie del producto según se indica en Preparación de la Muestra,
Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de Actividad Antimicrobiana. A partir de cada nivel de dilución, usar tres alí-
cuotas de 1 g o 1 ml para inocular tres tubos con 9 a 1 O ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, se puede
agregar al medio un agente tensoactivo, tal como polisorbato 80, o un inactivador de agentes anti microbianos. Por lo tanto, si
se preparan tres niveles de dilución, inocular nueve tubos.
Incubar todos los tubos a una temperatura de 30º a 35º durante no más de 3 días. Si la lectura de los resultados resulta
difícil o dudosa dada la naturaleza del producto a examinar, subcultivar en el mismo caldo o en Agar Digerido de Caseína y Soja
durante un período de 1 a 2 días a la misma temperatura y usar estos resultados. A partir de la Tabla 3, determinar el número
más probable de microorganismos por g o por ml del producto a examinar.
Tabla 3. Valores del Número Más Probable de Microorganismos
Combinaciones Observadas de Números de NMP porgo Límites
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada por ml de de Confianza
Juego Producto de 950/o
Número de g o ml de Producto por Tubo
0,1 0,01 0,001
o o o <3 0-9,4
o o 1 3 0,1-9,5
o 1 o 3 0,1-10
o 1 1 6,1 1,2-17
o 2 o 6,2 1,2-17
o 3 o 9,4 3,5-35
 68 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Mícrobíológícas USP 37

Tabla 3. Valores del Número Más Probable de Microorganismos (Continuación)

Combinaciones Observadas de Números de NMP porgo Límites
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada por ml de de Confianza
Juego Producto de95%
Número de g o ml de Producto por Tubo
0,1 0,01 0,001
1 o o 3,6 0,2-17
1 o 1 7,2 1,2-17
1 o 2 11 4-35
1 1 o 7,4 1,3-20
1 1 1 11 4-35
1 2 o 11 4-35
1 2 1 15 5-38
1 3 o 16 5-38
2 o o 9,2 1,5-35
2 o 1 14 4-35
2 o 2 20 5-38
2 1 o 15 4-38
2 1 1 20 5-38
2 1 2 27 9-94
2 2 o 21 5-40
2 2 1 28 9-94
2 2 2 35 9-94
2 3 o 29 9-94
2 3 1 36 9-94
3 o o 23 5-94
3 o 1 38 9-104
3 o 2 64 16-181
3 1 o 43 9-181
3 1 1 75 17-199
3 1 2 120 30-360
3 1 3 160 30-380
3 2 o 93 18-360
3 2 1 150 30-380
3 2 2 210 30-400
3 2 3 290 90-990
3 3 o 240 40-990
3 3 1 460 90-1980
3 3 2 1100 200-4000
3 3 3 >1100

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

Al verificar la aptitud del método de Filtración por Membrana o del Método de Recuento en Placa, se debe obtener un recuento
medio de cualquier microorganismo de prueba que no difiera en un factor mayor de 2 del valor del control definido en Inocu-
lación y Dilución en la ausencia del producto. Al verificar la aptitud del Método del NMP, el valor calculado a partir del inóculo
debe estar dentro de los límites de confianza de 95% de los resultados obtenidos con el control.
Si los criterios mencionados anteriormente no pueden cumplirse para uno o más de los microorganismos analizados con
cualquiera de los métodos descritos, se debe utilizar para examinar el producto, el método y las condiciones de prueba más
cercanas a esos criterios.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 69

PRUEBA DE PRODUCTOS

Cantidad Usada para la Prueba

A menos que se indique algo diferente, usar 1Og o 1O mL del producto a examinar, tomados con las precauciones mencio-
nadas anteriormente. Para líquidos o sólidos en forma de aerosol, muestrear 1O envases. Para parches transdérmicos, mues-
trear 1O parches.
Se puede reducir la cantidad a analizar de las sustancias activas que se formulan en las siguientes condiciones: la cantidad
por unidad de dosificación (por ej., tableta, cápsula, inyección) es menor o igual a 1 mg o la cantidad por g o mL (para prepa-
raciones que no se presentan en unidades de dosificación) es menor de 1 mg. En estos casos, la cantidad de la muestra a anali-
zar no es menor que la cantidad presente en 1O unidades de dosificación o 1O g o 1O mL del producto.
Para materiales que se usan como sustancias activas en los que la cantidad de la muestra es limitada o el tamaño de la parti-
da es extremadamente pequeño (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g), la cantidad analizada debe ser 1% de la partida a
menos que se indique, o justifique y autorice una cantidad menor.
Para productos cuyo número total de entidades en una partida es menor de 200 (por ej. muestras que se usan en ensayos
clínicos), el tamaño de la muestra puede reducirse a dos unidades o a una unidad si el tamaño es menor de 1OO.
Escoger la(s) muestra(s) aleatoriamente a partir del material a granel o de los envases disponibles de la preparación. Para
obtener la cantidad requerida, mezclar los contenidos de un número suficiente de envases para proporcionar la muestra.

Examen del Producto

FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Usar un aparato de filtración diseñado para permitir la transferencia del filtro al medio. Preparar la muestra empleando un
método cuya aptitud se haya demostrado según se indica en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Re-
cuento, transferir la cantidad adecuada a dos filtros de membrana y filtrar inmediatamente. Lavar cada filtro siguiendo el proce-
dimiento que haya demostrado su aptitud.
Para determinar el RTMA, transferir uno de los dos filtros de membrana a la superficie del Agar Digerido de Caseína y Soja.
Para determinar el RTCHL, transferir la otra membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar la placa de Agar
Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 3 a 5 días y la placa de Agar Sabouraud
Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º durante un período de 5 a 7 días. Calcular el número de ufc por g o por mL del
producto.
Al examinar los parches transdérmicos, filtrar por separado 10% del volumen de la preparación descrita en Preparación de la
Muestra a través de cada una de las dos membranas de filtración estériles. Transferir una membrana al Agar Digerido de Caseína
y Soja para el RTMA y la otra membrana al Agar Sabouraud Dextrosa para el RTCHL.

MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACA

Método de Vertido en Placa-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se des-
cribe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para cada
medio por cada nivel de dilución. Incubar las placas de Agar Digerido de Caseína y Soja a una temperatura entre 30º y 35º
durante un período de 3 a 5 días y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa á una temperatura entre 20º y 25º durante un perío-
do de 5 a 7 días. Escoger las placas correspondientes a una dilución determinada y que muestren el mayor número de colo-
nias, menor de 250 para el RTMA y 50 para el RTCHL. Tomar la media aritmética de los recuentos por medio de cultivo y cal-
cular el número de ufc por g o por mL del producto.
Método de Extensión en Superficie-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según
se describe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para
cada medio y cada nivel de dilución. Para la incubación y cálculo del número de ufc, proceder según se indica en el Método de
Vertido en Placa.

MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

Preparar y diluir la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se describe en Prueba de Promo-
ción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Incubar todos los tubos durante un período de 3 a 5 días a una tempera-
tura de 30º a 35º. Subcultivar, si fuera necesario, empleando el procedimiento cuya aptitud se haya demostrado. Registrar para
cada nivel de dilución el número de tubos que muestran crecimiento microbiano. A partir de la Tabla 3, determinar el número
más probable de microorganismos por g o por mL del producto a examinar.
 70 (61) Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas USP 37

Interpretación de los Resultados

El recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) se considera equivalente al número de ufc encontrado usando Agar
Digerido de Caseína-Soja; si se detectan colonias de hongos en este medio, contarlas como parte del RTMA. El recuento total
combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se considera equivalente al número de ufc encontrado empleando
Agar Sabouraud Dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este medio, contarlas como parte del RTCHL. Cuando se espe-
ra que el RTCHL exceda el criterio de aceptación debido al crecimiento bacteriano, se puede usar Agar Sabouraud Dextrosa que
contenga antibióticos. Si se realiza el recuento mediante el Método del MNP, el valor calculado es RTMA.
Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, éste se interpreta de la siguiente manera:
- 10 1 ufc: recuento máximo aceptable = 20;
- 102 ufc: recuento máximo aceptable = 200;
- 10 3 ufc: recuento máximo aceptable = 2000;
y así sucesivamente.
Las soluciones y medios recomendados se indican en Pruebas de Microorganismos Específicos (62).

(62) EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO

ESTÉRILES: PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS

INTRODUCCIÓN

Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán determinar la ausencia, o presencia limitada, de microorganismos
específicos que puedan ser detectados en las condiciones descritas.
Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con alguna especifi-
cación establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a con-
tinuación, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo.
Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluyendo métodos automatizados, siempre que se haya de-
mostrado su equivalencia con el método farmacopeico.

PROCEDIMIENTOS GENERALES

La preparación de muestras se realiza según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento
Microbiano (61 ).
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible
según se describe en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar su ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado, según se describe en Examen Microbiológico de Produc-
tos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).

PROPIEDADES DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS,

APTITUD DE LA PRUEBA Y CONTROLES NEGATIVOS

Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar. Se debe
confirmar la aptitud de la prueba si se introduce un cambio en la ejecución de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados.

Preparación de Cepas de Prueba

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba según se indica más abajo. Las técnicas de mantenimiento de
cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inocu-
lación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original.

MICROORGANISMOS AEROBIOS

Cultivar por separado cada cepa bacteriana de prueba en recipientes que contengan Caldo Digerido de Caseína y Soja o Agar
Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Cultivar por separado la cepa
USP 37 Pruebas Microbiológicos/ (62) Examen Microbiológico 71

de prueba de Candida albicans en Agar Sabouraud Dextrosa o Caldo Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º duran-
te un período de 2 a 3 días.
Staphyfococcus aureus Por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276
Pseudomonas aeruginosa Por ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC
13275
Escherichia cofi Por ejemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 o NBRC
3972
Safmonefla enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o, como alternativa, Por ejemplo ATCC 14028
Salmonefla enterica subesp. enterica serovar Abony Por ejemplo NBRC 100797, NCTC 6017 o CIP 80.39
Candida a/bicans Por ejemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 o NBRC 1594

Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7, O o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para preparar
las suspensiones de prueba. Usar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una tempe-
ratura de 2º a 8º.

CLOSTRIDIOS

Usar Clostridium sporogenes, como por ejemplo ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) o ATCC 19404
(NCTC 532 o CIP 79.3). Cultivar la cepa clostridial de prueba en condiciones anaeróbicas en Medio Reforzado para Clostridios a
una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Como alternativa para la preparación y posterior dilución
de una suspensión fresca de las células vegetativas de CI. sporogenes, se emplea una suspensión estable de esporas para la ino-
culación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º durante un período
validado.

Control Negativo

Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la prepa-
ración de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.

Propiedades de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes. Verificar las propiedades adecuadas de los medios pertinentes según se indica en la Tabla 7.
Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios
Prueba/Medio Propiedad Cepas de Prueba
Prueba eara bacterias Gram-negativas tolerantes a la bilis
Caldo Mossel para Enriquecimiento de En- Promoción del crecimiento E. coli
terobacterias
P. aeruginosa
Inhibitoria S. aureus
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa Promoción del crecimiento+ Indicadora E. coli
P. aeruginosa
Prueba de Escherichia coli
Caldo MacConkey Promoción del crecimiento E. cofi
Inhibitoria S. aureus
Agar MacConkey Promoción del crecimiento + Indicadora E. co/i
Prueba de Salmonella
Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enrique- Promoción del crecimiento Safmonefla enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
cimiento de Salmonella rium o
Salmonefla enterica subesp. enterica serovar Abony
Inhibitoria S. aureus
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato Promoción del crecimiento + Indicadora Safmonefla enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
rium o
Salmonefla enterica subesp. enterica serovar Abony
Prueba de Pseudomonas aeruginosa
Agar Cetrimida Promoción del crecimiento P. aeruginosa
 72 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 37

Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios (Continuación)
Prueba/Medio [ Propiedad [ Cepas de Prueba
[ Inhibitoria [ E. coli
Prueba de StaQhi¿lococcus aureus
Agar Manito! Salado [ Promoción del crecimiento + Indicadora [ S. aureus
[ Inhibitoria [ f. co/i
Prueba de Clostridios
Medio Reforzado para Clostridios 1 Promoción del crecimiento [ CI. sporogenes
Agar Columbia 1 Promoción del crecimiento [ C/. sporogenes
Prueba de Candida albicans
Caldo Sabouraud Dextrosa 1 Promoción del crecimiento 1 C. albicans
Agar Sabouraud Dextrosa [ Promoción del crecimiento + Indicadora 1 C. albicans

Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Líquidos-Inocular una porción del medio apropia-
do con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada duran-
te un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de micro-
organismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Sólidos-Usar el Método de Extensión en Superficie
(ver Métodos de Recuento en Placa en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), ino-
culando cada una de las placas con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la
temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimien-
to de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades Inhibitorias, Medios Sólidos o Líquidos-Inocular el medio apropiado con al menos 100 ufc
del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no menor del período mayor indica-
do en la prueba. No se produce crecimiento del microorganismo de prueba.
Prueba de las Propiedades Indicadoras-Usar el Método de Extensión en Superficie (ver Métodos de Recuento en Placa en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), inoculando cada una de las placas con
un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un
período que se encuentre en el intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indi-
cadoras, a aquellas anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente.

Aptitud del Método de Prueba

Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la muestra según se indica en el párrafo pertinente en
Pruebas de Productos. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio de crecimiento indicado. Inocular
individualmente las cepas de prueba. Usar un número de microorganismos equivalente a no más de 100 ufc en la preparación
de prueba inoculada.
Realizar la prueba según se indica en el párrafo pertinente en Pruebas de Productos empleando el período más corto de incu-
bación indicado.
Se deben detectar los microorganismos específicos con las reacciones indicaqoras según se describe en Pruebas de Productos.
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificación del procedimiento de la prueba (ver Neutrali-
zación/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Micro-
biano (61 )).
Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con respecto al microorganismo para el cual se indica la prue-
ba no puede neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no estará presente en el producto.

PRUEBAS DE PRODUCTOS

Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis

Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra empleando una dilución 1 en 1O de no menos de
1 g del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
(61 ), excepto que se debe usar Caldo Digerido de Caseína y Soja como diluyente de elección, mezclar e incubar a una tempera-
tura de 20º a 25º durante un período suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicación de los orga-
nismos (por lo general 2 horas pero no más de 5 horas).
Prueba de Ausencia-A menos que se indique algo diferente, usar un volumen correspondiente a 1 g del producto, según
se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa, para inocular Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias.
Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis
Glucosa. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 73

El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.

Prueba Cuantitativa-
Se/ección y Subcultivo-lnocular cantidades adecuadas de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con la prepa-
ración según se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa y/o diluciones de la misma que contengan respectiva-
mente O, 1 g; 0,01 g y 0,001 g (ó 0, 1 ml; 0,01 ml y 0,001 ml) del producto a examinar. Incubar a una temperatura de 30º a
35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar cada uno de los cultivos en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa.
Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la menor cantidad del producto que pro-
duce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado negativo. Determinar la cantidad probable de bacte-
rias a partir de la Tabla 2.
Tabla 2. Interpretación de Resultados
Resultados para Cada Cantidad
del Producto Cantidad Probable de Bacterias por
0,1go0,1 ml 0,01 g o 0,01 ml 0,001 g o 0,001 ml g o ml del Producto
+ + + más de 10 3
+ + - menos de 10 3 y más de 102
+ - - menos de 1 02 y más de 1 O
- - - menos de 10

Escherichia coli
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g
del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe
en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º duran-
te un período de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo-Agitar el recipiente, transferir 1 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 100 ml de Caldo MacCon-
key e incubar a una temperatura de 42º a 44º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en una placa de Agar MacCon-
key a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E. coli. Esto se confirma mediante pruebas de
identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación son negati-
vos.

Sa/monel/a
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar una cantidad correspondiente a no menos de 1O g ó
1O ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digeri-
do de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo-Transferir O, l ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 1Oml de Caldo Rappaport-Vassiliadis para
Enriquecimiento de Salmonella e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Subcultivar en
placas de Agar Xi/osa Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 48 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias bien desarrolladas de color rojo, con o sin centros negros indica la posible pre-
sencia de Salmonella. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificación confirmatorias son negativos.

Pseudomonas aeruginosa
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g
del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe
en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el volu-
men de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a través de un filtro de membrana estéril
y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a
24 horas.
 74 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 37

Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Cetrimida e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un
período de 18 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de P. aeruginosa. Esto se confirma mediante pruebas
de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación confirma-
torias son negativos.

5taphylococcus aureus

Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1 O de no menos de 1 g
del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe
en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Cmema y Soja y homogenizar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el
volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a través de un filtro de membrana estéril
y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a
24 horas.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Manito/ Salado e incubar a una temperatura de 30º a 35º duran-
te un período de 18 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias amarillas o blancas rodeadas de una zona amarilla indica la posible presencia de
S. aureus. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificación confirmatorias son negativos.

Clostridios

Preparación de la Muestra y Tratamiento Térmico-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1 O (con un volumen
total mínimo de 20 ml) de no menos de 2 g o 2 ml del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Pro-
ductos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ). Dividir la muestra en dos porciones de al menos 1 O ml. Calentar una
porción a 80º durante 1 O minutos y enfriar rápidamente. No calentar la otra porción.
Selección y Subcultivo-Usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml del producto a analizar de ambas porcio-
nes para inocular cantidades adecuadas (determinadas según se indica en Aptitud del Método de Prueba) de Medio Reforzado
para Clostridios. Incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 30º a 35º durante 48 horas. Después de la incuba-
ción, realizar subcultivos a partir de cada recipiente en Agar Columbia e incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatu-
ra de 30º a 35º durante 48 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento anaeróbico de bacilos (con o sin endosporas) que dan una reacción de catalasa negativa
indica la presencia de Clostridios.
Esto se confirma mediante pruebas de identificación. Si no se detectan colonias de los tipos descritos o si las pruebas de
identificación confirmatorias resultan negativas, el producto cumple con la prueba.

Candida albicans
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a no menos de 1 g ó
1 ml, para inocular 100 ml de Caldo Sabouraud Dextrosa y mezclar. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un perío-
do de 3 a 5 días.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Sabouraud Dextrosa e incubar a una temperatura de 30º a 35º
durante un período de 24 a 48 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias blancas puede indicar la presencia de C. albicans. Esto se confirma mediante
pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan tales colonias o si las pruebas de identificación confirmatorias resultan
negativas.

SOLUCIONES RECOMENDADAS Y
MEDIOS DE CULTIVO

NOTA-Esta sección se proporciona como información.

Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales
se indican en la prueba de contaminación microbiana en la Farmacopea. Se pueden usar otros medios siempre que se pueda
demostrar su aptitud.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ <62) Examen Microbiológico 75

Solución Amortiguadora Madre-Transferir 34 g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico de 1 000 ml,
disolver en 500 ml de Agua Purificada, ajustar con hidróxido de sodio a un pH de 7,2 ± 0,2, agregar Agua Purificada a volumen
y mezclar. Dispensar en recipientes y esterilizar. Almacenar a una temperatura de 2º a 8".
Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2-Preparar una mezcla de Agua Purificada y Solución Amortiguadora Madre
(800:1 v/v) y esterilizar.

Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona

de pH 7,0
Fosfato Monobásico de Potasio 3,6 g
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato 7,2 g (equivalente a fosfato 0,067 M)
Cloruro de Sodio 4,3 g
Peptona (de carne o caseína) 1,0 g
Agua Purificada 1000 ml
-~~·---·----

Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Caldo Digerido de Caseína y Soja

Digerido Pancreático de Caseína 17,0 g
Digerido Papaínico de Soja 3,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g
Glucosa Monohidrato 2,5 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Digerido de Caseína y Soja

Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g
Digerido Papaínico de Soja 5,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 40,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido 10,0 g
Animal y Digerido Pancreático de
Caseína (1 :1)
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Papa Dextrosa

Infusión de papas 200 g
Dextrosa 20,0 g
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Caldo Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 20,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido 10,0 g
Animal y Digerido Pancreático de
Caseína (1: 1)
 76 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 37

Caldo Sabouraud Dextrosa

Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25°. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias

Digerido Pancreático de Gelatina 10,0 g
Glucosa Monohidrato 5,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 20,0 g
Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 g
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato 8,0 g
Verde Brillante - - -------- __J~_rnJL -
- ·--~---· ----- -------

Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,2 ± 0,2 a 25º. Calentar a 100º durante 30 minutos y enfriar inme-
diatamente.

Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa

Extracto de Levadura 3,0 g
Digerido Pancreático de Gelatina 7,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Glucosa Monohidrato 10,0 g
Agar 15,0 g
Rojo Neutro 30 mg
Cristal Violeta 2 mg
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar hasta el punto de ebullición; no calentar
en autoclave.

Caldo MacConkey
Digerido Pancreático de Gelatina 20,0 g
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 5,0 g
Púrpura de Bromocresol 10mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar MacConkey
Digerido Pancreático de Gelatina 17,0 g
Peptonas (de carne y caseína) 3,0 g
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Agar 13,5 g
Rojo Neutro 30,0 mg
Cristal Violeta 1 mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7, 1 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición durante 1 minuto, agitando
constantemente, y luego esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 77

Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enriquecimiento de

Salmonella
Peptona de Soja 4,5 g
Cloruro de Magnesio Hexahidrato 29,0 g
Cloruro de Sodio 8,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 0,4 g
Fosfato Monobásico de Potasio 0,6 g
Verde de Malaquita 0,036 g
Agua Purificada 1000 mL

Disolver, calentando ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado a una temperatura que no exceda de
115º. El pH debe ser de 5,2 ± 0,2 a 25º luego del calentamiento y esterilización en autoclave.

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato

Xi losa 3,5 g
L-Lisina 5,0 g
Lactosa Monohidrato 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
Rojo de Fenal 80 mg
Agar 13,5 g
Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Tiosulfato de Sodio 6,8 g
Citrato Férrico Amónico 0,8 g
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición, enfriar a 50º y verter en
placas de Petri. No calentar en un autoclave.

Agar Cetrimida
Digerido Pancreático de Gelatina 20,0 g
Cloruro de Magnesio 1,4 g
Sulfato de Potasio 10,0 g
Cetrimida 0,3 g
Agar 13,6 g
Agua Purificada 1000 mL
Glicerol 10,0 mL

Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,2 ± 0,2 a
25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Agar Manitol Salado

Digerido Pancreático de Caseína 5,0 g
Digerido Péptico de Tejido Animal 5,0 g
Extracto de Carne 1,0 g
o-Manito! 10,0 g
Cloruro de Sodio 75,0 g
Agar 15,0 g
Rojo de Fenal 0,025 g
Agua Purificada 1000 mL

Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,4 ± 0,2 a
25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Medio Reforzado para Clostridios

Extracto de Carne 10,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
 •
78 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 37

~ Medio Reforzado para Clostridios

~Air111_cio~i_
1
SolLJ_li¡e
Glucosa Monohidrato
- -.-~ ~~---~=--======:=:------------------·- -------L------ _ _l_~O_g_
5,0 g
_____

~;~~~-r:_~º_sd_o~~i,te_í~_-"-_-~~-----_-_- -_-_-_~~----~-------~---------~~-------=--=-=-=========---=--=-=-=-~--+----=-~----=--~===~=:-~-~~:============~__,
Acetato de Sodio
_-_-_-:-
_ __
>-----------------------·--·-----·--------------+----------~----------<
3,0 g
Aga_r__________________________ ·------------------------~-----------º·~'-S~g~--------<
~gua Purificada 1000 ml

Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que después de la esterilización sea de 6,8 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
¡--· ----------------------
_ ___ J\9ar Colu111_1Ji¡¡ ______ _
_ Digerido l'ancreáticCJ_CJ_e Cas_E'.1'1<l__ _________._ 1 º~'-º~g~---------1
_ ____
5,._0~g'-----------1
Digerido Péptico de Car_ne__________________________________-+-_ _ _ _ _ _ _ _
Digerido Pancreático de Corazón 3,0 g
Extracto de Levadura 5,0 g
Almidón de Maíz 1,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Agar, de acuerdo con la capacidad de
gelificación 10,0-15,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Dejar enfriar a
una temperatura de 45º a 50º, agregar, cuando sea necesario, sulfato de gentamicina correspondiente a 20 mg de gentamici-
na base y verter en placas de Petri.

(63) PRUEBAS PARA MICOPLASMAS

INTRODUCCIÓN

El género micoplasma representa un grupo de bacterias diminutas que no tienen pared celular. Este género comprende más
de 120 especies. Son los organismos procariotas autorreplicantes más pequeños. Las células varían en tamaño y morfología y
no se pueden colorear con Gram, pero las impresiones de las colonias sobre agar sólido se pueden colorear con azul de metile-
no o una tinción equivalente. Los micoplasmas son parásitos y comensales, y algunos pueden ser patógenos para una gran
variedad de huéspedes animales y vegetales. En humanos, los micoplasmas son por lo general parásitos de superficie que colo-
nizan el epitelio de los tractos respiratorio y urogenital. Los micoplasmas son comunes y pueden ser causa de contaminación
seria en los cultivos de células y/o tejidos usados para producir artículos farmac'opeicos. También pueden causar contamina-
ción en el caldo de digestión de caseína de soja filtrado y esterilizado. Una infección en un cultivo celular puede persistir por
un periodo prolongado sin causar un daño celular aparente. La infección de las células en un cultivo puede afectar práctica-
mente todas las vías del metabolismo celular, alterando incluso las características fenotípicas de las células y su crecimiento
normal. La presencia de especies de micoplasma no siempre trae como resultado turbidez debido a crecimiento en los cultivos
o una alteración visible de las células.
La prueba para detección de micoplasmas es un requisito necesario de control de calidad para garantizar de manera confia-
ble la pureza de los productos biotecnológicos y de los materiales afines usados para producir dichos productos. Este capítulo
de pruebas generales describe dos métodos requeridos para detectar la contaminación por micoplasma en los artículos de
prueba y en los cultivos tisulares y/o celulares usados para producir dichos artículos, caldos de digestión o cualquier otro mate-
rial en el que se sospeche contaminación por micoplasma. Estos son: (A) el procedimiento en medios de agar y caldos y (B) el
procedimiento en cultivo de células indicadoras. Estas pruebas requieren una cuidadosa técnica aséptica y condiciones de labo-
ratorio apropiadas. Con el fin de garantizar que las pruebas y la interpretación de los resultados sean apropiadas, el personal
debe estar adecuadamente capacitado y calificado. Para detectar micoplasmas se puede utilizar una técnica validada de ampli-
ficación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) o un método basado en la actividad enzimática, siempre que el
método usado demuestre ser comparable con ambos métodos (A) y (B). Los métodos alternativos se deben validar apropiada-
mente. Los requisitos de validación para los métodos alternativos no se tratarán en este capítulo.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 79

MÉTODO DE CULTIVO

Elección de los Medios de Cultivo

La prueba se efectúa usando un número suficiente de medios de cultivo tanto sólidos como líquidos para garantizar el creci-
miento en las condiciones de incubación elegidas de pequeñas cantidades de micoplasmas (aproximadamente 100 unidades
formadoras de colonias o ufc; o 100 unidades cambiadoras de color, o ucc) que puedan estar presentes en el artículo o mate-
rial de prueba. Los medios de cultivo líquidos deben contener rojo de fenol. La gama de medios de cultivo escogidos ha de-
mostrado tener propiedades nutritivas satisfactorias al menos para los microorganismos que aparecen en Cepas de Microorga-
nismos de Prueba para Control de Calidad (a continuación). Las propiedades nutritivas de cada nuevo lote de medio de cultivo
se verifican para los microorganismos apropiados en la lista. Cuando se hagan las pruebas para micoplasmas se deben incluir
en cada una al menos dos especies o cepas conocidas de micoplasmas (listadas en Cepas de Microorganismos de Prueba para
Control de Calidad) como controles positivos, una de las cuales debe ser fermentadora de dextrosa (es decir, M. pneumoniae o
una especie y cepa equivalente) y la otra debe ser hidrolizadora de arginina (es decir, M. ora/e o una especie y cepa equivalen-
te). Solo al examinar líneas celulares de insectos se debe incluir una cepa de control de espiroplasma (p.ej., 5. citri ATCC 29747,
S. melliferum ATCC 29416 o una especie y cepa equivalente). Adicionalmente, estas cepas pueden ser un poco más exigentes
en sus requerimientos nutricionales. Necesitan temperaturas de incubación más bajas (al igual que las líneas celulares de insec-
tos).

Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad

Los cultivos de controles positivos no deben tener más de 15 pases desde el aislamiento. Las especies o cepas de micoplas-
mas aptas para el uso se enumeran a continuación:
- Acholep/asma /aidlawii (vacunas y/o materiales derivados de células o cultivos para uso humano y veterinario cuando se ha
usado un antibiótico durante la producción)
- M. gallisepticum (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el cultivo celular están
destinados al uso en aves de corral)
- M. hyorhinis (vacunas o cultivos celulares veterinarios no aviares)
- M. ora/e (vacunas para uso humano y veterinario)
- M. pneumoniae (vacunas o bancos de células para uso humano) u otras especies apropiadas de fermentadores de o-gluco-
sa como M. fermentans
- M. synoviae (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el banco de células está desti-
nado al uso en aves de corral)
Las cepas de prueba pueden ser aislados de campo que han sufrido un número limitado de subcultivos (no más de 15), se
almacenan congeladas (-20º o menos) o liofilizadas y se identifican como pertenecientes a las especies requeridas, por compa-
ración con cultivos tipo, por ejemplo, los que aparecen en la Tabla 7.
Tabla 1. Cultivos Tipo para Identificar Aislados de Campo Usados como Cepas de Prueba
Organismo de Prueba Número NCTC Número CIP Número ATCC
A. laidlawii NCTC 10116 CIP 75,27 ATCC 23206
M. gallisepticum NCTC10115 CIP 104967 ATCC 19610
M. fermentans NCTC 10117 CIP 105680 ATCC 19989
M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981
M. ora/e NCTC10112 CIP 104969 ATCC 23714
M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531
M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204

Condiciones de Incubación

Incubar los medios de cultivo líquidos en recipientes herméticamente tapados a 36 ± 1 º. Incubar los medios de cultivo sóli-
dos en condiciones microaerofílicas (atmósfera de hidrógeno que contenga< 0,5% de oxígeno y/o nitrógeno que contenga
5% a 10% de dióxido de carbono en nitrógeno). Debe aportarse la humedad suficiente para evitar la desecación de la superfi-
cie del agar a 36 ± 1 º.

Propiedades Nutritivas

Efectuar la prueba de propiedades nutritivas para cada nueva partida de medio de cultivo. Inocular el medio de cultivo elegi-
do con los microorganismos de prueba apropiados; no usar más de 1 00 ufc por placa que contenga al menos 9 mL de medio
de cultivo sólido y por recipiente de 1 00 mL de medio de cultivo líquido; usar una placa y un recipiente aparte para cada espe-
cie de microorganismo. Incubar el medio de cultivo y hacer subcultivos a partir de 0,2 mL de medio líquido en medio sólido a
80 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas USP 37

los intervalos especificados (ver a continuación en Prueba de Micoplasmas en el Material o Artículo de Prueba). El medio sólido
cumple con la prueba si se encuentra un recuento dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas de la cantidad inoculada
para cada microorganismo de prueba. El medio líquido cumple con la prueba si se encuentra crecimiento en las placas de agar
subcultivadas a partir del caldo, por lo menos en 1 subcultivo para cada microorganismo de prueba. El uso de un microscopio
con un aumento de 1 OOx o mayor puede ser útil.

Sustancias lnhibidoras

La prueba de sustancias inhibidoras se efectúa una vez para un producto determinado y se repite siempre que haya un cam-
bio en el método de producción que pueda afectar la detección de micoplasmas. Para demostrar la ausencia de sustancias
inhibidoras, llevar a cabo la prueba de propiedades nutritivas en presencia y ausencia del artículo o material de prueba. Si el
crecimiento de un microorganismo de prueba en más de 1 subcultivo ocurre en ausencia del artículo o material de prueba
antes que en su presencia, se encuentran presentes sustancias inhibidoras. Lo mismo es cierto si las placas directamente inocu-
ladas con el artículo o material de prueba no están dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas del número de colonias
de aquellas inoculadas sin el artículo o material de prueba. En ambos casos, las sustancias inhibidoras se deben neutralizar o
contrarrestar su efecto por un método apropiado; por ejemplo, por pase en sustratos que no contengan inhibidores o por dilu-
ción en un volumen mayor de medio antes de la prueba. Si se usa la dilución, se pueden usar volúmenes mayores de medio o
se puede dividir el volumen del inóculo en varios matraces de 1 00 ml. La eficacia de la neutralización o de otros procesos se
controla repitiendo la prueba de sustancias inhibidoras después de la neutralización.

Prueba para Micoplasmas en el Artículo o Material de Prueba

Inocular no menos de 1 O mL del ¡¡rtículo o material de prueba por 100 mL de cada medio líquido. Si ocurre un cambio de
pH significativo después de la adición del artículo o material de prueba, se restablece el valor original de pH del medio de
cultivo por medio de la adición de una solución estéril de hidróxido de sodio o de ácido clorhídrico. Inocular 0,2 mL del artícu-
lo o material de prueba en cada placa de medio sólido. Incubar el medio líquido durante 20 a 21 días. Incubar el medio sólido
durante no menos de 14 días, excepto para aquellas placas correspondientes al subcultivo de 20 a 21 días, las cuales se incu-
ban durante 7 días. Simultáneamente, incubar una porción de 100 mL, sin inóculo, de cada medio líquido y placa de agar,
como control negativo. En los días 2 a 4 después de la inoculación, subcultivar cada medio líquido por inoculación de 0,2 mL
al menos en 1 placa de cada medio sólido. Repetir el procedimiento entre los días 6 y 8, de nuevo entre los días 13 y 15 y una
vez más entre los días 19 y 21 de la prueba. Observar el medio líquido cada 2 ó 3 días y si se presenta un cambio de color,
subcultivar. Si un medio líquido muestra contaminación bacteriana o fúngica, la prueba es inválida. La prueba es válida si se
puede leer al menos 1 placa por medio y por día de inoculación. Incluir en la prueba controles positivos preparados por inocu-
lación de no más de 100 ufc de al menos 1 microorganismo de prueba en medio de agar o caldo. Cuando se lleve a cabo la
prueba de detección de micoplasmas periódicamente, se recomienda utilizar los microorganismos de prueba en rotación pe-
riódica. Los microorganismos de prueba usados son los listados en Elección de Jos Medios de Cultivo. Incubar los caldos nutritivos
y las placas en una atmósfera humidificada con condiciones microaerofílicas (5% a 10% de C0 2 ).

Interpretación de los Resultados

Al finalizar el periodo de incubación prescrito, examinar todos los medios sólidos inoculados en busca de la presencia de
colonias de micoplasmas. El producto cumple con la prueba si no ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplas-
mas. El producto no cumple con la prueba si ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplasmas en cualquiera de
los medios sólidos. La prueba es inválida si 1 o más de los controles positivos no muestra crecimiento de micoplasmas al me-
nos en 1 placa de subcultivo. La prueba es inválida si 1 o más de los controles negativos muestra crecimiento de micoplasmas.
Si se observan colonias sospechosas, usar un método validado apropiado para determinar si se deben a micoplasmas.

Soluciones y Medios Recomendados para el Método de Cultivo

NOTA-Esta sección se proporciona como información.

SOLUCIONES

Caldo de infusión de Corazón Vacuno

Corazón vacuno (para preparar la infusión) 500 g
Peptona o
1 g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada hasta 1 000 ml
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (63> Pruebas para Micoplasmas 81

Vitaminas Esenciales
Biotina 100 mg
Pantotenato de calcio 100 mg
Cloruro de colina 100 mg
Ácido fálico 100 mg
i-lnositol 200 mg
Nicotinamida 100 mg
Clorhidrato de piridoxal 100 mg
Riboflavina 10 mg
Clorhidrato de tiamina 100 mg
Agua destilada hasta 1000 ml

Agar, Purificado
Un agar altamente refinado para usar en microbiología e inmunología, preparado por un procedimiento de intercambio iónico que da como resultado
un producto con superior pureza, claridad y poder gelificante. Contiene los siguientes ingredientes:
Agua 12,2%
Cenizas 1,5%
Cenizas insolubles en ácido 0,2%
Cloro o
Fosfato (calculado como P7 0,) 0,3%
Nitrógeno total 0,3%
Cobre 8 ppm
Hierro 170 ppm
Calcio 0,28%
Magnesio 0,32%

Solución Salina Balanceada de Hanks (modificada)

Cloruro de sodio 6,4 g
Cloruro de potasio 0,32 g
Sulfato de magnesio heptahidrato 0,08 g
Cloruro de magnesio hexahidrato 0,08 g
Cloruro de calcio anhidro 0,112 g
Fosfato ácido disódico dihidrato 0,0596 g
Fosfato diácido de potasio anhidro 0,048 g
Agua destilada hasta 800 ml

Infusión de Cerebro-Corazón
Infusión de cerebro de ternero 200 g
Infusión de corazón vacuno 250 g
Proteosa peptona 10 g
Glucosa monohidrato 2g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato ácido disódico anhidro 2,5 g
Agua destilada hasta 1000 ml

Caldo PPLO
Infusión de corazón vacuno 50 g
Peptona 10 g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada hasta 1000 ml

MEDIOS

Se recomiendan los siguientes medios. Se pueden usar otros medios, siempre que cumplan los criterios dados en las seccio-
nes Elección de los Medios de Cultivo, Condiciones de Incubación, Propiedades Nutritivas y Sustancias lnhibidoras.
82 (63) Pruebas para Micoplasmas /Pruebas Microbiológicas USP 37

Medios de Hayflick
(recomendado para la detección general de micoplasmas)
1 Medio Líquido

~·
Caldo de infusión de corazón vacuno 90,0 ml
Suero de caballo (sin calentar) 20,0 ml
Extracto de levadura (250 g/L) (se recomienda extracto de levadura fresca) 10,0 ml
Rojo de fenal (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 UJ/ml) 0,25 ml
Ácido desoxirribonucleico (solución de 2 g/L) 1,2 ml
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Sólido
Preparar como se describió anteriormente, reemplazando el caldo de infusión de corazón vacuno por agar de infusión de corazón vacuno que conten-
lJd 15 g/L de dgclr.

Medios de Frey
(recomendado para la detección de M. synoviae)
Medio Líquido
Caldo de infusión de corazón vacuno 90,0 ml
Vitaminas esenciales 0,02S ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (inactivado a 56º durante 30 min) 12,0 ml
P.Nicotinamida adenina dinucleótido 1,0 ml
(solución de 1 O g/L)
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Rojo de fenol (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 UJ/ml) 0,25 ml
Mezclar las soluciones de p.nicotinamida adenina dinucleótido y clorhidrato de cisteína y después de 1O minutos agregar a Jos demás ingredientes.
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Sólido
Caldo de infusión de corazón vacuno 90,0 ml
Agar, purificado 1,4 g
Ajustar a un pH de 7,8; esterilizar en autoclave y Juego agregar:
Vitaminas esenciales 0,025 ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (sin calentar) 12,0 ml
p.Nicotinamida adenina dinucleótido (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Rojo de fenol (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml

Medios de Frlls
(recomendado para la detección de micoplasmas no aviares)
Medio Líquido
Solución salina balanceada de Hanks (modificada) 800 ml
Agua destilada 67 ml
Infusión de cerebro-corazón 135 ml
Caldo PPLO 248 ml
Extracto de levadura (1 70 g/L) 60 ml
Bacitraci na 250 mg
Meticilina 250 mg
Rojo de fenol (5 g/L) 4,5 ml
Suero de caballo 165 ml
Suero de cerdo 165 ml
Ajustar a un pH de 7,40 a 7,45
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 83

Medios de Friis
(recomendado para la detección de micoplasmas no aviares)
Medio Sólido
Solución salina balanceada de Hanks (modificada) 200 ml
DEAE-dextrano 200 mg
Agar, purificado 15,65 g
Mezclar bien y esterilizar en autoclave. Enfriar a 100º. Agregar a 1 740 ml de Medio Líquido como se describió anteriormente.

MÉTODO DE CULTIVO DE CÉLULAS INDICADORAS

Los cultivos celulares se tiñen con un colorante fluorescente que se une al ADN. Los micoplasmas se detectan por su patrón
de fluorescencia filamentoso o particulado característico sobre la superficie celular y, si la contaminación es abundante, en las
áreas vecinas. Las mitocondrias en el citoplasma se pueden teñir pero se distinguen fácilmente de los micoplasmas. Para sus-
pensiones virales, si la interpretación de los resultados se ve afectada por efectos citopáticos marcados, neutralizar el virus
usando un antisuero específico que no tenga efectos inhibidores sobre los micoplasmas o usar un sustrato de cultivo celular
que no permita el crecimiento del virus. Para demostrar la ausencia de efectos inhibidores del suero, efectuar las pruebas con
controles positivos en presencia y ausencia del antisuero.

Verificación del Sustrato

Usar células Vero o un cultivo celular equivalente (por ejemplo, la línea de células de producción) que tenga una eficacia
equivalente para detectar micoplasmas. Probar la eficacia de las células que se van a usar aplicando el procedimiento descripto
a continuación e inoculando no más de 100 ufc o ucc de microorganismos de cepas de referencia adecuadas de M. hyorhinis y
M. ora/e. Las células son adecuadas si se detectan ambas cepas de referencia. Las células indicadoras se deben subcultivar sin
antibióticos antes de usarlas en la prueba.

Método de Prueba

NOTA-Lo siguiente se proporciona como información.

SOLUCIONES

Solución Salina Amortiguada con Fosfato-

Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M-Disolver 13,61 g de fosfato monobásico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 M-Disolver 17,42 g de fosfato dibásico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4)---Combinar 3,6 mL de Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M, 16,4 mL de
Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 M, 8 g de cloruro de sodio, y 1 L de agua. Mezclar bien. Ajustar el pH si fuera necesario.
Solución Madre de Bisbenzimida-Disolver 5 mg de bisbenzimida en agua y diluir con el mismo disolvente hasta 100 ml.
Almacenar en la oscuridad.
Solución de Trabajo de Bisbenzimida-lnmediatamente antes de usar, diluir 100 µL de Solución Madre de Bisbenzimida
con Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4) hasta 100 ml.
Solución Amortiguadora de Fosfato-Citrato de pH 5,5-Mezclar 56,85 mL de una solución de 28,4 g/L de fosfato ácido
disódico anhidro y 43, 15 mL de una solución de 21 g/L de ácido cítrico.

MÉTODO

1. Sembrar el cultivo de células indicadoras con una densidad apropiada (por ejemplo, 2 x 104 a 2 x 1 os células/mL, 4 x 10 3 a
2,5 x 104 células/cm 2 ) que lleven a la confluencia después de 3 días de crecimiento. Inocular 1 mL del producto a exami-
nar en el recipiente con cultivo celular e incubar a 36±1 º.
2. Después de 3 días de incubación como mínimo, cuando las células hayan alcanzado la confluencia, hacer un subcultivo
sobre cubreobjetos en recipientes adecuados o sobre alguna otra superficie (por ejemplo, portaobjetos con cámara para
cultivo) adecuada para el procedimiento de prueba. Sembrar las células con baja densidad, de forma que puedan alcanzar
una confluencia del 50% después de 3 a 5 días de incubación. La confluencia completa impide la visualización de mico-
plasmas después de la tinción y debe evitarse.
3. Retirar el medio y enjuagar las células indicadoras con solución salina amortiguada con fosfato, pH 7,4; luego agregar una
solución fijadora adecuada (una mezcla recién preparada de 1 volumen de ácido acético glacial SR y 3 volúmenes de me-
tano! se considera adecuada cuando se usa bisbenzimida para la tinción).
4. Retirar la solución fijadora y lavar las células con Agua Purificada estéril. Secar los portaobjetos completamente si se van a
colorear más de 1 hora después (es preciso tener especial cuidado cuando se colorean las láminas después del secado
debido a los artefactos que se podrían producir).
84 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas USP 37

5. Agregar un colorante apto para ADN y dejar en reposo durante el tiempo adecuado (la solución de trabajo de bisbenzimi-
da y un tiempo de reposo de 1 O minutos se consideran adecuados).
6. Retirar el colorante y enjuagar la monocapa con Agua Purificada.
7. Montar cada cubreobjetos, cuando corresponda (una mezcla de volúmenes iguales de glicerol y Solución Amortiguadora
de Fosfato-Citrato de pH 5,5 es apropiada para el montaje). Examinar por fluorescencia (para la coloración con bisbenzimi-
da resulta apropiado usar un filtro de excitación de 330 nm a 380 nm y un filtro de barrera LP de 440 nm) con un au-
mento de 400x o mayor.
8. Comparar la apariencia microscópica de los cultivos de prueba con la de los controles negativos y positivos, buscando
fluorescencia extranuclear. Los micoplasmas producen puntitos o filamentos en el citoplasma de la célula indicadora.
También pueden producir puntitos y filamentos en los espacios intercelulares. Siguiendo el protocolo establecido durante
la validación, se examinan múltiples campos microscópicos.

Interpretación de los Resultados

El producto a examinar cumple con la prueba si no está presente la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es
inválida si los controles positivos no presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es inválida si los controles
negativos presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas.

(71) PRUEBAS DE ESTERILIDAD

•Algunas partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea
y/o la Farmacopea japonesa. Las partes no armonizadas están marcadas con los símbolos (•.) para indicar esta situación .•
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseñado para garantizar que una partida de un producto es estéril o ha sido
esterilizada. Esta garantía se consigue principalmente mediante la validación del proceso de esterilización o de los procedi-
mientos del procesamiento aséptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artículos cuya esterilidad es requerida por la Farmacopea. Sin embargo, un resul-
tado satisfactorio únicamente indica que no se han encontrado microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las
condiciones de la prueba.

PRECAUCIONES CONTRA LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA

La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones asépticas, por lo que, para lograr tales condiciones, el entorno de la
prueba debe adaptarse a la manera en que ésta se realice. Las precauciones para evitar la contaminación se deben tomar de
modo tal que no se afecte a ningún microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en las
que se efectúan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del área de trabajo y la realización
de controles apropiados.

MEDIOS DE CULTIVO Y TEMPERATURAS DE INCUBACIÓN

Los medios para la prueba se pueden preparar según se indica a continuación o se pueden usar medios equivalentes dispo-
nibles comercialmente siempre y cuando cumplan con los requisitos de la Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos
Aerobios, Anaerobios y Hongos.
Se ha hallado que los medios de cultivo siguientes son adecuados para la prueba de esterilidad. El Medio Líquido de Tioglico-
lato sirve principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo, también detecta bacterias aerobias. El Medio de
Digerido de Caseína y Soja es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias aerobias.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 85

Medio Líquido de Tiogllcolato

L-Cistina 0,5 g
Cloruro de Sodio 2,5 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra 5,5/5,0 g
Agar 0,75 g
Extracto de Levadura (soluble en agua) 5,0 g
Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g
Tioglicolato de Sodio 0,5 g
o Ácido Tioglicólico 0,3 ml
Solución de Resazurina Sódica (1 en 1000), recién preparada 1,0 ml
Agua Purificada 1000 ml

El pH después de la esterilización es de 7, 1 ± 0,2.

Mezclar la L-cistina, el agar, el cloruro de sodio, la dextrosa, el extracto de levadura y el digerido pancreático de caseína con
el agua purificada y calentar hasta su disolución. Disolver el tioglicolato de sodio o el ácido tioglicólico en la solución y, de ser
necesario, agregar hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, la solución tenga un pH de 7, 1 ± 0,2. Si
se requiere filtración, calentar nuevamente la solución sin llegar a ebullición y filtrar mientras está caliente a través de un papel
de filtro humedecido. Agregar la solución de resazurina sódica, mezclar y colocar el medio en recipientes adecuados, de forma
que la relación entre superficie y profundidad sea tal que no más de la mitad superior del medio haya experimentado un cam-
bio de color indicativo de la captación de oxígeno al final del período de incubación. Esterilizar usando un proceso validado. Si
el medio se almacena, mantenerlo a una temperatura entre 2º y 25º en un envase estéril y hermético. Si una porción mayor
que el tercio superior del medio ha adquirido un color rosado, el medio puede recuperarse una vez calentando los recipientes
en un baño de agua o en vapor fluente hasta que desaparezca el color rosado, y enfriar rápidamente tratando de evitar la
entrada de aire no estéril en el recipiente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido
validado.
El Medio Líquido de Tioglicolato debe incubarse a 30º-35º. Para productos que contienen un conservante mercurial que no se
pueden analizar mediante el método de filtración por membrana, se puede utilizar Medio Líquido de Tioglicolato incubado a
20º-25º en lugar de Medio de Digerido de Caseína y Soja, siempre y cuando haya sido validado según se indica en Prueba de
Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Es posible utilizar el siguiente medio de tioglicolato
alternativo para los casos en que se prescriba o justifique y autorice. Preparar una mezcla que tenga la misma composición que
la del Medio Líquido de Tioglicolato, pero omitiendo el agar y la solución de resazurina sódica. Esterilizar según se indica ante-
riormente. El pH después de la esterilización es 7, 1 ± 0,2. Calentar en un baño de agua antes de usar e incubar a 30º-35º bajo
condiciones anaeróbicas.
Medio de Digerido de Caseína y Soja
Digerido Pancreático de Caseína 17,0 g
Digerido Papaínico de Harina de Soja 3,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra 2,5/2,3 g
Agua Purificada 1000 ml

El pH después de la esterilización es de 7,3 ± 0,2.

Disolver los sólidos en el Agua Purificada, calentando ligeramente hasta lograr la disolución. Enfriar la solución a temperatura
ambiente y ajustar el pH con hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, se obtenga un pH de 7,3 ±
0,2. Filtrar el medio si fuera necesario para lograr una solución transparente, y verter en recipientes adecuados y esterilizar
usando un procedimiento validado. Almacenar a temperatura entre 2º y 25º en un recipiente estéril y bien cerrado, a menos
que se use inmediatamente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido validado.
El Medio de Digerido de Caseína y Soja debe incubarse a 22,5 ± 2,5º.

•Medios para Penicilinas o Cefalosporinas

Cuando deban usarse medios de prueba de esterilidad en el método de Inoculación Directa del Medio de Cultivo que se indica
en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar, modificar la preparación del Medio Líquido de Tioglicolato y del Medio de Digeri-
do de Caseína y Soja según se indica a continuación. Transferir aséptica mente a los recipientes de cada medio una cantidad de
,B-lactamasa suficiente para inactivar la cantidad de antibiótico presente en la muestra de prueba. Determinar la cantidad de ,B-
lactamasa requerida para inactivar el antibiótico empleando una preparación de ,B-lactamasa cuyo poder inactivante de penici-
linas o cefalosporinas haya sido valorado previamente. [NOTA-Los medios complementados con ,B-lactamasa también pueden
usarse en la prueba de filtración por membrana.]
 86 (71 > Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37

Alternativamente (en un lugar completamente separado del usado para las pruebas de esterilidad), confirmar que se incor-
pora una cantidad adecuada de /J-lactamasa en el medio, siguiendo cualquiera de los dos métodos indicados en Prueba de
Aptitud del Método, usando como desafío menos de 1 00 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococws aureus (ver
Tabla 7). Debe observarse un crecimiento microbiano típico del cultivo inoculado como confirmación de que la concentración
de /i-lactamasa es adecuada .•
Tabla 1. Cepas de Microorganismos de Prueba Adecuados para Usar en la Prueba de Promoción del Crecimiento y en la
Prueba de Aptitud del Método
Bacterias Aerobias
Staphy/ococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC
13276
Bacillus subtifis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa• 1 • ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bacteria anaerobia
Clostridium sporogenes• 2 • ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC
14293
Hongos
Candida a/bicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasi/iensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
(Aspergillus Niger)
• 1 Un microorganismo alternativo es Kocuria rhizophifa (Micrococcus luteus) ATCC 9341.+
• 2 Una alternativa para Clostridium sporogenes, cuando se desea usar un microorganismo no formador de esporas, es Bacteroides vulgatus (ATCC 8482) .•

Los medios usados cumplen con las pruebas siguientes, realizadas antes o en forma paralela, con la prueba sobre el produc-
to a examinar.

Esterilidad

Incubar porciones del medio durante 14 días. No se produce crecimiento de ningún organismo.

Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos

Evaluar cada lote de medio listo para usar, y cada partida de medio preparado ya sea a partir de medio deshidratado o mez-
clando los ingredientes. Las cepas adecuadas de microorganismos se indican en la Tabla 7.
Inocular porciones de Medio Líquido de Tiog/icolato con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos
siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aerugino-
sa y Staphylococcus aureus. •Inocular porciones de medio de tioglicolato alternativo con un número pequeño (no más de 100
ufc) de Clostridium sporogenes .• Inocular porciones de Medio de Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no más de
100 ufc) de los microorganismos siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Aspergillus
brasiliensis, Bacil/us subtilis y Candida a/bicans. Incubar durante no más de 3 días en el caso de bacterias y durante no más de 5
días en el caso de hongos. Las técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan
para que los microorganismos viables empleados para la inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de
siembra maestro original.
Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos.

•LÍQUIDOS DE DILUCIÓN Y LAVADO PARA FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Líquido A

PREPARACIÓN

Disolver 1 g de digerido péptico de tejido animal en agua para obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para clarificar, si fuera
necesario, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado.

PREPARACIÓN PARA PENICILINAS O CEFALOSPORINAS

Agregar aséptica mente a la Preparación anterior, si fuera necesario, una cantidad de ft-lactamasa estéril suficiente para inacti-
var cualquier actividad residual de antibióticos en las membranas después de haber filtrado la solución de la muestra de prue-
ba (ver Medios para Penicilinas o Cefalosporinas).
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 87

Líquido D

Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Líquido A, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a er.v.:ises y esteri!iz.:ir
empleando un proceso validado. Usar este líquido para artículos que contengan lecitina o aceite, o para dispositivos etiqueta-
dos "para administración estéril".

Líquido K

Disolver 5,0 g de digerido péptico de tejido animal, 3,0 g de extracto de carne bovina y 10,0 g de polisorbato 80 en agua
para obtener 1 litro. Ajustar el pH para obtener, después de la esterilización, un pH de 6,9 ± 0,2. Transferir a envases y esterili-
zar empleando un proceso validado .•

PRUEBA DE APTITUD DEL MÉTODO

Llevar a cabo una prueba según se describe más adelante en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar usando exacta-
mente los mismos métodos, a excepción de las modificaciones siguientes.

Filtración por Membrana

Después de transferir a la membrana el contenido del envase o envases a analizar, agregar un inóculo de un número peque-
ño de microorganismos viables (no más de 100 ufc) en la porción final del diluyente estéril usado para enjuagar el filtro.

Inoculación Directa

Después de transferir al medio de cultivo el contenido del envase o envases a analizar (para catgut y otros materiales de
sutura quirúrgica para uso veterinario: hebras), agregar al medio un inóculo de un número pequeño de microorganismos via-
bles (no más de 100 ufc).
En ambos casos, usar los mismos microorganismos que los mencionados anteriormente en Prueba de Promoción del Creci-
miento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Realizar una prueba de promoción del crecimiento como control positivo.
Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no más de 5 días.
Si después de la incubación se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con
el del recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal
actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones.
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, comparable visualmente con el de
los recipientes de control sin producto, el producto posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente
en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la Prueba
de Aptitud del Método.
Esta prueba de aptitud del método se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad tiene que realizarse en un producto
nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del método
podrá llevarse a cabo simultáneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.

PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL PRODUCTO A EXAMINAR

•Número de Artículos a Evaluar

A menos que se especifique algo diferente en otra parte de este capítulo o en la monografía individual, evaluar el número de
artículos especificado en la Tabla 3. Si el contenido de cada artículo está en cantidad suficiente, (ver la Tabla 2) se puede divi-
dir para agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones iguales y apropiadas. [NOTA-Realizar las pruebas de
esterilidad empleando dos o más de los medios especificados.] Si cada artículo no contiene las cantidades suficientes para cada
medio, usar el doble del número de artículos indicado en la Tabla 3 .•
Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar para cada Medio
Cantidad Mínima a Usar
Cantidad por Envase (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Líquidos
Menos de 1 ml El contenido total de cada envase
1-40 ml La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 1 ml
Más de 40 ml y no más de 100 ml 20 ml
Más de 100 ml 10% del contenido del envase, pero no menos de 20 ml
Líquidos antibióticos 1 ml
 88 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37

Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar para cada Medio (Continuación)

Cantidad Mínima a Usar
Cantidad por Envase (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Preparaciones insolubles, cremas y ungüentos que deben suspenderse o emul- Usar el contenido de cada envase para suministrar no menos de 200 mg
sionarse
Sólidos
Menos de 50 mg El contenido total de cada envase
50 mg o más, pero menos de 300 mg La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg
300 mg-5 g 150 mg
Más de 5 g 500 mg
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario 3 secciones de una hebra (cada una de 30 cm de longitud)
•Apósito quirúrgico/algodón/gasa (en envases) 100 mg por envase
Material de sutura y otro material de un solo uso envasado individualmen- El dispositivo completo
te
Otros dispositivos médicos El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado ..

Tabla 3. Número Mínimo de Artículos a Evaluar en Relación con el Número de Artículos en la Partida
Número Mínimo de Artículos a Analizar para cada Medio
Número de Artículos en la Partida* (a menos que se justifique y autorice algo diferente)**
Preparaciones parenterales
No más de 100 envases 10% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 1 00 pero no más de 500 envases 1 O envases
Más de 500 envases 2% o 20 envases, lo que resulte menor
•Para preparaciones parenterales de gran volumen 2% o 1O envases, lo que resulte menor
Antibióticos sólidos
Envases a granel para farmacias (<5 g) 20 envases
Envases a granel para farmacias (~5 g) 6 envases
Graneles y mezclas Ver Productos sólidos a granel+
Preparaciones oftálmicas y otras preparaciones no inyectables
No más de 200 envases 5% o 2 envases, lo que resulte mayor
Más de 200 envases 1 O envases
Si el producto se presenta en la forma de envases monodosis, aplicar el
esquema mostrado anteriormente para preparaciones para uso parente-
ral.
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario 2% o 5 envases, lo que resulte mayor, hasta un total máximo de 20 enva-
ses
•No más de 100 artículos 10% o 4 artículos, lo que resulte mayor
Más de 100, pero no más de 500 artículos 1 O artículos
Más de 500 artículos 2% o 20 artículos, lo que resulte menor..
Productos sólidos a granel
Hasta 4 envases Cada envase
Más de 4 envases, pero no más de 50 envases 20% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 50 envases 2% o 1 O envases, lo que resulte mayor
• Si no se conoce el tamaño de la partida, usar el número máximo de artículos prescritos.
•• Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna da el número de envases necesarios para los dos medios juntos.

La prueba puede llevarse a cabo mediante la técnica de Filtración por Membrana o por Inoculación Directa del Medio de Cultivo
con el producto a examinar. Se incluyen controles negativos adecuados. La técnica de filtración por membrana se usa cuando
la naturaleza del producto lo permite, es decir, para preparaciones acuosas filtrables, para preparaciones alcohólicas o aceitosas
y para preparaciones miscibles con, o solubles en, disolventes acuosos o aceitosos, siempre que dichos disolventes no posean
un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.

Filtración por Membrana

Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm, cuya eficacia para retener microorganis-
mos haya sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo con-
tenido alcohólico; y se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones con alto contenido alcohólico. Es posi-
ble que para ciertos productos (p.ej., antibióticos) se necesiten filtros especialmente adaptados.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas / (71) Pruebas de Esterilidad 89

La técnica descrita más adelante supone que se usarán membranas de aproximadamente 50 mm de diámetro. Si se usan
filtros de un diámetro diferente, los volúmenes de las diluciones y los lavados deben ajustarse según corresponda. El aparato de
filtración y la membrana se esterilizan usando técnicas adecuadas. El aparato se disena de tal modo que la solución a examinar
se pueda introducir y filtrar en condiciones asépticas: permite retirar aséptica mente la membrana para transferirla al medio de
cultivo, o es adecuado para llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de agregarle el medio.

SOLUCIONES ACUOSAS

Si corresponde, transferir una pequeña cantidad de un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líqui-
dos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. a la membrana en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener
sustancias neutralizantes adecuadas y/o sustancias inactivantes apropiadas, por ejemplo, en el caso de los antibióticos.
Transferir a la membrana o membranas el contenido del envase o envases a analizar, si fuera necesario, después de diluirlo
hasta el volumen usado en la Prueba de Aptitud del Método con el diluyente estéril elegido, pero usando no menos de las canti-
dades del producto a examinar indicadas en las Tablas 2 y 3. Filtrar inmediatamente. Si el producto posee propiedades antimi-
crobianas, lavar la membrana no menos de tres veces, filtrando en cada lavado el volumen del diluyente estéril elegido usado
en la Prueba de Aptitud del Método. El ciclo de lavado no debe exceder de cinco lavados con 100 mL por filtro, cada uno, inclu-
so si durante la prueba de aptitud del método se ha demostrado que tal ciclo no elimina por completo la actividad antimicro-
biana. Transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla asépticamente en dos partes iguales y transferir cada
mitad a sendos medios adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio que el empleado en la Prueba de Aptitud del Méto-
do. Alternativamente, transferir el medio a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos de 14 días.

SÓLIDOS SOLUBLES

Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en
do, como por ejemplo el disolvente suministrado con la preparación, Agua
solución estéril adecuada como por ejemplo •Líquido A (Líquidos de Dilución
der con la prueba según lo indicado anteriormente para Soluciones Acuosas
elegido.
las Tablas 2 y 3 disuelto en un disolvente adecua-
Estéril para Inyección, solución salina estéril o una
y Lavado para Filtración por Membrana),. y proce-
usando una membrana adecuada para el disolvente

ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS

Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3. Los aceites y las soluciones oleosas
de viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilución a través de una membrana seca. Los aceites viscosos se pue-
den diluir según sea necesario con un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demos-
trado no tener actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba. Dejar que el aceite penetre la membrana por su pro-
pio peso y, a continuación, filtrar, aplicando presión o succión gradualmente. Lavar la membrana al menos tres veces filtrando
cada vez aproximadamente 100 mL de una solución estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución
y Lavado para Filtración por Membrana),. que contenga un agente emulsionante adecuado a una concentración que haya de-
mostrado ser apropiada en la Prueba de Aptitud del Método, como por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1 O g por
L •(Líquido K) •. Transferir la membrana o membranas al medio o medios de cultivo, o viceversa, según lo descrito anteriormen-
te para Soluciones Acuosas e incubar a las mismas temperaturas y durante los mismos tiempos.

UNGÜENTOS Y CREMAS

Usar para cada medio no menos de las cantidades de producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Los ungüentos en base grasa y
las emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1 % en miristato de isopropilo según lo descrito anteriormente, calen-
tando si fuera necesario a no más de 40º. Es probable que en casos excepcionales se requiera calentar hasta no más de 44º.
Filtrar tan rápidamente como sea posible y proceder según lo descrito anteriormente para Aceites y Soluciones Oleosas.

•JERINGAS PRELLENADAS

Para jeringas prellenadas sin agujas estériles acopladas, expulsar el contenido de cada jeringa en uno o dos embudos para
filtración por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la transferencia. Si se adjunta una aguja estéril, ex-
pulsar directamente el contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y proceder según lo descrito para Solu-
ciones Acuosas. Evaluar la esterilidad de la aguja mediante el procedimiento de Inoculación Directa que se indica en Prueba de
Aptitud del Método.
90 (71 > Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37

SÓLIDOS PARA INYECCIÓN DISTINTOS DE ANTIBIÓTICOS

Reconstituir los artículos de prueba según las instrucciones de la etiqueta y proceder según lo indicado para Soluciones Acuo-
sas o Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. [NOTA-Si fuera necesario, se puede agregar diluyente en exceso
para facilitar la reconstitución y filtración del artículo de prueba reconstituido.]

ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS PARA INYECCIÓN

Envases a Granel para Farmacias, <5 g-Tomar una cantidad aproximada a 300 mg de sólido de cada uno de 20 envases,
transferir aséptica mente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A (ver
Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) y mezclar; o bien, reconstituir según lo indicado en la etiqueta,
cada uno de 20 envases y transferir una cantidad de líquido o suspensión que equivalga aproximadamente a 300 mg de sólido
a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo
indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar.
Envases a Granel para Farmacias, :>5 g-Tomar aproximadamente 1 g de sólido de cada uno de 6 envases, transferir asép-
ticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar; o bien,
reconstituir según lo indicado en la etiqueta, cada uno de 6 envases y transferir una cantidad de líquido que equivalga aproxi-
madamente a 1 g de sólido a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y
mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas.

ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS, GRANELES Y MEZCLAS

Retirar asépticamente una cantidad suficiente de sólido de la cantidad adecuada de envases (ver Tabla 2), mezclar hasta ob-
tener una mezcla que equivalga aproximadamente a 6 g de sólido y transferir a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 ml. Disol-
ver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas.

PRODUCTOS ESTÉRILES EN AEROSOL

Para productos líquidos en forma de aerosol presurizado, congelar los envases en una mezcla de hielo seco y alcohol por lo
menos a -20º durante aproximadamente 1 hora. Si es posible, dejar que el propelente escape antes de abrir asépticamente el
envase y transferir el contenido a un recipiente de combinación estéril. Agregar 100 mL de Líquido O al recipiente de combina-
ción y mezclar suavemente. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, según co-
rresponda.

DISPOSITIVOS CON GUÍAS QUE DECLARAN SER ESTÉRILES

Pasar asépticamente un volumen de Líquido O no inferior a 1 O veces el volumen de las guías a través de cada dispositivo
analizado. Recoger los líquidos en un recipiente estéril adecuado y proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites
y Soluciones Oleosas, según corresponda.
En el caso de jeringas vacías estériles, extraer diluyente estéril hacia el émbolo a través de la aguja estéril, si está acoplada, o
a través de una aguja estéril acoplada para el propósito de la prueba y expulsar el contenido en un recipiente de combinación
estéril. Proceder según lo indicado anteriormente .•

Inoculación Directa del Medio de Cultivo

Transferir directamente en el medio de cultivo la cantidad de la preparación a examinar que se indica en las Tablas 2 y 3, de
modo que el volumen del producto no sea mayor que el 10% del volumen del medio, a menos que se indique algo diferente.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, realizar la prueba después de neutralizar esta actividad con una
sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilución en una cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario
usar un volumen grande del producto, probablemente sea preferible usar un medio de cultivo concentrado preparado de tal
modo que se tenga en cuenta la dilución subsiguiente. Cuando corresponda, el medio concentrado podrá agregarse directa-
mente al producto en su envase.

LÍQUIDOS OLEOSOS

Usar medios a los que se les haya agregado un agente emulsionante apropiado a una concentración que haya demostrado
ser adecuada en la Prueba de Aptitud del Método, por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1O g por L.
 USP 37 Pruebas Microbiológicas/ <71) Pruebas de Esterilidad 91

UNGÜENTOS Y CREMAS

Realizar una dilución de aproximadamente 1 en 1O, emulsionando con el agente elegido en un diluyente estéril adecuado,
como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .• Transferir el producto diluido
a un medio que no contenga agente emulsionante.
Incubar los medios inoculados durante no menos de 14 días. Observar los cultivos varias veces durante el período de incuba-
ción. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos todos los días. Sin embargo, cuando se use Medio Líqui-
do de Tioglicolato para detectar microorganismos anaerobios, agitar o mezclar mínimamente con el fin de mantener las condi-
ciones anaerobias.

CATGUT Y OTROS MATERIALES DE SUTURA QUIRÚRGICA PARA USO VETERINARIO

Usar para cada medio no menos de las cantidades del producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Abrir el envase sellado tenien-
do en cuenta las precauciones de asepsia y retirar tres secciones de la hebra para cada medio de cultivo. Llevar a cabo la prue-
ba sobre las tres secciones, cada una de 30 cm de longitud, que se han cortado al comienzo, medio y final de la hebra. Usar
hebras completas de envases recién abiertos. Transferir cada una de las secciones de la hebra a los medios elegidos. Usar sufi-
ciente medio para cubrir adecuadamente el material a analizar (de 20 mL a 150 mL).

•SÓLIDOS

Transferir una cantidad de producto en forma de sólido seco (o preparar una suspensión del producto agregando diluyente
estéril al envase primario) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las Tablas 2 y 3. Transferir el material así
obtenido a 200 mL de Medio Líquido de Tioglicolato y mezclar. Del mismo modo, transferir la misma cantidad a 200 mL de
Medio de Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Proceder según lo indicado anteriormente.

ALGODÓN PURIFICADO, GASA, APÓSITOS QUIRÚRGICOS Y ARTÍCULOS RELACIONADOS

De cada envase de algodón, vendas de gasa enrollada o apósitos quirúrgicos grandes que se deba evaluar, extraer aséptica-
mente dos o más porciones de 100 a 500 mg cada una de la parte más interna de la muestra. Para materiales de un solo uso
envasados individualmente, extraer asépticamente todo el artículo. Sumergir las porciones o el artículo en cada medio y proce-
der según lo indicado anteriormente.

DISPOSITIVOS ESTÉRILES

Los artículos pueden sumergirse ensamblados o desmontados. Para asegurar que los conductos del dispositivo también es-
tén en contacto con los medios, sumergir la cantidad adecuada de unidades en un volumen de medio suficiente para sumergir
completamente el dispositivo y proceder según lo indicado anteriormente. Para dispositivos extremadamente grandes, sumer-
gir aquellas porciones del dispositivo que han de entrar en contacto con el paciente en un volumen de medio suficiente para
lograr la inmersión completa de esas porciones.
Para catéteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte externa, cortarlos en piezas de modo que
el medio entre en contacto con todo el lumen, o llenar el lumen con medio y sumergir la unidad intacta .•

OBSERVACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

A intervalos durante el período de incubación, y al momento de su finalización, examinar los medios en busca de evidencias
macroscópicas de crecimiento microbiano. Si el material que se está evaluando enturbia el medio de modo que no puede de-
terminarse fácilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano mediante examen visual, transferir porciones de me-
dio (no menores de 1 mL cada una) 14 días después de comenzada la incubación, a recipientes nuevos con el mismo medio y,
a continuación, incubar el recipiente original y el de transferencia durante no menos de 4 días.
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se ha-
llan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda
demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba pue-
de considerarse inválida sólo si se cumplen una o más de las siguientes condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla.
b. Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela un error.
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
d. Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o espe-
cies) puede atribuirse de manera inequívoca a errores con respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedi-
miento de la prueba de esterilidad.
92 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37

Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas
de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad.

APLICACIÓN DE LA PRUEBA A PREPARACIONES PARENTERALES, OFTÁLMICAS V OTRAS

PREPARACIONES NO INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

Al usar la técnica de filtración por membrana, utilizar, siempre que sea posible, el contenido total del envase, pero no menos
de las cantidades indicadas en las Tablas 2, diluyendo cuando sea necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solución
estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .•
Al usar la técnica de inoculación directa de medios, usar las cantidades que se muestran en la Tabla 2, a menos que se justifi-
que y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad bacteriana y fúngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del pro-
ducto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un único envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usará
el contenido de dos o más envases para inocular los distintos medios.

NÚMERO MÍNIMO DE ARTÍCULOS A ANALIZAR

En la Tabla 3 se indica el número mínimo de artículos a analizar en relación con el tamaño de la partida.

Pruebas y Valoraciones Biológicas

(81) ANTIBIÓTICOS-VALORACIONES MICROBIOLÓGICAS

Introducción e Información General

En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
microorganismos. La reducción en la actividad microbiana puede ser difícil de demostrar por métodos químicos. Este capítulo
resume los procedimientos para antibióticos reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valora-
ción microbiológica es el método analítico estándar.
Se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro-placa (o en placa) y la valoración turbidimétrica (o en tubo). La
Tabla 1 lista todos los antibióticos que incluyen valoraciones microbiológicas y especifica el tipo de valoración (cilindro-placa o
turbidimétrica).
Tabla 1
Antibiótico Tipo de Valoración
Amfotericina B Cilindro-placa
Bacitracina Cilindro-placa
Bleomicina Cilindro-placa
Capreomicina Turbidimétrica
Carbenicilina Cilindro-placa
Cloranfenicol Turbidimétrica
Clortetraciclina Turbidimétrica
Cloxacilina Cilindro-placa
Colistimetato Cilindro-placa
Colistina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Dihidroestreptomicina Turbidimétrica
Eritromicina Cilindro-placa
Gentamicina Cilindro-placa
Gramicidina Turbidimétrica
Nafcilina Cilindro-placa
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 93

Tabla 1 (Continuación)
Antibiótico - ---- ---
Tipo de Valoración
Natamicina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Neomicina T urbidimétrica
Novobiocina Cilindro-placa
Nistatina Cilindro-placa
Oxitetraciclina Turbidimétrica
Paromomicina Cilindro-placa
Penicilina G Cilindro-placa
Polimixina B Cilindro-placa
Sisomicina Cilindro-placa
Tetracicli na Turbidimétrica
Tioestreptona Turbidimétrica
Troleandomicina Turbidimétrica
Ti losina Turbidimétrica
Vancomicina Cilindro-placa

[NOTA-Realizar todos los procedimientos descritos en las monografías asépticamente. Tomar las precauciones de seguridad
adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles alergias a los fármacos y a que se usan cultivos vivos de organis-
mos en los procedimientos]
Valoración en cilindro-placa: La valoración en cilindro-placa se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a
través de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El crecimiento del microorganismo específico inoculado en
el agar resulta inhibido en un área circular o zona en torno al cilindro que contiene la solución del antibiótico.
Valoración turbidimétrica: La valoración turbidimétrica se basa en la inhibición del crecimiento de un microorganismo en
una solución uniforme del antibiótico en un medio fluido que favorezca el crecimiento del microorganismo en ausencia del
antibiótico.
Unidades y Estándares de Referencia: La potencia de los antibióticos se designa en unidades (U) o en µg de actividad. En
ambos casos, la unidad o µg de actividad del antibiótico se establece originalmente contra un Estándar Maestro Federal de los
Estados Unidos para el antibiótico en cuestión. El Estándar de Referencia USP correspondiente se calibra en términos del están-
dar maestro.
En un principio, se consideraba que un antibiótico seleccionado como estándar de referencia constaba en su totalidad de
una sola entidad química y, por lo tanto, se le asignaba una potencia de 1000 µg/mg. En muchos de estos casos, a medida
que los métodos de fabricación y purificación para ciertos antibióticos avanzaron en su desarrollo, fue posible obtener antibió-
ticos con más de 1000 µg de actividad/mg. Tales antibióticos tenían una actividad equivalente a un número determinado de
µg del estándar de referencia original. No obstante, la mayoría de las veces, los µg de actividad son, numéricamente, exacta-
mente equivalentes a los µg (peso) de la sustancia pura. En ciertas ocasiones, como las citadas a continuación, los µg de activi-
dad definidos en términos del estándar maestro original equivalen a una unidad:
1. Cuando el antibiótico se presenta como la base libre y en forma de sal, y los µg de actividad han sido definidos en térmi-
nos de una de estas formas.
2. Cuando la sustancia antibiótica consta de un número de componente~ que son químicamente similares pero que difieren
en actividad antibiótica.
3. Cuando las potencias de una familia de antibióticos se expresan en términos de un estándar de referencia que consta de
un solo miembro de la familia el cual, no obstante, puede ser por sí mismo heterogéneo.
No se debe asumir que los µg de actividad corresponden a los µg (peso) de la sustancia antibiótica.
Aparato: El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y diluciones de prueba debe ser esté-
ril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoración (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )). Usar un méto-
do de esterilización validado tal como calor seco, vapor o irradiación; o usar material de laboratorio estéril y desechable.
Control de temperatura: Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración microbiológica: durante el cul-
tivo de un microorganismo y la preparación de su inóculo, así como durante la incubación en las valoraciones en placa y tubo.
Referirse a los requisitos específicos de temperatura provistos más adelante para cada tipo de valoración.
Organismos de prueba: El organismo de prueba para cada antibiótico se lista en la Tabla 3 para la valoración en cilindro-
placa y en la Tabla 8 para la valoración turbidimétrica. Los organismos de prueba se especifican mediante su número de identi-
ficación en la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo de los EE.UU. o ATCC).
Para asegurar el desempeño aceptable de los organismos de prueba, estos deben ser almacenados y conservados de manera
apropiada. Se deben establecer las condiciones de almacenamiento específicas durante la validación o verificación del método.
Desechar los cultivos si se observa un cambio en las características del organismo.
Almacenamiento prolongado: Para el almacenamiento prolongado, mantener los organismos de prueba en una solución
de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal de ternero al 50% en caldo, glicerol al 10%-15% en caldo tripticasa de
 94 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 37

soja (caldo digerido de caseína y soja), sangre de oveja desfribinada o leche descremada. Los cultivos que se van a almacenar
durante periodos prolongados se almacenan mejor en estado liofilizado; se prefieren temperaturas de -60º o inferiores; son
aceptables temperaturas inferiores a -20c.
Cultivos primarios: Preparar los cultivos primarios transfiriendo organismos de prueba desde los viales de almacenamien-
to prolongado a medios apropiados e incubando en condiciones de crecimiento adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a
la temperatura apropiada, por lo general a 2º- 8º, y desechar después de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo prima-
rio para preparar los cultivos de trabajo por un máximo de siete días únicamente.
Cultivos de trabajo: Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo primario a medios sólidos apropiados para ob-
tener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento satisfactorio pa-
ra la preparación de los inóculos de prueba. Preparar cultivos de trabajo nuevos para cada día de análisis.
Crecimiento o desempeño no característicos de un organismo de prueba: Usar cultivos madre, cultivos primarios o
cultivos de trabajo nuevos cuando un organismo de prueba presente crecimiento o desempeño no característicos.
Diseños de valoración: Los rliseños experimentales adecuados son clave para incrementar la precisión y minimizar el sesgo.
Controlar los parámetros de incubación, la distribución de temperaturas y el tiempo es crítico para minimizar el sesgo; esto se
puede lograr acomodando las placas y gradillas, según se indica en cada valoración.
Valoración en cilindro-placa: Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones del diámetro de la zona
dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre placas. Las respuestas individuales de las placas se normalizan ba-
sándose en el tamaño relativo de la zona del estándar comparado con el tamaño medio de la zona del estándar en todas las
placas.
Valoración turbidimétrica: Para evitar un sesgo sistemático, colocar aleatoriamente tubos duplicados en gradillas separa-
das de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos. El propósito de esta configuración es mini-
mizar la influencia de la distribución de la temperatura sobre las muestras duplicadas. La valoración turbidimétrica, debido a la
configuración de las muestras en las gradillas para tubos de ensayo, es sensible a ligeras variaciones de temperatura. Asimismo,
la influencia de la variación de la temperatura se puede disminuir al asegurar un flujo de aire o la convección de calor adecua-
dos durante la incubación. Se deben colocar por lo menos tres tubos para cada concentración muestra y estándar (un conjun-
to completo de muestras) en una sola gradilla. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez ob-
servados dentro de las gradillas.
Consideraciones sobre potencia: Dentro de las restricciones citadas anteriormente, el diseño de valoración recomendado
emplea una curva estándar de cinco concentraciones y una sola concentración de cada preparación muestra.
Para la valoración en cilindro-placa, cada placa incluye únicamente dos tratamientos, el tratamiento de referencia (mediana
de los niveles del estándar, es decir, 53) y una de las otras cuatro concentraciones del estándar (5 7, 52, 54 y 55 ) o la muestra (U 3 ).
La concentración de la muestra es una estimación basada en la concentración deseada. La muestra se debe diluir para propor-
cionar una concentración nominal que se estima es equivalente a la mediana de la concentración de referencia del estándar
(5 3). El propósito de diluir a la mediana de la concentración de referencia es asegurar que el resultado de la muestra caerá
dentro de la porción lineal de la curva estándar. La prueba determina la potencia relativa de U3 en función de la curva están-
dar. La muestra (U) debe tener una potencia relativa de aproximadamente 100%. La potencia final de la muestra se obtiene
multiplicando el resultado de U3 por el factor de dilución.
Una valoración debe considerarse preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es inferior al 80% o superior al
125%. En dicho caso, los resultados sugieren que la concentración de la muestra supuesta durante la preparación de la solu-
ción madre de la muestra era incorrecta. Si esa fuera la situación, se puede ajustar la potencia supuesta de la muestra basándo-
se en el valor de potencia preliminar y repetir la valoración. De otro modo, la potencia se derivará de una porción de la curva
donde las respuestas del estándar y la muestra probablemente no serán paralela?.
Las determinaciones microbiológicas de potencia están sujetas a variables intervaloración e intravaloración, de modo tal que
se requieren dos o más valoraciones independientes para obtener una estimación confiable de la potencia de una muestra de-
terminada. Partiendo de soluciones madre y diluciones de prueba tanto del estándar como de la muestra, preparadas por se-
pardo, llevar a cabo otro día valoraciones adicionales de una muestra determinada. La potencia media debe incluir los resulta-
dos de todas las valoraciones independientes válidas. El número de valoraciones requerido para lograr una estimación de po-
tencia confiable depende de la variabilidad de la valoración y de la incertidumbre máxima requerida para la estimación de po-
tencia. Ésta última se evalúa mediante la amplitud del intervalo de confianza (ver Cálculos, Límites de confianza y combinaciones
de cálculos de valoración). El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes más pequeñas a lo largo de
varios días es una estimación de potencia más confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número
total de placas o tubos. Se debe tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor variabilidad permite que el
producto cumpla con intervalos de especificación más estrechos. Al reducir la variabilidad de las valoraciones se logra el límite
de confianza requerido con menos valoraciones.

Método de Cilindro-Placa
Control de temperatura: Usar equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura
especificados en la Tabla 3.
Aparato
Placas: Placas de Petri de plástico desechables o de vidrio (de aproximadamente 20 x 100 mm) con tapas
 USP 37 Pruebas Biológicas/ <81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 95

Cilindros: Cilindros de acero inoxidable o porcelana; de 8 ±O, 1 mm de diámetro externo; de 6 ±O, 1 mm de diámetro in-
terno; de 1O±0, 1 mm de altura. [NOTA-Limpiar los cilindros cuidadosamente para eliminar cualquier residuo; es necesario
limpiar ocasionalmente en un baño ácido, por ejemplo, con ácido nítrico aproximadamente 2 N o con ácido crómico (ver
Limpieza de Aparatos de Vidrio (1051 )).]
Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP de
un determinado antibiótico o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolven-
te especificado en la Tabla 2 y diluir a la concentración especificada. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En
el día de la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concen-
tración entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. Usar el diluyente final especificado de tal ma-
nera que la mediana tenga la concentración sugerida en la Tabla 2.
Soluciones muestra: Asignar a la muestra una potencia supuesta por unidad de peso o volumen. En el día de la valoración,
preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 2). Diluir la solu-
ción madre de la muestra en el diluyente final especificado hasta obtener una concentración nominal igual a la mediana de la
concentración del estándar (5 3).
Tabla 2
Solución Madre Dilución de Prueba
Mediana
Concentra- dela
Disolvente ción Diluyente Concentración Usar Diluyente Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Final dentro de Final (S,)•,b
Anfotericina Bc,d Dimetil sulfóxido - - 1 mg/ml El mismo día B. loe 1 µg/ml
Ácido clorhídrico
- -
Bacitracinaf 0,01 N 100 U/ml El mismo día B.le 1 U/ml
Bleomicina B.16e - - 2 U/ml 14 días B.l 6e 0,04 U/ml
Carbenicilina B.ie - - 1 mg/ml 14 días B.le 20 µg/ml
Cloxacilina B.ie - - 1 mg/ml 7 días B.le 5 µg/ml
Colistemetato< Agua 10 mg/ml B.6e 1 mg/ml El mismo día B.6e 1 µg/ml
Colistina Agua 10 mg/ml B.6e 1 mg/ml 14 días B.6e 1 µg/ml
Dihidrostreptomicina9 B.3• - - 1 mg/ml 30 días B.3e 1 µg/ml
Eritromicina Methanol 10 mg/ml B.3e 1 mg/ml 14 días B.3e 1 µg/ml
Gentamicina B.3e - - 1 mg/ml 30 días B.3e 0.1 µg/ml
Nafcilina B.ie - - 1 mg/ml 2 días B.ie 2 µg/ml
Natamicina Dimetil sulfóxido - - 1 mg/ml El mismo día B.1oe 5 µg/ml
Neomicina9 B.3e - - 1 mg/ml 14 días B.3e 1 µg/ml
Novobiocina alcohol 10 mg/ml B.3e 1 mg/ml 5 días B.6e 0,5 µg/ml
Nistatinac,h Dimetilformamida - - 1000 U/ml El mismo día B.6e 20 U/ml
Paromomicina B.3e - - 1 mg/ml 21 días B.3e 1 µg/ml
Penicilina G B.le - - 1000 U/ml 4 días B.ie 1 U/ml
Polimixina Bi Agua - B.6e 10 000 14 días B.6e 10 U/ml
U/ml
Sisomicina B.3e - - 1 mg/ml 14 días B.3e 0,1 µg/ml
Vancomicina Agua - - 1 mg/ml 7 días B.4e 10 µg/ml
ª Se puede ajustar la mediana de la concentración para optimizar los tamaños de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal.
b µg en esta columna se refiere a µg de actividad.
e Preparar el Estándar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo.
d Diluir adicionalmente la solución madre con dimetil sulfóxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 µg/ml antes de realizar las diluciones
de prueba. La dilución de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfóxido que las diluciones de prueba del Estándar de Referencia
USP.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
f Cada una de las diluciones de prueba del estándar debe contener la misma cantidad de ácido clorhídrico que la dilución de prueba de la muestra.
9 Se puede usar la valoración turbidimétrica como un procedimiento alternativo.
h Diluir adicionalmente la solución madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 U/mL antes de preparar las dilucio-
nes de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estándar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilución de prueba de
la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estándar. Usar material de vidrio con protección actínica.
i Preparar la solución madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estándar de Referencia USP.

lnóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución
salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de
dos o más placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del me-
dio especificado (ver la Tabla 3).
Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 3, o hasta que el crecimiento sea evidente.
 96 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR
estéril (excepto en el caso de bleomicina para el que debe usarse Medio 34; ver la sección Medios y Soluciones), usando una
varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un frasco de vidrio
estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Diluir una cantidad apropiada de la suspensión de recolección con solución salina SR estéril. Usando el espectrofotómetro de
UV-visible, medir el % de transmitancia a 580 nm. El valor deseado es aproximadamente 25% de transmitancia a 580 nm. Este
valor se usa para estandarizar el volumen de suspensión de recolección agregado a la capa de agar para siembra.
Determinar durante la verificación del método, comenzando con los volúmenes sugeridos en la Tabla 3, las proporciones de
suspensión madre que se habrán de agregar al medio de inóculo que resulten en zonas satisfactorias de inhibición de aproxi-
madamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar (5 3). [NOTA-Los tamaños de las zonas
fuera del intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que contribuyen a la variabilidad de la valoración.] Si el porcen-
taje de transmitancia de la dilución está por encima de 25%, se puede usar un cociente para normalizar la adición de microor-
ganismos a la capa de siembra. El factor de normalización se puede determinar dividiendo por 25 el porcentaje de transmitan-
cia obtenido de la dilución. Posteriormente, se puede multiplicar este cociente por la cantidad sugerida de inóculo para obte-
ner el volumen (ml) de suspensión de recolección que se requiere agregar a la capa de siembra. Ajustar la cantidad de inóculo
diariamente, si fuera necesario, para obtener una relación de concentración-respuesta óptima.
Alternativamente, determinar durante la verificación del método la proporción de suspensión de recolección que se habrá
de incorporar al inóculo, comenzando con los volúmenes indicados en la Tabla 3, que resulten en una demarcación satisfacto-
ria de las zonas de inhibición de aproximadamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar
(5 3) y que produzcan una relación de concentración-respuesta reproducible. Preparar el inóculo agregando una porción de
suspensión madre a una cantidad suficiente de medio de agar que se ha fundido y enfriado a 45º-50º. Agitar la mezcla por
rotación suave sin crear burbujas hasta obtener una suspensión homogénea.
Tabla 3
Composición
Condiciones de Incubación Sugerida del lnóculo
Temperatu-
Númeroª ra Tiem- Cantidad
Antibiótico Organismo de Prueba ATCC Mediob (º) po Mediob (mL/100 mL)
Amfotericina B Saccharomyces cerevisiae 9763 19 29-31 48 h 19 1,0
Bacitracina Micrococcus luteus 10240 1 32-35 24 h 1 0,3
Bleomicina Mycobacterium smegmatis 607 36 36-37,5 48 h 35 1,0
Carbenicilinac Pseudomonas aeruginosa 25619 1 36-37,5 24 h 10 0,5
Cloxacilina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,1
Colistimetato Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Colistina Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Dihidroestreptomi- Según se re-
cina Bacillus subtilis 6633 32 32-35 5 días 5 quiera
Eritromicina Micrococcus luteus 9341 1 32-35 24 h 11 1,5
Gentamicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Nafcilina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,3
Neomicina Staphy/ococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,4
Novobiocina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 1 4,0
Nistatina Saccharomyces cerevisiae 2601 19 29-31 48 h 19 1,0
Paromomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 2,0
Penicilina G Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 1,0
Polimixina B Bordetel/a bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Sisomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Según se re-
Vancomicina Bacil/us subti/is 6633 32 32-35 5 días 8 quiera
ª American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
e Usar 0,5 ml de una dilución 1 :25 de la suspensión madre/l 00 ml de Medio 1O.

Análisis: Preparar la capa base para el número requerido de placas de Petri para la valoración, usando el medio y el volumen
mostrados en la Tabla 4. Dejar que se endurezca formando una capa base lisa de profundidad uniforme. Preparar la cantidad
apropiada de inóculo para la capa de siembra (Tabla 5), según se indica para el antibiótico correspondiente (Tabla 3), realizan-
do los ajustes necesarios basándose en el análisis de ensayo preparatorio. Inclinar la placa hacia atrás y hacia adelante para
esparcir el inóculo uniformemente sobre la superficie de la capa base y dejar que se endurezca.
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 97

Tabla 4 (capa base)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medioª (ml)
Amfotericina Bb - --

Bleomicina 35 10
Carbenicilina 9 21
Colistimetato 9 21
Colistina 9 21
Dihidroestreptomicina 5 21
Eritromicina 11 21
Gentamicina 11 21
Neomicina 11 21
Nistatinab - -

Paromomicina 11 21
Polimixina B 9 21
Sisomicina 11 21
Vancomicina 8 10
Todos los demás 2 21
ª Ver Medios y Soluciones, Medios.
b No se usa capa base.
[NOTA-La capa base se puede entibiar para facilitar la formación de una capa uniforme.]

Tabla 5 (capa de siembra)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medioª (ml)
Amfotericina B Referirse a la Tabla 3 8
Bleomicina 6
Nistatina 8
Todos los demás 4
ª Ver Medios y Soluciones, Medios.

Dejar caer seis cilindros de valoración sobre la superficie inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una guía mecánica
u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de 2,8 cm y tapar las placas para evitar la contaminación.
Llenar los seis cilindros en cada placa con diluciones de antibiótico que contengan los niveles de prueba (S 7-S5 y U3 ) especifica-
dos en el párrafo siguiente. Incubar las placas según se especifica en la Tabla 6 durante 16-18 horas y retirar los cilindros. Me-
dir y registrar el diámetro de cada zona de inhibición del crecimiento con una aproximación de O, 1 mm.
Tabla 6
Antibiótico Temperatura de Incubación(º)
Amfotericina B 29-31
Carbenicilina 36-37,5
Colistimetato 36-37,5
Colistina 36-37,5
Dihidroestreptomicina 36-37,5
Gentamicina 36-37,5
Neomicina 36-37,5
Novobiocina 34-36
Nistatina 29-31
Paromomicina 36-37,5
Polimixina B 36-37,5
Sisomicina 36-37,5
Vancomicina 36-37,5
Todos los demás 32-35

Se usarán durante la valoración los estándares (S 7-S5 ) y un solo nivel de prueba de la muestra (U 3 ) correspondiente a S3 de la
curva estándar, según se definen en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Para derivar la curva estándar, llenar cilindros
alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la mediana de la dilución de prueba (S 3) del estándar y cada uno de
98 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicos USP 37

los nueve cilindros remanentes con una de las otras cuatro diluciones de prueba del estándar. Repetir el proceso para las tres
diluciones de prueba del estándar. Para la muestra, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la
mediana de la dilución de prueba (S) y llenar los nueve cilindros remanentes con la dilución de prueba correspondiente (U 3 )
de la muestra.

Método Turbidimétrico

Control de temperatura: Usar un equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatu-
ra especificados en la Tabla 8. [NOTA-El control de la temperatura se puede lograr con circulación de aíre o agua. La mayor
capacidad térmica del agua representa cierta ventaja sobre el aire circulante.]
Espectrofotómetro: La medición de la absorbancia o transmitancía dentro de una banda de frecuencia muy estrecha requie-
re un espectrofotómetro adecuado en el que se pueda variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm o 530
nm. Como alternativa, se puecfe usar un espectrofotómetro con longitud de onda variable y ajustar a una longitud de onda de
580 nm o 530 nm.
El instrumento se puede modificar de la siguiente manera:
1. Para que acepte el tubo en el que se lleva a cabo la incubación (ver Aparato a continuación).
2. Para que acepte una celda modificada equipada con un drenaje que facilite el cambio rápido del contenido.
3. Para que contenga una celda de flujo para un análisis de flujo continuo.
Ajustar automáticamente el instrumento a cero con un caldo no inoculado transparente, preparado según las especificacio-
nes de cada antibiótico, incluyendo la misma cantidad de dilución de prueba (incluyendo formaldehído sí se específica) que se
encuentra en cada muestra.
Durante la preparación de los ínóculos se puede medir tanto la absorbancía como la transmitancia.
Aparato: Tubos de ensayo de vidrio o plástico, p.ej., de 16 x 125 mm o de 18 x 150 mm. [NOTA-Usar tubos que tengan
una longitud, diámetro y espesor relativamente uniformes y que estén exentos de defectos y rayaduras en la superficie. En el
espectrofotómetro, usar tubos idénticos exentos de defectos y rayaduras. Limpiar los tubos minuciosamente para eliminar to-
dos los residuos de antibiótico y restos de soluciones de limpieza. Esterilizar los tubos antes de usar.]
Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad del Estándar de Referencia USP de un antibió-
tico determinado o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especifi-
cado en la Tabla 7 y diluir hasta la concentración requerida. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En el día de
la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concentración en-
tre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. [NOTA-Puede ser necesario usar relaciones más peque-
ñas para diluciones sucesivas de la solución madre para la valoración turbidímétrica.] Usar el diluyente final especificado de
manera tal que la mediana de los niveles del estándar (53 ) tenga la concentración sugerida en la Tabla 7.
Soluciones muestra: Asignar una potencia supuesta por unidad de peso o volumen a la muestra desconocida y, en el día de
la valoración, preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 7).
Diluir la solución madre de la muestra en el diluyente final especificado a una concentración nominal igual a la mediana de la
concentración del estándar (SJ según se especifica en la Tabla 7.
Tabla 7
Solución Madre Dilución de Prueba
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente ción Diluyente ción Dentro te Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S,)ª
Capreomicina Agua - - 1 mg/ml 7 días Agua 100 µg/ml
Cloranfenicol Alcohol 10 mg/ml Agua 1 mg/ml 30 días Agua 2,5 µg/ml
Clortetraciclina Ácido clorhídrico 0,01 N - - 1 mg/ml 4 días Agua 0,06 µg/ml
Dihidroestreptomicinab Agua - - 1 mg/ml 30 días Agua 30 µg/ml
Gramicidina Alcohol - - 1 mg/ml 30 días Alcohol 0,04 µg/ml
Neomicinab,d B.3c - - 100 µg/ml 14 días B.3c 1,0 µg/ml
Oxitetraciclina Ácido clorhídrico O, 1 N - - 1 mg/ml 4 días Agua 0,24 µg/ml
Tetraciclina Ácido clorhídrico O, 1 N - - 1 mg/ml 1 día Agua 0,24 µg/ml
Tioestreptona El mismo Dimetil
- -
Dimetil sulfóxido 1 U/ml día sulfóxido 0,80 U/ml
ª ¡1g en esta columna se refiere a µg de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 pg/ml con Solución amortiguadora B.3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 ,ug/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 Na cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 ftg/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.
USP 37 Pruebas Biológicas/ (81 >Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 99

Tabla 7 (Continuación)
Solución Madre Dilución de Prueba
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente ción Diluyente ción Dentro te Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S,)<l
Troleandomicina Alcohol isopropílico y agua El mismo
- -
(4:1) 1 mg/ml día Agua 25 pg/ml
Ti losina Metano! y
Metano! 10 mg/ml B.16' 1 mg/ml 30 días B.3' (1 :1) 4 ftg/ml
ª ,ug en esta columna se refiere a rtg de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
' La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 fLg/mL con Solución amortiguadora B. 3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 pg/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 Na cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora 8.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 ftg/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.

lnóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución
salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Enterococcus hirae (ATCC 10541) y 5taphylococcus
aureus (ATCC 9144) se cultivan en un medio líquido, no en agar. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de dos o más
placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del medio especifi-
cado (ver la Tabla 8). Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 8, o hasta que el crecimiento sea
evidente.
Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR
estéril, usando una varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un
frasco de vidrio estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Determinar durante la verificación del método la cantidad de suspensión de recolección que se usará como el inóculo, co-
menzando con el volumen sugerido en la Tabla 8. Preparar también una 53 extra como una prueba de crecimiento. Incubar las
pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la Tabla 7 7. Ajustar la cantidad de inóculo a diario, si fuera necesario, para
obtener la relación de concentración-respuesta óptima a partir del organismo de prueba en los tubos de valoración. Una vez
completados los periodos de incubación especificados, los tubos que contienen la mediana de la concentración del estándar
deben presentar los valores de absorbancia especificados en la Tabla 9. Determinar la duración exacta de la incubación, obser-
vando el crecimiento en la concentración de referencia (mediana de la concentración) del estándar (5 3).
Tabla 8
Composición
Condiciones de Incubación Sugerida del lnóculo
Tempera-
Número Me- tura Tiem- Cantidad
Antibiótico Organismo de prueba ATCca diob (º) po Mediob (ml/100 ml)
Capreomicina Klebsiel/a pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,05
Cloranfenicol Escherichia co/i 10536 1 32-35 24 h 3 0,7
Clortetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Dihidroestreptomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,1
Gramicidina Enterococcus hirae 10541 3 36-37,5 16-18 h 3 1,0
Neomicina Klebsiel/a pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 39 2
Oxitetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Tetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Tioestreptona Enterococcus hirae 10541 40 36-37,5 18-24 h 41 0,2
Troleandomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,1
Tilosina Staphylococcus aureus 9144 3 35-39 16-18 h 39 2-3
ª American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.

Tabla 9
Absorbancia,
Antibiótico No menos de (u.a.)
Capreomicina 0,4
Clortetraciclina 0,35
Gramicidina 0,35
Tetraciclina 0,35
Todas los demás 0,3
100 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

Análisis: En el día de la valoración, preparar la concentración necesaria de antibiótico, diluyendo soluciones madre del están-
dar y de cada una de las muestras, según se especifica en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Preparar cinco niveles de
prueba, cada uno por triplicado, del estándar (5 7-55 ) y un solo nivel de prueba (U 3 ), también por triplicado, de hasta 20 mues-
tras correspondientes a 53 (mediana de la concentración) del estándar.
Tabla 10
Volumen de
Dilución de Volumen de
Prueba lnóculo
Antibiótico (ml) (ml)
Gramicidina 0,10 9,0
Tioestreptona 0,10 10,0
Tilosina 0,10 9,0
Todos los demás 1,0 9,0

Colocar los tubos en gradillas para tubos de ensayo u otro portador. Incluir en cada gradilla 1-2 tubos de control que con-
tengan 1 ml del diluyente de prueba (ver la Tabla 7) pero sin antibiótico. Agregar los volúmenes de las diluciones de prueba
del estándar y de la muestra, según se indica en la Tabla 7O. Distribuir aleatoriamente un set completo, incluyendo los contro-
les, en una gradilla para tubos. Agregar el volumen de inóculo especificado en la Tabla 7O a cada tubo en la gradilla, uno por
vez, y colocar la gradilla completada inmediatamente en una incubadora o un baño de agua mantenidos a la temperatura
especificada en la Tabla 8 y durante el tiempo especificado en la Tabla 7 7.
Tabla 11
Tiempo de Incubación
Antibiótico (h)
Capreomicina 3-4
Cloranfenicol 3-4
Cicloserina 3-4
Dihidroestreptomicina 3-4
Estreptomicina 3-4
Troleandomicina 3-4
Tilosina 3-5
Todos los demás 4-5

Después de la incubación, inhibir inmediatamente el crecimiento del organismo, agregando 0,5 ml de formaldehído diluido
a cada tubo, excepto para tilosina. Para tilosina, calentar la gradilla en un baño de agua a 80º-90º durante 2-6 minutos o en
un baño de vapor durante 5-1 O minutos y llevar a temperatura ambiente. Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 ó 580
nm, analizando una gradilla cada vez.

Medios y Soluciones
Los medios requeridos para la preparación de los inóculos de los organismos de prueba se preparan con los ingredientes
listados en esta sección. Se permiten pequeñas modificaciones de los ingredientes individuales; asimismo, se pueden usar me-
dios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes tengan propiedades promotoras de crecimiento equiva-
lentes o superiores y que produzcan una curva de respuesta estándar similar.
Medios: Disolver los ingredientes en agua para obtener 1 L y ajustar las soluciones con hidróxido de sodio 1 N o ácido clorhí-
drico 1 N, según se requiera, de modo que, después de la esterilización con vapor, el pH sea el especificado.
Medio 1
Peptona 6,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1
USP 37 Pruebas Biológicos/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 101

Medlo2
Peptona 6,0 q
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medio 3
Peptona 5,0 g
Extracto de levadura 1,5 g
Extracto de carne 1,5 g
Cloruro de sodio 3,5 g
Dextrosa 1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 3,68 g
Fosfato monobásico de potasio 1,32 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,05

Medio4
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medlo5
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,9 ±0,1

Medlo8
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 5,9 ± 0,1

Medlo9
Digerido pancreático de caseína 17,0 g
Digerido papaínico de soja 3,0g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato dibásico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 20,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,2 ± 0,1
102 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

Medio 10
Digerido pancreático de caseína - ---------
17,0 g
Digerido papaínico de soja 3,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato dibásico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 12,0 g
Agua 1000 ml
Polisorbato 80 (agregado después de calentar a ebullición el medio para disolver el agar) 10 ml
pH después de la esterilización 7,2 ± 0,1

Medio 11
Peptona 6,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 8,3 ± 0,1

Medio 13
Peptona 10,0 g
Dextrosa 20,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 5,6 ± 0,1

Medio 19
Peptona 9,4 g
Extracto de levadura 4,7 g
Extracto de carne 2,4 g
Cloruro de sodio 10,0 g
Dextrosa 10,0 g
Agar 23,5 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,1±0,1

Medio 32
Peptona 6,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Sulfato de manganeso 0,3 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medio 34
Glicerol 10,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de carne 10,0 g
Cloruro de sodio 3,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,1
 USP 37 Pruebas Biológicos J (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 103

Medio 35
Glicerol 10,0 g
-·--- ----------------
Peptona 10,0 g
Extracto de carne 10,0 g
Cloruro de sodio 3,0 g
Agar 17,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,1

Medio 36
Digerido pancreático de caseína 15,0 g
Digerido papaínico de soja 5,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,3 ± 0,1

Medio 39
Peptona 5,0 g
Extracto de levadura 1,5 g
Extracto de carne 1,5 g
Cloruro de sodio 3,5 g
Dextrosa 1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 3,68 g
Fosfato monobásico de potasio 1,32 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,9 ± 0,1

Medio40
Extracto de levadura 20,0 g
Poli peptona 5,0 g
Dextrosa 10,0 g
Fosfato monobásico de potasio 2,0 g
Polisorbato 80 0,1 g
Agar 10,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,7 ± 0,2

Medio 41
Digerido pancreático de caseína 9,0 g
Dextrosa 20,0 g
Extracto de levadura 5,0 g
Citrato de sodio 10,0 g
Fosfato monobásico de potasio 1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 1,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,8 ± 0,1

Soluciones
Soluciones amortiguadoras: Preparar según se indica en la Tabla 72 o por otros medios adecuados. Las soluciones amor-
tiguadoras se esterilizan después de su preparación; el pH especificado en cada caso es el pH después de la esterilización.
 104 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

Tabla 12. Soluciones amortiguadoras

Volumen de Hidróxido
Concentración de de
Concentración de Fosfato Fosfato Potasio
Dibásico de Potasio Monobásico de Potasio 10 N pH después de la
Solución amortiguadora (g/L) (g/L) (ml) Esterilizaciónª
Solución amortiguadora B.1 (1 %, 2 8 - 6,0 ± 0,05
pH 6,0)
Solución amortiguadora B.3(O,1 16,73 0,523 - 8,0 ± 0,1
M, pH 8,0)
Solución amortiguadora B.4 (O, 1 - 13,61 - 4,5 ± 0,05
M, pH 4,5)
Solución amortiguadora B.6 20 80 - 6,0 ± 0,05
(1 0%, pH 6,0)
Solución amortiguadora B.1 O 35 - 2 10,5 ± 0,1
(0,2 M, pH 10,5)
Solución amortiguadora B.16 13,6 4 - 7,0 ± 0,2
(O, 1 M, pH 7,0)
ª Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 1O N.

Otras soluciones: Ver Reactivos, Indicadores y Soluciones.

Agua: Usar Agua Purificada.
Solución salina: Usar Solución salina SR.
Formaldehído diluido: Solución de formaldehído y agua (1 :3)

Cálculos
Introducción: La potencia del antibiótico se calcula mediante la interpolación de una recta estándar o patrón obtenida por
transformación logarítmica y ajustada por cuadrados mínimos (ver los detalles sobre los cálculos a continuación). El analista
debe considerar tres conceptos esenciales al interpretar los resultados de potencia del antibiótico:
1. Las relaciones biológicas de concentración-respuesta por lo general no son lineales. El método de potencia del antibiótico
permite ajustar los datos a una línea recta, evaluando un intervalo de concentración estrecho en el que los resultados se
acercan a la linealidad. Los resultados de la valoración se considerarán válidos únicamente si la potencia calculada es
80%-125% de la potencia asumida al preparar la solución madre de la muestra. Cuando la potencia calculada está fuera
del intervalo de 80%-125%, el resultado para la muestra puede quedar fuera del intervalo de concentración estrecho en
el que se ha establecido la linealidad, en cuyo caso, se debe ajustar la potencia asumida de la muestra según corresponda
y repetir la valoración para obtener un resultado válido.
2. El medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la media geométrica de la potencia de todos los
ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del procedimiento de valoración. El resultado combinado de una
serie de valoraciones independientes más pequeñas realizadas a lo largo de varios días es una estimación de potencia más
confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número total placas o tubos. Se requieren tres o
más valoraciones independientes para determinaciones de potencia de antibióticos.
3. El número de valoraciones requeridas para obtener una estimación confiable de potencia del antibiótico depende del in-
tervalo de especificación requerido y de la variabilidad de la valoración. El cálculo del límite de confianza descrito a conti-
nuación se determina a partir de varios logaritmos de las potencias que son aproximadamente iguales en precisión. Si el
valor calculado para la amplitud del intervalo de confianza, W, es demasiado amplio, no será posible tomar una decisión
útil con respecto a si la potencia cumple con su especificación.
El laboratorio debe determinar de antemano en sus procedimientos operativos estándar un valor máximo aceptable para la
amplitud del intervalo de confianza. El valor máximo se debe determinar durante el desarrollo y confirmarse durante la valida-
ción o la verificación. Si el intervalo de confianza calculado excede este límite, el analista debe llevar a cabo determinaciones
de potencia independientes adicionales para cumplir con el requisito del límite. Se debe tomar en cuenta que la decisión de
realizar determinaciones adicionales no depende de la potencia estimada, sino únicamente de la incertidumbre en dicha esti-
mación, según lo determina la amplitud del intervalo de confianza. La variabilidad de la valoración tiene un impacto mayor en
el límite de confianza calculado que el número de determinaciones de potencia independientes. Como resultado, el analista
debe considerar primeramente reducir la variabilidad en la medida de lo posible antes de realizar determinaciones de potencia.
Las siguientes secciones describen los cálculos para determinar la potencia de los antibióticos, así como la realización del
cálculo de límite de confianza. Asimismo, se presentan métodos para calcular el error estándar con el propósito de obtener
estimaciones de la varianza de la valoración. Cuando se usan logaritmos, resulta aceptable cualquier base logarítmica. El Apén-
dice 1 proporciona fórmulas para cálculos manuales cuando las concentraciones están equitativamente espaciadas en la escala
logarítmica. Se pueden usar métodos estadísticos alternativos siempre que se validen adecuadamente.
Valoración en cilindro-placa: Esta sección detalla el análisis de datos de muestra y la determinación de la potencia de una
muestra desconocida, usando la valoración en cilindro-placa.
USP 37 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 105

Datos de muestra: La Tabla 73 presenta los datos de una valoración que se usarán a manera de ejemplo a lo largo de esta
sección. Para cada una de las 12 placas, las zonas 1, 3 y 5 corresponden a la concentración de referencia y las otras tres zonas
son para una de las otras cuatro concentraciones, según se indican. Las otras columnas son necesarias para los cálculos y se
explican más adelante.
Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.
Para cada conjunto de tres placas, promediar los nueve valores de referencia y promediar los nueve valores estándar.
Ejemplo (ver la Tabla 73)
15,867 = X(l 6, 1; 15,6; ... ; 15,8)
14,167=X(14,6;14,1; ... ; 14,8)
Para cada conjunto de tres placas, determinar la desviación estándar de los nueve valores de referencia y de la desviación es-
tándar de los nueve valores estándar. Para cada desviación estándar, determinar la desviación estándar relativa correspondien-
te.
Ejemplo: (ver la Tabla 73)
0,200 = cr(l 6, 1, ... , 15,8)
1,30/o = (0,200/15,867) X 100
0,324 = cr(l 4,6, ... , 14, 1)
2,30/o = (0,324/14,167) X 100
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar un valor máximo aceptable para la desviación es-
tándar relativa. Si alguna de las ocho desviaciones estándar relativas (cuatro para la referencia y cuatro para el estándar) sobre-
pasan este máximo predeterminado, los datos de la valoración no serán adecuados y deben desecharse. [NOTA-El límite suge-
rido para la desviación estándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Realizar una corrección de variación entre placas.
Esta corrección se aplica para convertir la medición de zona promedio obtenida para cada concentración al valor que se ob-
tendría si la medición de la concentración de referencia promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la misma
que el valor del punto de corrección:

Xc = media corregida del estándar

X5 = media original del estándar
XR = media de la referencia
P = punto de corrección
Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la Tabla 13 (5 1), la corrección es:
14,022=14,167-(15,867-15,722) = 14,167-0,145
Paso 3: Determinar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, graficando las mediciones corregidas de la zona en función del logaritmo de los valores
de concentración estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no ponderada
estándar sobre estos valores, usando software adecuado o los cálculos manuales del Apéndice 1. [NOTA-Usar el logaritmo na-
tural o el logaritmo en base 1 O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente de determinación (%R2)
para una regresión aceptable. La regresión es aceptable sólo si la o/oR2 obtenida excede este valor predeterminado. [NOTA-El
límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 95%.]
 . .
. -~u
X ' >o m

m - ~ m~

Tabla 13. Datos de Muestra (Valoración en Cilindro-Placa)

o

Están-
Repetí-
ción
Referencia (5,) Media Media °'
00
Zona de la Muestra
dar de Pla- Zona 1 Zona 3 Zona 5 Media 2 Zona 4 Zona 6 Media Corregida
(U/ml) Concentración ca (mm) (mm) (mm) (mm) SD O/oRSD (mm) (mm) (mm) (mm) so O/oRSD (mm) )>
::i
51 3,20 1 16, 1 15,6 15,8 15,867 0,200 1,3 14,6 14,1 13,5 14,167 0,324 2,3 14,022 é:t.
0-
2 16,0 15,9 16,2 14,5 14, 1 14,4 (5;
é:t.
3 15,7 15,7 15,8 14,0 14,2 14, 1 n
oV1
5z 4,00 1 15,8 15,6 15,5 15,567 0,158 1,0 14,7 15,1 14,8 14,833 0,265 1,8 14,989
~
1

2 15,7 15,5 15,6 14,7 14,9 15,2

!:»
3 15,7 15,4 15,3 14,8 15,0 14,3 o....,
!:»
54 6,25 1 15,6 15,8 16,0 15, 789 0,169 1, 1 16,6 16,8 16,3 16,578 0,233 1,4 16,511 n
(5'
2 15,8 15,6 15,7 16,6 16,5 16,2 ::i
(1)
3 16, 1 15,7 15,8 16,9 16,5 16,8 V\

7,8125 1 15,6 15,6 15,5 15,667 0,141 0,9 17,3 17,0 17,0 17, 167 0,224 1, 3 17,222
!:;::
55 ;:;·
....,
2 15,6 15,7 15,5 17,3 17,4 17,2 o
15,9 15,8
o-
3 15,8 17,3 17,3 16,7 0·

U3 desconocida 1 15,7 15,8 15,7

15,722ª
15,678 0,179 1, 1 15,3 15,8 15,7 15,4781 0,307 2,0 15,522 °'
lD
n
!:»
V\
2 15,9 15,7 15,7 15,8 15,8 15,5 -.--._
3 15,5 15,8 15,3
2"
15,2 15, 1 15, 1 i
ªÉste es el valor de la media de referencia general, referida más adelante como el "punto de corrección". '1l
(J-
Q
V1
O:l
a·
~
§'
V1

eVl
v
w
',J

-
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 107

Ejemplo: La Tabla 74 resume la porción de la Tabla 73 requerida para esta parte del cálculo.

Conjunto de
Estándares
Tabla 14 - - - - -
Mediciones de la
Zona Corregida
(mm)
--- --- -

-i--_ Concentración
(U/ml)
5 14,022 3,2
5? 14,989 4,0
Referencia ( 5 ,) 15,722 5
54 16,511 6,25
5, 17,222 7,8125

Resultados de la regresión lineal

Línea de la curva estándar:

Z = [3,551 X ln(C)] + 9,978

Z = medición de zona corregida

C = concentración
%R2 = 99,7
Determinación de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las medicio-
nes de la zona del estándar y las mediciones de la zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por variación entre
placas, usando el punto de corrección determinado anteriormente para obtener un promedio corregido para la muestra desco-
nocida, V. [NOTA-Un método alternativo aceptable al uso del punto de corrección consiste en corregir usando el valor en la
línea de regresión estimada correspondiente al logaritmo de la concentración de Sy] Usar la medición de zona promedio co-
rregida en la ecuación de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra, Lu,
mediante:

Lu =(V- a)/b
a= intersección de la línea de regresión
b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Ejemplo: Medición corregida de la zona de la muestra (Tabla 73) = 15,522
Logaritmo natural de la concentración de la muestra:

Lu = (15,522 - 9, 978)/3,551 = 1,561

Concentración de la muestra:
Cu= e1,s61 = 4,765

Porcentaje de concentración de referencia:

Resultado= (4,765/5,000) x 100 = 95,3%

Valoración turbidimétrica: Esta sección detalla el análisis de los datos de.muestra y la determinación de la potencia de una
muestra desconocida usando la valoración turbidimétrica. El método asume que los tubos se distribuyen en forma aleatoria
dentro del bloque de calentamiento u otro dispositivo de control de temperatura. Si el dispositivo tiene un perfil de tempera-
tura que no es uniforme, se prefiere un diseño en bloques aleatorizados. En dicho diseño, la gradilla se divide en áreas (blo-
ques) de temperatura relativamente uniforme y en cada área se coloca al menos un tubo de cada concentración del Estándar y
de cada muestra desconocida. El análisis de datos del diseño en bloques aleatorizados es diferente del siguiente.
Datos de muestra: La Tabla 75 presenta los datos de una valoración que se usarán como ejemplo a lo largo de esta sec-
ción. Se requieren otras columnas para los cálculos, las cuales se explican a continuación.
Tabla 15. Datos de Muestra (Valoración Turbidimétrica)
Concentración Absorbancia Promedio Desviación
Estándar (µg/ml) Repetición (u.a.) (u.a.) Estándar
1 0,8545
2 0,8422
5, 64 3 0,8495 0,8487 0,0062
1 0,8142
2 0,8273
5, 80 3 0,8392 0,8269 0,0125
108 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

Tabla 15. Datos de Muestra (Valoración Turbldlmétrlca) (Continuación)

Concentración Absorbancia Promedio Desviación
Estándar (µg/ml) Repetición (u.a.) (u.a.) Estándar
1 0,6284
2 0,6947
5, 100 3 0,7563 0,6931 0,0640
1 0,6933
2 0,6850
s, 125 3 0,6699 0,6827 0,0119
1 0,5299
2 0,5779
s 156 3 0,5316 0,5465 0,0272

1 0,7130
2 0,7960
u, desconocida 3 0,7201 0,7430 0,0460

Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.

Para cada concentración (incluyendo la muestra), promediar los tres valores de absorbancia.
Ejemplo: Ver 5 1 en la Tabla 75.
0,8487 = X(0,8545; 0,8422; 0,8495)
Para cada concentración, determinar la desviación estándar de las tres lecturas y una desviación estándar combinada para to-
das las concentraciones.
Ejemplo: Ver 51 en la Tabla 75.
0,0125 = 50(0,8545; 0,8422; 0,8495)
El valor combinado se calcula tomando la raíz cuadrada del promedio de las cinco varianzas:
0,0325 = {[(0,0062)2 + (0,0125) 2 + (0,0640) 2 + (0,0119) 2 + (0,0272)2)/5}1/2
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar una desviación estándar combinada máxima acep-
table. Si la desviación estándar combinada excede este máximo predeterminado, los datos de valoración no son adecuados y
se deben descartar. [NOTA-El límite sugerido para la desviación estándar combinada es no más de 10% del valor de absor-
bancia promedio a través de las cinco concentraciones.] Si el número de determinaciones repetidas por concentración es al
menos cinco, entonces se puede calcular una desviación estándar relativa para cada concentración después de verificar valores
atípicos y comparar con una desviación estándar relativa máxima aceptable. [NOTA-El límite sugerido para la desviación es-
tándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Determinar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, graficando los valores de absorbancia promedio en función del logaritmo de los valo-
res de concentración del estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no pon-
derada sobre estos valores usando software apropiado o los cálculos manuales del Apéndice 7. [NOTA-Usar el logaritmo natu-
ral o el logaritmo en base 1 O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente porcentual de determina-
ción (%R 2) para una regresión aceptable. La regresión es aceptable únicamente si el valor %R2 obtenido excede este valor pre-
determinado. [NOTA-El límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 90%.]
Ejemplo: La Tabla 76 resume la porción de la Tabla 75 requerida para esta parte del cálculo.
Tabla 16
Valores Promedio de
Conjunto de Absorbancia Concentración
Estándares (u.a.) (µg/ml)
s, 0,8487 64
s, 0,8269 80
5, 0,6931 100
54 0,6827 125
5, 0,5465 156
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 109

Resultados de la regresión lineal

Línea de la curva estándar:
Absorbancia = 2,2665 - [0,7735 x log 10 (concentración)]

%R2 = 93,0%
Determinación de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las tres medi-
ciones de absorbancia para obtener un promedio para la muestra desconocida, V. Usar esta medición promedio en la ecuación
de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra desconocida, Lu, mediante:

Lu =(V- a)/b

a= intersección de la línea de regresión

b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Ejemplo: Absorbancia promedio de la muestra (Tabla 75) = 0,7430.
log 10 (Cu) = (0,7430 - 2,2665)/(- 0,7735) = 1,9696

Cu= 101,9696 = 93,2

Porcentaje de concentración de referencia = (93,2/100,0) x 100 = 93,2%

Cu= concentración de la muestra

Límites de confianza y combinación de los cálculos de las valoraciones: Debido a la variabilidad entre valoraciones, se
requieren tres o más determinaciones independientes para una estimación confiable de la potencia de la muestra. Para cada
determinación independiente, comenzar con soluciones madre y diluciones de prueba tanto del Estándar como de la muestra,
preparadas por separado, y repetir la valoración de una muestra determinada otro día.
Usando un conjunto de al menos tres determinaciones de la potencia desconocida, usar el método del Apéndice 2 para verifi-
car valores atípicos. Esta determinación debe realizarse en la escala logarítmica.
Para obtener una estimación combinada de la potencia desconocida, calcular el promedio, M, y la desviación estándar de los
logaritmos de las potencias aceptadas. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] Determinar el intervalo de
confianza para la potencia, según se indica a continuación:
antilog[M - t(0,05, N - 1) x SO/-../N], antilog[M + t(0,05, N - 1) x SO /-../N]

M= promedio
SO= desviación estándar
N = número de valoraciones
t(0,05, N-1) = el punto del 5% de dos colas de una distribución t de Student con N-1 grados de libertad
NOTA-El valor t está disponible en hojas de cálculos, textos estadísticos y software estadístico.
W = antilog{[t(0,05, N - 1) x SO/-../N]}
W = mitad de la amplitud del intervalo de confianza
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un valor máximo predeterminado aceptable. Si la mitad de
la amplitud es mayor que el límite de aceptación, continuar con valoraciones adicionales.
Ejemplo: Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con resultados de potencia en la escala logarítmica natural de
1,561; 1,444; 1,517 y 1,535. Entonces:
N=4
M = X(l ,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 1,514
SO= cr(l,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 0,050
t = 3, 182
El intervalo de confianza en la escala logarítmica es
1,514 ± (3, 182 X 0,050/-../4) = (1,434, 1,594)
Tomando antilogaritmos, la potencia estimada es
ei,514 = 4,546

con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de e1·434, e1·594 =(4,197; 4,924)
La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para comparar con un valor de aceptación es el cociente 4,924/4,546 =
1,083.
 11 O (81 >Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

Apéndice 1. Fórmulas para Cálculos Manuales de Regresión y Concentración de la Muestra

Cuando las concentraciones están igualmente espaciadas en la escala logarítmica, los cálculos se pueden realizar usando la
siguiente fórmula. Donde:
:Sk = media de la medición de zona corregida (valoración en cilindro-placa) o valor de absorbancia promedio (valoración
turbidimétrica) para el conjunto estándar k
k = 1, 2, 3, 4, 5
:S = media de los cinco valores :Sk
Lk = logaritmo de la concentración k correspondiente. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] La
pendiente de la línea de regresión se calcula mediante:

b= (Ya/to - Y baja)/ (X alta - Xba¡o)

Yalta = 1/s(3:S5 + 2)4 + )3 - :S¡)

Ybajo = '/s(3:S¡ + 2)2 + )3 - :Ss)

Xaua = Ls
Xbafa = L1
Combinar y simplificar a:

El logaritmo de la concentración de la muestra se halla usando:

Lu = Lreferencio + [ (D - :S)/ b]

Por ejemplo, usando los datos para la valoración en cilindro-placa en la Tabla 73 y logaritmos naturales:
b = [(4X17,222) + (2X16,511)- (2X14,989)- (4X14,020)]/{5[1n(7,81)] - ln(3,2)} = 3,551
:s = (14,020 + 14,989 + 15,722 + 16,511 + 17,222)/5 = 15,693

Logaritmo natural de la concentración de la muestra = ln(5) + [(15,522 - 15,693)/3,551] = 1,561

Concentración de la muestra= e1.s61 = 4,765

Apéndice 2: Procedimiento para Verificar Valores Atípicos; Rechazo de Mediciones

Atípicas o Aberrantes
Toda medición que sea claramente cuestionable debido a una falla en el procedimiento de valoración deberá ser rechazada,
sin importar si se descubre durante el procedimiento de medición o tabulación. El rechazo o la retención arbitrarios de una
medición aparentemente aberrante puede representar una fuente seria de sesgo. Por lo general, el rechazo de mediciones que
se basa únicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia.
Toda medición de potencia sospechada, o atípica, se puede analizar en función del criterio siguiente, el cual se basa en la
variación dentro de un solo grupo de mediciones supuestamente equivalentes a partir de una distribución normal. En prome-
dio, el criterio rechazará una observación válida una vez cada 25 ensayos o una vez cada 50 ensayos. Designar las mediciones
en orden de magnitud de y 1 a yN, donde y¡ es el posible valor atípico, y N es el número de mediciones en el grupo. Calcular la
brecha (gap) relativa usando la Tabla A2- 7, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas y las fórmulas siguientes:
Cuando N = 3 a 7:

Cuando N = 8 a 1O:

Cuando N = 11 a 13:

Si G7, G2 , o G3, según corresponda, excede el valor crítico en la Tabla A2- 7, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas, para la
N observada, existe una base estadística para omitir la(s) medición(es) atípica(s).
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 111

Tabla A2-1. Prueba para Detectar Mediciones Atípicas

En las muestras de una población normal, las brechas iguales o mayores que los valores siguientes de G1, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P
= 0,01, cuando las mediciones atípicas pueden ocurrir únicamente en un extremo; o con P = 0,02, cuando éstas pueden ocurrir en cualquiera de los
extremos.
N 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7
G1 1 0,987 1 0,889 1 0,781 1 0,698 1 0,637

N 1 8 1 9 1 10 1 1

G, 1 0,681 1 0,634 1 0,597 1 1

N 1 11 1 12 1 13 1 1

G, 1 0,674 1 0,643 1 0,617 1 1

Ejemplo: Potencias estimadas de la muestra en escala logarítmica = 1,561; 1,444; 1,51 7; 1,5 35
Verificar la potencia más baja para la medición atípica:
G1 = (1,517 -1,444)/(1,561 - 1,444) = 0,624<0,889

Por lo tanto, 1,444 no es una medición atípica.

Verificar la potencia más alta para la medición atípica:
G1 = (1,561 - 1,535)/(1,561 - 1,444) = 0,222 < 0,889

Por lo tanto, 1,561 no es una medición atípica.

Las potencias atípicas deben marcarse como valores atípicos y deben excluirse de los cálculos de la valoración. No se puede
excluir más de una potencia como medición atípica.

(85) PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

•Partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la
Farmacopea japonesa. Aquellas partes que no han sido armonizadas están marcadas con los símbolos (•.) para especificar dicha
situación .•
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegati-
vas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus).
Hay tres técnicas para esta prueba: la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada en la formación de gel; la técnica
turbidimétrica, basada en la producción de turbidez después de la ruptura de uniones de un sustrato endógeno; y la técnica
cromogénica que se basa en el desarrollo de color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno. Efec-
tuar la prueba con cualquiera de las tres técnicas. En caso de duda o controversia, la decisión final se toma basándose en la
prueba de límite de coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del producto en análisis. La prueba
se efectúa de forma tal que se evite la contaminación por endotoxinas.

APARATOS

Eliminar los pirógenos de todo el material de vidrio y otros materiales termoestables en un horno de aire caliente, mediante
un proceso validado.• 1 • Habitualmente se usan 30 minutos a 250º como tiempo y temperatura mínimos. Si se emplean mate-
riales de plástico, tales como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automáticos, usar los que han demostrado
estar exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba. [NOTA-En este capítulo, el término "tubo" incluye cual-
quier otro receptáculo, como por ejemplo los pocillos de las placas de microtitulación.]

REACTIVOS Y SOLUCIONES DE PRUEBA

Usado de Amebocitos-Un producto liofilizado obtenido a partir de un lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo he-
rradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere sólo a un producto fabricado de conformidad con
las reglamentaciones de la autoridad competente. [NOTA-El Lisado de Amebocitos reacciona con algunos j:i-glucanos además
de reaccionar con las endotoxinas. Existen preparaciones de Lisado de Amebocitos que no reaccionan con los glucanos: se pre-

• 1Para una prueba de validez del procedimiento para inactivar endotoxinas, ver Esterilización por Calor Seco en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos
Farmacopeicos (1211 ). Usar un Usado SR con una sensibilidad no menor de O, 15 Unidades de Endotoxina por ml .•
 112 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 37

paran retirando del Lisado de Amebocitos el factor G que reacciona con los glucanos o inhibiendo el sistema de reacción del
factor G del Lisado de Amebocitos. Se pueden usar para pruebas de endotoxinas en presencia de glucanos.]
Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)-Usar Agua para Inyección o agua producida por otros procedi-
mientos y que no reaccione con el lisado empleado, en el límite de detección del reactivo.
Usado SR-Disolver con agitación suave el Lisado de Amebocitos en Agua para PEB o en un amortiguador recomendado por
el fabricante del lisado. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o congelado, de acuerdo con las especificaciones del fa-
bricante.

PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES

Solución Madre del Estándar de Endotoxina-Preparar una Solución Madre del Estándar de Endotoxina a partir de un Es-
tándar de Referencia de Endotoxina USP que haya sido calibrado con el Estándar Internacional para Endotoxinas vigente de la
OMS. Seguir las especificaciones en el prospecto del empaque y en la etiqueta para la preparación y almacenamiento de la
Solución Madre del Estándar de Endotoxina. El contenido de endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NOTA-
Una Unidad USP de Endotoxina (UE) es igual a una Unidad Internacional (UI) de endotoxina.]
Soluciones Estándar de Endotoxina-Después de mezclar vigorosamente la Solución Madre del Estándar de Endotoxina,
preparar las diluciones seriales apropiadas de la Solución Estándar de Endotoxina, usando Agua para PEB. Usar las diluciones tan
pronto como sea posible para evitar la pérdida de actividad por adsorción.
Soluciones Muestra-Preparar las Soluciones Muestra disolviendo o diluyendo los medicamentos, usando Agua para PEB.
Algunas sustancias o preparaciones se pueden disolver o diluir adecuadamente en otras soluciones acuosas. Si fuera necesario,
ajustar el pH de la solución (o de la dilución) a examinar de modo que el pH de la mezcla del lisado y la Solución Muestra se
encuentre dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, por lo general entre 6,0-8,0. El pH se puede
ajustar con un ácido, una base o una solución amortiguadora adecuada según lo recomiende el fabricante del lisado. Los áci-
dos y las bases se pueden preparar a partir de concentrados o sólidos con Agua para PEB en recipientes exentos de endotoxinas
detectables. Las soluciones amortiguadoras se deben validar para garantizar que están exentas de endotoxinas y otros factores
de interferencia detectables.

DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DILUCIÓN VÁLIDA (MDV)

La máxima dilución válida es la dilución máxima permisible de una muestra a la que se le puede determinar el límite de
endotoxina. Determinar la MDV a partir de la siguiente ecuación:
MDV =(límite de endotoxina x concentración de la Solución Muestra)/(/...)
Límite de Endotoxina-EI límite de endotoxina para medicamentos de administración parenteral, definido según la dosis,
es igual a K/M• 2 . , donde K es la dosis pirogénica umbral de endotoxina por kg de peso corporal y Mes igual a la dosis máxima
recomendada del producto, en bolo, por kg de peso corporal. Cuando el producto se va a inyectar a intervalos frecuentes o
por infusión continua, Mes la dosis máxima total administrada durante un periodo de una hora. El límite de endotoxinas para
los medicamentos de administración parenteral se especifica en la monografía individual en unidades como UE/mL, UE/mg,
UE/Unidad de actividad biológica, etc.
Concentración de la Solución Muestra-
mg/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por peso (UE/mg);
Unidades/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por unidad d~ actividad biológica (UE/Unidad);
mL/mL: cuando el límite de endotoxina se especifica por volumen (UE/mL).
'A: la sensibilidad declarada en la Técnica de Coagulación (UE/mL) o la concentración más baja usada en la curva estándar
para la Técnica Turbidimétrica o la Técnica Cromogénica.

TÉCNICA DE COAGULACIÓN
La técnica de coagulación se usa para detectar o cuantificar endotoxinas basándose en la coagulación del lisado empleado
como reactivo en presencia de endotoxina. La concentración mínima de endotoxina requerida para hacer que el lisado se coa-
gule en las condiciones estándar es la sensibilidad declarada del lisado empleado como reactivo. Para garantizar tanto la preci-
sión como la validez de la prueba, efectuar las pruebas para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y para determinar
factores de interferencia según se describe en Pruebas Preparatorias.

• 2 K es 5 UE-USP/kg de peso corporal para cualquier vía de administración distinta de la intratecal (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de peso corporal). En el caso de
productos radiofarmacéuticos que no se administren por vía intratecal, el límite de endotoxina se calcula como 175 UE/V, donde Ves la dosis máxima recomenda-
da en ml. En el caso de radiofármacos administrados por vía intratecal, el límite de endotoxina se obtiene mediante la fórmula 14 UE/V. Para formulaciones (por lo
general productos oncológicos) que se administran por metro cuadrado de superficie corporal, la fórmula es K/M, donde K = 100 UE/m 2 y Mes la dosis
máxima/m2 .•
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 11 3

Pruebas Preparatorias
Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Usado-Confirmar en cuatro determinaciones repetidas la sen-
sibilidad declarada, A., expresada en UE/mL del lisado antes de usarlo en la prueba. La prueba de confirmación de sensibilidad
del lisado se debe llevar a cabo cuando se usa una partida nueva de lisado o cuando hay algún cambio en las condiciones de la
prueba que pueda afectar el resultado. Preparar soluciones estándar con al menos cuatro concentraciones equivalentes a 2A., A.,
0,5A. y 0,25A., diluyendo el ER Endotoxina USP con Agua para PEB.
Mezclar un volumen del Lisado SR con un volumen igual (como por ejemplo alícuotas de O, 1 mL) de una de las Soluciones
Estándar de Endotoxina en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas de prueba individuales que contengan lisa-
do liofilizado, agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. Incubar la mezcla de reacción durante un período
constante según las instrucciones del fabricante del lisado (habitualmente a 37 ± 1ºdurante 60 ± 2 minutos), evitando vibracio-
nes. Para analizar la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente de la incubadora y con un único movimiento
suave, invertirlos aproximadamente a 180º. Si se ha formado un gel firme que permanece en su lugar después de invertir los
tubos, registrar el resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un gel intacto. La prueba se considera váli-
da cuando la concentración más baja de las soluciones estándar presenta un resultado negativo en todas las pruebas repetidas.
El punto final es la concentración más baja en la serie de concentraciones decrecientes de endotoxina estándar que coagula
el lisado. Determinar la media geométrica del punto final calculando la media de los logaritmos de las concentraciones en el
punto final de la serie de cuatro determinaciones repetidas y calculando luego el antilogaritmo de la media, según se indica en
la siguiente fórmula:
media geométrica de la concentración en el punto final = antilogaritmo (L,e/f)
donde 'I,e es la suma de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de diluciones utilizadas, y fes el
número de tubos de ensayo repetidos. La media geométrica de la concentración en el punto final es la sensibilidad medida del
lisado (en UE/mL). Si no es menor de 0,5A- y no es mayor de 2A, se confirma la sensibilidad declarada y se usa en las pruebas
realizadas con este lisado.
Prueba de Factores de Interferencia-Por lo general, preparar soluciones (A-D) como se muestra en la Tabla 7, y efectuar
la prueba de inhibición o potenciación en las Soluciones Muestra con una dilución menor que la máxima dilución válida (MDV),
que no contenga endotoxinas detectables, procediendo según se describe en Prueba de Confirmación de Ja Sensibilidad Declara-
da del Lisado. La media geométrica de las concentraciones en el punto final de las Soluciones By C se determina usando la
fórmula descrita en la Prueba de Confirmación de Ja Sensibilidad Declarada del Lisado. La prueba de factores de interferencia de-
berá repetirse siempre que se presenten cambios en alguna de las condiciones que pudieran influir en el resultado de la prue-
ba.
Tabla 1. Preparación de Soluciones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas de Coagulación
Concentración de Endotoxina/
Solución a la que se Agrega Factor de Concentración Número de
Solución Endotoxina Diluyente Dilución de Endotoxina Repeticiones
Aª Ninguna/Solución Muestra - - - 4
Bb 2A/ Solución Muestra Solución Muestra 1 2A 4
2 n 4
4 0,5/,. 4
8 0,25/,. 4
ce 2A/Agua para PEB Agua para PEB 1 2A 2
2 n 2
4 0,5/,. 2
8 0,25/,. 2
Dd Ninguna/Agua para PEB - - - 2
ª Solución A: Una Solución Muestra de la preparación en análisis que esté exenta de endotoxinas detectables.
b Solución B: Prueba de interferencia.
e Solución C: Control para sensibilidad declarada del lisado.
d Solución D: Control negativo de Agua para PEB

Esta prueba se considera válida cuando todas las determinaciones repetidas de las Soluciones A y D no muestran ninguna
reacción y el resultado de la Solución C confirma la sensibilidad declarada.
Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la Solución B no es menor de 0,5A- y no es mayor de 2A, la Solución
Muestra no contiene factores que interfieran en las condiciones experimentales usadas. En caso contrario, la Solución Muestra a
examinar interfiere con la prueba.
Si la muestra en análisis no cumple con la prueba a una dilución menor que la MDV, se debe repetir la prueba empleando
una dilución mayor que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad permite una dilución mayor de la mues-
tra a examinar y esto puede contribuir a la eliminación de la interferencia.
114 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 37

La interferencia se puede resolver mediante un tratamiento adecuado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamien-
to. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valo-
ración descrita anteriormente, utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Estándar de Endotoxina y se ha
sometido al tratamiento seleccionado.

Prueba de Límite

Procedimiento-Preparar las Soluciones A, B, C y D según se indica en la Tabla 2 y llevar a cabo la prueba en estas solucio-
nes siguiendo el procedimiento indicado anteriormente en la Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado en
Pruebas Preparatorias.
Tabla 2. Preparación de Soluciones para la Prueba de Límite de Coagulación
Concentración de Endotoxina/
Solución a la que se Agrega
Solución* Endotoxina Número de Repeticiones
A Ninguna/ Solución Muestra Diluida 2
B 2ic/ Solución Muestra Diluida 2
e 2A/ Agua para PEB 2
D Ninguna/Agua para PEB 2
* Preparar la Solución A y la Solución B de control positivo del producto utilizando una dilución no mayor que la MDV y tratamientos según se indica en la Prueba
de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias. Las Soluciones By C de control positivo contienen la Solución Estándar de Endotoxina a una concentración que
corresponde al doble de la sensibilidad declarada del lisado. La Solución D de control negativo consiste en Agua para PEB.

Interpretación-La prueba se considera válida cuando ambas determinaciones repetidas de las Soluciones By C son positi-
vas y las de la Solución D son negativas. Cuando se obtiene un resultado negativo para ambas determinaciones repetidas de la
Solución A, la preparación en análisis cumple con la prueba. Cuando se obtiene un resultado positivo para ambas determinacio-
nes repetidas de la Solución A, la preparación en análisis no cumple con la prueba.
Cuando se obtiene un resultado positivo para una de las determinaciones de la Solución A y un resultado negativo para la
otra, repetir la prueba. En la repetición, la preparación en análisis cumple con la prueba si se obtiene un resultado negativo en
ambas determinaciones repetidas de la Solución A. La preparación no cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo
para una o ambas determinaciones repetidas de la Solución A. Sin embargo, si la preparación no cumple con la prueba a una
dilución menor que la MDV, se puede repetir la prueba empleando una dilución mayor que no exceda la MDV.

Prueba Cuantitativa

Procedimiento-La prueba cuantifica endotoxinas bacterianas en las Soluciones Muestra por valoración volumétrica hasta
un punto final. Preparar Soluciones A, B, C y D según se indica en la Tabla 3 y analizar siguiendo el procedimiento en la Prueba
de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebas Preparatorias.
Tabla 3. Preparación de Soluciones para la Prueba de Coagulación
Factor
Concentración de Endotoxina/ de
Solución a la cual se Agrega Dllu- Concentración Número de
Solución Endotoxina Diluyente ción de Endotoxina Repeticiones
Aª Ninguna/ Solución Muestra Agua para PEB 1 - 2
2 - 2
4 - 2
8 - 2
Bb 2A./ Solución Muestra - 1 2A 2
(' 21./ Agua para PEB Agua para PEB 1 2A 2
2 n 2
4 0,51. 2
8 0,25A. 2
Dd Ninguna/Agua para PEB - - - 2
ªSolución A: Solución Muestra en análisis a la dilución, que no debe exceder la MDV, con la cual se completó la Prueba de Factores de Interferencia. Las diluciones
subsiguientes de la Solución Muestra no deben exceder la MDV. Usar Agua para PEB para efectuar una serie de diluciones en cuatro tubos que contengan la
Solución Muestra en análisis a concentraciones de 1, 1/2, 1/,, y 1/, con respecto a la concentración usada en la Prueba de Factores de Interferencia. Se pueden usar
otras diluciones hasta la MDV, según sea necesario.
b Solución 8: Solución A que contenga endotoxina estándar a una concentración de 2). (control positivo del producto).
' Solución C: Dos series repetidas de cuatro tubos de Agua para PEB que contengan la endotoxina estándar a una concentración de 2i., l., 0,5)., y 0,25)., respecti-
vamente.
d Solución D: Agua para PEB (control negativo).
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 115

Cálculo e Interpretación-La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes: (1) ambas de-
terminaciones repetidas de la Solución D de control negativo son negativas; (2) ambas determinaciones repetidas de la Solución
B de control positivo del producto son positivas; y (3) la media geométrica de la concentración en el punto final de la Solución
e está comprendida en el intervalo de 0,5}. a n.
Para determinar la concentración de endotoxinas de la Solución A, calcular la concentración en el punto final para cada repe-
tición multiplicando cada factor de dilución del punto final por A. La concentración de endotoxinas en la Solución Muestra es la
concentración en el punto final de las repeticiones. Si la prueba se realiza con una Solución Muestra diluida, calcular la concen-
tración de endotoxinas en la Solución Muestra original multiplicando por el factor de dilución. Si ninguna de las diluciones de la
Solución Muestra es positiva en un ensayo válido, informar la concentración de endotoxina como menor que A (si se analizó la
muestra diluida, informar como menor que A multiplicado por el factor de dilución más bajo de la muestra). Si todas las dilu-
ciones son positivas, la concentración de endotoxina se informa como igual o mayor que el factor de dilución mayor por A
(p.ej., el factor de dilución inicial multiplicado por 8 y por A en la Tabla 3).
La preparación cumple con los requisitos de la prueba si la concentración de endotoxinas en ambas determinaciones repeti-
das es menor que la especificada en la monografía individual.

TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS CUANTITATIVAS

Técnica Turbidimétrica

Esta técnica es una valoración fotométrica que mide los incrementos en turbidez del reactante. Dependiendo del principio
empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valoración turbidimétrica de punto final o valoración turbidi-
métrica cinética. La valoración turbidimétrica de punto final se basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endo-
toxinas y la turbidez (absorbancia o transmisión) de la mezcla de reacción al término de un período de incubación. La valora-
ción turbidimétrica cinética es un método para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia o transmisión prede-
terminada de la mezcla de reacción (tiempo de iniciación) o la velocidad de desarrollo de turbidez. La prueba se efectúa a la
temperatura de incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1º).

Técnica Cromogénica

Esta técnica es una valoración para medir el cromóforo liberado de un péptido cromogénico adecuado por la reacción de las
endotoxinas con el lisado. Dependiendo del principio empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valora-
ción cromogénica de punto final o valoración cromogénica cinética. La valoración cromogénica de punto final se basa en la
relación cuantitativa entre la concentración de endotoxinas y la liberación del cromóforo al término de un período de incuba-
ción. La valoración cromogénica cinética es un método para medir el tiempo (tiempo de iniciación) necesario para alcanzar
una absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción o la velocidad de desarrollo de color. La prueba se efectúa a la tem-
peratura de incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1º).

Pruebas Preparatorias

Con el fin de garantizar la precisión o validez de las técnicas turbidimétricas y cromogénicas, se realizan las pruebas prepara-
torias para verificar que los criterios para la curva estándar son válidos y que la solución muestra no interfiere con la prueba.
Cuando cambian las condiciones que pueden influir en el resultado de la prueba es necesaria la validación del método de
prueba.
Garantía de los Criterios para la Curva Estándar-La prueba se debe efectuar para cada lote de lisado empleado como
reactivo. Utilizando la Solución Estándar de Endotoxina, preparar por lo menos tres concentraciones de endotoxina dentro del
intervalo indicado por el fabricante del lisado para generar la curva estándar. Realizar la valoración usando por lo menos tres
determinaciones repetidas de cada concentración de endotoxina estándar, siguiendo las instrucciones del fabricante del lisado
(con respecto a relaciones de volumen, tiempo de incubación, temperatura, pH, etc.). Si el intervalo deseado en los métodos
cinéticos es mayor de dos logaritmos, se deben incluir estándares adicionales para que cada aumento logarítmico esté com-
prendido en el intervalo de la curva estándar. El valor absoluto del coeficiente de correlación, r, debe ser mayor o igual a
0,980 para el intervalo establecido de concentraciones de endotoxina.
Prueba para Factores de Interferencia-Seleccionar una concentración de endotoxina en o cerca del centro de la curva
estándar de endotoxina. Preparar las Soluciones A, B, C y O según se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo la prueba en las Solucio-
nes A, B, C y O al menos por duplicado, de acuerdo con las instrucciones del lisado empleado, por ejemplo, en lo que respecta
al volumen entre la Solución Muestra y el Lisado SR, la relación de volumen de la Solución Muestra y el Lisado SR, el tiempo de
incubación, etc.
 1

116 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 37

Tabla 4. Preparación de Soluciones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas Fotométricas

Solución a la cual se Agrega
Solución Concentración de Endotoxina Endotoxina Número de Repeticiones
Aª Ninguna Solución Muestra No menos de 2
Bb Concentración central de la curva estándar Solución Muestra No menos de 2
ce Al menos 3 concentraciones (la concentración más baja se Agua para PEB No menos de 2 para cada una
denomina /,)
Dd Ninguna Agua para PEB No menos de 2
ª Solución A: Solución Muestra se puede diluir sin que exceda la MDV.
b Solución B: La preparación en análisis a la misma dilución que la Solución A, que contenga endotoxina agregada a una concentración igual o cercana a la
concentración central de la curva estándar.
e Solución C: La endotoxina estándar a las concentraciones usadas en la validación del método descrito para Garantía de Criterios para la Curva Estándar en
Pruebas Preparatorias (controles positivos).
d Solución O: Aqua para PEB (control negativo).

La prueba se considera válida cuando se cumplen las condiciones siguientes.

1 . El valor absoluto del coeficiente de correlación de la curva estándar generada usando la Solución Ces mayor o igual a
0,980.
2. El resultado de la Solución D no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del lisado empleado co-
mo reactivo o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
Calcular la recuperación media de la endotoxina agregada restando la concentración media de endotoxina en la solución, si
la hubiera (Solución A, Tabla 4), de la que contiene la endotoxina agregada (Solución B, Tabla 4). Para considerar que no pre-
senta factores que interfieran con la valoración en las condiciones de la prueba, la concentración medida de endotoxina agre-
gada a la Solución Muestra debe estar entre 50%-200% de la concentración conocida de endotoxina agregada después de
restar la endotoxina detectada en la solución sin endotoxina agregada.
Cuando la recuperación de endotoxina se encuentra fuera de los intervalos especificados, se considera que la Solución Mues-
tra en análisis contiene factores de interferencia. Luego, repetir la prueba usando una dilución mayor que no exceda la MDV.
Además, la interferencia de la Solución Muestra o de la Solución Muestra diluida que no exceda la MDV se puede eliminar me-
diante un tratamiento validado apropiado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamiento. Para establecer que el trata-
miento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración descrita anteriormente
utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Endotoxina Estándar y se ha sometido posteriormente al trata-
miento seleccionado.

Procedimiento de Prueba

Seguir el procedimiento descrito anteriormente para Prueba de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias.

Cálculo

Calcular la concentración de endotoxina de cada una de las determinaciones repetidas de la Solución A usando la curva es-
tándar generada con la Solución C de control positivo. La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones
siguientes.
1. Los resultados de la Solución C de control cumplen con los requisitos de validación definidos en Garantía de Criterios para
la Curva Estándar, en Pruebas Preparatorias. ·
2. La recuperación de endotoxina, calculada a partir de la concentración encontrada en la Solución B después de restar la
concentración de endotoxina encontrada en la Solución A está dentro del intervalo de 50%-200%.
3. El resultado de la Solución D de control negativo no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del
lisado empleado o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.

1nterpretación

En las valoraciones fotométricas, la preparación en análisis cumple con la prueba si la concentración media de endotoxinas
de las determinaciones repetidas de la Solución A, después de la corrección por dilución y concentración, es menor que el lími-
te de endotoxina para el producto.
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro 11 7

(87) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VITRO

Las pruebas que se describen a continuación han sido diseñadas para determinar la reactividad biológica de cultivos de célu-
las de mamíferos después de entrar en contacto con plásticos elastoméricos y otros materiales poliméricos que, a su vez, están
en contacto directo o indirecto con el paciente, o de extractos específicos preparados a partir de los materiales en análisis. Es
esencial que las pruebas se realicen en la superficie especificada. Cuando ésta no se puede determinar, utilizar O, 1 g de elastó-
mero o 0,2 g de plástico u otro material por cada mL de líquido de extracción. Tomar precauciones en la preparación de los
materiales para evitar la contaminación con microorganismos y otra materia extraña.
Se describen tres pruebas (es decir, la Prueba de Difusión en Agar, la Prueba de Contacto Directo y la Prueba de Elución). 1 La
decisión acerca del tipo de prueba o el número de pruebas a realizar para la evaluación de la posible respuesta biológica de
una muestra o extracto específicos depende del material, el producto final y el uso previsto. Otros factores que también pue-
den afectar la aptitud de la muestra para un uso específico son: la composición polimérica, los procedimientos de procesa-
miento y limpieza, el medio de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorción, la adsorción y la permeabilidad de los conser-
vantes, y las condiciones de almacenamiento. La evaluación de tales factores se debe realizar con pruebas específicas adiciona-
les adecuadas antes de determinar si un producto fabricado a partir de un material específico es apto para el uso previsto. Los
materiales que no cumplen con las pruebas in vitro son candidatos para las pruebas in vivo descritas en Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vivo (88).
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Polietileno de Alta Densidad USP. ER Biorreacción Positiva USP.
Preparación del Cultivo de Células-Preparar múltiples cultivos de células de fibroblastos de mamífero L-929 (ATCC línea
celular CCL 1, NCTC clon 929; pueden usarse líneas celulares alternativas obtenidas de un repositorio de estándares siempre
que se sometan a una validación adecuada) en un medio de cultivo esencial mínimo suplementado con suero, con una densi-
dad de siembra de aproximadamente 10 5 células por mL. Incubar los cultivos a 37° ± 1 º en una incubadora humidificada du-
rante no menos de 24 horas en una atmósfera de 5 ± 1% de dióxido de carbono hasta obtener una monocapa con una con-
fluencia superior al 80%. Observar al microscopio los cultivos preparados para asegurar que las monocapas sean uniformes y
tiendan a la confluencia. [NOTA-La reproducibilidad de las Pruebas de Reactividad Biológica In Vitro depende de la obtención
de una densidad uniforme del cultivo celular.]
Disolventes de Extracción-Inyección de Cloruro de Sodio (ver monografía-usar una Inyección de Cloruro de Sodio que
contenga NaCI al 0,9%). De modo alternativo, se pueden usar medios de cultivo de células de mamífero sin suero o medios de
cultivo de células de mamífero suplementados con suero. Se usa el suplemento de suero cuando la extracción se realiza a 37º
durante 24 horas.
Aparato-
Autoc/ave-Emplear un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 º ± 2º equipado con un termómetro, un ma-
nómetro, una llave de ventilación, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel del
agua y un sistema de refrigeración de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente 20º, pero no
por debajo de 20º, inmediatamente después del ciclo de calentamiento.
Estufa-Usar una estufa, preferentemente un modelo de convección mecánica, que mantenga las temperaturas de funcio-
namiento en un intervalo de 50º-70º ± 2º.
lncubadora--Usar una incubadora capaz de mantener una temperatura de 37º ± 1 ºy una atmósfera humidificada de 5 ± 1 %
de dióxido de carbono en el aire.
Recipientes de Extracción-Utilizar únicamente recipientes de vidrio Tipo 1, como por ejemplo, ampollas o tubos de ensayo
de cultivo con tapa de rosca, o equivalentes. En caso de utilizar tubos de ensayo para cultivo, o equivalentes, deben cerrarse
con una tapa de rosca que tenga un revestimiento elastomérico adecuado. La superficie expuesta del revestimiento elastoméri-
co está completamente protegida con un disco sólido inerte con un espesor de 50-75 µm. Se puede fabricar un disco adecua-
do de teflón.
Preparación del Aparato-Limpiar minuciosamente todo el material de vidrio con una mezcla limpiadora de ácido crómico y,
si fuera necesario, con ácido nítrico caliente y luego enjuagar con Agua Estéril para Inyección durante un tiempo prolongado.
Esterilizar y secar mediante un proceso adecuado los recipientes y dispositivos usados para la extracción, transferencia o admi-
nistración del material de prueba. Si se usa óxido de etileno como agente esterilizante, dejar que pasen no menos de 48 horas
para la desgasificación total.
Procedimiento-
Preparación de la Muestra para Extractos-Preparar según se indica en Procedimiento, en Pruebas de Reactividad Biológica, In
Vivo (88).
Preparación de Extractos-Preparar según se indica para la Preparación de Extractos, en Pruebas de Reactividad Biológica, In
Vivo (88) y usar la Inyección de Cloruro de Sodio (NaCI al 0,9%) o el medio de cultivo de células de mamífero sin suero como
Disolventes de Extracción. [NOTA-Si la extracción se realiza a 37º durante 24 horas en una incubadora, usar medio de cultivo

1 Para más detalles, consulte las siguientes publicaciones de la American Society for Testing and Materials, 1916 Race St., Philadelphia, PA 19103: "Standard Test
Method for Agar Diffusion Cell Culture Screening for Cytotoxicity," designación de ASTM F 895-84; "Standard Practice for Direct Contact Cell Culture Evaluation
of Materials for Medical Devices," designación de ASTM F 813-83.
 118 (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro / Pruebas Biológicas USP 37

de células suplementado con suero. Las condiciones de extracción no deben causar en ningún caso cambios físicos como la
fusión o el ablandamiento de los trozos de material, excepto una ligera adherencia.]

Prueba de Difusión en Agar

Esta prueba está diseñada para cierres elastoméricos de diferentes formas. La capa de agar actúa como protector de las célu-
las y evita daños mecánicos mientras permite la difusión de las sustancias químicas lixiviables de las muestras poliméricas. Los
extractos de los materiales que se van a analizar se aplican a una pieza de papel de filtro.
Preparación de Muestra-Usar extractos preparados según se indica o usar porciones de las muestras de prueba que tengan
superficies planas con un área de no menos de 100 mm 2 •
Preparación de Control Positivo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra.
Preparación de Control Negativo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra.
Procedimiento-Usando 7 mL de suspensión de células preparada según se indica en la Preparación del Cultivo de Células,
preparar las monocapas en placas de 60 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de las mono-
capas y reemplazarlo con medio de cultivo suplementado con suero que contenga no más de 2% de agar. [NOTA-La calidad
del agar debe ser adecuada para mantener el crecimiento celular. La capa de agar debe ser lo suficientemente delgada para
permitir la difusión de las sustancias químicas lixiviables.] Colocar las superficies planas de la Preparación de Muestra, Prepara-
ción de Control Negativo y Preparación de Control Positivo o sus extractos en un medio de extracción adecuado, en cultivos du-
plicados, en contacto con la superficie de agar solidificado. Usar no más de tres muestras por placa preparada. Incubar todos
los cultivos durante no menos de 24 horas a 37° ± 1º, preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1 %
de dióxido de carbono. Observar al microscopio, cada cultivo alrededor de cada Muestra, Control Negativo y Control Positivo
usando una tinción adecuada, si se desea.
Interpretación de los Resultados--La reactividad biológica (degeneración y malformación celular) se describe y clasifica en
una escala de 0-4 (ver la Tabla 7). Determinar las respuestas de los cultivos de células de la Preparación de Muestra, la Prepara-
ción de Control Negativo y la Preparación de Control Positivo. El sistema de prueba de cultivos de células es adecuado si la res-
puesta observada de la Preparación de Control Negativo es grado O (no reactiva) y la de la Preparación de Control Positivo es al
menos grado 3 (moderada). La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra no
es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
Tabla 1. Grados de Reactividad en la Prueba de Difusión en Agar y la Prueba de Contacto Directo
Grado Reactividad Descripción de la Zona de Reactividad
o Ninguna No se detecta zona reactiva alrededor, ni debajo de la muestra
1 Escasa Algunas células malformadas o degeneradas debajo de la muestra
2 Leve Zona limitada al área debajo de la muestra y menos de 0,45 cm alrededor de la muestra
3 Moderada Zona reactiva que se extiende de 0,45 cm a 1,0 cm alrededor de la muestra
4 Grave Zona reactiva que se extiende más de 1,0 cm alrededor de la muestra

Prueba de Contacto Directo

Esta prueba está diseñada para materiales de diferentes formas. Este procedimiento permite la extracción y el análisis simul-
táneos de sustancias químicas lixiviables de la muestra en un medio suplementado con suero. El procedimiento no es adecua-
do para materiales de muy baja o muy alta densidad que puedan causar daños. mecánicos a las células.
Preparación de Muestra-Usar porciones de la muestra de prueba que tenga superficies planas con un área de no menos de
100 mm 2 •
Preparación de Control Positivo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra.
Preparación de Control Negativo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra.
Procedimiento-Usando 2 mL de suspensión de células preparada según se indica en la Preparación del Cultivo de Células,
preparar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de los cultivos
y reemplazarlo con 0,8 mL de medio de cultivo recién preparado. Colocar una única Preparación de Muestra, una Preparación
de Control Negativo y una Preparación de Control Positivo en cada uno de los cultivos duplicados. Incubar todos los cultivos du-
rante no menos de 24 horas a 37º ± 1 ºen una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1 % de dióxido de carbono. Obser-
var al microscopio cada cultivo alrededor de cada Preparación de Muestra, Preparación de Control Negativo y Preparación de Con-
trol Positivo, usando una tinción adecuada, si se desea.
Interpretación de los Resultados-Proceder según se indica para la Interpretación de los Resultados en Prueba de Difusión en
Agar. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra no es mayor que grado 2
(levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
 USP 37 Pruebas Biológicas / (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 119

Prueba de Elución

Esta prueba está diseñada para la evaluación de extractos de materiales poliméricos. El procedimiento permite ia extracción
de muestras a temperaturas fisiológicas o no fisiológicas para distintos intervalos de tiempo. Es adecuada para materiales de
alta densidad y para evaluaciones de respuesta a la dosis.
Preparación de Muestra-Preparar según se indica en la Preparación de Extractos, usando una Inyección de Cloruro de Sodio
(NaCI al 0,9%) o un medio de cultivo de células de mamífero sin suero como Disolventes de Extracción. Si el tamaño de la
Muestra no se puede determinar inmediatamente, usar no menos de O, 1 g de material elastomérico o 0,2 g de material plásti-
co o polimérico por mL de medio de extracción. De modo alternativo, usar un medio de cultivo de células de mamífero suple-
mentado con suero como medio de extracción para simular mejor las condiciones fisiológicas. Preparar los extractos calentan-
do la muestra durante 24 horas en una incubadora que contenga 5 ± 1% de dióxido de carbono. Mantener la temperatura de
extracción a 37° ± 1 º, ya que temperaturas superiores pueden desnaturalizar las proteínas séricas.
Preparación de Control Positivo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra.
Preparación de Control Negativo-Proceder según se indica para la Preparación de Muestra.
Procedimiento-Usando 2 mL de suspensión de células preparada según se indica en la Preparación del Cultivo Celular, prepa-
rar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y
reemplazarlo con extractos de la Preparación de Muestra, Preparación de Control Negativo o Preparación de Control Positivo. Los
extractos de los medios de cultivo de células suplementados con suero y sin suero se analizan por duplicado sin dilución
(100%). El extracto con Inyección de Cloruro de Sodio se diluye con el medio de cultivo de células suplementado con suero y
se analiza por duplicado a una concentración del extracto del 25%. Incubar todos los cultivos durante 48 horas a 37° ± 1 º,
preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1% de dióxido de carbono. Observar al microscopio cada
cultivo a las 48 horas, usando una tinción adecuada, si se desea.
Interpretación de los Resultados-Proceder según se indica para la Interpretación de los Resultados en Prueba de Difusión en
Agar, pero usando la Tabla 2. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra no
es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma. Para realizar eva-
luaciones de la respuesta a la dosis, repetir el procedimiento, usando diluciones cuantitativas del extracto de la muestra.
Tabla 2. Grados de Reactividad en la Prueba de Elución
Grado Reactividad Condiciones de todos los Cultivos
o Ninguna Gránulos intracitoplasmáticos diferenciados sin lisis celular
El 20% o menos de las células son redondas, levemente adheridas, sin gránulos intracitoplasmáticos; hay al-
1 Escasa gunas células lisadas
Más del 20% pero menos o hasta el 50% de las células son redondas y desprovistas de gránulos intracito-
2 Leve plasmáticos; no hay lisis celular extensiva ni áreas vacías entre células
3 Moderada Más del 50% pero menos del 70% de las capas celulares contienen células redondas o lisadas
4 Grave Destrucción casi total de las capas celulares

(88) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VIVO

Las siguientes pruebas están diseñadas para determinar la respuesta biológica de animales a materiales elastoméricos, plásti-
cos y otros materiales poliméricos en contacto directo o indirecto con el paciente, o mediante la inyección de extractos especí-
ficos preparados a partir del material en análisis. Es esencial conocer el área específica para la extracción. Cuando ésta no se
puede determinar, utilizar O, 1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otro material por cada mL de líquido de extracción. Tam-
bién es fundamental tomar las precauciones necesarias en la preparación de los materiales que se van a inyectar o instilar para
evitar la contaminación con microorganismos y otra materia extraña. Se describen tres pruebas. La Prueba de Inyección Sistémi-
ca y la Prueba lntracutánea se utilizan para materiales elastoméricos, especialmente para cierres elastoméricos para los que las
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) correspondientes han indicado una reactividad biológica significativa. Estas dos
pruebas se utilizan para plásticos y otros polímeros además de una tercera prueba, la Prueba de Implantación, para probar la
aptitud de estos materiales destinados a la fabricación de envases y accesorios, para uso en preparaciones parenterales y en
dispositivos médicos, implantes y otros sistemas.
Estas tres pruebas se aplican a materiales o dispositivos médicos, cuando existe la necesidad de clasificar los plásticos y otros
polímeros basándose en las pruebas de reactividad biológica in vivo.
A los efectos de este capítulo, se aplicarán las siguientes definiciones: la Muestra es la muestra en análisis o un extracto pre-
parado a partir de dicha muestra. Un Blanco consiste en la misma cantidad del mismo medio de extracción usado para extraer
la muestra en análisis, tratado de la misma manera que el medio de extracción que contiene dicha muestra. Un Control Negati-
vo1 es una muestra que no produce ninguna reacción en las condiciones de prueba.

1 ER Polietileno de Alta Densidad USP.

 120 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo / Pruebas Biológicas USP 37

CLASIFICACIÓN DE PLÁSTICOS

Se definen seis Clases de Plásticos (ver la Tabla 1). Esta clasificación se basa en las respuestas a una serie de pruebas in vivo
para las que se especifican extractos, materiales y vías de administración. Estas pruebas están directamente relacionadas con el
uso final al que están destinados los artículos de plástico. La elección de extractantes es representativa de los vehículos en pre-
paraciones con las que es probable que los plásticos entren en contacto. La clasificación de la Tabla 1 facilita la comunicación
entre proveedores, usuarios y fabricantes de plásticos ya que resume las pruebas a las que deben someterse los envases de
inyectables y dispositivos médicos cuando es necesaria su clasificación.
Tabla 1. Clasificación de Plásticos
Clases de Plásticoª Pruebas por Realizar
1 11 111 IV V VI Material de Prueba Animal Dosis Procedimientob
X X X X X X Ratón 50 mL/kg A{IV)
Extracto de Muestra en Inyección de Clo- 0,2 mL/animal en cada
X X X X X X ruro de Sodio Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B(IC)
X X X X X
Extracto de Muestra en Solución 7 en 20 Ratón 50 mL/kg A(IP)
de Alcohol en Inyección de Cloruro de So- 0,2 mL/animal en cada
X X X X X dio Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B (IC)
X X X Ratón 10 g/kg A (IP)
Extracto de Muestra en Polietilenglicol 0,2 mL/animal en cada
X X 400 Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B(IC)
X X X X Ratón 50 mL/kg A (IP)
0,2 mL/animal en cada
X X X Extracto de Muestra en Aceite Vegetal Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B{IC)
X X Tiras de implante de Muestra Conejo 4 tiras/animal c
X X Implante de Muestra Rata 2 Muestras/animal c
ª Las pruebas requeridas para cada clase de plástico se indican con una "x" en las columnas correspondientes.
b Leyenda: A (IP)-Prueba de Inyección Sistémica (intraperitoneal); A (IV)-Prueba de Inyección Sistémica (intravenosa); B (IC)-Prueba lntracutánea (intracutá-
nea); C-Prueba de Implantación (implantación intramuscular o subcutánea).

Con excepción de la Prueba de Implantación, los procedimientos se basan en el uso de extractos que, según la resistencia
térmica del material, se preparan a una de las tres temperaturas estándar: 50º, 70º y 121 º. Por lo tanto, la designación del tipo
de plástico debe estar acompañada por una indicación de la temperatura de extracción (p.ej., IV-121 º, que representa un plás-
tico clase IV extraído a 121 ºo 1-50º, que representa un plástico clase 1extraído a 50º).
Los plásticos pueden clasificarse como Clases de Plástico USP 1-VI únicamente sobre la base de los criterios de respuesta pres-
critos en la Tabla 1.
Esta clasificación no es válida para plásticos destinados al uso como envases de productos orales o tópicos o que pudieran
utilizarse como una parte integral de la formulación de un medicamento. La Tabla 1 no es válida para elastómeros naturales,
los cuales deben analizarse con Inyección de Cloruro de Sodio y aceites vegetales únicamente.
La Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba lntracutánea están diseñadas para determinar las respuestas biológicas sistémica
y local, respectivamente, de animales a plásticos y otros polímeros mediante la inyección monodosis de extractos específicos
preparados a partir de una Muestra. La Prueba de Implantación está diseñada para evaluar la reacción del tejido vivo al plástico
y a otros polímeros mediante la implantación de la Muestra propiamente dicha.en el tejido animal. Para la realización de la
Prueba de Implantación, son importantes la preparación y la colocación adecuadas de las muestras en condiciones asépticas.
Estas pruebas están diseñadas para la aplicación de plásticos y otros polímeros en la condición en la que se utilizan. Si el
material va a exponerse a cualquier proceso de limpieza o esterilización antes de su uso final, las pruebas deben realizarse con
una Muestra preparada a partir de una muestra preacondicionada mediante el mismo procesamiento.
Ciertos factores, como por ejemplo la composición del material, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el contac-
to con los medios, tintas, adhesivos, absorción, adsorción y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de almacena-
miento también pueden afectar la aptitud de un material para un uso específico. Para determinar la aptitud de un material
para su uso indicado, deben evaluarse estos factores mediante pruebas específicas adicionales.
Estándares de Referencia USP (11 )-fR Polietileno de Alta Densidad USP.
Medios de Extracción-
INYECCIÓN DE CLORURO DE SODIO (ver la monografía). Usar Inyección de Cloruro de Sodio que contenga NaCI al 0,9%.
SOLUCIÓN 1 EN 20 DE ALCOHOL EN INYECCIÓN DE CLORURO DE SODIO
POLIETILENGLICOL 400 (ver la monografía).
ACEITE VEGETAL-Usar Aceite de Sésamo recién refinado (ver la monografía) o Aceite de Semilla de Algodón (ver la monogra-
fía) u otros aceites vegetales adecuados.
VEHÍCULO DEL PRODUCTO FARMACÉUTICO (donde corresponda).
AGUA PARA INYECCIÓN (ver la monografía).
USP 37 Pruebas Biológicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 121

NOTA-El Aceite de Sésamo o el Aceite de Semilla de Algodón u otros aceites vegetales cumplen con los siguientes requisitos
adicionales. Obtener, si es posible, aceite recientemente refinado. Usar tres animales debidamente preparados e inyectar el
aceite por vía intracutánea en una dosis de 0,2 mL en 1O sitios por animal y observar los animales a las 24, 48 y 72 horas
después de la inyección. Calificar las observaciones en cada sitio con la escala numérica indicada en la Tabla 2. Para los 3 cone-
jos o cobayos (30 ó 18 sitios de inyección), en cualquier momento de observación, la respuesta promedio para eritema no es
mayor de 0,5 y para edema no es mayor de 1,0; y ningún sitio muestra una reacción tisular de más de 1 O mm de diámetro
general. El residuo de aceite en el lugar de la inyección no debe confundirse con edema. El tejido edematoso se blanquea al
presionarlo suavemente.
Tabla 2. Evaluación de las Reacciones Cutáneasª
Eritema y Formación de Escaras Puntaje
Ausencia de eritema o
Eritema muy leve (apenas perceptible) 1
Eritema bien definido 2
Eritema de moderado a grave 3
Eritema grave (rojo intenso) a leve formación de escaras (lesiones profundas) 4
Formación de Edemab Punta je
Ausencia de edema o
Edema muy leve (apenas perceptible) 1
Edema leve (los bordes están bien definidos con una elevación clara) 2
Edema moderado (aproximadamente 1 mm de elevación) 3
Edema grave (más de 1 mm de elevación y extendido más allá del área de exposición) 4
ª Draize )H, Woodward G, Calvery HO. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. f
Pharmacol Exp Ther 1944;82:377-390.
b Excluye edemas no inflamatorios (mecánicos) del blanco o líquido de extracción.

Aparatos-Los aparatos requeridos para las pruebas incluyen los siguientes.

AUTOCLAVE-Usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 º ± 2,0º, equipado con un termómetro, un medi-
dor de presión, una llave de ventilación, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel
del agua y un sistema enfriador de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente, pero no por
debajo de 20º inmediatamente después del ciclo de calentamiento.
ESTUFA-Usar una estufa, preferentemente un modelo de circulación forzada, que mantenga las temperaturas de funciona-
miento de 50º o 70º ±2º.
RECIPIENTES DE EXTRACCIÓN-Usar únicamente recipientes, como ampollas o tubos de ensayo para cultivo de vidrio Tipo 1con
tapa de rosca. En caso de usarse, los tubos de ensayo para cultivo deben cerrarse con tapas de rosca que tengan revestimien-
tos elastoméricos adecuados. La superficie expuesta del revestimiento elastomérico está completamente protegida con un dis-
co sólido inerte con un espesor de 0,05-0,075 mm. Puede fabricarse un disco adecuado a partir de una resina de teflón.
Preparación del Aparato-Limpiar minuciosamente todos los elementos de vidrio con mezcla limpiadora de ácido crómico
o, si fuera necesario, con ácido nítrico caliente y luego enjuagar con agua durante un tiempo prolongado. Limpiar los utensi-
lios para cortar con un método adecuado (por ejemplo, limpieza sucesiva con acetona y cloruro de metileno) antes de utilizar-
los para subdividir una muestra. Limpiar todos los demás equipos cepillándolos minuciosamente con un detergente adecuado
y enjuagar con agua durante un tiempo prolongado.
Esterilizar y secar los recipientes y equipos utilizados para la extracción, transferencia y administración de material de prueba
con un proceso adecuado. [NOTA-Si se usa óxido de etileno como agente esterilizante, dejar transcurrir el tiempo suficiente
para la desgasificación total.]
Procedimiento-
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA-Tanto la Prueba de Inyección Sistémica como la Prueba lntracutánea pueden realizarse utilizando
el mismo extracto, si se desea, o bien pueden utilizarse extractos diferentes para cada prueba. Seleccionar y subdividir en por-
ciones una Muestra del tamaño indicado en la Tabla 3. Eliminar las partículas, como pelusas y partículas sueltas, tratando cada
Muestra subdividida o Control Negativo del siguiente modo. Colocar la Muestra en una probeta graduada limpia de 100 mL con
tapón de vidrio Tipo 1y agregar aproximadamente 70 mL de Agua para Inyección. Agitar aproximadamente 30 segundos y es-
currir el agua. Repetir este paso y secar las piezas preparadas para la extracción con Aceite Vegetal en una estufa a una tempe-
ratura máxima de 50º. [NOTA-No limpiar la Muestra con un paño seco o húmedo ni enjuagando o lavando con un disolvente
orgánico, agente tensoactivo, etc.]
 122 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo / Pruebas Biológicas USP 37

Tabla 3. Superficie de la Muestra a Utilizarª

Cantidad de Muestra por cada 20 ml de Medio de
Forma del Material Espesor Extracción Subdividida en
Equivalente a 120 cm 2 de superficie total (ambos lados Tiras de aprox. 5 x
Película o lámina <0,5 mm combinados) 0,3 cm
Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (ambos lados
0,5-1 mm combinados)
Longitud (en cm)= 120 cm 2 /(suma de las circunferencias Secciones de aprox.
Tubos <0,5 mm (pared) del DI y DE) 5 x 0,3 cm
Longitud (en cm)= 60 cm 2 /(suma de circunferencias del
0,5-1 mm (pared) DI y DE)
Placas, tubos y elementos moldea- Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (todas las superfi- Piezas hasta aprox. 5
dos >1 mm ~ies _expuestas combinadas) x 0,3 cm
>-------

Elastómeros
- - - ··--
·-

¡ --- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

>1 mm
---
Equivalente a 25 cm 2 de superficie total (todas las superfi- No subdividirb
cies expuestas combinadas)
ª Cuando la superficie no se puede determinar debido a la configuración de la muestra, usar O, 1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otros polímeros por cada
mL de líquido de extracción.
b Los cierres elastoméricos moldeados se prueban intactos.

PREPARACIÓN DE EXTRACTOS-Colocar una Muestra debidamente preparada para su análisis en un recipiente de extracción y
agregar 20 ml del medio de extracción adecuado. Repetir estas indicaciones para cada medio de extracción requerido para la
prueba. Preparar también un blanco de 20 ml de cada medio para inyecciones paralelas y comparaciones. Extraer calentando
en un autoclave a 121 º durante 60 minutos, en una estufa a 70º durante 24 horas o a 50º durante 72 horas. Dejar transcurrir
suficiente tiempo para que el líquido que se encuentra dentro del recipiente alcance la temperatura de extracción. [NOTA-Las
condiciones de extracción no deberían en ningún caso causar cambios físicos, como fusión o ablandamiento de los trozos de
Muestra, lo cual provocaría una reducción de la superficie disponible. Puede tolerarse una ligera adherencia de los trozos. Agre-
gar siempre las piezas limpias al medio de extracción en forma individual. Si se utilizan tubos para cultivo para extracciones en
autoclave con Aceite Vegetal, sellar las tapas de rosca en forma adecuada con cinta sensible a la presión.]
Enfriar hasta una temperatura cercana a la ambiente pero no inferior a 20º, agitar vigorosamente durante varios minutos y
decantar cada extracto de inmediato en un recipiente seco estéril, tomando las precauciones asépticas pertinentes. Almacenar
los extractos a una temperatura de 20º-30º y no utilizar para las pruebas después de transcurridas 24 horas. Es importante el
contacto del medio de extracción con la superficie disponible del plástico y el tiempo y la temperatura durante la extracción, el
enfriamiento adecuado, la agitación y el proceso de decantación, así como la manipulación y almacenamiento aséptico de los
extractos después de la extracción.

PRUEBA DE INYECCIÓN SISTÉMICA

Esta prueba está diseñada para evaluar respuestas sistémicas a los extractos de materiales en análisis después de su inyección
en ratones. Pueden usarse vías alternativas de inyección, si se justifican.
Animales de Prueba-Utilizar ratones albinos sanos que pesen de 17-23 g y que no hayan sido utilizados previamente.
Para cada grupo de prueba, utilizar únicamente ratones del mismo origen. Suministrar agua y comida ad líbitum, del tipo nor-
malmente utilizado para animales de laboratorio y de composición conocida.
Procedimiento-[NOTA-Agitar cada extracto vigorosamente antes de retir.ar las dosis de inyección para asegurar la distri-
bución uniforme de la materia extraída.] Inyectar a cada uno de los cinco ratones del grupo de prueba la Muestra o el Blanco
según se indica en la Tabla 4, excepto que se debe diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y
el Blanco correspondiente con 4, 1 volúmenes de Inyección de Cloruro de Sodio para obtener una solución con una concentra-
ción de aproximadamente 200 mg de polietilenglicol por ml.
Tabla 4. Procedimiento de Inyección-Prueba de Inyección Sistémica
Extracto o Blanco Dosis por kg Víaª
Inyección de Cloruro de Sodio 50 mL IV
Solución 1 en 20 de Alcohol en Inyección de Cloruro de Sodio 50 mL IV
Polietilenglicol 400 10 g IP
Vehículo del producto farmacéutico (cuando corresponda) 50 mL IV
50 mL IP
Aceite Vegetal 50 ml IP
ª IV= intravenosa (muestra acuosa y blanco); IP = intraperitoneal (muestra oleaginosa y blanco).
Observar a los animales de inmediato después de la inyección, nuevamente 4 horas después de la inyección y luego a las 24,
48 y 72 horas como mínimo. Si durante el período de observación ninguno de los animales tratados con el extracto de la
Muestra evidencia una reactividad biológica significativamente mayor que los animales tratados con el Blanco, la Muestra cum-
ple con los requisitos de esta prueba. Si dos o más ratones mueren, o si se produce una conducta anormal, como por ejemplo
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 123

convulsiones o postración, en dos o más ratones, o si se registra una pérdida de peso de más de 2 g en tres o más ratones, la
Muestra no cumple con los requisitos de la prueba. Si cualquiera de los animales tratados con la Muestra sólo presenta signos
leves de reactividad biológica y no más de un (1) animal presenta síntomas de marcada reactividad biológica o muere, repetir
la prueba utilizando grupos de 1 O ratones. Al repetir la prueba, los 1 O animales tratados con la Muestra no presentan reactivi-
dad biológica significativa superior a la de los animales tratados con el Blanco durante el período de observación.

PRUEBAINTRACUTÁNEA

Esta prueba está diseñada para evaluar las respuestas locales a los extractos de materiales en análisis después de su inyección
intracutánea en conejos o cobayos.
Animales de Prueba-Seleccionar conejos o cobayos sanos que puedan esquilarse bien y cuya piel esté libre de irritación o
traumatismos mecánicos. Al manipular los animales, evitar tocar los sitios de la inyección durante los períodos de observación,
salvo para discriminar entre edema y residuos de aceite
Procedimiento-[NOTA-Antes de retirar las dosis de inyección, agitar cada extracto vigorosamente para asegurar la distri-
bución uniforme de la materia extraída.] El día de la prueba, esquilar bien el lomo del animal a ambos lados de la columna
vertebral sobre un área de prueba suficientemente grande. Evitar la irritación y los traumatismos mecánicos. Eliminar los pelos
sueltos mediante aspiración. Si fuera necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo humedecido en alcohol diluido y secar
antes de aplicar la inyección. Puede utilizarse más de un extracto de un determinado material por conejo o cobayo, siempre y
cuando se haya determinado que los resultados de la prueba no se verán afectados. Para cada Muestra utilizar dos animales e
inyectar a cada uno por vía intracutánea, utilizando un lado del animal para la Muestra y el otro lado para el Blanco, según se
indica en la Tabla 5. [NOTA-Diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y el Blanco correspon-
diente, con 7,4 volúmenes de Inyección de Cloruro de Sodio para obtener una solución con una concentración de aproximada-
mente 120 mg de polietilenglicol por mL.]
Tabla 5. Prueba lntracutánea
Número de Sitios Dosis
Extracto o Blanco (por animal) (µL por sitio)
Muestra 5 200
Blanco 5 200

Examinar los sitios de inyección en busca de evidencia de cualquier reacción del tejido, como por ejemplo eritema, edema y
necrosis. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo con alcohol diluido para facilitar la lectura de los
sitios de inyección. Observar a todos los animales 24, 48 y 72 horas después de la inyección. Calificar las observaciones en una
escala numérica para el extracto de la Muestra y para el Blanco, utilizando la Tabla 2. Volver a esquilar el pelaje según sea nece-
sario durante el período de observación. Se determinan los puntajes promedio de eritema y edema para los sitios de la Muestra
y el Blanco en cada periodo de observación (24, 48 y 72 horas) para cada conejo o cobayo. Después del puntaje de las 72
horas, todos los puntajes de eritema más los puntajes de edema se suman por separado para cada Muestra y Blanco. Dividir
cada uno de los totales por 12 (2 animales x 3 períodos de observación x 2 categorías de puntaje) para determinar el puntaje
medio de cada Muestra frente al de cada Blanco correspondiente. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre
el puntaje medio de la Muestra y del Blanco es de 1,0 o menos. Si en cualquier período de observación, la reacción promedio a
la Muestra es cuestionablemente mayor que la reacción promedio al Blanco, repetir la prueba utilizando tres conejos o cobayos
adicionales. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre el punta je medio de la Muestra y el Blanco es de 1,0 o
menos.

PRUEBA DE IMPLANTACIÓN

La prueba de implantación está diseñada para la evaluación de materiales plásticos y otros materiales poliméricos que están
en contacto directo con tejido vivo. Es importante la preparación adecuada de las tiras de implante y su adecuada implanta-
ción en condiciones asépticas. Se requieren conejos adultos saludables de Nueva Zelanda para la prueba de implantación intra-
muscular. Las muestras de prueba se colocan dentro de agujas para ser implantadas. Aunque la mayoría de los materiales se
ajustan fácilmente a este método, existen algunos materiales que son inadecuados para la implantación intramuscular. El mo-
delo de implantación subcutánea en ratas es una alternativa factible para materiales cuyas características físicas son inadecua-
das para la implantación intramuscular de rutina.

Implantación Intramuscular en Conejos

Preparar para implantación 8 tiras de la Muestra y 4 tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP. Cada tira debe medir no
menos de 1 O mm x 1 mm. Los bordes de las tiras deben ser tan lisos como sea posible para evitar traumatismos mecánicos
adicionales durante la implantación. Las tiras del tamaño mínimo especificado se implantan con una aguja hipodérmica (cali-
bre 15-19) con una punta intravenosa y un trocar estéril. Utilizar agujas previamente esterilizadas dentro de las cuales se inser-
tan asépticamente las tiras de plástico estériles o insertar cada tira limpia en una aguja cuya cánula y conector hayan sido pro-
 124 <88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo / Pruebas Biológicas USP 37

tegidos con una cubierta adecuada y sometidos posteriomente al proceso de esterilización adecuado. [NOTA-Permitir la des-
gasificación adecuada si se usan agentes como óxido de etileno.]
Animales de Prueba-Seleccionar conejos adultos sanos con un peso de al menos 2,5 kg y cuyos músculos paravertebrales
sean lo suficientemente grandes para permitir la implantación de las tiras de prueba. No utilizar ningún tejido muscular que no
sea el sitio paravertebral. Los animales deben anestesiarse con un agente anestésico de uso común hasta un grado suficiente
como para evitar los movimientos musculares, como espasmos. Ver las pautas de la Asociación Internacional para la Evaluación
y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC, por sus siglas en inglés).
Procedimiento-Realizar la prueba en un área limpia. El día de la prueba, o hasta 20 horas antes del análisis, esquilar a los
animales a ambos lados de la columna vertebral. Eliminar los pelos sueltos mediante aspiración. Frotar la piel ligeramente con
un hisopo con alcohol diluido y secar antes de aplicar la inyección.
Implantar cuatro tiras de la Muestra en el músculo paravertebral a un lado de la columna de cada uno de dos conejos, 2,5-
5 cm respecto a la línea media y en forma paralela a la columna vertebral, con una separación de aproximadamente 2,5 cm
entre sí. De manera similar, implantar dos tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP en el músculo opuesto de cada animal.
Insertar un estilete estéril en la aguja para sostener la tira de implante en el tejido mientras se extrae la aguja. En caso de obser-
var sangrado excesivo después de implantar una tira, colocar una tira duplicada en otro lugar.
Mantener los animales durante 120 horas como mínimo y luego sacrificarlos al final del período de observación, adminis-
trándoles una sobredosis de un agente anestésico u otros agentes adecuados. Dejar transcurrir suficiente tiempo para cortar el
tejido sin que se presente sangrado. Examinar macroscópicamente el área del tejido que rodea la porción central de cada tira
de implante. Utilizar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control para detectar la presencia de hemorragia, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la
encapsulación, si la hubiera, registrando el ancho de la cápsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control
o Muestra hasta la periferia de la cápsula) redondeado a la décima de mm. Calificar la encapsulación según se indica en la
Tabla 6.
Tabla 6. Evaluación de la Encapsulación en la Prueba de Implantación
Ancho de la Cápsula Puntaje
Ninguna o
Hasta 0,5 mm 1
0,6-1,0 mm 2
1,1-2,0mm 3
Más de 2,0 mm 4

Calcular las diferencias entre puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se cum-
plen si la diferencia no es mayor de 1,0, o si la diferencia entre los puntajes medios de la Muestra y el Control para más de uno
de los cuatro sitios de implantación no es mayor de 1 en cualquiera de los animales implantados.

Prueba de Implantación Subcutánea en Ratas

Preparar para implantación 1 O muestras de prueba y 1 O muestras control. El tamaño y la forma de las muestras control de-
ben ser lo más parecido posible a los de las muestras de prueba. Por ejemplo, las muestras preparadas en láminas deben tener
un diámetro de 10-12 mm y un espesor de 0,3-1 mm. Los bordes de las muestras deben ser tan lisos como sea posible para
evitar traumatismos mecánicos adicionales durante la implantación.
Animales de Prueba-Seleccionar ratas albinas saludables con un peso entre 225-350 g al momento de la implantación.
Procedimiento-Realizar la prueba en un área limpia. Anestesiar (ver las pautas de la AAALAC) al animal hasta lograr un
plano quirúrgico. Esquilar el pelaje de los animales en ambos lados de la columna vertebral. Retirar los pelos sueltos mediante
aspiración. Limpiar el área esquilada con solución de yodo-povidona. Usando una técnica aséptica, realizar dos incisiones en la
línea media (de aproximadamente 1,0 cm de largo) a través de la piel en las regiones craneal y caudal sobre la superficie dor-
sal. Mediante disección roma, separar la fascia que conecta la piel con el músculo para formar una bolsa debajo de la piel late-
ral a cada costado de la incisión (la base de la bolsa es de aproximadamente 20 mm a partir de la línea del implante). Insertar
una muestra estéril en cada bolsa y cerrar la incisión mediante sutura o ganchos quirúrgicos. Implantar dos muestras de prue-
ba y dos muestras control en cada una de cinco ratas. Mantener a los animales durante un periodo de al menos siete días y
sacrificarlos al final del periodo de observación mediante hipoxia inducida por C0 2 o administrando una sobredosis de un
agente anestésico. Dejar transcurrir un tiempo suficiente para que el tejido pueda cortarse sin que sangre. Cortar longitudinal-
mente la piel (superficie dorsal) y levantarla. Examinar macroscópicamente y con cuidado el área del tejido que rodea el im-
plante. Cortar la muestra por la mitad y retirarla para examinar de cerca el tejido que está en contacto directo con la muestra.
Usar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar, si fuera apropiado. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control en busca de hemorragias, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la encapsulación,
si la hubiera, registrando el ancho de la cápsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control o Muestra hasta
la periferia de la cápsula) redondeando a la décima de mm. Registrar el puntaje de la encapsulación de acuerdo con la Tabla 6.
Calcular las diferencias entre los puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se
cumplen si la diferencia no excede de 1,0.
 USP 37 Pruebas Biológicas / (90) Suero Fetal Bovino 125

PRUEBAS DE SEGURIDAD-PRODUCTOS BIOLÓGICOS

La prueba de seguridad aquí descrita está diseñada para detectar cualquier reactividad biológica imprevista e inaceptable en
un artículo. Esta prueba in vivo es para la evaluación de la seguridad de los productos obtenidos por biotecnología.

Prueba de Seguridad

Seleccionar cinco ratones sanos que no hayan sido utilizados previamente para pruebas y que pesen de 1 7-23 g, a menos
que se indique algo diferente en la monografía individual correspondiente o en otra parte de este capítulo, mantenidos con
una dieta equilibrada adecuada. Preparar una solución de prueba según las indicaciones de la monografía individual corres-
pondiente. A menos que se indique lo contrario en la monografía individual o en otra parte de este capítulo, inyectar una dosis
de 0,5 mL de la solución de prueba a cada uno de los ratones, utilizando una aguja de calibre 26 de la longitud adecuada o de
la longitud especificada a continuación, según corresponda. Observar a los animales durante las 48 horas posteriores a la in-
yección. Si al cabo de las 48 horas todos los animales sobreviven y no más de uno de los animales presenta síntomas externos
de una reacción inesperada debido al nivel de toxicidad relacionado con el artículo, se cumplen los requisitos de esta prueba.
Si uno o más animales mueren o si más de uno de los animales presenta signos de toxicidad anormal o indebida del artículo
en análisis, repetir la prueba utilizando al menos otros 1O ratones similares a los utilizados para la prueba inicial pero con un
peso de 20 ± 1 g. En cualquiera de los casos, si todos los animales sobreviven durante 48 horas y no presentan síntomas de
una reacción indicativa de un nivel de toxicidad anormal o indebido del artículo, se cumplen los requisitos de la prueba. De-
ben obtenerse los pesos corporales de los ratones antes de la prueba y al finalizarse para detectar cualquier efecto inapropiado.
Los animales que presenten signos de toxicidad deberán someterse a una necropsia completa y a estudios de histopatología, si
fuera necesario.
Para los productos biológicos, realizar la prueba según los procedimientos que se describen en el Código de Reglamentos Fe-
derales, Sección 610.11.

(90) SUERO FETAL BOVINO-ATRIBUTOS DE CALIDAD Y PRUEBAS DE

FUNCIONALIDAD

PROCESAMIENTO

El Suero Fetal Bovino (FBS, por sus siglas en inglés) es la fracción líquida de color marrón claro de la sangre bovina fetal
coagulada de la que se ha eliminado células, fibrina y factores de coagulación. Aunque no se ha definido la composición com-
pleta del FBS, éste contiene altos niveles de factores de crecimiento y bajos niveles de inmunoglobulinas. Además, contiene
otros ingredientes claves que son esenciales para sustentar la proliferación de células en cultivos. Este producto se usa tanto en
la investigación básica de las ciencias biológicas como en la fabricación industrial. El FBS es un subproducto de la industria de
la carne y se recolecta a partir de fetos bovinos extraídos del ganado que se encuentra preñado al momento de su faena. El
FBS se recolecta en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del país de origen. La recolección y el procesa-
miento deben ser llevados a cabo por personal capacitado siguiendo procec:limientos escritos y aprobados. La sangre se reco-
lecta en un sistema cerrado en un área dedicada dentro de la instalación y se procesa rápidamente para evitar la hemólisis.
Posteriormente, se permite que la sangre coagule y luego, por lo general, se centrifuga en una centrífuga refrigerada para se-
parar el suero de los demás componentes. Por lo regular, el suero se extrae del coágulo, se transfiere a envases etiquetados, y
se congela. Todos los fabricantes emplean filtración estéril antes del envasado final. Además, la radiación gamma proporciona
la garantía más alta de ausencia de actividad viral. Las dosis de radiación gamma de 25-40 kGy proporcionan una reducción
logarítmica significativa de agentes virales y de otros agentes adventicios, al tiempo que preservan el desempeño para el creci-
miento celular.
La detección de contaminación viral en el FBS se logra usando todas las pruebas aplicables descritas en el Code of Federal
Regulations (Código de Reglamentos Federales) Título 9 CFR 113.53 (conocido como el análisis completo del Título 9 del
CFR). Los ensayos para micoplasmas se realizan según se indica en Pruebas para Micoplasmas (63).

ATRIBUTOS DE CALIDAD DEL SUERO FETAL BOVINO

Envasado y Almacenamiento: Almacenar en envases sellados a una temperatura de -1 Oº o menor.

Etiquetado: Etiquetar indicando que contiene Suero Fetal Bovino e indicar el número de lote, la fecha de caducidad y las
condiciones de almacenamiento. Asimismo, indicar el país de origen en el etiquetado del producto.
 126 (90) Suero Fetal Bovino / Pruebas Biológicas USP 37

Estándares de Referencia USP (11)

ER Endotoxina USP
ER Suero Fetal Bovino USP
pH (791 ): 7,00-8,00 en muestras de suero sin diluir
Osmolalidad (785): 280-360 mOsmol/kg
Endotoxinas Bacterianas (85): Contiene no más de 1O Unidades USP de Endotoxina/mL de suero.
Contenido de Proteínas Totales (1057): 30-45 mg/mL
Pruebas de Esterilidad (71 ): Cumple con los requisitos
ldentificación-lnmunodifusión Radial
Reactivos
- Muestras de prueba de FBS
- Suero de caballo, muestras de control negativo
- Calibrador de lgG bovina (500 mg/L)
- Diluyente de albúmina ovina (albúmina ovina al 1%, EDTA al O, 18%, NaCI al 1,75% y Tris/HCI de pH 7,4 al 1,21 %).
Materiales/ Aparato: Calibrar el dispositivo de medición de anillos (halos) en incrementos de O, 1 mm. Las placas de inmu-
nodifusión radial (IDR) están disponibles comercialmente y contienen antisuero anti-lgG bovina en un gel de agarosa al 1,5%,
solución amortiguadora de fosfato O, 1 M de pH 7,0, azida de sodio al O, 1% como agente bacteriostático y 1 µg/mL de anfote-
ricina B como agente antifúngico. Almacenar a una temperatura de 2º-8º. Usar placas de IDR que puedan medir lgG bovina
en el intervalo de 50-500 mg/L.
Curva estándar: Usar los calibradores de lgG bovina para la aptitud del sistema y para generar una curva de calibración.
Preparar dos diluciones a partir de una solución madre de lgG bovina de 500mg/ml. Diluir 120 µL de la solución madre de
500 mg/L con 80 µL de diluyente (dilución media) y 25 µL de la solución madre de 500 mg/L con 225 µL de diluyente (dilu-
ción baja). Etiquetar cada dilución respectivamente como calibradores de 300 mg/L y de 50 mg/L. Usar las soluciones de
500 mg/L, 300 mg/L y 50 mg/L para generar la curva estándar. [NOTA-Preparar y analizar las soluciones calibradoras de lgG
bovina por duplicado.] Cargar 5 µL de cada muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa. A las 72 horas de la incubación,
medir los diámetros de los anillos con una aproximación de O, 1 mm usando un dispositivo de medición de anillos apropiado.
Registrar los resultados y generar una curva estándar.
El diámetro del anillo debe desarrollarse completamente a temperatura ambiente durante 72 horas. Usando el resultado de
cada punto de la curva estándar, generar una gráfica de linealidad en la que y es el diámetro cuadrado (mm 2 ) del anillo de
precipitina alrededor del pocillo y x es la concentración de lgG bovina (mg/L). Calcular la curva de regresión lineal por cuadra-
dos mínimos de la forma y = m(x) + b con ayuda de un software adecuado y determinar los valores para la pendiente (m), la
ordenada al origen y (b) y el coeficiente de determinación (R2 ). La curva estándar para el método es lineal si R2 es ;:>:0,98.
Análisis: Las muestras congeladas sin diluir de FBS se descongelan y analizan dentro de las 24 horas si se almacenan a 4º.
El análisis de las muestras de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP se realiza por triplicado. Preparar placas de IDR que
contengan anti-lgG bovina para el análisis de varios tipos de suero. Dejar que las placas y los reactivos se equilibren a tempera-
tura ambiente antes de su uso dejando las placas abiertas durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir que se
evapore cualquier condensación de humedad en los pocillos o en la superficie del gel. Las muestras no se deben aplicar a los
pocillos en los que se observe humedad. Preparar diluciones en serie, si fuera necesario, de las muestras de prueba de FBS y de
ER Suero Fetal Bovino USP en diluyente. Diluir el suero de caballo para control negativo en diluyente. Cargar 5 µL de cada
muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 72 horas. [NOTA-Las muestras de
prueba y el control negativo se cargan en la misma placa.]
Cálculo: Después de 72 horas, medir los diámetros de los anillos usando el. dispositivo de medición de anillos y registrar
los resultados. Usando la ecuación de regresión desarrollada para la desviación de la curva estándar, calcular la concentración
de lgG bovina en las muestras de FBS. La concentración se expresa en mg/L.
Criterios de aceptación: El suero de caballo es negativo (no debe presentar un anillo de precipitación). Las muestras de
prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP son positivas y deben contener no más de 500 mg/L de lgG.
Contenido de hemoglobina:
(Ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 ).)
Preparación de la muestra: Las muestras de FBS se descongelan, se almacenan a 4º y se analizan dentro del mismo día.
Análisis: Determinar la absorbancia de la muestra de suero usando una celda espectrofotométrica con una longitud de
paso de 1 cm a las longitudes de onda de absorbancia de 576, 623 y 700 nm y usando agua como blanco. Calcular la concen-
tración de hemoglobina en mg/dL por la fórmula:
(Abs 576 x 115) - (Abs 623 x 102) - (Abs 700 x 39, 1)

Criterios de aceptación: No más de 30 mg/dL

PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD DEL FBS

En caso de no existir un ensayo de funcionalidad definido por el usuario, las siguientes pruebas son adecuadas para determi-
nar la funcionalidad de lotes específicos de FBS y para ayudar en la optimización de las condiciones de crecimiento de cultivos
de células mamíferas en presencia de FBS. Para una confirmación válida de la funcionalidad, independiente de las aplicaciones
USP 37 Pruebas Biológicas/ (90) Suero Fetal Bovino 127

específicas del usuario, las pruebas se realizan en las líneas celulares especificadas. Para la validación interna de aplicaciones
especializadas de cultivos celulares, se deben usar y caracterizar líneas celulares específicas para tales aplicaciones. Usar frascos
de cultivo de tejidos apropiados. Las dos pruebas descritas en este capítulo son la Curva de Promoción de Crecimiento y el Ensa-
yo Clona/. La decisión sobre el tipo de prueba o el número de pruebas que se van a realizar para evaluar la aptitud de un lote
específico de FBS depende del tipo de línea celular usada. Para líneas celulares adherentes, el número de colonias al final del
periodo de cultivo representa una buena evaluación de la capacidad de estas células, a baja concentración, para crecer en pre-
sencia de un lote específico de FBS. Para líneas celulares que crecen en cultivos en suspensión, la cinética óptima de crecimien-
to se mide contando las células viables después de 7 días de cultivo.
Líneas celulares: Se recomiendan cinco líneas celulares:
(1) HFL1 (ATCC CCL-153) fibroblasto de pulmón normal
(2) Mvl Lu (ATCC CCL-64) epitelio de pulmón de visón
(3) HL-60 (ATCC CCL-240) promieloblasto de sangre periférica, suspensión
(4) VERO (ATCC CCL-81) fibroblasto de riñón de mono
(5) CHO (CCL-61) ovario de hámster chino
Las pruebas de funcionalidad descritas se deben realizar en tres líneas celulares, dos de las cuales corresponden a la lista de las
cinco líneas celulares recomendadas, mientras que la tercera es la línea celular pertinente a la aplicación del usuario. Las líneas
celulares se cultivan con medios específicos según lo recomendado por la ATCC.
Materiales
- Frasco/recipiente de crecimiento adecuado
- Cabina de Seguridad Biológica Clase 11, Tipo A
- Contador de células/hemacitómetro
- Microscopio invertido con accesorio para cámara digital
- Frascos de cultivo de tejidos: T25 cm 2
Preparación de células para ensayos: Descongelar rápidamente un vial en un baño de agua a 37° y determinar el re-
cuento y la viabilidad celular. Preparar múltiples cultivos a partir de cada línea celular en un medio de crecimiento suplementa-
do con suero. Incubar los cultivos a 37º siguiendo las instrucciones provistas por la ATCC para cada una de las líneas celulares
usadas para la prueba. Examinar los cultivos celulares en un microscopio para asegurarse de la existencia de monocapas unifor-
mes casi confluentes o suspensiones uniformes. Expandir las células hasta que se tengan suficientes para el ensayo (aproxima-
damente 1 x 107 células totales; >90% viabilidad)
Recolección de cultivos
1. Retirar y desechar el medio de crecimiento y luego enjuagar cada cultivo con medio sin FBS.
2. Para las células adherentes, agregar 1 ml de Tripsina/EDTA durante unos pocos minutos para que las células se dispersen.
Incubar a 37°, si fuera necesario. Neutralizar con 1 mL de medio de cultivo que contenga por lo menos 10% de FBS.
3. Centrifugar brevemente (spin down) las células en una centrífuga. Aspirar el medio de lavado y resuspender las células en
un volumen apropiado para siembra.
Siembra de células
1. En el día O: Para las tres líneas celulares que se van a analizar, preparar cultivos múltiples usando densidades de siembra
que abarquen el intervalo entre 2 x 103 y 2 x 104 células viables/ml. (En un inicio, se seleccionan inóculos diferentes para
determinar las condiciones de crecimiento óptimas. Una vez que se ha seleccionado el inóculo apropiado, dicha condi-
ción se usa para propagar las células). A continuación se presentan las densidades de siembra recomendadas:
Densidad de siembra baja: 2 x 10 3 células viables/mL
Densidad de siembra media: 6 x 10 3 células viables/mL
Densidad de siembra alta: 2 x 104 células viables/mL
2. Preparar cultivos por triplicado para al menos cinco puntos de tiempo (en días u horas de acuerdo con la línea celular),
para determinar la densidad de siembra que producirá condiciones de crecimiento óptimo para cada línea celular usada.
3. Incubar los cultivos a 37° en una incubadora humidificada saturada con C0 2 al 5%.
4. Para cada punto de tiempo de medición (días O, 1, 2, 3, 4 y 7), tomar una fotografía de cada cultivo, por triplicado, tanto
para el material de prueba de FBS como del ER Suero Fetal Bovino USP a cada una de las tres concentraciones para cada
línea celular y registrar el porcentaje de confluencia para cada una de las condiciones. [NOTA-Realizar esta etapa antes de
la tripsinización y del conteo celular.]
5. Recolectar las células de los tres cultivos de diferente densidad de siembra para cada punto de tiempo específico. Para
cultivos adherentes, recolectar las células según se describió anteriormente.
6. Realizar y registrar el recuento de células totales y la viabilidad para cada uno de los nueve cultivos de la muestra de FBS y
de ER Suero Fetal Bovino USP para cada línea celular usando un contador de células o hemacitómetro apropiado.
[NOTAS-Es posible que tenga que cambiarse el programa de recuento para líneas celulares de crecimiento rápido o célu-
las grandes que confluyan antes del día 7 y/o para líneas celulares de lento crecimiento que requieran estar en cultivo 8-
1O días antes de alcanzar una meseta. Algunas líneas celulares adherentes nunca lograran la confluencia.]
 128 (90> Suero Fetal Bovino / Pruebas Biológicas USP 37

Curva de Promoción de Crecimiento

Las mediciones de las velocidades de proliferación celular a menudo se usan para determinar la respuesta de las células a
estímulos exógenos. La evaluación cuantitativa de las condiciones de crecimiento celular es un factor importante para monito-
rear la constancia de las condiciones de cultivo. El intervalo de concentración celular óptimo para subcultivos, el inóculo ópti-
mo y el tiempo de duplicación son parámetros que se pueden cuantificar y para los que se pueden establecer tendencias. La
información acerca de la cinética del crecimiento de un cultivo es crítica para el diseño de experimentos celulares. Los cultivos
varían significativamente en sus propiedades de crecimiento en la fase de latencia, la fase de crecimiento exponencial o logarít-
mica y la fase estacionaria. Documentar las características de crecimiento del cultivo durante las tres etapas de crecimiento
para determinar el tiempo de duplicación de la población y el tiempo del ciclo celular. Las células que han entrado en la fase
estacionaria pueden demostrar un potencial de crecimiento reducido y cambios en la morfología. Las células se pueden volver
polarizadas y pueden segregar más matriz extracelular, lo que las vuelve difíciles de retirar del sustrato. Al final de la fase de
crecimiento exponencial las células presentan su mayor rendimiento y su más alta reproductibilidad.
Reactivos
- Medios de crecimiento sin FBS
- Muestras de prueba de FBS
- Medio de crecimiento + 10% de FBS
- Solución de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS)
Análisis: Una vez que las células hayan alcanzado el final de la fase logarítmica, subcultivar las células para la prueba. Se-
guir el procedimiento descrito en Siembra de Células y preparar múltiples cultivos para el ER Suero Fetal Bovino USP y analizar
el FBS para diferentes líneas celulares a tres densidades de siembra para las que al menos una curva de crecimiento presenta
una fase de latencia, una fase logarítmica y una fase estacionaria, y para la cual la fase logarítmica es lineal en tres o más pun-
tos de tiempo.
Los recuentos de células viables se determinan en los días O, 1, 2, 3, 4 y 7.
Cálculo y Análisis de Datos: Calcular el recuento promedio de células viables [células/cm 2 (adherentes) o células/mL (en
suspensión)] y la viabilidad media porcentual para cada punto. Graficar los datos en una gráfica de escala semilogarítmica con
el recuento de células viables sobre la escala logarítmica en el eje y y los días (u horas) en cultivo sobre una escala aritmética en
el eje x. Estimar el tiempo de duplicación usando una curva de crecimiento que sea lineal sobre tres o más puntos.
Criterios de aceptación: El valor R2 de la curva debe ser igual o mayor que 0,98 a fin de respaldar el cálculo de un tiempo
de duplicación válido. El tiempo de duplicación correspondiente a la muestra de prueba debe ser no menos de 90% del tiem-
po de duplicación correspondiente a ER Suero Fetal Bovino USP.

Ensayo Clonal

Este ensayo está diseñado para evaluar el crecimiento óptimo de las líneas celulares adherentes. La eficiencia del plaqueo o
formación de colonias a baja densidad celular es un método preferido para analizar la capacidad de proliferación y la supervi-
vencia de células individuales en condiciones óptimas de crecimiento. Esta es una prueba muy sensible y a menudo se usa para
evaluar la calidad de los lotes de suero. Esta técnica revela diferencias en la velocidad de crecimiento dentro de la población
celular y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tamaño de colonias) y la supervivencia de las
células (número de colonias). Debido a la heterogeneidad de la población celular de algunos cultivos celulares, cabe recordar
que las células crecen de manera diferente como colonias aisladas a bajas densidades. Por consiguiente, pocas células sobrevi-
ven incluso en condiciones ideales debido a la pérdida de toda interacción celuJar. La clonación es un ensayo de supervivencia
que se usa también para optimizar las condiciones de crecimiento (selección de medio y suero). Si es posible confirmar que
una colonia individual surgió de una sola célula, entonces se puede determinar la eficiencia de la clonación.
Reactivos
- Medio de crecimiento + 10% de FBS (suero de prueba)-Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en in-
glés) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustado para que contenga 1,5 g/L de carbonato de sodio, aminoácidos no
esenciales O, 1 mM y piruvato de sodio conteniendo 100 U/mL de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina más 10% de
FBS.
- Solución de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en HBSS.
- Solución Salina Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio.
- Solución de Carbol Fucsina-Azul de Metileno-Mezclar 20 g de carbol fucsina en 2 L de metano! y mezclar durante 1O
minutos (carbol fucsina al 1%). Mezclar 50 g de azul de metileno en 5 L de metano! y mezclar durante 1O minutos (azul
de metileno al 1%). Preparar una solución de trabajo de Carbol Fuscina-Azul de Metileno mezclando azul de metileno al
1%, metano! y carbol fucsina al 1% en una proporción de 3:2:1. Mezclar durante 20 minutos y filtrar a través de cuatro
pliegues de gasa (cheesecloth) en un embudo. Preparar alícuotas y almacenar en frascos de vidrio marrón a una tempera-
tura de 15º a 25º.
Muestra: Se usan múltiples lotes de FBS para este ensayo. Por cada lote de suero a analizar, agregar 20 mL de FBS a
180 mL de EMEM y usar la misma muestra para toda la prueba. Esterilizar usando filtros de baja unión a proteínas de 0,22 µm.
Almacenar el medio de crecimiento a 4º hasta el momento de su uso.
 USP 37 Pruebas Biológicas / (91 > Valoración de Pantotenato de Calcio 129

Preparación de las células: Esta prueba es únicamente para cultivos adherentes y se realiza con las líneas celulares adhe-
rentes descritas en Líneas Celulares (HFL 1 y Mv 1 Lu). Una semana antes de analizar el suero, expandir las líneas celulares según
se indica en Siembra de Células, cambiar el medio cada 2-3 días, y subcultivar las células cuando presenten una confluencia
aproximada de 90%. Determinar el recuento y la viabilidad celular (la viabilidad debe ser
>90%) antes de realizar el ensayo. Recolectar las células según se indica en Recolección de Células, lavar dos veces, y resuspen-
der las células en EMEM basal.
Análisis: El procedimiento implica el plaqueo de una suspensión unicelular en densidades bajas (2-50 células/cm2) a partir
de la cual se formarán colonias discretas. Al final del ensayo, se debe fijar, teñir, y contar el número de colonias según se indica
a continuación.
1 . Para cada línea celular, etiquetar 1 O placas de cultivo de tejidos de 60 mm x 15 mm por cada lote de suero a analizar.
Etiquetar el costado de la mitad inferior de cada plato, incluyendo los controles.
2. Transferir 5 ml de medio que contenga 10% del suero de prueba correspondiente (1 O réplicas). Agregar 400 células por
placa de cultivo (se busca una concentración celular de aproximadamente 800 células/ml).
3. Incubar durante 10-14 días a 37° en una incubadora humidificada, saturada con C0 2 al 5%.
4. Retirar el sobrenadante y agregar suficiente Solución de Carbal Fucsina-Azul de Metileno para cubrir cada una de las pla-
cas de cultivo durante 1O minutos.
5. Retirar la solución colorante; enjuagar las placas de cultivo con varios enjuagues de agua destilada; invertir los platos en
toallas de papel; y dejar que se sequen.
6. Contar y registrar (1) el número de colonias y (2) la superficie total de colonias teñidas (mm 2). Calcular las medias y des-
viaciones estándar.
Criterios de aceptación: La eficiencia de plaqueo porcentual se expresa contando el número de colonias en un área defi-
nida, dividido por el número de células sembradas y multiplicado por 100. Comparar los resultados entre los lotes de FBS y
seleccionar un lote de suero que sea apropiado para varios tipos de células y óptimo para una aplicación de cultivo celular
específica.

(91) VALORACIÓN DE PANTOTENATO DE CALCIO

Estándares de Referencia USP (11 )-fR Pantotenato de Calcio USP.

Solución Madre del Estándar de Pantotenato de Calcio-En un matraz volumétrico de 1000 ml, disolver, en aproxima-
damente 500 ml de agua, 50 mg de ER Pantotenato de Calcio USP, previamente secado y almacenado en un lugar oscuro
sobre pentóxido de fósforo, y pesado con exactitud evitando la absorción de humedad durante la pesada. Agregar 1O ml de
ácido acético 0,2 N y 100 ml de solución de acetato de sodio (1 en 60) y diluir a volumen con agua. Cada ml contiene 50 µg
de ER Pantotenato de Calcio USP. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Preparación Estándar-Diluir, el mismo día de la valoración, un volumen medido de Solución Madre del Estándar de Panto-
tenato de Calcio con una cantidad de agua suficiente para obtener entre 0,01 µg y 0,04 µg de pantotenato de calcio por ml,
cuya concentración exacta sea tal que las respuestas obtenidas según se indica en el Procedimiento, utilizando 2,0 y 4,0 ml de
la Preparación Estándar, se encuentren en la parte lineal de la curva de respuesta en función del logaritmo de la concentración.
Preparación de Valoración-Proceder según se indica en la monografía individual y preparar una solución que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentración de pantotenato de calcio en la Preparación Estándar.
Solución Madre de Medio Basal-

Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína 25 ml

Solución de Cistina-Triptófano 25 ml
Solución de Polisorbato 80 0,25 ml
Dextrosa, Anhidra 10 9
Acetato de Sodio, Anhidro 5q
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina 5 ml
Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina 5 ml
Solución Salina A 5 ml
Solución Salina B 5 ml

Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas y ajustar con hidróxido de sodio
1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar.
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína-Mezclar 100 g de caseína sin vitaminas con 500 ml de ácido clorhídrico 6 N y
someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el ácido clorhídrico de la mezcla mediante destilación bajo presión
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en agua, ajustar la solución con hidróxido de sodio
 1 30 (91) Valoración de Pantotenato de Calcio/ Pruebas Biológicas USP 37

1 N a un pH de 3,5 ± O, 1 y agregar agua para obtener 1 000 ml. Agregar 20 g de carbón activado, revolver durante 1 hora y
filtrar. Repetir el tratamiento con carbón activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a
1 O". Filtrar la solución si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solución de Cistina-Triptófano-Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptófano (o 2,0 g de D,L-triptófano) en un vo-
lumen de agua entre 700 y 800 ml, calentar hasta entre 70º y 80º y agregar, gota a gota y agitando, ácido clorhídrico diluido
(1 en 2), hasta que los sólidos se disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000 ml. Almacenar bajo tolueno en un refri-
gerador a una temperatura no inferior a 1 Oº.
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo-Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y
200 mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1 O ml de ácido clorhídrico 4 N, enfriar y agregar agua para obtener 200 ml. Alma-
cenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de Polisorbato 80-Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml.
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina-Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en ácido
acético 0,02 N para obtener una solución que contenga 20 ~tg de riboflavina, 1 O pg de clorhidrato de tia mina y 0,04 ~tg de
biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina-Preparar una solución en alcohol al 25 por
ciento neutralizado para obtener las siguientes concentraciones: 1 O µg de ácido paraaminobenzoico, 50 µg de niacina y 40 ~tg
de clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución Salina A-Disolver 25 g de fosfato monobásico de potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para
obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Solución Salina B-Disolver en agua 1 O g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5 g
de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Cultivo Madre de Lactobacillus plantarum-Disolver 2,0 g de extracto de levadura hidrosoluble en 100 ml de agua, agre-
gar 500 mg de dextrosa anhidra, 500 mg de acetato de sodio anhidro y 1,5 g de agar y calentar agitando en un baño de vapor
hasta que el agar se disuelva. Verter porciones de aproximadamente 1 O ml de la solución caliente en tubos de ensayo, tapar o
cubrir adecuadamente, esterilizar a 121 ºy dejar que se enfríen en posición vertical. Preparar cultivos en cuña en tres o más de
los tubos, usando un cultivo puro de Lactobacil/us plantarum*, incubar durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada
entre 30º y 37º pero mantenerla constante con una aproximación de ± 0,5º y luego almacenar en un refrigerador. Preparar un
cultivo madre en cuña nuevo una vez por semana y no usar para inoculación si el cultivo tiene más de 1 semana.
Medio de Cultivo-Preparar una serie de tubos de ensayo con 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agregar 5,0 ml
de agua con 0,2 ~tg de pantotenato de calcio a cada tubo. Tapar los tubos con algodón, esterilizar en un autoclave a 121 ºy
enfriar.
lnóculo-Transferir células del cultivo madre de Lactobacil/us plantarum a un tubo estéril que contenga 1 O ml de medio de
cultivo. Incubar este cultivo durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30º y 37° pero mantenerla constante
con una aproximación de± 0,5º. La suspensión de células así obtenida es el inóculo.
Procedimiento-Agregar a tubos de ensayo similares, por duplicado, 1,0 ml y/o 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml,
respectivamente, de la Preparación Estándar. A cada tubo y a 4 tubos similares sin Preparación Estándar agregar 5,0 ml de Solu-
ción Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 1 O ml.
Agregar, por duplicado, a tubos de ensayo similares los volúmenes de Preparación de Valoración correspondientes a tres o
más de los niveles especificados anteriormente para la Preparación Estándar, incluidos los niveles de 2,0 ml, 3,0 ml y 4,0 ml.
Agregar a cada tubo 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 1 O ml. Colocar un conjunto com-
pleto de tubos de Estándar y Muestra juntos en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda gradilla o en otra sección
de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio. .
Cubrir los tubos de ambas series para prevenir la contaminación y colocar en un autoclave a 121 º durante 5 minutos. En-
friar, agregar 1 gota de inóculo a cada uno de los tubos, excepto a dos de los cuatro tubos que no contengan Preparación
Estándar (para que sirvan como blancos no inoculados) y mezclar. Incubar los tubos a una temperatura entre 30º y 37° mante-
nida con variaciones permitidas de± 0,5º hasta que, una vez incubados durante un período entre 16 y 24 horas, no haya habi-
do un aumento sustancial de la turbidez en los tubos que contienen el nivel más alto de estándar durante un período de 2
horas.
Determinar la transmitancia de los tubos de la siguiente manera: Mezclar el contenido de cada tubo y transferir a un reci-
piente apto para la lectura óptica si fuera necesario. Colocar el recipiente en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de
onda específica entre 540 nm y 660 nm y tomar la lectura de la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este
estado estacionario se observa unos pocos segundos después de agitar cuando la lectura del galvanómetro permanece cons-
tante durante 30 segundos o más. Emplear aproximadamente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Con la transmitan-
cia fija en 1,00 para el blanco inoculado, leer la transmitancia para cada uno de los tubos restantes. Si hay evidencia de conta-
minación con un microorganismo extraño, descartar el resultado de la valoración.
Cálculos-Preparar una curva estándar de concentración-respuesta del siguiente modo. Para cada nivel del estándar, calcu-
lar la respuesta a partir de la suma de los valores duplicados de transmitancia como la diferencia y= 2,00 - I (de transmitan-
cia). Graficar la respuesta en la ordenada de un papel cuadriculado contra el logaritmo del volumen de Preparación Estándar en

* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) N" 8014 es apropiada. Esta cepa se conocía anteriormente como Lactobacillus arabinosus 17-5.
USP 37 Pruebas Biológicas/ (92) Factores de Crecimiento 1 31

cada tubo, en mL, en la abscisa, usando para la ordenada una escala aritmética o logarítmica (eligiendo entre estas dos la que
más se aproxime a una recta). Trazar la línea recta o la curva continua que mejor se ajuste los puntos graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparacion de Valorac/On. Leer, a partir de ia
curva estándar, el logaritmo del volumen de la Preparación Estándar correspondiente a cada uno de los valores de y que estén
dentro del intervalo entre los puntos máximos y mínimos graficados para el estándar. Restar de cada logaritmo así obtenido el
logaritmo del volumen, en mL, de la Preparación de Valoración para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificación. Pro-
x
mediar los valores de x para cada uno de tres o más niveles de dosificación para obtener = M', el logaritmo de la potencia
relativa de la Preparación de Valoración. Determinar la cantidad, en mg, de ER Pantotenato de Calcio USP correspondiente al
pantotenato de calcio en la porción del material tomada para el ensayo como antilog:
M = antilog (M' + log R)
en donde Res el número de mg de pantotenato de calcio que se supuso que estaban presentes por mg (o cápsula o tableta)
del material tomado para valoración.
Repetición-Repetir toda la determinación al menos una vez, usando Preparaciones de Valoración preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08, su promedio, !VT, es el logaritmo de la poten-
cia del material de prueba analizado (ver Intervalo de Confianza y Umites de Potencia \111 )). Si la~ dos determinaciones difieren
en más de 0,08, realizar una o más determinaciones adicionales. Del promedio de dos o más valores de M que no difieren en
más de O, 15, calcular la potencia media de la preparación objeto de la valoración.

(92) FACTORES DE CRECIMIENTO V CITOKINAS USADOS EN LA FABRICACIÓN DE

PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR
INTRODUCCIÓN
La calificación de reactivos, de materiales de origen y el control de los procesos de fabricación son elementos claves que asegu-
ran la calidad y seguridad de las terapias celulares. Los factores de crecimiento y las citokinas son importantes para el mante-
nimiento, crecimiento, selección y purificación de cultivos de productos de terapia celular. Este capítulo describe las pruebas,
procedimientos y criterios de aceptación aceptados para factores de crecimiento y citokinas que pueden estar implicados en
la fabricación de productos de terapia celular.
INTERLEUKINA RECOMBINANTE HUMANA 4 (rhll-4, por sus siglas en inglés)
MHKCDITLQE llKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT
TEKETFCRAA TVLRQFYSHH EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL
IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC PVKEANQSTL ENFLERLKTI
MREKYSKCSS

15 096 Da

La rhlL-4 es un polipéptido de cadena simple de 1 30 residuos de aminoácido expresados en Escherichia coli. Se produce como
un polvo liofilizado y contiene no menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg de proteína total. Las impurezas de ADN de
la célula anfitriona específicas del proceso en IL-4 con límites de menos de 1 ng/mg se determinan según se indica en Técni-
cas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130). La IL-4
que se usa como material auxiliar durante la fabricación no requiere licencia de fabricación ni aprobación comercial. A conti-
nuación se presentan los atributos de calidad típicos de la IL-4.

IDENTIFICACIÓN
• A. El análisis de la secuencia amino-terminal de al menos ocho aminoácidos se realiza con un secuenciador automático, se-
gún se indica en Artículos Obtenidos por Biotecnología (1045). Los feniltiohidantoín-aminoácidos liberados en etapas se identi-
fican mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa en línea, basándose en sus tiempos de elución.
• B. Usar el método de electroforesis seguido del análisis por Western blot para visualizar la proteína IL-4. El método es electro-
foresis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), descrito en la prueba de Pureza.
Solución salina amortiguada con fosfatos; Solución amortiguadora de Laemmli, reductora; y Solución amortiguadora
de Laemmli, no reductora: Proceder según se indica en la prueba de Pureza en la Valoración.
Solución madre del estándar: 50 µg/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP reconstituida en Solución salina amortiguada
con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
Solución estándar: 20 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre del estándar, en Solución salina amortiguada con fosfatos
Solución estándar, reductora: Combinar 20 ~tL de Solución estándar y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reducto-
ra.
Solución estándar, no reductora: Combinar 20 ~tL de Solución estándar y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución madre de la muestra: 50 µg/mL de IL-4 reconstituida en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No
agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
 132 (92) Factores de Crecimiento/ Pruebas Biológicas USP 37

Solución muestra: 20 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra, en Solución salina amortiguada con fosfatos
Solución muestra, reductora: Combinar 20 µL de Solución muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reductora.
Solución muestra, no reductora: Combinar 20 ~1L de Solución muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de muestra de
Laemmli, no reductora.
Análisis
Muestras: Solución estándar, reductora; Solución estándar, no reductora; Solución muestra, reductora; y Solución muestra, no
reductora
Western blot: Después de la electroforesis, las proteínas se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno
(PVDF) usando procedimientos estándares. Incubar la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con Solución sali-
na amortiguada con fosfatos que contenga O, 1% de polisorbato 20 y 5% de leche en polvo descremada. Posteriormente, la
membrana se incuba con un anticuerpo anti-IL-4 1 (diluido apropiadamente en Solución salina amortiguada con fosfatos), y
luego con un anticuerpo secundario, a temperatura ambiente y agitación suave, durante 1 hora para cada uno de los anti-
cuerpos. La banda de la proteína IL-4 se identifica desarrollando la membrana usando un sistema de detección adecuado. 2
Criterios de aceptación: El Western blot desarrollado debe proporcionar una señal positiva equivalente al ER rlnterleukina
4 Humana USP.

VALORACIÓN
• PUREZA: [NOTA-La pureza se determina sobre la materia prima.] Se lleva a cabo una SDS-PAGE según se indica en Artículos
Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) en condiciones reductoras y no reductoras.
Marcador de peso molecular: Usar un marcador de peso molecular adecuado que contenga bandas de proteínas entre
10 y 200 kDa.
Solución salina amortiguada con fosfatos: Cloruro de potasio 2,67 mM, fosfato de potasio (KH 2 P0 4 ) 1,47 mM, cloruro
de sodio 137,93 mM y fosfato dibásico de sodio 8,06 mM en agua. Ajustar a un pH de 7,0-7,3.
Solución amortiguadora de Laemmli, no reductora: TRIS-HCI 100 mM, pH 6,8, 50% de glicerol, 0,25% de indicador de
azul de bromofenol y 10% de lauril sulfato de sodio en agua
Solución amortiguadora de Laemmli, reductora: Agregar 2,5 µL mercaptoetanol a 50 µL de Solución amortiguadora de
Laemmli, no reductora.
Solución madre de la muestra: 400 µg/mL de IL-4 a granel en Solución salina amortiguada con fosfatos
Solución muestra 1: Combinar 20 µL de Solución madre de la muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no re-
ductora.
Solución muestra 2: Combinar 20 µL de Solución madre de la muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reduc-
tora.
Solución madre de control A: 4 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra en Solución salina amortiguada con
fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control A se corren por triplicado tanto en condiciones reductoras como en no reducto-
ras.]
Solución 1 de control A: Combinar 20 µL de Solución madre de control A y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución 2 de control A: Combinar 20 µL de Solución madre de control A y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, re-
ductora.
Solución madre de control B: 12 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra en Solución salina amortiguada
con fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control B se corren por duplicado tanto en condiciones reductoras como en no reduc-
toras.]
Solución 1 de control B: Combinar 20 µL de Solución madre de control By 5"µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución 2 de control B: Combinar 20 µL de Solución madre de control By 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, re-
ductora.
Condiciones electroforéticas
(Ver Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrílamida (1056).)
Modo: Gel para PAGE discontinuo
Gel concentrador: Acrilamida al 4%
Gel de resolución: Acrilamida al 12%
Condiciones de corrida: 1O minutos a 100 V; luego 30 minutos a 200 V
Detección de proteínas: Tinción con plata
Análisis
Muestras: Solución muestra 7, Solución muestra 2, Solución 7 de control A, Solución 2 de control A, Solución 7 de control By
Solución 2 de control B
Incubar 25 µL de Solución muestra y de Solución control en condiciones no reductoras durante 5 minutos a 60º y cargar en
el gel. Incubar 20 µL de Solución muestra y de Solución control en condiciones reductoras durante 5 minutos a 60º, y car-
gar en el gel. Después de la tinción con plata y de barrer todo el gel, determinar la intensidad de todas las bandas de

1 Un anticuerpo anti-IL-4 adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Dianova lnc.).
2 Un sistema de detección adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Pierce/Perbio Science).
USP 37 Pruebas Biológicas/ (92) Factores de Crecimiento 133

proteína detectables por densitometría y calcular el porcentaje de cada banda de proteína detectable en la Solución
muestra dos veces comparando la intensidad de los pixeles de cada banda contaminante con el valor promedio de las
Soluciones de Control A y B, respectivamente, por las fórmulas:

Resultado = (A 100 ) x 1 /(A 1 ); y

Resultado= (A 100) x 3/(A 3)

A100 = intensidad de una banda contaminante de la Solución muestra

A1 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solución de control A
A3 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solución de control B
El análisis de las soluciones de control de IL-4 debe producir una banda detectable con un peso molecular aparente de
aproximadamente 15 kDa. Si los valores calculados mediante la Solución de control A son diferentes de los que se obtie-
nen por comparación con la Solución de control B, se debe tomar el valor correspondiente a la cantidad más alta de im-
pureza. Si la intensidad de una de las bandas contaminantes es menor que el valor de la Solución de control A (correspon-
diente a 1 %), el valor de esta contaminación se ajusta a 1 %. La pureza de la solución muestra se calcula de la siguiente
manera:
Resultado = 1 00 - I Cn

e = porcentaje de cada contaminación provista en números enteros redondeados

n =número de contaminantes de IL-4 de la Solución muestra
Criterios de aceptación: La pureza de IL-4 es no menos de 97%, según se determina mediante SDS-PAGE.
• CONTENIDO DE PROTEÍNAS: [NOTA-El contenido de proteínas se determina basándose en el producto envasado.]
Solución salina amortiguada con fosfatos: Proceder según se indica en la prueba de Pureza.
Solución muestra: 50 µg/mL de IL-4 en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla;
mezclar suavemente por rotación.]
Blanco: Solución salina amortiguada con fosfatos
Condiciones espectrométricas
(Ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 ).)
Modo: UV
Longitud de paso: 1 cm
Longitud de onda analítica: 280 nm
Análisis
Muestras: Solución muestra y Blanco
Calcular la concentración de proteínas:
C =A 280 /0,63
C =concentración de IL-4 de la Solución muestra (mg/mL)
A280 = absorbancia a 280 nm

PRUEBAS ESPECÍFICAS
• IDENTIDAD BIOLÓGICA: [NOTA-La medición de la actividad biológica se determina basándose en el producto envasado.]
Medio RPMI 1640 con L-glutamina: Preparar una mezcla de los ingredientes en las cantidades que se presentan en la si-
guiente tabla en suficiente agua para obtener 1 L de medio y esterilizar· mediante filtración:

Material Cantidad
Nitrato de calcio (Ca(N0,)-4H)O) 100 mg
Sulfato de magnesio (MgS0,·7H)O) lOOmg
Cloruro de potasio 400 mg
Cloruro de sodio 6000 mg
Fosfato dibásico de sodio anhidro 800 mg
Bicarbonato de sodio 2000 mg
Glicina 10 mg
L-Arginina 200 mg
L-Asparagina 50 mg
Ácido L-aspártico 20 mg
Diclorhidrato de L-cistina 20 mg
Ácido L-glutámico 20 mg
L-Glutamina 300 mg
L-Histidina 15 mg
134 (92) Factores de Crecimiento/ Pruebas Biológicas USP 37

Material Cantidad
L-Hidroxiprolina 20 mg
L-lsoleucina 50 mg
L-Leucina 50 mg
Clorhidrato de L-lisina 40 mg
L-Metionina 15 mg
L-Fenilalanina 15 mg
L-Prolina 20 mg
L-Serina 30 mg
L-Treonina 20 mg
L-Triptófano 5 mg
Sal disódica de L-tirosina dihidrato 20 mg
L-Valina 20 mg
Biotina 0,2 mg
Cloruro de colina 3 mg
o-Pantotenato de calcio 0,25 mg
Ácido fólico 1 mg
i-lnositol 35 mg
Niacinamida 1 mg
Ácido para-aminobenzoico 1 mg
Clorhidrato de piridoxina 1 mg
Riboflavina 0,2 mg
Clorhidrato de tiamina 1 mg
Vitamina B0 0,005 mg
o-Glucosa (dextrosa) 2000 mg
Glutationa (reducida) 1 mg
Rojo de fenol 5 mg

Medio de crecimiento: Usando procedimientos asépticos, preparar el siguiente medio de cultivo de tejidos:

RPMl-1640 con L-glutamina 500 ml

Piruvato de sodio 100 mM 5 ml
Suero fetal bovino 50 ml
rFEC-GM humanoª 3 x 104 Unidades Internacionales
ª El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (FEC-GM) se agrega de manera extemporánea.

Esterilizar mediante filtración y almacenar a una temperatura entre 2º y 8º. Usar dentro del periodo de 1 mes. Agregar el
FEC-GM inmediatamente antes de su uso.
Medio de valoración: Usar Medio de crecimiento que no contenga FEC-GM ..
Solución salina amortiguada con fosfatos: Proceder según se indica en la prueba de Pureza en la Valoración.
Solución de resazurina : 11 mg de resazurina en 100 mL de Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-Esterilizar
mediante filtración y almacenar la solución protegida de la luz a 4º. La Solución de resazurina es estable durante al menos 6
meses si se trata en condiciones estériles.]
[NOTA-Para todas las Soluciones estándar y Soluciones muestra, la concentración de IL-4 se determina mediante fotometría
a 280 nm usando un coeficiente de extinción (e) de 0,63 mg- 1cm- 1 .]
Solución madre del estándar: 50 µg/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP en Solución salina amortiguada con fosfatos.
[NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
Soluciones estándar: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; O, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solución madre del están-
dar en Medio de valoración
Solución madre de la muestra: 50 µg/mL de IL-4 en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras
se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
Soluciones muestra: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; O, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la mues-
tra en Medio de valoración
Solución control: Usar el Medio de valoración.
Preparación del cultivo celular: Preparar cultivos celulares de la línea celular TF-1 dependiente del factor humano (ATCC
Nº CRL-2003), siguiendo el protocolo descrito en la hoja de información de ATCC. Realizar transferencias de los cultivos
cada 2-3 días, usando subcultivos 1 :3 de las células durante un máximo de 1 mes. La densidad de siembra debe ser de 0,5
x 106 células/mL y la densidad máxima debe ser de 3 x 106 células/ml. La viabilidad de las células debe ser >90%. El núme-
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 1 35

ro máximo de pasajes es 24 y el tiempo de cultivo máximo a partir de la descongelación es 28 días. Después de 28 días,
iniciar un nuevo cultivo. Las células se propagan usando Medio de cultivo a 37º, suplementado con aire y dióxido de carbo-
no al 5%.
Análisis
Muestras: Soluciones estándar, Soluciones muestra y Solución control
La actividad de la Solución muestra se determina por duplicado. Lavar las células tres veces en Solución salina amortiguada
con fosfatos. Colocar en una placa 2 x 104 células TF-1 resuspendidas en 100 µL de Medio de valoración por pocillo en
microplacas de fondo plano de 96 pocillos. Incubar durante 72 horas a 37° y en una atmósfera de C0 2 al 5% en un
incubador humidificado en presencia o ausencia de diversas concentraciones de Solución estándar, Solución muestra o
Solución control agregando 100 µL de la solución correspondiente a cada pocillo. Agregar 30 µL de Solución de resazurina
a cada pocillo e incubar durante 24 horas más. Determinar la intensidad de la fluorescencia por pocillo leyendo la placa
con un lector de microplaca usando 544 nm (excitación) y 590 nm (emisión). Convertir la intensidad de fluorescencia
en cada pocillo a un porcentaje de intensidad de fluorescencia máxima. Para la Solución muestra y la Solución estándar,
graficar el porcentaje de la intensidad de fluorescencia en función de la concentración de la solución pertinente. Usando
el método de cuadrados mínimos del análisis de regresión, calcular el ED50 en ng/mL de la Solución muestra y la Solución
estándar. El coeficiente de determinación para la curva de regresión debe ser;:: 0,98. Calcular la potencia en Unidades
USP de lnterleukina 4/mg:

Resultado = A x EsfEu

A =actividad de ER rlnterleukina 4 Humana USP (unidades USP/mg)

E5 = ED 50 determinado de la Solución estándar (ng/ml)
Eu = ED 50 determinado de la Solución muestra (ng/mL)
Criterios
de aceptación: No menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg
• PRUEBAS DE ESTERILIDAD (71 ): Cumple con los requisitos
• PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): Contiene no más de 50 Unidades USP de Endotoxina/mg

REQUISITOS ADICIONALES
• ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Conservar en envases impermeables y almacenar a -80º.
• ETIQUETADO: El material se origina de ADN recombinante.
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP
ER rlnterleukina 4 Humana USP

(111) DISEÑO Y ANÁLISIS DE VALORACIONES BIOLÓGICAS

Información General

La potencia de varios medicamentos farmacopeicos debe determinarse mediante valoraciones biológicas. Un factor a con-
trolar en el diseño y en los análisis de las valoraciones es la variabilidad del sistema de pruebas biológicas, cuya respuesta me-
dia puede variar de un laboratorio a otro y, ocasionalmente, dentro de un mismo laboratorio. Para controlar este tipo de varia-
ción, la respuesta a un medicamento farmacopeico se compara con un Estándar de Referencia USP u otro estándar apropiado.
Por conveniencia, se denominará a cada una de estas preparaciones "Estándar" y a cada preparación que se está valorando, o
Muestra, la "Incógnita," y se designarán respectivamente con las letras S y U. (A veces se denomina "preparación de prueba" a
la Muestra.)
Después de eliminar las variables extrañas de la comparación entre el Estándar y la Incógnita, se calculará la varianza del
error a partir de la variación restante que, a pesar de que no se puede controlar, se puede medir. Se necesita la varianza del
error para calcular el intervalo de confianza de la potencia valorada. El intervalo de confianza se calcula de modo tal que se
espera que los límites inferior y superior de este intervalo cubran la potencia verdadera de la Incógnita en 19 de cada 20 valo-
raciones. Muchas valoraciones fijan la amplitud aceptable del intervalo de confianza y puede que se necesiten dos o más valo-
raciones independientes para cumplir el límite especificado. Los límites de confianza de las valoraciones de los componentes
individuales generalmente se superponen.
El objetivo de este capítulo es presentar un resumen conciso de los procedimientos biométricos para las valoraciones biológi-
cas de la USP. Las diferentes secciones están interrelacionadas. Aunque los procedimientos se diseñan fundamentalmente para
la valoración de una única Incógnita, las ecuaciones para la valoración conjunta de varias Incógnitas se ofrecen en contexto a
lo largo del capítulo y aparecen en forma de resumen en el último apartado. La prueba de que una potencia valorada cumple
con los requisitos necesarios respecto a los límites de confianza también puede basarse en otros métodos biométricos recono-
cidos que tengan una precisión equivalente a los métodos que se describen en este documento.
Al final de este capítulo se incluye un glosario de los términos utilizados en las ecuaciones.
 1

1 36 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 37

Pasos Previos al Cálculo de la Potencia

Diseños para Minimizar la Varianza del Error-La variación en la respuesta se reduce tanto como es posible mediante los
límites impuestos con respecto al peso corporal, la edad, la manipulación previa, el entorno y otros factores similares. En algu-
nas valoraciones, las diferentes dosis del Estándar y de la Incógnita se asignan de manera aleatoria a los animales de prueba o
sus equivalentes, pero dividiéndolos en grupos con igual número de individuos. Esto implica un proceso objetivo de selección
al azar, como por ejemplo tirar los dados, barajar las cartas o utilizar una tabla con números aleatorios. Al asignar el mismo
número de individuos a cada tratamiento, los cálculos se simplifican sustancialmente y, por lo general, también da lugar al
menor intervalo de confianza para un número dado de observaciones.
En algunas valoraciones, las respuestas potenciales pueden reunirse en conjuntos homogéneos antes del tratamiento. Las di-
ferencias entre los conjuntos se pueden separar posteriormente, de manera que no afecten adversamente ni a la potencia cal-
culada ni a su intervalo de confianza. Cada tratamiento se adjudica a una unidad seleccionada aleatoriamente dentro de cada
conjunto. Ejemplos de conjuntos aleatorios son las zonas transparentes en una placa individual en la valoración de un antibióti-
co o cuatro lecturas pareadas sucesivas en la misma rata en la valoración de la Inyección de Vasopresina. Se presentan conjun-
tos de dos cuando cada animal de prueba se emplea dos veces, como en las valoraciones de Inyección de Cloruro de Tubocu-
rarina y de Inyección de Insulina. En estos casos, ni las diferencias promedio entre individuos ni el orden de los tratamientos
pueden influir de manera parcial en la potencia o en la precisión. En las valoraciones microbiológicas de actividad de vitamina
B12 y de pantotenato de calcio, las réplicas, en sus respectivos tubos, se asignan a dos o más conjuntos separados y completos,
preferentemente distribuyendo los tubos al azar dentro de cada conjunto. Esto restringe la variación causada por la posición u
orden dentro de un conjunto a las diferencias dentro de cada réplica completa.
Rechazo de Observaciones Aberrantes o Erráticas-Una respuesta que es dudosa debido a que no cumple con el proce-
dimiento durante el curso de una valoración es rechazada. Otros valores aberrantes pueden descubrirse sólo después de tabu-
lar las respuestas, pero entonces pueden relacionarse con irregularidades en la valoración que justifiquen su omisión. El recha-
zo arbitrario o la conservación arbitraria de un resultado aparentemente aberrante pueden ser una importante fuente de par-
cialidad. Por lo general, el rechazo de observaciones que se basa únicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que
debe usarse con poca frecuencia. Cuando esto sea inevitable, cada respuesta que se sospecha es aberrante o anómala deberá
analizarse conforme a uno de los criterios siguientes:
1. El primer criterio se basa en la variación dentro de un grupo único de respuestas supuestamente equivalentes. En prome-
dio se rechazará una observación válida una vez cada 25 o una vez cada 50 pruebas siempre que pocas o ninguna de las res-
puestas en el grupo sean idénticas. Empezando con el valor supuestamente aberrante o errático, se deben designar las res-
puestas en orden de magnitud de y 1 a yN, en donde N representa el número de observaciones en el grupo. Calcular el interva-
lo relativo G1 = (y2 - y 1 )/(yN - y 1) cuando N = 3 a 7, G2 = (y 3 - y 1)/(yN_ 1 - y 1) cuando N = 8 a 13, o G3 = (y 3 - y 1 )/(yN_2 - y 1 )
cuando N = 14 a 24. Si G1, G2 o G3 exceden el valor crítico que aparece en la Tabla 1 para el valor de N observado, existe una
base estadística para omitir el valor aberrante.
Tabla 1
Prueba para detectar valores aberrantes. En muestras tomadas de una población normal, los intervalos Iguales o mayores que los
siguientes valores de Gp G2 y G 3 suceden con una probabilidad de P = 0,02 en donde los valores aberrantes pueden suceder sólo
en uno de los extremos o con una probabilidad de P = 0,04 en donde pueden ocurrir en cualquiera de los dos extremos.
N 3 4 5 6 7
G, 0,976 0,846 0,729 0,644 0,586
N 8 9 10 11 12 13
G, 0,780 0,725 0,678 0,638 0,605 0,578
N 14 15 16 17 18 19 20 1 21 1 22 1 23 1 24
G, 0,602 0,579 0,559 0,542 0,527 0,514 0,502 1 0,491 1 0,481 1 0,472 1 0,464

Este criterio también se aplica a las valoraciones microbiológicas, en las que cada tratamiento se representa mediante una
transmitancia en cada uno de dos conjuntos completos separados. El valor de cada transmitancia en el primer conjunto se
resta de su valor pareado en el segundo conjunto y se registra cada diferencia con su signo, ya sea positivo o negativo. Co-
menzando con la diferencia más divergente, se designan las N diferencias en orden de magnitud de y 1 a YN y se calcula el
intervalo relativo G1, G2 o G3 • Si esta diferencia excede su valor crítico que aparece en la Tabla 1, una de las dos transmitancias
que producen la diferencia aberrante es sospechosa y puede identificarse por inspección o por comparación con su valor espe-
rado (ver la siguiente columna). Se repite el proceso con las diferencias restantes si se sospechara un valor aberrante en un
segundo par.
2. El segundo criterio compara los intervalos de una serie de k = 2 o más grupos. Grupos diferentes pueden recibir trata-
mientos diferentes pero todas las respuestas f dentro del mismo grupo representan el mismo tratamiento. Calcular el intervalo
de cada grupo restando la respuesta menor de la respuesta mayor dentro de cada uno de los k grupos. Dividir el mayor de los
k intervalos entre la suma de todos los intervalos en la serie. Consultar este cociente R* en la Tabla 2. Si k no es mayor de 1O,
usar los valores tabulados que figuran en la parte superior de la Tabla 2; si k es mayor de 1O, multiplicar R* por (k + 2) e inter-
polar, si fuera necesario, entre los valores tabulados en la parte inferior de la Tabla 2. Si R* excede el valor interpolado o tabula-
do, el grupo con el intervalo mayor es sospechoso y la inspección de sus componentes generalmente permitirá identificar la
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 1 37

observación que luego se asumirá que es aberrante o anómala. Se puede repetir el proceso con los intervalos restantes si se
sospechara un valor aberrante en un segundo grupo.
Tabla 2
Prueba para grupos que contienen valores aberrantes. Calcular el intervalo de las f observaciones en cada uno de los k grupos,
cuando todos los grupos de la serie son de igual tamaño. El cociente R* observado entre el intervalo mayor y la suma de los k
intervalos deberá exceder o ser igual a los siguientes valores críticos con una probabilidad de P = 0,05.

Nº de R* Crítico para Intervalos de f Observaciones Cada Uno

Intervalos k 2 3 4 s 6 7 8 9 10
2 0,962 0,862 0,803 0,764 0,736 0,717 0,702 0,691 0,682
3 ,813 ,667 ,601 ,563 ,539 ,521 ,507 ,498 ,489
4 ,681 ,538 ,479 ,446 ,425 ,41 o ,398 ,389 ,382
5 ,581 ,451 ,398 ,369 ,351 ,338 ,328 ,320 ,314
6 0,508 0,389 0,342 0,316 0,300 0,288 0,280 0,273 0,267
7 ,451 ,342 ,300 ,278 ,263 ,253 ,245 ,239 ,234
8 ,407 ,305 ,267 ,248 ,234 ,225 ,218 ,213 ,208
9 ,369 ,276 ,241 ,224 ,211 ,203 ,197 ,192 ,188
10 ,339 ,253 ,220 ,204 ,193 ,185 ,179 ,174 ,172

Nº de R*(k + 2) Crítico para Intervalos de f Observaciones Cada Uno

Intervalos k 2 3 4 s 6 7 8 9 10
10 4,06 3,04 2,65 2,44 2,30 2,21 2,14 2,09 2,05
12 4,06 3,03 2,63 2,42 2,29 2,20 2,13 2,07 2,04
15 4,06 3,02 2,62 2,41 2,28 2,18 2,12 2,06 2,02
20 4,13 3,03 2,62 2,41 2,28 2,18 2,11 2,05 2,01
50 4,26 3,11 2,67 2,44 2,29 2,19 2,11 2,06 2,01

Reemplazo de Valores Faltantes-Tal como se indica en las monografías y en este apartado, el cálculo de la potencia y su
intervalo de confianza a partir de la respuesta total para cada dosis de cada preparación requiere el mismo número de observa-
ciones en cada total. Cuando se pierden observaciones o se han obtenido respuestas adicionales con el Estándar, el equilibrio
se puede restablecer mediante uno de los siguientes procedimientos a fin de que se puedan emplear las ecuaciones usuales.
1. Reducir el número de observaciones en los grupos más grandes hasta que el número de respuestas sea el mismo para
cada tratamiento. Si se han asignado animales aleatoriamente a cada grupo de tratamiento se puede omitir una o más res-
puestas, seleccionadas aleatoriamente, de cada grupo más grande o se puede restar la media de cada grupo más grande de su
total inicial, cuantas veces sea necesario. Se prefiere esta última técnica cuando se han asignado deliberadamente animales adi-
cionales para el Estándar. Cuando la valoración consiste en conjuntos aleatorios, deben retenerse sólo los conjuntos completos.
2. Alternativamente, un grupo más pequeño ocasional puede llevarse al tamaño adecuado cuando el número de respuestas
faltantes no sea más de una en cualquier tratamiento, o no represente más del 10% de la totalidad de la valoración. Estimar el
valor de reemplazo para cada valor faltante ya sea por el Método a o el Método b. Se pierde un grado de libertad (n) de la
varianza del error s2 por cada reemplazo realizado mediante cualquiera de los dos métodos, excepto en las valoraciones micro-
biológicas en donde cada respuesta está basada en la suma de dos o más transmitancias y sólo se reemplaza una transmitan-
cia.
(a) Si los animales han sido asignados aleatoriamente a los tratamientos, sumar la media de las respuestas restantes del gru-
po incompleto a su total. En una valoración microbiana, cuando para un tratamiento dado falte una de dos transmitancias,
para obtener el reemplazo sumar a la transmitancia restante la diferencia media entre conjuntos, calculada a partir de todos los
pares completos.
(b) Si la valoración consiste en grupos tomados al azar, reemplazar el valor faltante mediante:
fT'+kT'-T'
y'- u'-1)(~-1) · (1)

donde fes el número de conjuntos, k es el número de tratamientos o dosis y T;, T/y T' son los totales incompletos para el
conjunto aleatorio, el tratamiento y la valoración a los que les falta una observación.
Si la valoración consiste en n' cuadrados latinos con k filas en común, reemplazar un valor faltante mediante:
k(n'T'+ T'+ T')-2T'
y'= (kc-1)tn'k~2) ( 1a)

en donde n' es el número de cuadrados latinos con k filas en común, k es el número de tratamientos o dosis y Te', T;, T/ y T'
son respectivamente los totales incompletos para la columna, fila, tratamiento y valoración a los que les falta una observación.
 1 38 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 37

Si falta más de un valor, sustituir temporalmente los lugares vacíos, excepto uno, con la media del tratamiento y calcular y'
para el otro mediante la Ecuación 7. Reemplazar a su vez cada una de las sustituciones iniciales mediante la Ecuación 1 y repetir
el proceso en aproximaciones sucesivas hasta obtener una y' estable para cada observación faltante.

Cálculo de la Potencia a partir de una Valoración Única

En las monografías individuales se dan instrucciones para calcular la potencia a partir de los datos de una valoración única.
En aquellas valoraciones que especifican una interpolación gráfica de curvas de dosis-respuesta pero que cumplen las condicio-
nes para la validez de la valoración que se establecen en este documento, la potencia se puede calcular alternativamente por el
método apropiado de este apartado.
La planificación de la valoración implica asignar una potencia supuesta a la Incógnita, para poder administrarla en dosifica-
ciones equivalentes a las del Estándar. Mientras más aproximada sea la concordancia entre esta suposición inicial y el resultado
de la valoración, más precisa será la potencia calculada. El cociente entre una dosis dada del Estándar, en µg o Unidades USP y
la dosis correspondiente de la Incógnita, medido como se especifica en la monografía, se designa de manera uniforme como
R. El logaritmo de la potencia relativa en cantidades que inicialmente se supone que son iguales a las del Estándar, se designa
como M'.
Idealmente, M' no debiera diferir significativamente de cero. El logaritmo de la potencia es ecuación 2
M = M' + log R (2)
o
Potencia = P.= antilog M = (antilog M')R

Valoraciones a partir de Determinaciones Directas de la Dosis Umbral-La Inyección de Cloruro de Tubocurarina y el

Yoduro de Metocurarina se valoran a partir de la dosis umbral mínima que produce una respuesta biológica característica. El
cociente entre la dosis umbral media para el Estándar y la dosis umbral media para la Incógnita proporciona directamente la
potencia. La dosis umbral se determina dos veces en cada animal, una vez con el Estándar y una vez con la Incógnita. Cada
dosis se convierte en su logaritmo, se determina la diferencia (x) entre los dos logaritmos de las dosis para cada animal y se
calcula la potencia a partir del promedio de estas diferencias.
En la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), el punto final de la dilución de la media geométrica para la Incógnita que co-
rresponde al punto final de la dilución de la media geométrica del Estándar (multiplicado por un factor de dilución, si fuera
aplicable) proporciona la concentración de endotoxinas en el material en análisis.
En estas valoraciones, el intervalo de confianza depende de la variabilidad en la dosis umbral.
Valoraciones Indirectas a partir de la Relación entre el Logaritmo de la Dosis y la Respuesta-Por lo general, la dosis
umbral no puede medirse directamente; por lo tanto, la potencia se determinará indirectamente por comparación de las res-
puestas a dosis conocidas del Estándar con las respuestas después de una o varias dosis similares de la Incógnita. Dentro de un
intervalo de dosificación restringido, generalmente se puede graficar una medida adecuada de la respuesta como una línea
recta frente al logaritmo de la dosis, lo que simplifica el cálculo de la potencia y su intervalo de confianza. En cada valoración
se determinan tanto la pendiente como la posición de la relación de la respuesta en función del logaritmo de la dosis usando
dos o más niveles del Estándar o, preferentemente, del Estándar y de la Incógnita.
En la valoración de la Heparina Sódica, el intervalo entre la dosis con la que ocurre la coagulación y Ja dosis que no produce
coagulación es tan pequeño que la curva dosis-respuesta no se determina explícitamente. En su Jugar, se usan promedios mó-
viles para interpolar el logaritmo de la dosis correspondiente al 50% de coagulac:ión, tanto para el Estándar como para la In-
cógnita, que llevan al logaritmo de la potencia (ver Cálculos en Heparina Sódica). La precisión de la potencia se estima a partir
de la concordancia entre valoraciones independientes de la misma Incógnita.
En el caso de un fármaco al que se le realiza una valoración biológica, la respuesta debe graficarse como una línea recta
frente al logaritmo de la dosis a lo largo de un intervalo adecuado de dosis. Cuando se requiere una prueba preliminar o la
valoración depende de la interpolación a partir de una curva de dosis múltiples del Estándar, se graficará en papel milimetrado
la respuesta media del Estándar a cada nivel de dosis en el eje de las ordenadas frente al logaritmo de la dosis x en el eje de las
abscisas. Si la representación muestra una tendencia básicamente lineal a lo largo del intervalo de dosis requerido, la unidad de
respuesta inicial se puede usar directamente como y; si por el contrario la tendencia es visiblemente curvilínea, una transforma-
ción adecuada de cada lectura inicial podrá conferir linealidad.
Una posibilidad para ello es la trasformación en logaritmos; otra transformación, en el caso de las valoraciones microbiológi-
cas en tubos de ensayo, en donde y= (100 - % de transmitancia) no se representa gráficamente en forma lineal en función del
logaritmo de la dosis x, es la trasformación en probitas. En este caso, si la absorbancia no se puede leer directamente, en pri-
mer lugar el porcentaje de transmitancia para cada tubo o solución de prueba se debe convertir en la absorbancia A= 2 -
log(% de transmitancia). Cada valor de absorbancia, a su vez se convierte en un % de reducción del crecimiento bacteriano
como lo expresa la fórmula:
% de reducción = 1 OO(Ac - A)/Ac
 USP 37 Pruebas Biológicas / (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 1 39

en donde A, es la densidad media para los tubos control (sin antibióticos o con exceso de vitamina) en el mismo conjunto o
gradilla de tubos. La reducción porcentual se transforma luego en probitas (ver Tabla 3) a fin de obtener una nueva y para
cálculos posteriores. La transformación en probitas ofrece la ventaja de ampliar el intervalo de trabajo de linealidad aún cuando
una porción de la relación dosis-respuesta no sea lineal en las unidades originales de porcentaje de transmitancia, siempre que
el período de incubación no se extienda mas allá de la fase logarítmica de crecimiento de los tubos de control.
Tabla 3
Probltas (desviación normal + 5) correspondientes a los porcentajes que figuran en los márgenes.
o 1 2 3 4 5 6 7 8 9
o - 2,67 2,95 3, 12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66
10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12
20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45
30 4,48 4,50 4,53 4,56 4.59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72
40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97
50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23
60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50
70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81
80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23
90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
99 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09

La DL50 en la prueba de Seguridad para Hierro Dextrán, Inyección se calcula con logaritmos de dosis y probitas. Las cuatro
dosis de la Inyección, en mg de hierro por kg de peso corporal se transforman en x1 = 2,574, x2 = 2,699, x 3 = 2,875 y x4 =
3,000. Las probitas correspondientes al número de muertes observadas en cada grupo de 1O ratones se designan respectiva-
mente como y 1, y2, y 3 e y4 y figuran en la Tabla 3 para mortalidades de 1 O a 90 por ciento. Para las muertes observadas de O y
1 O adyacentes a las dosis que proporcionan una mortalidad intermedia, emplear las probitas aproximadas de 3,02 y 6,98 res-
pectivamente; omitir el valor final (a x1 o x4 ) si no es adyacente a una mortalidad intermedia. Puesto que la información en una
probita varía con su valor esperado, se debe asignar a cada probita una ponderación relativa aproximada w para calcular la
DL 50 de la Inyección, como se muestra en la siguiente tabla.
Nº de Muertes o ó 10 1ó9 2u8 3ó 7 4a6
Ponderación, w 0,3 0,7 1,0 1,2 1,3

Calcular las medias ponderadas

x = L.(wx)/L.w
y (2a)
y = L.(wy)/L.w
a partir de la suma de las ponderaciones, L.w, de las cuatro (o tres) respuestas aceptables y la sumas ponderadas correspon-
dientes de los logaritmos de las dosis, L.(wx) y de las probitas, L.(wy). A partir de las sumas de los productos ponderados,
I(wxy), y de los cuadrados ponderados, L.(wx 2), calcular la pendiente b de la línea de logaritmo de dosis-probita, por la fórmu-
la:
b = [I(wxy) - xI(wy)]/[I(wx2) - xI(wx)] (2b)
La DL50 para esta prueba de seguridad, en mg de hierro por kg de peso corporal, se calcula como:
DL 50 = antilog[x + (5 - y)/b] (2c)

En las valoraciones cuantales, que no están incluidas en esta Farmacopea, como por ejemplo la valoración de insulina en rato-
nes, los cálculos con probitas involucran otros ajustes que se omiten en este documento.
Cuando la respuesta media y, para cada dosis del Estándar se grafica linealmente frente al logaritmo de la dosis y las k dosis
se espacian a intervalos iguales en la escala logarítmica, las respuestas esperadas (YL e YH) en los extremos de la línea que mejor
se ajuste pueden calcularse directamente usando los coeficientes x. que figuran en la Tabla 4, que corresponden a los sucesivos
k logaritmos de dosis, como:
YL = I(x.y,)/divisor

y (3)
YH = I(x.y,)/divisor
 1

140 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

en donde I representa de manera uniforme "la suma de" los valores que le siguen. Cuando YL e YH se representan gráficamen-
te en función del logaritmo de las dosis bajas y altas, XL y XH, respectivamente, pueden conectarse mediante una línea recta
con la pendiente:
(4)

A cualquier logaritmo de dosis x seleccionado del Estándar, la respuesta esperada es:

y= y+ b(x - x) (5)
x
en donde =Ix/k e y= (YL + YH)/2 o para predicciones comprendidas dentro de un conjunto, y es la respuesta media para el
Estándar dentro del conjunto.
Tabla 4
Coeficientes x. para calcular las respuestas YL e YH pronosticadas mediante los cuadrados mínimos para el valor Inferior y supe-
rlor de k logaritmos de dosis cuando estos se encuentran espaciados a intervalos iguales.

Nºde Extremo Pronos- Coeficiente x. para Respuesta Media y al Logaritmo de Dosis

Dosis tlcado Y 1 2 3 4 5 6 Divisor
3 Y, 5 2 -1 6
YH -1 2 5 6
4 Y, 7 4 1 -2 10
YH -2 1 4 7 10
5 Y, 3 2 1 o -1 5
YH -1 o 1 2 3 5
6 Y, 11 8 5 2 -1 -4 21
YH -4 -1 2 5 8 11 21

Cuando la relación de la respuesta en función del logaritmo de la dosis es lineal, pero las k dosis (expresadas en mL) están
espaciadas sustancialmente en una secuencia aritmética como en la Tabla 5 (que se refiere a las valoraciones microbiológicas
que se establecen en Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81 )), la pendiente b de la línea recta que mejor se ajusta se
puede calcular con los términos que figuran en la Tabla 5 y la respuesta media a cada dosis Yv o T1 = ty1 en donde el número (f)
de las y es constante a cada dosis, se puede calcular como:
b = I(x 1y1)/eb'i = I(x 1T1)/feb'i (6)

Los coeficientes x, son múltiplos convenientes de las diferencias (x - X) respecto de la media del logaritmo de dosis x y eb'i es
el múltiplo correspondiente de I(x - X) 2 • La respuesta prevista y a un logaritmo de dosis x se puede calcular mediante la susti-
tución de la pendiente b de la valoración en la Ecuación 5 y de la media y o bien de todas las respuestas del Estándar en la
totalidad de la valoración o de las correspondientes para cada conjunto por separado.
Tabla 5
Coeficientes x 1 para calcular la pendiente b de una curva de logaritmo de dosis-respuesta cuando las dosis están espaciadas co-
mo se muestra en la escala aritmética.
Coeficientes x 1 para Calcular b a partir de las Respuestas y a Dosis, en ml,
de:
Nº de Do- Media del Loga-
sis 1 1,5 2 3 4 5 Divisor eh'I ritmo de Dosis x
4 - -29 -12 12 29 - 14,4663 0,38908
5 -34 - -9 5 15 23 24,7827 0,41584
5 - -20 -11 2 11 18 13,3249 0,45105
6 -15 -8 -3 4 9 13 14,1017 0,37588

POTENCIAS INTERPOLADAS A PARTIR DE UNA CURVA ESTÁNDAR-Cuando la curva de respuesta del logaritmo de la dosis del Estándar
en una valoración dada es curvilínea y se ajusta gráficamente a los puntos trazados, la cantidad del Estándar que se esperaría
que produzca cada respuesta y observada de una Incógnita se calcula por interpolación a partir de la curva y luego se ajusta
teniendo en cuenta la concentración conocida de su solución de prueba.
Cuando la respuesta frente al Estándar puede graficarse linealmente en función del logaritmo de la dosis, se ajusta numérica-
mente mediante una línea recta, como se describió en la sección precedente. Para determinaciones en conjuntos aleatorios, la
curva del estándar se calcula con b para la valoración e y para cada conjunto y la respuesta Yu en cada tubo de una Incógnita
dada en ese conjunto se convierte a un logaritmo de la potencia relativa estimada,
X = (Yu - Ys)/b (7)
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 141

donde Y5 es la respuesta prevista por la curva estándar al logaritmo de dosis x supuesto de la Incógnita. El promedio de las
estimaciones separadas obtenidas a partir de cada uno de los f conjuntos, M' = IX/f, es el logaritmo de la potencia relativa
valorada de la Incógnita.
Valoraciones Factoriales a Partir de la Respuesta a Cada Tratamiento-Cuando alguna función de la respuesta se puede
representar gráficamente en forma lineal en función del logaritmo de la dosis, la potencia valorada se calcula a partir de la
respuesta total para cada tratamiento y su precisión se mide en términos de intervalos de confianza. Esto requiere (1) que en
las unidades adecuadas, la respuesta (y) dependa linealmente del logaritmo de la dosis dentro del intervalo de dosificación de
la valoración y (2) que el número (f) de respuestas sea el mismo para cada nivel de dosificación, tanto del Estándar como de la
Incógnita. Las y se suman en cada nivel de dosis de cada preparación. En diferentes combinaciones, estos totales Tu llevan
directamente al logaritmo de la potencia relativa y a las pruebas de validez de la valoración. Los coeficientes factoriales en las
Tablas 6, 7 y 8 determinan cómo se deben combinar. En una fila dada, cada Tt se multiplica por el coeficiente correspondiente
y los productos se suman para obtener T;. Los T; que figuran en las filas sucesivas tienen el mismo significado en todas las valo-
raciones.
Tabla 6
Coeficientes factoriales x 1 para analizar una valoración biológica balanceada, en la que los sucesivos logaritmos de dosis del Es-
tándar (S¡) y de la Incógnita (U¡) están espaciados de igual manera y cada uno tiene el mismo número (f) de respuestas que su-
man un total de T,.
Coeficientes Factoriales x 1 para Cada Dosis
Diseño Fila s, s, s, s. u, u, u, u. e. T
2,2 a -1 -1 1 1 4 T,
b -1 1 -1 1 4 Th
ab 1 -1 -1 1 4 T,b

3,3 a -1 -1 -1 1 1 1 6 T,
b -1 o 1 -1 o 1 4 Th
ab 1 o -1 -1 o 1 4 T,h
q 1 -2 1 1 -2 1 12 Tº
aq -1 2 -1 1 -2 1 12 T,º
4,4 a -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 8 T,
b -3 -1 1 3 -3 -1 1 3 40 Th
ab 3 1 -1 -3 -3 -1 1 3 40 T,h
q 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 8 Tº
aq -1 1 1 -1 1 -1 -1 1 8 T,º

Valor de la Constante para el Diseño

Para Calcular Nº de Ecuación Constante 2,2 3,3 4,4
M' 8, 10 e 1 4/3 5
L 26, 29 e' 1 8/3 5

T. en la primera fila mide las diferencias en la respuesta promedio para el Estándar y para la Incógnita. Tb en la segunda fila
lleva directamente a la pendiente combinada de las curvas de dosis-respuesta para el Estándar y la Incógnita. Las filas tercera a
quinta (ab, q y aq) ofrecen pruebas de la validez de una valoración, tal como se describe en un apartado posterior. A partir de
los totales T. y Tb, calcular el logaritmo de la potencia relativa de la Incógnita, antes de ajustar en función de su potencia supu-
esta, como:
(8)

en donde i es el intervalo en los logaritmos entre los sucesivos logaritmos de dosis del Estándar y de la Incógnita y la constante
c se proporciona por separado al final de cada tabla. Cada M' se corrige hasta su logaritmo de potencia M según la Ecuación 2.
Cuando las dosis no están espaciadas a intervalos iguales en la escala logarítmica, como en la Tabla 8, usar en su lugar la
constante ci que figura al final de la tabla.
 142 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 37

Tabla 7
Í- -C-;;,cliciente-s--factoriales x !
para analizar una valoración parcialmente balanceada en la que los sucesivos logaritmos de dosis del 1

Estándar (S,) y de la Incógnita (U,) están espaciados de igual manera y cada uno tiene el mismo número (f) de respuestas que
suman un total de T,. Si el número de las dosis sucesivas de la Incógnita excede en uno el número del Estándar, intercambiar s, y
------
U en el encabezado e invertir el signo en todas las filas a, ab y aq.
Coeficientes Factoriales x 1 para Cada Dosis
Diseño Fila Si s, s, --r---
s4 u, u, u, e T
2,1 a -1 -1 2 6 T_,
b -1 1 o 2 Th
3,2 a -2 -2 -2 3 3 30 T
b -2 o 2 -1 1 10 Th
~-------
ab
- ----+-----------
1
-~--------·-----
o -1
-·--~----- ----------
-2 --
2
----- --· --- ------ -------
10
---- __ __I_ob____
~-------- --------
_q_ _ 1 i- - · --2
-
. 1 i o o 6 T"
1

4,3 a -3 -3 -3 -3 4 4 4 84 T
b -3 -1 1 3 -2 o 2 28 Th
ab 3 1 -1 -3 -5 o 5 70 T,h
q 3 -3 -3 3 2 -4 2 60 Tn
aq -1 1 1 -1 1 -2 1 10 T,n

-
Valor de la Constante para el Diseño
Para Calcular Nº de Ecuación Constante 2,1 3,2 4,3
M' 8, 10 e 1/2 5/6 7/6
L 26, 29 e' 3/4 25/12 49/12

Tabla 8
Coeficientes factoriales x 1 para analizar valoraciones con una secuencia de 3 ó 4 dosis de 1,5; 2,0; 3,0 y 4,0 donde cada dosis
tiene el mismo número (f) de respuestas.
Dosis del Estándar Dosis de la Incógnita
Diseño Fila 1,5 2,0 3,0 4,0 1,5 2,0 3,0 4,0 e- T
4,4 a -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 8 T"
b -29 -12 12 29 -29 -12 12 29 3940 Th
ab 29 12 -12 -29 -29 -12 12 29 3940 T,h
q 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 8 Tn
-- ~-

aq -1 1 1 -1 1 -1 -1 1 8 T,n
3,3 a -1 -1 -1 1 1 1 6 T
b -25 -3 28 -25 -3 28 2836 Th
ab 25 3 -28 -25 -3 28 2836 T,h
q 31 -53 22 31 -53 22 8508 Tº
aq -31 53 -22 31 -53. 22 8508 T,n
3,3 a -1 -1 -1 1 1 1 6 T,
b -28 3 25 -28 3 25 2836 Th
ab 28 -3 -25 -28 3 25 2836 T,h
q 22 -53 31 22 -53 31 8508 Tn
aq -22 53 -31 22 -53
-----------
31 8508 T,n

Valor de la Constante para el Diseño

Para Calcular Nº de Ecuación Constante 4,4 3,3
M' 8, 10 ci 7,2332 5,3695
L 26,29 c'i 2 O, 10623 0,06100

En una valoración completamente balanceada, tal como la valoración de corticotropina, calcular M' con los coeficientes que
figuran en la Tabla 6. Si una preparación tiene una diferencia de menos de una dosis respecto de la otra pero los sucesivos
intervalos de los logaritmos de dosis del Estándar y de la Incógnita difieren en un intervalo constante i, usar los coeficientes
factoriales que aparecen en la Tabla 7, corrigiendo en función de la diferencia existente entre la media de los logaritmos de
dosis observada, x5 y xu, calculando:
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 143

En las valoraciones donde las dosis sucesivas no están espaciadas a intervalos logarítmicos iguales, se puede calcular el log de la
potencia relativa de una única Incógnita según la Ecuación 8 con los coeficientes factoriales y ci que aparecen en la Tabla 8.
En una valoración de dos o más Incógnitas comparadas con un Estándar en común, todas con líneas de dosis-respuesta pa-
ralelas dentro del error experimental, se puede calcular cada logaritmo de la potencia relativa con la misma pendiente de la
valoración de la siguiente manera. Para cada preparación, determinar el factor de la pendiente Tb' = I(x 1T,) o I(x 1y), en donde
los valores de x 1 son los coeficientes factoriales para el Estándar en la fila b apropiada de la Tabla 6 u 8. El logaritmo de la
potencia relativa de cada Incógnita es:
M' = cih'T)2Hb' (1 O)

en donde h' es el número de valores de Tb 'sumados en el denominador.

Valoraciones a Partir de las Diferencias en las Respuestas-Cuando las dosis del Estándar y de la Incógnita se establecen
en pares y se calcula la diferencia de las respuestas para cada par, estas diferencias no se ven afectadas por las variaciones en la
sensibilidad promedio de las lecturas pareadas. La valoración de insulina realizada usando la valoración pareada de dos dosis
corresponde al primer diseño de la Tabla 6 y requiere cuatro grupos iguales de conejos, cada uno inyectado dos veces (ver
Valoraciones de Insulina (121 )). La diferencia (y) de la respuesta de azúcar en sangre de cada conejo en los dos tratamientos
lleva al logaritmo de la potencia relativa M' (ver los dos primeros párrafos de la sección Cálculo de la Potencia a Partir de una
Valoración Única). La valoración de la Inyección de Vasopresina sigue un diseño similar, en el que en lugar de los cuatro grupos
de tratamiento de conejos en la valoración de insulina se usan dos o más conjuntos aleatorios de cuatro pares sucesivos de
inyecciones en ratas.
La valoración de la Inyección de Oxitocina se realiza a partir de los cambios en la presión sanguínea producidos en un solo
animal de prueba alternando inyecciones de una dosis única del Estándar y de una de las dos dosis de la Incógnita. El cálculo
de la potencia obtenida a partir de las diferencias entre las respuestas de la Incógnita y el promedio de las dos respuestas adya-
centes del Estándar es equivalente al primer diseño de la Tabla 7 con S y U invertidos, en donde i es el logaritmo del intervalo
entre los dos niveles de dosificación de la Incógnita.

Error Experimental y Pruebas de Validez de la Valoración

En este documento, el término "error experimental" se refiere a la variación residual en la respuesta de los indicadores bioló-
gicos y no a un error en el procedimiento o a valores aberrantes que necesiten ser reemplazados. Se mide en términos de la
varianza del error de una respuesta individual u otra unidad, la cual se designa uniformemente como s2, a pesar de las diferen-
cias en la definición de la unidad. Se requiere en las pruebas de validez de la valoración y para el cálculo del intervalo de con-
fianza.
Varianza del Error de una Dosis Umbral-En algunas valoraciones la dosis umbral individual se mide directamente. En la
valoración de Digital, se designa cada dosis umbral individual con el símbolo z, el número o frecuencia de z con f y el total de
los valores de z para cada preparación con T, con los subíndices S y U para indicar el Estándar y la Incógnita, respectivamente.
Calcular la varianza del error de z como:

s2 = [Iz 2 - T52/f5 - Tu 2ffu)/n (11)

con n = f 5 +fu - 2 grados de libertad. En la valoración de la Inyección de Cloruro de Tubocurarina, cada logaritmo de la dosis
umbral de la Incógnita se resta del logaritmo de la dosis correspondiente del Estándar en el mismo conejo, para obtener una
diferencia individual x. Dado que cada x puede tener valor positivo o negativo(+ o-), es esencial transportar el signo correcto
en todas las sumas. Designar el total de valores x para los animales inyectados con el Estándar el primer día como T1 y para
aquellos inyectados con el Estándar el segundo día como T2. Calcular la varianza del error de x con n = N - 2 grados de liber-
tad como:
s2 = {Ix2 - (T12 + T/)/f}/n (12)

en donde N es el número total de conejos que completan la valoración, excluyendo cualquier reemplazo de un valor faltante
para igualar el tamaño de los dos grupos.
Varianza del Error de una Respuesta Individual-En las valoraciones farmacopeicas, se supone que las diferencias en las
dosis que modifican la respuesta media no afectan la variabilidad de la respuesta. El cálculo de la varianza del error depende
del diseño de la valoración y de la manera en que se realicen los ajustes para cualquier valor faltante. Cada respuesta se con-
vierte primero en la unidad y que se emplea para calcular la potencia. Se debe determinar una sola varianza del error a partir
de las desviaciones combinadas de y con respecto a sus respectivas medias para cada nivel de dosis, sumadas para todos los
niveles. Se pueden analizar los valores dudosos de y como se lo describió anteriormente en Rechazo de Observaciones Aberran-
tes o Erráticas y los valores aberrantes comprobados se pueden reemplazar como valores faltantes (ver Reemplazo de Valores
Faltantes).
En el diseño más sencillo, las unidades de respuesta se asignan aleatoriamente a cada nivel de dosificación, como ocurre en
la valoración de corticotropina. Si se reemplaza un valor faltante sumando la media de los valores de y restantes a cualquier
nivel de dosificación dado a su total, los grados de libertad (n) en la varianza del error se reducen en uno por cada reemplazo
 144 (111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 37

pero no es necesario hacer ningún otro cambio en el cálculo. Suponiendo que fes entonces igual para todos los grupos o
dosis, calcular la varianza del error a partir de la variación dentro de las dosis de todos los valores de y como:
s2 = {Iy2 - H,2/f}/n (13)

en donde T, es el total en cada dosis de los valores f de y; hay k totales T, y los grados de libertad n = If - k, donde If disminu-
ye en 1 con cada reemplazo.
Si las variaciones en f se ajustan restando una media de grupo del total del grupo, calcular la varianza del error a partir de los
valores de y observados y de los totales T, no ajustados como:
s2 = {Iy2 - I(T,2/f)}/n (14)

donde n = If - k.
Cuando se calcula el resultado de una valoración usando los coeficientes de la Tabla 6 u 8, s2 se puede calcular a partir de la
respuesta y para cada una de las h' preparaciones, incluyendo las h Incógnitas y los correspondientes niveles de dosificación
del Estándar. Para cada preparación, calcular T' = Iy y el factor de pendiente Tb' = I(x 1y) en donde los valores de x 1 son los
coeficientes factoriales para el Estándar en la fila b apropiada de la Tabla 6 u 8. La varianza del error para la valoración es
s2 = {Iy2 - n2;k - 2(Hb')2/h'ebf}/n (15)

en donde los grados de libertad n = h'(k - 1) - 1; y eb es el e; de la misma tabla y fila que los coeficientes x1 .
La Varianza del Error en Diseños con Restricciones-En algunas valoraciones, las respuestas individuales suceden en con-
juntos aleatorios de tres o más. Ejemplos de estos conjuntos son los animales de una misma camada en la valoración de vitami-
na D, las áreas transparentes en cada placa en una valoración de antibióticos y las respuestas a cuatro pares sucesivos de inyec-
ciones en la valoración de vasopresina. Disponer los valores individuales de y de estas valoraciones en una tabla de dos vías, en
la que cada columna representa un tratamiento o dosis diferente y cada fila, un conjunto aleatorio. Las pérdidas pueden reem-
plazarse tal como se describe en Reemplazo de Valores Faltantes. Los k totales de columna son los T, necesarios para el análisis
de diseños equilibrados. Los f totales de las filas (T,) representan una fuente de variación que no afecta la potencia estimada y,
por ello, se excluyen del error de la valoración. Calcular la varianza del error aproximada a partir de los cuadrados de los valo-
res de y individuales y de los totales marginales como:
s2 = {Iy2 - H//k - H,2/f + T2/N}/n (16)

en donde T = IT, = IT,; y los n = (k - 1 )(f - 1) grados de libertad se deben disminuir en 1 por cada espacio en blanco en la
tabla original que se complete mediante cálculo.
Cuando el orden de tratamiento representa una potencial fuente de variación adicional, su efecto puede corregirse mediante
un régimen de dosis para una serie de n' cuadrados latinos con k filas en común, como por ejemplo los dos cuadrados latinos
en los regímenes de dosis 1 a 4 y 5 a 8 en la valoración de Glucagón para Inyección. Listar en una columna separada las res-
puestas y observadas de cada animal de prueba conforme al orden de dosificación. Las respuestas a cada una de las k dosis
suceden con igual frecuencia en cada una de las k filas y de las n'k columnas, en donde n' es el número de cuadrados latinos.
Sumar las respuestas y en cada fila (T,) en cada columna (Te) y en una lista separada, para cada dosis o tratamiento (T,). Las
pérdidas ocasionales se pueden reemplazar mediante la Ecuación 7a tal como se describe en Reemplazo de Valores Faltantes.
Calcular la varianza del error a partir de los cuadrados de los valores y individuales y de los totales marginales y de tratamiento
como:
s2 = {Iy2 - IT//n'k - IT//k .
- n,2/n'k + 2T2/N}/n (l 6a)

en donde T = Iy = IT, = ITc = IT,, N = n'k 2 y los n = (k - 1)(n'k - 2) grados de libertad se deben disminuir en uno por cada
espacio en blanco en la tabla original que se complete mediante cálculo.
En las valoraciones donde las reacciones suceden en pares, las diferencias entre los animales de prueba o entre las reacciones
pareadas se separan automáticamente calculando la valoración usando como respuesta la diferencia dentro de un par. Con la
insulina, la respuesta es la diferencia y en los valores del azúcar en sangre en un único conejo después de dos inyecciones (ver
Valoración de Insulina (121 )). Después de realizar ajustes en función de los conejos que se pierden durante la valoración, calcu-
lar la varianza del error de y a partir de las respuestas en los cuatro grupos y a partir de los totales de los grupos T; = T1 a T4
como:
s2 = {Iy2 - H¡2/f}/n (17)

en donde el número de conejos fes el mismo en cada grupo y los grados de libertad, n = 4(f - 1), se reducen en uno por cada
reemplazo realizado por conejo perdido durante la valoración. En la valoración de Inyección de Oxitocina, cada y representa la
diferencia entre la respuesta medida de la presión sanguínea frente a una dosis de la Incógnita y al promedio de las dos dosis
adyacentes del Estándar. Calcular la varianza del error de y como:
s2 = {Iy2 - (T 12 + T/)/f}/n (18)
USP 37 Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 145

con n= 2(f - 1) grados de libertad, en donde T 1 es el total de y para la dosis baja de la Incógnita y T2 es el total para la dosis
alta.
En una valoración microbiológica calculada por interpolación a partir de una curva estándar, convertir cada diferencia entre
dos respuestas pareadas a unidades de logaritmo de dosis x usando la Ecuación 7. Con cada diferencia x como la unidad, se
calcula un s2 compuesto a partir de la variación en los valores f de x para cada Incógnita, sumando su total sobre las h Incógni-
tas en la valoración, como:

s2 = {L:X2 - I(T//f)}/n (19)

en donde Tx = L:x para una única Incógnita y los grados de libertad n = L:f - h.
Pruebas de la Validez de la Valoración-Además de los requisitos específicos que figuran en cada monografía y de la cur-
va combinada de logaritmo de dosis-respuesta con una pendiente significativa (ver la estadística C en el siguiente apartado),
dos condiciones determinan la validez de una valoración factorial individual: (1) la curva de logaritmo de dosis-respuesta para
la Incógnita debe ser paralela a la del Estándar dentro del error experimental y (2) ninguna de las curvas debe apartarse signifi-
cativamente de una línea recta. Cuando la valoración ha sido totalmente aleatoria o está constituida por conjuntos aleatorios,
las pruebas de validez necesarias se calculan con los coeficientes factoriales para ab, q y aq de las Tablas 6 a 8 y los totales de
tratamiento T,. Sumar los productos de los coeficientes en cada fila por los T, correspondientes para obtener el total del pro-
ducto T;, en donde el subíndice i representa a su vez ab, q y aq, respectivamente. Cada uno de los tres cocientes, T¡2/e¡f, se
calcula con el valor correspondiente de e; de la tabla y con f igual al número de valores de y en cada T,. El que está en la fila ab
analiza si las líneas de dosis-respuesta son paralelas y es la única prueba disponible en una valoración de dos dosis. Con tres o
más dosis de ambas preparaciones, el que está en la fila q es una prueba de curvatura combinada en la misma dirección y en la
fila aq es una prueba de curvaturas separadas en direcciones opuestas. Si algún cociente en una valoración de 3 ó 4 dosis exce-
de s 2 en más del triple, calcular:
(20)

En cambio, para una valoración de dos dosis calcular:

Fi = Tab2/eabfs2 (21)

y para una valoración 3,2 (Tabla 7) determinar:

(22)

Para que la valoración sea válida, F1, F2, o F3 no excederá los valores que se proporcionan en la Tabla 9 (con probabilidad de 1
en 20) para los n grados de libertad en s 2.
Tabla 9
Valores de t, t 2, F; y x2 para los n grados de libertad diferentes que se excederán con una probabilidad de P = 0,05 (ó 0,95 para
intervalos de confianza).t
n t t 2 = F, F? F, x2 n t t 2 = F, F? F, x2
1 12,706 161,45 - - 3,84 19 2,093 4,381 3,52 3,13 30,1
2 4,303 18,51 19,00 19,16 5,99 20 2,086 4,351 3,49 3, 10 31,4
3 3,182 10,128 9,55 9,28 7,82 21 2,080 4,325 3,47 3,07 32,7
4 2,776 7,709 6,94 6,59 9,49 22 2,074 4,301 3,44 3,05 33,9
5 2,571 6,608 5,79 5,41 11,07 23 2,069 4,279 3,42 3,03 35,2
6 2,447 5,987 5,14 4,76 12,59 24 2,064 4,260 3,40 3,01 36,4
7 2,365 5,591 4,74 4,35 14,07 25 2,060 4,242 3,38 2,99 37,7
8 2,306 5,318 4,46 4,07 15,51 26 2,056 4,225 3,37 2,98 38,9
9 2,262 5,117 4,26 3,86 16,92 27 2,052 4,210 3,35 2,96 40,1
10 2,228 4,965 4,10 3,71 18,31 28 2,048 4,196 3,34 2,95 41,3
11 2,201 4,844 3,98 3,59 19,68 29 2,045 4, 183 3,33 2,93 42,6
12 2,179 4,747 3,89 3,49 21,03 30 2,042 4,171 3,32 2,92 43,8
13 2,160 4,667 3,81 3,41 22,36 40 2,021 4,085 3,23 2,84 55,8
14 2,145 4,600 3,74 3,34 23,68 60 2,000 4,001 3, 15 2,76 79,1
15 2, 131 4,543 3,68 3,29 25,00 120 1,980 3,920 3,07 2,68 146,6
16 2,120 4,494 3,63 3,24 26,30 X 1,960 3,841 3,00 2,60
17 2,110 4,451 3,59 3,20 27,59
18 2,101 4,414 3,55 3, 16 28,87
t Adaptado de partes de las Tablas 111 a V de las Tablas de Estadística "Statistical Tables far Biological, Agricultura! and Medical Research," de R. A. Fisher y F.
Yates, publicadas por Oliver and Boyd, Ltd., Edimburgo.
 1

146 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 37

Una valoración puede no pasar la prueba de validez y aún así puede contribuir proporcionando un estimado de la potencia
que se puede combinar provechosamente con el resultado de una segunda valoración de la misma Incógnita, tal como se des-
cribe más adelante en otro apartado. El nivel de dosis final ya sea para el Estándar o la Incógnita o para ambos puede propor-
cionar resultados que se hallen fuera de la zona lineal. Con tres o más niveles de dosis y valores de T.,, T.,b y T.,q relativamente
grandes, el valor de la respuesta total T, a una dosis final de una preparación puede estar cerca de un límite superior o inferior
y ser responsable de los valores elevados de T"b y Taq· Este T, se puede omitir y la valoración se puede volver a calcular con el
diseño adecuado de la Tabla 7. Si entonces la valoración cumple con la prueba en las Ecuaciones 20 ó 22 la potencia resultante,
M, se puede combinar con la de una segunda valoración para calcular el logaritmo de la potencia de la Incógnita (ver en
Combinación de Valoraciones Independientes). Si Tª no es significativo pero Tq muestra una curvatura combinada significativa, la
dosis mayor (o menor) de ambas preparaciones puede ser excesivamente grande (o excesivamente pequeña). Su omisión pue-
de conducir a una valoración válida con los coeficientes factoriales para el diseño menor que le sigue en la Tabla 6 u 8. Se
puede descartar un Tq o ITq 'estadísticamente significativo y se pueden retener todos los niveles de dosificación sin ocasionar
desvíos de más de 5% en el logaritmo de la potencia M' calculado y su intervalo de confianza cuando la siguiente desigualdad
es verdadera:

o
(ITb') 2 /eb > 1 OO(ITq') 2 /eq (23)

en donde cada Tb' y Tq' se calculan con los valores de T, (o de y) para una única preparación multiplicados por los coeficientes
para el Estándar en las filas by q, respectivamente. Si T. y Tab son ambos significativos en una valoración de dos dosis, un T1
puede estar fuera de la zona lineal. En algunas ocasiones puede calcularse de manera preliminar o contribuyente una estima-
ción de la potencia a partir de los tres valores de T1 restantes y el primer diseño en la Tabla 7. En las valoraciones de insulina o
de otros fármacos cuyas respuestas son pareadas, la prueba del paralelismo es tan poco sensible que se omite. Si en una valo-
ración microbiológica los tubos se ordenan en cada conjunto sistemáticamente, en lugar de aleatoriamente, las pruebas de
validez pueden estar sujetas a un desvío por parcialidad por efectos de posición.

El Intervalo de Confianza y los Límites de la Potencia

Una valoración biológica proporciona una estimación de la potencia verdadera de una Incógnita. El valor de esta estimación
cae dentro de un intervalo de confianza, que se calcula de manera tal que la probabilidad de que la verdadera potencia exceda
el límite superior del intervalo de confianza o que sea menor que el límite inferior de éste no sea mayor de 1 en 20 (P = 0,05).
Como este intervalo está determinado por un número de factores que pueden influenciar la estimación de la potencia, la pre-
cisión requerida para la mayoría de las valoraciones biológicas se proporciona en las respectivas monografías en términos del
intervalo de confianza, relacionado con la potencia directamente o con su logaritmo.
Cálculos Generales-Las valoraciones biológicas, a pesar de la diversidad de sus formas, están comprendidas en dos cate-
gorías generales: (1) las que el logaritmo de la potencia se calcula directamente a partir de una media o de una diferencia
media y (2) las que se calculan a partir del cociente de dos estadísticas.
(1) Cuando el logaritmo de la potencia de una valoración se calcula como la media de varias estimaciones del logaritmo de
potencias que son aproximadamente iguales en precisión, el logaritmo del intervalo de confianza es:
L = 2st / '1i< (24)
en donde s es la desviación estándar de una estimación única del logaritmo de la potencia, t se lee de la Tabla 9 con los n
grados de libertad en s; y k es el número de estimaciones que se han promediado. La misma ecuación se usa cuando el logarit-
mo de la potencia se calcula como la x media de k diferencias de x, dondes es la desviación estándar de una única x. En
cualquiera de los casos, la estimación del logaritmo de la potencia M está en el centro de su intervalo de confianza, de manera
que los límites de confianza son:

Los límites superior e inferior se convierten en sus antilogaritmos para obtener los límites como potencias explícitas.
(2) Con mayor frecuencia, el logaritmo de la potencia o la potencia en sí se calcula a partir de un cociente y en estos casos la
amplitud del intervalo de confianza está caracterizada por el logaritmo del intervalo en la ecuación:

(26)

en donde M' es el logaritmo de la potencia relativa según se ha definido anteriormente (ver Cálculo de la Potencia a Partir de
una Valoración Única), i es el logaritmo del intervalo entre dosis sucesivas y c' es una constante característica del procedimiento
de la valoración. El término restante, C, depende de la precisión con que se haya determinado la pendiente de la curva dosis-
respuesta. (Algunas veces se expresa como g = (C - 1)/C). En las valoraciones factoriales, se calcula como:

C = Tb 2 /(Tb 2 - ebfs 2 t 2 ) (27)

 USP 37 Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 147

en donde s2 es la varianza del error de una observación individual; t 2 se lee de la Tabla 9 con los grados de libertad en s2; fes el
número de respuestas en cada T, empleadas para calcular Ti,; y T¡, y eh se calculan con los coeficientes factoriales para la fila b
en las Tablas 6 a 8. La s2 en la Ecuación 26 depende del diseno de la valoración, según se indica para cada fármaco en la sec-
ción siguiente. En una valoración válida, C es un número positivo.
En una valoración de dos o más Incógnitas frente a un Estándar en común, todas con curvas de dosis-respuesta paralelas
dentro del error experimental, se puede calcular C con la varianza del error s2 para la valoración y con la pendiente de la valo-
ración como:

El factor de pendiente Tb' = 2:(x 1T,) o l:(x,y) para cada una de las h' preparaciones, incluyendo el Estándar, se calcula con los
coeficientes factoriales x, para el Estándar en la fila b apropiada de la Tabla 6 u 8. Si un total de tratamiento T, incluye uno o
más reemplazos para una respuesta faltante, reemplazar ebf en la Ecuación 27, o ebfh'/2 en la Ecuación 28 por f22:(x 1 2/f'), en
donde cada x, es un coeficiente factorial de la fila h de las Tablas 6 a 8 que aparecen en este capítulo y f' es el número de
respuestas en el T, correspondiente antes de sumar el reemplazo. Con esta C calcular el intervalo de confianza como:

L-2~(C-1J(CM' 2 +c'i'h'i2) (29)

En valoraciones calculadas a partir de un cociente, el logaritmo de la potencia M más probable no se encuentra en el centro
exacto del intervalo de confianza. Los límites de confianza superior e inferior en logaritmos son:

XM = log R +CM'+ 1/2L y log R +CM' - 1/2L (30)

en donde con frecuencia C es muy poco mayor que la unidad y cuando más precisa es la valoración, más se acerca C a un
valor exacto de 1. R = z5 /zu es el cociente entre las dosis correspondientes del Estándar y de la Incógnita o la potencia supuesta
de la Incógnita. Los límites de confianza superior e inferior en los logaritmos de potencias se convierten separadamente en sus
antilogaritmos para obtener las correspondientes potencias.
Intervalos de Confianza para Valoraciones Individuales-Dado que el intervalo de confianza puede diferir en algún deta-
lle de los modelos generales mencionados anteriormente, calcular estos intervalos para cada valoración mediante las indicacio-
nes especiales que se proporcionan bajo el nombre de la sustancia en los siguientes párrafos.
Valoraciones de Antibióticos-El intervalo de confianza se puede calcular mediante las Ecuaciones 24 y 25.
Pantotenato de Calcio-Para los logaritmos de las potencias obtenidos por interpolación a partir de una Curva estándar, el
intervalo de confianza se puede calcular con las Ecuaciones 79 y 24. Para los logaritmos de potencias calculadas con la Ecuación
8 ó 7O, s2 se puede calcular con la Ecuación 75, C con la Ecuación 2 7 ó 28 y el intervalo de confianza L con la Ecuación 26 ó 29.
Corticotropina, Inyección-Calcular el logaritmo del intervalo de confianza según las Ecuaciones 26 y 2 7, con los coeficientes
y constantes de la Tabla 6 para una valoración de 3 dosis y s2 según se determina mediante la Ecuación 73 ó 74.
Digital-Calcular el intervalo de confianza como:

L~2f~-1¡{c(zsizu) 2 +Vt,} (31)

en donde fu y f 5 son el número de observaciones para la Incógnita y para el Estándar y

e= zu2/(zu2 - s2t2/fu) (32)

se determina con s2 a partir de la Ecuación 7 7. Entonces, los límites de confia-nza para la potencia en Unidades USP son:

en donde R es el definido en el Glosario de Símbolos.

Glucagón para Inyección-Calcular la varianza del error s2 mediante la Ecuación 7So, C mediante la Ecuación 2 7 con ebf =
l 6n' y el logaritmo del intervalo de confianza L mediante la Ecuación 26 con c'i 2 = 0,09062.
Gonadotropina Coriónica-Proceder según se indica en Corticotropina, Inyección.
Heparina Sódica-Si dos determinaciones independientes del logaritmo de la potencia M difieren en más de 0,05 se realiza-
rán valoraciones adicionales y se calcula la varianza del error entre los N valores de M como:

s2 = {2:M2 - (IM)2/N}/n (34)

con n = N - 1 grados de libertad. Dado este valor, determinar el intervalo de confianza en los logaritmos (L) según la Ecuación
24.
Insulina, Inyección-Calcular la varianza del error (s 2) de y según la Ecuación 76 y C como:

(35)

en donde t 2 de la Tabla 9 depende de n = 4(f - 1) grados de libertad en s2 y N = 4f es el número total de diferencias en los
cuatro grupos. Mediante la Ecuación 26, calcular el intervalo de confianza Len los logaritmos, en donde c'i 2 = 0,09062. Los
límites de confianza superior e inferior en Unidades USP de insulina están dados por los antilogaritmos de XM de la Ecuación 30.
 r
148 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicos USP 37

Oxitocina, Inyección-Calcular el logaritmo del intervalo de confianza aproximado mediante la Ecuación 26

en donde s2 se define según la Ecuación 18 y

c' = ( 4f - 1)/8(f + 1) (37)
Cloruro de Tubocurarina, Inyección-Calcular la varianza del error mediante la Ecuación 12 y el intervalo de confianza me-
diante la Ecuación 24.
Vasopresina, lnyección--Calcular la varianza del error s2 mediante la Ecuación 16; C mediante la Ecuación 35; y el logaritmo
del intervalo de confianza mediante la Ecuación 26, en donde c' = 1 e i es el logaritmo del intervalo que separa los dos niveles
de dosificación.
Actividad de Vitamina 812 -Proceder según se indica en Pantotenato de Calcio.

Combinación de Valoraciones Independientes

Cuando el método lo permita se pueden agregar animales adicionales en aquellas valoraciones que no fueran lo suficiente-
mente precisas hasta que los resultados combinados reduzcan el intervalo de confianza y éste quede comprendido dentro de
los límites especificados en la monografía. Cuando se requieren 2 o más valoraciones independientes y cada una de ellas con-
duce a un logaritmo de la potencia M, los valores M se combinan para determinar la potencia media ponderada de la Incógnita.
Excepto en la prueba de la Heparina Sódica, en la cual los logaritmos de las potencias se ponderan por igual, la precisión relati-
va de dos o más valores de M determina la ponderación asignada a cada valor para calcular su media y su intervalo de confían-
za.
Antes de combinar dos o más estimaciones separadas de M, analizar su coherencia mutua. Si los M son coherentes, sus in-
tervalos de confianza respectivos se superpondrán. Cuando los intervalos de confianza no se superponen o cuando la superpo-
sición es pequeña, calcular un XM 2 aproximado. Asignar a cada una de las h valoraciones individuales una ponderación w, defi-
nida como:

w = 4t2/L2 (38)
en donde la amplitud del intervalo de confianza L se calcula con la ecuación apropiada de la sección precedente y t2 se lee de
la Tabla 9 para los n grados de libertad en la varianza del error de la valoración. Sumar las ponderaciones individuales para
obtener 'Lw. Luego determinar un x2 aproximado con h - 1 grados de libertad como:

Aprox. XM 2 = 'L(wM 2 ) - {'L(wM)}2/'Lw (39)

Para dos valoraciones con logaritmos de potencia M 1 y M 2 y las ponderaciones w 1 y w 2, la Ecuación 35 se reduce a:

Aprox. XM 2 = w 1 wi{M 1 - M 2 ) 2 /w 1 + w 2 (40)

con un grado de libertad. Si el XM 2 aproximado está bien por debajo del valor crítico para x2 en la Tabla 9, usar las ponderacio-
nes w para calcular la media del logaritmo de la potencia fVl y su intervalo de confianza, L. Si XM2 supera o se acerca a su valor
crítico, emplear en su lugar semiponderaciones w' (Ecuación 41) cuando se calcula fVl.
Calcular la media del logaritmo de la potencia fVl de dos o más valoraciones mutuamente coherentes como:
fVl = 'L(wM)/'Lw (41)
Este es el valor individual más probable en un intervalo de confianza combinado de amplitud L0 definido como la raíz cuadra-
da de:

L/ = 4tL2 /'Lw {l + (4/'L 2w)'L(w('Lw - w)/n'} (42)

en donde cada n' = n - 4(h - 2)/(h - 1) y tL2 se interpola a partir de la Tabla 9 con los grados de libertad:

nL = 'L 2w/'L(w2/n)

Para dos valoraciones (h = 2) con logaritmos de potencias M 1 y M 2 y ponderaciones w 1 y w 2, respectivamente, la ecuación

anterior se puede reformular nuevamente como:

en donde 'Lw = w 1 + w 2 • Cuando Le, el intervalo de confianza para una estimación combinada, no excede los requisitos estable-
cidos en una monografía, los límites de confianza superior e inferior se toman 1/2Lc por encima y por debajo de M, para obte-
ner aproximadamente un intervalo de confianza del 95%.
Cuando la variación en la potencia valorada entre h determinaciones independientes, según se analiza mediante XM 2, excede
o se acerca a P = 0,05, se les asignan semiponderaciones w' a las distintas estimaciones. A partir de la ponderación w, calcular
la varianza de cada M como:
 USP 37 Pruebas Biológicas / (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 149

V= 1 /w = L2/4t2 (44)
Calcular la varianza de la heterogeneidad entre las valoraciones como:
v = IM2 - (IM 2/h)/(h - 1) - Iv/h (45)
o si h = 2,
(46)

Cuando V variara demasiado de manera que la v calculada previamente fuese un número negativo, calcular en su lugar una v
aproximada omitiendo el término que sigue al signo menos en las Ecuaciones 45 y 46. Una semiponderación se define como:
w' = 1/(V+ v) (47)
Usar w' y Iw' en lugar de w y Iw en la Ecuación 4 7 para obtener la media semi ponderada TVT. Este valor se aproxima al valor
medio de un intervalo de confianza de una amplitud aproximada Le: en donde:
(48)

y t2 de la Tabla 9 tiene IN grados de libertad.

Cuando XM2 en la Ecuación 39, de h = 4 o más estimaciones de M, excede el nivel crítico que figura en la Tabla 9 en más de
un 50%, y las ponderaciones w difieren en menos de un 30%, las h estimaciones de M se pueden verificar para determinar si
se sospechara que hay valores aberrantes en la Tabla 7. Si fueran significativos, los valores aberrantes de M se pueden omitir al
calcular TVT con w'.
Cuando la potencia de un fármaco se determina repetidamente en un laboratorio dado mediante el mismo método de valo-
ración biológica, las determinaciones sucesivas tanto de la pendiente b como de la varianza del error s2 se pueden dispersar
aleatoriamente dentro del error de muestreo con respecto a un valor común para cada parámetro. Las estimaciones obtenidas
de valoraciones sucesivas se pueden representar en una gráfica de control de calidad para cada estadística y así se pueden
calcular los valores medios y los límites de control que definen la variación aleatoria permitida para controlar en forma conti-
nua la coherencia de una técnica de valoración. Cuando las estimaciones de b y s2 están comprendidas dentro de los límites de
control, ambos valores se pueden reemplazar por sus promedios de laboratorio. Rechazar cualquier valoración en la que estas
estadísticas no estén comprendidas dentro de los límites de control, o aceptarlas sólo después de que un riguroso análisis de su
validez justifique su aceptación.

Valoración Conjunta de Varias Preparaciones

Cada monografía describe el ensayo de una Incógnita individual comparada con el Estándar. Aunque no se proporcionan
explícitamente, con frecuencia se incluyen diferentes Incógnitas en la misma valoración y cada una de ellas se compara indivi-
dualmente con las mismas respuestas del Estándar. Este hecho puede garantizar el incremento del número de observaciones
con el Estándar. Dadas f observaciones a cada nivel de dosificación de las h distintas Incógnitas, el número de observaciones a
cada nivel de dosificación del Estándar se puede incrementar ventajosamente, si h tiene un valor grande hasta:
t-vh
Esta regla sólo puede aplicarse aproximadamente cuando las diferencias entre camadas o sus equivalentes deben separarse y,
en cualquier caso, su aplicación es solamente una sugerencia.
Si todos los ensayos realizados concurrentemente cumplen con los requisitos de validez y presentan curvas de logaritmo de
dosis-respuesta lineales con la misma by con la misma varianza de error s2 respecto de esas líneas, ambas estadísticas se consi-
deran como características de la valoración. La combinación de toda evidencia obtenida de la misma valoración en un valor
único de la pendiente de la valoración da como resultado una estimación más estable y confiable de b que si se analiza cada
Incógnita en forma independiente. Los grados de libertad y la confiabilidad de la varianza del error s2 se pueden incrementar
de manera similar. Los intervalos de confianza calculados con estos valores compuestos para by s2 son menores en promedio
que si se los calcula basándose sólo en parte de los datos pertinentes. Para calcular o aplicar tales estimaciones de valoraciones,
ver las Ecuaciones 7O; 75; 76; 79; 28 y 29. La potencia estimada con una pendiente calculada a partir de un Estándar y una
única Incógnita concuerda dentro de una fracción del intervalo de confianza con la calculada a partir de la pendiente combi-
nada de la valoración total. Dado que ésta última está basada en más evidencia, se la considera como la mejor estimación.
 1

150 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas/ Pruebas Biológicas USP 37

GLOSARIO

----
Glosario de Símbolos
A absorbancia para calcular el % de reducción en el crecimiento bacteriano a partir de lecturas turbidimétricas.
----
b __ pendiente de la línea recta que relaciona la respuesta (y) con el logaritmo de la dosis (x) [Ecuaciones 2b; 4; 5; 6].
c constante para calcular M' con las Ecuaciones 8 y 7O.
c' constante para calcular L con las Ecuaciones 26 y 29.
ci constante para calcular M' cuando las dosis están espaciadas como en la Tabla 8.
c'i2 constante para calcular L cuando las dosis están espaciadas como en la Tabla 8.
e término que mide la precisión de la pendiente en un intervalo de confianza [Ecuaciones 2 7; 28; 35; 36].
x2 constante est_adíslica para analizar la significancia de una discrepancia [Tabla 9].

e--- ú.1· z' para analizar la discordancia entre distintas estimaciones del logaritmo de la potencia [Ecuaciones 39; 40].
___Ej,_ e de fila b en las Tablas 6 a 8.
e 1:i múltiplo de L(x - x) 2 [Tabla 5; Ecuación 6).
e suma de los cuadrados de los coeficientes factoriales en cada fila de las Tablas 6 a 8.
en e de la fila q en las Tablas 6 a 8.
f número de respuestas a cada nivel de dosificación de una preparación; número de repeticiones o conjuntos.
fs número de observaciones en el Estándar.
fil número de observaciones en la Incógnita.
F1 a F, cociente de las varianzas observadas con 1 a 3 grados de libertad en el numerador [Tabla 9].
G,, G 7 y G, intervalo relativo en una prueba para determinar valores aberrantes [Tabla 7].
h número de Incógnitas en una valoración múltiple.
h' número de preparaciones en una valoración múltiple, incluyendo el Estándar y h Incógnitas; es decir, h' = h + 1.
i intervalo logarítmico entre logaritmos de dosis sucesivos; lo mismo para el Estándar y la Incógnita.
k número de logaritmos de potencias estimadas en un promedio [Ecuación 24]; número de tratamientos o dosis
[Tabla 4; Ecuaciones 7; 73; 75; 76]; número de intervalos o grupos en una serie [Tabla 2]; número de filas, co-
lumnas y dosis en un único cuadrado latino [Ecuaciones 1a, 76a].
L amplitud del intervalo de confianza en logaritmos [Ecuaciones 24; 26; 29; 38], o en términos de una proporción
de la potencia relativa de las diluciones comparadas [Ecuaciones 3 7, 33].
L amplitud de un intervalo de confianza combinado [Ecuaciones 42; 43].
L,, amplitud de un intervalo de confianza para una media semiponderada lVT [Ecuación 48].
DL ,0 dosis letal que se espera mate un 50% de los animales sometidos a prueba [Ecuación 2c].
M logaritmo de la potencia [Ecuación 2].
M' logaritmo de la potencia de una Incógnita con respecto a su potencia supuesta.
lVT media de las potencias logarítmicas.
n grados de libertad en una varianza s2 estimada o en la estadística To x2 .
n' número de cuadrados latinos con filas en común [Ecuaciones 1a, 76a].
N número; por ejemplo, de observaciones en una prueba de intervalo [Tabla 7], o de respuestas y en una valora-
ción [Ecuación 16].
p probabilidad de observar un resultado dado o el valor tabular de una estadística, generalmente P = 0,05 ó 0,95
para intervalos de confianza [Tablas 7, 2, 9].
P. potencia, P. = antilog M o calculada directamente.
R cociente de una dosis dada del Estándar frente a la dosis correspondiente de la Incógnita, o potencia supuesta
de la Incógnita [Ecuaciones 2; 30; 33].
R. cociente del mayor de los k intervalos en una serie con respecto a su suma [Tabla 2].
s= -152 desviación estándar de una unidad de respuesta, también de un único logaritmo de potencia estimada en una
valoración directa [Ecuación 24].
s2 varianza del error de una unidad de respuesta.
s un logaritmo de dosis del Estándar [Tablas 6, 7].
¿ "la sumatoria de".
t T de Student para n grados de libertad y una probabilidad P = 0,05 [Tabla 9].
T total de las respuestas y en una valoración [Ecuación 76].
T' total incompleto para una valoración en conjuntos aleatorios con una observación faltante [Ecuación 7].
T, L(y) para los animales inyectados con el Estándar en el primer día [Ecuaciones 18; 36].
T, L(y) para los animales inyectados con el Estándar en el segundo día [Ecuaciones 18; 36].
T T para la diferencia entre las respuestas del Estándar y de la Incógnita [Tablas 6 a 8].
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (115) Valoración de Dexpantenol 151

Glosario de Símbolos (Continuación)

T., T. para analizar la cijh:;:;~~¡a-~n~;:;l~endiente dclE-stár~cJ~-r-~ de la lncóqnit.J__I Tablas 6as-1----=-~-==-J
T,,, T para analizar curvaturas opuestas en las curvas para el Estándar y la Incógnita [Tablas 6 a 8].
--
T,. T para la pendiente co_mbinada de las curvas de dosis-respuesta para el Estándar y la Incógnita [Tablas 6 a 8].
T' C,(x 1T,) o C,(x 1y) para calcular la pendiente del logaritmo de la curva dmiHespuesta [Ecuaciones 7O; 23; 28].
T,
" la suma de los productos de T1 multiplicado por los coeficientes factoriales correspondientes en cada fila de las
Tablas 6 a 8.

T" T para analizar curvaturas similares en las curvas para el Estándar y la Incógnita [Tablas 6 a 8].
T fila o total fijado en una valoración en conjuntos aleatorios [Ecuación 76].
T' total incompleto para una valoración en conjuntos aleatorios con una observación faltante en la Ecuación 7.
T total de f respuestas y para una dosis dada de una preparación [Tablas 6 a 8; Ecuaciones 6, 73, 74, 76].
_ _ _ _ ----2{_ total incompleto para el tratamiento con LHli1 obw'rv,ición faltante or1 1-i Frnación 7
u un logaritmo de dosis de la Incógnita [Tablas 6 a 8].
V varianza para la heterogeneidad entre valoraciones [Ecuación 45].
V= l/w varianza de una M individual [Ecuaciones 44 a 47].
w ponderación asignada a M para una valoración individual [Ecuación 38], o a una probita para calcular una DL50
[Ecuaciones 2a, 2b].
w' semiponderación de cada M en una serie de valoraciones [Ecuaciones 41; 48],
X un logaritmo de la dosis de un fármaco en una valoración biológica [Ecuación 5]; también la diferencia entre dos
logaritmos de dosis umbral en el mismo animal [Ecuación 72].
x* coeficientes para calcular las respuestas esperadas superior e inferior YL e YH en una curva de logaritmo de dosis-
respuesta [Tabla 4; Ecuación 3].
x, un coeficiente factorial que es un múltiplo de (x - :X) para calcular la pendiente de una línea recta [Tabla 5;
Ecuación 6].
:X media del logaritmo de dosis [Ecuación 5].
x, media del logaritmo de dosis del Estándar [Ecuación 9].

:X" media del logaritmo de dosis de la Incógnita [Ecuación 9],

X logaritmo de la potencia obtenida de una respuesta individual, interpolada a partir de una curva estándar [Ecua-
ciones la, lb, 79].

X" límites de confianza para un logaritmo de la potencia M estimada [Ecuaciones 25; 30].
X"* límites de confianza para una potencia P. estimada directamente (ver valoración de Digita0 [Ecuación 33].
y una respuesta individual observada para una dosis de un fármaco en las unidades usadas en el cálculo de la po-
tencia y la varianza del error [Ecuaciones 73 a 76]; una unidad de diferencia entre respuestas pareadas en las
valoraciones de 2 dosis [Ecuaciones 71; 78].
y, ... y" respuestas observadas que se listan en orden de magnitud, para calcular G 1, G? o G, en la Tabla 7.
y' reemplazo de un valor faltante [Ecuación 7].
y respuesta media en un grupo o valoración [Ecuación 5].
y respuesta media a un tratamiento dado [Ecuaciones 3; 6].
y una respuesta esperada a partir de la relación dosis-respuesta, frecuentemente con subíndices calificativos [Ecua-
ciones 3 a 5].
z dosis umbral obtenida directamente por volumetría (ver valoración de Digita0 [Ecuación 7 7].
z dosis umbral promedio en un conjunto (ver valoración de Digita0 [Ecuaciones 3 7; 32; 33].

(115) VALORACIÓN DE DEXPANTENOL

Este procedimiento se utiliza para realizar la valoración de dexpantenol cuando se presenta como ingrediente de preparacio-
nes multivitamínicas. Se aplica también para determinar el componente dextrógiro del pantenol racémico y de otras mezclas
que contengan pantenol dextrógiro.
Pueden usarse medios preparados según se indica a continuación o mezclas deshidratadas que proporcionen formulaciones
similares, siempre y cuando, una vez reconstituidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante o del distruidor, posean
propiedades de promoción del crecimiento equivalentes o superiores a las obtenidas con las fórmulas incluidas en este capítu-
lo.
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Dexpantenol USP.
 152 (115) Valoración de Dexpantenol / Pruebas Biológicas USP 37

Solución Madre del Estándar de Dexpantenol-Disolver en agua una cantidad pesada con exactitud de ER Dexpantenol
USP, diluir cuantitativamente con agua para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente
800 pg por ml y mezclar. Almacenar en un refrigerador, al resguardo de la luz, y usar dentro de los 30 días de preparada.
Preparación Estándar-El día de la valoración, preparar una dilución de la Solución Madre del Estándar de Dexpantenol en
agua para obtener una concentración de 1,2 ~1g de dexpantenol por ml.
Preparación de Valoración-Proceder según se indica en la monografía individual y preparar una solución que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentración de dexpantenol en la Preparación Estándar.
Medio de Pantotenato Modificado-
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína 25 ml
Solución de Cistina-Triptófano 25 ml
Solución de Polisorbato 80 0,25 ml
Dextrosa, Anhidra 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro 5g
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina 5 ml
Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina 5 ml
Solución Salina A 5 ml
Solución Salina B 5 ml
Solución de Pantotenato de Calcio-Piridoxal 5 ml
Solución de Polisorbato 40-Ácido Oleico 5 ml

Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas; ajustar con hidróxido de sodio
1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar.
Medio de Pantotenato Modificado de Doble Concentración-Preparar según se indica en Medio de Pantotenato Modifi-
cado, pero hacer que la dilución final sea de 125 ml en vez de 250 ml. Preparar a diario.
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína-Mezclar 100 g de caseína sin vitaminas con 500 ml de ácido clorhídrico 6 N y
someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el ácido clorhídrico de la mezcla mediante destilación bajo presión
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en aproximadamente 500 ml de agua, ajustar la
solución con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 3,5 ±O, 1 y agregar agua para obtener 1000 ml. Agregar 20 g de carbón
activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbón activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigera-
dor a una temperatura no inferior a 1Oº. Filtrar la solución si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solución de Cistina-Triptófano-Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptófano (o 2,0 g de D,L-triptófano) en un vo-
lumen de agua entre 700 y 800 ml, calentar a 75 ± 5º y agregar, gota a gota y agitando, ácido clorhídrico diluido (1 en 2)
hasta que los sólidos se disuelvan. Enfriar, agregar agua para obtener 1000 ml y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refri-
gerador a una temperatura no inferior a 1Oº.
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo-Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y
200 mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1 O ml de ácido clorhídrico 4 N, enfriar, agregar agua para obtener 200 ml y mez-
clar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de Polisorbato 80-Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml y mezclar.
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina-Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en ácido
acético 0,02 N para obtener una solución que contenga 20 pg de riboflavina, 1 Opg de clorhidrato de tiamina y 0,04 pg de
biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina-Preparar una solución con alcohol neutrali-
zado al 25 por ciento para obtener las siguientes concentraciones: 1O pg de ácido paraaminobenzoico, 50 pg de niacina y
40 pg clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución Salina A-Disolver 25 g de fosfato monobásico de potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para
obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Solución Salina B-Disolver en agua 1 Og de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5 g
de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Solución de Piridoxal-Pantotenato de Calcio-Disolver 40 mg de clorhidrato de piridoxal y 375 pg de pantotenato de
calcio en alcohol al 1O por ciento para obtener 2000 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 días
de preparada.
Solución de Polisorbato 40-Ácido Oleico-Disolver 25 g de polisorbato 40 y 0,25 g de ácido oleico en alcohol al 20 por
ciento para obtener 500 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 días de preparada.
Cultivo Madre de Pediococcus acidi/actici-Disolver con ayuda de calor 6,0 g de peptona, 4,0 g de digerido pancreático de
caseína, 3,0 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne, 1,0 g de dextrosa y 15,0 g de agar en aproximadamente
800 ml de agua. Ajustar con hidróxido de sodio O, 1 N o ácido clorhídrico O, 1 N a un pH entre 6,5 y 6,6, agregar agua hasta
1000 ml y mezclar. Agregar porciones de aproximadamente 1O ml de la solución a tubos de cultivo, tapar y esterilizar a 121 º
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (121) Valoración de Insulina 153

durante 15 minutos. Enfriar en pendiente y almacenar en un refrigerador. Preparar un cultivo madre de Pediococcus acidilactici*
en un tubo conteniendo una cuña de este medio. Incubar a 35º durante 20 a 24 horas y almacenar en un refrigerador. Mante-
ner el cultivo madre realizando transferencias mensuales en tubos con medio en cuña nuevos.
lnóculo-lnocular tres porciones de 250 mL de Medio de Pantotenato Modificado de una pendiente de cultivo madre e incu-
bar a 35º durante 20 a 24 horas. Centrifugar la suspensión de las porciones combinadas y lavar las células con Medio de Panto-
tenato Modificado. Resuspender las células en suficiente Medio modificado de pantotenato de manera que una dilución 1:50,
cuando se analiza en un tubo de ensayo de 1 3 mm de diámetro, proporciona una transmisión de luz de 80% a 530 nm. Trans-
ferir porciones de 1,2 mL de esta suspensión madre a ampollas de vidrio, sellar, congelar en nitrógeno líquido y almacenar en
un congelador. El día de la valoración, dejar que las ampollas alcancen temperatura ambiente, mezclar el contenido y diluir
1 mL del cultivo descongelado con solución salina estéril SR hasta 150 ml. [NOTA-Esta dilución se puede modificar, cuando
sea necesario, para obtener la respuesta deseada.]
Procedimiento-Preparar por triplicado series de ocho tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los
tubos de una serie: 5,0 mL, 4,5 mL, 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL, 1,0 mL y 0,0 ml. A estos mismos tubos y en ese mismo
orden agregar 0,0 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 3,0 mL, 4,0 mL y 5,0 mL de la Preparación estándar.
Preparar por duplicado una serie de cinco tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los tubos de una
serie: 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL y 1,0 ml. A estos mismos tubos y en ese mismo orden, agregar 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL,
3,0 mL y 4,0 mL de la Preparación de Valoración.
Agregar 5,0 mL de Medio de Pantotenato Modificado de Doble Concentración a cada tubo y mezclar. Cubrir los tubos con ta-
pas metálicas y esterilizar en autoclave a 121 ºdurante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente en un baño de agua fría e
inocular cada tubo con 0,5 mL del lnóculo. Dejar incubando a 37º durante 16 horas. Detener el crecimiento calentando a una
temperatura no inferior a 80º, por ejemplo mediante la aplicación de vapor a presión atmosférica en un esterilizador adecuado
durante 5 a 1O minutos. Enfriar y determinar concomitantemente el porcentaje de transmitancia de la suspensión, en celdas
de igual paso óptico, en un espectrofotómetro adecuado, a 530 nm.
Cálculo-Dibujar una curva de dosis-respuesta en papel para gráficos aritméticos trazando la respuesta promedio, en por-
centaje de transmitancia, para cada conjunto de tubos de la curva estándar en función de las concentraciones del estándar. La
curva se traza uniendo cada par adyacente de puntos con una línea recta. A partir de esta curva estándar, determinar la poten-
cia por interpolación, en función del dexpantenol, de cada tubo que contiene porciones de la Preparación de Valoración. Dividir
la potencia de cada tubo por la cantidad de Preparación de Valoración agregada para obtener las respuestas individuales. Calcu-
lar la respuesta media realizando el promedio de las respuestas individuales que varían de su media en no más de un 15%,
utilizando no menos de la mitad del número total de tubos. Calcular la potencia de la porción de material tomada para la
valoración, en función del dexpantenol, multiplicando la respuesta promedio por el factor de dilución adecuado.

(121) VALORACIÓN DE INSULINA

La manifestación más importante de la acción de la insulina, un brusco descenso de la glucosa en sangre, sirvió de base para
valoraciones biológicas desde sus primeros usos clínicos. El procedimiento, si bien es relativamente complejo, tiene el gran mé-
rito de reflejar con exactitud el efecto en el paciente diabético. La aparición de métodos fisicoquímicos prácticos pero sofistica-
dos (por ejemplo la cromatografía líquida) para medir cuantitativamente la potencia de la insulina ha dado lugar a pruebas
farmacopeicas más precisas y exactas para la insulina y los productos derivados de la insulina. Sin embargo, no se puede deter-
minar la identidad biológica de la insulina y de sus productos por estos métodos. Por esta razón, se incluye en este capítulo
una prueba cualitativa en conejos y su uso se especifica en las monografías correspondientes.
El Método de Determinación de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo se usa para determinar la potencia de los Estánda-
res de Referencia de la Insulina, para la validación de la estabilidad de nuevas preparaciones de insulina y para determinar las
actividades específicas de los análogos de la insulina.

MÉTODO DE LA GLUCEMIA EN CONEJOS-CUANTITATIVO

Estándares de Referencia USP (11 )-ER Dextrosa USP. ER Insulina USP. ER Insulina (Bovina) USP. ER Insulina Humana USP.
ER Insulina (Porcina) USP.
Diluyente-Preparar una solución acuosa que contenga de O, 1% a 0,25% (p/v) de cresol o de fenol, de 1,4% a 1,8% (p/v)
de glicerina y suficiente ácido clorhídrico para obtener un pH de entre 2,5 y 3,5 a menos que se especifique algo diferente en
la monografía individual.
Solución Madre del Estándar-Disolver ya sea una cantidad adecuada de ER Insulina USP pesada con exactitud o un vial
de ER Insulina USP liofilizada de la especie correspondiente en Diluyente para preparar una Solución Madre del Estándar que
contenga 40 Unidades USP de Insulina por mL y que tenga un pH entre 2,5 y 3,5 a menos que se indique algo diferente en la
monografía individual. Almacenar en un lugar frío, proteger contra la congelación y usarla dentro de un período de 6 meses.

* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) No. 8042 es adecuada.

 154 (121) Valoración de Insulina / Pruebas Biológicas USP 37

Soluciones Estándares-Diluir porciones de la Solución Madre del Estándar con Diluyente para obtener dos soluciones, una
que contenga 1,0 Unidad USP de Insulina por mL ('iolurión Fstándar 7), y otra que contenga 2,0 Unidades USP de Insulina por
mL (Solución Estándar 2).
Solución Madre de Valoración-Proceder según se indica en Solución Madre del Estándar excepto que se debe usar una
cantidad adecuada de la preparación en análisis en lugar de ER Insulina USP. La Solución Madre de Valoración contiene aproxi-
madamente 40 Unidades USP de Insulina por mL.
Soluciones de Valoración-Diluir porciones de la Solución Madre de Valoración con Diluyente para hacer dos diluciones de
la preparación en análisis, una de las cuales se puede esperar que contenga 1,0 Unidad USP de Insulina por mL (Solución de
Valoración 7), basándose en la potencia supuesta y la otra que contenga 2,0 Unidades USP de Insulina por mL (Solución de
Valoración 2). En el caso de una inyección de insulina neutra, ajustar a un pH de 2,5 a 3,5 antes de realizar las diluciones.
Dosis de las Soluciones a Inyectar-Seleccionar la dosis de las diluciones a inyectar, basándose en pruebas o experiencias
anteriores, cuyo volumen generalmente está entre O, 30 mL y 0,50 ml. Para cada animal, el volumen de la Solución Estándar es
el mismo que el de la Solución de Valoración.
Preparación de los Animales-Seleccionar conejos adecuados y sanos que no pesen menos de 1,8 kg cada uno. Mantener
los conejos en el laboratorio durante no menos de 1 semana antes de utilizarlos en la valoración y alimentarlos con una dieta
uniforme satisfactoria, con acceso libre al agua en todo momento.
Procedimiento-Dividir los conejos en cuatro grupos iguales, preferentemente de no menos de seis conejos cada uno. El
día anterior al procedimiento, aproximadamente 20 horas antes de la valoración, suministrar a cada conejo alimento suficiente
para que se consuma en 6 horas. Seguir este mismo programa de alimentación antes de cada día de prueba. Durante la valo-
ración, no suministrar alimentos hasta no haber extraído la última muestra de sangre. Manipular los conejos con cuidado para
evitar una excitación indebida e inyectar subcutáneamente las dosis indicadas en el siguiente diseño (ver la Tabla 1); la segun-
da inyección se debe administrar el día posterior a la primera inyección o no más de 1 semana después. El tiempo entre la
primera y la segunda inyección es el mismo para todos los conejos.
Tabla 1
Grupo Primera Inyección Segunda Inyección
1 Solución Estándar 2 Solución de Valoración 7
2 Solución Estándar 7 Solución de Valoración 2
3 Solución de Valoración 2 Solución Estándar 7
-
4 Solución de Valoración 7 Solución Estándar 2

Muestras de Sangre-A 1 hora ± 5 minutos y 2 1/2 horas ± 5 minutos después de la inyección, extraer de cada conejo una
muestra de sangre adecuada de una vena marginal de la oreja. La sangre también se puede extraer eficazmente de la arteria
auricular central.
Determinación de Dextrosa-Determinar el contenido de dextrosa en las muestras de sangre mediante un procedimiento
adecuado que se adapte a un análisis automatizado. Se puede utilizar el siguiente procedimiento.
Solución Anticoagulante-Disolver 1 g de edetato sódico y 200 mg de fluoruro de sodio en 1 L de agua y mezclar.
Preparaciones Estándar de Dextrosa-Transferir concentraciones conocidas de ER Dextrosa USP a recipientes adecuados y di-
luir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con Solución Anti-coagulante (1 :9) para obtener una serie de Preparaciones Es-
tándar de Dextrosa que contengan entre 20 mg y 100 mg por 100 mL con concentraciones conocidas similares a las concentra-
ciones de las muestras de sangre de los conejos.
Preparaciones de Prueba-Pipetear y transferir a distintos recipientes adecuados O, 1 mL de cada Muestra de Sangre y 0,9 mL
de Solución Anticoagulante. ·
Procedimiento-Someter a diálisis las Preparaciones de Prueba a través de una membrana semipermeable durante un tiempo
suficiente de modo que la dextrosa pase a través de la membrana a una solución salina SR que contenga oxidasa de glucosa,
peroxidasa de rábano, clorhidrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona SR y N,N-dimetilanilina. Las absorbancias de las
Preparaciones de Prueba se determinan a 600 nm en un colorímetro con registrador. Las absorbancias de las Preparaciones Es-
tándar de Dextrosa se determinan de manera similar al comienzo y al final de cada corrida.
Cálculos-Calcular la respuesta de cada conejo a cada inyección como la suma de los dos valores de glucemia. Calcular las
diferencias individuales, y, restando las respuestas como se indica en la Tabla 2, sin importar el orden cronológico.
Cuando falten datos de uno o más conejos en una valoración, no usar las fórmulas de intervalo de confianza que se brindan
en la presente valoración, sino usar un procedimiento estadístico adecuado. Los datos aún pueden analizarse con un análisis
adecuado de varianza.
Cuando el número de conejos, f, usado en la valoración sea igual en cada grupo, determinar la suma de y para cada grupo y
calcular Tª = -T 1 + T2 + T3 - T4 y Tb = T1 + T2 + T3 + T4 • El logaritmo de la potencia relativa de las diluciones de prueba es M' =
0,301Tª/Tb. La potencia de la inyección en Unidades USP por mg es igual al antilogaritmo (log R + M'), donde R = v 5/vu, en
donde v5 es el número de Unidades USP por mL de la Solución estándar y Vu es la cantidad de mg de insulina por mL de la
Solución de valoración correspondiente.
Determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa con una confianza del 95% usando el Teorema de
Fieller (ver Apéndice y Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas (111 >). Si el intervalo de confianza es mayor de 0,082, que
corresponde, a P = 0,95, a límites de confianza de aproximadamente± 10% de la potencia calculada, repetir la valoración
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón 155

hasta que los datos combinados de dos o más valoraciones, redeterminadas según se describe en Combinación de Valoraciones
Independientes en Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ), cumplan con este límite aceptable.
Tabla 2
Desviaciones
Respuesta Respuesta Estándar de las
Grupo Diferencias Individual (y) Total (T) Diferencias (S)
1 Solución Estándar 2-Solución de Valoración 7 y, T, s,
2 Solución de Valoración 2-Solución Estándar 7 y, T, s,
3 Solución de Valoración 2-Solución Estándar 7 y, T, s,
4 Solución Estándar 2-Solución de Valoración 7 y. T. s.

PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLÓGICA

Proceder según se indica en el Método de Determinación del Contenido de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo con las
siguientes modificaciones:
Procedimiento-Dividir los conejos en 4 grupos iguales de 2 conejos cada uno.
Cálculo-Proceder según se indica para Cálculos en Método de Determinación de Contenido de Glucosa en Sangre de Cone-
jos-Cuantitativo, pero no determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa, M'.
Interpretación-Si el valor de la potencia obtenido no es menor de 15 Unidades USP por mg, se cumple el requisito de la
Prueba de Bioidentidad. Si el valor de la potencia es menor de 15 Unidades USP por mg, repetir la prueba usando ocho conejos
más. Si la potencia promedio de los 2 conjuntos de pruebas no es menor de 15 Unidades USP por mg, se cumple el requisito
de la prueba.

Apéndice-Teorema de Fieller para Determinar el Intervalo de Confianza para un Cociente

Esta versión del Teorema de Fieller es para el caso en el cual el numerador y el denominador no están correlacionados. La
ecuación asume que el numerador y el denominador están normalmente distribuidos y que los grupos de conejos son del mis-
mo tamaño.
Luego, el intervalo de 95% de confianza para el cociente es:

M'± t )(1-g)S~ +(M')'S~

(L,U) =--1~b_ _ _ _ __
1-g

donde f (grados de libertad en los errores estándar)= 4(k-1 ), donde k es la cantidad de conejos en un grupo, tes el percentil
superior de 97,5 de la distribución t con grados f de libertad, y

Si g :::: 1, el denominador no es significativamente diferente a O y la fórmula no funciona.

sN = o.301-/i<)s~ + s; + s; + s~-

(123) PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLÓGICA DE GLUCAGÓN

DEFINICIÓN
El Glucagón es una hormona polipeptídica que posee la propiedad de incrementar la concentración de glucosa en la sangre
mediante su liberación a partir de la reserva de glucógeno del hígado y que se usa en la práctica clínica para tratar la hipo-
glucemia. El glucagón humano, porcino y bovino comparten la misma secuencia de 29 aminoácidos. Anteriormente, el glu-
cagón disponible comercialmente se purificaba a partir de glándulas pancreáticas bovinas y porcinas. En la actualidad, el
glucagón humano es producido recombinantemente (por ADNr) (rGlucagón) con diversos sistemas de fermentación micro-
biana usando la secuencia de aminoácidos humana. La monografía de los compendios USP-NF, Glucagón para Inyección,
define las pruebas de identificación para glucagón. La identidad biológica del glucagón se debe determinar usando un mé-
todo de valoración biológica validado, aprobado por una autoridad competente. La valoración biológica debe demostrar
que el proceso de fabricación produce Glucagón con una actividad biológica de no menos de 0,80 Unidades USP/mg de
glucagón. Este capítulo describe una prueba de identidad biológica validada que mide la glucosa liberada a partir de células
de hígado (hepatocitos) de rata preparadas recientemente, estimuladas in vitro con Glucagón.
156 (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón / Pruebas Biológicas USP 37

VALORACIÓN
•VALORACIÓN CON CÉLULAS HEPÁTICAS PRIMARIAS
[NOTA-Todas las soluciones amortiguadoras deben estar oxigenadas, preparadas con Agua Estéril para Inyección o Agua Esté-
ril para Irrigación, entibiadas a 37º y ajustadas a un pH final de 7,4, a menos que se indique algo distinto. Se deben realizar
por lo menos dos valoraciones independientes (determinaciones repetidas) utilizando dos hígados de rata para cada lote
de Glucagón. La Figura 7 demuestra el proceso usado para generar un valor repetido. Se deben combinar como mínimo
dos determinaciones repetidas de acuerdo con la sección Cálculos. El intervalo de concentración de las Preparaciones están-
dar y las Preparaciones de valoración se puede modificar para que caigan dentro del intervalo lineal de la Valoración; asimis-
mo, los cálculos se pueden ajustar de manera correspondiente. Como alternativa, se puede emplear un análisis de curva
completa usando métodos estadísticos no lineales validados, siempre y cuando se demuestre la similitud cuando los analis-
tas comparen las respuestas de las Preparaciones estándar y las Preparaciones de valoración.]

Suspensión de Hepatocitos de
Rata (1 Rata)
Dividida en 2 Suspensiones

/
Suspensión 1 Suspensión 2
1 Vial de ER 1 Vial de ER
5 Viales de Muestra 5 Viales de Muestra

Un Resultado de Un Resultado de
Medición Medición

1
Resultado
Repetido

Figura 1. Diagrama de flujo del método de valoración de hepatocitos de rata (ER = Estándar de Referencia).

Preparación de Hepatocitos
Solución amortiguadora para perfusión sin calcio con dextrosa: Preparar una solución que contenga 7,92 g/L de clo-
ruro de sodio, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 1,80
g/L de dextrosa, O, 19 g/L de ácido edético (EDTA) y 2,38
g/L de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES). Oxigenar antes de su uso.
Solución amortiguadora de colagenasa: Preparar una solución que contenga 3,62 g/L de cloruro de sodio, 23,83
g/L de HEPES, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 0,52 g/L de cloruro de calcio y 1,8 g/L de dextrosa. Ajustar a un pH de 7,6.
Inmediatamente antes de la perfusión, disolver en esta solución una cantidad de colagenasa para obtener una concentra-
ción de 0,02%-0,05%. La concentración exacta de colagenasa se determina empíricamente para cada lote nuevo de enzi-
ma y es la cantidad que puede disociar el tejido uniformemente dentro de los 1 O minutos del ingreso de la solución amor-
tiguadora y producir una concentración celular viable de no menos de 3 x 10 6 células/mL.
Solución amortiguadora para lavado: Preparar una solución que contenga 7,92 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de
cloruro de potasio, O, 19 g/L de EDTA, 2,38 g/L de HEPES, O, 11 g/L de cloruro de calcio y 0,06 g/L de sulfato de magnesio.
Solución amortiguadora para incubación: Preparar una solución que contenga 6, 19 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L
de cloruro de potasio, 0,22 g/L de cloruro de calcio, O, 12 g/L de sulfato de magnesio, O, 16 g/L de fosfato monobásico de
potasio, 11,915 g/L de HEPES y 1 O g/L de albúmina sérica bovina (BSA al 1 %). Ajustar a un pH de 7,5.
Animales de prueba: Mantener ratas macho Sprague-Dawley con una dieta estándar de alimento para rata, con agua a
voluntad y permitir que se ajusten a su nuevo ambiente antes del análisis. En la mañana de la prueba, seleccionar una rata
sana con un peso aproximado de 300 g y administrar 100 Unidades de Heparina Sódica por vía subcutánea.
USP 37 Pruebas Biológicas/ (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón 157

Procedimiento: (NOTA-Efectuar este procedimiento por la mañana para asegurarse de que la rata tenga un nivel óptimo
de glucógeno en el hígado y que el procedimiento pueda completarse en un solo día.] Anestesiar a la rata con una anes-
tésico adecuado. Abrir la cavidad abdominal y aislar la vena porta. Insertar un angiocatéter conectado a una bomba de
perfusión y ajustarlo a la vena porta en la ubicación general de la rama esplénica. Comenzar la perfusión (25 mL/min) in
situ con la Solución amortiguadora para perfusión exenta de calcio con dextrosa previamente entibiada y oxigenada. Mien-
tras el hígado aumenta de tamaño, cortar la vena cava inferior para permitir que la presión se equilibre. (NOTA-Se re-
quieren aproximadamente 300 mL del perfusato para limpiar el hígado de glóbulos rojos a una velocidad de flujo de 25-
60 mL/min.] Después, hacer que circule Solución amortiguadora de colagenasa a una velocidad de flujo apropiada de ma-
nera que el hígado empiece a drenar el líquido de perfusión de los lóbulos en aproximadamente 1O minutos (por lo gene-
ral 25-60 mL/min). Cuando el hígado aumente significativamente de tamaño, cambie de color y consistencia y comience
a drenar el líquido de perfusión de los lóbulos, cambiar el sistema a la Solución amortiguadora para lavado previamente
entibiada y oxigenada. Se requieren aproximadamente 100 mL de Solución amortiguadora para lavado para lavar el hígado
de colagenasa a una velocidad de flujo de 25 mL/min. Retirar quirúrgicamente el hígado del animal y colocarlo en una
cápsula de Petri previamente entibiada que contenga una pequeña cantidad de Solución amortiguadora para lavado oxige-
nada (37°). Peinar suavemente el hígado con un peine de dientes finos de acero inoxidable para liberar los hepatocitos.
Filtrar y lavar los hepatocitos con Solución amortiguadora para lavado a través de gasa (con un grosor de 3 capas, o a tra-
vés de una red de polietileno con un tamaño de malla de 150 µm) previamente humedecida en un vaso de precipitados.
Transferir las células a dos tubos de centrífuga y centrifugar durante aproximadamente 1 minuto a 600 rpm. Desechar el
sobrenadante y volver a suspender los dos pellets en Solución amortiguadora para incubación. Combinar los dos pellets en
un recipiente adecuado y agregar suficiente Solución amortiguadora para incubación para obtener 150 ml.
Aptitud del sistema de la preparación de las células: La concentración de las células puede variar debido a la actividad
de colagenasa y a la viabilidad de los hepatocitos. Para verificar la viabilidad de las células y determinar la concentración
de células viables, diluir una alícuota de 100 µL de la suspensión celular con 400 µL de Solución amortiguadora de lavado y
500 µL de solución isotónica de azul de tripán al 0,4%. Cargar alícuotas de la suspensión celular en las dos cámaras de un
hemocitómetro y contar los 8 cuadrantes. Para cumplir con la aptitud del sistema del método de preparación de las célu-
las, se debe obtener una concentración de células viables de 3 x 10 6 células/mL (un intervalo aceptable es de 2,5 x 10 6 a
3,4 x 106 células/mL) a fin de proseguir con la valoración. Si la concentración de células viables excede el límite superior,
se puede agregar a las células un volumen adicional de Solución amortiguadora para incubación para ajustar la concentra-
ción a 3 x 106 células/ml. En este caso, se realiza un nuevo recuento de las células en un hemocitómetro, según se indicó
anteriormente para verificar la concentración. [NOTA-Las células viables son aquéllas que excluyen el azul de tripán.]
Determinación de Glucosa
Solución de control negativo: Preparar una solución que contenga BSA al 0,5% usando Agua Estéril para Inyección o
Agua Estéril para Irrigación.
Matraces para incubación: Usar matraces Erlenmeyer de 25 mL especialmente preparados, cuyos fondos se han calenta-
do y empujado hacia adentro para formar un centro elevado cónicamente o matraces similares que permitan un mezcla-
do suficiente al agitar por rotación suave. Colocar los Matraces para incubación en un baño de agua con agitador orbital a
35º.
Preparaciones estándar: En el día de la valoración, disolver dos viales de ER rGlucagón USP, medidos con exactitud, en
ácido clorhídrico 0,01 N u otro diluyente adecuado (el volumen se basa en la potencia del lote del Estándar de Referencia)
para obtener dos soluciones que contengan cada una 1 Unidad USP de rGlucagón/mL. Todas las diluciones posteriores se
realizan con Solución de control negativo. Diluir con exactitud volúmenes medidos de cada solución con Solución de control
negativo para obtener una concentración intermedia de 400 µU/mL y luego diluir la concentración intermedia para pro-
ducir cinco concentraciones: 200; 100; 50; 25 y 12,5 µU/mL (Preparaciones estándar). Pipetear y transferir O, 1 mL de cada
una de las Preparaciones estándar a distintos Matraces para incubación. Pipetear y transferir O, 1 mL de Solución de control
negativo a cada uno de dos matraces (Soluciones de control negativo 7 y 2).
Preparaciones de valoración: Usando cantidades pesadas con exactitud de muestras de Glucagón, proceder según se
indica en Preparaciones estándar o, si se está analizando Glucagón para Inyección, reconstituir 1O viales agregando lenta-
mente el contenido de las jeringas prellenadas adjuntas que contienen un diluyente apropiado para glucagón. Mezclar
suavemente cada vial hasta que se disuelva el glucagón. Con las mismas jeringas, extraer el contenido de 5 viales y colo-
car las soluciones en un matraz volumétrico de 25 ml. Repetir la operación para los 5 viales remanentes, transfiriendo el
contenido a un segundo matraz volumétrico de 25 ml. Diluir cada matraz con ácido clorhídrico 0,01 N a volumen. Diluir
una cantidad exacta de cada solución con BSA al 0,5% para obtener una concentración de 400 µU/mL y diluir la concen-
tración intermedia para producir cinco concentraciones de Preparación de valoración: 200; 100; 50; 25 y 12,5 µU/ml. Lue-
go, proceder según se indica en Preparaciones estándar.
Solución madre de referencia: Secar ER Dextrosa USP y luego transferir 1,0 g, pesados con exactitud, a un matraz volu-
métrico de 100 ml. Disolver y diluir con solución saturada de ácido benzoico a volumen.
Soluciones de referencia: Transferir cantidades adecuadas de Solución madre de referencia a 4 matraces y diluir con solu-
ción saturada de ácido benzoico hasta obtener Soluciones de referencia con concentraciones de 100; 500; 1000 y
1500 mg/L.
Solución de ferrocianuro de potasio: Disolver 1,25 g de ferrocianuro de potasio trihidrato en 125 mL de Agua Estéril pa-
ra Inyección o usar una fuente comercial apropiada.
 1

158 (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón / Pruebas Biológicas USP 37

Aptitud del sistema: Analizar la Solución de ferrocianuro de potasio, las Soluciones de referencia y cinco determinaciones
repetidas adicionales de la Solución de referencia de 500 ó 1 000 mg/L en un analizador de glucosa adecuado. Preparar una
curva estándar usando las Soluooncs de referencia según se indica en Preparaciones estándar. La raíz cuadrada del error
cuadrático medio residual a partir de la regresión dividida por el promedio de la respuesta multiplicada por 100% (desvia-
ción estándar relativa porcentual [%RSD] de la línea) no debe ser más de 2,0%. Asimismo, la respuesta de la Solución de
ferricianuro de potasio no debe ser más de 30 mg/L y la desviación estándar relativa no debe ser más de 2,0% para los
análisis repetidos de la Solución de referencia media.
Procedimiento: Dispensar 5 mL de Preparación de Hepatocitos en los Matraces para incubación en secuencia desde la con-
centración más alta de glucagón hasta la concentración más baja de glucagón, alternando las Preparaciones estándar con
las Preparaciones de valoración. Agitar los matraces por rotación suave en un baño de agua giratorio a 125 rpm una tem-
peratura de 35º durante aproximadamente 30 minutos. Después de la incubación, extraer alícuotas de 1,0 mL de cada
Matraz para incubación, transferir a tubos de microcentrífuga rotulados y centrifugar a 1 3 000 rpm durante 15 segundos.
Colocar cada sobrenadante en un tubo de muestreo rotulado para analizador de glucosa y determinar la concentración
de glucosa (mg/L) de cada una de las Preparaciones estandar y Preparauones de valoración. Medir la lectura de tondo de
las Soluciones de control negativo 7 y 2 y calcular el promedio de las dos respuestas.
Para cumplir con el intervalo lineal del instrumento que se esté usando, puede ser necesario que los analistas ajusten cada
una de las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración mediante dilución. Se debe usar un analizador de glucosa
que haya demostrado una especificidad, exactitud, precisión y respuesta lineal apropiadas para el intervalo de concen-
traciones que se están determinando. Determinar el incremento en la concentración de glucosa para cada una de las
Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración en comparación con el valor promedio de la Solución de control ne-
gativo.
Cálculos
Calcular la potencia relativa de las muestras de Glucagón en Unidades USP/mL usando métodos estadísticos para valoracio-
nes de líneas paralelas, comparando la curva del Estándar de Referencia (a partir de las Preparaciones estándar) con la cur-
va de la muestra de Glucagón (a partir de las Preparaciones de valoración). No puede presentarse ninguna inversión de
dosis-respuesta dentro de una corrida para las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración de 25; 50 ó 100
µU/ml. [NOTA-Se puede excluir el nivel bajo o alto de dosis, pero no ambos, del cálculo para cumplir con Jos requisitos
de linealidad.] Debido a que se requiere un mínimo de dos valoraciones válidas (ratas), las potencias estimadas se combi-
nan usando los procedimientos del capítulo general Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas (111 ), Combinación de Valo-
raciones Independientes; asimismo, se calcula Ja amplitud, L, de un intervalo de confianza de 95% para el logaritmo esti-
mado de la potencia relativa. Los resultados son válidos si L no es más de O, 1938. Si Les >0, 1938, se pueden realizar
valoraciones adicionales y combinarlas hasta obtener un término L válido, y posteriormente se calcula la potencia relativa
a partir de todas las corridas independientes válidas. Cumple con el requisito de identidad biológica si la potencia relativa
no es menos de 0,80 Unidades USP de rGlucagón/mg.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dextrosa USP
ER rGlucagón USP

(130) ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LA PROTEÍNA A

Introducción
La Proteína A se acopla a un soporte de resina con el fin de crear medios cromatográficos de afinidad con la proteína A,
usados comúnmente en la fabricación de anticuerpos monoclonales terapéuticos recombinantes. La proteína A natural se ob-
tiene del Staphylococcus aureus y contiene cinco regiones homólogas de unión a anticuerpos y una región e-terminal de unión
a la pared celular. Además de la proteína A de origen natural, existe en el mercado proteína A recombinante producida en
Escherichia coli, así como varias versiones de la proteína modificadas por ingeniería, también fabricadas en forma recombinan-
te. Cuando se inmoviliza sobre una columna, la proteína A proporciona un método altamente eficiente y robusto para purificar
anticuerpos en diversas escalas. Sin embargo, la proteína A inmovilizada en la columna (ligando de proteína A) puede también
coeluir con el anticuerpo durante la purificación, un efecto conocido a menudo como /eaching de la proteína A. Esta tendencia
aumenta a medida que envejece el medio cromatográfico. Las versiones de la proteína A modificadas por ingeniería podrían
mejorar la tolerancia del medio al pH, pero no eliminan el leaching. La expectativa reglamentaria actual se centra en que la
proteína A coeluida se elimine durante la purificación de los anticuerpos para uso humano y los procesos de fabricación se
validen de acuerdo con ello. Generalmente, durante el desarrollo y validación del proceso se utiliza un Enzimoinmunoensayo
(ELISA) para asegurar la eliminación eficiente de la proteína A residual durante las etapas del proceso posteriores a la cromato-
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A 159

grafía de afinidad con la proteína A. Adicionalmente, el fabricante deberá poseer un claro conocimiento y documentación so-
bre la calidad de la resina y el ligando, mediante la calificación de las materias primas y estudios de vida útil de la columna.
El Capítulo General (130) describe los atributos de calidad de los ligandos de proteína A que se usan en los medios cromato-
gráficos para la fabricación de anticuerpos monoclonales terapéuticos: Proteína A; rProteína A; rProteína A, C-Cys; rProteína A,
B4, C-Cys.

Proteína A

C199sH3163N s910 697S3

46 760
Secuencia N-terminal AQHDEA
Secuencia (-terminal IAADNK
La Proteína A se obtiene del Staphylococcus aureus. La estructura se compone de una única cadena de polipéptidos que con-
tiene cuatro dominios de unión a lgG. Con excepción de lgG 3, todas las demás lgG humanas se unen a la proteína A. Cada
molécula de Proteína A es capaz de unirse a dos moléculas de lgG. Se fabrica como una solución a granel con una concentra-
ción mayor de 20 mg de proteína A por mL y una potencia de unión a lgG mayor de 95%. Dado que la Proteína A se usa
como un material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los
de productos farmacéuticos terapéuticos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor.
Estándares de Referencia USP (11 )-fR Endotoxina USP. ER Proteína A USP.
Identificación-
A: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER Proteína A USP.
B: Unión a lgG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER Proteína A USP.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
Endotoxinas bacterianas (85)-No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-La
prueba de Endotoxinas bacterianas para Proteína A se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no defi-
ne el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las cuales se usa la
Proteína A.]
Proteína total (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 ))-Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo
Proteína A hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm después de corregirla
usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la concentración de proteína con la siguiente ecuación:

Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0, l 49)

en donde A es la absorbancia de Proteína A a la longitud de onda de 275 nm y O, 149 es la absortividad molar. Promediar los
resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es ~5%.
Límite de proteína contaminante habitual y valoración correspondiente-
Enterotoxina 8-La enterotoxina B se determina con un kit de enzimoinmunoensayo en microplaca disponible comercial-
mente.1 Los pocillos de las microplacas están recubiertos con anticuerpos de oveja anti enterotoxina B. Las curvas estándar se
realizan utilizando el kit control de ELISA. Los controles negativos son pocillos recubiertos con suero de oveja no inmunizada. El
nivel de enterotoxina se determina a partir de la curva estándar. La especifitación para el nivel de la enterotoxina B es ~1 ng
por mg de proteína total.
Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la Proteína A
de los contaminantes de alto peso molecular.]
Fase móvil-Preparar una solución de fosfato diácido de sodio 50 mM de pH 6,5 de la siguiente manera. Agregar 6,9 ±O, l g
de fosfato diácido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio
5 M a un pH de 6,50 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir con agua a volumen. Pasar la
solución a través de un filtro de membrana de 0,22 µm.
Solución regeneradora de columna-Preparar una solución de fosfato diácido de sodio O, 1 M de pH 3,0 de la siguiente mane-
ra. Agregar 13,8 ±O, 1 g de fosfato diácido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua hasta obtener
900 mL y ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 3,0 ± 0, 1. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir
a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,22 µm.
Solución de almacenamiento de la columna-Mezclar 100 mL de metanol con 900 mL de agua.
Solución de prueba-Diluir Proteína A hasta aproximadamente 1 mg por mL con Fase móvil.
Estándares de calibración-Usando Fase móvil, preparar por separado soluciones de 1 mg por mL de cada una de las siguien-
tes proteínas: tiroglobulina (670 kD), lgG (150 kD), beta lactoglobulina (36 kD) y lisozima (14 kD).
Solución estándar-Preparar una solución que contenga 1 mg por mL de ER Proteína A USP en Fase móvil.

1 Se puede obtener un kit de enzimoinmunoensayo adecuado de TECRA lnternational Pty Ltd., Australia (Nº SETVIA96).
 160 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas USP 37

Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 280 nm y una
columna de 7,8 mm x 30 cm rellena con material L33. Equilibrar la columna durante aproximadamente 30 minutos a 0,5 mL
de Fase móvil por minuto o hasta que se consiga una línea base estable.
Procedimiento-Inyectar por separado 100 µL de cada muestra y correrlas en la siguiente secuencia: Estándares de calibra-
ción, tiroglobulina, lgG, beta lactoglobulina y lisozima; la Solución estándar; y la Solución de prueba. Correr la secuencia tres
veces isocráticamente usando Fase móvil a 0,5 mL por minuto durante 30 minutos. La absorbancia se detecta a 280 nm. Anali-
zar los datos de los picos a 280 nm y seleccionar el tiempo de retención (TR) con el área de pico más grande. Usando los datos
de los Estándares de calibración, graficar la media del TR en función del logaritmo del peso molecular para obtener la curva
estándar. La pureza debe ser ::::95% en el pico principal. Utilizar la fórmula de la curva estándar para obtener los logaritmos de
los pesos moleculares de las Soluciones de prueba. Convertir los logaritmos de los pesos moleculares de las Soluciones de prueba
y de las Soluciones estándar a pesos moleculares reales. El peso molecular aparente de la proteína A a partir de la Solución están-
dar está entre 156 y 205 kDa; y el de la Proteína A a partir de la Solución de prueba está dentro del mismo intervalo.
Limpieza y almacenamiento de la columna-Enjuagar la columna con 100 mL de Solución regeneradora de columna y almace-
nar lavando con 100 mL de Solución de almacenamiento de la columna.

rPROTEÍNA A, C-CYS

C141sH 2320N432Üso3S4
34317,5 Da
Secuencia N-terminal AQHDEAQQNA
La rProteína A, C-Cys es una Proteína A recombinante que carece de la parte C-terminal de unión a la membrana; en cam-
bio, se le ha introducido una cisteína e-terminal para permitir una inmovilización dirigida. Tiene cinco dominios homólogos de
unión a lgG idénticos a los de la Proteína A nativa y se produce usando Escherichia coli como célula anfitriona, seguido de puri-
ficación por cromatografía convencional. La rProteína A, C-Cys se fabrica como una solución a granel con una potencia de
unión a lgG mayor de 95%. Dado que la rProteína A, C-Cys se usa como material auxiliar en la fabricación de fármacos tera-
péuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor.
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER rProteína A, C-Cys USP.
Identificación-
A: SDS-PAGE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, C-Cys USP.
B: Unión a /gG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, C-Cys USP.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
Endotoxinas bacterianas (85)-No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-La
prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A, C-Cys se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba
no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las cuales
se usa la rProteína A, C-Cys.]
Proteína total (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 ))-Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo
rProteína A, C-Cys hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm después de
corregirla usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la concentración de proteína con la siguiente ecuación:
Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0,22)
en donde A es la absorbancia de rProteína A, C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar. Prome-
diar los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es :o;2,5%.
Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A,
C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase móvil-Preparar una solución de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la si-
guiente manera. Agregar 0,96 ± 0,02 g de fosfato monobásico de sodio hidrato, 2,32 ± 0,02 g de fosfato dibásico de sodio
dihidrato y 8,76 g ± 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con
hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 ± 0,05. Transferir esta solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen
con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
Solución de EDTA-Preparar una solución de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 20 mM, disolviendo 0,74 ± 0,02 g de
EDTA en 100 mL de Fase móvil.
Solución de OTT-Preparar una solución de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 ± 0,02 g de DTI en 100 mL de
Fase móvil.
Solución de pretratamiento-Preparar una solución que contenga una mezcla de Solución de EDTA y Solución de DTT (1 :1,
v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución de prueba-Diluir rProteína A, C-Cys 1 a 5 en Solución de pretratamiento, y mezclar suavemente. Incubar la muestra
a 40º durante 60 minutos.
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (130) Atributos de Calidad de la Proteína A 161

Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y una
columna de 1O mm x 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volúmenes de columna de
Fase movil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto.
Procedimiento-Inyectar 1 00 ftL de Solución de pretratamiento y dejar que la cromatografía continúe durante por lo menos
dos volúmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 ftL de la Solución de prueba. La absorbancia se detecta a
214 nm. Integrar el pico principal de la corrida a partir de la Solución de prueba y todos los demás picos que no estén presentes
en las corridas de la Solución de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porción de la rProteína A, C-Cys to-
mada, por la fórmula:

1 OO(r/r,)
en donde r, es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de las respuestas de todos los picos: la suma de todas las
impurezas no es más de 5%; y la Solución de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 35 minutos.

rPROTEÍNA A

e, 917H3039Ns6so6ssS3
46 618
Secuencia N-terminal FLRPVE
La Proteína A es un componente de la pared celular del Staphylococcus aureus. La Proteína A recombinante (rProteína A)
consta de cinco dominios homólogos de unión (E, D, A, B, C) a la inmunoglobulina (lgG) seguidos de una secuencia parcial
del dominio X. Se expresa en Escherichia coli y se purifica por medio de un proceso de cromatografía en columna. Las colum-
nas de lgG no se usan en el proceso de purificación. Se fabrica como una solución a granel con una potencia de unión a lgG
mayor de 95%. Los métodos de pruebas para su liberación y las especificaciones se describen a continuación. Dado que la
rProteína A se usa como un material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulato-
rios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-El etiquetado indica que el material proviene de ADN recombinante, así como el número de lote, las condicio-
nes de almacenamiento y la leyenda "Formulado en Agua para Inyección".
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER rProteína A USP.
Identificación-
A: SDS-PAGE-
Marcador de peso molecular-Usar un marcador de peso molecular (MWM, por sus siglas en inglés) apropiado, que conten-
ga bandas de proteínas entre 20 y 200 kD.
Solución de PBS-Preparar una solución que contenga 8065,0 mg de cloruro de sodio y 200,0 mg de cloruro de potasio por
L de solución amortiguadora de fosfato de sodio 0,01 M de pH 7,4.
Solución amortiguadora de la muestra 4X2 -Disolver 0,666 g de tris-clorhídrico, 0,682 g de tris base, 0,800 g de dodecil sul-
fato de litio (LDS, por sus siglas en inglés), 0,006 g de ácido etilendinitrilotetracético (EDTA) y 4 g de glicerol en 8 mL de agua;
agregar 0,75 mL de solución de azul brillante de Coomassie G-250 al 1% (ver Azul de Coomassie G-250 en Reactivos en Reacti-
vos, Indicadores y Soluciones) y 0,25 mL de solución de rojo de fenol al 1 %. Mezclar bien y ajustar el volumen con agua a
10 mL.
Solución amortiguadora de la muestra 2X-Preparar una mezcla de Solución amortiguadora de la muestra 4X y agua (1 :1 ).
Solución amortiguadora de la muestra 7X-Preparar una mezcla de Solución amortiguadora de la muestra 2X y agua (1 :1 ).
Solución de ditiotreitol 7 M-Disolver 0, 154 g de DL-ditiotreitol (DTI) en i mL de agua.
Solución amortiguadora reductora de la muestra 2X-Mezclar 180 µL de Solución amortiguadora de la muestra 2X y 20 µL de
Solución de ditiotreitol 7 M.
Solución amortiguadora de corrida 20X 3-Disolver 104,6 g de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS, por sus siglas
en inglés), 60,6 g de tris base, 1 O g de dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) y 3,0 g de EDTA en 400 mL de
agua. Mezclar bien y ajustar con agua hasta 500 ml.
Solución amortiguadora de corrida 7X-Preparar una solución de agua y Solución amortiguadora de corrida 20X (19:1 ).
Solución de tínción del gel-Preparar una solución de azul brillante de Coomassie R-250 (ver Azul Brillante de Coomassie
R-250 en Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) que contenga una concentración de 0,5 g por Len una mezcla de
agua, isopropanol y ácido acético (6,5:2,5:1,0). Filtrar y almacenar a temperatura ambiente. No se recomienda la tinción con
plata.
Solución decolorante-Mezclar 1 00 mL de ácido acético con 900 mL de agua.
Preparación estándar-Diluir ER rProteína A USP hasta 0,4 mg por mL con Solución de PBS. Diluir adicionalmente esta solu-
ción 1 :1 con Solución amortiguadora reductora de la muestra 2X e incubar en un tubo cerrado durante 5 minutos a 90º. Mezclar
y centrifugar brevemente (quick spin) antes de cargar.

2 La Solución amortiguadora de la muestra 4X NuPAGE LOS se puede obtener de lnvitogen (Nº NP0007).
3 La Solución Amortiguodora de Corrida 20X NuPAGE MOPS SOS se puede obtener de lnvitrogen (Nº NPOOOl ).
 162 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas USP 37

Preparación de prueba-Diluir rProteína A con Solución de PBS hasta 0,4 mg por mL. Proceder según se indica en Preparación
estándar, comenzando donde dice "Diluir adicionalmente".
Solución combinada--Diluir rProteína A y ER rProteína A USP rnn Solución de PBS hd~la 0,8 mg por mL. Esta solución contie-
ne 0,4 mg por mL de cada proteína. Proceder según se indica en Preparación estándar, comenzando donde dice "Diluir adicio-
nalmente".
Montaje del aparato y gel de SOS-PACE-Montar el aparato para el gel según las instrucciones del fabricante. Asegurar en su
lugar la cuña de presión del gel y llenar la cámara interna con aproximadamente 200 mL de Solución amortiguadora de corrida
7X. Si no se verifican pérdidas de líquido, verter 600 mL de Solución amortiguadora de corrida 7X en la cámara externa. Sacar
cuidadosamente el peine del gel para sumergir los pocillos (wells) en la Solución amortiguadora de corrida 7X. Cargar 1 O ~tL de
cada preparación según se indica a continuación en Carga del gel en un gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10%. 4
Carga del gel-Usar el siguiente esquema de carga del gel al correr una Preparación de prueba (ver la Tabla 7). Cada Prepara-
ción de prueba se corre sola y como parte de la Solución combinada que contiene la rProteína A y la ER rProteína A USP.
-- - - ~----------- ---- -- -

--------r---------------1
Tabla 1
Volumen
de Carga
Cantidad
de Carga
I_ Calle Muestra (,1L) (µg)
1 Solución amortiguadora de la muestra 1X 10 N/D
2 MWM 20 N/D
3 Preparación de prueba #1 10 2
4 Solución combinada #1 10 4 (total)
5 Preparación de prueba #1 10 2
6 Solución amortiguadora de la muestra 1X 10 N/D
7 Preparación estándar 10 2
8 MWM 20 N/D
9 - - -

10 - - -

Corrida del gel-Fijar el voltaje en 125 volts y correr a un voltaje constante. Correr los geles hasta que la banda de azul de
bromofenol quede aproximadamente a 5 mm del borde inferior del gel (aproximadamente de 120 a 140 minutos).
Tinción del gel-Verter aproximadamente 100 mL de Solución de tinción del gel dentro del recipiente de tinción. Colocar el
gel dentro del recipiente de tinción y dejar que la solución colorante cubra el gel por completo. Calentar en un horno de mi-
croondas durante 30 segundos. Colocar el recipiente de tinción en un agitador orbital y teñir el gel durante 1 hora, agitando
suavemente.
Decoloración-Escurrir la Solución de tinción del gel y agregar suficiente Solución decolorante al recipiente hasta cubrir el gel.
Colocar el recipiente en un agitador orbital y agitar a baja velocidad. Cambiar la Solución decolorante según sea necesario hasta
obtener un fondo transparente. Después de decolorar, enjuagar bien el gel con agua y dejarlo en agua durante 1 O minutos
antes del escaneo.
Escaneo del gel-Colocar un poco de agua en la placa de vidrio del escáner y colocar los geles sobre una placa de vidrio
humedecida. Eliminar las burbujas. Escanear los geles realizando los ajustes apropiados.
Análisis de los datos-Escoger una banda entre las bandas de 20 kD y 30 kD del MWM para calcular el porcentaje del factor
de retención. Trazar una línea en una calle (la calle que contiene la Solución amortiguadora de muestra 7X) desde el pocillo
hasta el ápice (región de mayor intensidad) de la banda escogida.
La longitud de esta línea se designa como la distancia total (Dr)· En las calles que contienen muestras, trazar una línea desde
el pocillo hasta el ápice de cada banda. Para cada banda, la longitud de esta distancia es la distancia de migración (DM) en
mm. Registrar la DT y la DM en la hoja de informe para cada pico o banda. La distancia total debe ser la misma para cada calle
en un gel. Calcular el porcentaje del factor de retención (Rf) de cada pico o banda principal y documentar en la hoja de infor-
me, usando la siguiente ecuación:

%Rf = DM/DT X 100

También para cada gel, registrar el número de bandas y el peso molecular aproximado de cada banda en cada muestra.
Aptitud del sistema-Todas las bandas entre 20 kD y 70 kD están presentes. La calle que contiene la Solución amortiguadora
de la muestra 7X no contiene ninguna banda.
Especificidad-La rProteína A tiene una banda principal y un peso molecular similar que corresponden a los de la ER rProteí-
na A USP. La Solución combinada presenta también una única banda principal.
B: Unión a lgG-[NOTA-EI ensayo de unión a lgG es un método funcional para determinar el porcentaje de rProteína A
capaz de unirse a inmunoglobulina policlonal humana inmovilizada. Dado que el porcentaje de rProteína A funcional en cada
lote no es menor de 95%, el ensayo mide la proteína no unida en función de la proteína total inyectada. Esto se realiza me-

4 El gel de Bi,-Tris SDS-PAGE al 10% se puede obtener de lnvitrogen (Nº NP0301 ).

 USP 37 Pruebas Biológicas/ (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A 163

diante la comparación entre la absorbancia del flujo que atraviesa la columna y la absorbancia de una inyección desviada de la
misma.]
Pretratamiento de la muestra (desalinización)---Zon el fin de elimimr cualquier componente de la solución amortiguador;¡
que pudiera contribuir a la absorbancia en la fracción "no unida" a lgG en la columna, las muestras se desalinizan con Solución
A. La desalinización se puede llevar a cabo usando una columna de desalinización adecuada 1 , dependiendo de los volúmenes
requeridos.
Columna lgG-Para este ensayo se requiere una columna Sepharose 6 de 1 mL con lgG policlonal humana inmovilizada
(hlgG, por sus siglas en inglés). [NOTA-La columna de lgG requiere lavado cuando es nueva, cuando se han efectuado varios
ciclos de análisis o después de una falla de la aptitud del sistema. No es necesario efectuar el procedimiento de lavado de la
columna para cada inyección de muestra.]
Solución A para lavado de la columna-Preparar una solución de ácido acético 0,5 M de pH 3,4, agregando 28,6 mL de áci-
do acético a un vaso de precipitados de 1000 mL, diluyendo a 900 mL con agua y ajustando a pH 3,4 con acetato de amonio.
Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro
de membrana de 0,45 ~tm.
Solución B para lavado de la columna-Preparar una solución de Tris 50 mM de pH 7,6; cloruro de sodio 150 mM y Tween
20 al 0,05% por el siguiente procedimiento. Agregar 6,06 ± 0,01 g de Tris y 8,77 ± 0,01 g de cloruro de sodio a un vaso de
precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 0,5 M a un pH de 7,60 ± 0,05. Transferir
la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de mem-
brana de 0,45 ~tm (solución amortiguadora). Agregar 0,5 mL de Tween 20 a 1 L de la solución amortiguadora y mezclar bien.
Solución A-Preparar una solución de fosfato monobásico de sodio 20 mM y cloruro de sodio 150 mM de pH 7,6 por el
siguiente procedimiento. Agregar 2,76 ± 0,01 g de fosfato monobásico de sodio hidrato y 8,77 ± 0,01 g de cloruro de sodio a
un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 5 M a un pH de 7,60 ± 0,05.
Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro
de membrana de 0,45 ~tm.
Solución 8-Preparar una solución de ácido fosfórico 1 00 mM de pH 2,8 por el siguiente procedimiento. Agregar 6,8 mL de
ácido fosfórico a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de potasio 2 M a un
pH de 2,80 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua.
Fase móvil-Usar mezclas variables de Solución A y de Solución 8, según se indica en el Sistema cromatográfico. Hacer ajustes
si fuera necesario (ver Aptitud del Sistema en Cromatografía (621 )).
Preparación estándar-Descongelar el ER rProteína A USP y usarlo directamente.
Preparación de prueba-Preparar una solución de 4,0 a 6,0 mg por mL de rProteína A en Solución A.
Sistema cromatográfico-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector a 280 nm y una columna de 1 mL con hlgG
inmovilizada. Equipar un cromatógrafo con una válvula que permita desviar el flujo de la columna. Cada análisis consta de una
serie de dos inyecciones, una donde la muestra se inyecta en la columna y otra donde la muestra se desvía de la columna y
fluye directamente al detector. Efectuar tres análisis repetidos. Programar el cromatógrafo (ver la Tabla 2) del siguiente modo.
Tabla 2
Velocidad de flujo Tiempo Solución A Solución B Posición de la
(ml por minuto) (minutos) (%) (%) Válvula Elución
1,0 0-6 100 o columna reequilibrio
1,0 6-12 100--+0 0--+ 100 columna reequilibrio
1,0 12-22 100 o columna equilibrio
0,4 22-25 100 o columna equilibrio
0,4 (muestra
inyectada) 25-35 100 o columna isocrática
1,0 35-49 100->0 0--+ 100 columna regeneración
1,0 49-63 0--+ 100 100--+0 columna reequilibrio
1 63-65 100 o desvío equilibrio
0,4 65-68 100 o desvío equilibrio
0,4 (muestra
inyectada) 68-75 100 o desvío isocrática

Inyectar en el cromatógrafo la Preparación estándar, registrar el cromatograma y calcular el porcentaje de unión a hlgG según
se indica en el Procedimiento: el porcentaje de unión a hlgG es :o: 95% y la desviación estándar relativa para el análisis repetido
no es más de 1%.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo un volumen (aproximadamente 1 00 ~1L) de la Preparación de prueba. Registrar el
cromatograma y medir las respuestas de los picos. Calcular el porcentaje de actividad de unión a la hlgG, por la siguiente fór-
mula:

5 Las columnas Zeba se pueden obtener de Pierce; las columnas Nap-1 O se pueden obtener de GE Healthcare.
6 La columna HiTrap lgG Sepharose 6 FF se puede obtener de GE Healthcare (Nº 90-1003-97).
 164 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A / Pruebas Biológicas USP 37

en donde re es la respuesta del pico del material no unido obtenido a partir de la inyección de la columna y rB es lél respuesta
del pico obtenido a partir de la inyección desviada de la columna. La unión a hlgG no es menor de 95% en cada análisis repe-
tido de la Preparación de prueba. Informar el valor promedio de los tres análisis repetidos.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
Endotoxinas bacterianas (85)-No contiene más de 0,5 Unidades USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-
La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no
define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las cuales se
usa la rProteína A.]
Proteína total (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 ))-Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo
rProteína A hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nrn despué~ de corregir-
la usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la concentración de proteína con la siguiente ecuación:
Concentración de proteína (mg por mL) = (A275 /0, 165)

en donde A es la absorbancia de rProteína A a la longitud de onda de 275 nm y O, 165 es la absortividad molar. Promediar los
resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es :'0:5%.
Análisis espectral UV-Diluir rProteína A a 1 mg por mL en Agua para Inyección. Usar un espectrofotómetro de barrido UV
con Agua para Inyección como blanco, obtener los barridos espectrales en el intervalo de 240 a 360 nm. De los datos resultan-
tes, calcular el valor de la absorbancia a 270 nm y el cociente de absorbancias a 270 y a 250 nm (es decir, E270/E250): la
absorbancia a 270 nm de una solución de 1 mg por mL de rProteína A en Agua para Inyección está dentro del intervalo O, 14-
0,20.
Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A
de los contaminantes de alto peso molecular.]
Fase móvil-Preparar una solución de fosfato de sodio 0,3 M de pH 7, mezclando soluciones de fosfato monobásico y dibá-
sico de la siguiente manera. Pesar 21,3 ±O, 1 g de fosfato dibásico de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obte-
ner una solución de fosfato dibásico de sodio 0,3 M (Solución 7). En otro recipiente, pesar 18,0 ±O, 1 g de fosfato monobásico
de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obtener una solución de fosfato monobásico de sodio 0,3 M (Solución 2).
Calibrar un medidor de pH usando calibradores de pH 7 y 1O. Agregar 400 mL de Solución 7 a un vaso de precipitados de 1 L.
Transferir la sonda de pH al vaso de precipitados. Agregar lentamente la Solución 2 hasta que el pH sea 7,0 ± O, 1. Pasar la
solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
Solución estándar-Diluir ER rProteína A USP hasta 1 mg por ml en Fase móvil.
Solución de prueba-Diluir rProteína A hasta 1 mg por mL en Fase móvil.
Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y a 280
nm, y una columna de 9,4 mm x 25 cm rellena con material L35. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar
la Solución estándar según se indica en el Procedimiento: la rProteína A presenta un único pico principal aproximadamente a los
9 minutos y el porcentaje de área es 298% a 214 nm y 295% a 280 nm.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo 100 µL de la Solución de prueba, correr isocráticamente durante 15 minutos y
registrar el cromatograma. Los valores para la rProteína A a partir de la Solución de prueba corresponden a las especificaciones
del ER rProteína A USP a partir de la Solución estándar.
lsoformas-
Solución estándar-Descongelar ER rProteína A USP y usarlo directamente.
Solución de prueba-Diluir rProteína A a 4 mg por mL en Agua para Inyección.
Marcadores de pl--Usar un set de marcadores adecuado que contenga marcadores entre 3 y 10.7
Gel de IEF (isoelectroenfoque)-Usar un gel adecuado con intervalo de pH 3-1 O y un tamaño de 100 x 125 mm. 8
Procedimiento-Aplicar alícuotas de 5 µL de los Marcadores de pi de la Solución de prueba y de la Solución estándar al gel de
IEF y correrlas a 1W de potencia durante aproximadamente 1O minutos. Retirar la máscara de aplicación de la muestra y sumi-
nistrar potencia, con enfriamiento simultáneo entre 5º y 1Oº de la cámara de enfoque, durante 40 minutos a 1OOOV, 20 mA y
25W. Fijar el gel de IEF durante 1 hora en ácido tricloroacético al 20%, luego teñirlo con una tinción adecuada para geles de
IEF. 9 Por último, lavar y secar el gel: el coeficiente de correlación para la línea de mejor ajuste para los Marcadores de pi en
función de su migración en cm es 20,990, y la rProteína A a partir de la Solución estándar presenta una única banda principal
dentro del intervalo de pi de 4,6 a 5,2. En la Solución de prueba se observa una única banda que corresponde al intervalo de pi
de la Solución estándar.
Límite de Triton X-100-
Fase móvil-Preparar una mezcla filtrada y desgasificada de agua y acetonitrilo (60:40).
Solución de prueba-Diluir rProteína A a 5 mg por mL en Agua para Inyección.

7 Los marcadores de pi en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de BioRad (Nº 161-031 O).
8 Los geles de IEF en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de Cambrex (Nº 56015).
9 ISS Pro-Blue se puede obtener de lntegrated Separation Systems.
 USP 37 Pruebas Biológicas / (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A 1 65

Solución de Triton X- 700 con una cantidad conocida agregada-Combinar 5 mg por mL de ER rProteína A USP y Triton X-1 00
al O, 15% (9:1) para obtener una solución con una concentración conocida de rProteína A y Triton X-100 al 0,015%.
Sistema cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))--Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y 280
nm y una columna de 4,6 mm x 25 cm rellena con material L11 de 5 pm. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Croma-
tografiar la Solución de Triton X- 700 con una cantidad conocida agregada según se indica en el Procedimiento: el Triton X-100
tiene un único pico principal aproximadamente a los 9 minutos y la rProteína A presenta un pico menor o indetectable con el
mismo tiempo de retención.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 100 ~tL de la Solución de prueba, correr isocráticamente du-
rante 35 minutos y registrar el cromatograma. La absorbancia se detecta a 223 nm: el pico de Triton X-100 no es mayor de
0,015% (equivalente a la Solución de Triton X- 700 con una cantidad conocida agregada).

rPROTEÍNA A, B4 , C-CYS

e,, 77H, ss4N326o384s 1

26747,6 Da
Secuencia N-terminal AQGTVDAKFD
La rProteína A, B4 , C-Cys es una proteína recombinante derivada del dominio B de la Proteína A. El dominio de la Proteína A
ha sido estabilizado al álcali por mutagénesis sitio-específica y multimerizado en un tetrámero con una cisteína e-terminal para
permitir una inmovilización dirigida. La rProteína A, B4 , C-Cys se produce usando Escherichia coli como célula anfitriona, segui-
do de purificación por cromatografía convencional. La rProteína A, B4 , C-Cys se fabrica como una solución a granel con una
potencia de unión a lgG mayor de 95%. Dado que la rProteína A, B4 , C-Cys se usa como un material auxiliar en la fabricación
de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos.
Envasado y almacenamiento-Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
Etiquetado-Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor.
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Endotoxina USP. ER rProteína A, 84 , C-Cys USP.
Identificación-
A: SOS-PACE-Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, B4 , C-Cys
USP.
B: Unión a lgG-Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, B4 , C-Cys
USP.
Pruebas de recuento microbiano (61) y Pruebas de microorganismos específicos (62)-EI recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1 O ufc por mL.
Endotoxinas bacterianas (85)-No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total. [NOTA-La
prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A, B4 , C-Cys se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta
prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en las
cuales se usa la rProteína A, B4 , C-Cys.]
Proteína total (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851) ) -
Solución amortiguadora de formulación-Preparar una solución de fosfato de potasio 0,02 M de pH 7,0, que contenga cloru-
ro de potasio O, 15 M y ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 2 mM de la siguiente manera. Agregar 2,72 ± 0,01 g de fosfato
monobásico de potasio anhidro, 11, 18 g ± 0,22 g de cloruro de potasio y 0,744 ± 0,02 g de EDTA en un vaso de precipitados
de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,00 ± 0,05. Transferir la solución a un
matraz volumétrico de 1 000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 pm.
Preparación de pruebo-Diluir la rProteína A, B4 , C-Cys a 3,0 mg por mL con Solución amortiguadora de formulación.
Procedimiento-Preparar muestras por triplicado para análisis. Medir la absorbancia de cada Preparación de prueba a 275 nm
después de corregirla usando Solución amortiguadora de formulación como blanco. Determinar la concentración de proteína
con la siguiente ecuación:

Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0,22)

en donde A es la absorbancia de rProteína A, B4 , C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar.
Promediar los resultados triplicados y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es -:::2,5%.
Pureza cromatográfica-[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A,
B4 , C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase móvil-Preparar una solución de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la si-
guiente manera. Agregar 0,96 ± 0,02 g de fosfato monobásico de sodio hidrato, 2,32 ± 0,02 g de fosfato dibásico de sodio
dihidrato, y 8,76 g ± 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con
hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 ± 0,05. Transferir esta solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen
con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 pm.
Solución de EOTA-Preparar una solución de EDTA 20 mM, disolviendo 0,74 ± 0,02 g de EDTA en 100 mL de Fase móvil.
Solución de OH-Preparar una solución de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 ± 0,02 g de DTI en 100 mL de
Fase móvil.
 166 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas USP 37

Solución de pretratamiento-Preparar una solución que contenga una mezcla de Solución de EDTA y Solución de DTT (1: 1,
v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución rfp prut'ba-Diluir rProteína A, B4 , C-Cys 1 a 5 en Solución de pretratamienlo y mezclar ~uavemente. Incubar la mues-
tra a 40º durante 60 minutos.
Sistt'ma cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y una
columna de 1 O mm x 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volúmenes de columnna de
la Fase móvil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto.
Procedimiento-Inyectar 1 00 µL de Solución de pretratamiento, y dejar que la cromatografía continúe durante por lo menos
dos volúmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 ~tL de la Solución de prueba. La absorbancia se detecta a
los 214 nm. Integrar el pico principal a partir de la corrida de la Solución de prueba y todos los demás picos que no estén pre-
sentes en las corridas de la Solución de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porción de rProteína A, B4 ,
C-Cys, por la fórmula:
1OO(r/r)

en donde r; es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de todas las respuestas de todos los picos: la suma de
todas las impurezas no es más de 5%; y la Solución de prueba presentJ un pico principal aproximadamente a los 37 minutos.

(151) PRUEBA DE PIRÓGENOS

La prueba de pirógenos está diseñada para limitar a un nivel aceptable el riesgo de reacción febril en pacientes a los que se
inyecta un determinado producto. La prueba mide el aumento de la temperatura corporal en conejos a los que se inyecta una
solución de prueba por vía intravenosa. Este ensayo está diseñado para productos que pueden ser tolerados por conejos en
una dosis que no exceda de 1 O ml por kg del peso del conejo, inyectados por vía intravenosa durante un período de no más
de 1 O minutos. En el caso de productos que requieren una preparación preliminar o que están sujetos a condiciones especiales
de administración, se deben seguir las indicaciones adicionales establecidas en la monografía individual o, en el caso de anti-
bióticos o de productos biológicos, seguir las indicaciones adicionales establecidas en las reglamentaciones federales (ver Pro-
ductos Biológicos (1041 )).

APARATOS Y DILUYENTES

Despirogenar jeringas, agujas y material de vidrio por calentamiento a 250º durante no menos de 30 minutos o utilizando
otro método adecuado. Todos los diluyentes y soluciones para lavado y enjuague de los dispositivos o sistemas de inyección
parenteral, se deben tratar de manera que garanticen la esterilidad y la ausencia de pirógenos. Se deben realizar periódica-
mente pruebas de control de pirógenos en porciones representativas de los diluyentes y soluciones que se emplean para lava-
do y enjuague de los aparatos. Cuando se especifique el uso de Inyección de Cloruro de Sodio como diluyente, emplear una
Inyección que contenga 0,9 por ciento de NaCI.

REGISTRO DE LA TEMPERATURA

Emplear dispositivos sensores de temperatura exactos, tales como termómetros clínicos, sondas termométricas u otra clase
de sonda calibrada, que aseguren una exactitud de ±0, 1 ºy que faciliten la lectura máxima en menos de 5 minutos. Insertar la
sonda sensora de temperatura en el recto del conejo, a una profundidad de no menos de 7,5 cm y, durante un período no
menor que el previamente estimado como suficiente, registrar la temperatura corporal del animal de prueba.

ANIMALES DE PRUEBA

Emplear conejos adultos y sanos. Mantenerlos individualmente en un lugar sin perturbaciones que los puedan excitar y a
una temperatura uniforme entre 20º y 23º, con una variación máxima de ±3º respecto de la temperatura seleccionada. Antes
de emplear por primera vez un conejo en una prueba de pirógenos, se lo debe acondicionar durante un período de no más de
7 días, realizando un ensayo simulado que incluya todos los pasos indicados en el Procedimiento, pero omitiendo la inyección.
No utilizar el mismo conejo para pruebas de pirógenos más de una vez cada 48 horas, ni antes de que hayan transcurrido dos
semanas después de una elevación de la temperatura corporal de 0,6º o más, mientras es sometido a la prueba de pirógenos o
después de administrarle una sustancia considerada pirogénica.
 USP 37 Pruebas Biológicas / (1 51) Prueba de Pirógenos 167

PROCEDIMIENTO

El ensayo se debe llevdr a cabo en un área destinada exclusivamente a la prueba de pirógenos, con condiciones ambientales
similares a las del espacio donde están alojados los conejos y libres de perturbaciones que puedan excitarlos. Durante el perío-
do de prueba se les suspenderá todo alimento. El acceso al agua está permitido en todo momento pero podrá restringirse du-
rante la prueba. Si el dispositivo empleado para medir la temperatura rectal debe dejarse insertado durante el período de prue-
ba, sujetar los conejos mediante sujetadores en el cuello, no muy ajustados, que les permita adoptar una postura natural de
descanso. Determinar la "temperatura control" de cada conejo no más de 30 minutos antes de la inyección de la dosis de
prueba: ésta es la temperatura base para determinar si existe aumento provocado por la inyección de una solución de prueba.
En cada uno de los grupos de conejos de prueba, emplear solamente aquellos cuya temperatura control no varíe más de 1 º
respecto de los demás. Descartar los conejos cuya temperatura corporal exceda de 39,8º.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía correspondiente, inyectar a cada uno de tres conejos, en una
vena de la oreja, 1 O mL de la solución de prueba por kg de peso, completándose cada inyección dentro de los 1O minutos
desde el inicio de su administración. La solución de prueba es o bien el producto, reconstituido de acuerdo con las especifica-
ciones de la etiqueta, o bien el material en análisis, tratado según se indica en la monografía individual e inyectado en la dosis
especificada en la misma. Para la prueba de pirógenos de dispositivos médicos o sistemas de inyección, lavar o enjuagar las
superficies del dispositivo o sistema que entran en contacto con el material administrado en forma parenteral, o con el sitio de
inyección, o con los tejidos internos del paciente. Asegurarse de que todas las soluciones de prueba estén protegidas de la
contaminación. Administrar la inyección después de entibiar la solución de prueba a una temperatura de 37 ± 2º. Registrar la
temperatura a intervalos de 30 minutos durante el período de 1 a 3 horas posteriores a la inyección.

INTERPRETACIÓN V CONTINUACIÓN DE LA PRUEBA

Considerar cualquier disminución de la temperatura como elevación cero. El producto cumple con los requisitos de la prue-
ba para determinar la ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra un aumento de 0,5º o más por encima de su tempera-
tura de control respectiva. Si algún conejo muestra un aumento de 0,5º o más, continuar la prueba empleando otros cinco
conejos. El material en análisis cumple con los requisitos para determinar la ausencia de pirógenos cuando no más de tres de
los ocho conejos tienen un aumento de temperatura de 0,5º o más y si la suma del aumento máximo de las temperaturas
individuales de los ocho conejos no excede de 3,3º.

PRODUCTOS FARMACÉUTICOS RADIOACTIVOS

Dosis de Prueba para Productos Preformulados, Listos para Usar Marcados con Radioactividad
ALBÚMINA AGREGADA Y OTROS PRODUCTOS QUE CONTIENEN PARTÍCULAS

Para la prueba de pirógenos en conejos, diluir el producto con Inyección de Cloruro de Sodio a no menos de 100 µCi por
mL e inyectar a cada conejo una dosis de 3 ml por kg de peso corporal.

OTROS PRODUCTOS

Cuando la Vida Media Física de los Radionucleidos Es de Más de Un.Día-Calcular el volumen máximo del producto
que puede inyectarse a una persona. Este cálculo debe tener en cuenta la dosis radioactiva máxima recomendada del produc-
to, en µCi, y la valoración de la radioactividad, en µCi por mL, del producto a la hora o fecha de su caducidad. Utilizando esta
información, se calcula el volumen de la dosis máxima por kg en una persona de 70 kg.
Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar a cada conejo un mínimo de 1O veces esta dosis por kg de peso corporal.
Si fuera necesario, diluir la dosis con Inyección de Cloruro de Sodio. El volumen total inyectado por conejo no debe ser menor
de 1 mL ni mayor de 1 O mL de solución.
Cuando la Vida Media Física de los Radionucleidos Es de Menos de Un Día-Para productos cuya etiqueta indica que
contienen radionucleidos con una vida media inferior a 1 día, los cálculos de dosificación son idénticos a los descritos en el
primer párrafo en Otros Productos. Se puede autorizar la distribución de estos productos antes de terminar la prueba de piróge-
nos en conejos, pero las pruebas se deben comenzar antes de las 36 horas de la autorización a más tardar.

Dosis de Prueba para Componentes de Productos Farmacéuticos o Reactivos a Ser Marcados

Se establecen los siguientes requisitos para la dosis de prueba de reactivos a ser marcados o reconstituidos antes del uso por
agregado directo de soluciones radioactivas tales como Inyección de Pertecnetato de Sodio Te 99 m, por ejemplo: "equipos
fríos".
 168 (151) Prueba de Pirógenos / Pruebas Biológicas USP 37

Se debe suponer que el contenido total del vial de reactivo no radioactivo se inyectará a una persona de 70 kg o que se
inyectará el 1 / 70 del contenido total por kg. Si el contenido es seco, reconstituirlo con un volumen medido de Inyección de
Cloruro de Sodio.
Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar (1/ 7) del contenido de un vial por kg de peso corporal de cada conejo. La
dosis máxima por conejo será igual al contenido completo de un solo vial. El volumen total inyectado por conejo no debe ser
de menos de 1 mL ni de más de 1 O mL de solución.

(161) EQUIPOS PARA TRANSFUSIÓN E INFUSIÓN Y DISPOSITIVOS

MÉDICOS SIMILARES

Los requisitos se aplican a dispositivos o equipos apirógenos y estériles que entran en contacto, directo o indirecto, con el
sistema cardiovascular, el sistema linfático o el líquido cefalorraquídeo. Estos incluyen los siguientes, sin limitarse a estos: equi-
pos de administración de soluciones, de extensión, de transferencia, de administración de sangre, catéteres intravenosos, im-
plantes, tuberías y accesorios de oxigenadores extracorpóreos, dializadores y tubos y accesorios para diálisis, válvulas cardíacas,
injertos vasculares, catéteres de administración intramuscular de fármacos, y equipos de transfusión e infusión. Estos requisitos
no se aplican a productos ortopédicos, guantes de látex o apósitos para heridas.
Esterilidad-Proceder según se indica para Dispositivos Esterilizados en Pruebas de Esterilidad (71 ).
Endotoxinas Bacterianas-Proceder según se indica en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85).
El límite de endotoxinas para los dispositivos médicos no es más de 20,0 Unidades USP de Endotoxinas por dispositivo, salvo
para los dispositivos médicos que entran en contacto con el líquido cefalorraquídeo, cuyo límite es no más de 2, 15 Unidades
USP de Endotoxinas por dispositivo.
Efectuar una segunda prueba de Endotoxinas Bacterianas solamente con todo dispositivo que no cumpla con la primera
prueba efectuada. Efectuar la Prueba de Pirógenos (151) con todos los dispositivos a los que no se les puede efectuar la Prueba
de Endotoxinas Bacterianas (85) por aumento o inhibición no eliminable.
Preparación de Jos Equipos-Escoger no menos de 3 y no más de 1O equipos. Enjuagarlos o remojarlos en Agua Reactiva LAL.
Ajustar el volumen de la solución de extracción o de enjuague según el tamaño y la configuración del equipo.
Purgar las líneas de recorrido del líquido de los equipos etiquetados como "recorrido de líquido apirógeno" con líquido de
extracción calentado a 37 ± 1,0º y mantener el líquido de extracción en contacto con el recorrido que corresponda durante no
menos de 1 hora a temperatura ambiente controlada. Combinar los extractos si corresponde. Calcular el límite de endotoxinas
de la solución de extracción o de enjuague por la fórmula:
(K X N)/(V)

en donde K es la cantidad de endotoxinas permitida por equipo, N es el número de equipos que se analizan y V es el volumen
total del extracto o del líquido de enjuague. Si la solución de enjuague o de extracción sin diluir no es adecuada para efectuar
la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), repetir la prueba de aumento o inhibición después de neutralizar y eliminar las sus-
tancias interferentes o después de diluir la solución en un factor que no exceda el de la Dilución Máxima Válida. La Dilución
Máxima Válida para dispositivos se calcula dividiendo el límite de endotoxinas por la sensibilidad A. declarada en la etiqueta del
reactivo LAL utilizado.
Pirógenos-Efectuar la Prueba de Pirógenos (151) con las muestras a las que ño se puede efectuar la Prueba de Endotoxinas
Bacterianas por aumento o inhibición no eliminable de la prueba. Escoger 1 O dispositivos y obtener un efluente combinado,
empleando métodos de preparación adecuados al equipo, según se indica en Endotoxinas Bacterianas, pero utilizando volúme-
nes de líquido de extracción o de enjuague que no excedan de 40 mL de solución salina estéril SR por equipo. Se cumple con
los requisitos de la Prueba de Pirógenos (151 ).
Otros Requisitos-Las partes de los dispositivos médicos que están fabricadas de plásticos u otros polímeros cumplen con
los requisitos especificados para Pruebas Biológicas-Plásticos y Otros Polímeros en Envases-Plásticos (661 ); las fabricadas de
elastómeros cumplen con los requisitos establecidos en Cierres Elastoméricos para Inyectables (381 ). Si fuera necesario estable-
cer una designación de clases para elastómeros, plásticos u otros polímeros, realizar las pruebas in vivo correspondientes, se-
gún se indica en el capítulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88).

(171) VALORACIÓN DE ACTIVIDAD DE VITAMINA B 12

Estándares de referencia USP (11 )-ER Cianocobalamina USP.

Preparación de Valoración-Colocar una cantidad adecuada del material a valorar, previamente reducida a polvo fino si
fuera necesario y medida o pesada con exactitud, en un recipiente apropiado que contenga, por cada g o mL del material
 USP 37 Pruebas Biológicas/ (1 71) Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 169

tomado, 25 ml de una solución acuosa para extracción preparad a justo antes de usar, en donde, cada 100 ml contienen
1,29 g de fosfato disódico, 1, 1 g de ácido cítrico anhidro y 1,0 g de metabisulfito de sodio. Colocar la mezcla en autoclave a
121 º durante 1O minutos. Dejar sedimentar las partículas no disueltas del extracto y filtrar o centrifugar si fuera necesario. Di-
luir una alícuota de la solución transparente con agua, de manera que la solución de prueba final contenga una actividad de
vitamina B12 que equivalga aproximadamente a la actividad de la Solución Estándar de Cianocobalamina que se agrega a los
tubos de valoración.
Solución Madre del Estándar de Cianocobalamina-A una cantidad adecuada de ER Cianocobalamina USP, pesada con
exactitud, agregar suficiente alcohol al 25 por ciento para obtener una solución con una concentración conocida de 1,0 ~tg de
cianocobalamina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución de Cianocobalamina Estándar-Diluir un volumen adecuado de Solución Madre del Estándar de Cianocobalamina
con agua hasta un volumen medido tal que después del período de incubación según se indica en el Procedimiento, la diferen-
cia en Ja transmitancia entre el blanco inoculado y el nivel de 5,0 ml de la Solución de Cianocobalamina Estándar no sea menor
de aquella correspondiente a la diferencia de 1,25 mg en peso seco de las células. Generalmente, esta concentración está entre
0,01 ng y 0,04 ng por ml de Solución de Cianocobalamina Estándar. Preparar una solución estándar nueva para cada valora-
ción.
Solución Madre de Medio Basal-Preparar el medio de acuerdo con la fórmula y las instrucciones que aparecen a conti-
nuación. Puede usarse una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que, una vez reconstituida se-
gún se indica en la etiqueta, proporcione un medio comparable al obtenido a partir de la fórmula que aparece en este procedi-
miento.
Agregar los ingredientes en el orden indicado, disolviendo con cuidado la cistina y el triptófano en el ácido clorhídrico antes
de agregar las ocho soluciones siguientes a la solución resultante. Agregar 100 ml de agua, mezclar y disolver la dextrosa, el
acetato de sodio y el ácido ascórbico. Filtrar, si fuera necesario, agregar la solución de polisorbato 80, ajustar la solución a un
pH entre 5,5 y 6,0 con hidróxido de sodio 1 N y agregar agua purificada hasta obtener 250 ml.

L-Cistina 0,1 g
L-Triptófano 0,05 g
Ácido Clorhídrico 1 N 10 ml
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solución de Xantina 5 ml
Solución Vitamínica 1 10 ml
Solución Vitamínica 11 10 ml
Solución Salina A 5 ml
Solución Salina B 5 ml
Solución de Asparagina 5 ml
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína 25 ml
Dextrosa Anhidra 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro 5g
Ácido Ascórbico 1g
Solución de Polisorbato 80 5 ml

Solución de Hidro/izado Ácido de Caseína-Preparar según se indica en Valoración de Pantotenato de Calcio (91 ).
Solución de Asparagina-Disolver 2,0 g de L-asparagina en agua hasta obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refri-
gerador.
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo-Preparar según se indica en Valoración de Pantotenato de Calcio (91 ).
Solución de Xantina-Suspender 0,20 g de xantina en 30 ml a 40 ml de agua, calentar a una temperatura de aproximada-
mente 70º, agregar 6,0 ml de hidróxido de amonio 6 N y mezclar hasta que el sólido se disuelva. Enfriar y agregar agua para
obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solución Salina A-Disolver 1 O g de fosfato monobásico de potasio y 1 O g de fosfato dibásico de potasio en agua para obte-
ner 200 ml. Agregar 2 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Solución Salina 8-Disolver 4,0 g de sulfato de magnesio, 0,20 g de cloruro de sodio, 0,20 g de sulfato ferroso y 0,20 g de
sulfato de manganeso en agua para obtener 200 ml. Agregar 2 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Solución de Po/isorbato 80-Disolver 20 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 200 ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución Vitamínica /-Disolver 1 O mg de riboflavina, 1 O mg de clorhidrato de tiamina, 1 00 µg de biotina y 20 mg de niacina
en ácido acético glacial 0,02 N para obtener 400 ml. Almacenar, bajo tolueno protegiendo de la luz, en un refrigerador.
Solución Vitamínica //-Disolver 20 mg de ácido paraaminobenzoico, 1 O mg de pantotenato de calcio, 40 mg de clorhidrato
de piridoxina, 40 mg de clorhidrato de piridoxal, 8 mg de diclorhidrato de piridoxamina y 2 mg de ácido fólico en alcohol neu-
tralizado diluido (1 en 4) para obtener 400 ml. Almacenar, protegiendo de la luz, en un refrigerador.
Preparación de Jugo de Tomate-Centrifugar jugo de tomate enlatado comercial para extraer la mayor parte de la pulpa.
Suspender aproximadamente 5 g por L de coadyuvante de filtración analítico en el sobrenadante y filtrar, con ayuda de pre-
 •
1 70 (1 71) Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 / Pruebas Biológicas USP 37

sión reducida, a través de una capa de coadyuvante de filtración. Repetir la filtración, si fuera necesario, hasta obtener un filtra-
do transparente, color amarillo claro. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Medio de Cultivo-[NOTA-Se puede usar una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que,
una vez reconstituida según las indicaciones del etiquetado, proporcione un medio equivalente al obtenido a partir de la fór-
mula descrita en este procedimiento.] Disolver 0,75 g de extracto de levadura hidrosoluble, 0,75 g de peptona seca, 1,0 g de
dextrosa anhidra y 0,20 g de bifosfato de potasio en 60 ml a 70 ml de agua. Agregar 1 O ml de Preparación de jugo de Tomate
y 1 ml de Solución de Polisorbato 80. Ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH de 6,8 y agregar agua para
obtener 100 ml. Colocar porciones de 1 O ml de la solución en tubos de ensayo y tapar con algodón. Esterilizar los tubos y su
contenido en autoclave a 121 ºdurante 15 minutos. Enfriar con la mayor prontitud posible para evitar formación de colores
que resultan del sobrecalentamiento del medio.
Medio de Suspensión-Diluir un volumen medido de la Solución Madre de Medio Basal con un volumen igual de agua.
Colocar porciones de 1O ml del medio diluido en tubos de ensayo. Esterilizar y enfriar según se ha indicado en Medio de Culti-
vo.
Cultivo Madre de Lactobacillus leichmanníí-Agregar 1,0 g a 1,5 g de agar a 100 ml de Medio de Cultivo y calentar la
mezcla en un baño de vapor, con agitación, hasta que el agar se disuelva. Colocar porciones de aproximadamente 1 O ml de la
solución caliente en los tubos de ensayo, tapar bien los tubos, esterilizarlos a 121ºdurante15 minutos en autoclave (tempera-
tura de la salida) y dejar que los tubos se enfríen en posición vertical. Inocular tres o más de los tubos, por transferencias en
cuña de un cultivo puro de Lactobacillus leichmannii. * (Antes de usar un cultivo nuevo por primera vez en esta valoración, hacer
no menos de 1 O transferencias sucesivas del cultivo en un período de 2 semanas.) Incubar durante 16 a 24 horas, a cualquier
temperatura seleccionada entre 30º y 40º, pero mantenida termostáticamente dentro de ±0,5º y finalmente almacenar en un
refrigerador.
Preparar cultivos nuevos en cuña al menos tres veces por semana y no usarlos para preparar el inóculo si tienen más de 4
días. La actividad del microorganismo se puede aumentar mediante transferencias del cultivo en cuña realizadas a diario o dos
veces al día, hasta el punto en que se pueda observar una evidente turbidez en el inóculo líquido 2 a 4 horas después de la
inoculación. Un cultivo de crecimiento lento raramente proporciona una curva de respuesta adecuada y puede conducir a re-
sultados irregulares.
lnóculo-[NOTA-Una suspensión congelada de Lactobacillus leichmannii puede usarse como cultivo madre, siempre que
proporcione un inóculo comparable a un cultivo nuevo.] Transferir las células del Cultivo Madre de Lactobacillus leichmannii a 2
tubos estériles que contengan 1O ml de Medio de Cultivo cada uno. Incubar estos cultivos durante 16 a 24 horas a cualquier
temperatura seleccionada entre 30º y 40º, pero mantenida termostáticamente dentro de ±0,5º. En condiciones asépticas, cen-
trifugar los cultivos y decantar el sobrenadante. Suspender las células de cultivo en 5 ml de Medio de Suspensión estéril y mez-
clar. Usando Medio de Suspensión estéril, ajustar el volumen para que una dilución 1 en 20 en solución salina SR produzca
transmitancia de 70% cuando se lee en un espectrofotómetro apropiado a una longitud de onda ajustada a 530 nm, equipado
con una celda de 1O mm y se lee contra solución salina SR ajustada a una transmitancia de 100%. Preparar una dilución 1 en
400 de la suspensión ajustada usando Solución Madre de Medio Basal y usarla para el inóculo de prueba. (Esta dilución puede
alterarse, cuando sea necesario, para obtener la respuesta deseada.)
Calibración del Espectrofotómetro-Comprobar la longitud de onda del espectrofotómetro periódicamente, usando una
celda de longitud de onda estándar u otro dispositivo apropiado. Previamente a la lectura de las soluciones, calibrar el espec-
trofotómetro con agua para fijar el 0% y el 100% de transmitancia, a la longitud de onda de 530 nm.
Procedimiento-Limpiar meticulosamente, por medios apropiados, los tubos de ensayo de vidrio duro, de 20 mm x
150 mm de tamaño aproximado y otro material de vidrio necesario, preferentemente seguido de un calentamiento a 250º du-
rante 2 horas, debido a la alta sensibilidad del organismo de prueba a la actividad de cantidades diminutas de vitamina B12 y a
trazas de muchos agentes de limpieza.
Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado: 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml, respectivamente, de la Solu-
ción de Cianocobalamína Estándar. A cada uno de estos tubos y a cuatro tubos vacíos similares, agregar 5,0 ml de Solución Ma-
dre de Medio Basal y agua para completar 1O ml.
En tubos de ensayo similares, agregar, por duplicado, respectivamente, 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml y 4,0 ml de la Prepa-
ración de Valoración. Agregar a cada tubo 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agua para completar 1 O ml. Colocar jun-
tos un juego completo de tubos del estándar y de la valoración en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda gradi-
lla o en otra sección de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
Cubrir los tubos apropiadamente para prevenir la contaminación bacteriana y esterilizar los tubos y su contenido en un au-
toclave a 121 º durante 5 minutos, procurando alcanzar esta temperatura en no más de 1O minutos, precalentando el autocla-
ve si fuera necesario. Enfriar tan rápidamente como sea posible para evitar formación de color como resultado del sobrecalen-
tamiento del medio. Tomar precauciones para mantener la uniformidad de las condiciones de esterilización y enfriamiento du-
rante toda la valoración ya que si los tubos se colocan demasiado juntos o si se sobrecarga el autoclave podría variar la veloci-
dad de calentamiento.

* Se pueden obtener cultivos puros de Lactobacil/us leichmannii, Número 7830, de la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (181) Identificación 171

Agregar asépticamente 0,5 ml de lnóculo a cada tubo así preparado, excepto a dos de los cuatro que no contengan Solución
de Cianocobalamina Estándar (los blancos no inoculados). Incubar lm tubos a una temperatura entre 30º y 40º, mantenida ter-
mostáticamente dentro de ±0,5º, durante 16 a 24 horas.
Terminar el crecimiento calentando a una temperatura no inferior a 80º durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Después de agitar su contenido, colocar el tubo en un espectrofotómetro que se ha fijado a una longitud de onda de 530 nm
y leer la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se observa unos pocos segundos des-
pués de agitar, cuando la lectura se mantiene constante durante 30 segundos o más. Emplear aproximadamente el mismo
intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Si la diferencia es
mayor de 5% o si hay evidencia de contaminación con un microorganismo extraño, descartar los resultados de la valoración.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia de cada uno de los tubos restantes.
Descartar los resultados de la valoración si la pendiente de la curva estándar indica un problema de sensibilidad.
Cálculos-Preparar una curva estándar de concentración-respuesta según el siguiente procedimiento. Examinar los resulta-
dos para detectar y reemplazar cualquier valor de transmitancia aberrante. Para cada nivel del estándar, calcular la respuesta a
partir de la suma de los valores duplicados de las transmitancias (I) como la diferencia, y= 2,00 - I. Graficar esta respuesta en
la ordenada del papel cuadriculado, contra el logaritmo de los ml de Solución de Cianocobalamina Estándar por tubo en la
abscisa, usando para la ordenada una escala aritmética o logarítmica, la que produzca una mejor aproximación a una línea
recta. Trazar la línea recta o la curva continua que mejor se ajuste a los puntos graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparación de Valoración. Leer de la curva
estándar el logaritmo del volumen de la Preparación Estándar correspondiente a cada uno de esos valores de y que estén com-
prendidos en el intervalo entre el punto más bajo y más alto graficados para el estándar. Restar de cada logaritmo así obtenido
el logaritmo del volumen, en ml, de la Preparación de Valoración para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificación.
x
Promediar los valores de x para cada uno de tres o más niveles de dosis para obtener = M', el logaritmo de la potencia relati-
va de la Preparación de Valoración. Determinar la cantidad, en µg, de ER Cianocobalamina USP correspondiente a la cianocoba-
lamina en la porción de material tomada para la valoración con la ecuación antilog M = antilog (M' + log R), en donde R es el
número de µg de cianocobalamina que se supone presente en cada mg (o cápsula o tableta) del material tomado para la valo-
ración.
Repetición-Repetir toda la determinación al menos una vez, usando Preparaciones de Valoración preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08; su promedio, l\il, es el logaritmo de la poten-
cia resultado de la valoración del material de prueba (ver Valoración de la Actividad de la Vitamina 812 en Diseño y Análisis de
Valoraciones Biológicas (111 )). Si las dos determinaciones difieren en más de 0,08 hay que realizar una o más determinaciones
adicionales. Del promedio de dos o más valores de M que no difieren en más de O, 15 calcular la potencia media de la prepara-
ción valorada.

Pruebas y Valoraciones Químicas

PRUEBAS DE IDENTIF~CACIÓN

(181) IDENTIFICACIÓN-BASES ORGÁNICAS NITROGENADAS

INTRODUCCIÓN
El propósito de esta prueba es identificar los compuestos de aminas terciarias. Esta prueba espectroscópica tiene un grado limi-
tado de especificidad y, por lo tanto, se debe cumplir con todas las pruebas de identificación adicionales listadas en una
monografía particular para asegurar la identidad de la muestra en análisis.
VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Solución estándar: Disolver en un separador 50 mg del Estándar de Referencia USP correspondiente en 25 ml de ácido
clorhídrico 0,01 N.
Solución muestra: Dependiendo de la naturaleza de la muestra, disolver 50 mg de la sustancia a granel en análisis en
25 ml de ácido clorhídrico 0,01 N, o agitar una cantidad de tabletas reducidas a polvo o el contenido de las cápsulas, equi-
valente a 50 mg de la sustancia, con 25 ml de ácido clorhídrico 0,01 N durante 1 O minutos. Transferir el líquido a un sepa-
rador, filtrando si fuera necesario y lavando el filtro y el residuo con varias porciones pequeñas de agua.
 1 72 (181) Identificación/ Pruebas Químicas USP 37

Condiciones instrumentales
(Ver EspPctrofotomPtría y DispPrsión dP Luz (851 ).)
Modo: IR
Intervalo de longitud de onda: 7-15 pm (1430 cm 1 a 650 cm 1)
Celda: 1 mm
Blanco: Disulfuro de carbono
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Tratar cada solución según se indica a continuación: Agregar 2 mL de hidróxido de sodio 1 N y 4 mL de disulfuro de carbo-
no, y agitar durante 2 minutos. Si fuera necesario, centrifugar hasta que la fase inferior se torne transparente y pasarla a
través de un filtro seco, recogiendo el filtrado en un matraz pequeño con tapón de vidrio. Determinar inmediatamente el
espectro de absorción de la Solución estándar y la Solución muestra filtradas.
Criterios de aceptación: El espectro de la Solución muestra debe presentar todas las bandas de absorción significativas pre-
sentes en el espectro de la Solución estándar.

(191) IDENTIFICACIÓN-PRUEBAS GENERALES

Bajo este encabezado se describen las pruebas que se mencionan con frecuencia para identificar los artículos oficiales en la
Farmacopea. Antes de usar cualquier ácido o base para modificar el pH de la solución muestra, asegurarse de que la sustancia
agregada no interferirá con los resultados de la prueba. [NOTA-Estas pruebas no están destinadas a mezclas de sustancias, a
menos que se indique específicamente.]
Acetatos-Disolver aproximadamente 30 mg de la sustancia a examinar en 3 mL de agua o usar 3 mL de la solución pres-
crita. Ajustar el pH de la solución con hidróxido de sodio hasta alcalinizar levemente. Agregar 0,25 mL de nitrato de lantano
SR. Si se produce un precipitado blanco, filtrar la solución. Agregar sucesivamente O, 1 mL de yodo y yoduro de potasio SR 3 y
O, 1 mL de amoníaco SR 2 a la solución. Si no se observa un color azul, calentar cuidadosamente hasta ebullición. En presencia
de acetatos, se desarrolla un color oscuro o se produce un precipitado azul. Con soluciones neutras de acetatos, el cloruro
férrico SR produce un color rojo que se elimina con la adición de ácidos minerales.
Aluminio-Con hidróxido de amonio 6 N, las soluciones de sales de aluminio producen un precipitado blanco gelatinoso
que es insoluble en un exceso de hidróxido de amonio 6 N. El hidróxido de sodio 1 N o el sulfuro de sodio SR producen el
mismo precipitado, que se disuelve en un exceso de cualquiera de los reactivos mencionados.
Amonio-Agregar 0,2 g de óxido de magnesio a la solución en análisis. Pasar una corriente de aire a través de la mezcla y
dirigir el gas que escapa apenas por debajo de la superficie de una solución indicadora, preparada mezclando 1 mL de ácido
clorhídrico O, 1 M y 0,05 mL de rojo de metilo SR 2. En presencia de amonio, el color de la solución indicadora cambia a amari-
llo. Después de dirigir el gas hacia el interior de la solución indicadora durante un periodo suficiente, agregar a la solución
indicadora 1 mL de cobaltinitrito de sodio SR preparado recientemente. Con la adición de cobaltinitrito de sodio SR se produce
un precipitado amarillo en presencia de amonio.
Antimonio-Con el sulfuro de hidrógeno, las soluciones de compuestos de antimonio (111) fuertemente acidificadas con áci-
do clorhídrico producen un precipitado de sulfuro de antimonio de color anaranjado que es insoluble en hidróxido de amonio
6 N, pero que es soluble en sulfuro de amonio SR.
Bario-Las soluciones de sales de bario forman un precipitado blanco con ácido sulfúrico 2 N. Este precipitado es insoluble
en ácido clorhídrico y en ácido nítrico. Las sales de bario confieren un color verde amarillento a una llama no luminosa, que
parece de color azul cuando se la mira a través de un vidrio verde.
Benzoato-En soluciones neutras, los benzoatos forman un precipitado de color salmón con cloruro férrico SR. En solucio-
nes moderadamente concentradas, los benzoatos producen un precipitado de ácido benzoico al acidificarse con ácido sulfúri-
co 2 N. Este precipitado es fácilmente soluble en éter etílico.
Bicarbonato-Ver Carbonatos.
Bismutos-Cuando se disuelven en un ligero exceso de ácido nítrico o ácido clorhídrico, las sales de bismuto proporcionan
un precipitado blanco al diluirse con agua. Este precipitado se torna de color marrón en presencia de sulfuro de hidrógeno y el
compuesto resultante se disuelve en una mezcla tibia de partes iguales de ácido nítrico y agua.
Bisulfitos-Ver Sulfitos.
Boratos-Agregar 3 ó 4 gotas de yodo SR y 3 ó 4 gotas de solución de alcohol polivinílico (1 in 50) a 1 mL de una solución
de borato, acidificada con ácido clorhídrico al tornasol: se produce un color azul intenso. Cuando a un borato se le trata con
ácido sulfúrico, se le agrega metano! y se incinera la mezcla, arde con una llama de borde verde.
Bromuros-Las soluciones de bromuros, con la adición gota a gota de cloro SR, liberan bromo que se disuelve en clorofor-
mo por agitación y colorean el cloroformo de un color rojo a marrón rojizo. El nitrato de plata SR en soluciones de bromuro
produce un precipitado blanco-amarillento que es insoluble en ácido nítrico y poco soluble en hidróxido de amonio 6 N.
Calcio-Las soluciones de sales de calcio forman oxalatos insolubles cuando se tratan de la siguiente manera. Agregar
2 gotas de rojo de metilo SR a una solución de sal de calcio (1 en 20) y neutralizar con hidróxido de amonio 6 N. Agregar,
 USP 37 Pruebas Químicas/ (191) Identificación-Pruebas Generales 173

gota a gota, ácido clorhídrico 3 N hasta que la solución sea ácida frente al indicador. Las soluciones de sales de calcio forman
un precipitado blanco al aqreqar oxalato de amonio SR. Este precipitado es insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve en
ácido clorhídrico. Las sales de calcio humedecidas con ácido clorhídrico proporcionan un color rojo amarillento transitorio a
una llama no luminosa.
Carbonatos-Los carbonatos y bicarbonatos son efervescentes en ácidos, y desprenden un gas incoloro que, cuando se
hace pasar por hidróxido de calcio SR, produce inmediatamente un precipitado de color blanco. Una solución fría (1 en 20) de
un carbonato soluble se colorea de rojo con fenolftaleína SR, mientras que una solución similar de bicarbonato no se modifica
o sólo se colorea ligeramente.
Cinc-En presencia de acetato de sodio, las soluciones de sales de cinc forman un precipitado blanco con sulfuro de hidró-
geno. Este precipitado es insoluble en ácido acético, pero se disuelve con ácido clorhídrico 3 N. El sulfuro de amonio SR produ-
ce un precipitado similar en soluciones neutras y alcalinas. Con ferrocianuro de potasio SR, las sales de cinc en solución forman
un precipitado blanco que es insoluble en ácido clorhídrico 3 N.
Citratos--.A.gregiF algunos rng de sal de citrato disueltos o suspendidos en 1 mL de agua, a 15 mL de piridina, y agitar.
Agregar 5 mL de anhídrido acético a esta mezcla y agitar: se produce un color rojo claro.
Cloratos-Las soluciones de cloratos no producen un precipitado con nitrato de plata SR. La adición de ácido sulfuroso a
esta mezcla produce un precipitado blanco que es insoluble en ácido nítrico, pero que es soluble en hidróxido de amonio 6 N.
Al incinerarlos, los cloratos producen cloruros que se identifican mediante las pruebas correspondientes. Cuando se agrega áci-
do sulfúrico a un clorato seco, éste crepita y desprende un gas amarillo verdoso. [Precaución-Emplear sólo una pequeña canti-
dad de clorato para esta prueba y extremar las precauciones para realizarla.]
Cloruros-Con nitrato de plata SR, las soluciones de cloruros producen un precipitado blanco, grumoso, que es insoluble
en ácido nítrico pero soluble en un ligero exceso de hidróxido de amonio 6 N. Cuando se analizan clorhidratos de aminas (in-
cluidos los alcaloides) que no responden a la prueba anterior, agregar una gota de ácido nítrico diluido y 0,5 mL de nitrato de
plata SR a una solución de la sustancia que está siendo examinada que contenga, a menos que se indique algo diferente en la
monografía, aproximadamente 2 mg de ión cloruro en 2 mL: se forma un precipitado blanco, grumoso. Centrifugar la mezcla
sin demora y decantar la capa sobrenadante. Lavar el precipitado con tres porciones de 1 mL de solución de ácido nítrico (1 en
100) y desechar los lavados. Agregar amoníaco SR gota a gota a este precipitado. Se disuelve rápidamente. Cuando una mo-
nografía especifica que un artículo responde a la prueba para cloruros secos, mezclar el sólido que se va a analizar con un peso
igual de dióxido de manganeso, humedecer con ácido sulfúrico y calentar moderadamente la mezcla: se produce cloro, que es
reconocible por la producción de un color azul con papel de yoduro-almidón humedecido.
Cobalto-Las soluciones de sales de cobalto (1 en 20) en ácido clorhídrico 3 N producen un precipitado rojo cuando la
mezcla se calienta en un baño de vapor, con un volumen igual de una solución caliente, recién preparada, de l -nitroso-2-
naftol (1 en 1 O) en ácido acético 9 N. Las soluciones de sales de cobalto, cuando se saturan con cloruro de potasio y se tratan
con nitrito de potasio y ácido acético, producen un precipitado amarillo.
Cobre-Las soluciones de compuestos cúpricos acidificadas con ácido clorhídrico, depositan una película roja de cobre me-
tálico sobre una superficie de hierro brillante y no oxidado. Un exceso de hidróxido de amonio 6 N, agregado a una solución
de una sal cúprica, produce al principio un precipitado azulado y posteriormente una solución de color azul intenso. Las solu-
ciones de sales cúpricas con ferrocianuro de potasio SR producen un precipitado de color marrón rojizo insoluble en ácidos
diluidos.
Fosfatos-[NOTA-Cuando la monografía especifica la prueba de identificación de Fosfatos, utilizar las pruebas para ortofos-
fatos, a menos que las instrucciones especifiquen que se deben emplear las pruebas para pirofosfatos o que se debe incinerar
el producto antes de realizar la prueba.] Con nitrato de plata SR, las soluciones neutras de ortofosfatos producen un precipita-
do amarillo que es soluble en ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 .N. Con molibdato de amonio SR, las soluciones
acidificadas de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en hidróxido de amonio 6 N. Este precipitado
puede tardar en formarse. Con nitrato de plata SR, los pirofosfatos obtenidos por incineración producen un precipitado blanco
que es soluble en ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR se forma un precipitado ama-
rillo que es soluble en hidróxido de amonio 6 N.
Hierro-Los compuestos férricos y ferrosos en solución producen un precipitado negro con sulfuro de amonio SR. Este pre-
cipitado se disuelve en presencia de ácido clorhídrico 3 N frío con desprendimiento de sulfuro de hidrógeno.
Sales Férricas-Las soluciones ácidas de sales férricas producen un precipitado azul oscuro con ferrocianuro de potasio SR.
Con un exceso de hidróxido de sodio 1 N, se forma un precipitado marrón rojizo. Con tiocianato de amonio SR, las soluciones
de sales férricas producen un color rojo intenso que no se elimina con el agregado de ácidos minerales diluidos.
Sales Ferrosas-Las soluciones de sales ferrosas producen un precipitado azul oscuro con ferricianuro de potasio SR. Este pre-
cipitado es insoluble en ácido clorhídrico 3 N pero se descompone con hidróxido de sodio 1 N. Las soluciones de sales ferrosas
con hidróxido de sodio 1 N producen un precipitado blanco-verdoso que cambia de color rápidamente a verde y luego, cuan-
do se agita, se torna marrón.
Hipofosfitos-Cuando se los calienta enérgicamente, los hipofosfitos desprenden fosfina que es espontáneamente inflama-
ble. Los hipofosfitos en solución producen un precipitado blanco con cloruro mercúrico SR. Este precipitado se torna gris ante
la presencia de un exceso de hipofosfito. Las soluciones de hipofosfitos, acidificadas con ácido sulfúrico y calentadas con sulfa-
to cúprico SR, producen un precipitado rojo.
Lactatos-Cuando las soluciones de lactatos se acidifican con ácido sulfúrico, se les agrega permanganato de potasio SR y
se calienta la mezcla, desprenden acetaldehído. Éste se puede detectar al permitir que los vapores entren en contacto con un
 174 (191) Identificación-Pruebas Generales/ Pruebas Químícas USP 37

papel de filtro humedecido con una mezcla recién preparada de volúmenes iguales de solución acuosa de morfolina al 20% y
de nitroferricianuro de sodio SR: se produce un color azul.
Litio-Con carbonato de sodio SR, las sales de litio en soluciones moderadamente concentradas, alcalinizadas con hidróxi-
do de sodio, producen un precipitado blanco al llevarlas a ebullició11. El precipitado es soluble en cloruro de amonio SR. Las
sales de litio humedecidas con ácido clorhídrico proporcionan un color carmesí intenso a una llama no luminosa. Las solucio-
nes de sales de litio no precipitan en ácido sulfúrico 2 N o sulfatos solubles (a diferencia del estroncio).
Magnesio-Las soluciones de sales de magnesio en presencia de cloruro de amonio producen solamente un precipitado
ligeramente turbio cuando se neutralizan con carbonato de amonio SR, pero con la adición posterior de fosfato dibásico de
sodio SR producen un precipitado blanco cristalino, insoluble en hidróxido de amonio 6 N.
Manganeso-Con sulfuro de amonio SR, las soluciones de sales manganosas producen un precipitado color salmón que se
disuelve en ácido acético.
Mercurio-Cuando se aplican sobre una lámina de cobre brillante, las soluciones de sales de mercurio, exentas de un exce-
so de ácido nítrico, pr0d1icen un precipitarlo ri11e, a! tratarlo, ack1L1iere una apariencia plateada y brillante. Con sulfuro de hi-
drógeno, las soluciones de compuestos de mercurio producen un precipitado negro que es insoluble en sulfuro de amonio SR
y en ácido nítrico 2 N en ebullición.
Sales Mercúricas-Las soluciones de sales mercúricas producen un precipitado amarillo con hidróxido de sodio 1 N. En solu-
ciones neutras con yoduro de potasio SR, también producen un precipitado escarlata que es muy soluble en un exceso de
reactivo.
Sales Mercuriosos-Los compuestos mercuriosos se descomponen en hidróxido de sodio 1 N y producen un color negro.
Con ácido clorhídrico, las soluciones de sales mercuriosas producen un precipitado blanco que se ennegrece con hidróxido de
amonio 6 N. Con yoduro de potasio SR producen un precipitado amarillo que, al quedar en reposo, puede tornarse verde.
Nitratos-Cuando una solución de nitrato se mezcla con un volumen igual de ácido sulfúrico, se enfría la mezcla y se su-
perpone una solución de sulfato ferroso, se desarrolla un color marrón en la unión de los dos líquidos. Cuando se calienta un
nitrato con ácido sulfúrico y cobre metálico, se desprenden humos de color rojo amarronado. Los nitratos no decoloran el per-
manganato de potasio SR acidificado (a diferencia de los nitritos).
Nitritos-Cuando se los trata con ácidos minerales diluidos o con ácido acético 6 N, los nitritos desprenden humos de color
rojo-amarronado. Las soluciones colorean de azul el papel de almidón-yoduro.
Oxalatos-Las soluciones neutras y alcalinas de oxalatos forman un precipitado blanco con cloruro de calcio SR. Este preci-
pitado es insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve con ácido clorhídrico. Las soluciones de oxalatos acidificadas y calien-
tes decoloran el permanganato de potasio SR.
Permanganatos-Las soluciones de permanganatos acidificadas con ácido sulfúrico se decoloran con peróxido de hidróge-
no SR y con bisulfito de sodio SR en frío y con ácido oxálico SR en solución caliente.
Peróxidos-Las soluciones de peróxidos acidificadas ligeramente con ácido sulfúrico proporcionan un color azul intenso
con la adición de dicromato de potasio SR. Si la mezcla se agita con un volumen igual de éter etílico y se deja que se separen
los líquidos, el color azul se encuentra en la capa de éter etílico.
Plata-Con ácido clorhídrico, las soluciones de sales de plata producen un precipitado grumoso, blanco, que es insoluble
en ácido nítrico pero fácilmente soluble en hidróxido de amonio 6 N. Una solución de una sal de plata a la que se le agrega
hidróxido de amonio 6 N y una pequeña cantidad de formaldehído SR, al entibiarla, deposita un espejo de plata metálica en
las paredes del recipiente.
Plomo-Las soluciones de sales de plomo con ácido sulfúrico 2 N producen un precipitado blanco que es insoluble en áci-
do clorhídrico 3 N o en ácido nítrico 2 N, pero que es soluble en hidróxido de sodio 1 N tibio y en acetato de amonio SR. Con
cromato de potasio SR, las soluciones de sales de plomo, exentas o casi exentas. de ácidos minerales, producen un precipitado
amarillo que es insoluble en ácido acético 6 N pero que es soluble en hidróxido de sodio 1 N.
Potasio-Los compuestos de potasio confieren un color violeta a una llama no luminosa, pero la presencia de pequeñas
cantidades de sodio enmascara el color a menos que el color amarillo producido por el sodio se elimine con un filtro azul que
bloquee la emisión a 589 nm (sodio) pero que sea transparente a la emisión a 404 nm (potasio). Tradicionalmente se ha usado
vidrio cobalto, pero también hay otros filtros satisfactorios que están disponibles comercialmente. En soluciones neutras, con-
centradas o moderadamente concentradas, de sales de potasio (dependiendo de la solubilidad y del contenido de potasio), el
bitartrato de sodio SR produce un precipitado blanco cristalino que es soluble en hidróxido de amonio 6 N y en soluciones de
hidróxidos alcalinos y carbonatos alcalinos. La formación del precipitado, que usualmente es lenta, se acelera al agitar o frotar
el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. La adición de una pequeña cantidad de ácido acético glacial o alcohol
también favorece la precipitación.
Salicilatos-En soluciones moderadamente diluidas de salicilatos, el cloruro férrico SR produce un color violeta. La adición
de ácidos a soluciones moderadamente concentradas de salicilatos produce un precipitado blanco cristalino de ácido salicílico,
que se funde entre 158º y 161 º.
Sodio-A menos que se especifique algo diferente en una monografía individual, preparar una solución que contenga O, 1 g
del compuesto de sodio en 2 mL de agua. Agregar 2 mL de carbonato de potasio al 15% y calentar hasta ebullición. No se
forma precipitado. Agregar 4 mL de piroantimoniato de potasio SR y calentar hasta ebullición. Dejar que se enfríe en agua he-
lada y, si fuera necesario, frotar el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Se forma un precipitado denso. Los
compuestos de sodio confieren un intenso color amarillo a una llama no luminosa.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (193) ldentificación-Tetraciclinas 175

Sulfatos-Las soluciones de sulfatos con cloruro de bario SR producen un precipitado blanco que es insoluble en ácido clor-
hídrico y en ácido nítrico. Con acetato de plomo SR, las soluciones neutras de sulfatos forman un precipitado blanco que es
soluble en acetato de amonio SR. El ácido clorhídrico no produce precipitado cuando se agrega a las soluciones de sulfatos (a
diferencia de los tiosulfatos).
Sulfitos-Cuando se los trata con ácido clorhídrico 3 N, los sulfitos y bisulfitos desprenden dióxido de azufre que ennegrece
el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR.
Tartratos-Disolver algunos mg de sal de tartrato en 2 gotas de solución de metaperyodato de sodio (1 en 20). Agregar
1 gota de ácido sulfúrico 1 N y después de 5 minutos, agregar algunas gotas de ácido sulfuroso seguido de algunas gotas de
ácido sulfuroso-fucsina SR: se produce un color rosado rojizo dentro de los 15 minutos.
Tiocianatos-Con cloruro férrico SR, las soluciones de tiocianato producen un color rojo que no se elimina con ácidos mi-
nerales moderadamente concentrados.
Tiosulfatos-Con ácido clorhídrico, las soluciones de tiosulfatos producen un precipitado de color blanco que se torna
amarillo rápidamente y dióxido de azufre, que ennegrece el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR. La adición
de cloruro férrico SR a las soluciones de tiosulfatos produce un color violeta oscuro que desaparece rápidamente.
Yoduros-Las soluciones de yoduros, con la adición de cloro SR gota a gota, liberan yodo que colorea la solución de amari-
llo a rojo. Si esta solución se agita con cloroformo, éste se torna de color violeta. El yodo así liberado proporciona un color azul
con almidón SR. El nitrato de plata SR, en soluciones de yoduros, produce un precipitado amarillo grumoso, que es insoluble
en ácido nítrico y en hidróxido de amonio 6 N.

(193) IDENTIFICACIÓN-TETRACICLINAS

Los procedimientos cromatográficos descritos a continuación se suministran para confirmar la identidad de los fármacos de
la Farmacopea que son del tipo tetraciclina, como por ejemplo la doxiciclina, oxitetraciclina y tetraciclina, y para confirmar la
identidad de dichos compuestos en sus respectivas formas farmacéuticas de la Farmacopea. Se describen dos procedimientos,
uno basado en cromatografía en papel (Método /)y otro en cromatografía en capa delgada (Método 11). Utilizar el Método I a
menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.
Solución Estándar-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referen-
cia USP del fármaco que se quiere identificar en el mismo disolvente y con la misma concentración que los utilizados para la
Solución de Prueba.
Solución de Prueba-Preparar según se indica en la monografía individual correspondiente.

MÉTODO 1
Solución amortiguadora de pH 3,5 -Disolver 13,4 g de ácido cítrico anhidro y 16,3 g de fosfato di básico de sodio en
1000 mL de agua y mezclar.
Fase Móvil-El día de la prueba, mezclar 1O volúmenes de cloroformo, 20 volúmenes de nitrometano y 3 volúmenes de
piridina.
Solución de Prueba Mezclada-Mezclar volúmenes iguales de la Solución Estándar y de la Solución de Prueba.
Hoja Cromatográfica-Trazar una línea de aplicación a 2,5 cm de uno de los bordes de una hoja de papel de filtro, (What-
man No. 1, o equivalente) de 20 cm x 20 cm. Impregnar la hoja pasándola a través de una cuba con Solución amortiguadora de
pH 3,5, eliminar el exceso de disolvente presionando con firmeza la hoja entre papeles secantes no fluorescentes.
Procedimiento-En una cámara cromatográfica adecuada preparada para cromatografía ascendente (ver Cromatografía
(621 )), colocar Fase Móvil hasta una altura de 0,6 cm. Aplicar 2 ~tL de la Solución Estándar, 2 µL de la Solución de Prueba y 2 µL
de la Solución de Prueba Mezclada a intervalos de 1,5 cm sobre la línea de aplicación de la Hoja Cromatográfica. Dejar que la
hoja se seque parcialmente y, mientras aún esté húmeda, colocarla en la cámara cromatográfica con el borde inferior en con-
tacto con la Fase Móvil. Cuando el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente 1 O cm, retirar la hoja de la cámara
y exponerla a vapores de amoníaco. Examinar el cromatograma bajo luz UV de longitud de onda larga. Registrar las posiciones
de las manchas amarillas fluorescentes principales: el valor RF de la mancha principal obtenida a partir de la Solución de Prueba
y de la Solución de Prueba Mezclada se corresponde con el de la mancha obtenida de la Solución Estándar.

MÉTODO 11
Solución de Resolución-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución en
metanol que contenga 0,5 mg de ER Clorhidrato de Clortetraciclina USP, 0,5 mg de ER Hiclato de Doxiciclina USP, 0,5 mg de
ER Oxitetraciclina USP y 0,5 mg de ER Clorhidrato de Tetraciclina USP por ml.
Fase Móvil-Preparar una mezcla de ácido oxálico 0,5 M, previamente ajustado con hidróxido de amonio a un pH de 2,0,
acetonitrilo y metanol (80:20:20).
 176 (193) ldentificación-Tetraciclinas / Pruebas Químicas USP 37

Placa Cromatográfica-Utilizar una placa para cromatografía en capa delgada adecuada (ver Cromatografía en Capa Delga-
da en Cromatografía (621 )) recubierta con una capa de 0,25 mm de mezcla de gel de sílice octilsilanizada para cromatografía.
Activar la placa calentándola a 130º durante 20 minutos, dejar que se enfríe y utilizarla mientras aún esté tibia.
Procedimiento-Aplicar por separado 1 µL de la Solución Estándar, 1 ~tL de la Solución de Prueba y 1 µL de la Solución de
Resolución a la Placa para Cromatografía. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en la Fase Móvil
hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de
la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire. Exponer la placa a vapores de
amoníaco durante 5 minutos y localizar rápidamente las manchas en la placa observándola bajo luz UV de longitud de onda
larga: el cromatograma de la Solución de Resolución presenta manchas bien separadas y el valor RF, la intensidad y el aspecto de
la mancha principal obtenida de la Solución de Prueba se corresponden con los de la mancha obtenida de la Solución Estándar.

(197) PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

Las pruebas espectrofotométricas son las de mayor importancia en la identificación de muchas de las sustancias químicas del
compendio. Los procedimientos de prueba que se indican a continuación se aplican a sustancias que absorben radiación infra-
rroja (IR) y/o ultravioleta (UV) (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )).
El espectro de absorción IR de una sustancia, en comparación con el que se obtuvo concomitantemente para el Estándar de
Referencia USP correspondiente, proporciona quizá la evidencia más concluyente de la identidad de la sustancia, que puede
obtenerse en una sola prueba. El espectro de absorción UV, por otro lado, no presenta un alto grado de especificidad. La con-
formidad con las especificaciones de prueba referentes tanto para la absorción IR como con la absorción UV, según se indica
en una gran proporción de monografías oficiales, deja pocas dudas, si las hubiera, con respecto a la identidad de la muestra
que se está examinando.

ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO

Se indican siete métodos para la preparación de muestras de prueba y Estándares de Referencia previamente secados para el
análisis. La referencia (l 97K) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se mezcla íntimamente con
bromuro de potasio. La referencia (l 97M) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se muele fina-
mente y se dispersa en aceite mineral. La referencia (197F) en una monografía significa que la sustancia que se está examinan-
do se suspende pura entre placas adecuadas (por ejemplo, de cloruro de sodio o bromuro de potasio). La referencia (l 97S)
significa que se prepara una solución de concentración especificada en el disolvente especificado en la monografía individual, y
que la solución se examina en celdas de O, 1 mm, a menos que se especifique una longitud de paso diferente para las celdas en
la monografía individual. La referencia (197A) significa que la sustancia que se está examinando está en contacto íntimo con
un elemento de reflexión interna para el análisis de reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas en inglés). La referencia
(l 97E) significa que la sustancia que se está analizando se presiona como una muestra muy delgada contra una placa adecua-
da para el microanálisis IR. La referencia (l 97D) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se mezc-
la íntimamente con un material transparente para IR y se transfiere a un recipiente de muestra para análisis por reflexión difusa
(DR, por sus siglas en inglés). Las técnicas ATR (l 97A) y (l 97E) pueden usarse como métodos alternativos para (l 97K),
(l 97M), (l 97F) y (l 97S) cuando la prueba se realiza cualitativamente y los esp~ctros del Estándar de Referencia se obtienen de
manera similar.
Registrar los espectros de la muestra de prueba y el correspondiente Estándar de Referencia USP en el intervalo de aproxima-
damente 2,6 µm a 15 µm (3800 cm-1 a 650 cm-1) a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. El
espectro de absorción IR de la preparación obtenida a partir de la muestra de prueba, previamente secada bajo las condiciones
especificadas para el Estándar de Referencia correspondiente, a menos que se especifique algo diferente, o que el Estándar de
Referencia se emplee sin secar, presenta máximos sólo a las mismas longitudes de onda que el de una preparación similar del
Estándar de Referencia USP correspondiente.
Las diferencias que pueden observarse en los espectros así obtenidos a veces se atribuyen a la presencia de polimorfos, lo
cual no es siempre aceptable (ver Procedimiento en Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )). Por lo tanto, a menos que se
especifique algo diferente en la monografía individual, continuar del siguiente modo. Si aparece una diferencia en los espec-
tros IR del analito y del estándar, disolver porciones iguales de la muestra de prueba y del Estándar de Referencia en volúmenes
iguales de un disolvente apropiado, evaporar la solución hasta sequedad en envases similares, bajo condiciones idénticas, y
repetir la prueba con los residuos.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (201) Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada 1 77

ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA

La referencia (l 97U) en una monografía significa que una solución de prueba y una Solución estándar se examinan espectro-
fotométricamente, en celdas de 1 cm, sobre el intervalo espectral de 200 nm a 400 nm, a menos que se especifique algo dife-
rente en la monografía individual.
Disolver una porción de la sustancia que se está examinando en el Medio especificado para obtener una solución de prueba
que tenga la concentración especificada en la monografía para Solución. En forma similar, preparar una Solución Estándar que
contenga el Estándar de Referencia USP correspondiente.
Registrar y comparar los espectros obtenidos concomitantemente para la solución de prueba y la Solución Estándar. Calcular
los cocientes de absortividad y/o absorbancia si estos criterios están incluidos en una monografía individual. A menos que se
especifique algo diferente, las absorbancias indicadas para estos cálculos son aquellas medidas a la absorbancia máxima, apro-
ximadamente a la longitud de onda especificada en la monografía individual. Cuando la absorbancia se deba medir aproxima-
damente a la longitud de onda especificada en lugar de la máxima absorbancia, las abreviaturas (min) y (sh) se utilizan para
indicar un mínimo y un hombro (shoulder), respectivamente, en un espectro de absorción. Los requisitos se cumplen si los
espectros de absorción UV de la solución de prueba y de la Solución Estándar presentan máximos y mínimos a las mismas
longitudes de onda y los cocientes de absortividad y/o absorbancia están dentro de los límites especificados.

(201) PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA

DELGADA

PROCEDIMIENTO GENERAL

El procedimiento descrito a continuación tiene como fin verificar la identificación de muchos fármacos farmacopeicos y de
sus formas farmacéuticas correspondientes.
Preparar una solución de prueba según las indicaciones de la monografía individual correspondiente. En una placa para cro-
matografía en capa delgada adecuada, recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm (ver
Cromatografía (621 )), aplicar, en una línea paralela al borde y aproximadamente a 2 cm, 1O µL de esta solución y 1OµL de una
Solución estándar; preparada a partir del Estándar de Referencia USP del fármaco que se quiere identificar, en el mismo disol-
vente y a la misma concentración que para la solución de prueba, a menos que se especifique algo diferente en la monografía
individual. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma con una fase móvil constituida por una mezcla
de cloroformo, metano! y agua (180:15:1 ), a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, hasta que el
frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara de
desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que el disolvente se evapore. A menos que se especifique algo diferente en
la monografía individual, localizar las manchas de la placa examinándolas bajo luz UV de longitud de onda corta. El valor RF de
la mancha principal obtenida a partir de la solución de prueba se corresponde con el obtenido a partir de la Solución estándar.

PROCEDIMIENTO PARA BACITRACINA, NEOMICINA V POLIMIXINA B

El procedimiento de cromatografía en capa delgada descrito a continuación tiene como fin verificar la identificación de los
ingredientes activos bacitracina, neomicina y polimixina By en sus formas farmacéuticas cuando se encuentran presentes de
forma aislada o en mezclas de dos o tres componentes. La referencia (201 BNP) en una monografía indica que éste es el proce-
dimiento a seguir.
Preparar una Solución de Prueba según se indica a continuación, a menos que se especifique algo diferente en la monografía
individual.
Solución de Prueba-
PARA FÁRMACOS-Disolver una porción de Bacitracina, Bacitracina Cinc, Sulfato de Neomicina o Sulfato de Polimixina B en
ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL, 3,5 mg de neomici-
na (base) por mL, o 1O000 Unidades USP de Polimixina B por mL.
PARA SOLUCIONES-Si la Solución contiene neomicina y polimixina B, diluir una porción de solución con ácido clorhídrico O, 1
N para obtener una solución que contenga, aproximadamente, la cantidad equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por ml.
Si la Solución contiene polimixina B pero no neomicina, diluir una porción de solución con ácido clorhídrico O, 1 N para obte-
ner una solución que contenga aproximadamente 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml.
PARA CREMAS, LOCIONES Y UNGÜENTOS-Si la Crema, la Loción o el Ungüento contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, transferir
una porción que equivalga aproximadamente a 500 Unidades USP de Bacitracina a un tubo de centrífuga de 15 ml. Si la Cre-
ma, la Loción o el Ungüento contiene neomicina pero no contiene Bacitracina ni Bacitracina Cinc, transferir una porción que
equivalga aproximadamente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL a un tubo de centrífuga de 15 mL. Agregar 4 mL de cloro-
 1 78 (201 >Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada/ Pruebas Químicas USP 37

formo al tubo de centrífuga y agitar bien para dispersar la Crema, la Loción o el Ungüento. Agregar 1 mL de ácido clorhídrico
O, 1 N, mezclar en un mezclador por vórtice durante 4 minutos, centrifugar y usar el sobrenadante transparente.
NOTA-En el Procedimiento Modificado se puede usar la Solución de Prueba Modificada preparada según se indica a continua-
ción en lugar de la Solución de Prueba.
Solución de Bacitracina Estándar-Disolver una porción de ER Bacitracina Cinc USP en ácido clorhídrico O, 1 N para obte-
ner una solución que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL.
Solución de Neomicina Estándar-Disolver una porción de ER Sulfato de Neomicina USP en ácido clorhídrico O, 1 N para
obtener una solución que contenga el equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL.
Solución de Polimixina B Estándar-Disolver una porción de ER Sulfato de Polimixina B USP en ácido clorhídrico O, 1 N
para obtener una solución que contenga 1 O 000 Unidades USP de Polimixina B por mL. Si el artículo en análisis también con-
tiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, disolver una porción de ER Sulfato de Polimixina B USP en ácido clorhídrico O, 1 N para
obtener una solución que contenga 500} Unidades USP de Polimixina B por mL, donde j es el cociente entre las cantidades de
Unidades USP de Polimixina B y de Unidades USP de Bacitracina declaradas en la etiqueta por g de Crema, Loción o Ungüen-
to.
Fase Móvil-Preparar una mezcla de metanol, alcohol isopropílico, cloruro de metileno, hidróxido de amonio y agua
(4:2:2:2: 1,5).
Procedimiento-Aplicar 1 O ~tL de Solución de prueba y 1 O µL de cada una de las Soluciones Estándar que corresponda a una
placa para cromatografía en capa delgada adecuada (ver Cromatografía (621 )), recubierta con una capa de gel de sílice para
cromatografía de 0,25 mm de espesor. Colocar la placa en una cámara cromatográfica presaturada y desarrollar los cromato-
gramas con la Fase Móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la
placa. Retirar la placa de la cámara y secar a 105º durante 1O minutos. Rociar la placa con una solución al 0,2% de ninhidrina
en alcohol butílico y calentarla a 105º durante 5 minutos. El valor Rr de cada mancha principal en el cromatograma de la
Solución de Prueba se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solución Están-
dar que corresponda según el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta. Si el cromatograma de la Solución de Prueba
presenta demasiadas bandas, proceder según se indica en el Procedimiento Modificado.
Procedimiento Modificado-Transferir la Solución de Prueba a un tubo de centrífuga de 15 mL, agregar 1 O mL de solución
acuosa de ácido pícrico saturada (1,2%, p/v), mezclar en un mezclador por vórtice durante 1 minuto, centrifugar durante 1 O
minutos y desechar el sobrenadante. Lavar el residuo con porciones de agua de 1 mL hasta que no se observe color amarillo en
el lavado. Desechar los lavados y secar el residuo bajo una corriente de nitrógeno a 50º. Disolver el residuo en 1 mL de aceto-
na, agregar 1 mL de una solución de ácido sulfúrico en acetona (1 en 1 00) recién preparada, agitar, centrifugar durante 5 mi-
nutos y desechar el sobrenadante. Enjuagar el residuo con 1 ml de acetona, centrifugar brevemente y desechar el lavado. Re-
petir el lavado hasta que no se observe color amarillo. Secar el residuo bajo una corriente de nitrógeno a 50º. Disolver el resi-
duo en 0,5 ml de ácido clorhídrico O, 1 N (Solución de Prueba Modificada). Repetir el Procedimiento utilizando esta Solución de
Prueba Modificada en lugar de la Solución de Prueba. El valor Rr de cada mancha principal en el cromatograma de la Solución de
Prueba Modificada se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solución Están-
dar que corresponda según el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta.

PRUEBAS DE LÍMITE

(206) ALUMINIO

El objetivo de este procedimiento es demostrar que el contenido de aluminio (Al) no excede el límite establecido en la mo-
nografía individual de una sustancia cuya etiqueta indica que está destinada a ser usada en hemodiálisis. [NOTA-Las Prepara-
ciones Estándar y la Preparación de Prueba pueden modificarse, si fuera necesario, para obtener soluciones de concentraciones
adecuadas adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento.]
Diluyente de Ácido Nítrico-Transferir 40 mL de ácido nítrico a un matraz volumétrico de 1 000 mL y diluir a volumen con
agua.
Preparaciones Estándar-Tratar un alambre de aluminio con ácido clorhídrico 6 N a 80º durante algunos minutos. Disol-
ver aproximadamente 100 mg del alambre tratado, pesados con exactitud, en una mezcla de 1 O ml de ácido clorhídrico y
2 mL de ácido nítrico calentando aproximadamente a 80º durante aproximadamente 30 minutos. Continuar el calentamiento
hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 4 ml. Enfriar a temperatura ambiente y agregar 4 ml de agua. Evaporar
hasta aproximadamente 2 mL calentando. Enfriar y transferir esta solución, con ayuda de agua, a un matraz volumétrico de
1 00 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 10,0 mL de esta solución a un segundo matraz volumétrico de
100 ml, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 1,0 ml de esta solución a un tercer matraz volumétrico de 100 ml,
diluir a volumen con agua y mezclar. La concentración de aluminio en esta Preparación Estándar es aproximadamente 1,0 µg
por ml. Si se requiere una Preparación Estándar más diluida, transferir porciones de 1,0; 2,0 y 4,0 mL de esta solución a sendos
 USP 37 Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el derivado 1,6-anhidro 179

matraces volumétricos de 100 mL, diluir a volumen con Diluyente de Ácido Nítrico y mezclar. Estas soluciones contienen
0,01 µg; 0,02 ~tg y 0,04 µg de Al por mL, respectivamente.
Preparación de Prueba-A menos que se indique algo diferente en la monografía correspondiente, transferir una cantidad
de la sustancia de prueba pesada con exactitud (en g), según se indica en la monografía, a un matraz volumétrico de plástico
de 100 mL, agregar 50 mL de agua y someter a ultrasonido durante 30 minutos. Agregar 4 mL de ácido nítrico, diluir a volu-
men con agua y mezclar.
Procedimiento-Determinar las absorbancias de las Preparaciones Estándar y de la Preparación de Prueba en la línea de emi-
sión del aluminio a 309,3 nm, con un espectrofotómetro de absorción atómica adecuado (ver Espectrofotometría y Dispersión
de Luz (851 )), equipado con una lámpara de aluminio de cátodo hueco y un horno eléctrico sin llama, empleando Diluyente de
Ácido Nítrico como blanco. Graficar las absorbancias de las Preparaciones Estándar en función del contenido de Al, en µg por
mL y trazar la línea recta que mejor se ajuste a los tres puntos graficados. A partir del gráfico así obtenido, determinar la canti-
dad, en µg, de Al en cada mL de la Preparación de Prueba. Calcular la cantidad de Al en la muestra tomada, en µg por g,
multiplicando este valor por 100/W, donde W es el peso, en g, de la sustancia tomada para preparar la Preparación de Prueba.

(207) PRUEBA PARA EL DERIVADO 1,6-ANHIDRO DE ENOXAPARINA

SÓDICA

El siguiente procedimiento se usa para determinar los niveles de las formas 1,6-anhidro en la enoxaparina sódica. [NOTA-La
prueba para el derivado 1,6-anhidro sólo se realiza cuando se especifica en la monografía individual.]

INTRODUCCIÓN

Los disacáridos especificados en este capítulo general se listan por nombre y estructura en el Apéndice 7; los oligosacáridos se
listan en el Apéndice 2.
La despolimerización de la heparina hasta enoxaparina sódica produce una conversión parcial pero característica de glucosa-
minas en las terminales reductoras de las cadenas de oligosacáridos con glucosamina 6-0 sulfato terminal, produciendo deriva-
dos 1,6-anhidro (ver Figura 7).

ºf~h,[º{~,h,jº{~~ Yº"
HO OR 1 HO /H
R2
HO OR1 R,O /H
R2 n
HO OR1 HO /H
R2

o --{º
CH,

n=Oa20

Figura 1. Estructura de la enoxaparina sódica que contiene un derivado 1,6-anhidro en el extremo reductor de la cadena.

El porcentaje de cadenas de oligosacáridos que se encuentran cíclicos en un anillo 1,6-anhidro es una característica de la
enoxaparina sódica.

DESPOLIMERIZACIÓN DE ENOXAPARINA SÓDICA POR LAS HEPARINASAS Y

OLIGOSACÁRIDOS RESULTANTES

La valoración involucra un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) de una solu-
ción de enoxaparina sódica despolimerizada por una mezcla de heparinasas. Después de la despolimerización enzimática, los
residuos 1,6-anhidro principales de la enoxaparina sódica observados son el 1,6-anhidro AllS, el 1,6-anhidro AllS•Pi, el 1,6-anhi-
dro AIS y el 1,6-anhidro AIS-IS•Pi (ver Apéndice 2).
Las heparinasas no escinden completamente el tetrasacárido 1,6-anhidro AIS-IS•Pi (forma de manosamina 2-0-sulfatada). Los
dos disacáridos (el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi), que generalmente coeluyen, tienen mala resolución comparados
con AllA (ver Apéndice 7), especialmente porque este último se presenta como dos anómeros: a y /J. Para poder cuantificar el
1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi, la muestra de enoxaparina sódica ya despolimerizada por las heparinasas se reduce
con borohidruro de sodio (ver Figura 2).
 180 (207) Prueba para el derivado 1,6-anhidro / Pruebas Químicas USP 37

RO '-.../"
OH

' y
OH

y
O

u 'H R:O "-..../' '

OH

......__,,.....
OH

. '/ - 'OH

Figura 2. Reducción de oligosacáridos con borohidruro de sodio

La reducción con borohidruro de sodio elimina el efecto anomérico a B fJ al abrir el anillo del oligosacárido terminal. Los
cuatro derivados 1,6-anhidro (ver Apéndice 2) no se reducen con el borohidruro de sodio porque el puente 1,6-anhidro blo-
quea la apertura del anillo. La reducción de los oligosacáridos disminuye su tiempo de retención, mientras que el tiempo de
retención de los derivados 1,6-anhidro permanece inmutable. Por esa razón, es posible separar los dos compuestos, el 1,6-an-
hidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi, del pico del disacárido AllA reducido. [NOTA-El 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllS•Pi
eluyen como dos picos sin resolver y se cuantifican juntos como un solo compuesto, el 1,6-anhidro AllS. Por lo tanto, con el
objeto de simplificar, la forma epimérica no se menciona en adelante.]

PROCEDIMIENTO

Estándares de Referencia USP (11 )-ER Enoxaparina Sódica USP.

Soluciones-
Solución A-Disolver 0,280 g de fosfato monobásico de sodio en 950 mL de agua, ajustar con ácido fosfórico a un pH de 3,0
y diluir con agua a 1000 ml.
Solución 8-Disolver 140 g de perclorato de sodio en 950 mL de Solución A, ajustar con ácido fosfórico a un pH de 3,0 y
diluir con Solución A a 1000 ml.
Fase Móvil-Usar mezclas variables de Solución A y Solución B, filtradas y desgasificadas, según se indica en el Sistema Croma-
tográfico.
Solución de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0-Disolver 1O mg de albúmina sérica bovina y 32 mg de acetato de calcio en
60 mL de agua. Agregar 580 µL de ácido acético glacial y ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,0. Transferir a un
matraz volumétrico de 100 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro con un tamaño de poro de
0,45 µm o 0,22 µm.
Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7, O-Disolver 68 mg de fosfato monobásico de potasio y 1O mg de albú-
mina sérica bovina en 30 mL de agua en un matraz volumétrico de 50 ml. Ajustar con hidróxido de potasio, si fuera necesario,
a un pH de 7,0 y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm o 0,22
µm.
Solución de Borohidruro de Sodio-Disolver 12 mg de borohidruro de sodio en 400 µL de agua y mezclar en un mezclador
por vórtice. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de usar.]
Solución de Heparinasa 7-Disolver heparinasa 1 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [refe-
rencia: heparina liasa 1, EC 4.2.2.7] en Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solución con
una actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso. [NOTA-Las soluciones de heparina-
sa se pueden almacenar durante 3 meses a -20º.]
Solución de Heparinasa 2-Disolver heparinasa 2 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones [sin
número EC] en Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solución con una actividad de 0,4 UI
por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso.
Solución de Heparinasa 3-Disolver heparinasa 3 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [refe-
rencia: heparitinasa 1, EC 4.2.2.8] en Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solución con una
actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso.
Solución de Heparinasas 7, 2 y 3-Preparar una mezcla 1 :1 :1 (v:v:v) de Solución de Heparinasa 7, Solución de Heparinasa 2 y
Solución de Heparinasa 3.
Soluciones para Identificación de los Picos-[NOTA-Las soluciones de prueba y las Soluciones estándar despolimerizadas
se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones de prueba despolimerizadas son estables durante 1 mes a -20º. Igualmen-
te, las soluciones de prueba y las Soluciones estándar reducidas se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones reducidas
también son estables durante 1 mes a -20º.]
Soluciones de Disacáridos-Preparar por separado una solución con 0,25 mg por mL de cada disacárido 1 AIA, AllA, AlllA,
AIVA, AIS, AllS, AlllS, AIVS (ver Apéndice 7). Inyectar en el cromatógrafo cada solución de disacárido y registrar el cromatogra-
ma.
Soluciones de Disacáridos Reducidos-A 60 µL de cada Solución de Disacárido, agregar 1O µL de Solución de Borohidruro de So-
dio recién preparada. Mezclar en un mezclador por vórtice y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4 ho-
ras. Inyectar en el cromatógrafo cada solución y registrar el cromatograma.
Solución Blanco-Preparar una mezcla de 20 µL de agua, 70 µL de Solución de Acetato de Calcio y Sodio de pH 1, Oy 100 µL de
la Solución de Heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversión y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un baño

1Se pueden obtener disacáridos adecuados de Grampian Enzymes (GE-Hl 001, GE-Gl 002, GE-Hl 003, GE-Hl 004, GE-Hl 005, GE-Hl 006, GE-Hl 007, GE-Hl 008),
Nisthouse, Harray, Orkney, KW1 7 2LQ, Reino Unido, Tel: 01856 771 771, Scottish Local Authority: Orkney lslands.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el derivado 1,6-anhidro 181

de agua a 25º. Preparar una mezcla de 60 µL de esta solución despolimerizada con 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio
recién preparada. Homogeneizar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4 horas. Inyectar en el cromató-
grafo la solución resultante y registrar el cromatograma.
Solución de Prueba 7-Preparar dos soluciones, cada una con 20 mg de enoxaparina sódica en 1 mL de agua.
Solución Estándar 7-Preparar una solución que contenga 20 mg de ER Enoxaparina Sódica USP en 1 mL de agua.
Solución de Prueba 2-Para cada solución, preparar una mezcla de 20 µL de Solución de Prueba 7, 70 µL de Solución de Aceta-
to de Calcio y Sodio de pH 7,0 y 100 µL de la Solución de Heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversión y dejar en
reposo durante al menos 48 horas en un baño de agua a 25º. Después de 48 horas de despolimerización, inyectar en el cro-
matógrafo la solución y registrar el cromatograma.
Solución Estándar 2- Preparar una mezcla de 20 µL de Solución Estándar 7, 70 µL de Solución de Acetato de Calcio y Sodio de
pH 7,0 y 100 µL de la Solución de Heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un
baño de agua a 25º. Después de 48 horas de despolimerización, inyectar en el cromatógrafo la solución y registrar el cromato-
grama.
Solución de Prueba 3-Para cada solución de prueba despolimerizada, preparar una mezcla de 60 µL de Solución de Prueba 2
y 1OµL de Solución de Borohidruro de Sodio recién preparada. Homogeneizar y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatu-
ra ambiente durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatógrafo. La Solución de Prueba 3 es estable durante 48
horas a temperatura ambiente.
Solución Estándar 3-Preparar una mezcla de 60 µL de Solución Estándar 2 y 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio recién
preparada. Homogeneizar, mezclar en un mezclador por vórtice y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatura ambiente
durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatógrafo. La Solución Estándar 3 es estable durante 48 horas a tempe-
ratura ambiente.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector a 234 nm y una
columna de 3 mm x 25 cm rellena con material L14 de 5 µm de. Se debe usar también una guarda columna rellena con el
mismo material. La velocidad de flujo es de 0,45 mL por minuto, la temperatura de la columna se mantiene a 50º y el volumen
de inyección es 1O µL. Programar el cromatógrafo del siguiente modo.

Tiempo
(minutos) Solución A(%) Solución 8 (%) Elución
0-20 97~65 3~35 gradiente lineal
20-50 65~0 35~100 gradiente lineal
50-60 o 100 isocrática
60-61 0~97 100~3 gradiente lineal para reequilibrio
61-79 97 3 isocrática para reequilibrio

Inyectar en el cromatógrafo la Solución de Prueba 3 reducida y la Solución Estándar 3 reducida y registrar el cromatograma se-
gún se indica en el Procedimiento.
Prueba de Aptitud de la Despolimerización-f.I cociente de área entre los picos de 1,6-anhidro-AIS-IS y 1,6-anhidro AIS no es
mayor de 1, 15 para la Solución Estándar 2 despolimerizada.
Prueba de Aptitud del Desempeño de la Columna-Identificar los picos correspondientes al AIA reducido y al 1,6-anhidro-AIS
para la Solución Estándar 3: el tiempo de retención del AIS reducido está entre 27 y 33 minutos para la Solución Estándar 3
despolimerizada y reducida; y la resolución, R, entre el A1A reducido y el 1,6-anhidro-AIS no es menor de 1,5.
Prueba de Aptitud de la Reducción-El cociente de área entre los picos de disacárido AIS y AIS reducido en la Solución Están-
dar 3 despolimerizada y reducida y la Solución de Prueba 3 no es más de 0,02%.
Procedimiento y Cálculos-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales de la Solución de Prueba 3 reducida y
de la Solución Estándar 3 reducida. Usar el método de porcentaje de área normalizada para el cálculo. Los picos se integran
desde el pico de volumen muerto hasta el último pico detectado. Medir el área del pico de cada analito excluyendo los picos
de los disolventes al comienzo del cromatograma y en la Solución Blanco. Usando los cromatogramas de las Soluciones de Disa-
cáridos Reducidos obtenidos previamente, identificar los picos pertenecientes a los ocho disacáridos reducidos en los cromato-
gramas de la Solución de Prueba 3 y la Solución Estándar 3. Los picos pertenecientes al 1,6-Anhidro AIS, 1,6-Anhidro AllS y
1,6-Anhidro AIS-ISepi se identifican a partir de los tiempos de retención relativos proporcionados en la Tabla 7 y del Cromato-
grama de referencia proporcionado con el ER Enoxaparina Sódica USP. Una vez identificados los picos, utilizar los valores en la
Tabla 7 para calcular el porcentaje (p/p) de los tres principales derivados 1,6-anhidro, obtenidos después de la despolimeriza-
ción de la enoxaparina sódica, usando la siguiente fórmula:
% 1,6-anhidro i (p/p) = (100 x MW; x A¡)/ L:(MWx x AJ

en donde MW; y A; son el peso molecular y el área del pico i del 1,6-anhidro, respectivamente; y MWx y Ax son el peso molecu-
lar y el área, respectivamente, del pico X o de la zona X especificados por su tiempo de retención. [NOTA-Una vez establecido
el método, los picos pertenecientes a los diferentes disacáridos y tetrasacáridos se pueden identificar fácilmente por medio del
cromatograma del ER Enoxaparina Sódica USP. Por lo tanto, el uso de los Estándares de disacáridos sólo es necesario durante la
etapa de implementación del método.]
182 (207) Prueba para el derivado 1,6-anhidro / Pruebas Químicas USP 37

Calcular el porcentaje molar de los componentes que contienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su
cadena en la muestra de prueba de enoxaparina sódica de acuerdo con la siguiente fórmula:
• . MW
%1,6anh1dro =100. IMw, xArea,
¡Areal11s1,6anhidro 1 Areal111s1,6anhidro 1 Areal11s ls1,6anhidro)

en donde MW es el peso molecular promedio en peso (ver prueba de Identificación D en Enoxaparina Sódica); MWx y Área, son
el peso molecular y el área, respectivamente, del pico X o del intervalo X, especificados por su tiempo de retención. El porcen-
taje molar de los componentes que tienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su cadena está entre 15% y
25%. En la Tabla 7 se proporcionan los tiempos de retención y las masas moleculares típicos atribuidos a las diferentes estruc-
turas de oligosacáridos.
Tabla 1. Tiempos de Retención Relativos (tRR) y Masas Moleculares Típicos Atribuidos a los Diferentes Compuestos*
Masa
Molecular
Compuesto t •• (daltones)
- < 0,25 741
AIVA reducido 0,25 401
- 0,25 <t•• < 0,51 741
AIVS reducido 0,51 461
0,51 < t•• < 0,55 483
AllA reducido 0,55 503
- 0,55 < t•• < 0,59 503
1,6-Anhidro AllS 0,59 443
- 0,59 < t•• < 0,64 503
AlllA reducido 0,64 503
- 0,64 < tRR < 0,72 533
AllS reducido 0,72 563
- 0,72 < t•• < 0,80 563
AlllS reducido 0,80 563
- 0,80 < t•• < 0,88 583
AIA reducido 0,88 605
- 0,88 < t•• < 0,90 635
1,6-Anhidro AIS 0,90 545
- 0,90 <t•• < 0,98 635
AllA-IVSglu reducido 0,98 1066
- 0,98< t•• < 1,00 635
AIS reducido 1,00 665
- 1,00< t•• < 1,04 665
AIS 1,04 665
- 1,04< t•• < 1,10 1228
AllA-!l29llJ. reducido 1,10 1168
- 1,10< t•• < 1,27 1228
1,6-Anhidro AIS-IS 1,27 1210
- t•• > 1,27 1228
* Los tiempos de retención relativos se obtuvieron con una partida de enoxaparina sódica despolimerizada y reducida. Se expresan con respecto al tiempo de
retención del pico principal correspondiente al 1115 reducido. Se debe tener en cuenta que los tiempos de retención relativos pueden variar un poco, dependien-
do de la calidad de la columna.
USP 37 Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el derivado 1,6-anhidro 183

APÉNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACÁRIDOS ESTÁNDARES

'llVA ,\LJA-(1--->4)u-GlcNAc

AIVS AUA-(1--->4)a-GlcN(NS)

ºi~f; .
HO OH HO NH
º:::::/
O 'o Na+

AllA AUA-(1--->4)a-GlcNAc(6S)

AlllA AUA-2S-(1--->4)a-GlcNAc

ºP-b-00
HO
O~/
OHO

o-:/\_
O Na+
o
=(NH

CH3

AllS AUA-(1--->4)a-GlcN (NS,65)

AlllS AUA-2S-(1--->4)a-GlcN (NS)

AIA AUA-2S-(1--->4)a-GlcNAc(6S)

AIS UA-2S-(1--->4)a-GlcN (NS,65)

 1

184 (207) Prueba para el derivado 1,6-anhidro / Pruebas Químicas USP 37

APÉNDICE 2: ESTRUCTURAS DE OLIGOSACÁRIDOS

1,6-Anhidro Al5 o
1,6-Anhidro 1115 glucosa

1,6-Anhidro 11115 o
1,6-Anhidro 11115 glucosa

1,6-Anhidro 11115 epi o

1,6-Anhidro 11115 manosa

1111A-IV5glu

1,6-Anhidro 1115-15 epi

o
1,6-Anhidro 1115-15 manosa
 USP 37 Pruebas Químicas/ (208) Valoración de Actividad Anti-Factor 185

(208) VALORACIÓN DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR

lla PARA HEPARINAS NO FRACCIONADAS Y DE BAJO PESO
MOLECULAR

Este capítulo provee información y procedimientos para determinar la actividad inhibitoria del factor Xa y la actividad inhibi-
toria del factor lla (trombina) de las heparinas no fraccionadas (HNF) y heparinas de bajo peso molecular (HBPM).

INTRODUCCIÓN

Las heparinas no fraccionadas y las heparinas de bajo peso molecular ejercen su efecto anticoagulante mediante la potencia-
ción de la actividad de los inhibidores de coagulación del plasma. De todos los glicosaminoglicanos comúnmente conocidos,
sólo las HNF, las HBPM y el heparán sulfato (referidos en lo sucesivo como heparina) contienen una secuencia de pentasacári-
dos específica que puede unirse al inhibidor de coagulación del plasma, la antitrombina (AT). Por lo tanto, se desarrollan valo-
raciones que dependen de la AT para asegurar la especificidad de los métodos para medir la actividad anticoagulante de la
heparina. La unión de la heparina con la AT provoca un cambio de conformación en la molécula de AT. Este cambio de confor-
mación incrementa la unión del complejo AT-heparina con los factores activados de coagulación, principalmente el factor lla
(trombina) y el factor Xa, causando su inhibición. Una vez que la AT ha sido activada por la secuencia de pentasacáridos de la
heparina, ésta interactúa con los factores Xa y lla mediante su bucle central reactivo. Para conseguir una inhibición eficiente de
trombina, la molécula de heparina también debe unirse a la antritombina y al factor lla. Dicha interacción requiere un segmen-
to extra de aproximadamente 13 monosacáridos, acoplados al extremo no reductor de la secuencia de pentasacáridos de la
heparina, que se une a la AT. Este segmento mínimo de la molécula de heparina necesario para inhibir la trombina con AT,
conocido como dominio C, tiene un peso molecular aproximado de 5400 Da. Aunque la potenciación de la capacidad de la
antitrombina para inactivar el factor Xa también depende del peso molecular, las unidades adicionales de sacáridos del domi-
nio C no son esenciales, y una heparina con un peso molecular menor de 5400 Da puede potenciar la capacidad de la anti-
trombina para inactivar el factor Xa. Por convención, el cociente de potencia entre el anti-factor Xa y el anti-factor lla para
HNF es 1. La HNF es heterogénea y polidispersa, pero contiene poco o ningún material con un peso molecular menor de 5400
Da. Los pesos moleculares promedio de los productos de HBPM son menores que aquéllos de las HNF, y contienen una pro-
porción mayor de material de peso molecular menor de 5400 Da. El cociente entre las potencias de anti-factor Xa y anti-factor
lla para HBPM es mayor que 1,5. Este capítulo describe procedimientos de valoración para medir la actividad anti-factor Xa y
anti-factor lla de las HBPM en presencia de AT.
En el sistema de prueba, la heparina se une a la AT, y el factor lla o el factor Xa agregado a la mezcla se une al complejo de
heparina-AT. El factor lla o factor Xa residual no inhibido por el complejo de heparina-AT se cuantifica mediante un sustrato
cromogénico que es específico para el factor lla o el factor Xa y se agrega en la etapa final. Los analistas observan una relación
inversa en la que una mayor cantidad de enzima residual produce más color, lo cual equivale a una menor actividad de hepari-
na.
Al igual que con cualquier valoración enzimática, la temperatura y el tiempo de la reacción, el manejo adecuado de los reac-
tivos y su orden de adición representan aspectos críticos para el desempeño óptimo de la valoración.

VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR Ha PARA HEPARINAS NO

FRACCIONADAS

Actividad Anti-Factor Xa para HNF

El siguiente procedimiento se usará siempre que se especifique en las monografías individuales. Esta valoración se puede lle-
var a cabo manualmente en tubos de plástico usando un bloque termostático o un baño de agua termostatizado. Un equipo
para placa de microtitulación con un lector y un coagulómetro automático pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimien-
to.
Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver cantidades de tris(hidroximetil)aminometano, ácido edético o edetato sódi-
co y cloruro de sodio en agua que contenga O, 1% de polietilenglicol 6000 para obtener soluciones con concentraciones 0,050
M, 0,0075 M y O, 175 M, respectivamente. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico o solución de hidróxido de sodio a
un pH de 8,4.
Solución de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de
Reactivos) según lo indicado por el fabricante y diluir esta solución con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una
solución con una concentración de 1,0 UI de Antitrombina/ml.
Solución de factor Xa: Reconstituir factor Xa bovino según lo indicado por el fabricante (ver Factor Xa en Reactivos, Indi-
cadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución
que proporcione un valor de absorbancia de 0,65-1,25 a 405 nm cuando se valora según se indica a continuación, pero usan-
do 30 µL de Solución amortiguadora de pH 8,4 en lugar de 30 µL de las Soluciones estándar o de las Soluciones muestra. [NOTA-
 •
186 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor / Pruebas Químicas USP 37

La Solución de factor Xa contiene aproximadamente 3 unidades nanocatalíticas/mL, pero puede variar dependiendo del fabri-
cante del factor Xa o del sustrato usado.]
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para la prueba amidolí-
tica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) específico para factor Xa en agua para obtener una
concentración 1 mM.
Solución de detención: Solución de ácido acético al 20% (v/v)
Soluciones estándar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sódica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos 5 diluciones en el intervalo de concentración de
0,03-0,375 Unidades USP de Heparina/ml.
Soluciones muestra: Disolver o diluir una cantidad medida con exactitud de Heparina Sódica en Solución amortiguadora
de pH 8,4 y diluir con la misma solución amortiguadora hasta obtener soluciones con actividades aproximadamente iguales a
las de las Soluciones estándar.
Análisis: [NOTA-El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas. Realizar la prueba con cada
Solución estándar y Solución muestra por duplicado.]
Transferir 120 ~tL de Solución amortiguadora de pH 8,4 a cada una de las series de tubos de plástico adecuados colocados en
un baño de agua ajustado a 37°. Luego, transferir por separado 30 µL de las diferentes diluciones de las Soluciones estándar o
de las Soluciones muestra a los tubos. Agregar 150 µL de Solución de antitrombina, entibiada previamente a 37° durante 15 mi-
nutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 µL de Solución de factor Xa, entibiada previamente a 37º
durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 µL de Solución de sustrato cromogénico,
entibiada previamente a 37° durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante exactamente 2 minutos. Agregar
150 µL de Solución de detención a cada tubo y mezclar. Preparar un blanco para ajustar a cero el espectrofotómetro, agregando
los reactivos en el orden inverso, comenzando con la Solución de detención y finalizando con la adición de 150 µL de Solución
amortiguadora de pH 8,4, y omitiendo las Soluciones estándar o las Soluciones muestra. Registrar la absorbancia a 405 nm contra
el blanco. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las
proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Cálculos: Graficar el logaritmo de los valores de absorbancia de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestra en fun-
ción de las concentraciones de heparina, en Unidades USP. Calcular la actividad de heparina sódica, en Unidades USP/mg,
usando métodos estadísticos para análisis de razón de pendientes. Calcular la actividad antifactor Xa de la heparina sódica:

A x (Sri S5)

A = potencia del ER Heparina Sódica para Valoraciones USP

Sr= pendiente de la recta de las Soluciones muestra
S5 = pendiente de la recta de las Soluciones estándar
Expresar la actividad anti-factor Xa de la Solución muestra como Unidades USP de Heparina/mg, calculada con respecto a la
sustancia seca. Calcular el cociente de la actividad anti-factor Xa en función de la potencia anti-factor lla (ver la Valoración a
continuación):

actividad anti-factor Xa/potencia anti-factor lla

Criterios de aceptación: 0, 9-1, 1

Actividad Anti-Factor tia para Heparinas No Fraccionadas

Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver 6, 1 Og de tris(hidroximetil)aminometano, 10,20 g de cloruro de sodio,

2,80 g de edetato sódico y, si fuera adecuado, 0-10,00 g de polietilenglicol 6000 y/o 2,00 g de albúmina sérica bovina en
800 mL de agua. [NOTA-Se pueden usar 2,00 g de albúmina humana en lugar de 2,00 g albúmina sérica bovina.] Ajustar con
ácido clorhídrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
Solución de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de
Reactivos) en agua para obtener una solución de 5 UI de Antitirombina/ml. Diluir esta solución con Solución amortiguadora de
pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de O, 125 UI de Antitrombina/ml.
Solución de trombina humana: Reconstituir trombina humana (factor lla) (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especi-
ficaciones de Reactivos) en agua para obtener una solución de 20 UI de Trombina/mL y diluir con Solución amortiguadora de pH
8,4 hasta obtener una solución con una concentración de 5 UI de Trombina/ml. [NOTA-La trombina debe tener una activi-
dad específica de no menos de 750 Ul/mg.]
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico de trombina adecuado para prue-
ba amidolítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una concentración
1,25 mM.
Solución de detención: Solución de ácido acético al 20% (v/v)
Soluciones estándar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sódica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos cuatro diluciones en el intervalo de concentración
de 0,005-0,03 Unidades USP de Heparina/ml.
 USP 37 Pruebas Químicas / (208) Valoración de Actividad Anti-Factor 187

Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de Heparina Sódica
similares a las obtenidas para las Soluciones estándar.
Análisis: [NOTA-El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas.] Para cada una de las dilu-
ciones de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestra, se deben analizar al menos muestras por duplicado. Etiquetar un
número adecuado de tubos dependiendo del número de determinaciones repetidas a analizar. Por ejemplo, si se van a usar
cinco blancos: Bl, B2, B3, B4 y B5 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las
Soluciones muestra; y Sl, S2, S3 y S4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las Soluciones estándar. Distribuir
los blancos sobre las series de manera que representen exactamente el comportamiento de los reactivos durante los experi-
mentos. [NOTA-Tratar los tubos en el siguiente orden: Bl, Sl, S2, S3, S4, B2, Tl, T2, T3, T4, B3, Tl, T2, T3, T4, B4, Sl, S2,
S3, S4, B5.] Cabe destacar que después de cada adición de un reactivo, la mezcla de incubación se debe mezclar evitando la
formación de burbujas. Agregar el doble del volumen (100-200 µL) de Solución de antitrombina a cada tubo que contenga un
volumen (50-100 µL) de Solución amortiguadora de pH 8,4 o de una dilución apropiada de las Soluciones muestra o de las Solu-
ciones estándar. Mezclar evitando la formación de burbujas. Incubar a 37° durante al menos 1 minuto. Agregar a cada tubo
25-50 µL de Solución de trombina humana e incubar durante al menos 1 minuto. Agregar 50-100 µL de Solución de sustrato
cromogénico. Es importante destacar que todos los reactivos, Soluciones estándar y Soluciones muestra deben entibiarse previa-
mente a 37º justo antes de su uso. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la
valoración, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se manten-
gan iguales.
Se pueden registrar dos tipos de mediciones diferentes:
1. Medición del Punto Final: Detener la reacción después de al menos 1 minuto con 50-100 µL de Solución de detención.
Medir la absorbancia de cada solución a 405 nm usando un espectrofotómetro adecuado (ver Espectrofotometría y Disper-
sión de Luz (851 )). La desviación estándar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco.
2. Medición Cinética: Seguir el cambio en la absorbancia para cada solución durante 1 minuto a 405 nm usando un espec-
trofotómetro adecuado (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )). Calcular el cambio en la absorbancia/min (~OD/
min). Los blancos para la medición cinética también se expresan en ~OD/min y deben proporcionar los valores más altos
debido a que se realizan en ausencia de heparina. La desviación estándar relativa es menos de 10% para las lecturas del
blanco.
Cálculos: Se pueden usar los modelos estadísticos de Método de razón de pendientes o Método de líneas paralelas depen-
diendo de qué modelo describa mejor la correlación entre concentración y respuesta.
Método de razón de pendientes: Para cada una de las series, calcular la regresión del logaritmo de absorbancia o el lo-
garitmo del cambio en la absorbancia/minuto en función de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones
estándar, y calcular la potencia de heparina sódica en Unidades USP/mL, usando métodos estadísticos para los métodos de
razón de pendientes. Expresar la potencia de heparina sódica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Método de líneas paralelas: Para cada una de las series, calcular la regresión de la absorbancia o el cambio en la absor-
bancia/minuto en función del logaritmo de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estándar, y calcular
la potencia de heparina sódica, en Unidades USP/mL, usando métodos estadísticos para métodos de líneas paralelas. Expresar
la potencia de heparina sódica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Criterios de aceptación: La potencia de heparina sódica, calculada con respecto a la sustancia seca, es no menos de 180
Unidades USP de Heparina en cada mg.
Estándares de Referencia USP (11 ): ER Heparina Sódica para Valoraciones USP

VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR Ha PARA HEPARINAS DE

BAJO PESO MOLECULAR

El siguiente procedimiento se usará siempre que se especifique en las monografías individuales. Esta valoración se puede lle-
var a cabo manualmente en tubos de plástico usando un bloque termostático o un baño de agua termostatizado. Un equipo
para placa de microtitulación con un lector y un coagulómetro automático pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimien-
to. Se usa solución de ácido acético (solución de detención) para la valoración manual y en placa de microtitulación. Los coa-
gulómetros automáticos miden la velocidad cinética inicial y, por consiguiente, no es necesario detener la reacción.

Actividad Anti-Factor Xa para Heparinas de Bajo Peso Molecular

Solución de ácido acético: Ácido acético glacial y agua (42:58)
Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g
de cloruro de sodio en 500 mL de agua. Agregar 1,0 g de polietilenglicol 6000 ó 10,0 g de albúmina sérica bovina, ajustar con
ácido clorhídrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
Solución amortiguadora de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g de cloruro de sodio en
500 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver 3,03 g de tris(hidroximetil)aminometano, 5, 12 g de cloruro de sodio y
1,40 g de edetato sódico en 250 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 500 mL.
 188 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor / Pruebas Químicas USP 37

Solución de antitrombina humana: Reconstituir un vial de antitrombina humana (ver Reactivos, Indicadores y Solucio-
nes-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solución que contenga 5 Unidades de Antitrombina por ml. Diluir
esta solución con Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución con una concentración
de 1,0 Unidad de Antitrombina/mL.
Solución de factor Xa: Reconstituir una cantidad pesada con exactitud de factor Xa bovino (ver Reactivos, Indicadores y
Soluciones-Especificaciones de Reactivos) según se indica en las instrucciones del fabricante. Diluir esta solución madre con
Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución que proporcione un incremento en el va-
lor de absorbancia a 405 nm de no más de 0,20 unidades de absorbancia/min o 0,8 unidades de absorbancia después de 4
minutos de incubación con el sustrato cromogénico cuando se valora según se describe a continuación, pero usando como un
volumen apropiado, V, el volumen, en µL, de Solución amortiguadora de pH 7,4 en lugar de V µL de la solución estándar o la
solución muestra.
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para prueba amidolíti-
ca (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para factor Xa en agua para obtener una concentración
aproximadamente 3 mM. Diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de
0,5 mM. [NOTA-Calentar previamente los reactivos a 37 ± 1º 15 minutos antes de su uso.]
Soluciones estándar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biológicas USP con agua destilada y luego diluir con Solución amortiguadora de pH 1,4 hasta obtener al menos
cuatro diluciones en el intervalo de concentración de 0,025-0,2 Unidades USP de anti-factor Xa/ml.
Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estándar.
Análisis
Muestras: Soluciones estándar, Soluciones muestra, Solución de antitrambina humana, Solución amortiguadora de pH 7,4, So-
lución de factor Xa, Solución de sustrato cromogénico y Solución de ácido acético
Etiquetar 18 tubos adecuados: Bl y B2 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno por duplicado para las diluciones de las
Soluciones muestra; y Sl, 52, 53 y S4 cada uno por duplicado para las diluciones de las Soluciones estándar. [NOTA-Tratar los
tubos en el orden siguiente: Bl, Sl, 52, 53, S4, Tl, T2, T3, T4, Tl, T2, T3, T4, Sl, S2, 53, 54, B2.] Agregar a cada tubo 50 µL
de Solución de antitrombina humano y un volumen igual, V, de la Solución amortiguadora de pH 7,4 (Blanco) o de una dilución
apropiada de las Soluciones muestra o de las Soluciones estándar. Mezclar evitando la formación de burbujas. Incubar a 37º du-
rante al menos 1,0 minuto. Agregar a cada tubo 100 µL de Solución de factor Xa e incubar durante 1,0 minuto. Agregar 250 µL
de Solución de sustrato cromogénico. Detener la reacción después de aproximadamente 4,0 minutos con 250 µL de Solución de
ácido acético. Medir Ja absorbancia de cada solución a 405 nm usando un espectrofotómetro adecuado (ver Espectrofotometrío
y Dispersión de Luz (851 )). Usar cubetas de cuarzo o de poliestireno desechables. Se puede aumentar o reducir el volumen de
los reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la
muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Aptitud del sistema: La valoración es válida si se cumplen los siguientes requisitos:
1 . Una solución blanco proporciona un incremento en el valor de absorbancia a 405 nm de no más de 0,20 unidades de
absorbancia/min (o un total de 0,8 unidades de absorbancia) cuando se valora usando un volumen apropiado (50 µL) de
Solución amortiguadora de pH 7,4 en lugar de 50 µL de la Solución estándar o de la Solución muestra.
2. La lectura del blanco B2 no difiere en más de ±0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco Bl.
Cálculos: Para esta valoración biológica, se pueden aplicar análisis de líneas paralelas o de razón de pendientes.
Calcular la potencia de la muestra de prueba, en Unidades USP de anti-factor Xa/mL, usando un modelo estadístico para
líneas paralelas, graficando la absorbancia en función de las concentraciones logarítmicas de las Soluciones muestra y de las
Soluciones estándar. En algunos casos, la transformación logarítmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la li-
nealidad para las curvas de dosis-respuesta. La valoración es válida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptación
para regresión, linealidad y paralelismo, conforme a lo requerido para el método de líneas paralelas. Para el análisis de razón de
pendientes, graficar la absorbancia en función de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estándar. En
algunos casos, la transformación logarítmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la linealidad de las curvas de
dosis-respuesta. La valoración es válida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptación para regresión, linealidad y
ordenada al origen común, conforme a lo requerido para el método de razón de pendientes (ver Diseño y Análisis de Valoracio-
nes Biológicas (111) y Análisis de Valoraciones Biológicas (1034)).
Expresar la actividad anti-factor Xa de la muestra/mg, calculada con respecto a la sustancia seca:
Unidades USP de Anti-factor Xa/mg = [potencia del estándar
(Unidades USP/mL) x cociente de potencia]/[concentración de Ja muestra (mg/mL)]

Actividad Anti-Factor lla para Heparinas de Bajo Peso Molecular

Solución de ácido acético, Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4, Solución amortiguadora de pH
7,4, Solución amortiguadora de pH 8,4 y Solución de antitrombina humana: Proceder según se indica en Actividad Anti-
Factor Xa, excepto que la concentración de la Solución de antitrombina humana es 0,5 Unidades de Antitrombina/ml.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (211) Arsénico 189

Solución de trombina humana: Reconstituir trombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reacti-
vos) en agua y diluir con Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución con una concen-
tración de 5 Unidades de Trombina/ml. Usar la Solución de trombina humana inmediatamente después de su preparación.
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para la prueba amidolí-
tica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para trombina en agua para obtener una concentra-
ción aproximadamente 3 mM. Diluir inmediatamente antes de su uso con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta 0,5 mM.
Soluciones estándar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biológicas USP con agua destilada y diluir con Solución amortiguadora de pH 1,4 hasta obtener al menos cuatro
diluciones en el intervalo de concentración de 0,015-0,075 Unidades USP de actividad de anti-factor lla/ml.
Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estándar.
Procedimiento: Proceder según se indica en Actividad Anti-Factor Xa, pero usar Solución de trombina humana en lugar de
Solución de factor Xa y usar la Solución de antitrombina humana según se describió anteriormente.
Aptitud del sistema: La valoración es válida si se cumple el siguiente requisito:
1. La lectura del blanco 82 no difiere en más de ±0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco B1.
Cálculos: Proceder según se indica en el cálculo de Actividad Anti-Factor Xa.
Estándares de Referencia USP (11 ): ER Heparina de Bajo Peso Molecular para Valoraciones Biológicas USP

(211) ARSÉNICO

Este procedimiento está diseñado para determinar la presencia de trazas de arsénico (As) convirtiendo el arsénico en las sus-
tancias en análisis en arsina, la cual se pasa luego a través de una solución de dietilditiocarbamato de plata y forma un comple-
jo de color rojo. El color rojo producido de esta manera se compara, en forma visual o espectrofotométrica, con el color produ-
cido de manera similar en un control que contiene una cantidad de arsénico que equivale al límite especificado en la mono-
grafía individual. Los límites se establecen en términos de arsénico (As). El contenido de arsénico no debe exceder el límite
indicado en la monografía individual.
Existen 2 métodos que sólo difieren en el tratamiento preliminar de la sustancia de prueba y del estándar. Por lo general, el
Método I se usa para materiales inorgánicos en tanto que el Método 11 se utiliza para los materiales orgánicos.
Aparato-
El aparato (ver la Ilustración) consta de un generador de arsina (a) equipado con una unidad depuradora (c) y un tubo de
absorción (e) con juntas cónicas estándar o juntas de rótula esférica de vidrio esmerilado (by d) entre las unidades. No obstan-
te, se puede usar cualquier otro aparato adecuado cuyo principio de funcionamiento sea el mismo que el del aparato descrito
e ilustrado.

e
d

Aparato para la Prueba de Arsénico

Solución Madre de Trióxido de Arsénico-Disolver 1 32,0 mg de trióxido de arsénico, previamente secados a 105º duran-
te una hora y pesados con exactitud, en 5 mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumétrico de
1000 mL. Neutralizar la solución con ácido sulfúrico 2 N, agregar 1O mL más de ácido sulfúrico 2 N y luego llevar a volumen
con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar.
 190 (211) Arsénico/ Pruebas Químicas USP 37

Solución Estándar de Arsénico-Transferir 10,0 mL de la Solución Madre de Trióxido de Arsénico a un matraz volumétrico de
1000 mL, agregar 1O mL de ácido sulfúrico 2 N, llevar a volumen con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar. Cada
mL de la Solución Estándar de Arsénico contiene el equivalente a 1 µg de arsénico (As). Conservar esta solución en un recipiente
que sea totalmente de vidrio y usarla durante los tres días posteriores a su preparación.

MÉTODO 1
Preparación Estándar-Pipetear 3,0 mL de la Solución Estándar de Arsénico y transferir a un matraz generador. Diluir con
agua hasta obtener un volumen de 35 ml.
Preparación de Prueba-Excepto que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir al matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada, por la fórmula:
3,0/L
en donde Les el límite de arsénico en ppm; disolver en agua y diluir con agua hasta obtener un volumen de 35 ml.
Procedimiento-Tratar la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba de la misma manera, tal como se describe a conti-
nuación. Agregar 20 mL de ácido sulfúrico 7 N, 2 mL de yoduro de potasio SR y 0,5 mL de solución ácida de cloruro estannoso
concentrada SR y 1 mL de alcohol isopropílico, y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Relle-
nar el tubo depurador (c) con dos trozos de algodón previamente impregnados con solución saturada de acetato de plomo,
exprimidos para eliminar el exceso de solución y secados al vacío a temperatura ambiente, dejando un pequeño espacio de
2 mm entre los dos trozos de algodón. Lubricar las juntas (by d) con una grasa adecuada para llaves de paso, apropiada para
usarse con disolventes orgánicos y conectar la unidad depuradora al tubo de absorción (e). Transferir 3,0 mL de dietilditiocar-
bamato de plata SR al tubo de absorción. Agregar 3,0 g de cinc granulado (malla Nº 20) a la mezcla del matraz y conectar
inmediatamente la unidad depuradora ensamblada y permitir el desprendimiento de hidrógeno y el desarrollo de color a tem-
peratura ambiente durante 45 minutos, agitando el matraz por rotación moderada cada 1O minutos. Desconectar el tubo de
absorción de la unidad depuradora y del matraz generador y transferir la solución absorbente a celdas de absorción de 1 cm.
La coloración roja producida por la Preparación de Prueba no excederá la producida por la Preparación Estándar. Si fuera nece-
sario o conveniente, determinar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción entre 535 nm y 540 nm con un
espectrofotómetro o colorímetro adecuado, usando dietilditiocarbamato de plata SR como blanco.
Sustancias Químicas lnterferentes-Los metales o las sales de metales, como el cromo, cobalto, cobre, mercurio, molib-
deno, níquel, paladio y plata, pueden interferir con la formación de arsina. El antimonio, que forma estibina, produce una in-
terferencia positiva en el desarrollo del color con dietilditiocarbamato de plata SR. Cuando se sospecha la presencia de antimo-
nio, el color rojo que se produce en las dos soluciones de dietilditiocarbamato de plata, puede compararse a la longitud de
onda de máxima absorción entre 535 nm y 540 nm con un colorímetro apropiado, ya que a esta longitud de onda la interfe-
rencia debida a la estibina es inapreciable.

MÉTODO 11
NOTAS-
(1) Precaución-Algunas sustancias pueden reaccionar en forma de explosiones violentas cuando se digieren con peróxido de hi-
drógeno. Extremar las medidas de seguridad en todo momento.
(2) Si se trabaja con compuestos que contienen halógenos, calentar las muestras con ácido sulfúrico a una temperatura más
baja evitando que la mezcla entre en ebullición y agregar cuidadosamente el p12róxido de hidrógeno antes de que tenga lugar
la carbonización para prevenir la pérdida de arsénico trivalente.
(3) Si la sustancia de prueba reacciona con demasiada rapidez y comienza a carbonizarse con 5 mL de ácido sulfúrico antes
de calentarse, se deberá usar en su lugar 1O mL de ácido sulfúrico diluido frío (1 en 2) y agregar algunas gotas de peróxido de
hidrógeno antes de calentar.
Preparación Estándar-Pipetear 3,0 mL de Solución Estándar de Arsénico y transferir al matraz generador, agregar 2 mL de
ácido sulfúrico, mezclar y agregar la cantidad total de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento empleado en la Preparación de
Prueba. Calentar la mezcla hasta que se desprenda humo denso. Dejar que se enfríe, agregar cuidadosamente 1 O mL de agua y
volver a calentar hasta que se produzca humo irritante. Se debe repetir este procedimiento con otros 1 O mL de agua para eli-
minar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar y diluir con agua hasta obtener 35 mL.
Preparación de Prueba-Excepto que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir un matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada por la fórmula:
3,0/L
en donde Les el límite de arsénico en ppm. Agregar 5 mL de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio y digerir en una campa-
na de extracción, preferentemente en una placa de calentamiento, y a una temperatura de no más de 120º, hasta que se inicie
la carbonización. (Agregar más ácido sulfúrico si fuera necesario para humedecer completamente algunas muestras pero te-
niendo en cuenta que el volumen total agregado no puede exceder de 1O mL.) Agregar cuidadosamente, gota a gota, peróxi-
do de hidrógeno al 30%, y dejar que la reacción disminuya y calentar nuevamente entre una y otra gota. Agregar las primeras
 USP 37 Pruebas Químicas/ (223) Dimetilanilina 191

gotas muy lentamente mezclando lo suficiente para evitar una reacción rápida. Interrumpir el calentamiento si se produce ex-
cesiva espuma. Cuando la reacción ha terminado, calentar cuidadosamente, rotando el matraz ocasionalmente para evitar que
algunas porciones de la muestra queden adheridas a las paredes del matraz expuestas a la unidad de calentamiento. Mantener
las condiciones de oxidación en todo momento durante la digestión agregando pequeñas cantidades de la solución de peróxido de
hidrógeno cada vez que la mezcla se torne de color marrón o se oscurezca. Continuar la digestión hasta que la materia orgánica se
destruya, aumentando gradualmente la temperatura de la placa de calentamiento hasta que se desprenda abundante humo
de trióxido de azufre y la solución se vuelva incolora o presente solamente un color ligeramente pajizo. Enfriar, agregar cuida-
dosamente 1O ml de agua, mezclar y volver a evaporar hasta que aparezca humo irritante; repetir este procedimiento para
eliminar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar, agregar cuidadosamente 1O ml de agua, lavar las paredes del ma-
traz con algunos ml de agua y diluir con agua a 35 ml.
Procedimiento-Proceder según se indica en el Procedimiento en el Método l.
Sustancias Químicas lnterferentes-Ver Sustancias Químicas lnterferentes en Método l.

(221) CLORUROS Y SULFATOS

Las siguientes pruebas de límites se utilizan como procedimientos generales en aquellos casos en que se especifican los lími-
tes de cloruros y sulfatos en las monografías individuales.
Realizar las pruebas y los controles utilizando tubos de vidrio que tengan el mismo diámetro y sean tan semejantes en las
restantes características como sea posible (ver Comparación Visual en Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851)). Emplear las
mismas cantidades de los mismos reactivos tanto para la solución en análisis como para la solución control que contiene el
volumen especificado de cloruro o sulfato. Si, después de la acidificación, la solución no queda totalmente transparente, filtrar-
la a través de un papel de filtro exento de cloruro y sulfato. Agregar el precipitante, nitrato de plata SR o cloruro de bario SR,
según sea necesario, a la solución de prueba y a la solución de control en secuencia inmediata.
En aquellos casos en que la monografía individual indique la realización de la prueba sobre un volumen específico de una
solución de la sustancia y el límite para cloruro o sulfato corresponda a 0,20 mL o menos de ácido clorhídrico 0,020 N o de
ácido sulfúrico 0,020 N, respectivamente, realizar la prueba a la solución sin dilución adicional. En tales casos, mantener las
mismas relaciones de volumen para la solución de control y para la solución en análisis. Cuando se realiza la prueba a sales de
metales pesados, que muestran normalmente una reacción ácida, omitir la acidificación y no neutralizar la solución. Disolver
las sales de bismuto en unos pocos ml de agua y 2 ml de ácido nítrico antes del tratamiento con el agente precipitante.
Cloruros-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en análisis en 30 ml a 40 ml de agua o, si la sustancia ya está en
solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 ml a 40 ml y, si fuera necesario, neutralizar la solución al tornasol
con ácido nítrico. Agregar 1 ml de ácido nítrico y 1 ml de nitrato de plata SR y agua suficiente para obtener 50 ml. Mezclar y
dejar en reposo durante 5 minutos protegido de la luz solar directa. A menos que se especifique algo diferente en la monogra-
fía correspondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solución que contenga el volumen de ácido
clorhídrico 0,020 N especificado en la monografía.
Sulfatos-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en análisis en 30 ml a 40 ml de agua, o, si la sustancia ya está en
solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solución al tornasol
con ácido clorhídrico. Agregar 1 ml de ácido clorhídrico 3 N, 3 mL de cloruro de bario SR y agua suficiente para obtener
50 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 1O minutos. A menos que se especifique algo diferente en la monografía correspon-
diente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solució"n que contenga el volumen de ácido sulfúrico
0,020 N especificado en la monografía.

(223) DIMETILANILINA

La siguiente prueba de límite se utiliza como un procedimiento general para la determinación de trazas de dimetilanilina en
artículos farmacopeicos utilizando cromatografía de gases, cuando esta determinación se especifica en la monografía individual
correspondiente. La dimetilanilina es un depurador del ácido clorhídrico que puede haber sido arrastrado durante el proceso.
Solución de Estándar Interno-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solu-
ción de naftaleno en ciclohexano que contenga aproximadamente 50 µg por ml.
Preparación Estándar-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir 50,0 mg de N,N-
dimetilanilina a un matraz volumétrico de 50 ml, agregar 25 ml de ácido clorhídrico 1 N, agitar por rotación suave hasta disol-
ver, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 5,0 mL de la solución resultante a un matraz volumétrico de 250 mL, diluir
a volumen con agua y mezclar. En un tubo de centrífuga adecuado agregar 1,0 mL de esta solución, 5,0 mL de hidróxido de
 1

192 (223) Dimetilanilina / Pruebas Químicas USP 37

sodio 1 N y 1,0 mL de Solución de Estándar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Emplear el sobrena-
dante transparente como Preparación Estándar.
Preparación de Prueba-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir 1,0 g de la sus-
tancia a analizar a un tubo de centrífuga adecuado, agregar 5 mL de hidróxido de sodio 1 N, agitar por rotación suave hasta
disolver la muestra, agregar 1,0 mL de Solución de Estándar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Em-
plear el sobrenadante transparente como Preparación de Prueba.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-
Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama, mantenido aproximadamente a 250º y una colum-
na capilar de sílice fundida, de 0,53 mm x 30 m, unida con una película de fase G42 de 1,0 µm. El gas transportador es helio,
con una velocidad lineal de aproximadamente 30 cm por segundo y una relación de partición de 1 O: 1. Mantener la tempera-
tura de la columna a 11 Oº durante los primeros 4 minutos después de inyectar, luego aumentar de 11 Oº a 200º a 8º por minu-
to, y mantener a 200º durante 5 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 250º. Inyectar en el cromatógrafo la Prepa-
ración Estándar y registrar las respuestas según se indica en el Procedimiento: identificar los picos de dimetilanilina y naftaleno
según sus tiempos de retención relativos, que son 1,0 y 1, 3, respectivamente. La relación señal-ruido para el pico de dimetila-
nilina es no menor de 1 O.
Procedimiento-Inyectar en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 pL) de la Preparación Estándar y de la
Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos principales. El cociente entre la respuesta de
cualquier pico de dimetilanilina y la respuesta del pico de naftaleno obtenido a partir de la Preparación de Prueba no es mayor
que el que se obtiene a partir de la Preparación Estándar (0,002%).

(226) 4-EPIANHIDRO-
TETRACICLINA

Este procedimiento cromatográfico se utiliza para demostrar que el contenido de 4-epianhidrotetraciclina, un producto de
degradación de la tetraciclina, no excede el límite indicado en la monografía individual.
Solución Amortiguadora de EDTA-Disolver 37,2 g de edetato disódico en 800 mL de agua, ajustar con hidróxido de
amonio hasta un pH de 7,8, diluir con agua a 1000 mL y mezclar.
Fase de Soporte-Agregar 5 mL de Solución Amortiguadora de EDTA a 1 O g de tierra silícea cromatográfica lavada con ácido
para cromatografía en columna y mezclar hasta que la tierra silícea se humedezca uniformemente.
Solución de Prueba-Preparar según se indica en la monografía individual correspondiente.
Procedimiento-Preparar un tubo cromatográfico de 15 mm x 1 70 mm con una salida de 4 mm x 50 mm rellenándolo
con Fase de Soporte, en porciones, apisonando firmemente cada porción, hasta que el tubo se llene hasta una altura de aproxi-
madamente 1 O cm. En un vaso de precipitados preparar una mezcla de 1 g de tierra silícea cromatográfica lavada con ácido
para cromatografía en columna y 1 mL de Solución de Prueba. Transferir la mezcla a la parte superior de la columna. Lavar en
seco el vaso de precipitados con Fase de Soporte y transferir a la columna para proporcionar una capa adicional de 1 cm en la
parte superior de la mezcla que contiene la Solución de Prueba. Dentro de los 30 minutos, pasar cloroformo a través de la co-
lumna y recolectar fracciones sucesivas de 5,0 mL, 5,0 mL, 10,0 mL, 10,0 mL y 5,0 mL. Observar la columna durante la elución
y prestar atención a la aparición de dos bandas amarillas separadas. La fracción o fracciones correspondientes a la primera ban-
da amarilla contienen las anhidrotetraciclinas. Descartar estas fracciones. Las fracciones que aparecen después de la primera
banda amarilla contienen la 4-epianhidrotetraciclina. Determinar la absorbancia de cada fracción de 4-epianhidrotetraciclina a
la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente a 438 nm, con un espectrofotómetro apropiado, diluyendo cada
fracción, si fuera necesario, con cloroformo y empleando cloroformo como blanco. Calcular la cantidad, en mg, de 4-epianhi-
drotetraciclina en cada fracción, por la fórmula:
AVD/20,08
en donde A es la absorbancia, V es el volumen, en mL, de la fracción tomada, D es el factor de dilución, si la fracción se diluyó
y 20,08 es la absortividad de la 4-epianhidrotetraciclina a 438 nm. A partir de la suma de las cantidades de 4-epianhidrotetra-
ciclina encontrada en las diferentes fracciones, calcular el porcentaje de 4-epianhidrotetraciclina en relación con el equivalente
de clorhidrato de tetraciclina contenido en la Solución de Prueba.
USP 37 Pruebas Químicas/ (228) Óxido de Etileno y Dioxano 193

(228) Óxido de Etileno y Dioxano

El siguiente procedimiento se usa para determinar el contenido de óxido de etileno y dioxano residuales en los productos que
se preparan a partir de óxido de etileno. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el
Método l.
Método 1
[PRECAUCIÓN-El óxido de etileno es tóxico e inflamable. Preparar estas soluciones en una campana bien ventilada con mucho
cuidado. Proteger manos y rostro usando guantes protectores de polietileno y una máscara adecuada. Almacenar todas las
soluciones en recipientes herméticos y refrigerar a una temperatura entre 4º y 8º.]
[NOTA-Antes de usar el polietilenglicol 200 en esta prueba, eliminar cualquier componente volátil colocando 500 ml de polie-
tilenglicol 200 en un matraz de fondo redondo de 1000 ml y acoplando el matraz a un evaporador rotatorio mantenido a
60º y bajo un vacío de 10-20 mm Hg durante 6 horas.]
Solución de acetaldehído: 1 O µg/ml de acetaldehído. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución madre de óxido de etileno: 2,5 mg/g de óxido de etileno.
Preparar según se indica a continuación: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio, agregar 50 ml de polietilenglicol
200, y volver a pesar el matraz. Transferir 5 ml del óxido de etileno líquido a un vaso de precipitados de 100 ml enfriado
en una mezcla de cloruro de sodio y hielo (1 :3). Transferir 300 µL (correspondientes a 250 mg) de óxido de etileno líqui-
do al polietilenglicol 200 y agitar por rotación suave hasta mezclar. Colocar de nuevo el tapón, volver a pesar el matraz, y
determinar la cantidad de óxido de etileno absorbido por diferencia de peso. Ajustar el peso de la mezcla con polietilen-
glicol 200 a 100,0 g, colocar de nuevo el tapón, y agitar por rotación suave hasta mezclar. [NOTA-Llenar con óxido de
etileno líquido un frasco resistente a la presión enfriado y almacenar en un congelador cuando no se use. Usar un trozo
pequeño de película de polietileno para proteger el líquido del contacto con la junta de caucho. Usar un aparato enfriado
adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar esta solución madre inmediatamente antes de su uso y almacenar en un
refrigerador después de su preparación.]
Solución de óxido de etileno: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio y enfriarlo en un refrigerador. Agregar
35 ml de polietilenglicol 200 y volver a pesar el matraz. Transferir 1 g de Solución madre de óxido de etileno enfriada al ma-
traz Erlenmeyer tarado. Ajustar el peso de la solución con polietilenglicol 200 a 50,0 g, colocar de nuevo el tapón, y agitar
por rotación suave hasta mezclar. Transferir 1 O g de esta solución a un matraz volumétrico de 50 ml. Agregar 30 ml de
agua y mezclar. Diluir con agua a volumen y mezclar para obtener una solución que contenga 1 O µg/ml de óxido de etile-
no. [NOTA-Usar un aparato enfriado adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución de dioxano: 500 µg/ml de dioxano
Solución estándar A: Transferir O, 1 ml de Solución de óxido de etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1 O ml.
[NOTA-Se pueden usar otros tamaños de vial para muestreo de fase gaseosa, como por ejemplo de 22 ml, dependiendo
de las condiciones operativas; sin embargo, se debe usar el mismo tamaño para la Solución estándar A, la Solución estándar
By la Solución muestra.] Agregar O, 1 ml de Solución de acetaldehído y O, 1 ml de Solución de dioxano, sellar el vial, y mezclar.
Solución estándar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml y agre-
gar O, 1 ml de Solución de óxido de etileno, O, 1 ml de Solución de dioxano y 1,0 ml de N,N-dimetilacetamida. Sellar el vial y
mezclar.
Solución muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un a vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml y agregar
1,0 ml de N,N-dimetilacetamida y 0,2 ml de agua. Sellar el vial y mezclar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases con muestreador de cámara gaseosa {Headspace GC)
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de vidrio o cuarzo, de 0,32 mm x 30 m, con una capa de fase Gl de 1,0 µm
Temperatura
Inyector: 150º
Detector: 250º
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.
Tiempo de Espera (Hold Time)
Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura a la Temperatura
Inicial (º) ('/min) Final (º) Final (mln)
50 - 50 5
50 5 180 -

180 30 230 5

Gas transportador: Helio

Velocidad lineal: 20 cm/s
Volumen de inyección: 1 ml (fase gaseosa)
Tipo de inyección: Relación de partición 20:1
 194 <228) Óxido de Etileno y Dioxano / Pruebas Químicos USP 37

Muestreador de fase gaseosa

Tiempo de equilibrio: 45 min
Temperatura de equilibrio
70º para la Solución estándar A
90º para la Solución estándar B
90º para la Solución muestra
Temperatura de la línea de transferencia: 150º
Tiempo de presurización: 1 min
Tiempo de inyección: 12 s
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar A
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para acetaldehído y óxido de etileno son 0,94 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre acetaldehído y óxido de etileno
Relación señal-ruido: No menos de 5, determinado a partir del pico de dioxano
Desviación estándar relativa: No más de 15%
Análisis
Muestras: Solución estándar By Solución muestra
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para óxido de etileno y dioxano son 1,0 y 2,5, respectivamente.]
Calcular el contenido de óxido de etileno, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:
Resultado =A¡ x rul[(r 5 x Wu) - (r u x W5)]

AE = cantidad de óxido de etileno agregado a la Solución estándar B (µg)

ru = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= AD x ru/[(r5 x Wu)- (ru x W5)]

AD = cantidad de dioxano agregado a la Solución estándar B (µg)

ru =respuesta del pico de dioxano de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de dioxano de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)

Cambio en la redacción:
Método 11
Solución estándar de óxido de etileno: Diluir 0,5 mL de óxido de etileno en cloruro de metileno (50 mg/mL) 1 con agua
hasta 50,0 mL. [NOTA-La solución es estable durante 3 meses si se almacena en viales con tapas precintadas de membrana
de silicona recubiertas con politetrafluoroetileno (polytef) a -20º.] Dejar que alcance la temperatura ambiente. Diluir
1,0 mL con agua hasta 250,0 mL para obtener una solución con una concenlración de 2 µg/mL de óxido de etileno.
[NOTA-Usar esta solución inmediatamente después de su preparación.]
Solución estándar de dioxano: 0,05 µL/mL de dioxano
Solución estándar de acetaldehído: 1 O µg/mL de acetaldehído. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución de resolución: Agregar 2,0 mL de Solución estándar de acetaldehído y 2,0 mL de Solución estándar de óxido de eti-
leno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1 O ml. Sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recu-
bierta con teflón y una tapa de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solución estándar A: 0,48 µg/mL de óxido de etileno, a partir de Solución estándar de óxido de etileno y 0,005 µL/mL de
dioxano, a partir de Solución estándar de dioxano, en agua
Solución estándar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1 O ml. Agregar
2,0 mL de Solución estándar A, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con teflón y una tapa
de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solución muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1 O mL. Agregar
2,0 mL de agua, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con teflón y una tapa de aluminio,
y mezclar cuidadosamente.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)

1 Esta es una solución disponible comercialmente.

 USP 37 Pruebas Químicas/ (231) Metales Pesados 195

Modo: Cromatografía de Gases con muestreador de cámara gaseosa (Headspace GC)

Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,53 mm x 50 m, cori unct capa de fase G27 de 5,0 pm
Temperatura
Inyector: 85º
Detector: 250º
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.

Tiempo de Espera (Hold Time)

Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura a la Temperatura
Inicial (º) (º/min) Final (°) Final (min)
70 10 250 5

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 4 ml/min
Volumen de inyección: 1 mL (fase gaseosa)
Tipo de inyección: Relación de partición 3,5 : 1
Muestreador de fase gaseosa
Tiempo de equilibrio: 30 min
Temperatura de equilibrio: 80º
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de resolución
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para acetaldehído y óxido de etileno son 0,9 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre acetaldehído y óxido de etileno
Análisis
Muestras: Solución estándar By Solución muestra
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para óxido de etileno y dioxano son 1,0 y 1,9, respectivamente.]
Calcular el contenido de óxido de etileno, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= c, X V X ru/[(rs X Wu) - Cru X Ws)J

CE = concentración de óxido de etileno en la Solución estándar A (µg/mL)

V =volumen de Solución estándar A agregada a la Solución estándar B (2,0 mL)
ru = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= CD x V x p x F x ru/[(r 5 x Wu) - (ru x W 5)]

CD = concentración de dioxano en la Solución estándar A (µL/mL)

V =volumen de la Solución estándar A agregada a la Solución estándar B (2,0 mL)
p =densidad de dioxano (1,03 g/mL = 1,03 mg/µL)
F =factor de conversión (1000 µg/mg)
ru = respuesta del pico de dioxano de la Solución muestra
r5 =respuesta del pico de •dioxano. ERR(Ol-iun- 2013 ) de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)

(231) METALES PESADOS

Esta prueba se proporciona para demostrar que el contenido de impurezas metálicas coloreadas por el ión sulfuro, en las
condiciones de prueba especificadas, no excede el límite de Metales pesados especificado en la monografía individual corres-
pondiente al porcentaje (en peso) de plomo en la sustancia en análisis, según se determina mediante comparación visual con-
comitante (ver Comparación Visual en la sección Procedimiento en Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )) con un control
preparado a partir de una Solución Estándar de Plomo. [NOTA-Las sustancias que generalmente responderán a esta prueba son:
plomo, mercurio, bismuto, arsénico, antimonio, estaño, cadmio, plata, cobre y molibdeno.]
 196 (231) Metales Pesados/ Pruebas Químicas USP 37

Determinar la cantidad de metales pesados por el Método /, a menos que se especifique algo diferente en la monografía
individual. El Método I se emplea para sustancias que producen preparaciones transparentes e incoloras en las condiciones de
prueba especificadas. El Método 11 se emplea para sustancias que no producen preparaciones transparentes e incoloras en las
condiciones de prueba especificadas para el Método/, o para sustancias que por su naturaleza compleja interfieren con la preci-
pitación de metales mediante el ión sulfuro, o para aceites fijos y volátiles. El Método fil es un método de digestión húmeda
que se usa sólo cuando no se puede usar ni el Método I ni el Método 11.

Reactivos Especiales
Solución Madre de Nitrato de Plomo-Disolver 159,8 mg de nitrato de plomo en 100 ml de agua a la que se le ha agre-
gado 1 ml de ácido nítrico, luego diluir con agua hasta 1000 ml. Preparar y almacenar esta solución en recipientes de vidrio
libres de sales de plomo solubles.
Solución Estándar de Plomo-En el día de uso, diluir con agua 10,0 ml de Solución Madre de Nitrato de Plomo hasta
100,0 ml. Cada ml de la Solución Estándar de Plomo contiene el equivalente a 1O µg de plomo. Una solución de comparación
preparada sobre la base de 100 µL de Solución Estándar de Plomo por g de sustancia en análisis contiene el equivalente a
1 parte de plomo por millón de partes de la sustancia en análisis.

Método 1

Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5-Disolver 25,0 g de acetato de amonio en 25 ml de agua y agregar

38,0 ml de ácido clorhídrico 6 N. Ajustar, si fuera necesario, con hidróxido de amonio 6 N o ácido clorhídrico 6 N hasta un pH
de 3,5; diluir con agua hasta 100 ml y mezclar.
Preparación Estándar-Pipetear 2 ml de la Solución Estándar de Plomo (20 µg de Pb), transferir a un tubo de comparación
de color de 50 ml y diluir con agua hasta 25 ml. Usando un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto
como indicador externo, ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua
hasta 40 ml y mezclar.
Preparación de Prueba-En un tubo de comparación de color de 50 ml, colocar 25 ml de la solución preparada para la
prueba según se indica en la monografía individual; o usando el volumen de ácido indicado, cuando se especifica en la mono-
grafía individual, disolver y diluir con agua hasta 25 ml la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, según se calcula, por la
fórmula:
2,0/(l OOOL)
en donde Les el límite de Metales pesados, expresado como porcentaje. Usando un medidor de pH o un papel indicador de
pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0
y 4,0, diluir con agua hasta 40 ml y mezclar.
Preparación Control-En un tercer tubo de comparación de color de 50 ml, colocar 25 ml de una solución preparada
según se indica en la Preparación de Prueba y agregar 2,0 ml de la Solución Estándar de Plomo. Usando un medidor de pH o un
papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N
hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua hasta 40 ml y mezclar.
Procedimiento-A cada uno de los tres tubos que contengan la Preparación Estándar, la Preparación de Prueba, y la Prepara-
ción Control, agregar 2 ml de la Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5; luego agregar 1,2 ml de tioacetamida-glicerina
básica SR, diluir con agua hasta 50 ml, mezclar, dejar en reposo durante 2 min.utos y observar hacia abajo sobre una superficie
blanca*: el color de la solución de la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la solución de la Preparación Estándar y
el color de la solución de la Preparación Control es igual o más oscuro que el color de la solución de la Preparación Estándar.
[NOTA-Si el color de la Preparación Control es más claro que el de la Preparación Estándar, usar el Método 11 en lugar del Méto-
do I para la sustancia en análisis.]

Método 11

NOTA-Este método no recupera mercurio.

Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5-Preparar según se indica en el Método l.
Preparación Estándar-Preparar según se indica en el Método l.
Preparación de Prueba-Usar una cantidad, en g, de la sustancia a analizar calculada por la fórmula:
2,0/(1 OOOL)
en donde L es el límite de Metales pesados, expresado como porcentaje. Transferir la cantidad pesada de la sustancia a un crisol
adecuado, agregar suficiente ácido sulfúrico para humedecerla e incinerar cuidadosamente a baja temperatura hasta que se
carbonice por completo. (El crisol puede estar cubierto con una tapa adecuada no ajustada durante la carbonización). Agregar

* En aquellos países o jurisdicciones en los que no se pueda usar tioacetamida, agregar a cada uno de los tubos 1O ml de sulfuro de hidrógeno SR recién prepara-
do, mezclar, dejar en reposo durante 5 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (231) Metales Pesados 197

2 ml de ácido nítrico y 5 gotas de ácido sulfúrico a la masa carbonizada y calentar con cuidado hasta que ya no se produzcan
humos blancos. Incinerar preferiblemente en una mufla, a una temperatura de 500º a 600º hasta que el carbón se haya que-
mado completamente. Enfriar, agregar 4 ml de ácido clorhídrico 6 N, cubrir y digerir en un baño de vapor durante 15 minu-
tos, remover la tapa y evaporar lentamente hasta sequedad en un baño de vapor. Humedecer el residuo con 1 gota de ácido
clorhídrico, agregar 1 O ml de agua caliente y digerir durante 2 minutos. Agregar, gota a gota, hidróxido de amonio 6 N hasta
que la solución sea alcalina al papel tornasol, diluir con agua a 25 ml y ajustar con ácido acético 1 N a un pH entre 3,0 y 4,0,
empleando un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Filtrar si fuera necesario, enjuagar el crisol y
el filtro con 1 O ml de agua, combinar el filtrado y el enjuague en un tubo de comparación de color de 50 ml, diluir con agua a
40 ml y mezclar.
Procedimiento-A cada uno de los tubos que contengan la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba, agregar 2 ml
de la Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5; luego agregar 1,2 ml de tioacetamida-glicerina básica SR, diluir con agua
hasta 50 ml, mezclar, dejar en reposo durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca*: el color de la
solución de la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la solución de la Preparación Estándar.

Método 111

Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5-Preparar según se indica en el Método l.

Preparación Estándar-Transferir a un matraz Kjeldahl de 100 ml limpio y seco, una mezcla de 8 ml de ácido sulfúrico y
1 O ml de ácido nítrico, y agregar otro volumen de ácido nítrico igual al volumen extra de ácido nítrico agregado a la Prepara-
ción de Prueba. Calentar la solución hasta que se produzcan humos blancos densos; enfriar; agregar cuidadosamente 1 O ml de
agua; y si se usó peróxido de hidrógeno para tratar la Preparación de Prueba, agregar un volumen de peróxido de hidrógeno al
30 por ciento, igual al que se usó para la sustancia en análisis. Calentar a ebullición moderada hasta que se produzcan humos
blancos densos. Volver a enfriar, agregar cuidadosamente 5 ml de agua, mezclar y calentar a ebullición moderada hasta que
se produzcan humos blancos densos y hasta obtener un volumen de 2 a 3 ml. Enfriar, diluir cuidadosamente con unos pocos
ml de agua, agregar 2,0 ml de la Solución Estándar de Plomo (20 µg de Pb) y mezclar. Transferir a un tubo de comparación de
color de 50 ml, enjuagar el matraz con agua, agregando los enjuagues al tubo hasta obtener un volumen de 25 ml y mezclar.
Preparación de Prueba-A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar una cantidad, en g, de la
sustancia a analizar calculada por la fórmula:
2,0/(1 OOOL)
en donde Les el límite de Metales pesados, expresado como porcentaje.
Si la sustancia es un sólido-Transferir la cantidad pesada de la sustancia en análisis a un matraz Kjeldahl de 100 ml limpio y
seco. [NOTA-Se puede usar un matraz de 300 ml si la reacción produce mucha espuma.] Fijar el matraz con una pinza en un
ángulo de 45º y agregar una cantidad suficiente de una mezcla de 8 ml de ácido sulfúrico y 1 O ml de ácido nítrico para hume-
decer bien la sustancia. Entibiar suavemente hasta que se inicie la reacción, dejar que la reacción disminuya y agregar porcio-
nes de la misma mezcla de ácidos, calentando después de cada adición, hasta que se haya agregado un total de 18 ml de la
mezcla de ácidos. Aumentar el calor y calentar a ebullición moderada hasta que la solución se oscurezca. Enfriar, agregar 2 ml
de ácido nítrico y volver a calentar hasta que la solución se oscurezca. Continuar el calentamiento y agregar luego ácido nítrico
hasta que no se observe más oscurecimiento, luego calentar intensamente hasta que se produzcan humos blancos densos. En-
friar, agregar cuidadosamente 5 ml de agua, calentar a ebullición moderada hasta que se produzcan humos blancos densos y
continuar el calentamiento hasta que el volumen se reduzca a unos pocos ml. Enfriar, agregar cuidadosamente 5 ml de agua
y examinar el color de la solución. Si es amarilla, agregar cuidadosamente 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento y
evaporar nuevamente hasta que se produzcan humos blancos densos y ha·sta un volumen de 2 a 3 ml. Si la solución aún está
amarilla, repetir la adición de 5 ml de agua y el tratamiento con peróxido. Enfriar, diluir cuidadosamente con unos pocos ml
de agua, enjuagar y recoger en un tubo de comparación de color de 50 ml, teniendo cuidado de que el volumen combinado
no exceda de 25 ml.
Si la sustancia es un líquido-Transferir la cantidad pesada de la sustancia en análisis a un matraz Kjeldahl de 100 ml limpio y
seco. [NOTA-Se puede usar un matraz de 300 ml si la reacción produce mucha espuma.] Fijar el matraz con una pinza en un
ángulo de 45º y agregar cuidadosamente unos pocos ml de una mezcla de 8 ml de ácido sulfúrico y 1 O ml de ácido nítrico.
Entibiar suavemente hasta que se inicie la reacción, dejar que la reacción disminuya y proceder según se indica en Si la sustan-
cia es un sólido, comenzando donde dice "agregar porciones de la misma mezcla de ácidos".
Preparación Control-Proceder con la digestión, usando la misma cantidad de muestra y el mismo procedimiento, según
se indica en el párrafo Si la sustancia es un sólido en la sección Preparación de Prueba, hasta el paso "Enfriar, diluir cuidadosa-
mente con unos pocos ml de agua". Agregar 2,0 ml de la Solución Estándar de Plomo (20 µg de plomo) y mezclar. Transferir a
un tubo de comparación de color de 50 ml, enjuagar el matraz con agua, agregando los enjuagues al tubo hasta obtener un
volumen de 25 ml y mezclar.
Procedimiento-Tratar la Preparación de Prueba, la Preparación Estándar y la Preparación Control del siguiente modo. Usan-
do un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar la solución a un pH entre
3,0 y 4,0 con hidróxido de amonio (se puede usar una solución de amoníaco diluida, si se desea, a medida que se acerca al pH
especificado), diluir con agua hasta 40 ml y mezclar.
 198 (231 > Metales Pesados / Pruebas Químicas USP 37

Agregar a cada tubo 2 mL de la Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5, luego agregar 1,2 mL de tioacetamida-glicerina
básica SR, diluir con agua hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie
blanca*: el color de la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la Preparación Estandar, y el color de Ja Preparación
Control es igual o más oscuro que el de la Preparación Estándar.

(232) IMPUREZAS ELEMENTALES-LÍMITES

Oficial a partir del 1 º de febrero de 2013

INTRODUCCIÓN

Este capítulo general especifica límites para la cantidad de impurezas elementales en productos farmacéuticos. Las impurezas
elementales incluyen catalizadores y contaminantes ambientales que pueden estar presentes en fármacos, excipientes o medi-
camentos. Estas impurezas pueden presentarse de manera natural, agregarse intencionalmente o introducirse inadvertidamen-
te (p.ej. mediante interacciones con el equipo de procesamiento). Cuando se conoce la presencia de impurezas elementales,
cuando se han agregado o cuando se pueden introducir potencialmente, es necesario asegurar el cumplimiento con los límites
especificados. Una estrategia de control basada en riesgos puede ser adecuada cuando los analistas determinan la forma en
que se va a asegurar el cumplimiento de esta norma. La estrategia de control basada en riesgos debe considerar (como míni-
mo) al As, Cd, Pb y Hg debido a su naturaleza ubicua. Independientemente de la metodología empleada, todos los medica-
mentos deben cumplir con los límites especificados.
Los límites presentados en este capítulo no se aplican a excipientes ni fármacos, excepto cuando se especifique en este capí-
tulo o en las monografías individuales. Sin embargo, es necesario conocer e informar los niveles de impurezas elementales pre-
sentes en fármacos y excipientes.
Los artículos destinados únicamente para uso veterinario y vacunas convencionales no están obligados a cumplir con los lí-
mites indicados en este capítulo. Los suplementos dietéticos y sus ingredientes se tratan en el capítulo Contaminantes Elemen-
tales en Suplementos Dietéticos (2232).

CLASIFICACIÓN DE ESPECIES

La determinación del estado de oxidación, complejo orgánico o combinación recibe el nombre de clasificación de especies.
Cada una de las impurezas elementales tiene el potencial de estar presente en diferentes estados de oxidación o de formación
de complejos. No obstante, el arsénico y el mercurio son de especial cuidado debido a las diferentes toxicidades de sus formas
inorgánicas y orgánicas complejas.
Los límites de arsénico se basan en la forma inorgánica (la más tóxica). El arsénico se puede medir usando un procedimiento
para arsénico total asumiendo que todo el arsénico contenido en el material en análisis se encuentra en la forma inorgánica.
Cuando el límite se excede usando el procedimiento para arsénico total, puede ser posible demostrarlo mediante un procedi-
miento que cuantifique las diferentes formas en que la forma inorgánica cumple con la especificación.
Los límites de mercurio se basan en el estado de oxidación (2+) inorgánico. El metilmercurio (la forma más tóxica de mercu-
rio) no es un problema común para la industria farmacéutica. Por consiguiente, ·el límite se estableció asumiendo la forma inor-
gánica más común (mercúrica). Los límites para artículos que tienen el potencial de contener metilmercurio (p.ej., productos
obtenidos a partir de peces) se proporcionan en las monografías correspondientes.

VÍAS DE EXPOSICIÓN

La toxicidad de una impureza elemental se relaciona con su grado de exposición (biodisponibilidad). Se ha determinado el
grado de exposición para cada una de las impurezas elementales para las tres vías de administración: oral, parenteral e inhala-
toria. Estos límites se basan en la exposición crónica. Las otras dos vías de administración, mucosa y tópica, se consideran igua-
les a la vía oral para los propósitos de esta norma, mientras que las exposiciones diarias permitidas (EDP) descritas en la Tabla 7
se aplicarían a estos productos. [NOTA-Las vías de administración de medicamentos se definen en el capítulo general Formas
Farmacéuticas (1151 ).]

Cambio en la redacción:

MEDICAMENTOS

Los límites descritos en la segunda, tercera y cuarta columnas de la Tabla 7 son las EDP en la dosis diaria base de las impure-
zas elementales de interés para un medicamento tomado por el paciente de acuerdo con las vías de administración indicadas.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (232) Impurezas Elementales-Límites 199

Los parenterales con una dosis máxima esperada mayor de 1O mL pero no mayor de 100 mL deben usar la Opción de Sumato-
ria descrita más adelante.

Parenterales de Gran Volumen (PGV)

Cuando la dosis diaria de un inyectable es mayor de 100 mL [parenteral de gran volumen (PGV)], la cantidad de impurezas
elementales presentes en el medicamento debe controlarse a través de los componentes individuales usados para producir el
producto. Las cantidades de impurezas elementales presentes en cada componente usado en un producto parenteral de gran
volumen deben ser inferiores a los valores indicados en la quinta columna de la Tabla 7.
Tabla 1. Impurezas Elementales para Medicamentos
EDP EDP EDP
para Dosis para Dosis para Dosis Límite de
Diaria Diaria Diaria Componente
Oral" Parenteral de Inhalación dePGV
Elemento (ftg/día) (µg/día) (µg/día) (µg/g)
Cadmio 25 2,5 1,5 0,25
Plomo 5 5 5 0,5
Arsénico inorgánicob 1,5 1,5 1,5 0,15
Mercurio inorgánicob 15 1,5 1,5 0,15
Iridio 100 10 1,5 1,0
Osmio 100 10 1,5 1,0
Paladio 100 10 1,5 1,0
Platino 100 10 1,5 1,0
Rodio 100 10 1,5 1,0
Rutenio 100 10 1,5 1,0
Cromo _e _e 25 _e

Molibdeno 100 10 10 1,0

Níquel 500 50 1,5 5,0
Vanadio 100 10 30 1,0
Cobre 1000 100 •100. <OO fn1-foh_OM" • 1oA FOO tn1-'-" on1 >\

ª EDP = Exposición diaria permitida basándose en una persona con un peso de 50 kg.
b Ver la sección Clasificación de Especies.
e No representa un riesgo de seguridad.

Opciones para Demostrar el Cumplimiento

OPCIÓN DE ANÁLISIS DEL MEDICAMENTO

Los resultados obtenidos a partir del análisis de una unidad de dosificación típica, multiplicados por la dosis diaria máxima,
se comparan con la EDP por Dosis Diaria.
EDP por Dosis Diaria;::: valor medido (µg/g) x dosis diaria máxima (g/día)
La cantidad medida de cada impureza no es mayor que la EDP por Dosis Diaria, a menos que se indique de otro modo en la
monografía individual.

OPCIÓN DE SUMATORIA

Sumar por separado las cantidades de cada impureza elemental (en µg/g) presente en cada uno de los componentes del
medicamento usando la siguiente ecuación:
EDP por Dosis Diaria;::: ¡¿M 1(CM x WM)] x D0

M =cada ingrediente usado para fabricar una unidad de dosificación

CM= concentración de elemento en el componente (fármaco o excipiente) (µg/g)
WM = peso del componente en una unidad de dosificación (g/unidad de dosificación)
D0 = número de unidades en la dosis diaria máxima (unidad/día)
El resultado de la sumatoria de cada impureza no es mayor que la EDP para Dosis Diaria, a menos que se indique alqo dife-
rente en la monografía individual. Antes de que se puedan evaluar los productos con esta opción, el fabricante debe •asegu-
rar• ERR coi-oct-lOB) que no se hayan agregado impurezas elementales adicionales de manera inadvertida durante el proceso de
fabricación.
 •
200 (232) Impurezas Elementales-Límites / Pruebas Químicas USP 37

Cambio en la redacción:

FÁRMACOS Y EXCIPIENTES

Se debe controlar e informar la presencia de impurezas elementales en fármacos y excipientes. Los niveles aceptables para
estas impurezas dependen del uso final previsto del material. Por consiguiente, los fabricantes de medicamentos deben deter-
minar el nivel aceptable de impurezas elementales en los fármacos y excipientes usados para producir sus productos.
Los valores provistos en la Tabla 2 representan los límites de concentración para componentes (fármacos y excipientes) de
medicamentos dosificados a una dosis diaria máxima de:::; 1 O g/día. Estos valores funcionan como límites de concentración
predeterminados para facilitar las discusiones entre los fabricantes de medicamentos y los proveedores de los componentes
para sus medicamentos. [NOTA-Puede ser necesario limitar los componentes individuales a niveles distintos de los presenta-
dos en la tabla, dependiendo de los factores mitigantes específicos de la monografía.]
Tabla 2. Límites de Concentración Predeterminados para Fármacos y Excipientes
Límites de Concentración Límites de Concentración Límites de Concentración
(pg/g) para Medicamentos (pg/g) para Medicamentos (pg/g) para Medicamentos
Orales con una Dosis Diaria Parenterales con una Dosis de Inhalación con una Dosis
Elemento Máxima de <::10 g/día Diaria Máxima de <::10 g/día Diaria Máxima de <::10 g/día
Cadmio 2,5 0,25 0,15
Plomo 0,5 0,5 0,5
Arsénico inorgánico 0,15 0,15 0,15
Mercurio inorgánico 1,5 O, 15 0,15
Iridio 10 1,0 o, 15
Osmio 10 1,0 0,15
Paladio 10 1,0 0,15
Platino 10 1,0 o, 15
Rodio 10 1,0 0,15
Rutenio 10 1,0 0,15
Cromo - a - a 2,5
Molibdeno 10 1,0 1,0
Níquel 50 5,0 0,15
Vanadio 10 1,0 3,0
Cobre 100 10 •1 º• <PP IOUoh.?01'\

ª No representa un riesgo de seguridad.

Cambio en la redacción:

PRUEBAS ANALÍTICAS
Cuando los fabricantes pueden demostrar la ausencia de impurezas •mediante la vigilancia del proceso y control en la cade-
na de abastecimiento,. ERR (Ol-oct-2013 ) no es necesario aplicar pruebas adicionales. _Cuando las pruebas se realizan para demostrar
el cumplimiento, se debe proceder según se indica en el capítulo general Impurezas Elementales-Procedimientos (233) y la eva-
luación de Elementos Diana debe incluir como mínimo As, Cd, Pb y Hg.

(233) IMPUREZAS ELEMENTALES-PROCEDIMIENTOS

Oficial a partir del 1 º de febrero de 2013

INTRODUCCIÓN
Este capítulo describe dos procedimientos analíticos (Procedimientos 1 y 2) para la evaluación de los niveles de impurezas
elementales. Asimismo, el capítulo describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los procedimientos alternati-
vos que cumplen con los requisitos de validación descritos en este capítulo pueden considerarse equivalentes a los Procedimien-
tos 1 y 2 para los propósitos de esta prueba. Asimismo, en el día del análisis, se deben realizar una estandarización y una eva-
luación de la aptitud del sistema usando materiales de referencia pertinentes. El requisito para una prueba de impurezas ele-
mentales se especifica en las Advertencias y Requisitos Generales o en la monografía individual. Los analistas confirmarán me-
 USP 37 Pruebas Químicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 201

diante estudios de verificación que los procedimientos analíticos aquí descritos, así como los procedimientos analíticos alterna-
tivos, sean adecuados para su uso en el material específico.

Clasificación de Especies

La determinación del estado de oxidación, complejo orgánico o combinación recibe el nombre de clasificación de especies.
Los procedimientos analíticos para determinación de especies no se incluyen en este capítulo, pero se pueden encontrar ejem-
plos en diversas partes de los compendios USP-NF y en la literatura.

Definiciones

Ácido Concentrado: Los ácidos nítrico, sulfúrico, clorhídrico o fluorhídrico concentrados ultrapuros o el Agua Regia.
Agua Regia: El agua regia es una mezcla de ácidos clorhídrico y nítrico concentrados, por lo general en proporciones de 3:1
ó 4:1, respectivamente.
Matriz Equiparada: Son soluciones que tienen la misma composición de disolvente que la Solución muestra. En el caso de
una solución acuosa, la Matriz Equiparada indicaría que se están usando los mismos ácidos, concentraciones ácidas y estabiliza-
dor de mercurio en ambas preparaciones.
Elementos Diana: Elementos que potencialmente estarían presentes en el material en análisis. Cuando el análisis se lleva a
cabo para demostrar el cumplimiento, la evaluación de elementos diana incluye As, Cd, Pb y Hg. Los elementos diana también
deben incluir cualquier elemento que pudiera agregarse a través del procesamiento o almacenamiento del material, así como
cualquier elemento cuya presencia pudiera interferir con la operación de los procedimientos analíticos.
Límite Diana o Concentración Diana: Valor de aceptación para la impureza elemental que se está evaluando. Un exceso en
el límite diana indica que un material en análisis excede el valor aceptable. La determinación del cumplimiento se trata en
otros capítulos. [NOTA-Cuando este capítulo se aplica a los capítulos Impurezas Elementales-Límites (232) y Contaminantes
Elementales en Suplementos Dietéticos (2232), es posible obtener una aproximación de los Límites Diana dividiendo las Exposicio-
nes Diarias Permitidas (EDP) para Dosis Diaria por la dosis diaria máxima para la Opción de Análisis del Medicamento del capítulo
(232) o la EDP por Ración Diaria dividida por el tamaño de ración diaria máximo del capítulo (2232).]
J: La concentración (p/p) de los elementos de interés en el Límite Diana se diluye apropiadamente hasta el intervalo de traba-
jo del instrumento. Por ejemplo, si los elementos diana son Pb y As para un análisis de un medicamento sólido oral, con una
dosis diaria de 1 O g/día, usando espectrometría de masas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS), el límite diana para
estos elementos sería 0,5 µg/g y O, 15 µg/g (ver la Tabla 2 en (232)). No obstante, en este caso, se sabe que el intervalo diná-
mico lineal de la ICP-MS se extiende desde 0,01 ng/mL hasta O, 1 µg/mL para estos elementos. Por consiguiente, se requiere
un factor de dilución de al menos 1 :1 O para asegurar que el análisis se realice en el intervalo dinámico lineal del instrumento. j
sería, en consecuencia, igual a 0,05 µg/mL y 0,015 µg/mL para Pb y As, respectivamente, cuando se suma el factor de dilución.
Materiales de Referencia Apropiados: Cuando se especifiquen Materiales de Referencia Apropiados en el capítulo, se deben
usar materiales de referencia certificados (CRM) de un instituto nacional de metrología, o materiales de referencia que sean
rastreables al material de referencia certificado de un instituto nacional de metrología. Un ejemplo de un instituto nacional de
metrología en los Estados Unidos es el National lnstitute of Standards and Technology.

PROCEDIMIENTOS FARMACOPEICOS 1 V 2

Procedimiento y Técnica de.Detección

El Procedimiento 7 se puede usar para impurezas elementales que por lo general son fáciles de detectar mediante espectros-
copía de emisión (óptica) atómica de plasma inductivamente acoplado (ICP-AES o ICP-OES). El Procedimiento 2 se puede usar
para impurezas elementales que por lo general son fáciles de detectar mediante ICP-MS. Antes del uso inicial, el analista debe
verificar que el procedimiento sea apropiado para el instrumento y la muestra usados (verificación del procedimiento) median-
te el cumplimiento de los requisitos de Validación de Procedimiento Alternativo siguientes.

Preparación de la Muestra

Las formas para la preparación de la muestra incluyen: Sin diluir, Solución Acuosa Directa, Solución Orgánica Directa y Solución
Indirecta. La selección de la forma apropiada de preparación de la muestra depende del material en análisis y es responsabili-
dad del analista. Cuando no se indica una forma de preparación de la muestra en la monografía, el analista puede usar cual-
quiera de los siguientes procedimientos de preparación adecuadamente verificados. Para casos en los que sea necesario agre-
gar cantidades conocidas (spiking) a un material en análisis a fin de proporcionar una señal de intensidad aceptable, el blanco
también debe ser adicionado con los mismos Elementos Diana y, cuando sea posible, con la misma solución usada para adicio-
nar la muestra. Las soluciones estándar pueden contener múltiples Elementos Diana. [NOTA-Se deben pesar todas las muestras
líquidas.]
Sin diluir: Se usa para líquidos o procedimientos alternativos que permiten examinar muestras sin disolventes.
 202 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos/ Pruebas Químicas USP 37

Solución Acuosa Directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente acuoso.

Solución Orgánica Directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente orgánico.
Solución Indirecta: Se usa cuando un material no es directamente >uluble er1 disolventes acuosos u orgánicos. La muestra
debe digerirse usando un procedimiento con vaso de digestión cerrado, similar al procedimiento que se presenta a continua-
ción. El esquema de preparación de la muestra debe proveer una cantidad suficiente de muestra para cuantificar cada elemen-
to en el límite especificado en la monografía o capítulo correspondiente.
Vaso de Digestión Cerrado: El procedimiento de preparación de la muestra se diseña para muestras que deben digerirse en
un Ácido Concentrado usando un aparato de vaso de digestión cerrado. El vaso de digestión cerrado minimiza la pérdida de
impurezas volátiles. La selección de un Ácido Concentrado depende de la matriz de la muestra. Puede ser apropiado el uso de
cualquiera de los Ácidos Concentrados, pero cada uno implica riesgos de seguridad inherentes. Por consiguiente, se deben to-
mar precauciones de seguridad adecuadas en todo momento. [NOTA-Los pesos y volúmenes provistos se pueden ajustar para
cumplir con los requisitos del aparato de digestión usado.]
Un procedimiento ilustrativo que ha demostrado una amplia aplicabilidad es el siguiente. Deshidratar y predigerir 0,5 g de
muestra primaria en 5 mL de Ácido Concentrado recientemente preparado. Dejar en reposo con la tapa sin ajustar durante 30
minutos en una campana de extracción. Agregar 1 O mL adicionales de Ácido Concentrado y digerir, usando una técnica de vaso
cerrado, hasta completar la digestión o la extracción. Repetir, si fuera necesario, agregando 5 ml adicionales de Ácido Concen-
trado. [NOTA-Cuando se requiera una digestión en vaso cerrado, seguir los procedimientos recomendados por el fabricante
para garantizar el uso seguro.]
Reactivos: Todos los reactivos usados para la preparación de las soluciones estándar y muestra deben estar exentos de impu-
rezas elementales, de conformidad con el capítulo Espectroquímica de Plasma (730).

Procedimiento 1: ICP-AES

Solución de estandarización 1: 2/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada

Solución de estandarización 2: 0,5/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solución madre de la muestra: Proceder según se indica anteriormente en Preparación de la Muestra. Si fuera necesario, de-
jar que la muestra se enfríe. Para la determinación de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solución muestra: Diluir la Solución madre de la muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentración final
de los Elementos Diana de no más de 2/.
Blanco: Matriz Equiparada
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroquímica de Plasma (730).)
Modo: ICP-AES
Detector: Sistema de detección óptica
Enjuague: El diluyente usado
Estandarización: Solución de estandarización 7, Solución de estandarización 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de estandarización 7
Requisitos de aptitud
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solución de estandarización 7 antes y después del análisis de las Soluciones
muestra.
Criterios de aptitud: No más de 20% para cada Elemento Diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto contenido mine-
ral, enjuagar bien el sistema (durante 60 segundos) antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Análisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y la longitud de onda. Calcular e
informar los resultados basándose en el tamaño de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas para co-
rregir por interferencias inducidas por la matriz (p.ej., superposiciones de longitud de onda).]

Procedimiento 2: ICP-MS

Solución de estandarización 1: 2/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada

Solución de estandarización 2: 0,5/ de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solución madre de la muestra: Proceder según se indica anteriormente en Preparación de la Muestra. Si fuera necesario, de-
jar que la muestra se enfríe. Para la determinación de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solución muestra: Diluir la Solución madre de la muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentración final
de los Elementos Diana de no más de 2/.
Blanco: Matriz Equiparada
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroquímica de Plasma (730).)
Modo: ICP-MS. [NOTA-Se recomienda un instrumento con una cámara de rocío enfriada. (Una celda de colisión o una
celda de reacción también puede ofrecer beneficios.)]
Detector: Espectrómetro de masas
 USP 37 Pruebas Químicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 203

Enjuague: El diluyente usado

Estandarización: Solución de estandarización 1, Solución de estandarización 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de estandarización 1
Requisitos de aptitud
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solución de estandarización 1 antes y después del análisis de las Soluciones
muestra.
Criterios de aptitud: Deriva no más de 20% para cada Elemento Diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto contenido
mineral, enjuagar bien el sistema (durante 60 segundos) antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Análisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y a miz. Calcular e informar los
resultados basándose en el tamaño de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas para corregir por in-
terferencias inducidas por la matriz (p.ej., interferencia de cloruro de argón en determinaciones de arsénico).]

VALIDACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS

Cuando un procedimiento farmacopeico especificado no cumple con los requisitos de una aplicación específica, es posible
utilizar un procedimiento alternativo (ver las Advertencias Generales 6.30). Los procedimientos alternativos deben validarse y
aprobarse y, por lo tanto, deben ser equivalentes a los procedimientos farmacopeicos para los propósitos de la prueba. Los
principios de validación se proporcionan en el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). El nivel de
validación necesario para asegurar que un procedimiento alternativo es aceptable depende de si se requiere realizar una prue-
ba de límite o una determinación cuantitativa. A continuación se describen los requisitos para la validación de un procedimien-
to de impurezas elementales para cualquier tipo de determinación. Cuando dicha información difiera de la presentada en Vali-
dación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), tendrán prioridad los parámetros y criterios de aceptación presentados en este
capítulo. Cualquier procedimiento alternativo que haya sido validado y que cumpla con los criterios de aceptación siguientes
se considerará equivalente a los procedimientos farmacopeicos para los propósitos de esta prueba.

PROCEDIMIENTOS DE LÍMITE

La siguiente sección define los parámetros de validación que se deben cumplir para que los procedimientos alternativos de
límite sean aceptables. El cumplimiento con estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedi-
miento de aptitud del sistema y un material de referencia adecuados. El cumplimiento con estos requisitos demuestra que el
procedimiento es equivalente al procedimiento farmacopeico como un procedimiento de límite para el Elemento Diana.
La aptitud del método se debe determinar mediante estudios que empleen los materiales o mezclas en análisis adicionados
con concentraciones conocidas de cada Elemento Diana de interés a la concentración del límite de aceptación apropiada. Las
cantidades conocidas deben agregarse al material o mezcla en análisis antes de llevar a cabo las etapas de preparación de la
muestra.

Capacidad de Detección
Solución estándar: Una preparación de materiales de referencia para los Elementos Diana a las Concentraciones Diana
Solución muestra adicionada 1: Preparar una solución de la muestra en análisis, a la que se le agregan cantidades conocidas
de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentración Diana, solubilizada o digerida según se
indica en Preparación de la Muestra.
Solución muestra adicionada 2: Preparar una solución de la muestra en análisis, a la que se le agregan cantidades conocidas
de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana al 80% de la Concentración Diana, solubilizada o digerida
según se indica en Preparación de la Muestra.
Solución muestra no adicionada: Una muestra del material en análisis, solubilizado o digerido de la misma manera que las
Soluciones muestra
Criterios de aceptación
Procedimientos no instrumentales: La Solución muestra adicionada 1 proporciona una señal o intensidad equivalente o
mayor que la de la Solución estándar. La Solución muestra adicionada 2 debe proporcionar una señal o intensidad menor que la
de la Solución muestra adicionada 7. [NOTA-La señal de cada Solución muestra adicionada no es menor que la determinación
de la Solución muestra no adicionada.]
Procedimientos instrumentales: El valor promedio de las tres mediciones repetidas de la Solución muestra adicionada 1
está dentro de (±15%) del valor promedio obtenido para las mediciones repetidas de la Solución estándar. El valor promedio de
las mediciones repetidas de la Solución muestra adicionada 2 debe proveer una intensidad o valor de señal menor que los de la
Solución estándar. [NOTA-Corregir los valores obtenidos para cada una de las soluciones adicionadas usando la Solución mues-
tra no adicionada.]
204 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos/ Pruebas Químicas USP 37

Precisión para Métodos Instrumentales (Repetibilidad)

[NOTA-La precisión no instrumental se demuestra cumpliendo con el requisito de Capacidad de Detección anterior.]
Soluciones muestra: Seis muestras independientes del material en análisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de
materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentración Diana.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 20% para cada Elemento Diana

Especificidad

El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequívoca (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225))
cada Elemento Diana ante la presencia de los componentes esperados, incluyendo otros Elementos Diana y componentes de la
matriz.

PROCEDIMIENTOS CUANTITATIVOS
La siguiente sección define los parámetros de validación que se deben cumplir para que los procedimientos cuantitativos
alternativos sean aceptables. El cumplimiento de estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un proce-
dimiento de aptitud del sistema y materiales de referencia adecuados. El cumplimiento con estos requisitos demuestra que el
procedimiento es equivalente al procedimiento farmacopeico con el propósito de cuantificar los Elementos Diana.

Exactitud

Soluciones estándar: Preparar soluciones que contengan los Elementos Diana a concentraciones en el intervalo de 50% a
150% de/, usando materiales de referencia apropiados.
Muestras de prueba: Preparar muestras del material en análisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de materiales
de referencia apropiados antes de cualquier etapa de preparación de la muestra (digestión o solubilización), a concentraciones
que caigan dentro del intervalo de 50% a 150% de f para cada Elemento Diana.
Criterios de aceptación
Recuperación de cantidades conocidas agregadas: 70%-150% para la media de tres preparaciones repetidas a cada
concentración

Precisión

REPETIBILIDAD

Muestras de prueba: Seis muestras independientes del material en análisis (tomadas del mismo lote) con materiales de refe-
rencia apropiados para los Elementos Diana al nivel indicado.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 20% para cada Elemento Diana

TOLERANCIA

Realizar el análisis de Repetibilidad durante tres eventos independientes usando los siguientes elementos o una combinación
de los mismos:
1 . en días distintos o
2. con instrumental distinto o
3. con analistas distintos.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 25% para cada Elemento Diana

Especificidad

El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequívoca (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225))
cada Elemento Diana en presencia de aquellos componentes que se espera estén presentes, incluyendo otros Elementos Diana y
componentes de la matriz.

Límite de Cuantificación, Intervalo y Linealidad

Se demuestra cumpliendo con el requisito de Exactitud.

 USP 37 Pruebas Químicas / (251) Plomo 205

(241) HIERRO

Esta prueba de límite se suministra para demostrar que el contenido de hierro, en forma férrica o ferrosa, no excede el límite
de hierro especificado en la monografía individual. La determinación se realiza mediante la comparación visual concomitante
con un control preparado a partir de una solución de hierro estándar.
Reactivos Especiales-
SOLUCIÓN DE HIERRO ESTÁNDAR-Disolver 863,4 mg de sulfato férrico amónico [FeNHiS0 4 ) 2 • 12Hp] en agua, agregar 1O mL
de ácido sulfúrico 2 N y diluir con agua hasta 100,0 ml. Pipetear 1O mL de esta solución y transferirlos a un matraz volumétrico
de 1000 mL, agregar 1O mL de ácido sulfúrico 2 N, diluir con agua a volumen y mezclar. Esta solución contiene el equivalente
a 0,01 mg (1 Oµg) de hierro por ml.
SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE AMONIO-Disolver 30 g de tiocianato de amonio en agua para obtener 100 ml.
Preparación Estándar-Pipetear 1 mL de Solución Estándar de Hierro (1 O ~tg de Fe) y transferirlos a un tubo para compara-
ción de color de 50 mL, diluir con agua hasta 45 mL, agregar 2 mL de ácido clorhídrico y mezclar.
Preparación de Prueba-Colocar en un tubo para comparación de color de 50 mL la solución preparada para la prueba
según se indica en la monografía individual y, si fuera necesario, diluir con agua hasta 45 mL; o disolver en agua y diluir con
agua hasta 45 mL la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, según se calcula por la fórmula:
1,0/(1 OOOL)
en donde L es el límite de Hierro expresado como porcentaje. Agregar 2 mL de ácido clorhídrico y mezclar.
Procedimiento-A cada uno de los tubos que contienen la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba agregar 50 mg
de cristales de peroxidisulfato de amonio y 3 mL de Solución de Tiocianato de Amonio y mezclar: el color de la solución obtenida
con la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la solución de la Preparación Estándar.

(251) PLOMO

La imposición de límites estrictos para las cantidades de plomo que pueden estar presentes en los productos farmacéuticos
ha dado como resultado la utilización de dos métodos; el que se presenta a continuación se basa en la extracción de plomo
mediante soluciones de ditizona. Para la determinación del contenido de metales pesados en general, expresados como equi-
valentes de plomo, ver Metales Pesados (231 ).
Seleccionar todos los reactivos para esta prueba de forma que tengan un contenido de plomo lo más bajo posible y almace-
nar todas las soluciones reactivo en recipientes de vidrio de borosilicato. Enjuagar bien todos los materiales de vidrio con ácido
nítrico tibio diluido (1 en 2) y luego con agua.
Reactivos Especiales-
SOLUCIÓN DE CIANURO Y AMONÍACO-Disolver 2 g de cianuro de potasio en 15 mL de hidróxido de amonio y diluir con agua
hasta 100 ml.
SOLUCIÓN DE CITRATO DE AMONIO-Disolver 40 g de ácido cítrico en 90 mL de agua. Agregar 2 ó 3 gotas de rojo fenol SR y
luego agregar cuidadosamente hidróxido de amonio hasta que la solución adquiera un color rojizo. Eliminar todo el plomo
que pueda estar presente mediante extracción de la solución con porciones 'de 20 mL de Solución de Extracción de Ditizona (ver
a continuación), hasta que la solución de ditizona retenga su color verde anaranjado.
SOLUCIÓN DE PLOMO ESTÁNDAR DILUIDA-Diluir un volumen medido con exactitud de Solución de Plomo Estándar (ver Metales
Pesados (231 )) [que contiene 1O µg de plomo por mL], con 9 volúmenes de ácido nítrico diluido (1 en 100) para obtener una
solución que contenga 1 µg de plomo por ml.
SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN DE DITIZONA-Disolver 30 mg de ditizona en 1000 mL de cloroformo y agregar 5 mL de alcohol. Al-
macenar la solución en un refrigerador.
Antes de usar, agitar un volumen apropiado de la solución de extracción de ditizona junto con aproximadamente la mitad
de su volumen de ácido nítrico diluido (1 en 100), desechando el ácido nítrico.
SOLUCIÓN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA-Disolver 20 g de clorhidrato de hidroxilamina en suficiente agua para obtener
aproximadamente 65 ml. Transferir a un separador, agregar 5 gotas de azul de timol SR, luego agregar hidróxido de amonio
hasta que la solución adquiera un color amarillo. Agregar 1O mL de solución de dietilditiocarbamato de sodio (1 en 25), mez-
clar y dejar en reposo durante 5 minutos. Extraer esta solución con porciones sucesivas de 1O a 15 mL de cloroformo hasta que
una porción de 5 mL del extracto clorofórmico no presente color amarillo al agitarla con sulfato cúprico SR. Agregar ácido clor-
hídrico 3 N hasta que la solución adquiera un color rosado (si fuera necesario, agregar 1 ó 2 gotas más de azul de timol SR) y
luego diluir con agua hasta 100 ml.
SOLUCIÓN DE CIANURO DE POTASIO-Disolver 50 g de cianuro de potasio en suficiente agua para obtener aproximadamente
100 mL. Eliminar el plomo de esta solución mediante extracción con porciones sucesivas de Solución de Extracción de Ditizona,
según se ha descrito en Solución de Citrato de Amonio, luego extraer cualquier resto de ditizona en la solución de cianuro por
 206 (251) Plomo / Pruebas Químicas USP 37

agitación con cloroformo. Finalmente diluir la solución de cianuro con suficiente agua de manera que cada porción de 1 00 ml
contenga 1 O g de cianuro de potasio.
~OLUCIÓN o~ 01 r1LONA ~STÁNDAR-Disolver 1 O mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo. Mantener la solución en un frasco
exento de plomo con tapón de vidrio, envuelto adecuadamente para proteger de la luz, y almacenar en un refrigerador.
Preparación de Prueba-[NOTA-Si en la siguiente preparación, la sustancia en análisis reacciona con demasiada rapidez y
empieza a carbonizarse con 5 ml de ácido sulfúrico antes del calentamiento, usar en su lugar 1 O ml de ácido sulfúrico enfriado
y diluido (1 en 2) y agregar unas pocas gotas del peróxido de hidrógeno antes del calentamiento.] Cuando la monografía no
especifica la preparación de una solución, preparar una Preparación de Prueba del siguiente modo: [Precaución-Tomar precau-
ciones de seguridad en este procedimiento, ya que algunas sustancias pueden reaccionar con violencia explosiva al digerirlas con pe-
róxido de hidrógeno.] Transferir 1,0 g de la sustancia en análisis a un matraz apropiado, agregar 5 ml de ácido sulfúrico y algu-
nas perlas de vidrio y digerir sobre una placa de calentamiento en una campana hasta que comience la carbonización. Se pue-
den utilizar en su lugar otros medios de calentamiento adecuados. (Agregar ácido sulfúrico adicional, si fuera necesario, para
humedecer la sustancia completamente, pero no agregar más de un total de 1 O ml.) Agregar, gota a gota y con cuidado,
peróxido de hidrógeno al 30 por ciento, permitiendo que la reacción disminuya y calentando nuevamente después de agregar
cada gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente, mezclar con cuidado para evitar una reacción rápida y suspender el
calentamiento si la espuma se torna excesiva. Agitar por rotación moderada la solución en el matraz para evitar que la sustan-
cia sin reaccionar se adhiera a las paredes del matraz. [NOTA-Agregar peróxido cuando la mezcla se torne marrón o se oscu-
rezca.] Continuar la digestión hasta que la sustancia se destruya por completo, se desprendan abundantes humos de trióxido
de azufre y la solución se torne incolora. Enfriar, agregar cuidadosamente 1 O ml de agua, evaporar hasta que nuevamente se
genere trióxido de azufre y enfriar. Se debe repetir este procedimiento con otros 1 O ml de agua para eliminar cualquier traza
de peróxido de hidrógeno. Diluir cuidadosamente con 1 O ml de agua y enfriar.
Procedimiento-Transferir a un separador la Preparación de Prueba enjuagando con 1O ml de agua o con el volumen de la
muestra preparada especificado en la monografía y, a menos que se indique algo diferente en la monografía, agregar 6 ml de
Solución de Citrato de Amonio y 2 ml de Solución de Clorhidrato de Hidroxilamina. (Para la determinación de plomo en sales de
hierro, emplear 1 O ml de Solución de Citrato de Amonio.) Agregar 2 gotas de rojo de fenal SR y alcalinizar la solución (sólo hasta
color rojo) mediante la adición de hidróxido de amonio. Enfriar la solución si fuera necesario y agregar 2 ml de Solución de
Cianuro de Potasio. Extraer de inmediato la solución con porciones de 5 ml de Solución de Extracción de Ditizona, vaciando cada
extracto en otro separador, hasta que la solución de ditizona retenga su color verde. Agitar las soluciones de ditizona combina-
das durante 30 segundos con 20 ml de ácido nítrico diluido (1 en 100) y desechar la capa clorofórmica. Agregar a la solución
ácida 5,0 ml de Solución de Ditizona Estándar y 4 ml de Solución de Cianuro y Amoníaco y agitar durante 30 segundos: el color
de la capa clorofórmica no tiene un tono violeta más intenso que el de un control preparado con un volumen de Solución de
Plomo Estándar Diluida equivalente a la cantidad de plomo permitida en la muestra a examinar y empleando las mismas canti-
dades de los mismos reactivos y de la misma manera que en la prueba con la muestra.

(261) MERCURIO

Método 1

NOTA-El ditizonato mercúrico es fotosensible. Realizar esta prueba en un lugar con luz tenue.
Reactivos-
SOLUCIÓN MADRE DE DITIZONA-Disolver 40 mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo.
SOLUCIÓN VOLUMÉTRICA DE DITIZONA-Diluir 30,0 ml de Solución Madre de Ditizona con cloroformo hasta 100,0 ml. Esta solu-
ción contiene aproximadamente 12 mg de ditizona por litro.
SOLUCIÓN MADRE DE MERCURIO-Transferir 135,4 mg de cloruro mercúrico a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a volu-
men con ácido sulfúrico 1 N. Esta solución contiene la cantidad equivalente a 100 mg de Hg en 100 ml.
SOLUCIÓN DE MERCURIO PARA ESTANDARIZAR LA SOLUCIÓN VOLUMÉTRICA DE DITIZONA-Transferir 2,0 ml de Solución Madre de Mer-
curio a un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a volumen con ácido sulfúrico 1 N. Cada ml de esta solución contiene el
equivalente a 20 µg de Hg.
Las siguientes soluciones son necesarias en la prueba de límite para mercurio que se especifica en las monografías de Fuma-
rato Ferroso, Sulfato Ferroso y Sulfato Ferroso Seco.
SOLUCIÓN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA-Preparar según se indica en la prueba para Plomo (251 ).
SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE MERCURIO-En el día de uso, diluir cuantitativamente 1,0 ml de la Solución Madre de Mercurio con áci-
do sulfúrico 1 N hasta 1000 ml. Cada ml de la solución resultante contiene el equivalente a 1 µg de mercurio.
SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN CON DITIZONA-Preparar según se indica en la prueba para Plomo (251 ).
SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN CON DITIZONA DILUIDA-Inmediatamente antes de usar, diluir 5 ml de la Solución de Extracción con
Ditizona con 25 ml de cloroformo.
Estardarización de la Solución Volumétrica de Ditizona-Transferir 1,0 ml de la Solución de Mercurio para Estandarizar la
Solución Volumétrica de Ditizona a un separador de 250 ml y agregar 100 ml de ácido sulfúrico 1 N, 90 ml de agua, 1 ml de
 USP 37 Pruebas Químicas/ (261) Mercurio 207

ácido acético glacial y 1O ml de solución de clorhidrato de hidroxilamina (1 en 5). Valorar la solución con la Solución Volumétri-
ca de Ditizona transferida desde una microbureta de 1O ml, agitando la mezcla 20 veces después de cada adición y dejando
que la capa clorofórmica se separe, y luego desechar la capa clorofórmica. Continuar hasta que una última adición de la Solu-
ción Volumétrica de Ditizona haga que la solución tome una coloración verde después de agitarla. Calcular la cantidad, en µg,
de Hg equivalente a cada ml de la Solución Volumétrica de Ditizona, por la fórmula:
20/V
en donde V es el volumen, en ml, de la Solución Volumétrica de Ditizona agregada.
Preparación de Prueba-Transferir aproximadamente 2 g de la sustancia en análisis, pesados con exactitud, a un matraz
Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio, agregar 20 ml de una mezcla de volúmenes iguales de ácido nítrico y ácido sulfú-
rico, acoplar un condensador adecuado, someter la mezcla a reflujo durante 1 hora, enfriar, diluir cuidadosamente con agua y
calentar a ebullición hasta que no se perciban vapores de ácido nitroso. Enfriar la solución, diluir cuidadosamente con agua,
transferir a un matraz volumétrico de 200 ml, diluir a volumen con agua, mezclar y filtrar.
Procedimiento-Transferir 50,0 ml de la Preparación de Prueba a un separador de 250 ml y extraer con pequeñas porcio-
nes sucesivas de cloroformo hasta que el último extracto clorofórmico permanezca incoloro. Desechar el extracto clorofórmico
y agregar 50 ml de ácido sulfúrico 1 N, 90 ml de agua, 1 ml de ácido acético glacial y 1O ml de solución de clorhidrato de
hidroxilamina (1 en 5) a la Preparación de Prueba extraída. Proceder según se indica en Estandarización de Ja Solución Volumétri-
ca de Ditizona, comenzando donde dice "Valorar la solución". Calcular la cantidad de mercurio.

Método lla y Método llb

Instrumento de Detección de Mercurio-Usar cualquier espectrofotómetro de absorción atómica adecuado equipado con
un registrador de respuesta rápida y capaz de medir la radiación absorbida por los vapores de mercurio en la línea de resonan-
cia del mercurio a 253,6 nm. [NOTA-Lavar todo el material de vidrio asociado a la prueba con ácido nítrico y enjuagar bien
con agua antes de usar.]
Aparato de Aireación-El aparato (ver el diagrama adjunto) consiste en un caudalímetro capaz de medir velocidades de
flujo entre 500 y 1000 ml por minuto, conectado a través de una llave de paso de tres vías equipada con un tapón de teflón a
un vaso de aireación (frasco de lavado de gases de 250 ml), seguido de una trampa, un tubo de secado relleno con perclorato
de magnesio, una celda de flujo de 1O cm x 25 mm con ventanas de cuarzo y, por último, un orificio de ventilación a una
campana de extracción.

Llave de paso de tres vías

con tapón de teflón
Desvío

Aireo
nitrógeno
Tubo de secado
relleno con
Mg(CI04)2
Trampa
IOOmL

Vaso de Aireación
(Frasco lavadora de gases) Celda de 10cm.
con ventanas de cuarzo

Las conexiones son de vidrio o de PVC

Aparato de Aireación de Mercurio

Reactivos-
Solución de Permanganato de Potasio-Disolver 5 g de permanganato de potasio en 100 ml de agua.
Solución de Clorhidrato de Hidroxilamina-Disolver 1O g de clorhidrato de hidroxilamina en 100 ml de agua.
Solución de Cloruro Estannoso-Disolver 1Og de SnCl 2 • 2H 2 0 en 20 ml de ácido clorhídrico tibio y agregar 80 ml de agua.
Preparar soluciones nuevas cada semana.
Solución Estándar de Mercurio-Preparar a partir de la Solución Madre de Mercurio según se indica en Método l. Cada ml de la
Solución Estándar de Mercurio contiene el equivalente a 1 µg de mercurio.
Preparación de Prueba-A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar la cantidad, en g, de la
sustancia de prueba calculada por la fórmula:

2,0/L
en donde Les el límite de mercurio, en ppm.
 208 (261) Mercurio/ Pruebas Químicas USP 37

Método lla

Preparación Estándar-Pipetear 2,0 ml de la Solución Estándar de Mercurio, transferir a un vaso de precipitados de 100 ml
y agregar 35 ml de agua, 3 ml de ácido sulfúrico y 1 ml de solución de permanganato de potasio. Cubrir el vaso de precipita-
dos con un vidrio de reloj, calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar.
Preparación de Prueba-Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un vaso de precipitados de 100 ml y
agregar 35 ml de agua. Mezclar y entibiar para disolver, si fuera necesario. Agregar 2 gotas de fenolftaleína SR y, según sea
necesario, neutralizar lentamente revolviendo constantemente, usando hidróxido de sodio 1 N o ácido sulfúrico 1 N. Agregar
3 ml de ácido sulfúrico y 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj,
calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar.
Procedimiento-Ensamblar el Aparato de Aireación según se muestra en el diagrama adjunto, con el vaso de aireación y la
trampa vacíos y la llave de paso en la posición de desvío. Conectar el aparato a una celda de absorción y ajustar la velocidad
de flujo del aire o del nitrógeno de modo que, en el procedimiento siguiente, se obtengan una absorción y una reproducibili-
dad máximas sin la formación excesiva de espuma en la solución de prueba. Obtener una lectura inicial estable a 253,6 nm
según las instrucciones de funcionamiento del fabricante del instrumento.
Tratar la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba de modo similar, de la siguiente manera. Eliminar el exceso de per-
manganato agregando Solución de Clorhidrato de Hidroxilamina, gota a gota, hasta que la solución quede incolora. Lavar inme-
diatamente con agua la solución en el vaso de aireación y diluir con agua hasta 100 ml. Agregar 2 ml de la Solución de Cloruro
Estannoso y reconectar inmediatamente el vaso de aireación al aparato de aireación. Girar la llave de paso de la posición de
desvío a la posición de aireación y continuar la aireación hasta que se haya pasado el pico de absorción y la pluma registradora
vuelva al valor inicial. Desconectar el vaso de aireación del aparato y lavar con agua después de cada uso. Después de hacer
correcciones por cualquier blanco de reactivo, toda absorbancia producida por la Preparación de Prueba no excede la produci-
da por la Preparación Estándar.

Método llb

Precaución-Algunas sustancias pueden reaccionar con violencia explosiva cuando se digieren con peróxido de hidrógeno. Tomar
precauciones de seguridad en todo momento.
Preparación Estándar-Pipetear 2,0 ml de la Solución Estándar de Mercurio y transferir a un matraz Erlenmeyer de 125 ml,
agregar 3 ml de ácido nítrico y 3 ml de ácido sulfúrico, mezclar y agregar una cantidad de peróxido de hidrógeno al 30 por
ciento igual a la cantidad total usada para preparar la Preparación de Prueba. Acoplar un condensador enfriado por agua ade-
cuado con una junta ahusada estándar que se ajuste al matraz y someter a reflujo la mezcla en una campana de extracción
durante 1 hora. Cortar el agua que circula a través del condensador y calentar hasta que aparezcan humos blancos en el ma-
traz. Enfriar y agregar cuidadosamente 1 O ml de agua a través del condensador mezclando, por rotación suave. Volver a calen-
tar hasta que aparezcan humos blancos, enfriar y agregar otros 15 ml de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes
del matraz para obtener un volumen de 35 ml. Agregar 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio, calentar a ebullición
durante unos segundos y enfriar.
Preparación de Prueba-Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un matraz Erlenmeyer de 125 ml.
Agregar 5 ml de ácido nítrico, 5 ml de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio. Acoplar un condensador refrigerado por agua
adecuado con una junta ahusada estándar que se ajuste al matraz y digerir en una campana de extracción, preferentemente
sobre una placa de calentamiento, y a una temperatura que no exceda los 120º hasta que comience la carbonización. (Si se
necesita ácido sulfúrico adicional para humedecer la muestra por completo, agregarlo cuidadosamente a través del condensa-
dor, pero sin permitir que el volumen total agregado exceda de 1 O ml.) Después de que el ácido haya descompuesto la sus-
tancia de prueba, agregar cuidadosamente, gota a gota a través del condensador, peróxido de hidrógeno al 30 por ciento,
permitir que la reacción disminuya su intensidad, calentar nuevamente entre las gotas (agregar las primeras gotas muy lenta-
mente y mezclando bien para evitar una reacción rápida; detener el calentamiento si la espuma se torna excesiva). Cuando la
reacción haya disminuido, calentar cuidadosamente y girar el matraz ocasionalmente para evitar que la muestra se aglutine
sobre el vidrio expuesto a la unidad de calentamiento. Mantener las condiciones de oxidación en todo momento durante la
digestión agregando pequeñas cantidades de solución de peróxido de hidrógeno cuando la mezcla se vuelva de color marrón
o se oscurezca. Continuar la digestión hasta que la materia orgánica se destruya y luego calentar a reflujo la mezcla durante 1
hora. Cortar el agua que circula a través del condensador y calentar hasta que se desprendan abundantes humos de trióxido
de azufre y la solución se vuelva incolora o presente solamente un color pajizo claro. Enfriar y agregar cuidadosamente 1 O ml
de agua a través del condensador, mezclando por rotación suave. Calentar nuevamente hasta que aparezcan humos blancos.
Enfriar y agregar cuidadosamente 15 ml de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz con algunos ml de
agua para obtener un volumen de 35 ml. Agregar 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio, calentar a ebullición duran-
te unos segundos y enfriar.
Procedimiento-Proceder según se indica en el Procedimiento en Método /la.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio 209

<267) POROSIMETRÍA POR INSTRUSIÓN DE MERCURIO

En general, los diversos tipos de poros se pueden representar como aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo sóli-
do o como espacios (es decir, intersticios o espacios vacíos) entre partículas sólidas en un lecho, compacto o agregado. Porosi-
dad es un término comúnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material sólido y se define con mayor precisión
como la relación entre el volumen de poros y espacios vacíos accesibles y el volumen total ocupado por una cantidad dada del
sólido. Además de los poros accesibles, un sólido puede comprender poros cerrados, que están aislados de la superficie exter-
na y a los cuales no son capaces de penetrar los fluidos. Este capítulo general no abarca la caracterización de poros cerrados, es
decir, cavidades sin acceso a una superficie externa.
Los materiales porosos pueden presentarse en forma de polvos finos o gruesos, compactos, extrudidos, láminas o monolitos,
y su caracterización a menudo implica la determinación del volumen total de los poros o porosidad, así como la distribución
del tamaño de los poros.
Se ha establecido debidamente que el desempeño de un sólido poroso (p.ej., su resistencia, reactividad, permeabilidad o
poder adsorbente) depende de la estructura de sus poros. Se ha desarrollado un gran número de métodos distintos para carac-
terizar la estructura de los poros. En vista de la complejidad de la mayoría de los sólidos porosos, no resulta extraño obtener
resultados que no siempre concuerdan y que no exista una técnica definitiva que pueda garantizar una imagen completa de la
estructura de los poros. La selección del método más adecuado depende de la aplicación del sólido poroso, de su naturaleza
física y química, y del rango de tamaños de poro.
Este capítulo ofrece pautas para medir la porosidad y la distribución del tamaño de los poros mediante porosimetría de mer-
curio, la cual es una prueba comparativa, generalmente destructiva, en la que el volumen de mercurio que penetra en un poro
o espacio vacío se determina como una función de la presión hidrostática aplicada, que se puede relacionar con el diámetro
del poro. Asimismo, se puede inferir otra información a partir de las curvas de volumen-presión, por ejemplo, la forma de los
poros y sus interconexiones, el área de las superficies interna y externa, la granulometría del polvo y la densidad aparente y
después del asentamiento; sin embargo, el alcance del presente capítulo no abarca dichos aspectos de la técnica.
Las consideraciones prácticas actualmente limitan la presión absoluta máxima aplicada que pueden alcanzar algunos equi-
pos de aproximadamente 400 MPa, que corresponde a un diámetro mínimo de poro equivalente a aproximadamente 0,003
µm. El diámetro máximo estará limitado por el tamaño de la muestra debido a la diferencia del frente hidrostático del mercu-
rio entre los extremos superior e inferior de la muestra. Para la mayoría de los propósitos, se puede considerar que este límite
es de aproximadamente 400 µm.
Resulta posible determinar la porosidad interparticular e intraparticular, pero el método no distingue entre estas porosidades
cuando coexisten.
El método es apropiado para el estudio de la mayoría de los materiales porosos. Sin embargo, puede no ser apropiado para
materiales que se amalgaman con mercurio, como ciertos metales, o puede ser necesaria una pasivación preliminar. Asimismo,
la presión puede deformar o compactar otros materiales. En algunos casos, se pueden aplicar correcciones a la compresibilidad
de la muestra y aún así obtener datos comparativos útiles.
La porosimetría de mercurio debe considerarse una técnica comparativa, debido a que, para la mayoría de los medios poro-
sos, no se encuentra disponible una teoría que permita un cálculo absoluto de resultados de la distribución del tamaño de los
poros. Por lo tanto, esta técnica se recomienda principalmente para estudios de desarrollo.
El mercurio es tóxico. Se deben tomar precauciones adecuadas para salvaguardar la salud del operador y de aquéllos que
operen en el área. El material de desecho se debe eliminar de una manera adecuada, de conformidad con los reglamentos
locales.

PRINCIPIO

La técnica se basa en la medición del volumen de mercurio resultante de la intrusión en un sólido poroso como una función
de la presión aplicada. La medición incluye únicamente aquellos poros en los que el mercurio puede penetrar a la presión apli-
cada.
Un líquido no humectante penetra en un sistema poroso sólo a presión. La presión aplicada es inversamente proporcional al
ancho interno del poro. En poros cilíndricos, la correlación entre el diámetro del poro y la presión se obtiene mediante la ecua-
ción de Washburn:

4. 0-
dp ==---cose (1)
p
p presión aplicada, en pascales
dP diámetro del poro, en metros
cr tensión superficial del mercurio, en newtons por metro
O ángulo de contacto entre el mercurio y la muestra, en grados
 •
21 O (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio/ Pruebas Químicas USP 37

APARATO

El portamuestras, conocido como penetrómetro o dilatómetro, tiene un tubo capilar calibrado a través del cual se puede
evacuar la muestra y por el que puede entrar el mercurio. El tubo capilar está unido a un tubo más ancho en el que se coloca
la muestra. El cambio en el volumen de mercurio resultante de la intrusión por lo general se mide por el cambio de la capaci-
tancia entre la columna de mercurio en el tubo capilar y una funda metálica que rodea la parte externa del tubo capilar. Cuan-
do se requieren mediciones precisas, el volumen interno del tubo capilar debe ser entre 20% y 90% del volumen previsto del
poro y de los espacios vacíos de la muestra. Debido a que los distintos materiales presentan un amplio rango de porosidad,
pueden ser necesarios varios penetrómetros equipados con tubos capilares con diferentes diámetros y volúmenes de muestra.
La Figura 7 presenta una configuración típica para un instrumento de porosimetría de mercurio. El porosímetro puede tener
diferentes puertos para la operación a alta y baja presión; también es posible llevar a cabo la medición a baja presión en una
unidad distinta.
El intervalo de presión es, por lo general, de 4 kPa a 300 kPa para la operación a baja presión, y superior a 300 kPa para la
operación a alta presión, lo cual depende particularmente del diseño del aparato y del uso previsto.

~
6

Aceite 1
1
Indicador de 1
volumen de 1
penetración 1
Cámara de 1
alta presión 1
1
Mercurio 1
¡
Muestra 1

1 Reservorio para fluido hidráulico

de ba1a presión
2. Bomba hidráulica
3. Multiplicador de presión
4. Transductor de presión
3
-8
5 Reservorio para fluido hidráulico
de alta presión
6. Bomba de vacío con manómetro
7. Reservona para mercurio

Figura 1. Ejemplo de la configuración de un instrumento para porosimetría de mercurio.

MÉTODO

Preparación de la Muestra-Tratar la muestra previamente mediante calentamiento y/o evacuación o con un flujo de gas
inerte para eliminar el material adsorbido que pudiera ocultar su porosidad accesible. La pasivación de la superficie de sólidos
humectables o amalgamables se puede lograr produciendo una capa fina de óxido o recubriendo con estearato. Pesar la mues-
tra del sólido previamente tratado y transferir al penetrómetro. Luego, desgasificar el sistema de poros de la muestra al vacío
hasta una presión residual máxima de 7 Pa.
Llenado del Penetrómetro con Mercurio-Usar mercurio de calidad analítica. Cubrir la muestra con mercurio al vacío. El
vacío es necesario para asegurar la transferencia del mercurio desde el reservorio al penetrómetro. En un penetrómetro lleno,
la presión de llenado comprende la presión aplicada más la contribución de presión generada por el frente de mercurio que
entra en contacto con la muestra. La presión de llenado típica es aproximadamente 4 kPa. Se puede minimizar la presión hi-
drostática del mercurio sobre la muestra llenando el penetrómetro en las posiciones horizontales.
Medición a Baja Presión-Aplicar aire o nitrógeno de manera controlada para incrementar la presión en las etapas corres-
pondientes a los tamaños de los poros de interés o de manera continua a una velocidad baja. Registrar el cambio concomitan-
te en la longitud de la columna de mercurio en el tubo capilar. Una vez alcanzada la presión máxima requerida, reducirla hasta
presión ambiental.
Medición a Alta Presión-Después de medir en condiciones de baja presión, transferir el penetrómetro cargado con mer-
curio al puerto o unidad de alta presión del instrumento y cubrir con fluido hidráulico. El mercurio penetra en el sistema de
poros por medio del fluido hidráulico. Incrementar la presión en el sistema hasta la presión máxima alcanzada en la medición a
baja presión y registrar el volumen de intrusión a esta presión, debido a que los volúmenes de intrusión subsiguientes se calcu-
lan a partir de este volumen inicial. Incrementar la presión en las etapas correspondientes a los tamaños de poro de interés o
de manera continua a una velocidad baja. La caída en la columna de mercurio se mide hasta la presión máxima requerida. En
 USP 37 Pruebas Químicas/ (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio 211

caso necesario, se puede reducir la presión por etapas o de manera continua a una velocidad baja para determinar la curva de
extrusión del mercurio. Corregir para considerar los cambios en el volumen del mercurio, el penetrómetro y demás compo-
nentes del sistema detector de volumen a presión elevada. El grado de las correcciones requeridas se puede determinar a tra-
vés de mediciones blanco aplicando las mismas condiciones. La Figura 2 presenta una curva de volumen-presión determinada
experimentalmente.
300

°' 240
E
_§,
o 180
"O
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3
§ 120
u
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E 60
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10" 10' 10'

Figura 2. Curva de volumen-presión como gráfica semilogarítmica.

INFORME DE LOS RESULTADOS

Convertir las lecturas de la presión a diámetro de los poros usando la ecuación de Washburn u otro modelo.
La tensión superficial de mercurio, cr, no sólo depende de la temperatura y del material, sino también-en el caso de las
áreas superficiales con curvas marcadas-del radio de la curvatura. En general, los valores entre 0,41 N · m- 1 y 0,52 N · m- 1 se
miden a temperatura ambiente. Si no se conoce el valor, se puede usar cr = 0,48 N · m- 1 •
El ángulo de contacto del mercurio, O, es más de 90º en la mayoría de los casos y se puede determinar con un instrumento
para medir el ángulo de contacto. Si no se conoce el valor O, se puede usar 130º. Informar los valores de ángulo de contacto,
tensión superficial, así como el modelo usado para el cálculo. La visualización de los datos se puede realizar mediante varios
tipos de gráficas. Frecuentemente, se visualiza la distribución del tamaño de poros representando el diámetro de poro en las
abscisas y el volumen específico dependiente de la intrusión en las ordenadas. En este caso, resulta apropiado representar las
abscisas en escala logarítmica (ver la Figura 3). Los espacios entre las partículas de la muestra sólida se incluyen como poros en
el cálculo. Si los poros difieren en tamaño de los espacios vacíos, éstos últimos se pueden separar seleccionando el intervalo de
tamaño de poro pertinente.
No se pueden usar las curvas de extrusión para calcular la distribución del tamaño de los poros (para histéresis, ver la Figura
2), debido a que una parte del mercurio resultante de la intrusión siempre permanece en el sistema de poros. La relación de
retención puede ser de utilidad para la caracterización cualitativa de los poros a los que únicamente se puede acceder a través
de aberturas estrechas ("poros en forma de tintero").
Los valores característicos más comunes, como el volumen específico total resultante de la intrusión, la media y la mediana
del diámetro de poro se calculan a partir de la distribución del tamaño de los poros. Asimismo, la documentación del procedi-
miento debe comprender la muestra, su preparación, las condiciones de evacuación y el instrumento utilizado.
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10' lO
D1ametro de poro (nm)

Figura 3. Distribución del volumen de los poros como gráfica semilogarítmica.

CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

Puesto que la técnica de porosimetría de mercurio es considerada una prueba comparativa, este capítulo no proporciona
detalles sobre la misma. Sin embargo, se recomienda analizar un material de comparación estable de manera rutinaria para
monitorear la calibración y el desempeño del instrumento.
212 (268) Porosidad por Adsorción-Desorción de Nitrógeno / Pruebas Físicas USP 37

Agregar lo siguiente:

·(268) POROSIDAD POR ADSORCIÓN-DESORCIÓN DE NITRÓGENO

INTRODUCCIÓN
La porosidad es un término comúnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material sólido y se define, con ma-
yor precisión, como la relación entre el volumen de poros y espacios vacíos accesibles y el volumen total ocupado por una
cantidad dada del sólido. Los poros cerrados o inaccesibles que están aislados de la superficie externa se excluyen de esta defi-
nición de volumen de poro. Los poros (o espacios vacíos) pueden incluir aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo
sólido o espacios entre partículas sólidas en un compacto o agregado. Los poros se presentan en una variedad de materiales
sólidos más allá de los compactos y los agregados, tales como polvos y tabletas, y su caracterización a menudo implica la de-
terminación del volumen de poro total o porosidad, así como la distribución del tamaño de poro. Por lo general, la clasifica-
ción de los poros se hace por tamaño en los siguientes grupos:
• Microporos-menores de 2 nm
• Mesoporos-2 a 50 nm
• Macroporos-mayores de 50 nm
El método del presente capítulo, Porosidad por Adsorción-Desorción de Nitrógeno (268), es complementario al del capítulo
general Porosimetría por Intrusión de Mercurio (267). La porosimetría por mercurio puede, en principio (teóricamente), usarse
con diámetros de poro de 3 nm a 400 µm, aunque se aplica mayormente para el intervalo de 100 nm a 200 µm. La adsor-
ción-desorción de nitrógeno se puede usar para caracterizar poros con tamaños menores de aproximadamente 300 nm, pero
es más apropiado para el análisis de mesoporos y en el intervalo inferior de rnacroporos de 2 a 100 nrn.

APARATO
Las mediciones generalmente se llevan a cabo usando el procedimiento volumétrico estático, aunque también se pueden
emplear métodos de flujo dinámico. Los usuarios de equipos comercialmente disponibles deben referirse a los documentos y
manuales del fabricante para obtener una descripción de su aparato en particular. Por ejemplo, un aparato volumétrico estáti-
co debe proveer lo siguiente: sistema de vacío para una presión de menos de 1 O Pa, suministro de volúmenes conocidos de
nitrógeno y helio de alta pureza, medición exacta de presión y temperatura, y un medio para enfriar la muestra a la tempera-
tura del nitrógeno líquido.

PRINCIPIO DE MEDICIÓN
La adsorción de un gas inerte sobre las superficies sólidas a bajas temperaturas es un fenómeno bien conocido y es el funda-
mento para la medición del área superficial de los sólidos (ver el capítulo general Área Superficial Específica (846)). A medida
que el gas se adsorbe sobre una superficie, se puede condensar en el interior de los poros accesibles. El volumen total de poro
y la distribución de tamaño de poro se pueden derivar de la isoterma de adsorción de gas, la cual es una medición de la canti-
dad adsorbida corno una función de la presión parcial del adsorbato. Las isotermas de adsorción se dividen en seis categorías
generales, dependiendo de la energética relativa de la adsorción y la presencia de poros. La Figura 7 representa las seis catego-
rías generales de isotermas de adsorción. ·
 USP 37 Pruebas Físicas / (268) Porosidad por Adsorción-Desorción de Nitrógeno 21 3

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(.)

Figura 1. Tipos de Isotermas. [Reproducido con autorización y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et al. Repor-
ting physisorption for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (recommenda-
tions 1984}(1nforme de ftsisorción para sistemas de gas/sólido con referencia especial a la determinación del área superficial y
la porosidad. (Recomendaciones 1984) Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 2.J
los microporos (poros con tamai'los menores de 2 nm) con frecuencia generan isotermas tipo l. Los mesoporos y macropo-
ros normalmente producen isotermas tipo IV, pero la histéresis puede ser difícil de observar en poros con tamaños mayores a
aproximadamente 100 nm, lo que produce una isoterma tipo 11. Aunque es posible derivar cierta información, tal como la po-
rosidad total, para materiales microporosos, la determinación de las distribuciones del tamaño de poro en dicho intervalo de
tamaño está fuera del alcance de este capítulo.
El adsorbato preferido es nitrógeno, mientras que la isoterma se determina a la temperatura del nitrógeno líquido (77,4 K).
Se pueden usar otros adsorbatos para propósitos especiales, aunque no se tratan en este capítulo.

PROCEDIMIENTO
Preparación de la Muestra

Antes del análisis, los analistas deben desgasificar la muestra para eliminar gases y vapores que se hayan adsorbido física-
mente sobre la superficie. Resulta necesario demostrar las condiciones de desgasificación para obtener una adsorción-desor-
ción reproducible, un peso constante de la muestra y que no se produzcan cambios físicos o químicos detectables en la mues-
tra. La desgasificación de un gran número de sustancias a menudo se consigue mediante vacío, purgando la muestra en una
corriente fluida de gas seco no reactivo o aplicando un procedimiento de adsorción-desorción cíclica. Si resultara apropiado,
los analistas pueden aplicar temperaturas elevadas para aumentar la velocidad a la que los contaminantes abandonan la super-
ficie. Los analistas deben ser precavidos para evitar que se afecte la naturaleza de la superficie y la integridad de la muestra
cuando se desgasifica a temperaturas elevadas. Si se emplea calentamiento, la temperatura y el tiempo de desgasificación re-
comendados deben ser los mínimos requeridos para lograr una medición reproducible de la isoterma de adsorción-desorción.
Los analistas deben determinar la masa de la muestra después de desgasificar o como alternativa, deben determinar la masa
después de la medición de adsorción-desorción. El área superficial total de la muestra debe ser mayor que 1 m2 y de preferen-
cia mayor que 5 mi.
 214 (268) Porosidad por Adsorción-Desorción de Nitrógeno / Pruebas Físicas USP 37

Medición de las Isotermas

Los detalles específicos del proceso de medición dependen del procedimiento usado. Los analistas deben seguir las instruc-
ciones del fabricante para el instrumento usado en particular. La siguiente descripción puede aplicarse de manera general:
- Los analistas deben determinar la presión de vapor saturado del adsorbato, p0 • Es preferible determinar Po de manera ex-
perimental al momento de la medición, aunque los analistas pueden usar un valor calculado.
- Los analistas deben determinar la isoterma de sorción de nitrógeno y deben medir el volumen adsorbido, Vª, a la presión
relativa más baja deseada (p/p 0, el cociente entre la presión de adsorbato medida y la presión de su vapor saturado).
- Los analistas repiten la medición de V0 a valores de presión relativa sucesivamente mayores hasta la máxima presión relati-
va deseada (por lo general, 0,99). Posteriormente, los analistas reducen la presión relativa de manera sucesiva para deter-
minar las cantidades sorbidas en la porción de desorción de la isoterma. Los analistas deben medir al menos 20 puntos en
los segmentos de adsorción y desorción, abarcando un intervalo de presión relativa (p/p 0) de aproximadamente 0,05-
0,99. Los valores p/p,) se pueden distribuir para lograr la mejor resolución de la distribución del tamaño de poro. Cuando
se esté usando únicamente el segmento de desorción para calcular la distribución del tamaño de poro, se pueden usar
menos puntos en el segmento de adsorción.

ANÁLISIS DE DATOS

Análisis de la Isoterma

La isoterma se presenta como una gráfica de la cantidad de nitrógeno adsorbido (en volumen, Vª, o moles, nª) en función de
p/p 0• Los datos de la isoterma también pueden presentarse en formato de tabla. Los tipos de isoterma e histéresis se determi-
nan a partir de la gráfica, comparándola con los ejemplos de las Figuras 1 y 2. Una isoterma tipo 1 es común para materiales
mícroporosos. Una isoterma tipo IV por lo general se presenta en materiales que contienen mesoporos o macroporos peque-
ños.

H1 H2

co
-o
:.a
l....
o
en
-o
co
-o
C'O

-
~
e
C'O
ü

Presión relativa----
Figura 2. Tipos de Ciclos de Histéresis. [Reproducido con autorización y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et
al. Reporting physisorption for gas/sol id systems with special reference to the determination of surface area and porosity (re-
commendations 1984)(1nforme de fisisorción para sistemas de gas/sólido con referencia especial a la determinación del área
superficial y la porosidad. (Recomendaciones 1984). Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 3.]

Generar una gráfica to a 1 para comparar la isoterma de la muestra de prueba con la de una isoterma de referencia también
ayuda a ilustrar la presencia de micro y mesoporosidad. La isoterma de referencia se puede calcular usando una expresión ma-
 USP 37 Pruebas Fisicas / (268) Porosidad por Adsorció11~Desorció11 de Nitrógeno 215

temática, aunque cuando el adsorbente tiene propiedades químicas similares a las de la muestra de prueba, se recomienda
usar una isoterma de referencia determinada de manera experimental.
El método de la gráfica t se basa en la curva t, que es una gráfica de la cantidad de nitrógeno adsorbido en el sólido no
poroso como una función de t, el espesor estadístico de la capa adsorbida. El valor t se calcula mediante:

nm = cantidad de monocapa
jJ0 =espesor de una capa molecular simple, por lo general tomada como 0,354 nm para nitrógeno
En el método de la gráfica a. 1, la cantidad de nitrógeno adsorbido por el sólido no poroso de referencia se normaliza usando
la cantidad adsorbida a alguna presión relativa fija (n',,J, a menudo tomada como 0,4. Posteriormente, la adsorción normaliza-
da a.5 (igual a n0 ln' 0 , ) se grafica contra plp 0 para obtener una curva a 1.
La gráfica to la g'ráfica a.5 se construye graficando la cantidad de nitrógeno adsorbido por la muestra de prueba en función
de to a.5 para el material de referencia, en lugar de plp 0 . La conversión de plp 0 ato a.5 se lleva a cabo tomando como referen-
cia la curva to la curva ªs- La forma de la gráfica depende de la naturaleza de la porosidad presente en la muestra de prueba,
conforme a lo siguiente:
(a) si la gráfica to a.5 es lineal y pasa a través del origen, la muestra de prueba es no porosa o macroporosa.
(b) si la muestra de prueba contiene mesoporos, la gráfica presenta una desviación hacia arriba a la presión relativa corres-
pondiente al comienzo de la condensación capilar en los mesoporos más pequeños
(c) si la muestra de prueba contiene microporos, la gráfica presenta una desviación hacia abajo debido a que no se pueden
desarrollar múltiples capas dentro del espacio limitado en el interior de los microporos.
Algunos materiales contienen combinaciones de poros, lo que puede resultar en una gráfica compleja y difícil de interpretar.
En dichos casos, los analistas deben tener cuidado al analizar la isoterma.

Cálculo de la Distribución del Tamaño de Poro

Este análisis es válido únicamente para cálculos de las distribuciones del tamaño de mesoporos.
El cálculo de la distribución del tamaño de poro se basa en la ecuación de Kelvin:

2xa1 xv1 xcos(O)x10 3

rk = -
R x T x ln(p/ p 0 )

rK =radio del núcleo del poro (o radio de Kelvin) (nm)

a1 =tensión superficial (Nlm) del adsorbato líquido (nitrógeno)
v1 =volumen molar del adsorbato condensado (nitrógeno) (cm 3lmol)
R =constante universal de los gases, 8,3144 (J · K- 1 • mol- 1)
T =temperatura (K)
e= ángulo de contacto del adsorbato (O para una superficie humedecida)
Para nitrógeno, la ecuación 2 se reduce a:

-0.953
rk =----
ln(pl p 0 )

El radio real del poro, rP' se calcula a partir del radio de Kelvin, corrigiendo por el espesor, t, del adsorbato en las paredes del
poro. Para poros cilíndricos, rP = r1 + t, y el diámetro del poro, dP, se obtiene mediante dr = 2(r1 + t). Debido a la diferente
geometría de los poros en forma de ranura con lados paralelos, el ancho de la ranura se obtiene mediante r1 + 2t.
Los analistas pueden calcular la distribución del tamaño de poro por volumen usando el método de Barrett, joyner y Halen-
da. Este modelo asume que los poros son rígidos y tienen una forma regular (p.ej., cilíndrica o en forma de ranura), que no
hay microporos presentes y que la distribución del tamaño de poro no se extiende continuamente sobre los poros más gran-
des que se pueden medir usando este procedimiento, lo cual implica que todos los poros evaluados se llenan a la presión rela-
tiva más alta.
Los cálculos de porosidad y de distribución del tamaño de poro que emplean la ecuación de Kelvin deben realizarse usando
la isoterma de desorción. La ecuación de Kelvin se derivó para sistemas macroscópicos y no es estrictamente válida a la escala
molecular. Por ende, la ecuación de Kelvin se basa en un menisco intacto para describir con exactitud el fenómeno experimen-
tales. Para los sistemas tratados en este capítulo, esto se logra únicamente para la isoterma de desorción. Sin embargo, para la
desorción, la aplicación de la ecuación de Kelvin a tamaños de poro menores se ve limitada por la tensión superficial del adsor-
bato. El límite se ilustra mediante el punto de cierre del ciclo de histéresis en la isoterma. Para nitrógeno, este punto ocurre a
una presión relativa de aproximadamente 0,45, que corresponde a un radio de poro cilíndrico limitante de aproximadamente
2 nm. Por consiguiente, la ecuación de Kelvin no es aplicable a los microporos.
 216 (268) Porosidad por Adsorción--Desorción de Nitrógeno / Pruebas Físicas USP 37

Cálculo del Volumen de Microporos

Si la gráfica to a 1 indica la presencia de microporos, el volumen de los microporos se puede obtener a partir de la intersec-
ción de la porción lineal extrapolada de la curva.

Informe de Resultados

Por lo general, los resultados informados pueden incluir el volumen o la porosidad total de los poros, el volumen de los mi-
croporos, la media o la mediana del diámetro de poro, la distribución del tamaño de poro y el área superficial de los poros.

CALIBRACIÓN V VERIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL SISTEMA

Los analistas deben llevar a cabo la calibración de los componentes individuales de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. La calibración de transductores de presión y de sensores de temperatura se logra con referencia a dispositivos es-
tándar de medición de temperatura y presión que cuentan con calibraciones rastreables a estándares nacionales. La calibración
del volumen del distribuidor múltiple (manifold) se logra a través de las mediciones apropiadas de presión y temperatura,
usando espacios volumétricos con temperatura constante o sólidos con volumen rastreable y conocido.
Un material de referencia certificado o un material de referencia definido localmente que sea rastreable a un material de
referencia certificado debe analizarse de manera regular para monitorear la calibración y el desempeño del instrumento ..._usm

(271) PRUEBA PARA SUSTANCIAS FÁCILMENTE CARBONIZABLES

En las pruebas para sustancias fácilmente carbonizables, a menos que se indique algo diferente, agregar la cantidad especifi-
cada de la sustancia, reducida a polvo fino si se encuentra en forma sólida, en pequeñas porciones al recipiente para compara-
ción que es de vidrio incoloro resistente a la acción del ácido sulfúrico y contiene el volumen especificado de ácido sulfúrico
(ver en Especificaciones de Reactivos en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones).
Revolver la mezcla con una varilla de vidrio hasta completar su disolución, dejar la solución en reposo durante 15 minutos, a
menos que se indique algo diferente, y comparar el color de la solución con el del Líquido de Comparación especificado (ver
Color y Acromatismo (631 )) utilizando un recipiente para comparación, que también es de vidrio incoloro y tiene las mismas
dimensiones internas y cruzadas, observando los líquidos transversalmente contra un fondo de porcelana blanca o de vidrio
blanco.
Cuando se aplica calor para disolver la sustancia en el ácido sulfúrico, mezclar la muestra y el ácido en un tubo de ensayo,
calentar según se indica y transferir la solución al recipiente para comparación para observarla con el Líquido de Comparación
designado (ver Color y Acromatismo (631 )).

(281) RESIDUO DE INCINERACIÓN

Partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y de la Far-
macopea japonesa. Las partes que no están armonizadas se indican con los símbolos (•.). Los textos armonizados de estas far-
macopeas son por lo tanto intercambiables y, en lugar de este capítulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos, se pue-
den usar los métodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento con los requisitos.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado.
La prueba de Residuo de Incineración/Cenizas Sulfatadas emplea un procedimiento para medir la cantidad de sustancia resi-
dual no volatilizada de una muestra cuando ésta se incinera en presencia de ácido sulfúrico conforme al procedimiento que se
describe a continuación. Generalmente esta prueba se emplea para determinar el contenido de impurezas inorgánicas en una
sustancia orgánica.
Procedimiento-Calcinar un crisol adecuado (por ejemplo de sílice, platino, cuarzo o porcelana) a 600 ± 50º durante 30
minutos, enfriar el crisol en un desecador (gel de sílice u otro desecante adecuado) y pesarlo con exactitud. Pesar con exacti-
tud •1 a 2 g de la sustancia º• la cantidad que se especifica en la monografía individual, en el crisol.
Humedecer la muestra con una pequeña cantidad (generalmente 1 mL) de ácido sulfúrico y luego calentar suavemente a
una temperatura tan baja como sea posible hasta que la sustancia se carbonice totalmente. Enfriar; y luego•, a menos que se
indique algo diferente en la monografía individual,. humedecer el residuo con una pequeña cantidad (generalmente 1 mL) de
ácido sulfúrico; calentar suavemente hasta que no se generen humos blancos y calcinar a 600 ± 50º •, a menos que se especifi-
que otra temperatura en la monografía individual,. hasta que el residuo esté completamente incinerado. Asegurarse, durante
USP 37 Pruebas Químicas/ (291) Selenio 21 7

todo el procedimiento, de que no se produzcan llamas en ningún momento. Enfriar el crisol en un desecador (gel de sílice u
otro desecante adecuado), pesar con exactitud y calcular el porcentaje del residuo.
A menos que se especifique algo diferente, si la cantidad del residuo así obtenido excede el límite especificado en la mono-
grafía individual, humedecer nuevamente con ácido sulfúrico, calentar y calcinar como se indicó anteriormente, usando un
período de incineración de 30 minutos, hasta que dos pesadas consecutivas del residuo no difieran en más de 0,5 mg o hasta
que el porcentaje del residuo cumpla con el límite establecido en la monografía individual.
•Realizar la incineración en una campana bien ventilada, pero protegida de las corrientes de aire y a la menor temperatura
posible para lograr la combustión completa del carbón. Puede usarse una mufla, si se desea, cuyo uso para la calcinación final
se recomienda a 600 ± 50º.
La mufla se puede calibrar empleando un termómetro digital adecuado y una sonda termopar de trabajo calibrada contra
un termopar estándar rastreable al Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés).
Verificar la exactitud de los circuitos de medición y control de la mufla mediante la comprobación de la temperatura fijada
para el uso previsto en distintas posiciones dentro de la mufla. Seleccionar las posiciones que reflejen el método de uso even-
tual con respecto a la ubicación de la muestra en análisis. La tolerancia es de± 25º en cada posición medida .•

(291) SELENIO

Solución Madre-Disolver 40,0 mg de selenio metálico en 100 mL de ácido nítrico diluido (1 en 2) en un matraz volumé-
trico de 1000 mL, calentar moderadamente en un baño de vapor, si fuera necesario para completar la disolución, agregar agua
a volumen y mezclar. Pipetear 5 mL de esta solución y transferir a un matraz volumétrico de 200 mL, agregar agua a volumen
y mezclar. Cada mL de la solución resultante contiene la cantidad equivalente a 1 µg de selenio (Se).
Solución de Diaminonaftaleno-Disolver 100 mg de 2,3-diaminonaftaleno y 500 mg de clorhidrato de hidroxilamina en
ácido clorhídrico O, l N para obtener 100 ml. Preparar esta solución el mismo día de su uso.
Solución Estándar-Pipetear 6 mL de Solución Estándar y transferir a un vaso de precipitados de 150 mL, y agregar 25 mL
de ácido nítrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua.
Solución de Prueba-La combustión completa del material de prueba es un factor importante para realizar la prueba. Para
los compuestos que se queman mal y producen hollín, la adición de óxido de magnesio por lo general da como resultado una
combustión más minuciosa y reduce la formación de hollín. Cuando se haya detectado la necesidad de agregar óxido de mag-
nesio, ésta se especificará en la monografía individual. Utilizando un matraz de combustión de 1000 mL y empleando 25 mL
de ácido nítrico diluido (1 en 30) como líquido absorbente, proceder según se indica en Combustión en Matraz con Oxígeno
(471 ), empleando 100 mg a 200 mg de muestra de prueba, a menos que se indique algo diferente en la monografía indivi-
dual. Al finalizar la combustión, colocar algunos mL de agua en el matraz, aflojar el tapón, luego enjuagar el tapón, el porta-
muestras y las paredes del matraz con aproximadamente 1O mL de agua. Transferir la solución a un vaso de precipitados de
150 mL con la ayuda de aproximadamente 20 mL de agua y calentar moderadamente hasta temperatura de ebullición. Calen-
tar a ebullición durante 1O minutos y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
Procedimiento-Tratar concomitantemente y en paralelo la Solución Estándar, la Solución de Prueba y el blanco de reactivos
constituido por 25 mL de ácido nítrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua, según se indica a continuación. Agregar solución de
hidróxido de amonio (1 en 2) para ajustar a un pH de 2,0 ± 0,2. Diluir con agua a 60 mL y transferir a un separador de vidrio
con protección actínica con la ayuda de 1O mL de agua, agregando los 1O n:iL al separador. Agregar 200 mg de clorhidrato de
hidroxilamina, agitar por rotación moderada para disolver; de inmediato agregar 5,0 mL de Solución de Diaminonaftaleno, ta-
par y mezclar por rotación suave. Dejar la solución en reposo a temperatura ambiente durante 100 minutos. Agregar 5,0 mL
de ciclohexano, agitar vigorosamente durante 2 minutos y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y centrifu-
gar el extracto de ciclohexano para eliminar el agua dispersada. Determinar las absorbancias de los extractos de ciclohexano
de la Solución de prueba y de la Solución estándar en una celda de 1 cm, a la longitud de onda de máxima absorción, aproxima-
damente a 380 nm, con un espectrofotómetro adecuado, usando el extracto de ciclohexano del blanco de reactivos como
blanco, y comparar las absorbancias: la absorbancia de la Solución de Prueba no es mayor que la de la Solución Estándar cuando
se ha tomado una muestra de prueba de 200 mg, o no es mayor que la mitad de la absorbancia de la Solución Estándar cuan-
do se ha tomado una muestra de prueba de 100 mg.
 218 (301 > Capacidad Neutralizante de Ac1do / Pruebm Químicas USP 37

OTRAS PRUEBAS Y VALORACIONES

(301) CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE ÁCIDO

NOTA-Todas las pruebas se deben realizar a una temperatura de 37 ± 3 º.

Calibración del Medidor de pH-Calibrar un medidor de pH usando soluciones amortiguadoras de calibración de biftalato
de potasio 0,05 m y de tetraoxalato de potasio 0,05 m como se describe en pH \791 ).
Mezclador Magnético-Tramferír 100 ml de agua a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga una barra mezcla-
dora magnética de 40 mm x 1O nrn1 (u otro tarnario adt'cuacJo; recubierta con teflón y con un anillo de giro en el centro.
Ajustar la velocidad de la barra meLcladora, de forma que cuando la barra mezcladora se centra en el vaso de precipitados, la
velocidad de meLclado sea ele 300 ± 30 rp111, uelt:r 111i11ddd cu1 r un lacúmelr u ÚfJLicu ádecuddo.
Preparación de Prueba-
Po/vos-Transferir a u11 vaso de precipitadm de 250 ml, la porción pesada con exactitud de la sustancia especificada en la
monografía individual, agregar 70 rnl de agua y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto.
Sólidos Efervescentes--Transferir a un vaso de precipitadm de 250 ml, una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a
la dosificación mínima declarada en la etiqueta, agregar 1 O ml de agua y mezclar por rotación moderada el vaso de precipita-
dos mientras se reduce la intensidad de la reacción. Agregar 1 O ml más de agua y mezclar por rotación suave. Lavar las pare-
des del vaso de precipitados con 50 rnl de agua, y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto.
Suspensiones y Otros Líquidos-Agitar el recipiente hasta que el contenido sea uniforme y determinar la densidad. Transferir
a un vaso de precipitados de 250 ml una cantidad de la mezcla uniforme, pesada con exactitud, que equivalga a la dosifica-
ción mínima declarada en la etiqueta, agregar agua hasta obtener un volumen de aproximadamente 70 ml y mezclar en el
Mezclador Magnético durante 1 minuto.
Tabletas de Disolución Bucal--Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas de disolución bucal y determinar el peso prome-
dio. Seleccionar y pesar 2 tabletas de disolución bucal y transferirlas a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga 70 ml
de agua.
Tabletas No Masticables-Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas y determinar el peso promedio de las tabletas. Moler
las tabletas hasta un polvo fino, mezclar para obtener una mezcla uniforme y transferir a un vaso de precipitados de 250 ml
una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a la dosificación mínima declarada en la etiqueta. Si se desea humedecer,
agregar no más de 5 ml de alcohol (neutralizado a un pH aparente de 3,5) y mezclar para humedecer bien la muestra. Agre-
gar 70 ml de agua y mezclar en el Mezclador Magnético durante 1 minuto.
Tabletas Masticables-Preparar según se indica en Tabletas No Masticables.
Tabletas que Deben Masticarse-Transferir 1 Tableta a un vaso de precipitados de 250 ml, agregar 50 ml de agua y mezclar
en el Mezclador Magnético durante 1 minuto.
Cápsulas-Pesar con exactitud no menos de 20 cápsulas. Extraer completamente el contenido de las cápsulas con la ayuda
de un hisopo de algodón si fuera necesario. Pesar con exactitud las cápsulas vacías y determinar el peso promedio del conteni-
do de cada cápsula. Mezclar el contenido combinado de las cápsulas para obtener una mezcla uniforme y proceder según se
indica en Tabletas No Masticables, comenzando donde dice "transferir una cantidad pesada con exactitud".
Procedimiento para Polvos, Sólidos Efervescentes, Suspensiones y Otros Líquidos, Tabletas de Disolución Bucal,
Tabletas No Masticables, Tabletas Masticables y Cápsulas-Pipetear 30,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV y transferir a la
Preparación de Prueba mientras se continúa mezclando con el Mezclador Magnético. [NOTA-Cuando la capacidad neutralizante
de ácido de la muestra en análisis es mayor de 25 mEq, usar 60,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV, y hacer las modificaciones
correspondientes en los cálculos.] Mezclar durante 15 minutos, cronometrados exactamente, después de agregar el ácido, co-
menzar a valorar de inmediato y en un período que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el ácido clorhídrico en exceso
con hidróxido de sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante l O a 15 segundos). Calcular el número de mEq
de ácido consumido por la fórmula:

mEq totales= (30 x NHn) - (VN"oH x N,1, 0 H)

en donde NHci y NNarni son las normalidades del ácido clorhídrico SV y del hidróxido de sodio SV, respectivamente; y VN,,oH es el
volumen de hidróxido de sodio SV usado para la valoración. Expresar el resultado como mEq del ácido consumido por g de la
sustancia analizada.
Procedimiento para Tabletas que Deben Masticarse--Pipetear 30,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV y transferir a la
Preparación de Prueba mientras se continúa mezclando con el Mezclador Magnético durante 1 O minutos, cronometrados con
exactitud, después de agregar el <:Ícidu. lnterr ump1r el mezclado brevemente y retirar sin demora cualquier base gomosa del
vaso de precipitados usando una agu¡a larga. Enjuagar sin demora la aguja con 20 rnl de agua, recogiendo los lavados en el
vaso de precipitado:, y cor1tinuar rrH:'LclancJo durante 5 minutos exactamente cronometrados, después comenzar a valorar de
inmediato y en un período que no exceda lo:, 5 minutos adicionales, valorar el ácido clorhídrico en exceso con hidróxido de
 USP 37 Pruebas Químicas/ (311) Valoración de Alginatos 219

sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 1 O a 15 segundos). Calcular el número de mEq de ácido consumi-
do por la Tableta analizada por la fórmula:

mEq totales= (30 x N11 l ) - (V,,"ui¡ x N,_, 01 ,)

en donde los términos son los definidos anteriormentP.

(311) VALORACIÓN DE ALGINATOS

APARATO
El aparato necesario (ver Figura 7) contiene una válvula dosificadora capilar, A, seguida de un caudalímetro, B, para controlar
y vigilar el flujo de nitrógeno a través del sistema. Se emplean tubos de plástico vinílico halogenado* y una conexión de cau-
cho, C, para conectar el caudalímetro a un brazo lateral de un matraz de reacción, D. El matraz D es un matraz de fondo
redondo, de 250 ml, para ebullición, apoyado en un manto de calefacción adecuado, E. El matraz D está equipado con un
condensador de reflujo de bobina Hopkins de 225 mm, F. El condensador termina en una trampa en U, G, que contiene dos
bandas de 25 g de cinc de malla 20; estas bandas están limitadas y separadas por tres tapones de lana de vidrio de 3 pulgadas.
La trampa termina en un adaptador, H, que por medio de un tubo de plástico vinílico halogenado y un conector con llave de
paso por torsión, 1, se conecta con un frasco lavador de gas de 250 ml, J. El tubo de entrada (burbujeo) se extiende casi hasta
el fondo del frasco de lavado de gas y termina en un disco sinterizado con una porosidad gruesa. El tamaño de todas las juntas
de vidrio es de 24 / 40 , excepto la junta de 45 / 50 del frasco de lavado de gas.
G

Figura 1 . Aparato para Valoración de Alginatos.

APTITUD DEL SISTEMA

Empleando D-glucuronolactona como el estándar, proceder como se indica en el Procedimiento, pero no realizar los pasos
previos a la ebullición. El sistema es adecuado si se cumplen los siguientes criterios: (1) la determinación con un blanco da
como resultado un valor neto de volumetría, C, de entre 0,02 y 0,06 mEq, calculado de la siguiente manera:

Ab - Bb

en donde Ab es el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 N en los 25 ml utilizados y Bb es el número de mEq de ácido
clorhídrico O, 1 N utilizado en la volumetría con un blanco; y (2) el porcentaje de dióxido de carbono, CO,, obtenido a partir
del estándar está entre 24,2% y 25,7%.

* Este tipo de tubos se denominan mm Cm mente tubos Tygon. Esta nota se <1grega il los cf Prtos rle una mdyor claridarl y no implica que la l JW aville este prorlurtn.
 •
220 (311) Valoración de Alginatos /Pruebas Químicas USP 37

PROCEDIMIENTO

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir una muestra de aproximadamente 250 mg,
pesados con exactitud, al matraz de reacción, D, agregar 50 ml de ácido clorhídrico O, 1 N, agregar varias perlas de ebullición
y conectar el matraz al condensador de reflujo, F, empleando ácido fosfórico como lubricante. [NOTA-Se puede emplear grasa
para llaves de paso para las otras conexiones.] Conectar la línea de nitrógeno al brazo lateral del matraz y ajustar el flujo de
agua refrigerante aproximadamente a 2 L por minuto.
[NOTA-Los pasos previos a la ebullición que se describen en este párrafo son opcionales y únicamente es necesario realizar-
los cuando se sospecha de la presencia de carbonatos inorgánicos.] Mantener el flujo de nitrógeno a través del aparato a una
velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto. Acercar el manto de calefacción, E, hasta el matraz, calentar la muestra y llevarla a
ebullición, y mantener una ebullición moderada durante 2 minutos. Apagar la fuente de calor, bajar el manto, E, y dejar que la
muestra se enfríe durante aproximadamente 1O minutos.
Conectar el frasco lavador de gas vacío, J, y purgar el sistema con nitrógeno a una velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto
durante 5 minutos. Reducir el flujo de nitrógeno hasta 60 mL a 65 mL por minuto, agregar al frasco 1O gotas de alcohol butíli-
co, 25,0 mL de hidróxido de sodio 0,25 N SV y 50 mL de agua destilada, enjuagando hacia el interior del frasco lavador de gas
y volver a colocar la tapa. Desconectar la conexión de caucho, C, del brazo lateral y agregar 46 mL de ácido clorhídrico a tra-
vés del brazo lateral del matraz de ebullición. Volver a unir la línea de nitrógeno, acercar el manto de calefacción y calentar la
mezcla de reacción hasta ebullición. Después de 2 horas de ebullición, aumentar el flujo de nitrógeno hasta 90 mL a 100 mL
por minuto, suspender el calentamiento y bajar el manto. Dejar que se enfríe durante 1O minutos. Desconectar y desmontar el
frasco lavador de gas. Empleando un chorro dirigido de agua destilada, enjuagar bien todas las partes del tubo de burbujeo y
tapar, recolectando los lavados en el frasco de lavado de gas. Emplear nitrógeno para forzar suavemente la salida de toda el
agua del tubo de burbujeo. Agregar al frasco inmediatamente 1O mL de solución de cloruro de bario al 10% y una barra de
agitación. Tapar herméticamente y mezclar lentamente durante 1 minuto. Dejar en reposo durante un mínimo de 5 minutos.
Agregar tres gotas de fenolftaleína SR y valorar con ácido clorhídrico O, 1 N SV. Realizar una determinación con un blanco (ver
Valoraciones Volumétricas Residuales en Volumetría (541 )). Calcular el porcentaje de dióxido de carbono, C0 2 , por la fórmula:
2200[(A - B) - C]/(1 OOOW)(l - D)

en donde A es el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 N en los 25 mL empleados; B es el número de mEq de ácido
clorhídrico O, 1 N empleado para la volumetría de la muestra o del estándar; C es el valor neto de volumetría calculado en la
determinación con un blanco; W es el peso, en g, de la muestra o del estándar tomado; y D es el porcentaje expresado hasta
la décima de unidad (1 lugar decimal), obtenido en la prueba de Pérdida por Secado para la muestra o para el estándar.

(341) AGENTES ANTIMICROBIANOS-CONTENIDO

Un componente esencial de las inyecciones conservadas en envases multidosis es el agente o los agentes que se incorporan
para reducir el riesgo de que, en el momento de retirar parte del contenido, se produzca una contaminación microbiana acci-
dental del contenido restante. Es un requisito farmacopeico que la presencia y la cantidad agregada de tal( es) agente(s) cons-
ten en la etiqueta del envase. Los métodos proporcionados aquí para los agentes más usados deben emplearse para demostrar
que el agente declarado está presente pero no excede la cantidad declarada en.la etiqueta en más de 20%.
La concentración de un conservante antimicrobiano agregado a una preparación para uso oftálmico, nasal, ótico y parente-
ral, multidosis o monodosis, puede disminuir durante la vida útil del producto. Por ello, el fabricante debe determinar el nivel
mínimo en el que el conservante resulta eficaz y debe formular el producto de modo que se garantice que este nivel de efecti-
vidad exceda durante toda la vida útil del producto. En el momento de su fabricación, el producto debe contener la cantidad
declarada del conservante anti microbiano (dentro de un ±20% considerando las variaciones originadas en la fabricación y el
análisis). La declaración de la cantidad de conservante que se indica en la etiqueta, no pretende definir la cantidad de conser-
vante a mantener durante la vida útil del producto; sino la cantidad que fue agregada, dentro de las limitaciones del proceso,
y que no se excedió en más de 20%. Un ejemplo de tal declaración en la etiqueta es "_(unidad) agregado como conservan-
te." [NOTA-" __ (unidad)" es un número seguido de la unidad de medida, por ej. 0,015 mg por mL o O, 1%.]
Los agentes más usados incluyen los dos derivados mercuriales, nitrato fenilmercúrico y timerosal, los cuatro ésteres homólo-
gos del ácido p-hidroxibenzoico, fenol, alcohol bencílico y clorobutanol. Para los dos primeros mencionados se emplea el mé-
todo polarográfico, mientras que para la determinación de los otros agentes se emplea la cromatografía de gases cuantitativa.

MÉTODO GENERAL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES

Los procedimientos generales que se establecen a continuación son aplicables a la determinación cuantitativa de alcohol
bencílico, clorobutanol, fenol y los ésteres metílico, etílico, propílico y butílico del ácido p-hidroxibenzoico; estos últimos se
tratan como un grupo pero, si están presentes en forma individual, se los puede determinar por separado. Preparar la Solución
 USP 37 Pruebas Químicas/ (341) Agentes Anti microbianos-Contenido 221

de Estándar Interno y la Preparación Estándar para cada agente según se indica a continuación. A menos que se indique lo con-
trario, preparar la Preparación de Prueba a partir de porciones medidas con exactitud de la Solución de Estándar Interno y la
muestra de la prueba, de tamaño tal que la conce11lració11 del agente y la compmición del disolvente se correspondan estre-
chamente con la concentración y la composición de la Preparación Estándar. En la siguiente tabla se proporcionan los paráme-
tros operativos recomendados para el cromatógrafo de gases; el gas transportador es helio o nitrógeno y el detector es del tipo
de ionización a la llama.
Parámetros Operativos Recomendados para
el Cromatógrafo de Gases
Dimensiones
de la Columna Relleno de la Columna Velocidad de Flujo, Temperatura de
Agente Long. DI Fases y Soporte ml por min. la Columna
Alcohol Benzílico 1,8 m 3mm 5%G16/51A 50 140º
Clorobutdnol 1,8 ni 2 rnn1 5%Gl6.IS1A 20 11 Oº
-~---,.
---------
Fenol 1,2 m 3 mm 5%Gl6/SlA 50 145º
Parabenos 1,8 m 2mm 5%G2/51A 1 20 - - -- 1
150º

Alcohol Bencílico

Solución de Estándar Interno-Disolver aproximadamente 380 mg de fenal en 1 O ml de metanol contenido en un matraz

volumétrico de 200 ml. Agregar agua a volumen y mezclar.
Preparación Estándar-Disolver aproximadamente 180 mg de ER Alcohol Bencílico USP, pesados con exactitud, en
20,0 ml de metanol contenidos en un matraz volumétrico de 1 00 ml. Agregar la Solución de Estándar Interno a volumen y
mezclar.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 5 ~tl) de la Preparación
Estándar y de la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parámetros establecidos en la
tabla adjunta y medir las áreas correspondientes a los picos de alcohol bencílico y fenal. Calcular el contenido, en mg por ml,
de alcohol bencílico (C 7 H8 0) en la muestra tomada, por la fórmula:

en donde C es la concentración, en mg por ml, de alcohol bencílico en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la
muestra de la prueba usada para preparar cada 1 00 ml de la Preparación de Prueba; p, y p 2 son las áreas de los picos del al-
cohol bencílico y el fenal, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de Prueba; y P, y P2 son las áreas de los picos
del alcohol bencílico y el fenal, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Estándar.

Clorobutanol

Solución de Estándar Interno-Transferir aproximadamente 140 mg de benzaldehído a un matraz volumétrico de 100 ml,
agregar 1 O ml de metanol y agitar por rotación moderada para disolver. Diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparación Estándar-Transferir aproximadamente 125 mg de ER Clorobutanol USP, pesados con exactitud, a un matraz
volumétrico de 25 ml. Agregar 2 ml de metanol, agitar por rotación moderada para disolver, diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 5,0 ml de esta solución y 5,0 ml de la Solución de Estándar Interno a un matraz de 25 ml y mezclar para
obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 2,5 mg de clorobutanol por ml.
Preparación de Prueba-Diluir cuantitativamente, si fuera necesario, un volumen medido con exactitud de la muestra de
la prueba con metanol para obtener una solución que no contenga más de aproximadamente 5,0 mg de clorobutanol por ml.
Combinar 3,0 ml de esta solución con 3,0 ml de la Solución de Estándar Interno y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-[NOTA-Ver la tabla adjunta para determinar las dimensiones de la
columna, el relleno de la columna con su fase y soporte, la velocidad de flujo y la temperatura de la columna.] Mantener la
temperatura del inyector a 180º y la del detector, a 220º. Inyectar en el cromatógrafo la Preparación Estándar y registrar el
cromatograma según se indica en el Procedimiento: los tiempos de retención relativos son aproximadamente 0,8 para el ben-
zaldehído y 1,0 para el clorobutanol; la resolución, R, entre el benzaldehído y el clorobutanol no es menor de 2,0; y la desvia-
ción estándar relativa para inyecciones repetidas no es más de 2,0%.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 ~tl) de la Preparación
Estándar y de la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las áreas correspondientes a los picos principales.
Calcular la cantidad, en mg, de clorobutanol (C 4 H7 Cl¡O) en cada ml de la muestra sometida a la prueba, por la fórmula:

en donde Ces la concentración, en mg por ml, de clorobutanol, calculada con respecto a la sustancia anhidra, en la Prepara-
ción Estándar; Les la cantidad declarada, en mg, de clorobutanol en cada ml de la muestra de prueba; Des la concentración,
en mg por ml, de clorobutanol en la Preparación de Prueba, respecto al volumen de la muestra sometida a la prueba y el grado
 222 (341) Agentes Antimicrobianos--Contenido / Pruebas Químicas USP 37

de dilución; y R,, y R<. son los cocientes entre el pico de clorobutanol y el pico de benzaldehído obtenidos a partir de la Prepara-
cion de Prueba y de la Preparanón fstandar, respectivamente.

Fenol

Solución de Estándar Interno-Pipetear 1 ml de ER Alcohol Bencílico USP y transferir a un matraz volumétrico de 500 ml,
agregar metano! a volumen y mezclar.
Preparación Estándar-Disolver aproximadamente 75 mg de ER Fenol USP, pesados con exactitud, en 7,5 ml de metano!
contenidos en un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 20,0 ml de Solución de Estándar Interno, luego agregar agua a volu-
men y mezclar.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 3 pl) de la Preparación
Estándar y la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parámetros establecidos en la
tabla adjunta y medir las áreas correspondientes a los picos de fenol y alcohol bencílico. Calcular el contenido, en mg por ml,
de fenal (C,,H 6 0) en cada ml de la muestra tomada, por la formula:

en donde Ces la concentración, en mg por ml, de fenal en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la muestra de
la prueba usada para preparar 100 ml de la Preparación de Prueba; p 1 y p 2 son las áreas de los picos de fenal y alcohol bencíli-
co, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de Prueba; y P1 y P2 son las áreas de los picos de fenal y alcohol bencí-
lico, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Estándar.

Metilparabeno y Propilparabeno

Solución de Estándar Interno-Colocar aproximadamente 200 mg de benzofenona en un matraz volumétrico de 250 ml,
diluir a volumen con éter y mezclar.
Preparación Estándar-Colocar 100 mg de ER Metilparabeno USP y 1O mg de ER Propilparabeno USP, pesados con exacti-
tud, en un matraz volumétrico de 200 ml, diluir a volumen con Solución de Estándar Interno y mezclar. Colocar 1O ml de esta
solución en un matraz Erlenmeyer de 25 ml y proceder según se indica en la Preparación de Prueba, comenzando desde donde
dice "Agregar 3 ml de piridina".
Preparación de Prueba-Pipetear 1O ml de la muestra sometida a la prueba y 1O ml de la Solución de Estándar Interno en
un separador pequeño. Agitar vigorosamente, permitir que las capas se separen, retirar la capa acuosa y ponerla en un segun-
do separador y transferir la capa de éter a un matraz pequeño a través de un embudo que contenga sulfato de sodio anhidro.
Extraer la capa acuosa con dos porciones de éter de 1O ml y filtrar también los extractos a través del sulfato de sodio anhidro.
Evaporar los extractos combinados en una corriente de aire seco hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 O ml y
luego transferir el residuo a un matraz Erlenmeyer de 25 ml. Agregar 3 ml de piridina, completar la evaporación del éter y
hervir en una placa de calentamiento hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 ml. Enfriar y agregar 1 ml de un
agente silanizante adecuado, como por ejemplo bis(trimetilsi/i/)trifluoroacetamida, bis(trimetilsilil)acetamida o una mezcla de
hexametildisilazano y trimetilclorosilano [2:1 ó 3:1 (v/v)]. Mezclar y dejar en reposo durante no menos de 15 minutos.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (2 ~1L) de la solución silanizada de la Prepara-
ción Estándar y la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parámetros establecidos en
la tabla adjunta y medir las áreas correspondientes a los picos de metilparabeno, propilparabeno y benzofenona. Calcular el
contenido, en pg por ml, de metilparabeno (C 8 H8 0 3) en la muestra sometida a. la prueba, por la fórmula:

en donde CM es la concentración, en ~ig por ml, de metilparabeno en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la
muestra tomada; p 1 y Pi son las áreas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de
la Preparación de Prueba; y P1 y P3 son las áreas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a
partir de la Preparación Estándar. De modo similar, calcular el contenido, en pg por ml, de propilparabeno (C 10 H12 0 3) en la
muestra sometida a la prueba, por la fórmula:

en donde Cp es la concentración, en ~tg por ml, de propilparabeno en la Preparación Estándar; V es el volumen, en ml, de la
muestra tomada; p 2 y Pi son las áreas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir
de la Preparación de Prueba; y P2 y P3 son las áreas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obteni-
dos a partir de la Preparación Estándar.
El etilparabeno y el butilparabeno pueden determinarse de modo similar.
 USP 37 Pruebas Químicas/ <345\ Valoración de Ácido Cítrico/Citrato y Fosfato 223

MÉTODO POLAROGRÁFICO

Nitrato Fenilrner(Úrico

Preparación Estándar-Disolver aproximadamente 100 mg de nitrato fenilmercúrico, pesados con exactit11d, en una solu-
ción de hidróxido de sodio (1 en 250) contenida en un matraz volumétrico de 1000 ml y entibiar si fuera necesario para lograr
una completa disolución, agregar la solución de hidróxido de sodio a volumen y mezclar. Pipetear 1 O ml de esta solución,
transferir a un matraz volumétrico de 25 ml y proceder según se indica en la Preparación de Prueba, comenzando desde donde
dice "agregar 2 ml de solución de nitrato de potasio (1 en 100)."
Preparación de Prueba-Pipetear 1 O ml de la muestra de la prueba, transferir a un matraz volumétrico de 25 ml, agregar
2 ml de solución de nitrato de potasio (1 en 1 00) y 1 O ml de solución amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 (ver Solu-
ciones Amortiguadoras en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones) y, si fuera necesario, ajustar a un pH de 9,2 agregando
ácido nítrico 2 N. Aciregar 1 .5 ml de solución de gelatina recién preparada (1 en 1000), luego agregar la solución amortigua-
dora alcalina de borato de pH 9,2 a volumen y mezclar.
Procedimiento-Pipetear una porción de la Preparación di? Prul?ba y transferir a la celda polarográfica y desairear burbu-
jeando nitrógeno a través de la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodc de gocec de ~ercurio de un polarógrafo
adecuado (ver Po/orografía (801 )) y registrar el polarograma desde -0,6 hasta -1,5 voltios en comparación con el electrodo de
calomel saturado. Determinar la corriente de difusión de la Preparación de Prueba, (i,¡)¡¡, como la diferencia entre la corriente
residual y la corriente limitante. De forma similar y concomitante, determinar la corriente de difusión, (id) 1, de la Preparación
Estándar. Calcular la cantidad, en pg, de nitrato fenilmercúrico (C 6 H 1 HgN0 1 ) en cada ml de la muestra tomada, por la fórmu-
la:

en donde C es la concentración, en µg por ml, de nitrato fenilmercúrico en la Preparación Estándar.

Timerosal

Preparación Estándar-En el día de uso, colocar aproximadamente 25 mg de ER Timerosal USP, pesados con exactitud, en
un matraz volumétrico de 250 ml, agregar agua a volumen y mezclar. Proteger de la luz. Pipetear 15 ml de esta solución en
un matraz volumétrico de 25 ml, agregar 1,5 ml de solución de gelatina (1 en 1000), luego agregar solución de nitrato de
potasio 1 en 1 00 a volumen y mezclar.
Preparación de Prueba-Pipetear 15 ml de la muestra en análisis, transferir a un matraz volumétrico de 25 ml, agregar
1,5 ml de solución de gelatina (1 en 1000), agregar solución de nitrato de potasio (1 en 100) a volumen y mezclar.
Procedimiento-Transferir una porción de la Preparación de Prueba a la celda polarográfica y desairear burbujeando nitró-
geno a través de la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polarógrafo adecuado (ver
Po/orografía (801 )) y registrar el polarograma de -0,2 a -1,4 voltios en comparación con el electrodo de calomel saturado.
Determinar la corriente de difusión, (ici)u, como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante. De forma similar
y concomitante, determinar la corriente de difusión, (id),, de la Preparación Estándar. Calcular la cantidad, en ~tg, de timerosal
(C 6 H 9 HgNa0 2 S) en cada ml de la muestra sometida a la prueba, por la fórmula:

l ,667C[(id)u/Cid)sl

en donde C es la concentración, en µg por ml, de timerosal en la Preparación Estándar y los otros términos son los definidos
anteriormente.

(345) VALORACIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO/CITRATO Y FOSFATO

El siguiente procedimiento general de cromatografía iónica se emplea para determinar el contenido de ácido cítrico/citrato y
fosfato en los artículos farmacopeicos, cuando se especifica en las monografías individuales. Las pruebas de identificación de
citrato y fosfato se explican por separado en el capítulo general de la USP Pruebas de ldentificación--General (191 ). El procedi-
miento para preparar las Preparaciones Estándar empleadas para la valoración depende de si se valoran el citrato y el fosfato
concomitantemente, según se indica a continuación.
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Ácido Cftrico USP.
Fase Móvil-Transferir un volumen adecuado de agua (de una resistividad de no menos de 18 megohm-cm) a un recipien-
te adecuado y desgasificar con helio durante no menos de 20 minutos. Agregar un volumen adecuado de hidróxido de sodio
o hidróxido de potasio al 50% (p/p) libre de carbonato, para obtener una solución de hidróxido de potasio o de hidróxido de
sodio 20 mM. Alternativamente, se puede generar un eluyente de hidroxido de sodio o hidróxido de potasio 20 mM por me-
224 (345) Valoración de Ácido Cítrico/Citrato y Fosfato/ Pruebas Químicas USP 37

dios electrónicos empleando un generador automático de eluyente. [NOTA-Proteger la Fase Móvil del dióxido de carbono at-
mosférico.]
Preparaciones Estándar-Usar la Preparación Estándar 7 sólo para una valoración de ácido cítrico/citrato. Usar la Prepara-
ción Estándar 2 si se pretende realizar una valoración concomitante de citrato y fosfato.
Preparación Estándar 7-Disolver ER Ácido Cítrico USP en hidróxido de sodio 1 mM recién preparado para obtener una solu-
ción con una concentración conocida de aproximadamente 20 ~1g de citrato (C 6 H5 0 7) por ml.
Preparación Estándar 2-Disolver ER Ácido Cítrico USP y fosfato monobásico de sodio en hidróxido de sodio 1 mM recién
preparado para obtener una solución con concentraciones conocidas de aproximadamente 20 µg por ml y 12 µg por ml de
citrato y fosfato (P0 4 ), respectivamente.
Preparación de Valoración para la Valoración de Ácido Cítrico/Citrato-A menos que se especifique algo diferente en la
monografía, disolver una cantidad adecuada de la forma farmacéutica sólida en hidróxido de sodio 1 mM recién preparado
para obtener una solución que contenga aproximadamente 20 ~tg de citrato por ml. Si la forma farmacéutica es una formula-
ción líquida, diluir con agua y agregar una solución de hidróxido de sodio recién preparada para obtener una solución que
contenga aproximadamente 20 µg de citrato por ml en hidróxido de sodio 1 mM.
Preparación de Valoración para la Valoración de Fosfato-A menos que se especifique algo diferente en la monografía,
disolver una cantidad adecuada de la forma farmacéutica sólida en hidróxido de sodio 1 mM recién preparado para obtener
una solución que contenga aproximadamente 12 µg de fosfato por ml. Si la forma farmacéutica es una formulación líquida,
diluir con agua y agregar una solución de hidróxido de sodio recién preparada para obtener una solución que contenga apro-
ximadamente 12 µg de fosfato por ml en hidróxido de sodio 1 mM.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con una columna separadora de
aniones adecuada; una guarda columna de 4 mm x 50 mm y una columna analítica de 4 mm x 250 mm, ambas rellenas con
material L61; y un detector electroquímico con detección de conductividad suprimida mediante una micromembrana supreso-
ra de aniones o un sistema de supresión química adecuado. Mantener todas las columnas a una temperatura de 30º y eluir a
una velocidad de flujo de 2 ml por minuto. [NOTA-Se debe colocar una columna para atrapar aniones antes del inyector para
extraer las trazas de contaminantes aniónicos en la Fase Móvil.] Inyectar en el cromatógrafo la Preparación Estándar 7 o la Pre-
paración Estándar 2, según corresponda, y registrar el cromatograma según se indica en el Procedimiento: el factor de asimetría
no es mayor de 2,0 y la desviación estándar relativa de las áreas de los picos de citrato (y fosfato, según corresponda), para seis
inyecciones repetidas de la Preparación Estándar 7 o de la Preparación Estándar 2, no es más de 1,5%.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo 1 O µL de la Preparación Estándar y de la Preparación de Valora-
ción correspondientes, registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos de citrato y de fosfato según corresponda.
Determinar la concentración de citrato o de fosfato en la porción de Preparación de Valoración tomada, por la fórmula:
Cs(ru/rs)
en donde C5 es la concentración de citrato o fosfato, en µg por ml, en la Preparación Estándar correspondiente; y ru y r5 son las
áreas de los picos de citrato o fosfato obtenidos a partir de la Preparación de Valoración y de la Preparación Estándar, respectiva-
mente.

(351) VALORACIÓN DE ESTEROi DES

El siguiente procedimiento se aplica para determinar los esteroides Farmacopeicos que poseen grupos funcionales reductores
tales como a-cetoles.
Preparación Estándar-Disolver en alcohol una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la mo-
nografía individual, previamente secado en las condiciones especificadas en la monografía individual y pesado con exactitud, y
diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con alcohol para obtener una solución con una concentración de aproxima-
damente 1 O µg por ml. Pipetear 20 ml de esta solución y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 ml con tapón de vidrio.
Preparación de Valoración-Preparar según se indica en la monografía individual.
Procedimiento-A sendos matraces que contienen la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente,
y a un matraz similar que contenga 20,0 ml de alcohol como blanco, agregar 2,0 ml de una solución preparada por disolu-
ción de 50 mg de azul de tetrazolio en 1 O ml de metanol y mezclar. Agregar después a cada matraz 2,0 ml de una mezcla de
alcohol e hidróxido de tetrametilamonio SR (9:1 ), mezclar y dejar en reposo en la oscuridad durante 90 minutos. Sin demora,
determinar al mismo tiempo las absorbancias de las soluciones de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar aproxi-
madamente a 525 nm, utilizando un espectrofotómetro adecuado, contra el blanco. Calcular el resultado por la fórmula dada
en la monografía individual, en donde Ces la concentración, en µg por ml, del Estándar de Referencia en la Preparación Están-
dar; y Au y A5 son las absorbancias de las soluciones de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (371 >Valoración de Coba lamina con Marcador Radioactivo 225

(361) VALORACIÓN DE BARBITÚRICOS

Estándar Interno, Solución del Estándar Interno, Preparación Estándar y Preparación de Valoración-Preparar según
se indica en la monografía individual.
Sistema Cromatográfico-En condiciones típicas, equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la
llama y con una columna de vidrio de 4 mm x 0,9 m rellena con fase líquida Gl O al 3% sobre soporte Sl A de malla 80 a 1OO.
Mantener la temperatura de la columna a 200º ± 1 Oº y mantener el inyector y el detector aproximadamente a 225º, la tempe-
ratura de la columna puede variar dentro de la tolerancia especificada, según sea necesario, para cumplir las especificaciones
de Aptitud del Sistema y proporcionar tiempos de retención apropiados. Emplear un gas trasportador adecuado, tal como nitró-
geno seco, a una velocidad de flujo apropiada, como por ejemplo de 60 ml a 80 ml por minuto. Emplear inyección directa en
la columna. [NOTA-Si el instrumento no está equipado para inyección directa en la columna, emplear un inyector recubierto
de vidrio que se haya lavado sucesivamente con una solución de limpieza de ácido crómico, agua, metanol, cloroformo, una
solución 1 en 1 O de trimetilclorosilano en cloroformo y cloroformo.]
Aptitud del Sistema (ver Cromatografía (621 ))-Inyectar en el cromatógrafo cinco inyecciones repetidas de la Preparación
Estándar y registrar el cromatograma según se indica en el Procedimiento: la desviación estándar relativa para el cociente R5 no
es más de 1,5%. En un cromatograma apropiado, la resolución, R, entre el ácido barbitúrico y el Estándar Interno no es menor
que el valor dado en la monografía individual y el factor de asimetría, T, para cada uno de los dos picos no es mayor de 2,0.
Procedimiento-Inyectar en un cromatógrafo de gases apropiado una porción adecuada (aproximadamente 5 µL) de la
Preparación estándar y registrar el cromatograma. De modo similar, inyectar una porción adecuada de la Preparación de Valora-
ción y registrar el cromatograma. Calcular el contenido de barbiturato o ácido barbitúrico en la muestra de valoración por la
fórmula que se proporciona en la monografía individual, en donde Ru es el cociente de respuesta entre los picos del ácido
barbitúrico y del Estándar Interno en la Preparación de Valoración; Q 5 es el cociente entre el peso del barbitúrico en la forma de
ácido y el del Estándar Interno en la Preparación Estándar; C; es la concentración, en mg por ml, de Estándar Interno en la
Solución de Estándar Interno; y R1 es el cociente de respuesta entre los picos del ácido barbitúrico y del Estándar Interno en la
Preparación Estándar.

(371) VALORACIÓN DE COBALAMINA CON MARCADOR

RADIOACTIVO

Todas las determinaciones de radioactividad requeridas por este método deben hacerse con un equipo de conteo apropia-
do, durante un período de tiempo que sea óptimo de acuerdo con el equipo de conteo específico empleado. Todos los proce-
dimientos deben realizarse varias veces para obtener la mayor exactitud posible.
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Cianocobalamina USP.
Reactivo Marcador de Cianocobalamina-Diluir con agua un volumen medido con exactitud de una solución de cianoco-
balamina radioactiva* para producir una solución que tenga una radioactividad entre 500 y 5000 conteos por minuto por ml.
Agregar 1 gota de creso! por litro de solución preparada y almacenar en un refrigerador.
Estandarización-Preparar en agua una solución de una cantidad de ER (:ianocobalamina USP, pesada con exactitud, que
contenga 20 ~ig a 50 µg por ml. Realizar la valoración entera de una porción de 1 0,0 ml de esta solución, procediendo según
se indica en la Preparación de Valoración, comenzando donde dice "Agregar agua para obtener un volumen medido".
Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono-Mezclar volúmenes iguales de tetracloruro de carbono y cresol reciente-
mente destilado.
Solución de Fosfato-Cianuro-Disolver 100 mg de cianuro de potasio en 1 000 ml de una solución saturada de fosfato
dibásico de sodio y mezclar.
Solución de Butanol-Cloruro de Benzalconio-Diluir una solución de cloruro de benzalconio (17 en 100) con agua (3:1)
y mezclar con 36 volúmenes de alcohol butílico.
Columna de Alúmina-Resina-Colocar un trozo de lana de vidrio en el fondo de un tubo de vidrio que posea una constric-
ción en uno de sus extremos, como por ejemplo una bu reta de 50 ml. Sosteniendo el tubo en posición vertical, agregar un
volumen de una suspensión acuosa espesa de resina de intercambio iónico (ver en la sección Reactivos, Indicadores y Solucio-
nes), suficiente para obtener una columna de resina sedimentada de 7 cm de alto. Cuando el sólido se haya sedimentado par-
cialmente, dejar que el agua drene, de manera que quede sólo 1 cm de líquido encima de la columna de resina y comprimir la
resina suavemente. Luego agregar una suspensión acuosa espesa de alúmina anhidra (que no esté lavada con ácido) suficiente
para aumentar la altura de la columna sedimentada a 1 O cm; dejar que drene el agua hasta que quede aproximadamente a
1 cm por encima de la alúmina. Agregar un trozo de lana de vidrio y lavar la columna, empleando un total de 50 ml de agua y
drenar nuevamente hasta un nivel de 1 cm por encima de la columna. Preparar una columna nueva para cada determinación.

* Una solución de cianocobalamina, transformada en radioactiva mediante la incorporación de 60 co, está disponible de Merck and Co .. lnc., Rahway, Nj 07065.
 226 (371) Valoración de Cobalamina con Marcador Radioactivo / Pruebas Químicas USP 37

Preparación de Valoración-Transferir a un vaso de precipitados una cantidad pesada o un volumen medido de la prepa-
ración a valorar, con una actividad de vitamina B1; equivalente a la de 200 µg a 500 µg de cianocobalamina. Agregar agua
para obtener un volumen medido de no menos de 25 mL; luego agregar 5,0 mL de Reactivo MarcwJor de Cianocobalamina.
Trabajando bajo una campana, agregar 5 mg de nitrito de sodio y 2 mg de cianuro de potasio por cada mL de la solución
resultante. Ajustar la solución con ácido clorhídrico diluido hasta pH 4 aproximadamente y calentar en baño de vapor durante
15 minutos. Enfriar y ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH entre 7,6 y 8,0. Centrifugar o filtrar para
eliminar cualquier sólido no disuelto.
Procedimiento-Transferir la Preparación de Valoración a un frasco de centrífuga de 250 mL, agregar 1 O mL de Solución de
Cresol-Tetracloruro de Carbono, cerrar adecuadamente el frasco con un tapón de vidrio, de polietileno o de goma envuelto en
papel de aluminio, agitar vigorosamente durante 2 a 5 minutos y centrifugar. Retirar y guardar la capa de disolvente inferior.
Repetir la extracción empleando una porción de 5 mL de Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono y combinar los extractos
de las capas de disolvente inferiores en un frasco de centrífuga o separador de 50 mL a 100 mL de capacidad.
Lavar los extractos combinados con porciones sucesivas de 1 O mL de ácido sulfúrico 5 N hasta que el último lavado sea prác-
ticamente incoloro (dos lavados bastan generalmente). Durante cada lavado, agitar durante 2 a 5 minutos, dejar que las capas
se separen, centrifugar si fuera necesario y descartar la capa ácida. Lavar luego con dos porciones sucesivas de 1 O mL de Solu-
ción de Fosfato-Cianuro. Finalmente, lavar con 1 O mL de agua. Descartar todos los lavados.
Al extracto lavado agregarle 30 mL de una mezcla de Solución de Butanol-Cloruro de Benzalconio y tetracloruro de carbono
(2:1 ). Extraer con dos porciones de agua de 5 mL cada una, agitando vigorosamente cada vez durante 1 minuto, centrifugar,
retirar y guardar la capa superior acuosa.
Pasar los extractos acuosos combinados a través de la Columna de Alúmina-Resina a una velocidad de aproximadamente
1 mL por minuto, mantener una capa de 1 cm de líquido sobre la parte superior de la columna, agregando agua según sea
necesario. Descartar los primeros mL incoloros (generalmente alrededor de 5 mL) y recoger el eluato coloreado (generalmente
alrededor de 1 O mL) en un tubo de centrífuga o separador de 50 mL que contenga 500 µL de ácido acético diluido. Extraer el
eluato agitando durante 2 a 5 minutos con 5 mL de Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono y desechar la capa acuosa supe-
rior. Agregar al extracto 5,0 mL de agua, 5 mL de tetracloruro de carbono y 1 O mL de alcohol butílico. Agitar, dejar que se
separe hasta que la capa superior esté transparente y retirar la capa superior acuosa.
Determinar las absorbancias del extracto acuoso en una celda de 1 cm, a 361 nm y 550 nm, con un espectrofotómetro
apropiado, empleando una fuente de iluminación de tungsteno. Hacer la lectura a 361 nm empleando un filtro capaz de redu-
cir la luz dispersada. Calcular el cociente A361 /A550 : la pureza del extracto acuoso es aceptable si el cociente es entre 3, 1 O y
3,40. Si se observa un cociente fuera de este intervalo, purificar el extracto acuoso repitiendo el ciclo de extracción, procedien-
do según se indica en el párrafo anterior.
Si se observa un cociente de absorbancia aceptable en el extracto acuoso, determinar la radioactividad, en conteos por mi-
nuto, empleando un equipo de conteo apropiado durante un período de tiempo óptimo de acuerdo al equipo de conteo es-
pecífico empleado. Promediar los resultados y corregir el promedio por la radioactividad de fondo observada durante dos o
más períodos de 30 minutos.
Cálculos-Calcular el contenido de cobalamina, expresado en µg de cianocobalamina, de la porción tomada para la valora-
ción, por la fórmula:

en donde Res la cantidad, en µg, de cianocobalamina en la porción de la solución estándar tomada; C5 y Cu son los valores de
radioactividad promedio corregidos, expresados en conteos por minuto por mL, de la solución estándar y de la solución de
valoración, respectivamente; y Au y A5 son las absorbancias, determinadas a 361 nm, de la solución de valoración y de la solu-
ción estándar, respectivamente. ·

(381) TAPONES ELASTOMÉRICOS PARA INYECTABLES

INTRODUCCIÓN

Los tapones elastoméricos para los envases usados en los tipos de preparaciones definidas en el capítulo de pruebas genera-
les Inyectables (1 ), están hechos de materiales obtenidos por vulcanización (entrecruzamiento), polimerización, poliadición, o
policondensación de sustancias orgánicas macromoleculares (elastómeros). Las formulaciones de los tapones contienen elastó-
meros naturales o sintéticos y aditivos orgánicos e inorgánicos para facilitar o controlar la vulcanización, impartir propiedades
físicas y químicas o color, o estabilizar la formulación del tapón.
Este capítulo se refiere a tapones usados para el almacenamiento a largo plazo de preparaciones definidas en el capítulo de
pruebas generales Inyectables (1 ). Dichos tapones se utilizan generalmente como parte de un vial, frasco o sistema de envasa-
do de una jeringa prellenada.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 227

Este capítulo se refiere a tapones formulados con sustancias elastoméricas naturales o sintéticas. No concierne a tapones he-
chos de elastómero de silicona; sin embargo, sí se refiere a tapones tratados con silicona (p.ej., Dimeticona, NF). Al efectuar las
pruebas de este capítulo, no es necesario tratar los tapones con si!icona, aunque ninguna restricción prohíbe el uso de tapones
sil iconizados.
Este capítulo también se refiere a tapones recubiertos con otros materiales lubricantes (p.ej., materiales unidos química o
mecánicamente al tapón) no destinados a proporcionar una barrera para el elastómero base, y que de hecho no funcionan
como tal. Al efectuar las pruebas, los tapones con recubrimientos lubricantes sin función de barrera deben analizarse en su
estado recubierto.
Los siguientes comentarios se refieren únicamente a los tapones laminados o recubiertos con materiales destinados a propor-
cionar, o que funcionan como, una barrera para el elastómero base (p.ej., recubrimientos de PTFE o laca). No se permite usar
un material de barrera en un tapón que no cumpla con los requisitos farmacopeicos para convertirlo en uno que sí los cumpla.
Por lo tanto, todas las Pruebas Fisicoquímicas conciernen a la fórmula base de dichos tapones, así como sobre el tapón recubier-
to o laminado. Con el fin de obtener los resultados de las Pruebas Fisicoquímicas, éstas deben efectuarse sobre tapones del mis-
mo compuesto elastomérico sin recubrimiento o laminado, así como al tapón recubierto o laminado. Las Pruebas de Funcionali-
dad corresponden y deben efectuarse usando el tapón elastomérico laminado o recubierto. Las Pruebas Biológicas conciernen
tanto al material de laminación o recubrimiento como a la fórmula base. Las Pruebas Biológicas pueden efectuarse sobre el ta-
pón laminado o recubierto, o sobre el material de laminación o recubrimiento y los tapones del mismo compuesto elastoméri-
co sin recubrimiento o laminado. En este último caso, los resultados deben informarse por separado. La fórmula base usada
para las pruebas fisicoquímicas o biológicas, destinada a sustentar la conformidad farmacopeica de un tapón recubierto con
material de barrera, debería ser similar al tapón recubierto correspondiente en cuanto a configuración y tamaño.
Para todas las pruebas de este capítulo, Tapones Elastoméricos para Inyectables (381 ), efectuadas sobre cualquier tipo de ta-
pón, es importante documentar el tapón en análisis, incluyendo una descripción completa del elastómero y de cualquier lubri-
cante, recubrimiento, laminación o tratamiento aplicado.
Este capítulo establece los límites de prueba para los tapones elastoméricos Tipo 1y Tipo 11. Los tapones Tipo 1 son usados
generalmente para preparaciones acuosas. Los tapones Tipo 11 son los destinados generalmente a preparaciones no acuosas,
que si bien tienen propiedades optimizadas para usos especiales, es posible que no cumplan con todos los requisitos listados
para los tapones Tipo 1 debido a su configuración física, al material de construcción o a ambos. Si un tapón no cumple con
uno o más de los requisitos de prueba para Tipo 1 pero cumple con los requisitos para Tipo 11, se le asigna una clasificación final
de Tipo 11. Todos los tapones elastoméricos adecuados para usar en preparaciones inyectables deben cumplir con los límites de
prueba para Tipo 1o Tipo 11. Sin embargo, no se pretende que esta especificación sirva como único criterio de evaluación para
la selección de dichos tapones.
El uso de este capítulo resulta apropiado al identificar tapones elastoméricos que pueden ser aceptables para usar en prepa-
raciones inyectables basándose en su reactividad biológica, las propiedades fisicoquímicas de su extracto acuoso y su funciona-
lidad.
Los siguientes requisitos para la evaluación de los tapones están fuera del alcance de este capítulo:
- El establecimiento de pruebas y especificaciones para la identificación de tapones
- La verificación de la compatibilidad fisicoquímica entre el tapón y el producto
- La identificación y determinación de seguridad de los lixiviados de los tapones que se encuentran en el producto envasa-
do
- La verificación de la funcionalidad del tapón del producto envasado bajo condiciones reales de almacenamiento y uso
El fabricante del producto inyectable (el usuario final) debe obtener del proveedor del tapón la garantía de que la composi-
ción del tapón no varía y que es igual a la del tapón usado durante las pruebas de compatibilidad. Cuando el proveedor infor-
ma al usuario final de cambios en la composición, se deben repetir las pruebas de compatibilidad, total o parcialmente, depen-
diendo de la naturaleza de los cambios. Los tapones deben almacenarse apropiadamente, limpiarse para remover los contami-
nantes ambientales y las endotoxinas, y para procesos asépticos, esterilizarse antes de usar en el envasado de productos inyec-
tables.

CARACTERÍSTICAS
Los tapones elastoméricos son translúcidos u opacos y no tienen un color característico; éste depende de los aditivos usados.
Son homogéneos y prácticamente libres de rebabas y materiales adventicios (p.ej., fibras, partículas extrañas y residuos de go-
ma).

IDENTIFICACIÓN
Los tapones se hacen de una gran variedad de materiales elastoméricos y recubrimientos poliméricos opcionales. Por esta
razón, está más allá del propósito de este capítulo especificar pruebas de identificación que abarquen todas las posibles presen-
taciones de los tapones. Sin embargo, es responsabilidad del proveedor del tapón y del fabricante del producto inyectable (el
usuario final) verificar la formulación elastomérica del tapón y cualquier recubrimiento o material laminado usado, de acuerdo
con las pruebas de identificación apropiadas. Ejemplos de algunas de las metodologías analíticas de prueba que se pueden
usar incluyen peso específico, análisis del porcentaje de cenizas, determinación del contenido de azufre, prueba FTIR-ATR, ero-
 1

228 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables/ Pruebas Químicas USP 37

matografía en capa delgada de un extracto, espectrofotometría de absorción UV de un extracto o espectrofotometría de ab-

sorción IR de un pirolisado.

PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA

Los tapones elastoméricos deben ajustarse a los requisitos biológicos, fisicoquímicos y de funcionalidad, tanto cuando son
enviados por el proveedor de tapones al fabricante del producto inyectable (el usuario final) como cuando el usuario final los
pone en su estado definitivo, listos para usar.
Para aquellos tapones elastoméricos procesados por el proveedor antes de la distribución al usuario final, el proveedor debe-
rá demostrar el cumplimiento con los requisitos farmacopeicos de los tapones expuestos a dichos pasos de procesamiento y/o
esterilización. De igual manera, si los tapones elastoméricos recibidos por el usuario final son posteriormente procesados o es-
terilizados, el usuario final es responsable de demostrar que los tapones siguen cumpliendo con los requisitos farmacopeicos
después de dichas condiciones de procesamiento y/o esterilización (es decir, en su estado listo para usar). Esto es especialmen-
te importante si los tapones se deben exponer a procesos o condiciones que podrían impactar significativamente las caracterís-
ticas biológicas, fisicoquímicas o de funcionalidad del tapón (p.ej., radiación gamma).
Para tapones que normalmente se lubrican con silicona antes de usar, está permitido efectuar las pruebas fisicoquímicas en
los tapones no lubricados con el fin de evitar una posible interferencia del método y/o dificultades en la interpretación de los
resultados de la prueba. Para tapones suministrados con otros recubrimientos lubricantes sin función de barrera, todas las
pruebas se deben efectuar usando el tapón recubierto.
Para tapones recubiertos o laminados con recubrimientos destinados a proveer una barrera (p.ej., recubrimientos de PTFE o
laca), las pruebas farmacopeicas fisicoquímicas se aplican al elastómero base no recubierto, así como al tapón recubierto. En
este caso, los proveedores son responsables de demostrar el cumplimiento con los requisitos fisicoquímicos farmacopeicos tan-
to del tapón recubierto como del no recubierto, procesado o tratado de forma tal que se simulen las condiciones usadas para
los tapones recubiertos antes del envío al usuario final. El tapón no recubierto sujeto a las pruebas fisicoquímicas debería ser
similar en tamaño y configuración al tapón recubierto correspondiente. Los usuarios finales de los tapones recubiertos son res-
ponsables también de demostrar el continuo cumplimiento con los requisitos fisicoquímicos farmacopeicos del tapón recubier-
to, procesado o tratado en una forma que simule las condiciones típicas empleadas por el usuario final previo al uso.
En todos los casos, al informar los resultados de las pruebas es apropiado documentar todas las condiciones del procesa-
miento, pretratamiento, esterilización o lubricación de los tapones.
La Tabla 7 resume los requisitos de prueba de los tapones y las responsabilidades del proveedor y del usuario final.
Tabla 1
Tipos de Tapones (Tal como Requisitos de Prueba
se Suministran o Utilizan) Pruebas Fislcoquímlcas Pruebas de Funcionalidad Pruebas Biológicas
Tapón con o sin • Estas pruebas son obligatorias. • Estas pruebas son obligatorias. • Estas pruebas son obligatorias.
Recubrimiento de Silicona • El uso de silicona es opcional. • El uso de silicona es opcional. • El uso de silicona es opcional.
• Responsibilidad: proveedor y • Responsibilidad: proveedor y usua- • Responsibilidad: proveedor y
usuario final. rio final. usuario final.
Tapones con Recubrimiento • Estas pruebas se deben • Estas pruebas se deben realizar so- • Estas pruebas se deben realizar so-
Lubricante (Material realizar sobre el tapón recubier- bre el tapón recubierto. bre el tapón recubierto.
Sin Función de Barrera; Diferen- to. • Responsibilidad: proveedor y usua- • Responsibilidad: proveedor y
te de Silicona) • Responsibilidad: proveedor y rio final. usuario final.
usuario final.
Tapones con Recubrimiento • Estas pruebas se deben realizar • Estas pruebas se deben realizar so- • Estas pruebas se deben realizar so-
de Barrera sobre los tapones recubiertos. bre los tapones recubiertos. bre los tapones recubiertos.
• Responsibilidad: proveedor y • Responsibilidad: proveedor y usua- O:
usuario final. rio final.
Y: • Estas pruebas se deben realizar so-
• Estas pruebas se deben realizar bre los tapones sin recubrimiento
sobre los tapones sin recubri- (fórmula base) y al material de la-
miento (fórmula base). minado/recubrimiento (los resulta-
dos se informan por separado).
• Responsibilidad: proveedor. • Responsibilidad: proveedor y
usuario final.

PRUEBAS BIOLÓGICAS

Se establecen dos etapas de pruebas. La primera etapa es la realización de un procedimiento de prueba in vitro según se
describe en el capítulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87). Los materiales que no cumplen con
los requisitos de la prueba in vitro están sujetos a la segunda etapa de pruebas, que es la realización de pruebas in vivo, Prueba
de Inyección Sistémica y Prueba lntracutónea, según los procedimientos presentados en el capítulo de pruebas generales Pruebas
 USP 37 Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 229

de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Los materiales que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no necesitan some-
terse a pruebas in vivo.
Los tapones Tipo 1 y Tipo 11 deben cumplir con los requisitos de las pruebas de reactividad biológica in vitro o in vivo.
[NOTA-Ver también el capítulo de información general Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos,
Dispositivos Médicos e Implantes (1031 ).]

PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Preparación de la Solución S

Colocar dentro de un recipiente de vidrio adecuado, tapones enteros, sin cortar, que equivalgan a un área superficial de
100 ± 1O cm 2 • Cubrir los tapones con 200 mL de Agua Purificada o Agua para Inyección. Si no es posible conseguir el área
superficial de tapón prescrita (1 00 ± 1O cm 2 ) usando tapones sin cortar, seleccionar el número de tapones que se aproximen
mejor a los 100 cm 2 , y ajustar el volumen de agua usado al equivalente de 2 mL por cada 1 cm 2 de área superficial real de
tapón utilizada. Calentar a ebullición durante 5 minutos y enjuagar cinco veces con Agua Purificada o Agua para Inyección.
Colocar los tapones lavados en un matraz Erlenmeyer de vidrio Tipo 1 con cuello ancho (ver Envases-Vidrio (660)), agregar
la misma cantidad de Agua Purificada o Agua para Inyección agregada inicialmente a los tapones, y pesar. Cubrir la boca del
matraz con un vaso de precipitados de vidrio Tipo l. Calentar en un autoclave hasta alcanzar una temperatura de 121 ± 2º den-
tro de 20 a 30 minutos y mantenerla durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente durante un periodo de aproximada-
mente 30 minutos. Agregar Agua Purificada o Agua para Inyección para completar de nuevo la masa original. Agitar e inme-
diatamente decantar y recoger la solución. [NOTA-Esta solución se debe agitar antes de usarse en cada una de las pruebas.]

Preparación del Blanco

Preparar una solución blanco en forma similar, usando 200 mL de Agua Purificada o de Agua para Inyección, pero omitiendo
los tapones.

Apariencia de la Solución (Turbidez/Opalescencia y Color)

Determinación de Turbidez (Opalescencia)

NOTA-La determinación de turbidez se puede efectuar por comparación visual (Procedimiento A), o instrumentalmente, con
un turbidímetro de relación adecuado (Procedimiento 8). Para mayor información sobre turbidimetría, ver Espectrofotometría y
Dispersión de Luz (851 ). La evaluación instrumental de transparencia constituye una prueba más sensible que no depende de la
agudeza visual del analista.
Solución de Sulfato de Hidrazina-Disolver 1,0 g de sulfato de hidrazina en agua y diluir con agua hasta 100,0 ml. Dejar en
reposo durante 4 a 6 horas.
Solución de Hexametilentetramina-Disolver 2,5 g de hexametilentetramina en 25,0 mL de agua en un matraz Erlenmeyer de
vidrio tapado de 100 ml.
Suspensión Madre de Opalescencia-Agregar 25,0 mL de Solución de Sulfato de Hidrazina a la Solución de Hexametilentetrami-
na en el matraz. Mezclar y dejar en reposo durante 24 horas. Esta suspensión es estable durante un período de 2 meses, siem-
pre y cuando se almacene en un envase de vidrio sin defectos en su superficie. La suspensión no debe adherirse al vidrio y
debe mezclarse bien antes de usar.
Suspensión del Estándar de Opalescencia-Preparar una suspensión diluyendo 15,0 mL de la Suspensión Madre de Opalescen-
cia con agua hasta 1000,0 mL. La Suspensión del Estándar de Opalescencia es estable durante aproximadamente 24 horas des-
pués de la preparación.
Suspensiones de Referencia-Preparar de acuerdo con la Tabla 2. Mezclar y agitar antes de usar. [NOTA-Las suspensiones de
formacina estabilizada que se pueden usar para preparar estándares de turbidez estables y diluidos, están disponibles comer-
cialmente y se pueden usar después de la comparación con los estándares preparados como se ha descrito.]
Tabla 2
Suspensión de Referen- Suspensión de Referen- Suspensión de Referen- Suspensión de Referen-
da A da B da e da D
Estándar de Opalescencia 5,0 ml 10,0 ml 30,0 ml 50,0 ml
Agua 95,0 ml 90,0 ml 70,0 ml 50,0 ml
Unidades de Turbidez Nefe- 3 NTU 6 NTU 18 NTU 30 NTU
lométrica

Procedimiento A: Comparación Visual-Usar tubos de prueba idénticos, de vidrio neutro, incoloro y transparente con base
plana y un diámetro interno de 15 a 25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de líquido de 40 mm con Solución S, un tubo
hasta la misma altura con agua, y cuatro tubos más hasta la misma altura con Suspensiones de Referencia A, B, C y D. Comparar
las soluciones bajo luz diurna difusa 5 minutos después de la preparación de las Suspensiones de Referencia, observándolas verti-
 •
230 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables/ Pruebas Químicas USP 37

calmente contra un fondo negro. Las condiciones de luz deben ser tales que la Suspensión de Referencia A puede distinguirse
fácilmente del agua y la Suspensión de Referencia B puede distinguirse fácilmente de la Suspensión de Referencia A.
Requisito-La Solución S no es más opalescente que la Suspensión de Referencia 8 para tapones Tipo 1y no más opalescente
que la Suspensión de Referencia C para tapones Tipo 11. La Solución S se considera transparente si su transparencia es igual que la
del agua cuando se examina según se describió anteriormente o si su opalescencia no es más pronunciada que la de Suspen-
sión de Referencia A (ver la Tabla 3).
Procedimiento B: Comparación Instrumental-Medir la turbidez de las Suspensiones de Referencia en un turbidímetro calibrado
adecuado (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )). Medir el blanco y corregir los resultados por el blanco. Las Suspen-
siones de Referencia A, B, C y D representan 3, 6, 18 y 30 Unidades de Turbidez Nefelométrica (NTU, por sus siglas en inglés),
respectivamente. Medir la turbidez de la Solución S con el turbidímetro calibrado.
Requisito-La turbidez de la Solución S no es mayor que la de la Suspensión de Referencia B (6 NTU FTU) para tapones Tipo 1y
no es mayor que la de la Suspensión de Referencia C (18 NTU FTU) para tapones Tipo 11 (ver la Tabla 3).
Tabla 3
Método de Comparación
Requisitos de Procedimiento A Procedimiento B
Opalescencia {Visual) {Instrumental)
Tapones Tipo 1 No más opalescente que la Suspensión B No más de 6 NTU
Tapones Tipo 11 No más opalescente que la Suspensión C No más de 18 NTU

Determinación de Color
Estándar de Color-Preparar una solución diluyendo 3,0 mL de Líquido de Comparación O (ver Color y Acromatismo (631 ))
con 97,0 mL de ácido clorhídrico diluido.
Procedimiento-Usar tubos idénticos de vidrio neutro, incoloro y transparente con base plana y un diámetro interno de 15 a
25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de líquido de 40 mm con Solución S y el segundo con Estándar de Color. Comparar los
líquidos bajo luz diurna difusa, observándolos verticalmente contra un fondo blanco.
Requisito-La Solución S no está más intensamente coloreada que el Estándar de Color.

Acidez o Alcalinidad
Solución de Azul de Bromotimol-Disolver 50 mg de azul de bromotimol en una mezcla de 4 mL de hidróxido de sodio 0,02
M y 20 mL de alcohol. Diluir con agua hasta 100 ml.
Procedimiento-A 20 mL de Solución S, agregar O, 1 mL de Solución de Azul de Bromotimol. Si la solución es amarilla, valorar
con hidróxido de sodio 0,01 N hasta alcanzar un punto final azul. Si la solución es azul, valorar con ácido clorhídrico 0,01 N
hasta alcanzar un punto final amarillo. Si la solución es verde, es neutra y no se requiere una valoración.
Corrección del Blanco-Probar 20 mL de Blanco de manera similar. Corregir los resultados obtenidos para la Solución S, sus-
trayendo o agregando el volumen de la solución volumétrica requerida para el Blanco según sea apropiado. (Ver Volumetría
(541 ).)
Requisito-No más de 0,3 mL de hidróxido de sodio 0,01 N producen un color azul, o no más de 0,8 mL de ácido clorhídri-
co 0,01 N producen un color amarillo o no se requiere una valoración.

Absorbancia
Procedimiento-[NOTA-Efectuar esta prueba dentro de las 5 horas de la preparación de la Solución S.] Pasar la Solución S a
través de un filtro con tamaño de poro 0,45 µm, desechando los primeros mL de filtrado. Medir la absorbancia del filtrado a
una longitud de onda entre 220 y 360 nm en una celda de 1 cm, usando el blanco en una celda pareada en el haz de referen-
cia. Si se requiere diluir el filtrado antes de medir la absorbancia, corregir los resultados de la prueba por la dilución.
Requisito-Las absorbancias a estas longitudes de onda no exceden de 0,2 para tapones Tipo 1o 4,0 para tapones Tipo 11.

Sustancias Reductoras
Procedimiento-[NOTA-Efectuar esta prueba dentro de las 4 horas de la preparación de la Solución S.] A 20,0 mL de Solución
S, agregar 1 mL de ácido sulfúrico diluido y 20,0 mL de permanganato de potasio 0,002 M. Calentar a ebullición durante 3
minutos. Enfriar, agregar 1 g de yoduro de potasio, y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 M, usando 0,25 mL de
solución de almidón SR como indicador. Efectuar una valoración usando 20,0 mL de blanco y anotar la diferencia en volumen
de tiosulfato de sodio 0,01 M requerido.
Requisito-La diferencia entre los volúmenes de las valoraciones no es mayor de 3,0 mL para tapones Tipo 1y no es mayor
de 7,0 mL para tapones Tipo 11.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 231

Metales Pesados

Procedimiento-Proceder según se indica en Método 1 en Meta/e~ Pe~adm (231 ). Preparar la Preparación de Prueba usando
10,0 mL de Solución S.
Requisito-La Solución S contiene no más de 2 ppm de metales pesados como plomo.

Cinc Extraíble

Solución de Prueba-Preparar una Solución de Prueba diluyendo 10,0 mL de Solución S con ácido clorhídrico O, 1 N hasta
100 mL. Preparar un blanco de prueba de forma similar, usando el Blanco en lugar de la Solución S.
Solución Estándar de Cinc-Preparar una solución (1 O ppm de Zn) disolviendo sulfato de cinc en ácido clorhídrico O, 1 N.
Soluciones de Referencia-Preparar no menos de tres Soluciones de Referencia, diluyendo la Solución Estándar de Cinc con áci-
do clorhídrico O, 1 N. Las concentraciones de cinc en estas Soluciones de Referencia deben abarcar el límite esperado para la
Solución de Prueba.
Procedimiento-Usar un espectrofotómetro de absorción atómica apropiado (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz
(851 )) equipado con una lámpara de cinc de cátodo hueco y una llama de aire-acetileno. Se puede usar un procedimiento
alterno tal como un análisis de plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés) apropiadamente validado.
Probar cada una de las Soluciones de Referencia en la línea de emisión de cinc a 213,9 nm por lo menos tres veces. Registrar
las lecturas estables. Enjuagar el aparato con la solución del blanco de prueba cada vez, para garantizar que la lectura retorna
al valor inicial del blanco. Preparar una curva de calibración a partir de la media de las lecturas obtenidas para cada Solución de
Referencia. Registrar la absorbancia de la Solución de Prueba. Determinar la concentración de cinc en ppm de la Solución de
Prueba usando la curva de calibración.
Requisito-La Solución S contiene no más de 5 ppm de cinc extraíble.

Amonio

Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina-Preparar una solución de 100 mL que contenga 11 g de yoduro de po-
tasio y 15 g de yoduro mercúrico en agua. Inmediatamente antes de usar, mezclar 1 volumen de esta solución con un volu-
men igual de una solución de hidróxido de sodio de 250 g por L.
Solución de Prueba-Diluir 5 mL de Solución S con agua hasta 14 ml. Alcalinizarla, si fuera necesario, agregando hidróxido
de sodio 1 N y diluir hasta 15 mL con agua. Agregar 0,3 mL de Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina y cerrar el
recipiente.
Solución Estándar de Amonio-Preparar una solución de cloruro de amonio en agua (1 ppm NH 4 ). Mezclar 1O mL de la solu-
ción de cloruro de amonio de 1 ppm con 5 mL de agua y 0,3 mL de Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina. Cerrar
el recipiente.
Requisito-Después de 5 minutos, cualquier color amarillo en la Solución de Prueba no es más oscuro que el de la Solución
Estándar de Amonio (no más de 2 ppm de NH 4 en la Solución S).

Sulfuros Volátiles

Procedimiento-Colocar tapones, cortados si fuera necesario, con un área superficial total de 20 ± 2 cm 2 en un matraz de
100 mL y agregar 50 mL de una solución de ácido cítrico de 20 g por L. D~ la misma manera y en forma simultánea, preparar
una solución de control en otro matraz de 100 mL, disolviendo O, 154 mg de sulfuro de sodio en 50 mL de una solución de
ácido cítrico de 20 g por L. Colocar un trozo de papel de acetato de plomo sobre la boca de cada matraz y asegurarlo en
posición, poniendo sobre él un frasco para pesada invertido. Calentar los matraces en un autoclave a 121 ± 2º durante 30 mi-
nutos.
Requisito-Cualquier mancha negra en el papel, producida por la solución de prueba, no es más intensa que la producida
por la solución de control.

PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD

NOTA-Las muestras tratadas según se describió para la preparación de la Solución S y secadas al aire, se deben usar para las
Pruebas de Funcionalidad de Penetrabilidad, Fragmentación y Capacidad de Autosel/ado. Las Pruebas de Funcionalidad se efectúan
en tapones destinados a ser perforados por una aguja hipodérmica. La prueba de Capacidad de Autosellado se requiere sólo
para tapones destinados a envases multidosis. La aguja especificada para cada prueba es una aguja hipodérmica lubricada de
bisel largo (ángulo de bisel: 12 ± 2º) 1 •

1 Consultar ISO 7864, Agujas hipodérmicas estériles para único uso con un diámetro externo de 0,8 mm (Calibre 21 ).
232 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables / Pruebas Químicas USP 37

Penetrabilidad
Procedimiento-Llenar con agua 1O viales adecuados hasta el volumen nominal, colocar los tapones a examinar y asegurar
con una tapa. Usando una aguja hipodérmica nueva, según se describió anteriormente, para cada tapón, perforar el tapón con
la aguja perpendicular a la superficie.
Requisito-La fuerza de la perforación no es mayor que 1O N (1 kgf) para cada tapón, determinada con una exactitud de ±
0,25 N (25 gf).

Fragmentación
Tapones para Preparaciones Líquidas-Llenar con agua 12 viales limpios hasta 4 mL menos de la capacidad nominal. Colocar
los tapones a examinar, asegurarlos con una tapa y dejar en reposo durante 16 horas.
Tapones para Preparaciones Secas-Colocar los tapones a examinar en 12 viales limpios y asegurar cada uno con una tapa.
Procedimiento-Usando una aguja hipodérmica según se describió anteriormente, colocada en una jeringa limpia, inyectar
dentro de cada vial 1 mL de agua mientras se retira 1 mL de aire. Repetir este procedimiento cuatro veces para cada tapón,
perforando cada vez en un sitio diferente. Usar una aguja nueva para cada tapón, verificando que no se vuelva roma durante la
prueba. Filtrar el volumen total de líquido en todos los viales a través de un único filtro con un tamaño de poro nominal no
mayor que 0,5 µm. Contar los fragmentos de caucho que se puedan ver a simple vista en la superficie del filtro.
Requisito-No hay más de cinco fragmentos visibles. Este límite se basa en la suposición de que los fragmentos con un diá-
metro >50 µm se pueden ver a simple vista. En caso de duda o controversia, examinar las partículas microscópicamente para
verificar su naturaleza y tamaño.

Capacidad de Autosellado
Procedimiento-Llenar 1O viales adecuados con agua hasta el volumen nominal. Colocar los tapones a examinar y tapar.
Usando una jeringa hipodérmica nueva para cada tapón, según se describió anteriormente, perforar cada tapón 1O veces en
un sitio diferente cada vez. Sumergir los 1O viales en una solución de azul de metileno al O, 1% (1 g por L) y reducir la presión
externa en 27 kPa durante 1O minutos. Restablecer la presión atmosférica y dejar los viales sumergidos durante 30 minutos.
Enjuagar el exterior de los viales.
Requisito-Ninguno de los viales contiene vestigios de solución azul.

(391) VALORACIÓN DE EPINEFRINA

Estándares de Referencia USP (11 )-ER Bitartrato de Epinefrina USP.

Solución Ferro-Cítrica-El día en que se va a utilizar, disolver 1,5 g de sulfato ferroso en 200 mL de agua, a los que se ha
agregado 1,0 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 12) y 1,0 g de bisulfito de sodio. Disolver 500 mg de citrato de sodio en
1O mL de esta solución y mezclar.
Solución Amortiguadora-En un matraz volumétrico de 50 mL, mezclar 4,2 g de bicarbonato de sodio, 5,0 g de bicarbo-
nato de potasio y 18 mL de agua (no todos los sólidos se disolverán en esta etapa). A otros 18 mL de agua, agregar 3,75 g de
ácido aminoacético y 1,7 mL de hidróxido de amonio 6 N; mezclar para disolver y transferir esta solución al matraz volumétri-
co de 50 mL que contiene la otra mezcla. Diluir a volumen con agua y mezclar hasta dilución completa.
Preparación Estándar-Transferir aproximadamente 18 mg de ER Bitartrato de Epinefrina USP pesados con exactitud, a un
matraz volumétrico de 100 mL con ayuda de 20 mL de solución de bisulfito de sodio (1 en 50), diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con solución de bisulfito de
sodio (1 en 500) y mezclar. [NOTA-Hacer la dilución final en el momento de llevar a cabo la valoración.] La concentración de
ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparación Estándar es aproximadamente 18 µg por ml.
Preparación de Valoración-Transferir a un matraz volumétrico de 50 mL un volumen medido con exactitud de la Inyec-
ción a valorar, que equivalga aproximadamente a 500 µg de epinefrina, diluir a volumen con solución de bisulfito de sodio (1
en 500), si fuera necesario, y mezclar. [NOTA-La concentración final de bisulfito de sodio está en el intervalo de 1 a 3 mg por
mL, teniendo en cuenta todo el bisulfito presente en la Inyección a valorar.]
Procedimiento-A tres matraces Erlenmeyer de 50 mL con tapones de vidrio, transferir sendas alícuotas de 20,0 mL de la
Preparación Estándar, de la Preparación de Valoración y de la solución de bisulfito de sodio (1 en 500) para proporcionar el blan-
co. A cada matraz, agregar 200 µL de Solución Ferro-Cítrica y 2,0 mL de Solución Amortiguadora, mezclar y dejar las soluciones
en reposo durante 30 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones en celdas de 5 cm a la longitud de onda de máxi-
ma absorción, aproximadamente a 530 nm, con un espectrofotómetro apropiado, utilizando el blanco para ajustar el instru-
mento. Calcular la cantidad, en mg, de epinefrina (C 9 H, 3 N0 3) en cada mL de Inyección, por lil fórmula:
(183,21 /333,30)(0,05C/V)(Au/A 5)
 USP 37 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 233

en donde 183,21 y 333,30 son los pesos moleculares de epinefrina y bitartrato de epinefrina, respectivamente; Ces la concen-
tración, en pg por mL, de ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparación Estándar; y V es el volumen tomado, en mL, de
Inyección.

(401) GRASAS Y ACEITES FIJOS

Las siguientes definiciones y procedimientos generales se aplican a grasas, aceites fijos, ceras, resinas, bálsamos y sustancias
similares.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Si la muestra de aceite se presenta turbia debido a la presencia de estearina, entibiar el recipiente en un baño de agua a 50º
hasta que el aceite quede transparente; si el aceite no se clarifica al entibiarlo, filtrarlo a través de un papel de filtro seco en un
embudo dentro de una camisa de agua caliente. Mezclar minuciosamente y pesar de una vez tantas porciones como sean ne-
cesarias para las distintas determinaciones, empleando preferiblemente una botella que tenga una pipeta gotero o una bureta
de pesaje. Si la muestra se solidifica a temperatura ambiente, mantenerla fundida hasta que se hayan tomado las porciones
necesarias.

PESO ESPECÍFICO

Determinar el peso específico de una grasa o aceite según se indica en Peso Específico (841 ).

TEMPERATURA DE FUSIÓN

Determinar la temperatura de fusión según se indica para las sustancias de Clase 11 (ver Intervalo o Temperatura de Fusión
(741)).

ÍNDICE DE ACIDEZ (ÁCIDOS GRASOS LIBRES)

La acidez de las grasas y los aceites fijos en esta farmacopea pueden expresarse como el número de mL de álcali O, 1 N re-
querido para neutralizar los ácidos libres en 10,0 g de sustancia. La acidez se expresa frecuentemente como el Índice de Aci-
dez, que es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para neutralizar los ácidos libres en 1,0 g de la sustancia. A
menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l.

Método 1

Procedimiento-A menos que se especifique algo diferente, disolver aproximadamente 10,0 g de la sustancia, pesados con
exactitud, en 50 mL de una mezcla de volúmenes iguales de alcohol y éter (que se haya neutralizado a la fenolftaleína con
hidróxido de potasio O, 1 N o hidróxido de sodio O, 1 N, a menos que se especifique algo diferente) contenidos en un matraz.
Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente frío, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lenta-
mente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agregar 1 mL de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de
potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que la solución permanezca de color ligeramente rosado después de
agitar durante 30 segundos. Calcular el Índice de Acidez o el volumen de álcali O, 1 N requerido para neutralizar 10,0 g de
muestra (ácidos grasos libres), según corresponda. Calcular el Índice de Acidez:

Resultado= (M, x \!) x (N/W)

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

V= volumen (mL)
N = normalidad de la solución de hidróxido de potasio o la solución de hidróxido de sodio
W = peso de la muestra tomada (g)
Si el volumen de hidróxido de potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV requerido para la volumetría es menos de
2 mL, puede utilizarse una solución volumétrica más diluida o ajustar el tamaño de la muestra de acuerdo con las necesidades.
Los resultados pueden expresarse en términos del volumen de solución volumétrica utilizado o en términos del volumen equi-
valente de hidróxido de potasio O, 1 N o hidróxido de sodio O, 1 N.
Si se ha saturado el aceite con dióxido de carbono para preservarlo, someter la solución de alcohol-éter a reflujo suavemente
durante 1O minutos antes de la volumetría. También se puede eliminar el dióxido de carbono del aceite, exponiéndolo al vacío
durante 24 horas dentro de una cápsula de poca profundidad en un desecador, antes de pesar las muestras de prueba.
 234 (401) Grasas y Aceites Fijos / Pruebas Químicos USP 37

Método 11

Procedimiento-Preparar 125 ml de una mezcla de disolventes que contenga volúmenes iguales de alcohol isopropílico y
tolueno. Antes de su uso, agregar 2 ml de una solución de fenolftaleína al 1% en alcohol isopropílico a la mezla de 125 ml y
neutralizar con álcali hasta que se produzca un color rosado leve pero permanente. Pesar con exactitud la cantidad adecuada
de una muestra líquida bien mezclada, indicada en la Tabla 7 y disolverla en la mezcla de disolventes neutralizada. Si la mues-
tra de prueba no se disuelve en el disolvente frío, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lentamente, agi-
tando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agitar vigorosamente mientras se valora con hidróxido de potasio O, 1
N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que se produzca el primer color rosado permanente, de la misma intensidad que la
del disolvente neutralizado antes de mezclar con la muestra. Calcular el Índice de Acidez según se indica en el Método l.
Tabla 1
Índice de Acidez Peso de Muestra (g)
0-1 20
1-4 10
4-15 2,5
15-74,9 0,5
275,0 0,1

ÍNDICE DE ESTERIFICACIÓN

El Índice de Esterificación es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para saponificar los ésteres en 1,0 g de la
sustancia. Si se han determinado el Índice de Saponificación y el Índice de Acidez, la diferencia entre éstos dos representa el
Índice de Esterificación, es decir, Índice de Esterificación = Índice de Saponificación - Índice de Acidez.
Procedimiento-Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 ml, agregar 20-
30 ml de alcohol neutralizado y agitar. Agregar 1 ml de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N
SV hasta que se neutralice el ácido libre. Agregar 25,0 ml de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV y proceder según se
indica en Índice de Saponificación, comenzando donde dice "Calentar el matraz", pero omitiendo la adición posterior de fenolf-
taleína SR. Calcular el Índice de Esterificación:

Resultado= [M, x (Va - Vr) x N]/W

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

Va= volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (ml)
Vr =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba real (ml)
N = normalidad exacta del ácido clorhídrico
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)

ÍNDICE DE HIDROXILO

El Índice de Hidroxilo es el número de mg de hidróxido de potasio equivalente al contenido de hidroxilo de 1,0 g de la sus-
tancia.
Reactivo de Piridina-Anhídrido Acético-Antes de usar, mezclar 3 volúmenes de piridina recientemente abierta o recién
destilada con 1 volumen de anhídrido acético recién abierto o recién destilado.
Procedimiento-Transferir una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud y ajustada a la Tabla 2, a un matraz Erlenme-
yer de 250 ml con tapón de vidrio y agregar 5,0 ml de Reactivo Piridina-Anhídrido Acético. Transferir 5,0 ml de Reactivo Piridi-
na-Anhídrido Acético a un segundo matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio para proporcionar el blanco del reactivo.
Equipar ambos matraces con condensadores de reflujo con juntas de vidrio adecuadas, calentar en un baño de vapor durante
1 hora, agregar 1O ml de agua a través de cada condensador y calentar en el baño de vapor durante 1O minutos adicionales.
Enfriar y agregar 25 ml de alcohol butílico previamente neutralizado a la fenolftaleína SR con hidróxido de potasio alcohólico
0,5 N a cada matraz, vertiendo 15 ml a través de cada condensador y lavando las paredes de cada matraz con las porciones
de 1O ml restantes después de retirar los condensadores. Agregar 1 ml de fenolftaleína SR a cada matraz y valorar con hidróxi-
do de potasio alcohólico 0,5 N SV, registrando el volumen, en ml, consumido por el ácido residual en la solución de prueba
como Ty el consumido por el blanco como B. En un matraz Erlenmeyer de 125 ml, mezclar aproximadamente 1O g de la
sustancia, pesada con exactitud, con 1O ml de piridina recién destilada y previamente neutralizada a la fenolftaleína SR, agre-
gar 1 ml de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV, registrando el volumen, en ml, consumi-
do por el ácido libre en la muestra de prueba como A. Calcular el Índice de Hidroxilo:

Resultado= [(M, X N)/W] X {B + [(W X A)/C] - n

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11
N = normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico
 USP 37 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 235

W = peso de la sustancia tomada para la acetilación (g)

e= peso de la sustancia tomada para la determinación de ácido libre (g)
Si se conoce el Índice de Acidez para la sustancia de prueba, calcular el Índice de Hidroxilo:
Resultado= [(M, x N)!W] x (B - T) +Índice de Acidez

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

N = normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico
W = peso de la sustancia tomada para la acetilación (g)
Tabla 2
Intervalo del Índice Peso de la Muestra de Prueba
de Hidroxilo (g)
0-20 ---~ ----~~
10
20-50 5
50-100 3
100-150 2
150-200 1,5
200-250 1,25
250-300 1,0
300-350 0,75

ÍNDICE DE YODO
El Índice de Yodo representa el número de g de yodo absorbido, en las condiciones prescritas, por 100 g de la sustancia. A
menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, determinar el Índice de Yodo mediante el Método l.

Método 1 (Método de Hanus)

Procedimiento-Transferir una cantidad de la muestra pesada con exactitud, según se determina en la Tabla 3, a un ma-
traz para yodo de 250 ml, disolver en 1O ml de cloroformo, agregar 25,0 ml de yodobromuro SR, tapar el vaso en forma se-
gura y dejar en reposo durante 30 minutos, protegido de la luz, agitando ocasionalmente. Luego agregar, en este orden,
30 ml de yoduro de potasio SR y 100 ml de agua, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agitando minu-
ciosamente después de cada adición de tiosulfato. Cuando el color del yodo se torne muy pálido, agregar 3 ml de almidón SR
y continuar la valoración con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que el color azul desaparezca. Realizar una prueba blanco al
mismo tiempo con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetría (541 ), Valoraciones Resi-
duales). Calcular el Índice de Yodo:

Resultado = [A, x (Va - V5 ) x N]/(1 O x W)

A,= peso atómico del yodo, 126,90

Va= volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N SV consumido por la prueba del blanco (ml)
V5 =volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N SV consumido por la prueba real (ml)
N = normalidad exacta del tiosulfato de sodio SV
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
NOTA-Si la porción de sustancia tomada absorbe más de la mitad del yodobromuro SR, repetir la determinación emplean-
do una porción más pequeña de la sustancia en análisis.
Tabla 3. Peso de las Muestras
Índice de Peso (g)
Yodo Esperado ±0,1
<5 3,0
5-20 1,0
21-50 0,4
51-100 0,2
101-150 0,13
151-200 0,1

Método 11

Solución de Yoduro de Potasio-Disolver 10,0 g de yoduro de potasio en agua para obtener 100 ml. Almacenar en reci-
pientes resistentes a la luz.
236 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 37

Solución Indicadora de Almidón-Mezclar 1 g de almidón soluble con suficiente agua fría para obtener una pasta fina.
Agregar, mezclando, a 100 mL de agua hirviendo. Mezclar y enfriar. Emplear sólo la solución transparente.
Procedimiento-Fundir la muestra si no estuviera líquida todavía. [NOTA-La temperatura durante la fusión debe exceder
el punto de fusión de la muestra en no más de 1 Oº.] Pasar a través de dos trozos de papel de filtro para eliminar cualquier
impureza sólida y los últimos restos de humedad. El filtrado puede realizarse en un horno de aire a 100º pero debe completar-
se dentro de los 5 minutos± 30 segundos. La muestra debe estar absolutamente seca. Todo el material de vidrio debe estar
absolutamente limpio y completamente seco. Después del filtrado, dejar que la muestra filtrada alcance una temperatura de
68º-71 ± 1 ºantes de pesar la muestra. Una vez que la muestra alcance una temperatura de 68º-71 ± 1 º, pesar inmediatamente
la muestra en un matraz para yodo de 500 mL, ajustándose a los pesos y la exactitud de pesada de la tabla adjunta. [NOTA-El
peso de la sustancia debe ser tal que se produzca un exceso de yodocloruro SR de 50-60% de la cantidad agregada, es decir,
del 100-150% de la cantidad absorbida.] Agregar 15 mL de una mezcla recién preparada de ciclohexano y ácido acético gla-
cial (1 :1) y agitar por rotación suave hasta disolver la muestra. Agregar 25,0 mL de yodocloruro SR, tapar el matraz de forma
segura y agitar por rotación suave para mezclar. Dejar en reposo a 25 ± 5º, protegido de la luz, agitando ocasionalmente, du-
rante 1,0 ó 2,0 horas, dependiendo del Índice de Yodo (IV) de la muestra: IV< 150, 1,0 hora; IV 2150, 2,0 horas. Luego, den-
tro de los 3 minutos después del tiempo de reacción indicado, agregar en este orden, 20 mL de Solución de Yoduro de Potasio y
150 mL de agua recién hervida y enfriada, y mezclar. Dentro de los 30 minutos, valorar el yodo liberado con tiosulfato de so-
dio O, 1 N SV mientras se mezcla mecánicamente después de cada adición de tiosulfato. Cuando el color amarillo del yodo
haya desparecido casi por completo, agregar 1-2 mL de Solución Indicadora de Almidón y continuar la valoración con tiosulfato
de sodio O, 1 N SV hasta que desaparezca el color azul. Realizar una prueba blanco al mismo tiempo, con las mismas cantida-
des de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetría (541) Valoraciones Residuales). Calcular el Índice de Yodo,
según se indica en Método l.

ÍNDICE DE PERÓXIDO

El Índice de Peróxido es el número que expresa, en miliequivalentes de oxígeno activo, la cantidad de peróxido contenido
en 1000 g de la sustancia. [NOTA-Esta prueba debe realizarse inmediatamente después de tomar la muestra para evitar la
oxidación de la muestra de prueba.]
Procedimiento-A menos que se indique algo diferente, colocar aproximadamente 5 g de la sustancia, pesada con exacti-
tud, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio esmerilado. Agregar 30 mL de una mezcla de ácido acético gla-
cial y cloroformo (3:2), agitar hasta disolver y agregar 0,5 mL de solución de yoduro de potasio saturada. Agitar durante 1
minuto exactamente y agregar 30 mL de agua. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV, agregando lentamente la solución
volumétrica y agitando continuamente, hasta que el color amarillo desaparezca casi por completo. Agregar 5 mL de almidón
SR y continuar la valoración, agitando enérgicamente, hasta que desaparezca el color azul. Realizar una determinación con un
blanco en las mismas condiciones. [NOTA-El volumen de solución volumétrica empleada en la determinación con el blanco
no debe exceder O, 1 mL.] Calcular el Índice de Peróxido:
Resultado= [l 000 (V1 - V8) x N]/W

V7 = volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba real (mL)

V8 =volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba del blanco (ml)
N = normalidad exacta de la solución de tiosulfato de sodio
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)

ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN

El Índice de Saponificación es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para neutralizar los ácidos libres y saponi-
ficar los ésteres existentes en 1,0 g de la sustancia.
Procedimiento-Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 mL y agregar
25,0 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N. Calentar el matraz en un baño de vapor, bajo un condensador adecuado
para mantener el reflujo durante 30 minutos, rotando el contenido con frecuencia. [NOTA-El tiempo de reflujo puede ser de
hasta 90 minutos para asegurar la saponificación completa, dependiendo del tipo de éster a analizar.] Agregar a continuación
1 mL de fenolftaleína SR y valorar el exceso de hidróxido de potasio con ácido clorhídrico 0,5 N SV. Realizar una determinación
con un blanco en las mismas condiciones (ver Volumetría (541 ), Valoraciones Residuales). La valoración también puede realizar-
se potenciométricamente. Calcular el Índice de Saponificación:
Resultado= [M, x (V8 - V1) x N]/W

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

V8 =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (mL)
V7 =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba real (mL)
N = normalidad exacta del ácido clorhídrico
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
 USP 37 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 237

Si el aceite se ha saturado con dióxido de carbono con el propósito de conservarlo, dejarlo en una cápsula poco profunda en
un desecador de vacío durante 24 horas antes de pesar las muestras de prueba.

MATERIA INSAPONIFICABLE

El término "materia insaponificable" en aceites o grasas, se refiere a aquellas sustancias que no son saponificables por medio
de hidróxidos alcalinos, pero que son solubles en disolventes de grasas ordinarios, y a los productos de saponificación que son
solubles en dichos disolventes.
Procedimiento-Transferir aproximadamente 5,0 g del aceite o grasa, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de
250 mL, agregar 50 mL de una solución de hidróxido de potasio alcohólico preparada disolviendo 12 g de hidróxido de pota-
sio en 1 O mL de agua y diluyendo esta solución con alcohol hasta 100 mL, y calentar el matraz en un baño de vapor bajo un
condensador adecuado para mantener el reflujo durante 1 hora, agitando frecuentemente por rotación suave. Enfriar a una
temperatura inferior J 25 y Lransferir el contenido del matraz a un separador con una llave de paso de teflón, enjuagando el
matraz con dos porciones de 50 mL de agua que se agregan al separador (no usar grasa en la llave de paso). Extraer con tres
porciones de 100 mL de éter, combinando los extractos de éter en otro separador que contenga 40 mL de agua. Rotar o agitar
suavemente el separador durante unos minutos. [NOTA-Si se agita con demasiada fuerza, puede formarse una emulsión difícil
de separar.] Dejar que la mezcla se separe y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de éter con dos porciones adicio-
nales de 40 mL de agua y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de éter sucesivamente con una porción de 40 mL
de solución de hidróxido de potasio (3 en 100) y una porción de 40 mL de agua. Repetir tres veces esta secuencia de lavado
con solución de hidróxido de potasio y agua. Lavar el extracto de éter con porciones de 40 mL de agua hasta que el último
lavado no se torne rojo con la adición de 2 gotas de fenolftaleína SR. Transferir el extracto de éter a un matraz tarado y enjua-
gar el separador con 1O mL de éter, agregando los enjuagues al matraz. Evaporar el éter en un baño de vapor y agregar 6 mL
de acetona al residuo. Extraer la acetona en una corriente de aire y secar el residuo a 105º hasta que las pesadas sucesivas
difieran en no más de 1 mg. Calcular el porcentaje de materia insaponificable en la porción de aceite o grasa tomada:
Resultado= 100 x (WR/W5)

WR = peso del residuo (g)

W5 = peso del aceite o grasa tomado para la prueba (g)
Disolver el residuo en 20 mL de alcohol, neutralizado previamente en el punto final de la fenolftaleína, agregar fenolftaleína
SR y valorar con hidróxido de sodio alcohólico O, 1 N SV hasta la primera aparición de un color rosado pálido que permanezca
durante no menos de 30 segundos. Si el volumen requerido de hidróxido de sodio alcohólico O, 1 N es superior a 0,2 mL, la
separación de las capas no fue completa; el residuo pesado no puede considerarse como "materia insaponificable" y debe re-
petirse la prueba.

TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN DE
ÁCIDOS GRASOS

Preparación de los Ácidos Grasos-Calentar 75 mL de solución de glicerina-hidróxido de potasio (preparada disolviendo

25 g de hidróxido de potasio en 100 mL de glicerina) en un vaso de precipitados de 800 mL a 150º y agregar 50 mL de la
grasa clarificada, fundida si fuera necesario. Calentar la mezcla durante 15 minutos mezclando con frecuencia, pero sin permi-
tir que la temperatura sobrepase los 150º. La saponificación se considera completa cuando la mezcla es homogénea, sin partí-
culas que se adhieran al vaso de precipitados en el menisco. Verter el contenido del vaso de precipitados en 500 mL de agua
próxima a su punto de ebullición, en una cápsula con mango o un vaso de precipitados de 800 mL, agregar lentamente 50 mL
de ácido sulfúrico diluido [preparado agregando agua y ácido sulfúrico (3:1 )] y calentar la solución, mezclando con frecuencia,
hasta que los ácidos grasos se separen claramente, formando una capa transparente. Lavar los ácidos con agua hirviendo hasta
que queden libres de ácido sulfúrico, recogerlos en un vaso de precipitados pequeño, colocar en un baño de vapor hasta que
el agua se haya sedimentado y los ácidos grasos se vuelvan transparentes, filtrar en un vaso de precipitados seco mientras esté
caliente y secar a 1 05º durante 20 minutos. Colocar los ácidos grasos aún calientes en un recipiente adecuado y enfriar en un
baño de hielo hasta que se solidifiquen.
Prueba de Saponificación Completa-Colocar 3 mL de los ácidos secos en un tubo de ensayo y agregar 15 mL de alcohol.
Calentar la solución a ebullición y agregar un volumen igual de hidróxido de amonio 6 N. Se obtiene una solución transparen-
te.
Procedimiento-Empleando un aparato similar al Aparato de Temperatura de Solidificación especificado en el capítulo Tem-
peratura de Solidificación (651 ), proceder según se indica en Procedimiento, leyendo "temperatura de solidificación" por "punto
de solidificación" (los términos son sinónimos). El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas del punto más alto al
que llega la temperatura es la temperatura de solidificación de los ácidos grasos.
 1

238 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Qufmícas USP 37

COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS

Solución Estándar-Preparar una mezcla de éster de composición conocida que contenga los ésteres requeridos en la mo-
nografía individual. Esta Solución Estandar puede contener otros componentes. [NOTA-Las mezclas de ésteres están disponi-
bles comercialmente en Nu-Chek-Prep, lnc., PO Box 295, Elysian, MN 56028. Las mezclas de ésteres habituales que son útiles
para esta prueba incluyen Nu-Chek 1 7A y Nu-Chek l 9A.] La mezcla Nu-Chek 1 7A tiene la siguiente composición:
Tabla 4
Longitud de la Cadena Nº de
>--··_ _ _ _P_o_r_c_e_nt_a~j_e_____+-É_st_e_r_d_e_A_'_ci_d_o_G_r_a_s_o_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _--+_ _ _d_e_C_a_r_b_o_n_o_ _- + -Enlaces
----- Dobles
----4

1,0 Miristato de metilo 14 O

4,0 Palmitato de metilo 16 O
~-----~------t----------------------+-----------+--------1

5,0 Estearato de metilo 18 O

~-- -- - - - ·---· - ·--------·-----·---------------1-------

t=___ ~:~----- -~~~~;~~t;_:_~~:~l~I~- --

3,0 _ _ _ _ _--+-_Li~g_n_oc_e_ra_t_o_d_e_m_e_t_ilo__
- . -- ---------~-~
24
_ _ _ _ _ _ _ _ _o_º-------j
O
45,~º-----+-0_le_at_o_d_e_m_et_il_o_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _t--_ _ _ _1_8_ _ _ __,__ _ _ _1_ _ __,
15,0 Linoleato de metilo 18 2
3,0 Linolenato de metilo 18 3
20,0 Erucato de metilo 22 1

La mezcla Nu-Chek l 9A tiene la siguiente composición:

Tabla 5
Longitud de la Cadena Nº de
Porcentaje Éster de Ácido Graso de Carbono Enlaces Dobles
7,0 Caprilato de metilo 8 o
5,0 Caprato de metilo 10 o
48,0 Laurato de metilo 12 o
15,0 Miristato de metilo 14 o
7,0 Palmitato de metilo 16 o
3,0 Estearato de metilo 18 o
12,0 Oleato de metilo 18 1
3,0 Linoleato de metilo 18 2

Solución de Hidróxido de Sodio Metanólico 0,5 N-Disolver 2 g de hidróxido de sodio en 100 mL de metanol.
Solución de Prueba-[NOTA-Si en la muestra de prueba hay ácidos grasos que contengan más de 2 enlaces dobles, ex-
traer el aire del matraz purgándolo con nitrógeno durante unos minutos.] Transferir aproximadamente 1 00 mg de la muestra
de prueba a un matraz Erlenmeyer de 50 mL equipado con un condensador de reflujo adecuado enfriado con agua y una ba-
rra mezcladora magnética. Agregar 4 ml de Solución de Hidróxido de Sodio Metanólico 0,5 N y someter a reflujo hasta que desa-
parezcan los glóbulos de grasa (generalmente 5-1 O minutos). Agregar 5 ml de una solución preparada disolviendo 14 g de
trifluoruro de boro en metano! para obtener 100 mL, agitar por rotación suave para mezclar y someter a reflujo durante 2 mi-
nutos. Agregar 4 mL de n-heptano cromatográfico, a través del condensador y someter a reflujo durante 1 minuto. Enfriar,
retirar el condensador, agregar aproximadamente 15 mL de solución de cloruro de sodio saturada, agitar y dejar que las capas
se separen. Pasar la capa de n-heptano a través de O, 1 g de sulfato de sodio anhidro (lavado previamente con n-heptano cro-
matográfico) a un matraz apropiado. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 1 O mL, diluir con n-hepta-
no cromatográfico a volumen y mezclar.
Solución de Aptitud del Sistema-Transferir aproximadamente 20 mg de ácido esteárico, de ácido palmítico y de ácido
oleico a un matraz Erlenmeyer de 25 mL equipado con un condensador a reflujo enfriado por agua adecuado y una barra mez-
cladora magnética, y proceder según se indica para la Solución de Prueba, empezando donde dice "Agregar 5,0 mL de una
solución preparada disolviendo".
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a
la llama, mantenido a una temperatura de aproximadamente 260º, un sistema de inyección no dividido y una columna capilar
de sílice fundida de 0,53 mm x 30 m, ligada con una capa de fase G 16 de 1,0 µm. Programar el cromatógrafo para que man-
tenga una temperatura de columna de 70º durante aproximadamente 2 minutos después de la inyección, luego para que au-
mente la temperatura a una velocidad de 5º/min hasta 240º y finalmente para que mantenga esta temperatura durante 5 mi-
nutos. Mantener la temperatura del inyector aproximadamente a 220º. El gas transportador es helio con una velocidad lineal
de aproximadamente 50 cm/s.
Cromatografiar la Solución de Aptitud del Sistema y registrar las respuestas de los picos según se indica en Procedimiento: los
tiempos de retención relativos son aproximadamente 0,87 para el palmitato de metilo, O, 99 para el estearato de metilo y
1,0 para el oleato de metilo; la resolución, R, entre el estearato de metilo y el oleato de metilo es no menos de 1,5; y la desvia-
 USP 37 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 239

ción estándar relativa de las respuestas de las áreas de los picos de palmitato y estearato en inyecciones repetidas es no más de
6,0%. La desviación estándar relativa del cociente entre las respuestas de los picos del palmitato y del estearato en inyecciones
repetidas es no más de 1,0%.
Procedimiento-Inyectar por separado volúmenes iguales (aproximadamente 1 pL) de la Solución Estándar y la Solución de
Prueba en el cromatógrafo, registrar los cromatogramas, identificar los picos de éster de los ácidos grasos en el cromatograma
de la Solución de Prueba, comparando los tiempos de retención de estos picos con los del cromatograma de la Solución Están-
dar y medir las áreas de los picos para todos los picos de éster de los ácidos grasos en el cromatograma de la Solución de Prue-
ba. Calcular el porcentaje de cada componente de ácido graso en la muestra de prueba:

Resultado = 1 00 x (Al B)

A= área de la respuesta de los picos obtenidos para cada componente de éster de ácido graso individual
B = suma de las áreas de todos los picos, excluido el pico del disolvente, en el cromatograma de la Solución de Prueba

DETERMINACIÓN Y PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS OMEGA-3

El siguiente procedimiento se puede usar para la determinación de ácido eicosapentaenoico (EPA) (C20:5 n-3), ácido doco-
sahexaenoico (DHA) (C22:6 n-3) y ácidos omega-3 totales que se obtienen de peces, plantas o fuentes microbianas en aceites
a granel y aceite encapsulado, ya sea como triglicéridos o como ésteres etílicos. El término "triglicérido" es aplicable a aceites
de algas, aceites de pescado, aceites de hígado de pescado y productos que contienen ácidos omega-3 en forma de triglicéri-
dos. Los resultados se exprE:san como ácidos grasos libres o ésteres etílicos. Realizar las pruebas lo más rápidamente posible.
Proteger las soluciones de la luz actínica, agentes oxidantes, catalizadores de oxidación y aire.

Contenido de EPA y DHA

Estándares de Referencia USP (11)

ER Éster Etílico del Ácido Docosahexaenoico USP
ER Éster Etílico del Ácido Eicosapentaenoico USP
ER Tricosanoato de Metilo USP
Solución Antioxidante-Disolver una cantidad, pesada con exactitud, de butil hidroxitolueno en 2,2,4-trimetilpentano pa-
ra obtener una solución con una concentración de 0,05 mg por mL.
Solución de Estándar Interno-Transferir una cantidad de ER Tricosanoato de Metilo USP, pesada con exactitud, a un ma-
traz volumétrico. Disolver en Solución Antioxidante y diluir con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una con-
centración de aproximadamente 7,0 mg/mL. [NOTA-Proteger la solución de la evaporación durante su uso.]
Tabla 6
Cantidad de Muestra
Suma Aproximada a Pesar
EPA+ DHA (g)
30%-50% 0,4-0,5
50%-70% 0,3
>70% 0,25

Solución de Prueba 1 (para triglicéridos)-En un matraz volumétrico de ·l O mL, disolver la masa de la muestra a examinar,
de acuerdo con la Tabla 6, en Solución Antioxidante y diluir con la misma solución a volumen. Transferir 2,0 mL de esta solución
a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrógeno. Agregar 1,5 mL de una solución de hidróxi-
do de sodio en metanol al 2% (p/v), tapar herméticamente con una tapa con recubrimiento interno de politetrafluoroetileno,
mezclar y calentar en un baño de agua hirviendo durante 7 minutos. Enfriar, agregar 2 mL de solución de tricloruro de boro-
metanol (120 g en 1 000 mL de metanol), cubrir con nitrógeno, tapar herméticamente, mezclar y calentar en un baño de agua
hirviendo durante 30 minutos. Enfriar a una temperatura de 40º-50º, agregar 1,0 ml de 2,2,4-trimetilpentano, tapar y mezclar
en un mezclador de vórtice o agitar vigorosamente durante al menos 30 segundos. Agregar inmediatamente 5 ml de solución
saturada de cloruro de sodio que contenga 1 volumen de cloruro de sodio y 2 volúmenes de agua. [NOTA-Agitar de vez en
cuando. Antes de usar, decantar la solución de cualquier sustancia no disuelta y filtrar si fuera necesario.] Cubrir con nitrógeno,
tapar y mezclar en un mezclador de vórtice o agitar minuciosamente durante al menos 15 segundos. Dejar que la capa supe-
rior se torne transparente y transferir a otro tubo. Agitar la capa de metanol una vez más con 1,0 ml de 2,2,4-trimetilpentano
y combinar los extractos de 2,2,4-trimetilpentano. Lavar los extractos combinados dos veces, cada una con 1 mL de agua, y
secar sobre sulfato de sodio anhidro.
Solución de Prueba 2 (para triglicéridos)-Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solución
de Prueba 7 a un matraz volumétrico de 1 O mL, disolver y diluir con Solución de Estándar Interno a volumen. Puede aplicarse
calor suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente. Después, proceder según se indica en Solución
de Prueba 7, comenzando donde dice "Transferir 2,0 mL".
 240 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 37

Solución de Prueba 3 (para ésteres etílicos)-En un matraz volumétrico de 1 O ml, disolver la masa de la muestra a exami-
nar, ajustándose a la Tabla 6, en Solución de Estándar Interno y diluir con la misma solución a volumen. Puede aplicarse calor
suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente.
Solución de Prueba 4 (para ésteres etílicos)-Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solu-
ción de Prueba 3 a un matraz volumétrico de 1 O ml, disolver y diluir con Solución Antioxidante a volumen.
Solución Estándar la-Transferir 60 mg de ER Éster Etílico del Ácido Docosahexaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumétrico de 1O ml, disolver y diluir con Solución de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta
un máximo de 60º) para obtener una solución transparente.
Solución Estándar 1 b-Transferir 90 mg de ER Éster Etílico del Ácido Eicosapentaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumétrico de 1O ml, disolver y diluir con Solución de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta
un máximo de 60º) para obtener una solución transparente.
La Solución Estándar 7a y la Solución Estándar 7b están listas para el análisis de ésteres etílicos. Para el análisis de triglicéridos,
continuar con la Solución Estándar 2a y la Solución Estándar 2b.
Solución Estándar 2a-Transferir 2,0 ml de Solución Estándar 7a a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una co-
rriente suave de nitrógeno. Después, proceder según se indica en Solución de Prueba 7, comenzando donde dice, "Agregar
1,5 ml".
Solución Estándar 2b-Transferir 2,0 ml de Solución Estándar 7b a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una co-
rriente suave de nitrógeno. Después, proceder según se indica en Solución de Prueba 7, comenzando donde dice, "Agregar
1,5 ml".
Solución de Aptitud del Sistema 1-Transferir 0,300 g de palmitato de metilo, 0,300 g de estearato de metilo, 0,300 g de
araquidato de metilo y 0,300 g de behenato de metilo, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1 O ml, disolver y
diluir con Solución Antioxidante a volumen.
Solución de Aptitud del Sistema 2-[NOTA-Esta solución debe prepararse sólo para triglicéridos y sólo si el éster metílico
del ácido tetracos-15-enoico no se observa claramente en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 2.] Transferir
55,0 mg de éster metílico del ácido docosahexaenoico y aproximadamente 5,0 mg de éster metílico del ácido tetracos-15-
enoico (ácido nervónico), pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1 O ml, disolver y diluir con Solución Antioxidante
a volumen.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,25 mm x 25 m; ligada con una película de fase Gl 6 de 0,20 µm
Temperaturas
Inyector
Inyección dividida: 250º
Inyección no dividida: 90º-250º
Detector: 270º
Columna: Ver la Tabla la o la Tabla lb.
Tabla 7a (Inyección Dividida)
Tiempo de
Tiempo de Espera
Espera (Hold Time)
(Hold a la
Temperatura Time) Rampa de Temperatura Temperatura
Inicial a 170º Temperatura Final Final
(º) (min) (º/min) (º) (mln)
170 2 3 240 2,5

Tabla 7b (Inyección no Dividida)

Tiempo de
Espera
Tiempo de (Hold
Espera Hasta Time)
(Hold Rampa de Hasta Rampa de Temperatu- ala
Temperatura Time) Temperatura Temperatu- Temperatura ra Temperatura
Inicial a 90º Número 1 ra Número 2 Final Final
(º) (min) (°/mln) (°) (º/mln) (°) (mln)
90 2 30 170 3 240 2

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 1 ml/min
Relación de partición del flujo: 200:1. [NOTA-Si fuera necesario, ajustar la relación de partición y/o la dilución de la
muestra para obtener un factor de asimetría de 0,8-1,5 para los picos de los ésteres metílicos de ácidos grasos en la Solución de
USP 37 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 241

Aptitud del Sistema 1, los picos de éster metílico o éster etílico del ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico en la
Solución de Prueba 1 y Solución de Prueba 4, observando al mismo tiempo que para la Solución de Prueba 1 o Solución de Prueba
4 los picos debidos a los ésteres correspondientes de Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3 y C22:5 n-3 son claramente
detectables. Si se utiliza la modalidad de inyección no dividida, las soluciones deben diluirse adicionalmente 1 en 200 con
Solución Antioxidante.]
Volumen de inyección: 1 ~tl
Aptitud del sistema (para triglicéridos)
Muestras: Solución de Aptitud del Sistema 1 y Solución de Prueba 2 o Solución de Aptitud del Sistema 2 (si es aplicable)
Aptitud del sistema (para ésteres etílicos)
Muestra: Solución de Aptitud del Sistema 1
Requisitos de aptitud del sistema
Porcentajes de área teóricos (Solución de Aptitud del Sistema 1): Los porcentajes de las áreas, después de ajustar por el peso
real, de los picos de palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de metilo, deben estar cada
uno dentro de± 1,0% (absoluto) de los valores teóricos provistos en la Tabla 8.
Tabla 8
Área Teórica (%) en una Solución de Pesos Iguales de Palmitato de
Éster Metílico del Metilo, Estearato de Metilo, Araquldato de Metilo y Behenato de Me-
Ácido Graso tilo
Palmitato de metilo 24,37
Estearato de metilo 24,84
Araquidato de metilo 25,23
Behenato de metilo 25,56

[NOTA-El área teórica (%) en una solución de pesos iguales (Tabla 8) se deriva de los factores de respuesta teórica calculados,
que son 1,049; 1,029; 1,013 y 1,000 para palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de meti-
lo, respectivamente.]
Resolución: Para triglicéridos (Solución de Prueba 2 o Solución de Aptitud del Sistema 2): No menos de 1,2 entre los picos de
éster metílico del ácido docosahexaenoico y éster metílico del ácido tetracos-15-enoico
Analisis (para triglicéridos)
Muestras: Solución Estándar 2a, Solución Estándar 2b, Solución de Prueba 7 y Solución de Prueba 2
Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatográfico de la Solución de
Prueba 2 con el de la Solución de Prueba 7 e identificar el pico del estándar interno presente en la Solución de Prueba 2. Calcular
el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de triglicéridos tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (Wsf Wu) x F x 100

Ru =cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estándar interno en el croma-
tograma de la Solución de Prueba 2, calculado:
Resultado= 1![(rU21rr2 ) - (ruif rn)l

[NOTA-Si ru 1 =O debido a que no se observan picos en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de
Prueba 7, entonces Ru = rr2 frU2.]
ru2 = respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 2
rr2 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 2
ru 1 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 7
rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 7
R5 = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de
la Solución Estándar 2a o la Solución Estándar 2b
W5 = peso del DHA tomado para preparar la Solución Estándar 7a o peso del EPA tomado para preparar la Solución Están-
dar 1b (mg)
Wu = peso de la muestra tomada para preparar la Solución de Prueba 2 (mg)
F =factor para expresar el contenido de DHA como ácidos grasos libres, 0,921; y factor para expresar el contenido de EPA
como ácidos grasos libres, 0,915
Análisis (para ésteres etílicos)
Muestras: Solución Estándar 7a, Solución Estándar 1b, Solución de Prueba 3 y Solución de Prueba 4
Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatográfico de la Solución de
Prueba 3 con el de la Solución de Prueba 4 e identificar el pico del estándar interno presente en la Solución de Prueba 3. Calcular
el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de ésteres etílicos tomada:
Resultado= (Ruf R1) x (W/Wu) x 100
 r
242 (401) Grasas y Aceites Fijos / Pruebas Químicas USP 37

Ru = cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estándar interno en el croma-
tograma de la Solución de Prueba 3, calculada según se indica a continuación:

Resultado= 1![(rUJ!rr) - (ru 4frr 4 )]

[NOTA-Si ru 4 = O debido a que no se observan picos en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de
Prueba 4, entonces Ru = rr)rui·l
ru 3 = respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 3
rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 3
ru 4 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de Prueba 4
rr4 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de Prueba 4
R5 = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de
la Solución Estándar 7a o Solución Estándar 7b
W, = peso del DHA tomado para preparar la Solución Estándar 7a o peso del EPA tomado para preparar la Solución Están-
dar 7b (mg)
Wu = peso de la muestra tomada para preparar la Solución de Prueba 3 (mg)

Contenido de Ácidos Omega-3 Totales (para triglicéridos)

Calcular el porcentaje de los ácidos omega-3 totales en la porción de muestra de triglicéridos tomada:

Resultado= EPA+ DHA + [(An- 3 x (EPA+ DHA)/(AEPA + AoHA)]

EPA= contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)

DHA = contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
An- 3 =suma de las áreas de los picos correspondientes a los ésteres metílicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3
y C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 7
AEPA =área del pico correspondiente al éster metílico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 7
AoHA = área del pico correspondiente al éster metílico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 7

Contenido de Ácidos Omega-3 Totales (para ésteres etílicos)

Calcular el porcentaje de los ácidos omega-3 totales en la porción de muestra de ésteres etílicos tomada:

Resultado= EPA+ DHA + [(An- 3 x (EPA+ DHA)/(AEPA + AoHA)]

EPA= contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)

DHA =contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
An _3 =suma de las áreas de los picos correspondientes a los ésteres etílicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3 y
C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 4
AEPA = área del pico correspondiente al éster etílico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 4
AoHA = área del pico correspondiente al éster etílico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solución de Prueba 4

AGUA Y SEDIMENTOS EN ACEITES FIJOS

Aparato-La centrífuga preferida tiene un diámetro de giro (d = distancia entre los extremos de los tubos cuando éstos
están girando) de 38-43 cm y opera a una velocidad aproximada de 1500 rpm. Si se emplea una centrífuga de dimensiones
diferentes, calcular la velocidad deseada de las revoluciones:

rpm = 15üüv'40,6/d

Los tubos de la centrífuga tienen forma de pera y se les puede colocar tapones. La capacidad total de cada tubo es de apro-
ximadamente 125 ml. Las graduaciones son claras y diferenciadas, y se leen hacia arriba desde el fondo del tubo, según la
escala mostrada en la Tabla 9.
Tabla 9
Volumen División de la Escala
(ml) (ml)
0-3 0,1
3-5 0,5
5-10 1,0
10-25 5,0
25-50 25,0
 USP 37 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 243

Tabla 9 (Continuac_io__n~) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____________ 1

Volumen División de la Escala 1

(ml) (ml) 1
50-100 50,0 1

Procedimiento-Colocar 50,0 mL de benceno en cada uno de dos tubos de centrífuga y agregar a cada tubo 50,0 mL de
aceite, entibiado, si fuera necesario, para reincorporar la estearina separada y mezclar minuciosamente a 25º. Tapar con firme-
za los tubos y agitarlos enérgicamente hasta que el contenido se mezcle minuciosamente y sumergir los tubos en un baño de
agua a 50º durante 1 O minutos. Centrifugar durante 1 O minutos. Leer el volumen combinado de agua y sedimento en el fon-
do de cada tubo. Centrifugar repetidamente en períodos de 1O minutos hasta que el volumen combinado de agua y sedimen-
to permanezca constante en 3 lecturas consecutivas. La suma de los volúmenes de agua y sedimento combinados en los dos
tubos representa el porcentaje, en volumen, de agua y sedimento en el aceite.

ÍNDICE DE ANISIDINA

El Índice de Anisidina se define como 1 00 veces la densidad óptica medida en una celda de 1 cm de una solución que con-
tiene 1 g de la sustancia a examinar en 100 mL de una mezcla de disolventes y reactivos, según el método que se describe a
continuación. [NOTA-Realizar las operaciones lo más rápidamente posible, evitando la exposición a la luz actínica.]
Solución de Prueba A-Disolver 0,500 g de la sustancia a examinar en isooctano y diluir con el mismo disolvente hasta
25,0 ml.
Solución de Prueba B-Agregar 1,0 mL de una solución de 2,5 g/L de p-anisidina en ácido acético glacial a 5,0 mL de la
Solución de Prueba A, agitar y almacenar protegida de la luz.
Solución Estándar-Agregar 1,0 mL de una solución de 2,5 g/L de p-anisidina en ácido acético glacial a 5,0 mL de isoocta-
no, agitar y almacenar protegida de la luz.
Procedimiento-Medir la absorbancia de la Solución de Prueba A a 350 nm usando isooctano como blanco. Medir la absor-
bancia de la Solución de Prueba B a 350 nm, exactamente 1 O minutos después de su preparación, usando la Solución Estándar
como el líquido de compensación. Calcular el Índice de Anisidina a partir de la expresión:

Resultado = [25 x (1,2As - As)]! m

A5 = absorbancia de la Solución de Prueba B a 350 nm

As= absorbancia de la Solución de Prueba A a 350 nm
m = peso de la sustancia a analizar en la Solución de Prueba A (g)

ÍNDICE DE OXIDACIÓN TOTAL (TOTOX)

El Índice de Oxidación Total se define:

Resultado= 2PV +AV

PV = Índice de Peróxido
AV= Índice de Anisidina

TRAZAS DE METALl;S

Aparato
El aparato generalmente consiste en lo siguiente:
Matraces de Digestión-Usar un matraz de politetrafluoroetileno con un volumen de aproximadamente 120 mL, equipado
con un tapón impermeable, una válvula para ajustar la presión en el interior del recipiente y un tubo de politetrafluoroetileno
para permitir la liberación de gas.
Sistema-Cerrar los matraces de forma impermeable usando la misma fuerza de torsión para cada uno de ellos.
Horno de Microondas-Tiene una frecuencia de magnetrón de 2450 MHz, con una potencia de salida seleccionable de O a
630 ± 70 vatios en incrementos de 1%, una computadora digital programable, una cámara de microondas recubierta con poli-
tetrafluoroetileno con un ventilador para extracción con velocidad variable, un sistema de transmisión con plato giratorio y
tubos de escape para permitir la salida de humos.
Espectrómetro de Absorción Atómica-Equipado con una lámpara de cátodo hueco como fuente de radiación y una lám-
para de deuterio como corrector de fondo. El sistema se equipa con lo siguiente:
1. Un horno de grafito como el dispositivo de atomización para cadmio, cobre, hierro, plomo, níquel y cinc.
2. Un sistema automatizado de generación de vapores de hidruros de flujo continuo para arsénico y mercurio.
244 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 37

Procedimiento General

Precaucion-Cuando se usan vasos de d1gesllon de alta pres1on cerrados y eqwpo de laboratono de microondas, se deben segwr
las precaucione~ e intrurciones de operación y seguridad suministradas por el fabricante.
[NOTA-Si se utiliza un aparato alternativo, es posible que se requiera ajustarle los parámetros.]
Limpieza-Limpiar todo el material de vidrio y el equipo de laboratorio con una solución de 1 O mg/mL de ácido nítrico
antes de usarlo.
Ácido Nítrico Libre de Trazas de Metal-El ácido nítrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos para arsé-
nico (As), cadmio (Cd), cobre (Cu), hierro (Fe), mercurio (Hg), plomo (Pb), níquel (Ni) y cinc (Zn) son iguales a 0,005; 0,005;
0,001; 0,02; 0,002; 0,001; 0,005 y 0,01 ppm, respectivamente.
Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal-El ácido clorhídrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos
para As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,003; 0,003; 0,05; 0,005; 0,001; 0,004 y 0,005 ppm, respectiva-
mente.
Ácido Sulfúrico Libre de Trazas de Metal-El ácido sulfúrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos para
As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,002; 0,001; 0,05; 0,005; 0,001; 0,002 y 0,005 ppm, respectivamente.
Solución Madre de Prueba-Colocar en un matraz de digestión aproximadamente 0,5 g de aceite graso, pesados con
exactitud, según se indica en cada monografía individual. Agregar 6 mL de Ácido Nítrico Libre de Trazas de Metal y 4 mL de
Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal. Cerrar el matraz.
Solución Madre del Blanco-Mezclar 6 mL de Ácido Nítrico Libre de Trazas de Metal y 4 mL de Ácido Clorhídrico Libre de
Trazas de Metal en un matraz de digestión.
Solución de Prueba 1-Colocar el matraz de digestión que contiene la Solución Madre de Prueba en el horno de microon-
das. Llevar a cabo la digestión en tres etapas, según el siguiente programa: 80% de potencia durante 15 minutos, 1 00% de
potencia durante 5 minutos y 80% de potencia durante 20 minutos.
Al final del ciclo, dejar que el matraz se enfríe. Agregar 4 mL de Ácido Sulfúrico Libre de Trazas de Metal al matraz. Repetir el
programa de digestión. Después de completar la digestión, dejar que el matraz se enfríe a temperatura ambiente. Abrir el ma-
traz de digestión y transferir la solución transparente e incolora obtenida a un matraz volumétrico de 50 mL. Enjuagar el ma-
traz de digestión dos veces, cada una con 15 mL de agua, y recoger los enjuagues en el matraz volumétrico. Agregar 1,0 mL
de una solución de 1 O mg/mL de nitrato de magnesio y 1,0 mL de una solución de 100 mg/mL de fosfato diácido de amonio
al matraz volumétrico. Diluir con agua a volumen y mezclar. La solución resultante es la Solución de Prueba 1.
Solución Blanco 1-Colocar el matraz de digestión que contiene la Solución Madre del Blanco en el horno de microondas.
Proceder según se indica en Solución de Prueba 1, comenzando donde dice "Llevar a cabo la digestión en tres etapas, según el
siguiente programa".
Calibración Directa- [NOTA-Las concentraciones de las soluciones estándar dependerán de los contenidos de metal de la
sustancia de prueba.] Para mediciones de rutina, se preparan y examinan tres soluciones estándar, la Solución Blanco 1 y la
Solución de Prueba 7.
Emplear la Solución de Prueba 1 y la Solución Blanco 1 preparadas según se indica anteriormente o según se indica en la mo-
nografía. Preparar no menos de 3 soluciones estándar que contengan todos los metales a analizar. El valor de absorbancia es-
perado en la Solución de Prueba 1 para cada metal deberá estar comprendido dentro del intervalo de absorbancia calibrado
correspondiente, de preferencia en la parte media de dicho intervalo. Cualquier reactivo usado en la preparación de la Solución
de Prueba 1 se agrega en la misma concentración en las soluciones estándar.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento usando el mismo número de repeticiones para cada una de las solu-
ciones para obtener una lectura estable.
Preparar una curva de calibración a partir de la media de las lecturas obtenidas con las soluciones estándar, graficando las
medias en función de la concentración. Determinar la concentración del elemento en la Solución de Prueba 1 a partir de la
curva obtenida.
Estándar Agregado-Agregar volúmenes iguales de la Solución de Prueba 1, preparada según se indica anteriormente o
según se indica en la monografía, a por lo menos cuatro matraces volumétricos idénticos. Agregar a todos los matraces menos
a uno volúmenes progresivamente mayores de una solución estándar que contenga una concentración conocida del elemento
de prueba para obtener una serie de soluciones con concentraciones crecientes de manera estable del elemento que se sabe
produce respuestas en la parte lineal de la curva. Diluir el contenido de cada matraz con el disolvente especificado en la mono-
grafía a volumen y mezclar. Etiquetar el matraz sin el estándar adicionado como la solución de prueba.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento, usando el mismo número de repeticiones para cada una de las solu-
ciones, para obtener una lectura estable.
Graficar las absorbancias de las soluciones estándar y de la solución de prueba en función de la cantidad agregada del ele-
mento de prueba. [NOTA-La solución de prueba debe graficarse como si tuviera un contenido del elemento de prueba agre-
gado equivalente a O mg o µg]. Extrapolar la línea uniendo los puntos en la gráfica hasta que se encuentre con el eje de con-
centración. La distancia entre este punto y la intersección de los ejes representa la concentración del elemento de prueba en la
solución de prueba.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 245

Pruebas Específicas

CADMIO (CD), COBRE (cu), HIERRO (FE), PLOMO (PB), NÍQUEL (NI) y CINC (ZN)

Solución Madre del Estándar-Preparar una solución con concentraciones conocidas de 5 µg/mL de cada elemento de
prueba.
Soluciones Estándar-En tres matraces volumétricos idénticos de 1O mL, introducir 1 O, 20 y 40 ~tL, respectivamente, de
Solución Madre del Estándar. Agregar a cada matraz 5,0 mL de la Solución de Prueba 7, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solución de Prueba 2-En un matraz volumétrico de 1O mL, agregar 5,0 mL de la Solución de Prueba 7, diluir con agua a
volumen y mezclar.
Solución Blanco 2-En un matraz volumétrico de 1O mL, agregar 5,0 mL de Solución Blanco 7, diluir con agua a volumen y
mezclar.
Procedimiento-Medir el contenido de Cd, Cu, Fe, Pb, Ni y Zn usando un espectrofotómetro de absorción atómica equi-
pado con un horno de grafito adecuado. Determinar concomitantemente las absorbancias de la Solución Blanco 2, las Solucio-
nes Estándar y Solución de Prueba 2 por lo menos tres veces cada una. El valor de absorbancia de la Solución Blanco 2 se resta
del valor obtenido usando las Soluciones Estándar y la Solución de Prueba 2. Proceder según se indica en el método de Estándar
Agregado en el Procedimiento General anterior. La Tabla 7O indica los parámetros instrumentales que pueden usarse.
Tabla 10
Cd Cu Fe Pb Ni Zn
Longitud de onda (nm) 228,8 324,8 248,3 283,5 232 213,9
Ranura (nm) 0,5 0,5 0,2 0,5 0,2 0,5
Corriente de la lámpara (mA) 6 7 5 5 10 7
Temperatura de incineración(º) 800 800 800 800 800 800
Temperatura de atomización (º) 1800 2300 2300 2200 2500 2000
Corrector de fondo Encendido Apagado Apagado Apagado Apagado Apagado
Flujo de nitrógeno (L/min) 3 3 3 3 3 3

ARSÉNICO Y MERCURIO

Medir el contenido de arsénico y mercurio contra sus soluciones estándar de arsénico o mercurio a una concentración cono-
cida empleando el método de Calibración Directa de la sección Procedimiento General anterior, con un sistema automatizado de
generación de vapores de hidruros de flujo continuo.
Para el límite de especificación de 1 ppm para arsénico y el límite de especificación de 1 ppm para mercurio, preparar tres
soluciones de calibración de trabajo con concentraciones conocidas de aproximadamente 5, 1O y 20 ng/mL, respectivamente,
para cada elemento de prueba.
El valor de absorbancia de la solución blanco se resta automáticamente del valor obtenido usando la solución de prueba.
Arsénico-
Solución Blanco 3-Agregar 1,0 mL de una solución de 200 mg/mL de yoduro de potasio a 19,0 mL de la Solución Blanco 7
preparada según se indica anteriormente. Dejar esta solución en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente
50 minutos o a 70º durante aproximadamente 4 minutos.
Solución de Prueba 3-Agregar 1,0 mL de una solución de 200 mg/mL de yoduro de potasio a 19,0 mL de la Solución de
Prueba 7 preparada según se indica anteriormente. Dejar esta solución en reposo a temperatura ambiente durante aproxima-
damente 50 minutos o a 70º durante aproximadamente 4 minutos.
Reactivo Ácido 7: Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal
Reactivo Reductor 7: Una solución de 6 mg/mL de tetrahidroborato de sodio en una solución de 5 mg/mL de hidróxido de
sodio
Se pueden utilizar los parámetros instrumentales de la Tabla 1 7.
Mercurio-
Solución Blanco 4-Proceder según se indica en Solución Blanco 3.
Solución de Prueba 4-Proceder según se indica en Solución de Prueba 3.
Reactivo Ácido 2: Una solución de 515 mg/mL de Ácido Clorhídrico Libre de Trazas de Metal
Reactivo Reductor 2: Una solución de 1O mg/mL de cloruro estannoso en una solución de 200 mg/mL de Ácido Clorhídrico
Libre de Trazas de Metal
Se pueden utilizar los parámetros instrumentales de la Tabla 7 7.
Tabla 11
As Hg
Longitud de onda (nm) 193,7 253,7
Ancho de ranura (nm) 0,2 0,5
 246 (401) Grasas y Aceites Fijos / Pruebas Químicas USP 37

Tabla 11 (Continuacion)
As Hg
>-<;:_()rri~nte_ de ~~ámjla_ra_(m_~ ____ "-~-- --- --·-- -·-~--
10 4
Velocidad de flujo del reactivo ácido (ml/min) 1,0 1,0
Velocidad de flujo del reactivo reductor (ml/min) 1,0 1,0
Velocidad de flujo para las soluciones blanco, estándar y de prueba (ml/min) 7,0 7,0
Celda de absorción Cuarzo (calentado) Cuarzo (sin calentar)
Corrector de fondo Apagado Apagado
Velocidad de flujo de nitrógeno (L/min) 0,1 0,1

COMPOSICIÓN DE ESTEROLES

Separación de la Fracción de Esteroles

Solución de Referencia A-Disolver una cantidad de colesterol, pesada con exactitud, en cloroformo para obtener una so-
lución al 5% (p/v).
Fase Móvil: Una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y éter (65:35)
Solución de Prueba A-Pesar con exactitud 5 g de la sustancia de prueba en un matraz de 250 ml. Agregar 50 mL de hi-
dróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de potasio alcohólico 2 N) y calentar hasta ebullición suave, agitando vigorosa-
mente y de manera continua, hasta que ocurra la saponificación (la solución se torna transparente). Continuar calentando du-
rante 20 minutos adicionales y agregar 50 mL de agua desde la parte superior del condensador. Enfriar el matraz hasta aproxi-
madamente 30º. Transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 500 mL con varios enjuagues de agua, has-
ta un volumen total de aproximadamente 50 ml. Agregar aproximadamente 80 mL de éter, agitar vigorosamente durante
aproximadamente 30 segundos y dejar que sedimente. [NOTA-Cualquier emulsión puede destruirse mediante el rociado de
pequeñas cantidades de alcohol etílico o alcohol metílico.] Separar la fase acuosa inferior y recogerla en un segundo embudo
de separación. Realizar de la misma forma dos extracciones adicionales en la fase de agua-alcohol, usando 60-70 mL de éter
en cada ocasión. Combinar los extractos etéreos en un solo embudo de separación y realizar lavados con agua, de 50 mL cada
uno, hasta que el agua de lavado no presente reacción alcalina frente a la fenolftaleína. Secar la fase etérea con sulfato de
sodio anhidro y filtrar a través de sulfato de sodio anhidro recolectando en un matraz de 250 mL previamente pesado, lavando
el embudo y filtrando con pequeñas cantidades de éter. Destilar el éter hasta que el contenido del matraz se reduzca a unos
pocos mL y llevar a sequedad aplicando un ligero vacío o una corriente de nitrógeno. Completar el secado a 100º durante
aproximadamente 15 minutos, luego pesar después de enfriar en un desecador. Disolver la materia insaponificable así obteni-
da en cloroformo para obtener una solución con una concentración de aproximadamente 5%.
Solución de Prueba B-Tratar 5 g de aceite de canola de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solución de Prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de potasio
alcohólico 2 N)".
Solución de Prueba (-Tratar 5 g de aceite de girasol de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solución de Prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de potasio
alcohólico 2 N)".
Procedimiento-Sumergir por completo en hidróxido de potasio alcohólico 0,2 N durante 1O segundos una placa de gel
de sílice para cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía (621 )), de 20 cm x 20 cm con un espesor de capa de 200 µm
y un tamaño de partícula de 5-17 ~tm 1 sobre poliéster, luego dejar que se seqÚe en una campana de extracción durante 2
horas y finalmente colocar a 100º durante 1 hora. [NOTA-Retirar del dispositivo de calentamiento validado y mantener la pla-
ca en un desecador hasta que se requiera su uso. Las placas deben usarse dentro de los 15 días. También se encuentran dispo-
nibles comercialmente placas para cromatografía en capa delgada que no requieren de preacondicionamiento]. Usar una placa
individual para cada solución de prueba.
Colocar en la cámara una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y éter (65:35) hasta una profundidad
de aproximadamente 1 cm. Cerrar la cámara con la cubierta apropiada y dejar en reposo durante al menos 30 minutos. Se
pueden colocar tiras de papel de filtro sumergidas en el eluyente sobre las superficies internas de la cámara. [NOTA-La fase
móvil debería reemplazarse para cada prueba para asegurar condiciones de elución reproducibles.] Aplicar 0,3 mL de Solución
de Prueba A aproximadamente a 2 cm a partir del borde inferior formando una franja que sea lo más delgada y uniforme posi-
ble. Colocar 2-3 ~tL de Solución de Referencia A en un extremo de la placa, alineados con la franja. Desarrollar los cromatogra-
mas en una cámara equilibrada con la Fase Móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente 1 cm
desde el borde superior de la placa. Retirar la placa de la cámara de desarrollo y evaporar la fase móvil empleando una corrien-
te de aire caliente [NOTA-Evitar el calor excesivo.] o dejando la placa bajo una campana durante un periodo corto. Rociar la
placa con una solucion alcohólica de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2% y examinar bajo luz UV a 254 nm. [NOTA-También se
encuentran disponibles comercialmente placas previamente tratadas con indicador de UV y se usan en forma equivalente]. En
cada una de las placas, marcar los límites de la banda de esteroles, identificada mediante su alineación con la mancha obteni-

1 Se puede obtener una placa para TLC de grado comercial en Sigma-Aldrich, Nº de catálogo zl 22785.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (401 > Grasas y Aceites Fijos 247

da a partir de la Solución de Referencia A a lo largo de los bordes de la fluorescencia e incluir además el área de las zonas que se
encuentran a 2-3 mm por encima y por debajo de las zonas visibles que corresponden a la Solución de Referencia A. Retirar el
gel de sílice de las áreas marcadas y colocarlo en un embudo de filtración provisto de un septo poroso G3. 2 Agregar 1O mL de
cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la espátula de metal, filtrar empleando vacío y recoger el filtrado en el ma-
traz Erlenmeyer acoplado al embudo de filtración. Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter, aproximadamente 1O mL
cada vez, y recoger el filtrado en el mismo matraz acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta un volumen de 4-5 mL,
transferir la solución residual a un tubo de ensayo de 1O mL, previamente pesado, con fondo cónico y tapón de cierre herméti-
co, y evaporar hasta sequedad mediante calentamiento moderado en una corriente suave de nitrógeno. Disolver el residuo en
unas pocas gotas de acetona y evaporar de nuevo hasta sequedad. Colocar a 105º durante aproximadamente 1O minutos,
dejar que se enfríe en un desecador y pesar.
Tratar la Solución de Prueba By la Solución de Prueba C de la misma forma que se indica para la Solución de Prueba A.

Determinación de Esteroles

Solución de Prueba O-Agregar al tubo de ensayo que contiene la fracción de esteroles separada de la sustancia de prueba
mediante cromatografia en capa delgada, una mezcla preparada recientemente de piridina anhidra, hexametildisilazano y clo-
rotrimetilsilano (9:3:1) [NOTA-Este reactivo también se encuentra comercialmente disponible y se utiliza de manera equivalen-
te.], en una relación de 50 µL por cada mg de esteroles, evitando cualquier absorción de humedad. Tapar el tubo de ensayo y
agitar cuidadosamente hasta disolver completamente los esteroles. Dejar en reposo durante al menos 15 minutos a temperatu-
ra ambiente y centrifugar durante unos pocos minutos si fuera necesario. Usar el sobrenadante. [NOTA-Es normal que se pro-
duzca una leve opalescencia y no causa anomalía. Sin embargo, la formación de un flóculo blanco o la aparición de un color
rosado indica la presencia de humedad o el deterioro del reactivo. Si algo de esto ocurre, se debe repetir la prueba].
Solución de Referencia E-Agregar a 9 partes de los esteroles separados del aceite de canola mediante cromatografía en
capa delgada, 1 parte de colesterol. Tratar la mezcla de la misma forma que se indica para la Solución de Prueba D.
Solución de Referencia F-Tratar los esteroles separados del aceite de girasol mediante cromatografia en capa delgada de
la misma forma que se indica para la Solución de Prueba D.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la
llama y una columna capilar de vidrio o de sílice fundida de 20-30 m de largo, con un diámetro interno de 0,25-0,32 mm,
totalmente recubierta con una capa de fase estacionaria G27 o G36 de O, 1O a 0,30 µm. Mantener la temperatura del inyector
a 280º, la temperatura del detector a 290º y la temperatura de la columna a 260 ± 5º. El gas transportador es helio con una
velocidad lineal de 20-35 cm/s o hidrógeno con una velocidad lineal de 30-50 cm/s. Se usa una relación de partición de 1 :50
a 1 :1 OO. Inyectar en el cromatógrafo Solución de Referencia E y Solución de Referencia F y registrar el cromatograma según se
indica en Procedimiento: el tiempo de retención debería ser de 20 ± 5 minutos para ,8-sitosterol y todos los esteroles presentes
deben estar separados. El cromatograma obtenido con la Solución de Referencia E presenta cuatro picos principales correspon-
dientes a colesterol, brasicasterol, campesterol y ,8-sitosterol; y el cromatograma obtenido con la Solución de Referencia F pre-
senta cuatro picos principales correspondientes a campesterol, estigmasterol, ,B-sitosterol y L',7-estigmastenol. Los tiempos de
retención de los esteroles con referencia a ,8-sitosterol se indican en la Tabla 72.
Tabla 12. Tiempos de Retención Relativos de Esteroles
para Dos Columnas Diferentes
Identificación Columna G36 Columna G27
Colesterol 0,67 0,63
Brasicasterol 0,73 0,71
24-Metileno-colesterol 0,82 0,80
Campesterol 0,83 0,81
Campestanol 0,85 0,82
Estigmasterol 0,88 0,87
8.7-Campesterol 0,93 0,92
8.5,23-Estigmastadienol 0,95 0,95
Clerosterol 0,96 0,96
¡J-Sitosterol 1,00 1,00
Sitostanol 1,02 1,02
8.5-Avenasterol 1,03 1,03
8.5,24-Estigmastadienol 1,08 1,08
117-Estigmastenol 1,12 1,12
8.7-Avenasterol 1,16 1,16

2 Se puede obtener un producto comercial en Kimble/Kontes como un filtro buchner con disco sinterizado, Kimax 28400-152.
248 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 37

Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de Solución de Prue-
ba D, Solución de Referencia E y Solución de Referencia F, registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos de esteroles.
Calcular el porcentaje de cada esterol individual en la fracción de esteroles de la sustancia de prueba tomada:
Resultado = 100 x (AJ S)
A= área del pico debido al componente de esteroles a determinar
S = suma de las áreas de los picos debidos a los componentes indicados en la Tabla 72

(411) VALORACIÓN DE ÁCIDO FÓLICO

El siguiente procedimiento se utiliza para la estimación de ácido fólico como ingrediente de preparaciones farmacopeicas
que contienen otros elementos activos constituyentes.
Estándares de Referencia USP(l l )-ER Ácido Fálico USP.
Fase Móvil-Colocar 2,0 g de fosfato monobásico de potasio en un matraz volumétrico de 1 litro y disolver en aproximada-
mente 650 mL de agua. Agregar 12,0 mL de una solución 1 en 4 de hidróxido de tetrabutilamonio en metanol, 7,0 mL de
ácido fosfórico 3 N y 240 mL de metano!. Enfriar a temperatura ambiente, ajustar con ácido fosfórico 3 N o hidróxido de amo-
nio 6 N a un pH de 7,0, diluir a volumen con agua y mezclar. Filtrar a través de un filtro de 0,45 µm y controlar nuevamente el
pH antes de usar. [NOTA-La relación entre el metanol y el agua puede variarse hasta 3% y el pH puede incrementarse hasta
7, 15 para lograr una mejor separación.]
Disolvente de Dilución-Preparar según se indica en Fase Móvil. Ajustar a pH 7,0 y burbujear nitrógeno a través de la solu-
ción durante 30 minutos antes de usar.
Solución de Estándar Interno-Disolver aproximadamente 25 mg de metilparabeno en 2,0 mL de metano!, diluir con Di-
solvente de Dilución a 50 mL y mezclar.
Solución Estándar de Ácido Fólico-Transferir aproximadamente 12 mg de ER Ácido Fólico USP, pesados con exactitud, a
un matraz volumétrico de 50 mL con protección actínica; disolver en 2 mL de hidróxido de amonio, diluir a volumen con Disol-
vente de Dilución y mezclar.
Preparación Estándar-Transferir 2,0 mL de Solución Estándar de Ácido Fálico a un matraz volumétrico de 25 mL con pro-
tección actínica; agregar 2,0 mL de Solución de Estándar Interno; agregar Disolvente de Dilución a volumen y mezclar.
Preparación de Valoración-Transferir una porción pesada o medida con exactitud de la preparación que se va a analizar
que contenga aproximadamente 1 mg de ácido fólico a un matraz volumétrico de 50 mL con protección actínica; agregar
4,0 mL de Solución de Estándar Interno; agregar Disolvente de Dilución a volumen y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 280 nm y una
columna de 15 cm x 3,9 mm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,0 mL por minuto. Inyec-
tar en el cromatógrafo la Preparación Estándar y registrar el cromatograma según se indica en el Procedimiento: debe haber una
línea base de separación entre el ácido fólico y el metilparabeno.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1O µL) de la Preparación
Estándar y de la Preparación de Valoración; registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Los tiem-
pos de retención relativos son aproximadamente 0,8 para ácido fólico y 1,0 para metilparabeno. Calcular la cantidad, en µg,
de C19 H19 N,0 6 en la porción de la preparación tomada, por la fórmula:

50C(Ru/R 5)

en donde Ces la concentración, en µg por mL, de ER Ácido Fálico USP en la Preparación Estándar; y Ru y R5 son los cocientes
entre las respuestas de los picos de ácido fálico y de metilparabeno obtenidos a partir de la Preparación de Valoración y de la
Preparación Estándar, respectivamente.

(413) ANÁLISIS DE IMPUREZAS EN GASES MEDICINALES

INTRODUCCIÓN
El presente capítulo de prueba general define los medios seguros y apropiados para el muestreo de envases de gases a alta
presión conteniendo distintas composiciones de gases medicinales usando tubos detectores de acuerdo con las monografías
USP, y utilizando el volumen total de gas recomendado por el fabricante del tubo detector. Ver Reactivos en la sección Reacti-
vos, Indicadores y Soluciones para información sobre cada tubo detector referido.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (415) Valoración de Gases Medicinales 249

En la actualidad se fabrican dos tipos de tubos detectores: aquellos que se utilizan con una bomba manual de volumen fijo
(p.ej., 100 mL/bombeo) y aquellos que se usan en un sistema de flujo continuo que se puede ajustar para pasar un volumen
de gas a través del tubo detector a aproximadamente 1 atmósfera. Es importante usar un tipo de tubo detector que corres-
ponda con el modo de intercambio de volumen de gas.
Para asegurar el paso del volumen de gas requerido a través del tubo detector, medir el volumen de gas al momento del
análisis usando una bomba manual o un caudalímetro calibrado para el gas que se analiza o corregido mediante un gráfico de
calibración. Los fabricantes de caudalímetros por lo general proveen gráficos de volumen de flujo para gases comunes con ca-
da uno de los tubos identificados en este capítulo general. [NOTA-Ver el capítulo general Valoración de Gases Medicinales
(415) para el muestreo.]

Sistema de Flujo Continuo

Identificar el gas contenido en el envase y seleccionar el regulador de gas apropiado. Conectar el regulador al envase del
gas. No aplicar lubricante o cinta de Teflón a las conexiones entre el envase y el regulador. Purgar el regulador con el gas en
análisis. Ajustar el nivel del flotador para obtener la velocidad de flujo adecuada a fin de lograr el volumen total de gas reco-
mendado por el fabricante. Acoplar el tubo detector, luego ajustar la velocidad de flujo al nivel requerido, según se indica en
los gráficos que acompañan al caudalímetro y al tubo detector. Cronometrar para alcanzar el volumen total de gas requerido
±1O segundos al flujo fijado. En el tiempo establecido, cerrar la válvula del regulador y luego la válvula principal del envase.
Observar el tubo mientras continúe conectado para determinar el grado de cambio de color y registrar el resultado. Retirar el
tubo y desconectar el aparato, equilibrar la presión de gas en el regulador permitiendo que el gas se libere a la atmósfera y
desconectar el regulador del envase. Desechar el tubo después de su uso.

Bomba Manual de Volumen Fijo

El método alternativo consiste en aplicar la bomba manual detectora de gases. El sistema extrae un volumen constante con
cada bombeo. Para asegurar la exactitud del volumen total de gas, el usuario debe seguir las recomendaciones de bombeo
sugeridas por el fabricante de la bomba.

(415) VALORACIÓN DE GASES MEDICINALES

INTRODUCCIÓN

Las monografías de gases medicinales USP tienen como propósito evaluar la pureza de un gas usado para tratamiento médi-
co o como componente de un proceso farmacéutico. En general, la pureza se evalúa mediante una valoración del contenido
del artículo y mediante análisis de trazas de impurezas. La aplicación de cromatografía de gases, análisis paramagnético y tu-
bos detectores para gases medicinales varía con respecto a los procedimientos tradicionales usados para analitos en fase líqui-
da y, por lo tanto, requiere de una descripción separada. Este capítulo de pruebas generales se centra en la valoración para
pruebas de contenido. El muestreo de impurezas se trata en el capítulo general Análisis de Impurezas en Gases Medicinales
(413). .
Este capítulo incluye los aspectos relacionados con el muestreo y la calificación para el análisis por cromatografía de gases y
análisis paramagnético de gases medicinales. Asimismo, este capítulo incluye una descripción de la configuración, validación y
calibración iniciales de estos instrumentos. Los procedimientos específicos de valoración se definen en la monografía específica
para cada gas.
Las definiciones básicas sobre calificación y validación instrumental se incluyen en los capítulos de información general Califi-
cación de Instrumentos Analíticos (1058) y Validación de Métodos Farmacopeicos (1225), respectivamente, por lo que no se repi-
ten en este capítulo. No obstante, cuando debido a la naturaleza del analito se requieran variaciones de los materiales presen-
tados en los capítulos mencionados, tales variaciones serán definidas en este capítulo.
 250 (415) Valoración de Gases Medicinales/ Pruebas Químicas USP 37

MÉTODOS

Cromatografía de Gases (GC)

Ver Cromatografía (621 ).

Detectores para Valoración de Gases Medicinales

Los dos detectores más comunes usados en los análisis de gases medicinales son el detector de conductividad térmica (TCD,
por sus siglas en inglés) y el detector de ionización a la llama (FID, por sus siglas en inglés).
El TCD detectará cualquier gas o vapor que tenga una conductividad térmica que difiera significativamente de la alta con-
ductividad térmica del gas de referencia, por lo regular helio, y por lo tanto, es prácticamente universal. Sin embargo, el límite
de detección más bajo generalmente aceptado para el TCD es 50 ppm v/v. Esto representa una limitación para la evaluación
de trazas de impurezas en gases medicinales.
El FID también se usa para la evaluación de trazas de impurezas en gases medicinales, debido a que es más sensible a com-
puestos orgánicos pero no produce señales para los gases medicinales más comunes.

CALIFICACIÓN

Calificación de la Instalación {IQ, por sus siglas en inglés)-Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el softwa-
re (o dispositivo de lectura) del cromatógrafo de gases se instale de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabri-
cante del Cromatógrafo de Gases.
Se debe tener en cuenta lo siguiente según sea aplicable:
• Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
• Fugas (debe estar exento de fugas);
• Muestreo representativo;
•Velocidad de flujo de la muestra;
• Tiempo de respuesta;
• Señales de encendido correcto;
• Suministro de energía (incluyendo regulación de voltaje); y
• Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presión).
Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés)-La OQ verifica que el desempeño del Cromatógrafo de Gases sea
el previsto dentro de su intervalo de operación esperado. Para el análisis de producto final del gas medicinal, el Cromatógrafo
de Gases se prueba para asegurar la repetibilidad (verificación de que la desviación estándar relativa se corresponde con lo
declarado) para cada analito de interés. Debido a la naturaleza específica del análisis de gases medicinales y al número limitado
de analitos, en lugar de la OQ inicial o periódica, se pueden usar la calibración de rutina y la verificación de calibración periódi-
ca del Cromatógrafo de Gases, así como el procedimiento de análisis. Cuando un instrumento se usa para un rango más amp-
lio de analitos, resulta inapropiado realizar la calibración y la verificación de calibración periódica en lugar de la OQ.
Calificación de Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés)- Para el análisis de producto final de los gases medicinales, el
Cromatógrafo de Gases se verifica de manera periódica en intervalos apropiados durante los análisis con un gas de calibración
(es decir, verificando que los resultados se correspondan con una determinada concentración en un intervalo de exactitud y
precisión aceptables después de un número específico de inyecciones de la muestra).

Medición Paramagnética de Oxígeno

Teoría-El analizador paramagnético mide el desplazamiento de un gas diamagnético (nitrógeno) ocasionado por un gas
paramagnético (oxígeno), en un campo magnético fuerte. Una celda de medición por lo general emplea dos esferas de vidrio
conectadas por un tubo rellenas de nitrógeno, que se suspenden sobre una cinta de torsión entre imanes que concentran el
flujo alrededor de las esferas de vidrio. Cuando las moléculas de oxígeno ingresan a la celda de medición, las esferas de vidrio
se mueven por la fuerza ejercida por las moléculas de oxígeno, que son atraídas a la parte más fuerte del campo magnético.
Mediante el uso de sensores ópticos, una bobina de retroalimentación y aparatos electrónicos adecuados, los analistas miden
una respuesta que es directamente proporcional a la presión parcial de oxígeno.
El oxígeno es el único gas paramagnético de la atmósfera que se encuentra por encima de los niveles de trazas. No obstante,
los analizadores paramagnéticos se pueden ver afectados por la susceptibilidad magnética del gas acompañante. Por lo tanto,
se debe evitar hacer cambios a los gases acompañantes en las monografías USP.
 USP 37 Pruebas Químicos / (415) Valoración de Gases Medicinales 251

Consideraciones del Diseño

Las consideraciones del diseño para la adquisición de nuevos instrumentos pueden incluir los siguientes parametros:
Deriva-Cambio de la respuesta del instrumento para una concentración determinada durante un tiempo establecido en
condiciones constantes y sin ajustes del instrumento por medios externos. La deriva es la suma de dos componentes, deriva
del cero y deriva de medición. La deriva determina la frecuencia con que se debe calibrar el instrumento.
Deriva del Cero-Cambio en la respuesta cuando se mide gas cero.
Deriva de Medición-Cambio en la respuesta con respecto a la concentración de oxígeno durante la medición del gas.
Temperatura de Operación-El intervalo de temperatura ambiente en el que continuará siendo válida la especificación de
desempeño declarada del instrumento. Un coeficiente de temperatura mayor indicará que se permite un cambio más pequeño
en la temperatura ambiente antes de que se requiera la recalibración.
Presión Operativa-El instrumento debe operar a las presiones de entrada de las muestras a analizar.

Aspectos de la Calificación
Calificación de la Instalación (IQ)-Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectu-
ra) del analizador de oxígeno se instale de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de
oxígeno.
Se debe tener en cuenta lo siguiente según sea aplicable:
•Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
• Fugas (debe estar exento de fugas);
• Muestreo representativo;
• Velocidad de flujo de la muestra;
• Tiempo de respuesta;
• Señales de encendido correcto;
• Suministro de energía (incluyendo regulación de voltaje); y
• Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presión).
Calificación Operativa (OQ)-Los requisitos de la OQ verifican que el desempeño del analizador paramagnético sea el pre-
visto dentro de su intervalo de operación esperado y que sea adecuado para las condiciones reales de uso. Los instrumentos y
aparatos se deben calibrar y usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Debido a la natura-
leza específica del instrumento, en lugar de la OQ inicial y periódica, se puede usar la calibración de rutina.
Calificación del Desempeño (PQ)-Los requisitos de la PQ verifican que el desempeño del analizador paramagnético sea
el esperado en su ambiente normal operativo. Para el análisis de producto final de los gases medicinales, el analizador para-
magnético se calibra inicialmente [ajustando a cero y calibrando (spanning) mediante un estándar certificado] de acuerdo con
las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno y se recalibra periódicamente para asegurar un desempeño continuo
aceptable.
Ajuste a Cero del Instrumento (establecimiento del límite inferior)-Usando el estándar certificado definido en lamo-
nografía, ajustar a cero el analizador pasando el gas cero en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante
del analizador de oxígeno. Mantener el flujo hasta que se observe una lectura estable en el instrumento. Conforme se requiera,
ajustar la configuración de la posición del cero a un valor de 0,0% de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analiza-
dor de oxígeno. Confirmar que la lectura sea estable. [NOTA-Dependiendo del uso previsto del instrumento, una alternativa
aceptable a este procedimiento es cambiar la configuración de la posición d~I cero a un valor diferente de 0,0%, siempre que
proporcione una mayor precisión en la medición.]
Calibración (spanning) del Intervalo de Uso-Establecer el límite superior (span) con un gas de calibración (span gas)
definido en la monografía y apropiado para el intervalo de uso. Pasar el gas de calibración a través del instrumento a la veloci-
dad de flujo sugerida por el fabricante. Confirmar que la lectura sea estable. Ajustar la configuración de la calibración al valor
certificado del estándar de referencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Confirmar que
la lectura sea estable.

VALIDACIÓN

La validación de este instrumento por lo general se completa durante el proceso (IQ/OQ). La verificación de rutina se lleva a
cabo según se describe en las secciones OQ/PQ de este capítulo y, por lo tanto, no se requiere de información específica sobre
la validación del instrumento.

PROCEDIMIENTO

Para Instrumentos Fuera de Línea-Antes del análisis, ajustar el cero del instrumento y calibrar (span) según se describe
en la sección PQ. [NOTA-La calibración no debe correrse concomitantemente con las muestras de prueba.] Conectar el gas
muestra al instrumento y establecer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante
252 (415) Valoración de Gases Medicinales / Pruebas Químicas USP 37

del analizador. Mantener el flujo hasta que se observe una lectura constante en el instrumento. La definición de lectura cons-
tante se incluye en las instrucciones del fabricante del analizador o en la documentación para calificación del instrumento del
usuario.
Para Instrumentos en Línea-Los intervalos de calibración son definidos por el fabricante del analizador, por el historial o
por medios estadísticos. Establecer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante.

MUESTREO

Muestreo de Fase Líquida-Los cilindros que contienen un tubo de inmersión permiten obtener una muestra líquida a
partir de la salida de la válvula con el cilindro en posición vertical. Si no se cuenta con un tubo de inmersión, el cilindro debe
colocarse en posición invertida con el cilindro y la válvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase líquida
esté en contacto con la válvula).
El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido. Los reguladores deben purgarse
con el gas que se va a muestrear. Cuando sea necesario, se debe medir el flujo hacia el analizador usando un caudalímetro
calibrado.
Muestreo de Fase Gaseosa-Los cilindros que no cuentan con un tubo de inmersión permiten obtener una muestra ga-
seosa de la salida de la válvula con el cilindro en posición vertical. Si se cuenta con un tubo de inmersión, el cilindro debe
colocarse en posición invertida con el cilindro y la válvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase gaseosa
esté en contacto con el tubo de inmersión). El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador
requerido.

ESTÁNDARES CERTIFICADOS PARA EL ANÁLISIS DE GASES MEDICINALES

Las monografías USP para gases medicinales requieren de pruebas que usan estándares certificados para la calibración del
instrumento y determinaciones analíticas. Tales análisis farmacopeicos se pueden llevar a cabo usando materiales de referencia
rastreables al U.S. National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de EE.UU.,
[NIST]) u otras organizaciones de estándares nacionales, p.ej., el lnstitute for National Measurement Standards (Instituto Na-
cional de Estándares de Medición, Canadá). Las monografías individuales, así como la sección de reactivos, indicadores y solu-
ciones hacen referencia al porcentaje nominal de diversos estándares certificados requeridos para llevar a cabo los análisis de
gases medicinales. Los requisitos para las concentraciones certificadas reales en términos de varianza del valor nominal se indi-
can en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones para cada estándar certificado pertinente.

(425) ANTIBIÓTICOS-VALORACIÓN YODOMÉTRICA

El siguiente método se utiliza para la valoración de la mayoría de los medicamentos antibióticos farmacopeicos derivados de
la penicilina y sus formas farmacéuticas, cuando la valoración yodométrica resulta particularmente apropiada.
Preparación Estándar-Disolver en el disolvente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una canti-
dad adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la monografía individual, previamente secado bajo las condicio-
nes citadas en la monografía individual y pesado con exactitud, y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas, con el
mismo disolvente hasta obtener una solución con una concentración conocida aproximada a la que se especifica en la tabla.
Pipetear 2,0 mL de esta solución y transferir a cada uno de dos matraces Erlenmeyer de 125 mL con tapón de vidrio.
Disolventes y Concentraciones Finales
Concentración
Antibiótico Disolvente* Final
Amoxicilina Agua 1,0 mg por ml
Ampicilina Agua 1,25 mg por mL
Ampicilina Sódica Solución Amortiguadora Nº 1 1,25 mg por ml
Cloxacilina Sódica Agua 1,25 mg por ml
Ciclacilina Agua 1,0 mg por ml
Dicloxacilina Sódica Solución Amortiguadora Nº 1 1,25 mg por ml
Meticilina Sódica Solución Amortiguadora Nº 1 1,25 mg por ml
Nafcilina Sódica Solución Amortiguadora Nº 1 1,25 mg por ml
Oxacilina Sódica Solución Amortiguadora Nº 1 1,25 mg por mL
Penicilina G Potásica Solución Amortiguadora Nº 1 2000 unidades por ml
* A menos que se indique algo diferente, las Soluciones Amortiguadoras son las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en la sección Medios y
Diluyentes en Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81 ), excepto que no se requiere su esterilización antes de usarlas.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 253

Disolventes y Concentraciones Finales (Continuación)

Concentración
1 1
Antibiótico Disolvente• Final
Penicilina G Sódica Solución Amortiguadora N" 7 2000 unidades por ml
Penicilina V Potásica Solución Amortiguadora Nº 7 2000 unidades por ml
Feneticilina Potásica Solución Amortiguadora Nº 7 2000 unidades por ml
* A menos que se indique algo diferente, las Soluciones Amortiguadoras son las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en la sección Medios y
Diluyentes en Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81 ), excepto que no se requiere su esterilización antes de usarlas.

Preparación de Valoración-A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, disolver en el disol-
vente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una cantidad adecuada, pesada con exactitud, de la
muestra en análisis y diluir cuantitativamente con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una concentración final
conocida aproximada a la que se especifica en la tabla. Pipetear 2 mL de esta solución y transferir a cada uno de dos matraces
Erlenmeyer de 125 mL con tapón de vidrio.
Procedimiento-
lnactivación y Volumetría-Agregar 2,0 mL de hidróxido de sodio 1,0 N a 2,0 mL de la Preparación Estándar y de la Prepara-
ción de Valoración, en sus respectivos matraces, mezclar por rotación moderada y dejar en reposo durante 15 minutos. Agregar
a cada matraz 2,0 mL de ácido clorhídrico 1,2 N y 10,0 mL de yodo 0,01 N SV. Tapar de inmediato y dejar en reposo durante
15 minutos. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidón yoduro SR al acercarse al punto
final y continuar la volumetría hasta que el color azul desaparezca.
Determinación con un Blanco-En un matraz que contenga 2,0 mL de la Preparación Estándar, agregar 10,0 mL de yodo 0,01
N SV. Si la Preparación Estándar contiene amoxicilina o ampicilina, agregar de inmediato 0, 1 mL de ácido clorhídrico 1,2 N.
Valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidón yoduro SR cerca del punto final y
continuar la volumetría hasta que el color azul desaparezca. Tratar en forma similar un matraz que contenga 2,0 mL de la
Preparación de Valoración.
Cálculos-Calcular los microgramos (o unidades) equivalentes (F) a cada mL de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido por la
Preparación Estándar, por la fórmula:

(2CP)/(B - 1)
en donde C es la concentración, en mg por mL, de Estándar de Referencia en la Preparación Estándar; P es la potencia, en µg
(o unidades) por mg, del Estándar de Referencia; Bes el volumen, en ml, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la
Determinación con un Blanco; e 1 es el volumen, en mL, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la lnactivación y Volumetría.
Calcular la potencia de la muestra en análisis por la fórmula especificada en la monografía individual.

(429) MEDICIÓN DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA POR DIFRACCIÓN DE

LUZ

INTRODUCCIÓN

El método se basa en las normas ISO 73320-1 (1999) y 92 76-1 (1998).

Este capítulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japo-
nesa.
La técnica de difracción de luz láser usada para la determinación de la distribución del tamaño de las partículas se basa en el
análisis del patrón de difracción producido cuando las partículas se exponen a un haz de luz monocromática. Históricamente,
los primeros instrumentos de difracción láser usaban sólo dispersión en ángulos pequeños. No obstante, desde entonces la
técnica se ha ampliado para incluir dispersión de la luz láser en un intervalo angular más amplio y la aplicación de la teoría de
Mie, además de la aproximación de Fraunhofer y de la difracción anómala.
La técnica no puede distinguir entre dispersión por partículas individuales y dispersión por grupos de partículas primarias, es
decir por aglomerados o agregados. Dado que la mayoría de las muestras de partículas contienen aglomerados o agregados y
como el foco de interés generalmente se centra en la distribución del tamaño de las partículas primarias, los grupos por lo
general se dispersan en partículas primarias antes de la medición.
Para partículas no esféricas, se obtiene una distribución de tamaño de esferas equivalentes, debido a que la técnica supone
en su modelo óptico que las partículas son esféricas. La distribución de tamaño de partícula resultante puede diferir de la obte-
nida por métodos que se basan en otros principios físicos (p.ej., sedimentación, tamizado).
Este capítulo proporciona una guía para la medición de las distribuciones de tamaño de las partículas en diferentes sistemas
dispersos (p.ej., polvos, atomizaciones, aerosoles, suspensiones, emulsiones y burbujas de gas en líquidos) por medio del análi-
1
254 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas USP 37

sis de sus patrones angulares de dispersión de luz. No se consideran en este capítulo los requisitos particulares de la medición
del tamano de las partículas de productos específicos.

PRINCIPIO

Una muestra representativa, dispersada a una concentración adecuada en un líquido o gas apropiado, se pasa a través de un
haz de luz monocromática, generalmente un láser. La luz dispersada por las partículas a diversos ángulos se mide con un de-
tector de multielementos. Se registran los valores numéricos que representan el patrón de dispersión para su posterior análisis.
Estos valores del patrón de dispersión se transforman luego, por medio de un modelo óptico y un procedimiento matemático
adecuados, para obtener la proporción entre el volumen total y un número discreto de clases de tamano, formando una distri-
bución volumétrica del tamano de partículas.

INSTRUMENTO

El instrumento se ubica en un entorno donde no se vea afectado por el ruido eléctrico, las vibraciones mecánicas, las fluctua-
ciones de temperatura, la humedad o la luz brillante directa.
En la Figura 7 se muestra un ejemplo de configuración de un instrumento de difracción de luz láser. Se puede usar otro equi-
po.
9 11

8 10
7

(/)

5
1. Detector de 5. Luz dispersa no captada 9. Distancia de trabajo de la lente (4)
oscurecimiento por la lente (4) 1O. Detector de multielementos
2. Haz dispersado 6. Conjunto de partículas
3. Haz directo 7. Fuente de luz láser 11.Distancia focal de la lente (4)
4. Lente de Fourier 8. Unidad de procesamiento del haz

Figura 1. Ejemplo de configuración de un instrumento de difracción de luz láser.

El instrumento está compuesto por una fuente de luz láser, un sistema óptico para procesar el haz de luz, una región de
medición de la muestra (o celda), una lente de Fourier y un detector de multielementos para medir el patrón de la luz disper-
sada. También se requiere un sistema de datos para la deconvolución de los datos de dispersión en una distribución volumétri-
ca de ta manos, así como el análisis e informe de los datos asociados.
Las partículas pueden entrar al haz láser en dos posiciones. En el caso convencional, las partículas entran al haz paralelo an-
tes de la lente colectora y dentro de su distancia de trabajo. En la llamada óptica de Fourier inversa, las partículas entran por
detrás de la lente colectora y por lo tanto, en un haz convergente. La ventaja de la configuración convencional es que queda
un paso de longitud razonable para la muestra dentro de la distancia de trabaj9 de la lente. La segunda configuración admite
sólo longitudes de paso pequenas, pero permite la medición de luz dispersa en ángulos más grandes, lo cual es útil cuando
hay presencia de partículas submicrométricas.
La interacción del haz de luz incidente con el conjunto de las partículas dispersas da como resultado un patrón de dispersión
con distintas intensidades de luz en diversos ángulos. La distribución de intensidad angular total, constituida por la luz directa
y la dispersa, se enfoca entonces sobre un detector de multielementos por medio de una lente o una serie de lentes. Estas
lentes crean un patrón de dispersión que, dentro de ciertos límites, no depende de la ubicación de las partículas en el haz de
luz. Por consiguiente, la distribución de intensidad angular continua se convierte en una distribución de intensidad espacial
discreta en un set de elementos detectores.
Se supone que el patrón de dispersión medido del conjunto de partículas es idéntico a la suma de los patrones de todas las
partículas dispersivas individuales presentadas en posiciones relativas aleatorias. Se debe tener en cuenta que las lentes y por lo
tanto, el detector, sólo captan un intervalo angular limitado de luz dispersa.

DESARROLLO DEL MÉTODO

La medición del tamano de las partículas por difracción láser puede arrojar datos reproducibles, incluso en la región submi-
crométrica, siempre que el instrumento usado y la muestra analizada sean cuidadosamente controlados para limitar la variabili-
dad de las condiciones de la prueba (p.ej., medio de dispersión, método de preparación de la dispersión de la muestra).
Tradicionalmente, la medición del tamano de partícula utilizando difracción láser se ha limitado a partículas comprendidas
en un intervalo de aproximadamente O, 1 pm a 3 mm. Debido a los recientes avances en el diseno de lentes y equipos, los
 USP 37 Pruebas Químicas/ <429'> Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 255

instrumentos modernos son habitualmente capaces de exceder este intervalo. Con el informe de validación, el usuario de-
muestra la aplicabilidad del método para el uso previsto.

Muestreo

La técnica de muestreo debe ser adecuada para obtener una muestra representativa de un volumen apropiado para la medí
ción del tamaño de partículas. Se pueden aplicar técnicas de división de muestras tales como la del separador rotatorio de
muestras o el método de cono y división por cuarteo.

Evaluación del Procedimiento de Dispersión

La muestra a analizar se inspecciona, visualmente o con la ayuda de un microscopio, para estimar su intervalo de tamaño y
forma de partículas. El procedimiento de dispersión debe ajustarse al propósito de lri medición. ti propósito puede ser tal, que
se prefiera desaglomerar los grupos en partículas primarias tanto como sea posible o, por el contrario, conservar los grupos tan
intactos como sea posible. En este sentido, las partículas de interés pueden ser partículas primarias o grupos de partículas.
Para el desarrollo de un método, es aconsejable verificar que no ocurra la conminución de las partículas y, a la inversa, que la
dispersión de las partículas o grupos sea satisfactoria. Por lo general, esto puede hacerse cambiando la energía de dispersión y
monitoreando el cambio de la distribución del tamaño de las partículas. La distribución de tamaño medida no debe cambiar
de manera significativa si la muestra está bien dispersada y las partículas no son frágiles ni solubles. Por otra parte, si el proceso
de fabricación (p.ej., cristalización, molienda) del material ha cambiado, se debe verificar la aplicabilidad del método (p.ej., por
comparación microscópica).
Las atomizaciones, aerosoles y burbujas de gas en un líquido se deben medir directamente, siempre que su concentración
sea adecuada, puesto que el muestreo o la dilución generalmente alteran la distribución del tamaño de las partículas.
En otros casos (como por ejemplo emulsiones, pastas y polvos), se pueden dispersar muestras representativas en los líquidos
adecuados. A menudo se usan aditivos dispersantes (humectantes, estabilizadores) y/o fuerzas mecánicas (p.ej., agitación, ul-
trasonido) para la desaglomeración o desagregación de grupos de partículas y la estabilización de la dispersión. Para estas dis-
persiones líquidas, lo que se usa más comúnmente es un sistema de recirculación, que consiste en una celda de medición ópti-
ca, un baño de dispersión por lo general equipado con un mezclador y un generador de ultrasonido, una bomba y tuberías.
Las celdas de agitación sin sistema recirculante son útiles cuando se dispone sólo de pequeñas cantidades de muestra o cuan-
do se utilizan líquidos especiales en la dispersión.
Los polvos secos también pueden convertirse en aerosoles por medio del uso de dispersadores de polvo seco adecuados, los
cuales aplican fuerzas mecánicas para la desaglomeración o desagregación. Por lo general, los dispersadores usan la energía
del gas comprimido o la presión diferencial de un sistema de vacío para dispersar las partículas hasta convertirlas en un aerosol
que es soplado a través de la zona de medición, habitualmente hacia la entrada de una unidad de vacío que recolecta las partí-
culas. Sin embargo, en el caso de partículas o gránulos más gruesos y de libre fluidez, el efecto de la gravedad puede ser sufi-
ciente para dispersar las partículas adecuadamente.
Si el tamaño máximo de las partículas de la muestra excede el intervalo de medición del instrumento, el material que es
demasiado grueso se puede retirar por tamizado, informándose la masa y el porcentaje del material retirado. Sin embargo,
cabe señalar que después del pretamizado la muestra deja de ser representativa, a menos que se compruebe lo contrario.

Optimización de la Dispersión Líquida

Los líquidos, surfactantes y dispersantes usados para dispersar polvos deben:

- ser transparentes a la longitud de onda del láser y estar prácticamente exentos de burbujas de aire o partículas;
- tener un índice de refracción que difiera del correspondiente al material de prueba;
- no ser disolventes del material de prueba (líquido puro o solución saturada, prefiltrada);
- no alterar el tamaño de los materiales de prueba (p.ej., por efecto de la solubilidad, aumento de la solubilidad o recristali-
zación);
- favorecer la fácil formación y estabilidad de la dispersión;
- ser compatibles con los materiales usados en el instrumento (como juntas tóricas, juntas de estanqueidad, tuberías, etc.);
y
- poseer una viscosidad apropiada para facilitar la recirculación, agitación y filtración.
Para humedecer las partículas y estabilizar la dispersión a menudo se usan agentes tensoactivos y/o dispersantes. Para el caso
de ácidos y bases débiles, la amortiguación del medio dispersante a un pH bajo o alto, respectivamente, puede ayudar a la
identificación de un dispersante adecuado.
Se puede hacer una verificación preliminar de la calidad de la dispersión por medio de una inspección visual o microscópica.
También es posible tomar muestras fraccionadas de una dispersión madre bien mezclada. Dichas dispersiones madre se for-
man agregando un líquido a la muestra mientras se mezcla, por ejemplo, con una varilla de vidrio, una espátula o un mezcla-
dor por vórtice. Se debe tener cuidado de asegurar la transferencia de una muestra representativa y de que no se sPdimenten
 •
256 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas USP 37

las partículas más grandes. Por lo tanto, se prepara una pasta de la muestra o se lleva a cabo un muestreo rápido de una sus-
pensión que se mantiene bajo agitación.

Optimización de la Dispersión con Gas

Para atomizaciones y dispersiones de polvo seco se puede utilizar un gas comprimido exento de aceite, agua y partículas.
Para retirar dichos materiales del gas comprimido se puede usar una secadora provista de filtro. Toda unidad de vacío debe
estar localizada lejos de la zona de medición, de forma que no altere la medición.

Determinación del Intervalo de Concentración

Con el fin de producir una relación señal-ruido aceptable en el detector, la concentración de partículas en la dispersión debe
exceder un nivel mínimo. De igual manera, debe estar por debajo de un nivel máximo con el fin de evitar la dispersión múlti-
ple. El intervalo de concentración está influenciado por el ancho del haz láser, la longitud de paso de la zona de medición, las
propiedades ópticas de las partículas y la sensibilidad de los elementos detectores.
En vista de lo anterior, se deben efectuar las mediciones con diferentes concentraciones de partículas para determinar el in-
tervalo apropiado de la concentración para cualquier muestra típica de material. [NOTA-En diferentes instrumentos, las con-
centraciones de partículas se representan habitualmente mediante magnitudes y escalas diferentes, p.ej., oscurecimiento, con-
centración óptica, número proporcional de la masa total.]

Determinación del Tiempo de Medición

El tiempo de medición, el tiempo de lectura del detector y la frecuencia de adquisición se determinan experimentalmente,
de acuerdo con la precisión requerida. Por lo general, el tiempo de medición permite un gran número de barridos o escaneas
en intervalos de tiempo cortos.

Selección de un Modelo Óptico Apropiado

La mayoría de los instrumentos usan la aproximación de Fraunhofer o la teoría de Mie, aunque a veces se aplican otras apro-
ximaciones para el cálculo de la matriz de dispersión. La elección del modelo teórico depende de la aplicación prevista y las
diferentes suposiciones (tamaño, absorbancia, índice de refracción, rugosidad, orientación cristalina, mezcla, etc.) hechas para
el material de prueba. Si los valores del índice de refracción (partes real e imaginaria para la longitud de onda usada) no se
conocen exactamente, entonces se puede usar la aproximación de Frauenhofer o la teoría de Mie con una estimación realista
del índice de refracción. La primera tiene la ventaja de que es simple y no necesita valores del índice de refracción; la segunda
por lo general arroja distribuciones menos sesgadas del tamaño de las partículas, en el caso de partículas pequeñas. Por ejem-
plo, si se usa el modelo Fraunhofer para muestras que contienen una cantidad apreciable de partículas pequeñas, transparen-
tes, la cantidad de partículas pequeñas calculada puede resultar significativamente sobreestimada. Con el fin de obtener resul-
tados rastreables, es esencial documentar los valores del índice de refracción usados, porque pequeñas diferencias en los valo-
res supuestos para la parte real e imaginaria del índice de refracción complejo pueden ocasionar diferencias significativas en las
distribuciones de tamaño de las partículas resultantes. A menudo se aplican valores bajos de la parte imaginaria del índice de
refracción (aproximadamente 0,01 a O, l i) para permitir la corrección de la absorbancia en función de la rugosidad de superfi-
cie de las partículas. En general, cabe anotar que las propiedades ópticas de la sustancia a analizar, así como la estructura
(p.ej., forma, rugosidad de superficie y porosidad) influyen en el resultado final.

Validación

Típicamente, la validación de un procedimiento se puede determinar por la evaluación de su especificidad, linealidad, inter-
valo, exactitud, precisión y robustez. En el análisis del tamaño de partículas por difracción de luz láser no aplica la especifici-
dad, según la definición de la /CH, y no es posible discriminar los diferentes componentes en una muestra, ni discriminar entre
aglomerados y partículas dispersas a menos que se complemente adecuadamente con técnicas microscópicas. No se puede
aplicar a este procedimiento la exploración de una relación lineal entre concentración y respuesta o un modelo matemático de
interpolación. Más que evaluar la linealidad, este método requiere la definición de un intervalo de concentración dentro del
cual el resultado de las mediciones no varíe significativamente. Las concentraciones por debajo de ese intervalo producen un
error debido a la deficiente relación señal-ruido, mientras que las concentraciones por encima de ese intervalo producen un
error debido a la dispersión múltiple. El intervalo depende principalmente del hardware del instrumento. La exactitud se debe
confirmar a través de una apropiada calificación del instrumento y de una comparación con un análisis microscópico, mientras
que la precisión se puede evaluar por medio de una determinación de repetibilidad.
La repetibilidad que se consiga con el método depende principalmente de las características del material (molido o sin mo-
ler, robusto o frágil, ancho de la distribución de su tamaño, etc.) mientras que la repetibilidad requerida depende del propósi-
to de la medición. Los límites obligatorios no se pueden especificar en este capítulo puesto que la repetibilidad (diferentes pre-
 USP 37 Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 257

paraciones de la muestra) puede variar apreciablemente de una sustancia a otra. Sin embargo, una buena práctica consiste en
aspirar a criterios de aceptación para repetibilidad, tales como% RSD <:'. 10% [n = 6] para cualquier valor central de la distribu-
ción (p.ej., para x 50 ). Los valores a los lados de la distribución (p.ej., x 10 y x90 ) serán sometidos a criterios de aceptación menm
estrictos, como % RSD <:'. 15% [n = 6]. Por debajo de 1O pm, estos valores deben duplicarse. La robustez se puede analizar du-
rante la selección y optimización de los medios y fuerzas de dispersión. El cambio de la energía dispersante se puede monito-
rear por el cambio en la distribución del tamaño de las partículas.

MEDICIÓN

Precauciones

Seguir las instrucciones en el manual del instrumento:

- no mirar nunca de frente el haz láser directo o sus reflexiones;
- conectar a tierra todos los componentes del instrumento para prevenir la ignición de los disolventes o explosiones del
polvo;
- verificar la configuración del instrumento (p.ej., calentamiento, intervalo de medición y lentes requeridos, distancia de tra-
bajo apropiada, posición del detector, ausencia de luz diurna brillante directa); y
- en el caso de dispersiones húmedas, evitar burbujas de aire, evaporación de líquidos, efecto schlieren u otras inhomoge-
neidades en la dispersión; de igual manera, evitar una relación masa-flujo inapropiada del dispersador o un flujo de aire
turbulento en el caso de dispersiones secas; dichos efectos pueden ocasionar distribuciones erróneas del tamaño de partí-
culas.

Medición de la Dispersión de la Luz de las Muestras Dispersadas

Después de la alineación adecuada de la parte óptica del instrumento se debe efectuar una medición blanco del medio de
dispersión exento de partículas, usando el mismo método utilizado para la medición de la muestra. La señal de ruido de fondo
debe estar por debajo del umbral apropiado. Los datos suministrados por el detector se guardan con el fin de restarlos poste-
riormente de los datos obtenidos con la muestra. La dispersión de la muestra se mide de acuerdo con el método desarrollado.
Para cada elemento del detector se calcula una señal promedio, a veces junto con su desviación estándar. La magnitud de la
señal de cada elemento del detector depende del área de detección, de la intensidad de la luz y de la eficiencia cuántica. Las
coordenadas (tamaño y posición) de los elementos del detector junto con la distancia focal de la lente determinan el intervalo
de los ángulos de dispersión para cada elemento. La mayoría de los instrumentos miden también la intensidad del haz láser
central (sin dispersar). La relación entre la intensidad de una muestra dispersada y la obtenida en su ausencia (la medición
blanco) indica la proporción de luz dispersada y por lo tanto la concentración de partículas.

Conversión del Patrón de Dispersión en Distribución del Tamaño de Partícula

Este paso de deconvolución es la inversa del cálculo de un patrón de dispersión para una distribución dada del tamaño de
partícula. La suposición de la forma esférica de las partículas es especialmente importante por cuanto la mayoría de los algorit-
mos usan la solución matemática para la dispersión por partículas esféricas. Además, los datos medidos siempre contienen
errores aleatorios y sistemáticos que podrían viciar las distribuciones de tamaño. Se han desarrollado varios procedimientos
matemáticos para usar en los instrumentos disponibles. Estos permiten cierta ponderación de las desviaciones entre los patro-
nes de dispersión medidos y calculados (p.ej., cuadrados mínimos), algunas restricciones (p.ej., no negatividad para cantidades
de partículas), y/o cierta suavización de la curva de distribución de tamaño.
Los algoritmos utilizados son específicos para cada marca y modelo de equipo y están amparados por una licencia. Las dife-
rencias en los algoritmos entre distintos instrumentos pueden dar lugar a diferencias en las distribuciones de tamaños de las
partículas calculadas.

Repeticiones

El número de mediciones repetidas (con preparaciones de muestras individuales) a efectuar depende de la precisión requeri-
da en la medición. Se recomienda fijar este número en el método específico de una sustancia.

INFORME DE RESULTADOS
Los datos de distribución del tamaño de las partículas por lo general se informan como una distribución acumulada de los
tamaños inferiores y/o como distribución de la densidad por volumen. El símbolo x se usa para indicar el tamaño de la partícu-
la, que a su vez se define como el diámetro de una esfera de volumen equivalente. Q3(x) indica la fracción en volumen de las
partículas de tamaño menor a x. En una representación gráfica, x se representa sobre la abscisa y la variable dependiente Q3
sobre la ordenada. Los valores característicos más comunes se calculan por interpolación de la curva de distribución del tama-
 258 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas USP 37

ño de partículas. Con frecuencia se usan tamaños de partículas de las fracciones acumuladas del 10%, 50%, y 90% (x 10, x50 , y
x90 , respectivamente); x 50 se conoce también como la mediana del tamaño de partícula. Se reconoce que el símbolo d se usa
también ampliamente para designar el tamaño de partícula, por lo cual el simbolo x podría reemplazarse por d.
Por otra parte, se debe documentar suficiente información sobre la muestra, la preparación de la muestra, las condiciones de
dispersión y el tipo de celda. Dado que los resultados dependen del instrumento particular, el programa de análisis de datos y
el modelo óptico usado, estos detalles también se deben documentar.

CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

Usar el instrumento según las instrucciones del fabricante y llevar a cabo las calificaciones prescritas con la frecuencia ade-
cuada, de acuerdo con el uso del instrumento y las sustancias a examinar.

Calibración

Los sistemas de difracción láser, aunque suponen propiedades idealizadas de las partículas, se basan en los principios funda-
mentales de la dispersión de la luz láser. Por eso, no se requiere una calibración en el sentido estricto. Sin embargo, es necesa-
rio confirmar que el instrumento funciona correctamente. Esto puede efectuarse usando cualquier material de referencia certifi-
cado que sea aceptable en la práctica industrial. Se examina el procedimiento de medición completo, incluidos la recolección
de la muestra, la dispersión de la muestra, el transporte de la muestra a través de la zona de medición, la medición y el proce-
dimiento de deconvolución. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
Los materiales de referencia certificados preferidos constan de partículas esféricas de una distribución conocida. Deben estar
certificados en lo que respecta a la distribución del tamaño en porcentaje de masa por medio de una técnica absoluta, si estu-
viese disponible, y usarse junto con un procedimiento operativo acordado y detallado. Si se aplica la teoría de Mie en el análisis
de datos, es fundamental que se indiquen las partes real e imaginaria del índice de refracción complejo del material. La repre-
sentación de la distribución del tamaño de partículas por volumen igualará a la de la distribución por masa, siempre que la
densidad de las partículas sea la misma para todas las fracciones de tamaños.
La respuesta de un instrumento de difracción láser cumple con los requisitos si el valor medio de x50 de por lo menos tres
mediciones independientes no se desvía en más de 3% del intervalo de valores certificado del material de referencia certifica-
do. Los valores medios para x10 y x90 no se deben desviar del intervalo de valores certificado en más del 5%. Por debajo de 1O
µm, estos valores deben duplicarse.
Pese a que se prefiere el uso de materiales compuestos por partículas esféricas, también pueden usarse partículas no esféri-
cas. Preferentemente, éstas deben tener valores certificados o típicos provenientes de análisis de difracción láser efectuados se-
gún un procedimiento operativo acordado y detallado. El uso de valores de referencia obtenidos por métodos distintos de la
difracción láser puede ocasionar una desviación significativa. El motivo de esta desviación es que los distintos principios inhe-
rentes a los diversos métodos pueden conducir a diferentes diámetros de esferas equivalentes para la misma partícula no esféri-
ca.
Aunque se prefiere el uso de de materiales de referencia certificados, se pueden emplear también otros materiales de refe-
rencia bien definidos. Estos consisten en sustancias de composición y distribución de tamaño de partículas típicas para una
clase especificada de sustancias. La distribución del tamaño de partículas de los mismos ha demostrado ser estable con el tiem-
po. Los resultados deben cumplir con los datos previamente determinados, con la misma precisión y desviación que el material
de referencia certificado.

Calificación del Sistema

Además de la calibración, el desempeño del instrumento debe calificarse a intervalos regulares o tan frecuentemente como
sea apropiado. Esto se puede llevar a cabo usando un material de referencia apropiado, como se mencionó en el párrafo ante-
rior.
La calificación del sistema se basa en el concepto de que el equipo, la electrónica, el software y las operaciones analíticas
constituyen un sistema integral que se puede evaluar como una entidad. Se examina el procedimiento de medición completo,
incluidos la recolección de la muestra, la dispersión de la muestra, el transporte de la muestra a través de la zona de medición,
la medición y el procedimiento de deconvolución. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
En general, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se considera que la respuesta de un ins-
trumento de difracción láser cumple con los requisitos si el valor x50 no se desvía en más de 10% del intervalo de valores del
material de referencia. Si se evalúan opcionalmente los valores a los lados de la distribución (p.ej., x10 y x90 ), estos valores no se
deben desviar en más de 15% del intervalo de valores certificado. Por debajo de 1O µm, estos valores deben duplicarse.
NOTA-Para la calibración del instrumento, en el párrafo sobre Calibración se especifican requisitos más estrictos.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (431) Determinación de Grupos Metoxilo 259

(431) DETERMINACIÓN DE GRUPOS METOXILO

Aparato-El aparato para la determinación de grupos metoxilos se muestra esquemáticamente en la figura adjunta.

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Aparato para la Determinación de Grupos Metoxilos

El matraz de ebullición, A, cuenta con un brazo lateral capilar para la introducción de dióxido de carbono o nitrógeno y está
conectado a una columna, B, que sirve para separar el ácido yodhídrico acuoso del yoduro de metilo que es más volátil. El
yoduro de metilo pasa a través de agua en una trampa depuradora, C, y fif1almente es absorbido en la solución de bromo-
ácido acético en el tubo de absorción D. El dióxido de carbono o nitrógeno se introduce a través de un dispositivo que regula
la presión y se conecta al aparato por medio de un capilar pequeño que contiene un pequeño trozo de algodón. [NOTA-Evitar
el uso de disolventes orgánicos al limpiar este aparato, ya que las trazas remanentes pueden afectar la determinación. Esta
prueba se emplea también para la determinación de grupos etoxilo con un tiempo de reacción de 80 minutos y un equivalen-
te de solución volumétrica de 0,751 mg de (OC 2 HJ.]
Para mayor comodidad en el uso y la limpieza, una junta esférica de vidrio esmerilado conecta las dos columnas verticales
del aparato. La parte superior del depurador C consta de una junta esférica 35/20, cuya mitad superior está conectada por
medio del brazo lateral al tubo D. Esto permite separar el aparato en partes y facilita el agregado de agua a la trampa. Además,
permite el acceso al tubo de ensayo (de 1O mm) suelto e invertido que sirve como trampa sobre el tubo interno del depurador
c.
Reactivos-
SOLUCIÓN DE BROMO-ÁCIDO ACÉTICO-Disolver 100 g de acetato de potasio en 1000 ml de una solución constituida por
900 ml de ácido acético glacial y 100 ml de anhídrido acético. En el día de su utilización, agregar 5 ml de bromo a 145 ml de
esta solución.
ÁCIDO YODHÍDRICO-Está disponible comercialmente una solución reactivo incolora o casi incolora de punto de ebullición
constante preparada para este fin. Si no se obtiene comercialmente, puede prepararse destilando ácido yodhídrico sobre fósfo-
ro rojo, pasando dióxido de carbono o nitrógeno a través del aparato durante la destilación. Usar la mezcla de punto de ebulli-
ción constante (entre 55% y 58% de HI) que destila entre 126º y 127º, que es incolora o casi incolora. [Precaución-Se deben
260 (431) Determinación de Grupos Metoxilo /Pruebas Químicas USP 37

tomar medidas de seguridad al destilar Ácido Yodhídrico.] Colocar el ácido en frascos pequeños de color ámbar con tapón de
vidrio purgados con dióxido de carbono o nitrógeno, sellarlos con parafina y almacenar en un sitio fresco y oscuro.
Procedimiento-Preparar el aparato desconectando la junta esférica y vertiendo agua en la trampa C hasta la mitad. Co-
nectar las dos partes, empleando una cantidad mínima de una grasa de silicona apropiada para sellar la junta esférica. Agregar
7 mL de Solución de Bromo-Ácido Acético en el tubo de absorción O. Pesar la muestra en una cápsula de gelatina tarada y colo-
carla en el matraz de ebullición junto con unas pocas perlas de ebullición o pedazos de plato poroso. Finalmente agregar 6 mL
de Ácido Yodhídrico y juntar el matraz a la columna, empleando una cantidad mínima de grasa de silicona apropiada para sellar
Ja unión. Burbujear dióxido de carbono o nitrógeno a través del aparato a una velocidad de 2 burbujas por segundo; colocar el
matraz de ebullición en un baño de aceite o manto de calentamiento a 150º y continuar la reacción durante 40 minutos para
la determinación de grupos metoxilo, u 80 minutos para la determinación de grupos etoxilo. Drenar el contenido del tubo de
absorción en un matraz Erlenmeyer de 500 mL que contenga 1 O mL de solución de acetato de sodio (1 en 4). Lavar el tubo
con agua, agregar Jos líquidos de lavado al matraz y finalmente, diluir con agua hasta aproximadamente 125 ml. Agregar áci-
do fórmico, gota a gota, agitando por rotación moderada hasta que el color marrón rojizo del bromo desaparezca; luego agre-
gar 3 gotas adicionales. Por lo general, se requiere un total de 12 a 15 gotas. Dejar en reposo durante 3 minutos y agregar
15 mL de ácido sulfúrico diluido y 3 g de yoduro de potasio y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio O, 1 N SV usando
3 mL de almidón SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco, incluyendo también una cápsula de gelatina y
hacer las correcciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio O, 1 N equivale a 0,51 7 mg de (OCH 3 ).

(441) VALORACIÓN DE NIACINA O NIACINAMIDA

Estándares de Referencia USP (11 )-ER Niacina USP. ER Niacinamida USP. [NOTA-Los Estándares de Referencia secados
previamente se pueden almacenar en un desecador sobre gel de sílice. Proteger de Ja luz.]

Método Químico

NOTA-Determinar a partir de la información del etiquetado si la vitamina presente en la muestra de valoración es niacina o
niacinamida y emplear la preparación estándar correspondiente (ya sea Preparación Estándar de Niacina o Preparación Estándar
de Niacinamida) según se indica en el Procedimiento.
Solución de Bromuro de Cianógeno-Disolver 5 g de bromuro de cianógeno en agua para obtener 50 mL. [Precaución-
Preparar esta solución bajo una campana, ya que el bromuro de cianógeno se volatiliza a temperatura ambiente y el vapor es suma-
mente irritante y venenoso.]
Solución de Ácido Sulfanílico-Agregar 15 mL de agua y 3 mL de hidróxido de amonio 6 N a 2,5 g de ácido sulfanílico.
Mezclar y, si fuera necesario, agregar revolviendo más hidróxido de amonio 6 N hasta que el ácido se disuelva. Ajustar el pH de
la solución aproximadamente a 4,5 con ácido clorhídrico 3 N empleando verde de bromocresol SR como indicador externo, y
diluir con agua hasta 25 ml.
Solución Madre de Niacina Estándar-Transferir 25,0 mg de ER Niacina USP a un matraz volumétrico de 500 mL, disolver
en solución de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con solución de alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un refrigerador.
Cada mL de esta solución contiene 50 µg de ER Niacina USP.
Preparación Estándar de Niacina-Transferir 10,0 mL de Solución Madre de.Niacina Estándar a un matraz volumétrico de
100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Cada mL de esta solución contiene 5 µg de ER Niacina USP.
Solución Madre de Niacinamida Estándar-Transferir 50,0 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de
500 mL, disolver en solución de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con solución de alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un
refrigerador. Cada mL de esta solución contiene 100 µg de ER Niacinamida USP.
Preparación Estándar de Niacinamida-Transferir 10,0 mL de Solución Madre de Níacinamída Estándar a un matraz volu-
métrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Cada mL de esta solución contiene 1 O µg de ER Niacinamida USP.
Preparación de Valoración-Preparar según se indica en la monografía individual.
Procedimiento-Pipetear y transferir a cuatro tubos marcados las cantidades de la Preparación Estándar correspondiente,
de la Preparación de Valoración, de la dilución de amoníaco y del agua que se indican en la tabla adjunta. Luego agregar los
demás componentes, respectivamente, según se indican en la tabla, conforme a las instrucciones que se proporcionan aquí.
Mezclas de Reacción para la Valoración de Niacina o Niacinamida-Método Químico
Componente Tubo 1, ml Tubo 2, ml Tubo 3, ml Tubo 4, ml
Preparación Estándar 1,0 1,0 - -

Preparación de Valoración - - 1,0 1,0

Dilución de Amoníaco (hidróxido de amonio, diluido a 1 en
50) 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua 6,5 1,5 6,5 1,5
USP 37 Pruebas Químicas/ (441) Valoración de Niacina o Niacinamida 261

Mezclas de Reacción para la Valoración de Nlacina o Niacinamida-Método Químico (Continuación)

Componente Tubo 1, ml Tubo 2, ml Tubo 3, ml Tubo 4, ml
~-

Solución de Bromuro de Cianógeno - 5,0 - 5,0

Solución de Ácido Sulfanílico 2,0 2,0 2,0 2,0
Ácido Clorhídrico 1 gota - 1 gota -

Agregar al Tubo 1 la Solución de Ácido Sulfanílico, agitar bien, agregar el ácido clorhídrico, mezclar, colocar en un espectrofo-
tómetro adecuado y ajustar a absorbancia cero a 450 nm. Agregar al Tubo 2 la Solución de Bromuro de Cianógeno, mezclar y a
los 30 segundos, cronometrados con exactitud, después de completar la adición del bromuro de cianógeno, agregar la Solu-
ción de Ácido Sulfanílico, agitando por rotación suave. Cerrar el tubo, colocarlo en el espectrofotómetro y después de 2 minutos
medir su absorbancia a 450 nm contra el Tubo 1 utilizado como blanco, designando la absorbancia como As. Repetir el proce-
dimiento con el Tubo 3 (como blanco) y el Tubo 4, designando la absorbancia del Tubo 4 como Au. Calcular la cantidad de
niacina o niacinamida en la muestra según se indica en la monografía individual.

Método Microbiológico

Solución de Prueba del Material a Valorar-Colocar la cantidad indicada del material a valorar en un matraz de tamaño
adecuado y proseguir según uno de los métodos que se ofrecen a continuación. Las concentraciones de las soluciones de áci-
do sulfúrico y de hidróxido de sodio empleadas no se indican en cada caso porque estas concentraciones pueden variar de-
pendiendo de la cantidad de material tomado para valorar, el volumen de la solución de prueba y el efecto amortiguador del
material.
(a) Para Materiales Secos o Semisecos que No Contienen Cantidades Apreciables de Sustancias Básicas-Agregar un volumen de
ácido sulfúrico diluido (1 en 35) que equivalga, en mL, a no menos de 1O veces el peso seco del material, en g, pero la solu-
ción resultante debe contener no más de 5,0 mg de niacina en cada mL. Si el material no es fácilmente soluble, triturarlo para
que pueda dispersarse uniformemente en el líquido, luego agitar vigorosamente y lavar las paredes del matraz con ácido sulfú-
rico diluido (1 en 35).
Calentar la mezcla en un autoclave a una temperatura entre 121 ºy 123º durante 30 minutos y enfriar. Si se forman grumos,
agitar la mezcla hasta que las partículas se dispersen uniformemente. Ajustar la mezcla a un pH de 6,8 con solución de hidróxi-
do de sodio, diluir con agua para obtener un volumen final medido que tenga una concentración de niacina que equivalga a
la de la Solución Estándar de Niacina y filtrar.
(b) Para Materiales Secos o Semisecos que Contienen Cantidades Apreciables de Sustancias Básicas-Agregar suficiente solución
de ácido sulfúrico para llevar el pH de la mezcla a entre 5,0 y 6,0. Agregar una cantidad de agua suficiente para que el volu-
men total del líquido sea equivalente, en mL, a no menos de diez veces el peso seco de la muestra de valoración, en g, pero
que la solución resultante no contenga más de 5,0 mg de niacina en cada ml. Luego agregar el equivalente a 1O mL de ácido
sulfúrico diluido (2 en 7) por cada 100 mL de líquido y proceder como se indica en (a), comenzando a partir del segundo
párrafo.
(e) Para Materiales Líquidos-Ajustar el material a un pH de 5,0 a 6,0 con solución de ácido sulfúrico o bien con solución de
hidróxido de sodio. Agregar una cantidad de agua suficiente para que el volumen total del líquido sea igual, en mL a no me-
nos de 1O veces el volumen de la muestra, en mL, pero que la solución resultante no contenga más de 5,0 mg de niacina en
cada mL. Luego agregar el equivalente a 1O mL de ácido sulfúrico diluido (2 en 7) por cada mL de líquido y proceder como se
indica en (a), comenzando a partir del segundo párrafo.
Solución Madre de Niacina Estándar 1-Transferir 50,0 mg de ER Niacina USP a un matraz volumétrico de 500 mL, disol-
ver en alcohol, diluir a volumen con alcohol y mezclar. Almacenar en un réfrigerador. Cada mL de esta solución contiene
100 µg de ER Niacina USP.
Solución Madre de Niacina Estándar 11-Agregar agua a 100,0 mL de Solución Madre de Niacina Estándar I para obtener
1000,0 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Cada mL de esta solución contiene 1 O µg de ER Niacina USP.
Solución de Niacina Estándar-Diluir con agua un volumen adecuado de Solución Madre de Niacina Estándar 11 hasta un
volumen medido tal que después de su incubación, como se describe en el Procedimiento de Valoración, la transmitancia del
nivel de 5,0 mL de Solución de Niacina Estándar sea equivalente a un peso de células secas de no menos de 1,25 mg, cuando el
blanco inoculado se fija a una transmitancia de 1 00 por ciento. Esta concentración generalmente está entre 1 O ng y 40 ng de
niacina por ml. Preparar una Solución de Niacina Estándar nueva para cada valoración.
Solución Madre de Medio Basal-

Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína 25 ml

Solución de Cistina-T riptófano 25 ml
Dextrosa Anhidra 10 g
Acetato de Sodio Anhidro 5g
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina 5 ml
Solución de Ácido Aminobenzoico-Pantotenato de Calcio-Clorhidrato de Piridoxina 5 ml
 262 (441) Valoración de Niacina o Niacinamida /Pruebas Químicas USP 37

Solución Salina A 5 ml
Solución Salina B 5 ml

Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas y ajustar a un pH de 6,8 con
hidróxido de sodio 1 N. Finalmente, agregar agua para obtener 250 ml.
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína-Mezclar 100 g de caseína exenta de vitaminas con 500 ml de ácido clorhídri-
co aproximadamente al 20 por ciento (p/p) en ebullición constante, y someter la mezcla a reflujo durante 24 horas. Eliminar el
ácido clorhídrico de la mezcla mediante destilación a presión reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta
resultante en agua, ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH de 3,5 (± O, 1) y agregar agua para obtener
1 000 ml. Agregar 20 g de carbón activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbón activado si el
filtrado no presenta un color amarillo claro a incoloro. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Filtrar la solución si se for-
mara un precipitado al almacenar.
Solución de Cistina-Triptófano-Suspender 4,0 g de 1-cistina y 1,0 g de 1-triptófano (o 2,0 g de dl-triptófano) en 700 a
800 ml de agua, calentar entre 70º y 80º, y agregar el ácido clorhídrico al 20 por ciento (p/p), gota a gota, revolviendo, hasta
que los sólidos se disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una
temperatura no inferior a 1 Oº.
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo-Disolver 100 mg de sulfato de adenina, 1 00 mg de clorhidrato de guanina y
100 mg de uracilo, con ayuda de calor, en 5,0 ml del ácido clorhídrico al 20 por ciento (p/p), enfriar y agregar agua para ob-
tener 100 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina-Preparar una solución que contenga, en cada ml, 20 µg de
riboflavina, 1O µg de clorhidrato de tia mina y 0,04 µg de biotina obtenida disolviendo riboflavina cristalina, clorhidrato de tia-
mina cristalino y biotina cristalina (ácido libre) en ácido acético glacial diluido (1 en 850). Almacenar, protegida de la luz, bajo
tolueno en un refrigerador.
Solución de Ácido Aminobenzoico-Pantotenato de Calcio-Clorhidrato de Piridoxina-Preparar una solución de alcohol
neutro al 25 por ciento con una concentración de 1 O µg de ácido aminobenzoico, 20 µg de pantotenato de calcio y 40 µg de
clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución Salina A-Disolver 25 g de fosfato monobásico de potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para
obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Solución Salina B-Disolver en agua 1 O g de sulfato de magnesio, 500 mg de cloruro de sodio, 500 mg de sulfato ferroso y
500 mg de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Cultivo Madre de Lactobacillus plantarum-Disolver 2,0 g de extracto de levadura hidrosoluble en 100 ml de agua, agre-
gar 500 mg de dextrosa anhidra, 500 mg de acetato de sodio anhidro y 1,5 g de agar y calentar la mezcla en un baño de
vapor, con agitación, hasta que el agar se disuelva. Agregar porciones de aproximadamente 1O ml de la solución caliente a los
tubos de ensayo, tapar los tubos con algodón, esterilizar en un autoclave durante 15 minutos a una temperatura entre 121 ºy
123º y dejar que los tubos se enfríen en posición vertical. Preparar cultivos en cuña en tres o más de los tubos, empleando un
cultivo puro de Lactobacil/us plantarum, * incubándolos durante 16 a 24 horas a cualquier temperatura seleccionada entre 30º y
37° pero manteniéndola constante con una aproximación de± 0,5º y finalmente almacenar en un refrigerador. Preparar un
cultivo madre en cuña nuevo una vez por semana y no usar para inoculación si el cultivo tiene más de 1 semana.
Medio de Cultivo-Agregar 5,0 ml de agua que contenga 1,0 µg de niacina a cada uno de los tubos de una serie de tubos
de ensayo que contengan 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal. Tapar los tubos con algodón, esterilizar durante 15 minu-
tos en un autoclave a una temperatura entre 121ºy123º y enfriar.
lnóculo-Hacer una transferencia de células del cultivo madre de Lactobaci//us plantarum a un tubo estéril que contenga
1 O ml de medio de cultivo. Incubar este cultivo durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30º y 37º pero
mantenerla constante con una aproximación de± 0,5º. La suspensión de células así obtenida es el inóculo.
Calibración del Espectrofotómetro-Agregar en forma aséptica 1 ml de lnóculo a aproximadamente 300 ml de Medio de
Cultivo que contenga 1 ml de Solución de Niacina Estándar. Incubar el medio inoculado durante el mismo período de tiempo y
a la misma temperatura que se va a emplear en el Procedimiento de Valoración.
Después del período de incubación, centrifugar y lavar las células tres veces con porciones de aproximadamente 50 ml de
solución salina SR y luego resuspender las células en aproximadamente 25 ml de la solución salina.
Secar hasta peso constante una porción de 1O ml, medida con exactitud, empleando un baño de vapor y completando el
secado al vacío a 100º y calcular el peso seco de las células, en mg por ml, corregido por la cantidad de cloruro de sodio
presente.
Diluir una segunda porción, medida con exactitud, de la suspensión celular salina con solución salina de manera que cada
ml contenga una cantidad de células conocida que equivalga a 500 µg con respecto a la sustancia seca. Agregar a los tubos
de ensayo, por triplicado, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, 2,5 ml, 3,0 ml, 4,0 ml y 5,0 ml, respectivamente, de esta suspen-
sión de células diluida y 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y llevar el volumen de cada tubo hasta 1 0,0 ml con solución
salina. Empleando como blanco tres tubos similares que no contengan suspensión de células, medir la transmitancia de luz de
cada tubo en las mismas condiciones que se van a utilizar en la valoración. Graficar en papel cuadriculado las observaciones
como la ordenada en función del contenido celular, expresado en mg de peso seco, como la abscisa.

* Se pueden obtener cultivos puros de Lactobaci/lus plantarum, con el número 8014, de American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, EE.
uu.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (451) Volumetría con Nitrito 263

Repetir este procedimiento como mínimo dos veces para el espectrofotómetro que se va a emplear en la valoración. Trazar
la curva compuesta que mejor represente las tres o más curvas individuales que relacionan la transmitancia en función de la
densidad celular para el espectrofotómetro bajo las condiciones de la valoración.
Procedimiento de Valoración-Preparar los tubos del estándar de niacina del siguiente modo. Agregar a los tubos de en-
sayo, por duplicado, 0,0 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 2,5 mL, 3,0 mL, 3,5 mL, 4,0 mL, 4,5 mL y 5,0 mL, respectivamen-
te, de Solución de Niacina Estándar. Agregar a cada tubo 5,0 mL de Solución Madre de Medio Basal y agua para completar
10,0 ml.
Preparar los tubos que contienen el material a valorar de la siguiente manera. Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado,
1,0 mL, 2,0 mL, 3,0 mL y 4,0 mL, respectivamente, de la solución de prueba del material a valorar. Agregar a cada tubo 5,0 mL
de Solución Madre de Medio Basal y agua para completar 10,0 ml. Después de mezclar, tapar los tubos con algodón o cubrir
con tapas y esterilizar en autoclave a una temperatura entre 121ºy123º. (El recalentamiento de los tubos de ensayo puede
ocasionar resultados no satisfactorios). Enfriar, inocular en forma aséptica cada tubo con 1 gota de lnóculo e incubar durante
16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30º y 37º pero mantenida constante con una aproximación de± 0,5º. La
contaminación de los tubos de ensayo con organismos extraños invalida la valoración.
Determinar la transmitancia de los tubos de la siguiente manera. Mezclar el contenido de cada tubo, al que se puede agre-
gar 1 gota de una solución de un agente antiespumante adecuado, y transferir a un recipiente apto para la lectura óptica. Des-
pués de agitar su contenido, colocar el recipiente en un espectrofotómetro que se haya fijado a una longitud de onda específi-
ca entre 540 y 660 nm y leer la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se observa
unos pocos segundos después de agitar, cuando la lectura se mantiene constante durante 30 segundos o más. Emplear aproxi-
madamente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Si esta lectura de
transmitancia corresponde a un peso celular seco mayor de 600 µg por tubo o si hay evidencia de contaminación con un mi-
croorganismo extraño, descartar los resultados de la valoración.
Luego, con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco inoculado, leer la transmitancia para cada uno de los tubos restantes.
Descartar los resultados de la valoración si la diferencia entre la transmitancia observada al nivel más alto del estándar y la del
blanco inoculado es menor que la diferencia correspondiente al peso celular seco de 1,25 mg por tubo.
Cálculo-Graficar una curva estándar de las transmitancias del estándar de niacina para cada nivel de Solución de Niacina
Estándar en función de los µg de niacina contenidos en los tubos respectivos. A partir de esta curva estándar, determinar me-
diante interpolación el contenido de niacina de la solución de prueba de cada tubo. Descartar los valores de transmitancia que
equivalgan a menos de 0,5 mL o a más de 4,5 mL de Solución de Niacina Estándar. El contenido de niacina del material de
prueba se calcula a partir de los valores promedio obtenidos de no menos de seis tubos que no se alejen del promedio en más
de ± 1O por ciento. Si los valores de transmitancia de menos de seis tubos que contienen la solución de prueba están dentro del
intervalo de 0,5 mL a 4,5 mL de los tubos de estándar de niacina, los datos son insuficientes para permitir el cálculo de la con-
centración de niacina en el material de prueba. Los valores de transmitancia del blanco inoculado que excedan las lecturas
correspondientes a pesos celulares secos de más de 600 µg por tubo indican la presencia de una cantidad excesiva de niacina
en la Solución Madre de Medio Basal e invalidan la valoración.
Multiplicar los valores obtenidos por 0,992 si los resultados se deben expresar como niacinamida.

(451) VOLUMETRÍA CON NITRITO

El siguiente método general se utiliza para la determinación de la mayoría de los medicamentos farmacopeicos con sulfona-
midas y sus formas farmacéuticas, así como de otros medicamentos farmacopeicos para los cuales la volumetría con nitrito
resulta particularmente apropiada.
Estándares de referencia USP (11 )-ER Sulfanilamida USP.
Procedimiento-Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg en el caso de una sulfonamida, o la cantidad especificada
en la monografía individual y transferir a un recipiente apropiado abierto. Agregar 20 mL de ácido clorhídrico y 50 mL de
agua, agitar hasta disolver, enfriar hasta aproximadamente 15°, lentamente valorar con nitrito de sodio O, l M SV, previamente
normalizado frente a ER Sulfanilamida USP.
Determinar electrométricamente el punto final empleando electrodos apropiados (de platino-calomel o platino-platino). Co-
locar la punta de la bureta debajo de la superficie de la solución para evitar la oxidación del nitrito de sodio por efecto del aire
y agitar la solución suavemente, usando un agitador magnético, evitando la formación de un vórtice de aire bajo la superficie y
manteniendo la temperatura aproximadamente a 15º. La volumetría puede llevarse a cabo manualmente, o con un titulador
automático. En la volumetría manual, agregar la solución volumétrica hasta que la volumetría esté cerca de 1 mL del punto
final y luego, agregar porciones de O, l mL, dejando que transcurra no menos de 1 minuto entre cada adición. (La aguja del
instrumento se desvía y luego regresa aproximadamente a su posición original hasta que se alcanza el punto final).
El peso, en mg, de la sustancia al que equivale cada mL de nitrito de sodio O, 1 M SV es el indicado en la monografía indivi-
dual.
 264 (451 > Volumetría con Nitrito/ Pruebas Químicas USP 37

Para la valoración de Tabletas de sulfonamidas u otros fármacos, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas, pesar con
exactitud una porción del polvo, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de fármaco
especificada en la monografía individual y proceder según se indica previamente, desde donde dice "transferir a un recipiente
apropiado abierto".
Para la valoración de Inyectables y otras formas líquidas para las que se especifica la volumetría con nitrito, pipetear una
porción, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de fármaco especificada en la mo-
nografía individual, y transferir a un recipiente abierto apropiado y proceder según se indica previamente, desde donde dice
"Agregar 20 ml de ácido clorhídrico".

(461) DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO

Algunos alcaloides y otros compuestos orgánicos que contienen nitrógeno no proporcionan todo el nitrógeno que contie-
nen al someterlos a digestión con ácido sulfúrico; en consecuencia, estos métodos no pueden emplearse para la determinación
de nitrógeno en todos los compuestos orgánicos.

MÉTODO 1

Nitratos y Nitritos Ausentes-Colocar aproximadamente 1 g de la sustancia, pesado con exactitud, en un matraz de Kjel-
dahl de 500 ml de vidrio de borosilicato duro. El material a analizar, si es sólido o semisólido, puede envolverse en una hoja de
papel de filtro exento de nitrógeno para transferirlo mas cómodamente al matraz. Agregar 1 O g de sulfato de potasio en polvo
o sulfato de sodio anhidro, 500 mg de sulfato cúprico en polvo y 20 ml de ácido sulfúrico. Inclinar el matraz en un ángulo de
aproximadamente 45º y calentar moderadamente la mezcla, manteniendo la temperatura debajo del punto de ebullición has-
ta que deje de producir espuma. Aumentar el calor hasta que el ácido llegue a una ebullición intensa y continuar el calenta-
miento hasta que la solución se torne casi incolora o adquiera un color verde transparente durante 30 minutos. Dejar que se
enfríe, agregar 150 ml de agua, mezclar el contenido del matraz y volver a enfriar. Agregar cuidadosamente 100 ml de solu-
ción de hidróxido de sodio (2 en 5), de tal manera que la solución fluya hacia abajo por la pared interna del matraz y forme
una capa bajo la solución ácida. Agregar inmediatamente unos pedazos de cinc granulado y, sin demorarse, conectar el ma-
traz a un bulbo de conexión (trampa) Kjeldahl, previamente unido a un condensador, cuyo tubo de salida esté sumergido de-
bajo de la superficie de 100 ml de solución de ácido bórico (1 en 25) contenidos en un matraz Erlenmeyer o en un frasco de
boca ancha de aproximadamente 500 ml de capacidad. Mezclar el contenido del matraz de Kjeldahl mediante rotación mode-
rada y destilar hasta que se hayan destilado aproximadamente cuatro quintas partes del contenido del matraz. Valorar con
ácido sulfúrico 0,5 N SV, determinando el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y ha-
cer las correcciones necesarias. Cada ml de ácido sulfúrico 0,5 N SV equivale a 7,003 mg de nitrógeno.
Cuando se sabe que el contenido de nitrógeno de la sustancia es bajo, el ácido sulfúrico 0,5 N SV puede reemplazarse por
ácido sulfúrico O, 1 N SV. Cada ml de ácido sulfúrico O, 1 N SV equivale a 1,401 mg de nitrógeno.
Nitratos y Nitritos Presentes-Colocar una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud, que corresponda aproximada-
mente a 150 mg de nitrógeno, en un matraz de Kjeldahl de 500 ml de vidrio de borosilicato duro y agregar 25 ml de ácido
sulfúrico en el cual se ha disuelto previamente 1 g de ácido salicílico. Mezclar el contenido del matraz y dejar reposar la mezcla
durante 30 minutos agitando frecuentemente. Agregar a la mezcla 5 g de tiosulf.ato de sodio en polvo y volver a mezclar; lue-
go, agregar 500 mg de sulfato cúprico en polvo y proceder según se indica en Nitratos y Nitritos Ausentes, desde donde dice
"Inclinar el matraz a un ángulo de aproximadamente 45º".
Cuando se sabe que el contenido de nitrógeno de la sustancia excede de 10%, pueden agregarse entre 500 mg y 1 g de
ácido benzoico, antes de la digestión, para facilitar la descomposición de la sustancia.

MÉTODO 11
Aparato-Seleccionar un matraz de Kjeldahl de 300 ml adecuado, del cual se libera el nitrógeno por digestión ácida en
primer lugar y luego se transfiere cuantitativamente al recipiente de volumetría mediante destilación con vapor.
Procedimiento-Colocar en el matraz de digestión del aparato una cantidad del material pesada o medida con exactitud,
equivalente a 2 a 3 mg de nitrógeno. Agregar 1 g de una mezcla pulverizada de sulfato de potasio y sulfato cúprico (1O:1) y
lavar el cuello del matraz con un chorro fino de agua para desprender cualquier material adherido a él. Agregar 7 ml de ácido
sulfúrico, dejando que se escurra por las paredes del matraz; luego, girando el matraz con rotación suave, agregar cuidadosa-
mente 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento de manera tal que resbale por la pared del matraz. (No agregar peróxi-
do de hidrógeno durante la digestión).
Calentar el matraz sobre una llama libre o sobre un calentador eléctrico hasta que la solución tome un color azul transparen-
te y las paredes del matraz estén exentas de material carbonoso. Agregar cuidadosamente 70 ml de agua a la mezcla de diges-
tión, enfriar la solución y preparar para destilación con vapor. Agregar 30 ml de solución de hidróxido de sodio (2 en 5) a
 USP 37 Pruebas Químicas/ <466) Impurezas Comunes 265

través de un embudo, de manera tal que la solución fluya hacia abajo por la pared interna del matraz para formar una capa
bajo la solución ácida; enjuagar el embudo con 1O mL de agua, cerrar herméticamente el aparato y comenzar la destilación
con vapor inmediatamente. Recibir el destilado en 15 mL de solución de ácido bórico (1 en 25), a la cual se le han agregado
3 gotas de rojo de metilo-azul de metileno SR y agua suficiente para cubrir el extremo del tubo condensador. Continuar la
destilación hasta que el destilado mida de 80 a 100 ml. Retirar el matraz de absorción, enjuagar el extremo del tubo conden-
sador con una cantidad pequeña de agua y valorar volumétricamente el destilado con ácido sulfúrico 0,01 N SV. Realizar una
determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido sulfúrico 0,01 N SV equivale a 140, 1 ~tg de
nitrógeno.
Cuando se toma una cantidad de material que contiene más de 2 mg a 3 mg de nitrógeno, puede emplearse ácido sulfúrico
0,02 N o O, 1 N, siempre y cuando se requieran al menos 15 mL para la volumetría. Si el peso seco total de material tomado es
mayor de 100 mg, aumentar proporcionalmente las cantidades de ácido sulfúrico y de hidróxido de sodio.

<466) IMPUREZAS COMUNES

Esta prueba tiene como fin evaluar la presencia de impurezas comunes en artículos oficiales y se utiliza cuando una mono-
grafía individual así lo indica. Las impurezas comunes se definen como aquellas especies en fármacos y/o productos farmacéu-
ticos que no poseen una actividad biológica indeseable significativa en las cantidades presentes. Estas impurezas pueden surgir
de la síntesis, preparación o degradación de los artículos farmacopeicos. En algunos casos, se pueden detectar impurezas que
representan un riesgo potencial para la salud. Dado que dichas impurezas no serían identificadas individualmente por el uso
estricto de este Capítulo General, puede ser necesario realizar otra evaluación diferente para garantizar que las impurezas de-
tectadas cumplen con los requisitos establecidos en la definición de Impurezas Comunes. La selección de pruebas y valoracio-
nes admite cantidades previstas de impurezas que no son objetables para el uso habitual del artículo.
Informe y Especificaciones-A menos que la monografía individual indique algo diferente, se seleccionó el valor 2,0% co-
mo límite general para la cantidad total de impurezas comunes en monografías en las que la documentación no respaldaba la
adopción de otros valores.
Cuando una monografía establece límites para componentes concomitantes y/o impurezas/productos de degradación espe-
cificados, estas especies no deben incluirse en la estimación de impurezas comunes a menos que así lo especifique la monogra-
fía individual. Los componentes concomitantes se definen como especies características de muchos fármacos que no se consi-
deran impurezas en el sentido Farmacopeico. Son ejemplos de componentes concomitantes los isómeros geométricos y ópti-
cos (o racematos) y los antibióticos que son mezclas. Cualquier componente que pueda considerarse una impureza tóxica de-
bido a su efecto biológico indeseable significativo no se considera un componente concomitante.
Metodología-A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, la estimación de la cantidad y número
de impurezas comunes se hace mediante métodos relativos en lugar de la comparación estricta con Estándares de Referencia
individuales. La detección no específica de impurezas comunes también es consecuente con esta clasificación.
Los métodos de evaluación típicos empleados para las impurezas comunes son las técnicas por cromatografía en capa delga-
da (TLC, por sus siglas en inglés). Ver en Cromatografía (621) una explicación general de la técnica por cromatografía en capa
delgada. Las pruebas para sustancias relacionadas o pureza cromatográfica también pueden usarse para evaluar la presencia de
impurezas comunes. También pueden emplearse, con la debida justificación, otros métodos alternativos (p.ej., HPLC, HPTLC,
etc.). A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, u.sar el siguiente método.
Solución de Prueba-Preparar una solución de la sustancia en análisis en el disolvente especificado en la monografía para
obtener una concentración final conocida con exactitud de aproximadamente 1O mg por ml. [NOTA-Para disolver el fármaco
se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten negativamente el compuesto.]
Soluciones Estándar-Preparar soluciones del Estándar de Referencia USP o de la sustancia indicada en el disolvente especi-
ficado en la monografía, para obtener concentraciones conocidas con exactitud de 0,01 mg por ml, 0,05 mg por ml, O, 1 mg
por mL y 0,2 mg por ml. [NOTA-Para disolver el fármaco se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos pro-
cedimientos no afecten negativamente el compuesto.]
Procedimiento-Utilizar una placa para cromatografía en capa delgada recubierta de una capa de mezcla de gel de sílice
para cromatografía de 0,25 mm de espesor y la Fase móvil especificada en la monografía. Aplicar a la placa volúmenes iguales
(de 20 µL) de la Solución de Prueba y de las Soluciones Estándar, empleando una corriente de nitrógeno para secar las manchas.
Desarrollar el cromatograma en una cámara preequilibrada hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximada-
mente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara y secar al aire. Examinar la placa utilizando las técni-
cas de visualización especificadas. Localizar en el cromatograma de la Solución de Prueba cualquier mancha diferente de la
mancha principal y determinar las intensidades relativas por comparación con las manchas obtenidas en los cromatogramas de
las Soluciones Estándar correspondientes. Ver la discusión anterior en cuanto al informe y especificación de impurezas comunes
totales.
 •
266 (466) Impurezas Comunes/ Pruebas Químicas USP 37

CLAVE DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN

(1) Utilizar luz UV a 254 nm y aproximadamente a 366 nm.

(2) Utilizar Yodoplatinato SR.
(3) Solución A-Mezclar 850 mg de subnitrato de bismuto con 40 ml de agua y 1 O ml de ácido acético glacial.
Solución 8--Disolver 8 g de yoduro de potasio en 20 ml de agua. Mezclar A y B para obtener una Solución Madre, la cual se
puede almacenar durante varios meses en un frasco oscuro. Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 1 O ml de la Solu-
ción Madre con 20 ml de ácido acético glacial y diluir con agua hasta 100 ml.
(4) Solución de Ninhidrina para Rociado-Disolver 200 mg de ninhidrina en 100 ml de alcohol. Calentar la placa después de
rociarla.
(5) Solución de Ácido para Rociado-En un baño de hielo, agregar lenta y cuidadosamente, y mezclando, 1 O ml de ácido
sulfúrico a 90 ml de alcohol. Rociar Ja placa y calentarla hasta que se carbonice.
(6) Solución de Ácido-Dicromato para Rociado-Agregar suficiente dicromato de potasio a 100 ml de ácido sulfúrico para ob-
tener una solución saturada. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice.
(7) Vainil/ina-Disolver 1 g de vainillina en 100 ml de ácido sulfúrico.
(8) Cloramina T-Ácido Tricloroacético-Mezclar 1 O ml de una solución acuosa de cloramina Tal 3% con 40 ml de una solu-
ción alcohólica de ácido tricloroacético al 25%. Preparar inmediatamente antes de usar.
(9) Folin-C-Agregar 1 O g de tungstato de sodio y 2,5 g de molibdato de sodio a 70 ml de agua, agregar 5 ml de ácido
fosfórico al 85% y 1 O ml de ácido clorhídrico al 36% y someter esta solución a reflujo durante 1 O horas.
(1 O) KMn0 4 -Disolver 100 mg de Permanganato de Potasio en 1 00 ml de agua.
(11) OAB--Mezclar 1 g de p-dimetilaminobenzaldehído en 1 00 ml de ácido clorhídrico 0,6 N.
(12) OAC-Mezclar 100 mg de p-dimetilaminocinamaldehído en 100 ml de ácido clorhídrico 1 N.
(13) Ferricianuro-Mezclar volúmenes iguales de una solución de cloruro férrico al 1 % y de una solución de ferricianuro de
potasio al 1 %. Usar inmediatamente.
(14) Fast Blue 8--Reactivo A-Disolver 500 mg de Sal de Fast Blue B en 100 ml de agua.
Reactivo B-Hidróxido de sodio O, 1 N.
Rociar primero con el Reactivo A y luego con el Reactivo B.
(15) Cianuro Férrico Alcalino-Diluir 1,5 ml de una solución de ferricianuro de potasio al 1 % con agua hasta 20 ml y agregar
1 O ml de una solución de hidróxido de sodio al 15%.
(16) Solución de Yodo para Rociado-Preparar una solución de yodo al 0,5% en cloroformo.
(17) Exponer la placa durante 1 O minutos a Jos vapores de yodo en una cámara cerrada preequilibrada que tenga cristales
de yodo en el fondo.
(18) Solución A-Disolver 0,5 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua.
Solución 8--Preparar una solución de 0,5 g de almidón soluble en 50 ml de agua caliente.
Mezclar volúmenes iguales de Ja Solución A y de la Solución B inmediatamente antes de usar.
(19) PTSS-Disolver 20 g de ácido p-toluensulfónico en 100 ml de alcohol, rociar la placa, secarla durante 15 minutos a
11 Oº y examinarla bajo luz UV a 366 nm.
(20) Solución de o-Tolidina para Rociado-Disolver 160 mg de o-tolidina en 30 ml de ácido acético glacial, diluir con agua
hasta 500 ml, agregar 1 g de yoduro de potasio y mezclar hasta que el yoduro de potasio se haya disuelto.
(21) Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 3 ml de solución de ácido cloroplatínico (1 en 1 O) con 97 ml de agua,
seguido del agregado de 100 ml de una solución de yoduro de potasio (6 en 100).
(22) Solución de Yodo-Metano! para Rociado-Preparar una mezcla de yodo SR y metano! (1 :1 ).

(467) DISOLVENTES RESIDUALES

INTRODUCCIÓN

Este capítulo general se aplica a fármacos, excipientes y productos existentes. Toda sustancia o producto se encuentra sujeto
al control pertinente de disolventes que pudieran estar presentes en una sustancia o producto.
Generalmente no se mencionan las pruebas de disolventes residuales en las monografías específicas cuando los límites a apli-
car cumplen con los que se especifican más adelante, ya que los disolventes empleados pueden variar de un fabricante a otro.
El objetivo de este capítulo general es proporcionar las cantidades aceptables de disolventes residuales en productos farma-
céuticos para la seguridad del paciente. El capítulo recomienda el uso de disolventes menos tóxicos y describe niveles conside-
rados toxicológicamente aceptables para algunos disolventes residuales.
Para propósitos farmacopeicos, Jos disolventes residuales en productos farmacéuticos se definen como las sustancias quími-
cas orgánicas volátiles que se emplean o producen durante la fabricación de fármacos o excipientes, o en la preparación de
productos farmacéuticos. Los disolventes residuales no se eliminan por completo mediante las técnicas prácticas de fabrica-
 USP 37 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 267

ción. La selección adecuada del disolvente para la síntesis de un fármaco o un excipiente puede mejorar el rendimiento o de-
terminar características tales como la forma cristalina, la pureza y la solubilidad. Por lo tanto, a veces el disolvente puede ser un
elemento crítico en el proceso de síntesis. Este capítulo general no trata los disolventes que se emplean deliberadamente como
excipientes ni los solvatos. No obstante, se debe evaluar y justificar el contenido de disolventes en tales productos.
Dado que los disolventes residuales no proporcionan ningún beneficio terapéutico, deben eliminarse en lo posible, para
cumplir con las especificaciones del producto y de sus ingredientes, las buenas prácticas de fabricación u otros requisitos basa-
dos en la calidad. Los productos farmacéuticos no deben contener niveles de disolventes residuales superiores a los que permi-
tan los datos de seguridad. Evitar el uso de disolventes que ocasionen una toxicidad inaceptable (Clase 1, Tabla 7) en la pro-
ducción de fármacos, excipientes o productos farmacéuticos, a menos que su uso pueda justificarse fehacientemente mediante
una evaluación de riesgo-beneficio. Se deberá limitar el uso de disolventes asociados a una toxicidad menos grave (Clase 2,
Tabla 2) para proteger a los pacientes de posibles efectos adversos. En una situación ideal, se deberían emplear los disolventes
menos tóxicos (Clase 3, Tabla 3). En el Apéndice 7 se proporciona la lista de todos los disolventes incluidos en este capítulo
general. Estas tablas y el listado no son exhaustivos. Para los fines de esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aproba-
ción por parte de una autoridad reglamentaria competente para usar un disolvente nuevo que no se indica actualmente en
este capítulo, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente, el límite de disolvente residual
aprobado en el artículo y el procedimiento de prueba adecuado para dicho disolvente residual en el artículo. La USP considera-
rá entonces este tema en la monografía individual. Cuando se aprueba un disolvente nuevo a través del proceso de ICH, este
disolvente nuevo se agregará a la lista correspondiente en este capítulo general. En ese momento, se considerará la eliminación
del requisito de la prueba para el disolvente específico en la monografía individual.
Se deberán analizar los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos para detectar la presencia de disolventes residuales
cuando se sepa que los procesos de purificación o producción dan como resultado la presencia de tales disolventes residuales.
Solamente es necesario realizar pruebas para los disolventes residuales que se emplean o producen en la purificación o fabrica-
ción de fármacos, excipientes o productos.
Aunque los fabricantes pueden optar por realizar una prueba al producto farmacéutico, se puede emplear un procedimiento
acumulativo para calcular los niveles de disolventes residuales en el producto farmacéutico a partir de los niveles en los ingre-
dientes usados para producir el producto farmacéutico. Si los cálculos dan como resultado un nivel igual o inferior al propor-
cionado en este capítulo general, no es necesario considerar la realización de la prueba de disolventes residuales al producto
farmacéutico. Sin embargo, si el nivel calculado está por encima del nivel recomendado, se debe analizar el producto farma-
céutico para determinar si el proceso de formulación redujo el nivel del disolvente correspondiente hasta la cantidad acepta-
ble. También se debe analizar un producto farmacéutico si durante su fabricación se utiliza un disolvente residual.
Para los fines de esta Farmacopea, cuando el fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria com-
petente de un nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del
disolvente y el límite de disolvente residual aprobado en el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía
individual.
Ver el Apéndice 2 para obtener información de referencia adicional sobre disolventes residuales.

CLASIFICACIÓN DE DISOLVENTES RESIDUALES POR EVALUACIÓN DE RIESGO

El Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Químicas (lnternational Program on Chemical Safety, IPCS, por sus
siglas en inglés) emplea la expresión ingesta diaria tolerable (IDT) para describir los límites de exposición a sustancias químicas
tóxicas, y la Organización Mundial de la Salud (OMS) y otros institutos y autoridades sanitarias nacionales e internacionales
emplean la expresión ingesta diaria admisible (IDA). La expresión exposición f}iaria permitida (EDP) se define como la ingesta
farmacéuticamente admisible de disolventes residuales para evitar crear confusiones con valores diferentes de IDA de una mis-
ma sustancia.
Los disolventes residuales que se evalúan en este capítulo general se listan en el Apéndice 7 según su estructura y nombre
común. Los mismos han sido evaluados en función del riesgo que pueden suponer para la salud humana y colocados en una
de las tres clases que figuran a continuación:

Clase de
Disolvente
Residual Evaluación
Disolventes que deben evitarse.
Sustancias conocidas como carcinógenas para los seres humanos.
Clase 1
Sustancias seriamente sospechosas de ser carcinógenas para los seres humanos.
Sustancias que representan riesgos ambientales.
Disolventes que deben limitarse.
Sustancias carcinógenas y no genotóxicas, o posibles agentes causantes de otras toxicidades irreversibles
Clase 2
tales como neurotoxicidad o teratogenicidad, en animales.
Disolventes sospechosos de causar otras toxicidades importantes pero reversibles.
* Para disolventes residuales con EDP superior a 50 mg por día, ver las consideraciones presentadas en la sección Clase 3 en Límites de Disolventes Residuales.
268 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 37

Clase de
Disolvente
Residual Evaluación
Disolventes con bajo potencial tóxico
Clase 3 Disolventes con bajo potencial tóxico para los seres humanos; no es necesario un límite de exposición
basado en el riesgo para la salud.
[NOTA-Los disolventes residuales de Clase 3 tienen EDP de 50 mg o más por día.]*
* Para disolventes residuales con EDP superior a 50 mg por día, ver las consideraciones presentadas en la sección Clase 3 en Límites de Disolventes Residuales.

MÉTODOS PARA ESTABLECER LÍMITES DE EXPOSICIÓN

El método empleado para establecer la EDP respecto a disolventes residuales se presenta en el Apéndice 3.
Para los artículos designados como "sólo para uso veterinario", se pueden justificar niveles más elevados de EDP y de límite
de concentración en casos excepcionales, basados en la dosis diaria real, la especie para la cual están destinados y los datos
toxicológicos pertinentes, considerando el impacto sobre la seguridad del consumidor. Para los fines de esta Farmacopea,
cuando un fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente de un límite superior, es res-
ponsabilidad del fabricante notificar a la USP el límite de disolvente residual aprobado en el artículo y la justificación. La USP
considerará entonces este tema en la monografía individual.

OPCIONES PARA DESCRIBIR LOS LÍMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES DE CLASE 2

Existen dos opciones para establecer los límites de disolventes residuales de Clase 2.

Opción 1

Se emplean los límites de concentración en ppm indicados en la Tabla 2. Éstos se calcularon empleando la ecuación que
figura a continuación, suponiendo un peso de producto de 1 O g administrado diariamente.
Concentración (ppm) = (1000 µg/mg x EDP)/dosis
En este caso, la EDP se expresa en mg por día y la dosis se expresa en g por día.
Estos límites se consideran aceptables para todos los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos. Por lo tanto, esta op-
ción se puede aplicar si la dosis diaria no se conoce o no ha sido fijada. Si todos los fármacos y excipientes de una formulación
cumplen con los límites que se proporcionan en la Opción 7, estos componentes se pueden usar en cualquier proporción. No
es necesario realizar cálculos adicionales siempre que la dosis diaria no exceda de 1O g. Los productos que se administran en
dosis superiores a 1O g por día se contemplan en la Opción 2.

Opción 2

No se requiere que cada componente del producto farmacéutico cumpla con los límites proporcionados en la Opción 7. Se
puede emplear la EDP expresada en mg por día según se indica en la Tabla 2 con la dosis diaria máxima conocida y la ecua-
ción anteriormente mencionada, para determinar la concentración de disolvente residual permitida en un producto farmacéu-
tico. Tales límites se consideran aceptables, si se demuestra que el disolvente residual se ha reducido al mínimo factible. Los
límites deben ser realistas en cuanto a la precisión analítica, la capacidad de fabricación y la variación razonable en el proceso
de fabricación. Los límites también deben reflejar las normas de fabricación actuales.
La Opción 2 se puede aplicar sumando las cantidades de disolventes residuales presentes en cada uno de los componentes
del producto farmacéutico. La suma de las cantidades de disolvente por día debe ser menor que la indicada por la EDP.
A continuación, se ofrece un ejemplo de la aplicación de la Opción 7 y la Opción 2 para la concentración de acetonitrilo en
un producto farmacéutico. La exposición diaria permitida al acetonitrilo es 4, 1 mg por día; por lo tanto, el límite de la Opción 7
es 41 O ppm. El peso diario máximo administrado de un producto farmacéutico es 5,0 g y el producto farmacéutico contiene
dos excipientes. La composición del producto farmacéutico y el contenido máximo calculado de acetonitrilo residual se mues-
tran en la siguiente tabla.
Cantidad en la Contenido de Exposición
Formulación Acetonltrllo Diaria
Componente (g) (ppm) (mg)
Fármaco 0,3 800 0,24
Excipiente 1 0,9 400 0,36
Excipiente 2 3,8 800 3,04
Producto farmacéutico 5,0 728 3,64
 USP 37 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 269

El Excipiente 1 cumple con el límite de la Opción 1, pero el fármaco, el excipiente 2 y el producto farmacéutico no cumplen
con el límite de la Opción 1. No obstante, el producto farmacéutico cumple con el límite de la Opción 2 de 4, 1 mg por día y de
ese modo se ajusta a los criterios de aceptación de este capítulo general.
A continuación, se ofrece otro ejemplo que emplea acetonitrilo como disolvente residual. El peso diario máximo administra-
do de un producto farmacéutico es 5,0 g y el producto farmacéutico contiene dos excipientes. La composición del producto
farmacéutico y el contenido máximo calculado de acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla.

Contenido de Exposición
Cantidad en la Acetonitrilo Diaria
Componente Formulación (g) (ppm) (mg)
Fármaco 0,3 800 0,24
Excipiente 1 0,9 2000 1,80
Excipiente 2 3,8 800 3,04
Producto farmacéutico 5,0 1016 5,08

En este ejemplo, el producto farmacéutico no cumple con el límite de la Opción 1 ni con el de la Opción 2 según esta suma. El
fabricante podría analizar el producto farmacéutico para determinar si el proceso de formulación redujo el nivel de acetonitrilo.
Si, durante la formulación, el nivel de acetonitrilo no se redujo a los límites permitidos, el producto no cumple con los límites
de disolventes según se describen en este capítulo y el fabricante del producto farmacéutico debe tomar otras medidas para
reducir la cantidad de acetonitrilo en el producto farmacéutico. En algunos casos, el fabricante puede haber recibido la apro-
bación por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre dicho nivel más elevado de disolvente residual. Si éste fue-
ra el caso, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el límite de disolvente residual apro-
bado en el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual.

PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

Normalmente, los disolventes residuales se determinan empleando técnicas cromatográficas tales como la cromatografía de
gases. Los métodos oficiales para analizar el contenido de disolventes residuales se describen en la sección Identificación, Con-
trol y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo general. Las Advertencias Generales tratan el uso de otros métodos
en circunstancias especiales (ver 6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados). Si están presentes disolventes de
Clase 3, se puede usar un método no específico como por ejemplo pérdida por secado.

INFORME DE NIVELES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Los fabricantes de productos farmacéuticos necesitan cierta información acerca del contenido de disolventes residuales en
fármacos o excipientes para cumplir con los criterios de este capítulo general. Las siguientes declaraciones se proporcionan
como ejemplos aceptables de la información que podría ofrecer un proveedor de fármacos o excipientes a un fabricante de
productos farmacéuticos. El proveedor podría escoger alguna de las que se presentan a continuación, según corresponda:
• Es probable que estén presentes sólo disolventes de Clase 3. La pérdida por secado es menos de 0,5%.
• Es probable que estén presentes sólo los disolventes X, Y, ... de Clase 2. Todos se encuentran por debajo del límite de la
Opción 1. (Aquí el fabricante mencionaría los disolventes de Clase 2 representados por X, Y, ... )
• Es probable que estén presentes sólo los disolventes X, Y, ... de Clase 2 y disolventes de Clase 3. Los disolventes residuales
de Clase 2 se encuentran por debajo del límite de la Opción 1 y los disolventes residuales de Clase 3 se encuentran por
debajo de 0,5%.
La frase "es probable que estén presentes", según se usa en los ejemplos anteriores, hace referencia al disolvente usado o
producido en la etapa final de fabricación y a los disolventes usados o producidos en las etapas iniciales de fabricación y que
no son eliminados uniformemente mediante un proceso validado.
Si es probable que estén presentes los disolventes de Clase 1, éstos se deberían identificar y cuantificar. Si los disolventes de
Clase 2 ó 3 están presentes en cantidades superiores a los límites de la Opción 1 ó 0,5%, respectivamente, éstos se deben iden-
tificar y cuantificar.

LÍMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Clase 1 (Disolventes que deben evitarse)

Los disolventes residuales de Clase 1 (Tabla 1) no deben emplearse en la fabricación de fármacos, excipientes o productos
farmacéuticos debido a su inaceptable toxicidad o sus efectos ambientales perjudiciales. No obstante, si es inevitable su uso en
la fabricación de un medicamento con una ventaja terapéutica significativa, sus niveles deben estar restringidos tal como se
muestra en la Tabla 1, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. El disolvente 1, 1, 1-tricloroetano se
ha incluido en la Tabla 1 debido a que representa un riesgo ambiental. El límite indicado de 1500 ppm está basado en la revi-
sión de datos de seguridad.
 1

270 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 37

Cuando se emplean o producen disolventes residuales de Clase 1 en la fabricación o purificación de fármacos, excipientes o
productos farmacéuticos y no son eliminados durante el proceso, estos disolventes se deben identificar y cuantificar. Los proce-
d1m1entos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo gene-
ral se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
Tabla 1. Disolventes Residuales de Clase 1
(Disolventes que deben evitarse)
Límite de
Disolvente Concentración (ppm) Motivo
r--- Benceno 2 Carcinógeno
Tetracloruro de carbono 4 Tóxico y presenta riesgos para el medio ambiente
1,2-Dicloroetano 5 Tóxico
,_..1, 1-Dicloroeteno 8 Tóxico

1
l, l, 1-Tricloroetano 1
1500 Presenta riesgos para el medio ambiente

Clase 2

Los disolventes residuales de Clase 2 (Tabla 2) deben estar limitados en los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos
debido a su toxicidad inherente. Las EDP se proporcionan con una aproximación de O, 1 mg por día y las concentraciones con
una aproximación de 1O ppm. Los valores indicados no reflejan la precisión analítica necesaria del proceso de determinación.
La precisión se debe determinar como parte de la validación del procedimiento.
Si los disolventes residuales de Clase 2 están presentes en cantidades superiores a los límites de la Opción 7, éstos se deben
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes
Residuales de este capítulo general se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un pro-
cedimiento validado apropiado. [NOTA-Los siguientes disolventes residuales de Clase 2 no se detectan con facilidad mediante
las condiciones de inyección de fase gaseosa que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes
Residuales de este capítulo general: formamida, 2-etoxietanol, 2-metoxietanol, etilenglicol, N-metilpirrolidona y sulfolano. Es
necesario emplear otros procedimientos validados apropiados para la cuantificación de estos disolventes residuales. Tales pro-
cedimientos se deberán remitir a la USP para su revisión y posible inclusión en la monografía individual correspondiente. Ade-
más, puede usarse ER Mezcla e-Disolventes Residuales de Clase 2 USP para desarrollar un procedimiento alternativo.]
Tabla 2. Disolventes Residuales de Clase 2
Límite de
EDP Concentración
Disolvente (mg/día) (ppm)
Aceton itri lo 4,1 410
Ciclohexano 38,8 3880
Clorobenceno 3,6 360
Cloroformo 0,6 60
Cloruro de metileno 6,0 600
Cu meno 0,7 70
1,2-Dicloroeteno 18,7 1870
N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090
N,N-Dimetilformamida 8,8 880
1,2-Dimetoxietano 1,0 100
1,4-Dioxano 3,8 380
Etilenglicol 6,2 620
2-Etoxietanol 1,6 160
Forma mida 2,2 220
Hexano 2,9 290
Metanol 30,0 3000
Metilbutilcetona 0,5 50
Metilciclohexano 11,8 1180
N-Metilpirrolidona 5,3 530
2-Metoxietanol 0,5 50
Nitrometano 0,5 50
Piridina 2,0 200
Sulfolano 1,6 160
* Generalmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etilbenceno
USP 37 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 271

Tabla 2. Disolventes Residuales de Clase 2 (Continuación)

Límite de
EDP Concentración
Disolvente (mg/día) (ppm)
Tetrahidrofurano 7,2 720
Tetralina 1,0 100
Tolueno 8,9 890
Tricloroetileno 0,8 80
Xileno* 21,7 2170
• Generalmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etilbenceno

Clase 3
Se considera que los disolventes residuales de Clase 3 (Tabla 3) son menos tóxicos y representan un riesgo menor para la
salud humana que los disolventes residuales de Clase 1 y Clase 2. La Clase 3 no incluye disolventes que representen un riesgo
para la salud humana a los niveles normalmente aceptados en productos farmacéuticos. Sin embargo, no hay estudios de car-
cinogenicidad o toxicidad a largo plazo para muchos de los disolventes residuales de Clase 3. Los datos disponibles indican
que son menos tóxicos en estudios de toxicidad a corto plazo o agudos y que son negativos en estudios de genotoxicidad.
Se considera que aquellas cantidades de disolventes residuales de 50 mg por día o menos (correspondientes a 5000 ppm o
0,5% en la Opción 1) serían aceptables sin necesidad de justificación. Cantidades superiores pueden también ser aceptables
siempre que sean realistas en relación con la capacidad de fabricación y las buenas prácticas de fabricación. Para los fines de
esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre un
nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el
límite de disolvente residual aprobado para el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual. Si
el límite de disolvente de Clase 3 en una monografía individual es superior a 50 mg por día, ese disolvente residual se debe
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes
Residuales de este capítulo general, con las debidas modificaciones a las soluciones estándar, se deben aplicar siempre que sea
posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
Tabla 3. Disolventes Residuales de Clase 3
(Limitados por las buenas prácticas de fabricación u otros requisitos basados en la calidad en fármacos, excipientes y productos farmacéuticos)
Acetato de butilo Etanol
Acetato de etilo Éter terc-butilmetílico
Acetato de isobutilo Éter etílico
Acetato de isopropilo Formiato de etilo
Acetato de metilo Heptano
Acetato de propilo 3-Metil-1-butanol
Acetona Metiletilcetona
Ácido acético Metilisobutilcetona
Ácido fórmico 2-Metil-1-propanol
Anisol Pentano
1-Butanol 1-Pentanol
2-Butanol 1-Propanol
Dimetil sulfóxido 2-Propanol

Otros Disolventes Residuales

Los disolventes residuales que figuran en la Tabla 4 también podrían interesar a los fabricantes de fármacos, excipientes o
productos farmacéuticos. No obstante, no se han encontrado datos toxicológicos adecuados para fundamentar una EDP.
Tabla 4. Otros Disolventes Residuales
(Para los cuales no se han encontrado datos toxicológicos adecuados)
Ácido tricloroacético Éter isopropílico
Ácido trifluoroacético Éter de petróleo
1, 1-Dietoxipropano lsooctano
1, 1-Dimetoximetano Metil isopropil cetona
2,2-Dimetoxipropano Metiltetrahidrofurano
272 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 37

IDENTIFICACIÓN, CONTROL Y CUANTIFICACIÓN DE DISOLVENTES RESIDUALES

Siempre que sea posible, la sustancia en análisis debe disolverse para liberar el disolvente residual. Dado que la USP se ocupa
de productos farmacéuticos, así como de ingredientes activos y excipientes, a veces puede ser aceptable que algunos de los
componentes de la formulación no se disuelvan por completo. En tales casos, puede ser necesario reducir el producto farma-
céutico primero a polvo fino, de manera que se pueda liberar cualquier disolvente residual que pudiera estar presente. Esta
operación debe realizarse lo más rápido posible para evitar la pérdida de disolventes volátiles durante el procedimiento.
[NOTA-El agua exenta de sustancias orgánicas que se especifica en los siguientes procedimientos no produce picos que inter-
fieran significativamente cuando se lleva a cabo una cromatografía.]

Disolventes Residuales de Clase 1 y Clase 2

Los siguientes procedimientos son útiles para identificar y cuantificar disolventes residuales cuando no esté disponible la in-
formación acerca de los disolventes residuales que pudieran estar presentes en el material. Cuando la información acerca de la
presencia de disolventes residuales específicos está disponible, sólo es necesario llevar a cabo el Procedimiento C para cuantificar
la cantidad de disolventes residuales presentes. La Figura 7 muestra un diagrama de flujo para la aplicación de las pruebas de
límite de disolventes residuales.

Preparación de las
soluciones <le prueba:

¿Los picos SÍ
correspondiente::. a los disolventes >-------tl!ICUMP!.F CON LA l'RUFAA, NO
rc~i<luaks tienen áreas menores que U'.QUJrJU: J\CCIÓN l'OSTER!O
las de Jos estándares'?

¿!,os picos SÍ
correspondientes a los disolventes > - - - - - - - + - l l CUMPLE CON LA PRUEBA, NO
residuales tienen áreas menores que R~:QLllLRF ACCIÓN POSTERIOR
las de los estándares'.)

NO
PROCEDIMIENTO C

Calcular la cantidad
del disolvente residual

~,t1quetar mdican o
la canlidad del disolvente
residual encontrndo

SI

CUMPU. CON Li\ PR!H BA, r\O

>----..0<UJUJ! RI ACCIOr\ l'()Sll-RlO

Fig. 1. Diagrama relativo a la identificación de disolventes residuales y la aplicación de pruebas de límite.

 USP 37 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 273

ARTÍCULOS SOLUBLES EN AGUA

Procedimiento A-
Solución Madre del Estándar de Clase 7-[NOTA-AI transferir las soluciones, colocar la punta de la pipeta justo por debajo de
la superficie del líquido y mezclar.] Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz volu-
métrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 9 mL de dimetil sulfóxido, diluir con agua a volu-
men y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado
aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 1 O mL de esta solución a un matraz volumé-
trico de 100 mL, al que previamente se le han agregado aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y mez-
clar.
Solución Estándar de Clase 1-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 7 a un vial para muestreo de fase
gaseosa apropiado que contenga 5,0 mL de agua (colocar la punta de la pipeta justo por debajo de la superficie del líquido
para dispensar), tapar y mezclar.
Soluciones Madre del Estándar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre A del Estándar de Clase 2. Trans-
ferir 1,0 mL de ER Mezcla B-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 1 00 mL, diluir con agua a
volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre B del Estándar de Clase 2.
Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre A del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Estándar Mezcla B de Clase 2-Transferir 5,0 mL de Solución Madre B del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 250 mg del artículo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumétrico de 25 mL, disolver y diluir con agua a volumen, y mezclar.
Solución de Prueba-Transferir 5,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agre-
gar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución de Aptitud del Sistema de Clase /-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 7 a un vial para mues-
treo de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de la Solución Madre de Prueba, tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la
llama y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 1,8 µm o una columna
macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :5. [NOTA-La relación de partición
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40º durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 1 Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas
del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica
en Procedimiento: la relación señal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 7 no es menor de 5; la relación
señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets
de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproxi-
madamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 7, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase
2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas dé los picos principales. Si la respuesta de cualquier
pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución de Prueba es mayor o igual a la del pico correspondiente en la
Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, o si la respuesta del pico de 1, 1, 1-
tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar
de Clase 7, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no sucediera, el artículo cumple con los
requisitos de esta prueba.
Tabla 5. Parámetros Operativos para el Inyector de Fase Gaseosa
Sets de Parámetros Operativos
para el Inyector de Fase Gaseosa
1 2 3
Temperatura de equilibrio(°) 80 105 80
Tiempo de equilibrio (min) 60 45 45
Temperatura de línea de transferencia(º) (si corresponde) 85 110 105
Temperatura de la jeringa(°) (si corresponde) 80-90 105-115 80-90
Gas transportador: nitrógeno o helio a una presión adecuada
* O seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento, siempre y cuando se cumplan los criterios del método. Se permite inyectar una cantidad menor
a la citada siempre y cuando se logre la sensibilidad adecuada.
 •
274 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 37

Tabla 5. Parámetros Operativos para el Inyector de Fase Gaseosa (Continuación)

Sets de Parámetros Operativos
1 para el Inyector de Fase Gaseosa
1 2 3
Tiempo de presurización (s) (si corresponde) >60 ;>60 260
Volumen de inyección (ml)* 1 1 1
* O seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento, siempre y cuando se cumplan los criterios del método. Se permite inyectar una cantidad menor
a la citada siempre y cuando se logre la sensibilidad adecuada.

Procedimiento B-
Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de Clase 1, Soluciones Madre del Estándar de Clase 2, Solución
Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución de
Aptitud del Sistema de Clase 7-Preparar según se indica en Procedimiento A.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la
llama y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl 6 de 0,25 µm o una columna
macrocapilar de 0,5 3 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G 16 de 0,25 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :5. [NOTA-La relación de partición
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 50º durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 6º por minuto hasta 165º y mantenerla a 165º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del
inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 1 y la Solución
de Aptitud del Sistema de Clase 1, y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido del ben-
ceno en la Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del
Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cis-dicloroeteno en la Solución Estándar Mezcla A de
Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NoTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets
de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa, descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (apro-
ximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 1, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Cla-
se 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si las respuestas de los
picos en la Solución de Prueba de los picos identificados en el Procedimiento A son iguales o mayores que los picos correspon-
dientes en la Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el
Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento C-
Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de Clase 1, Solución Madre A del Estándar de Clase 2, Solución
Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Prepa-
rar según se indica en Procedimiento A.
Solución Madre del Estándar- [NOTA-Preparar por separado una Solución Madre del Estándar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para los disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la pri-
mera dilución según se indica para la primera dilución en Solución Madre del Estándar de Clase 1, Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente resi-
dual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentración final de 1/20 del valor indicado
en la Tabla 7 ó 2 (en Límite de Concentración). ·
Solución Estándar-Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 5,0 mL de
agua, tapar y mezclar.
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada-[NOTA-Preparar por separado una Solución de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL de
Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 1,0 mL de Solución Madre del Estándar,
tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-[NOTA-Si se verifica que los resultados de la cromatografía del Procedi-
miento A son inferiores a los del Procedimiento 8, se puede sustituir el Sistema Cromatográfico del Procedimiento B.] Equipar un
cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubier-
ta con una capa de fase G43 de 1,8 ~tm o una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43
de 3,0 ~im. El gas transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de
partición de 1 :5. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura
de la columna a 40º durante 20 minutos, luego elevarla a una velocidad de 1 Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º
durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cro-
matógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2,
y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Es-
tándar de Clase 7 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es
 USP 37 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 275

menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor
de 1,0.
Procedimiento-[NOTA~-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de tramfPrencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets
de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de fase gaseosa (aproxi-
madamente 1,0 mL) de Solución Estándar, Solución de Prueba y Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, regis-
trar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente resi-
dual encontrado en el artículo en análisis, por la fórmula:

en donde Ces la concentración, en µg por mL, del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución Madre del Están-
dar; W es el peso, en g, del artículo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Prueba; y ru y r5 r son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solución de Prueba y la Solución de Prueba con una Cantidad Conoci-
da Agregada, respectivamente.

ARTÍCULOS INSOLUBLES EN AGUA

Procedimiento A-[NOTA-Se puede usar dimetil sulfóxido como disolvente alternativo en lugar de dimetilformamida.]
Solución Madre del Estándar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un ma-
traz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previa-
mente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar (re-
servar una porción de esta solución para la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1). Transferir 1,0 mL de esta solución a un
matraz volumétrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
Solución Estándar de Clase 1-T ransferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 1 a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Soluciones Madre del Estándar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre A del Estándar de Clase 2. Transferir 0,5 mL de ER Mezcla B-
Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
Ésta es la Solución Madre B del Estándar de Clase 2.
Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre A del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Estándar Mezcla B de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre B del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 500 mg del artículo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumétrico de 1 O mL, disolver y diluir con dimetilformamida a volumen, y mezclar.
Solución de Prueba-Transferir 1,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Mezclar 5 mL de la Solución Madre de Prueba con 0,5 mL de la dilución interme-
dia reservada de la Solución Madre del Estándar de Clase 1. Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la lla-
ma y una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 µm. El gas transportador es
helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :3. [NOTA-La relación de parti-
ción puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40º durante 20 minutos, lue-
go aumentarla a una velocidad de 1 Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º durante 20 minutos. Mantener las tempera-
turas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica
en Procedimiento: la relación señal-ruido de 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación
señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NoTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1 O psi) volúme-
nes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 1, Solución Estándar Mezcla A de Clase
2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos
principales. Si la respuesta de cualquier pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano, en la Solución de Prueba es mayor o igual
al pico correspondiente en la Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, o si
la respuesta del pico de 1, 1, 1-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-triclo-
 276 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 37

roetano en la Solución Estándar de Clase 7, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no suce-
diera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento B-
Solución Madre del Estándar de Clase 7, Solución Estándar de Clase 7, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7, Soluciones
Madre del Estándar de Clase 2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2, Solución Madre de
Prueba y Solución de Prueba-Preparar según se indica en Procedimiento A.
Sistema Cromatográfico-Proceder según se indica en Procedimiento Ben Artículos Solubles en Agua con una relación de parti-
ción de 1: 3. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.]
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros
operativos para inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1 O psi) volúmenes
iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 ml) de Solución Estándar de Clase 7, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2,
Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos prin-
cipales. Si la respuesta de los picos identificados en la Solución de Prueba en el Procedimiento A son mayores o iguales a los picos
correspondientes en la Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a
cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento ( -
Solución Madre del Estándar de Clase 7, Solución Estándar de Clase 7, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7, Solución Madre
A del Estándar de Clase 2 y Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Proceder según se indica en Procedimiento A.
Solución Madre del Estándar- [NOTA-Preparar por separado una Solución Madre del Estándar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la primera
dilución según se indica para la primera dilución en Solución Madre del Estándar de Clase 7 en el Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente resi-
dual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentración final de 1 /20 del valor especifica-
do en la Tabla 7 o Tabla 2 (en Límite de Concentración).
Solución Estándar-Transferir 1,0 ml de la Solución Madre del Estándar a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado,
que contenga 5,0 ml de agua, tapar y mezclar.
Solución Madre de Prueba-Proceder según se indica en Procedimiento A.
Solución de Prueba-Transferir 1,0 ml de la Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 ml de agua, tapar y mezclar.
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada- [NOTA-Preparar por separado una Solución de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 1,0 ml de
Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1 ml de Solución Madre del Estándar y
4,0 ml de agua, tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico-Proceder según se indica en Procedimiento C en Artículos Solubles en Agua.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1 O psi) volúme-
nes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 ml) de Solución Estándar, Solución de Prueba y Solución de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad,
en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el artículo en análisis, por la fórmula:

en donde Ces la concentración, en ~tg por ml, del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución Madre del Están-
dar; W es el peso, en g, del artículo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Prueba; y ru y r5 r son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solución de Prueba y la Solución de Prueba con una Cantidad Conoci-
da Agregada, respectivamente.

Disolventes Residuales de Clase 3

Si están presentes los disolventes de Clase 3, el nivel de disolventes residuales se puede determinar según se indica en Pérdi-
da por Secado (731) cuando la monografía del artículo en análisis incluye un procedimiento de pérdida por secado que especi-
fique un límite superior de no más de 0,5% (de acuerdo con la Opción 7 en este capitulo general), o se puede realizar una
determinación específica del disolvente. Si la monografía del artículo en análisis no incluye un procedimiento de pérdida por
secado o si el límite de disolvente de Clase 3 en una monografía individual es superior a 50 mg por día (lo que corresponde a
5000 ppm ó 0,5% en la Opción 7), el disolvente residual de Clase 3 individual o los disolventes presentes en el artículo en aná-
lisis se deben identificar y cuantificar, aplicando los procedimientos descritos anteriormente, con las debidas modificaciones a
las soluciones estándar, siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropia-
do. En estos procedimientos se deben usar Estándares de Referencia USP, siempre que estén disponibles.
•

USP 37 Pruebas Químicos/ (467) Disolventes Residuales 277

GLOSARIO

Carcinógenos genotóxicos: Son carcinógenos que producen cáncer al afectar los genes o cromosomas.
Exposición diaria permitida (EDP): La máxima ingesta diaria admisible de un disolvente residual en productos farmacéuticos.
Factor de modificación: Un factor determinado según el criterio profesional de un toxicólogo y que se aplica a datos devalo-
raciones biológicas de manera que los datos se puedan relacionar con seres humanos de manera segura.
lngesta diaria admisible (IDA): La máxima ingesta diaria admisible de sustancias químicas tóxicas. Este término es empleado
por la Organización Mundial de la Salud (OMS).
lngesta diaria tolerable (IDT): La exposición diaria tolerable a sustancias químicas tóxicas. Este término es empleado por el
Programa Internacional para la Seguridad de las Sustancias Químicas (IPCS).
Neurotoxicidad: La capacidad de una sustancia de ocasionar efectos adversos en el sistema nervioso.
Nivel mínimo de efecto observable (LOEL, por sus siglas en inglés): La dosis mínima de una sustancia en un estudio o grupo de
estudios que produce un incremento biológicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los
seres humanos o animales expuestos a esta sustancia.
Nivel sin efecto observable (NOEL, por sus siglas en inglés): La dosis máxima de una sustancia que no produce un incremento
biológicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos o animales expuestos a
esta sustancia.
Sustancias seriamente sospechosas de carcinogenidad para los seres humanos: Una sustancia para la cual no hay evidencia epi-
demiológica de carcinogénesis pero de la que existen datos de genotoxicidad positivos y clara evidencia de carcinogénesis en
roedores.
Teratogenicidad: La presencia de malformaciones estructurales en un feto en desarrollo ocasionadas cuando se administra
una sustancia durante el embarazo.
Toxicidad reversible: La presencia de efectos nocivos ocasionados por una sustancia que desaparecen cuando termina la ex-
posición.

LISTA DEL APÉNDICE 1.

Ver la tabla Apéndice 7. Lista de Disolventes Residuales Incluidos en Este Capítulo General.
APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL
DI solvente Otros nombres Estructura Clase
Acetato de butilo Éster butílico del ácido acético CH,COO(CH,),CH, Clase 3
Acetato de etilo Éster etílico del ácido acético CH,COOCH,CH, Clase 3
Acetato de isobutilo Éster isobutílico del ácido acético CH,COOCH,CH(CH,), Clase 3
Éster isopropílico del ácido
Acetato de isopropilo acético CH,COOCH(CH,) 7 Clase 3
Acetato de metilo Éster metílico del ácido acético CH,COOCH, Clase 3
Acetato de propilo Éster propílico del ácido acético CH,COOCH,CH,CH, Clase 3
2-Propanona
Acetona Propan-2-ona CH,COCH, Clase 3
Acetonitrilo CH,CN Clase 2
Ácido acético Ácido etanoico CH,COOH Clase 3
Ácido fórmico HCOOH Clase 3

Anisal Metoxibenceno uºº"'

"'
/;
Clase 3

Benceno Benzol
Alcohol n-butílico
o Clase 1

1-Butanol Butan-1-ol CH,(CH,),OH Clase 3

Alcohol sec-butílico
2-Butanol Butan-2-ol CH,CH 7 CH(OH)CH, Clase 3

Ciclohexano Hexametileno o Clase 2

Cloro benceno
Cloroformo Triclorometano
uº'
CHCI,
Clase 2
Clase 2
Cloruro de metileno Diclorometano CH,CI, Clase 2
• Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.
278 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 37

APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL (Continuación)

Disolvente Otros nombres Estructura Clase
CH

lsopropilbenceno
Cu meno (1 -Metiletil)benceno Clase 2
sim-Dicloroetano
Dicloruro de etileno
1,2-Dicloroetano Cloruro de etileno CH 7 CICH 7 CI Clase 1
1, 1-Dicloroetileno
1, 1-Dicloroeteno Cloruro de vinilideno H,C=CCI, Clase 1
1,2-Dicloroetileno
1,2-Dicloroeteno Dicloruro de acetileno CIHC=CHCI Clase 2
N,N-Dimetilacetamida DMA CH 3CON(CH 3) 2 Clase 2
------ ----- --- - -- -
N,N-Dimetilformamida DMF HCON(CH 3 ) 7 Clase 2
Metilsulfinilmetano
Metil sulfóxido
Dimetil sulfóxido DMSO (CH 3 ) 7 SO Clase 3
Éter dimetílico de etilenglicol
Monoglima
1,2-Dimetoxietano Dimetil celosolve H 3 COCH 7 CH 7 0CH 3 Clase 2

1,4-Dioxano
p-Dioxano
[1,4]Dioxano
(°)o Clase 2
Etanol Alcohol etílico CH 3 CH 7 0H Clase 3
Éter terc-butilmetílico 2-Metoxi-2-metilpropano (CH 3 ) 3 COCH 3 Clase 3
Éter d ietíl ico
Etoxietano
Éter etílico 1, 1 '-0xibisetano CH ,CH 7 0CH ,CH 3 Clase 3
1,2-Dihidroxietano
Etilenglicol 1,2-Etanodiol HOCH,CH,OH Clase 2
2-Etoxietanol Celosolve CH,CH,OCH,CH,OH Clase 2
Formamida Meta na mida HCONH, Clase 2
Formiato de etilo Éster etílico del ácido fórmico HCOOCH,CH, Clase 3
Heptano n-Heptano CH,(CH,),CH, Clase 3
Hexano n-Hexano CH 3 (CH 7 ) 4 CH 3 Clase 2
Metano! Alcohol metílico CHpH Clase 2
Alcohol isoamílico
Alcohol isopentílico
3-Metil-1-butanol 3-Metilbutan-1-ol (CH 3 ),CHCH,CH,OH Clase 3
2-Hexanona
Metilbutilcetona Hexan-2-ona CH 3 (CH 7 ) 3 COCH 3 Clase 2

('(º""
Metilciclohexano Ciclohexilmetano ~ Clase 2
2-Butanona
MEK
Metiletilcetona Butan-2-ona CH 3 CH 7 COCH 3 Clase 3
4-Metilpentan-2-ona
4-Metil-2-pentanona
Metil isobutil cetona MIBK CH 3 COCH 7 CH(CH 3 ) 7 Clase 3

1-Metilpirrolidin-2-ona
N-Metilpirrolidona 1-Metil-2-pirrolidinona Clase 2
Alcohol isobutílico
2-Metil-1-propanol 2-Metilpropan-1-ol (CH 3 ) 7 CHCH 7 0H Clase 3
2-Metoxietanol Metil celosolve CH,OCH 7 CH 7 0H Clase 2
Nitrometano CH,N0 7 Clase 2
Pentano n-Pentano CH 3 (CH 7 ) 3 CH 3 Clase 3
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno_
 USP 37 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 279

APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL (Continuación)

Disolvente Otros nombres Estructura Clase
Alcohol amílico
Pentan-1-ol
1-Pentanol Alcohol pentílico CH,(CH,),CH,OH Clase 3
_N

11 1
Piridina '-....-:/ Clase 2
Propan-1-ol
1-Propanol Alcohol propílico CH,CH,CH,OH Clase 3
Propan-2-ol
2-Propanol Alcohol isopropílico (CH,),CHOH Clase 3
\v;°
1, 1-Dióxido de /s')
Sulfolano tetrahidrotiofeno LJ Clase 2
Tetracloruro de carbono Tetraclorometano CCl 4 Clase 1

Tetrahidrofurano
Óxido de tetrametileno
Oxaciclopentano ó Clase 2

Tetralina 1,2,3,4-Tetrahidronaftaleno co Clase 2

Tolueno Metilbenceno
O'º"' Clase 2
1, 1, 1-Tricloroetano Metilcloroformo CH,CCI, Clase 1
Tricloroetileno 1, 1,2-Tricloroeteno HCIC=CCI, Clase 2
CH,

Dimetilbenceno
Xi le no* Xilol
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.
ºº"' Clase 2

APÉNDICE 2. REFERENCIA ADICIONAL

A2.1. Reglamentación Ambiental de Disolventes Orgánicos Volátiles

Varios de los disolventes residuales empleados con frecuencia en la elaboración de productos farmacéuticos figuran como
productos químicos tóxicos en las monografías de los Criterios Sanitarios Ambientales (EHC, por sus siglas en inglés) y en el
Sistema Integrado de Información de Riesgo (IRIS, por sus siglas en inglés). Entre los objetivos de grupos tales como el Progra-
ma Internacional para la Seguridad de las Sustancias Químicas (IPCS, por sus siglas en inglés), la Agencia de Protección Am-
biental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en inglés) y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) se incluye la determinación de niveles de exposición admisibles. Su propósito es mante-
ner la integridad medioambiental y proteger la salud de los seres humanos frente a los posibles efectos nocivos de las sustan-
cias químicas ocasionados por una exposición medioambiental a largo plazo. Los procedimientos relativos a la estimación de
los límites de exposición máxima segura están basados generalmente en estudios a largo plazo. Cuando no hay disponibles
datos de estudios a largo plazo, se pueden emplear datos de estudios a plazos más cortos modificando el método, por ejemplo
empleando factores de seguridad mayores. El enfoque descrito en esos documentos se refiere en primer lugar a la exposición a
largo plazo o durante toda la vida de la población general al medio ambiente (es decir, el aire ambiental, la comida, el agua
potable y otros medios).

A2.2. Disolventes Residuales en Productos Farmacéuticos

Los límites de exposición que figuran en este capítulo general están establecidos con respecto a metodologías y datos de
toxicidad descritos en monografías del EHC e IRIS. Sin embargo, se deben tener en cuenta al establecer los límites de exposi-
ción las siguientes suposiciones específicas sobre los disolventes residuales que se emplearán en la síntesis y formulación de
productos farmacéuticos.
1. Los pacientes (no la población en general) emplean los productos farmacéuticos para tratar sus enfermedades o como
profilaxis para prevenir infecciones o enfermedades.
2. La suposición de una exposición del paciente durante toda su vida no es necesaria para la mayoría de los productos far-
macéuticos, pero puede ser adecuada como hipótesis de trabajo para reducir el riesgo para la salud de los seres humanos.
3. Los disolventes residuales son componentes inevitables en la producción de productos farmacéuticos y a menudo son par-
te de los productos medicinales.
4. No se debe exceder el nivel recomendado de disolventes residuales salvo en circunstancias excepcionales.
 280 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 37

5. Los datos de los estudios toxicológicos que se emplean para determinar los niveles admisibles de disolventes residuales
deben provenir de protocolos apropiados, como por ejemplo los que describen la Organización para la Cooperación y el
Desarrollo Económico (OECD, por sus siglas en inglés), la EPA y el Libro Rojo de la FDA.

APÉNDICE 3. PROCEDIMIENTOS PARA ESTABLECER LÍMITES DE EXPOSICIÓN

El método Gaylor-Kodell para la evaluación del riesgo (Gaylor, D. W. y Kodell, R. L., Linear lnterpolation Algorithm for Low
Dose Assessment of Toxic Substance. journal of Environmental Pathology and Toxicology, 4:305, 1980) es apropiado para los
disolventes carcinogénicos de Clase 1. Solamente cuando se dispone de datos fiables sobre carcinogenicidad puede hacerse
una extrapolación mediante modelos matemáticos para fijar límites de exposición. Los límites de exposición para los disolven-
tes residuales de Clase 1 podrían determinarse empleando un factor de seguridad mayor (es decir, de 1O000 a 100 000) con
respecto al nivel sin efecto observable (NOEL). La detección y la cuantificación de estos disolventes residuales se efectúan me-
diante técnicas analíticas de última generación.
Los niveles de exposición admisibles que figuran en este capítulo general para los disolventes residuales de Clase 2 se esta-
blecieron mediante el cálculo de los valores de EDP conforme a los procedimientos para fijar límites de exposición en produc-
tos farmacéuticos (página 5748 del PF 15(6) [nov.-dic. 1989]) y el método adoptado por la IPCS para la Evaluación del Riesgo
para la Salud Humana de los Productos Químicos [Assessing Human Health Risk of Chemicals (Environmental Health Criterio
770, OMS, 1994)]. Estos procedimientos son similares a los que emplea la EPA de los Estados Unidos (IRIS), la FDA de los Esta-
dos Unidos (Libro Rojo) y otros organismos. El método se describe en este documento para facilitar la comprensión del origen
de los valores de EDP. No es necesario realizar estos cálculos para emplear los valores de EDP que figuran en la Tabla 2 de este
documento.
La EDP proviene del nivel sin efecto observable (NOEL) o del nivel mínimo de efecto observable (LOEL), en los estudios más
importantes en animales, de la siguiente manera:
EDP = (NOEL x Ajuste por Peso)/(Fl x F2 x F3 x F4 x F5) (1)
La EDP se calcula preferentemente a partir de un NOEL. Si no se obtiene un NOEL, se puede emplear el LOEL. Los factores de
modificación que se proponen en este documento para relacionar datos con seres humanos son del mismo tipo que los "facto-
res de incertidumbre" empleados en los Criterios Sanitarios Ambientales (Environmental Health Criterio 770, OMS, Ginebra,
1994) y los "factores de modificación" o los "factores de seguridad" en el Pharmacopeial Forum. La suposición de una exposi-
ción sistémica del 100% se emplea en todos los cálculos sin tener en cuenta la vía de administración.
Los factores de modificación son los siguientes:

Fl = Un factor que representa la extrapolación entre especies

Fl = 2 para extrapolación de perros a seres humanos
Fl = 2,5 para extrapolación de conejos a seres humanos
Fl = 3 para extrapolación de monos a seres humanos
Fl = 5 para extrapolación de ratas a seres humanos
Fl = 1 O para extrapolación de otros animales a seres humanos
Fl = 12 para extrapolación de ratones a seres humanos

El factor Fl tiene en cuenta la relación comparativa entre el área de superficie y el peso corporal de las especies involucradas y
de los seres humanos. El área de superficie (5) se calcula como:
S = kMº· 67 (2)
en donde M = peso corporal; y la constante k se ha tomado con valor 1 O. Los pesos corporales empleados en la ecuación
figuran a continuación en la Tabla A3. 7.

F2 = Un factor de 1 O representa la variabilidad entre individuos. Por lo general, se proporciona un factor de 1 O para todos los disolventes orgáni-
cos y 1 O se usa en todo este capítulo general.

F3 = Un factor de variabilidad que representa los estudios de toxicidad por exposición a corto plazo.
F3 = 1 para estudios con una duración de al menos la mitad del ciclo vital (1 año para roedores o conejos; 7 años para gatos, perros
y monos).
F3 = 1 para estudios reproductivos que cubren el periodo completo de organogénesis.
F3 = 2 para un estudio de 6 meses en roedores o de 3,5 años en no roedores.
F3 = 5 para un estudio de 3 meses en roedores o de 2 años en no roedores.
F3 = 1 O para estudios de más corta duración.

En todos los casos, se ha empleado el factor más alto para los estudios con una duración intermedia (p.ej., un factor de 2 para
un estudio de 9 meses en roedores).
 USP 37 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 281

F4 = Un factor que se puede aplicar en casos de toxicidad grave, p.ej., carcinogenicidad no genotóxica, neurotoxicidad o teratogenicidad. En
estudios de toxicidad reproductiva, se emplean los siguientes factores:
F4 = 1 para toxicidad fetal asociada a toxicidad materna
F4 = 5 para toxicidad fetal sin toxicidad materna
F4 = 5 para un efecto teratogéníco con toxicidad materna
F4 = 1 O para un efecto teratogéníco sin toxicidad materna

F5 = Un factor variable que se puede aplicar sí no se ha establecido un nivel sin efecto.

Cuando sólo está disponible un LOEL, se puede emplear un factor de hasta 1 O dependiendo de la gravedad de la toxicidad.
Para el ajuste por peso, se supone un peso corporal arbitrario para humanos adultos para ambos sexos de 50 kilogramos (kg).
Este peso relativamente bajo proporciona un factor de seguridad adicional con respecto a los pesos estándar de 60 ó 70 kg
que se usan a menudo en este tipo de cálculos. Se reconoce que algunos pacientes adultos pesan menos de 50 kg; se conside-
ra que estos pacientes se incluyen mediante los factores de seguridad empleados para determinar una EDP. Si el disolvente
estaba presente en una formulación específicamente destinada para uso pediátrico, sería apropiado realizar un ajuste para un
peso corporal inferior.
Como ejemplo de la aplicación de esta ecuación, se considera un estudio de toxicidad de acetonitrilo en ratones que está
resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, Nº 1, Suplemento, abril 1997, página S24. Se calcula que el NOEL es de 50,7 mg kg- 1 día- 1 •
La EDP para el acetonitrilo en este estudio se calcula de la siguiente manera:
EDP = (50,7 mg kg- 1 día- 1 x 50 kg)/(12 x 1 O x 5 x 1 x 1) = 4,22 mg día 1

En este ejemplo,

Fl = 12 representa la extrapolación de ratones a seres humanos

F2 = 1 O representa las diferencias entre seres humanos individuales
F3 = 5 porque la duración del estudio fue de sólo 13 semanas
F4 = 1 porque no se encontró toxicidad grave
F5 = 1 porque se determinó el nivel sin efecto

A3.1. Valores Empleados en los Cálculos en este Documento

Peso corporal de ratas 425 g
Peso corporal de ratas preñadas 330 g
Peso corporal de ratones 28 g
Peso corporal de ratonas preñadas 30 g
Peso corporal de cobayos 500 g
Peso corporal de monos Rhesus 2,5 kg
Peso corporal de conejas (preñadas o no) 4 kg
Peso corporal de perros Beagle 11,5 kg
Volumen respiratorio de ratas 290 L/día
Volumen respiratorio de ratones 43 L/día
Volumen respiratorio de conejos 1440 L/día
Volumen respiratorio de cobayos 430 L/día
Volumen respiratorio de humanos 28 800 L/día
Volumen respiratorio de perros 9000 L/día
Volumen respiratorio de monos 1150 L/día
Consumo de agua de ratones 5 ml/día
Consumo de agua de ratas 30 ml/día
Consumo de alimentos de ratas 30 g/día

Se emplea la ecuación de gases ideales, PV = nRT, para convertir las concentraciones de gases empleados en estudios de
inhalación de unidades en ppm a unidades en mg/L o mg/m 3 • Se propone como ejemplo un estudio de toxicidad reproducti-
va en ratas por inhalación de tetracloruro de carbono (peso molecular 153,84) resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, Nº 1, Suple-
mento, abril 1997, página S9.
n p ~go x 1 O 6 atm x 153 840 mg mol 1
= 46.15m_~= 1 _89 mg/L
V RT 0.082 L a mK 1 mol 1 X 298K 24.45 L

La relación 1000 L = 1 m 3 se emplea para convertir los valores a mg/m 3•

 282 (471 >Combustión en Matraz con Oxígeno/ Pruebas Químicas USP 37

(471) COMBUSTIÓN EN MATRAZ CON OXÍGENO

El procedimiento de combustión en matraz con oxígeno constituye el paso preparatorio en la determinación de bromo, clo-
ro, yodo, selenio y azufre en algunos artículos farmacopeicos. La combustión del material en análisis (generalmente orgánico)
produce compuestos inorgánicos hidrosolubles, los cuales se analizan para determinar los elementos específicos, según se indi-
ca en la monografía individual o en el capítulo general.
La advertencia que figura en el Procedimiento sólo indica las precauciones de seguridad mínimas y subraya la necesidad de
proceder con extremo cuidado en todas las etapas.
Aparato-El aparato 1 consta de un matraz Erlenmeyer de paredes gruesas, con boca de bordes elevados o en forma de
copa, de 500 mL de capacidad (salvo que se indique un matraz de mayor capacidad), equipado con un tapón de vidrio esme-
rilado al que se ha soldado un dispositivo para colocar la muestra de prueba, formado por un alambre de platino grueso y un
pieza de malla de platino soldada de aproximadamente 1,5 x 2 cm.

Punto de
ignición

Tapón esmerilado estandardizado

Aparato para la Combustión en Matraz con Oxígeno

Procedimiento-[Precaución-Usar lentes de seguridad y colocar una protección de seguridad adecuada entre el aparato y us-
ted. Tomar las precauciones necesarias para asegurar que el matraz esté perfectamente limpio y no contenga ni siquiera trazas de
disolventes orgánicos.] Si se trata de un sólido, pesar la sustancia colocándola sobre un trozo de papel de filtro exento de halu-
ros de aproximadamente 4 cm cuadrados y plegar el papel de forma tal que el sólido quede envuelto por aquel. Si se trata de
sustancias líquidas, pesarlas en cápsulas taradas; las cápsulas de policarbonatoi se utilizan para líquidos cuyos volúmenes no
excedan de 200 µL, mientras que las cápsulas de gelatina resultan adecuadas para volúmenes mayores. [NOTA-Es posible que
las cápsulas de gelatina contengan cantidades significativas de azufre o haluros combinados. Si se utiliza este tipo de cápsulas,
efectuar una determinación con un blanco y realizar las correcciones necesarias.] Colocar la muestra y una tira de papel de
filtro, a modo de mecha, en el soporte de malla de platino. Colocar en el matraz el líquido absorbente especificado en la mo-
nografía individual o en el capítulo general, humedecer la junta del tapón con agua y desplazar el aire del matraz con una
corriente rápida de oxígeno, agitando el líquido por rotación moderada para favorecer la absorción de oxígeno. [NOTA-La
saturación del líquido con oxígeno es clave para el éxito del procedimiento de combustión.] Encender la tira de papel de filtro
por medios adecuados. Si se enciende la tira fuera del matraz, introducir inmediatamente el soporte de la muestra en el ma-
traz, invertir el matraz para que la solución de absorción selle el tapón y sostener el tapón en su lugar con firmeza. Se puede
omitir la inversión del matraz si se enciende en un sistema cerrado. Una vez finalizada la combustión, agitar el matraz vigorosa-
mente y dejarlo en reposo durante no menos de 1O minutos agitando intermitentemente. Luego proceder según se indica en
la monografía individual o en el capítulo general.

(481) VALORACIÓN DE RIBOFLAVINA

El siguiente procedimiento es apropiado para las preparaciones donde la riboflavina es un elemento constitutivo de una
mezcla de varios ingredientes. Al emplearlo, se debe mantener el pH de las soluciones por debajo de 7,0 y proteger las solucio-
nes de la luz solar directa en todo momento.
Estándares de Referencia USP (11 )-fR Ribof/avina USP.
Solución Madre del Estándar de Riboflavina-A 50,0 mg de ER Riboflavina USP, previamente secados y protegidos de la
luz en un desecador sobre pentóxido de fósforo, agregar aproximadamente 300 mL de ácido acético 0,02 N y calentar la
mezcla en un baño de vapor agitando frecuentemente hasta que la riboflavina se haya disuelto. Luego enfriar, agregar ácido
acético 0,02 N para obtener 500 mL y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.

1 Thomas Scientific, localizado en 99 High Hill Road, Swedesboro, NJ 08085 provee un aparato [Números de Catálogo 6513-C20 (de 500 ml de capacidad) y
651 3-C30 (de 1000 ml de capacidad)] y cápsulas [Número de Catálogo 6513-84 (1000 cápsulas)] adecuados.
 USP 37 Pruebas Químicas/ <501) Sales de Bases Orgánicas Nitrogenadas 283

Diluir una porción medida con exactitud de esta solución, usando ácido acético 0,02 N, hasta una concentración de 10,0 ~tg
de ER Riboflavina USP seca por mL para obtener la Solución Madre del Estándar de Ribof/avina. Almacenar bajo tolueno en un
refrigerador.
Preparación Estándar-Diluir a volumen con agua 10,0 mL de la Solución Madre del Estándar de Riboflavina en un matraz
volumétrico de 100 mL y mezclar. Cada mL representa 1,0 ~tg de ER Riboflavina USP. Preparar una Preparación Estándar nueva
para cada valoración.
Preparación de Valoración-Colocar una cantidad del material a valorar en un matraz de tamaño adecuado y agregar un
volumen de ácido clorhídrico O, 1 N igual en mL a no menos de 1O veces el peso seco del material en g, aunque la solución
resultante no debe contener más de 100 µg de riboflavina por ml. Si el material no es fácilmente soluble, pulverizarlo para que
pueda dispersarse uniformemente en el líquido. Luego agitar vigorosamente y lavar las paredes del matraz con ácido clorhídri-
co O, 1 N.
Calentar la mezcla en un autoclave entre 121 ºy 123º durante 30 minutos y enfriar. Si el material se aglutina, agitar la mezc-
la hasta que las partículas se dispersen uniformemente. Ajustar la mezcla, agitando vigorosamente, a un pH de 6,0 a 6,5 con
solución de hidróxido de sodio* y, de inmediato, agregar solución de ácido clorhídrico* hasta que no haya más precipitación
(por lo general a un pH de aproximadamente 4,5, el punto isoeléctrico de muchas de las proteínas presentes). Diluir la mezcla
con agua para obtener un volumen medido que contenga aproximadamente O, 11 µg de riboflavina en cada mL y filtrar a tra-
vés de papel que se sepa que no adsorbe riboflavina. A una alícuota del filtrado, agregar, agitando vigorosamente, una solu-
ción de hidróxido de sodio* para producir un pH de 6,6 a 6,8, diluir la solución con agua para obtener un volumen final medi-
do que contenga aproximadamente O, 1 µg de riboflavina en cada mL y, si la solución se enturbia, filtrar nuevamente.
Procedimiento-Agregar a cada uno de cuatro o más tubos (o recipientes de reacción) 10,0 mL de la Preparación de Valo-
ración. Agregar a cada uno de dos o más de estos tubos 1,0 mL de la Preparación Estándar y mezclar y luego agregar a cada
uno de los dos o más tubos restantes 1,0 mL de agua y mezclar. Agregar a cada tubo 1,0 mL de ácido acético glacial y mez-
clar; luego agregar, mezclando, 0,50 mL de solución de permanganato de potasio (1 en 25) y dejar en reposo durante 2 minu-
tos. Agregar a cada tubo, mezclando, 0,50 mL de solución de peróxido de hidrógeno, con lo cual el color del permanganato
desaparecerá en 1O segundos. Agitar vigorosamente los tubos hasta expulsar todo el exceso de oxígeno. Cuando haya cesado
la producción de espuma, eliminar las burbujas de gas que queden en las paredes de los tubos por inclinación de los tubos
para que la solución fluya lentamente de un extremo a otro.
En un fluorofotómetro adecuado que tenga un filtro de entrada con un estrecho intervalo de transmitancia y un máximo
aproximadamente a 440 nm y un filtro de salida con un estrecho intervalo de transmitancia y un máximo aproximadamente a
530 nm, medir la fluorescencia de todos los tubos y designar la lectura promedio de los tubos que contienen solamente la
Preparación de Valoración como lu y el promedio de los tubos que contienen la Preparación de Valoración y la Preparación Están-
dar como Is. Luego, a uno o más tubos de cada tipo, agregar, mezclando, 20 mg de hidrosulfito de sodio y medir nuevamente
la fluorescencia a los 5 segundos; designar la lectura promedio como 18 •
Cálculo-Calcular la cantidad, en mg, de C17 H20 N 4 0 6 en cada mL de la Preparación de Valoración tomado, por la fórmula:

Calcular la cantidad, en mg, de C17 H20 N4 0 6 en cada cápsula o tableta.

(501) SALES DE BASES ORGÁNICAS NITROGENADAS

Preparación Estándar-A menos que se indique algo diferente, preparar una solución en ácido sulfúrico diluido (1 en 70)
que contenga, en cada mL, aproximadamente 500 µg del Estándar de Referencia USP especificado, calculados con respecto a
la sustancia anhidra y pesados con exactitud.
Preparación de Valoración-Si la forma farmacéutica es una tableta, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas,
pesar con exactitud una porción del polvo, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente activo y transferir a un
separador de 125 mL; o, si la forma farmacéutica es un líquido, transferir un volumen de éste, que equivalga aproximadamente
a 25 mg del ingrediente activo y medido con exactitud, a un separador de 125 ml. Luego agregar al separador 20 mL de ácido
sulfúrico diluido (1 en 350) y agitar vigorosamente durante 5 minutos. Agregar 20 mL de éter, agitar cuidadosamente y filtrar
la fase ácida, recogiéndola en un segundo separador de 125 ml. Agitar la fase etérea con dos porciones de 1O mL de ácido
sulfúrico diluido (1 en 350), filtrar cada porción del ácido y recolectarla en el segundo separador y desechar el éter. Agregar
1O mL de hidróxido de sodio SR y 50 mL de éter al extracto ácido, agitar cuidadosamente y transferir la fase acuosa a un tercer
separador de 125 mL que contenga 50 mL de éter. Agitar cuidadosamente el tercer separador y desechar la fase acuosa. Lavar
sucesivamente las dos soluciones etéreas con una única porción de 20 mL de agua y desechar el agua. Extraer cada una de las
dos soluciones etéreas con porciones de 20 mL, 20 mL y 5 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 70), en el orden indicado, pero

* Las concentraciones de las soluciones de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio empleadas no se indican en cada caso porque estas concentraciones pueden
variar según la cantidad de material tomado para la valoración, el volumen de la solución de prueba y el efecto amortiguador del material.
 1

284 (501) Sales de Bases Orgánicas Nitrogenadas / Pruebas Químicas USP 37

siempre extrayendo primero la solución etérea del tercer separador y después la del segundo separador. Combinar los extrac-
tos ácidos en un matraz volumétrico de 50 ml, diluir a volumen con el ácido y mezclar.
NOTA-El éter puede sustituirse por hexano o heptano si el coeficiente de partición de la base nitrogenada entre el agua y el
hexano, o entre el agua y el heptano, favorece una extracción completa hacia la fase orgánica.
Procedimiento-A menos que se indique algo diferente, diluir 5,0 ml de la Preparación Estándar y 5,0 ml de la Preparación
de Valoración con ácido sulfúrico diluido (1 en 70) hasta 100,0 ml y determinar la absorbancia de cada solución a la longitud
de onda especificada, usando ácido sulfúrico diluido (1 en 70) como blanco. Designar la absorbancia de la solución de la Pre-
paración Estándar como A5 y la de la Preparación de Valoración como Au y calcular el resultado de la valoración según se indique
en la monografía individual.

(503) ÁCIDO ACÉTICO EN PÉPTIDOS

El siguiente procedimiento se debe usar para determinar la cantidad de acetato o ácido acético en péptidos. El acetato es un
contra-ión común en muchas preparaciones de péptidos.
Estándares de Referencia USP (11 )-ER Ácido Acético Glacial USP.
Solución de Hidróxido de Sodio Concentrado-Disolver 42 g de hidróxido de sodio en agua y diluir con agua a 100 mL.
Solución A-Agregar 0,7 ml de ácido fosfórico a 1000 ml de agua y ajustar con Solución de Hidróxido de Sodio Concentrado
hasta un pH de 3,0.
Solución B-Usar metano!.
Diluyente-Preparar una mezcla de Solución A y Solución B (95:5).
Solución Estándar-[NOTA-La concentración puede ajustarse dependiendo de la cantidad de acetato o ácido acético que
se espera esté presente en el material de prueba.] Disolver en Diluyente una cantidad, pesada con exactitud, de ER Ácido Acéti-
co Glacial USP para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente O, 1 mg por ml.
Solución de Prueba-Preparar según se indica en la monografía individual. La cantidad de material usado se puede adap-
tar dependiendo de la cantidad de ácido acético esperada.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 21 O nm y una
columna de 4,6 mm x 25 cm rellena con material L1 de no más de 5 µm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,2 ml
por minuto. Programar el cromatógrafo del siguiente modo.
Tiempo Solución A Solución B
(minutos) (o/o) (o/o) Eluclón
o 95 5 equilibrio
0-5 95 5 isocrática
5-10 95--+50 5--+50 gradiente lineal
10-20 50 50 isocrática
20-22 50--+95 50--+5 gradiente lineal

Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar y registrar el cromatograma según se indica en el Procedimiento: el tiempo de
retención de ácido acético está entre 3 y 4 minutos y la desviación estándar relativa para inyecciones repetidas no es más de
5%.
Procedimiento-Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 O µL) de la Solución Es-
tándar y de la Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos de ácido acético. Calcular el
porcentaje de ácido acético en la porción de material tomada, por la fórmula:
1 OO(C 5 /M)(ru/r5)

en donde C5 es la concentración de ácido acético en la Solución Estándar; M es la concentración, en mg por ml, de la Solución
de Prueba, basada en el peso del material de prueba tomado y el grado de dilución; y ru y r5 son las respuestas de los picos de
ácido acético obtenidos a partir de la Solución de Prueba y la Solución Estándar, respectivamente.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 285

(511) VALORACIÓN DE UN ESTEROi DE AISLADO

En el siguiente procedimiento, el esteroide a valorar se separa de los esteroides extraños relacionados y excipientes mediante
cromatografía en capa delgada y se determina después de la recuperación a partir del cromatograma.
Preparación de la Placa-Preparar una suspensión espesa con 30 g de gel de sílice para cromatografía y una sustancia fluo-
rescente adecuada agregando gradualmente aproximadamente 65 mL de una mezcla de agua y alcohol (5:2), y mezclando.
Transferir la suspensión espesa a una placa limpia de 20 cm x 20 cm, extender hasta obtener una capa uniforme de 250 ~tm de
espesor y dejar que se seque a temperatura ambiente durante 15 minutos. Calentar la placa a 105º durante 1 hora y almace-
nar en un desecador.
Disolvente A-Mezclar cloruro de metileno con metano! (180:16).
Disolvente B-Mezclar cloroformo con acetona (4:1 ).
Preparación Estándar-Disolver en una mezcla de volúmenes iguales de cloroformo y alcohol una cantidad adecuada del
Estándar de Referencia USP especificado en la monografía individual, previamente secada según se indicó (ver Estándares de
Referencia USP (11 )) y pesada con exactitud, para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente
2 mg por mL.
Preparación de Valoración-Preparar según se indica en la monografía individual.
Procedimiento-Dividir el área de la placa cromatográfica en tres secciones iguales y usar las secciones izquierda y derecha
para la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente, y la sección central para el blanco. Aplicar 200 ~tL
de la Preparación de Valoración y 200 µL de la Preparación Estándar en franjas alejadas en 2,5 cm del borde inferior de la sección
correspondiente de la placa. Secar la solución a medida que se aplica, con ayuda de una corriente de aire. Usando el Disolvente
especificado en la monografía individual, desarrollar el cromatograma en una cámara adecuada, previamente equilibrada y
con recubrimiento interno de papel absorbente, hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido 15 cm por encima de las
franjas iniciales.
Retirar la placa, evaporar el disolvente y localizar la banda principal ocupada por la Preparación Estándar observándola bajo
luz UV. Marcar esta banda, además de las bandas correspondientes en la Preparación de Valoración y en las secciones del blan-
co de la placa. Quitar el gel de sílice de cada banda por separado, ya sea raspando sobre papel satinado o usando un dispositi-
vo adecuado recolector por vacío y transferirlo a un tubo de centrífuga de 50 mL con tapón de vidrio. Agregar 25,0 mL de
alcohol a cada tubo y agitar durante no menos de 2 minutos. Centrifugar los tubos durante 5 minutos, pipetear 20 mL del
sobrenadante de cada tubo y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 mL con tapón de vidrio, agregar 2,0 mL de una solución
preparada por disolución de 50 mg de azul de tetrazolio en 1 O mL de metano! y mezclar. Proceder según se indica en el Proce-
dimiento en Valoración de Esteroides (351 ), comenzando donde dice "Luego a cada matraz".

(525) DIÓXIDO DE AZUFRE

Los siguientes métodos se proporcionan a efectos de la determinación de dióxido de azufre en excipientes farmacéuticos.

MÉTODO 1

Procedimiento

Mezclar 20 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, con 200 mL de un disolvente adecuado, según se indica en la
monografía individual, y mezclar hasta obtener una suspensión homogénea. Dejar en reposo la mezcla de prueba hasta que la
mayor parte de la muestra se haya sedimentado y filtrar la porción acuosa a través de papel (Whatman Nº 1 o equivalente). A
100 mL del filtrado transparente, agregar un disolvente adicional según se indica en la monografía individual, agregar 3 mL de
almidón SR y valorar con solución de yodo 0,01 N SV hasta el primer color azul o púrpura permanente. Cada mL de solución
de yodo 0,01 N SV consumido corresponde a 0,003% de dióxido de azufre encontrado.

MÉTODO 11

Procedimiento

Transferir aproximadamente 50 a 1 00 g de la sustancia en análisis, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de

250 mL, agregar 100 a 150 mL de agua y mezclar. Enfriar entre 5º y 1 Oº. Mientras se mezcla con un mezclador magnético,
agregar 1 O mL de hidróxido de sodio 1,5 N frío (a una temperatura entre 5º y 1 Oº). Mezclar durante 20 segundos adicionales y
agregar 1 O mL de solución indicadora de almidón, preparada de la siguiente manera: mezclar 1 O g de almidón soluble con
286 (525) Dióxido de Azufre / Pruebas Químicas USP 37

50 ml de agua fría, transferir a 1 000 ml de agua en ebullición, mezclar hasta que se disuelva por completo, enfriar y agregar
1 g de ácido salicílico como conservante. [NOTA-Desechar la solución después de 1 mes.] Agregar 1 O ml de ácido sulfúrico
2,0 N (a una temperatura entre 5º y 1Oº) y valorar inmediatamente con yodo 0,005 N SV hasta que persista un color azul claro
durante 1 minuto (ver Volumetría (541 )). Realizar una determinación con un blanco, usando 200 ml de agua tratada de mane-
ra similar que la solución en análisis y hacer las correcciones necesarias. Cada ml de yodo 0,005 N equivale a O, 16 mg de S0 2 .

MÉTODO 111

Procedimiento

Disolver 20,0 g de la muestra de prueba en 150 ml de agua caliente en un matraz de fondo redondo y cuello largo, agregar
5 ml de ácido fosfórico y 1 g de bicarbonato de sodio, e inmediatamente conectar el matraz a un condensador. [NOTA-Se
puede reducir la producción excesiva de espuma mediante el agregado de unas pocas gotas de un agente antiespumante ade-
cuado.] Destilar 50 ml, recibiendo el destilado bajo la superficie de 50 ml de yodo O, 1 N. Acidificar el destilado con unas po-
cas gotas de ácido clorhídrico, agregar 2 ml de cloruro de bario SR y calentar en un baño de vapor hasta que el líquido sea
casi incoloro. El precipitado de sulfato de bario, si lo hubiera, una vez filtrado, lavado e incinerado, pesa no más de 3 mg, que
corresponde a no más de 0,004% de dióxido de azufre, haciendo las correcciones para cualquier sulfato que pudiera estar
presente en 50 ml del yodo O, 1 N.

MÉTODO IV
En esta prueba, el dióxido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio ácido en ebullición y se extrae
con una corriente de dióxido de carbono. El gas separado se recoje en una solución de peróxido de hidrógeno diluida, en la
que el dióxido de azufre se oxida a ácido sulfúrico y se valora con álcali estándar, usando un medidor de pH para controlar el
valor de pH y la valoración. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la
prueba de aptitud del sistema.

Reactivos Especiales

Dióxido de Carbono-Usar dióxido de carbono con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 100 ± 1O ml por mi-
nuto.
Solución de Peróxido de Hidrógeno-Diluir peróxido de hidrógeno al 30% con agua para obtener una solución al 3%.
Neutralizar la solución de peróxido de hidrógeno al 3% con hidróxido de sodio 0,01 N a un pH de 4, 1 determinado potencio-
métricamente.
Solución de Metabisulfito de Potasio-Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K 2 Sp 5) y 0,2 g de edetato disódico a
un matraz volumétrico de 1000 ml. Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disódico para prote-
ger al ión sulfito de la oxidación.]

Aparato

El diagrama adjunto muestra un aparato adecuado para la determinación de ~ióxido de azufre (Figura 1). El aparato consiste
en un matraz de ebullición de 500 ml de fondo redondo con tres cuellos, A; un embudo de separación, B, con una capacidad
de 100 ml o mayor; un tubo de entrada de gas de longitud sificiente para permitir la introducción de dióxido de carbono a
2,5 cm del fondo del matraz de ebullición; un condensador de reflujo, C, con una longitud de la camisa de 200 mm; y un tubo
de salida, E, que conecta el extremo superior del condensador de reflujo con el fondo de un tubo de ensayo receptor, D.
Aplicar una película fina de grasa para llaves de paso a las superificies de sellado de todas las juntas, excepto la junta que está
entre el embudo de separación y el matraz de ebullición, y sujetar las juntas con abrazaderas para garantizar la hermeticidad.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 287

Figura 1. Aparato para el Método IV.

Prueba de Aptitud del Sistema

Prueba A-Usando la Solución de Metabisulfito de Potasio como el estándar, proceder según se indica en Procedimiento, ex-
cepto que se deben reemplazar 25,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solución de Metabisulfito de Potasio. Calcular el
contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio tomada por la fórmula:

1000(32,03)VN/Vr

en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y Vr es el volumen, en mL, de la
Solución de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.
Prueba B-En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solución de yodo 0,02 N y 5 mL de ácido clorhídrico
2 N. Agregar 1 mL de almidón SR y valorar con la Solución de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decolora-
ción. Calcular el contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio por la fórmula:

1 000(32,03)V¡N¡/Vr

en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V1 es el volumen, en mL, de solución de yodo usado en la prueba; N 1 es la
normalidad de la solución de yodo; y Vr es el volumen, en mL, de la SoluciÓ(I de Metabisulfito de Potasio consumida.
La diferencia entre los contenidos de dióxido de azufre obtenidos a partir de la Prueba A y la Prueba Bes no más de 5% de su
valor promedio. La Prueba B se debe realizar dentro de los 15 minutos posteriores a la finalización de la Prueba A. [NOTA-Esto
evita una variación potencial del contenido de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena
a temperatura ambiente.]

Procedimiento

Agregar 150 mL de agua al matraz de ebullición (A). Cerrar la llave de paso del embudo de separación y comenzar el flujo
de dióxido de carbono a una velocidad de 100 ± 5 mL por minuto a través del aparato. Iniciar el flujo refrigerante del conden-
sador. Colocar 1O mL de Solución de Peróxido de Hidrógeno en el tubo de ensayo receptor (O). Después de 15 minutos, sin ha-
ber interrumpido el flujo de dióxido de carbono, retirar el embudo de separación (8) del matraz de ebullición y transferir
25,0 g de la muestra de prueba al matraz de ebullición con ayuda de 100 mL de agua. Aplicar grasa para llaves de paso a la
junta externa del embudo de separación y volver a colocar el embudo de separación en el matraz de ebullición. Cerrar la llave
de paso del embudo de separación y agregar 80 mL de ácido clorhídrico 2 N al embudo de separación. Abrir la llave de paso
del embudo de separación para permitir que la solución de ácido clorhídrico fluya en el matraz de ebullición, cerrando la llave
de paso antes de que escurran los últimos mL de ácido clorhídrico para evitar que el dióxido de azufre escape hacia el embudo
de separación. Calentar la mezcla a ebullición durante 1 hora. Abrir la llave de paso del embudo, detener el flujo de dióxido de
carbono, discontinuar el calentamiento del matraz, y detener el flujo de agua refrigerante en el condensador. Retirar el tubo de
ensayo receptor y transferir su contenido a un matraz Erlenmeyer de 200 mL de cuello ancho. Enjuagar el tubo de ensayo re-
288 (525) Dióxido de Azufre/ Pruebas Químicas USP 37

ceptor con una pequeña porción de agua, agregar el enjuague al matraz Erlenmeyer de 200 mL, y mezclar. Calentar en un
baño de agua durante 15 minutos y dejar que se enfríe. Agregar O, 1 mL de azul de bromofenol SR y valorar el contenido con
hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que el color cambie de amarillo a azul violáceo y el cambio de color persista durante al
menos 20 segundos. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetría (541 )). Cal-
cular el contenido, en ftg por g, de dióxido de azufre en la muestra de prueba tomada por la fórmula:
1000(32,03)VN/W

en donde 1000 es el factor de conversión de mg a pg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y W es el peso, en g, de la muestra
de prueba tomada.

MÉTODO V

En este método, de manera similar al Método IV, el dióxido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio
ácido en ebullición y se extrae con una corriente de nitrógeno. El gas separado se recoje en una solución de peróxido de hidró-
geno diluida, en la que el dióxido de azufre se oxida a ácido sulfúrico y se valora con álcali estándar, usando rojo de metilo
como indicador. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la prueba de
aptitud del sistema.

Reactivos Especiales

Solución de Peróxido de Hidrógeno-Diluir una porción de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento con agua para obte-
ner una solución al 3%. justo antes de su uso, agregar 3 gotas de rojo de metilo SR y neutralizar hasta un punto final amarillo
con hidróxido de sodio 0,01 N. No exceder el punto final.
Nitrógeno-Usar nitrógeno de alta pureza con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 200 ± 1O ml por minuto.
Evitar la presencia de oxígeno pasando el nitrógeno a través de un depurador, tal como pirogalol alcalino, que se prepara se-
gún se indica a continuación: agregar 4,5 g de pirogalol a un frasco de lavado de gases, purgar el frasco con nitrógeno duran-
te 3 minutos, y agregar una solución que contenga 85 ml de agua y 65 g de hidróxido de potasio mientras se mantiene una
atmósfera de nitrógeno en el frasco.
Solución de Metabisulfito de Potasio-Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K 2 Sp 5 ) y 0,2 g de edetato disódico a
un matraz volumétrico de 1000 mL. Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disódico para prote-
ger al ión sulfito de la oxidación.]

Aparato

El aparato (ver la Figura 2) está diseñado para realizar la transferencia selectiva de dióxido de azufre de la muestra en ácido
clorhídrico acuoso en ebullición a la Solución de Peróxido de Hidrógeno en el vaso G. La contrapresión se limita a la presión inevi-
table debida a la altura de la Solución de Peróxido de Hidrógeno por encima del extremo del burbujeador, F. Mantener la contra-
presión lo más baja posible reduce la probabilidad de pérdida de dióxido de azufre por fugas. Calentar a ebullición previamen-
te los tubos de vinilo y silicona. Aplicar una película fina de grasa para llaves de paso a las superficies de sellado de todas las
juntas, excepto la junta entre el embudo de separación y el matraz, y sujetar las juntas para garantizar la hermeticidad. El em-
budo de separación, B, tiene una capacidad de 100 mL o mayor. El adaptador de entrada, A, con una manguera conectora,
permite aplicar presión de carga a la solución. [NOTA-No se recomienda el uso de un embudo de goteo que equilibre la pre-
sión debido a que el condensado, que puede contener dióxido de azufre, se deposita en el embudo y en el brazo lateral.]
El matraz de fondo redondo, C, es un matraz de 1000 ml con tres juntas cónicas tipo 24/40. El tubo de entrada de gas, D,
tiene una longitud suficiente para permitir la introducción del nitrógeno a 2,5 cm del fondo del matraz. El condensador Allihn,
E, tiene una longitud de camisa de 300 mm. El burbujeador, F (ver la Figura 3), está fabricado con vidrio según las dimensiones
proporcionadas en la Figura 3. La Solución de Peróxido de Hidrógeno está contenida en el vaso, G, con un diámetro interno de
aproximadamente 2,5 cm y una profundidad de aproximadamente 18 cm. Hacer que circule un refrigerante, como por ejem-
plo una mezcla de agua y metanol ( 4:1) mantenida a 5º, para enfriar el condensador.
USP 37 Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 289

A-

s-

Figura 2. Aparato para el Método V.

T24/40

1
185 mm

J
Figura 3. Burbujeador (F) para el aparato del Método V.
290 (525) Dióxido de Azufre/ Pruebas Químicas USP 37

Prueba de Aptitud del Sistema

Prueba A-Usando la Solución de Metabisulfito de Potasio como el estándar, proceder según se indica en Procedimiento, ex-
cepto qe se deben reemplazar los 50,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solución de Metabisulfito de Potasio. Calcular
el contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisuffito de Potasio tomada por la fórmula:
1000(32,03)VN/Vp

en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y Vp es el volumen, en mL, de
Solución de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.
Prueba B-En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solución de yodo 0,02 N y 5 mL de ácido clorhídrico
2 N. Agregar 1 mL de almidón SR y valorar con la Solución de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decolora-
ción. Calcular el contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio por la fórmula:
1000(32,03)V¡N,/Vp

en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V es el volumen, en mL, de solución de yodo usado en la prueba; N es la
1 1

normalidad de solución de yodo; y VP es el volumen, en mL, de Solución de Metabisulfito de Potasio consumida.

La diferencia entre el contenido de dióxido de azufre obtenido a partir de la Prueba A y la Prueba Bes no más de 5% de su
valor promedio. La Prueba B deberá realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la finalización de la Prueba A. [NOTA-Esto
evita la variación potencial del contenido de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena a
temperatura ambiente.]

Procedimiento
Colocar el aparato en un manto de calentamiento controlado por un dispositivo regulador de energía. Agregar 400 mL de
agua al matraz. Cerrar la llave de paso del embudo de separación y agregar 90 mL de ácido clorhídrico 4 N al embudo de
separación. Comenzar el flujo de nitrógeno a una velocidad de 200 ± 1O mL por minuto. Iniciar el flujo refrigerante del con-
densador. Agregar 30 mL de Solución de Peróxido de Hidrógeno al vaso (G). Después de 15 minutos, retirar el embudo de sepa-
ración y transferir al matraz una mezcla de 50,0 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, y 100 mL de solución al-
cohólica (5 en 100). Aplicar grasa para llaves de paso a la junta externa del embudo de separación, volver a colocar el embudo
de separación al matraz de junta cónica, y reanudar concomitantemente el flujo de nitrógeno. Aplicar presión de carga sobre
la solución de ácido clorhídrico en el embudo de separación con una pera de goma provista de una válvula. Abrir la llave de
paso del embudo de separación para permitir que la solución de ácido clorhídrico fluya en el matraz. Continuar manteniendo
por encima de la solución de ácido clorhídrico una presión suficiente para forzarla hacia el interior del matraz. [NOTA-Si fuera
necesario, se puede cerrar la llave de paso temporalmente para incrementar la presión.] Para evitar fugas de dióxido de azufre
hacia el embudo de separación, cerrar la llave de paso antes de que escurran los últimos mL de ácido clorhídrico. Aplicar sufi-
ciente energía al manto de calentamiento para generar aproximadamente 85 gotas de reflujo por minuto. Después de someter
a reflujo durante 1,75 horas, retirar el vaso (G), agregar 3 gotas de rojo de metilo SR, y valorar el contenido con hidróxido de
sodio 0,01 N SV, usando una bureta de 1O mL con un tubo de desborde y una manguera que conecte a un tubo de absorción
de dióxido de carbono, hasta un punto final amarillo que persista durante al menos 20 segundos. Realizar una determinación
con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetría (541 )). Calcular la cantidad, en µg, de S0 2 en cada g de la
muestra de prueba tomada por la fórmula: ·
1000(32,03)VN/W
en donde el factor 1000 convierte mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen, en mL, de
solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y W es el peso, en g, de la muestra de prueba
tomada.
 USP 37 Pruebas Químicas / <S 31 > Valoración de Tia mina 291

(531) VALORACIÓN DE TIAMINA

Estándares de Referencia USP (11 )-ER Clorhidrato de Tiamina USP.

El siguiente procedimiento se proporciona para la determinación de tiamina como ingrediente de Preparaciones farmacopei-
cas que contengan otros componentes activos.
Soluciones y Disolventes Especiales-
SOLUCIÓN DE FERRICIANURO DE POTASIO-Disolver 1,0 g de ferricianuro de potasio en agua para obtener 100 ml. Preparar la
solución el mismo día de su uso.
REACTIVO DE OXIDACIÓN-Mezclar 4,0 ml de la Solución de Ferricianuro de Potasio con suficiente hidróxido de sodio 3,5 N para
obtener 100 ml. Usar esta solución dentro de las 4 horas posteriores.
SOLUCIÓN MADRE DE SULFATO DE QUININA-Disolver 1 O mg de sulfato de quinina en ácido sulfúrico O, 1 N para obtener
1000 ml. Conservar esta solución, protegida de la luz, en un refrigerador.
SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE SULFATO DE QUININA-Diluir ácido sulfúrico o, 1 N con Solución Madre de Sulfato de Quinina (39:1 ). Esta
solución emite fluorescencia aproximadamente en el mismo grado que el tiocromo obtenido de 1 µg de clorhidrato de tiamina
y se usa para corregir el fluorómetro a intervalos frecuentes debido a la variación en la sensibilidad entre una lectura y otra
dentro de una valoración. Preparar esta solución el mismo día de su uso.
Solución Madre de Clorhidrato de Tiamina Estándar-Transferir aproximadamente 25 mg de ER Clorhidrato de Tiamina
USP, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1000 ml. Disolver el Estándar pesado en aproximadamente 300 ml
de solución de alcohol diluido (1 en 5) ajustada con ácido clorhídrico 3 N hasta un pH de 4,0 y llevar a volumen con el alcohol
diluido acidificado. Almacenar en un envase resistente a la luz, en un refrigerador. Preparar esta solución madre nueva cada
mes.
Preparación Estándar-Diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas una porción de la Solución Madre de Clorhidrato
de Tiamina Estándar con ácido clorhídrico 0,2 N para obtener la Preparación Estándar, cada ml de la cual representa 0,2 µg del
ER Clorhidrato de Tiamina USP.
Preparación de Valoración-Colocar en un matraz volumétrico adecuado una cantidad suficiente del material a valorar,
pesada con exactitud o medida por volumen según se indique, de modo que al diluir a volumen con ácido clorhídrico 0,2 N,
la solución resultante contenga aproximadamente 100 µg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml. Si la muestra es
difícil de disolver, se puede calentar la solución en un baño de vapor y luego enfriar y diluir a volumen con el ácido. Diluir
cuantitativamente y en diluciones sucesivas 5 ml de esta solución usando ácido clorhídrico 0,2 N hasta una concentración esti-
mada de 0,2 µg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml.
Procedimiento-Pipetear 5 ml de la Preparación Estándar y transferir a cada uno de tres o más tubos (u otros recipientes
adecuados) de aproximadamente 40 ml de capacidad. A cada uno de dos de estos tubos agregar rápidamente (en 1 ó 2 se-
gundos) mezclando, 3,0 ml del Reactivo de Oxidación y dentro de 30 segundos agregar 20,0 ml de alcohol isobutílico, luego
mezclar vigorosamente durante 90 segundos por agitación manual de los tubos tapados, o haciendo burbujear una corriente
de aire en la mezcla. Preparar un blanco en el tubo restante del estándar sustituyendo el Reactivo de Oxidación por un volumen
equivalente de hidróxido de sodio 3,5 N y procediendo de la misma manera.
Pipetear 5 ml de la Preparación de Valoración y transferir a cada uno de tres o más tubos similares. Tratar estos tubos de
manera similar a como se indica para los tubos que contienen la Preparación Estándar.
Pipetear 2 ml de alcohol deshidratado y transferir a cada uno de seis tubos, agitar por rotación suave durante algunos se-
gundos, permitir que las fases se separen y decantar o extraer aproximadamente 1O ml de solución de alcohol isobutílico so-
brenadante transparente a celdas estandarizadas, luego medir la fluorescerrcia en un fluorómetro adecuado que tenga un filtro
de entrada de intervalo de transmitancia estrecho con un máximo aproximadamente a 365 nm y un filtro de salida con un
intervalo de transmitancia estrecho con un máximo aproximadamente a 435 nm.
Cálculos-La cantidad de µg de C12 H17 CINpS · HCI en cada 5 ml de la Preparación de Valoración está dada, por la fórmula:
(A - b)/(S - d)
en donde A y S son las lecturas promedio del fluorómetro de las porciones de la Preparación de Valoración y la Preparación
Estándar tratadas con el Reactivo de Oxidación, respectivamente, y b y d son las lecturas de los blancos de la Preparación de
Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente.
Calcular la cantidad, en mg, de clorhidrato de tiamina (C 12 H17 CIN 4 0S · HCI) en el material de valoración sobre la base de las
alícuotas tomadas. Cuando se indique, la cantidad, en mg, de mononitrato de tiamina (C 12 H17 N 5 0 4 S) se puede calcular por
multiplicación de la cantidad encontrada de C12 H17CIN 4 0S · HCI por 0,9706.
 292 (541) Volumetría /Pruebas Químicas USP 37

(541) VOLUMETRÍA

Valoraciones Volumétricas Directas-La volumetría directa es el tratamiento de una sustancia soluble en solución, y con-
tenida en un recipiente adecuado, con una solución estandarizada apropiada (la solución volumétrica), donde el punto final se
determina en forma instrumental, o visualmente con ayuda de un indicador adecuado.
La solución volumétrica se agrega desde una bureta de capacidad adecuada que se elige de acuerdo con la concentración
(normalidad), de modo tal que el volumen consumido sea de entre 30% y 1 00% de la capacidad nominal de la bu reta.
[NOTA-En los casos en que se requiera menos de 1 O mL de solución volumétrica, se debe utilizar una microbureta adecuada.]
La aproximación al punto final se hace directamente pero con cuidado, y finalmente la solución volumétrica se agrega gota a
gota desde la bureta para que la última gota no sobrepase el punto final. La cantidad de sustancia valorada se puede calcular a
partir del volumen, el factor de normalidad o molaridad de la solución volumétrica, y el factor de equivalencia de la sustancia
que se especifica en la monografía correspondiente.
Valoraciones Volumétricas Residuales-Algunas valoraciones farmacopeicas requieren la adición de un volumen determi-
nado de una solución volumétrica, en exceso del necesario para reaccionar con la sustancia a valorar. Después, el excedente
de esta solución se valora con una segunda solución volumétrica. Esto constituye una volumetría residual y también se conoce
como "retrovaloración" o "valoración por retorno". La cantidad de la sustancia valorada se puede calcular a partir de la dife-
rencia entre el volumen de la solución volumétrica que se agregó originalmente corregida por medio de una valoración con un
blanco y el consumido por la solución volumétrica en la retrovaloración, teniendo en cuenta los respectivos factores de molari-
dad o normalidad de las dos soluciones y el factor de equivalencia para la sustancia indicado en la monografía correspondien-
te.
Valoraciones Complejométricas-EI éxito de las valoraciones complejométricas depende de varios factores. La constante
de equilibrio de formación del complejo del reactivo en la solución volumétrica-analito debe ser lo suficientemente grande co-
mo para que, en el punto final, casi el 100% del analito haya formado el complejo. El complejo final se debe formar lo suficien-
temente rápido para que el tiempo de análisis sea práctico. Cuando la reacción analítica no es rápida, algunas veces puede
resultar útil realizar una volumetría residual.
En general, los indicadores para valoraciones complejométricas son en sí mismos agentes formadores de complejos. La reac-
ción entre el ión metálico y el indicador debe ser rápida y reversible. La constante de equilibrio de formación del complejo
metal-indicador debe ser lo suficientemente grande como para producir un cambio de color marcado pero debe ser menor
que la correspondiente al complejo metal-valorante. La elección del indicador también está limitada por el intervalo de pH en
el que se debe efectuar la reacción de formación del complejo y por la interferencia de otros iones presentes en la muestra o
de la solución amortiguadora. Los iones que interfieren, a menudo se pueden enmascarar o "secuestrar" mediante la adición
de otro agente formador de complejos. (La técnica de enmascaramiento también se usa en las valoraciones redox).
Valoraciones por Óxido-Reducción (Redox)-Con frecuencia, se pueden llevar a cabo determinaciones de manera conve-
niente mediante el uso de un reactivo que provoque la oxidación o la reducción del analito. Muchas curvas de valoración re-
dox no son simétricas respecto al punto de equivalencia y, de ese modo, no es posible la determinación gráfica del punto final;
pero se dispone de indicadores para muchas determinaciones y además, frecuentemente los reactivos redox pueden servir co-
mo sus propios indicadores. Igual que en cualquier tipo de volumetría, el indicador ideal cambia de color en un punto final
que está lo más próximo posible al punto de equivalencia. En consecuencia, cuando la solución volumétrica sirve como su pro-
pio indicador, la diferencia entre el punto final y el punto de equivalencia sólo está determinada por la habilidad del analista
para detectar el cambio de color. Un ejemplo común es el uso del ión permanganato como componente de una solución volu-
métrica de oxidación ya que un leve exceso se puede detectar por su color rosado. Otras soluciones volumétricas que pueden
servir como sus propios indicadores son el yodo, las sales de cerio (IV) y el dicromato de potasio. En la mayoría de los casos, sin
embargo, el uso de un indicador redox producirá un punto final mucho más marcado.
Puede ser necesario ajustar el estado de oxidación del analito antes de la volumetría mediante el uso de un agente oxidante
o reductor adecuado; después, el exceso de reactivo se debe eliminar, por ejemplo, mediante precipitación. Esta es casi siem-
pre la práctica habitual en la determinación de agentes oxidantes, ya que la mayoría de soluciones volumétricas de agentes
reductores son oxidadas lentamente por el oxígeno atmosférico.
Valoraciones Volumétricas en Disolventes No Acuosos-Los ácidos y las bases han sido definidas durante mucho tiempo
como sustancias que cuando se disuelven en agua, proporcionan iones de hidrógeno e hidroxilo, respectivamente. Esta defini-
ción, introducida por Arrhenius, no reconoce el hecho de que propiedades características de los ácidos o las bases también se
pueden desarrollar en otros disolventes. Una definición más generalizada es la de Bronsted, quien definió un ácido como una
sustancia que proporciona protones y una base como una sustancia que se combina con protones. Una definición aún más
amplia es la de Lewis, quien definió un ácido como cualquier sustancia que acepta un par de electrones, una base como cual-
quier sustancia que dona un par de electrones y la neutralización como la formación de una unión de coordinación entre un
ácido y una base.
La fuerza aparente de un ácido o una base se determina por su grado de reacción con un disolvente. En solución acuosa
todos los ácidos fuertes parecen ser igualmente fuertes porque reaccionan con el disolvente para sufrir una conversión casi
completa en el ión oxonio y el anión del ácido (efecto nivelador). En un disolvente débilmente protófilo como el ácido acético,
 USP 37 Pruebas Químicas/ (541) Volumetría 293

el grado de formación del ión acidonio del acetato, indica que el orden decreciente de la fuerza para ácidos es perclórico,
bromhídrico, sulfúrico, clorhídrico y nítrico (efecto diferenciador).
El ácido acético reacciona de forma incompleta con el agua para formar ión oxonio y por lo tanto es un ácido débil. En
contraste, se disuelve en una base como etilendiamina y reacciona en forma tan completa con el disolvente que se comporta
como un ácido fuerte. Lo mismo es válido para el ácido perclórico.
Este efecto nivelador también se observa en el caso de las bases. En ácido sulfúrico, casi todas las bases parecen tener la
misma fuerza. A medida que las propiedades del disolvente disminuyen en la serie constituida por ácido sulfúrico, ácido acéti-
co, fenal, agua, piridina y butilamina, las bases se vuelven progresivamente más débiles hasta que todas, excepto las más fuer-
tes, pierden sus propiedades básicas. En orden de fuerza decreciente, las bases más fuertes son 2-aminoetóxido de sodio, me-
tóxido de potasio, metóxido de sodio y metóxido de litio.
Muchos compuestos insolubles en agua adquieren mejores propiedades ácidas o básicas cuando se disuelven en disolventes
orgánicos. De esta manera, la elección del disolvente adecuado permite la determinación de una variedad de tales sustancias
mediante valoración en medios no acuosos. Además, dependiendo de cual sea la parte fisiológicamente activa del compuesto,
con frecuencia es posible valorarla selectivamente, eligiendo el disolvente y el valorante adecuados. Los compuestos puros se
pueden valorar directamente, pero en preparaciones farmacéuticas a menudo es necesario aislar el ingrediente activo de los
excipientes y vehículos que interfieran.
Entre los tipos de compuestos que se pueden valorar como ácidos están los ácidos de haluros, anhídridos de ácidos, ácidos
carboxílicos, aminoácidos, enoles como barbituratos y xantinas, imidas, fenoles, pirroles y sulfonamidas. Entre los tipos de
compuestos que se pueden valorar como bases están las aminas, compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno, oxazoli-
nas, compuestos de amonio cuaternario, sales alcalinas de ácidos orgánicos, sales alcalinas de ácidos inorgánicos débiles y al-
gunas sales de aminas. Muchas sales de ácidos halogenados se pueden valorar en ácido acético o anhídrido acético después de
agregar acetato de mercurio, que elimina iones haluros formando un complejo de halógeno-mercurio sin ionizar e introduce el
acetato ionizado.
Para la volumetría de un compuesto básico se prefiere una solución volumétrica de ácido perclórico en ácido acético glacial,
aunque en casos especiales se usa ácido perclórico en dioxano. El sistema de electrodos de vidrio-calomel resulta útil en este
caso. En ácido acético como disolvente, este sistema de electrodos funciona de acuerdo con la teoría.
Para la volumetría de un compuesto ácido, se dispone de dos clases de soluciones volumétricas: los alcóxidos de metales
alcalinos y los hidróxidos de tetraalquilamonio. Con frecuencia se usa una solución volumétrica de metóxido de sodio en una
mezcla de metano! y tolueno, aunque en algunos casos, cuando se produce un precipitado gelatinoso con el metóxido de
sodio, se emplea metóxido de litio en un disolvente de metanol-benceno.
Cuando se emplean soluciones volumétricas de alcóxidos de metales alcalinos se produce un error alcalino que limita el em-
pleo de un electrodo de vidrio, en particular en disolventes básicos. El electrodo indicador de antimonio, aunque algo errático,
resulta útil en estos casos. El uso de hidróxidos de amonio cuaternario, por ej., el hidróxido de tetra-n-butilamonio y el hidróxi-
do de trimetilhexadecilamonio (en benceno-metanol o alcohol isopropílico), presenta dos ventajas sobre las otras dos solucio-
nes volumétricas: (a) la sal de tetraalquilamonio del ácido valorado es soluble en el medio de valoración y (b) se puede em-
plear un par de electrodos de vidrio calomel, de uso corriente en la mayoría de los laboratorios analíticos, para llevar a cabo
valoraciones volumétricas potenciométricas.
Debido a la interferencia producida por el dióxido de carbono, los disolventes empleados en la valoración de sustancias áci-
das se deben proteger de la exposición excesiva al aire atmosférico durante la valoración mediante una protección adecuada o
una atmósfera inerte. La absorción de dióxido de carbono se puede determinar mediante la volumetría con un blanco. El blan-
co no debe exceder más de 0,01 mL de metóxido de sodio SV 0, 1 N por mL de disolvente.
El punto final se puede determinar visualmente por el cambio de color de un indicador, o potenciométricamente, según se
especifique en la monografía correspondiente. Si se usa un electrodo de calÓmel como referencia, es recomendable sustituir la
solución acuosa de cloruro de potasio del puente salino con perclorato de litio O, 1 N en ácido acético glacial para valoraciones
en disolventes ácidos o cloruro de potasio en metano! para valoraciones en disolventes básicos.
Cuando en la monografía correspondiente se indica el uso de estas u otras mezclas, el electrodo de calomel de referencia se
modifica retirando en primer lugar la solución acuosa de cloruro de potasio y el cloruro de potasio residual, si lo hubiera, en-
juagando con agua y luego eliminando el agua residual enjuagando con el disolvente no acuoso indicado y finalmente, llenan-
do el electrodo con la mezcla no acuosa indicada.
En casi todos los casos, excepto en aquellos en los que el ión de plata podría interferir, el electrodo de calomel se puede
sustituir por un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. El electrodo de plata-cloruro de plata es más resistente y su
uso ayuda a eliminar sales de mercurio tóxicas del laboratorio. En general se puede utilizar un puente salino para evitar la inter-
ferencia del ión plata.
Los sistemas más útiles para volumetría en disolventes no acuosos se indican en la Tabla 1.
 294 (541) Volumetría / Pruebas Químicas USP 37

Tabla 1. Sistemas para Valoraciones Volumétricas No Acuosas

Relativamente Neutro Relativamente Neutro
Tipo de Ácido (para valoración (para valoración Básico (para valoración (para valoración
Disolvente de bases y sus sales) diferencial de bases) de ácidos) diferencial de ácidos)
Disolvente 1 Ácido acético glacial Acetonitrilo Dimetilformam ida Acetona
Anhídrido acético Alcoholes n-Butilamina Acetonitrilo
Ácido fórmico Cloroformo Piridina Metil etil cetona
Ácido propiónico Benceno Etilendiamina Metil isobutil cetona
Cloruro de sulfurilo Tolueno Morfolina Alcohol terc-butílico
Clorobenceno
Acetato de etilo
Dioxano
Indicador Cristal violeta Rojo de metilo Azul de timol Azo violeta
Rojo de quinaldina Naranja de metilo Thymolphthalein Azul de bromotimol
p-Naftolbenceína p-Naftolbenceína Azo violeta p-Hidroxiazobenceno
Alfazurina 2-G o-Nitroanilina Azul de timol
Verde de malaquita p-Hidroxiazobenceno
Electrodos Vidrio-calomel Vidrio-calomel Antimonio-calomel Antimonio-calomel
Vidrio-plata-cloruro de pla- Calomel-plata-cloruro de Antimonio-vidrio Vidrio-calomel
ta plata
Mercurio-acetato mercúrico Antimonio-antimonio 2 Vidrio-platino2
Platino-calomel
Vidrio-calomel
1 Los disolventes relativamente neutros de baja constante dieléctrica como benceno, tolueno, cloroformo o dioxano se pueden emplear junto con cualquier
disolvente ácido o básico para aumentar la sensibilidad del punto final de la valoración.
2 En solución volumétrica.

Indicadores y Detección Potenciométrica del Punto Final-El método más simple y conveniente para determinar el pun-
to de equivalencia, es decir, el punto en el que la reacción analítica estequiométrica está terminada, es mediante el uso de
indicadores. Estas sustancias químicas, generalmente coloreadas, responden a cambios en la solución antes y después del pun-
to de equivalencia presentando cambios de color que se pueden detectar visualmente como el punto final de la reacción, lo
que constituye una estimación confiable del punto de equivalencia.
Un método útil de determinación del punto final es mediante mediciones electroquímicas. Si un electrodo indicador, sensi-
ble a la concentración de la especie sometida a la reacción volumétrica y un electrodo de referencia cuyo potencial no es sensi-
ble a ninguna especie disuelta, se sumergen en la solución a valorar para formar una celda galvánica, la diferencia de potencial
entre los electrodos se puede medir con un medidor de pH que permite seguir el curso de la reacción. Cuando es posible grafi-
car correctamente dichas series de cambios (por ejemplo, para el caso de una valoración ácido-base, el pH en función de los
ml de solución volumétrica agregada; para valoraciones de precipitación, complejométricas o de óxido-reducción, los mV en
función de los ml de solución volumétrica agregada), se obtiene una curva sigmoidea con una porción que cambia rápida-
mente (punto de "ruptura") cerca del punto de equivalencia. El punto medio de esta porción vertical o punto de inflexión se
puede considerar como punto final. El punto de equivalencia también se puede· determinar matemáticamente sin trazar una
curva de valoración. Sin embargo, se debe tener en cuenta que en reacciones asimétricas en las que el número de aniones que
reaccionan no es igual al número de cationes que reaccionan, el punto final definido por la inflexión de la curva de volumetría
no ocurre exactamente en el punto de equivalencia estequiométrico. En consecuencia, la detección potenciométrica del punto
final mediante este método no es adecuada para reacciones asimétricas, como por ejemplo la reacción de precipitación,
2Ag+ + Cr0 4- 2

y la reacción de óxido-reducción,

Todas las reacciones ácido-base, sin embargo, son simétricas. De este modo, la detección potenciométrica del punto final se
puede emplear en valoraciones volumétricas ácido-base y en otras valoraciones volumétricas que comprendan reacciones si-
métricas reversibles donde se especifique un indicador, a menos que se indique lo contrario en la monografía correspondiente.
Existen dos tipos de tituladores electrométricos. El primero agrega la solución volumétrica automáticamente y registra las
diferencias de potencial del electrodo durante el curso de la titulación dando la curva sigmoidea esperada. En el segundo tipo,
el agregado de solución volumétrica se lleva a cabo automáticamente hasta que se alcanza un potencial o pH preseleccionado,
que representa el punto final y en ese momento cesa el agregado de solución volumétrica.
Varios sistemas de electrodos, apropiados para valoraciones volumétricas potenciométricas, se resumen en la Tabla 2.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Alfa Tocoferol 295

Tabla 2. Sistemas de Electrodos para Valoraciones Volumétricas Potenclométricas

Valoración
volumétrica Electrodo Indicador Ecuaclón 1 Electrodo de referencia Aplicaclones2
Ácido-base Vidrio E = k + 0,0591 pH Calomel o plata-cloruro de Valoración volumétrica de
plata ácidos y bases
Precipitimetría (plata) Plata E= Eº+ 0,0591 lag [Ag +] Calomel (con puente salino Valoración volumétrica con
de nitrato de potasio) plata o de plata que com-
prende haluros o tiocianatos
Complejometría Mercurio-mercurio (\\) E= Eº+ 0,0296(1og k'- pM) Calomel Valoración volumétrica de di-
versos metales (M), p.ej.,
Mg+ 2, Ca+ 2, Al+3, Bi+ 3, con
EDTA
Óxido-reducción Platino E = Eº+ (0,0591 /n) x lag Calomel o plata-cloruro de Valoraciones volumétricas
[ox]/[red] plata con arsenito, bromo, cerato,
dicromato, hexacianoferrato
(111), yodato, nitrito, perman-
ganato, tiosulfato
1 Forma apropiada de la ecuación de Nernst que describe el sistema de electrodos indicado: k = constante del electrodo de vidrio; k' = constante derivada del
equilibrio Hg-Hg(ll)-EDTA; M =cualquier metal que se pueda valorar con EDTA; [ax] y [red] de la ecuación, ax+ ne~ red.
2 La lista es representativa pero no está completa.

Correcciones con un Blanco-Como se hizo notar anteriormente, el punto final determinado en una volumetría es una
estimación del punto de equivalencia de la reacción. La validez de esta estimación depende, entre otros factores, de la natura-
leza de las sustancias a valorar y de la concentración de la solución volumétrica. Para aumentar la confiabilidad de la determi-
nación del punto final en valoraciones volumétricas, se realiza una corrección con un blanco adecuado. Dicha corrección con un
blanco se obtiene habitualmente mediante una valoración residual del blanco, en la que el procedimiento indicado se repite en
todos los detalles excepto que la muestra en análisis se omite. En tales casos, el volumen real de solución volumétrica, equiva-
lente a la sustancia analizada, es la diferencia entre el volumen consumido en la valoración residual del blanco y el consumido
en la valoración de la muestra. El volumen corregido que se obtiene de esta manera se utiliza para calcular la cantidad de sus-
tancia valorada, de la misma manera que se indica en Valoraciones volumétricas residuales. Cuando el punto final se determina
potenciométricamente, la corrección del blanco en general es inapreciable.

(551) VALORACIÓN DE ALFA TOCOFEROL

El siguiente procedimiento se utiliza para la determinación de tocoferol como ingrediente.

Hidrogenador-Se puede ensamblar un dispositivo adecuado para la hidrogenación a baja presión del siguiente modo.
Preparar en una gradilla o en pinzas dos tubos de centrífuga cónicos, conectados en serie por medio de una tubería de vidrio y
plástico inerte y tapones adecuados de vidrio, polímero o corcho (evitando por completo el uso de caucho). Usar un tubo para
el blanco y el otro para la muestra de valoración. Preparar un tubo de dispersión de gas de modo que el hidrógeno se disperse
en forma de burbujas en el fondo de cada tubo. Pasar el hidrógeno primero por el tubo del blanco y luego por el tubo de la
muestra.
Procedimiento-Pipetear 25 ml de la solución de éter lavada final de la fracción no saponificable obtenida según se indicó
para Cuando Está Presente Tocoferol en el Procedimiento en la Valoración de Vitamina A (571) y transferir a un recipiente adecua-
do y evaporar hasta aproximadamente 5 ml. Sin aplicar calor, eliminar el éter restante con una corriente de gas inerte o al
vacío. Disolver el residuo en suficiente alcohol para obtener una concentración esperada de aproximadamente O, 15 mg de alfa
tocoferol por ml. Pipetear 15 ml y transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar aproximadamente 200 mg de cataliza-
dor de paladio, mezclar con una varilla de vidrio e hidrogenar durante 1O minutos en el Hidrogenador, usando hidrógeno que
haya pasado por alcohol en un tubo de blanco. Agregar aproximadamente 300 mg de tierra silícea para cromatografía, mez-
clar con una varilla de vidrio y centrifugar inmediatamente hasta que la solución esté transparente.
Para analizar una alícuota de 1 ml de la solución, eliminar el disolvente por evaporación, disolver el residuo en 1 ml de clo-
roformo y agregar 1O ml de tricloruro de antimonio SR: no aparece color azul detectable. [NOTA-Si aparece un color azul,
repetir la hidrogenación durante más tiempo o con un nuevo lote de catalizador.]
Pipetear 2 ml del sobrenadante y transferir a un matraz opaco con tapón de vidrio, agregar 1,0 ml de una solución 1 en
500 de cloruro férrico en alcohol deshidratado* y comenzar a tomar el tiempo de la reacción, preferentemente con un cronó-
metro. Agregar inmediatamente 1,0 ml de una solución 1 en 200 de 2,2'-bipiridina en alcohol deshidratado, mezclar por rota-
ción suave, agregar 21,0 ml de alcohol deshidratado, cerrar el tubo y agitar vigorosamente para asegurar que se mezcle por

* NOTA-La absorbancia del blanco se puede disminuir y así mejorar la precisión de la determinación al purificar el alcohol deshidratado que se utiliza durante toda
la valoración. La purificación se puede lograr agregando algunos cristales (aproximadamente 0,02%) de permanganato de potasio y algunas lentejas de hidróxido
de potasio al alcohol deshidratado y volviendo a destilar.
 296 (551 > Valoración de Alfa Tocoferol / Pruebas Químicas USP 37

completo. Cuando hayan transcurrido aproximadamente 9,5 minutos desde el comienzo de la reacción, transferir parte de la
mezcla a una de un par de celdas de espectrofotómetro rlP 1 rm. A los 1 O minutos, medidos con exactitud, después de agre-
gar la solución de cloruro férrico y alcohol deshidratado, determinar la absorbancia a 520 nm con un espectrofotómetro ade-
cuado, usando alcohol deshidratado como blanco. Realizar una determinación con un blanco con las mismas cantidades de los
mismos reactivos y de la misma manera, pero usando 2 mL de alcohol deshidratado en lugar de 2 mL de la solución hidroge-
nada. Restar la absorbancia determinada para el blanco de la determinada para la muestra de valoración y designar la diferen-
cia como AD.
Calcular el contenido de alfa tocoferol, en mg, de la muestra de valoración tomada, por la fórmula:

en donde An es la absorbancia corregida; L es el largo, en cm, de la celda de absorción; y CD es el contenido de la muestra de

valoración en la solución de alcohol empleada para la medición de la absorbancia, expresado en g, cápsulas o tabletas por
100 mL.

(561) ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

MUESTREO
Con el fin de reducir el efecto de la desviación sistemática de muestreo en los resultados cualitativos y cuantitativos, es nece-
sario asegurar que la composición de la muestra usada sea representativa de la partida de material que está siendo examinada.
Los procedimientos de muestreo siguientes son el mínimo que se considera aplicable a artículos de origen vegetal. Algunos
artículos o algunas pruebas pueden requerir procedimientos más rigurosos que involucren el muestreo de más envases o de
más muestras por envase.

Muestra Bruta

Cuando el examen externo de envases, marcas y etiquetas indica que la partida se puede considerar homogénea, tomar
muestras individuales del número de envases seleccionados de forma aleatoria que se indica a continuación. Cuando la partida
no se puede considerar homogénea, dividirla en subpartidas que sean tan homogéneas como sea posible y, a continuación,
muestrear cada una como una partida homogénea. Cuando el número de envases en la partida (N) es 11 o más y cada envase
de la partida está marcado en orden con un número o una letra, se recomienda incluir muestras de los envases primero, inter-
medio y último.
Nº de Envases Nº de Envases
en la Partida (N) que Deben Ser Muestreados (n)
1-10 Todos
11-19 11
>19 n = 1 O + (N/l O)

(Redondear "n" al siguiente número entero más alto.)

Las muestras se toman de las secciones superior, media e inferior de cada envase. Si el material sin procesar está formado
por partes componentes que tienen 1 cm o menos en cualquier dimensión, y en el caso de todos los materiales molidos o en
polvo, retirar la muestra por medio de un dispositivo de muestreo que quite un centro de la parte superior a la inferior del
envase, tomando no menos de dos centros desde ángulos diferentes. Para materiales con partes componentes de más de 1 cm
en cualquier dimensión, retirar las muestras manualmente. En el caso de fardos o paquetes grandes, las muestras se deben
tomar a una profundidad de 1 Ocm porque el contenido de humedad de la capa superficial puede ser diferente del de las ca-
pas interiores.
Preparar la muestra bruta combinando y mezclando las muestras individuales tomadas de cada envase abierto, teniendo cui-
dado de no aumentar el grado de fragmentación ni de afectar significativamente el contenido de humedad.
Para artículos en envases que contienen menos de 1 kg, mezclar el contenido y retirar una cantidad suficiente para las prue-
bas. Para artículos en envases que contienen entre 1 y 5 kg, retirar porciones iguales de la parte superior, media e inferior del
envase, de modo que cada una de las muestras sea suficiente para realizar las pruebas. Mezclar meticulosamente las muestras
y retirar una cantidad suficiente para realizar las pruebas. Para envases que contienen más de 5 kg, retirar tres muestras, de
modo que cada una pese no menos de 250 g, de la parte superior, media e inferior del envase. Mezclar minuciosamente las
muestras y retirar una porción suficiente para realizar las pruebas.
 USP 37 Pruebas Químicos/ (561) Artículos de Origen Botánico 297

Muestra de Laboratorio

Preparar la muestra de laboratorio por cuarteo repetido de la muestra bruta.

NOTA-La reducción de muestra por cuarteo consiste en la distribución pareja de la muestra, adecuadamente mezclada, en
la forma de un cuadrado, y la posterior división por las diagonales en cuatro partes iguales. Luego se toman las dos partes
opuestas y se mezclan cuidadosamente. El proceso se repite según sea necesario hasta obtener la cantidad requerida.
La muestra de laboratorio debe ser de un tamaño suficiente como para realizar todas las pruebas necesarias.

Muestra de Prueba

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual o en el procedimiento de prueba siguiente, preparar la
muestra de prueba según se indica a continuación.
Reducir por cuarteo el tamaño de la muestra de laboratorio, teniendo cuidado de que cada una de las porciones retiradas
continúe siendo representativa. En el caso de artículos sin moler o que no se presentan en polvo, moler la muestra tomada de
modo que pase a través de un tamiz de malla estándar Nº 20 y mezclar bien el polvo resultante. Si el material no se puede
moler, reducirlo a un estado tan fino como sea posible, mezclarlo haciéndolo rodar sobre un papel o paño de muestreo, exten-
derlo hasta formar una capa delgada y retirar la porción para analizar.

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Materia Orgánica Extraña

Muestra de Prueba-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, pesar las cantidades siguien-
tes de la muestra de laboratorio, teniendo cuidado de que la porción tomada sea representativa (reducir la muestra por cuar-
teo si fuera necesario).

Raíces, rizomas, corteza y hierbas 500 g

Hojas, flores, semillas y frutos 250 g
Cortar los fármacos vegetales (el peso promedio de las piezas es menos de 0,5 g) 50 g

Extender la muestra hasta formar una capa delgada y separar a mano la materia orgánica extraña tanto como sea posible.
Pesar y determinar el porcentaje de materia orgánica extraña en el peso del artículo tomado.

Cenizas Totales

Pesar con exactitud, en un crisol tarado, una cantidad de la Muestra de Prueba, que represente 2-4 g del material secado al
aire e incinerar, suavemente al principio, y aumentar gradualmente la temperatura a 675 ± 25º, hasta que no quede carbón y
determinar el peso de la ceniza. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, extraer la masa carbonizada con agua
caliente, recoger el residuo insoluble en un papel de filtro exento de ceniza, incinerar el residuo y el papel de filtro hasta que la
ceniza quede blanca o casi blanca, luego agregar el filtrado, evaporar hasta sequedad y calentar todo a una temperatura de
675 ± 25º. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, enfriar el crisol, agregar 15 mL de alcohol, deshacer la ceni-
za con una varilla de vidrio, quemar el alcohol y volver a calentar todo a una temperatura de 675 ± 25º. Enfriar en un deseca-
dor, pesar la ceniza y calcular el porcentaje de ceniza total con referencia al peso del artículo tomado.

Cenizas Insolubles en Ácido

Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica anteriormente en Cenizas Totales con 25 mL de ácido clorhídrico 3 N
durante 5 minutos, recoger la materia insoluble en un crisol de filtrado tarado o un filtro exento de ceniza, lavar con agua
caliente, incinerar y pesar. Determinar el porcentaje de ceniza insoluble en ácido calculada con referencia al peso del artículo
tomado.

Cenizas Solubles en Agua

Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica en Cenizas Totales con 25 mL de agua durante 5 minutos. Recoger la
materia insoluble en un crisol de vidrio sinterizado o sobre un papel de filtro exento de ceniza. Lavar con agua caliente e inci-
nerar durante 15 minutos a una temperatura que no exceda de 450º. Restar el peso de este residuo, en mg, obtenido en
Cenizas Totales, y calcular el porcentaje de ceniza soluble en agua con referencia al peso de la muestra según se determinó en
Cenizas Totales.
 298 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

Extractos Solubles en Alcohol

Método 1 (método de extracción en caliente)-Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en

polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol y pesar el matraz. Agitar y
dejar en reposo durante 1 hora. Acoplar un condensador de reflujo al matraz y calentar a ebullición suave durante 1 hora,
enfriar y pesar. Volver a ajustar al peso original con alcohol. Agitar y filtrar rápidamente a través de un filtro seco. Transferir
25 ml del filtrado a una cápsula tarada de fondo plano y evaporar en un baño de agua hasta sequedad. Secar a 105º durante
6 horas, enfriar en un desecador durante 30 minutos y pesar sin demora. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extraíble
en alcohol en la muestra de prueba.
Método 2 (método de extracción en frío )-Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo
grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol, tapar el matraz y macerar du-
rante 24 horas, agitando frecuentemente durante las primeras 8 horas y, a continuación, dejar en reposo. Filtrar rápidamente,
procurando no perder alcohol. Evaporar 25 ml del filtrado hasta sequedad en una cápsula tarada, poco profunda y de fondo
plano, y secar a 105º hasta peso constante. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extraíble en alcohol en la muestra de
prueba.

Extractos Solubles en Agua

Método 1 (método de extracción en caliente)-Proceder según se indica en el Método 7 (método de extracción en calien-
te) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe usar agua en lugar de alcohol.
Método 2 (método de extracción en frío)-Proceder según se indica en el Método 2 (método de extracción en frío) en
Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe usar agua en lugar de alcohol.

Fibra Cruda

Agotar una cantidad pesada de la Muestra de Prueba, que represente aproximadamente 2 g del artículo, con éter. Agregar
200 ml de ácido sulfúrico diluido en ebullición (1 en 78) al residuo agotado con éter, en un matraz de 500 mL, y conectar el
matraz a un condensador de reflujo. Calentar a reflujo la mezcla durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, luego pa-
sar a través de un filtro de tela o papel endurecido y lavar el residuo en el filtro con agua hirviendo hasta que el lavado efluente
ya no sea ácido. Volver a colocar el residuo en el matraz enjuagando con 200 mL de solución de hidróxido de sodio en ebulli-
ción, ajustada a 1,25% por valoración volumétrica y sin carbonato de sodio. Someter a reflujo nuevamente la mezcla durante
30 minutos, cronometrados con exactitud, y luego, pasar rápidamente a través de un filtro tarado, lavar el residuo con agua
hirviendo hasta que el último lavado sea neutro y secar a 11 Oº hasta peso constante. Incinerar el residuo seco hasta peso cons-
tante, enfriar en un desecador y pesar la ceniza: la diferencia entre el peso obtenido mediante el secado a 11 Oº y el de la ceni-
za representa el peso de fibra cruda.
NOTA-La ebullición con ácido y álcali debe continuar durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, desde el momen-
to en que el líquido (que se enfría por debajo del punto de ebullición al agregarlo al matraz frío) vuelve a alcanzar su punto de
ebullición. Después de llevar la solución al punto de ebullición, se debe disminuir el calor lo suficiente como para mantener la
ebullición. Durante la ebullición, el matraz se debe rotar suavemente a intervalos regulares para reincorporar a la solución toda
partícula que pueda adherirse a las paredes del matraz. Una corriente de aire suave introducida en el matraz durante la opera-
ción de ebullición ayuda a evitar la formación excesiva de espuma.

Contenido de Almidón

Método 1-EI siguiente es un procedimiento general para todos los azúcares reductores y se puede utilizar para determinar
el contenido de almidón en artículos botánicos.
Extracto de Malta-Usar malta de cebada nueva, limpia y de eficacia conocida y moler inmediatamente antes de usar. Pre-
parar el extracto de malta inmediatamente antes de usar. Por cada 80 mL de extracto de malta que se necesiten, digerir 5 g de
malta molida con 100 mL de agua a temperatura ambiente durante 2 horas. [NOTA-Si se usa un mezclador eléctrico, mezclar
durante 20 minutos.] Filtrar para obtener un extracto transparente, volver a filtrar, si fuera necesario, y mezclar bien la infusión.
Solución de Prueba-Extraer aproximadamente 5 g de la muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 1O mL
de éter, usando un filtro que retenga completamente el gránulo de almidón más pequeño. Dejar evaporar el éter del residuo y
lavar con 250 mL de solución de alcohol acuosa (1 O en 100). Lavar cuidadosamente el residuo del papel y verterlo en un vaso
de precipitados de 500 mL con aproximadamente 100 mL de agua. Calentar aproximadamente a 60º (evitando, si es posible,
gelatinizar el almidón) y dejar en reposo durante aproximadamente 1 hora, mezclando frecuentemente para lograr una disolu-
ción completa de los azúcares. Transferir a un frasco de boca ancha, enjuagar el vaso de precipitados con un poco de agua
tibia y enfriar. Agregar un volumen equivalente de alcohol, mezclar y dejar en reposo durante no menos de 1 hora.
Centrifugar hasta que el precipitado quede bien compacto en el fondo del frasco y decantar el sobrenadante. Lavar el preci-
pitado con porciones sucesivas de 50 mL de solución de alcohol (50 en 100) centrifugando y decantando a través de un filtro
adecuado hasta que los lavados estén exentos de azúcar. [NOTA-Para comprobar la presencia de azúcar, transferir unas gotas
USP 37 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 299

de los lavados a un tubo de ensayo, agregar 3 ó 4 gotas de una solución de 1-naftol en alcohol al 20%, preparada por disolu-
ción de 200 mg de 1-naftol en 1 mL de alcohol y 2 mL de agua. Agitar bien el tubo de ensayo para que la mezcla quede uni-
forme, dejar fluir entre 2-4 mL de ácido sulfúrico por las paredes del tubo de ensayo y sostener el tubo de ensayo en posición
vertical. Si hay presencia de azúcar, la interfase de los dos líquidos pasa de color violeta claro a violeta oscuro, y al agitar toda
la solución se torna violeta azulado.]
Transferir el residuo del frasco y del filtro endurecido a un vaso de precipitados con aproximadamente 50 mL de agua. Su-
mergir el vaso de precipitados en agua hirviendo y mezclar constantemente durante 15 minutos o hasta que se gelatinice todo
el almidón. Enfriar el vaso de precipitados a 55º, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a esta temperatura durante 1
hora. Volver a calentar a ebullición durante algunos minutos, enfriar a 55º, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a
esta temperatura durante 1 hora o hasta que el residuo, cuando se trata con yodo SR, no muestre un matiz azulado en el exa-
men microscópico. Enfriar, diluir con agua hasta 250 mL y filtrar.
Procedimiento General-Transferir 200 mL de la Solución de Prueba a un matraz equipado con un condensador de reflujo,
agregar 20 mL de ácido clorhídrico y calentar en un baño de agua hirviendo durante 2 1/2 horas. Enfriar, llevar a pH casi neutro
con hidróxido de sodio SR, completar la neutralización con carbonato de sodio SR, diluir con agua hasta 500 mL, mezclar y
filtrar. El volumen de la alícuota tomada depende del contenido de almidón de la muestra en análisis (ver la Tabla 7). La alícuo-
ta debería contener entre 100 y 200 mg de dextrosa. Transferir 50 mL del filtrado a un vaso de precipitados de vidrio de
400 mL resistente a los álcalis, agregar 50 mL de tartrato cúprico alcalino SR, cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de
reloj y calentar. Ajustar la llama del quemador para que el contenido del matraz comience a hervir en 4 minutos y continuar la
ebullición durante 2 minutos exactos. Filtrar la solución caliente de inmediato a través de un filtro de vidrio sinterizado. Lavar
minuciosamente el precipitado de óxido cuproso con agua aproximadamente a 60º, luego con 1O mL de alcohol y finalmente
con 1O mL de éter.
Tabla 1. Determinación de la Alícuota Óptima
Contenido de Almidón Esperado Alícuota
(%) (ml)
60 25
50 35
40 50
30 50
20 50

Para soluciones de azúcares reductores de relativamente alta pureza, proceder según se indica en el Método 7A para determi-
nar la cantidad de cobre reducido obtenido pesando el óxido cuproso seco. Para soluciones de azúcares reductores que contie-
nen grandes cantidades de impurezas orgánicas, incluida sacarosa, proceder según se indica en el Método 1B para determinar
la cantidad de cobre reducido obtenido por valoración volumétrica con tiosulfato de sodio.
MÉTODO lA-Secar el precipitado obtenido en el Procedimiento General en un horno durante 30 minutos a 11O±2º, enfriar a
temperatura ambiente en un desecador y pesar. Consultar la Tabla 2 para obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspon-
diente al peso del óxido cuproso hallado. Determinar el porcentaje de dextrosa y, luego, el contenido de almidón por la si-
guiente fórmula:
Porcentaje de dextrosa= (peso de dextrosa en mg x O, 1 x 500)/(peso de la muestra en g x alícuota en mL)
Contenido de almidón=% de dextrosa x 0,9

Tabla 2 Cálculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu'? O) (Expresado en mg)
Óxido Dextro- Óxido Dextro- Óxido Óxido Óxido Dextro- Óxido Dextro-
Cu pro- sa Cu pro- sa Cu pro- Dextrosa Cu pro- Dextrosa Cu pro- sa Cu pro- sa
so (o-Glu- so (o-Glu- so (o-Gluco- so (o-Gluco- so (o-Glu- so (o-Glu-
(Cu 7 0) cosa) (Cu 7 0) cosa) (Cu 7 0) sa) (Cu 7 0) sa) (Cu 70) cosa) (Cu,O) cosa)
10 4,0 90 38,9 170 75, 1 250 112,8 330 152,2 410 193,7
12 4,9 92 39,8 172 76,0 252 113,7 332 153,2 412 194,7
14 5,7 94 40,6 174 76,9 254 114,7 334 154,2 414 195,8
16 6,6 96 41,5 176 77,8 256 115,7 336 155,2 416 196,8
18 7,5 98 42,4 178 78,8 258 116,6 338 156,3 418 197,9

20 8,3 100 43,3 180 79,7 260 117,6 340 157,3 420 199,0
22 9,2 102 44,2 182 80,6 262 118,6 342 158,3 422 200,1
24 10,0 104 45,1 184 81,5 264 119,5 344 159,3 424 201,1
26 10,9 106 46,0 186 82,5 266 120,5 346 160,3 426 202,2
28 11,8 108 46,9 188 83,4 268 121,5 348 161,4 428 203,3
 300 (561) Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas USP 37

Tabla 2 Cálculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu,, O) (Expresado en mg) (Continuación)
Óxido Dextro- Óxido Dextro- Óxido Óxido 1 Óxido Dextro- Óxido Dextro-
Cu pro- sa Cu pro- sa Cu pro- Dextrosa Cu pro- Dextrosa 1 Cu pro- sa Cu pro- sa
so (D-Glu- so (D-Glu- so (D-Gluco- so (o-Gluco- so (D-Glu- so (o-Glu-
(Cu,O) cosa) (Cu,O) cosa) (Cu,O) sa) (Cu,O) sa) (Cu,O) cosa) (Cu 7 0) cosa)
30 12,6 11 o 47,8 190 84,3 270 122,5 350 162,4 430 204,4
32 13,5 112 48,7 192 85,3 272 123,4 352 163,4 432 205,5
34 14,3 114 49,6 194 86,2 274 124,4 354 164,4 434 206,5
36 15,2 116 50,5 196 87, 1 276 125,4 356 165,4 436 207,6
38 16, 1 118 51,4 198 88,1 278 126,4 358 166,5 438 208,7

40 16,9 120 52,3 200 89,0 280 127,3 360 167,5 440 209,8
42 l 7,8 122 53,2 202 89,9 282 128,3 362 168,5 442 210,9
44 18,7 124 54, 1 204 90,9 284 129,3 364 169,6 444 212,0
46 19,6 126 55,0 206 91,8 286 130,3 366 170,6 446 213,1
48 20,4 128 55,9 208 92,8 288 131,3 368 171,6 448 214,1

50 21,3 130 56,8 210 93,7 290 132,3 370 172,7 450 215,2
52 22,2 132 57,7 212 94,6 292 133,2 372 173,7 452 216,3
54 23,0 134 58,6 214 95,6 294 134,2 374 174,7 454 217,4
56 23,9 136 59,5 216 96,5 296 135,2 376 175,8 456 218,5
58 24,8 138 60,4 218 97,5 298 136,2 378 176,8 458 219,6

60 25,6 140 61,3 220 98,4 300 137,2 380 177,9 460 220,7
62 26,5 142 62,2 222 99,4 302 138,2 382 178,9 462 221,8
64 27,4 144 63,1 224 100,3 304 139,2 384 180,0 464 222,9
66 28,3 146 64,0 226 101,3 306 140,2 386 181,0 466 224,0
68 29,2 148 65,0 228 102,2 308 141,2 388 182,0 468 225,1

70 30,0 150 65,9 230 103,2 310 142,2 390 183, 1 470 226,2
72 30,9 152 66,8 232 104,1 312 143,2 392 184,1 472 227,4
74 31,8 154 67,7 234 105,1 314 144,2 394 185,2 474 228,3
76 32,7 156 68,6 236 106,0 316 145,2 396 186,2 476 229,6
78 33,6 158 69,5 238 107,0 318 146,2 398 187,3 478 230,7

80 34,4 160 70,4 240 108,0 320 147,2 400 188,4 480 231,8
82 35,3 162 71,4 242 108,9 322 148,2 402 189,4 482 232,9
84 36,2 164 72,3 244 109,9 324 149,2 404 190,5 484 234,1
86 37, 1 166 73,2 246 110,8 326 150,2 406 191,5 486 235,2
88 38,0 168 74,1 248 111,8 328 151,2 408 192,6 488 236,3

MÉTODO lB-
Solución de Tiosulfato de Sodio-Transferir 3,9 g de tiosulfato de sodio, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de
100 ml, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar.
Solución de Yoduro de Potasio-Disolver 42 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua.
Solución de Acetato de Sodio-Disolver 5,74 g de acetato de sodio en 1O ml de agua.
Solución de Cobre-Transferir aproximadamente 0,3 g de cobre electrolítico puro, pesados con exactitud, a un matraz de
250 ml, agregar 5 ml de ácido nítrico para disolver el cobre, agregar aproximadamente 25 ml de agua y calentar a ebullición
para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 ml de bromo SR y calentar a ebullición hasta eliminar completamente
el bromo. Enfriar, agregar 1O ml de Solución de Acetato de Sodio seguidos de 1 O ml de Solución de Yoduro de Potasio y valorar
con la Solución de Tiosulfato de Sodio hasta obtener un color amarillo claro. Agregar suficiente almidón SR para producir un
marcado color azul y continuar con la valoración. A medida que se aproxima el punto final, agregar 2 g de tiocianato de pota-
sio y mezclar hasta disolver completamente. Continuar la valoración hasta que el precipitado quede totalmente blanco. Un ml
de solución de tiosulfato de sodio equivale aproximadamente a 1 O mg de cobre. [NOTA-Es esencial que la concentración de la
Solución de Yoduro de Potasio se regule cuidadosamente. Si la solución contiene menos de 320 mg de cobre al finalizar la volu-
metría, agregar 4,2-5 g de yoduro de potasio para obtener una solución total de 1 00 ml. Si hay presentes cantidades mayores
 USP 37 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 301

de Cu, agregar lentamente Solución de Yoduro de Potasio desde una bureta con agitación constante en cantidades proporcio-
nalmente mayores.]
Procedimiento-Lavar con agua el precipitado de óxido cuproso obtenido en el Prorpdimipntn GPnPral, rnbrir estP filtro con
un vidrio de reloj y disolver el óxido cuproso con 5 mL de ácido nítrico vertidos con una pipeta por debajo del vidrio de reloj.
Recoger el filtrado en un matraz de 250 mL, lavar el vidrio de reloj y el filtro con agua. Recoger todos los lavados en el matraz.
Calentar a ebullición el contenido del matraz para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 mL de bromo SR y ca-
lentar a ebullición hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar y proceder según se indica en Solución de Cobre comenzan-
do donde dice "agregar 1 O mL de Solución de Acetato de Sodio". A partir del volumen de Solución de Tiosulfato de Sodio consu-
mido, obtener el peso de cobre, en mg, multiplicándolo por 1, 1259 para obtener el peso, en mg, de óxido cuproso. Basándo-
se en la Tabla 2, obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso de óxido cuproso. El contenido de almidón
equivale al peso, en mg, de dextrosa obtenida multiplicado por 0,9. Realizar una determinación con un blanco usando 50 mL
de tartrato cúprico alcalino SR y 50 mL de Extracto de Malta. Si el peso del óxido cuproso así obtenido excede 0,5 mg, corregir
el resultado de la determinación de forma adecuada. [NOTA-El tartrato cúprico alcalino SR se deteriora en reposo y la canti-
dad de óxido cuproso obtenida en la determinación con un blanco aumenta.]
Método 2-EI método siguiente es específico para la dextrosa (glucosa) y, dado que es extremadamente sensible, puede
explicar las diferencias detectadas entre valores obtenidos a partir de una misma muestra. Las determinaciones duplicadas no
varían en más de 2%.
Solución de Glucoamilasa-Preparar una solución de glucoamilasa en agua que contenga 30 Unidades Internacionales
(Ul)/mL. Usar glucoamilasa obtenida preferentemente de Rhizopus delemar. El total de actividad de glucoamilasa en la muestra
de prueba utilizada debe ser no menos de 150 UI.
Solución Amortiguadora de Acetato-Disolver 16,4 g de acetato de sodio en 100 mL de agua, agregar 12,0 mL de ácido acé-
tico glacial y mezclar. El pH de esta solución es 4,8.
Solución Amortiguadora de Fosfato-Disolver 3,63 g de tris (hidroximetil) aminometano y 5,0 g de fosfato monobásico de
sodio en 50,0 mL de agua. Ajustar con ácido fosfórico a un pH de 7,0 a una temperatura de 37°, diluir con agua hasta
100,0 mL y mezclar. [NOTA-El pH del medio de la solución amortiguadora es sensible a la temperatura y se debe ajustar al pH
deseado a la temperatura que se utilizará durante la incubación.]
Solución Enzimática-Disolver 30 mg de glucosa oxidasa (Tipo 11 de Aspergillus niger), 3 mg de peroxidasa (Tipo 1 de rábano
picante) y 1 O mg de ferrocianuro de potasio en 100 mL de Solución Amortiguadora de Fosfato. [NOTA-Esta mezcla se puede
almacenar en un refrigerador durante un período de hasta 1 O días.]
Ácido Sulfúrico 78 N-Agregar lentamente, mezclando, 54 mL de ácido sulfúrico a 1 02 mL de agua, dejar que se enfríe a 25º
y mezclar.
Soluciones Estándar-Disolver una cantidad pesada con exactitud de ER Dextrosa USP en agua para obtener una solución
que contenga 1,0 mg de ER Dextrosa USP por mL. Diluir cuantitativamente un volumen conocido de esta solución en agua
para obtener las Soluciones Estándares A, B, C, O y E, con concentraciones conocidas de 1O, 20, 25, 40 y 50 µg/mL de ER Dex-
trosa USP, respectivamente. [NOTA-Esperar 4 horas para que termine la mutarrotación antes de usar.]
Soluciones de Prueba-Extraer aproximadamente 5 g de muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 25 mL
de alcohol al 80% y filtrar. Eliminar todo el alcohol del residuo mediante secado en un horno de aire a 105º durante aproxima-
damente 8 horas. [NOTA 1-Cualquier traza de alcohol que quede en el residuo inhibirá la glucoamilasa.] Enfriar y transferir el
matraz que contiene la muestra de prueba seca a un desecador. Transferir aproximadamente 1 g de la muestra de prueba,
pesado con exactitud, a un matraz previamente tarado, agregar 25 mL de agua y ajustar con ácido fosfórico a un pH entre
5,0-7,0; si fuera necesario. Calentar a ebullición la suspensión durante aproximadamente 3 minutos, transferir el matraz a un
autoclave y calentar a 1 35º durante 2 horas. Retirar el matraz del autoclave, mantener la temperatura próxima a 55º y agregar
2,5 mL de Solución Amortiguadora de Acetato y agua suficiente para ajustar el peso total de la solución a 45 ± 1 g. Sumergir el
matraz en un baño de agua mantenido a 55 ± 1 ºy agregar 5 mL de Solución de Glucoamilasa. Agitar el matraz por rotación
suave y de forma continua durante 2 horas para lograr la hidrólisis, pasar a través de un papel de filtro a un matraz volumétri-
co de 250 mL, lavar cuantitativamente con agua y recoger todos los lavados en el matraz. Diluir el contenido del matraz con
agua a volumen y mezclar. Transferir 1 mL de una alícuota que contenga entre 20-60 ~tg de o-glucosa a cada uno de cinco
tubos de ensayo. [NOTA 2-Para obtener el intervalo de concentración de glucosa en el hidrolizado, diluir cuantitativamente
con agua a volumen, si fuera necesario.] Agregar 2 mL de Solución Enzimática a cada uno de los cinco tubos de ensayo y colo-
carlos en la oscuridad a 37±1 ºdurante exactamente 30 minutos para que se forme el color. Una vez transcurridos los 30 mi-
nutos, agregar 2 mL de Ácido Sulfúrico 78 Na cada uno de los tubos de ensayo para detener la reacción y mezclar.
Solución Control-Transferir una cantidad pesada con exactitud de aproximadamente 0,4 g de almidón a un matraz tarado
previamente y proceder según se indica en Soluciones de Prueba, comenzando donde dice "agregar 25 mL de agua y ajustar el
pH con ácido fosfórico".
Procedimiento-Determinar concomitantemente las absorbancias de las Soluciones Estándar y las Soluciones de Prueba a la
longitud de onda de absorbancia máxima aproximadamente a 540 nm, con un espectrofotómetro apropiado, utilizando la
Solución Control como blanco para ajustar el instrumento. Graficar los valores de absorbancia de las Soluciones Estándar en fun-
ción de la concentración, en ~tg/mL, de dextrosa, y trazar la línea recta que mejor se ajuste a los cinco puntos graficados. A
partir de la gráfica así obtenida, determinar la concentración, C, en µg/mL, de dextrosa en cada una de las Soluciones de Prueba
y calcular la concentración promedio, en ~tg/mL, de la solución en análisis. El porcentaje del contenido de almidón en el peso
de la muestra de prueba tomada se calcula por la fórmula:
 302 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

(O, 9C/l 0 6 )(V 1)(250/V0 )(100/ E)(l 00/ VII) = 2,25CV¡/V0 EW

en donde E es el peso, en g, de la muestra de prueba tomada; Vn es el volumen, en mL, de la alícuota tomada del matraz
volumétrico de 250 mL; W es el porcentaje de peso en seco de la muestra de prueba; y V1 es el volumen, en mL, si se realiza
una dilución adicional (ver Nota 2 en Soluciones de Prueba). [NOTA-V0 es 1,0 cuando no se realiza ninguna dilución adicional.]

Determinación de Aceite Volátil

Colocar un matraz de 1 L de fondo redondo y cuello corto en un manto de calentamiento sobre un mezclador magnético.
Introducir en el matraz una barra de agitación magnética de forma ovoide y acoplar un condensador de tubo enfriado por
agua y una trampa para aceite volátil apropiada del tipo que se ilustra.

Graduado= Graduado -
O, 1 mL - 0,1 mL

Para aceites más Para aceites más

livianos que el agua pesados que el agua

Trampas para Aceite Volátil

Triturar en granos gruesos una cantidad suficiente del artículo para producir entre 1 y 3 mL de aceite volátil. Normalmente
no es necesario triturar semillas, frutos pequeños u hojas quebradas de hierbas. Se deben evitar los polvos muy finos. Si esto no
fuera posible, puede que sea necesario mezclarlos con serrín purificado o arena purificada. Colocar una cantidad adecuada del
artículo, pesada con exactitud, en un matraz y llenarlo con agua hasta la mitad. Acoplar el condensador y el separador adecua-
do. Calentar a ebullición el contenido del matraz, con una cantidad adecuada de calor para mantener una ebullición suave
durante 2 horas, o hasta que el aceite volátil se haya separado completamente del artículo y ya no se recoja en el tubo gradua-
do del separador.
Si se ha obtenido una cantidad adecuada de aceite volátil en el tubo graduado del separador, se puede leer en décimos de
1 mL, y se puede calcular el volumen de aceite volátil por cada 1 00 g del artículo usando el peso del artículo tomado para el
análisis. Las graduaciones en el separador "para aceites más pesados que el agua" se colocan de manera que el aceite perma-
nezca por debajo del condensado acuoso que fluye automáticamente de regreso al matraz.

Contenido de Agua

Para artículos sin moler o que no se presentan en polvo, preparar aproximadamente 1 O g de la Muestra de Laboratorio cor-
tando, granulando o desmenuzando de modo que las partes tengan aproximadamente 3 mm de grosor. Las semillas o los fru-
tos más pequeños de 3 mm deben partirse. Evitar el uso de molinos de alta velocidad para preparar la muestra. Procurar que
no se pierda una cantidad apreciable de humedad durante la preparación y que la porción tomada sea representativa de la
Muestra de Laboratorio. Determinar el contenido de agua según se indica en Procedimiento para Artículos de Origen Botánico en
Determinación de Agua (921 ), Método 111 (Gravimétrico).

PRUEBA DE AFLATOXINAS

[Precaución-Las aflatoxinas son muy peligrosas, por lo que se debe tener sumo cuidado cuando se manipulan materiales que contie-
nen aflatoxinas.]
Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g
para aflatoxina B, (AFB,) y no más de 20 ng/g para la suma de aflatoxinas B1 (AFB,), B2 (AFB 2 ), G, (AFG 1) y G2 (AFG 2). Se puede
usar un enfoque basado en el riesgo de contaminación para determinar el alcance de Ja prueba. Al determinar el cumplimien-
to, se considera Ja presencia inesperada de aflatoxinas. Se proporcionan Jos siguientes procedimientos analíticos para determi-
 USP 37 Pruebas Químicas/ (561 >Artículos de Origen Botánico 303

nar el cumplimiento. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l. Si la aptitud del
sistema no cumple con los requisitos, usar el Método 11 o el Método 111.

Método 1

La prueba de TLC se suministra para detectar la posible presencia de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2 en cualquier material de origen
vegetal.
Reactivo de Acetato de Cinc-Cloruro de Aluminio-Disolver 20 g de acetato de cinc y 5 g de cloruro de aluminio en agua
suficiente para obtener 100 mL.
Solución de Cloruro de Sodio-Disolver 5 g de cloruro de sodio en 50 mL de agua.
Solución de Prueba 1-Moler aproximadamente 200 g de material vegetal para formar un polvo fino. Transferir aproxima-
damente 50 g pesados con exactitud de material en polvo a un matraz con tapón de vidrio. Agregar 200 mL de una mezcla de
metanol y agua (1 7:3). Agitar mecánicamente en forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. [NOTA-Si la solu-
ción contiene pigmentos vegetales que interfieren, proceder según se indica para la Solución de Prueba 2.] Desechar los prime-
ros 50 mL del filtrado y recoger la porción siguiente de 40 ml. Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 40 mL
de Solución de Cloruro de Sodio y 25 mL de éter de petróleo y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transfe-
rir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separación. Extraer dos veces la capa acuosa en el embudo de separación,
cada vez con 25 mL de cloruro de metileno, agitando durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la
capa orgánica inferior y recoger las capas orgánicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Evaporar el disolvente
orgánico en un baño de agua. Transferir el extracto remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en
un baño de agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica para Procedimiento de
Limpieza en Solución de Prueba 2; de lo contrario, disolver el residuo obtenido anteriormente en 0,2 mL de una mezcla de clo-
roformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamente si fuera necesario.
Solución de Prueba 2-Recoger 100 mL de filtrado del inicio del flujo y transferir a un vaso de precipitados de 250 ml.
Agregar 20 mL de Reactivo de Acetato de Cinc-Cloruro de Aluminio y 80 mL de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minu-
tos. Agregar 5 g de un coadyuvante de filtración adecuado, como por ejemplo tierra de diatomeas, mezclar y filtrar. Desechar
los primeros 50 mL del filtrado y recoger la porción siguiente de 80 mL. Proceder según se indica para la Solución de Prueba 1,
comenzando donde dice "Transferir el filtrado a un embudo de separación".
Procedimiento de Limpieza-Colocar un disco de vidrio sinterizado de porosidad media o un tapón de lana de vidrio en el
fondo de un tubo cromatográfico de 1 O mm x 300 mm. Preparar una suspensión espesa de 2 g de gel de sílice con una mezcla
de éter etílico y éter de petróleo (3:1 ), verter la suspensión espesa en la columna y lavar con 5 ml de la misma mezcla de
disolventes. Dejar que el absorbente sedimente y agregar a la parte superior de la columna una capa de 1,5 g de sulfato de
sodio anhidro. Disolver el residuo obtenido anteriormente en 3 mL de cloruro de metileno y transferir a la columna. Enjuagar el
matraz dos veces con porciones de 1 mL de cloruro de metileno, transferir los enjuagues a la columna y eluir a una velocidad
de no más de 1 mL/min. Agregar sucesivamente a la columna 3 mL de éter de petróleo, 3 mL de éter etílico y 3 mL de cloruro
de metileno, eluir a una velocidad de no más de 3 mL/min y desechar los eluatos. Agregar a la columna 6 mL de una mezcla
de cloruro de metileno y acetona (9:1) y eluir a una velocidad de no más de 1 mL/min, preferentemente sin la ayuda de vacío.
Recoger este eluato en un vial pequeño, agregar una perla de ebullición si fuera necesario y evaporar hasta sequedad en un
baño de agua. Disolver el residuo en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamente si
fuera necesario.
Solución de Prueba 3-Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con
IAC en Solución de Prueba en Método 11.
Solución de Aflatoxinas-[Precaución-Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado.] Diluir el ER Aflatoxinas USP
1 :5 con acetonitrilo para obtener una solución con una concentración de 0,4 µg/mL de AFB 1 y de AFG 1 , y O, 1 µg/mL de AFB 2 y
de AFG 2 .
Procedimiento-Aplicar por separado 2,5; 5; 7,5 y 1 O µL de la Solución de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 1 O µL de la
Solución de Prueba 1, Solución de Prueba 2, o Solución de Prueba 3 a una placa adecuada para cromatografía en capa delgada
(ver Cromatografía (621)) recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm. Superponer 5 µL
de la Solución de Aflatoxinas a una de las tres aplicaciones de 1 O ~tl de la Solución de Prueba. Dejar que se sequen las aplicacio-
nes y desarrollar el cromatograma en una cámara no saturada que contenga una fase móvil constituida por una mezcla de
cloroformo, acetona y alcohol isopropílico (85:10:5) hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no menos de 15 cm
desde el origen. Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al
aire. Localizar las manchas en la placa bajo luz UV a 365 nm.
Aptitud del Sistema-Las cuatro aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluores-
centes separadas claramente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que concide en tono y ubicación
con aquéllas de la Solución de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas
superpuesta no es de menor intensidad que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente.
Criterios de Aceptación-Ninguna mancha de las aplicaciones de la Solución de Prueba corresponde a las manchas obteni-
das con las aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas. Si se obtiene alguna mancha de aflatoxinas en la Solución de Prueba, com-
parar la ubicación de cada mancha fluorescente de la Solución de Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el
tipo de aflatoxina presente. La intensidad de la mancha de aflatoxina, si estuviera presente en la Solución de Prueba, cuando se
 1

304 (561) Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas USP 37

compara con la de la aflatoxina correspondiente en la Solución de Aflatoxinas representa la concentración aproximada de afia-
toxina en la Solución de Prueba. Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los
límites son no más de 5 ng/g para AFB, y no más de 20 ng/g para la suma de AFB¡, AFB 2 , AFC 1 y AFC 2 , a menos que se especi-
fique algo diferente.

Método 11

Solución de Cloruro de Sodio-Ver Método l.

Solución Salina Amortiguada con Fosfato-Preparar una solución amortiguadora de fosfato 1 O mM que contenga cloruro
de sodio O, 138 M y cloruro de potasio 0,0027 M en agua, y ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4. 1
Columna de lnmunoafinidad (IAC, por sus siglas en inglés)-Antes de acondicionar, ajustar la IAC a temperatura am-
biente. Para acondicionar, aplicar 1 O mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato sobre la columna y dejar que fluya a través
de la columna por gravedad a una velocidad de 2-3 mL/min. Dejar 0,5 mL de la Solución Salina Amortiguada con Fosfato sobre
la parte superior de la columna hasta que se aplique la Solución de Prueba.
Solución de Prueba-
Extracción de la Muestra-Transferir aproximadamente 5 g de una muestra representativa en polvo, pesada con exactitud, a
un matraz con tapón de vidrio. Agregar 20 mL de una mezcla de metano! y agua (17:3). Agitar mecánicamente en forma vigo-
rosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. Desechar los primeros 5 mL del filtrado y recoger la porción siguiente de 4 ml.
Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 4 mL de Solución de Cloruro de Sodio y 2,5 mL de hexano y agitar
durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separación.
Extraer la capa acuosa en el embudo de separación dos veces, cada vez con 2,5 mL de cloruro de metileno, agitando durante
1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgánica inferior, y recoger las capas orgánicas combinadas
en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Evaporar el disolvente orgánico en un baño de agua. Transferir el extracto remanente a un
tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un baño de agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias en el
residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC. De otra manera, disolver el residuo obtenido anterior-
mente en 200 ~tL de acetonitrilo y agitar mecánicamente, si fuera necesario.
Procedimiento de Limpieza con IAC-Disolver el residuo en 5 mL de una mezcla de metano! y agua (60:40) y luego diluir con
5 mL de agua. Aplicar este extracto sobre una IAC acondicionada. Enjuagar la IAC dos veces con 1 O mL de Solución Salina
Amortiguada con Fosfato y eluir lentamente con 2 mL de metano!. Evaporar el eluato con nitrógeno y disolver el residuo en
200 µL de acetonitrilo.
Solución de Aflatoxinas-[Precaución-Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado.] Diluir cuantitativamente el
ER Aflatoxinas USP 1 :50 con acetonitrilo para obtener una solución que contenga 0,04 µg/mL de AFB 1 y de AFG 1, y
0,01 µg/mL de AFB 2 y de AFC 2 .
Análisis-Aplicar por separado 5; 7,5 y 1O µL de Solución de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 1 O µL de la Solución de Prueba
a un placa para HPTLC adecuada (ver Cromatografía (621 )) recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromato-
grafía de 200 µm. Superponer 5 µL de Solución de Aflatoxinas sobre una de las tres aplicaciones de 1 O µL de la Solución de Prue-
ba. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en una cámara saturada que contenga una fase móvil
constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y agua (140:20:0,3) hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no
menos de 72 mm desde el origen (80 mm del borde inferior de la placa). Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el
frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire durante 5 minutos. Localizar las manchas en la placa mediante el
barrido de la densidad de fluorescencia (> 400 nm) bajo luz UV a 366 nm. Comparar la ubicación de cada mancha fluorescen-
te de la Solución de Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxinas presente. La concentración
de aflatoxinas en la Solución de Prueba se puede calcular a partir de la curva de· calibración obtenida de los datos de barrido
con Solución de Aflatoxinas.
Aptitud del Sistema-Las cuatro aplicaciones de Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescen-
tes separadas claramente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que coincida en tono y ubicación con
las de Solución de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas superpuesta no
es de menor intensidad que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente. La recuperación media de la cantidad agregada
conocida de AFB 1 y AFG 1 es no menos de 70%.
Criterios de Aceptación- Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los lí-
mites son no más de 5 ng/g para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2 , AFG 1 y AFG 2 , a menos que especifi-
que algo diferente.

Método 111

Se proporciona este método de prueba como un ejemplo para la detección de la presencia posible de AFB 1 y de aflatoxinas
totales (AF: suma de AFB 1, AFB 2 , AFG 1 y AFG 2 ). Se ha demostrado que este método es adecuado para ginseng y jengibre en
polvo. Se debe demostrar su aptitud para otros artículos de origen botánico.

1 Se puede obtener una mezcla de polvo adecuada en Sigma como PBS P-3813.
 USP 37 Pruebas Químicas / (561 > Artículos de Origen Botánico 305

Solución Amortiguadora de Fosfato O, 1 M-Disolver 8,69 g de fosfato disódico anhidro y 4,66 g de fosfato monosódico
anhidro o 5,36 g de fosfato monosódico monohidrato en 800 ml de agua, ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4,
agregar 1 O ml de polisorbato 20, y diluir ha'ita 1 1
Solución Salina Amortiguada con Fosfato-Preparar según se indica en el Método 11.
Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas-Preparar seis soluciones en sendos matraces volumétricos de 1 O ml se-
gún la Tabla 3. Diluir con una mezcla de metanol y agua (1 :1, v/v) a volumen. Almacenar en un refrigerador y equilibrar a
temperatura ambiente antes de su uso. Preparar las soluciones en el día de su uso.
Tabla 3. Preparación de Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas
Concentración Final de Aflatoxinas
de la Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas
Soluciones Estándar de Trabajo de ER Aflatoxinas USP (ng/ml)
Aflatoxinas (pl) AFB, AFB, AFG, AFG, 2:AF

-·--~-~--
1
--~---·----
- -
o -----~'---
o o o o o
2 12,5 0,25 0,0625 0,25 0,0625 0,625
3 25 0,5 O, 125 0,5 O, 125 1,25
4 50 1 0,25 1 0,25 2,5
5 100 2 0,5 2 0,5 5
6 200 4 1 4 1 10

Columna de lnmunoafinidad (IAC)2-Usar una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpos monoclonales de
reactividad cruzada con AFB 1, AFB 2 , AFG 1 y AFG 2 • Las columnas de inmunoafinidad tienen una capacidad mínima de no menos
de 100 ng de aflatoxinas totales y proporcionan una recuperación de no menos de 80% para AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2 cuando
se aplican 5 ng de AFBu de AFB 2 , de AFG 1 y de AFG 2 en 1 O ml de metanol al 1 0% en Solución Salina Amortiguada con Fosfato
(v/v).
Solución de Prueba-
Extracción-Pesar 5 g de una muestra de prueba representativa en un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 1 g de cloruro
de sodio y 25 ml de una mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300). Mezclar en un mezclador de vórtice
hasta que las partículas de muestra y el disolvente de extracción se mezclen bien. Agitar a 400 rpm durante 1 O minutos. Cen-
trifugar durante 1 O minutos a 7000 rpm (valor g = 5323 mm/s 2 ) o a una velocidad que pueda producir un pellet de residuos
firme. Pipetear y transferir de inmediato 7 ml a un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar 28 ml de Solución Amortiguadora de
Fosfato O, 7 M, mezclar y filtrar a través de papel de microfibra de vidrio. Recoger 25 ml del filtrado (equivalente a 1 g de la
muestra de prueba) en una probeta graduada de 25 ml y proceder inmediatamente con la cromatografía de IAC.
Limpieza de IAC-[NOTA-Para la limpieza de IAC, las columnas deben mantenerse a temperatura ambiente durante al me-
nos 15 minutos antes de su uso.] Retirar la tapa superior de la columna y conectarla con el reservorio de solvente. Retirar la
tapa inferior de la columna y acoplarla al colector de la columna (el ajuste debe ser hermético). Dejar que el líquido pase a
través de la columna hasta dejar aproximadamente 2-3 mm de líquido por encima del lecho de la columna. Transferir los
25 ml del filtrado, obtenido en Extracción, al reservorio de solvente. Dejar que el filtrado fluya a través de la columna por gra-
vedad. Dejar que la columna se seque. Retirar la columna del colector para comenzar el flujo de nuevo con facilidad, agregar
aproximadamente 2 ml de Solución Salina Amortiguada con Fosfato a la columna, volver a acoplar la columna al reservorio de
solvente, lavar la columna con 3 ml adicionales de Solución Salina Amortiguada con Fosfato y luego con 5 ml de agua (se pue-
de agregar 5 ml de Solución Salina Amortiguada con Fosfato directamente al reservorio de solvente de la columna si se usan
otras técnicas para desprender las burbujas de aire en el extremo de la columna y para comenzar el flujo de nuevo con facili-
dad). Dejar que la columna se seque, luego forzar 3 ml de aire a través de la columna con una jeringa. Eluir con 1 ml de meta-
no! y recoger los analitos en un matraz volumétrico de 3 ml, dejando que el eluato gotee libremente. Dejar que la columna se
seque. Dejar en reposo durante 1 minuto, luego el u ir con 1 ml adicional de metano!, y recoger en el mismo matraz volumétri-
co. Dejar que la columna se seque y forzar 1 O ml de aire a través de la columna. Diluir el eluato con agua a volumen. Usar esta
dilución como la Solución de Prueba y realizar el análisis de aflatoxinas de inmediato.
Solución de Aptitud del Sistema-Preparar una muestra adicionada, agregando 5 ml de Solución Estándar de Trabajo de
Aflatoxinas 5 a una muestra de 5 g, repitiendo el procedimiento para la Solución de Prueba, usando 20 ml en lugar de 25 ml de
la mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300).
Sistema Cromatográfico-
Velocidad de Flujo-0,8 ml/minuto
Detección-Detector de fluorescencia; ajustar la longitud de onda de excitación (Ex) a 362 nm y la longitud de onda de
emisión (Em) a 440 nm.
Columna-4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 3 pm
Fase Móvil-lsocrática
PARA DERIVATIZACIÓN POST-COLUMNA CON CELDA FOTOQUÍMICA 3-Agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150)

2 Columna de AflaOchraTest (Gl 017; Vicam, Watertown, MA, USA) o equivalente. Las columnas de inmunoafinidad de Aflatoxina/OTA son adecuadas.
 306 (561 >Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

PARA DERIVATIZACIÓN POST-COLUMNA CON CELDA ELECTROQUÍMICA 4 -Una solución preparada mezclando 1 L de una mezcla de
agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150); 350 pL de ácido nítrico 4 M; y 120 mg de bromuro de potasio
Sistemas de Oerivatización Post-Columna (PCD, por sus siglas en inglés)-
CELDA PHRED-Celda fotoquímica para derivatización post-columna'
CELDA KOBRA-Celda electroquímica, celda de bromación para derivatización post-columna. 4
Análisis-
Oerivatización Post-Columna para Aflatoxinas-Usar una celda fotoquímica o electroquímica. Inyectar 50 pL de blanco de
reactivo (Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas 7), las Soluciones Estándares de Trabajo de Aflatoxinas 2-6 o la Solución de
Prueba en la columna de HPLC. Identificar los picos de aflatoxinas en la Solución de Prueba comparando los tiempos de reten-
ción con los de los estándares de trabajo. Las aflatoxinas eluyen en el orden AFG 2 , AFG1t AFB 2 y AFB 1 • Después de pasar a través
de la celda fotoquímica o electroquímica, AFG 1 y AFB 1 han derivatizado para formar AFG 2 , (derivado de AFG 1 ) y AFB 2 , (deriva-
do de AFB 1). [NOTA-Las estructuras químicas de los derivados que resultan de bromación electroquímica y fotólisis no son
iguales. Las estructuras de los productos de fotólisis de AFB 1 y AFG 1 no se han definido.] Los tiempos de retención de AFG 2 ,
AFG 2 ,, AFB 2 y Af'B ¿, están entre aproximadamente 14 y 27 minutos usando la celda fotoquímica; los tiempos de retención
usando la celda electroquímica resultan en períodos de tiempo más breves. Los picos se deben resolver hasta la línea base.
Construir una curva estándar para cada aflatoxina. Determinar la concentración de cada aflatoxina en la Solución de Prueba a
partir de la curva de calibración.
Curvas de Calibración de Aflatoxinas-Se preparan las curvas de calibración para cada una de las aflatoxinas usando las Solu-
ciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas que contengan las cuatro aflatoxinas descritas. Estas soluciones abarcan el intervalo de
0,25-4 ng/mL para AFB 1 y AFG 1, y el intervalo de 0,0625-1 ng/mL para AFB 2 y AFG 2 • Construir las curvas de calibración antes
de su análisis según la Tabla 3 y verificar la linealidad de la gráfica. Si el área de respuesta de la porción de prueba se encuentra
fuera (más alto) del intervalo de la calibración, entonces la Solución de Prueba debe diluirse con una mezcla de metanol y agua
(1 :1; v/v) y volver a inyectarse en la columna de HPLC.
Cuantificación de Aflatoxinas-Se realiza la cuantificación de aflatoxinas midiendo las áreas de los picos a cada tiempo de
retención de aflatoxina y comparándolos con la curva de calibración correspondiente.
Aptitud del Sistema-La recuperación media de la cantidad agregada conocida de AFB 1 (2 pg/kg) y de aflatoxinas totales
(5 pg/kg) es no menos de 68% y 70%, respectivamente. La desviación estándar relativa (RSD) es no más de 10% para AFB 1 y
para aflatoxinas totales.
Cálculos-Graficar el área del pico (respuesta, eje y) de cada estándar de toxina en función de la concentración (ng/mL, eje
x) y determinar la pendiente (5) y la intersección con el eje y (a). Calcular el nivel de toxina en la muestra por la siguiente
fórmula:

Toxina (pg/kg) = {[(R- a)/S] x V/lt\I} x F

en donde Res el área del pico de la Solución de Prueba; V es el volumen final de la Solución de Prueba inyectada (mL); y Fes el
factor de dilución. F = 1 cuando V= 3 ml. W es 1 g de la muestra de prueba pasada a través de la columna de inmunoafinidad.
Las aflatoxinas totales son la suma de AFG 2, AFG 1 , AFB 2 y AFB 1 •
Criterios de aceptación-Cuando la monografía individual requiera cumplimiento con los límites para aflatoxinas, los lími-
tes son no más de 5 ng/g para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2 , AFG 1 y AFG 2 , excepto cuando se indique
algo diferente.

MÉTODO GENERAL PARA ANÁLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS

Definición-Siempre que se emplee en esta Farmacopea, la denominación ·de plaguicida se aplica a cualquier sustancia o
mezcla de sustancias destinadas a evitar, destruir o controlar plagas, especies de plantas no deseadas o animales que provocan
daños durante la producción, el procesamiento, el almacenamiento, el transporte o la comercialización de artículos puros, o
que interfieren de algún otro modo con estos procesos. La denominación incluye sustancias elaboradas para ser usadas como
reguladores de crecimiento, defoliantes o desecantes, y cualquier sustancia que se aplica a los cultivos antes o después de la
cosecha para proteger el producto del deterioro durante el almacenamiento y el transporte.
Límites-Dentro de los Estados Unidos, muchos productos botánicos se tratan como suplementos dietéticos y por eso es-
tán sujetos a las disposiciones reglamentarias que rigen sobre los alimentos pero no rigen sobre los medicamentos en la Ley
Federal sobre Alimentos, Medicamentos y Productos Cosméticos (Federal Food, Drug and Cosmetic Act). Los límites de plagui-
cidas en alimentos están determinados por la Agencia de Protección del Medio Ambiente (EPA - Environmental Protection
Agency) según se indica en el Reglamento sobre Alimentos y Medicamentos [Code of Federal Regulations (40 CFR Part 180)] o
el Diario Oficial (FR - Federal Register). Para plaguicidas químicos sin niveles de tolerancia establecidos por la EPA, los valores
límites deben estar por debajo del límite de detección del método especificado. Los resultados con valores menores a los lími-
tes de detección de la EPA se consideran cero. Por lo tanto, los límites aquí detallados no son válidos en los Estados Unidos
cuando los artículos de origen botánico están etiquetados para fines alimentarios. Sin embargo, los límites se pueden aplicar

3 Celda fotoquímica para derivatización post-columna, tipo PHRED'' Reactor Fotoquímico (AURA Industries, New York, NY, USA) o equivalente. Procurar no mirar
directamente la lámpara UV.
4 Celda electroquímica para derivatización post-columna, tipo Kobra' (R-Biopharm lnc., Marshall, MI, USA) o equivalente. Ajustado a 100 mA. No prender la co-
rriente hasta que el bombeo de HPLC funcione para evitar el sobrecalentamiento de la membrana celular.
USP 37 Pruebas Químicas / (561 > Artículos de Origen Botánico 307

en otros países donde se permite la presencia de residuos de plaguicidas. A menos que se especifique algo diferente en la mo-
nografía individual, el artículo a examinar debe cumplir con los límites indicados en la Tabla 4. Los límites de supuestos plagui-
cidas que no se indican en la Tabla 4 deben cumplir las reglamentaciones de la EPA. En casos en donde un plaguicida no se
indica en la Tabla 4 ni en las reglamentaciones de la EPA, calcular el límite por la fórmula:

Límites (mg/kg) = AM/1008

en donde A es la ingesta diaria admisible (IDA), publicada por FAO-OMS, en mg/kg de peso corporal; Mes el peso corporal,
en kg (60 kg); y 8 es la dosis diaria del artículo, en kg.
Si el artículo está destinado para la preparación de extractos, tinturas o otras formas farmacéuticas de la cual el método de
preparación modifica el contenido de plaguicidas en el producto final, calcular los límites por la fórmula:
Límites (mg/kg) = AME/l 008
donde E es el factor de extracción del método de preparación, determinado experimentalmente; y A, M y 8 se definen ante-
riormente.
Puede concederse una exención total o parcial de la prueba cuando se conoce toda la historia (naturaleza y cantidad de los
plaguicidas usados, la fecha de cada tratamiento durante el cultivo y después de cosechar) del tratamiento de la partida y se
puede verificar precisamente de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas y de recolección (GACP, por sus siglas en inglés).
Tabla 4
Límite
Sustancia (mg/kg)
Acefato 0,1
Alaclor 0,05
Aldrina y dieldrina (suma de) 0,05
Azinfos-etílico 0,1
Azinfos-metílico 1
Bromuro inorgánico (calculado como ión bromuro) 50
Bromofos-etílico 0,05
Bromofos-metílico 0,05
Bromopropilato 3
Clordano (suma de cis-, trans- y oxiclordano) 0,05
Clorfenvinfos 0,5
Clorpirifos-etílico 0,2
Clorpirifos-metílico 0,1
Clortal-dimetílico 0,01
Ciflutrina (suma de) 0,1
A.-Cihalotrina 1
Cipermetrina e isómeros (suma de) 1
DDT (suma de o,p'-DDE, p,p'-DDE, o,p'-DDT, p,p'-DDT, o,p'-TDE y p,p'-TDE) 1
Deltametrina 0,5
Diazinón 0,5
Diclofluanida 0,1
Diclorvos 1
Dicofol 0,5
Dimetoato y ometoato (suma de) 0,1
Ditiocarbamatos (expresado como CS2) 2
Endosulfán (suma de isómeros y sulfato de endosulfano) 3
Endrina 0,05
Etión 2
Etrimfos 0,05
Fenclorofos (suma de fenclorofos y fenclorofos-oxón) 0,1
Fenitrotión 0,5
Fenpropatrina 0,03
Fensulfotión (suma de fensulfotión, fensulfotión-oxón, fensulfotión-oxonsulfona y fensulfotión-sulfona) 0,05
Fentión (suma de fentión, fentión-oxón, fention-oxón-sulfona, fentión-oxón-sulfóxido, fentión-sulfona y
fentión-sulfóxido) 0,05
Fenvalerato 1,5
 308 (561 >Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

Tabla 4 (Continuacion)
----
Límite
1 1
Sustancia (mg/kg)
Flucitrinato 0,05
r-Fluvalinato ·---.
0,05
Fonofos 0,05
Heptaclor (suma de heptaclor, cis-heptaclorepóxido y trons-heptaclorepóxido) 0,05
Hexaclorbenceno 0,1
Hexaclorociclohexano (suma de isómeros u-, /J-, /J- y>:-) 0,3
Lindano ('¡-hexaclorociclohexano) 0,6
Malatión y malaoxón (suma de) 1
Mecarbam
----------- ----- - --- ------------ -------- ---- -·---
0,05 --
Metacrifos 0,05
Metamidofos 0,05
Metidatión 0,2
Metoxiclor 0,05
Mirex 0,01
Monocrotofos 0,1
Paratión-etílico y Paraoxón-etílico (suma de) 0,5
Paratión-metílico y Paraoxón-metílico (suma de) 0,2
Pendimetalina 0,1
Pentacloranisol 0,01
Permetrina e isómeros (suma de) 1
Fosalona 0,1
Fosmeto 0,05
Butóxido de piperonilo 3
Pirimifos-etílico 0,05
Pirimifos-metílico (suma de pirimifos-metílico y N-desetil-pirimifos-metílico) 4
Procimidona 0,1
Profenofos 0,1
Protiofos 0,05
Piretro (suma de cinerina 1, cinerina 11, jasmolina 1, jasmolina 11, piretrina 1y piretrina 11) 3
Quinalfos 0,05
Quintoceno (suma de quintoceno, pentacloroanilina y metil pentaclorofenil sulfuro) 1
S-421 0,02
Tecnaceno 0,05
Tetradifona 0,3
Vinclozolina 0,4

Reactivos-Usar reactivos y disolventes que estén libres de cualquier contaminante, especialmente plaguicidas, que puedan
interferir en el análisis. Con frecuencia es necesario usar disolventes de grado especial adecuados para el análisis de residuos de
plaguicidas, o disolventes que se hayan vuelto a destilar recientemente en un aparato totalmente de vidrio. En todos los casos,
se han de realizar pruebas con un blanco adecuado.
Preparación del Aparato-Limpiar todo el equipo, especialmente el material de vidrio, para garantizar que esté libre de
plaguicidas. Remojar todo el material de vidrio durante un mínimo de 16 horas en una solución detergente sin fosfatos, enjua-
gar con abundante agua destilada y, a continuación, lavar con acetona, seguida de hexano o heptano.
Análisis Cualitativo y Cuantitativo de Residuos de Plaguicidas-Emplear procedimientos analíticos validados (p.ej., FDA
Pesticide Ana lytical Manua 1 (PAM) [http://www. fda .gov /Food/ScienceResearch/La boratoryMethods/PesticideAnalysisMan ual-
PAM/ defau lt. htm], u otros procedimientos analíticos validados de acuerdo con la guía de la UE [NOTA-Nº de documento
SANCO/l 0232/2006, http://ec.europa.eu/food/plant/resources/qualcontrol_en.pdf] o Validación de Procedimientos Farmacopei-
cos (1225).) que cumplan con los criterios siguientes. El método, especialmente con respecto a los pasos de purificación, es
adecuado para la combinación de residuos de plaguicidas y la sustancia en análisis, y no es susceptible a interferencias de sus-
tancias coextraíbles. Medir los límites de detección y cuantificación para cada combinación de matriz de plaguicida que debe
ser analizada: el método muestra la recuperación de entre 70% y 11 0% de cada plaguicida; la repetibilidad y la reproducibili-
dad del método son no menores que los valores apropiados indicados en la Tabla 5; y las concentraciones de las soluciones de
prueba y de referencia y la calibración del aparato son tales que se obtiene una respuesta lineal del detector analítico.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 309

Tabla 5
Intervalo de Concentración Repetlbllldad Reproducibilidad
de los Plaguicidas (RSD) (RSD)
(mg/kg) (%) (%)
0,001 -0,01 30 60
> 0,01 - 0,1 20 40
> 0,1 -1 15 30
>1 10 20

PRUEBAS DE PLAGUICIDAS

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se pueden usar los métodos siguientes para el análisis
de plaguicidas. En función de la sustancia que se está examinando, puede ser necesario modificar, extensamente en ocasiones,
el procedimiento descrito a continuación. Además, puede ser necesario llevar a cabo otro método con otra columna con una
polaridad diferente, otro método de detección (p.ej., espectrometría de masa) o un método diferente (p.ej., método inmuno-
químico) para confirmar los resultados.
Extracción-[NOTA-Emplear el procedimiento siguiente para el análisis de muestras de artículos que tengan un contenido
de agua de menos de 15%. Las muestras que tengan un contenido de agua mayor se pueden secar, siempre que el procedi-
miento de secado no afecte significativamente el contenido del plaguicida.] Agregar 100 mL de acetona a 1Og de la sustancia
en polvo grueso en análisis y dejar en reposo durante 20 minutos. Agregar 1 mL de una solución en tolueno que contenga
1,8 µg de carbofenotión por ml. Mezclar en un mezclador de alta velocidad durante 3 minutos. Filtrar esta solución y lavar el
residuo con dos porciones de 25 mL de acetona. Combinar el filtrado y los lavados, y calentar, en un evaporador rotatorio,
manteniendo la temperatura del baño por debajo de 40º hasta que el disolvente se haya evaporado casi por completo. Agre-
gar al residuo unos pocos mL de tolueno y volver a calentar hasta que se elimine totalmente la acetona. Disolver el residuo en
8 mL de tolueno. Pasar a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 45 µm, enjuagar el matraz y el filtro con
tolueno, diluir con tolueno hasta 10,0 mL (Solución A) y mezclar.
Purificación-
Insecticidas Organoclorados, Organofosforados y Piretroides-Equipar un cromatógrafo de exclusión por tamaño con una co-
lumna de acero inoxidable de 7,8 mm x 30 cm con relleno L21 de 5 µm. El tolueno se usa como fase móvil a una velocidad de
flujo de aproximadamente 1 mL/minuto.
Funcionamiento de la Columna-Inyectar 100 µL de una solución de tolueno que contenga, en cada mL, 0,5 mg de rojo de
metilo y 0,5 mg de azul de oracet o equivalente. La columna no es adecuada a menos que el color de los eluatos cambie de
anaranjado a azul en un volumen de elución de aproximadamente 10,3 ml. Calibrar la columna, si fuera necesario, usando
una solución en tolueno que contenga concentraciones adecuadas del plaguicida de interés que tenga el menor peso molecu-
lar (por ejemplo, diclorvos) y del que tenga el mayor peso molecular (por ejemplo, deltametrina). Determinar qué fracción del
eluato contiene ambos plaguicidas.
Purificación de la Solución de Prueba-Inyectar un volumen adecuado (100 a 500 µL) de Solución A en el cromatógrafo. Reco-
ger la fracción (Solución B) según se indica más arriba en Funcionamiento de la Columna. Los plaguicidas organofosforados elu-
yen entre 8,8 y 10,9 ml. Los plaguicidas organoclorados y piretroides eluyen entre 8,5 y 10,3 ml.
Insecticidas Organoclorados y Piretroides-En una columna cromatográfica de 5 mm x 1O cm, introducir una pieza de algo-
dón exenta de grasa y 0,5 g de gel de sílice tratado del siguiente modo. Calentar el gel de sílice para cromatografía en un
horno a 150º durante al menos 4 horas. Dejar que se enfríe y agregar, gota a gota, una cantidad de agua correspondiente a
1,5% del peso del gel de sílice usado. Agitar vigorosamente hasta que desaparezcan los aglomerados y continuar agitando
mecánicamente durante 2 horas. Acondicionar la columna con 1,5 mL de hexano. [NOTA-También se pueden usar columnas
previamente rellenas que contengan aproximadamente 0,50 g de un gel de sílice adecuado, siempre que hayan sido validadas
con antelación.] Concentrar la Solución B casi hasta sequedad, con la ayuda de una corriente de helio o de nitrógeno exento de
oxígeno, y diluir con tolueno a un volumen adecuado (200 µL a 1 mL, de acuerdo con el volumen inyectado en la preparación
de la Solución 8). Transferir cuantitativamente esta solución a la columna y proceder con la cromatografía usando 1,8 mL de
tolueno como fase móvil. Recoger el eluato (Solución C).
Análisis Cuantitativo de Insecticidas Organofosforados-
Solución de Prueba-Concentrar la Solución B casi hasta sequedad, con la ayuda de una corriente de helio, diluir con tolueno
hasta 100 µL y mezclar.
Solución Estándar-Preparar al menos tres soluciones en tolueno que contengan cada uno de los plaguicidas de interés y
carbofenotión en concentraciones adecuadas para graficar una curva de calibración.
Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama alcalina o un detector
de fotometría a la llama y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl de 0,25 µm.
Usar hidrógeno como gas transportador. También se pueden usar otros gases, como helio o nitrógeno. Mantener la tempera-
tura del inyector a 250º y la del detector, a 275º. Mantener la temperatura de la columna a 80º durante 1 minuto, luego au-
mentarla a 150º a una velocidad de 30º /minuto, mantener a 150º durante 3 minutos y, luego, aumentarla a 280º a una veloci-
dad de 4º/minuto y mantener a esta temperatura durante 1 minuto. Usar carbofenotión como estándar interno. [NOTA-Si
fuera necesario, usar un segundo estándar interno para identificar cualquier posible interferencia con el pico de carbofenotión
 31 O (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

correspondiente.J Inyectar el volumen elegido de cada solución, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los pi-
cos. Calcular el contenido de cada plaguicida a partir de las áreas correspondientes a los picos y las concentraciones de la solu-
ción.
Análisis Cuantitativo de Insecticidas Organoclorados y Piretroides-
Solución de Prueba-Concentrar la Solución C casi hasta sequedad, con la ayuda de una corriente de helio o de nitrógeno
exento de oxígeno, diluir con tolueno hasta 500 .uL y mezclar.
Solución Estándar-Preparar al menos tres soluciones en tolueno que contengan cada uno de los plaguicidas de interés y
carbofenotión en concentraciones adecuadas para graficar una curva de calibración.
Sistema Cromatográfico-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de captura de electrones, un dispositivo que
permite la inyección directa en trío en la columna, y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una
capa de fase Gl de 0,25 ~tm. Usar hidrógeno como gas transportador. También se pueden usar otros gases, como helio o
nitrógeno. Mantener la temperatura del inyector a 275u y la del detector, a 300º. Mantener la temperatura de la columna a
80º durante 1 minuto, luego aumentarla a 150º a una velocidad de 30º /minuto, mantener a 150º durante 3 minutos y, luego,
aumentar a 280º a una velocidad de 4u/minuto y mantener a esta temperatura durante 1 minuto. Usar carbofenotión como
estándar interno. [NOTA-Si fuera necesario, usar un segundo estándar interno para identificar cualquier posible interferencia
con el pico de carbofenotión correspü11die11le.] l1iyec.lar el volumen elegido Je cada solución, registrar los c.romatogramas y
medir las respuestas de los picos. Calcular el contenido de cada plaguicida a partir de las áreas de los picos y las concentracio-
nes de las soluciones.

(563) IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

La identificación de materias primas vegetales que se utilizan en la fabricación de medicamentos, excipientes, o suplementos
dietéticos se lleva a cabo examinando las características morfológicas e histológicas del artículo de prueba y realizando pruebas
químicas. Las características botánicas y químicas obtenidas del examen del artículo de prueba se comparan luego con las ca-
racterísticas botánicas y químicas conocidas de la especie vegetal. Se pueden especificar artículos de referencia para ayudar a la
adecuada identificación botánica y química de la planta y de las partes de la planta. Un artículo de referencia puede ser un
Material de Referencia Autenticado USP, que se puede utilizar tanto para la identificación química como botánica, o un Están-
dar de Referencia USP, que se usa sólo para la identificación química.

MATERIALES DE REFERENCIA AUTENTICADOS USP

Los Materiales de Referencia Autenticados USP son órganos o tejidos vegetales certifcados por provenir de una planta identi-
ficada adecuadamente como perteneciente a la especie declarada en la etiqueta. La autenticación es realizada por especialistas
en taxonomía botánica, anatomía vegetal, fitoquímica u otros científicos especialistas en plantas contratados por la USP. Un
Material de Referencia Autenticado USP es habitualmente un órgano o tejido vegetal seco y pulverizado y que se puede obte-
ner de la USP. Se archivan muestras de herbario de las plantas autenticadas, que pueden incluir raíces, tallos, hojas, flores, fru-
tos y semillas. Las muestras del archivo se pueden solicitar para su examen. Generalmente, una muestra de herbario estándar
consiste en la planta adulta entera. Los Materiales de Referencia Autenticados USP se someten a las mismas pruebas de diag-
nóstico botánico y químico que se aplican en el análisis de materias primas. Un artículo de prueba debe tener todas las carac-
terísticas botánicas y químicas especificadas que se encuentran en el Material de Referencia Autenticado USP. Para que sirva al
propósito al que está destinado, cada Material de Referencia Autenticado USP se debe almacenar, manipular y usar de manera
apropiada. Por lo general, los Materiales de Referencia Autenticados USP se almacenan en sus envases originales en un ambien-
te fresco y seco y se los protege de la luz y de la infestación por insectos. Cuando se requieren condiciones de almacenamiento
especiales, las instrucciones se indican en la etiqueta. Por lo general, los principios activos y los compuestos marcadores se de-
gradan con el tiempo; por lo tanto, se asignan fechas de caducidad a los Materiales de Referencia Autenticados USP para su
uso en identificación química. Los Materiales de Referencia Autenticados USP no están destinados para emplearse en la fabrica-
ción de productos farmacéuticos, excipientes ni suplementos dietéticos.

IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA

La identificación botánica de las materias primas vegetales que se emplean en la fabricación de productos farmacéuticos,
excipientes, o suplementos dietéticos consiste en determinar las características macroscópicas e histológicas (microscópicas) de
la parte de la planta, como por ejemplo, raíz, tallo, hoja, flor, fruto o semilla, que se utilizan en la fabricación del artículo. La
identificación puede incluir también la inspección de las características organolépticas del tejido vegetal, como la presencia o
ausencia de un olor característico. Las monografías oficiales individuales pueden incluir información botánica de posibles espe-
cies adulterantes para asegurar su ausencia en la materia prima. Para identificar adecuadamente la planta, el órgano o el tejido
vegetal, es necesario tener un conocimiento básico de anatomía vegetal.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (563> Identificación de Artículos de Origen Botánico 311

Morfología y Anatomía Vegetal Diagnóstica

Esta sección trata exclusivamente las características morfológicas y anatómicas diagnósticas de plantas vasculares y de las
diversas partes de las plantas, tales como raíces, tallos, hojas, flores, frutos y semillas, a partir de las que se obtienen productos
farmacéuticos, excipientes o suplementos dietéticos. Las plantas vasculares comprenden las Pteridofitas (helechos y plantas re-
lacionadas con los helechos, por ejemplo, los géneros Aspidium, Equisetum y Lycopodium), las Gimnospermas (plantas de semi-
lla, en las que la semilla no está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Ephedra, Gingko y Pinus) y las Angiosper-
mas (plantas de semilla, donde la semilla está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Allium, Digitalis, Panax,
Matricaria y Rauwolfia). Algunas de las características anatómicas diagnósticas que se especifican en una monografía individual
(ver Características botánicas en monografías individuales) pueden incluir, entre otras, la presencia de un tejido particular en un
órgano; la disposición y el tipo de células de un tejido; la presencia y el tipo de canal secretor, la presencia de aceite, resina o
conductos laticíferos dentro de un órgano; el número de células epiteliales que rodea un canal secretor; y la presencia y tipo
de sustancias ergásticas como por ejemplo almidón, inulina, glóbulos de grasa, aceites esenciales, cristales de oxalato de cal-
cio, cistolitos, polifenoles, líquidos u otros materiales que se producen en el citoplasma, organelos, vacuolas, cavidades o pared
celular.

RAÍCES

Los tejidos presentes en raíces jóvenes, comenzando desde el tejido más externo, comprenden una epidermis con pelos radi-
culares, corteza, endodermis, periciclo, floema, xilema y, en algunas especies, médula. En algunas especies, la capa o capas
más externas de la corteza son diferentes de las capas internas, en cuyo caso se las denomina hipodermis. En especies que
presentan crecimiento secundario de la raíz, es habitual que se desprendan todos los tejidos externos al periciclo. Las raíces
que presentan crecimiento secundario tienen un peridermo o corteza, compuesto de súber (tejido suberoso), felógeno (cám-
bium suberoso) y felodermo como el tejido más externo. Debajo del peridermo se pueden encontrar restos de floema prima-
rio, floema secundario, cámbium vascular, xilema primario y xilema secundario. Los tejidos vasculares secundarios tienen ra-
dios medulares que separan en grupos a las principales células conductoras del floema (elementos cribosos o células cribosas)
y a las principales células conductoras del xilema (vasos y traqueidas). Muchas especies de plantas que presentan crecimiento
secundario carecen de médula en la raíz. El tipo y la disposición de las células conductoras principales de los tejidos vasculares
puede permitir el diagnóstico de la especie. Las raíces de muchas especies se desarrollan como órganos de almacenamiento
alimenticio. A este tipo de raíces les caracteriza la presencia de abundante parénquima y grandes cantidades de almidón u
otros polisacáridos. La presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicación de ma-
terial ergástico también pueden ser características diagnósticas. Desde el punto de vista morfológico, las raíces se pueden dis-
tinguir de los rizomas (los tallos subterráneos) principalmente por la ausencia de nodos e internodos, que están presentes en
los rizomas.

TALLOS

Varias características macroscópicas externas de los tallos que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los
atributos de los nodos, internodos, cicatrices de las hojas, cicatrices de los haces vasculares, lenticelas y yemas; el patrón de
crecimiento de las yemas; la posición y disposición de las hojas a lo largo del tallo y la presencia de zarcillos, aguijones, púas o
espinas. Comenzando con el tejido más externo, la disposición interna de tejidos en los tallos jóvenes de muchas especies es
epidermis, corteza, un anillo concéntrico de haces vasculares separados entr-e sí por haces medulares parenquimatosos y mé-
dula. Según la especie, en la epidermis puede haber estomas o tricomas, o ambas estructuras. La corteza de algunas especies
puede incluir una hipodermis o una endodermis, o ambas. En muchas monocotiledóneas, la disposición de los haces vascula-
res no es concéntrica, sino que los haces están esparcidos a través de toda una masa de tejido parenquimatoso en la parte
interior de la epidermis. Debido a esta disposición, no se puede distinguir la corteza, los haces medulares, ni la médula. En los
tallos de plantas leñosas que presentan crecimiento secundario, es habitual que la epidermis se desprenda y se reemplace por
un peridermo que consta de súber, felógeno y felodermo. Algunas especies se caracterizan por presentar múltiples peridermos
(ritidoma). En el peridermo puede haber lenticelas y sus atributos pueden servir como características diagnósticas. Por debajo
del peridermo están los restos de la corteza, el floema primario, el floema secundario, el cámbium vascular y el xi lema secun-
dario, y los restos del xilema secundario y la médula. También hay haces medulares. Igual que en la raíz, el tipo y la disposición
de las células conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros
tejidos, y la presencia y ubicación de material ergástico, también pueden ser características diagnósticas. Los rizomas pueden
tener algunas características morfológicas similares a las de las raíces y por lo tanto se pueden confundir con raíces. Sin embar-
go, los rizomas se pueden identificar correctamente como tallos porque tienen nodos e internodos evidentes.

HOJAS

Algunas características macroscópicas de las hojas que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los atribu-
tos de las láminas foliares, el pecíolo, las estípulas y la filotaxia. El tejido más externo de la lámina foliar es la epidermis, seguida
 312 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

por los tejidos mesófilo y vascular. Entre las características diagnósticas microscópicas de las células epidérmicas están el grosor
y las marcas de la cutícula, la forma y disposición de los estomas y las células guardianas, la disposición y tamaño de células
subsidiarias, el número de estomas (número de estomas por unidad de superficie) y el índice estomático (número de estomas
por número de unidades de células epidérmicas). Otras características útiles en la identificación de material foliar consisten en
los tipos y la disposición de los tricomas (pelos vegetales) presentes; el tipo y la disposición de Jos tejidos mesófi/o y vascular; la
relación de mesófilo en empalizada; la presencia y el aspecto de tejidos accesorios tales como vainas de haces parenquimato-
sos o esc/erenquimatosos, mesófilo paraveinal, endodermis y tejido de transfusión; el tipo y la disposición de las células con-
ductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de fibras, esc/ereidas y otros tejidos; y la pre-
sencia, la ubicación y el aspecto físico del material ergástico.

FLORES

Las flores son las mejores cara<terísticas morfológicas diagnósticas de cualquier planta floral y la estructura floral es el criterio
principal que se usa en taxonomía vegetal. Las características diagnósticas de las flores comprenden el tipo de inflorescencia; la
presencia, el número y el aspecto de las partes florales principales (sépalos, pétalos, estambres y carpelos); el tipo de simetría
que presentan las partes florales; la posición relativa de los ovarios con respecto a las demás partes de la flor; el número de
óvulos por ovario; el tipo de placentación del ovario; el aspecto físico de los granos de polen; la presencia de nectarios, la pre-
sencia de recubrimientos o tricomas glandulares; y características físicas de estructuras accesorias, como el receptáculo y las
brácteas. Las características histológicas y la presencia de materiales ergásticos en los tejidos de las partes florales permiten
también el diagnóstico de la Especie.

FRUTOS

La identificación de la especie vegetal a partir de la que se obtiene un fruto se puede determinar mediante la observación de
varios criterios macroscópicos. Estos criterios comprenden el número de pistilos que tiene el fruto, el número de carpelos den-
tro de cada pistilo, el número de semillas dentro de cada carpelo, la placentación del fruto y si el fruto es dehiscente, indehis-
cente o carnoso. Algunas otras características diagnósticas son las referentes al número de suturas en un fruto dehiscente, la
determinación de las semillas si están unidas o no a la pared del pericarpio, las características físicas de las tres capas del peri-
carpio de los frutos carnosos (epicarpio, mesocarpio y endocarpio) y la presencia y el aspecto físico de tejidos accesorios como
el receptáculo y las brácteas. Las características histológicas de los tejidos del fruto pueden ayudar a la identificación. Las carac-
terísticas de las semillas dentro del fruto también son caracteres distintivos que permiten diagnosticar la especie.

SEMILLAS

Las características macroscópicas de las semillas que se utilizan en la identificación comprenden la forma y el tamaño de la
semilla; el aspecto de la superficie del recubrimiento de la semilla; la posición del hilio y del micrópilo; y la presencia de estruc-
turas accesorias del recubrimiento de la semilla, tales como arilos, carúncula, o cuerpos oleosos. Las características físicas del
embrión, tales como su tamaño, forma, posición y el número y aspecto de los cotiledones, al igual que la presencia y el aspec-
to de tejidos nutritivos accesorios como los restos de un megagametofito (en Gimnospermas), perisperma (nucela) o endos-
perma, permiten también diagnosticar la especie. Las características histológicas del recubrimiento de la semilla y otras estruc-
turas y tejidos de la semilla también se pueden utilizar para identificar la especie.

M icrotécn ica

El análisis histológico de muestras botánicas se puede realizar en material vegetal entero o pulverizado. Puede ser necesario
el empleo de tinciones citológicas u otros reactivos para visualizar determinadas características histológicas. Se pueden emplear
polarizadores cruzados para detectar estructuras que rotan la luz polarizada plana. Estas estructuras comprenden granos de
almidón, cristales de oxalato de calcio, algunas fibras y granos de arena (presente como un contaminante) que se pueden ob-
servar como objetos brillantes contra un fondo oscuro. Generalmente se coloca un polarizador en el condensador o la fuente
de iluminación y el segundo polarizador se coloca en el ocular. La luz que entra al portaobjetos desde abajo es polarizada pla-
na, lo que permite que pasen solamente algunas ondas luminosas en un plano específico. El campo se torna brillante cuando
los dos polarizadores se alinean y cuando los dos polarizadores están cruzados, el campo se oscurece.

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES TEMPORALES Y MATERIAL PULVERIZADO

Procedimiento General-Las muestras vegetales se observan bajo el microscopio mediante el empleo de diferentes medios
de montaje, tinciones u otras soluciones que ayudan a la correcta identificación del artículo de prueba. Si se dispone de un
Material de Referencia Autenticado USP, se debe preparar con los mismos medios de montaje o soluciones reactivo utilizados
para el artículo de prueba. Colocar una o dos gotas de agua, Solución de Alcohol-Glicerina, Solución de Hidrato de Cloral, u otra
solución reactivo en el centro de un portaobjetos limpio (ver Preparación y Uso de Soluciones Reactivo, Dispositivos Ópticos y
USP 37 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 313

Medios de Montaje). Transferir una pequeña sección de tejido vegetal o una porción de polvo de la planta al medio de montaje
o solución reactivo y cubrirla con un cubreobjetos limpio. (Para obtener más información sobre técnicas de preparación especí-
ficas, ver Preparación de Montajes Temporales y Cortes Manuales, Maceración o Preparación de Material Pulverizado, según corres-
ponda). Para evitar la formación de burbujas de aire, el cubreobjetos se debe colocar cuidadosamente en un ángulo adecuado,
de tal manera que su borde entre primero en contacto con el portaobjetos y luego presionar hasta que cubra la muestra. Elimi-
nar el exceso de líquido del extremo del cubreobjeto con un trozo de papel de filtro. Las burbujas de aire se pueden eliminar
colocando el portaobjetos en un desecador de vacío. Cuando se emplea hidrato de cloral, las burbujas de aire se pueden elimi-
nar calentando la muestra a ebullición moderada sobre una llama pequeña, como la de una lámpara de alcohol. Para reempla-
zar el medio de montaje o solución reactivo, colocar gotas del nuevo medio de montaje o solución reactivo en un borde del
cubreobjetos. Colocar una tira de papel de filtro en el extremo opuesto del cubreobjetos para eliminar el medio de montaje o
solución reactivo anterior y hacer que el nuevo medio de montaje o solución reactivo corra sobre el tejido o material pulveriza-
do. Los aceites vegetales también pueden ser arrastrados del tejido de esta manera, lavando el portaobjetos con éter de petró-
leo o acetona seguido luego por agua, y si fuera necesario, por Solución de Hidrato de Cloral. No usar Solución de Hidrato de
Cloral inmediatamente después de tratar el tejido vegetal con disolventes inflamables sin haber lavado minuciosamente el teji-
do con agua. De este modo se evita que el disolvente residual se inflame cuando el portaobjetos se coloca sobre una llama
pequeña para calentar el tejido a ebullición. Se debe tener cuidado al usar soluciones reactivo que sean volátiles o corrosivas
para el microscopio. Para evitar que las soluciones acuosas o de hidrato de cloral se sequen durante la observación, agregar al
portaobjetos una pequeña gota de glicerina. Observar la muestra montada bajo un microscopio óptico (ver Microscopía Óptica
(776)), y examinar las características histológicas.
Preparación y Uso de Soluciones Reactivo, Dispositivos Ópticos y Medios de Montaje-Los siguientes reactivos, disposi-
tivos ópticos y medios de montaje se emplean en la identificación de células, tejidos, características estructurales y sustancias
ergásticas en el tejido o material pulverizado (ver las Tablas 1 y 2).
Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos
Soluciones Reactivo y
Detección Dispositivos Ópticos
Concreción de Carbonato de calcio Ácido Acético Diluido
Cristales de oxalato de calcio Polarizadores Cruzados
Celulosa Solución de Carmín-Alumbre-Verde de Metilo
Ácido Yodhídrico
Solución de Yodo-Cloruro de Cinc
Citoplasma Solución de Ácido Pícrico Alcohólico
1,8-Dihidroxiantraquinonas Solución de Hidróxido de Potasio 1 M
Aceites esenciales Solución de Tetróxido de Osmio
Solución de Sudán 111
lnulina Solución de Naftol-Ácido Sulfúrico
Lignina Solución de Carmín-Alumbre-Verde de Metilo
Solución de Floroglucinol-Ácido Clorhídrico
Reactivo Universa/
Lípidos (cutina, ceras y suberina incluidas) Solución de Carmín-Alumbre-Verde de Metilo
Solución de Tetróxido de Osmio
Solución de Sudán 111
Reactivo Universal
Pectina y mucílago Solución de Rojo de Rutenio
Solución de Tionina
Solución de Azul de Toluidina
Fitoglicógeno Solución de Rojo de Rutenio
Cuerpos proteicos Solución de Ácido Pícrico Alcohólico Solución de Tetróxido de Osmio
Saponina Mezcla de Sangre-Gelatina
Solución de Yodo-Glicerina
(confirmar mediante prueba con Mezcla de Sangre-Gelatina)
Almidón Polarizadores cruzados
Solución de Yodo
Reactivo Universa/
Taninos y otros polifenoles Solución de Cloruro Férrico
Solución de Tetróxido de Osmio
 •
314 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

--- ----
·---

Usar
--
Tabla -------
- ··- r- -- ----
2. Agentes Blanqueadores
-- ---
y Clarificantes
-- ----- ------ -
y Medios de Montaje
Medios de Montaje y Agentes
------·· -·---~

Agentes Blanqueadores -- . -------

-------~ució~de-H1p~lo;ito de Sodio --·--·
Agentes Clarificantes Solución de Hidrato de Cloral
Solución de Lactoclorol
Solución de Lactofenol
Medios de Montaje Glicerina
Solución de Glicerina-Alcohol
Mezcla de Glicerina-Gelatina
Agua

Solución de Ácido Pícrico Alcohólico-Preparar una solución de ácido pícrico al 1% en alcohol. El ácido pícrico es útil para
teñir células que tienen un citoplasma denso, como las células de aleurona en semillas. Colocar una pequeña cantidad del ma-
terial vegetal pulverizado en un tubo de ensayo y agitarla con aproximadamente 1 mL de éter de petróleo para eliminar aceites
vegetales que interferirían con la reacción. Centrifugar y desechar el éter de petróleo. Empapar el polvo vegetal en Solución de
Ácido Pícrico Alcohólico durante aproximadamente 30 minutos. Transferir una porción del polvo a un portaobjetos y observar al
microscopio: el citoplasma y los cuerpos proteicos se tornan de un color amarillo brillante. [Precaución-El ácido pícrico es explo-
sivo cuando se seca. Manipular de manera adecuada.]
Mezcla Sangre-Gelatina-Agregar 4,5 g de gelatina en polvo a 100 mL de una solución de cloruro de sodio al 0,9% y dejar
hinchar durante 30 minutos. Calentar el gel mezclándolo hasta aproximadamente 80º, en un baño de agua. Enfriar a 40º y
agregar 6 mL de sangre bovina desfibrinada. Calentar de 45º a 50º y verter sobre un portaobjetos para microscopio en una
capa delgada de aproximadamente 1 mm manteniendo el portaobjetos en posición horizontal. Para evitar pérdidas de la
mezcla de sangre-gelatina por los lados del portaobjetos, sellar los bordes con cinta adhesiva de 1 cm de ancho para formar
una bandeja. Después de enfriarse y solidificarse, la mezcla está lista para usar. [NOTA-Almacenar en una cámara húmeda
durante no más de 1 a 2 días, entre 3º y 4º.] Para realizar la prueba de saponinas, colocar grupos pequeños del material vege-
tal en polvo sobre la capa de sangre-gelatina, dejando una separación de algunos milímetros entre ellos, transferir a un humi-
dificador durante algunas horas y observar: las partículas que contengan saponinas originarán zonas claras transparentes en la
sangre-gelatina.
Solución de Carmín-Alumbre-Verde de Metí/o-Calentar a ebullición 1,5 g de carmín durante 30 minutos en una solución de
sulfato de potasio y aluminio al 15%. Enfriar, filtrar, y agregar mezclando 1O mL de una solución de verde de metilo al 0,75%.
Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal: la lignina y la suberina se tornan de color verde y la celulosa se torna de color viole-
ta rojizo.
Solución de Hidrato de Cloral-Usar hidrato de cloral SR. Cuando se use la solución como agente clarificante, agregar algu-
nas gotas al material vegetal y calentar a ebullición brevemente sobre una llama pequeña. El hidrato de cloral disuelve el con-
tenido celular y las sustancias intercelulares y permite observar fácilmente las paredes y las formas celulares. Se puede utilizar
para ayudar a la identificación de súber, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio (con ayuda de polarizadores cruzados), tri-
comas, estomas y polen.
Polarizadores Cruzados-Este dispositivo óptico se emplea para detectar cristales de oxalato de calcio y granos de almidón
(amiloplastos). Bajo la luz polarizada, los cristales de oxalato de calcio y los granos de almidón aparecen como objetos brillan-
tes, birrefringentes, sobre un fondo oscuro. Los granos de almidón observados bajo la luz polarizada también presentan el
efecto de la cruz de Malta, cuyos brazos se cruzan en el hilio. En general, los cristales de oxalato de calcio se ven mejor des-
pués de clarificar la muestra con Solución de Hidrato de Cloral u otro agente clarificante.
Ácido Acético Diluido-Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal y observar. inmediatamente bajo un microscopio: los depó-
sitos de carbonato de calcio se disuelven con efervescencia.
Solución de Cloruro Férrico-Diluir 1 mL de cloruro férrico SR con 9 mL de agua. Para la detección de grupos hidroxilo fenóli-
cos, como taninos y flavonoides, agregar la solución a la muestra acuosa desde la parte lateral del cubreobjetos: los taninos y
otros politeno/es adquieren un color de negro azulado a verde.
Glicerina-Usar como medio de montaje para evitar que las soluciones acuosas y de hidrato de cloral se sequen.
Solución de Glicerina-Alcohol-Mezclar volúmenes iguales de glicerina y alcohol. Usar como medio de montaje.
Mezcla de Glicerina-Gelatina-Agregar 10,0 g de gelatina en polvo a 60 mL de agua. Dejar en reposo durante 2 horas y
agregar 70 mL de glicerina que contenga 1,5 g de fenol disuelto. Calentar en un baño de agua y filtrar a través de un embudo
precalentado que contenga lana de vidrio. La mezcla filtrada se licúa antes de usar y sirve como medio de montaje. Agregar
algunas gotas al material vegetal pulverizado o cortado y cubrir con un cubreobjetos calentado. Esta preparación se utiliza para
el almacenamiento a largo plazo de montajes de muestras. Los extremos del cubreobjetos se pueden sellar con bálsamo de
Canadá después de algunos meses de secado.
Ácido Yodhídrico-Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal: las paredes celulares de celulosa adquieren un color azul a
violeta azulado.
Solución de Yodo-Agregar de 1 a 2 gotas de yodo O, 1 N SR al material vegeta!: las partículas de almidón adquieren un color
azul oscuro a violeta azulado; esta reacción es reversible si se calienta. [NOTA-Las proteínas, los lípidos y la celulosa se tornan
de amarillo a marrón; y las partículas de polvo de guayaco se tornan de verde a azul, pero este reactivo no se usa para la iden-
tificación diagnóstica de estas características.]
 USP 37 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 315

Solución de Yodo-Glicerina-Disolver 0,3 g de yodo y 1,0 g de yoduro de potasio en una pequeña cantidad de agua y agre-
gar 1O mL de una mezcla de glicerina y agua (1: 1). Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal en polvo: las muestras que con-
tienen saponinas forman grumos o agregado~ de color a111a1 illo. Si la p1ueba de una rnuestrJ diCía un resultJdo positivo para
saponina, el resultado se debe confirmar realizando una prueba a la muestra con la Mezcla de Sangre-Gelatina también.
Solución de Lactoc/ora/-Disolver 50,0 g de hidrato de cloral en 50 mL de ácido láctico, calentando suavemente. Agregar
algunas gotas al material vegetal. Si fuera necesario, colocar el portaobjetos del microscopio en un pequeño desecador al vacío
para eliminar las burbujas de aire. La Solución de Hidrato de Cloral y la Solución de Lactoclora/ se utilizan para el mismo tipo de
identificación, excepto que la Solución de Lactoclora/ es un agente clarificante más fuerte y se usa para el material vegetal que
es más difícil de clarificar.
Solución de Lactofenol-Mezclar 20 g de ácido láctico, 40 g de glicerina y 20 mL de agua. Agregar 20 g de fenol y mezclar.
Éste es un agente clarificante fuerte adecuado para el examen de granos de polen.
Solución de Naftol-Ácido Sulfúrico-Preparar una solución al 20% de 1-naftol en alcohol. Agregar al material vegetal 1 gota
de solución de 1-naftol y 1 gota de ácido sulfúrico: los cristales de inulina adquieren un color rojo amarronado y luego se di-
suelven.
Solución de Tetróxido de Osmio-Disolver O, 1 g de tetróxido de osmio en 5 mL de agua destilada. Agregar de 1 a 2 gotas de
la solución así obtenida al material vegetal: los aceites esenciales, los aceites grasos y otros lípidos, los taninos y los cuerpos
proteicos adquieren un color de marrón a negro.
Solución de Floroglucinol-Ácido Clorhídrico-Esta solución se utiliza para la identificación de la lignina y otros derivados de
hidroxifenilpropano, tejidos lignificados como esclereidas, vasos, fibras y células pétreas y parénquima lignificado. Humedecer
el polvo o la muestra cortada con floroglucinol SR y dejar que se seque durante 2 a 3 minutos antes de colocar el cubreobje-
tos. Agregar algunas gotas de solución de ácido clorhídrico al 25% y cubrir con el cubreobjetos. Las paredes de las células
lignificadas se tornan de color rojo carmín. [NOTA-Este colorante no es estable.] Las células que presentan derivados de hidro-
xifenilpropano, como vainillina y ácido ferúlico, también se tornan de color rojo. Alternativamente, los derivados del hidroxife-
nilpropano se pueden extraer del material vegetal y luego éste puede ser examinado. Para extraer los derivados del hidroxife-
nilpropano, sumergir repetidamente en alcohol el material sin tratar, mezclar en un mezclador por vórtice, centrifugar, y dese-
char el alcohol entre los lavados. A continuación tratar el material vegetal según la especificación provista anteriormente, co-
menzando con el agregado de floroglucinol SR.
Solución de Hidróxido de Potasio 7 M-Agregar 1 gota al material vegetal: las células que contienen 1,8-dihidroxiantraquino-
nas se tiñen de rojo.
Solución de Rojo de Rutenio-Agregar algunas gotas de hidróxido de amonio a rojo de rutenio SR. [NOTA-Almacenar esta
solución protegiéndola de la luz.] Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal: las membranas celulares que contienen pectina,
mucílago ácido y fitoglicógeno se tornan de color rojo.
Solución de Hipoclorito de Sodio-Esta solución se usa para blanquear profundamente los cortes coloreados. Sumergir el ma-
terial vegetal en la solución durante algunos minutos hasta que esté suficientemente blanqueado. Lavar el tejido con agua y
montar con un agente de montaje adecuado. [NOTA-El hipoclorito de sodio extraerá la lignina; el tejido vegetal tratado de
esta manera dará un resultado negativo para lignina.]
Solución de Sudán ///-Disolver 0,5 g de Sudán 111 en 50 mL de alcohol o alcohol isopropílico con ebullición a reflujo. Enfriar,
filtrar y agregar 50 mL de glicerina. Agregar de 1 a 2 gotas de esta solución al polvo vegetal: los aceites esenciales, las ceras, la
cutina, la suberina, los aceites grasos y otros lípidos se combinan con este colorante lipofílico y se tornan de un color rojo ana-
ranjado a un color rojo después de un período corto.
Solución de Tionina-Preparar una solución de acetato de tionina al 0,2% en alcohol al 25 por ciento. Sumergir la muestra
seca en esta solución. Después de aproximadamente 15 minutos, lavar el exceso de colorante con alcohol al 25 por ciento: el
mucílago se habrá hinchado formando glóbulos esféricos y se habrá tornado de color violeta rojizo, mientras que la celulosa, la
pectina y los tabiques lignificados se tornarán de color azul o violeta azulado.
Solución de Azul de Toluidina-Utilizando azul de toluidina, proceder según se indica en Solución de Tionina.
Reactivo Universa/-
SOLUCIÓN A-Diluir 20 mL de una solución de Sudán 111 saturada con ácido láctico con 30 mL de ácido láctico.
SOLUCIÓN B-Disolver 0,55 g de sulfato de anilina en 35 mL de agua.
SOLUCIÓN e-Disolver 0,55 g de yoduro de potasio y 0,05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de alcohol.
PROCEDIMIENTO-Combinar la Solución A, la Solución By la Solución C y agregar mezclando 2,5 mL de ácido clorhídrico. [NOTA-
La solución se usa sin filtrar.] Para identificación, agregar de 2 a 3 gotas a la muestra y calentar a ebullición moderada sobre
una llama pequeña. Si fuera necesario, se pueden agregar cantidades pequeñas de Reactivo Universal durante la ebullición. Cu-
brir con el cubreobjetos: los elementos lignificados se tornan de color amarillo, la suberina de color marrón rojizo, los lípidos
de color rojo y el almidón de color violeta azulado.
Agua-Usar como medio de montaje. [NOTA-Todos los grados de agua son aceptables para este propósito.]
Solución de Cloruro de Cinc-Yodo-Disolver 20,0 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua.
Agregar 0,5 g de yodo O, 1 N SV y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Almacenar en recipientes de vidrio con
protección actínica. Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal y dejar en reposo durante algunos minutos: las paredes celulares
de celulosa se tiñen de color azul a violeta azulado.
Preparación de Montajes Temporales y Cortes Manuales-Cuando se use el tejido vegetal seco, empapar o calentar a
ebullición moderada en agua hasta que se ablande. No dejar que se ablande demasiado. El material se puede tratar entonces
 316 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

como material vegetal fresco. Cuando corresponda, usar los medios de montaje o soluciones reactivo indicadas para usar con
plantas en polvo para ayudar a visualizar las características del tejido (ver Preparación y Uso de Soluciones Reactivo, Dispositivos
Ópticos y Medios de Montaje).
Para sacar una película epidérmica de la hoja, pétalo, sépalo, bráctea u otro apéndice similar a la hoja, enrollar el tejido for-
mando un cilindro y hacer una muesca con una cuchilla afilada, revestida de teflón, que haya sido humedecida con agua. Con
una pinza tomar el trozo de tejido cortado y tirando hacia atrás, remover un corte transparente de la epidermis. Montar en
agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo en el microscopio. Si resulta difícil obtener
una película epidérmica mediante el procedimiento anterior, proceder del siguiente modo. Empapar el tejido en una solución
de ácido nítrico entre 40% y 60%, a 60º durante 3 a 4 minutos, o hasta que la epidermis se pueda pelar con facilidad. La
película epidérmica después se lava en agua de tres a cinco veces para eliminar el exceso de ácido nítrico. Neutralizar el tejido
en una solución de hidróxido de potasio al 1% o una solución de hidróxido de sodio al 1%. Lavar nuevamente el tejido con
agua, montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo en el microscopio.
Un método alternativo para preparar tejido vegetal para el examen de la epidermis es calentar un fragmento de la hoja
(aproximadamente 5 mm x 5 mm) durante 15 minutos en Solución de Hidrato de Cloral en un baño de agua. Transferir el tejido
a un portaobjetos, agregar una gota de agua, y cubrirlo con un cubreobjetos. Se pueden emplear estos procedimientos para
determinar el tipo, la distribución y el número de estomas, al igual que el índice estomático.
El número de estomas se determina contando el número de estomas por unidad de superficie de un campo microscópico.
Determinar el número de estomas en al menos 1O sitios diferentes de la muestra y calcular un valor medio. Registrar la superfi-
cie foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia el número de estomas de las distintas superfi-
cies es muy diferente.
Para calcular el índice estomático, la muestra se observa bajo un microscopio con poco aumento. El tamaño de la superficie
se define con un micrómetro ocular calibrado y se determina el número de estomas y el número de células epidérmicas para
esa superficie. El índice estomático se calcula mediante la fórmula:
1OOS/(E + S)
en donde S es el número de estomas para una superficie determinada; y E es el número de células epidérmicas de la misma
superficie. Determinar el índice estomático en al menos 1O sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Nuevamen-
te registrar la superficie foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia los índices estomáticos de
las distintas superficies son muy diferentes.
Para hacer un corte transversal de una hoja o raíces delgadas, tallos u otros apéndices delgados, poner el apéndice que se va
a cortar sobre un portaobjetos. Colocar otro portaobjetos sobre el apéndice con una porción del tejido expuesto. Con una
cuchilla afilada, revestida de teflón, humedecida, cortar derecho hacia abajo a lo largo del borde del portaobjetos superior. Sin
mover el portaobjetos superior, cortar de nuevo hacia abajo colocando la cuchilla en ángulo. Se puede necesitar cierta práctica
para poder obtener cortes lo suficientemente finos, de modo que cuando se monten y se cubran con un cubreobjetos, estos
cortes se puedan utilizar para determinar la organización del tejido (por ejemplo, el número de capas en empalizada en la ho-
ja, el grosor de la cutícula, los tipos de tricomas, los tipos de haces vasculares y otros similares). Debido a que las cuchillas se
desafilan rápidamente, se las debe reemplazar con frecuencia.
Usar el corte transversal del tejido foliar así obtenido para determinar la relación de mesófilo en empalizada. Alternativamen-
te, calentar a ebullición fragmentos de hoja de aproximadamente 2 mm 2 en Solución de Hidrato de Cloral, montar, cubrir con
un cubreobjetos, y observar bajo un microscopio. Identificar grupos de cuatro células epidérmicas adaxiales y contar las células
de mesófilo en empalizada que se extiendan por debajo y estén cubiertas al menos en el 50% por las células epidérmicas. Este
valor dividido entre 4 es la relación de mesófilo en empalizada. Determinar la relación de mesófilo en empalizada de al menos
1O grupos de células epidérmicas y calcular un valor medio. La relación de mesofilo en empalizada también se puede determi-
nar en material foliar en polvo.
Para hacer un corte transversal de tallos o raíces gruesas, u otras partes de la planta, incluidos los tejidos leñosos, sostener el
tejido con una mano y utilizando una cuchilla afilada revestida de teflón, previamente humedecida con agua, rebanar un corte
transversal del apéndice. Montar en agua, otro medio o solución reactivo, colocar un cubreobjetos sobre el material y exami-
nar al microscopio. En general, con un poco de práctica se pueden hacer cortes que sean lo suficientemente delgados como
para determinar la organización del tejido vascular, el tipo de rayos, la distribución del parénquima, la presencia de cristales y
similares.
Maceración-Para la adecuada identificación del material vegetal, algunas veces es necesario macerar el tejido en sus célu-
las individuales antes del examen microscópico. Esta técnica puede ser particularmente útil para tejidos leñosos u otros tejidos
duros. El material se corta en pequeños trozos de aproximadamente 2 mm de grosor y 5 mm de largo o se rebana en trozos de
aproximadamente 1 mm de grosor. Según la naturaleza de la pared celular, se emplea uno de los métodos siguientes. Para
tejidos duros o muy lignificados, usar el Método l. Para tejidos que no están muy lignificados, usar el Método 11.
Método/-
SOLUCIÓN A-Usar solución de ácido nítrico 4 N.
SOLUCIÓN B-Preparar una mezcla de solución de trióxido de cromo 1,2 M y ácido sulfúrico (7:4).
PROCEDIMIENTO-Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una mezcla de la
Solución A y de la Solución B (1 :1). Calentar en un baño de agua durante 20 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y
transferir a un portaobjetos. Desmenuzar el tejido con una aguja de disección, agregar de 1 a 2 gotas de medio de montaje,
 USP 37 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 317

cubrir con un cubreobjetos, y examinar bajo un microscopio. Si fuera necesario, las células se pueden separar más entre sí al
presionar el cubreobjeto con un movimiento suave y deslizante. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba
para lignina.
Método//-
PROCEDIMIENTO-Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una solución de
hidróxido de potasio 2 M. Calentar en un baño de agua durante 30 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transferir a
un portaobjetos. Agregar de 1 a 2 gotas de medio de montaje. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido, presionar hacia abajo,
aplastando el tejido y examinar al microscopio. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba para lignina.
Preparación de Materiales en Polvo-Colocar una o dos gotas de agua, otro medio de montaje o una solución reactivo
en el centro de un portaobjetos limpio. Humedecer la punta de una aguja de disección con agua y sumergir en el polvo some-
tido a prueba. Transferir una pequeña cantidad de material que se adhiera a la aguja al líquido en el portaobjetos y mezclar
bien con mucho cuidado. Cubrir con un cubreobjetos limpio. Debido a que se ha destruido la organización de las estructuras
del tejido dentro del tejido vegetal, las características importantes a observar del material vegetal en polvo son las característi-
cas físicas y químicas de los tejidos y los tipos celulares, al igual que la presencia y las características químicas y físicas de sus-
tancias ergásticas. Los tejidos, células y sustancias ergásticas específicas que se van a examinar se especifican en la monografía
individual.

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES PERMANENTES DELGADOS

Cuando sea necesario revelar características histológicas detalladas de una muestra vegetal, se deben obtener cortes delga-
dos del tejido. Los cortes deben ser lo suficientemente delgados como para transmitir luz y se deben cortar en un plano que
permita exponer las características deseadas. El material vegetal se mata, fija y deshidrata en forma adecuada y se lo incluye en
parafina u otro medio de inclusión. El medio de inclusión se usa como una matriz de soporte sólido durante el corte del tejido.
Después de efectuar el corte y el montaje, frecuentemente se realiza la tinción de la muestra para ayudar a la diferenciación de
determinadas estructuras. [NOTA-El proceso de fijación, deshidratación, inclusión y tinción se puede acelerar significativamen-
te si se utiliza un horno de microondas diseñado específicamente para trabajo histológico.]
Muerte y Fijación-El primer paso en la preparación de material vegetal para corte es matar las células vivas y conservar el
tejido. Con mucha frecuencia, esto se hace mediante el empleo de un fijador químico. Un buen fijador de uso general para
material vegetal es una mezcla de formaldehído, ácido acético y alcohol (FAA).
Solución FAA-Mezclar 50 mL de alcohol, 5 mL de ácido acético glacial, 1O mL de solución de formaldehído y 35 ml de
agua. [NOTA-Preparar periódicamente una solución nueva, ya que con el almacenamiento pierde su eficacia.]
Procedimiento-Sumergir completamente el material vegetal en Solución FAA. Dejar el material sumergido durante 18 a 24
horas a temperatura ambiente. El material vegetal se puede conservar indefinidamente en Solución FAA, siempre que el mismo
permanezca completamente sumergido y no se lo deje secar. Determinados tejidos pueden requerir infiltración al vacío para
facilitar la penetración del fijador. La infiltración al vacío es necesaria si el tejido tuviera abundantes espacios de aire o pelos
epidérmicos, o si flotara en la superficie de la solución de fijación. Colocar el tejido en un vial pequeño que contenga el fijador.
Colocar el vial sin tapar en una campana de cristal o desecador que esté conectado a una fuente de vacío, preferentemente
una bomba de vacío con sello de aceite. Conectar la salida del sistema de vacío a una campana de extracción para evitar que
los vapores de fijación llenen la habitación. Encender lentamente el vacío. No usar un vacío fuerte porque el fijador puede co-
menzar a hervir y dañar el tejido. Debido a que el aire residual es extraído del tejido, éste sube a la superficie. Encender y
apagar durante varios ciclos de vacío hasta que el tejido quede en el fondo del recipiente durante un ciclo "encendido".
Deshidratación del Tejido-La parafina y otros medios de inclusión son hidrófobos. Por lo tanto, se debe eliminar el agua
del tejido vegetal después de la fijación. Esto se lleva a cabo sumergiendo er tejido fijado en soluciones de deshidratación, sien-
do estas soluciones una serie de mezclas de alcohol y agua con concentraciones de alcohol en aumento. La solución final de la
serie es alcohol deshidratado. Comenzar lavando el tejido fijado una o dos veces con alcohol nuevo al 50 por ciento para elimi-
nar trazas de FAA. Eliminar esta solución y eliminar a continuación cualquier otra solución de deshidratación decantando la
solución o eliminándola con ayuda de una pipeta de vidrio. Agregar la primera solución de deshidratación (alcohol al 70 por
ciento) al vial, sumergiendo el tejido completamente. La serie graduada alcohol-agua y los tiempos sugeridos para la inmersión
del tejido son los siguientes.

Solución de Deshidratación Tiempo

(horas)
Alcohol al 50 por ciento 1-2
Alcohol al 70 por ciento 1-2
Alcohol al 90 por ciento 1-2
Alcohol al 95 por ciento 1-2
Alcohol deshidratado con O, 1% de safranina O 2-4
Alcohol deshidratado 1

Se agrega safranina O a la penúltima solución de deshidratación de la serie para visualizar el tejido cuando ha quedado in-
cluido en parafina. Si el tejido que se va a cortar es duro o leñoso, es posible que el tiempo de cada uno de los pasos de la serie
 •
318 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 37

se deba aumentar hasta 24 horas. Si fuera necesario, el tejido se puede almacenar durante varios días en alcohol al 70 por
ciento o en soluciones con concentraciones de alcohol aún más altas.
Inclusión-
Preparación para Inclusión-
REMOCIÓN DE ALCOHOL-La parafina es el medio de inclusión más común, aunque se dispone de otros medios de inclusión. Des-
pués de la deshidratación, el alcohol se elimina del tejido por medio de una serie graduada de soluciones de alcohol deshidra-
tado-xileno, debido a que la parafina no es soluble en alcohol. La serie graduada alcohol deshidratado-xileno y los tiempos
sugeridos para la inmersión del tejido son los siguientes.

Tiempo
Solución de Remoción de Alcohol (horas)
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (3:1) 1
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1) 1
U11a mezcla de alcohol de;hidralado y xileno (1 :3) 1
Xileno 1
Xi len o 1

REMOCIÓN DE XILENO-Una vez que el xileno haya reemplazado completamente al alcohol, agregar lentamente parafina para
infiltrar el tejido y eliminar el xileno. Proceder del siguiente modo:
1. Por cada mL de xileno, agregar aproximadamente 1 perla de parafina al vial del tejido, tapar, y dejar en reposo a tempera-
tura ambiente durante 4 horas. Agregar más perlas de parafina hasta que no se disuelvan más perlas.
2. Colocar el tejido en un horno mantenido entre 42º y 45º. Agregar de 2 a 3 perlas de parafina cada hora hasta que a esa
temperatura no se disuelvan más perlas.
3. Verter un tercio del volumen y reemplazar con un volumen igual de parafina fundida. No tapar y transferir el vial a un
horno mantenido entre 58º y 60º.
4. Después que la parafina se vuelva a fundir (aproximadamente 4 horas más tarde), verter la mitad del volumen y reempla-
zar con un volumen igual de parafina fundida. Transferir el vial al horno mantenido entre 58º y 60º si la parafina comienza
a solidificarse.
5. Repetir el paso 4 dos veces más, después verter todo el volumen de parafina-xileno. Reemplazar con parafina pura fundi-
da. Aproximadamente 4 horas más tarde, verter la parafina y reemplazarla con parafina pura nueva fundida. Volver a ver-
ter y reemplazar 4 horas más tarde, y dejar en reposo durante toda la noche. [NOTA-Transferir el vial al horno mantenido
entre 58º y 60º si la parafina comienza a solidificarse en algún momento.]
Procedimiento de Inclusión-Verter el tejido con la parafina en un molde de inclusión. La parafina debe cubrir el tejido por
completo aproximadamente 3 a 5 mm. Colocar el molde de inclusión en una plataforma de calentamiento precalentada, dise-
ñada para trabajar en histología. Ajustar el tejido en el molde con la orientación adecuada para realizar el corte. Lentamente,
enfriar la parafina deslizando el molde hacia abajo, hacia el lado frío de la plataforma, hasta que la parafina se solidifique. Su-
mergir el bloque de parafina en agua helada para enfriarlo rápidamente y evitar que se formen cristales de parafina. Almacenar
el bloque de parafina a 4º.
Corte y Montaje-Cortar el bloque de parafina en trozos, cada uno de los cuales debe contener una muestra de tejido.
Recortar el bloque de parafina lo más cerca posible de la masa de tejido, para formar un rectángulo o una forma casi trapezoi-
dal. Este recorte evitará problemas de corte debidos al exceso de parafina alrededor del tejido. Para hacer cortes transversales,
orientar el tejido en un ángulo recto respecto a un bloque de tejido de madera cuya superficie se haya empapado en parafina
fundida. Fijar el bloque de parafina a la superficie del bloque de tejido. Agregar una pequeña cantidad de parafina fundida a la
base del bloque de parafina para que se forme un sello más impermeable. Enfriar el bloque a 4º.
Montar y ajustar en forma apropiada el tejido y el bloque de parafina en un micrótomo. Usar una cuchilla de micrótomo de
acero inoxidable adecuadamente afilada. Ajustar el micrótomo para hacer cortes de 8 a 15 µm de grosor (1 O µm es el grosor
óptimo para la mayoría de los tejidos). Hacer cortes individuales o en serie. Preparar un portaobjetos para microscopio del si-
guiente modo. Se puede preparar un adhesivo en forma de solución con 1 % de gelatina y 0,5% de benzoato de sodio que se
calienta entre 30º y 35º para disolver la gelatina. Hacer un frotis de una película del adhesivo así obtenido sobre el portaobje-
tos, dejar secar, enjuagar con una solución de formaldehído SR al 4% y agregar una pequeña cantidad de agua. Colocar al
revés las secciones cortadas sobre el portaobjetos, de modo que floten en agua e inundar con una solución de formaldehído
SR al 4%. Los cortes se extienden inmediatamente y desaparecen las arrugas.
Colocar el portaobjeto sobre una plataforma de calentamiento, mantenida a 42º, para que los cortes se expandan. Pipetear
y secar el exceso de agua y solución de formaldehído. Secar durante toda la noche en un horno a 42º para asegurar la adhe-
rencia del corte de tejido al portaobjeto.
Tinción-
Preparación para Tinción-Sumergir dos veces en xileno el portaobjetos¡:on el tejido fijado, durante 1 O a 15 minutos cada
vez para eliminar la parafina. Luego sumergir el portaobjetos en varias soluciones, dejándolo durante 5 minutos en cada solu-
ción y teniendo cuidado de no sacar el tejido y usar la siguiente secuencia de soluciones: una mezcla de alcohol deshidratado y
xileno (1: 1), alcohol deshidratado, alcohol y una solución de alcohol al 70 por ciento. El tejido se blanquea antes de la tinción
si está opaco debido a la presencia de taninos u otros materiales ergásticos. Para blanquear, sumergir el portaobjetos en una
 USP 37 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 319

solución de permanganato de potasio al 1% durante 1 minuto, enjuagar con agua, sumergir en una solución de ácido oxálico
al 5% durante 1 minuto, y enjuagar muy bien con agua. El material está ya listo para la tinción. Para la mayoría de los trabajos
de identificación botarnca se recomienda usar uno de los Jos procedimientos de tinción siguientes. E! primer procedimiento de
tinción emplea safranina O contrastada con fast green. Un procedimiento alternativo emplea safranina O contrastada con ana-
ranjado G.
Tinción de Safranina 0-Fast Green-
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA o-Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado, agua y solución de formal-
dehído (50:25:25:2). Agregar una cantidad suficiente de acetato de sodio para obtener una solución que contenga 1% de ace-
tato de sodio y mezclar. Agregar una cantidad suficiente de safranina O para obtener una solución que contenga 1% de safra-
nina O y mezclar.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE FAST GREEN-Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado y salicilato de metilo (1: 1 :1)
con 0,05% de fast green FCF.
PROCEDIMIENTO-Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70 por ciento según se describe en Preparación para
Tinción, sumergir durante 2 a 24 horas, dependiendo del te¡1do, en SoluCton de Tincion de Safranina O. Eliminar el exceso de
colorante sumergiendo varias veces el portaobjetos en agua. Transferir el portaobjetos a una solución de alcohol con 0,5% de
ácido pícrico durante 2 a 1 O segundos para eliminar aún más el exceso de colorante del cortf> y ayudar a la diferenciación de
las estructuras del tejido. Para detener la acción del ácido pícrico, transferir el portaobjetos durante 1 O segundos a 1 minuto a
una solución de alcohol que contenga 4 gotas de hidróxido de amonio por cada 100 mL de alcohol. Transferir el portaobjetos
al alcohol deshidratado durante 1 O segundos. Inspeccionar visualmente el tejido teñido bajo un microscopio para comprobar
si es necesaria una mayor decoloración con ácido pícrico. Contrastar durante 1 O a 15 segundos en Solución de Tinción de Fast
Green. Pasar el portaobjetos por dos cambios de una mezcla de salicilato de metilo, alcohol deshidratado y xileno (2: 1 :1 ); cada
cambio dura entre 5 y 1O segundos. Luego transferir el portaobjetos a una mezcla de xileno y alcohol deshidratado (95:5)
durante 1 minuto. Pasar por dos cambios de xileno. Almacenar en xileno hasta que esté listo para montar el cubreobjetos. Los
cromosomas, los núcleos y las paredes celulares lignificadas, cutinizadas o suberizadas, se teñirán de color rojo. El citoplasma y
la paredes celulares de celulosa se teñirán de color verde a azul, dependiendo del pH del tejido.
Tinción de Anaranjado G-Safranina 0-
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA o-Preparar una solución de safranina o al 0,004%.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE ANARANJADO e-Disolver 2 g de anaranjado G, 5 g de ácido tánico y 4 gotas de ácido clorhídrico en
agua, y diluir con agua hasta 100 ml.
PROCEDIMIENTO-Una vez que el tejido haya sido rehidratado hasta alcohol al 70 por ciento según se describe en Preparación
para Tinción, transferir en forma secuencial el frotis por la siguiente serie de soluciones.

Solución Tiempo
Alcohol al 35 por ciento 5 minutos
Una solución filtrada de cloruro de cinc al 2% 1 minuto
Agua 5 segundos
Solución de Tinción de Safranina O 5 minutos
Agua 5 segundos
Solución de Tinción de Anaranjado G 1 minuto
Agua 5 segundos
Una solución filtrada de ácido tánico al 5% 5 minutos
Agua 3 segundos
Una solución de sulfato férrico amónico al 1% 2 minutos
Agua 15 segundos
Alcohol al 45 por ciento 1O segundos
Alcohol al 90 por ciento 1O segundos
Alcohol deshidratado 1O segundos
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1) 1 a 2 minutos

Finalmente, almacenar en xileno hasta que esté listo para colocar el cubreobjetos. Las paredes celulares de celulosa se teñi-
rán de negro azulado, los núcleos de color amarillo, los granos de almidón de color negro y las paredes celulares lignificadas
de color rojo.
Montaje del Cubreobjetos-El montaje del cubreobjetos sobre el tejido completa la preparación del portaobjetos. Como
adhesivo se puede usar bálsamo de Canadá, diluido con una pequeña parte de xileno. En el mercado existen otros medios de
montaje disponibles. Cuando se seca el medio de montaje, el frotis puede examinarse en el microscopio. Todo el proceso de
preparación de extensiones permanentes sobre portaobjetos puede llevar 5 días o más.
Microscopía Electrónica de Barrido-Los productos botánicos comercializados por lo general se encuentran en forma de
polvo o en trozos, lo que dificulta y generalmente imposibilita la autenticación mediante un método rutinario de corte trans-
versal del artículo. Las estructuras tales como los vasos del xilema y las traqueidas se pueden partir en trozos más pequeños, lo
que dificulta y en ocasiones imposibilita la detección de puntuaciones y lignificaciones en las part>des usando un microscopio
 320 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas USP 37

óptico. Las estructuras que son resistentes a estos procesos son más útiles en la identificación. La microscopía electrónica de
barrido (SEM, por sus siglas en inglés) es útil para caracterizar el tamaño y la morfología de muestras microscópicas. Mediante
la SEM es posible observar e identificar las características diferenciales más detalladas en la estructura de los tricomas, elemen-
tos peculiares en la epidermis, junto con material granular superficial que contenga compuestos específicos, lo cual ayuda en la
identificación de especies particulares. La SEM se ha usado ampliamente para investigar la topología superficial de una extensa
variedad de materiales vegetales y puede desempeñar un papel vital en la autenticación de un producto botánico completo,
aquellos en forma de polvo, distinguiendo entre especies estrechamente relacionadas, y se puede usar para examinar una
mezcla de polvos.
El capítulo general de USP Microscopía Electrónica de Barrido (1181) proporciona una introducción e información general
acerca de la SEM con respecto a su aplicación a artículos farmacopeicos.
La SEM produce una resolución más alta en comparación con la resolución obtenible usando un microscopio óptico y las
imágenes obtenidas son tridimensionales. La SEM tiene la ventaja de proporcionar imágenes con una gran profundidad de
campo, lo cual premite enfocar un espesor importante de la muestra de una sola vez. Asimismo, permite el análisis de mues-
tras de tamaños tan grandes como 50 mm, lo que permite producir micrografías electrónicas con los detalles topográficos de
un objeto claramente visibles para el ojo humano. La resolución máxima para la SEM (la distancia mínima por la cual se pue-
den separar y observar los dos objetos como objetos distintos) es de 1 O a 20 nm en comparación con 200 a 300 nm para la
microscopía óptica. El aumento típico de la SEM varía de xl O a x300 000. Los instrumentos comerciales SEM también están
disponibles con aumentos tan bajos como x5 y tan altos como x2 000 000. En comparación, los microscopios ópticos moder-
nos típicos tienen un intervalo de aumento de xl O a x2000. A un aumento bajo, las imágenes obtenidas con la SEM propor-
cionan más información que aquellas obtenidas mediante microscopía óptica. La SEM puede producir imágenes cuyos cons-
trastes se basan en variaciones composicionales de las muestras.

IDENTIFICACIÓN QUÍMICA

Para tener la certeza de que se logra la autenticidad del artículo, se realiza la identificación química junto con la identifica-
ción botánica descrita anteriormente. La identificación química generalmente emplea procedimientos cromatográficos para
detectar la presencia de compuestos indicadores o marcadores especificados en la monografía individual. Se pueden emplear
perfiles espectroscópicos o cromatográficos para obtener la identificación química mediante la comparación de huellas dactila-
res o caracterizaciones con un estándar o muestra de referencia. Algunos ejemplos de métodos espectroscópicos son UV, IR e
IR por transformada de Fourier (ver Pruebas de Identificación Espectrofotométrica (197)). Algunos ejemplos de métodos cromato-
gráficos son cromatografía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés), cromatografía en capa delgada (TLC, por
sus siglas en inglés), TLC bidimensional y cromatografía de gases (ver Cromatografía (621 )). Los métodos analíticos utilizados
para producir huellas dactilares deben ser capaces de detectar tantos componentes químicos como sea posible. Puede resultar
útil emplear huellas dactilares múltiples, tales como una combinación de métodos analíticos con principios de separación y
condiciones de prueba diferentes. Además de los métodos cromatográficos espectroscópicos, en la monografía individual tam-
bién se pueden especificar métodos cualitativos de química húmeda.

Quimiotaxonomía

La quimiotaxonomía es la clasificación de las plantas, basada en sus componentes químicos, y la misma puede resultar útil
para la identificación de artículos botánicos. Los compuestos metabólicos que se encuentran en los tejidos vegetales se pueden
dividir en dos amplias categorías, en base a sus funciones. La primera categoría comprende los metabolitos primarios-meta-
bolitos que participan en los procesos fisiológicos vegetales, que son absolutam.ente necesarios para la vida y están presentes
en todo el reino vegetal. Estos procesos comprenden la fotosíntesis, la respiración y el metabolismo de los ácidos nucleicos, las
proteínas, los carbohidratos y los lípidos. La segunda categoría comprende metabolitos secundarios-compuestos que no se
consideran absolutamente necesarios para los procesos vegetales, aunque pueden tener funciones importantes en las interac-
ciones de las plantas con otros organismos, como interacciones alelopáticas; en la defensa química contra herbívoros y patóge-
nos vegetales y en las señales para atraer animales que polinizan y propagan las semillas. Se sabe que muchos metabolitos
secundarios tienen actividad farmacológica. También representan la base de la quimiotaxonomía vegetal. Los metabolitos se-
cundarios pertenecen a varias clases químicas diferentes, tales como aminoácidos no proteicos, flavonoides, xantonas, cumari-
nas, poliacetilenos, policétidos cíclicos, monoterpenos, sesquiterpenos, iridoides, triterpenos, esteroles, terpenos que contienen
nitrógeno y alcaloides. Estas clases químicas no se encuentran en todo el reino vegetal, sino que tienden a ser específicas para
determinadas clases, órdenes y familias botánicas. Por otra parte, muchas subclases químicas y compuestos secundarios parti-
culares son específicos para determinadas subfamilias, géneros o especies. Estas subclases químicas y compuestos particulares
son los que se pueden usar como compuestos marcadores para ayudar a la identificación adecuada del material vegetal.

Principios Activos y Compuestos Marcadores

Para la identificación química de artículos botánicos se preparan extractos. Dichos extractos son generalmente mezclas com-
plejas de varios componentes químicos. En la gran mayoría de los extractos botánicos no se conoce con certeza cuál de los
 USP 37 Pruebas Químicas/ (565) Extractos Botánicos 321

diferentes componentes es responsable del efecto farmacológico informado. En general, se cree que los distintos componentes
actúan en forma sinérgica para proporcionar el efecto informado. En el caso de artículos para los que existen monografías ofi-
ciales, se eligen determinados componentes químicos del artículo y se proporcionan procedimientos de pruebas cuantitativas
para determinar su contenido. La elección de dichos componentes, generalmente conocidos como compuestos marcadores,
se basa en ciertas consideraciones. Actualmente, en las monografías oficiales se especifican los siguientes tipos de compuestos
marcadores y pueden ser identificados en materias primas:
Principios Activos-Estos son componentes que han demostrado ser los responsables de la actividad clínica. Generalmen-
te, en la monografía individual se especifica un intervalo o contenido mínimo de los principios activos. Una determinación
cuantitativa de los principios activos durante estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información
necesaria para determinar fechas de caducidad apropiadas.
Marcadores Activos-Estos componentes tienen actividad farmacológica conocida que contribuye en cierto grado a la efi-
cacia. Sin embargo, la eficacia clínica de estos componentes puede no estar demostrada. Por lo general, en las monografías
individuales se especifica un intervalo o contenido mínimo de marcadores activos. Una determinación cuantitativa de los mar-
cadores activos durante estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información necesaria para deter-
minar fechas de caducidad apropiadas.
Marcadores Analíticos-Cuando no se conocen ni los principios activos ni los marcadores activos, se eligen otros compo-
nentes del extracto botánico a los que se les puedan realizar determinaciones cuantitativas. Estos marcadores ayudan a la iden-
tificación positiva del artículo de prueba. Además, mantener un contenido mínimo o un intervalo específico de los marcadores
analíticos ayuda a lograr la normalización del extracto vegetal y a determinar una fecha de caducidad apropiada durante los
estudios de estabilidad.
Marcadores Negativos-Estos componentes pueden tener propiedades alergénicas o tóxicas. La presencia de estos com-
ponentes resulta indeseable en el extracto botánico. Por ejemplo, los ácidos ginkgólicos del ginkgo pertenecen a esta catego-
ría. Las monografías individuales pueden tener especificado un límite estricto para estos marcadores negativos.

Uso de Artículos de Referencia USP

Se usan artículos de referencia para ayudar a la identificación de compuestos marcadores dentro del artículo de prueba. Los
artículos de referencia son Materiales de Referencia Autenticados USP o Estándares de Referencia USP (ver Estándares de Refe-
rencia USP ('11 )), según lo que especifique en la monografía individual. Los Estándares de Referencia USP utilizados para identi-
ficar compuestos indicadores o marcadores en los artículos de prueba pueden ser una entidad química purificada única, una
mezcla de entidades químicas purificadas, o un extracto estandarizado preparado a partir del artículo vegetal autenticado.
Además se pueden utilizar Estándares de Referencia USP para cuantificar compuestos marcadores, según se especifique en la
monografía individual.
Se somete un artículo de prueba pulverizado a un procedimiento de extracción especificado (ver Métodos de Extracción en
Extractos Botánicos (565)) y se prepara para el análisis cromatográfico o de química húmeda. Cuando se dispone de un Mate-
rial de Referencia Autenticado USP, se somete al mismo procedimiento de extracción que al artículo de prueba. Luego se so-
meten la preparación de prueba y los artículos de referencia al mismo procedimiento cromatográfico o de química húmeda
especificado en la monografía individual. Se compara la respuesta de la preparación de prueba con la respuesta de los artículos
de referencia para determinar la presencia de los compuestos indicadores o marcadores en el artículo de prueba.

(565) EXTRACTOS BOTÁNICOS

En la práctica de extracción para artículos de origen botánico, los componentes de interés se separan total o parcialmente
de los otros componentes con ayuda de agua, alcohol, mezclas de alcohol y agua u otros disolventes adecuados. El proceso de
extracción implica la extracción de los componentes deseados de la materia de origen vegetal con disolventes adecuados, la
evaporación de todo o casi todo el disolvente y el ajuste de los líquidos, masas o polvos residuales a los estándares prescritos.
Se pueden agregar sustancias inertes adecuadas como vehículos o diluyentes para mejorar las características físicas. Se pueden
agregar agentes antimicrobianos y otros conservantes adecuados para preservar la integridad. Los extractos pueden estar suje-
tos a procesos que aumentan el contenido de los componentes caracterizados, que disminuyan el contenido de componentes
no deseados, o ambos. Los extractos que no tienen sustancias inertes agregadas ni procesamientos más allá de la extracción se
llaman extractos naturales. En algunas preparaciones, la materia de origen vegetal puede tener un tratamiento previo median-
te la inactivación de enzimas y contaminantes microbianos, molienda, desengrasado o un procedimiento similar.
Los extractos se pueden definir como preparaciones con consistencia líquida, sólida o semisólida. Los productos obtenidos
mediante extracción son extractos líquidos, extractos en polvo, extractos semisólidos y tinturas.
 322 (565) Extractos Botánicos/ Pruebas Químicas USP 37

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

Percolación

En la fabricación de extractos, la percolación es un método comúnmente usado. El material sin refinar a extraer se reduce a
trozos de un tamar1o adecuado, si fuera necesario, luego se mezcla bien con una porción del disolvente especificado y se deja
en reposo durante aproximadamente 15 minutos. La mezcla se transfiere a un percolador, se agrega una cantidad suficiente
del disolvente especificado para cubrir toda la masa sólida y se deja percolar la mezcla lentamente (a una velocidad no mayor
de 1 mL por minuto por 1000 g de material), manteniendo la materia a extraer siempre recubierta con una capa de disolvente.
El residuo se puede prensar y el líquido obtenido se combina con el percolado. Los percolados totales se concentran, general-
mente por destilación a presión reducida, a fin de someter los contenidos de interés en el artículo bajo extracción al menor
calor posible.

Maceración

A menos que se especifique algo diferente, el material crudo a extraer se reduce a trozos del tamaño adecuado, se mezcla
bien con el disolvente de extracción especificado y se deja en reposo a temperatura ambiente en un recipiente cerrado durante
un tiempo adecuado, agitando frecuentemente hasta que la materia soluble se disuelva. La mezcla se filtra, la materia insoluble
se lava con el mismo disolvente usado para la maceración y los filtrados se combinan y concentran, por lo general a presión
reducida, hasta lograr la consistencia deseada.

PREPARACIONES

Extractos Líquidos

Los EXTRACTOS LÍQUIDOS son preparaciones de materia de origen vegetal que contienen alcohol como disolvente o como con-
servante, o ambos, y están hechos de forma que cada mL contiene los componentes extraídos de 1 g del material crudo que
representa, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Se pueden preparar a partir de extractos
adecuados y pueden contener conservantes anti microbianos o de otro tipo que sean adecuados.
Los extractos líquidos farmacopeicos se producen por perca/ación, a menudo después de un período de maceración. El di-
solvente requerido se especifica en la monografía individual. El procedimiento de fabricación común incluye la concentración
de las porciones más diluidas de percolado por evaporación o destilación al vacío a temperaturas por debajo de 60º. El tiempo
de maceración y la velocidad de flujo durante la percolación se pueden modificar para ajustarlos a la cantidad y naturaleza del
material sin refinar que se extrae, siempre que la composición de los componentes de interés extraídos no se altere negativa-
mente.
La velocidad de flujo del percolado puede ser lenta, moderada o rápida. Con referencia a la extracción de 1000 g del mate-
rial inicial, a una velocidad lenta, no se produce más de 1 mL de percolado por minuto; a una velocidad moderada, se produ-
cen entre 1 y 3 mL por minuto; y a una velocidad rápida, se producen entre 3 y 5 mL por minuto. Los extractos líquidos que
tienden a depositar sedimentos se pueden dejar en reposo por un tiempo y luego filtrar, o se puede decantar la porción trans-
parente, siempre que el líquido transparente resultante cumpla con las normas de la Farmacopea.

Extractos en Polvo

Los EXTRACTOS EN POLVO son preparaciones sólidas que tienen una consistencia polvorienta obtenida por evaporación del di-
solvente usado para la extracción. Pueden contener sustancias adecuadas agregadas, como por ejemplo excipientes, estabili-
zantes y conservantes. Los extractos en polvo estandarizados se ajustan al contenido definido de componentes, usando mate-
ria/es inertes adecuados o un extracto en polvo de la materia de origen vegetal usada para la preparación. Cuando correspon-
da, se especifica un límite para el disolvente en la monografía individual.

Extractos Semisólidos

Los EXTRACTOS SEMISÓLIDOS, también conocidos como extractos blandos o extractos pilulares, son preparaciones que tienen
una consistencia entre la de los extractos líquidos y la de los extractos en polvo y se obtienen por evaporación parcial del disol-
vente, agua, alcohol o mezclas hidroalcohólicas usadas como disolventes de extracción. Pueden contener conservantes antimi-
crobianos o de otro tipo que sean adecuados. Un extracto semisólido y un extracto en polvo obtenidos del mismo material son
intercambiables como fármacos o complementos, pero cada uno tiene sus propias ventajas.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (565) Extractos Botánicos 323

Requisitos Farmacopeicos Generales

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, los requisitos Farmacopeicos para los extractos líqui-
dos, extractos en polvo y extractos semisólidos son los siguientes.
Envasado y Almacenamiento-Almacenar en envases impermeables resistentes a la luz. [NOTA-Ver Conservación, Envasa-
do, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.]
Etiquetado-Etiquetar indicando el nombre de la parte de la planta usada, el nombre de los disolventes, con excepción de
los disolventes hidroalcohólicos, usados en la preparación, el contenido, en porcentaje, de los principios activos o compuestos
marcadores identificados en la monografía individual, y el nombre y la concentración de cualquier conservante anti microbiano
o de otro tipo. Cuando se desconocen los principios activos, se declara la relación entre el material inicial y el producto final.
Para los extractos semisólidos y extractos en polvo, se indica la identidad y la cantidad de todos los excipientes agregados. En
tales casos, se puede declarar el porcentaje de extracto natural.
Residuo de Evaporación-Transferir rápidamente aproximadamente 2 mL, determinados con exactitud, de Extracto Líqui-
do, aproximadamente 0,5 g de Extracto en Polvo, o aproximadamente 2 g de Extracto Semisólido a un matraz de fondo re-
dondo tarado. Evaporar hasta sequedad en un baño de agua y secar el residuo entre 100º y 1 05º durante 3 horas. Dejar que se
enfríe en un desecador sobre pentóxido de fósforo y determinar el peso del residuo obtenido: no menos del 95% de la mues-
tra de Extracto en Polvo permanece como residuo; o no menos del 70% de la muestra de Extracto Semisólido permanece co-
mo residuo. [NOTA-Los límites para los Extractos Líquidos se especifican en las monografías individuales.]
Disolventes Residuales-Si se prepara con disolventes que no sean alcohol, agua o mezclas de alcohol y agua, cumplen
con los requisitos para Disolventes Residuales (467). [NOTA-Ver en el documento de la ICH Impurezas: Disolventes Residuales
para obtener información relacionada.]
Residuos de Plaguicidas-Proceder según se indica en Artículos de Origen Botánico (561 ): cumple con los requisitos.
Metales pesados, Método 11 (231 ): 20 µg por g.
Contenido de Alcohol, Método 11 (611) (si estuviera presente): entre 90% y 110% de la cantidad declarada en la etiqueta de
C2 H50H se encuentra en Extracto Líquido y Extracto Semisólido.

Tinturas
Las TINTURAS son preparaciones líquidas, por lo general preparadas por extracción de materia vegetal con alcohol o mezclas
hidroalcohólicas. Tradicionalmente, las tinturas de artículos potentes de origen botánico representan la actividad de 1O g del
fármaco en 100 mL de tintura, ajustándose la concentración después de la prueba para ajustar el contenido de principios acti-
vos o compuestos marcadores. La mayoría de las demás tinturas vegetales representan 20 g de la respectiva materia vegetal en
100 mL de tintura.
Las diferentes tinturas no siempre se diluyen para obtener la misma relación de materia vegetal inicial con la tintura final.
Esta relación depende de los requisitos indicados en las pruebas específicas para contenido de principios activos o de compues-
tos marcadores incluidos en las monografías individuales. A medida que se preparan las tinturas, se valoran de acuerdo con
estas pruebas de contenido. Utilizando los valores obtenidos a partir de tales valoraciones, la concentración final de una tintura
se ajusta agregando más disolvente o evaporándolo parcialmente.
A menos que se especifique algo diferente, las tinturas generalmente se preparan a partir de polvo grueso o cortes finos de
materia vegetal, ya sea mediante un proceso de percolado o un proceso de maceración.

PROCESO DE PERCOLACIÓN

Mezclar cuidadosamente la mezcla de ingredientes molidos con una cantidad suficiente del disolvente de extracción indica-
do para humedecerlo de forma completa y uniforme, dejar en reposo durante 15 minutos, trasladar la mezcla a un percolador
adecuado y compactar la masa con firmeza. Verter una cantidad suficiente del disolvente de extracción indicado para saturar el
material a extraer y cubrir la parte superior del percolador. Cuando el líquido esté a punto de gotear, cerrar el orificio inferior y
dejar macerar durante 24 horas o durante el tiempo especificado en la monografía. Si la monografía individual no requiere
prueba de contenido de principios activos o compuestos marcadores, dejar que la percolación proceda lentamente o a la velo-
cidad indicada (ver definiciones de velocidad de flujo en Extractos Líquidos), agregar gradualmente una cantidad suficiente de
disolvente para producir 1000 mL de tintura y mezclar. Si se requiere una prueba de principios activos o compuestos marcado-
res, recolectar sólo 950 mL del percolado, mezclar y analizar una porción según se indica en la monografía individual. Diluir el
resto del percolado con la cantidad de disolvente de extracción que indique la prueba de contenido que es necesaria para
producir una tintura que cumple con los requisitos y mezclar.

PROCESO DE MACERACIÓN

Macerar el material a extraer con 750 mL del disolvente de extracción indicado en un recipiente cerrado y colocar en un
lugar tibio. Agitarlo con frecuencia durante 3 días o hasta que el material soluble se disuelva. Transferir la mezcla a un filtro.
 324 (565) Extractos Botánicos / Pruebas Químicas USP 37

Cuando se haya filtrado la mayor parte del líquido, lavar el residuo sobre el filtro con una cantidad suficiente del disolvente de
extracción indicado, combinar los filtrados para producir 1000 ml de tintura y mezclar.

REQUISITOS FARMACOPEICOS GENERALES

A menos que se especifique algo diferente en las monografías individuales, los requisitos Farmacopeicos para las tinturas son
los siguientes.
Envasado y Almacenamiento-Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz y protegerlos de la exposición a
la luz solar directa y al calor excesivo. [NOTA-Ver Conservación, Envasado, Almacenamientoy Etiquetado en Advertencias y Requi-
sitos Generales.]
Etiquetado-Declarar en la etiqueta el nombre de la parte de la planta usada para la preparación, el nombre del disolvente
o de la mezcla disolvente usada para la extracción, el contenido de los componentes de interés y la relación entre el material
inicial y el producto final.

(571) VALORACIÓN DE VITAMINA A

Cambio en la redacción:

•MÉTODOS QUÍMICOS

Procedimiento 1
El siguiente procedimiento se utilíza para la determinación de vitamina A en ingredientes dietéticos o ingredientes farmacéu-
ticos. Cumple con el procedimiento adoptado en 1956 para uso internacional por la lnternational Un ion of Pure and Applied
Chemistry (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada).
Realizar la valoración sin demora y tomar precauciones a lo largo del procedimiento para reducir al mínimo la exposición a la
luz actínica y al oxígeno atmosférico y otros agentes oxidantes, usando preferentemente material de vidrio con protección ac-
tínica y una atmósfera de gas inerte.
Para los artículos de prueba que contienen tocoferol, se debe usar un método cromatográfico apropiado.
Solución muestra: Pesar, contar o medir con exactitud una porción de la muestra de prueba, que se espera contenga el
equivalente a no menos de O, 15 mg de retino!, pero que no contenga más de 1 g de grasa. Si se presenta en forma de cápsu-
las, tabletas u otro sólido, de modo que no se puede saponificar de manera eficiente según las instrucciones descritas a conti-
nuación, someter a reflujo la porción tomada en 1O ml de agua en un baño de vapor durante aproximadamente 1O minutos,
triturar el sólido remanente con una varilla de vidrio de punta roma y entibiar durante aproximadamente 5 minutos más.
Transferir a un matraz de vidrio de borosilicato adecuado y agregar 30 ml de alcohol, seguidos por 3 ml de solución de
hidróxido de potasio (9 en 1O). Someter a reflujo en un aparato que sea completamente de vidrio de borosilicato durante 30
minutos. Enfriar la solución, agregar 30 ml de agua y transferir a un separador cónico. Agregar 4 g de sulfato de sodio decahi-
drato reducido a polvo fino. Extraer agitando con una porción de 150 ml de éter durante 2 minutos y luego, si se forma una
emulsión, con tres porciones de 25 ml de éter. Combinar los extractos etéreos, si fuera necesario, y lavar agitando por rota-
ción suave con 50 ml de agua. Repetir el lavado de manera más vigorosa con tr-es porciones adicionales de 50 ml de agua.
Transferir el extracto etéreo lavado a un matraz volumétrico de 250 ml, agregar éter a volumen y mezclar.
Evaporar una porción de 25,0 ml del extracto etéreo hasta aproximadamente 5 ml. Sin aplicar calor y con ayuda de una co-
rriente de gas inerte o vacío, continuar la evaporación hasta aproximadamente 3 ml. Disolver el residuo en un volumen de al-
cohol isopropílico suficiente para obtener una concentración esperada equivalente a 3 µg-5 ~tg de vitamina A por ml o para
obtener una absorbancia en el intervalo de 0,5-0,8 a 325 nm.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 ).)
Modo: UV
Longitudes de onda analíticas: 31 O; 325 y 334 nm
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isopropílico
Análisis
Muestra: Solución muestra
 USP 37 Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 325

Determinar las absorbancias de la Solución muestra a 31 O; 325 y 334 nm. Calcular la vitamina A, como contenido de retino!
(C 20 H 30 0), en mg, en la porción de muestra tomada, usando una de las siguientes fórmulas:
Resultado= (0,549 x A325 )/(L x C)

o
Resultado = (0,549 x [AmJ)/(L x C)

L =longitud de la celda de absorción (cm)

C =concentración en la solución final de alcohol isopropílico de la muestra de prueba (gil 00 ml) o cápsulas o tabletas
(unidades/l 00 ml)
[A 325 ] = absorbancia corregida a 325 nm, calculada:
Resultado= (6,815 x A325 ) - (2,555 x A310 ) - (4,260 x A334 )

Cada mg de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.
Usar la primera fórmula cuando A329 la absorbancia observada a 325 nm, esté entre [A 325 ]/l ,030 y [A 325 ]/0,970. Usar la se-
gunda fórmula cuando [A 325 ] tenga un valor menor que A325 /l ,030.
[NOTA-El intervalo de los límites de error para este procedimiento analítico, en el que se indica el grado de discrepancia
que se puede esperar en los resultados de diferentes laboratorios a P = 0,05, es aproximadamente ±8%.]
Procedimiento 2
Este procedimiento se usa para ingredientes dietéticos o ingredientes farmacéuticos en forma de ésteres de retinilo puro o
preparados a partir de ésteres de retinilo puro en un vehículo excipiente.
Solución muestra: Disolver 25-100 mg, pesados con exactitud, en 5 ml de pentano y diluir con alcohol isopropílico hasta
obtener una concentración esperada equivalente a 3-4,5 µg/ml de retino!.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 ).)
Modo: UV
Longitud de onda analítica: 326 nm
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isopropílico
Análisis
Muestra: Solución muestra
Calcular la vitamina A, como contenido de retino! (C 20 H30 0), en mg, en la porción de muestra tomada:
Resultado= (0,570 x A326 )/(L x C)

A326 = absorbancia a 326 nm

L =longitud de la celda de absorción (cm)
C =concentración de la Solución muestra (g/l 00 ml)
Cada mg de vitamina A, como retino! (C 20 H3p), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para· la determinación de vitamina A como un ingredien-
te farmacéutico activo, como un ingrediente de suplemento dietético o como un componente de suplementos dietéticos o de
medicamentos terminados.
A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmósfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan
de la muestra de prueba y de los Estándares de Referencia, usando preferiblemente una atmósfera de gas inerte y material de
vidrio con protección actínica.
Cuando se especifique una forma de éster de vitamina A (acetato de retinilo o palmitato de retinilo) en el siguiente procedi-
miento, usar la forma química presente en la formulación y el Estándar de Referencia USP correspondiente.
Estándares de Referencia USP (11)
ER Acetato de Retinilo USP
ER Palmitato de Retinilo USP
Procedimiento 1
Éste es un procedimiento neutro que implica simplemente la disolución de la muestra directamente en hexano y su inyec-
ción en el cromatógrafo de líquidos o la extracción de la muestra disolviéndola primero en dimetil sulfóxido, seguida por una
extracción líquido-líquido de la vitamina A con hexano. Aunque su sistema cromatográfico puede separar los isómeros 1 3-cis y
todo trans de vitamina A, únicamente se usa el pico del isómero todo trans para la cuantificación de vitamina A. El procedi-
miento se puede usar para determinar la vitamina A en una materia prima, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, en Cápsulas
de Vitaminas Oleosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, en Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e
 •
326 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas USP 37

Hidrosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y en Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e
Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individudles, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y la Solución de
aptitud del sistema se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano
Solución estándar 1: 15 µg/ml de retino!, 1 a partir de ER Acetato de Retinilo USP en n-hexano
Solución estándar 2: 15 µg/ml de retinol,2 a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en n-hexano
Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar 1 y de Solución estándar 2.
Solución muestra para materias primas: Transferir acetato de retinilo o palmitato de retinilo, pesados con exactitud,
equivalente a 15 mg de retino!, a un matraz volumétrico de 100 ml, disolver y diluir con n-hexano a volumen y mezclar. Pipe-
tear y transferir 5,0 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 50 ml, diluir con n-hexano a volumen y mezclar.
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, que no
exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retino! (C 20 H300), a un tubo de centrífuga con tapa de
rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 ml de
n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua manteni-
do a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa.]
Centrifugar a 3000 rpm durante 1 O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar
3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5
minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones
adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta
solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración nominal de 15 µg/ml de vitamina A, como retino!
(C 20 H300). [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.]
Solución muestra para Cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mezclar
y pesar. Transferir una porción de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como
retino! (C 20 H300), a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.[NOTA-Para Cápsulas de
gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas, cortando las cubiertas de las Cápsu-
las para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado, y triturando hasta formar una masa ho-
mogénea. Transferir una porción de la masa, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retino! (C 20 H300), a un
tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.] Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfóxi-
do y aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas y agitar durante 45 minutos en un agita-
dor en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle
de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1 O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a
un matraz volumétrico. Agregar 3 ml de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido,
agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir
esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volu-
men. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración nominal de
15 µg/ml de vitamina A, como retino! (C20 H30 0). [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 µm
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 40 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar 1 o Solución estándar 2
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1O entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retini-
lo, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar 1 o Solución estándar 2
Análisis
Muestras: Solución estándar 1 o Solución estándar 2 y la Solución muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retino! (C20 H30 0), en la porción de muestra tomada:
Resultado= (rufr5) x (CsfCu) x 100
ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra correspondiente
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar 1 o la Solución estándar 2
C5 = concentración de retino! (C 20 H30 0) en la Solución estándar 1 o la Solución estándar 2 (µg/ml)

1 Usar el valor de 0,872 para convertir acetato de retinilo en su equivalente de retino!.

2 Usar el valor de 0,546 para convertir palmitato de retinilo en su equivalente de retino!.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (571 >Valoración de Vitamina A 327

Cu= concentración de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/mL)

Procedimiento 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con ácido sulfúrico metanólico, seguido por extracción con 2,2,4-
trimetilpentano. La preparación muestra se puede usar para la formulación que contiene vitaminas A, D y E. La aplicación in-
cluye Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolu-
bles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y
Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra, la Solución de
aptitud del sistema y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y acetato de etilo (99,7: 0,3)
Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metanol en un
matraz volumétrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metano! a volumen.
Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumé-
trico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 ml de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen.
Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solución estándar 1: 15 µg/ml de retinoP, a partir de ER Acetato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solución estándar 2: 15 µg/ml de retinol 2, a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar 1 y de Solución estándar 2.
Solución muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina O
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción del polvo
nominalmente equivalente a una cantidad entre 0,4 mg y 2,5 mg retinol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de
Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de
ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya ce-
sado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un
mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico
metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar
12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1 O minu-
tos. Centrifugar durante 1 O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera nece-
sario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cerca-
na a la de la Solución estándar.
Solución muestra para Cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una
cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el conteni-
do a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando
con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire
seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cáp-
sulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 2,5 mg de la cantidad declarada de vitamina A, como
retinol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 ml de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en
un mezclador de vórtice. Agregar 6 ml de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se
desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales.
Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minu-
tos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspen-
sión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar
una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y para que el sobrena-
dante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpenta-
no hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar.
Sistema cromatográfico
0fer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 µm
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Volumen de inyección: 40 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 8,0 entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retini-
lo
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
 328 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas USP 37

Análisis
Muestras: Solución estándar 7 o Solución estándar 2 y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retino! (C 20 H30 0), en la porción de muestra tomada:
Resultado= (rufr5) x (CsfCu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2
C5 == concentración de retino! (C 20 H300) en la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 (~1g/ml)
Cu= concentración nominal de vitamina A, como retino! (C 20 H30 0), en la Solución muestra (µg/ml). [NOTA-Usar 26,5 ml
como el volumen final de la Solución muestra para calcular la concentración nominal.]
Procedimiento 3
Este procedimiento emplea la saponificación del estándar y de la muestra, seguida por una extracción líquido-líquido de
vitamina A a partir de la muestra con una mezcla de n-hexano y cloruro de metileno (3:1 ). Se pueden caracterizar y cuantificar
los isómeros 1 3-cis y todo trans de vitamina A. El procedimiento se puede usar para Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cáp-
sulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hi-
drosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidro-
solubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y alcohol isopropílico (92:8)
Disolvente de extracción: n-Hexano y cloruro de metileno (3:1)
Solución de hidróxido de potasio: 800 mg/ml de hidróxido de potasio en agua. [NOTA-Agregar cuidadosamente el hi-
dróxido de potasio al agua. Mezclar y enfriar.)
Diluyente: 1 O mg/ml de pirogalol en alcohol
Solución estándar: Diluir ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo USP con Diluyente hasta obtener una con-
centración de 8,5 µg/ml de retino11, 2 (C 20 H300). Transferir 10,0 ml de esta solución a un matraz de 125 ml con tapón y agre-
gar 5 ml de agua, 5 ml de Diluyente y 3 ml de Solución de hidróxido de potasio. Ajustar bien el tapón, agitar durante 15 minu-
tos sobre un baño de agua mantenido a 60 ± 5º y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disol-
vente de extracción. Ajustar bien el tapón y agitar vigorosamente durante 60 segundos. Enjuagar las paredes del matraz con
60 ml de agua y dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen. Retirar una porción de la capa orgánica
para inyectarla en el cromatógrafo. Esta Solución estándar contiene 3,4 µg/ml de retino!.
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adhe-
rido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las
Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y
calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 1,3 mg
de retino!, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de Solución de hidróxido de
potasio. Ajustar bien el tapón, agitar durante 15 minutos sobre un baño de agua mantenido a 60 ± 5º y enfriar a temperatura
ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el tapón y agitar vigorosamente durante
60 segundos, o más si fuera necesario, para completar la extracción. Enjuagar las paredes del matraz con 60 ml de agua y
dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No agitar porque podría formarse una emulsión.]
Retirar una porción de la capa orgánica y diluir cuantitativamente, y en diluciones sucesivas si fuera necesario, con Disolvente
de extracción para obtener una concentración de 3,4 µg/ml de retino!. ·
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino un número contado de Tabletas. Transferir una porción del polvo,
equivalente a 1,3 mg de retinol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de
Solución de hidróxido de potasio. Tapar herméticamente, agitar durante 15 minutos sobre un baño de agua mantenido a 60 ± 5º
y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el tapón y agitar
vigorosamente durante 60 segundos, o más si fuera necesario, para completar la extracción. Enjuagar las paredes del matraz
con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No agitar porque podría
formarse una emulsión.] Retirar una porción de la capa orgánica y diluir con Disolvente de extracción para obtener una concen-
tración de 3,4 µg/ml de retino!.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 335 nm
Columna: 6,2 mm x 8 cm; relleno L3
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 4 ml/min
Volumen de inyección: 50 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
 USP 37 Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 329

Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la porción de muestra tomada:
Resultado= (rnlrr2 ) x (CsfCu) x 100

rn = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de éster de retinilo y 1 3-cis de éster de retinilo de la
Solución muestra
rr2 = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de éster de retinilo y 13-cis de éster de retinilo de la
Solución estándar
C5 =concentración de retinol (C 20 H 300) en la Solución estándar (µg/ml)
Cu= concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/mL)
Procedimiento 4
Este procedimiento emplea una extracción líquido-líquido de vitamina A a partir de la muestra con hexano, seguida por la
evaporación de hexano y la reconstitución del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1 ). Se puede usar
para la determinación de vitamina A en la Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles y la Solución Oral de Vita-
minas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y el Diluyente se prepa-
ran según se indica a continuación.
Fase móvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1)
Solución estándar: 0,33 mg/ml de retinol1· 2 (C 20 H300), a partir de ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo
USP en Diluyente
Solución muestra para formas farmacéuticas líquidas: Transferir un volumen medido con exactitud de Solución Oral,
equivalente a 3, 3 mg de retinol, a un embudo de separación de 500 ml que contenga 1Oml de agua y 20 ml de alcohol des-
hidratado. Agregar 150 ml de éter de petróleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 ml de éter de petróleo,
tapar, agitar y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y filtrar el extracto de éter de petróleo en un matraz de
fondo redondo de 500 ml a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solución hasta sequedad con ayuda de un evapora-
dor rotatorio sobre un baño de agua mantenido a aproximadamente 65º. Agregar inmediatamente 10,0 mL de Diluyente, agi-
tar por rotación suave hasta disolver el residuo y filtrar.
Sistema cromatográfico
0fer Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 50 cm (dos columnas concatenadas de 4,6 mm x 25 cm cada una); relleno L1
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 5,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20H 3p), en la porción de muestra tomada:
Resultado = (ruf r5) x ( Csf Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar
C5 = concentración de retinol (C 20H 300) en la Solución estándar (µg/ml)
Cu= concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20H 300), en la Solución muestra (µg/mL)
"-USP31
 330 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas USP 37

(581) VALORACIÓN DE VITAMINA D

Cambio en la redacción:

•MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de vitamina D como ingrediente
farmacéutico activo, como ingrediente de suplemento dietético o como componente de formas farmacéuticas farmacopeicas.
Durante toda esta valoración, proteger de la atmósfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
Estándar de Referencia y las que deriven de éstos, usando preferentemente una atmósfera de gas inerte y material de vidrio
con protección actínica.
Cuando se especifique vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) en el siguiente procedimiento, usar la forma química pre-
sente en la formulación y el Estándar de Referencia USP pertinente.
Estándares de Referencia USP (11 >
ER Colecalciferol USP
ER Ergocalciferol USP
ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP
Procedimiento 1
Este procedimiento usa una preparación de la muestra sin ajuste de pH y conlleva el uso de dimetil sulfóxido para disolver
los excipientes en la muestra, seguido por una extracción líquido-líquido de la vitamina D con hexano. La separación cromato-
gráfica se logra usando modo de fase normal sobre una columna L8. Se puede usar para determinar vitamina D sola o en com-
binación con otras vitaminas y minerales en formas farmacéuticas farmacopeicas.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y la Solución de aptitud
del sistema se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y alcohol isopropílico (99:1)
Solución estándar: 2 µg/ml de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en n-hexano
Solución de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solución estándar a 60º durante 1 hora para isomerizar parcial-
mente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, que no
exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrífu-
ga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfóxido y aproximada-
mente 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de
agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa
y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano
con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de
dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz
volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico
con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración
de 2 µg/mL de colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.]
Solución muestra para Cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mezclar y
pesar. Transferir una porción de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D, como
colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. [NOTA-Para
Cápsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas cortando las cubiertas de
las Cápsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y triturando hasta formar una
masa homogénea. Transferir una porción de la masa, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D, como colecalciferol o
ergocalciferol, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.] Agregar aproximadamente
2 mL de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas y agitar durante 45
minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del
recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1 O
minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de
contenido de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de he-
xano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir
los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obte-
ner una solución con una concentración de 2 µg/mL de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podría no ser
necesaria la dilución.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
 USP 37 Pruebas Químicas / (581) Valoración de Vitamina D 3 31

Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 µm

Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 100 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución estándar y Solución de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1O entre la forma presente de vitamina D y su precursor correspondiente, Solución de aptitud del
sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de mues-
tra tomada:
Resultado= (ruf rs) x (C,!Cu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
F =factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solución
muestra, 1,09
Procedimiento 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con bicarbonato de sodio, una solución ácida antioxidante que ge-
nera la emisión de gas; lecitina como surfactante; y dimetil sulfóxido, seguido por ácido sulfúrico metanólico para crear una
dispersión y extraer de manera eficiente la vitamina D de los componentes de la matriz en la fase de 2,2,4-trimetilpentano. La
separación se logra en un modo de fase normal sobre una columna L24. La preparación muestra y el Sistema cromatográfico
usados en este procedimiento también son adecuados para determinar vitamina A y E cuando se encuentran presentes en la
formulación; los analistas deben realizar los ajustes correspondientes en el tamaño de la muestra y longitud de onda de detec-
ción.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra, la Solución de aptitud
del sistema y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y alcohol butílico terciario (98,75: 1,25)
Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metano! en un
matraz volumétrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metano! a volumen.
Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumétrico
de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen.
Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solución estándar: 1 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solución de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solución estándar a 60º durante 1 hora para isomerizar parcial-
mente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solución muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y
vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad. de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción del polvo
nominalmente equivalente a una cantidad de no menos de O, 1 mg de vitamina D. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio,
1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de
Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta
que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mez-
clar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido
sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar
12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minu-
tos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera nece-
sario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cerca-
na a la de la Solución estándar.
Solución muestra para Cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y
vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una
cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el conteni-
do a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando
con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire
seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cáp-
sulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a no menos de O, 1 mg de la cantidad declarada de
 332 (581) Valoración de Vitamina D /Pruebas Químicas USP 37

vitamina D, como colecalciferol o ergocalciferol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 ml de Solución de lecitina y
12,5 ml de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 ml de Solución de ascorbato de sodio-piro-
galol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases
y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 ml de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta
formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 ml de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un
mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 ml de 2,2,4-trimetilpentano,
mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos
para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volu-
men del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 µm
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 40 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución estándar y Solución de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 4,0 entre la forma de vitamina D presente y su precursor correspondiente, Solución de aptitud del
sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de mues-
tra tomada:
Resultado= (rulr;J x (CsfCu) x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
Procedimiento 3
Este procedimiento es adecuado para matrices con excipientes que son solubles o degradables en condiciones alcalinas. Em-
plea la saponificación de la solución muestra, seguida por una extracción líquido-líquido con hexano y una limpieza por ex-
tracción en fase sólida (EFS) usando una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isopropílico (99,8: 0,2) como eluyente. La
Solución estándar se somete a un tratamiento similar para compensar pérdidas en la recuperación debidas a la isomerización.
Posteriormente, el eluato se evapora y el residuo se reconstituye en acetonitrilo antes de inyectarlo en el cromatógrafo. La se-
paración se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones reacti-
vo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: Acetonitrilo y metanol (91 :9)
Ácido acético diluido: Solución de ácido acético glacial (1 en 1O) en agua
Solución de fenolftaleína: 1O mg/mL de fenolftaleína en alcohol
Solución de hidróxido de potasio: Disolver lentamente 14 g de hidróxido de potasio en una mezcla de 31 ml de alcohol
deshidratado y 5 ml de agua. Preparar en el día de su uso.
Disolvente de extracción: Cloruro de metileno y alcohol isopropílico (99,8:0,2)
Columna de extracción: Relleno de sílice con una relación entre la masa del sorbente y el volumen de la columna de
500 mg a 2,8 ml o equivalente. [NOTA-Acondicionar la columna lavándola inicialmente con 4,0 ml de una mezcla de cloruro
de metileno y alcohol isopropílico (4:1 ), seguida de 5,0 ml de Disolvente de extracción. No dejar que la columna se seque.]
Solución madre del estándar: 0,2 mg/ml de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en alcohol deshidratado. [NOTA-
Preparar cada 4 semanas. Almacenar en un congelador.]
Solución estándar: Diluir un volumen de Solución madre del estándar con alcohol deshidratado hasta obtener una concentra-
ción de 5 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP. Preparar esta solución en el día de su uso. Transferir 2,0 ml
de esta solución a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 15,0 mL de agua y 15,0 mL de Solución de hidróxido de potasio,
tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se enfríe a temperatura ambiente y transfe-
rir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 mL. Agregar 15,0 ml de agua al matraz, tapar, agitar vigorosa-
mente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz con 60 mL de n-hexano y transferir el enjuague al
embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que las
capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a la capa de hexano en el embudo de separa-
ción, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa
 USP 37 Pruebas Químicos/ (581) Valoración de Vitamina D 333

acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,0 ml de agua al embudo de separación. Agregar Ácido acético diluido,
gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen.
Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeño
trozo de algodón, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml
de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50º
hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Transferir esta solución a
una Columna de extracción en fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de
Disolvente de extracción y transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente de extracción y dese-
char esta fracción. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar
el matraz en un baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agre-
gar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo.
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, equivalen-
te a 1 O pg de colecalciferol o ergocalciferol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0 ml de Solución
de hidróxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se enfríe a tempera-
tura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 ml. Agregar 15,0 ml de agua al matraz,
tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz con 60 ml de n-hexano y
transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante
15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a la capa de hexano
en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen
y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,0 ml de agua al embudo de separación. Agregar
Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las
capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado
sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio
con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evapora-
dor rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Trans-
ferir esta solución a una Columna de extracción en fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo re-
dondo con 1,0 ml de Disolvente de extracción y transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente
de extracción y desechar esta fracción. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz
adecuado. Colocar el matraz en un baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente
de nitrógeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo.
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin per-
der material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 1 00 ml. Retirar cualquier contenido adherido
a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las
Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y
calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 1 Oµg
de ergocalciferol o colecalciferol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0 ml de Solución de hidróxi-
do de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se enfríe a temperatura
ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 ml. Agregar 15,0 ml de agua al matraz,
tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz con 60 ml de n-hexano y
transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante
15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a la capa de hexano
en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen
y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,o" ml de agua al embudo de separación. Agregar
Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las
capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado
sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio
con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evapora-
dor rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Trans-
ferir esta solución a una Columna de extracción en fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo re-
dondo con 1,0 ml de Disolvente de extracción y transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente
de extracción y desechar esta fracción. Eluir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz
adecuado. Colocar el matraz en un baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente
de nitrógeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 ~tm
Temperatura de la columna: 27º
Velocidad de flujo: 0,7 ml/min
Volumen de inyección: 15 pl
 334 (581) Valoración de Vitamina D /Pruebas Químicas USP 37

Aptitud del sistema

Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 4,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de mues-
tra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (CsfCu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C, =concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (~tg/mL)
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
F = factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solución
muestra, 1,09
Procedimiento 4
Este procedimiento se aplica a formas farmacéuticas líquidas. Emplea una extracción líquido-líquido de la muestra con hexa-
no, seguida por la evaporación del hexano y la reconstitución del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo
(1 :1 ). La separación se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y el Diluyente se prepa-
ran según se indica a continuación.
Fase móvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1)
Solución estándar: 5 µg/ml de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Diluyente
Solución muestra: Transferir un volumen medido con exactitud de la muestra, equivalente a 50 µg de colecalciferol o ergo-
calciferol, a un embudo de separación de 500 ml que contenga 1O mL de agua y 20 ml de alcohol deshidratado. Agregar
150 mL de éter de petróleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 ml de éter de petróleo, tapar, agitar y dejar
que las capas se separen. Desechar la capa acuosa. Escurrir el extracto de éter de petróleo en un matraz de fondo redondo de
500 mL a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solución hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre
un baño de agua mantenido a aproximadamente 65º. Agregar inmediatamente 10,0 ml de Diluyente, agitar por rotación sua-
ve hasta disolver el residuo y filtrar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: Dos columnas, 4,6 mm x 25 cm, conectadas en serie; ambas con relleno L1
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 5,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de mues-
tra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (CsfCu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 "' concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
F = factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solución
muestra, 1,09
Procedimiento 5
Este procedimiento emplea la disolución de vitamina D en tolueno y la solución se inyecta en el cromatógrafo de líquidos.
Se puede aplicar a matrices simples tales como vitaminas puras e ingredientes que no requieren saponificación y que son solu-
bles en tolueno. La separación se logra en modo de fase normal.
 USP 37 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 335

A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y la Solución de aptitud
del sistema se preparan según se indica a continuación.
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatográfica rellenando un tubo cromatográfico, de 8 cm x 60 cm, con
500 g de tierra silícea para cromatografía de 50 a 250 ~tm, activada mediante secado a 150º durante 4 horas. (Ver Cromatogra-
fía (621 ), Cromatografía en Columna.) Pasar 500 ml de hexano a través de la columna y recoger el eluato en un matraz con
tapón de vidrio.
Fase móvil: Alcohol n-amílico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solución de aptitud del sistema: 250 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP en 1O ml de una
mezcla de tolueno y Fase móvil (1 :1 ). Calentar esta solución a reflujo a 90º durante 45 minutos y enfriar. [NOTA-Esta solución
contiene colecalciferol, precolecalciferol y trans-colecalciferol. Para las soluciones madre, seguir estos procedimientos: usar ma-
terial de vidrio con protección actínica, disolver las muestras sin calentar y preparar las soluciones en el día de su uso.]
Solución madre del estándar: 0,6 mg/ml de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno
Solución estándar: 120 µg/ml de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Fase móvil, preparada a partir de Solución
madre del estándar
Solución madre de la muestra: 0,6 mg/ml of colecalciferol o ergocalciferol en tolueno
Solución muestra: 120 µg/ml de colecalciferol o ergocalciferol en Fase móvil, preparada a partir de Solución madre de la
muestra
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: Se puede variar para cumplir con los Requisitos de aptitud del sistema
Volumen de inyección: 5-1 OµL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, res-
pectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de mues-
tra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru =respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
Procedimiento 6 ·
El procedimiento emplea la disolución de la muestra en Fase móvil y la solución se inyecta en el cromatógrafo de líquidos. La
aplicación incluye colecalciferol y ergocalciferol disueltos en aceite vegetal comestible, polisorbato 80 o propilenglicol, ningu-
no de los cuales interferirá con el precursor correspondiente de modo que éste pueda cuantificarse. La separación se logra en
modo de fase normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separación de las formas trans de los precurso-
res de vitamina D.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar y la Solución muestra se preparan según
se indica a continuación.
Fase móvil: Hexano y pentanol (997:3)
Solución madre del estándar: Disolver ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno y diluir con Fase móvil hasta
50 µg/ml. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
Solución estándar A: 5 µg/ml, a partir de Solución madre del estándar en Fase móvil. [NOTA-Almacenar a una temperatura
que no exceda de Oº.]
Solución estándar B: Transferir 5,0 ml de Solución madre del estándar a un matraz de fondo redondo equipado con un con-
densador de reflujo. Desplazar el aire con nitrógeno y someter a reflujo durante 1 hora en un baño de agua bajo una atmósfe-
ra de nitrógeno para obtener una solución que contenga colecalciferol y precolecalciferol. Enfriar, transferir la solución con
ayuda de varias porciones de Fase móvil a un matraz volumétrico de 50 mL y diluir con Fase móvil a volumen.
Solución muestra: Equivalente a 5 µg/ml de colecalciferol o ergocalciferol en Fase móvil, a partir de un volumen de muestra
medido con exactitud
 336 (581) Valoración de Vitamina D /Pruebas Químicas USP 37

Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Velocidad de flujo: 1-2 mL/min
Volumen de inyección: 10-20 ~tL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar B (ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP)
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol y colecalciferol son aproximadamente 0,4 y 1,0, respectiva-
mente, y aproximadamente 0,8 y 1,0 para pre-ergocalciferol y ergocalciferol, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,0 entre los picos de precolecalciferol y colecalciferol. No menos de 1,0 entre los picos de pre-
ergocalciferol y ergocalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol
Análisis
Muestras: Solución estándar A, Solución estándar By Solución muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, Fe:

Fe= C5/r5
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/mL)
r5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentración, C' 9 en µg/mL, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B:

C's=Fexr's
Fe= factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
r' 5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar B
Calcular la concentración, Cpre, en µg/mL, de precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml)

C 5 = concentración de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B (µg/mL)
Calcular el factor de respuesta, Fpre' para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

Fpre = C'p,/rp
e ore= concentración de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (µg/mL)
r0 = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución estándar B
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como colecalciferol (C 27 H44 0) o como ergocalciferol (C 28 H44 0)
en la porción de muestra tomada: ·

Resultado= {[(Fe x re)+ (Fpre x rpre)]!Cu} x 100

Fe= factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol

re= área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra
FrrP = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
r0 ,e = área del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución muestra
Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
Procedimiento 7
Este procedimiento emplea la saponificación de la muestra, seguida por una extracción líquido-líquido con éter-éter de pe-
tróleo y por la evaporación del éter-éter de petróleo y la reconstitución del residuo en una mezcla de tolueno y Fase móvil
(1 :4). Se aplica a soluciones en aceite y cápsulas que contengan soluciones de vitamina D en aceite, en las que el aceite no
interfiera con el precursor correspondiente de modo que éste pueda cuantificarse. La separación se logra en modo de fase nor-
mal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separación de las formas trans de los precursores de vitamina D.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, la Solución muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatográfica rellenando un tubo cromatográfico, de 8 cm x 60 cm, con
500 g de tierra silícea para cromatografía de 50 a 250 µm, activada mediante secado a 150º durante 4 horas. (Ver Cromatogra-
 USP 37 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 337

fía (621 ), Cromatografía en Columna.) Pasar 500 ml de hexano a través de la columna y recoger el eluato en un matraz con
tapón de vidrio.
Fase móvil: Alcohol n-amílico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solución de butil hidroxitolueno: 1O mg/ml de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografía
Solución acuosa de hidróxido de potasio: 1 g/ml de hidróxido de potasio en agua recientemente calentada a ebullición.
[NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
Solución alcohólica de hidróxido de potasio: 3 g de hidróxido de potasio en 50 ml de agua recientemente calentada a
ebullición. Agregar 1O ml de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullición hasta 100 ml. [NOTA-Preparar
esta solución en el día de su uso.]
Solución de ascorbato de sodio: Disolver 175 mg/mL de ácido ascórbico en hidróxido de sodio 1 N. [NOTA-Preparar en el
día de su uso.]
Solución de sulfuro de sodio: 12 g de sulfuro de sodio en 20 ml de agua. Diluir con glicerina hasta 100 ml.
Solución madre del estándar: 0,5 mg/ml de ER Ergocalciferol USP o ER Colecalciferol USP en tolueno. [NOTA-Preparar esta
solución en el día de su uso.]
Solución estándar A: 20 µg/ml, a partir de Solución madre del estándar en Fase móvil. [NOTA-Almacenar esta solución a una
temperatura que no exceda de Oº.]
Solución estándar B: Pipetear y transferir 4 ml de Solución madre del estándar a un matraz de fondo redondo equipado con
un condensador de reflujo y agregar 2 ó 3 cristales de butil hidroxitolueno. Desplazar el aire con nitrógeno y calentar en un
baño de agua mantenido a una temperatura de 90º con luz tenue bajo una atmósfera de nitrógeno durante 45 minutos para
obtener una solución que contenga vitamina D y pre-vitamina D. Enfriar, transferir con ayuda de varias porciones de Fase móvil
a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir con Fase móvil a volumen.
Solución de aptitud del sistema: Agregar 100 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP a un matraz
volumétrico de 1O ml. Agregar una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase móvil a volumen y mezclar. Calentar una porción de esta
solución a reflujo a 90º durante 45 minutos y enfriar.
Solución muestra: Someter a reflujo no menos de 1O Cápsulas con una mezcla de 1O mL de Solución de ascorbato de sodio y
2 gotas de Solución de sulfuro de sodio en un baño de vapor durante 1O minutos, triturar los sólidos remanentes con una varilla
de vidrio de punta roma y continuar el calentamiento durante 5 minutos. Enfriar y agregar 25 mL de alcohol y 3 mL de Solu-
ción acuosa de hidróxido de potasio. Someter la mezcla a reflujo en un baño de vapor durante 30 minutos. Enfriar rápidamente
bajo una corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador cónico, enjuagando el matraz de saponificación
con dos porciones de 15 ml de agua, 1Oml de alcohol y dos porciones de 50 ml de éter. [NOTA-Usar el éter dentro de las 24
horas después de abrir el envase.] Agitar vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30 segun-
dos y dejar en reposo hasta que ambas capas se tornen transparentes. Transferir la fase acuosa a un segundo separador cónico,
agregar una mezcla de 1O mL de alcohol y 50 ml de éter de petróleo y agitar vigorosamente. Dejar que se separen, transferir
la fase acuosa a un tercer separador cónico y transferir la fase de éter de petróleo al primer separador, enjuagando el segundo
separador con dos porciones de 1Oml de éter de petróleo y agregando los enjuagues al primer separador. Agitar la fase acuo-
sa en el tercer separador con 50 mL de éter de petróleo y agregar la fase de éter de petróleo al primer separador. Lavar los
extractos combinados de éter-éter de petróleo agitando vigorosamente con tres porciones de 50 mL de Solución alcohólica de
hidróxido de potasio y lavar vigorosamente con porciones de 50 mL de agua hasta que el último lavado sea neutro frente a la
fenolftaleína. Escurrir las gotas de agua remanentes de los extractos combinados de éter-éter de petróleo, agregar 2 láminas
de papel de filtro de 9 cm en tiras al separador y agitar. Transferir los extractos lavados de éter-éter de petróleo a un matraz de
fondo redondo, enjuagando el separador y el papel con éter de petróleo. Combinar los enjuagues de éter de petróleo con los
extractos de éter-éter de petróleo, agregar 100 µL de Solución de butil hidroxitolueno y mezclar. Evaporar hasta sequedad al
vacío agitando por rotación suave en un baño de agua mantenido a una temperatura no superior a 40º. Enfriar bajo una co-
rriente de agua e introducir nitrógeno suficiente para restaurar la presión atmosférica. Disolver y diluir el residuo sin demora en
un volumen medido con exactitud de una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase móvil, hasta que la concentración de vitamina D
sea aproximadamente 25 µg/ml.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Velocidad de flujo: 1-2 mL/min
Volumen de inyección: 10-20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, res-
pectivamente.
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
 338 <581) Valoración de Vitamina D /Pruebas Químicas USP 37

Análisis
Muestras: Solución estándar A, Solución estándar By Solución muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, F0 :

Fo=Csfrs
C5 = concentración de ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml)
r5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentración, C' 9 en µg/ml, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B:

C's=Foxr's
F0 .~factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
r' 5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar B
Calcular la concentración, C'1"'" en µg/ml, para pre-ergocalciferol:

C5 = concentración de ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml)

C' 5 = concentración de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B (µg/ml)
Calcular el factor de respuesta, Fr,e' para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

e pre= concentración de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (µg/ml)

rr = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución estándar B
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como ergocalciferol (C 28 H44 0) o como colecalciferol (C 27 H44 0)
en la porción de muestra tomada:

Resultado= {[(F0 x re)+ (Fpre x r'pre)]!Cu} x 100

F0 =factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol

re= área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra
Fore = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
r' ore= área del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución muestra
Cu= concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/ml)
Procedimiento 8
Este procedimiento es adecuado para la determinación de colecalciferol en aceites y matrices grasas. Emplea dos sistemas
cromatográficos, uno para la limpieza de la muestra y el otro para la determinación de vitamina D. El estándar, estándar inter-
no y las soluciones muestra se someten a saponificación, seguida por una extracción líquido-líquido con una mezcla de éter y
hexano (1 :1). El extracto se evapora y reconstituye en la Solución de butil hidroxitolueno.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra, la Solución de es-
tándar interno y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Solución A: Alcohol n-amílico y hexano deshidratado (3:997) ·
Solución B: Acetonitrilo, agua y ácido fosfórico (96: 3,8: 0,2)
Solución de butil hidroxitolueno: 1Omg/ml de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografía
Solución acuosa de hidróxido de potasio: Disolver 800 mg de hidróxido de potasio en 1000 ml de agua recientemente
calentada a ebullición, mezclar y enfriar. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
Solución alcohólica de hidróxido de potasio: Disolver 3 g de hidróxido de potasio en 50 ml de agua recientemente calen-
tada a ebullición, agregar 1O ml de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullición hasta 100 ml. [NOTA-Pre-
parar esta solución en el día de su uso.]
Solución de ácido ascórbico: 100 mg/ml de ácido ascórbico en agua. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
Solución de estándar interno: 5 ¡1g/ml de ER Ergocalciferol USP en alcohol
Solución madre del estándar: 5 µg/ml de ER Colecalciferol USP en alcohol
Solución estándar: Transferir 2,0 ml de Solución madre del estándar y 2,0 ml de Solución de estándar interno a un matraz de
fondo redondo. Proceder según se indica en Solución muestra 7 comenzando donde dice "Agregar 5 ml de ... ".
Solución muestra 1: Transferir 4,00 g de aceite a un matraz de fondo redondo. Agregar 5 ml de Solución de ácido ascórbico,
100 ml de alcohol y 1 O ml de Solución acuosa de hidróxido de potasio y mezclar. Someter la mezcla a reflujo en un baño de
vapor durante 30 minutos. Agregar 100 ml de una solución de cloruro de sodio de 1 O mg/ml. Enfriar rápidamente bajo una
corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador de 500 ml, enjuagando el matraz de saponificación con
75 ml de una solución de cloruro de sodio de 1O mg/ml y luego con 150 ml de una mezcla de éter y hexano (1 :1 ). Agitar
vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30 segundos y dejar en reposo hasta que ambas
 USP 37 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 339

capas se tornen transparentes. Desechar la capa inferior. Lavar los extractos de éter y hexano agitando vigorosamente con
50 mL de Solución alcohólica de hidróxido de potasio y luego lavando con tres porciones de 50 mL de una solución de cloruro de
sodio de 1O mg/ml. Filtrar la capa superior a través de 5 g de sulfato de sodio anhidro sobre un papel de filtración rápida en
un matraz de 250 mL adecuado para un evaporador rotatorio. Lavar el filtro con 1O mL de una mezcla de éter y hexano (1: 1),
y combinar con el extracto. Evaporar el disolvente a presión reducida a una temperatura que no exceda de 30º y llenar con
nitrógeno cuando la evaporación se haya completado. Alternativamente, evaporar el disolvente bajo una corriente suave de
nitrógeno a una temperatura que no exceda de 30º. Disolver el residuo en 1,5 mL de Solución de butil hidroxitolueno. [NOTA-
Puede ser necesario calentar suavemente en un baño ultrasónico. Una fracción grande del residuo blanco es colesterol.]
Solución muestra 2: Agregar 2,0 mL de Solución de estándar interno a 4,00 g de aceite y proceder según se indica en Solución
muestra 1 comenzando donde dice "Agregar 5 mL de ... ".
Sistema cromatográfico de limpieza
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase móvil: Solución A
Columna de limpieza: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 O
Volumen de inyección: 350 µL
Análisis (limpieza)
Muestras: Solución estándar, Solución muestra 1 y Solución muestra 2
Recoger por separado los eluatos desde 2 minutos antes hasta 2 minutos después del tiempo de retención de colecalciferol
en un tubo de vidrio que contenga 1 ml de Solución de butil hidroxitolueno y equipado con un cierre hermético. Evaporar cada
tubo bajo una corriente de nitrógeno a una temperatura que no exceda de 30°. Disolver cada residuo en 1,5 mL de acetonitri-
lo e inyectar en el sistema cromatográfico analítico siguiente.
Sistema cromatográfico analítico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase móvil: Solución B
Columna analítica: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 5 µm
Volumen de inyección: 200 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar (después de la limpieza)
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,4 entre colecalciferol y ergocalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de colecalciferol, en inyecciones repetidas
Análisis
Muestras: Solución estándar, Solución muestra 7 y Solución muestra 2 (después de la limpieza)
Calcular el contenido de vitamina D, en µg/g, en la porción de muestra tomada:
Resultado= (Rvf R¡) x (C5/Cu)

R5 = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estándar interno de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP en la Solución estándar (µg/ml)
Cu= concentración de aceite en la Solución muestra 2 (g/ml) ·
Ru = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estándar interno de la Solución estándar 2, según se calcula a con-
tinuación:

Ru = ruif[r1s2 - (r1s1 x rU2f ru,)]

[NOTA-Si r151 = O debido a que no se observa ningún pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución
muestra 1, entonces Ru = rU2/r152.]
rU2 =respuesta del pico de colecalciferol de la Solución muestra 2
r152 = respuesta del pico del estándar interno de la Solución muestra 2
r151 = respuesta del pico del estándar interno de la Solución muestra 1
ru 1= respuesta del pico de colecalciferol de la Solución muestra 1
•USP37
340 (591) Determinación de Cinc / Pruebas Químicas USP 37

(591) DETERMINACIÓN DE CINC

La necesidad de establecer una determinación cuantitativa de cinc en las Preparaciones farmacopeicas de insulina refleja el
hecho de que este elemento es un componente esencial de los cristales de insulina-cinc. De la misma manera que el plomo, se
puede determinar el contenido de cinc por el método de la ditizona o mediante absorción atómica.

Método de Ditizona

Para esta prueba, seleccionar todos los reactivos que contengan el menor contenido posible de metales pesados. Si fuera
necesario, destilar el agua y otros disolventes en aparatos de vidrio duro o vidrio de borosilicato. Enjuagar bien todos los mate-
ria/es de vidrio con ácido nítrico diluido tibio (1 en 2) y luego con agua. Evitar el uso en el separador de cualquier lubricante
que se disuelva en cloroformo.
Soluciones y Disolventes Especia/es-
SOLUCIÓN ALCALINA DE CITRATO DE AMONIO-Disolver 50 g de citrato dibásico de amonio en agua para obtener 100 ml. Agre-
gar 100 ml de hidróxido de amonio. Eliminar los metales pesados que podrían estar presentes, por extracción de la solución
con porciones de 20 ml de Solución de Extracción de Ditizona (ver Plomo (251 )) hasta que la solución de ditizona retenga un
color verde transparente, luego extraer la ditizona remanente en la solución de citrato por agitación con cloroformo.
CLOROFORMO-Destilar el cloroformo en un aparato de vidrio duro o vidrio de borosilicato, recibiendo el destilado en sufi-
ciente alcohol deshidratado para obtener una concentración final de 1 ml de alcohol por cada 100 ml de destilado.
SOLUCIÓN DE DITIZONA-Emplear Solución Estándar de Ditizona (ver Plomo (251 )), preparada con el Cloroformo destilado.
SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE CINC-Disolver 625 mg de óxido de cinc, pesados con exactitud y previamente incinerados suavemen-
te hasta peso constante, en 1 O ml de ácido nítrico y agregar agua hasta obtener 500,0 ml. Esta solución contiene 1,0 mg de
cinc por ml.
SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE CINC DILUIDA-Diluir 1 ml de Solución Estándar de Cinc, medido con exactitud, con 2 gotas de ácido
nítrico y suficiente agua para obtener 100,0 ml. Esta solución contiene 1 O ~tg de cinc por ml. Usar esta solución dentro del
periodo de 2 semanas.
SOLUCIÓN DE ÁCIDO TRICLOROACÉTICO-Disolver 100 g de ácido tricloroacético en agua hasta obtener 1 000 ml.
Procedimiento-Transferir de 1 a 5 ml de la preparación a analizar, medidos con exactitud, a un tubo de centrífuga gra-
duado de 40 ml. Si fuera necesario, agregar ácido clorhídrico 0,25 N, gota a gota, hasta obtener una solución transparente.
Agregar 5 ml de Solución de Ácido Tric!oroacético y suficiente agua para obtener 40,0 ml. Mezclar y centrifugar.
Transferir a un separador de vidrio duro un volumen exactamente medido del sobrenadante que, se supone, contiene de
5 µg a 20 µg de cinc y agregar agua hasta obtener aproximadamente 20 ml. Agregar 1,5 ml de Solución Alcalina de Citrato de
Amonio y 35 ml de Solución de Ditizona. Agitar vigorosamente 100 veces. Permitir que la fase clorofórmica se separe. Insertar
un trozo cilíndrico de algodón en el vástago del separador para extraer el agua que esté emulsionada en el cloroformo. Reco-
ger en un tubo de ensayo el extracto clorofórmico (descartando la primera porción que pase) y determinar la absorbancia a
530 nm, con un espectrofotómetro apropiado.
Calcular la cantidad de cinc contenida por referencia a una curva estándar de absorbancia-concentración obtenida utilizan-
do 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml y, si el contenido de cinc de la muestra extraída excede 15 µg, también 2,0 ml de la Solución Están-
dar de Cinc Diluida. Corregir la curva estándar mediante una determinación concomitante de un blanco según se indica, donde
se usan todos los reactivos pero no se agrega cinc.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 341

Pruebas y Determinaciones Físicas

(601) AEROSOLES, ATOMIZADORES NASALES, INHALADORES DE

DOSIS FIJA E INHALADORES DE POLVO SECO

Este capítulo general contiene métodos de prueba para propelentes, aerosoles tópicos presurizados, atomizadores nasales,
inhaladores de dosis fija e inhaladores de polvo seco exentos de propelentes, empleados para suspender en aerosol, o bien
para suspender en aerosol y medir, dosis de polvos para inhalación. Aplicar estos métodos, cuando así se indique, en el análisis
de las formas farmacéuticas apropiadas.

PROPELENTES

Precaución-Los propelentes que son hidrocarburos son extremadamente inflamables y explosivos. Tomar las precauciones necesa-
rias y realizar el muestreo y las operaciones analíticas bajo una campana de extracción bien ventilada.

Procedimiento General de Muestreo

Este procedimiento se utiliza para obtener muestras de prueba de propelentes que son gases a aproximadamente 25º y que
se almacenan en cilindros presurizados. Emplear un cilindro para muestras de acero inoxidable equipado con una válvula de
acero inoxidable con una capacidad de no menos de 200 ml que soporte 240 psi o una presión mayor. Secar el cilindro con la
válvula abierta a 11 Oº durante 2 horas y vaciar el cilindro caliente hasta menos de 1 mm de mercurio. Cerrar la válvula, enfriar
y pesar. Conectar un extremo de una tubería de carga al envase del propelente ajustando bien y conectar sin ajustar el otro
extremo al cilindro para muestras. Abrir con cuidado el envase del propelente y dejar que el propelente purgue la tubería de
carga y salga a través de la conexión sin ajustar. Evitar una purga excesiva, ya que esto provoca la congelación de humedad en
la tubería de carga y las conexiones. Ajustar la conexión del cilindro para muestras, abrir la válvula del cilindro y dejar que el
propelente fluya hacia el interior del cilindro vacío. Continuar el muestreo hasta que se obtenga la cantidad deseada de mues-
tra, luego cerrar la válvula del envase de propelente y, finalmente, cerrar la válvula del cilindro para muestras. [Precaución-No
sobrecargar el cilindro para muestras; la expansión hidráulica ocasionada por los cambios de temperatura puede causar la explosión
de un cilindro sobrecargado.] Pesar nuevamente el cilindro para muestras cargado y calcular el peso de la muestra.

Temperatura de Ebullición Aproximada

Transferir una muestra de 100 ml a un tubo de centrífuga tarado en forma de pera de 100 ml que contenga algunas pie-
dras de ebullición y pesar. Suspender un termómetro en el líquido y colocar el tubo en un medio mantenido a una temperatu-
ra de 32º por encima de la temperatura de ebullición esperada. Cuando la lectura del termómetro permanezca constante, re-
gistrar como temperatura de ebullición la lectura del termómetro después de que se haya destilado como mínimo el 5% de la
muestra. Conservar el resto de la muestra para la determinación de Residuos 'de Alto Punto de Ebullición.

Residuos de Alto Punto de Ebullición,

Método 1

Dejar que destilen 85 ml de la muestra según se indica en la prueba para Temperatura de Ebullición Aproximada y transferir el
tubo de centrífuga que contiene los 15 ml restantes de la muestra a un medio mantenido a una temperatura de 1Oº por enci-
ma de la temperatura de ebullición. Después de 30 minutos, retirar el tubo del baño de agua, secarlo con material absorbente
y pesar. Calcular el peso del residuo.

Residuos de Alto Punto de Ebullición,

Método 11

Preparar una serpentina de enfriamiento con una tubería de cobre (de aproximadamente 6 mm de diámetro exterior x apro-
ximadamente 6, 1 m de largo) para que entre en un frasco con camisa al vacío. Sumergir la serpentina de enfriamiento en una
mezcla de hielo seco y acetona en el matraz con camisa al vacío y conectar un extremo de la tubería al cilindro para muestras
con propelente. Abrir cuidadosamente la válvula del cilindro para muestras, purgar la serpentina de enfriamiento con aproxi-
madamente 50 ml de propelente y desechar esta porción de propelente licuado. Continuar descargando el propelente licuado
desde la serpentina de enfriamiento y recolectarlo en un cono de sedimentación de 1000 ml previamente enfriado hasta que
 342 (601) Aerosoles/ Pruebas Ftsicas USP 37

el cono se llene hasta la marca de 1000 ml. Dejar que el propelente se evapore, empleando un baño de agua tibia mantenido
aproximadamente a 40º para reducir el tiempo de evaporación. Cuando todo el líquido se haya evaporado, enjuagar el cono
de sedimentación con dos porciones de 50 ml de pentano y combinar los enjuagues en una cápsula de evaporación tarada de
150 ml. Transferir 100 ml de f.le11ta110 a una segu11dd cáµsula de evaporación tai-ada de 150 ml, colocar ambas cápsulas de
evaporación en un bailo de agud; evaporar ha'> la sequedad y calentar la'> cápsulds en una estufa a 100º durante 60 minutos.
Enfriar las cápsulas en un desecador y pesar. Repetir el calentamiento por periodos de 15 minutos hasta que la variación de
peso entre pesadas sucesivas no sea más de O, 1 mg y calcular el peso del residuo obtenido a partir del propelente como la
diferencia entre los pesos de los residuos en las dos cápsulas de evaporación.

Contenido de Agua

Proceder según se indica en Determinación de Agua (921 ), con las siguientes modificaciones: (a) Utilizar un recipiente de sis-
tema cerrado para vol1Jmetría con una abertura a tr,1vés de la cual pilsa un tubo de dispersión de gases de porosidad gruesa
conectado a un cilindro para muestras. (b) Diluir ei Reactívo con metanol anhidro para proporcionar un factor de equivalencia
de agua entre 0,2 mg y 1,0 mg por ml; dejar reposar esta solución diluida durante no menos de 16 horas antes de la normali-
zación. (c) Obtener un muestra de 100 g según se indica en Procedimiento General de Muestreo e introducir la muestra en el
recipiente de valoración a través del tubo de dispersión de gases a una velocidad de aproximadamente 100 ml de gas por
minuto; si fuera necesario, calentar suavemente el cilindro para muestras para mantener esta velocidad de flujo.

Otras Determinaciones

Para los aerosoles que utilizan propelentes, realizar las pruebas que se especifican en las monografías individuales de prope-
lentes NF.

AEROSOLES

Dado que es necesario minimizar el lixiviado de sustancias extraíbles en las formulaciones presurizadas, los materiales de las
válvulas y los restantes componentes que están en contacto con el producto cumplen con los requisitos de Tapones Elastoméri-
cos para Inyecciones (381 ). (Tener en cuenta que en Procedimientos de Pruebas Fisicoquímicas en (381 ), las instrucciones para
preparar la muestra requieren una extracción previa, lo que puede ocasionar una subestimación de la cantidad de sustancia
extraíble de un componente dado.) Ver también Aerosoles en Formas Farmacéuticas (1151 ).

AEROSOLES TÓPICOS

Las siguientes pruebas son aplicables a aerosoles tópicos que contienen fármacos, en suspensión o solución, envasados a
presión y que se liberan al activar un sistema de válvulas apropiado.

Velocidad de Descarga y Cantidad Descargada

Realizar estas pruebas exclusivamente en envases equipados con válvulas de descarga continua.
Velocidad de Descarga-Seleccionar no menos de cuatro envases de aeros.ol, agitar si la etiqueta incluye esta instrucción,
retirar las tapas y las cubiertas y accionar cada válvula durante 2 ó 3 segundos. Pesar cada envase con exactitud y sumergir en
un baño de temperatura constante hasta que la presión interna se equilibre a una temperatura de 25º, determinada por la
constancia de la presión interna, según se indica más adelante en Prueba de Presión. Retirar los envases del baño, eliminar el
exceso de humedad secando externamente con una toalla de papel, agitar, si la etiqueta incluye esta instrucción, accionar ca-
da válvula durante 5,0 segundos (medidos con exactitud, empleando un cronómetro) y pesar nuevamente cada envase. De-
volver los envases al baño de temperatura constante y repetir el procedimiento previo tres veces más para cada envase. Calcu-
lar el promedio de Velocidad de Descarga, en g por segundo, para cada envase.
Cantidad Descargada-Devolver los envases al baño de temperatura constante, continuar descargando en accionamientos
de 5 segundos hasta vaciar los envases. [NOTA-Asegurarse de que pase suficiente tiempo entre los accionamientos para evitar
un enfriamiento significativo del envase.] Calcular la pérdida total de peso de cada envase. Ésta es la Cantidad Descargada.

Prueba de Presión

Realizar esta prueba sólo en aerosoles tópicos equipados con válvulas de descarga continua.
Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, retirar las tapas y las cubiertas y sumergir en un baño de temperatura
constante hasta que la presión interna sea constante a una temperatura de 25º. Retirar los envases del baño, agitar y retirar el
disparador y el agua (si la hubiera) del vástago de la válvula. Colocar cada envase en posición vertical y determinar la presión
en cada envase colocando un manómetro calibrado sobre el vástago de la válvula, sosteniéndolo con firmeza y accionando la
válvula de manera que quede completamente abierta. El manómetro se calibra para presiones aproximadas a las esperadas y
 USP 37 Pruebas Físicos/ (601) Aerosoles 343

está equipado con un adaptador apropiado para las dimensiones particulares del vástago de la válvula. Leer la presión directa-
mente del manómetro.

Llenado Mínimo

Los aerosoles tópicos cumplen con los requisitos para aerosoles que figuran en Llenado Mínimo (755).

Prueba de Fuga

Realizar esta prueba sólo en aerosoles tópicos equipados con válvulas de descarga continua.
Seleccionar 12 envases de aerosol y registrar la fecha y la hora con una aproximación de media hora. Pesar cada envase con
una aproximación de 1 mg y registrar el peso de cada uno, en mg, como W1 • Dejar en reposo los envases en posición vertical a
una temperatura de 25,0º ± 2,0º durante no menos de 3 días, pesar nuevamente cada envase, registrar el peso de cada uno,
en mg, como W2 y registrar la fecha y la hora con una aproximación de media hora. Determinar el tiempo, T (en horas), du-
rante el que se analizaron los envases. Calcular la velocidad de fuga, en mg por año, de cada envase tomado, por la fórmula:
(365)(24/T)(W1 - W2 )
Cuando se analizan envases de aerosol de vidrio recubiertos de plástico, secar los envases en un desecador de 12 a 18 horas
y mantenerlos en una atmósfera de humedad constante durante 24 horas antes de determinar el peso inicial según se indicó
anteriormente. Realizar la prueba bajo las mismas condiciones de humedad constante. Vaciar el contenido de cada envase ana-
lizado empleando una técnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la presión interna, retirar la válvula y verter). Retirar el
contenido residual enjuagando con disolventes adecuados y luego enjuagar con algunas porciones de metano!. Retener como
una unidad el envase, la válvula y todas las partes del mismo y calentarlas a 100º durante 5 minutos. Enfriar, pesar, registrar el
peso como W3 y determinar el peso neto de llenado (W 1 - W3) para cada envase analizado. [NOTA-Si el peso neto de llenado
promedio se ha determinado previamente, este valor puede emplearse en lugar del valor (W1 - W3) mencionado anteriormen-
te.] Los requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio por año para los 12 envases no es más de 3,5% del peso neto
de llenado y ninguno de los envases tiene fugas de más de 5,0% del peso neto de llenado por año. Si un envase tiene fugas de
más de 5,0% por año y si ninguno de los envases tienen fugas de más de 7,0% por año, determinar la velocidad de fuga sobre
24 envases adicionales, según se indica en esta prueba. No más de 2 de los 36 envases tienen fugas de más de 5,0% del peso
neto de llenado por año y ninguno de los 36 envases tiene fugas de más de 7,0% del peso neto de llenado por año. Cuando el
peso neto de llenado es menos de 15 g y la etiqueta declara una fecha de caducidad, los requisitos se cumplen si la velocidad
de fuga promedio de los 12 envases no es mayor de 525 mg por año y ninguno de los envases tiene fugas mayores de 750 mg
por año. Si un envase tiene fugas de más de 750 mg por año pero de no más de 1, 1 g por año, determinar la velocidad de
fuga sobre 24 envases adicionales, según se indica en esta prueba. No más de 2 de los 36 envases tiene fugas mayores a
750 mg por año y ninguno de los 36 envases tiene fugas mayores de 1, 1 g por año. Esta prueba es adicional a la prueba de
fuga habitual que se realiza en línea a cada envase.

Número Total de Descargas por Envase

Realizar esta prueba sólo a los aerosoles tópicos equipados con válvulas dosificadoras, simultáneamente con la prueba de
Uniformidad de Dosis Liberada y a los mismos envases utilizados en esta prueba. Determinar el número total de descargas o
liberaciones contando el número de descargas para cebado más las usadas para determinar el contenido del rocío y continuar
accionando el disparador hasta completar el número de descargas declarado en la etiqueta. Los requisitos se cumplen si todos
los envases o inhaladores analizados contienen un número de descargas que no es menor al establecido en la etiqueta.

Uniformidad de Dosis Liberada

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles tópicos equipados con válvulas dosificadoras. Para re-
colectar la dosis mínima, proceder según se indica en la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Inhaladores de Dosis Fija e
Inhaladores de Polvo Seco, según se describe a continuación, excepto que se debe modificar el aparato de muestreo de dosis de
manera que sea capaz de capturar cuantitativamente la dosis descargada de la preparación que se está analizando. A menos
que se indique algo diferente en la monografía individual, aplicar el criterio de aceptación para Inhaladores de Dosis Fija e Inha-
ladores de Polvo Seco según se describe a continuación.

ATOMIZADORES NASALES

La siguiente prueba se aplica a atomizadores nasales, formulados como suspensiones acuosas o soluciones de fármacos que
se presentan en envases multidosis y provistos de válvulas dosificadoras. En todos los casos y para todas las pruebas, preparar y
analizar el atomizador nasal según se indica en la etiqueta y en las instrucciones de uso.
 344 (601) Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

Uniformidad de Dosis Liberada

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de las dosis mínimas liberadas
(menor número de atomizaciones por narina según se indica en la etiqueta o en las instrucciones de uso) recolectado al co-
mienzo de la vida de la unidad (después de realizar el cebado según se describe en la etiqueta o en las instrucciones de uso) y
considerando el número de atomizaciones medidas que se declara en la etiqueta, correspondiente a cada uno de 1 O envases
distintos, debe cumplir con el siguiente criterio de aceptación: no más de 2 de las 20 dosis quedan fuera del intervalo com-
prendido entre 80% y 120% de la cantidad indicada en la etiqueta y ninguna queda fuera del intervalo comprendido entre
75% y 125% de la cantidad indicada en la etiqueta, mientras que la media de las dosis iniciales y la media de las dosis finales
quedan dentro del intervalo comprendido entre 85% y 115% de la cantidad indicada en la etiqueta. Si de 3 a 6 de las 20 dosis
quedan fuera del intervalo comprendido entre 80% y 120% de la cantidad declarada en la etiqueta pero ninguna queda fuera
del intervalo entre 75% y 125% de la cantidad declarada en la etiqueta, y la media de las dosis iniciales y la media de las dosis
finales están comprendidas en el intervalo entre 85% y 115% de la cantidad indicada en la etiqueta, seleccionar 20 envases
adicionales para realizar un análisis de segundo nivel. Para el análisis de segundo nivel, los requisitos se cumplen si no más de 6
de las 60 dosis recolectadas quedan fuera del intervalo entre 80% y 120% de la cantidad declarada en la etiqueta y ninguna
queda fuera del intervalo entre 75% y 125% de la cantidad declarada en la etiqueta, mientras que la media de las dosis inicia-
les y la media de las dosis finales están comprendidas en el intervalo entre 85% y 115% de la cantidad declarada en la etique-
ta.

MUESTREO PARA DETERMINAR LA UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE ATOMIZADORES NASALES DE DOSIS FIJA

Procedimiento de Muestreo General-Para garantizar una recolección de dosis in vitro reproducible, se recomienda em-
plear un medio mecánico de accionamiento de la bomba para liberar las dosis. El procedimiento de accionamiento mecánico
debe tener controles adecuados para los parámetros de accionamiento críticos (por ejemplo, fuerza de accionamiento, veloci-
dad de accionamiento, longitud de desplazamiento, periodos de descanso, etc.). Se debe realizar la prueba en unidades que se
hayan cebado según las instrucciones de uso para el paciente. Las unidades de prueba se deben accionar en posición vertical o
casi vertical, con la válvula hacia arriba. Las dos dosis recolectadas al comienzo y al final de la vida del envase deben ser la dosis
inmediatamente posterior al cebado y la dosis correspondiente al número declarado en la etiqueta como número final de dosis
del envase.
Para productos en suspensión, la dosis liberada debe ser liberada en un envase adecuado (por ejemplo, un vial de centelleo)
en el cual se pueda lograr la transferencia cuantitativa desde el envase en análisis. Se emplea un método analítico validado
para determinar la cantidad de fármaco en cada dosis liberada y los datos se registran como porcentajes de la cantidad decla-
rada en la etiqueta. Para productos en solución, la dosis liberada se puede determinar gravimétricamente a partir del peso de
la dosis liberada y de la concentración y la densidad de la solución de llenado del producto en análisis.

INHALADORES DE DOSIS FIJA E INHALADORES DE POLVO SECO

Las siguientes pruebas son aplicables a inhaladores de dosis fija que estén formulados como suspensiones o soluciones de
fármacos activos en propelentes e inhaladores de polvo seco que se presenten como unidades monodosis o multidosis. Los
siguientes métodos de prueba son específicos para los inhaladores anteriormente mencionados y pueden requerir alguna mo-
dificación cuando se analicen tecnologías de inhalación alternativas (por ejemplo, inhaladores de dosis fija accionados por la
respiración o nebulizadores de dosis fija). Sin embargo, la Farmacopea requiere la determinación de la dosis liberada y de la
Distribución de Tamaños Aerodinámicos para todas las formas farmacéuticas de inhalación de dosis fija. En todos los casos y para
todas las pruebas, preparar y analizar el inhalador según se indica en la etiqueta y en las instrucciones de uso. Cuando el fabri-
cante del producto no proporciona estas instrucciones, seguir las instrucciones precisas de descarga que se incluyen en las
pruebas que siguen a continuación.

Uniformidad de Dosis Liberada

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para inhaladores (por ejemplo inhaladores de dosis fija o inhaladores
de polvo seco) que contengan la formulación (por ejemplo, solución, suspensión o polvo) en reservorios o en unidades de
dosificación previamente medidas cuando la etiqueta de estos envases indica que están destinados para utilizarse con un dis-
positivo de inhalación determinado. (Para inhalaciones envasadas en unidades de dosificación previamente medidas, ver tam-
bién Uniformidad de Unidades de Dosificación (905)). Se debe tener en cuenta que la dosis liberada esperada es el contenido
medio de fármaco esperado de un gran número de dosis liberadas recolectadas de muchos inhaladores del producto elegido.
En muchos casos, su valor depende de la forma en que se realice la prueba para la dosis liberada. Para los inhaladores de dosis
fija, en la etiqueta se declara específicamente la dosis liberada esperada, a menos que se indique algo diferente en la monogra-
fía individual. Para inhaladores de polvo seco, donde la cantidad que se declara en la etiqueta es usualmente la dosis envasada
o medida del fármaco, la dosis liberada esperada se especifica en la monografía individual y generalmente es menor a la canti-
USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 345

dad que se declara en la etiqueta. Su valor refleja el contenido medio de fármaco esperado para un gran número de dosis
liberadas recolectadas del producto, empleando el método especificado en la monografía.
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de la dosis mínima liberada de
cada uno de 1O envases separados se determina de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, se cumplen los requisitos para uniformidad de dosifica-
ción si no menos de 9 de las 1 O dosis están comprendidas entre 75% y 125% de la dosis liberada esperada especificada y
ninguna está fuera del intervalo entre 65% y 135% de la dosis liberada esperada especificada. Si el contenido de no más de 3
dosis está fuera del intervalo entre 75% y 125% de la dosis liberada esperada especificada, pero está comprendido en el inter-
valo de 65% a 135% de la dosis liberada esperada especificada, seleccionar 20 envases adicionales y seguir el procedimiento
establecido para el análisis de 1 dosis mínima de cada uno. Los requisitos se cumplen si no más de 3 resultados, entre los 30
valores, quedan fuera del intervalo comprendido entre 75% y 125% de la dosis liberada esperada especificada y si ninguno
queda fuera del intervalo comprendido entre 65% y 135% de la dosis liberada esperada especificada.

MUESTREO DE DOSIS LIBERADA DE INHALADORES

DE DOSIS FIJA

Para determinar el contenido del ingrediente activo en el rocío descargado de un inhalador de dosis fija, emplear el aparato
de muestreo que se indica a continuación, empleando una velocidad de flujo de 28,3 L de aire por minuto (±5%), a menos
que se indique algo diferente en la monografía individual.
Aparato A-El aparato (ver Figura 1) consta de una base para soporte de filtro con un soporte de filtro de malla abierta,
como una criba de acero inoxidable, un tubo de recolección fijado o atornillado a la base para soporte de filtro y un adaptador
de boquilla para garantizar un sellado hermético entre el tubo de recolección y la boquilla. Usar un adaptador de boquilla que
garantice que la abertura de la boquilla del inhalador esté nivelada con la cara frontal o con el borde indentado de 2,5 mm
que está en el tubo de recolección de muestra, según sea apropiado. El conector de vacío está conectado a un sistema com-
puesto por una fuente de vacío, un regulador de flujo y un caudalímetro. La fuente debe ser capaz de arrastrar aire a través de
todo el dispositivo, incluyendo el filtro y el inhalador a analizar, a la velocidad de flujo deseada. Cuando se analizan inhaladores
de dosis fija, el aire debe extraerse de forma continua a través del sistema de manera que se evite la pérdida del medicamento
por fuga al medio ambiente que lo rodea. La base para soporte de filtro está diseñada para soportar discos de filtro de 25 mm
de diámetro. Con el flujo de aire empleado, el tubo de recolección de muestra y el disco de filtro deben ser capaces de reco-
lectar la Dosis Liberada. El disco de filtro y los restantes materiales utilizados en la construcción del aparato deben ser compati-
bles con el fármaco y los disolventes empleados para extraer el fármaco del filtro. Un extremo del tubo de recolección está
diseñado para sostener firmemente el filtro contra la base para soporte de filtro. Una vez montado, las uniones entre los com-
ponentes del aparato son herméticas, de forma que cuando se aplica vacío a la base del filtro, todo el aire extraído a través del
aparato de recolección pasa a través del inhalador.
 346 (601) Aerosoles/ Pruebas FÍ!>icas USP 37

Rosca Interna

938,1
$26,7
$35,5
$32,8 4> 31,8
<i> 31,8

$28,6
4>27,2
4>26,7
4>25,7
$21,8
/}s 0 10,020 Tubo
/! !j ¡
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Re!.
103 89,5
Dim.

Conector de Vacío

Tapa
Adaptadores de Boquilla

~
Tubo de recolección de Muestra

Tapa

Las dimensiones son en mm,

salvo que se especifique lo contrario. ~ lnhaladmdo
Dosis Fija

Fig. 1. Aparato de muestreo para inhaladores presurizados de dosis fija.

Procedimiento-Preparar el inhalador para su uso de acuerdo con las instrucciones que figuran en la etiqueta. A menos
que se indique algo diferente en la monografía individual, con la bomba de vacío en funcionamiento y asegurando una veloci-
dad de flujo de aíre de 28,3 L por minuto (±5%), descargar en el aparato la dosis mínima recomendada a través del adaptador
de boquilla, presionando la válvula durante un tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por comple-
to. Desmontar el inhalador del Aparato A y desconectar el vacío. Valorar el contenido de fármaco en el aparato después de
enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado.

MUESTREO DE DOSIS LIBERADA DE INHALADORES DE POLVO SECO

Emplear el Aparato B (ver Figura 2) para determinar el contenido del ingrediente activo emitido desde la boquilla de un inha-
lador de polvo seco.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 347

G
Adaptado1 de Boquilla

Bomba
de Vacío

B Filtro
Tubo de Recolecc1on de Muestra
o
A

Fig. 2. Aparato B: Aparato de muestreo para inhaladores de polvo seco. (Ver Tabla 7 para obtener información sobre las
especificaciones de los componentes.)

Código
A
Tabla 1. Especificaciones de-- Componentes
Artículo
Tubo de recolección de muestraª
~- ----- - ------~

Descripción
Ver Figura 2
b
para el Aparato B (ver Figura 2)
Dimensiones
4,~5 mm de diámetro interno x 12 cm de longi-
LUU

B Filtrob Ver Figura 2 Filtro de fibra de vidrio de 47 mm

c Conector (por ej., un acoplamiento corto de > 8 mm de diámetro interno
metal con ramificación a P3 de
diámetro menor)
D Tubería de vacío (por ej., tubería de silicona con un una longitud adecuada de tubería ::> 8 mm de diá·
diámetro externo de 14 mm y un metro interno con un volumen interno de 25 mL
diámetro interno de 8 mm) ± 5 ml.
E Válvula solenoide de dos víasc Ver Figura 2 Válvula solenoide de 2 vías, 2 puertos, con un diá-
metro interno:> de 8 mm y un tiempo de res-
puesta de apertura de ,o; 100 milisegundos.
F Bomba de vacíod Ver Figura 2 La bomba debe ser capaz de extraer aire a la velo-
cidad de flujo requerida a través del aparato en-
samblado con el inhalador de polvo seco en el
adaptador de boquilla. Conectar la bomba a la
válvula solenoide empleando una tubería de vacío
corta y ancha (::> 1O mm de diámetro interno) y
conectores para minimizar los requisitos de capa-
cidad de la bomba.
G Temporizador• Ver Figura 2 El temporizador interrumpe o permite el paso de
corriente a la válvula solenoide durante el lapso
de tiempo requerido.
P1 Llave de paso de presión Ver Figura 2 2,2 mm de diámetro interno, 3, 1 mm de diámetro
externo, a nivel con la superficie interna del tubo
de recolección de muestra, centrado y sin reba-
bas, a 59 mm de su entrada. Las llaves de presión
P1, P2 y P3 no se deben abrir al exterior durante
la recolección de la dosis.
P1, P2, P3 Mediciones de presión 1
H Válvula de control de flujo9 Ver Figura 2 Válvula reguladora ajustable con máximo Cv ::> 1 h.
ª A modo de ejemplo, un producto Millipore número XX40 047 00 (Millipore Corporation, 80, Ashby Road, Bedford, MA 01732), modificado de forma que el
tubo de salida tenga un diámetro interno de ::> 8 mm, equipado con un producto Gelman número 61631.
b A/E (Gelman Sciences lnc., 600 South Wagner Road, Ann Arbor, MI 48106) o equivalente.
e Producto ASCO número 8030G1 3, Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, N) 07932.
d Producto Gast tipo 1023, 1423 o 2565 (Gast Manufacturing lnc., PO Box 97, Benton Harbar, MI 49022) o equivalente.
e Producto Eaton número 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094) o equivalente.
1 A modo de ejemplo, un manómetro PDM 21 O (Air-Neotronics Ltd., Neotronics Technology ple, Parsonage Road, Takeley, Bishop's Stortford, CM22 6PU, Gran
Bretaña) o equivalente.
9 Un producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS (Parker Hannifin ple., Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaña) o equivalente.
h Coeficiente de Flujo, según lo define la norma ISA S75.02 "Control valve capacity test procedure" en Standards and Recommended Practices far lnstrumentation
and Control, 10° edición, Vol. 2; 1989. Publicada por lnstrument Society of America, 67 Alexander Orive, P.O. Box 1227, Research Triangle Park, NC 27709,
Estados Unidos.

Este aparato puede muestrear las dosis emitidas a distintas velocidades de flujo de aire.
Aparato 8-EI aparato es similar al que se describe en la Figura 7 para analizar los inhaladores de dosis fija. Sin embargo, en
este caso el filtro y el tubo de recolección tienen un diámetro interno mayor para poder alojar discos de filtro de 47 mm de
diámetro. Esta característica permite la recolección de la dosificación a una velocidad de flujo mayor-de hasta 100 L de aire
por minuto-cuando fuera necesario. Un adaptador de boquilla garantiza un sellado hermético entre el tubo de recolección y
la boquilla del inhalador de polvo seco en análisis. El adaptador de boquilla debe garantizar que el extremo de la boquilla del
inhalador esté a nivel con el extremo abierto del tubo de recolección de la muestra. Los conectores de tubería, si se emplean,
deben tener un diámetro interno mayor o igual a 8 mm para evitar que sus propios diámetros internos creen una resistencia
 348 (601) Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

significativa al flujo de aire. Se debe seleccionar una bomba de vacío con una capacidad para extraer aire mayor a la requerida,
a la velocidad de flujo volumétrico especificada, a través del aparato de muestreo y del inhalador simultáneamente. Una válvu-
la de dos vías, operada mediante solenoide, de baja resistencia y controlada por un temporizador está interpuesta entre la
bomba de vacío y la válvula de control de flujo para controlar la duración del flujo. Este tipo de válvulas permite que se extrai-
gan 4,0 L de aire (±5%) desde la boquilla del inhalador a la velocidad de flujo especificada. El control del flujo se logra asegu-
rando que se produzca un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo (relación de presión absoluta P3/P2 :o: 0,5 en
condiciones de flujo estacionario).
Procedimiento-Operar el aparato a un flujo de aire que produzca una caída de presión de 4 kPa (40,8 cm de H2 0) en el
inhalador a analizar y durante un lapso de tiempo que sea consistente con la extracción de 4 L de aire desde la boquilla del
inhalador. [NOTA-Si la velocidad de flujo y la duración se definieran de forma diferente en la monografía, ajustar el sistema
con una aproximación de 5% con respecto a esos valores.] Determinar la velocidad de flujo de prueba empleando el Aparato B
de la siguiente manera. Insertar un inhalador en el adaptador de boquilla para asegurar un sellado hermético. En los casos en
que el envase del medicamento modifique la resistencia del inhalador al flujo de aire, usar un inhalador con el envase coloca-
do, sin el medicamento (envase previamente vaciado). En los otros casos, usar un inhalador sin envase. Conectar un puerto de
un transductor de presión diferencial a la llave de presión, P1, y dejar el otro abierto a la atmósfera exterior. Encender la bom-
ba y abrir la válvula solenoide de dos vías. Ajustar la válvula de control de flujo hasta que la caída de presión a través del inhala-
dor sea de 4,0 kPa (40,8 cm de HP). Asegurarse de que se produzca un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo
determinando los valores de presión absoluta P2 y P3 de manera que la relación P3/P2 sea menor o igual a 0,5. Si este criterio
no se puede lograr, es probable que la bomba de vacío esté desgastada o que su capacidad no sea suficiente. Las condiciones
de flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo son necesarias para asegurar que el flujo volumétrico de aire extraído
de la boquilla no se vea afectado por fluctuaciones y modificaciones de la resistencia al flujo de aire en el inhalador. Retirar el
inhalador del adaptador de boquilla sin alterar la válvula de control de flujo, medir la velocidad del flujo de aire extraído desde
la boquilla, Q0 uu conectando herméticamente un caudalímetro al adaptador de boquilla. Emplear un caudalímetro calibrado
para medir el flujo volumétrico que abandona el medidor de manera hermética para determinar directamente Oout o, si tal
medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo volumétrico que sale del medidor (Qout) empleando la ley de los gases ideales.
Por ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo volumétrico de entrada (Q;n), emplear la fórmula:

Qout = Q¡nPo/cPo - i:'.P)

en donde P0 es la presión atmosférica y i:'.P es la caída de presión a lo largo del medidor. Si la velocidad de flujo es mayor de
100 L de aire por minuto, ajustar la válvula de control de flujo hasta que Qout sea igual a 100 L por minuto; de lo contrario,
registrar el valor de Q0 ut1 sin modificar la válvula de control de flujo. Definir la duración del flujo de prueba, T = 240/Q0 w en
segundos, de manera que un volumen de 4,0 L de aire (±5%) se extraiga desde el inhalador a la velocidad de flujo de prueba
Qout y ajustar en consecuencia el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías. Cebar o cargar el
inhalador con polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcio-
namiento y la válvula solenoide cerrada, insertar la boquilla horizontalmente en el adaptador de boquilla. Descargar el polvo
en el aparato de muestreo activando el temporizador que controla la válvula solenoide y extrayendo 4,0 L de aire desde el
inhalador a la velocidad de flujo previamente definida. Si las instrucciones de la etiqueta así lo indican, repetir la operación
para simular el uso del inhalador por el paciente (por ejemplo, inhalar dos o tres veces, si fuera necesario, para vaciar la cápsu-
la). Repetir la operación completan -1 veces, comenzando donde dice "Cebar o cargar el inhalador con polvo", en donde n
es el número de veces definido en la etiqueta como la dosis mínima recomendada. Desmontar el inhalador de polvo seco del
aparato de muestreo y desconectar la tubería de vacío D. Valorar el contenido de fármaco en el aparato después de enjuagar el
filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado. Si así se indica en la monografía individual, realizar esta prueba en
condiciones de temperatura y humedad controladas.

Uniformidad de Dosis Liberada en Todo el Contenido

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Todo el Contenido se requiere para inhaladores (por ejemplo inhaladores de
dosis fija o inhaladores de polvo seco) que contienen múltiples dosis de la formulación (por ejemplo, solución, suspensión o
polvo seco) en reservorios o en unidades de dosificación previamente medidas (por ejemplo, blísteres), y para formulaciones
envasadas en reservorios o en presentaciones multidosis de unidades de dosificación previamente medidas que tienen una se-
cuencia de dosis predeterminada, cuando la etiqueta de estas presentaciones multidosis indica que están destinadas a ser utili-
zadas con un dispositivo de inhalación determinado. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Todo el Contenido también
asegura que los productos multidosis proporcionen el número de descargas declarado en la etiqueta. A menos que se especifi-
que algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de al menos 9 de las 1O dosis recolectadas a partir de
un inhalador, de acuerdo con el procedimiento que se describe más adelante, está comprendido en un intervalo entre 75% y
125% de la dosis liberada esperada y ninguno está fuera del intervalo entre 65% y 135% de la dosis liberada esperada. Si el
contenido de no más de 3 dosis está fuera del intervalo entre 75% y 125%, pero está comprendido en el intervalo entre 65%
y 135% de la dosis liberada esperada, seleccionar 2 inhaladores adicionales y seguir el procedimiento establecido para analizar
1O dosis de cada uno. Los requisitos se cumplen si no más de 3 resultados, entre los 30 valores, quedan fuera del intervalo
entre 75% y 125% de la dosis liberada esperada y ninguno queda fuera del intervalo entre 65% y 135% de la dosis liberada
esperada.
USP 37 Pruebas Físicos/ (601 >Aerosoles 349

INHALADORES DE DOSIS FIJA

Aparato-Emplear el Aparato A según se indica en Muestreo de Dosis Liberada de Inhaladores de Dosis Fija en Uniformidad de
Dosis Liberada a una velocidad de flujo de 28,3 L de aire por minuto (±5%).
Procedimiento-Una dosis única se define como el número de atomizaciones especificado en la etiqueta del producto para
la dosis mínima recomendada. Seleccionar un inhalador de dosis fija y seguir todas las instrucciones que figuran en la etiqueta
para cebar, agitar, limpiar y accionar el inhalador para liberar la dosis. A menos que se indique algo diferente en las instruccio-
nes de uso para el paciente, agitar el inhalador durante 5 segundos y accionar el disparador para desechar una dosis mínima
recomendada. Esperar 5 segundos y recolectar la siguiente dosis. Desmontar el inhalador del Aparato A y desconectar el vacío.
Valorar el contenido de fármaco en el aparato después de enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecua-
do. Recolectar dos dosis más, dejando que transcurran como mínimo 5 segundos entre dosis. Descargar el dispositivo, dese-
char el contenido, esperar no menos de 5 segundos entre disparos (a menos que se indique algo diferente en la monografía
individual), hasta que queden por descargar (n/2) + 1 del número mínimo de dosis recomendadas, en donde n es el número
mínimo de dosis recomendadas declarado en la etiqueta. Recolectar cuatro dosis más y dejar que transcurran como mínimo 5
segundos entre dosis, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. Descargar el dispositivo y desechar la
descarga, como se hizo anteriormente, hasta que queden tres dosis por descargar. Recolectar las tres dosis finales dejando que
transcurran como mínimo 5 segundos entre dosis. Tener en cuenta que la velocidad de las descargas para desechar el conteni-
do no debe ocasionar un enfriamiento excesivo del envase.

INHALADORES DE POLVO SECO

Aparato-Emplear el Aparato B según se indica en Muestreo de Dosis Liberada de Inhaladores de Polvo Seco en Uniformidad de
Dosis Liberada a la velocidad de flujo apropiada para la prueba.
Procedimiento-Proceder según se indica en Procedimiento en Muestreo de Dosis Liberada de Inhaladores de Polvo Seco en
Uniformidad de Dosis Liberada. Una dosis única se define como el número de disparos especificado en la etiqueta del producto
como la dosis mínima recomendada. Seleccionar un solo inhalador y seguir todas las instrucciones para cargar el polvo, des-
cargar y limpiar que figuran en la etiqueta. Recolectar un total de 1O dosis -tres dosis al comienzo, cuatro dosis en el medio
[(n/2) - 1 a (n/2) + 2, en donde n es el número mínimo de dosis recomendadas declarado en la etiqueta] y tres al final- del
contenido declarado en la etiqueta siguiendo las instrucciones que figuran en la etiqueta. Antes de recolectar cada una de las
dosis a analizar, limpiar el inhalador siguiendo las instrucciones que figuran en la etiqueta.

Tamaño de Partícula

La distribución del tamaño de partículas o gotas en el rocío descargado por los inhaladores de dosis fija y la distribución del
tamaño de partículas en la nube descargada de los inhaladores de polvo seco son parámetros importantes para evaluar el fun-
cionamiento del inhalador. Aunque se puede emplear la medición del tamaño de partículas por microscopía para evaluar el
número de partículas extrañas, aglomerados y partículas grandes en las emisiones de los inhaladores de dosis fija (por ejemplo,
Bitartrato de Epinefrina, Aerosol para Inhalación), cuando sea posible, esta prueba debe reemplazarse por un método para deter-
minar la distribución de tamaños aerodinámicos de las partículas que abandonan el inhalador. La distribución de tamaños ae-
rodinámicos define la forma en que un aerosol se deposita durante la inhalación. Cuando hay una distribución logarítmica nor-
mal, la distribución de tamaños aerodinámicos puede caracterizarse por la mediana del diámetro aerodinámico de la masa
(MMAD, por sus siglas en inglés) y la desviación estándar geométrica (GSD1 por sus siglas en inglés). La distribución de tama-
ños aerodinámicos del fármaco que abandona los inhaladores de polvo seco y de dosis fija se determina empleando los Apara-
tos 1; 2; 3; 4; 5 ó 6 según se especifica en este capítulo. Una dosis de partículas finas o una fracción de partículas finas también
puede definirse como la porción de la emisión del inhalador que tiene un diámetro aerodinámico menor que el establecido en
la monografía individual. Es de esperar que estos términos establezcan una correlación con la dosis de fármaco o la fracción de
la dosis de fármaco que penetra en los pulmones durante la inhalación. Las monografías individuales también pueden definir
las fracciones emitidas de la dosis liberada en más de un rango de tamaño aerodinámico.

DISTRIBUCIÓN DE TAMAÑOS AERODINÁMICOS

Los dispositivos de impacto en cascada clasifican las partículas y las gotas de los aerosoles de acuerdo con sus diámetros
aerodinámicos. El principio de operación de estos dispositivos, mediante el cual las partículas y gotas de aerosol se separan de
la corriente de aire en movimiento por su inercia, se muestra en la Figura 3.
 •
350 (601) Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

Partículas en aerosol

Estación inicial
de la descarga

Sello-----,

Primera estación
de la descarga

Placa colectora

Última estación
de la descarga ---v
Placa colectora

Vacío

Fig. 3. Representación esquemática del principio de operación de los impactadores en cascada. (Se muestra un solo chorro
por estación del impactador. Los impactadores con chorros múltiples en cada estación funcionan de la misma manera.)

Debido a que las dimensiones del tubo de admisión utilizado para conectar los inhaladores a impactadores en cascada y a
impactadores en fase líquida (que se muestra en los Aparatos 7; 2; 3; 4; 5 y 6) también definen la masa del fármaco que ingre-
sa en el dispositivo para clasificar el tamaño aerodinámico, estas dimensiones se definen cuidadosamente y, cuando es posible,
se mantienen constantes entre aparatos (ver Figuras 4, 6, 7, 8 y 9).

Boquilla del
.,. __ Inhalador

Fig. 4. Aparato 1: Montaje del tubo de admisión y del cono de ingreso sobre el impactador en cascada.
USP 37 Pruebas Físicas / <601 ) Aerosoles 351

Tullo de adm1s1on para ei Muestreador de ,Anri''''C'

Vers,ón de Beca Grande-Dnble Estrec:harr 1e1t1:

1
1 rgwA~ri§'iiii~~wa~"'" ~~1::::=
' j '] -±-1

L _¡
/
/
/ j
1 WS 1:1
, La JUllla DEBE: ser a prueba de fugas
J_ ~ 1

/
, ¡
/ 15

,_ 1 !/ 31

1-¡ El rnnternl puede sm ;il1:m1~110

:nox1r1al1ip ,¡ olrD r·iaterial
2} Torne;ir a ¡iar1·' de lil13 barra est;inda• de 38 mm i 5··1
3) Hacer u;1 orific10 llP 1\! m111 !e> b¿¡rra
4) Cortar el tubo en un rrngul0 de 4:"· i::xactos crn110 se rnueslra - .... 1íl°±
5J

tubo de admisión

interior de los or1f1c1os eri la JUnla

Fig. 4a. Aparato 1: Vista expandida del tubo de admisión para uso con inhaladores de dosis fija y de polvo seco.

Fi'.B~~ Romper todos los bordes

~F52 EXCEPTO este borde interno

• 71
~-+-c-'tT-
"'31 ,75+,00
,, -,05

• 25,4± ,1

Puerto de entrada del muestreador de Andersen

--,
~55°!
12,3 30,2

A9,5 l ¡

Profundidad 2,5 hasta el

fondo del estrechamiento
del aguiero

Las medidas están en mm a menos que se indique algo diferente

Fig. 4b. Aparato 1: Vista expandida del cono de ingreso para montar el tubo de admisión en el impactador en cascada An-
dersen sin preseparador, El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado. La rugosidad de la superfi-
cie (Ra) debe ser aproximadamente de 0,4 ,um,
352 (601) Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

F Adaptador
Válvula de control de flujo de boquilla
E
f Temporizador 1
Aparatos

~
2, 3ó4

Bomba
de vacío

solenoide
P3 P2
o
de dos vías
e
A B

Fig. 5. Aparatos 2; 3, 4 ó 5: Equipos de control general. (Ver Tabla 3 para obtener información sobre las especificaciones de
los componentes.)

Fig. 6. Aparato 2: Montaje del tubo de admisión, colector de estaciones y portafiltro.

(lmpactador Marple-Miller, Modelo 160 con tubo de admisión USP.)
USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 353

Los radios se muestran en vista superior y en sección

44-1 transversal para mayor claridad

19-¡
38,3j-1

15---
Sección transversal

13-¡
14,4--

8---

- R38,3~.~
R6,70 ± ,03 -R6,70±,03
45°±3º

Excepto cuando se indique lo contrario,

todos los bordes se deben romper y eliminar los
rebordes
Las superficies deben estar bien pulidas a máquina,
Argolla de junta: Dimensiones nominales: DI = 29 mm,
DE = 32 mm, Ancho = 1,8 mm

Las medidas están en mm a menos que se indique

algo diferente
No romper este borde

Fig. 7. Aparato 3: Vista expandida de la parte superior del preseparador Andersen adaptado al tubo de admisión USP. El
material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado; el interior debe estar pulido hasta una rugosidad de
superficie (Ra) de aproximadamente 0,4 µm.
 •
354 (601) Aerosoles / Pruebas Físicas USP 37

Estación 1

Estación 2

Estación 3
\ - 1_ -1
1 1

1 1

Estación 4

Estación 5 (filtro)

Fig. 8. Aparato 4: Esquema del impactador en fase líquida multiestación. (Ver Tabla 4 para obtener información sobre las
especificaciones de los componentes.)

Dado que la distribución de tamaños ocasionada por distintos impactadores es a menudo una función del diseño del impacta-
dor y de la velocidad del flujo de aire que pasa a través de ellos, existe la necesidad de normalizar los instrumentos que se
emplean para analizar los inhaladores (es decir, Aparatos 7 ó 6 para inhaladores de dosis fija) o de proporcionar guías sobre la
aptitud del sistema en donde se puedan utilizar distintos aparatos (es decir, Aparatos 2; 3; 4 ó 5 para inhaladores de polvo
seco).
Debido a la naturaleza variada de las formulaciones y dispositivos en análisis, los sistemas de impacto en cascada y las técni-
cas seleccionadas para analizar un inhalador deben cumplir con ciertos criterios:
Medición de Estación-Los fabricantes de dispositivos de impacto en cascada proporcionan una calibración definitiva para las
características de separación de cada estación de impacto en términos de la relación entre la eficiencia de recolección a dicha
estación y el diámetro aerodinámico de las partículas y gotas que la atraviesan en forma de aerosol. La calibración es una pro-
piedad que depende de la dimensión, la disposición espacial del chorro y de la superficie sobre la que se recoge, y de la veloci-
dad del flujo de aire que pasa a través de éste. Debido a que los chorros pueden causar corrosión y desgaste a lo largo del
tiempo, las dimensiones críticas de cada estación, que definen la calibración de la estación de impacto, deben medirse periódi-
camente. Este proceso conocido como medición de estación evita la necesidad de la calibración repetida (usando aerosoles
estándar) y asegura que, en el análisis de las emisiones de los inhaladores, sólo se utilicen aquellos dispositivos que cumplen
con las especificaciones. El proceso incluye la medición y el ajuste de las dimensiones críticas del instrumento.
Pérdida de Fármaco entre Estaciones (pérdidas de pared)-Cuando sean posibles variaciones en la metodología y no se espe-
cifique un aparato en la monografía, la técnica seleccionada debe asegurar que no se pierda más del 5% de la masa de fárma-
co total descargada (dentro del impactador) entre las superficies de recolección de muestra del dispositivo de impacto. En el
caso de que se sepa que las pérdidas de fármaco entre estaciones son mayores de 5%, se debe usar otro aparato alternativo o
bien el procedimiento debe realizarse de tal forma que las pérdidas de pared se incluyan junto con la recolección de la placa
correspondiente asociada. A modo de ejemplo, los siguientes procedimientos descritos para los Aparatos 7 y 3 han sido redac-
tados incluyendo pérdidas de pared junto con la placa de recolección asociada. Siempre que se sepa que tales pérdidas son
menores o iguales al 5% de la masa total de fármaco descargada dentro del impactador y que no haya instrucciones contrarias
 USP 37 Pruebas Físicas/ <601) Aerosoles 355

en una monografía individual, la técnica puede simplificarse valorando sólo el fármaco que está sobre las placas de recolec-
ción.
Reingreso por Arrastre-Cuando sea pmible vdridr la metúduiogíJ, lil técnica seleccionada debe apunt:ir Cl rninirni1ilr PI rein-
greso de partículas por arrastre (desde una estación de impacto superior a una inferior) en las estaciones que contribuyan a
fracciones del tamaño definido en la monografía individual, especialmente cuando esto pueda alterar las cantidades recolecta-
das de fármaco. Minimizar el número de dosis tomadas corno muestra, usa1· superficies de recolección de partículas recubiertas
y probar que las técnicas para dosis múltiples producen resultados estadísticamente similares a los obtenidos a partir de un
número de dosis menor son métodos que se pueden emplear para este propósito. En el caso de que no se pueda evitar el
reingreso por arrastre, se debe normalizar el número de dosis recolectadas, el intervalo de tiempo entre dosis y la duración
total del flujo de aire a través del dispositivo de impacto en cascada. Bajo estas circunstancias, la presentación de los datos de
impacto no debe asumir la validez de la calibración del impactador (es decir, los rangos de diámetros aerodinámicos no deben
ser asignados a masas de fármacos recolectadas en estaciones específicas).
Usando métodos de valoración apropiados y un dispositivo de impacto medido adecuadamente, se puede determinar la dis-
tribución de tamaños aerodinámicos de part1culas de :m farmac.os que ~aie11 Je las uuyuillas de los inhJladores de dosis fija o
polvo seco. Si los límites de temperatura o humedad para el uso del inhalador están indicados en la etiqueta, puede ser nece-
sario controlar la temperatura y la humedad del aire del entorno del rfürositivo y del aire que lo atraviesa para que se ajusten a
esos límites. Se presumen las condiciones ambientales, salvo que se especifique algo diferente en las monografías individuales.
Balance de Masa-Además de la distribución de tamaño, las buenas prácticas analíticas dictan que se debe lograr un balan-
ce de masa completo para confirmar que toda la cantidad de fármaco descargada desde el inhalador, que se captura y se mide
en el tubo de admisión-impactador en cascada del aparato, está comprendida en el intervalo aceptable con respecto al valor
esperado. La masa total de fármaco recolectada en todos los componentes (balance material) dividida por el número total de
dosis mínimas recomendadas descargadas no es menos de 75% y no es más de 125% de la dosis mínima recomendada pro-
medio determinada durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Ésta no es una prueba del inhalador pero sirve para
asegurar que los resultados de la prueba son válidos.
Usar uno de los dispositivos de impacto de múltiples estaciones que se muestran más adelante, o uno equivalente, para de-
terminar la distribución de tamaños aerodinámicos de partículas de los fármacos que salen de las boquillas de inhaladores de
dosis fija o polvo seco. Los Aparatos 7 y 6 [Figuras 4 y 9 (sin preseparador), respectivamente] están destinados para uso con
inhaladores de dosis fija a una única velocidad de flujo. Los Aparatos 2; 3; 4 y 5 (Figuras 6, 7, 8 y 9, respectivamente) están
destinados para uso con inhaladores de polvo seco a la velocidad de flujo apropiada, Qº"" determinada anteriormente, siempre
que el valor Qº"' esté comprendido en el intervalo de 30 La 100 L por minuto.
NOTA-Si Qº"' es mayor que 100 L por minuto, la prueba debe ser realizada ajustando Q00 , a 1 00 L por minuto; si Q00 , es
menor que 30 L por minuto, la prueba se realiza con Oout a 30 L por minuto.
Aparato 1 para Inhaladores de Dosis fija-Usar este aparato o uno equivalente a una velocidad de flujo de 28,3 L por
minuto (± 5%) conforme a lo especificado por el fabricante del impactador en cascada.
Diseño-El diseño y montaje de este aparato y el tubo de admisión para conectar el dispositivo al inhalador se muestran en
las Figuras 4, 4a y 4b,.
Las dimensiones críticas de ingeniería aplicadas por los fabricantes a las estaciones del Aparato 7 figuran en la Tabla 2. Du-
rante el uso, puede producirse la oclusión y bloqueo de las toberas de chorros y por lo tanto, es necesario justificar las toleran-
cias de medición "durante el uso".
Tabla 2. Dimensiones Críticas para las Toberas de Chorro del Aparata 1
Número Diámetro de
Nº Estación de Chorros Tobera (mm)
o 96 2,55 ± 0,025
1 96 1,89 :i 0,025
2 400 0,914 ± 0,0127
3 400 1 0,711 ± 0,0127
4 400 0,533 ± 0,0127
5 400 0,343 ± 0,0127
6 400 0,254 ± 0,0127
7 201 0,254 ± 0,0127
·---·--------- ~

Procedimiento-Ajustar el impactador en cascada de múltiples estaciones como se describe en las instrucciones del fabrican-
te, con un filtro terminal debajo de la última estación para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del
dispositivo. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada esta-
ción con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado, normalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos

1 Se puede obtener un impactador en cascada adernado como Modelo Mk 11 de Thermo-rlectron, 27 Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador se usa sin
el preseparador. El inhalador se conecta al impactador a trdvés del tubo de odmision, por encima del cono de ingreso que se mueslrd en la Figura 4. Si se emplea
un impactador equivalente, se debe utilizar el tubo de admision de Id fiqwn 4o aunque <'Icono de 1nqresu (Figura 4h) debe ser reempl,uado por otro que se a¡uste
al impactador en cuestión. Se debe tener en cuenta que las superficies internas del tubo de admisión (Figuro 4o) están diseñadas para ajustarse a nivel con sus
contrapartes en el cono de ingreso (Figura 4b). Este diseno evita la cartura del aerosol en IJ junta entre los dos tubos.
 356 (601) Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

que se haya demostrado que esto es innecesario. Unir el tubo de admisión y el adaptador de boquilla de manera que se pro-
duzca un sellado hermético entre la boquilla del inhalador y el tubo de admisión según se muestra en la Figura 4. Usar un
adaptador de boquilla que asegure que el extremo de la boquilla del inhalador esté a nivel con el extremo abierto del tubo de
admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada estén conectadas herméticamente para evitar
fugas. Encender la bomba de vacío para extraer el aire a través del impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a través del
sistema con un caudalímetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisión. Ajustar la válvula de control de flujo en
la bomba de vacío para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida y asegurarse de que el flujo de
aire a través del sistema tenga una aproximación de ±5% respecto de la velocidad de flujo especificada por el fabricante. A
menos que se indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el inhalador durante 5 segundos y
accionar el disparador para desechar una descarga. Con la bomba de vacío en funcionamiento, insertar la boquilla en su adap-
tador e inmediatamente pulsar para descargar la dosis mínima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la válvula
presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se ha descargado por completo. Si se requieren atomiza-
ciones adicionales para recolectar la muestra, esperar 5 segundos antes de desmontar el inhalador del adaptador de boquilla,
agitar el inhalador, colocar nuevamente en el adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la siguiente dosis mínima
recomendada. Repetir hasta que se descargue el número de dosis requerido. El número de dosis mínimas recomendadas debe
ser tal que permita una determinación exacta y precisa de la Distribución de Tamaños Aerodinámicos. [NOTA-Usualmente, el
número de dosis mínimas recomendadas no es mayor de 1 O.] Después de descargar la última dosis, retirar el inhalador del
adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir el enjua-
gue cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada, colocar cada estación y su respecti-
va placa de recolección o filtro asociado en sendos recipientes y enjuagar para extraer el fármaco de cada uno de éstos.
[NOTA-Si se ha determinado que las pérdidas de pared en el impactador son menores o iguales a 5%, entonces se puede usar
solamente el material recolectado en las placas.]
Diluir cada uno cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Empleando el método de análisis especificado en la mono-
grafía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los componentes. Para analizar los datos, proce-
der según se indica en Análisis de Datos.
Aparato 2 para Inhaladores de Polvo Seco-
Diseño-El diseño y el montaje del Aparato 2 y del tubo de admisión para conectar el dispositivo a un inhalador se muestran
en la Figura 62 . [NOTA-El tubo de admisión se muestra en detalle en la Figura 4a.] El impactador tiene 5 estaciones de impac-
tación y un filtro terminal. A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L por minuto (la velocidad del flujo nominal, Qn),
los diámetros aerodinámicos límite D5 o,Qn de las Estaciones 1 a 5 son 1 O µm; 5 ~1m; 2,5 µm; 1,25 µm y 0,625 µm, respectiva-
mente. El filtro terminal retiene eficazmente el fármaco suspendido en aerosol en un rango de tamaño de partícula de hasta
0,625 µm. Colocar el impactador en cascada multiestación con el sistema de control según se especifica en la Figura 5. Para
asegurar que la captura de partículas sea eficiente, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con gli-
cerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado normalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya
demostrado que es innecesario. Ensamblar el impactador según se describe en las instrucciones del fabricante con un filtro
terminal por debajo de la estación final para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del dispositivo.
Unir el tubo de admisión y el adaptador de boquilla, de manera que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del
inhalador y el tubo de admisión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del inhalador
esté a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en casca-
da estén conectadas y selladas herméticamente para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide y calibrar el flujo de aire a través del sistema según se indica a
continuación. Conectar un caudalímetro al tubo de admisión. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétri-
co que abandona el medidor para determinar directamente Oout o, si tal medidór no se pudiera obtener, calcular el flujo volu-
métrico que sale del medidor (Q ut) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo
0

volumétrico de entrada (Q;n), emplear la fórmula:

en donde P0 es la presión atmosférica y L'lP es la caída de presión a lo largo del medidor. Ajustar la válvula de control de flujo
para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida, Oouu de manera que el valor de Qº"' esté dentro del
±5% del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crítico en la
válvula de control de flujo a la velocidad de flujo que se va a emplear durante la prueba, empleando el siguiente procedimien-
to. Con el inhalador montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulación, medir la presión absoluta a ambos lados de
la válvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 5). Una relación de P3/P2 s 0,5 indica flujo crítico. Cambiar la bomba por
una más potente y medir nuevamente la velocidad de flujo si P3/P2 > 0,5. Ajustar el temporizador que controla la operación de
la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra esta válvula durante un lapso de T segundos, según se determinó durante
la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o cargar el inhalador de polvo seco con polvo para inhalación de acuerdo
con las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías
cerrada, insertar la boquilla del inhalador en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Descargar el

2 Se puede obtener el impactador en cascada como Modelo 160 Marple-Miller Impactar de MSP Corporation, Minneapolis, MN. El inhalador debe conectarse al
impactador mediante el tubo de admisión que se muestra en la Figura 4a.
USP 37 Pruebas Fisicas / (601 >Aerosoles 357

polvo dentro del aparato, abriendo la válvula solenoide de dos vías durante un lapso de T segundos. Después de que la válvula
solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el inhalador del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la
muestra, recargar el inhalador según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de bo-
quilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la última
dosis, apagar la bomba de vacío.
Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir el enjuague cuantitativamente
hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada y colocar el filtro terminal en un recipiente aparte. Enjua-
gar para extraer el fármaco de cada una de las estaciones y del filtro y diluir cuantitativamente cada uno a un volumen apro-
piado. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada
en cada uno de los componentes. Determinar los diámetros límite de cada una de las estaciones individuales del impactador,
al valor de Q = Oout empleado en la prueba, por la fórmula:

Dso.o = Dso.onCOr/0) 112 (Ecuación 1)

en donde D 50 _0 es el diámetro límite a la velocidad de flujo, Q, empleada en la prueba y el subíndice n se refiere a los valores
nominales determinados cuando Qn es igual a 60 L por minuto. Así, cuando Q es igual a 40 L por minuto, el diámetro límite de
la Estación 2 viene dado por la fórmula:

D50 , 4 oLPM = 5 ~tm x [60/40] 112 =6,1 µm

Procedimiento General-Realizar la prueba utilizando el Aparato 2 a la velocidad de flujo de aire, Oout determinada anterior-
mente, durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada, siempre que Q 00 , sea menor o igual a 1 00 L por minuto. [NOTA-Si
Q 00 , es mayor que 1 00 L por minuto, utilizar una velocidad de flujo de aire de 100 L por minuto.] Conectar el aparato al siste-
ma de control de flujo basado en el flujo crítico (sónico) según se especifica en la Figura 5 (ver también la Tabla 3).
Tabla 3. Especificaciones de los Componentes para la Figura 5
Código Artículo Descripción Dimensiones
A Conector (por ej., acoplamiento corto de me- diámetro interno:> de 8 mm
tal con ramificación a P3 de diá-
metro menor)
B Tubería de vacío (por ej., tubería de silicona con un Un tubo de longitud adecuada de diámetro interno :> 8 mm con
diámetro externo de 14 mm y un un volumen interno de 25 ml ± 5 ml.
diámetro interno de 8 mm)
c Válvula solenoide de dos Ver Figura 5 Válvula solenoide de 2 vías, 2 puertos, con un diámetro interno :>
víasª 8 mm y un tiempo de respuesta de <; 100 milisegundos.
D Bomba de vacíob Ver Figura 5 La bomba debe ser capaz de extraer el flujo requerido a través del
aparato ensamblado con el inhalador de polvo seco en el adapta-
dar de boquilla. Conectar la bomba a la válvula solenoide em-
pleando una tubería de vacío corta y ancha
(:> 1O mm de diámetro interno) y conectores para minimizar los
requisitos de capacidad de la bomba.
E Temporizadorc Ver Figura 5 El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente a la vál-
vula solenoide durante el lapso de tiempo requerido.
P2, P3 Mediciones de Presión Determinar en condiciones de flujo estacionario con un transduc-
tor de presión absoluta.
F Válvula de control de flujod Ver Figura 5 Válvula reguladora ajustable con Cv :> 1 máximo.
ª A modo de ejemplo, el producto ASCO número 8030Gl 3 (Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932) o equivalente. Ver tam-
bién la Nota al pie h en la Tabla 7.
b Producto Gast tipo 1023, 1423 ó 2565 (Gast Manufacturing lnc., PO Box 97, Benton Harbar, MI 49022) o equivalente.
' A modo de ejemplo, el producto Eaton número 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901 South 12th Street, Watertown, WI 53094)
o equivalente.
d Producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS o equivalente (Parker Hannifin ple, Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaña). Ver también la Nota
al pie h en la Tabla 1.

Tabla 4. Unidades Componentes del lmpactador en Fase Líquida (lmpinger) Multiestación (ver Figura 8)
Código 1 Artículo Descripción Dimensiones 2
A,H Tubo de chorro Tubo de metal atornillado a una pared divisora sellada por Ver Figura Ba
una junta (C), superficie interna pulida
B,G Pared divisoria Placa circular de metal, diámetro 120
Grosor Ver Figura Ba
c Junta por ej., de PTFE para adaptarse al tubo de chorro
D Placa de impacto Disco de vidrio sinterizado de porosidad O,
Diámetro Ver Figura Ba
1 Ver Figura 8.
2 Las medidas son en mm a menos que se indique algo diferente.
 1

358 (601 >Aerosoles / Pruebas Físicas USP 37

Tabla 4. Unidades Componentes del lmpactador en Fase Líquida (lmpinger) Multiestación (ver Figura 8) (Continuación)
Código 1 Artículo Descripción ---------- --
Dimensiones
-
2 1

E Cilindro de vidrio Tubo de vidrio cortado pulido plano

1
Altura, incluyendo juntas ' 46
~· --
Diámetro externo 100
----
Espesor de pared 3,5
-~ ..- - - - - - --- --------
Diámetro (F) del muestreador 18
--
Tapón en muestreador ISO 24/25
j Marco de metal Marco circular con perfil en L con ranura
Diámetro interno Para adaptarse a la placa de impacto
Altura 4
,--------- -----
Grosor de sección horizontal 0,5
Grosor de sección vertical 2
-------- ---- -------------
K Alambre Alambre de acero que interconecta el marco de ~eta! y el
eje (dos por cada marco)
Diámetro 1
L Camisa Camisa de metal fijada al tubo de chorro mediante torni-
llos
Diámetro interno Para adaptarse al tubo del chorro
Altura 6
Grosor 5
M junta Por ej., de silicona Para adaptarse al cilindro de vidrio
N Perno Perno con tuerca de metal (seis pares), longitud 205
Diámetro 4
p junta tórica junta tórica de goma, diámetro x grosor 66,34 X 2,62
Q junta tórica Junta tórica de goma, diámetro x grosor 29,1 X 1,6
R Portafiltro Bastidor de metal con pie y salida Ver Figura Bb
s Soporte de filtro Lámina de metal perforada, diámetro 65
Diámetro de orificio 3
Distancia entre orificios (puntos centrales) 4
--
T Cierres de funcionamiento
ultrarrápido
u Tubo de chorros múltiples Tubo de chorro (H) que termina en disposición de chorros Ver insertos en Figura Ba
múltiples
V Salida Salida y tobera para conexión a vacío Diámetro interno 2 1O (Figura Bb)
1 Ver Figura 8.
2 Las medidas son en mm a menos que se indique algo diferente.
USP 37 Pruebas Físicas/ (601 \Aerosoles 359

Centro de la estación

r
1- ________'
1

5
J

Esquema de la trayectoria
de múltiples chorros

Fig. 8a. Aparato 4: Detalles del tubo de chorro y la placa de impacto. Los insertos muestran el extremo del tubo de chorros
múltiples, U, que lleva a la Estación 4. (Ver Tabla 5 para obtener más detalles sobre especificaciones de dimensiones.)

- $81 mm ---

$60 mm
1

10mm
5mm

Fig. 8b. Aparato 4: Vista expandida de la Estación 5 (Ver Tabla 4 para obtener información sobre las especificaciones de los
componentes.)

Tabla S. Aparato 4: Dimensiones 1 del Tubo de Chorro con Placa de Impacto (ver Figura Sa).
Filtro (Esta-
Tipo Código 2 Estación 1 Estación 2 Estación 3 Estación 4 ción S)
Distancia 1 9,5 (-0,0; +0,5) 5,5 (-0,0; +0,5) 4,0 (-0,0; +0,5) 6,0 (-0,0; +0,5) n.a.
Distancia 2 26 31 33 30,5 o
Distancia 3 8 5 5 5 5
Distancia 4 3 3 3 3 n.a.
-- --
Distancia 5 o 3 3 3 3
Distancia 63 20 25 25 25 25
Distancia 7 n.a.
-- ~--- r--- ..
n.a. n.a. 8,5 n.a.
---
Diámetro c 25 14 8,0 (±0,1) 21 14
- - r-------
Diámetro d 50 30 20 30 n.a.
Diámetro e 27,9 16,5 10,5 23,9 n.a.
Diámetro f 31,75 (-0,05; +0,00) 22 14 31 22
--
Diámetro g 25,4 21 13 30 21
Diámetro h n.a. n.a. n.a. 2,70 (±0,05) n.a.
--
Diámetro j n.a. n.a. n.a. 6,3 n.a.
1 Medidas en mm con tolerancias conformes a ISO 2768-m, d menos que se indique algo d1ferrntr.
2 Ver Figura 8a.
3 Incluyendo junta.
4 Línea central relativa del compartimento de la estdción.
n.a.: no aplicable.
 360 (601 >Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

Tabla 5. Aparato 4: Dimensiones 1 del Tubo de Chorro con Placa de Impacto (ver Figura 80). (Continuación)
Filtro (Esta- 1

Tipo Código 2 Estación 1 Estación 2 Estación 3 Estación 4 ción 5)

Diámetro k n.a. n.a. n.a. 12,6 n.a.
Radio 4 r 16 22 27 28,5 o
Radio 4 s 46 46 46 46 n.a.
Radio 4 t n.a. 50 50 50 50
Ángulo w 1 Oº 53º 53º 53º 53º
Ángulo u n.a. n.a. n.a. 45º n.a.
Ángulo V n.a. n.a. n.a. 60º n.a.
1 Medidas en mm con tolerancias conformes a ISO 2768-m, a menos que se indique algo diferente.
2 Ver Figura 80.
3 Incluyendo junta.
4 Línea central relativa del compartimento de la estación.
n.a.: no aplicable.

En condiciones de flujo constante, a la velocidad de flujo de aire volumétrico apropiada a través de todo el aparato, asegu-
rarse de que se ocasione un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo determinando los valores de presión absoluta,
P2 y P3, de manera que la relación P3/P2 sea menor o igual a 0,5. Recubrir la superficie de recolección de partículas de cada
una de las estaciones del impactador en cascada para asegurar que las partículas que hayan impactado en una estación dada
no se reintroduzcan por arrastre en la corriente de aire que fluye a menos que se haya demostrado que esto no es necesario.
Analizar los datos según se indica en Análisis de Datos.
Aparato 3 para Inhaladores de Polvo Seco-
Diseño-El Aparato 3 es idéntico al Aparato 7 (Figura 4), excepto que el preseparador del fabricante se agrega encima de la
Estación O para recolectar masas grandes de polvo no inhalable antes de que ingresen al impactador; y la conexión de salida,
que se utiliza para conexión al tubo de vacío B (Figura 5), se reemplaza por otra que tenga un diámetro interno :2: 8 mm. Para
conectar el preseparador del impactador al tubo de admisión (Figura 4a), se debe emplear una pieza superior especialmente
diseñada para el preseparador. Esto se muestra en la Figura 1 3 • Por lo tanto, el impactador tiene 8 estaciones, un preseparador
(para recolección de partículas grandes) y un filtro terminal. A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 28,3 L por minuto
(la velocidad del flujo nominal, Q"), los diámetros aerodinámicos límite D5 o.on de las Estaciones O a 7 son 9,0 ~tm, 5,8 µm, 4,7
µm, 3, 3 µm, 2, 1 µm, 1, 1 µm, 0, 7 µm y 0,4 µm, respectivamente. El filtro terminal retiene eficazmente el fármaco suspendido
en el aerosol en el rango de tamaño de partícula de hasta 0,4 µm. Conectar el impactador en cascada al sistema de control
especificado en la Figura 5. Omitir la Estación 6 y la Estación 7 del impactador si la velocidad de flujo de prueba, Qº"" emplea-
da durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada es mayor o igual a 60 L por minuto. Para asegurar una captura eficiente
de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido
adecuado típicamente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario.
Ensamblar el impactador, según se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de la estación
final para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del dispositivo. Colocar un volumen adecuado (has-
ta 1 O ml) de un disolvente apropiado en el preseparador o recubrir las superficies de recolección de partículas del presepara-
dor para prevenir el reingreso de las partículas impactadas por arrastre. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezc-
las de aíre y vapor inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones
correspondientes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operación de la bomba mínimos, etc.) para garanti-
zar la protección del operador durante la prueba.] Conectar un adaptador de boqüilla moldeado al extremo del tubo de admi-
sión de manera que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del inhalador y el tubo de admisión. Emplear un adap-
tador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del inhalador esté a nivel con el extremo abierto del tubo de
admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada estén conectadas y selladas herméticamente
para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide de dos vías y calibrar el flujo de aire a través del sistema según
se indica a continuación. Cebar o cargar el inhalador de polvo seco con polvo para inhalación conforme a las instrucciones que
figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla
del inhalador en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Una vez que el inhalador está en posición,
descargar el polvo dentro del aparato activando el temporizador y abriendo la válvula solenoide de dos vías durante el lapso
de tiempo requerido, T ± 5%, según se determinó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Después de que la vál-
vula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el inhalador del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para
la muestra, recargar el inhalador según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de
boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la
última dosis, retirar el inhalador del adaptador de boquilla y apagar la bomba de vacío.

3 El impactador en cascada está disponible como el producto Andersen 1ACFM Non-Viable Cascade lmpactor (Mark 11) de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway,
Franklin, MA 02038. El impactador se usa con el preseparador.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 361

Desmontar cuidadosamente el aparato. Usando un disolvente adecuado, enjuagar para extraer el fármaco del adaptador de
boquilla, el tubo de admisión y el preseparador y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Enjuagar
para extraer el fármaco de cada estación y de la placa de impacto situada inmediatamente debajo y recoger los enjuagues en
matraces de tamaño apropiado. Diluir cuantitativamente cada matraz hasta un volumen apropiado. Empleando el método de
análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada una de las muestras. Los
diámetros aerodinámicos límite de las estaciones individuales de este dispositivo, en el intervalo de flujo de aire entre 30 L y
100 L de aire por minuto, no se han podido establecer bien en la actualidad. No utilizar la fórmula de la Ecuación 1 para calcu-
lar los diámetros límite.
Procedimiento-Proceder según se indica en el Procedimiento General en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 3.
Aparato 4 para Inhaladores de Polvo Seco-
NOTA-El Aparato 4, un impactador en fase líquida multiestación, tiene un número reducido de estaciones y su uso está am-
pliamente difundido fuera de los Estados Unidos. Se proporciona en este documento para beneficio de los usuarios de los res-
tantes países fuera de los Estados Unidos.
Diseño-El diseño y el montaje del Aparato 4 se muestran en las Figuras 8, 8a y 8b. 4 El tubo de admisión utilizado para
conectar el dispositivo al inhalador se muestra en la Figura 4a. El dispositivo es un impactador en fase líquida multiestación que
consiste en las Estaciones de impacto 1; 2; 3 y 4 y un filtro terminal integrado (Estación 5). Las estaciones de recolección del
impactador en fase líquida (ver Figura 8 y Tabla 4) se mantienen húmedas, a diferencia de los impactadores tradicionales, co-
mo por ejemplo los Aparatos 1; 2; 3; 5 y 6; este humedecimiento puede producir un efecto similar al recubrimiento de las
estaciones de los Aparatos 2; 3; 5 y 6 a determinadas velocidades de flujo, aunque esto debe confirmarse demostrando el con-
trol del reingreso por arrastre según se ha descrito previamente. Una estación de impacto comprende una pared divisoria me-
tálica horizontal y superior (B) a través de la cual sobresale un tubo metálico de entrada de chorro (A) con su placa de impacto
(D); un cilindro de vidrio (E) con una abertura de muestreo (F), que forma la pared vertical de la estación; y una pared divisoria
metálica horizontal inferior (G) a través de la cual un tubo (H) se conecta a la estación inferior. El tubo que entra en la estación
4 (U) termina en una disposición de chorros múltiples. La placa de impacto (D) se asegura en un marco metálico (J), el cual se
ajusta mediante dos alambres (K) a una manga (L) asegurada sobre el tubo de chorro (C). Para más detalles sobre el tubo de
chorro y la placa de impacto, ver Figura 8a. El plano horizontal de la placa de recolección es perpendicular al eje del tubo de
chorro y se alinea centralmente. La superficie superior de la placa de impacto se eleva levemente por encima del borde del
marco metálico. Un surco alrededor del perímetro de la pared divisoria horizontal guía la posición del cilindro de vidrio. Los
cilindros de vidrio se sellan con juntas (M) contra las paredes divisorias horizontales y se sujetan mediante seis pernos (N). Las
aberturas de muestreo se sellan con tapones. El fondo de la pared divisoria inferior de la Estación 4, tiene una protuberancia
concéntrica fijada con una junta tórica (P) que la sella contra el borde de un filtro colocado en el portafiltro. El portafiltro (R),
es una cubeta con un hueco concéntrico en el que se calza un soporte de filtro perforado (S). El portafiltro está diseñado para
filtros de 76 mm de diámetro. El montaje completo de la estación de impacto se ajusta al portafiltro mediante dos cierres de
funcionamiento ultrarrápido (T). El impactador en fase líquida está equipado con un tubo de admisión (Figura 4a) que se ajus-
ta al tubo de entrada de chorro de la Estación 1. Una junta tórica de goma en el tubo de chorro proporciona un sellado her-
mético al tubo de admisión. Un adaptador de boquilla elastomérico para insertar el inhalador en análisis proporciona un sella-
do hermético entre el inhalador y el tubo de admisión.
A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L por minuto (la velocidad del flujo nominal, Qn), los diámetros aerodiná-
micos límite Dso,on de las Estaciones 1 a 4 son 13,0 µm, 6,8 µm, 3, 1 µm y 1,7 µm, respectivamente. El filtro terminal retiene
eficazmente el fármaco suspendido en aerosol cuyo tamaño de partícula se encuentra en el rango hasta 1,7 µm. Asegurarse de
que el Aparato 4 esté limpio y exento de solución del fármaco proveniente de pruebas anteriores. Colocar un filtro de 76 mm
de diámetro en la estación de filtro y montar el aparato. Usar un filtro de baja presión capaz de recolectar cuantitativamente el
aerosol del fármaco que lo atraviesa, que también permita una recuperación cuantitativa del fármaco recolectado. Armar el
Aparato 4 empleando el sistema de control especificado en la Figura 5. Unir el tubo de admisión (Figura 4a) y el adaptador de
boquilla para que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del inhalador y el tubo de admisión. Emplear un adapta-
dor de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del inhalador esté a nivel con el extremo abierto del tubo de admi-
sión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del aparato estén conectadas herméticamente para evitar fugas. Poner en
marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide de dos vías y calibrar el flujo de aire a través del sistema según se indica a
continuación. Conectar al tubo de admisión un caudalímetro calibrado para medir la velocidad del flujo volumétrico que sale
del medidor. Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida,
Q 0 uu de manera que el valor de Qout esté dentro del ±5 % del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis
Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crítico en la válvula de control de flujo al valor Qout que se va a emplear durante la
prueba, empleando el siguiente procedimiento. Con el inhalador montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulación,
medir la presión absoluta a ambos lados de la válvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 5). Una relación de P3/P2:;:; 0,5
indica flujo crítico. Cambiar la bomba por una más potente y medir nuevamente la velocidad de flujo si P3/P2 > 0,5. Ajustar el
temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra esta válvula durante el mismo
lapso de tiempo, T, que el que se empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Dispensar 20 mL de un disolven-
te capaz de disolver el fármaco dentro de cada una de las cuatro estaciones superiores del Aparato 4 y colocar nuevamente los

4 El impactador en fase líquida de cinco estaciones está disponible de Copley lnstruments, ple, Nottingham, Gran Bretaña. El inhalador debe conectarse al impac-
tador por medio del tubo de admisión, que se muestra en la Figura 4 y la Figura 4a.
 362 (601) Aerosoles/ Pruebas Físicos USP 37

tapones. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire y vapor inflamables que se pueden incendiar durante su
pasaje a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor,
tiempos de operación de la bomba mínimos, etc.) para garantizar !a protección del operador durante la prueba.] Inclinar el aparato
para humedecer los tapones y de esa forma neutralizar sus cargas electroestáticas. Ajustar el temporizador que controla la ope-
ración de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra la válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se
empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o cargar el inhalador de polvo seco con polvo para inhala-
ción conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide
de dos vías cerrada, insertar la boquilla del inhalador en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión.
Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la válvula solenoide de dos vías durante el lapso
requerido, T ± 5%. Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el inhalador del adaptador de bo-
quilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el inhalador según las instrucciones que figuran en la etiqueta,
reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido des-
cargado. Después de la descarga de la ultima dosis, apagar la bomba de vacío.
Desarmar la estación de filtro del Aparato 4. Cuidadosamente retirar el filtro y extraer el fármaco con disolvente. Enjuagar el
adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un
volumen apropiado. Enjuagar el interior del tubo de chorro de entrada que va a la Estación 1 (Figura 8), permitiendo que el
disolvente fluya dentro de la estación. Enjuagar para extraer el fármaco de las paredes internas y de la placa de recolección de
cada una de las 4 estaciones superiores del aparato y transferir a la solución de la estación respectiva, inclinando y rotando el
aparato, asegurándose de que no haya transferencia de líquido entre las estaciones. Empleando el método de análisis especifi-
cado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los seis volúmenes de disolvente.
Asegurarse de que el método corrija la posible evaporación de disolvente durante la prueba. Esto puede involucrar el uso de un
estándar interno (de concentración original conocida en el disolvente y valorado al mismo tiempo que el fármaco) o la transfe-
rencia cuantitativa del contenido líquido de cada una de las estaciones, seguida por una dilución hasta un volumen conocido.
Determinar los diámetros límite de cada una de las estaciones individuales del impactador, al valor de Q = Oout empleado en la
prueba, por la fórmula:

Dso,Q = Dso,Qn (Qn/0) 112

en donde D50 ,0 es el diámetro límite a la velocidad de flujo, Q, empleada en la prueba y el subíndice n se refiere a Jos valores
nominales determinados cuando Q" es igual a 60 L de aire por minuto. Así, cuando Q es igual a 40 L de aire por minuto, el
diámetro límite de la Estación 2 viene dado por la fórmula:
Dso,4oLPM = 6,8 µm x (60/40) 112 = 8,3 µm.

Procedimiento-Proceder según se indica en el Procedimiento General en Aparato 2, excepto que se debe usar el Aparato 4.
Aparato 5 para Inhaladores de Polvo Seco-
Oiseño-EI diseño y montaje del Aparato 5 5 se muestran en las Figuras 9, 9a, 9b, 9c y 9d. El tubo de admisión, empleado
para conectar el dispositivo a un inhalador, se muestra en la Figura 4a. El dispositivo es un impactador en cascada con siete
estaciones y un colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés). A lo largo del intervalo de velocidad de flujo de
diseño entre 30 L y 100 L por minuto, los diámetros límite de las estaciones al 50% de eficiencia (valores D50) varían entre 0,24
µm y 11,7 µm espaciados de manera uniforme en una escala logarítmica. En el intervalo de velocidad de flujo de diseño, siem-
pre hay como mínimo cinco estaciones con valores D50 entre 0,5 µm y 6,5 µm. Las curvas de eficiencia de recolección para
cada estación son marcadas y minimizan la superposición entre estaciones. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u
otro material adecuado.
La distribución del impactador tiene cubetas de impacto extraíbles con todas ías cubetas en un plano (Figuras 9 a 9c). El
impactador tiene tres secciones principales: el marco inferior que aloja las cubetas de impacto, el cuerpo sellador que mantiene
en su Jugar Jos chorros y la tapa que contiene los pasajes entre estaciones (que se muestran en las Figuras 9 a 9b). Se emplean
múltiples toberas en todas las estaciones salvo en Ja primera (Figura 9c). El flujo pasa a través del impactador siguiendo un
patrón en forma de dientes de sierra.
La medición de la estación se realiza periódicamente junto con la confirmación de otras dimensiones críticas para el eficaz
funcionamiento del impactador. Las dimensiones críticas se proporcionan a continuación en la Tabla 6.
Tabla 6. Dimensiones Críticas para los Aparatos 5 y 6
Dimensiones
Descripción (mm)
Preseparador (dimensión a-ver Figura 9d) 12,80 ± 0,05
Estación 1 1 Diámetro de tobera 14,30 ± 0,05
Estación 2 1 Diámetro de tobera 4,88 ± 0,04
1 Ver Figura 9c.
2 Ver Figura 9b.

5 El impactador en cascada puede obtenerse como Next Generation Pharmaceutical Impactar de MSP Corporation, Minneapolis, MN.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 363

Tabla 6. Dimensiones Críticas

----·
para los Aparatos 5 y 6 (Continuación)
Dimensiones
Descripción (mm)
Estación 3 1 Diámetro de tobera 2,185 ± 0,02
Estación 4 1 Diámetro de tobera 1,207 ± 0,01
Estación 5 1 Diámetro de tobera 0,608 ± 0,01
Estación 6 1 Diámetro de tobera 0,323 ± 0,01
Estación 71 Diámetro de tobera 0,206 ± 0,01
MOC 1 aproximadamente 0,070
Profundidad de cubeta (Dimensión b-ver Figura 9b) -··
14,625 ± 0,10
Rugosidad de la superfici_e_~e la cub_et¡¡ ~ec()lt>Ct()~ª- ----- --- ----------- --------- -··- --
0,5 ~1m a 2 pm
Estación 1 Distancia de tobera hasta cuerpo sellador2 -dimensión c o± 1,18
J=stación 2 Distancia de tobera hasta cuerpo sellador 2-dimensión c 5,236 ± 0,736
Estación 3 Distancia de tobera hasta cuerpo sellador2-dimensión c 8,445 ± 0,41 o
Estación 4 Distancia de tobera hasta cuerpo sellador2-dimensión c 11,379 ± 0,237
Estación 5 Distancia de tobera hasta cuerpo sellador2-dimensión c 13,176 ± 0,341
Estación 6 Distancia de tobera hasta cuerpo sellador2-dimensión c 13,999 ± 0,071
Estación 7 Distancia de tobera hasta cuerpo sellador 2-dimensión c 14,000 ± 0,071
MOC Distancia de tobera hasta cuerpo sellador2-dimensión c 14,429 - 14,571
1 Ver Figura 9c.
2 Ver Figura 9b.

En las operaciones de rutina, el cuerpo sellador y la tapa se mantienen juntos entre sí como un solo dispositivo. Se tiene
acceso a las cubetas de impacto cuando se abre este equipo al final de una prueba de un inhalador. Las cubetas se mantienen
en una bandeja que hace de soporte, de manera que todas las cubetas se pueden sacar simultáneamente del impactador le-
vantando la bandeja.
Un tubo de admisión con dimensiones internas idénticas a las que se definen en la Figura 4a se conecta a la entrada del
impactador. Cuando sea necesario, con los inhaladores de polvo seco, se puede agregar un preseparador para evitar sobrecar-
gar la primera estación. El preseparador se conecta entre el tubo de admisión y el impactador. Se emplea un adaptador de
boquilla adecuado para proporcionar un sellado hermético entre el inhalador y el tubo de admisión.
A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L por minuto (velocidad de flujo de referencia asignada para cálculos de
diámetro límite, Qn), los diámetros aerodinámicos límite D5 o,on de las Estaciones 1 a 7 son 8,06 µm, 4,46 µm, 2,82 µm, 1,66
µm, 0,94 µm, 0,55 µm y 0,34 µm respectivamente. El aparato contiene un colector de microorificios (MOC) terminal que,
para la mayoría de las formulaciones, puede eliminar la necesidad de un filtro final, según se determine mediante la validación
del método. El MOC es la placa de toberas y cubeta de recolección de un impactador. La placa de toberas contiene, nominal-
mente, 4032 orificios, cada uno con un diámetro de aproximadamente 70 µm. La mayoría de las partículas que no fueron
capturadas en la Estación 7 del impactador serán capturadas en la superficie de la cubeta que está debajo del MOC. (Para
impactadores que operan a 60 L por minuto, el MOC es capaz de recolectar un 80% de partículas de O, 14 µm). Para formula-
ciones con una fracción significativa de partículas no capturadas por el MOC, hay un portafiltro opcional que puede reempla-
zar al MOC o colocarse a continuación del MOC que contiene un filtro terminal adecuado (a menudo, la fibra de vidrio es
adecuada).
Procedimiento-Ensamblar el aparato con el preseparador (Figura 9d), a menos que se haya demostrado experimentalmente
que su omisión no da como resultado un incremento en la pérdida de fármaco entre estaciones (>5%) o en el reingreso de
partículas por arrastre, en cuyo caso se puede omitir el preseparador.
Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la
superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente
depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Insertar la bandeja de
cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido a
esta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de forma que el sistema sea hermético.
El preseparador puede prepararse del siguiente modo: montar el inserto del preseparador en la base del preseparador; co-
nectar la base del preseparador a la entrada del impactador; agregar 15 mL del disolvente empleado para la recuperación de la
muestra a la cubeta central del inserto del preseparador; colocar el cuerpo del preseparador; y cerrar las dos grampas sujetado-
ras. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire y vapor inflamables que se pueden incendiar durante su pasa-
je a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondientes (por ejemplo, disolventes alternativos, uso de trampas de
vapor, tiempos mínimos de operación de la bomba, etc.) para garantizar la protección del operador durante la prueba.]
Conectar un tubo de admisión con dimensiones internas según se definen en la Figura 4a a la entrada del impactador o a la
entrada del preseparador ubicado encima del impactador en cascada (Figura 9d). Colocar en posición un adaptador de boqui-
lla adecuado al final del tubo de admisión de manera que el extremo final de la boquilla del inhalador, cuando se inserta, esté
alineado a lo largo del eje horizontal del tubo de admisión. La cara frontal de la boquilla del inhalador está a nivel con la cara
364 (601) Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

frontal del tubo de admisión, produciendo un sellado hermético. Cuando se une al adaptador de boquilla, el inhalador debe
colocarse en la misma orientación en la que está previsto que se use. Conectar e! aparato al sistema de flujo conforme al es-
quema especificado en la Figura 5.
A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba a la velocidad de flujo empleada en la prueba para Uniformidad de
Dosis Liberada, extrayendo 4 L de aire desde la boquilla del inhalador a través del aparato. Conectar un caudalímetro al tubo de
admisión. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétrico que abandona el medidor o calcular el flujo volu-
métrico que sale del medidor (Q 0 u 1) utilizando la ley de los gases ideales. Para un medidor calibrado con el fin medir el flujo
volumétrico de entrada (Q, 0 ) , emplear la fórmula:

en donde P0 es la presión atmosférica y t.P es la caída de presión a lo largo del medidor. Ajustar la válvula de control de flujo
para lograr un flujo estable a través del sistema a la velocidad requerida, Q 001 (±5%). Asegurar que se produzca flujo crítico en
la válvula de control de flujo mediante el procedimiento descrito para el Aparato 2. Ajustar el temporizador que controla la
operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra la válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que
se empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada.
Cebar o cargar el inhalador de polvo seco con polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta.
Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del inhalador en for-
ma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el tempori-
zador y abriendo la válvula solenoide de dos vías durante el lapso requerido, T (± 5%). Después de que la válvula solenoide de
dos vías se haya cerrado, retirar el inhalador del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recar-
gar el inhalador según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la
operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la ultima dosis, apagar la
bomba de vacío.
Desarmar el aparato y recuperar el fármaco a analizar de la siguiente manera: retirar el tubo de admisión y el adaptador de
boquilla del preseparador y extraer el fármaco en una alícuota de disolvente; sí se hubiera empleado el preseparador, retirarlo
del impactador sin derramar el disolvente dentro de este último; y recuperar el ingrediente activo de todas las superficies inter-
nas.
Abrir el impactador liberando el mecanismo de enganche y levantando la tapa. Retirar la bandeja de cubetas con las cubetas
y recuperar el ingrediente activo de cada cubeta con una alícuota de disolvente. Empleando el método de análisis especificado
en la monografía individual, determinar la masa de fármaco contenida en cada alícuota de disolvente.
Determinar los diámetros límite de cada una de las estaciones individuales del ímpactador, al valor de Q = Oaut empleado en
la prueba, por la fórmula:

Dso,Q = Dso,Qn (Q 0 /Q)X, (Ecuación 2)

en donde D 50 _0 es el diámetro límite a la velocidad de flujo, Q, empleada en la prueba y el subíndice n se refiere a los valores
nominales o de referencia para Q 0 = 60 L de aire por minuto (ver Tabla 7). Los valores para el exponente x, se enumeran en la
Tabla 7. Así, cuando Q = 40 L de aire por minuto, el diámetro límite de la Estación 2 viene dado por la fórmula:

D50, 4 oLPM = 4,46 µm x (60/40)º· 52 = 5,51 µm.

Analizar los datos según se indica en Análisis de Datos.

Tabla 7. Diámetro Aerodinámico Límite para las Estaciones de los Aparatos 5 y 6
Utilizar la Ecuación 2 para calcular Dso,Q para velocidades de flujo, Q, comprendidas en el intervalo entre 30 L y 100 L por minuto
con Q = 60 L por minuto.
0

Estación X
º'º""
1 8,06 0,54
2 4,46 0,52
3 2,82 0,50
4 1,66 0,47
5 0,94 0,53
6 0,55 0,60
7 0,34 0,67
USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 365

Tubo de admisión

Cuerpo del impactador

Figura 9. Aparato 5 (se muestra con el preseparador colocado en su lugar).

Boquilla de estación 1 Conexión entre estaciones

Colector de micro-
orificios (MOC)

Tapa con sello

unida al cuerpo

Encaje para la saliente de

colocación

Marro infer'<lr oon la bandeja

paa las cubetas rrootada

Fig. 9a. Componentes del Aparato 5.

 366 (601) Aerosoles / Pruebas Físicas USP 37

( 'tmc:1:iún a la siguicnLL' ( 'onc:1:i{m a la estación

r r
cstacillll prc\la

Tapa

Sello del cuerpo

Band~jade
Flujo de aire cubetas
Marco inferior

C ubda de 1\_,cuk:cci,·m
Estación multi tobera

Figura 9b. Disposición de los pasajes entre estaciones del Aparato 5.

estación 2 estación 4 estación 6 MOC

6 orificios 52 orificios 396 orificios 4032 orificios

estación 1 estación 3 estación 5 estación 7

1 orificio 24 orificios 152 orificios 630 orificios

Figura 9c. Configuración de toberas del Aparato 5.

r
~
J'
C( •..---=---cc::-:::=--==·~5

, Base del preseparador

Inserto del preseparador

Figura 9d. Disposición del preseparador para el Aparato 5.

Aparato 6 para Inhaladores de Dosis Fija-

Oiseño-EI Aparato 6 es idéntico al Aparato 5 (Figuras 9 a 9d), excepto que no se utiliza el preseparador. Emplear este apara-
to a una velocidad de flujo de 30 L por minuto (±5%), a menos que se indique algo diferente en la monografía individual.
Procedimiento-Montar el aparato sin el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para
asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol,
aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya de-
mostrado que esto es innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Ce-
rrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido y accionar el mecanismo de enganche para trabar ambas partes del
impactador de forma que el sistema cierre herméticamente. Conectar a la entrada del impactador un tubo de admisión con
dimensiones internas idénticas a las que se definen en la Figura 4a. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el
extremo de la boquilla del inhalador esté a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Encender la bomba de vacío
para extraer el aire a través del impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a través del sistema con un caudalímetro apro-
USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 367

piado unido al extremo abierto del tubo de admisión. Ajustar la válvula de control de flujo de la bomba de vacío para lograr un
flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida, y asegurarse de que el flujo de aire que recorre el sistema esté
comprendido entre ±5% de la velocidad de flujo seleccionada. A menos que se indique algo diferente en las instrucciones de
uso para el paciente, agitar el inhalador duran le 5 segundos y disparar para desechar una descarga. Con la bomba de vacío en
funcionamiento, insertar la boquilla en su adaptador e inmediatamente disparar para descargar la dosis mínima recomendada
en el impactador en cascada. Mantener la válvula presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya
descargado por completo. Si se requieren atomizaciones adicionales para recolectar la muestra, agitar el inhalador, reinsertar
en el adaptador de boquilla e inmediatamente pulsar para descargar la siguiente dosis mínima recomendada.
Repetir hasta que se haya descargado el número de dosis requerido. El número de dosis mínimas recomendadas debe ser tal
que permita una determinación exacta y precisa de la Distribución de Tamaños Aerodinámicos. [NOTA-Usualmente, el número
de dosis mínimas recomendadas no es mayor de 1 O.] Después de que la última dosis haya sido descargada, retirar el inhalador
del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los
enjuagues cuantitativamente hasta un vo!umen apropiado.
Desarmar el aparato y recuperar el fármaco para su análisis de la siguiente manera: retirar el tubo de admisión y el adapta-
dor de boquilla del aparato y recuperar el fármaco depositado en una alícuota de disolvente; abrir el impactador liberando el
mecanismo de enganche y levantando la tapa; retirar la bandeja de cubetas con las cubetas; y extraer el ingrediente activo de
cada cubeta con una alícuota de disolvente. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, deter-
minar la cantidad de ingrediente activo contenida en cada alícuota de disolvente.
Determinar los diámetros límite de cada una de las estaciones individuales del impactador, al valor de Q empleado en la
prueba, utilizando la Ecuación 2 con los valores obtenidos de la Tabla 7. Así, cuando Q = 30 L de aire por minuto, el diámetro
límite de la Estación 2 viene dado por la fórmula:

Dso. 3oLPM = 4,46 ~tm x (60/30) 0.s 2 = 6,40 µm

Para analizar los datos, proceder según se indica en Análisis de Datos.

Análisis de Datos

Esta sección describe el análisis de datos requerido para definir la Distribución de Tamaños Aerodinámicos del fármaco descar-
gado de un inhalador de prueba, después del uso de los Aparatos 1; 2; 3, 4; 5 ó 6. Ingresar los datos recolectados de los
Aparatos 1; 2; 3, 4; 5 ó 6 en la tabla de resumen de masas según se muestra en la Tabla 8. Realizar exclusivamente los cálculos
especificados en la monografía individual.
Tabla 8 Tabla de Resumen de Masas para Análisis de Inhaladores de Dosis Fija e Inhaladores de Polvo Seco
Masa Aparato 1 Aparato 2 Aparato 3ª Aparato 4b Aparato 5d Aparato 6d
Adaptador de boquilla A - AA - A - A - A - A -

Preseparador - - - - Ap - - - Ap - - -
Estación O del impac- Ao Bo - - Ao Bo - - - - - -
tador
Estación 1 del A1 B1 A1 - A1 B1 A1 - A1 B1 A1 B1
impactador/
borboteador
Estación 2 del A2 B2 A2 B2 A2 B2 ~2 B2 A2 B2 A2 B2
impactador/
borboteador
Estación 3 del A3 B3 A3 B3 A3 B3 A3 B3 A3 B3 A3 B3
impactador/
borboteador
Estación 4 del A4 B4 A4 B4 A4 B4 A4 B4 A4 B4 A4 B4
impactador/
borboteador
Estación 5 del As Bs As Bs As Bs - - As Bs As Bs
impactador/
borboteador
Estación 6 del A6 B6 - - A6 B6 - - A6 B6 A6 B6
impactador/
borboteador
ª Las Estaciones 6 y 7 se han omitido del Aparato 3 a velocidades de flujo de aire de >60 L por minuto.
b La Estación 5 del Aparato 4 es la estación de filtro (ver Figura 8).
e 'iA es la masa total de fármaco recuperada del aparato; 'iB es la masa de fármaco recuperado del impactador (Aparatos 7, 3, 5 y 6) o de las estaciones del
impactador ubicadas debajo de la estación más alta (Aparatos 2 y 4).
d Para los Aparatos 5 y 6, los valores para las masas de fármaco AF y BF se refieren a recolecciones del MOC o el filtro terminal, si se utiliza, o de ambos.
368 (601 >Aerosoles/ Pruebas Físicas USP 37

Tabla 8. Tabla de Resumen de Masas para Análisis de Inhaladores de Dosis Fija e Inhaladores de Polvo Seco (Continuación)
1
Masa Aparato 1 Aparato 2 Aparato 3" Aparato 4h Aparato Sci Aparato 6d
Estación 7 del A1 g; -·- -
A1 g1 -- - A¡ g7 A¡ g1
impactador/
borboteador
Filtro A, gr A g, A, g, A, g, A, g, A, g,
Suma de 'i.Ac ¿ge L.N ¿ge L.N 'i.B( '2.Ac ¿ge 'i..A( ¿ge L.Ac IBC
Masas
" Las Estaciones 6 y 7 se han omitido del Aparato 3 a velocidades de flujo de aire de >60 L por minuto.
b La Estación 5 del Aparato 4 es la estación de filtro (ver Figura 8).
' 'f.A es la masa total de fármaco recuperada del aparato; Z:B es la masa de fármaco recuperado del impactador (Aparatos 7, 3, 5 y 6) o de las estaciones del
impactador ubicadas debajo de la estación más alta (Aparatos 2 y 4).
d Para los Aparatos 5 y 6, los valores para las masas de fármaco AF y BF se refieren a recolecciones del MOC o el filtro terminal, si se utiliza, o de ambos.

CÁLCULOS

Dosis de Partículas Finas y Fracción de Partículas Finas -Calcular la masa total, 'LA, de fármaco descargado en el aparato
desde la boquilla del inhalador. Luego calcular la masa total, R, de fármaco encontrada en las estaciones del aparato y en el
filtro que capturó el fármaco en el intervalo de partículas finas apropiado para el fármaco particular en análisis. La Dosis de
Partículas Finas se calcula con la fórmula:

R/n
en donde R es el térmido definido anteriormente y n es el número de dosis descargadas durante la prueba. La Fracción de Partí-
culas Finas que sería emitida desde el inhalador se calcula luego por la fórmula:

R/'LA
Porcentaje Acumulativo(% Acum.) de Masa de Fármaco Menor que el Diámetro Aerodinámico Declarado-Construir
la Tabla 9 dividiendo la masa de fármaco recolectada en la estación de filtro entre 'LB (ver Tabla 8). Multiplicar el cociente por
1 00 e introducir este número como el porcentaje opuesto al diámetro límite efectivo de la estación inmediata superior en la
pila de estaciones del impactador o borboteador. Para el Aparato 2 ó 4, emplear la Ecuación 1 para calcular los diámetros límite
de estación, Ds 0 , 0 , a la velocidad de flujo de aire, Q, utilizada durante la prueba. Para los Aparatos 5 y 6, emplear la Ecuación 2
con la Tabla 7. Para el Aparato 7, usar los diámetros límite informados por el fabricante. Para el Aparato 3, presentar los datos
como porcentajes acumulativos de masa para la estación establecida e inferiores y evitar la asignación de valores a los diáme-
tros límite de la estación.
Repetir los cálculos para cada una de las estaciones en la pila de estaciones del impactador o borboteador, en orden numéri-
co inverso (de mayor a menor número de estación). Para cada estación, calcular el porcentaje acumulativo de masa que sea
menor que el diámetro aerodinámico establecido, sumando el porcentaje de masa en esa estación y el porcentaje de masa
total de las estaciones por debajo e ingresando el valor opuesto al diámetro límite efectivo de la estación por encima en la pila
de estaciones. De esta manera, el porcentaje de fármaco sobre el filtro puede verse como el que tiene diámetros aerodinámi-
cos menores que el diámetro límite de la estación por encima del filtro; y el porcentaje sobre el filtro más el porcentaje de la
estación superior tiene diámetros aerodinámicos menores que el diámetro límite de la estación por encima y así sucesivamen-
te. Repetir los cálculos para cada una de las restantes estaciones en orden num.érico inverso (ver Tabla 9).
Tabla 9. Porcentaje Acumulativo (% Acum) de Masa Menor que el Diámetro Aerodinámico Declarado
Aparato 1 Aparato 2 Aparato 3ª Aparato 4b Aparato 5 Aparato 6
Acum Acum Acum Acum Acum Acum
Masa O/OC Dsod ºlo' D,n,,d ºlo' D,;;nne ºlo' Dcnnd 0/oC Drn ,,d ºlo' D,n,,d
Filtro 0,4 0,625 0,4 1,7 0,34 0,34
Estación 7 b 0,7 - - b 0,7 - - b 0,55 b 0,55
Estación 6 c 1,1 - - c 1,1 - - c 0,94 c 0,94
Estación 5 d 2,1 b 1,25 d 2, 1 - - d 1,66 d 1,66
Estación 4 e 3,3 c 2,5 e 3,3 b 3, 1 e 2,82 e 2,82
Estación 3 f 4,7 d 5,0 f 4,7 c 6,8 f 4,46 t 4,46
ª Las Estaciones 6 y 7 se omiten del Aparato 3 a niveles de flujo >60 L por minuto; así, los valores para by c deben omitirse para el Aparato 3, cuando sea
necesario.
b La estación de filtro en el Aparato 4 es la Estación 5 (ver Figura 8).
' [(masa en la estación/ Z:B)xl 00] % +(%total de ¿g de las estaciones inferiores).
d El 50% del diámetro límite de la estación inmediatamente superior a la indicada (por ejemplo, para la Estación 4, ingresar el diámetro límite para la Estación 3;
para los Aparatos 2 ó 4,. calcular como Dso,Q a partir de la Ecuación 1; para los Aparatos 5 ó 6, calcular como Dso,Q a partir de la Ecuación 2 emple.ando la Tabla
7). Los valores rntroducrdos en la Tabla son correctos para los Aparatos 7; 2; 4; 5 y 6 solamente cuando se usan a 28,3 L por minuto, 60,0 L por minuto, 60,0 L
por minuto, 60,0 L por minuto y 60,0 L por minuto, respectivamente.
' Los valores 0 50 sólo son válidos a la velocidad de flujo de 28, 3 L por minuto.
USP 37 Pruebas Físicas/ (601) Aerosoles 369

Tabla 9. Porcentaje Acumulativo (% Acum) de Masa Menor que el Diámetro Aerodinámico Declarado (Continuación)
Aparato 1 Aparato 2 Aparato 3ª Aparato 4b Aparato 5 Aparato 6
Acum Acum Acum Acum Acum Acum
Masa ºlo' D,od ºlo' Drn nd ºlo' D;nrie ºlo' D,nnd ºlo' D,o nd O/OC D<nnd
Estación 2 g 5,8 100 10,0 g 5,8 100 13,0 g 8,06 g 8,06
Estación 1 h 9,0 - - h 9,0 - - - -- - -

Estación O 100 - - - 100 - - - 100 - 100 -

ª Las Estaciones 6 y 7 se omiten del Aparato 3 a niveles de flujo >60 L por minuto; así, los valores para by c deben omitirse para el Aparato 3, cuando sea
necesario.
b La estación de filtro en el Aparato 4 es la Estación 5 (ver Figura 8).
e [(masa en la estación/ LB)xl 00] % +(%total de rn de las estaciones inferiores).
d El 50% del diámetro límite de la estación inmediatamente superior a la indicada (por ejemplo, para la Estación 4, ingresar el diámetro límite para la Estación 3;
para los Aparatos 2 ó 4, calcular como D 50 Q a partir de la Ecuación 1; para los Aparatos 5 ó 6, calcular como D50 Q a partir de la Ecuación 2 empleando la Tabla
7). Los valores introducidos en la Tabla sorí correctos para los Aparatos l; 2; 4; 5 y 6 solamente cuando se usan a'28,3 L por minuto, 60,0 L por minuto, 60,0 L
por minuto, 60,0 L por minuto y 60,0 L por minuto, respectivamente.
e Los valores D, 0 sólo son válidos a la velocidad de flujo de 28,3 L por minuto.

Si fuera necesario y cuando fuera apropiado, graficar el porcentaje de masa menor que el diámetro aerodinámico estableci-
do, en función del diámetro aerodinámico, 0 50, 0 , en papel para probabilidades logarítmicas. Calcular la desviación estándar
geométrica (GSD, por sus siglas en inglés) por la ecuación:

Tamaño X
GSD=
Tamaño Y

Utilizar estos datos o el gráfico para determinar los valores de MMAD y GSD, según corresponda y cuando fuera necesario (ver
Figura 7O).

84,13
----------------,:.7!
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~r·oo ./
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E 15,87 - - - .1 1
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y MMAD X
TAMAÑO DE PARTÍCULA

Fig. 1O. Gráfico del porcentaje acumulativo de masa menor que el diámetro aerodinámico declarado (escala de probabili-
dad) en función del diámetro aerodinámico (escala logarítmica).
 3 70 ( 61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos / Pruebas Físicas USP 37

(61 O) MÉTODOS DE MUESTREO MICROBIOLÓGICO ALTERNATIVOS

PARA PRODUCTOS NASALES E INHALADORES NO ESTÉRILES

INTRODUCCIÓN

El muestreo apropiado de productos no estériles susceptibles a la contaminación microbiana puede ser complicado, debido
a que estos productos a menudo se llenan en envases primarios especiales, diseñados para proteger al producto de la contami-
nación inadvertida durante su almacenamiento y uso. Estos diseños especiales pueden hacer más difícil la toma de muestras
asépticas de tamaño o volumen suficientes para el análisis microbiológico. A menos que se utilicen metodologías especiales,
puede resultar difícil realizar el muestreo de productos tales como formas farmacéuticas en polvo, líquidos nasales o para inha-
lación, '>in exponerlos potencialmente -1 cont<Jminación microbiana extraña. El presente capítulo de pruebas generales propor-
ciona tales metodologías especiales para el muestreo de formas farmacéuticas para inhalación o nasales de alto y bajo conteni-
do. Las metodologías de muestreo alternativas pueden ofrecer mejores maneras para muestrear envases de forma aséptica. To-
da metodología alternativa debe utilizar técnicas asépticas y se debe llevar a cabo en condiciones ambientales y de otro tipo,
apropiadas para el muestreo aséptico.

FORMAS FARMACÉUTICAS PARA INHALACIÓN Y NASALES

Los productos farmacéuticos nasales e inhaladores de bajo contenido (en lo sucesivo, PFNI de bajo contenido) son produc-
tos que presentan un llenado esperado de menos de 100 mg de polvo o 1 mL de formulación líquida por unidad (envase pri-
mario). Ejemplos de estos productos incluyen polvos para inhalación previamente medidos, más comúnmente conocidos co-
mo inhaladores de polvo seco, y atomizadores nasales monodosis.
Los PFNI de alto contenido son productos farmacéuticos multidosis que presentan un llenado esperado de más de 100 mg
de polvo o más de 1 mL de formulación liquida por unidad. Ejemplos de estos productos incluyen aerosoles para administra-
ción por inhalación y vía nasal, conocidos como inhaladores de dosis fija; polvos para inhalación con dosis medidas para dispo-
sitivos; y aerosoles nasales multidosis.
La cantidad o volumen apropiado de muestra debe basarse en la metodología de prueba, incluido cualquier capítulo de
pruebas generales pertinente, como los capítulos (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Mi-
crobiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos. El análisis se puede llevar
a cabo en el polvo seco a granel sin envasar, en la formulación líquida o en el producto terminado. Si el análisis se realiza sólo
en el material a granel, entonces se debe validar la capacidad del proceso para prevenir la contaminación microbiana desde el
lote a granel hasta el producto terminado. El análisis se debe llevar a cabo en el producto terminado cuando el proceso no esté
validado.

DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA

Para cada prueba microbiológica, muestrear 1 O envases o unidades del producto farmacéutico o un número de unidades
que sea representativo de la partida y que pueda proporcionar como mínimo 1 gramo de producto. Para tamaños de partida
menores de 200 unidades (p.ej., partidas usadas en ensayos clínicos), el tamaño de la muestra se puede reducir al 1% de las
unidades o a 1 unidad, lo que resulte mayor. Se puede combinar el contenido tJe envases individuales para el análisis.

ANÁLISIS DEL GRANEL PARA PFNI DE BAJO CONTENIDO

Es preferible el análisis de lote a granel para PFNI de bajo contenido en lugar del análisis del producto terminado, debido a
que permite tomar muestras de mayores tamaños que son representativas de la partida, sin incrementar indebidamente el ries-
go de contaminación microbiana inadvertida. El análisis del granel se puede llevar a cabo en polvos o en preparaciones líqui-
das justo antes del llenado. Cuando se realiza el análisis del granel en lugar del análisis del producto terminado, se debe validar
la capacidad de los procesos de fabricación posteriores al muestreo (p.ej., llenado y envasado) para prevenir contaminación
microbiana de conformidad con las buenas prácticas de fabricación vigentes (CGMP). Para pruebas de recuento microbiano,
se pueden muestrear al menos 1 O g o 1 O mL de material a granel o, para las pruebas de microorganismos específicos, se puede
muestrear 1 g o 1 mL de material de prueba. Para tamaños pequeños de partida (es decir, menos de 1000 g o 1000 mL), el
tamaño de muestra recomendado es 1 % de la partida para las pruebas de recuento microbiano y de microorganismos específi-
cos.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos 371

MÉTODOS DE MUESTREO PARA PFNI DE AL TO CONTENIDO

Inhaladores de Polvo Seco

Los inhaladores de polvo seco tienen un reservorio interno que contiene una cantidad suficiente de formulación para dosis
múltiples que son dosificadas por el dispositivo durante la activación por parte del paciente. En estos casos, se deben emplear
procedimientos validados apropiados para muestrear un envase de producto farmacéutico no estéril.

Aerosoles para Inhalación

Tomar en cuenta las cuestiones de seguridad relacionadas con la inhalación del producto farmacéutico y el posible peligro
de inflamación. Evitar la contaminación de las muestras usando técnicas asépticas siempre que sea necesario.

MÉTODO DE ACCIONAMIENTO AUTOMÁTICO

El contenido de los envases de los aerosoles para inhalación se puede recolectar accionando automáticamente cada envase
de aerosol y recolectando la formulación liberada en un filtro estéril adecuado.

MÉTODO A TEMPERATURA AMBIENTE

Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los envases se sequen en
un ambiente controlado. Vaciar el contenido del envase de aerosol en un vaso estéril usando un dispositivo con aguja u otro
dispositivo similar (p.ej., el conducto de ingreso de agua de una máquina para hacer hielo). Si se ha demostrado que el prope-
lente no inhibe el crecimiento de microorganismos, se puede agregar el contenido del vaso estéril directamente a los medios
líquidos o a las soluciones amortiguadoras para la prueba. De otro modo, esperar a que el propelente se evapore del vaso,
dejando el vaso a temperatura ambiente durante varios minutos. Eliminar el propelente gaseoso residual inclinando ligeramen-
te el vaso o permitiendo el paso de una corriente lenta de gas estéril microbiológicamente inerte sobre la superficie del mismo.
En el caso de algunos propelentes menos volátiles, por ejemplo, combinaciones de clorofluorocarbono (CFC) 11 /12, se puede
calentar el vaso suavemente (a temperatura<:: 45º) para ayudar a la evaporación. Una vez evaporado el propelente, agregar los
medios líquidos o las soluciones amortiguadoras y mezclar el contenido para preparar para el análisis.
La expulsión directa en los caldos de cultivo o las soluciones amortiguadoras puede ser factible siempre que se cuente con
un dispositivo con aguja que sea lo suficientemente fino y fuerte como para perforar el envase y permitir que el contenido
salga lentamente. En este caso, el contenido puede ser expulsado y mezclado en el medio acuoso. Existe la posibilidad de que
se formen capas de propelente y de medio acuoso, lo cual puede requerir un mayor periodo de espera y calentamiento suave
(que no exceda de 45º) para evaporar el propelente.

MÉTODO CON ENFRIAMIENTO

Colocar los envases de aerosol desinfectados en hielo seco o en una suspensión espesa de hielo seco (garantizar la calidad
microbiana del hielo seco y del líquido para formar la suspensión espesa), o en un criocongelador durante el periodo necesario
para licuar el contenido. Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los
envases se sequen en un ambiente aséptico. Abrir asépticamente los envases de aerosol usando una herramienta apropiada. Se
debe tener en cuenta que la congelación puede afectar la viabilidad de los microorganismos. Para productos basados en CFC,
verter el contenido de los envases en vasos estériles. Dejar que escape el propelente y combinar el residuo con un diluyente
adecuado para el producto farmacéutico. También se pueden emplear otros procedimientos específicos para el fármaco. Para
productos basados en hidrofluoroalcanos, verter el contenido de los envases en vasos estériles parcialmente sumergidos en va-
sos más grandes que contengan hielo seco. Expulsar el propelente, por ejemplo, evaporando el material hasta sequedad con
una corriente lenta de aire comprimido estéril, filtrado y libre de aceite. Combinar el residuo con un diluyente apropiado para
el producto farmacéutico. Un método alternativo para analizar todo el contenido de un envase previamente enfriado consiste
en verter el contenido del envase abierto en una unidad de filtración por membrana estéril, dejar que escape el propelente y
luego enjuagar con una cantidad adecuada de diluyente estéril.

Atomizadores Nasales Multidosis

Los envases de atomizadores nasales multidosis a menudo tienen una tapa de rosca, precintada, o de anclaje hermético. El
envase se puede abrir desenroscando la tapa, cortando el sello o usando una herramienta para retirar el precinto, con cuidado
de evitar la contaminación microbiana durante el proceso. Después de retirar la tapa, por lo general resulta apropiado el uso
de los métodos de muestreo tradicionales, como los descritos en los capítulos de pruebas generales (61) Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Mi-
croorganismos Específicos.
 1

3 72 <611) Determinación de Alcohol / Pruebas Físicas USP 37

(611) DETERMINACIÓN DE ALCOHOL

MÉTODO 1-MÉTODO DE DESTILACIÓN

El método 1 se utiliza para la determinación de alcohol a menos que se especifique algo diferente en la monografía indivi-
dual. Es adecuado para examinar la mayoría de los extractos líquidos y las tinturas, siempre que la capacidad del matraz de
destilación sea suficiente (normalmente de dos a cuatro veces el volumen del líquido a calentar) y la velocidad de destilación
sea la necesaria para producir destilados transparentes. Los destilados turbios pueden clarificarse mediante agitación con talco
o con carbonato de calcio y filtración, después de lo cual la temperatura del filtrado se ajusta y el contenido de alcohol se
determina a partir del peso específico. Durante todas las manipulaciones, tomar precauciones para minimizar la pérdida de
alcohol por evaporación.
Tratar los líquidos que forman una cantidad inconveniente de espuma durante la destilación acidificándolos fuertemente con
ácidos fosfórico, sulfúrico o tánico, o tratarlos con un leve exceso de solución de cloruro de calcio o con una pequeña cantidad
de parafina o aceite de silicona antes de comenzar la destilación.
Evitar las proyecciones durante la destilación agregando trozos de material poroso insoluble, como carburo de silicio, o per-
las.
Para Líquidos que se Supone que Contienen 30% de Alcohol o Menos-Con una pipeta, transferir a un aparato de des-
tilación adecuado no menos de 25 mL del líquido en el que se debe determinar el contenido de alcohol y observar la tempera-
tura a la que se midió el volumen. Agregar un volumen igual de agua, destilar y recoger un volumen de destilado que sea
aproximadamente 2 mL menor que el volumen tomado de líquido de prueba original, ajustar a la temperatura a la cual se
midió el líquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el volumen original del líquido de prue-
ba y mezclar. El destilado es transparente o no más que levemente turbio y no contiene más que trazas de sustancias volátiles,
además de alcohol y agua. Determinar el peso específico del líquido a 25º, según se indica en Peso Específico (841 ), y usar este
resultado para establecer el porcentaje, en volumen, de C2 H5 0H contenido en el líquido examinado por referencia a la Tabla
Alcoholimétrica en la sección Tablas de Referencia.
Para Líquidos que se Supone que Contienen Más de 30% de Alcohol-Proceder según se indica en el párrafo anterior,
excepto que se debe hacer lo siguiente: diluir la muestra con aproximadamente el doble de su volumen en agua, recoger un
volumen de destilado que sea aproximadamente 2 mL menor que el doble del volumen del líquido de prueba original, ajustar
a la temperatura a la cual se midió el líquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el doble del
volumen original del líquido de prueba, mezclar y determinar el peso específico. La proporción de C2 H5 0H, en volumen, en
este destilado, según se determina a partir de su peso específico, equivale a la mitad del C2 H5 0H contenido en el líquido exa-
minado.
Tratamiento Especial-
ÁCIDOS Y BASES VOLÁTILES-Acidificar levemente las preparaciones que contengan bases volátiles con ácido sulfúrico diluido
antes de destilar. Si hay ácidos volátiles presentes, alcalinizar levemente la preparación con hidróxido de sodio SR.
GLICERINA-A los líquidos que contengan glicerina, agregar suficiente agua para que el residuo, después de la destilación,
contenga no menos de 50% de agua.
YODO-Antes de la destilación, tratar todas las soluciones que contengan yodo libre con cinc en polvo o decolorar con una
cantidad apenas suficiente de solución de tiosulfato de sodio (1 en 1 O), seguida de algunas gotas de hidróxido de sodio SR.
OTRAS SUSTANCIAS VOLÁTILES-Los alcoholados, elíxires, tinturas y preparaciones similares que contienen proporciones aprecia-
bles de sustancias volátiles, además de alcohol y agua, tales como aceites volá~iles, cloroformo, éter, alcanfor, etc., requieren
tratamiento especial, como se describe a continuación:
Para Líquidos que se Supone que Contienen 50% de Alcohol o Menos-Mezclar en un separador 25 mL de la muestra en análi-
sis, medidos con exactitud, con aproximadamente el mismo volumen de agua. Saturar esta mezcla con cloruro de sodio, luego
agregar 25 mL de éter de petróleo y agitar la mezcla para extraer los ingredientes volátiles que interfieran. Transferir la capa
separada inferior a un segundo separador y repetir la extracción dos veces con dos porciones más de 25 mL de éter de petró-
leo. Extraer las soluciones combinadas de éter de petróleo con tres porciones de 1 O mL de una solución saturada de cloruro de
sodio. Combinar las soluciones salinas y destilar de la manera habitual, recogiendo un volumen de destilado que presente un
cociente simple en relación al volumen de la muestra original.
Para Líquidos que se Supone que Contienen Más de 50% de Alcohol-Ajustar la muestra en análisis a una concentración de
aproximadamente 25% de alcohol diluyendo con agua y luego proceder según se indica en Para Líquidos que se Supone que
Contienen 50% de Alcohol o Menos, comenzando donde dice "Saturar esta mezcla con cloruro de sodio".
En la preparación de Colodión o Colodión Flexible para destilación, usar agua en lugar de la solución saturada de cloruro de
sodio que se indica anteriormente.
Si hay aceites volátiles presentes sólo en pequeñas proporciones y se obtiene un destilado turbio, y no se ha empleado el
tratamiento con éter de petróleo, se puede clarificar el destilado y adecuarlo para la determinación de peso específico agitán-
dolo con aproximadamente un quinto de su volumen de éter de petróleo o filtrándolo a través de una capa fina de talco.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (611) Determinación de Alcohol 373

MÉTODO U-MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE GASES

Usar el Método /la cuando el Método 11 se especifica en la monografía individual. Para obtener un análisis de ios principios en
los que se basa, ver Cromatografía de Gases en Cromatografía (621 ).
Estándares de referencia USP-ER Determinación de Alcohol-Acetonitrilo USP. ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP.

Método lla

Aparato-En condiciones típicas, usar un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización a la llama y una
columna cromatográfica de vidrio de 4 mm x 1,8 m rellena con soporte 53 de malla 100 a 120, usando nitrógeno o helio
como gas transportador. Antes de usar, acondicionar la columna durante la noche a 235º con un flujo lento de gas transporta-
dor. Mantener la temperatura de la columna a 120º y la temperatura del inyector y el detector a 21 Oº. Ajustar el flujo del gas
transportador y la temperatura de modo que el acetonitrilo, el estándar interno, eluya entre 5 y 1O minutos.
Soluciones-
Preparación Madre de Prueba-Diluir la muestra en análisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solución que
contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparación de Prueba-Pipetear 5 ml de la Preparación Madre de Prueba y de ER Determinación de Alcohol-Acetonitrilo
USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solución de
estándar interno], transferir a un matraz volumétrico de 50 ml, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparación Estándar-Pipetear 5 ml de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinación de Alcohol-
Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solución de estándar interno], transferir a un matraz volumétrico de 50 ml, diluir a volumen con agua y mezclar.
Procedimiento-Inyectar por duplicado en el cromatógrafo de gases aproximadamente 5 µL de la Preparación de Prueba y
de la Preparación estándar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes entre las respuestas de los picos. Calcular el
porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en análisis, por la fórmula:

CD(Ru/R 5)

en donde Ces la concentración declarada de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP; D es el factor de dilución (cociente
entre el volumen de la Preparación Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y Ru y R5 son los cocientes de respuesta
entre los picos obtenidos a partir de la Preparación de Prueba y de la Preparación Estándar, respectivamente.
Prueba de Aptitud del Sistema-En un cromatograma adecuado, el factor de resolución, R, no es menor de 2; el factor de
asimetría del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la Preparación Estándar presentan una desvia-
ción estándar relativa de no más de 2,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del estándar interno.

Método llb

Aparato-Equipar un cromatógrafo de gases con un inyector partido con una relación de partición de 5 : 1, un detector de
ionización a la llama y una columna capilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una película de 3,0 µm de fase G43. Usar helio
como gas transportador a una velocidad de flujo de 34,0 cm por segundo. Programar el cromatógrafo para mantener la tem-
peratura de la columna a 50º durante 5 minutos, luego aumentar la temperatura a una velocidad de 1Oº por minuto hasta
200º, y mantener a esa temperatura durante 4 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 21 Oº y la del detector a 280º.
Soluciones-
Preparación Madre de Prueba-Diluir la muestra en análisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solución que
contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparación de Prueba-Pipetear 5 ml de la Preparación Madre de Prueba y de ER Determinación de Alcohol-Acetonitrilo
USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solución de
estándar interno], y transferir a un matraz volumétrico de 25 ml, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparación Estándar-Pipetear 5 ml de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinación de Alcohol-
Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solución de estándar interno], y transferir a un matraz volumétrico de 25 ml, diluir a volumen con agua y mezclar.
Procedimiento-Inyectar por duplicado en el cromatógrafo de gases aproximadamente de 0,2 a 0,5 µL de la Preparación
de Prueba y de la Preparación Estándar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes de respuesta de los picos. Calcu-
lar el porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en análisis, por la fórmula:

CD(Ru/R 5)

en donde Ces la concentración declarada de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP; Des el factor de dilución (cociente
entre el volumen de la Preparación Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y Ru y R5 son los cocientes de respuesta
entre los picos obtenidos a partir de la Preparación de Prueba y de la Preparación Estándar, respectivamente.
Prueba de Aptitud del Sistema-En un cromatograma adecuado, el factor de resolución, R, entre alcohol y el estándar
interno no es menor de 4; el factor de asimetría del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la
 374 (611 >Determinación de Alcohol/ Pruebas Físicas USP 37

Preparación Estándar presentan una desviación estándar de no más de 4,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del
estándar interno.

(616) DENSIDAD APARENTE Y DENSIDAD POR ASENTAMIENTO DE

LOS POLVOS

DENSIDAD APARENTE

Este capítulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japo-
nesa. •La porción que no está armonizada se marca con los símbolos (• .) para especificar este hecho .•
La densidad aparente de un polvo es la relación de la masa de una muestra de polvo sin asentar y su volumen, incluida la
contribución del volumen del espacio vacío entre las partículas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la
densidad de las partículas de polvo como de la distribución espacial de las partículas en el lecho de polvo. La densidad aparen-
te se expresa en gramos por mL (g/mL) aunque la unidad internacional es el kilogramo por metro cúbico (1 g/mL =
1000 kg/m 3) porque las mediciones se hacen usando probetas. También se puede expresar en gramos por centímetro cúbico
(g/cm 3). Las propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo dependen de la preparación, el tratamiento y el
almacenamiento de la muestra, es decir la forma en que se manipuló. Las partículas se pueden compactar para que tengan un
intervalo variable de densidades aparentes; sin embargo, la más ligera perturbación del lecho de polvo puede producir un
cambio en la densidad aparente. Por lo tanto, a menudo es muy difícil medir la densidad aparente de un polvo con buena
reproducibilidad y, al informar los resultados, es fundamental especificar cómo se hizo la determinación. La densidad aparente
de un polvo se determina midiendo el volumen de una muestra de polvo de peso conocido, que puede haber sido pasada a
través de un tamiz, en una probeta graduada (Método f) o midiendo la masa de un volumen conocido de polvo que haya sido
pasado a través de un volúmetro a un vaso (Método /f) o un recipiente de medidas (Método l/f).
Se prefieren el Método I y el Método 111.

Método !-Medición en una Probeta Graduada

Procedimiento-Pasar una cantidad de material suficiente para completar la prueba a través de un tamiz con aperturas
mayores o iguales a 1,0 mm, de ser necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el alma-
cenamiento; esto se debe hacer cuidadosamente para evitar cambios en la naturaleza del material. Introducir sin compactar
aproximadamente 1 00 g de la muestra de prueba, M, pesada con una exactitud de O, 1 %, en una probeta graduada, seca, de
250 mL (legible hasta 2 ml). Si fuera necesario, nivelar cuidadosamente el polvo, sin compactarlo, y tomar la lectura del volu-
men aparente sin asentar (V0 ) con una aproximación a la unidad más cercana de la escala. Calcular la densidad aparente en
g/ml por la fórmula M/V0 • En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repetidas. Si la densi-
dad del polvo es demasiado baja o demasiado alta, de tal forma que la muestra de prueba tenga un volumen aparente sin
asentamiento de más de 250 ml o menos de 150 ml, no es posible usar una muestra de polvo de 100 g. Por lo tanto, se debe
seleccionar una cantidad diferente de polvo como muestra de prueba, de manera que su volumen aparente sin asentamiento
sea de 150 a 250 ml (volumen aparente mayor o igual a 60% del volumen total de la probeta); el peso de la muestra de prue-
ba se especifica en la expresión de los resultados. Para muestras de prueba qué tengan un volumen aparente entre 50 y
100 ml, se puede usar una probeta de 100 ml, legible hasta 1 ml; el volumen de la probeta se especifica en la expresión de
los resultados.

Método 11-Medición en un Volúmetro

Aparato-El aparato (Figura 7) consta de un embudo superior provisto de un tamiz de 1,0 mm. 1 El embudo está montado
sobre una caja deflectora que contiene cuatro placas deflectoras de vidrio sobre las que se desliza el polvo y rebota a medida
que pasa. El embudo que se encuentra en el fondo de la caja deflectora recoge el polvo y lo vierte en un vaso de capacidad
especificada colocado directamente debajo del embudo. El vaso puede ser cilíndrico (con una capacidad de 25,00 ± 0,05 ml y
con un diámetro interno de 30,00 ± 2,00 mm) o cúbico (con una capacidad de 16,39 ± 0,2 ml cuyas dimensiones internas
son de 25,400 ± 0,076 mm).

1 El aparato (Volúmetro de Scott) se ajusta a las dimensiones que aparecen en ASTM 329 90.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (616) Densidad Aparente y por Asentamiento 375

Tamiz de 1.0 mm

Caja deflectora

Soporte

/
Vaso colector
de muestra

Figura 1.

Procedimiento-Dejar que un exceso de polvo fluya a través del aparato y recogerlo en el vaso colector de la muestra has-
ta que éste se desborde, usando al menos 25 cm 3 de polvo con el vaso cúbico y 35 cm 3 de polvo con el vaso cilíndrico. Quitar
cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del vaso pasando suavemente el filo de la hoja de una espátula ubica-
da en dirección perpendicular a la superficie y apoyada en el borde superior del vaso, tomando las precauciones necesarias
para que la espátula esté siempre perpendicular y así evitar la compactación o la remoción del polvo del vaso. Limpiar el mate-
rial que hubiera podido quedar adherido a las paredes laterales del vaso y determinar el peso del polvo, M, con una aproxima-
ción de O, 1 %. Calcular la densidad aparente, en g/mL, por la fórmula:

en donde V0 es el volumen del vaso, en ml. Registrar el promedio de tres determinaciones usando tres muestras de polvo dife-
rentes.

Método 111-Medición en un Recipiente

Aparato-El aparato consta de un recipiente cilíndrico de acero inoxidable de 100 mL, con las dimensiones que se especifi-
can en la Figura 2.

r
50,0

1
Figura 2.

Procedimiento-Pasar una cantidad de polvo suficiente para completar la prueba a través de un tamiz de 1,0 mm, si fuera
necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento y permitir que la muestra
obtenida fluya libremente hacia el recipiente de medición hasta que se desborde. Quitar cuidadosamente el exceso de polvo
de la parte superior del recipiente como se describió para el Método 11. Determinar el peso (M0 ) del polvo con una aproxima-
ción de O, 1 %, restando la masa, previamente determinada, del recipiente de medición vacío. Calcular la densidad aparente
(g/mL) por la fórmula M0 /l 00 y registrar el promedio de tres determinaciones, usando tres muestras de polvo diferentes.

DENSIDAD POR ASENTAMIENTO

La densidad por asentamiento es una densidad aparente aumentada, obtenida después de golpetear mecánicamente un re-
cipiente que contiene la muestra de polvo. La densidad por asentamiento se obtiene golpeteando mecánicamente una probe-
ta o un recipiente de medición graduado que contenga una muestra de polvo. Después de determinar el volumen o peso ini-
cial del polvo, se golpetea mecánicamente la probeta o recipiente de medición y se toman las lecturas de volumen o peso
hasta que sean prácticamente constantes. El asentamiento mecánico se obtiene levantando la probeta o recipiente y dejándolo
 1

376 (616) Densidad Aparente y por Asentamiento/ Pruebas Físicas USP 37

caer por su propio peso desde una altura especificada, por alguno de los tres métodos que se describen a continuación. Puede
ser preferible emplear dispositivos que rotan la probeta o recipiente durante el golpeteo a fin de reducir al mínimo la posibili-
dad de que la masa se separe durante el asentamiento.

Método 1

Aparato-El aparato (Figura 3) consta de lo siguiente:

• Una probeta graduada de 250 ml (legible hasta 2 ml, con una masa de 220 ± 44 g)
• Un aparato de asentamiento capaz de producir, en 1 minuto, nominalmente, 250 ± 15 golpes desde una altura de
3 ± 0,2 mm o, nominalmente, 300 ± 15 golpes desde una altura de 14 ± 2 mm. El soporte de la probeta graduada, con su
dispositivo de fijación, tiene una masa de 450 ± 1O g.

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Esta dimensión es tal que la
caída CD
cumple con las
..-'-t"-il---------'-especificaciones y que, en el punto
Í
más bajo de la leva, el soporte de
la probeta se apoya libremente
sobre la parte superior del yunque.

Figura 3.

Procedimiento-Proceder según se describió anteriormente para la determinación del volumen aparente (V0 ). Fijar la pro-
beta en el soporte. Realizar 1O, 500 y 1250 golpes en la misma muestra de polvo y leer los volúmenes correspondientes V10,
V500 y V1250 con una aproximación a la unidad más cercana de la escala. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a
2 ml, V1250 es el volumen por asentamiento. Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 2 ml, repetir en incrementos, por ej.,
de 1250 golpes, hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 2 ml. Para algunos polvos, puede
ser apropiado un número menor de golpes, si se ha validado. Calcular la densidad por asentamiento (g/ml), usando la fórmu-
la m/VF en donde VF es el volumen final por asentamiento. En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando
mediciones repetidas. Especificar la altura de caída con los resultados. Si no es posible utilizar una muestra de prueba de 100 g,
usar una cantidad reducida y una probeta graduada apropiada de 100 ml (legible hasta 1 ml) que pese 130±16 g y esté
montada en un soporte que pese 240 ± 12 g. Las condiciones de la prueba modificada se especifican en la expresión de los
resultados.

Método 11

Aparato y Procedimiento-Proceder según se indicó en Método/, excepto que el analizador mecánico proporciona una
caída fija de 3 ± 0,2 mm a una velocidad nominal de 250 golpes por minuto.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 377

Método 111

Aparato y Procedimiento-Proceder según se indicó en el Método ///-Medición en un Recipiente para medir la densidad
aparente en un recipiente de medición equipado con la tapa que se muestra en la Figura 2. El recipiente de medición con la
tapa se levanta 50-60 veces por minuto mediante un aparato medidor de densidad por asentamiento adecuado. Efectuar
200 golpes, retirar la tapa y quitar cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del recipiente de medición según se
describe en el Método ///-Medición en un Recipiente para medir la densidad aparente. Repetir el procedimiento con 400 golpes.
Si la diferencia entre las dos masas obtenidas después de 200 y 400 golpes excede el 2%, realizar una prueba efectuando
200 golpes adicionales hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menos de 2%. Calcular la densidad por asen-
tamiento (g/mL) usando la fórmula M/100, donde MF es la masa del polvo en el recipiente de medición. Registrar el promedio
de tres determinaciones usando tres muestras de polvo diferentes. Especificar las condiciones de la prueba en los resultados,
incluyendo la altura de la caída.

MEDIDAS DE LA COMPRESIBILIDAD DE UN POLVO

Dado que las interacciones entre las partículas que afectan las propiedades que determinan la densidad aparente de un pol-
vo también afectan el flujo del polvo, una comparación entre la densidad aparente y la densidad por asentamiento puede pro-
porcionar una medida de la importancia relativa de estas interacciones en un polvo determinado. A menudo, este tipo de
comparación se usa como un índice de la capacidad de flujo del polvo, por ejemplo, el Índice de Compresibilidad o el Índice de
Hausner, según se describe a continuación.
El Índice de Compresibilidad y el Índice de Hausner son medidas que expresan la propensión de un polvo a la compresión,
según se describió antes. Como tales, son medidas de la capacidad de asentamiento de un polvo y permiten evaluar la impor-
tancia relativa de las interacciones entre partículas. En un polvo que fluye libremente, dichas interacciones son menos relevan-
tes, y la densidad aparente y la densidad por asentamiento tendrán valores más cercanos. En el caso de materiales de menor
fluidez, generalmente existen interacciones mayores entre las partículas y se observa una diferencia mayor entre la densidad
aparente y la densidad por asentamiento. El Índice de Compresibilidad y el Índice de Hausner reflejan estas diferencias.
Índice de Compresibilidad-Calcular por la fórmula:
1 OO(Va - VF)!Va
Va= volumen aparente sin asentar
VF =volumen final asentado
Índice de Hausner-

Va!VF
Dependiendo del material, el índice de compresibilidad se puede determinar usando V1a en vez de Va. [NOTA-Si se usa V1a,
debe especificarse claramente en los resultados.]

(621) CROMATOGRAFÍA

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de separación cromatográfica son métodos de separación de múltiples etapas en los que los componentes de
una muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. La fase estacionaria puede ser un
sólido, un líquido absorbido sobre un sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar empacada en una columna, extendida
como una capa, distribuida como película o aplicada mediante otras técnicas. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida o un
fluido supercrítico. La separación puede basarse en adsorción, distribución de masa (partición) o intercambio iónico; o puede
basarse en diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de las moléculas, tales como tamaño, masa o volumen. Este capítu-
lo contiene procedimientos generales, definiciones y cálculos de parámetros comunes y describe requisitos generales para apti-
tud del sistema. Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos
cromatográficos de la USP son: cromatografía en columna, de gases, en papel, en capa delgada (incluyendo la cromatografía
en capa delgada de alta resolución) y de líquidos presurizados (comúnmente llamada cromatografía líquida de alta presión o
alta resolución).

PROCEDIMIENTOS GENERALES

Esta sección describe los procedimientos básicos usados cuando se describe un método cromatográfico en una monografía.
Se deben seguir los siguientes procedimientos a menos que se indique algo distinto en la monografía individual.
 1

378 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas USP 37

Cromatografía en Papel
Fase Estacionaria: La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser as-
cendente, en cuyo caso el disolvente se desplaza hacia arriba por el papel mediante fuerzas de capilaridad, o descendente, en
cuyo caso el flujo del disolvente se ve ayudado por la fuerza de gravedad. La orientación de las fibras del papel con respecto al
flujo del disolvente se debe mantener constante en una serie de cromatogramas. (Por lo general, el fabricante indica la direc-
ción de máquina).
Aparato: El equipo esencial para cromatografía en papel comprende una cámara hermética al vapor provista de entradas
para agregar el disolvente y una gradilla de material resistente a la corrosión aproximadamente 5 cm más corta que la altura
interior de la cámara. La gradilla sirve como soporte para la cubeta de disolvente y para las varillas antisifón que, a su vez,
sostienen las hojas cromatográficas. El fondo de la cámara está cubierto con la mezcla de disolventes o fase móvil indicada. La
saturación de la cámara con el vapor del disolvente se facilita revistiendo las paredes del interior con un papel humedecido con
la fase móvil indicada.
Siembra: La sustancia o sustancias a ser analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se aplican volúmenes conve-
nientes, medidos con micropipetas adecuadas, de la solución resultante que contengan normalmente de 1-20 ~tg del com-
puesto, en zonas de 6 a 1 O mm de diámetro y con una separación de no menos de 3 cm.
Procedimiento para Cromatografía Descendiente en Papel
(1) Suspender la hoja cromatográfica sembrada en el aparato, usando la varilla antisifón para sostener el extremo superior de
la hoja en la cubeta de disolvente. [NOTA-Asegurar que la porción de la hoja que cuelga por debajo de las varillas esté
suspendida libremente en la cámara sin tocar la gradilla o las paredes de la cámara o el líquido que está en el interior de la
cámara.]
(2) La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exce-
so de presión, si fuera necesario.
(3) Después de equilibrar la cámara, la fase móvil previamente preparada se introduce en la cubeta a través de la entrada.
(4) Cerrar la entrada y dejar que la fase móvil se desplace hacia abajo la distancia deseada sobre el papel.
(5) Retirar la hoja de la cámara.
(6) Marcar rápidamente la ubicación de la fase móvil y secar la hoja.
(7) Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del fármaco
o de los fármacos aislados.
Procedimiento para Cromatografía Ascendente en Papel
(1) Agregar la fase móvil al fondo de la cámara.
(2) La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exce-
so de presión, si fuera necesario.
(3) Sumergir el borde inferior de la fase estacionaria en la fase móvil para permitir que la fase móvil ascienda en la hoja cro-
matográfica por capilaridad.
(4) Cuando la fase móvil haya alcanzado la altura deseada, abrir la cámara, retirar la hoja, marcar rápidamente la ubicación
del frente de la fase móvil, y secar la hoja.
(5) Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del fármaco
o de los fármacos aislados.

Cromatografía en Capa Delgada

Fase Estacionaria: La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco y reducido a polvo
fino que se aplica sobre una lámina o placa de vidrio, plástico o metal (generalmente conocida como la placa). La fase estacio-
naria para TLC tiene un tamaño de partícula promedio de 10-15 µm, y la de TLC de alta resolución (HPTLC) tiene un tamaño
de partícula promedio de 5 µm. Se pueden usar placas disponibles comercialmente con una zona preadsorbente si se especifi-
can en una monografía. La muestra aplicada a la región preadsorbente se desarrolla en forma de bandas estrechas y definidas
en la interfase entre el preadsorbente y el sorbente. Las separaciones logradas pueden basarse en la adsorción, la partición o
una combinación de ambos efectos, según el tipo específico de fase estacionaria.
Aparato: Usar una cámara cromatográfica de material inerte y transparente con las siguientes especificaciones: una cube-
ta de fondo plano o cubetas gemelas, una tapa que cierre herméticamente y un tamaño adecuado para las placas. Revestir
como mínimo una pared de la cámara cromatográfica con papel de filtro. Agregar una cantidad suficiente de fase móvil a la
cámara cromatográfica de modo que proporcione, después de impregnar el papel de filtro, un nivel de profundidad apropiado
a la dimensión de la placa utilizada. Cerrar la cámara cromatográfica y dejar que se equilibre. [NOTA-A menos que se indique
algo diferente, las separaciones se realizan en una cámara saturada.]
Detección/Visualización: A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV
de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm), así como una variedad de soluciones reveladoras para visualizar las
manchas.
Siembra: Aplicar las soluciones en forma de zonas sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescri-
to en porciones lo suficientemente pequeñas para obtener manchas circulares de 2-5 mm de diámetro (1-2 mm sobre placas
de HPTLC) o bandas de 10-20 mm x 1-2 mm (5-1 O mm x 0,5-1 mm sobre placas de HPTLC) a una distancia adecuada del
 USP 37 Pruebas Físicas/ (621 > Cromatografía 379

borde inferior y de los bordes laterales de la placa. [NOTA-Durante el desarrollo, la posición de la aplicación debe estar por lo
menos 5 mm (TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase móvil.] Aplicar las soluciones sobre una línea paralela al
borde inferior de la placa con una separación mínima de 1O mm (5 mm en placas de HPTLC) entre ios centros de ias mancha~
o 4 mm (2 mm en placas de HPTLC) entre los bordes de las bandas y dejar que se sequen.
Procedimiento
(1) Colocar la placa en la cámara, asegurando que las manchas o bandas estén por encima de la superficie de la fase móvil.
(2) Cerrar la cámara.
(3) Dejar que la fase móvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido tres cuartos de la longitud
de la placa o la distancia indicada en la monografía.
(4) Retirar la placa, marcar el frente de la fase móvil con un lápiz, y dejar que se seque.
(5) Visualizar los cromatogramas según se indica.
(6) Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico (RF) para las manchas o zonas principales.
(7) Se puede realizar una identificación presuntiva mediante la observación de las manchas o zonas con valores RF idénticos y
de magnitud similar, obtenidas respectivamente cromatografiando una muestra desconocida y un estándar en la misma
placa. Una comparación visual del tamaño o intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimación semi-
cuantitativa. La mediciones cuantitativas se pueden efectuar mediante densitometría (mediciones de absorbancia o fluo-
rescencia).

Cromatografía en Columna

Soporte Sólido: Usar tierra silícea purificada para separación de fase normal. Usar tierra silícea cromatográfica silanizada
para cromatografía de partición en fase reversa.
Fase Estacionaria: Modificar el soporte sólido agregando la fase estacionaria especificada en la monografía individual. Si
se emplea una mezcla de líquidos como fase estacionaria, mezclarlos antes de la introducción del soporte sólido.
Fase móvil: La fase móvil se especifica en la monografía individual. Si la fase estacionaria es una solución acuosa, equili-
brar con agua. Si la fase estacionaria es un líquido orgánico polar, equilibrar con ese líquido.
Aparato: A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, el tubo cromatográfico tiene un diáme-
tro interno de aproximadamente 22 mm y una longitud de 200-300 mm. Acoplado al tubo cromatográfico se encuentra un
tubo de salida sin llave de paso con un diámetro interno de aproximadamente 4 mm y una longitud de 50 mm.
PREPARACIÓN DEL APARATO: Apisonar un trozo de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combinar el volumen especificado
de fase estacionaria y la cantidad especificada de soporte sólido para producir una mezcla homogénea y liviana. Transferir esta
mezcla al tubo cromatográfico y apisonar empleando presión suave, hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad especifi-
cada de soporte sólido es más de 3 g, transferir la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisonar cada
porción. Si la valoración o la prueba requieren una columna multisegmentada, con una fase estacionaria diferente especificada
para cada segmento, apisonar después de la adición de cada segmento y agregar cada segmento directamente sobre el ante-
rior. Colocar un trozo de lana de vidrio fina por encima del relleno de la columna. [NOTA-La fase móvil debe fluir a través de
una columna rellena como una corriente moderada o, si se lleva a cabo una cromatografía en fase reversa, como un goteo
lento.]
Si se incorpora la solución del analito en la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico
raspando el vaso de precipitados usado para la preparación de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g
de Soporte Sólido y varias gotas del disolvente usado para preparar la solución muestra antes de agregar el trozo final de lana
de vidrio por encima del relleno.
Procedimiento
(1) Transferir la fase móvil al espacio de la columna por encima del relleno y dejar que fluya a través de la columna por acción
de la gravedad.
(2) Enjuagar la punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 mL de fase móvil antes de cada cambio en la
composición de la fase móvil y después de completar la elución.
(3) Si se introduce el analito en la columna como una solución en la fase móvil, dejar que pase completamente al relleno de
la columna, luego agregar fase móvil en varias porciones pequeñas, dejando que cada porción drene completamente, an-
tes de agregar el grueso de la fase móvil.
(4) Cuando el procedimiento indique el uso de múltiples columnas cromatográficas montadas en serie y se especifique la adi-
ción de fase móvil en porciones divididas, dejar que cada porción drene por completo a través de cada columna, y enjua-
gar la punta de la columna con fase móvil antes de la adición de cada porción sucesiva.

Cromatografía de Gases (GC)

Fase Estacionaria Líquida: Este tipo de fase está disponible en columnas rellenas o capilares.
Cromatografía de Gases en Columna Rellena: La fase estacionaria líquida se deposita sobre un soporte sólido inerte fi-
namente dividido, como por ejemplo tierra de diatomeas, polímeros porosos, o carbono grafito, con el que se rellena la co-
lumna que por lo regular tiene un diámetro interno de 2-4 mm y una longitud de 1-3 m.
 •
380 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas USP 37

Cromatografía de Gases en Columna Capilar: En las columnas capilares, las cuales no están rellenas con soporte sólido,
la fase estacionaria líquida se deposita sobre la superficie interna de la columna y puede unirse químicamente a ella.
Fase Estacionaria Sólida: Este tipo de fase está disponible únicamente en columnas rellenas. En estas columnas, la fase
sólida es un adsorbente activo, como por ejemplo alúmina, sílice o carbono, con el que se rellena una columna. Las resinas
poliaromáticas porosas, que a veces se emplean en las columnas rellenas, no se recubren con una fase líquida. [NOTA-Las
columnas capilares y rellenas deben acondicionarse antes del uso, hasta que la línea base y otras características sean estables.
Los distribuidores de columnas y materiales de relleno proveen instrucciones relativas al acondicionamiento recomendado.]
Aparato: Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector, una columna, un detector y
un dispositivo registrador. El inyector, la columna y el detector tienen temperaturas controladas y se puede variar como parte
del análisis. Los gases transportadores típicos son helio, nitrógeno o hidrógeno, dependiendo de la columna y el detector en
uso. El tipo de detector que se usa depende de la naturaleza de los compuestos que se analizan y se especifica en la monogra-
fía individual. La señal de salida de los detectores se registra como la respuesta del instrumento en función del tiempo y la
medida del área o altura del pico, es una función de la cantidad presente.
Programa de Temperatura: La longitud y la calidad de una separación por GC se pueden controlar alterando la tempera-
tura de la columna cromatográfica. Cuando sea necesario un programa de temperatura, la monografía individual indica las
condiciones en formato de tabla. La tabla indica la temperatura inicial, la velocidad de cambio de temperatura (rampa), la
temperatura final y el tiempo de espera (hold time) a la temperatura final.
Procedimiento
(1) Equilibrar la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas transportador hasta obtener una señal constante.
(2) Inyectar una muestra a través del septo del inyector, o usar un muestreador automático.
(3) Comenzar el programa de temperatura.
(4) Registrar el cromatograma.
(5) Analizar según se indica en la monografía.

Cromatografía de Líquidos (HPLC)

El término cromatografía de líquidos, según se usa en los compendios, es sinónimo de cromatografía líquida de alta presión y
de cromatografía líquida de alta resolución. La cromatografía de líquidos es una técnica de separación basada en una fase esta-
cionaria sólida y una fase móvil líquida.
Fase Estacionaria: Las separaciones se logran por procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, según el tipo de
fase estacionaria empleada. Las fases estacionarias más comúnmente usadas son la sílice modificada o las microperlas de polí-
mero. Las microperlas se modifican agregando hidrocarburos de cadena larga El tipo de relleno específico necesario para com-
pletar un análisis se indica mediante la designación "L" en la monografía individual (ver también la sección Columnas Cromato-
gráficas más adelante). A menudo, el tamaño de las microperlas también se describe en la monografía. Los cambios en el tipo
y tamaño de relleno se analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo.
Columna Cromatográfica: El término columna incluye columnas de acero inoxidable, de acero inoxidable con recubri-
miento interno y poliméricas, rellenas con una fase estacionaria. La longitud y el diámetro de la columna afectan la separación
y, por lo tanto, las dimensiones típicas de la columna se incluyen en la monografía individual. Los cambios en las dimensiones
de la columna se analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo. Las monografías farmacopeicas no incluyen el
nombre comercial de las columnas apropiadas; esta omisión evita la interpretación de cualquier tipo de respaldo para un pro-
ducto de un proveedor y permite la adaptación a cambios normales en el mercado. Ver la sección Columnas Cromatográficas
para más información.
Fase Móvil: La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, según se define en la monografía individual.
Aparato: Un cromatógrafo de líquidos consta de un recipiente que contiene la fase móvil, una bomba para forzar el paso
de la fase móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna croma-
tográfica, un detector y un dispositivo de recolección de datos.
Elución en Gradiente: Se denomina elución en gradiente o programación del disolvente a la técnica de cambiar conti-
nuamente la composición del disolvente durante la cromatografía. El perfil de elución en gradiente se presenta en la monogra-
fía individual como una tabla de gradientes, que indica el tiempo y la composición proporcional de la fase móvil en el tiempo
indicado.
Procedimiento
(1) Equilibrar la columna y el detector con fase móvil a la velocidad de flujo especificada hasta obtener una señal constante.
(2) Inyectar una muestra a través del inyector o usar un muestreador automático.
(3) Comenzar el programa de gradientes.
(4) Registrar el cromatograma.
(5) Analizar según se indica en la monografía.

COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS

Una lista completa de rellenos (L), fases (G) y soportes (S) usados en las pruebas y valoraciones de USP-NF se encuentra en la
sección Reactivos, Indicadores y Soluciones-Columnas Cromatográficas de USP-NF y PF. Esta lista pretende ser una referencia útil
 USP 37 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 381

para el técnico en cromatografía en la identificación de la columna cromatográfica correspondiente especificada en la mono-

grafía individual.

DEFINICIONES E INTERPRETACIÓN DE CROMATOGRAMAS

Cromatograma: Un cromatograma es una representación gráfica de la respuesta del detector, concentración de analito
en el efluente u otra cantidad usada como una medida de concentración del efluente en función del volumen de efluente o del
tiempo. En la cromatografía planar se puede usar el término, cromatograma para referirse al papel o capa con las zonas separa-
das.
La Figura 1 representa una separación cromatográfica típica de dos sustancias, 1 y 2. tR 1 y tR 2 son los tiempos de retención
respectivos; y hes la altura, h/2 la mitad de la altura y Wh 12 el ancho a la mitad de la altura, para el pico 1. W 1 y W 2 son los
anchos de los picos 1 y 2, respectivamente, en la línea base. Los picos de aire son una característica de los cromatogramas de
gases y corresponden al frente de la fase móvil en la cromatografía de líquido~. El tiempo de retención de estos picos de aire o
componentes no retenidos se denomina tM.

a:
Pico del disolvente
§
UJ
1-
UJ
o
--' Cola del disolvente
UJ
o
~
en
UJ
::>
a_
en
UJ
a:

TIEMPO------

Figura 1. Separación cromatográfica de las dos sustancias.

Volumen de Residencia (D): El volumen de residencia (también conocido como volumen de demora en elución a gra-
diente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna.
Tiempo Muerto (tM): El tiempo muerto es el tiempo requerido para la elución de un componente no retenido (ver la
Figura 1, mostrado como un pico de aire o de componente no retenido, con la escala de la línea base en minutos).
Volumen Muerto (VM): El volumen muerto es el volumen de fase móvil requerido para eluir un componente no retenido.
Se puede calcular a partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo F, en mL/min:

VM = tM X F

En la cromatografía de exclusión por tamaño, se usa el símbolo V0 •

Número de Platos Teóricos (N) 1 : N es una medida de eficiencia de la columna. Para los picos gaussianos, se calcula por
la ecuación:

en donde tR es el tiempo de retención de la sustancia y W es el ancho del pico en su base, que se obtiene extrapolando los
lados relativamente rectos del pico hasta la línea base. El valor de N depende de la sustancia cromatografiada así como de las
condiciones operativas, tales como la velocidad de flujo y la temperatura de la fase móvil o gas transportador, la calidad del
relleno, la uniformidad del relleno dentro de la columna, y, para columnas capilares, el espesor de la película de fase estaciona-
ria, el diámetro interno y la longitud de la columna.
Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser conveniente determinar el número de platos teóricos por la ecuación:

N=5,54[l) wh/2
2

donde Wh12 es el ancho del pico a la mitad de la altura. Sin embargo, en caso de discrepancias, sólo se deben usar las ecuacio-
nes basadas en el ancho del pico en la línea base.

1 Los parámetros k, N, r y re se desarrollaron para separaciones por GC isotérmicas y separaciones por HPLC isocráticas. Debido a que estos términos son
parámetros termodinámicos, son válidos únicamente para separaciones realizadas a temperatura, composición de la fase móvil y velocidad de flujo constantes. No
obstante, para separaciones realizadas con un programa de temperatura o gradiente de disolventes, estos parámetros se pueden usar simplemente como medio de
comparación para asegurar que existen las condiciones cromatográficas adecuadas para llevar a cabo los métodos según se indican en la monografías.
 •
382 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas USP 37

Pico: El pico es la porción del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un componente individual elu-
ye de la columna. Si la separación es incompleta, se puede registrar la elución de dos o más componentes como un pico no
resuelto.
Relación Pico/Valle (p/v): La p/v se pueden emplear como un criterio de aptitud del sistema en una prueba de sustancias
relacionadas cuando no se logra la separación entre dos picos en la línea base. La Figura 2 representa una separación incomple-
ta de dos sustancias, donde HP es la altura del pico menor por encima de la línea base extrapolada y Hv es la altura en el punto
más bajo de la curva que separa los picos menor y mayor por encima de la línea base extrapolada:

p/v = H/Hv

Figura 2. Determinación de la relación pico/valle.

Retardo Relativo (R,e1): El retardo relativo es el cociente de la distancia recorrida por el analito y la distancia recorrida si-
multáneamente por un compuesto de referencia (ver la Figura 3) y se usa en una cromatografía planar.

Rre1=b/c

Frente de Fase Móvil

-- -
....
Muestra

Referencia
a
b
e

• -- --
Punto de Inicio (línea)

Figura 3. Cromatografía planar típica.

Retención Relativa (r) 1: Es el cociente entre el tiempo de retención ajustado de un componente y el de otro usado como
referencia obtenido en condiciones idénticas:

r = tR2 - tM/tRl - tM

donde tR 2 es el tiempo de retención medido desde el punto de inyección del compuesto de interés; tR 1 es el tiempo de reten-
ción medido a partir del punto de inyección del compuesto usado como referencia; y tM es el tiempo de retención de un mar-
cador no retenido definido en el procedimiento, todos determinados en condiciones experimentales idénticas en la misma co-
lumna.
Tiempo de Retención Relativo (RRT): También conocido como tiempo relativo no ajustado. Las comparaciones en USP
normalmente se realizan en términos de retención relativa no ajustada, a menos que se indique de otro modo.

RRT = tRif tRl

El símbolo re también se usa para designar los valores de retención relativa no ajustados.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 383

Desviación Estándar Relativa Porcentual

%RSD - 2~Q -
'
I(x,
1 -----
-xr
x N-1

Factor de Retardo (R,): El factor de retardo es el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la
distancia recorrida simultáneamente por la fase móvil y se usa en cromatografía planar. Usando los símbolos de la Figura 3:
Rf = b/a

Factor de Retención (k) 1 : Al factor de retención también se le conoce como el factor de capacidad (k'). Se define como:

k -~ cantidad de sust_anc1a en la fase estacionaria

cantidad de sustancia en la fase móvil
o
tiempo de la sustancia en la fase estacionaria
k= tiempo de la sustancia en la fase móvil

El factor de retención de un componente se puede determinar a partir del cromatograma:

k = (tR - tM)/tM

Tiempo de Retención (tR): En cromatografía líquida y cromatografía de gases, el tiempo de retención, tR, se define como
el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta máxima. Se puede usar tR como un pará-
metro para identificación. Los tiempos de retención cromatográficos son característicos de los compuestos que representan,
pero no son únicos. La coincidencia de los tiempos de retención de una muestra y de una sustancia de referencia puede usarse
como un criterio parcial en la construcción de un perfil de identidad, pero es insuficiente por sí misma para establecer la identi-
dad. Los tiempos de retención absolutos de un compuesto dado varían de un cromatograma al siguiente.
Volumen de Retención (VR): El volumen de retención es el volumen de fase móvil requerido para la elución de un com-
ponente. Se puede calcular a partir del tiempo de retención y de la velocidad de flujo en mL/min:
VR = tR X F
Resolución (Rs): La resolución es la separación de dos componentes en una mezcla, calculada por:
Rs = 2(tR2 - tR1)/(W1 + W2)
donde tR2 y tR 1 son los tiempos de retención de los dos componentes; y W2 y W1 son los anchos correspondientes en las bases
de los picos obtenidos extrapolando los lados relativamente rectos de los picos hasta la línea base.
Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser conveniente determinar la resolución, mediante la ecuación:

Rs = 1, 18(tR2 - tR1)/(Wl,h/2 + w2,h/2)

Factor de Separación (a): el factor de separación es la retención relativa calculada para dos picos adyacentes (por con-
vención, el valor del factor de separación siempre es > 1 ):
u= k2/k1
Factor de Simetría (As)2: El factor de simetría (también conocido como factor de asimetría) de un pico (ver la Figura 4) se
calcula por:

As= W0, 0 sf2f

donde W005 es el ancho del pico al 5% de la altura y fes la distancia del máximo del pico hasta el borde inicial del pico, mi-
diendo la distancia en un punto ubicado al 5% de la altura desde de la línea base.

2 Una práctica común consiste en medir el Factor de Asimetría como el cociente entre la distancia entre la línea vertical que canee ta el ápice del pico con la línea
base interpolada y el frente del pico, y la distancia entre dicha línea y el pico medido a la inversa al 10% de la altura del pico (ver la Figuro 4) sería (W0 10 - 1010 )/
10 10 . No obstante, para los propósitos de la USP, únicamente es válida la fórmula (As) segCm se presenta en este capítulo. · ·
 384 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas USP 37

T
h

0,05h

Figura 4. Pico cromatográfico asimétrico.

Factor de Asimetría (T): Ver Factor de Simetría.

Cambio en la redacción:

APTITUD DEL SISTEMA

Las pruebas de aptitud del sistema son una parte integral de los métodos de cromatografía de líquidos y de gases. Estas
pruebas se usan para verificar que el sistema cromatográfico sea adecuado para el análisis que se pretende efectuar.
Las pruebas se basan en el concepto de que el equipo, los sistemas electrónicos, las operaciones analíticas y las muestras
analizadas constituyen un sistema integral que se puede evaluar como tal.
Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico incluyen lo siguiente:
• Composición, fuerza iónica, temperatura y pH aparente de la fase móvil
• Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presión
• Las características de la fase estacionaria, incluyendo el tipo de soporte cromatográfico (basado en partículas o monolíti-
co), tamaño de partícula, tamaño de poro y área específica
• En fase reversa y otras modificaciones superficiales de las fases estacionarias, el grado de modificación química (según se
expresa mediante recubrimiento exhaustivo (end-capping), carga de carbono, etc.)
La resolución, Rs, es una función del número de platos teóricos, N (también referido como eficiencia), el factor de separa-
ción, a, y el factor de capacidad, k. [NOTA-Todos los términos y símbolos se definen en la sección anterior Definiciones e Inter-
pretación de Cromatogramas.] Para una fase móvil y una fase estacionaria determinadas, se puede especificar N para asegurar
que los compuestos que eluyen muy cerca entre sí se resuelvan unos de otros, para establecer el poder de resolución general
del sistema y/o para asegurar que el estándar interno se resuelva del fármaco. Este es un medio menos confiable para asegurar
la resolución que la medición directa de la misma. La eficiencia de la columna es, en parte, una reflexión de la agudeza del
pico, que es también importante para la detección de trazas de componentes.
Las inyecciones repetidas de una preparación estándar u otras soluciones estándar se comparan entre sí para determinar si se
cumplen los requisitos de precisión. A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, se usan los datos
de cinco inyecciones repetidas del analito para calcular la desviación estándar relativa, %RSD, si el requisito es 2,0% o menos;
se usan los datos de seis inyecciones repetidas si la desviación estándar relativa es más de 2,0%.
Para la Valoración en una monografía de un fármaco, donde el valor es 100% para la sustancia pura, y no se especifica una
desviación estándar relativa máxima, se calcula la %RSD máxima permitida paré! una serie de inyecciones de la solución de
referencia como:

%RSD = KB-Vn/t 90 %, "_ 1

donde K es una constante (0, 349), obtenida a partir de la expresión K = (0,6dL.) x (t 90 % 1 5/-16), en la que 0,6/-VL. representa la
desviación estándar relativa porcentual después de seis inyecciones para B = 1,0; B es el límite superior provisto en la definición
de la monografía individual menos 1 00%; n es el número de inyecciones repetidas de la solución de referencia (3 ~n ~ 6); y
t 90 %, "_ 1 es el valor t de Student al 90% del nivel de probabilidad (dos colas) con n - 1 grados de libertad.
A menos que se indique de otro modo, la desviación estándar relativa máxima permitida no excede del valor apropiado pro-
visto en la tabla de requisitos de repetibilidad. Este requisito no se aplica a las pruebas para sustancias relacionadas.
Requisitos para Desviación Estándar Relativa
Número de Inyecciones Individuales
3 4 5 6
B (%) RSD Máxima Permitida
2,0 0,41 0,59 0,73 0,85
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06
3,0 0,62 0,89 1,10 1,27
 USP 37 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 385

El factor de simetría, A5, una medición de la simetría del pico, la unidad es el valor que adquiere para picos perfectamente
simétricos; y su valor se incrementa conforme la asimetría se vuelve más pronunciada (ver la Figura 4). En algunos casos, pue-
den observarse valores menores a la unidad. A medida que la simetría del pico se aleja de valores de 1, la integración y por lo
tanto la precisión se tornan menos confiables.
La relación señal-ruido (S/N) es un parámetro útil de aptitud del sistema. La S/N se calcula según se indica a continuación:
S/N = 2H/h
donde H es la altura del pico medido a partir del ápice del pico hasta la línea base extrapolada sobre una distancia 25 veces el
ancho del pico a su altura media; y h es la diferencia entre el valor de ruido más grande y más pequeño observados sobre una
distancia 25 veces el ancho del pico a su altura media y, si fuera posible, igualmente distribuida a ambos lados del pico de
interés (ver la Figura 5).

Figura 5. Ruido y pico cromatográfico, componentes de la relación S/N.

Estas pruebas de aptitud del sistema se realizan recolectando datos a partir de inyecciones repetidas del estándar u otras
soluciones según se especifica en la monografía individual.
La especificación de parámetros definidos en una monografía no excluye el uso de otras condiciones de operación aptas. Se
permiten ajustes únicamente cuando
• Se encuentran disponibles estándares adecuados (incluyendo Estándares de Referencia) para todos los compuestos usados
en la prueba de aptitud; y
• Esos estándares muestran que los ajustes mejoraron la calidad de la cromatografía con respecto a los requisitos de aptitud
del sistema.
No se deben realizar ajustes a los sistemas cromatográficos a fin de cumplir con los requisitos de aptitud del sistema para
compensar fallas en la columna o mal funcionamiento del sistema.
Si es necesario realizar ajustes a las condiciones operativas para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema, cada uno
de los parámetros en la lista siguiente es la variación máxima que se puede considerar, a menos que se indique algo distinto en
la monografía; estos cambios pueden requerir datos de validación adicionales. Para verificar la aptitud del método en estas
nuevas condiciones, evaluar las características de desempeño analítico pertinentes que sean potencialmente afectadas por el
cambio. Múltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el desempeño del sistema y deben considerarse cuidadosa-
mente antes de implementarlos. No se recomienda realizar ajustes a la composición de la fase móvil en la elución en gradiente.
Si es necesario realizar ajustes, únicamente se recomiendan cambios en la columna (mismo material de relleno) o ajustes en
volumen muerto. ·
pH de la Fase Móvil (HPLC): El pH de la solución amortiguadora acuosa usada en la preparación de la fase móvil se pue-
de ajustar dentro de ±0,2 unidades del valor o intervalo especificado.
Concentración de Sales en la Solución Amortiguadora (HPLC): La concentración de las sales usadas en la preparación
de la solución amortiguadora acuosa empleada en la fase móvil se puede ajustar dentro de± 10% siempre que se cumpla con
la variación del pH permitida (ver arriba).
Relación de los Componentes en la Fase Móvil (HPLC): Los siguientes límites de ajuste aplican a componentes minori-
tarios de la fase móvil (especificados a 50% o menos). La cantidad de estos componentes se puede ajustar en un ±30% relati-
vo. Sin embargo, el cambio en cualquier componente no puede exceder de ±10% absoluto (es decir, en relación a la fase
móvil total). Se puede ajustar un componente minoritario en una mezcla ternaria. A continuación se presentan ejemplos de
ajustes para mezclas binarias y ternarias.
Mezclas Binarias
RELACIÓN ESPECIFICADA DE 50:50: 30% de 50 es 15% absoluto, pero esto excede el cambio máximo permitido de± 10% ab-
soluto en cada componente. Por lo tanto, sólo se puede ajustar la relación de la fase móvil dentro del intervalo de 40:60 a
60:40.
RELACIÓN ESPECIFICADA DE 2:98: 30% de 2 es 0,6% absoluto. Por lo tanto, el ajuste máximo permitido se encuentra dentro
del intervalo de 1,4:98,6 a 2,6:97,4.
 •
386 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas USP 37

Mezclas Ternarias
RELACIÓN ESPECIFICADA DE 60:35:5: Para el segundo componente, 30% de 35 es 10,5% absoluto, que excede el cambio má-
ximo permitido de ± 10% absoluto en cualquier componente. Por lo tanto, el segundo componente sólo puede ajustarse den-
tro del intervalo de 25% a 45% absoluto. Para el tercer componente, 30% de 5 es 1,5% absoluto. En todos los casos, usar una
cantidad suficiente del primer componente para obtener un total de 100%. Como consecuencia, los intervalos de mezclas de
50:45:5 a 70:25:5 ó 58,5:35:6,5 a 61,5:35:3,5 cumplirán con el requisito.
Longitud de Onda del Detector UV-Visible (HPLC): No están permitidas las desviaciones de las longitudes de onda
especificadas en el procedimiento. Se usa el procedimiento especificado por el fabricante del detector, u otro procedimiento
validado, para verificar que el error en la longitud de onda del detector sea, como máximo, ±3 nm.
Fase Estacionaria
LONGITUD DE LA COLUMNA (Ge, HPLC): Se puede ajustar tanto como ±70%.
DIÁMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (HPLC): Se puede ajustar siempre que la velocidad lineal se mantenga constante. Ver Velo-
cidad de Flujo (HPLC) más adelante.
DIÁMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (GC)-Se puede ajustar tanto como ±50% para GC.
ESPESOR DE LA PELÍCULA (CG CAPILAR)-Se puede ajustar tanto como -50% a 100%.
Tamaño de Partícula (HPLC): El tamaño de partícula se puede reducir tanto como 50%, pero no se puede aumentar.
Tamaño de la Partícula (GC): Es aceptable cambiar la malla de un soporte para GC de un tamaño de partícula mayor a
uno menor o de uno menor a uno mayor siempre que la cromatografía cumpla con los requisitos de aptitud del sistema y se
mantenga la misma relación del intervalo de tamaño de partícula. La relación del intervalo del tamaño de partícula se define
como el diámetro de la partícula más grande dividida por el diámetro de la partícula más pequeña.
Velocidad de Flujo (GC): La velocidad de flujo se puede ajustar tanto como ±50%.
Velocidad de Flujo (HPLC): Cuando hayan sido modificadas las dimensiones de la columna, la velocidad de flujo se pue-
de ajustar usando:
•

e ERR (01 -jun-2013)

en donde F1 es la velocidad de flujo indicada en la monografía, en mL/min; F2 es la velocidad de flujo ajustada, en mL/
min; •. ERR(Ol-jun-2onJ d 1 es el diámetro interno de la columna indicado en la monografía; y d 2 es el diámetro interno de la co-
lumna usada. Además, la velocidad de flujo se puede ajustar en ±50%.
Volumen de Inyección (HPLC): El volumen de inyección se puede reducir hasta tanto lo permitan los límites de detec-
ción y precisión aceptados; no se permiten aumentos.
Volumen de Inyección y Volumen de División (Split Volume) (GC): El volumen de inyección y el volumen de división
se pueden ajustar si la detección y la repetibilidad son satisfactorias.
Temperatura de la Columna (HPLC): La temperatura de la columna se puede ajustar tanto como ± 1Oº. Se recomienda la
termostatización de la columna para mejorar el control y la reproducibilidad del tiempo de retención.
Temperatura del Horno (GC): La temperatura del horno se puede ajustar tanto como± 10%.
Programa de Temperatura del Horno (GC): Se permiten ajustes de la temperatura según se especificó anteriormente.
Cuando la temperatura especificada se debe mantener o cuando la temperatura debe cambiarse de un valor a otro, se permite
un ajuste de hasta ±20%.
A menos de se indique algo distinto en la monografía, los parámetros de aptitud del sistema se determinan a partir del pico
del analito.
Los valores medidos de R, o RF o tR para la muestra no se desvían de los valores obtenidos para el compuesto o la mezcla de
referencia en más que los estimados de confiabilidad estadísticamente determinados en valoraciones repetidas del compuesto
de referencia. Los tiempos de retención relativos, si se proporcionan en las monografías, son con fines informativos únicamente
para facilitar la identificación de los picos. No existen criterios de aceptación pertinentes a los tiempos de retención relativos.
El sistema operativo final debe someterse a una prueba de aptitud para determinar su eficiencia. Realizar inyecciones de las
preparaciones apropiadas según se requiera para demostrar una adecuada aptitud del sistema en toda la corrida (según se des-
cribe en la sección Sistema cromatográfico del procedimiento en una monografía).
La preparación puede ser una preparación estándar o una solución que contenga una cantidad conocida de analito y cual-
quier material adicional (por ejemplo, excipientes o impurezas) útiles para el control del sistema analítico. Siempre que haya
un cambio significativo en el sistema cromatográfico (equipo, componentes de la fase móvil, u otros componentes) o en un
reactivo crítico, debería restablecerse la aptitud del sistema. Ningún análisis de muestras es aceptable a menos que se haya
demostrado la aptitud del sistema.

CUANTIFICACIÓN
Durante la cuantificación, no tomar en cuenta los picos producidos por disolventes y reactivos o generados por la fase móvil
o la matriz de la muestra.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (631) Color y Acromatismo 387

En el intervalo lineal, el área del pico y la altura del pico son generalmente proporcionales a la cantidad de compuesto elui-
do. Las áreas y las alturas de los picos se miden comúnmente mediante integradores electrónicos, pero se pueden determinar
de modos más clásicos. En general, se emplean las áreas de los picos pero pueden ser menos exacta~ ~i ~e f->ruducen interferen-
cias. Los componentes medidos se separan de cualquier componente interferente. Se deben minimizar las asimetrías tanto en
la parte anterior como en la posterior del pico y se debe evitar la medición de picos dentro de las colas de otros picos.
Aunque se prefiere la comparación de los picos de impurezas con los del cromatograma de un estándar de la impureza a
una concentración similar, las pruebas de impurezas pueden basarse en la medición de las respuestas de los pico debidos a
impurezas y expresarse como un porcentaje del área del pico del fármaco. El estándar puede ser el mismo fármaco a un nivel
correspondiente de impurezas, por ejemplo, a 0,5%, asumiendo respuestas idénticas de los picos. Cuando las impurezas de-
ben determinarse con una mayor certeza, usar un estándar de la misma impureza o aplicar un factor de corrección basado en
la respuesta de la impureza relativa a la del componente principal.
Método de Estándar Externo: La concentración del componente cuantificado se determina comparando las respuestas
obtenidas a partir de la solución muestra con las respuestas obtenidas a partir de una solución estándar.
Método del Estándar Interno: Se introducen cantidades iguales del estándar interno en la solucion muestra y en una ~o­
lución estándar. El estándar interno se selecciona de modo que no reaccione con el material de prueba, se resuelva de los com-
ponentes cuantificados (analitos), y no contenga impurezas con el mismo tiempo de retención que los analitos. Las concentra-
ciones de los analitos se determinan comparando los cocientes entre las áreas de sus picos o las alturas de sus picos y el están-
dar interno en la solución muestra, con los cocientes entre las áreas o alturas de sus picos y el estándar interno en la solución
estándar.
Procedimiento de Normalización: El contenido porcentual de un componente del material de prueba se calcula determi-
nando el área del pico correspondiente como un porcentaje del área total de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a
disolventes o reactivos o que surgen de la fase móvil o de la matriz de la muestra y aquellos por debajo del límite en el que
pueden descartarse.
Procedimiento de Calibración: Se determina la relación entre la señal medida o evaluada y la cantidad de la sustancia x
(por ejemplo, concentración, masa) y se calcula la función de calibración. Los resultados analíticos se calculan a partir de la
señal del analito medida o evaluada y su posición en la curva de calibración.
En las pruebas para impurezas tanto para el Método del Estándar Externo, cuando se usa una dilución de la solución muestra
para comparación, como para el Procedimiento de Normalización, se aplica cualquier factor de corrección indicado en la mono-
grafía (por ejemplo, cuando el factor de respuesta está fuera del intervalo de 0,8-1,2).
Cuando la prueba de impurezas indica el total de impurezas o cuando existe una determinación cuantitativa de una impure-
za, es importante seleccionar un ajuste de umbral apropiado y condiciones apropiadas para la integración de las áreas de los
picos. En tales pruebas, el límite en el cual, o por debajo del cual se descarta un pico, es generalmente 0,05%. De esta forma,
el ajuste de umbral del sistema de recolección de datos corresponde al menos a la mitad de este límite. Integrar el área del
pico de cualquier impureza que no se separe por completo del pico principal, preferiblemente mediante extrapolación valle a
valle de la línea base (extrapolación tangencial).

(631) COLOR Y ACROMATISMO

Definición-A los efectos de este capítulo, el color se puede definir COIT\O la percepción o la respuesta subjetiva de un ob-
servador al estímulo objetivo de energía radiante en el espectro visible que se extiende en el intervalo de longitudes de onda
de 400 nm a 700 nm. El color percibido es una función de tres variables: las propiedades espectrales del objeto, tanto absor-
bentes como reflectantes; las propiedades espectrales de la fuente de iluminación; y las características visuales del observador.
Se dice que dos objetos poseen colores iguales para una fuente específica de iluminación cuando un observador no puede
detectar una diferencia de color. Cuando un par de objetos presenta colores iguales, con una fuente de iluminación y no con
otra, constituyen un par metamérico. El color de dos objetos es igual para todas las fuentes de iluminación si los espectros de
absorción y de reflectancia de los dos objetos son idénticos.
El acromatismo o falta de color es un extremo de cualquier escala de color para la transmisión de luz. Esto implica la ausen-
cia completa de color y, en consecuencia, el espectro visible del objeto carece de absorbancias. A efectos prácticos, el observa-
dor en este caso percibe poca o ninguna absorción en el espectro visible.
Atributos del Color-Como la sensación de color tiene un componente subjetivo y otro objetivo, el color no puede descri-
birse exclusivamente en términos espectrofotométricos. Por lo tanto, los atributos comunes del color no pueden corresponder
uno a uno con la terminología espectral.
Por lo general se utilizan tres atributos para identificar un color. (1) el matiz, o la cualidad según la cual una familia de colo-
res se distingue de otra, como por ejemplo rojo, amarillo, azul, verde y términos intermedios; (2) el valor, o la cualidad que
distingue un color claro de uno oscuro; y (3) la cromaticidad, o la cualidad que distingue un color fuerte de uno débil, o el
grado en el cual un color difiere de un gris del mismo valor.
Los tres atributos del color se pueden utilizar para definir ur espacio de color tridimensional, en el cual se ubica cualquier
color por sus coordenadas. El espacio de color elegido es visualmente uniforme si la distancia geométrica entre dos colores en
 388 (631) Color y Acromatismo/ Pruebas Físicas USP 37

el espacio de color es directamente una medida de la distancia del color entre ellos. A menudo se eligen coordenadas cilíndri-
cas por conveniencia. Los puntos a lo largo del eje longitudinal representan valores del oscuro al claro o del negro al blanco y
poseen un matiz indeterminado y ninguna cromaticidad. Centrándose en una sección transversal perpendicular al eje del va-
lor, el matiz se determina por el ángulo con respecto al eje longitudinal y la cromaticidad se determina por la distancia desde
el eje longitudinal. Los matices rojos, amarillos, verdes, azules, morados e intermedios están dados por diferentes ángulos. Los
colores a lo largo de un radio de una sección transversal tienen el mismo matiz, que se convierte en un matiz más intenso a
medida que se aleja. Por ejemplo, el agua incolora o acromática tiene un matiz intermedio, valor alto y ninguna cromaticidad.
Si se agrega un soluto de color, el agua adopta un matiz específico. A medida que se agrega más soluto, el color se torna más
oscuro, más intenso, o más profundo; es decir, generalmente la cromaticidad aumenta y el valor disminuye. Sin embargo si el
soluto es de color neutro, es decir, gris, el valor disminuye, no se observa un aumento en la cromaticidad y el matiz permanece
indeterminado.
Las mediciones espectroscópicas de laboratorio pueden convertirse en mediciones de los tres atributos de color. Los resulta-
dos espectroscópicos para tres luces o estímulos elegidos se ponderan mediante tres funciones de distribución para producir
los valores tricromáticos, X, Y, Z (ver Color-Medición Instrumental (1061 )). Las funciones de distribución se determinaron en
experimentos de comparación de color con sujetos humanos.
Los valores tricromáticos no son coordenadas en un espacio de color visualmente uniforme; sin embargo, se han propuesto
varias transformaciones que son cercanas a la uniformidad, una de las cuales se describe en el capítulo citado (1061) Color-
Medición Instrumental. El valor es a menudo una función solamente del valor de Y. La obtención de uniformidad en el subespa-
cio de matiz y cromatismo ha sido menos satisfactoria. En un sentido práctico, esto significa que en una comparación visual de
colores, cuando dos objetos difieren significativamente en matiz, resulta difícil decidir cuál tiene mayor cromaticidad. Esto se-
ñala la importancia de elegir un estándar de comparación lo más parecido posible al color de la muestra, especialmente para
los atributos de matiz y cromaticidad.
Determinación de Color y Estándares-La percepción del color y de la igualdad de colores depende de las condiciones de
observación e iluminación. Las determinaciones deben hacerse usando iluminación difusa y uniforme bajo condiciones que re-
duzcan al mínimo las sombras y la reflectancia no espectral. La superficie de los polvos debe alisarse con presión suave para
que puedan presentar una superficie plana sin irregularidades. Los líquidos deben compararse en tubos para comparación de
color iguales, contra un fondo blanco. Si se descubre que los resultados varían con la iluminación, se considerarán correctos los
valores obtenidos con luz de día natural o artificial. En lugar de la determinación visual debe emplearse un método instrumen-
tal apropiado.
Los colores de los estándares deben ser lo más parecidos posibles a los de las muestras de prueba para cuantificar las diferen-
cias de color. Los estándares para materiales opacos están disponibles como conjuntos de muestras indicadoras de color que se
disponen en un espacio visualmente uniforme.* Estándares para comparaciones de color de líquidos, identificados mediante
una letra, se pueden preparar según la tabla adjunta. Para preparar el líquido de comparación requerido, pipetear y transferir
los volúmenes prescritos de las soluciones de prueba colorimétricas [ver en Soluciones Calorimétricas (SC) en la sección Reacti-
vos, Indicadores, y Soluciones] y agua en uno de los recipientes para comparación y mezclar la solución en el recipiente. Hacer
la comparación según se indica en la monografía individual, bajo las condiciones de observación previamente descritas. Los
líquidos de comparación u otras combinaciones de las soluciones colorimétricas pueden emplearse en concentraciones muy
bajas para medir desviaciones del acromatismo.
Líquidos de Comparación
Partes de Partes de
Líquido de Compara- Partes de Cloruro Sulfato
ción Cloruro Cobaltoso SC Férrico SC Cúprico ~e Partes de Agua
A 0,1 0,4 0,1 4,4
B 0,3 0,9 0,3 3,5
e 0,1 0,6 0,1 4,2
D 0,3 0,6 0,4 3,7
E 0,4 1,2 0,3 3, 1
F 0,3 1,2 0,0 3,5
G 0,5 1,2 0,2 3, 1
H 0,2 1,5 0,0 3,3
1 0,4 2,2 0,1 2,3
J 0,4 3,5 0,1 1,0
K 0,5 4,5 0,0 0,0
L 0,8 3,8 0,1 0,3
M 0,1 2,0 0,1 2,8
N 0,0 4,9 0,1 0,0

* Las colecciones de muestras de color, ordenadas según matiz, valor y cromatismo en un espacio visualmente uniforme y apropiado para su uso en la designación
de colores de muestras por comparación visual están disponibles en GretagMacbeth LLC, 617 Little Britain Road, New Windsor, NY 12553-6148.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (643) Carbono Orgánico Total 389

Líquidos de Comparación (Continuación)

Partes de Partes de
Líquido de Compara- Partes de Cloruro Sulfato
ción Cloruro Cobaltoso SC Férrico SC Cúprico SC Partes de Agua
o 0,1 4,8 0,1 0,0
p 0,2 0,4 0,1 4,3
Q 0,2 0,3 0,1 4,4
R 0,3 0,4 0,2 4,1
5 0,2 0,1 0,0 4,7
T 0,5 0,5 0,4 3,6

(641 ) TOTALIDAD DE LA DISOLUCIÓN

Colocar la cantidad de la sustancia especificada en la monografía individual en una probeta de vidrio de 1 O mL, de aproxi-
madamente 13 mm x 125 mm de tamaño, con tapón de vidrio, meticulosamente limpia. Utilizando el disolvente especificado
en la monografía o en la etiqueta del producto, llenar la probeta casi hasta el estrechamiento del cuello. Agitar suavemente
para disolver: La solución no es menos transparente que un volumen igual del mismo disolvente contenido en un recipiente
similar y examinado de modo similar.

(643) CARBONO ORGÁNICO TOTAL

El carbono orgánico total (COT) es una medida indirecta de las moléculas orgánicas presentes en las aguas para uso farma-
céutico, determinadas como carbono. Las moléculas orgánicas se introducen en el agua junto con el agua original, desde los
materiales del sistema de purificación y distribución, desde biopelículas que se desarrollan en el sistema y desde los envases de
agua estéril y de agua no estéril. El COT también puede emplearse como un atributo de control del proceso, para monitorear
el funcionamiento de las operaciones unitarias que conforman el sistema de purificación y distribución. Una medición de COT
no es un reemplazo de la prueba de control microbiológico o de endotoxinas. Aunque puede haber una relación cualitativa
entre el COT y la actividad microbiológica, no existe una correlación numérica directa.
Existen varios métodos aceptables para analizar el COT. Este capítulo no respalda, limita ni impide el empleo de tecnologías
alternativas, sino que ofrece una orientación para calificar estas tecnologías analíticas para su uso, así como también una guía
para interpretar los resultados de los instrumentos para emplearlos como una prueba de límite.
Los aparatos que se usan comúnmente para determinar el COT en aguas para uso farmacéutico comparten el objetivo de
oxidar las moléculas orgánicas del agua para producir dióxido de carbono, seguido de la medición de la cantidad de dióxido
de carbono producido. Posteriormente, la cantidad determinada de C0 2 producido se usa para calcular la concentración de
carbono orgánico en el agua.
Todas las tecnologías deben distinguir entre el carbono inorgánico, que puede estar presente en el agua proveniente de
fuentes como C0 2 y bicarbonato disueltos, y el C0 2 generado por la oxidación de moléculas orgánicas en la muestra. La distin-
ción se puede lograr determinando el carbono inorgánico y restándolo del carbono total (que es la suma de carbono orgánico
y carbono inorgánico), o eliminando el carbono inorgánico de la muestra antes de oxidarla. Aunque el paso de eliminación
también puede eliminar moléculas orgánicas, este carbono orgánico eliminable se encuentra presente en cantidades inaprecia-
bles en las aguas para uso farmacéutico.

AGUA A GRANEL

Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua para Hemodiálisis y el con-
densado de Vapor Puro a granel.
Requisitos del Aparato: Este método de prueba se lleva a cabo como una prueba en línea (on-line test) o como una
prueba de laboratorio fuera de la línea de producción (off-line test), empleando un instrumento calibrado. La aptitud del apa-
rato debe demostrarse periódicamente, según se describe a continuación. Además, debe tener especificado un límite de detec-
ción, establecido por el fabricante, de 0,05 mg/L (0,05 ppm) de carbono o menor.
Cuando se analiza agua para propósitos de control de calidad, se debe asegurar que el instrumento y sus datos estén bajo
un control apropiado y que los métodos y lugares de muestreo tanto de las mediciones en línea como de las mediciones fuera
de línea sean representativos de la calidad del agua usada. Se debe tomar en cuenta el carácter de la producción, distribución
y uso del agua al momento de seleccionar una medición en línea o fuera de línea.
 •
390 (643) Carbono Orgánico Total / Pruebas Físicas USP 37

Estándares de Referencia USP (11 ): ER 1,4-Benzoquinona USP. ER Sacarosa USP.

Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no más de O, 1 O mg/L. [NOTA-Puede ser necesario establecer un
requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del método.]
Preparación de Envases: La contaminación orgánica de los envases da lugar a valores de COT más altos. Por lo tanto, se
deben usar materiales de laboratorio y envases que hayan sido meticulosamente limpiados para eliminar los residuos orgáni-
cos. Se puede emplear cualquier método eficaz para eliminar la materia orgánica (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )).
Utilizar Agua Reactivo para el enjuague final.
Solución Estándar: A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solución con una concentración de 1, 19 mg/L de saca-
rosa (0,50 mg/L de carbono).
Solución de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad pesada con exactitud de ER 1,4-Benzoquinona
USP para obtener una solución con una concentración de 0,75 mg/L (0,50 mg/L de carbono).
Control de Agua Reactivo: Usar una cantidad adecuada de Agua Reactivo obtenida al mismo tiempo que la utilizada en la
preparación de la Solución Estándar y de la Solución de Aptitud del Sistema.
Muestra de Agua: Obtener una muestra en línea o fuera de línea que refleje de manera apta la calidad del agua usada.
Otras Soluciones de Control: Preparar soluciones apropiadas de blanco de reactivos u otras soluciones especificadas ne-
cesarias para establecer la línea de base del aparato o para realizar ajustes en la calibración siguiendo las instrucciones del fabri-
cante, y correr los blancos apropiados para ajustar a cero el instrumento, si fuera necesario.
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utili-
zando la Solución Estándar y registrar la respuesta, r5 • Calcular la respuesta corregida de la Solución Estándar, que es también la
respuesta límite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución Estándar. El límite teórico de
0,50 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solución Estándar, r5 - rw· Analizar la Solución de Aptitud del Siste-
ma en el aparato y registrar la respuesta, r5s- Calcular la respuesta corregida de la Solución de Aptitud del Sistema, restando la
respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución de Aptitud del Sistema, r55 - rw. Calcular la eficiencia de la
respuesta porcentual de la Solución de Aptitud del Sistema:
eficiencia de la respuesta%= 1OO[(r55 - rw)l(r5 - rw)l
en donde r55 es la respuesta del instrumento para la Solución de Aptitud del Sistema; rw es la respuesta del instrumento para el
Control de Agua Reactivo y r5 es la respuesta del instrumento para la Solución Estándar. El sistema es apto si la eficiencia de la
respuesta porcentual no es menos de 85% ni más de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, ru. La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si runo es mayor que la respuesta límite, r5 - rw. Este método se puede realizar usando instrumental en línea o
fuera de línea que cumpla con los Requisitos del Aparato.

AGUA ESTÉRIL

Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril Purificada, Agua Estéril para Irri-
gación y Agua Estéril para Inhalación.
Seguir los requisitos en Agua a Granel, con las siguientes excepciones.
Requisitos del Aparato: Además de cumplir con los Requisitos del Aparato en Agua a Granel, el aparato debe tener un
límite de detección especificado por el fabricante de O, 1 O mg/L (O, 1 O ppm) de carbono o menor.
Control de Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no más de 0,50 mg/L. [NOTA-Puede ser necesario
establecer un requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del método.]
Solución Estándar: A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solución con una concentración de 19,0 mg/L de saca-
rosa (8,0 mg/L de carbono).
Solución de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad, pesada con exactitud, de ER 1,4-Benzoquino-
na USP para obtener una solución con una concentración de 12,0 mg/L (8,0 mg/L de carbono).
Muestra de Agua: Obtener una muestra que refleje de manera apta la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigo-
rosamente el envase para homogeneizar la muestra de agua. Puede que se requieran varios envases para contar con suficiente
agua para analizar.
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utili-
zando la Solución Estándar y registrar la respuesta, r5• Calcular la respuesta corregida de la Solución Estándar, que es también la
respuesta límite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución Estándar. El límite teórico de
8,0 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solución Estándar, r5 - rw· Analizar la Solución de Aptitud del Sistema
en el aparato y registrar la respuesta, r55 • Calcular la respuesta corregida de la Solución de Aptitud del Sistema, restando la res-
puesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución de Aptitud del Sistema, r, 1 - rw. Calcular la eficiencia de la
respuesta porcentual de la Solución de Aptitud del Sistema:
eficiencia de la respuesta % = 1 OO[(r11 - rw)l(r5 - rw)l
 USP 37 Pruebas Físicas/ (645) Conductividad del Agua 391

en donde r55 es la respuesta del instrumento para la Solución de Aptitud del Sistema; rw es la respuesta del instrumento para el
Control de Agua Reactivo; y r1 es la respuesta del instrumento para la Solución Estándar. El sistema es apto si la eficiencia de la
respuesta porcentual es no menos de 85% ni más de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, r11 • La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si runo es mayor que la respuesta límite, r1 - rw, determinada en los requisitos de Aptitud del Sistema, en Agua
Estéril

(645) CONDUCTIVIDAD DEL AGUA

Cambio en la redacción:

•INTRODUCCIÓN 4 usr 37
La conductividad eléctrica del agua es una medida del flujo de electrones facilitado con iones. Las moléculas de agua se diso-
cian en iones en función del pH y la temperatura, produciéndose una conductividad fácil de predecir. Algunos gases, especial-
mente el dióxido de carbono, se disuelven fácilmente en el agua e interactúan para formar iones, lo que •también 4 usP37 afecta
la conductividad en forma predecible. Para los fines de este capítulo, estos iones y la conductividad resultante se pueden consi-
derar como intrínsecos al agua.
•La presencia de iones extraños también afecta la conductividad del agua. Los iones extraños usados para determinar las
especificaciones de conductividad que se describen a continuación son los iones cloruro y amonio. En cuanto al nivel de impu-
rezas iónicas permitidas en el agua, la mayor proporción corresponde a la conductividad del ión cloruro ubicuo (en una con-
centración teórica final de 0,47 ppm cuando el cloruro constituía una prueba de calidad requerida en la USP 22 y en versiones
anteriores) y al ión amonio (con un límite de 0,3 ppm). Para mantener la electroneutralidad el nivel de impurezas permitido
incluye una cantidad balanceada de aniones (tales como cloruro, para contrarrestar el ión amonio) y cationes (tales como so-
dio, para contrarrestar el ión cloruro). Los iones extraños como los mencionados, pueden tener un efecto significativo en la
pureza química del agua y en la aptitud para su uso en aplicaciones farmacéuticas.
El procedimiento en la sección Agua a Granel está especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purifica-
da, el Agua para Inyección, el Agua para Hemodiá/isis y el condensado de Vapor Puro. El procedimiento en la sección Agua Estéril
está especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril
para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación.
Los procedimientos siguientes se deben realizar usando instrumental que haya sido calibrado, cuyas constantes de celda del
sensor de conductividad hayan sido determinadas con exactitud y cuya función de compensación de temperatura haya sido
desactivada para la Etapa 1 del análisis de Agua a Granel. Para las mediciones en línea y fuera de línea, la aptitud del instrumen-
to para las pruebas de control de calidad depende también de los sitios de muestreo en el sistema del agua. Los sitios seleccio-
nados para el instrumento de muestreo deben reflejar la calidad del agua empleada. 4 usm

Cambio en la redacción:

ESPECIFICACIONES DEL INSTRUMENTO Y PARÁMETROS DE FUNCIONAMIENTO

•La conductividad del agua debe medirse con exactitud usando instrumentos calibrados. Una medición de la conductividad
eléctrica consiste en la determinación de la conductancia, G (o su inversa, la resistencia, R), del fluido entre y alrededor de los
electrodos. La conductancia (1 / R) se ve directamente afectada por las propiedades geométricas de los electrodos; es decir, la
conductancia es inversamente proporcional a la distancia (d) entre los electrodos y proporcional al área (A) de los mismos. Esta
relación geométrica (d/A) se conoce como constante de celda, E>. Por consiguiente, la conductancia medida se normaliza para
la constante de celda a fin de determinar la conductividad, K, de acuerdo con la siguiente ecuación:
conductividad, K (S/cm) =E> (cm-1)/R (Q)
Si fuera necesario, se deben ajustar y verificar la constante de celda y la medida de resistencia.
Constante de celda: La constante de celda debe conocerse con una aproximación de ±2%. La constante de celda puede ser
verificada directamente, usando una solución de conductividad conocida o rastreable, o indirectamente, comparando la lectu-
ra del instrumento obtenida con el sensor de conductividad en cuestión con las lecturas obtenidas con un sensor de conducti-
vidad con constante de celda conocida o rastreable. Si fuera necesario, ajustar la constante de celda siguiendo el protocolo del
instrumento provisto por el fabricante del mismo. La frecuencia de la verificación/calibración se determina en función del dise-
ño del sensor.
Medición de resistencia: La calibración (o verificación) de la medición de resistencia se logra reemplazando los electrodos
del sensor de conductividad con resistores de precisión que tengan estándares rastreables al NIST o a autoridades nacionales
 392 (645) Conductividad del Agua/ Pruebas Físicos USP 37

equivalentes en otros países (con una exactitud que no se aleje en más de ±0, lo/o del valor declarado) para obtener una res-
puesta de conductividad prevista del instrumento. La exactitud de la medición de resistencia es aceptable si la conductividad
medida con el resistor rastreable se encuentra dentro de ±0, 1 µS/cm del valor calculado, de acuerdo con la ecuación anterior.
Por ejemplo, el resistor rastreable es 50 kQ y la constante de celda, e, es O, 1 O cm-1 • El valor calculado es 2,0 x 10-6 S/cm ó 2,0
µS/cm. El valor medido debe ser 2,0±O,1 µS/cm. El instrumento debe tener una resolución mínima de 0, 1 µS/cm en el inter-
valo más bajo.
Los valores de conductividad deseados deben basarse en el tipo de agua que se va a analizar y deben ser iguales o menores
que el límite de conductividad del agua para dicho tipo de agua. Se pueden incluir múltiples circuitos de medición en el medi-
dor o el sensor y cada circuito puede requerir de verificación o calibración independiente antes del uso. La frecuencia de la
recalibración se determina en función del diseño del instrumento.
Verificación del sistema: La constante de celda del sensor del usuario se puede determinar con el sistema de medición de
resistencia del usuario, o la constante de celda se puede determinar con un sistema de medición de resistencia independiente.
Si la constante de celda se determina con un sistema de medición de resistencia independiente, se recomienda que el usuario
verifique que el sensor ha sido apropiadamente conectado al sistema de medición de resistencia para asegurar un funciona-
miento adecuado. La verificación puede hacerse comparando los valores de conductividad (o resistividad) presentados en la
pantalla del equipo de medición, con los de un dispositivo externo calibrado medidor de conductividad. Los dos valores de
conductividad (o resistividad) no compensados por temperatura deben ser equivalentes entre sí o tener una aproximación de
±5%, o bien deben tener una diferencia que sea aceptable con respecto a la criticidad del agua producida y/o a los intervalos
de conductividad del agua en los que se realizaron las mediciones. Los dos sensores de conductividad se deben posicionar lo
suficientemente juntos para medir la misma muestra de agua a la misma temperatura y calidad del agua.
Compensación de temperatura y mediciones de temperatura: Debido a que la temperatura tiene un efecto sustancial so-
bre las lecturas de conductividad de las muestras a temperaturas altas y bajas, muchos instrumentos corrigen automáticamente
la lectura real para mostrar el valor que teóricamente se observaría a la temperatura nominal de 25º. Norméilmente, la correc-
ción se efectúa mediante un sensor de temperatura incluido junto con el sensor de conductividad y un algoritmo informático
incluido en el instrumento. Este algoritmo de compensación de temperatura puede no ser exactq para Jos distintos tipos de
agua e impurezas. Por esta razón, los valores de conductividad usados en la prueba de la E.tapa 1 para Agua a Granel son medj:.
dones no compensadas por temperatura. Otras pruebas de conductividad que se especifican para la medición a 25º pueden
usar mediciones compensadas por temperatura o mediciones no compensadas por temperatura.
Se requiere una medición de temperatura para la prueba de la E.topa 1 o para las otras pruebas a 15º. Esta puede realizarse
usando el sensor de temperatura incluido en el sensor de la celda de conductividad. También es aceptable un sensor de tem~
peratura externo colocado cerca del sensor de conductividad. la exactitud de las mediciones de temperatura debe ser de
±2º.&USP31
Cambio en la redacci6n:

AGUA A GRANEL

El procedimiento y los límites de prueba en esta sección están destinados para Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua
para Hemodiálisis, el condensado de Vapor Puro y cualquier otra monografía que especifique esta sección.
•Se trata de un método de prueba de tres etapas para realizar el análisis en línea o fuera de línea. la prueba de conductivi-
dad en línea proporciona mediciones en tiempo real y oportunidades para controlar, tomar decisiones e intervenir en el procé·
so en tiempo real. Se deben tomar las precauciones necesarias en la recolección c;fe muestras de agua para l~s mediciones de
conductividad fuera de línea. El método de muestreo, el envase de muestreo y lós factores ambientales, tales como la concen·
tración ambiental de dióxido de carbono y los vapores orgánicos pueden afectar la muestra. El procedimiento se puede iniciar
en la E.tapa 2 si se prefiere el análisis fuera de línea. 4 usm

Procedimiento

ETAPA 1

La Etapa 7 está destinada para la medición en línea o puede realizarse fuera de línea en un recipiente apropiado.
1. Determinar la temperatura y la conductividad del agua usando una lectura de conductividad que no haya sido compensa-
da por temperatura.
2. Mediante la Tabla 7, determinar el valor de temperatura que no sea mayor que la temperatura medida, es decir, la tem-
peratura inmediatamente inferior. El valor de conductividad correspondiente en esta tabla es el límite. [NOTA-No interpolar.]
3. Si la conductividad medida no es mayor que el valor especificado en la tabla •determinado en la etapa 2,•usm el agua
cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad es mayor que el valor especificado en la tabla,
pasar a la Etapa 2.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (645) Conductividad del Agua 393

Tabla 1. Etapa 1-Requisitos de Temperatura y Conductividad

(sólo para mediciones de conductividad no compensadas por temperatura)
Temperatura Requisito de Conductividad (µS/cm)
o 0,6
5 0,8
10 0,9
15 1,0
20 1,1
25 1,3
30 1,4
35 1,5
40 1,7
45 1,8
50 1,9
55 2,1
60 2,2
65 2,4
70 2,5
75 2,7
80 2,7
85 2,7
90 2,7
95 2,9
100 3, 1

ETAPA 2

4. Transferir una cantidad de agua suficiente"'.11.usm a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la
temperatura, si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 ± 1 º, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente
mientras se observa la conductividad de manera periódica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la ab-
sorción de dióxido de carbono atmosférico) es menos de O, 1 µS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad. "'[NOTA-las
mediciones de conductividad en esta etapa pueden ser compensadas. por temperatura a 25º o no compensadas por tempera-
tura.J.vsm
5. Si la conductividad no es mayor de 2, 1 µS/cm, el agua cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la
conductividad es mayor de 2, 1 µS/cm, pasar a la Etapa 3.

ETAPA 3

6. Efectuar esta prueba dentro de los 5 minutos aproximadamente de haber efectuado la determinación de conductividad
en el paso 5, manteniendo la temperatura de la muestra a 25 ± 1 º. Agregar una solución saturada de cloruro de potasio a la
misma muestra de agua (0,3 ml por cada 100 ml de la muestra de prueba) y determinar el pH con una aproximación de O, 1
unidades de pH según se indica en pH (791 ).
7. Empleando la Tabla 2, determinar el límite de conductividad en el valor de pH medido. Si la conductividad medida en el
paso 4 •no es mayor que el valor especificado en la tabla 4 usm determinado en el paso 6, el agua cumple con los requisitos de
la prueba de conductividad. Si la conductividad medida es mayor que este valor o si el pH está fuera del intervalo de 5,0-7,0,
el agua no cumple con los requisitos de la prueba de conductividad.
Tabla 2. Etapa 3-Requisitos de pH y Conductividad
(sólo para muestras equilibradas con la temperatura y la atmósfera)
pH Requisito de Conductividad (µS/cm)
5,0 4,7
5,1 4,1
5,2 3,6
5,3 3,3
5,4 3,0
5,5 2,8
5,6 2,6
5,7 2,5
 394 (645) Conductividad del Agua / Pruebas Físicas USP 37

Tabla 2. Etapa 3-Requlsitos de pH y Conductividad

(sólo para muestras equilibradas con la temperatura y la atmósfera) (Continuación)
pH Requisito de Conductividad (ftS/cm)
5,8 2,4
5,9 2,4
6,0 2,4
6,1 2,4
6,2 2,5
6,3 2,4
6,4 2,3
6,5 2,2
6,6 ---~--
2,1
6,7 2,6
6,8 3, 1
6,9 3,8
7,0 4,6

AGUA ESTÉRIL

El procedimiento y los límites de prueba están destinados para Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril
para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación y cualquier otra monografía que especifique esta sección. Las aguas estériles proce-
den de Agua Purificada o Agua para Inyección y por lo tanto se ha determinado que cumplen con los requisitos para Agua a
Granel antes de ser envasadas. La especificación proporcionada representa el valor máximo de conductividad permitido, to-
mando en cuenta la limitación del método de medición y una razonable lixiviación (leaching) del envase. La elección de la
especificación y del volumen de muestreo se debe definir y validar de acuerdo con el propósito previsto del agua.

Procedimiento

Obtener una muestra que refleje de manera adecuada la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigorosamente el
envase para homogeneizar la muestra de agua. Se pueden requerir varios envases para recolectar suficiente agua para el análi-
sis.
Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatura,
si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 ± 1 º, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se obser-
va la conductividad de manera periódica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorción de dióxido
de carbono atmosférico) es menos de O, 1 µS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad.
Para envases con un volumen nominal de 1O mL o menos, si la conductividad no es mayor que 25 µS/cm, el agua cumple
con los requisitos. En envases con un volumen nominal mayor que 1O mL, si la conductividad no es mayor que 5 µS/cm, el
agua cumple con los requisitos.

(651) TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN

La temperatura a la cual una sustancia pasa del estado líquido al sólido cuando se enfría es un índice útil de su pureza si se
libera calor al producirse la solidificación, siempre que toda impureza presente se disuelva sólo en el líquido y no en el sólido.
Las sustancias puras tienen un punto de congelación bien definido, pero generalmente las mezclas se congelan a diferentes
temperaturas. Para muchas mezclas, la temperatura de solidificación, determinada siguiendo estrictamente los siguientes mé-
todos empíricos, es un índice útil de su pureza. El método para determinar las temperaturas de solidificación que se describe
en este documento se aplica a sustancias que funden entre -20º y 150º, que es el intervalo del termómetro usado en el baño.
La temperatura de solidificación es el punto máximo (o en caso de no existir un máximo, el punto de inflexión) en la curva de
temperatura-tiempo.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (651) Temperatura de Solidificación 395

Aparato-Ensamblar un aparato similar al ilustrado, donde el recipiente para la sustancia es un tubo de ensayo de 25 x 100
mm en el que se coloca un termómetro adecuado de intervalo corto, suspendido en el centro y un mezclador de alambre,
aproximadamente de 30 cm de largo, que se dobla en su extremo inferior en un anillo horizontal que rodea el termómetro.
Emplear un termómetro con un intervalo que no exceda de 30º, graduado en divisiones de O, 1ºy calibrado para una inmer-
sión a 76 mm pero no usado a esa profundidad. La serie ASTM El 89C a 96C es una serie disponible y adecuada de termóme-
tros, que abarcan un intervalo desde -20º hasta+ 150º. Se pueden usar otros aparatos para medir temperaturas siempre y
cuando estén validados para este procedimiento (ver Termómetros (21 )). Las dimensiones deben estar comprendidas entre±
20% con respecto a las que se muestran en la figura.

1,85
cm --- ----T
Nivel de llenado

5cm

-~~~-~;i;,,t
15cm

-3.?Scm 1,25cm 3,75 cm

3.75 cm

Aparato de Temperatura de Solidificación

El recipiente para la muestra se encuentra sostenido, mediante un corcho, dentro de un cilindro adecuado, impermeable al
agua, con un diámetro interno de aproximadamente 50 mm y 11 cm de longitud. A su vez, el cilindro se apoya en un baño
con una altura suficiente como para proporcionar una capa de no menos de 37 mm alrededor de los lados y del fondo del
cilindro. El baño externo tiene un termómetro apropiado.
Procedimiento-Fundir la sustancia, si es un sólido, a una temperatura que no exceda de 20º por encima del punto de
solidificación esperado y verterla en el tubo de ensayo hasta una altura de 50 mm a 57 mm. Armar el aparato con el bulbo del
termómetro del tubo de ensayo inmerso en un punto medio entre la parte superior e inferior de la muestra en el tubo de
ensayo. Llenar el baño hasta aproximadamente 12 mm desde la parte superior del tubo con un líquido apropiado a una tem-
peratura de 4º a 5° por debajo del punto de solidificación esperado.
En caso de que la sustancia sea un líquido a temperatura ambiente, llevar a cabo la determinación empleando un baño a
una temperatura de aproximadamente 15º por debajo del punto de solidificación esperado.
Cuando la muestra de prueba esté enfriada aproximadamente a 5º por encima del punto de solidificación esperado, ajustar
el baño a una temperatura de 7º a 8º por debajo del punto de congelación esperado. Revolver continuamente la muestra has-
ta terminar la prueba moviendo el agitador de alambre hacia arriba y hacia abajo entre la parte superior e inferior de la mues-
tra, a una velocidad constante de 20 ciclos completos por minuto.
Frecuentemente, la congelación puede inducirse frotando las paredes internas del tubo de ensayo con el termómetro, o in-
troduciendo un fragmento pequeño de la sustancia previamente solidificada. Un sobreenfriamiento pronunciado puede causar
 396 (651) Temperatura de Solidificación/ Pruebas Físicas USP 37

una desviación respecto del patrón normal de cambios de temperatura. Si esto último ocurre, repetir la prueba, introduciendo
partículas pequeñas del material en análisis en forma sólida a intervalos de 1 º a medida que la temperatura se acerca al punto
de solidificación esperado.
Registrar la lectura del termómetro del tubo de ensayo cada 30 segundos. Continuar revolviendo sólo mientras baje gradual-
mente la temperatura; dejar de revolver cuando la temperatura se vuelva constante o comience a subir levemente. Continuar
registrando la temperatura en el tubo de ensayo cada 30 segundos, al menos durante 3 minutos, después de que la tempera-
tura comience a caer nuevamente después de haber permanecido constante.
El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas comprendidas dentro de un intervalo de 0,2º constituye la tempe-
ratura de solidificación. Estas lecturas se encuentran cerca de un punto de inflexión o un máximo, en la curva de temperatura-
tiempo, que se produce después de que la temperatura se vuelva constante o comience a subir y antes de que empiece a bajar
nuevamente. El promedio de las lecturas con una aproximación de O, 1 º constituye la temperatura de solidificación.

(659) REQUISITOS DE ENVASES Y ALMACENAMIENTO

Todas las monografías USP y NF deben contar con requisitos de envasado y almacenamiento. Las opciones de los distintos
tipos de envase, para la porción de la leyenda referida a envasado, se consignan en este capítulo. Asimismo, se proporcionan
definiciones como pautas par.a la selección y adaptación de los requisitos de envasado de productos farmacéuticos. Para los
ingredientes farmacéuticos activos (API, por sus siglas en inglés), el envase de elección sería impermeable, bien cerrado o, si
fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volúmenes (cuyos en-
vases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado.
Cuando no se proporcionen instrucciones o limitaciones específicas en el etiquetado del artículo, los artículos deben prote-
gerse de la humedad, congelación y calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribución. Los
fármacos están exentos de dicha norma.

ENVASES

El envase no debe interaccionar física o químicamente con los artículos oficiales de modo que se ocasionen fallas en el cum-
plimiento de los requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza de dichos artículos. Este capítulo provee defi-
niciones para envases y almacenamiento.

DEFINICIONES GENERALES

Sistema de Envase (también referido como sistema de envase-cierre): Se refiere al conjunto de los componentes del envase
que contienen y protegen al artículo, e incluye los componentes del envase primario y los componentes del envase secundario,
si éste último se utilizara para ofrecer protección adicional.
Envase Primario: Receptáculo que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacéutico activo, excipiente o forma
farmacéutica, y que está en contacto directo con el artículo.
Componentes del Envase: Cualquier parte del envase o del sistema de envase-cierre, incluido el envase primario (p.ej., am-
pollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); el recubrimiento interno del envase primario (p.ej., recubrimiento interno en cartu-
cho tubular); el cierre (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos inter-
nos; puertos de administración; envolturas; accesorios de administración; y etiquetas.
Componentes Primarios de los Envases: Componentes de envases que están en contacto directo o que pueden entrar en
contacto directo con el artículo.
Componentes Secundarios de los Envases: Componentes de envases que no están y que no entrarán en contacto directo
con el artículo, pero que pueden proveer protección adicional.
Envase Terciario (embalaje): Componentes de envases que no están en contacto directo con el artículo pero que facilitan
su manipulación y transporte para evitar daños derivados de la manipulación física y de las condiciones de almacenamiento a
las que se somete el artículo.
Materiales de Construcción: Se refiere a los materiales (p.ej., vidrio, plástico, elastómeros, metal) usados para fabricar com-
ponentes de envases.
Envases Multidosis (o de dosis múltiple): Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artículo para
administración parenteral sin alterar la seguridad, contenido, calidad o pureza de la porción remanente. Ver Envases Multidosis
en Inyectables (1 ), Determinación del Volumen de Inyección en los Envases.
Envases de Unidades Múltiples: Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artículo sin alterar la
seguridad, contenido, calidad o pureza de la porción remanente.
Envases Unitarios: Sistemas de envases que contienen una cantidad de un artículo destinado para administración como do-
sis única o un dispositivo terminado individual destinado para un solo uso.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envases y Almacenamiento 397

Envases Monodosis (ver también Inyectables (l ), Envases para Inyecciones): Envases unitarios para un artículo destinado a su
administración parenteral. Entre los ejemplos de envases monodosis se incluyen jeringas prellenadas, cartuchos, envases sella-
dos por fusión y envases con cierres sellados cuando se los etiqueta como tales.
Envases de Dosis Única: Sistemas de envases unitarios para un artículo destinado a su administración como dosis única por
una vía que no sea parenteral.
Envases de Unidad de Uso: Sistemas de envases que contienen una cantidad específica de un artículo que está destinado a
dispensarse como tal, sin ninguna modificación posterior excepto por la adición de un etiquetado adecuado. El envase de Uni-
dad de Uso no se puede reenvasar para su venta.
Envases a Granel Para Farmacias: Envases de una preparación estéril para uso parenteral que contienen muchas monodosis.
El contenido está destinado para su uso en programas de preparación de mezclas en farmacias y está restringido a la prepara-
ción de mezclas para infusión o al llenado de jeringas estériles vacías con un dispositivo de transferencia estéril.
Luego de la reconstitución, su cierre debe ser perforado sólo una vez usando un dispositivo de transferencia estéril o equipo
dispensador que permita la dosificación medida del contenido. El Envase a Granel Para Farmacias sólo se empleará en un área
de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar (o un área equivalente de aire limpio para preparación ma-
gistral).
La nomenclatura Envase a Granel Para Farmacias se limita a Inyecciones, artículos para Inyección o Emulsiones Inyectables se-
gún se define en Inyectables (1 ), Nomenclatura.
Los Envases a Granel Para Farmacias, aunque contengan más de una monodosis, están exentos del límite de volumen de
30 mL para envases multidosis, y del requisito de contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para prevenir el
crecimiento de microorganismos. Cuando un envase se ofrece como Envase a Granel Para Farmacias, la etiqueta debe (a) indi-
car explícitamente "Envase a Granel para Farmacias-No usar para infusión directa", (b) contener o hacer referencia a informa-
ción sobre técnicas apropiadas para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una declaración que limite el
tiempo en el que el envase se puede usar una vez perforado el cierre, siempre que su contenido se haya mantenido en las
condiciones de almacenamiento declaradas.
Inyecciones de Pequeño Volumen: Inyección monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que
declaran contener 100 mL o menos.
Inyecciones de Gran Volumen: Inyección monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que decla-
ran contener más de 100 ml.
Envases Seguros para Niños: Sistemas de envases diseñados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Pro-
duct Safety Commission (Comisión de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de
niños (16 CFR § 1 700.20).
Envases Adecuados para la Tercera Edad: Sistemas de envases diseñados o construidos para cumplir con las normas de la
Consumer Product Safety Commission (Comisión de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases
por parte de personas de edad avanzada (16 CFR § 1700.20).
Envases Que Evidencian su Alteración Intencional: Sistemas de envases que no pueden ser abiertos sin la destrucción evi-
dente del sello o de alguna otra parte del sistema de envase.
Envases Impermeables: Sistemas de envases que protegen a los artículos de la contaminación por líquidos, sólidos o vapores
extraños; de la pérdida del artículo; y de eflorescencia, delicuescencia o evaporación en condiciones habituales o acostumbra-
das de manejo, transporte, almacenamiento y distribución. Ver Envases-Pruebas de Desempeño (671 ).
Envases Bien Cerrados: Sistemas de envases que protegen a los artículos de la contaminación por sólidos y líquidos extraños
y de la pérdida del artículo en condiciones habituales o acostumbradas de manejo, transporte, almacenamiento y distribución.
Ver Envases-Pruebas de Desempeño (671 ).
Envases Resistentes a la Luz: Sistemas de envases que protegen el contenido de los efectos de la luz por medio de las pro-
piedades específicas del material que los compone, incluyendo los recubrimientos aplicados sobre los mismos. Un envase
translúcido o incoloro y transparente puede convertirse en un envase resistente a la luz mediante una cubierta exterior opaca o
mediante un envase secundario, en cuyo caso la etiqueta del envase debe indicar que es imprescindible el uso de la cubierta
opaca o que se requiere el envase secundario hasta que el artículo se haya usado o administrado. Ver Envases-Pruebas de
Desempeño (671 ), Prueba de Transmisión de Luz.

ENVASES PARA GASES MEDICINALES

Cilindro de Gas: Un cilindro de gas es un sistema de envase metálico construido de acero o aluminio diseñado para conte-
ner gases medicinales a presión. Los gases medicinales incluyen Dióxido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, Óxi-
do Nítrico, Óxido Nitroso USP, Nitrógeno NF y Oxígeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Segu-
ridad de encaje pareado "Pin-lndex" para dióxido de carbono, ciclopropano, helio, aire medicinal, óxido nitroso y oxígeno en
cilindros de Tamaño E o menor.

COMPONENTES RELACIONADOS

Muchos componentes relacionados se gradúan para administración en dosis determinadas. Es responsabilidad del fabricante
garantizar que se provea el componente de dosificación apropiado o que se especifique un componente para propósitos gene-
 398 (659) Requisitos de Envases y Almacenamiento / Pruebas Físicas USP 37

rales, como los descritos en esta sección, para la administración de la dosis apropiada con la exactitud prevista. Las graduacio-
nes deben ser visibles e indelebles.
Los componentes graduados que se dt::uiben en esta sección son de u~o general. Las marcas de graduación deben ser legi-
bles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga contacto con la boca o producto. En condiciones ideales de
uso, el error de volumen en el que se incurre al medir líquidos para la administración de dosis individuales por medio de dichos
componentes graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparación líquida con la que se usará el
componente graduado. Pocas preparaciones líquidas comparten las mismas características superficiales y de flujo. Por tanto, el
volumen administrado varía considerablemente de una preparación a otra.
Los polímeros e ingredientes agregados a los polímeros que se usan en la fabricación de componentes relacionados deben
cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Code of Federal Regulations (Código de Reglamentos Federales), Títu-
lo 21, lndirect Food Additives (Aditivos Alimentarios Indirectos).
Dosificadores: Dispositivo de medición que consiste en un pequeño vaso que se incluye en el envase de los artículos líquidos
orales o que se puede vender o comprar por separado.
Cuchara dosificadora: Dispositivo de med1C1on que consiste en una parte cóncava con un mango que se incluye en el enva-
se de los artículos líquidos orales o que se puede vender o comprar por separado. El mango puede ser un tubo graduado.
Gotero para Medicamentos: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translúcido que ge-
neralmente está equipado con un bulbo depresible. Se incluye en el envase de artículos líquidos orales o se puede vender o
comprar por separado.
Aunque la capacidad de los goteros generalmente varía, el extremo de descarga debe ser una abertura redonda con un diá-
metro externo de aproximadamente 3 mm. El cuerpo puede estar graduado. [NOTA-Pocos líquidos medicinales comparten
las mismas características superficiales y de flujo que el agua, por lo que el tamaño de las gotas varía considerablemente de
una preparación a otra.]
Jeringa para Administración Oral: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo y un émbolo fabricados con material
de plástico rígido y transparente o translúcido y que tiene un sello en el extremo. Se incluye en el envase de artículos líquidos
orales o se puede vender o comprar por separado. La jeringa debe expulsar una cantidad medida del artículo líquido directa-
mente en la boca del paciente. Las alas para los dedos ubicadas en el extremo abierto del cuerpo deben tener un tamaño,
forma y resistencia apropiados y deben permitir que la jeringa se pueda sostener de manera segura durante el uso. El cuerpo
puede estar graduado.
Cucharita de Té: Dispositivo de medición que consiste en una parte cóncava poco profunda, de forma ovalada o redonda,
que se encuentra al final de un mango. Se ha establecido que una cucharadita de té contiene 4,93 ± 0,24 ml. Para la adminis-
tración de artículos, se puede considerar que la cucharadita de té representa 5 mL.
Los artículos destinados para administración mediante cucharita de té se deben formular tomando en cuenta una dosifica-
ción en unidades de 5 mL, por lo que, siempre que se indique una calibración basada en una cucharadita de té, el componen-
te usado para administrar artículos líquidos deberá liberar 5 ml. Una cuchara disponible en el hogar no es una alternativa
aceptable a la cucharita de té graduada descrita en este capítulo.

POISON PREVENTION PACKAGING ACT (Ley de Envases para Prevenir Envenenamientos o

PPPA)

Esta ley exige el uso de envases especiales para la mayoría de los medicamentos de administración por vía oral para huma-
nos de venta bajo receta, medicamentos de administración por vía oral controlados, algunos medicamentos de administración
por vía oral de venta sin receta médica, algunos suplementos dietéticos y para muchas preparaciones farmacéuticas de venta
libre para proteger al público de lesiones o enfermedades causadas por el uso i'ncorrecto de estas preparaciones (16 CFR
§1700.14).
El envase primario para sustancias reglamentadas por la PPPA debe cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR
§1700.15 y 16 CFR §1700.16, las cuales rigen para todos los tipos de envases, incluidos los que pueden volver a cerrarse, los
que no se cierran y los de dosis única.
No se requieren envases especiales para los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Los
fabricantes o envasadores de medicamentos a granel de venta bajo receta no necesitan usar envases especiales si el medica-
mento ha de ser reenvasado por el farmacéutico. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la PPPA se pue-
den dispensar en envases inseguros para niños si el comprador lo solicita o si la receta original así lo indica (15 U.S.C. §1473).
Los fabricantes o envasadores de medicamentos de venta libre reglamentados por la PPPA están autorizados a envasar un
tamaño de producto en envases inseguros para niños siempre que provean el tamaño de venta habitual en envases especiales.
Los envases inseguros para niños requieren un etiquetado especial (16 CFR §1700.5).

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO

En algunas monografías se establecen instrucciones específicas con respecto a las condiciones de almacenamiento, p.ej., la
temperatura o humedad, a las que se debe almacenar y transportar el artículo. Estas condiciones aplican excepto cuando la
etiqueta del artículo indique condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estabilidad. Cuando no se
proporcionan condiciones de almacenamiento específicas en la monografía individual, pero la etiqueta de un artículo establece
 USP 37 Pruebas Físicas/ \660) Envases-Vidrio 399

condiciones de almacenamiento basadas en estudios de estabilidad, tales instrucciones de almacenamiento son las que se de-
ben aplicar. Las condiciones de almacenamiento vigentes para artículos se definen de acuerdo con los siguientes términos.
Congelador: Es u11 lugar co11 u11a temperatura mantenida entre -25" y -1 Oº (-1 3'' y 14 ''F).
Refrigerador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre 2° y 8' (36º y 46 ºF).
Frío: Toda temperatura que no exceda de 8" (46 ºF).
Fresco: Toda temperatura entre 8º y 15º (46º y 59 ''F). [NOTA-Cuando se indique que un artículo debe conservarse en un
lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, en un refrigerador, a menos que se especifique algo dife-
rente en la monografía individual.]
Temperatura Ambiente: La temperatura predominante en un área de trabajo.
Temperatura Ambiente Controlada: La temperatura mantenida entre 20º y 25º (68º y 77 ºF) prevalente en el ambiente
usual de trabajo. También se deben cumplir las siguientes condiciones:
La temperatura cinética media no debe exceder de 25º. La temperatura cinética media es un valor calculado que correspon-
de a la temperatura isotérmica que simula los efectos no isotérmicos de las variaciones de temperatura de almacenamiento.
Se permiten desviaciones entre 15c y 30 (59' y 86 ·~)experimentadas en farmacias, hospitales y depósitos y durante el
transporte, siempre que la temperatura cinética media no exceda de 25º.
Se permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a 40º siempre que no duren más de 24 horas. Sólo se per-
miten elevaciones superiores a 40º cuando el fabricante así lo instruye.
Los artículos pueden etiquetar para almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o "hasta 25º", u otra referencia
escrita con base en la misma temperatura cinética media.
Un artículo para el que se indique almacenamiento a Temperatura Ambiente Controlada alternativamente puede almacenarse
o distribuirse en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual o en la
etiqueta.
Cálido: Toda temperatura entre 30º y 40º (86º y 104 ºF).
Calor Excesivo: Toda temperatura por encima de 40º
(104 ºF).
Lugar Seco: El término "lugar seco" se refiere a un sitio con una humedad relativa promedio que no exceda de 40% a 20º
(68 ºF) o de la presión de vapor de agua equivalente a otras temperaturas. La determinación puede hacerse por medición di-
recta en el lugar o basándose en información de las condiciones climáticas. La determinación se basa en por lo menos 12 me-
diciones espaciadas equitativamente y realizadas ya sea durante una estación del año, durante un año, o si los registros los
demostrasen, durante el periodo de almacenamiento del artículo. Puede haber valores de hasta 45% de humedad relativa
siempre que el promedio no exceda de 40%. Se considera almacenamiento en un lugar seco al almacenamiento de un envase
que haya sido validado para proteger al artículo del vapor húmedo, incluyendo el almacenamiento a granel.
Protección contra la congelación: Cuando además del riesgo de rotura del envase, la congelación de un artículo pueda
ocasionar la pérdida de contenido o potencia, o la alteración destructiva de sus características, la etiqueta del envase indica las
instrucciones apropiadas para proteger al artículo contra la congelación.
Protección contra la Luz: Cuando la luz pueda ocasionar la pérdida de contenido o potencia de un artículo, o la alteración
destructiva de sus características, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artículo de la luz.

(660) ENVASES-VIDRIO

DESCRIPCIÓN
Los envases de vidrio para uso farmacéutico están destinados para entrar en contacto directo con los productos farmacéuti-
cos. El vidrio usado para los envases farmacéuticos es de borosilicato (neutro) o de cal sodada y sílice. El vidrio de borosilicato
contiene cantidades significativas de óxido bórico, óxido de aluminio y óxidos alcalinos y/o alcalino térreos. Debido a su com-
posición química, el vidrio de borosilicato presenta una alta resistencia hidrolítica y una alta resistencia al impacto térmico; está
clasificado como vidrio Tipo l. El vidrio de cal sodada y sílice es un vidrio de sílice que contiene óxidos de metales alcalinos,
principalmente óxido de sodio, y óxidos alcalino térreos, principalmente óxido de calcio. Debido a su composición química, el
vidrio de cal sodada y sílice presenta una resistencia hidrolítica moderada; está clasificado como vidrio Tipo 111. El tratamiento
adecuado de la superficie interna de los envases de vidrio de cal sodada y sílice Tipo 111 aumentará su resistencia hidrolítica de
un grado moderado a alto, cambiando así la clasificación del vidrio a Tipo 11.
A continuación, se presentan recomendaciones con respecto a la aptitud del tipo de vidrio para envases de productos farma-
céuticos, basadas en las pruebas de resistencia hidrolítica. Los envases de vidrio Tipo 1 son adecuados para la mayoría de los
productos para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 son adecuados para la mayoría de los productos
acuosos ácidos y neutros para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 se pueden usar para productos pa-
renterales alcalinos siempre que se demuestre su aptitud mediante datos de estabilidad. Los envases de vidrio Tipo 111 por lo
general no se usan para productos parenterales ni para polvos para uso parenteral, excepto cuando se cuenta con datos de
pruebas de estabilidad que indican que el vidrio Tipo 111 es satisfactorio.
 •
400 (660) Envases-Vidrio / Pruebas Físicas USP 37

Se puede tratar la superficie interna de los envases de vidrio para mejorar su resistencia hidrolítica. Asimismo, se puede tratar
la superficie externa de los envases de vidrio para reducir la fricción o para proteger de la abrasión o rotura. El tratamiento de
la superficie externa se realiza de manera que no contamine la superficie interna del envase.
El vidrio se puede colorear para que ofrezca protección de la luz mediante la adición de pequeñas cantidades de óxidos de
metales y se analiza según se indica en Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado. Un envase transparente e incolo-
ro que se convierte en un envase resistente a la luz mediante una envoltura opaca (ver Envases Resistentes a la Luz en Requisitos
de Envases y Almacenamiento (659)) está exento de los requisitos de transmisión espectral. Los envases para productos parente-
rales acuosos se analizan para comprobar la liberación de arsénico.

PRUEBAS ESPECÍFICAS

La Prueba de Vidrio Granulado en combinación con la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidrolítica determina el tipo
de vidrio. La resistencia hidrolítica se determina por la cantidad de álcali que libera el vidrio en las condiciones especificadas.
Dicha cantidad de álcali es extremadamente pequeña en el caso de los vidrios más resistentes, por lo que es muy importante
prestar la debida atención a todos los detalles de la prueba y utilizar aparatos de alta calidad y precisión. Estas pruebas deben
realizarse en un área relativamente exenta de humos y polvo excesivo. La selección de la prueba se presenta en la Tabla 7 y la
Tabla 2.
Tabla 1. Determinación de Tipos de Vidrio
Tipo de Envase Prueba Propósito
Distingue el vidrio de borosilicato
Prueba de Vidrio Tipo 1del vidrio de cal saciada y sílice
1, 11, 111 Granulado Tipos 11y111

La superficie interna de los envases de vidrio es la superficie de contacto para las preparaciones farmacéuticas, y la calidad de
esta superficie se determina mediante la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidrolítica. La Prueba de Atacado de Superfi-
cie se puede usar para determinar si la resistencia hidrolítica se debe a la composición química o al tratamiento de la superficie.
Como alternativa, la comparación de los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial se puede usar
en la Tabla 2.
Tabla 2. Determinación de la Resistencia Hidrolítica de la Superficie Interna
Tipo de Envase Prueba Propósito
Determina la resistencia hidrolítica de la superfi-
cie interna.
Distingue entre envases Tipo I y Tipo 11 con alta
Prueba de Vidrio resistencia hidrolítica y envases Tipo 111 con re-
1, 11, 111 Superficial sistencia hidrolítica moderada
Prueba de Atacado de Superficie Cuando resulte necesario determinar si la alta
o comparación de los datos de la resistencia hidrolítica se debe al tratamiento de
Prueba de Vidrio Granulado la superficie interna o a la composición quími-
1, 11 y la Prueba de Vidrio Superficial ca de los envases de vidrio.

Los envases de vidrio deben cumplir con sus especificaciones respectivas de identidad y resistencia hidrolítica superficial para
que sean clasificados como vidrio Tipo 1, 11 o 111. Los envases Tipo 1 o Tipo 11 para productos parenterales acuosos se analizan
para determinar la presencia de arsénico extraíble.

Resistencia Hidrolítica

Aparato
Autoclave-Para estas pruebas, usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 ± 1 º, equipado con un termó-
metro, un manómetro, una válvula de ventilación y una bandeja con suficiente capacidad para acomodar el número de enva-
ses requeridos para llevar a cabo la prueba sobre el nivel del agua. Limpiar el autoclave y demás aparatos minuciosamente con
Agua Purificada antes de usar.
Mortero y Mano de Mortero-Usar un mortero y una mano de mortero de acero endurecido, construidos de acuerdo con las
especificaciones de la Figura 7.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 401

40

</>48
</>50

35
60

</>15

Figura 1. Mortero y mano de mortero para pulverizar vidrio.

Otros Aparatos-También se requiere un juego de tres tamices enmarcados, de malla cuadrangular de acero inoxidable Nº
25, 40 y 50, según la numeración de los EE.UU. (ver Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico
(786), Tabla 1. Tamaños de las Series de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés); un martillo magnético de acero templa-
do; un imán permanente; frascos de pesada; tapones; lámina metálica (p.ej. aluminio, acero inoxidable); un horno de aire ca-
liente con capacidad de mantener 140 ± 5°; una balanza capaz de pesar hasta 500 g con una exactitud de 0,005 g; un deseca-
dor y un baño ultrasónico.
Reactivos
Agua Exenta de Dióxido de Carbono-Se trata de Agua Purificada que se ha calentado a ebullición vigorosa durante 5 minu-
tos o más y se ha dejado enfriar protegiéndola de la absorción de dióxido de carbono de la atmósfera, o Agua Purificada con
una resistividad no menor de 18 Mohm-cm.
Solución de Rojo de Metilo-Disolver 50 mg de rojo de metilo en 1,86 mL de hidróxido de sodio O, 1 M y 50 mL de etanol
(96%), y diluir con Agua Purificada hasta 100 ml. Para analizar la sensibilidad, agregar 100 mL de agua exenta de dióxido de
carbono y 0,05 mL de ácido clorhídrico 0,02 M a O, 1 mL de la solución de rojo de metilo. La solución resultante debe ser roja.
No se requieren más de O, 1 mL de hidróxido de sodio 0,02 M para cambiar el color a amarillo. El cambio de color de rojo a
amarillo corresponde a un cambio en el pH de 4,4 (rojo) a 6,0 (amarillo).

PRUEBA DE VIDRIO GRANULADO

La Prueba de Vidrio Granulado se puede realizar sobre los envases o sobre las cañas que se usan para fabricar envases tubula-
res de vidrio.
Preparación de la Muestra: Enjuagar los envases a analizar con Agua Purificada y secar en el horno. Envolver al menos tres
de los artículos de vidrio en papel limpio y triturar para obtener dos muestras de aproximadamente 100 g cada una en trozos
con un tamaño no mayor de 30 mm. Colocar en el mortero 30-40 g de las piezas con un tamaño de entre 1O y 30 mm toma-
das de una de las muestras, insertar la mano del mortero y golpearla firmemente con el martillo una sola vez. Alternativamen-
te, transferir las muestras a un molino de bolas, agregar las bolas y triturar el vidrio. Transferir el contenido del mortero o del
molino de bolas al tamiz más grueso (Nº 25) de los tamices. Repetir la operación hasta que todos los fragmentos hayan sido
transferidos al tamiz. Agitar manualmente los tamices durante un periodo breve y retirar el vidrio remanente en los tamices Nº
25 y Nº 40. Triturar de nuevo estas porciones, repitiendo la operación hasta que queden aproximadamente 1O g de vidrio en
el tamiz Nº 25. Descartar esta porción y la porción que pase a través del tamiz Nº 50. Volver a encajar los tamices y agitar
durante 5 minutos. Transferir a un frasco de pesada los granos de vidrio que pasaron a través del tamiz Nº 40 y que quedaron
retenidos en el tamiz Nº 50. Repetir el procedimiento de triturado y tamizado con la segunda muestra de vidrio hasta obtener
dos muestras de granos, cada una con un peso mayor a 1O g.
Extender cada muestra sobre una pieza de papel satinado limpio y extraer las partículas de hierro pasándo el imán
sobre ellas. Transferir cada muestra a un vaso de precipitados para limpiarlas. Agregar 30 mL de acetona a los granos en cada
vaso de precipitados y agitar los granos usando medios adecuados, como por ejemplo, una varilla de vidrio con punta de go-
ma o recubierta de plástico. Después de agitar los granos, dejar que sedimenten y decantar la mayor cantidad de acetona po-
sible. Agregar 30 mL adicionales de acetona, agitar por rotación suave, decantar y agregar una nueva porción de acetona. Lle-
nar el recipiente del baño ultrasónico con agua a temperatura ambiente, luego colocar el vaso de precipitados en la gradilla y
 402 (660) Envases--Vidrio / Pruebas Físicas USP 37

sumergirlo hasta que el 11ivel de aceto11a esté al mismo nivel que el agua; aplicar ultrasonido durante 1 minuto. Agitar por
rotación suave el vaso de precipitados, dejar que sedimente y decantar la mayor cantidad de acetona posible; luego repetir la
opcrJción de !imµicLJ ultrJ~ÓnicJ. Si persiste ur;J leve tu¡·b¡dez, repetií lJ iin1pieza ultrasónica y el lavado con acetona hasta
que la solución se mantenga tr,H1sparente. Agitar por rotación suave y decantar la acetona. Secar los granos colocando el vaso
de precipitados primero sobre una placa tibia y luego calentando a 140º durante 20 minutos en un horno de secado. Transfe-
rir los granos secm de cada vaso de precipitados a se11dos frascos de pesadd, insertar los tapones y enfriar en un desecador.
Método
Llenado y Calentamiento-Pesar 10,00 g de los granos limpios y secos en dos matraces Erlenmeyer diferentes. Pipetear y
transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono a cada uno de los matraces Erlenmeyer (soluciones de prue-
ba). Pipetear y transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono a un tercer matraz Erlenmeyer que servirá
como blanco. Distribuir los granos de manera uniforme sobre las bases planas de los matraces agitando suavemente. Cubrir los
matraces con una tapd de vidrio neutro o papel aluminio enjuagados con Agua Purificada o con vasos de precipitados inverti-
dos de modo tal que las superficies internas de los vasos de precipitados se ajusten perfectamente a los bordes superiores de
lm ;11cJLrclce,. 1._uiuccJr 10:, ue' 111dlrdces en el dL1loc1ave que contiene el agua a temperatura ambiente y asegurarse que se man-
tengan sujetos por encima del niwl del agua en el vaso. Realizar las siguientes operaciones:
1. Calentar el autoclave a 1OW y dejar que el vil por salga por la válvula de ventilación durante 1 O minutos.
2. Cerrar la válvula de ventilación y aumentar la temperatura de 100º a 121 ºa una velocidad de 1º por minuto.
3. Mantener la temperatura a 121 ± 1 ºdurante 30 ± 1 minutos.
4. Reducir la temperatura de 121 ºa 100º a una velocidad de 0,5º por minuto, ventilando para evitar la formación de vacío.
5. No abrir el autoclave antes de que se haya enfriado a 95º. Retirar el contenido del autoclave, tomando las precauciones
necesdrias, y enfriar los matraces en una corriente de agua.
Valoración-Agregar a cada uno de los 3 matraces 0,05 mL de Solución de Rojo de Metilo. Valorar la solución blanco inmedia-
tamente con ácido clorhídrico 0,02 M, luego valorar las soluciones de prueba hasta que el color sea idéntico al obtenido con la
solución blanco. Restar el volumen de valoración para la solución blanco del volumen de valoración de las soluciones de prue-
ba. Calcular el valor medio de los resultados en mL de ácido clorhídrico 0,02 M por gramo de la muestra. Repetir la prueba si
los valores más altos y más bajos observados difieren en más de 20%.
NOTA-Cuando se necesite obtener un punto final bien definido, decantar la solución transparente en un matraz diferente
de 250 mL. Enjuagar los granos agitando por rotación suave con tres porciones de 15 mL de Agua Exenta de Dióxido de Car-
bono y agregar los lavados a la solución principal. Agregar 0,05 mL de la Solución de Rojo de Metilo. Valorar y calcular según se
indicó anteriormente. En este caso, agregar también 45 mL de Agua Purificada y 0,05 mL de Solución de Rojo de Metilo a la
solución blanco.
Límites: El volumen no excede los valores indicados en la Tabla 3.
Tabla 3. Límites de Prueba para la Prueba de Vidrio Granulado
Volumen Máximo de
HCI 0,02 M por g de Vidrio de Prueba (ml)
Volumen de
Llenado Tipos 11
(ml)
Todos t Tipo 1
0,1
y 111
0,85

PRUEBA DE VIDRIO SUPERFICIAL

Determinación del Volumen de Llenado: El volumen de llenado es el volumen de Agua Purificada que se debe agregar al
envase para los fines de esta prueba. Para viales, frascos, cartuchos y jeringas, el volumen de llenado es 90% de la capacidad
de desbordamiento. Para ampollas, se refiere al volumen hasta la altura del hombro.
Viales y Frascos-Seleccionar seis viales o frascos secos del lote de muestra, o tres si su capacidad excede 100 mL, y eliminar
toda suciedad o residuo. Pesar los envases vacíos con una exactitud de O, 1 g. Colocar los envases sobre una superficie horizon-
tal y llenarlos con Agua Purificada aproximadamente hasta el borde, evitando el desbordamiento y la introducción de burbujas
de aire. Ajustar los niveles de líquido hasta la línea de desbordamiento. Pesar los envases llenos para obtener la masa de agua
expresada con 2 decimales para envases con un volumen nominal menor o igual a 30 mL; y expresada con 1 decimal para
envases con un volumen nominal mayor de 30 ml. Calcular el valor medio de la capacidad de desbordamiento en mL y multi-
plicarlo por O, 9. Este volumen, expresado con 1 decimal, es el volumen de llenado para el lote de envases particular.
Cartuchos y jeringas-Seleccionar seis jeringas o cartuchos secos y sellar la pequeña abertura (la boca de los cartuchos; el
cierre Luer o la aguja insertada de las jeringas), usando un material inerte. Determinar la capacidad de desbordamiento media
y el volumen de llenado de acuerdo con la sección Viales y Frascos.
Ampollas--Colocar al menos seis ampollas secas sobre una superficie horizontal plana y llenarlas con Agua Purificada usando
una bu reta hasta que el agua alcance el punto A, donde el cuerpo de la ampolla comienza a estrecharse para formar el hom-
bro de la ampolla (ver la Figura 2). Leer las capacidades, expresadas con 2 decimales y calcular el valor medio. Este volumen,
expresado con 1 decimal, es el volumen de llenado para el lote de ampollas particular. El volumen de llenado se puede deter-
minar también por peso.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 403

íl
A

Figura 2. Volúmenes de llenado de ampollas hasta el punto A.

Prueba: La determinación se lleva a cabo en envases sin usar. Los volúmenes del líquido de prueba requeridos para la deter-
minación final se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4. Volumen de Líquido de Prueba y
Número de Valoraciones
Volumen de
Líquido de
Prueba Número
Volumen de para Una de
Llenado (ml) Valoración (ml) Valoraciones
Hasta 3 25,0 1
Más de 3 y hasta 30 50,0 2
Más de 30 y hasta 100 100,0 2
Más de 100 100,0 3

Método
Limpieza-Eliminar cualquier residuo o polvo. Poco antes de la prueba, enjuagar cada envase cuidadosamente al menos dos
veces con Agua Purificada y dejar en reposo. Inmediatamente antes del análisis, vaciar los envases; enjuagarlos una vez con
Agua Purificada, luego con agua exenta de dióxido de carbono y dejar que escurran. El procedimiento de limpieza se debe
completar desde el momento del primer enjuage en no menos de 20 minutos y no más de 25 minutos. Calentar las ampollas
cerradas en un baño de agua o en una estufa de aire a aproximadamente 50º durante aproximadamente 2 minutos antes de
abrir. No enjuagar antes de analizar.
Llenado y Calentamiento-Llenar los envases con agua exenta de dióxido de carbono hasta el volumen de llenado. Cerrar los
envases en forma de cartucho o jeringas prellenables de manera adecuada con material que no interfiera con la prueba. Se
debe cerrar holgadamente cada envase, incluidas las ampollas, con un material inerte, como por ejemplo, una tapa de vidrio
neutro o papel aluminio previamente enjuagados con Agua Purificada. Colocar los envases en la bandeja del autoclave, el cual
contiene una cantidad de agua tal que la bandeja permanece por encima d~I agua. Cerrar el autoclave y llevar a cabo el proce-
dimiento de esterilización en el autoclave según se indica en la Prueba de Vidrio Granulado, excepto que se debe mantener la
temperatura a 121 ± 1 º durante 60 ± 1 minutos. Retirar los envases del autoclave tomando las precauciones necesarias, colocar-
los en un baño de agua a 80º y hacer que corra agua fría en el baño de agua, procurando que el agua no entre en contacto
con las cubiertas de aluminio sueltas para evitar la contaminación de la solución de extracción. El tiempo de enfriamiento no
excede de 30 minutos. Las soluciones de extracción se analizan valorando de acuerdo con el método descrito a continuación.
Valoración-Llevar a cabo la valoración dentro de la primera hora después de retirar los envases del autoclave. Combinar los
líquidos obtenidos de los envases y mezclar. Introducir el volumen prescrito (ver la Tabla 4) en un matraz Erlenmeyer. Transfe-
rir el mismo volumen de agua exenta de dióxido de carbono a un segundo matraz similar para usarlo como blanco. Agregar a
cada matraz 0,05 mL de Solución de Rojo de Metilo por cada 25 mL de líquido. Valorar el blanco con ácido clorhídrico 0,01 M.
Valorar el líquido de prueba con el mismo ácido hasta que el color de la solución resultante sea igual que el obtenido para el
blanco. Restar el valor encontrado para la valoración con el blanco, del encontrado para el líquido de prueba y expresar los
resultados en mL de ácido clorhídrico 0,01 M por 100 mL de líquido de prueba. Expresar los valores de la valoración menores
de 1,0 mL con dos decimales; expresar los valores de la valoración mayores o iguales a 1,0 mL con un decimal.
Límites: Los resultados, o el promedio de los resultados si se realiza más de una valoración, no exceden los valores declarados
en la Tabla 5.
404 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Físicas USP 37

¡------- Tabla 5. Límites para la Prueba de Vidrio Superficial

Volumen Máximo
de HCI O 01 M
por 100 ml de
-·---·--
Líquido de Prueba (ml)
Volumen de llenado Tipos 1
(ml) y 11 Tipo 111
Hasta 1 2,0 20,0
Más de 1 y hasta 2 1,8 17,6
Más de 2 y hasta 5 1,3 13,2
Más de 5 y hasta 1 O 1,0 10,2
__ _l'v'lás de 1 O y hasta 20 0,80 8,1
Más ~e ~Q y hasta 50 - - - ---------··
0,60 6, 1
Más de 50 y hasta 1 OQ 0,50 4,8
~ás de 100 y hasta 200 0,40 3,8
Más de 200 y hasta 500 0,30 2,9
Más de 500 0,20 2,2

PRUEBA DE ATACADO DE SUPERFICIE

La Prueba de Atacado de Superficie se usa de manera adicional a la Prueba de Vidrio Superficial cuando es necesario determinar
si se ha tratado la superficie de un envase y/o para distinguir entre envases de vidrio Tipo 1yTipo11. Alternativamente, se pue-
de usar la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial. La Prueba de Atacado de Superficie puede realizarse con
muestras sin usar o con muestras usadas en la Prueba de Vidrio Superficial.
Método
Viales y Frascos-Los volúmenes de líquido de prueba requeridos se presentan en la Tabla 4. Enjuagar los envases dos veces
con Agua Purificada, llenar hasta el punto de desbordamiento con una mezcla de 1 volumen de ácido fluorhídrico y 9 volúme-
nes de ácido clorhídrico, y dejar en reposo durante 1 O minutos. Vaciar los envases y enjuagar cuidadosamente cinco veces con
Agua Purificada. Inmediatamente antes de la prueba, enjuagar una vez más con Agua Purificada. Someter estos envases al mis-
mo procedimiento de esterilización en autoclave y determinación según se indica en la Prueba de Vidrio Superficial. Si los resul-
tados son considerablemente más altos que los obtenidos de las superficies originales (por un factor de aproximadamente 5 a
1 O), significa que la superficie de las muestras ha sido tratada. [Precaución-El ácido fluorhídrico es extremadamente agresivo.
Incluso en cantidades pequeñas puede ocasionar lesiones que ponen en riesgo la vida.]
Ampollas, Cartuchos y jeringas-Aplicar el método de prueba según se indica en Viales y Frascos. Si la superficie de las ampo-
llas, cartuchos y jeringas no ha sido tratada, entonces los valores obtenidos serán ligeramente más bajos que los obtenidos en
las pruebas previas. [NOTA-La superficie interna de las ampollas, cartuchos y jeringas fabricadas con tubos de vidrio Tipo 1
normalmente no se somete a tratamiento.]
Distinción entre Envases de Vidrio Tipo 1 y Tipo 11: Los resultados obtenidos de la Prueba de Atacado de Superficie se com-
paran con los obtenidos de la Prueba de Vidrio Superficial. Para envases de vidrio Tipo 1, los valores obtenidos son cercanos a los
obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial. Para envases de vidrio Tipo 11, los valores obtenidos exceden en gran medida a los
obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial; y son similares, pero no mayores, a los obtenidos para envases de vidrio Tipo 111 con
el mismo volumen de llenado.

IMPUREZAS

Arsénico (211)
Usar como Preparación de Prueba 35 mL de agua de un envase de vidrio Tipo 1 o de uno Tipo 11, o, para envases más peque-
ños, 35 mL del contenido combinado de varios envases de vidrio Tipo 1 o Tipo 11, preparados según se indica en la Prueba de
Vidrio Superficial. El límite no excede de O, 1 µg por g.

FUNCIONALIDAD

Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado

Aparato: Un espectrofotómetro UV-Vis, equipado con un detector de fotodiodos o un tubo fotomultiplicador acoplado con
una esfera de integración.
Preparación de la Muestra: Romper el envase de vidrio o cortarlo con una sierra circular equipada con un disco abrasivo en
húmedo, como por ejemplo, un disco de carborundo o diamante. Seleccionar las secciones representativas del espesor de la
USP 37 Pruebas Físicas / <661) Envases-Plásticos 405

pared y cortarlas de un tamaño adecuado para montarlas en un espectrofotómetro. Después de cortar, lavar y secar cada
muestra, procurando no rayar las superficies. Si la muestra es demasiado pequeña para cubrir la abertura del portamuestras,
cubrir la porción descubierta de la abertura con papel o cinta opaca, tomando en cuenta que la longitud de la muestra debe
ser mayor que la de la abertura. Antes de colocar en el portamuestras, lavar, secar y limpiar la muestra con un paño para len-
tes. Montar la muestra con ayuda de cera u otros medios adecuados, procurando no dejar huellas dactilares u otras marcas.
Método: Colocar la muestra en el espectrofotómetro con su eje cilíndrico en paralelo a la abertura y de tal manera que el haz
de luz sea perpendicular a la superficie de la sección y que las pérdidas por reflexión sean mínimas. Medir la transmisión de la
muestra con respecto al aire en la región espectral de 290-450 nm, de manera continua o en intervalos de 20 nm.
Límites: La transmisión espectral observada para envases de vidrio coloreado para productos no parenterales no excede del
10% a ninguna longitud de onda en el intervalo de 290-450 nm, independientemente del tipo y capacidad del envase de
vidrio. La transmisión espectral observada en los envases de vidrio coloreado para productos parenterales no excede los límites
provistos en la Tabla 6.
Tabla 6. Límites de Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado para Productos Parenterales
·---- ----- --- -- ·-- ·-
Porcentaje Máximo
de Transmisión
Espectral
a Cualquier Longitud de Onda
entre 290 nm
y 450 nm
Envases
Volumen Nominal Envases Sellados con
(ml) a la Llama Cierres
Hasta 1 50 25
Más de 1 y hasta 2 45 20
Más de 2 y hasta 5 40 15
Más de 5 y hasta 1 O 35 13
Más de 1 O y hasta 20 30 12
Más de 20 25 10

(661) ENVASES-PLÁSTICOS

INTRODUCCIÓN

El propósito de este capítulo es proveer las normas para los materiales y componentes plásticos usados para envasar artículos
médicos (productos farmacéuticos, biológicos, suplementos dietéticos y dispositivos). Las definiciones que aplican a este capí-
tulo se suministran en Requisitos de Envases y Almacenamiento (659). Las normas y las pruebas para las propiedades funcionales
de los envases y sus componentes se proporcionan en el capítulo general Envases-Pruebas de Desempeño (671 ).
Además de las normas suministradas aquí, los ingredientes agregados a los polímeros y los usados en la fabricación de los
envases deben cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Código de Reglamentaciones Federales (Code of Federal
Regulations), Título 21, Aditivos Alimentarios Indirectos (lndirect Food Additives), o haber sido evaluados por la FDA y considera-
dos sustancias aceptables para el uso indicado.
Los artículos plásticos se identifican y caracterizan por espectroscopía IR y calorimetría de barrido diferencial. En este capítulo
se suministran normas para la identificación y caracterización de los diferentes tipos de plástico y al final del capítulo se propor-
cionan los procedimientos de análisis. El grado de análisis depende de si el envase tiene contacto directo con el producto far-
macéutico o no, y el riesgo se basa en la vía de administración.
Los plásticos están compuestos por una mezcla de polímeros homólogos que tienen una gran variedad de pesos molecula-
res. Los plásticos pueden contener otras sustancias, como por ejemplo: residuos del proceso de polimerización, plastificantes,
estabilizadores, antioxidantes, pigmentos y lubricantes. Estos materiales cumplen con los requisitos para contacto con los ali-
mentos según se especifican en el Código de Reglamentaciones Federales, Título 21. Ciertos factores también pueden afectar la
aptitud de un plástico para un uso específico, como por ejemplo la composición del plástico, los procedimientos de procesa-
miento y limpieza, el tratamiento de la superficie, los medios de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorción y permeabili-
dad de los conservantes y las condiciones de almacenamiento. Las pruebas de extracción están diseñadas para caracterizar los
componentes extraídos e identificar los posibles migrantes. El grado o alcance de las pruebas para las sustancias extraíbles del
componente depende del uso al que está destinado y al grado de riesgo de impactar en forma adversa la eficacia del artículo
farmacopeico (medicamento, producto biológico, suplemento dietético o dispositivo). En este capítulo se suministran pruebas
de extracción de resinas específicas para polietileno, polipropileno, tereftalato de polietileno y tereftalato de polietileno G. Los
406 ( 661) Envases-Plásticos / Pruebas Físicas USP 37

demás plásticos se analizan según se indica para Pruebas Fisicoquímicas en la sección Métodos de Prueba. Efectuar la prueba de
Capacidad Amortiguadora solamente cuando los envases estén destinados a contener un producto líquido.
Los componentes plásticos usados para los productos de alto riesgo, como aquellos destinados para inhalación, preparación
parenteral y uso oftálmico se analizan usando las Pruebas Biológicas en la sección Métodos de Prueba.
Los envases plásticos destinados a envasar productos preparados para uso parenteral cumplen con los requisitos para Prue-
bas Biológicas y Pruebas Fisicoqwmicas en la sección Métodos de Prueba. Las normas aplican también a envases de polietileno
usados para envasar formas farmacéuticas secas para administración oral que no están destinadas a reconstituirse en solución.

ENVASES DE POLIETILENO

Propósito

Las normas y pruebas que se proporcionan en esta sección caracterizan los envases y componentes producidos a partir de
polietileno de baja densidad o polietileno de alta densidad, de resinas homopoliméricas o copoliméricas, que se consideran
adecuados para envasar indistintamente formas farmacéuticas secas para administración oral que no están destinadas a recons-
tituirse en solución. Todos los componentes de polietileno se someten a análisis por espectroscopía IR y calorimetría de barrido
diferencial. Si se han realizado estudios de estabilidad para establecer la fecha de caducidad de una forma farmacéutica especí-
fica contenida en un envase de polietileno apropiado, se puede utilizar cualquier otro envase de polietileno que cumpla con
estos requisitos para envasar dicha forma farmacéutica, siempre que los programas de estabilidad apropiados se amplíen para
incluir el envase alternativo a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y pureza de la forma farmacéutica se man-
tienen hasta la fecha de caducidad.

Antecedentes

Ambos polietilenos, de baja y alta densidad, son polímeros de cadena larga sintetizados a partir de no menos de 85,0% de
etileno y no menos de 95,0% de olefinas totales en condiciones controladas de calor y presión mediante reacciones en las que
se emplean catalizadores. Los otros ingredientes olefínicos que se utilizan con mayor frecuencia son el buteno, el hexeno y el
propileno. El espectro de absorción IR de ambos polietilenos, de alta y baja densidad, es típico de los polietilenos y cada uno
de ellos tiene propiedades térmicas características. La densidad del polietileno de alta densidad está entre 0,941 g por cm 3 y
0,965 g por cm 3 . La del polietileno de baja densidad está entre 0,850 g por cm 3 y 0,940 g por cm 3 . Otras propiedades que
pueden afectar la aptitud del polietileno incluyen el módulo de elasticidad, el índice de fusión, la resistencia a las fisuras por
estrés ambiental y el grado de cristalinidad posterior al moldeado.

Polietileno de Alta Densidad

Espectroscopía Infrarroja-Proceder según se indica para Reflectancia Interna Múltiple en la sección Métodos de Prueba. El
espectro corregido de la muestra presenta bandas de absorción principales sólo a las mismas longitudes de onda que las del
espectro del ER Polietileno de Alta Densidad USP.
Calorimetría de Barrido Diferencial-Proceder según se indica para Análisis Térmico en la sección Métodos de Prueba. El
termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Alta Densidad USP, determinado de la misma mane-
ra, y la temperatura de la endoterma (fusión) en el termograma de la muestra no difiere de la del Estándar de Referencia USP
en más de 6,0º.
Metales Pesados y Residuo No Volátil-Preparar extractos de muestras para estas pruebas según se indica para Pruebas
Fisicoquímicas en Métodos de Prueba, excepto que por cada 20,0 mL de Medio de Extracción la porción será de 60 cm 2 , indepen-
dientemente del espesor.
METALES PESADOS-Los envases cumplen con los requisitos para Metales Pesados en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Méto-
dos de Prueba.
RESIDUO NO VOLÁTIL-Proceder según se indica para Residuo No Volátil en Pruebas Fisicoquímicas, excepto que el Blanco será el
mismo disolvente usado en cada una de las siguientes condiciones de prueba: la diferencia entre las cantidades obtenidas de la
Preparación de la Muestra y del Blanco no excede de 12,0 mg cuando se emplea agua mantenida a una temperatura de 70º
como Medio de Extracción; no excede de 75,0 mg cuando se emplea alcohol mantenido a una temperatura de 70º como Medio
de Extracción; y no excede de 100,0 mg cuando se emplean hexanos mantenidos a una temperatura de 50º como Medio de
Extracción.
Componentes Usados en Contacto con Preparaciones Líquidas Orales-Proceder según se indica para Capacidad Amor-
tiguadora en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Métodos de Prueba.
USP 37 Pruebas Físicas/ (661) Envases-Plásticos 407

Polietileno de Baja Densidad

Espectroscopía Infrarroja-Proceder según se indica para Reflectancia Interna Múltiple en Métodos de Pruebo. El espectro
corregido de la muestra presenta bandas de absorción principales sólo a las mismas longitudes de onda que las del espectro
del ER Polietileno de Baja Densidad USP.
Calorimetría de Barrido Diferencial-Proceder según se indica para Análisis Térmico en Métodos de Prueba. El termograma
de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Baja Densidad USP, determinado de la misma manera, y la tempe-
ratura de la endoterma (fusión) en el termograma de la muestra no difiere de la del Estándar de Referencia USP en más de 8,0º.
Metales Pesados y Residuo no Volátil-Preparar extractos de muestras para estas pruebas según se indica para Prepara-
ción de la Muestra en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Métodos de Prueba, excepto que por cada 20,0 mL de Medio de Ex-
tracción la porción será de 60 cm 2 , independientemente del espesor.
METALES PESADOS-Los envases cumplen con los requisitos para Metales Pesados en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Méto-
dos de Prueba.
RESIDUO NO VOLATIL-Proceder según se indica para Residuo No Volátil en la seccion Pruebas Fis1coqwmicas en Metodos de
Prueba, excepto que el Blanco será el mismo disolvente usado en cada una de las siguientes condiciones de prueba: la diferen-
cia entre las cantidades obtenidas a partir de la Preparación de la Muestra y del Blanco no excede de 12,0 mg cuando se emplea
agua mantenida a una temperatura de 70º como Medio de Extracción; no excede de 75,0 mg cuando se emplea alcohol mante-
nido a una temperatura de 70º como Medio de Extracción; y no excede de 350,0 mg cuando se emplean hexanos mantenidos
a una temperatura de 50º como Medio de Extracción.
Componentes Usados en Contacto con Preparaciones Líquidas Orales-Proceder según se indica para Capacidad Amor-
tiguadora en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Métodos de Prueba.

ENVASES DE POLIPROPILENO

Propósito

Las normas y pruebas que se proporcionan en esta sección caracterizan los envases de polipropileno, producidos a partir de
homopolímeros o copolímeros, que se consideran adecuados para envasar indistintamente formas farmacéuticas líquidas y só-
lidas secas de administración oral. Si se han realizado estudios de estabilidad adecuados para establecer la fecha de caducidad
de una forma farmacéutica específica contenida en un envase de polipropileno apropiado, se puede utilizar cualquier otro en-
vase de polipropileno que cumpla con estos requisitos para envasar dicha forma farmacéutica, siempre que los programas de
estabilidad apropiados se amplíen para incluir el envase alternativo a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y
pureza de la forma farmacéutica se mantienen hasta la fecha de caducidad.

Antecedentes

Los polímeros de propileno son polímeros de cadena larga sintetizados a partir de propileno o de propileno y otras olefinas
en condiciones controladas de calor y presión, empleando catalizadores. Entre las otras olefinas que se utilizan con mayor fre-
cuencia se incluyen, a modo de ejemplo, el etileno y el buteno. Los polímeros de propileno, los ingredientes usados para fabri-
car los polímeros de propileno y los ingredientes utilizados en la fabricación de los envases cumplen con los requisitos estable-
cidos en las secciones pertinentes del Código de Reglamentaciones Federales, Título 21.
Ciertos factores, como por ejemplo la composición del plástico, los proce9imientos de procesamiento y limpieza, los medios
de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorción, la adsorción y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de alma-
cenamiento también pueden afectar la aptitud de un plástico para un uso específico. Se deben realizar pruebas apropiadas
para determinar la aptitud de un polipropileno específico.
El polipropileno posee un espectro de absorción IR típico y propiedades térmicas características. Su densidad está entre
0,880 g por cm 3 y 0,913 g por cm 3 • Las propiedades de permeación de envases moldeados de polipropileno pueden alterarse
incorporando polímero molido, según la proporción de material molido en el producto final. Otras propiedades que pueden
afectar la aptitud del polipropileno utilizado en envases de fármacos son: la permeabilidad al oxígeno y a la humedad, el mó-
dulo de elasticidad, el índice de flujo de fusión, la resistencia a las fisuras por estrés ambiental y el grado de cristalinidad des-
pués del moldeado. Se deben cumplir los requisitos de esta sección cuando el tipo de envase definido en la misma se usa para
envasar formas farmacéuticas sólidas secas y líquidas de administración oral.
Espectroscopía Infrarroja-Proceder según se indica para Reflectancia Interna Múltiple en Métodos de Prueba. El espectro
corregido de la muestra presenta bandas de absorción principales sólo a las mismas longitudes de onda que las del espectro
respectivo del ER Homopolímero de Polipropileno USP o del estándar de copolímero de polipropileno, determinados de mane-
ra similar.
Calorimetría de Barrido Diferencial-Proceder según se indica para Análisis Térmico en Métodos de Prueba. La temperatura
de la endoterma (fusión) en el termograma no difiere de la del Estándar de Referencia USP para homopolímeros en más de
6,0º. La temperatura de la endoterma obtenida a partir del termograma de la muestra del copolímero de polipropileno no
difiere de la del estándar de copolímero de polipropileno en más de 12,0º.
408 ( 661) Envases-Plásticos / Pruebas Físicas USP 37

Metales Pesados y Residuo no Volátil-Preparar extractos de muestras para estas pruebas según se indica para Prepara-
ción de la Muestra en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Métodos de Prueba, excepto que por cada 20 mL de Medio de Extrac-
ción la porción será de 60 cm 2, independientemente del espesor.
METALES PESADOS-Los envases cumplen con los requisitos para Metales Pesados en Pruebas Fisicoquímicas de la sección Méto-
dos de Prueba.
RESIDUO NO VOLÁTIL-Proceder según se indica para Residuo No Volátil en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Métodos de
Prueba, excepto que el Blanco será el mismo disolvente usado en cada una de las siguientes condiciones de prueba: la diferen-
cia entre las cantidades obtenidas a partir de la Preparación de la Muestra y del Blanco no excede de 10,0 mg cuando se emplea
agua mantenida a una temperatura de 70º como Medio de Extracción; no excede de 60,0 mg cuando se emplea alcohol mante-
nido a una temperatura de 70º como Medio de Extracción; y no excede de 225,0 mg cuando se emplean hexanos mantenidos
a una temperatura de 50º como Medio de Extracción. Los envases cumplen con estos requisitos de Residuo No Volátil para todos
los medios de extracción anteriormente mencionados. [NOTA-Los hexanos y el alcohol son inflamables. Para evaporar estos
disolventes, utilizar una corriente de aire con un baño de agua y utilizar una estufa a prueba de explosiones para secar el resi-
duo.]
Componentes Usados en Contacto con Preparaciones Líquidas Orales-Proceder según se indica para Capacidad Amor-
tiguadora en la sección Pruebas Fisicoquímicas en Métodos de Prueba.

FRASCOS DE TEREFTALATO DE POLIETILENO Y

ENVASES DE TEREFTALATO
DE POLIETILENO G

Propósito
Las normas y pruebas que se proporcionan en esta sección caracterizan los frascos de tereftalato de polietileno (PET, por sus
siglas en inglés) y de tereftalato de polietileno G (PETG, por sus siglas en inglés), ambos adecuados para envasar formas farma-
céuticas líquidas de administración oral. Si se han realizado estudios de estabilidad para establecer la fecha de caducidad de
una forma farmacéutica líquida de administración oral específica envasada en un frasco que cumple con los requisitos estable-
cidos en este documento para frascos de PET o PETG, se puede utilizar cualquier otro frasco de PET o PETG que cumpla estos
requisitos para envasar dicha forma farmacéutica siempre que los programas de estabilidad se amplíen para incluir el frasco
alternativo a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y pureza de la forma farmacéutica se mantienen hasta la
fecha de caducidad. Efectuar las pruebas que correspondan a fin de determinar la aptitud de un frasco específico de PET o
PETG para dispensar una forma farmacéutica líquida de administración oral en particular.

Antecedentes
Las resinas de PET son polímeros cristalinos de cadena larga preparados mediante condensación de etilenglicol con tereftala-
to de dimetilo o ácido tereftálico. Las resinas de copolímero de PET se preparan de manera similar, con la excepción de que
también pueden contener una pequeña cantidad de ácido isoftálico (un porcentaje molar de no más de 3) o 1,4-ciclohexano-
dimetanol (un porcentaje molar de no más de 5). La polimerización se realiza en condiciones controladas de calor y vacío,
empleando catalizadores y estabilizadores.
Las resinas de copolímero de PET tienen propiedades físicas y espectrales similares a las del PET y a los efectos prácticos se las
considera como PET. Las pruebas y especificaciones que se proporcionan en e~ta sección para caracterizar a las resinas y los
frascos de PET también se aplican a las resinas de copolímeros de PET y a los frascos fabricados con éstas.
Las resinas de copolímero de PET y el PET, generalmente presentan una estructura molecular muy ordenada. Como conse-
cuencia, muestran un comportamiento térmico característico que depende de la composición, incluyendo una temperatura de
transición vítrea de aproximadamente 76º y una temperatura de fusión de aproximadamente 250º. Estas resinas tienen un es-
pectro de absorción IR distintivo que permite diferenciarlas de otros materiales plásticos (por ejemplo: policarbonato, poliesti-
reno, polietileno y resinas de PETG). El PET y las resinas de copolímero de PET tienen una densidad entre 1, 3 y 1,4 g por cm 3 y
una viscosidad intrínseca mínima de 0,7 dL por g, que corresponde a un peso molecular promedio en número de aproximada-
mente 23 000 daltones.
Las resinas de PETG son polímeros de alto peso molecular preparados mediante condensación de etilenglicol con tereftalato
de di metilo o ácido tereftálico y un porcentaje molar de 15 a 34 de 1,4-ciclohexanodimetanol. Las resinas PETG son polímeros
transparentes, amorfos, que poseen una temperatura de transición vítrea de aproximadamente 81 ºy no tienen un punto de
fusión cristalino, según se determina por calorimetría de barrido diferencial. Estas resinas de PETG tienen un espectro de absor-
ción IR característico que permite diferenciarlas de otros materiales plásticos, incluso el PET. Las resinas de PETG tienen una
densidad de aproximadamente 1,27 g por cm 3 y una viscosidad intrínseca mínima de 0,65 dL por g, que corresponde a un
peso molecular promedio en número de aproximadamente 16 000 daltones.
Las resinas de PET y de PETG y otros ingredientes utilizados en la fabricación de estos frascos cumplen con los requisitos de
las secciones pertinentes del Código de Reglamentaciones Federales, Título 21, en lo referente al uso de estos materiales en con-
tacto con alimentos y bebidas alcohólicas. Las resinas de PET y de PETG no contienen plastificantes, adyuvantes de procesa-
USP 37 Pruebas Físicas/ (661) Envases-Plásticos 409

miento o antioxidantes. Los colorantes que se empleen en la fabricación de frascos de PET y de PETG, si los hubiera, no migran
al líquido contenido en el frasco.
Espectroscopía Infrarroja-Proceder según se indica en Reflectancia Interna Múltiple en la sección Métodos de Prueba. El
espectro de la muestra corregido presenta bandas de absorción principales sólo a las mismas longitudes de onda que las del
espectro de ER Tereftalato de Polietileno USP o ER Tereftalato de Polietileno G USP, determinados de manera similar.
Calorimetría de Barrido Diferencial-Proceder según se indica en Análisis Térmico en la sección Métodos de Prueba. Para
tereftalato de polietileno, el termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Polietileno USP, determi-
nado de manera similar: el punto de fusión (Tm) de la muestra no difiere del punto de fusión del Estándar de Referencia USP en
más de 9,0º y la temperatura de transición vítrea (T9 ) de la muestra no difiere de la del Estándar de Referencia USP en más de
4,0º. Para tereftalato de polietileno G, el termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Polietileno G
USP, determinado de manera similar: la temperatura de transición vítrea (T9 ) de la muestra no difiere de la del Estándar de
Referencia USP en más de 6,0º.
Extracción de Colorantes-Seleccionar tres frascos de prueba. Cortar una porción relativamente plana de la pared de un
frasco y recortarla, según sea necesario, para que pueda colocarse en el portamuestras del espectrofotómetro. Obtener el es-
pectro visible de la pared barriendo la porción del espectro visible desde 350 nm hasta 700 nm. Determinar la longitud de
onda de máxima absorbancia con una aproximación de 2 nm. Llenar los dos frascos de prueba restantes, empleando alcohol
al 50% para frascos de PET y alcohol al 25% para frascos de PETG. Sellar los frascos con sellos impermeables, como por ejem-
plo papel de aluminio y colocar los cierres. Llenar un frasco de vidrio que tenga la misma capacidad que los frascos de prueba
con el disolvente que corresponda, sellar el frasco con un sello impermeable, como por ejemplo papel de aluminio y colocar el
cierre. Incubar los frascos de prueba y el frasco de vidrio a 49º durante 1O días. Retirar los frascos y dejar que se equilibren a
temperatura ambiente. Determinar concomitantemente las absorbancias de las soluciones de prueba en celdas de 5 cm a la
longitud de onda de máxima absorbancia (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )), empleando el disolvente del frasco
de vidrio como blanco. Los valores de absorbancia así obtenidos son menores a 0,01 para ambas soluciones de prueba.
Metales Pesados, Partes Totales de Tereftaloílo y Etilenglicol-
MEDIO DE EXTRACCIÓN-
Agua Purificada--{ver monografía).
Alcohol al 50 por ciento-Diluir 125 mL de alcohol con agua hasta 238 mL y mezclar.
Alcohol al 25 por ciento-Diluir 125 mL de Alcohol al 50 por ciento con agua hasta 250 mL y mezclar.
n-Heptano.
PROCEDIMIENTO GENERAL-[NOTA-Utilizar un Medio de Extracción de Alcohol al 50 por ciento para frascos de PET y Alcohol al
25 por ciento para frascos de PETG.] Para cada Medio de Extracción, llenar una cantidad suficiente de frascos de prueba al 90%
de su capacidad nominal para obtener no menos de 30 ml. Llenar un número correspondiente de frascos de vidrio con Agua
Purificada, un número correspondiente de frascos de vidrio con Alcohol al 50 por ciento o Alcohol al 25 por ciento y un número
correspondiente de frascos de vidrio con n-Heptano para emplearlos como blancos de los Medios de Extracción. Sellar los frascos
con sellos impermeables, como por ejemplo papel de aluminio, y colocar los cierres. Incubar los frascos de prueba y los frascos
de vidrio a 49º durante 1O días. Retirar los frascos de prueba con las muestras de los Medios de Extracción, los frascos de vidrio
con los blancos de los Medios de Extracción y almacenarlos a temperatura ambiente. No transferir las muestras de los Medios de
Extracción a otros recipientes de almacenamiento.
METALES PESADOS-Pipetear 20 mL del extracto de Agua Purificada de los frascos de prueba, filtrado si fuera necesario, y trans-
ferir a uno de dos tubos para comparación de color de 50 mL y reservar el extracto restante de Agua Purificada en los frascos
de prueba para utilizarlo en la prueba de Etilenglicol. Ajustar el extracto con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N a un
pH entre 3,0 y 4,0, utilizando papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Diluir con agua hasta aproxi-
madamente 35 mL y mezclar. ·
Pipetear 2 mL de Solución Estándar de Plomo recién preparada (en el día de uso) (ver Metales Pesados (231 )) y transferir al
segundo tubo para comparación de color, y agregar 20 mL de Agua Purificada. Ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de
amonio 6 N a un pH entre 3,0 y 4,0, utilizando papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Diluir con
agua hasta aproximadamente 35 mL y mezclar.
Agregar a cada tubo 1,2 mL de tioacetamida-glicerina básica SR y 2 mL de Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5 (ver
Metales Pesados (231 )), diluir con agua hasta 50 mL y mezclar: todo color que se produzca dentro de los 1 O minutos en el tubo
que contiene el extracto de Agua Purificada de los frascos de prueba no excede el que se produce en el tubo que contiene la
Solución Estándar de Plomo, observando ambos tubos hacia abajo sobre una superficie blanca (1 ppm en el extracto).
PARTES TOTALES DE TEREFTALOÍLO-Determinar la absorbancia del extracto de Alcohol al 50 por ciento o de Alcohol al 25 por cien-
to en una celda de 1 cm a la longitud de onda de máxima absorbancia, aproximadamente a 244 nm (ver Espectrofotometría y
Dispersión de Luz (851 )), utilizando el blanco de Medio de Extracción correspondiente como blanco: la absorbancia del extracto
no excede de O, 150, correspondiente a no más de 1 ppm de tereftaloílo total.
Determinar la absorbancia del extracto de n-Heptano en una celda de 1 cm a la longitud de onda de máxima absorción,
aproximadamente a 240 nm, (ver Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )), utilizando el Medio de Extracción de n-Heptano
como blanco: la absorbancia del extracto no excede de O, 150, correspondiente a no más de 1 ppm de tereftaloílo total.
ETILENGLICOL-
Solución de Ácido Peryódico-Disolver 125 mg de ácido peryódico en 1 O mL de agua.
41 O ( 661) Envases--Plásticos / Pruebas Físicas USP 37

Ácido Sulfúrico Diluido-Agregar despacio y mezclando constantemente 50 ml de ácido sulfúrico a 50 ml de agua y dejar
que se enfríe a temperatura ambiente.
Solución de Bisulfito de Sodio-Disolver O, 1 g de bisulfito de sodio en 1 O ml de agua. Usar esta solución dentro de los 7 días
de preparada.
Solución de Cromotropato Disódico-Disolver 100 mg de cromotropato disódico en 100 ml de ácido sulfúrico. Proteger esta
solución de la luz y utilizar dentro de los 7 días de preparada.
Solución Estándar-Disolver en agua una cantidad, pesada con exactitud, de etilenglicol y diluir cuantitativamente, y si fuera
necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 1 µg por
ml.
Solución de Prueba-Emplear el extracto de Agua Purificada.
Procedimiento-Transferir 1,0 ml de la Solución Estándar a un matraz volumétrico de 1 O ml. Transferir 1,0 ml de la Solución
de Prueba a un segundo matraz volumétrico de 1 O ml. Transferir 1,0 ml del Medio de Extracción de Agua Purificada a un tercer
matraz volumétrico de 1 O ml. Agregar a cada uno de los tres matraces 1 00 µL de Solución de Ácido Peryódico, agitar por rota-
ción suave para mezclar y dejar en reposo durante 60 minutos. Agregar 1,0 ml de Solución de Bisulfito de Sodio a cada matraz y
mezclar. Agregar 1 00 µL de Solución de Cromotropato Disódico a cada matraz y mezclar. [NOTA-Analizar todas las soluciones
dentro del plazo de 1 hora después de agregar la Solución de Cromotropato Disódico.] Con cuidado, agregar 6 ml de ácido
sulfúrico a cada matraz, mezclar y dejar que las soluciones se enfríen a temperatura ambiente. [Precaución-La dilución de ácido
sulfúrico produce mucho calor y puede hacer que la solución entre en ebullición. Realizar esta adición cuidadosamente. Se desprende-
rán gases de dióxido de azufre. Se recomienda usar una campana de extracción]. Diluir a volumen cada solución con Ácido Sulfúri-
co Diluido y mezclar. Determinar concomitantemente las absorbancias de las soluciones obtenidas a partir de la Solución Están-
dar y de la Solución de Prueba en celdas de 1 cm a la longitud de onda de máxima absorción aproximadamente a 575 nm, (ver
Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )), usando la solución del blanco de Medio de Extracción de Agua Purificada: la absor-
bancia de la solución obtenida a partir de la Solución de Prueba no excede de la absorbancia de la solución obtenida a partir de
la Solución Estándar, correspondiendo a no más de 1 ppm de etilenglicol.

MÉTODOS DE PRUEBA

Reflectancia Interna Múltiple

Aparato-Utilizar un espectrofotómetro IR capaz de corregir por el espectro del blanco, equipado con accesorios de reflec-
tancia interna múltiple y una placa de reflectancia interna KRS-5. 1 Un cristal KRS-5 de 2 mm de espesor con un ángulo de inci-
dencia de 45º proporciona un número suficiente de reflejos.
Preparación de la Muestra-Cortar dos secciones planas de un espesor equivalente al espesor promedio de la pared del
envase y recortarlas, según sea necesario, a fin de obtener segmentos que tengan un tamaño conveniente para montarlos en
el accesorio de reflectancia interna múltiple. Con cuidado para evitar rayar las superficies, secar las muestras con papel seco o,
si fuera necesario, limpiarlas con una tela suave humedecida con metanol y dejarlas secar. Montar firmemente las muestras en
ambos lados de la placa KRS-5 de reflectancia interna, asegurándose de lograr un contacto superficial adecuado. Antes del
montaje en la placa, las muestras pueden comprimirse mediante exposición a temperaturas de aproximadamente 1 77º a alta
presión (15 000 psi o más) para obtener películas uniformes delgadas.
Procedimiento General-Colocar las secciones de la muestra en el accesorio de reflectancia interna múltiple y colocar el
conjunto en el haz de la muestra del espectrofotómetro IR. Ajustar la posición de la muestra y de los espejos dentro del acceso-
rio para permitir la máxima transmisión de luz del haz de referencia no atenuado. (Si se trata de un instrumento de haz doble,
completar los ajustes en el accesorio y luego atenuar el haz de referencia para ·permitir una deflexión de escala completa du-
rante el barrido de la muestra.) Determinar el espectro IR de 3500 cm- 1 a 600 cm-1 para polietileno y polipropileno, y de
4000 cm- 1 a 400 cm- 1 para PET y PETG.

Análisis Térmico

Procedimiento General-Cortar una sección que pese aproximadamente 12 mg y colocarla en el platillo para la muestra
de prueba. [NOTA-Es esencial un buen contacto entre el platillo y la termocupla para lograr resultados reproducibles.] Deter-
minar el termograma bajo nitrógeno, empleando las condiciones de calentamiento y enfriamiento especificadas para el tipo de
resina utilizado, con un equipo capaz de realizar las determinaciones especificadas en Análisis Térmico (891 ).
Para Polietileno-Determinar el termograma bajo nitrógeno a una temperatura entre 40º y 200º con una velocidad de
calentamiento entre 2º y 1 Oº por minuto, seguido de enfriamiento a una velocidad entre 2º y 1 Oº por minuto hasta 40º.
Para Polipropileno-Determinar el termograma bajo nitrógeno a una temperatura entre la temperatura ambiente y 30º
por encima del punto de fusión. Mantener la temperatura durante 1 O minutos, luego enfriar hasta 50º por debajo de la tem-
peratura del pico de cristalización a una velocidad de 1 Oº a 20º por minuto.

1 El accesmio de rcflectancia i11tcrna rnulliple y la µlaca de KRó-5 w pueden obtener de diversas fuentes, entre las que se incluyen Beckman lnstruments, lnc., 2500

HJrbor Blvd., Fullerton. CA 92634, y í'erkin Elmer Corµ., Main Ave., Norwalk, CT 06856.
 USP 37 Pruebas Físicas / (661 ) Envases-Plásticos 411

Para Tereftalato de Polietileno-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 280º a una velocidad de calenta-
miento de aproximadamente 20º por minuto. Mantener la muestra a 280º durante 1 minuto. Enfriar rápidamente la muestra
hasta temperatura ambiente, volver a calentar hasta 280º a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 5º por mi-
nuto.
Para Tereftalato de Polietileno e-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 120º a una velocidad de calen-
tamiento de aproximadamente 20º por minuto. Mantener la muestra a 120º durante 1 minuto. Enfriar rápidamente la muestra
hasta temperatura ambiente, volver a calentar hasta 120º a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 1 Oº por mi-
nuto.

Pruebas Biológicas
Las pruebas biológicas in vitro se realizan según los procedimientos establecidos en Prueba de Reactividad Biológica, In Vitro
(87). Los componentes que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no necesitan ser 5ometidos a pruebas adiciona-
les. No se asigna ningún tipo de designación de clase de plástico para estos materiales. Los materiales que no cumplen con los
requisitos de las pruebas in vitro no son adecuados para envases de productos farmacéuticos.
Si se necesita una designación de clase para plásticos y otros polímeros que cumplan con los requisitos de las Pruebas de
Reactividad Biológica, In Vitro (87), realizar las pruebas in vivo apropiadas que se especifican en Clasificación de Plásticos en Prue-
bas de Reactividad Biológica, In Vivo (88).

Pruebas Fisicoquímicas
Las siguientes pruebas, diseñadas para determinar las propiedades físicas y químicas de los plásticos y sus extractos, están
basadas en la extracción del material plástico y es esencial que se emplee la cantidad de plástico indicada. Asimismo, es nece-
sario que el área superficial especificada esté disponible para la extracción a la temperatura indicada.
Parámetros de Prueba-
Medio de Extracción-A menos que se indique algo diferente en alguna de las pruebas específicas descritas a continuación,
emplear Agua Purificada (ver monografía) como Medio de Extracción y mantenerla a una temperatura de 70º durante la extrac-
ción de la Preparación de la Muestra.
Blanco-Usar Agua Purificada cuando se especifique un blanco en las siguientes pruebas.
Aparatos-Emplear un baño de agua y los Envases de Extracción según se describen en Pruebas de Reactividad Biológica, In
Vivo (88). Proceder según se indica en el primer párrafo en Preparación del Equipo en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
(88). [NOTA-Los envases y equipos no necesitan estar esterilizados.]
Preparación de la Muestra-Utilizar una porción de una muestra de plástico homogénea, que equivalga a 120 cm 2 de área
superficial total (ambos lados combinados), por cada 20,0 mL de Medio de Extracción y subdividir en tiras de aproximadamente
3 mm de ancho y con una longitud lo más próxima posible a 5 cm. Transferir la muestra subdividida a una probeta graduada
de vidrio Tipo 1 de 250 mL con tapón de vidrio y agregar aproximadamente 150 mL de Agua Purificada. Agitar durante aproxi-
madamente 30 segundos, drenar y desechar el líquido, y repetir con un segundo lavado.
Extracto de Preparación de la Muestra-Transferir la Preparación de la Muestra a un matraz de extracción adecuado y agregar
la cantidad requerida de Medio de Extracción. Extraer la muestra mediante calentamiento en un baño de agua a la temperatura
especificada para el Medio de Extracción durante 24 horas. Enfriar, pero a una temperatura no menor a 20º. Pipetear 20 mL del
extracto preparado y transferir a un recipiente adecuado. [NOTA-Emplear esta porción en la prueba de Capacidad Amortigua-
dora.] De inmediato decantar el extracto restante recogiendo el filtrado en kJn recipiente limpiado adecuadamente y sellarlo.
Residuo No Volátil-Transferir, en porciones adecuadas, 50,0 mL del Extracto de Preparación de la Muestra, a un crisol tara-
do adecuado (preferentemente un crisol de sílice fundida que haya sido lavado con ácido) y evaporar la materia volátil en un
baño de vapor. Emplear el mismo procedimiento para evaporar 50,0 mL del Blanco en un segundo crisol. [NOTA-Si se espera
obtener un residuo oleoso, inspeccionar el crisol repetidamente durante la evaporación y el período de secado y reducir el ca-
lor si el aceite tiende a ascender por las paredes del crisol.] Secar a 105º durante 1 hora: la diferencia entre las cantidades obte-
nidas a partir del Extracto de Preparación de la Muestra y el Blanco no excede de 15 mg.
Residuo de Incineración (281 )-[NOTA-No es necesario realizar esta prueba cuando el resultado de la prueba de Residuo No
Volátil no excede de 5 mg.] Proceder con los residuos obtenidos a partir del Extracto de Preparación de la Muestra y del Blanco
en la prueba para Residuo No Volátil descrita anteriormente, utilizando, si fuera necesario, una cantidad adicional de ácido sul-
fúrico pero agregando la misma cantidad de ácido sulfúrico a cada crisol: la diferencia entre las cantidades de residuo de inci-
neración obtenidas a partir del Extracto de Preparación de la Muestra y el Blanco no excede de 5 mg.
Metales Pesados-Pipetear 20 mL del Extracto de Preparación de la Muestra, filtrado si fuera necesario, y transferir a uno de
dos tubos para comparación de color de 50 ml. Ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N a un pH entre 3,0 y
4,0 utilizando papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, diluir con agua hasta aproximadamente
35 mL y mezclar.
Pipetear 2 mL de Solución Estándar de Plomo (ver Metales Pesados (231 )), transferir al segundo tubo de comparación de color
y agregar 20 mL del Blanco. Ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N a un pH entre 3,0 y 4,0 utilizando papel
indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, diluir con agua hasta aproximadamente 35 mL y mezclar. Agregar
a cada tubo 1,2 mL de tioacetamida-glicerina básica SR y 2 mL de Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5 (ver Metales
 41 2 <661) Envases-Plásticos / Pruebas Físicas USP 37

Pesados (231 )), diluir con agua hasta 50 mL y mezclar: el color marrón que se produzca dentro de los 1O minutos en el tubo
que contiene el Extracto de Preparación de la Muestra no excede del que se produce en el tubo que contiene la Solución Están-
dar de Plomo, observando ambos tubos hacia abajo sobre una superficie blanca (1 ppm en el extracto).
Capacidad Amortiguadora-Valorar potenciométricamente la porción de 20 mL previamente recolectada del Extracto de
Preparación de la Muestra hasta un pH de 7,0, utilizando ácido clorhídrico 0,01 O N o hidróxido de sodio 0,01 O N, según se
requiera. Tratar una porción de 20,0 mL del Blanco en forma similar: si se requiere la misma solución volumétrica tanto para el
Extracto de Preparación de la Muestra como para el Blanco, la diferencia entre los dos volúmenes no es mayor de 10,0 mL; si se
requiere ácido para el Extracto de Preparación de la Muestra o el Blanco y álcali para el otro, el total de los dos volúmenes reque-
ridos no es mayor de 10,0 ml.

(670) ENVASES-COMPONENTES AUXILIARES

Los componentes auxiliares de los envases son artículos que se usan para respaldar o mejorar los sistemas de envase y cierre.
Estos artículos incluyen, entre otros, torunda farmacéutica (pharmaceutical coil) para envases. Los componentes que se descri-
ben en este capítulo deben cumplir con los requisitos aquí provistos y los requisitos adicionales especificados en otros capítu-
los.

TORUNDA FARMACÉUTICA
La torunda farmacéutica se usa como material de relleno en envases de unidades múltiples para formas farmacéuticas orales
sólidas a fin de evitar la ruptura de tabletas o cápsulas durante el transporte. El material de relleno se debe desechar una vez
que se ha abierto el frasco.

Soluciones

Solución Yodada de Cloruro de Cinc -Disolver 20 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de Agua
Purificada. Agregar 0,5 g de yodo y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Proteger de la luz.
Solución de Cloruro de Cinc-Ácido Fórmico-Disolver 20 g de cloruro de cinc en 80 g de una solución de 850 g/L de
ácido fórmico anhidro.
Solución al 1% de Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont 1 -Disolver 3,8 g de colorante en polvo en
378,5 mL de agua desionizada.

Torunda Farmacéutica de Algodón

El algodón purificado es el pelo de la semilla de las variedades cultivadas de Gossypium hirsutum L. u otras especies de Gossy-
pium (Fam. Malvaceae). Se elimina el material graso y se blanquea, y no contiene más que trazas de residuo de hojas, pericar-
pio, recubrimiento de la semilla u otras impurezas. La torunda farmacéutica de algodón se usa en frascos de formas farmacéu-
ticas orales sólidas para evitar la ruptura.
Identificación-
A: Cuando se examinan al microscopio, se observa que cada fibra consiste en una célula, de hasta aproximadamente 4 cm
de largo y 40 µm de ancho, en forma de un tubo aplanado con paredes gruesas y redondeadas que están a menudo retorci-
das.
B: Cuando se tratan con Solución Yodada de Cloruro de Cinc, las fibras se tornan de color violeta.
C: Agregar 1O mL de Solución de Cloruro de Cinc-Ácido Fórmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40º, y dejar en reposo durante 2
horas, agitando ocasionalmente: las fibras no se disuelven.
D: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, embeber con agua, y exprimir el exceso. Agregar las fibras a 100 mL de Solución
al 7% de Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont en ebullición y continuar la ebullición suavemente por no menos de
1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría, y exprimir el líquido en exceso: las fibras se tornan de color verde.
Acidez o Alcalinidad-Sumergir aproximadamente 1O g de fibras en 100 mL de Agua Purificada recientemente hervida y
enfriada, y dejar que se macere durante 2 horas. Decantar dos porciones de 25 mL del agua, con ayuda de una varilla de vi-
drio, en sendas cápsulas. Agregar a una porción 3 gotas de fenolftaleína SR y agregar a la otra porción 1 gota de anaranjado de
metilo SR. Ninguna porción se presenta de color rosa cuando se la observa contra un fondo blanco.
Fluorescencia-Examinar una capa de aproximadamente 5 mm de espesor bajo luz UV a 365 nm. Presenta solamente una
ligera fluorescencia violeta amarronada y unas pocas partículas de color amarillo. No presenta una fluorescencia azul intensa,
excepto por la que pueden presentar unas pocas fibras aisladas.

1 El Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont está disponible en Pylam Products Co., 2175 East Cedar Street, Tempe, AZ 85281: www.pylamdyes.com.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 413

Concentración de Peróxido de Hidrógeno Residual-Colocar 1 g de fibras en un vaso de precipitados que contenga

30 mL de Agua Purificada y mezclar durante 3 minutos con una varilla de vidrio. Verter el contenido en otro recipiente limpio
(no exprimir la muestra), o alternativamente, retirar las fibras de la solución con tenacillas limpias. Retirar una tira de prueba
analítica de peróxido 2 de su envase y sumergir el extremo de prueba en el líquido de muestra durante 2 segundm. Agitar para
eliminar el exceso de líquido, insertar inmediatamente la tira de prueba en un instrumento de reflectometría adecuado, y regis-
trar la lectura en mg/kg (ppm), y calcular la concentración de peróxido de hidrógeno residual en ppm.
Para un método alternativo, colocar 20 gen un vaso de precipitados, agregar 400 mL de Agua Purificada, mezclar, agregar
20 mL de ácido sulfúrico al 20%, y mezclar el contenido. Valorar con solución de permanganato de potasio O, 1 00 N hasta un
color rosado pálido que permanezca durante 30 segundos. Registrar la cantidad de contenido y calcular la concentración en
ppm.
Se encuentra no más de 50 ppm usando cualquiera de los métodos.
Pérdida por Secado (731 )-Secar 5,00 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante: pierde no más de 8,0% de su
peso.
Residuo de Incineración (281 )-Colocar 5 g de fibras en una cápsula de porcelana o platino y humedecer con ácido sulfú-
rico 2 N. Calentar suavemente el algodón hasta que se carbonice, luego incinerar con mayor intensidad hasta que el carbono
se haya consumido completamente: Queda no más de 0,20% de residuo.
Sustancias Solubles en Agua-Colocar 1 0,00 g de fibras en un vaso de precipitados que contenga 1000 mL de Agua Purifi-
cada y calentar a ebullición suave durante 30 minutos, agregando agua según se requiera para mantener el volumen. Verter el
agua a través de un embudo en otro vaso y exprimir el exceso de agua del algodón con una varilla de vidrio. Lavar el algodón
en el embudo con dos porciones de 250 mL de agua hirviendo, presionando el algodón después de cada lavado. Filtrar el ex-
tracto y los lavados combinados y lavar bien el filtro con agua caliente. Evaporar el extracto y los lavados combinados hasta un
volumen pequeño, transferir a una cápsula de porcelana o platino tarada, evaporar hasta sequedad, y secar el residuo a 105º
hasta peso constante. El residuo pesa no más de 0,35%.
Materia Grasa-Compactar 10,00 g de fibras en un extractor Soxhlet equipado con un receptor tarado y extraer con éter
etílico durante 4 horas a una velocidad tal que permita que el éter se descargue por sifón no menos de cuatro veces por hora.
La solución de éter etílico en el matraz no presenta trazas de color azul, verde o marrón. Evaporar el extracto hasta sequedad y
secar a 1 05º durante 1 hora. El peso del residuo no excede de 0,7%.
Colorantes-Compactar aproximadamente 1 O g en un percolador estrecho y extraer lentamente con alcohol hasta que el
percolado alcance 50 ml. Cuando se observa hacia abajo a través de una columna de 20 cm de profundidad, el percolado
puede presentar un color amarillento, pero no una coloración azul o verde.
Otra Materia Extraña-Pequeños trozos de algodón no contienen manchas de aceite o partículas metálicas por inspección
visual.

Torunda Farmacéutica de Rayón

La torunda farmacéutica de rayón es una forma fibrosa de celulosa regenerada blanqueada que se usa como relleno en fras-
cos de formas farmacéuticas orales sólidas para evitar la ruptura. Consiste exclusivamente en fibras de rayón excepto por unas
pocas fibras extrañas aisladas que pueden estar presentes.
[NOTA-Se ha demostrado que la torunda farmacéutica de rayón es una fuente potencial de problemas de disolución para
cápsulas de gelatina o tabletas recubiertas de gelatina que resultan del entrecruzamiento de la gelatina.]
Identificación-
A: Cuando se tratan con Solución Yodada de Cloruro de Cinc, las fibras s~ tornan de color violeta.
B: Agregar 1 O mL de Solución de Cloruro de Cinc-Ácido Fórmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40º, y dejar en reposo durante 2
horas, agitando ocasionalmente: las fibras se disuelven por completo, excepto por las fibras de rayón mate en las que se con-
servan partículas de titanio.
C: Pesar aproximadamente 5 g de las fibras, embeber con agua, y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solución
al 7% de Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont en ebullición y continuar la ebullición suavemente por no menos de
1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría, y exprimir el líquido en exceso: las fibras se tornan de color verde azula-
do.
Acidez o Alcalinidad, Fluorescencia, Materia Grasa, Colorantes y Otra Materia Extraña-Proceder según se indica en
Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar torunda farmacéutica de rayón. El peso de la muestra para materia
grasa es 5 g y el peso del residuo no excede de 0,5%.
Pérdida por Secado (731 )-Secar 5,00 g de fibras en un horno a 1 05º hasta peso constante: pierde no más de 11,0% de
su peso.
Residuo de Incineración (281 ): No más de 1,50%, determinado en una muestra de prueba de 5,00 g.
Cenizas Insolubles en Ácido-Agregar 25 mL de ácido clorhídrico 3 N al residuo obtenido en la prueba de Residuo de Inci-
neración y calentar a ebullición durante 5 minutos. Recoger la materia insoluble en un crisol de filtración tarado, lavar con agua
caliente, incinerar, y pesar: el residuo pesa no más de 1,25%.

2Un sistema de análisis adecuado que consiste en tiras de prueba de peróxido Reflectoquant® y un instrumento de reflectometría RQflex® se puede obtener de
EMD Chemicals lnc., 480 S. Democrat Road, Gibbstown, NJ 08027: www.emdchemicals.com.
414 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Físicas USP 37

Sustancias Solubles en Agua-Proceder según se indica en Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar
torunda farmacéutica de rayón. El residuo pesa no más de 1,0%.

Torunda Farmacéutica de Poliéster

La torunda farmacéutica de poliéster es un material blanco e inodoro que se usa como relleno en frascos de formas farma-
céuticas orales sólidas para evitar la ruptura.
Identificación--
A: Proceder según se indica en Espectroscopía Infrarroja en la sección de Métodos de Prueba. Determinar el espectro IR de
4000 a 650 cm 1 (2,5 a 15 µm). El espectro obtenido de la muestra presenta bandas de absorción principales únicamente a las
mismas longitudes de onda que el espectro de ER Tereftalato de Polietileno USP.
B: Pesar aproximadamente 5 g de las fibras, embeber con agua, y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solución
al 7% de Colorante Nº 4 paro fcf,'ntificacion de Fibra:, Ouf'ont en ebullición y continuar la ebullición suavemente por no menos de
1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría, y exprimir el líquido en exceso: las fibras se tornan de color anaranjado
pálido.
Acidez o Alcalinidad-Proceder según se indica en Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar torunda
farmacéutica de poliéster.
Pérdida por Secado (731 )-Secar 5,00 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante: pierde no más de 1,0% de su
peso.
Residuo de Incineración (281 ): No más de 0,5%, determinado en una muestra de prueba de 5,00 g.
Acabado sobre Fibras-El acabado sobre las fibras usado para el procesamiento debe cumplir con los reglamentos de la
FDA para el contacto con alimentos.

Métodos de Prueba

ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA 3

Aparato: FTIR o un espectrómetro de doble haz capaz de barrer de 4000 a 650 cm- 1 (2,5 a 15 µm).
Preparación de la Muestra-
Método 7 (Disco de Bromuro de Potasio)-Usar tijeras para cortar las fibras de poliéster (1 a 3 mg) en longitudes cortas (me-
nos de 1 mm de largo), mezclar con 200 mg de bromuro de potasio en polvo, y moler en un molino de bolas durante 1 a 2
minutos. Transferir a una matriz para discos de bromuro de potasio y formar un disco.
Método 2 (Película Fundida)-Generar una película presionando fibras de poliéster entre láminas de TFE-fluorocarbono y co-
locar entre placas calientes.

(671) ENVASES-PRUEBAS DE DESEMPEÑO

El propósito de este capítulo es proporcionar normas para las propiedades fu~cionales de envases y sus componentes usados
para envasar artículos regulados (productos farmacéuticos, biológicos, suplementos dietéticos y dispositivos). Las definiciones
que aplican a este capítulo se especifican en Requisitos de Envases y Almacenamiento (659). Las siguientes pruebas se suminis-
tran para determinar la permeabilidad a la humedad y la transmisión de la luz de los envases utilizados para artículos regula-
dos. La sección Envases de Unidades Múltiples para Cápsulas y Tabletas se aplica a envases de unidades múltiples. La sección
Envases Unitarios y Envases de Dosis Única para Cápsulas y Tabletas se aplica a envases unitarios y de dosis única. La sección
Envases de Unidades Múltiples para Cápsulas y Tabletas (Sin Cierre) se aplica a los envases de polietileno y polipropileno sin cie-
rre. La sección Envases de Unidades Múltiples y Unitarios para Líquidos se aplica a envases de unidades múltiples y envases unita-
rios.
Un envase destinado a proteger de la luz o presentado como un envase resistente a la luz cumple con los requisitos de Trans-
misión de Luz, cuando dicha protección o resistencia es en virtud de las propiedades específicas del material con que está com-
puesto el envase, incluyendo cualquier recubrimiento que se aplique al mismo. Un envase transparente e incoloro o un envase
translúcido que puede convertirse en un envase resistente a la luz mediante una envoltura opaca (ver Advertencias y Requisitos
Generales) está exento de los requisitos de Transmisión de Luz. El término "envase", tal como se utiliza en este documento, se
refiere al sistema completo que comprende, por lo general, el envase propiamente dicho, el recubrimiento (si lo tuviera), el
cierre en el caso de envases de unidades múltiples y la lámina de cierre y el blíster en el caso de envases de dosis única.

l Se puede encontrJr información adicional sobre metodos de identificación para fibras en "Standard Test Methods far ldentification of Fibers in Textiles" (Méto-
dos de Prueba Estándar para Identificación de Fibras en Textiles). Versión actual del Método D276 de ASTM, publicada por ASTM lnternational, 100 Barr Harbar
Drive, P.O. Box C700, West Conchohocken, PA 19428-2959. www.astm.org.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (671 > Envases-Pruebas de Desempeño 415

PERMEABILIDAD A LA HUMEDAD

Envases de Unidades Múltiples para Cápsulas y Tabletas

Desecante-Colocar una cantidad de cloruro de calcio anhidro, de malla 4 a 8 1 en un recipiente poco profundo, teniendo
cuidado de excluir el polvo fino, luego secar a 11 Oº durante 1 hora y enfriar en un desecador.
Procedimiento-Seleccionar 12 envases de tipo y tamaño uniforme, limpiar las superficies de sellado con un paño sin pelu-
sa, y cerrar y abrir cada envase 30 veces. Aplicar el cierre firme y uniformemente cada vez que se cierra el envase. Cerrar los
envases con tapa de rosca con una fuerza de torsión (torque) que esté comprendida dentro del intervalo de ajuste especificado
en la tabla adjunta. Agregar Desecante a 1O de los envases, designados como envases de prueba, llenando cada uno hasta
13 mm por debajo del cierre si el volumen del envase es 20 ml o más, o llenando cada uno hasta dos tercios de la capacidad si
el volumen del envase es menos de 20 ml. Si el interior del envase tiene más de 63 mm de profundidad, puede colocarse un
relleno inerte o un espaciador en el fondo para minimizar el peso total del envase y Desecante; la capa de Desecante en dicho
envase no debe ser de menos de 5 cm de espesor. Cerrar cada envase inmediatamente después de agregar el Desecante, apli-
cando la fuerza de torsión especificada en la tabla adjunta cuando se cierran envases con tapa de rosca. A cada uno de los 2
envases restantes, designados como controles, agregar un número suficiente de perlas de vidrio para lograr un peso aproxima-
damente igual al de cada uno de los envases de prueba y cerrarlos, aplicando la fuerza de torsión señalada en la tabla adjunta
cuando se cierran envases con tapa de rosca. Registrar el peso de los envases individuales así preparados con una aproxima-
ción de O, 1 mg si el volumen del envase es menos de 20 ml, con una aproximación de un mg si el volumen del envase es
mayor o igual a 20 ml pero menos de 200 ml, o con una aproximación de un centigramo (1 O mg) si el volumen del envase es
mayor o igual a 200 ml, y almacenar a una humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTA-Un sistema
saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 ml de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad
especificada. Se pueden emplear otros métodos para mantener estas condiciones.] Después de 336 horas± 1 hora (14 días),
registrar el peso de los envases individuales de la misma manera. Llenar completamente 5 envases vacíos del mismo tipo y
tamaño que los envases en análisis con agua o con un sólido no compresible y de libre fluidez, como por ejemplo perlas de
vidrio pequeñas y bien apisonadas, hasta el nivel indicado por la superficie del cierre cuando está colocado en su lugar. Trans-
ferir el contenido de cada envase a una probeta graduada y determinar el volumen promedio de los envases, en ml. Calcular
la velocidad de permeabilidad a la humedad, en mg por día por L, por la fórmula:
(1000/l 4V)[(Tr - T 1) - (Cr - C1)]

en donde V es el volumen, en ml, del envase; (Tr - T1) es la diferencia, en mg, entre el peso final y el peso inicial de cada
envase de prueba; y (Cr - C1) es la diferencia, en mg, entre el peso promedio final y el peso promedio inicial de los 2 controles.
Para los envases utilizados para medicamentos dispensados con receta médica, los envases así analizados son envases imper-
meables si no más de 1 de los 1 O envases de prueba tiene una permeabilidad a la humedad que excede de 100 mg por día por
L y ninguno excede de 200 mg por día por L.
Para los envases utilizados para medicamentos dispensados con receta médica, los envases son envases bien cerrados si no
más de 1 de los 1 O envases de prueba tiene una permeabilidad a la humedad que excede de 2000 mg por día por L y ninguno
excede de 3000 mg por día por L.
Tabla 1. Fuerza de Torsión Aplicable a Envases con Tapa de Rosca
Diámetro de
Cierreª (mm) Intervalo de Ajuste Sugerido para la Aplicación Manual de Fuerza de Torsiónb (pulgadas-libra)
8 5
10 6
13 8
15 5-9
18 7-10
20 8-12
22 9-14
24 10-18
28 12-21
30 13-23
ª Se debe aplicar la fuerza de torsión indicada para el diámetro de cierre inmediato superior cuando se prueban envases que tengan un diámetro de cierre
intermedio a los diámetros listados.
b Owens-lllinois, de Toledo, OH 43666, tiene disponible un aparato adecuado. (Se usa el medidor de fuerza de torsión Modelo 25 para medir entre O y 25, el
Modelo 50 para medir entre O y 50, y el Modelo 100 para medir entre O y 100 pulgadas-libra de fuerza de torsión.) Los valores de tuerza de torsión se refieren al
cerrado, y no a la apertura, de la tapa de rosca. Para mayores detalles con respecto a las instrucciones, se puede consultar "Standard Test Method for Application
and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closures", Método ASTM 03198-02, publicado por American Society for Testing and Materials, 100 Barr Harbor Dr,
P.O Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.

1 Un cloruro de calcio anhidro adecuado, de malla 4 a 8, está disponible comercialmente como Ítem JTl 313-1 de VWR lnternational. Consultar el catálogo de VWR
lnternational para obtener información o llamar al 1-800-234-9300 en EE.UU.
416 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas USP 37

Tabla 1. Fuerza de Torsión Aplicable a Envases con Tapa de Rosca (Continuación)

Diámetro de
Cierre" (mm) Intervalo de Ajuste Sugerido para la Aplicación Manual de Fuerza de Torslónb (pulgadas-libra)
33 15-25
38 17-26
43 17-27
48 19-30
53 21-36
58 23-40
63 25-43
66 26-45
70 28-50
------·-·---· ---·-- ----
83 32-65
86 40-65
89 40-70
100 45-70
110 45-70
120 55-95
132 60-95
ª Se debe aplicar la fuerza de torsión indicada para el diámetro de cierre inmediato superior cuando se prueban envases que tengan un diámetro de cierre
intermedio a los diámetros listados.
b Owens-lllinois, de Toledo, OH 43666, tiene disponible un aparato adecuado. (Se usa el medidor de fuerza de torsión Modelo 25 para medir entre O y 25, el
Modelo 50 para medir entre O y 50, y el Modelo 100 para medir entre O y 100 pulgadas-libra de fuerza de torsión.) Los valores de fuerza de torsión se refieren al
cerrado, y no a la apertura, de la tapa de rosca. Para mayores detalles con respecto a las instrucciones, se puede consultar "Standard Test Method for Application
and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closures", Método ASTM 03198-02, publicado por American Society for Testing and Materials, 100 Barr Harbar Dr,
P.O Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.

Envases de Unidades Múltiples para Cápsulas y Tabletas

(Sin Cierre)
Envase de Polietileno-Sellar los envases con sellos impermeables mediante sellado térmico de un laminado de papel de
aluminio y polietileno, u otro sello apropiado. 2 Probar los envases según se especifica en Envases de Unidades Múltiples para
Cápsulas y Tabletas: los envases de polietileno de alta densidad analizados cumplen con los requisitos si la permeabilidad a la
humedad excede de 1 O mg por día por Len no más de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg por día por
L. Los envases de polietileno de baja densidad analizados cumplen con los requisitos si la permeabilidad a la humedad excede
de 20 mg por día por L en no más de 1 de los 1O envases de prueba y ninguno de ellos excede de 30 mg por día por L.
Envases de Polipropileno-Sellar los envases con sellos impermeables mediante sellado térmico de un laminado de papel
de aluminio y polietileno, u otro sello apropiado. Analizar los envases según se especifica en Envases de Unidades Múltiples para
Cápsulas y Tabletas. Los envases cumplen con los requisitos si la permeabilidad a la humedad excede de 15 mg por día por L
en no más de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg por día por L.

Envases Unitarios y de Dosis Única para Cápsulas y Tabletas

El procedimiento y el esquema de clasificación que siguen a continuación para evaluar las características de permeabilidad a
la humedad de envases unitarios y de dosis única se proporcionan para permitir un juicio objetivo de la aptitud del envase para
un tipo de producto específico. Debido a que el desempeño del operador y del equipo pueden afectar Ja permeabilidad a la
humedad de un envase formado o cerrado, se deben determinar las características de permeabilidad de humedad del sistema
de envase que se utiliza.
Desecante-Secar un desecante granular adecuado 3 a 11 Oº durante 1 hora antes de su uso. Utilizar gránulos que pesen
aproximadamente 400 mg cada uno y que tengan un diámetro de aproximadamente 8 mm. [NOTA-Si fuera necesario, debi-
do al tamaño limitado de los envases de dosis única, se pueden usar gránulos que pesen menos de 400 mg cada uno y que
tengan un diámetro menor de 8 mm.]

2 Un laminado adecuado para sellado tiene una capa de polietileno como capa de contacto con el envase de no menos de 0,025 mm (0,001 pulgadas) y una
segunda capa de papel de aluminio de no menos de 0,018 mm (0,0007 pulgadas), con capas adicionales de materiales de refuerzo adecuados. Se puede obtener
también un sello apropiado mediante el empleo de placas de vidrio y una cera para sellado constituida por 60% de cera amorfa refinada y 40% de cera de parafina
cristalina refinada.
1 Hay desecantes granulados con indicador de humedad apropiados están disponibles comercialmente de fuentes, tales como Medical Packaging, lnc., 470 Route
31, Ringoes, NJ -08551-1409 [Teléfono 800-257-5282 en EE. UU.; en NJ, 609-466-8991; FAX 609-466-3775], como lndicating Desiccant Pellets, ltem No.
TK-1002.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (671) Envases-Prueba~ de Desempeño 41 7

Procedimiento-
Método /-Sellar no menos de 1 O envases de dosis única con 1 gránulo en cada uno y sellar 1 O envases de dosis única va-
cíos adicionales que servirán de control, usando dedales o pinzas con extremos almohadillados para manipular los envases se-
llados. Numerar los envases y registrar los pesos individuales 4 con una aproximación de 1 mg. Pesar los controles como una
sola unidad y dividir el peso total por el número de controles para obtener el promedio. Almacenar todos los envases a una
humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por
cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros
métodos para mantener estas condiciones.] Después de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo múltiplo de éste (ver
Resultados), retirar los envases de la cámara y permitir que se equilibren durante 15 a 60 minutos en el área de pesada. Regis-
trar nuevamente el peso de los envases individuales y de los controles combinados de la misma manera. [NOTA-Si algún grá-
nulo indicador se torna de color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso del gránulo excede de 1 0%,
terminar la prueba y considerar válidas sólo las determinaciones anteriores.] Devolver los envases a la cámara de humedad.
Calcular la velocidad de permeabilidad a la humedad, en mg por día, de cada envase tomado. por la fórmula:

en donde N es el número de días transcurridos en el período de prueba (comenzando después del período de equilibrio inicial
de 24 horas), (WF - W es la diferencia, en mg, entre el peso final y el peso inicial de cada envase de prueba y (CF - C es la
1) 1)

diferencia, en mg, entre el peso promedio final y el peso promedio inicial de los controles, calculando los datos con dos cifras
significativas. [NOTA-Cuando los valores de permeabilidad medidos son menores de 5 mg por día y cuando se observa que
los controles llegan a un estado de equilibrio dentro de los 7 días, la permeabilidad individual puede determinarse con mayor
exactitud empleando en el cálculo los valores obtenidos a los 7 días para los pesos del envase de prueba y del envase de con-
trol como W 1 y C1, respectivamente. En tal caso, un intervalo de prueba apropiado para la Clase A (ver Resultados) no sería me-
nor de 28 días después del período de equilibrio inicial de 7 días (un total de 35 días).]
Método //-Usar este procedimiento para envases (por ejemplo, blísteres) que incorporen varios envases de dosis única sella-
dos por separado. Sellar un número suficiente de envases, de modo que no menos de 4 envases y un total de no menos de 1O
envases de dosis única o blísteres con 1 gránulo en cada unidad sean sometidos a la prueba. Sellar el mismo número de enva-
ses vacíos, que contengan cada uno el mismo número de envases de dosis única o blísteres que los usados en los envases de
prueba, para utilizarlos como control. Almacenar todos los envases a una humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de
23 ± 2º. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un dese-
cador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros métodos para mantener estas condiciones.] Después de un
intervalo de 24 horas, y a cada intervalo múltiplo de éste (ver Resultados), retirar los envases de la cámara y dejar que se equili-
bren durante 45 minutos. Registrar los pesos de los envases individuales y devolverlos a la cámara. Pesar los envases de control
como una sola unidad y dividir el peso total por el número de envases de control para obtener el peso promedio del paquete
vacío. [NOTA-Si algún gránulo indicador se torna de color rosado durante el procedimiento, o si el aumento promedio del
peso del pellet en cualquier paquete excede de 10%, terminar la prueba y considerar válidas sólo las determinaciones anterio-
res.] Calcular la velocidad promedio de permeabilidad a la humedad, en mg por día, para cada envase de dosis única o blíster
en cada paquete tomado, por la fórmula:

en donde N es el número de días transcurridos en el período de prueba (comenzando después del período de equilibrio inicial
de 24 horas), X es el número de unidades selladas por separado por paquete, (WF - W es la diferencia, en mg, entre el peso
1)

final y el peso inicial de cada envase de prueba y (CF - C es la diferencia, en mg, entre el peso promedio final y el peso pro-
1)

medio inicial de los envases de control, calculando las velocidades con dos cifras significativas.
Resultados-Los envases de dosis única individuales probados según el Método /se designan Clase A si no más de 1 de los
1O envases probados excede de 0,5 mg por día de velocidad de permeabilidad a la humedad y ninguno excede de 1 mg por
día; se designan Clase B si no más de 1 de 1 O envases probados excede de 5 mg por día y ninguno excede de 1O mg por día;
se designan Clase C si no más de 1 de 1O envases probados excede de 20 mg por día y ninguno excede de 40 mg por día; y se
designan Clase O si los envases probados no cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de permeabilidad a la hume-
dad.
Los envases probados según el Método 11 se designan Clase A si ningún envase probado excede de 0,5 mg por día de veloci-
dad promedio de permeabilidad a la humedad del blíster; se designan Clase B si ningún envase probado excede de 5 mg por
día de velocidad promedio de permeabilidad a la humedad del blíster; se designan Clase C si ningún envase probado excede
de 20 mg por día de velocidad promedio de permeabilidad a la humedad del blíster; y se designan Clase O si los envases pro-
bados no cumplen con ninguno de los requisitos anteriores de velocidad promedio de permeabilidad a la humedad del blíster.
Utilizando el Desecante descrito en este documento, tal como se indica en el Método I y el Método 11, después de cada 24
horas, pesar los envases de prueba y de control; los intervalos de prueba apropiados para las pesadas finales, WF y CF, son los
siguientes: 24 horas para la Clase O, 48 horas para la Clase C, 7 días para la Clase By no menos de 28 días para la Clase A.

4 Las comparaciones exactas de envases Clase A pueden exigir períodos de prueba de más de 28 días si las pesadas se realizan en una balanza para preparar
medicamentos recetados Clase A (ver Balanzas y Aparatos Volumétricos poro Preparar Medicamentos Recetados (1176\). El uso de una balanza analítica que permita
registrar los pesos con una sensibilidad de décima o centésima de miligramo lleva a una caracterización más precisa entre envases y/o períodos de prueba más
cortos.
 •
418 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas USP 37

Envases de Unidades Múltiples y Envases de Dosis Única para Líquidos

Las normas y pruebas que se proporcionan en esta sección miden las características funcionales y de desempeño de los fras-
cos usados para envasar productos acuosos mediante la medición de la pérdida de peso de agua líquida como porcentaje del
contenido. Esta prueba también puede emplearse para demostrar la equivalencia funcional o de desempeño. [NOTA-Durante
todo el proceso que se describe a continuación, determinar el peso de los sistemas de envase-cierre individuales (frasco, sello
interno si se ha usado y cierre) como pesos de tara y como pesos de llenado, con una aproximación de O, 1 mg si la capacidad
de desborde del frasco es menos de 200 mL, con una aproximación de un mg si la capacidad de desborde del frasco es mayor
o igual a 200 mL pero menos de 1 000 mL, o con una aproximación de un centigramo (1 O mg) si la capacidad de desborde del
frasco es mayor o igual a 1000 mL.]
Procedimiento-Seleccionar 12 frascos de tipo y tamaño uniforme y limpiar las superficies de sellado con un paño que no
suelte pelusa. Acondicionar cada frasco con un sello, recubrimiento interno de cierre (si corresponde) y cierre. Numerar cada
sistema de envase-cierre y regi~trar el peso de tara.
Retirar los cierres y, usando una pipeta, llenar 1 O frascos con agua hasta la capacidad de llenado. Llenar 2 envases con perlas
de vidrio hasta aproximadamente el mismo peso de los envases de prueba llenos. Si se emplean cierres de rosca, aplicar la
fuerza de torsión que esté comprendida dentro del intervalo especificado en la Tabla 7, y almacenar los envases sellados a una
temperatura de 25 ± 2º y a una humedad relativa de 40 ± 2%. Después de 336± 1 horas (14 días), registrar el peso de los enva-
ses individuales y calcular la velocidad de pérdida de peso de agua, en porcentaje por año, para cada frasco tomado, por la
fórmula:
(W,, - WT) - (W 14 ; - WT) - (WC, - WC 14 ) 365 x 100/(W,; - WT)l 4 =Porcentaje por año

en donde W 1 ; es el peso inicial de cada frasco (i); WT es el peso de tara; W14 ; es el peso de cada frasco (i) a los 14 días; y (WC, -
WC 14) es el cambio de peso promedio de los controles desde el inicio hasta los 14 días.
Los envases así analizados cumplen con los requisitos y se consideran envases impermeables si el porcentaje de pérdida de
peso de agua no excede de 2,5% por año en no más de 1 de los 1 O envases de prueba y ninguno excede de 5,0% por año.

PRUEBA DE TRANSMISIÓN DE LUZ

Aparatos-Utilizar un espectrofotómetro de sensibilidad y exactitud adecuadas, adaptado para medir la cantidad de luz
transmitida a través de los materiales plásticos o de vidrio transparentes o translúcidos usados en los envases farmacéuticos.
Además, el espectrofotómetro tiene la capacidad de medir y registrar la luz transmitida en haces difusos o paralelos.
Procedimiento-Seleccionar trozos que representen el promedio del espesor de la pared. Cortar secciones circulares de dos
o más áreas del envase y recortarlas, según sea necesario, para obtener segmentos de un tamaño adecuado para montarlos en
el espectrofotómetro. Después de cortarlas, lavar y secar cada muestra, cuidando de no rayar las superficies. Si la muestra fuera
demasiado pequeña para abarcar la abertura del portamuestras, tapar el espacio sobrante de la abertura con un papel opaco o
una cinta adhesiva, siempre y cuando la longitud de la muestra exceda la de la ranura del espectrofotómetro. Limpiar la mues-
tra inmediatamente antes de montarla en el portamuestras con papel para limpiar objetivos. Montar la muestra con ayuda de
una cera adherente, o empleando otro medio adecuado, y tomar las precauciones necesarias para evitar dejar huellas digitales
u otras marcas en las superficies a través de las cuales debe pasar la luz. Colocar la sección en el espectrofotómetro con su eje
cilíndrico paralelo al plano de la ranura y aproximadamente centrado en relación a la ranura. Cuando está correctamente colo-
cada, el haz de luz es normal en relación a la superficie de la sección y las pérdidas por reflexión son mínimas.
Medir continuamente la transmitancia de la sección en relación al aire en la región espectral de interés con un instrumento
de registro o a intervalos de aproximadamente 20 nm con un instrumento manual, en la región de 290 nm a 450 nm.
Límites-La transmisión de la luz observada no excede los límites que se proporcionan en la Tabla 2 para envases destina-
dos para uso parenteral.
Tabla 2. Límites para Plásticos de Clases 1-VI y
Vidrios de Tipos 1, 11 y 111
Porcentaje Máximo de Transmisión de Luz a cualquier Longitud de Onda entre 290 nm y 450 nm
Tamaño Nominal
(en mL) Envases Sellados a la Llama Envases con Cierre
1 50 25
2 45 20
5 40 15
10 35 13
20 30 12
50 15 10

5 Para información más detallada en relación con el aparato y los procedimientos, puede referirse a las siguientes publicaciones de la American Society for Testing
and Materials, 100 Barr Harbar Orive, West Conshohocken, PA 19428-2959: "Standard Method of Test for Haze and Luminous Transmittance of Transparent Plas-
tics," ASTM Method Dl 003-07; "Tentative Method of Test for Luminous Reflectance, Transmittance and Color of System"ASTM Method E308-06.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (691) Algodón 419

[NOTA-La transmisión de cualquier envase de tamaño intermedio a los citados en la tabla no es superior a la transmisión del
envase de tamaño inmediato superior citado en la tabla. Si se trata de envases con tamaños superiores a 50 mL, se aplican los
límites establecidos para los de 50 mL.]
La transmisión de luz observada para envases plásticos para productos destinados a la administración oral o tópica no exce-
de de 10% a cualquier longitud de onda en el intervalo de 290 nm a 450 nm.

(691) ALGODÓN

Antes de determinar la absorbencia y la longitud de la fibra, extraer el Algodón de su envoltorio y acondicionarlo durante no
menos de 4 horas en una atmósfera estándar a una humedad relativa de 65 ± 2% a 21 ± 1, 1 º (70 ± 2ºF).

Prueba de Absorbencia

Procedimiento-Preparar una canastilla de prueba usando alambre de cobre de aproximadamente 0,4 mm de diámetro (N
º 26 B. &. S.) que no pese más de 3 g, con forma de cilindro de aproximadamente 5 cm de diámetro y 8 cm de profundidad y
con espacios de aproximadamente 2 cm entre cada alambre. Tomar porciones de algodón purificado que pesen 1 ± 0,05 g de
cinco partes diferentes del paquete, tirando pero sin cortar. Colocar las porciones combinadas en la canastilla y pesar. Sostener
la canastilla por uno de los lados aproximadamente a 12 mm por encima de la superficie del agua a 25 ± 1 ºy, luego, dejarla
caer en el agua. Determinar, preferentemente mediante el uso de un cronómetro, el tiempo requerido en segundos hasta que
la canastilla se sumerja completamente.
Retirar la canastilla del agua, dejar que se escurra durante 1 O segundos en la misma posición horizontal; luego colocarla de
inmediato en un recipiente tarado cubierto y pesarla. Restar el peso de la canastilla de prueba y del algodón purificado para
determinar el peso del agua absorbida.

Longitud de Fibra

Para determinar la longitud y la distribución de la longitud de las fibras de algodón en el algodón purificado emplear el si-
guiente método:
Llevar a cabo todas las operaciones asociadas con la determinación de la longitud de fibra del algodón purificado en una
atmósfera estable de humedad relativa de 65 ± 2% a 21 ± 1, 1 º (70 ± 2ºF).
Estas instrucciones describen la modalidad de procedimiento que se adecúa bien al clasificador* de mayor uso en la actuali-
dad en los Estados Unidos.
Aparato-El clasificador (ver ilustración)

Clasificador Doble de Fibra de Algodón

consta de dos bancos de peines rígidamente montados uno al lado del otro sobre una base común. Cada banco de peines
consta de por lo menos 12 peines individuales, separados 3,2 mm uno detrás de otro y montados en ranuras para que a medi-
da que se acercan durante el proceso de fraccionamiento y cuando ya no sean necesarios, puedan descender debajo del plano
de trabajo. Cada peine individual tiene una sola fila de dientes puntiagudos de 12 mm de largo exactamente alineados, que
son agujas de 0,38 mm de diámetro. Los dientes están espaciados a una distancia de 62 a 25 mm entre sí a lo largo de una
extensión de aproximadamente 50 mm.
El equipo accesorio consta de pinzas para clasificar las fibras, una rejilla para comprimir la fibra, una placa lisa para compri-
mir la fibra y placas recubiertas de terciopelo. Las pinzas clasificadoras constan de dos piezas de latón de aproximadamente
75 mm de largo unidas en uno de sus extremos y ligeramente curvadas en forma de pico en el otro para agarrar las fibras que

* NOTA-El método aquí descrito se adapta especialmente al aparato clasificador Suter-Webb Duplex Cotton Fiber, pero introduciendo alteraciones más o menos
obvias en el procedimiento, también se puede llevar a cabo con dos clasificadores Baer dispuestos en serie, o con un aparato )ohannsen u otro aparato similar.
420 (691) Algodón/ Pruebas Físicas USP 37

sobresalgan cerca de la superficie de los peines. Por lo general, uno de los bordes sujetadores posee un almohadillado de cuero
o de otro material fibroso. El borde por el que se toman las fibras tiene un ancho de aproximadamente 19 mm.
La rejilla que comprime las fibras consta de una serie de varillas de latón separadas a una distancia de 3,2 mm entre sí para
que puedan colocarse entre los peines a fin de apretar las fibras entre los dientes. La placa lisa para comprimir las fibras consta
de una placa pulida de latón de aproximadamente 25 x 50 mm con una perilla o mango en la superficie superior, mediante el
cual la placa puede pasarse sobre las fibras cuando éstas se colocan en la superficie de las placas recubiertas de terciopelo. Las
placas recubiertas de terciopelo, sobre las cuales se pueden distribuir las fibras, son láminas de aluminio de aproximadamente
1 00 mm x 225 mm x 2,4 mm de espesor, recubiertas sobre ambos lados con terciopelo de alta calidad, preferentemente de
color negro.
Selección del Algodón-Después de desenrollar el algodón, preparar una muestra de prueba representativa tomando, de
un paquete que contenga de 8 a 16 onzas, 32 trozos pequeños (de aproximadamente 75 mg cada uno) bien distribuidos en
todo el volumen del rollo, tomando 16 trozos representativos de cada mitad longitudinal del rollo. Evitar los extremos cortados
del rollo y tener la precaución de tomar porciones de todo el espesor del rollo. Para evitar que se seleccionen sólo las fibras
largas o las cortas, extraer todas las fibras tomadas del grupo cuidando que no se resbalen entre los dedos.
De los paquetes de no más de 4 onzas de peso, tomar 8 trozos y de los envases de más de 4 onzas pero no más de 8 onzas,
tomar 16 trozos, en forma bien distribuida.
Mezclar muy bien los trozos en pares y combinar cada par tirando y enrollando suavemente entre los dedos. Luego fraccio-
nar cada par combinado dividiéndolos longitudinalmente en dos partes aproximadamente iguales y utilizar una parte en el
mezclado adicional. (La otra parte puede descartarse o reservarse para cualquier prueba o control adicional.)
Repetir el proceso descrito en el párrafo anterior con las sucesivas mitades de la serie bifurcada hasta que sólo se obtenga un
trozo: la porción de prueba final integrada. Enderezar suavemente y colocar en forma paralela las fibras de la porción de prue-
ba final integrada extrayéndolas y enrollándolas entre los dedos. Tomar la precaución de retener todas las fibras, en lo posible
incluyendo aquellas que forman botones (partículas de fibras enmarañadas) y lanillas (masas apelmazadas de fibras), desechan-
do sólo las motas (fragmentos de semillas inmaduras con fibras) y todo material extraño que no sea fibra, como por ejemplo
tallos, hojas y fragmentos de las cáscaras de las semillas.
De la porción final integrada descrita en el párrafo anterior, separar longitudinalmente una porción de prueba de 75 ± 2 mg,
pesada con exactitud. Retener el residuo para cualquier prueba de control que pudiera ser necesaria.
Procedimiento-Con la rejilla para comprimir las fibras, insertar cuidadosamente la porción de prueba pesada en un banco
de peines del clasificador de algodón de modo tal de que se extienda a través de los peines en ángulos aproximadamente
rectos.
Con las pinzas clasificadoras, tomar por los extremos libres una porción pequeña de las fibras extendiéndolas a través de los
dientes del peine más cercano al operador. En forma suave y pareja, halar las fibras para que emerjan de los peines hacia ade-
lante y transferirlas a las puntas de los dientes en el segundo banco de peines; colocarlas en forma paralela entre sí y en un
ángulo aproximadamente recto con respecto a las caras de los peines, liberando los extremos sujetos tan cerca de la cara del
peine frontal como sea posible. Con la rejilla para comprimir las fibras, apretar cuidadosamente las fibras transferidas a los
dientes de los peines. Continuar la operación hasta que se hayan transferido todas las fibras al segundo banco de peines. Du-
rante esta transferencia de las fibras, soltar en forma sucesiva los peines del primer banco una vez que todas las fibras sobresa-
lientes hayan sido retiradas.
Girar la máquina a 180º y transferir las fibras de algodón nuevamente al primer banco de peines de la manera descrita en el
párrafo anterior.
Asegurarse bien de emparejar los extremos de las fibras durante las dos transferencias anteriores, acomodándolas lo más cer-
ca posible a la superficie frontal del peine próximo. Este emparejamiento de las puntas de las fibras sobresalientes también
puede incluir la extracción de fibras desparejas del frente o de la parte de atrás de los bancos de peines, para volver a colocar-
las dentro o sobre el manojo principal de algodón en los peines.
Girar nuevamente la máquina a 180º. Soltar en forma sucesiva los peines, si fuera necesario, para exponer los extremos de
las fibras más largas. Puede ser necesario volver a depositar algunas fibras desparejas. Con las pinzas extraer las pocas fibras
que más sobresalgan. Continuar extrayendo de esta manera las fibras sobresalientes que queden en la parte opuesta a la cara
frontal del peine más próximo. Soltar este peine y repetir la serie de operaciones de la misma manera hasta que se hayan ex-
traído todas las fibras. Para no alterar excesivamente la porción de prueba y de ese modo viciar el fraccionamiento de longitu-
des en grupos, hacer varias tracciones (8 a 1 O) entre cada par de peines.
Colocar las tracciones sobre las placas recubiertas con terciopelo una al lado de la otra, tan derechas como sea posible, con
los extremos lo mejor definidos que sea posible y con los extremos distales colocados en una línea recta. Presionar luego hacia
abajo suavemente y en forma homogénea con la placa para comprimir fibras antes de liberar la tracción de las pinzas. Emplear
no menos de 50 y no más de 1 00 tracciones para fraccionar la porción de prueba.
Agrupar todas las fibras que midan 12,5 mm (aproximadamente media pulgada) o más de longitud y pesar el grupo con
una aproximación de 0,3 mg. De la misma manera, agrupar todas las fibras de 6,25 mm (aproximadamente 1 /4 de pulgada) o
menos de longitud y pesar de la misma manera. Finalmente, agrupar las fibras restantes de longitudes intermedias y pesarlas.
La suma de los tres pesos no difiere del peso inicial de la porción de prueba en más de 3 mg. Dividir el peso de cada uno de los
dos primeros grupos por el peso de la porción de prueba para obtener el porcentaje, en peso, de fibra en los dos intervalos de
longitud.
USP 37 Pruebas Físicas/ (696) Sólidos Cristalinos 421

(695) CRISTALINIDAD

Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento con los requisitos de cristalinidad establecidos en la monografía indi-
vidual de un fármaco.
Procedimiento-En Microscopía Óptica (776) se describe un detallado procedimiento de la prueba.

(696) CARACTERIZACIÓN DE SÓLIDOS CRISTALINOS POR

MICROCALORIMETRÍA Y CALORIMETRÍA DE DISOLUCIÓN

Para los propósitos de este capítulo, los materiales cristalinos, parcialmente cristalinos y amorfos se consideran sólidos.

INTRODUCCIÓN-EL CONCEPTO DE CRISTALINIDAD

Una retícula cristalina perfectamente ordenada, donde cada molécula ocupa su lugar esperado en la retícula es un ideal que
casi nunca se logra. El otro extremo es el estado amorfo, en el que un sólido contiene la mayor densidad posible de imperfec-
ciones (defectos de diversas dimensionalidades), donde se pierde todo el orden de largo alcance y donde sólo permanece el
orden de corto alcance, impuesto por las moléculas adyacentes más cercanas. Los cristales reales están en algún punto entre
estos dos extremos. La posición de un cristal en una escala delimitada por estos dos extremos se denomina cristalínidad.
Todos los cristales reales, incluso los que están en estado puro, poseen algunas imperfecciones o defectos en su retícula, que
incrementan tanto la energía (entalpía en condiciones de presión atmosférica constante) como el desorden (expresado como
la entropía) de su retícula cristalina. Se dice que un cristal es altamente cristalino cuando posee una densidad relativamente
baja de imperfecciones y una cristalinidad alta. Por el contrario, una partícula con una densidad de imperfecciones relativa-
mente alta se dice que es parcialmente amorfa y que posee una baja cristalinidad. En términos ideales, a una partícula total-
mente amorfa le corresponde una cristalinidad de cero. Las partículas amorfas pueden contener dominios ordenados de algu-
na manera que pueden actuar como núcleos para la cristalización; de tales partículas denominadas amorfas se dice que poseen
una cristalinidad de bajo nivel pero finita.
La capacidad de detectar y cuantificar la cantidad de material amorfo dentro de una sustancia altamente cristalina es de
gran importancia durante el desarrollo y la fabricación subsiguiente de una preparación farmacéutica.
En realidad, un polvo probablemente contiene partículas con diferentes grados de cristalinidad, así como puede contener
partículas con formas y tamaños variados. Cuanto más baja es la cristalinidad de un sólido, mayor es su entalpía y su entropía.
El aumento de la entalpía nunca se compensa totalmente con el incremento en la entropía; por lo tanto, la energía libre de
Gibbs, que refleja el equilibrio entre ambas, tiene un aumento neto. Así, cuanto más baja es la cristalinidad de un material
(polvo), y consecuentemente, cuanto mayor es su carácter amorfo, mayor es su solubilidad intrínseca aparente y su velocidad
de disolución, pero menor es su estabilidad termodinámica. Debido a la gran relevancia de estas propiedades, la cristalinidad
es asimismo una propiedad importante y es necesario medirla mediante un método adecuado.
En este capítulo, la cristalinidad o el contenido de partes amorfas de un polvo se miden mediante métodos de calorimetría,
tales como microcalorimetría o calorimetría de disolución, aunque se pueden emplear otros métodos (p.ej., ver el capítulo ge-
neral Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP) (941 )).
Muchas sustancias son capaces de cristalizar en más de un tipo de retícula cristalina, lo que se conoce como polimorfismo.
Cuando se incorpora agua o un disolvente en la retícula cristalina, a los cristales se les denomina hidratos o solvatos. Debido al
diferente orden cristalino y/o conformación molecular y energía de la retícula, las distintas formas cristalinas a menudo presen-
tan distintas propiedades físicas. Por cuestiones de simplicidad, las mediciones de calorimetría para determinar el grado de cris-
talinidad discutida en este capítulo asumen una forma cristalina sólida que se halla presente sólo en el material de interés. La
teoría y técnica experimental se pueden expandir fácilmente a sistemas polimórficos tomando las consideraciones adecuadas
de las diferencias de entalpía entre los polimorfos.

MÉTODO 1-MICROCALORIMETRÍA (DETERMINACIÓN DE CONTENIDO AMORFO)

La mayoría de los procesos químicos, físicos y biológicos tienen un intercambio de calor asociado. La microcalorimetría es
una técnica altamente sensible para monitorear y cuantificar los cambios exotérmicos (que producen de calor) y endotérmicos
(que absorben calor) asociados con tales procesos. La técnica permite determinar la velocidad y extensión de las reacciones
químicas, los cambios de fase o los cambios de estructura.
Se pueden observar eventos térmicos que producen únicamente una fracción de un microvatio usando microcalorimetría.
Esto significa que se deben detectar diferencias de temperatura menores de 10- 6 K. La microcalorimetría por lo regular emplea
el principio de flujo de calor (pérdida de calor), donde, en un vaso definido térmicamente, el calor producido (o absorbido)
422 (696) Sólidos Cristalinos/ Pruebas Físicas USP 37

fluye desde (o hacia dentro del) vaso en un esfuerzo por restablecer el equilibrio térmico con su entorno. La estabilidad térmica
excepcional con sus alrededores debe obtenerse mediante un aislador de calor (heat sink) o un entorno regulado electrónica-
mente.
La energía térmica de una muestra activa en el vaso de reacción se canaliza generalmente a través de elementos Peltier; di-
chos elementos actúan como generadores termoeléctricos usando el efecto Seebeck. La energía térmica se convierte en una
señal de voltaje proporcional al flujo de calor.
Por lo general, los resultados se presentan como una medición de la energía térmica producida por unidad de tiempo (Va-
tio) en función del tiempo.

Aparato

Los microcalorímetros a menudo se diseñan como sistemas gemelos con un vaso de medición y un vaso de referencia. Los
vasos generalmente están hechos de vidrio o acero inoxidable. Para ciertas aplicaciones, se pueden usar vasos especialmente
diseñados que permiten la adición de un material gaseoso, líquido o sólido.

Calibración

El microcalorímetro se calibra para el flujo de calor (energía por unidad de tiempo) usando fuentes de calor eléctrico exter-
nas o internas o una reacción estándar adecuada.

Sensibilidad

La sensibilidad del método micocalorimétrico se puede evaluar con respecto a una muestra estándar apropiada, que se anali-
za de acuerdo con el método correspondiente en conjunto con la determinación del ruido de la línea base del instrumento.

Procedimiento

Pesar una cantidad apropiada del material en un vaso adecuado. Cerrar el vaso cuidadosamente para evitar cualquier evapo-
ración de disolventes y colocar los vasos en el portamuestras. Si resulta apropiado, permitir que el vaso se equilibre a la tempe-
ratura de la medición antes de colocarlo en la posición de medición.
Comenzar el análisis y registrar el flujo de calor con el tiempo sobre la abscisa y el flujo de calor sobre la ordenada (especifi-
car la dirección del flujo de calor exotérmico o endotérmico).
Detección y Cuantificación de Contenido Amorfo en Polvos-El estado amorfo es metaestable con respecto al estado
cristalino; por consiguiente, puede producirse recristalización. La medición del calor de recristalización permite determinar el
contenido amorfo mediante el área del pico de recristalización. Resulta posible cuantificar el contenido amorfo de la muestra
relacionando el resultado del microcalorímetro para una muestra con el obtenido a partir de un estándar amorfo. El intervalo
de contenido amorfo abarcado por este método depende de la sustancia individual que se va a analizar. En casos favorables, se
pueden alcanzar límites de detección por debajo de 1%.
Es posible iniciar la recristalización sometiendo la muestra a una humedad relativa más alta o a una atmósfera que contenga
vapor orgánico. La muestra generalmente se coloca en una ampolla que también contiene un pequeño tubo de ensayo que a
su vez contiene una solución salina acuosa saturada, un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes.
El calor de recristalización por lo regular se mide usando una masa de muestra fija colocada en un vaso de vidrio o acero. Al
seleccionar el tubo de ensayo que contiene la solución salina saturada o el disolvente orgánico se debe optar por un tubo lo
suficientemente largo para permitir una saturación total de la atmósfera sobre la muestra. La masa de la muestra y la naturale-
za de la atmósfera de vapor sobre la muestra deben permitir que la recristalización ocurra de tal forma que se observe un pico
definido, claramente separado de los eventos térmicos iniciales ocasionados por la introducción de la muestra.
Las condiciones en las que ocurra la transición de la fase amorfa a un estado cristalino termodinámicamente más estable
tendrán un impacto significativo sobre el tiempo de recristalización. En particular, las mezclas físicas de material puramente
amorfo y cristalino se comportarán de forma diferente a un material parcialmente cristalino. Estos efectos se deben tomar en
cuenta al desarrollar un método.
La Figura 7 muestra una respuesta típica para la recristalización de un material mayoritariamente amorfo. La primera parte de
la curva representa diversos procesos concurrentes que ocurren de manera simultánea, tales como la absorción de vapor de
agua en las partes amorfas del polvo y por la generación de vapor de agua a partir del tubo de ensayo. Después de esta res-
puesta inicial, se presenta una gran respuesta exotérmica ocasionada por la recristalización del material amorfo. También in-
cluida, aunque inobservable, está la expulsión del exceso de agua de las partes recristalizadas y su condensación. Por consi-
guiente, el área bajo esta respuesta de recristalización exotérmica es proporcional al calor de recristalización.
USP 37 Pruebas Físicas/ (696) Sólidos Cristalinos 423

2,5
11

§"
2: 1,5
ni
·~
:g 1
w

0,5

o 1 2 3
Tiempo (Horas)

Figura 1. Resultado microcalorimétrico típico de energía (en µW) en función del tiempo (en horas): pico de colapso amorfo
(1) y pico de recristalización (11) para lactosa mayoritariamente amorfa a 25º y a una humedad relativa de 75%.

MÉTODO 2-CALORIMETRÍA DE DISOLUCIÓN (DETERMINACIÓN DE CRISTALINIDAD)

La calorimetría de disolución proporciona un medio para determinar la entalpía de disolución (es decir, el calor de disolución
a presión atmosférica constante) de una sustancia. La entalpía de disolución se define como la entalpía de la sustancia disuelta
en la solución a una concentración definida, menos la entalpía de la sustancia original. El disolvente para el proceso de disolu-
ción debe ser tal que la masa del sólido se disuelva dentro de un intervalo de tiempo que corresponda con el tiempo de res-
puesta del calorímetro, según se analiza a continuación. La entalpía de una disolución es proporcional a la cantidad de sólido
que se disuelve. Esta cantidad se puede definir como un mol para la entalpía molar o un gramo para la entalpía específica. Si la
sustancia posee una pureza adecuada (según se determina mediante el grado de exactitud requerida) y se conoce su masa
molecular, se prefiere la entalpía molar; en caso contrario, se emplea la entalpía específica. La entalpía de disolución depende
levemente tanto de la temperatura, que generalmente es de 25,0º, como de la concentración final del soluto disuelto.
Por lo general, se prefiere expresar la cristalinidad, Pe, de una sustancia en una escala porcentual. Este procedimiento requie-
re de dos estándares de referencia, a saber, una muestra altamente cristalina para la que se asume una cristalinidad de 100% y
que posea una entalpía de disolución medida de AH'e1 y una muestra amorfa para la que se asume una cristalinidad de 0% y
que posea una entalpía de disolución medida de AH'0 • A partir de estos valores y de la entalpía, AHs,, la disolución medida del
sólido en análisis, se puede calcular la cristalinidad porcentual del sólido, Pe1 según se indica a continuación:

pe(%)= 1 OO(AHs, - AH'a)l(AH'e - AH'a)

Resulta claro que la cristalinidad expresada en una escala porcentual depende de tres valores medidos y que las entalpías de
disolución se pueden reemplazar por otras cantidades físicas correspondientes que dependan de la cristalinidad. Sin embargo,
el valor de la cristalinidad porcentual de una muestra depende no sólo de la naturaleza y del método de preparación de los dos
estándares de referencia, sino también de la elección de la cantidad física que se mide.
La entalpía de la disolución se mide ya sea mediante un calorímetro de disolución isoperibólico (con perímetro constante, es
decir, camisa) o mediante un calorímetro de disolución isotérmico (con temperatura constante). Por lo general, se realizan co-
mo mínimo tres mediciones con cada muestra. Posteriormente, se calcula la media aritmética de estos tres valores. Los requisi-
tos exactos dependerán de la capacidad del equipo y del grado de exactitud requerido.

Calorimetría de Disolución lsoperibólica

En el calorímetro de disolución isoperibólico, el cambio de temperatura durante el proceso de disolución ocasiona un cam-
bio correspondiente en la temperatura del sistema disolvente-soluto (es decir, en la solución). Este cambio de temperatura se
mide con un sensor de temperatura, que está conectado a un circuito eléctrico que registra una señal eléctrica que correspon-
de al cambio de temperatura. Por lo regular, este cambio de temperatura en forma electrónica se mide a intervalos de tiempo
definidos con precisión para proporcionar datos de temperatura-tiempo que una computadora recoge, analiza y posterior-
mente grafica. Una corrida con un blanco sin la adición del soluto sólido al disolvente normalmente no muestra un cambio
discernible en la pendiente de la gráfica de temperatura-tiempo.
Para los calorímetros de disolución isoperibólicos, la respuesta es lo suficientemente rápida, pero se deben hacer correccio-
nes por cualquier pérdida o ganancia de calor originada a partir del baño. Por lo tanto los calorímetros de disolución isoperibó-
licos tienen más ventajas que los calorímetros de disolución isotérmica cuando el proceso de disolución es relativamente rápi-
do. Para todas las mediciones de la entalpía de la disolución empleando calorímetros de disolución isoperibólicos, la elección
424 (696) Sólidos Cristalinos/ Pruebas Ffsicas USP 37

del disolvente es un paso crítico. La naturaleza y la masa del disolvente y la masa de la muestra se eligen de forma que el
cambio de calor total correspondiente a la disolución total del sólido se complete en el plazo de cinco minutos agitando vigo-
rosamente a una velocidad de rotación constante dentro del intervalo de 400-600 revoluciones/minuto.
Se determina la capacidad de calor efectiva de la celda del calorímetro y su contenido para cada corrida del calorímetro. Esta
determinación se logra mediante el calentamiento eléctrico del contenido de la celda del calorímetro. La capacidad térmica
efectiva se determina de acuerdo con uno de dos protocolos-realizando una determinación después del rompimiento de la
ampolla o realizando una determinación antes y una segunda determinación después del rompimiento de la ampolla, y poste-
riormente promediando los dos resultados. La exactitud y confiabilidad del calentamiento eléctrico se establecen mediante la
exactitud y confiabilidad de las calibraciones químicas anteriormente mencionadas.

Calorimetría de Disolución Isotérmica

En el calorímetro de disolución isotérmico (temperatura constante), el cambio de temperatura durante el proceso de disolu-
ción se compensa mediante un cambio de energía igual pero opuesto, de tal manera que la temperatura del sistema disolven-
te-soluto (es decir, en la solución) se mantenga esencialmente constante. Este cambio igual pero opuesto de energía se mide
y, cuando se invierte su signo, proporciona la entalpía de disolución. Para calorímetros isotérmicos, la respuesta es relativamen-
te lenta, pero el proceso de compensación elimina el efecto de pérdidas o ganancias de calor causadas por el baño. Por lo
tanto, los calorímetros de disolución isotérmicos son más ventajosos que los calorímetros de disolución isoperibólicos cuando
el proceso de disolución es relativamente lento.

Solución de Calibración del Calorímetro

Para asegurar la exactitud del calorímetro, se deben realizar calibraciones químicas regularmente. Para una disolución endo-
térmica, la calibración del calorímetro se verifica midiendo el calor absorbido durante la disolución de cloruro de potasio en
agua destilada a 298, 15 K (25,0º). El cambio de entalpía establecido en este proceso endotérmico es 235,5 J/g (1 7,56 kj/mol).
Para una disolución exotérmica, el calorímetro se verifica midiendo el calor producido durante la disolución de 5 g/L de trome-
tamina [tris(hidroximetil)aminometano, THAM] en una solución acuosa de ácido clorhídrico O, 1 M a 298, 15 K (25,0º). El calor
establecido para el proceso mencionado anteriormente es de -246,0 j/g (-29,80 kj/mol).

Manejo de la Muestra

La estabilidad química y física de los sólidos puede verse reducida al disminuir la cristalinidad. En particular, los sólidos de
baja cristalinidad, especialmente los sólidos amorfos, tienden a absorber vapor de agua de la atmósfera, lo que provoca cristali-
zación y un aumento correspondiente en la cristalinidad. Por estos motivos, las muestras anhidras cuya cristalinidad se va a
determinar, deben almacenarse en condiciones de cero humedad o a niveles inferiores a la humedad crítica en cámaras sella-
das que contengan un desecante que preferentemente contenga un indicador de eficacia. Cuando se van a llevar a cabo estu-
dios de cristalinidad-humedad, la muestra se almacena en una cámara sellada que contenga una solución salina saturada para
proporcionar una humedad relativa definida.

(698) VOLUMEN DE ENTREGA

PROPÓSITO

Las siguientes pruebas están diseñadas para garantizar que las preparaciones líquidas orales, cuando se transfieren desde su
envase original, entreguen el volumen de la forma farmacéutica que se declara en la etiqueta del artículo.

ALCANCE

Estas pruebas se aplican a productos que se dispensan vertiendo desde el envase. Estas pruebas se aplican a productos que
se suministran como preparaciones líquidas o como preparaciones líquidas reconstituidas a partir de sólidos mediante el agre-
gado del volumen determinado del diluyente especificado. Estas pruebas no son obligatorias para los artículos envasados en
envases unitarios cuando la monografía incluye la prueba de Uniformidad de Unidades de Dosificación (905).

DETERMINACIÓN DE DENSIDAD

Debido a la tendencia de las preparaciones líquidas orales a atrapar aire al ser agitadas o transferidas, determinar primero la
masa entregada resulta un método más exacto de determinación del volumen entregado, usando luego la densidad del mate-
USP 37 Pruebas Físicas/ (698) Volumen de Entrega 425

rial para convertir la masa en volumen entregado. Para usar este método, se requiere una determinación de la densidad del
material. A continuación se indica un método para determinar la densidad:
1. Tarar un matraz volumétrico de 100 ml que contenga 50,0 ml de agua.
2. Agregar aproximadamente 25 g de producto bien agitado, agitando el contenido por rotación suave hasta mezclar.
3. Volver a pesar el matraz.
4. Agregar desde una bureta, una cantidad de agua medida con exactitud hasta llevar el contenido del matraz a volumen,
mientras se agita por rotación suave. Registrar el volumen agregado desde la bureta.
5. Calcular la densidad de la muestra:
W/V
en donde W es el peso, en g, del material tomado; y V es 50,0 ml menos el volumen de agua necesario para ajustar el conteni-
do del matraz a volumen, en ml. Se pueden usar otros métodos para determinar la densidad, dependiendo de la formulación
(p.ej., formulaciones sustancialmente no acuosas).

PREPARACIONES DE PRUEBA

Para determinar el volumen de entrega, seleccionar no menos de 30 envases y proceder del siguiente modo para la forma
farmacéutica correspondiente.
Soluciones Orales y Suspensiones Orales-Agitar individualmente el contenido de 1 O envases.
Polvos Cuyas Etiquetas Declaran el Volumen de la Preparación Líquida Oral que Resulta cuando el Polvo se
Reconstituye con el Volumen de Diluyente Declarado en el Etiquetado-Reconstituir 1O envases con el volumen de dilu-
yente declarado en el etiquetado, medido con exactitud, y agitar individualmente.

PROCEDIMIENTO

El volumen de entrega se puede determinar por peso, según se indica a continuación:

1. Vaciar el contenido del envase en un recipiente tarado adecuado (dejando que escurra durante no más de 5 segundos
para envases unitarios, y no más de 1 O minutos para envases de unidades múltiples).
2. Determinar la masa del contenido.
3. Calcular el volumen usando la densidad .
Como alternativa, se puede usar el siguiente procedimiento por volumen:
1 . De acuerdo con las condiciones de uso, o según se indique en el etiquetado, vaciar cuidadosamente el contenido de cada
envase en sendas probetas individuales, graduadas y secas, con una capacidad marcada que no exceda de dos veces y
media el volumen a medir, y calibradas "para contener" (ver Aparatos Volumétricos (31 )). Se debe tener cuidado de evitar
que se formen burbujas de aire durante el proceso. Si el etiquetado carece de instrucciones, sujetar los envases en un án-
gulo de aproximadamente 30º con respecto a la horizontal y vaciar, cuidadosamente, el contenido en la probeta gradua-
da.
2. Dejar escurrir cada envase durante un periodo que no exceda de 1O minutos para envases de unidades múltiples y 5 se-
gundos para envases unitarios, a menos que se especifique de otra manera en la monografía.
3. Cuando no haya burbujas, medir el volumen de cada mezcla.

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

Usar los siguientes criterios para determinar el cumplimiento de esta prueba.

Para Envases de Unidades Múltiples (ver la Figura 1)-EI volumen promedio de líquido obtenido a partir de los 1O enva-
ses es no menos de 100% y el volumen de ningún envase es menos de 95% del volumen declarado en el etiquetado. Realizar
la prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en el etiquetado pero el volu-
men de ningún envase es menos de 95% de la cantidad declarada, o si B, el volumen promedio es no menos de 100% y el
volumen de no más de 1 envase es menos de 95%, pero es no menos del 90% del volumen declarado. El volumen promedio
de líquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado; y el volumen de líquido
obtenido de no más de 1 de los 30 envases es menos de 95%, pero no menos de 90% del volumen declarado en el etiqueta-
do.
426 (698) Volumen de Entrega / Pruebas Físicas USP 37

Menos de 100% del V decl No menos de 100°/a del V decl

El volumen de 1 envase El volumen de ningún El volumen de 1 o más El volumen de ningún

es menos de envase es menos de envases es menos de envase es menos de
95% del V decl 95% del V decl. 95% del V decl. 95% del V decl.

No cumple Cumple
con la prueba El volumen de no más El volumen de con la prueba
de 1 envase es menos más de 1 envase
de 95% del V decl. es menos de
pero no menos de 95% del V decl
90% del V decl

A B
No cumple
con la prueba
Analizar 20 envases más

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

No cumple
con la prueba El volumen de no más
El volumen de
más de 1 envase de 1 envase es menos
es menos de de 95% del V decl.
95% del V decl. pero no menos de
90% del V decl.

No cumple Cumple
con la prueba con la prueba

Figura 1. Esquema de decisión para envases de unidades múltiples. (\/=Volumen promedio. V decl. =Volumen declarado)

Para Envases Unitarios (ver la Figura 2)-EI volumen promedio de líquido obtenido a partir de los 1O envases es no menos
de 100% y el volumen de cada uno de los 1 O envases se encuentra dentro del intervalo de 95%-110% del volumen declarado
en el etiquetado. Realizar la prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en
el etiquetado, pero el volumen de ningún envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, o si B, el volumen promedio
es no menos de 100% y el volumen de no más de 1 envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, pero dentro del
intervalo de 90%-115%. El volumen promedio de líquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen de-
clarado en el etiquetado y el volumen obtenido de no más de 1 de los 30 envases se encuentra fuera del intervalo de 95%-
110% pero dentro del intervalo de 90%-115% del volumen declarado en el etiquetado.
USP 37 Pruebas Físicas/ (699) Densidad de Sólidos 427

Menos de 100% del V decl No menos de 100%) del V decl

E! volumen de 1 o más El volumen de ningún El volumen de 1 o más El volumen de cada uno de

envases cae afuera del envase cae afuera del envases cae afuera del los envases cae afuera del
intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110%
del V decl del V decl del V decl del V decl

No cumple El volumen de no mas Cumple

El volumen de
con la pruebn Jo 1 envase cae afuera con la prueba
mas de 1 envase
del intervalo de 95% a cae afuera del
110% del V decl pero intervalo de 95% a
dentro del intervalo 110% del V decl
de 90% a 115%

A 8
No cumple
con la prueba
Analizar 20 envases más

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

No cumple
con la prueba El volumen de no más
El volumen de más
de 1 envase cae afuera
de 1 envase
del intervalo de 95% a
cae afuera del
110% del V decl. pero
intervalo de 95% a
dentro del intervalo
110% del V decl.
de 90% a 115%

No cumple Cumple
con la prueba con la prueba

Figura 2. Esquema de decisión para envases unitarios. ('\/=Volumen promedio. V decl. =Volumen declarado)

(699) DENSIDAD DE SÓLIDOS

TÉRMINOS Y DEFINICIONES
El término densidad se refiere a la distribución espacial promedio de la masa en un material. La densidad de los sólidos típi-
camente se expresa en g por cm 3, mientras que en los líquidos la densidad se expresa generalmente en g por mL a una tempe-
ratura de referencia establecida.
La densidad de una partícula sólida puede tomar diferentes valores según el método empleado para medir el volumen de la
partícula. Es importante distinguir entre tres posibilidades diferentes.
La densidad verdadera de una sustancia es la masa promedio por unidad de volumen, excluyendo todos los espacios vacíos
que no son parte fundamental de la disposición tridimensional molecular. Es una propiedad de cada material particular y, por
lo tanto, debe ser independiente del método de determinación. La densidad verdadera de un cristal perfecto puede determi-
narse a partir del tamaño y la composición de la unidad celular.
La densidad picnométrica, medida por picnometría de gases, es una medición de la densidad conveniente para polvos farma-
céuticos. En un picnómetro de gases, el volumen ocupado por una masa conocida de polvo se determina mediante la medi-
ción del volumen de gas desplazado por el polvo. El cociente entre la masa y el volumen de gas desplazado es la densidad
picnométrica. La densidad picnométrica equivale a la densidad verdadera a menos que el material contenga espacios vacíos
impenetrables, o poros cerrados que sean inaccesibles al gas empleado en el picnómetro.
La densidad granular incluye las contribuciones al volumen de la partícula de poros abiertos que son más pequeños que un
tamaño límite, que depende del método de medición. Una técnica común de medición es la porosimetría de mercurio, donde
428 (699) Densidad de Sólidos / Pruebas Físicas USP 37

el tamaño límite del poro depende de la presión máxima de penetración. Debido a la contribución adicional del volumen de
poro, la densidad granular nunca será mayor que la densidad verdadera. Un concepto relacionado es la densidad aerodinámica,
que es la densidad de la partícula con un volumen definido por la envoltura aerodinámica de la partícula en una corriente de
flujo. Tanto los poros cerrados como los abiertos contribuyen a este volumen, pero los poros abiertos se llenan con el líquido
impregnante. Por lo tanto, si la partícula es porosa, la densidad aerodinámica depende de la densidad del líquido utilizado en
la prueba.
En síntesis, tanto la densidad picnométrica como la densidad verdadera se denominan "densidad". Si es necesario, se pue-
den distinguir estas cantidades según el método de medición.
La densidad de un material depende de la cohesión molecular. En el caso de los gases y los líquidos, la densidad depende de
la temperatura y la presión. En el caso de los sólidos, la densidad también variaría según la estructura del cristal y el grado de
cristalinidad. Si los sólidos son amorfos, la densidad también puede depender de los antecedentes de preparación y tratamien-
to de esta sustancia. En consecuencia, a diferencia de los líquidos, las densidades de dos sólidos químicamente equivalentes
pueden ser diferentes debido a una diferencia en la estructura del estado sólido. La densidad de las partículas constitutivas es
una característica física importante de los polvos farmacéuticos.
Más allá de estas definiciones sobre densidad de la partícula, la densidad aparente de un polvo incluye la contribución al vo-
lumen del espacio vacío entre las partículas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la densidad como de la
compactación de las partículas de polvo.

PICNOMETRÍA DE GASES PARA LA MEDICIÓN DE DENSIDAD

La picnometría de gases es un método conveniente y apropiado para la medición de la densidad de partículas de polvo. En
la Figura 1 se muestra un diagrama sencillo de un tipo de picnómetro de gases.

v, = Volumen de referencia
Ve= Volumen de celda
V5 = Volumen de muestra
M = Manómetro

Fig. 1. Esquema de Picnómetro de Gases.

La muestra, con una masa w y un volumen V,, se coloca dentro de una celda de prueba sellada que tiene un volumen de
celda sin contenido de Ve La presión de referencia del sistema, P, se determina en el manómetro mientras la válvula que co-
necta el volumen de referencia con la celda de prueba está abierta. Se cierra la válvula para separar el volumen de referencia,
V,, de la celda de prueba. La celda de la prueba se presuriza con el gas de medición a una presión inicial, P;. Luego, se abre la
válvula para conectar el volumen de referencia, V,, con la celda de la prueba y la presión desciende a la presión final, P1• Si el
gas de medición se comporta idealmente en las condiciones de medición, el volumen de la muestra, v,, se calcula mediante la
siguiente expresión:

(1)

La densidad, p, se calcula por la ecuación:

w
p=-(2)
V,

Los detalles del diseño instrumental pueden diferir, pero todos los picnómetros de gases dependen de la medición de los cam-
bios de presión a medida que se agrega o se elimina un volumen de referencia de la celda de prueba.
La densidad medida es una media ponderada por volumen de las densidades de las partículas individuales que constituyen
el polvo. La densidad será errónea si el gas de la prueba se adsorbe o se absorbe en el polvo o si se producen contaminantes
volátiles a partir del polvo durante la medición. La adsorción o absorción se evitan mediante una elección apropiada del gas de
prueba. Normalmente se elige helio. Los contaminantes volátiles del polvo se eliminan mediante la desgasificación del polvo a
través de una purga constante con helio antes de la medición. Ocasionalmente, los polvos pueden desgasificarse al vacío. Si los
 USP 37 Pruebas Físicas/ (701) Desintegración 429

contaminantes volátiles no interfieren con la medición, los volúmenes de muestra proporcionados por dos lecturas consecuti-
vas no difieren en más del 0,2%. Debido a que se pueden producir contaminantes volátiles durante la medición, el peso de la
muestra debe tomarse después de la medición picnométrica del volumen.

Método

Asegurarse de que el volumen de referencia y el volumen de calibración se hayan determinado para el picnómetro de gases
mediante un procedimiento apropiado de calibración. El gas a utilizar en la prueba debe ser helio, a menos que se especifique
otro gas en la monografía individual correspondiente. La temperatura del picnómetro de gases debe estar entre 15º y 30º y no
debe variar en más de 2º durante el curso de la medición. Cargar la celda de prueba con la sustancia en análisis que se ha
preparado según la monografía individual correspondiente. Secar la sustancia en análisis, cuando se indica (699D), según se
describe en Pérdida por secado en la monografía correspondiente, a menos que se especifiquen otras condiciones de secado en
la prueba de Densidad de sólidos de la monografía. Cuando se indica (699U), la sustancia en análisis se emplea sin secar. Em-
plear una cantidad de polvo recomendada en el manual operativo para el picnómetro. Sellar la celda de prueba del picnóme-
tro y purgar el sistema del picnómetro con el gas de prueba según el procedimiento indicado en las instrucciones de funciona-
miento del fabricante. Si la muestra debe desgasificarse al vacío, seguir las recomendaciones de las monografías individuales
correspondientes y las instrucciones del manual operativo del picnómetro.
La secuencia de medición anterior describe el procedimiento para el picnómetro de gases que aparece en la Figura 1. Si el
picnómetro tiene una operación o construcción diferentes, del que se muestra en la Figura 1, seguir el procedimiento operativo
indicado en el manual de uso del picnómetro.
Repetir la secuencia de medición para la misma muestra de polvo hasta que las mediciones consecutivas del volumen de
muestra, V,, no difieran en más del 0,2%. Descargar la celda de la prueba y medir el peso final de polvo, w. Calcular la densi-
dad picnométrica, p, de la muestra según la Ecuación 2.

(701) DESINTEGRACIÓN

Este capítulo general está armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa.
Los textos de estas farmacopeas son por lo tanto intercambiables y en lugar de este capítulo general, se pueden usar los méto-
dos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento de los requisitos. Estas farmacopeas
se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado.
Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armoniza-
do, están indicadas con símbolos (•.) para especificar este hecho.
Esta prueba sirve para determinar si las tabletas o cápsulas se desintegran dentro del tiempo establecido cuando se las colo-
ca en un medio líquido en las condiciones experimentales que se presentan a continuación. •se requiere el cumplimiento con
los límites de Desintegración establecidos en las monografías individuales excepto cuando la etiqueta indica que las tabletas o
cápsulas están destinadas para su uso como trociscos (troches) o para ser masticadas o están diseñadas como formas farma-
céuticas de liberación prolongada o formas farmacéuticas de liberación retardada. Determinar el tipo de unidades en análisis
según lo que indique el etiquetado o por observación y aplicar el procedimiento correspondiente a 6 o más unidades de dosifi-
cación .•
A los efectos de esta prueba, la desintegración no implica la disolución completa de la unidad ni de su ingrediente activo. Se
define como desintegración completa al estado en el cual los residuos de la unidad, excepto la cubierta insoluble de una cáp-
sula o los fragmentos del recubrimiento insoluble, que permanezcan en el tamiz del aparato de prueba o se adhieran a la su-
perficie inferior del disco, constituyen una masa blanda sin un núcleo firme y palpable.

APARATO

El aparato consta de un montaje de canastilla-gradilla, un vaso de precipitados bajo de 1000 mL, con una altura entre
138 mm y 160 mm y con un diámetro interno de 97 mm a 115 mm para el líquido de inmersión, una disposición termostática
para calentar el líquido entre 35º y 39º y un dispositivo para elevar y sumergir la canastilla en el líquido de inmersión a una
frecuencia constante entre 29 y 32 ciclos por minuto recorriendo una distancia de no menos de 53 mm y no más de 57 mm. El
volumen del líquido en el recipiente es tal que en el punto más alto del recorrido ascendente, la malla de alambre permanece
al menos 15 mm por debajo de la superficie del líquido y desciende a no menos de 25 mm desde el fondo del recipiente en el
recorrido descendente. En ningún momento debe quedar sumergida la parte superior del montaje de canastilla-gradilla. El
tiempo requerido para el recorrido ascendente es igual al tiempo del recorrido descendente y el cambio de sentido se produce
en una transición suave y no con un movimiento abrupto. El montaje de canastilla-gradilla se mueve verticalmente a lo largo
de su eje. No hay un movimiento horizontal significativo ni un movimiento del eje que no sea vertical.
430 (701) Desintegración / Pruebas Físicas USP 37

Montaje de Canastilla-Gradilla-El montaje de canastilla-gradilla consiste en seis tubos transparentes abiertos en sus extre-
mos, de 77,5 ± 2,5 mm de longitud cada uno, con un diámetro interno de aproximadamente 20,7 mm a 23 mm y una pared
de 1,0 mm a 2,8 mm de espesor; los tubos están sostenidos en posición vertical por dos placas, de 88 mm a 92 mm de diáme-
tro y de 5 mm a 8,5 mm de espesor cada una, con seis orificios de 22 mm a 26 mm de diámetro cada uno, equidistantes del
centro de la placa y equidistantes entre sí. Debajo de la superficie de la placa inferior, se fija una tela de alambre de acero
inoxidable tramado que posee una trama cuadrada simple con aberturas de 1,8 mm a 2,2 mm y con un diámetro de alambre
de 0,57 mm a 0,66 mm. Las piezas del aparato se arman y se sostienen rígidamente por medio de tres pernos que pasan a
través de las dos placas. Se proporciona un medio adecuado para suspender el montaje de canastilla-gradilla del dispositivo de
ascenso y descenso, utilizando un punto de su eje.
El diseño del montaje de canastilla-gradilla se puede variar de alguna forma, siempre que se mantengan las especificaciones
para los tubos de vidrio y el tamaño del tamiz de la malla. El montaje de canastilla-gradilla se ajusta a las dimensiones que se
encuentran en la Figura 1.
Discos-El uso de discos está permitido exclusivamente cuando está especificado o autorizado •en la monografía. Si se es-
pecifica en la monografía individual,. cada tubo presenta un disco cil1ndrico de 9,5 ± O, 15 mm de espesor y 20,7 ± O, 15 mm
de diámetro. El disco está hecho de un material plástico transparente adecuado, con un peso específico entre 1, 18 y 1,20.
Cinco orificios paralelos de 2±O,1 mm se extienden entre los extremos del cilindro. Uno de los orificios está centrado en el eje
cilíndrico. Los otros orificios están centrados a 6 ± 0,2 mm del eje en líneas imaginarias perpendiculares al eje y paralelas entre
sí. Se cortan cuatro planos idénticos de forma trapezoidal en la pared del cilindro, casi perpendiculares a los extremos del cilin-
dro. La forma trapezoidal es simétrica; sus lados paralelos coinciden con los extremos del cilindro y son paralelos a una línea
imaginaria que conecta los centros de dos orificios adyacentes de 6 mm desde el eje cilíndrico. El lado paralelo del trapezoide
en la parte inferior del cilindro tiene un largo de 1,6 ± O, 1 mm y sus bordes inferiores se encuentran a una profundidad de 1,5
a 1,8 mm de la circunferencia del cilindro. El lado paralelo del trapezoide en la parte superior del cilindro tiene un largo de 9,4
± 0,2 mm y su centro se encuentra a una profundidad de 2,6±O,1 mm de la circunferencia del cilindro. Todas las superficies
del disco son lisas. Si se especifica el uso de discos •en la monografía individual,. agregar un disco a cada tubo y hacer funcio-
nar el aparato según se indica en el Procedimiento. Los discos se ajustan a las dimensiones que se encuentran en la Figura 71 .

Disco
Montaje de
Canastilla-Gradilla

1,9 [l 21,a511
±0,9 1±1,15

+I
,....
LO

"'
LO
N'
+I LO
,...._

~,~,~,~:~,~, --~l Vista

LO
¡-..:"
,.... +I

,_,__,_,__,___-+-,_....,__, ~l : .: : ' ':: ', lateral

90±2
~ LO
al

20,7~•0,15 1,6 ¡
Vista
inferior
•1,5-1~ ±O~

-r

Figura 1. Aparato de desintegración. (Todas las dimensiones están expresadas en mm.)

1 El uso de detección automática empleando discos modificados está permitido cuando se especifica o se autoriza el uso de discos. Tales discos deben cumplir con
los requisitos de densidad y dimensión que se proporcionan en este capítulo.
USP 37 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 431

PROCEDIMIENTO

•Tabletas Sin Cubierta-.Colocar 1 unidad de dosificación en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si se indica,
agregar un disco. Hacer funcionar el aparato, usando •agua º• el medio especificado como el líquido de inmersión; mantener
a 37 ± 2º. Al final del tiempo especificado •en la monografía,• levantar la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas las
tabletas se han desintegrado completamente. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
tabletas adicionales. El requisito se cumple si se desintegran no menos de 16 tabletas del total de 18 tabletas analizadas.
•Tabletas Con Cubierta Simple-Aplicar la prueba de Tabletas Sin Cubierta, haciendo funcionar el aparato durante el tiem-
po especificado en la monografía individual.
Tabletas de Liberación Retardada (Recubrimiento Entérico)-Colocar 1 tableta en cada uno de los seis tubos de la ca-
nastilla y, si la tableta tiene una cubierta externa de azúcar soluble, sumergir la canastilla en agua a temperatura ambiente du-
rante 5 minutos. Poner el aparato en funcionamiento utilizando fluido gástrico simulado SR a 37 ± 2º como el líquido de in-
mersión. Al cabo de 1 hora de inmersión en el fluido gástrico simulado SR, levantar la canastilla y observar las tabletas: las
tabletas no muestran signos de desintegración, resquebrajamiento o ablandamiento. Poner el aparato en funcionamiento utili-
zando fluido intestinal simulado SR a 37 ± 2º como líquido de inmersión, durante el tiempo especificado en la monografía. Sa-
car la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas las tabletas se desintegran completamente. Si 1 ó 2 tabletas no se
desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas
se desintegran completamente.
Tabletas Bucales-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Después de 4 horas, sacar la canastilla del líquido y observar
las tabletas: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con
12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.
Tabletas Sublinguales-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Al final del tiempo especificado en la monografía indi-
vidual: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.
Cápsulas de Gelatina Dura-Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Fijar a la superficie de la placa superior del mon-
taje de canastilla-gradilla, una tela de alambre que se pueda desprender, que tenga una trama cuadrada simple con aberturas
de 1,8 mm a 2,2 mm y con un diámetro de alambre de 0,60 mm a 0,655 mm, según se describe en Montaje de Canastilla-
Gradilla. Observar las cápsulas dentro del tiempo especificado en la monografía individual: todas las cápsulas se han desinte-
grado excepto los fragmentos de las cubiertas. Si 1 ó 2 cápsulas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
cápsulas adicionales: no menos de 16 del total de 18 cápsulas analizadas se desintegran completamente.
Cápsulas de Gelatina Blanda-Proceder según se indica en Cápsulas de Gelatina Dura .•

(711) DISOLUCIÓN

Este capítulo general está armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado.
Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armoniza-
do, están indicadas con símbolos (•.) para especificar este hecho.
Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento de los requisitos de disolución •si estuvieran indicados en la mono-
grafía individual. de las formas farmacéuticas administradas oralmente. Para los fines de este capítulo general, una unidad de
dosificación está definida como 1 tableta, 1 cápsula o la cantidad que se especifique. •De los tipos de aparatos que se descri-
ben en este capítulo, utilizar el que se especifica en la monografía individual. Cuando la etiqueta indica que el artículo tiene
recubrimiento entérico, y cuando la monografía individual incluye una prueba de disolución o desintegración sin establecer
específicamente que se aplica a artículos de liberación retardada, emplear el procedimiento y la interpretación indicados para
Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Si se trata
de cápsulas de gelatina dura o blanda, o de tabletas recubiertas con gelatina que no cumplen con las especificaciones de Diso-
lución, repetir la prueba del siguiente modo. Cuando se especifica utilizar agua o un medio con un pH inferior a 6,8 como el
Medio en la monografía individual, se puede emplear el mismo Medio especificado agregando pepsina purificada, de forma
que la actividad resultante sea igual o menor a 750 000 Unidades por 1000 ml. Para medios con un pH igual o mayor a 6,8, se
puede agregar pancreatina de forma que la actividad de proteasa sea de no más de 1750 Unidades USP por 1000 ml.
Estándares de Referencia USP (11 )- ER Tabletas de Prednisona USP•
432 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 37

APARATO

Aparato 1 (Aparato con Canastilla)

El aparato consta de: un vaso, con o sin tapa, de vidrio u otro material inerte y transparente; 1 un motor; un eje propulsor
metálico y una canastilla cilíndrica. El vaso está parcialmente sumergido en un baño de agua adecuado de cualquier dimensión
conveniente o recibe calor de un dispositivo adecuado, como por ejemplo una camisa de calentamiento. Durante el transcurso
de la prueba, el baño de agua o el dispositivo de calentamiento mantienen la temperatura en el interior del vaso a 37 ± 0,5º y
garantizan que el fluido del baño se mantenga en movimiento suave y constante. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual está colocado, aumenta significativamente el movimiento, agitación o vibración, por encima de los producidos por el
elemento de agitación que gira con suavidad. Es preferible emplear un aparato que permita observar la muestra y el elemento
de agitación durante la prueba. El vaso es cilíndrico y de fondo semiesférico •con las siguientes dimensiones y capacidades:.
para 1 L de capacidad •nominal., la altura es de 160 mm a 21 O mm y el diámetro interno es de 98 mm a 106 mm; •para 2 L
de capacidad nominal, la altura es de 280 mm a 300 mm y el diámetro interno es de 98 mm a 106 mm; y para 4 L de capaci-
dad nominal, la altura es de 280 mm a 300 mm y el diámetro interno es de 145 mm a 1 55 mm •. Las paredes del vaso cilíndri-
co tienen un reborde en el extremo superior. Se puede utilizar una tapa para retardar la evaporación. 2 Colocar el eje propulsor
de forma tal que su eje central guarde una distancia máxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje vertical del vaso
y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. Emplear un dispositivo para regular la
velocidad con el objeto de seleccionar y mantener la velocidad de rotación del eje propulsor a la velocidad especificada •en la
monografía individual,. con una aproximación de ±4%.
Los componentes del eje y de la canastilla del elemento de agitación son de acero inoxidable tipo 316 o de otro material
inerte, según las especificaciones de la Figura 7. Se puede emplear una canastilla con un baño de oro de aproximadamente
0,0001 pulgadas (2,5 µm) de espesor. La unidad de dosificación se coloca en una canastilla seca al comienzo de cada prueba.
La distancia entre el fondo interno del vaso y el fondo de la canastilla se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba.

6,3 a 6,5 ó
9,4 a 10,1 mm
Orificio de ventilación

2,0 ± 0,5 mm de diámetro

Seguro de retención con

3 lengüetas radiales a 120' entre sí , 1
5, 1 ± 0,5 mm
'~
Abertura libre
20,2±1,0mm
ífr} ' !
1 1

l1--1 _____ ¡
>'· , _,___ ,_ - Jrl-- - - -·

"º'
3,0 mm
,,'~~~1r~Hi"--r:~1:·: ,~:1ramado soldado
malla 11 0,22-0,31 mm de diámetro del alambre
:trta ;1_:\ ~- con aberturas en el alambre de
1

1 ~ 0,36-0,44 mm.
-·' -7 L: - [Nota-La malla podría alterarse
A ,
ligeramente después de soldarla.]
[Nota- La máxima desviación permisible
en "A" es ± 1,0 mm cuando la parte
se gira sobre un eje lineal central con
la cantastilla montada.] 1 -¡/
-- -;-!\
25,0 ± 3,0 mm
20,2 ± 1,0 mm -. ··_-._.
i / J

t ' . ,/

Figura 1. Elemento de Agitación de Canastilla

1 Los materiales deben ser tales que no produzcan sorción, reacciones ni interferencias con la muestra en análisis.
2 Si se usa una tapa, verificar que cuenta con orificios para insertar fácilmente un termómetro y para retirar las muestras.
USP 37 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 433

Aparato 2 (Aparato con Paleta)

Emplear el Aparato 1, excepto que se usa una paleta compuesta por un aspa y un eje como elemento de agitación. Colocar
el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde una distancia máxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje
vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. La línea central vertical
del aspa está alineada con el eje propulsor de forma tal que el extremo inferior del aspa está nivelado con el extremo inferior
del eje propulsor. La paleta cumple con las especificaciones que se indican en la Figura 2. La distancia entre el fondo interno
del vaso y el borde inferior del aspa se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba. El aspa metálica o de otro material inerte
adecuado y el eje forman una unidad. En algunos casos, se puede usar un dispositivo desmontable de dos partes adecuado,
siempre y cuando las partes permanezcan firmemente ajustadas durante la prueba. El eje y el aspa de la paleta pueden estar
recubiertos con un material inerte adecuado. Dejar que la unidad de dosificación se hunda hasta el fondo del vaso antes de
empezar a rotar el aspa. A las unidades de dosificación se les puede agregar una pieza pequeña, suelta, de algún material no
reactivo, como por ejemplo un par de vueltas de alambre, para evitar que floten. La Figura 2a ilustra un dispositivo de sumer-
sión alternativo. También se pueden emplear otros dispositivos de sumersión validados.

Diámetro de
9,4a 10,1 mm

NOTAS
(1) Las dimensiones A y 8
no deben variar en más
de 0,5 mm cuando esta
pieza se gira sobre el eje
lineal central.
(2) Las tolerancias son de
± 1,0 mm, a menos que
se indique lo contrario.

l.,
Radio41,5 mm 7¡-•--------.-
Radlo 1.2±0,2~ i ________-::t-,j ,.~
A 35,Bmm

.--
j:t. ...._~~!--~-'
±0,5mm

j__
!.-- ___.¡
42,0°mm

4,0±1,0mm

l..___.._____ 8-----.----'I _L
1, 74,0 mm a 75,0 mm ----<·•~1--r
Figura 2. Elemento de Agitación de Paleta

3,5-4,0t

A_/ 25-26
12,0 ±0,2
A: Tapa de alambre resistente a los ácidos
8: Soporte de alambre resistente a los ácidos

Figura 2a. Dispositivo de sumersión alternativo. Todas las dimensiones están expresadas en mm.
434 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 37

Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

El equipo se compone de un grupo de vasos cilíndricos de vidrio de fondo plano, un grupo de cilindros oscilantes de vidrio,
accesorios de un material inerte (de acero inoxidable tipo 316 o de otro material adecuado) y mallas de un material adecuado
no absorbente ni reactivo, que se fijan a la parte superior e inferior de los cilindros oscilantes; un motor y una transmisión que
hacen oscilar los cilindros en sentido vertical dentro de los vasos y, de ser necesario, traslada los cilindros oscilantes en sentido
horizontal hacia otra hilera de vasos. Los vasos están parcialmente sumergidos en un baño de agua adecuado de un tamaño
conveniente que permita mantener la temperatura a 37 ± 0,5º durante la prueba. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual el equipo está colocado, produce una cantidad importante de movimiento, agitación o vibración, que exceda la oscila-
ción vertical suave del cilindro oscilante. Se usa un dispositivo que permite elegir la velocidad de oscilación y mantenerla a la
velocidad de inmersión •especificada en la monografía individual,. dentro de ±5%. Es preferible emplear un aparato que per-
mita observar las muestras y los cilindros oscilantes. Los vasos cuentan con una tapa de evaporación que permanece colocada
durante la prueba. Los componentes se ajustan a las dimensiones que se indican en la Figura 3, a menos que se especifique
algo diferente •en la monografía individual •.

1 50,8± 1 1
• • Orificios para aire
/ Diámetro 3,9 ± O, 1

+I Tapa para evaporación

CXl
¡g-

Cilindro de oscilación
vertical de vidrio

·---+--tt--- 47± 1,4

+I
o
00

1 Vaso de vidrio
1
1
1
1
1
1
1
1
L.-- - - _J

Figura 3. Aparato 3 (cilindro oscilante)

USP 37 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 435

Aparato 4 (Celda de Flujo)

El equipo se compone de un depósito y una bomba para el Medio de Disolución, una celda de flujo y un baño de agua que
mantiene el Medio de Disolución a 37 ± 0,5º. Usar la celda del tamaño especificado •en la monografía individual •.
La bomba desplaza el Medio de Disolución a través de la celda de flujo en dirección ascendente. La bomba tiene un intervalo
de operación de 240 mL a 960 mL por hora y las velocidades de flujo estándares son de 4 mL, 8 mL y 16 ml por minuto. La
bomba debe suministrar un flujo constante (±5% de la velocidad de flujo nominal); el perfil del flujo es sinusoidal con una
pulsación de 120 ± 1 O pulsos por minuto. Se puede usar también una bomba no pulsátil. Los procedimientos de la prueba de
disolución en los que se usa una celda de flujo deben estar caracterizados con respecto a la velocidad y a las pulsaciones.
La celda de flujo (ver las Figuras 4 y 5), de un material transparente e inerte, está montada verticalmente con un sistema de
filtro (especificado en la monografía individual) que impide que se escapen partículas no disueltas de la parte superior de la
celda; el diámetro estándar de la celda se ubica entre 12 mm y 22,6 mm; la base cónica de la celda está generalmente llena de
pequeñas perlas de vidrio de aproximadamente 1 mm de diámetro y una de esas perlas, de aproximadamente 5 mm, está ubi-
cada en el ápice para proteger el tubo de entrada del fluido; se dispone de un portatabletas (ver las Figuras 4 y 5) para colocar
formas farmacéuticas especiales, por ejemplo, tabletas estratificadas. La celda se sumerge en un baño de agua y se mantiene la
temperatura a 37 ± 0,5º.

Cámara del filtro

Tamiz con malla Nº 40

Diámetro del alambre = 0,2
Apertura = 0,45
LO
6
+I
LO
'---..
~ Muesca para el soporte
de tabletas

(03)
1

. -min3
J ___ '
f ---.L 0 0,8 ± 0,05

0 =Diámetro

"-~·1

24,0±0,5

Figura 4. Celda grande para tabletas y cápsulas (arriba) y portatabletas para la celda grande (abajo) del Aparato 4. (Todas las
dimensiones están expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)
436 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 37

Cámara del fihro

--.-~- tf~~~~~- Tamiz con malla Nº 40

Diámetro del alambre =0,2
Apertura 0,45=
"'o·
+I

"'c:i "'lli
+I
o
"'
12Jl 2 !0• 2 .........__ Muesca para el soporte
~ de tabletas

0=Diámetro

13,5 ± 0,5

Figura 5. Celda pequeña para tabletas y cápsulas (arriba) y portatabletas pára celda pequeña (abajo) del Aparato 4. {Todas
las dimensiones están expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)

El aparato emplea un mecanismo de abrazadera y dos juntas de goma para fijar la celda. La bomba está separada de la uni-
dad de disolución a fin de proteger a esta última de las vibraciones que pueda originar la bomba. La bomba no debe estar
colocada en un nivel superior al de los recipientes de depósito. Las conexiones entre tubos son lo más cortas posible. Emplear
tuberías de material inerte adecuado, como por ejemplo teflón de aproximadamente 1,6 mm de diámetro interno y conexio-
nes con rebordes químicamente inertes.

APTITUD DEL APARATO

La determinación de la aptitud del aparato que se utilizará en la prueba de disolución debe incluir el cumplimiento de las
dimensiones y tolerancias indicadas anteriormente. Además, los parámetros de prueba cruciales que es necesario controlar pe-
riódicamente mientras se usa el aparato incluyen el volumen y la temperatura del Medio de Disolución, la velocidad de rotación
(Aparato 7 y Aparato 2), la velocidad de inmersión (Aparato 3) y la velocidad de flujo del medio (Aparato 4).
Controlar periódicamente que el desempeño del equipo de disolución sea aceptable. •Comprobar la aptitud de un aparato
individual mediante la Prueba de Verificación del Desempeño.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 437

Prueba de Verificación del Desempeño, Aparatos 1 y 2-Analizar el ER Tabletas de Prednisona USP, de acuerdo con las
condiciones operativas especificadas. El aparato es apto si los resultados obtenidos están dentro del intervalo aceptable que se
indica en la hoja de datos técnicos específica para el lote usado y el aparato analizado.
Prueba de Verificación del Desempeño, Aparato 3-[Se incluirá más adelante.]
Prueba de Verificación del Desempeño, Aparato 4--[Se incluirá más adelante.].

PROCEDIMIENTO

Aparato 1 y Aparato 2

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA

Colocar el volumen indicado de Medio de Disolución (± 1 %) en el vaso del aparato indicado •en la monografía individual.,
ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de Disolución a 37 ± 0,5º y quitar el termómetro. Colocar 1 unidad de dosificación en
el aparato, verificando que no queden burbujas de aire en su superficie y poner el aparato en funcionamiento inmediatamente
a la velocidad indicada •en la monografía individual •. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o a cada tiempo especifica-
do, retirar una muestra de una zona equidistante entre la superficie del Medio de Disolución y la parte superior de la canastilla o
aspa rotatoria que no esté a menos de 1 cm de la pared del vaso. [NOTA-Si se indica tomar más de una muestra, usar volúme-
nes iguales de Medio de Disolución nuevo a 37º en lugar de las alícuotas tomadas para el análisis o, si se demuestra que no es
necesario reemplazar el medio, corregir el cálculo por el cambio de volumen. Mantener el vaso cubierto durante el transcurso
de la prueba y verificar la temperatura de la mezcla en análisis con una frecuencia adecuada.] Realizar el análisis •según se
indica en la monografía individual. empleando un método de valoración adecuado. 3 Repetir la prueba con otras unidades de
la forma farmacéutica.
Si se emplean equipos automáticos para muestreo o si se introducen otras modificaciones en el aparato, es necesario verifi-
car que los resultados obtenidos con el aparato modificado son equivalentes a los obtenidos con el aparato estándar descrito
en este capítulo general.
Medio de Disolución-Emplear un medio de disolución adecuado. Emplear el disolvente especificado •en la monografía
individual •. El volumen especificado se refiere a mediciones realizadas entre 20º y 25º. Si el Medio de Disolución es una solución
amortiguada, ajustar el pH al valor indicado con una aproximación de 0,05 unidades con respecto al pH indicado •en la mo-
nografía individual.. [NOTA-Los gases disueltos pueden causar la formación de burbujas que pueden alterar los resultados de
la prueba. Si los gases disueltos interfieren en los resultados de la disolución, eliminarlos antes de iniciar las pruebas. 4 ]
Tiempo-Cuando se especifica un solo tiempo, la prueba se puede concluir en un período más corto, siempre y cuando se
cumpla el requisito de cantidad mínima disuelta. Tomar las muestras sólo en los tiempos indicados con una tolerancia de ±2%.
•Procedimiento para una Muestra Combinada para Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata-Usar este proce-
dimiento cuando se especifica un Procedimiento para una Muestra Combinada en la monografía individual. Proceder según se
indica en Procedimiento para Aparato 7 y Aparato 2 en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Combinar volúmenes igua-
les de soluciones filtradas de las seis o doce muestras individuales tomadas y emplear la muestra combinada como la muestra
de prueba. Determinar la cantidad promedio del ingrediente activo disuelto en la muestra combinada .•

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata.·

Medio de Disolución-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata.
Tiempo-Los tiempos de prueba, que generalmente son tres, se expresan en horas.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Emplear el Método A o el Método By el aparato especificado •en la monografía individual •. Todos los tiempos de prueba
especificados deben cumplirse con una tolerancia de ±2%, a menos que se especifique algo diferente.
Método A-
Procedimiento •(a menos que se indique algo diferente en la monografía individual)._
ETAPA ÁCIDA-Colocar 750 mL de ácido clorhídrico O, 1 Nen el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a
una temperatura de 37 ± 0,5º. Colocar 1 unidad de dosificación en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el
aparato a la velocidad especificada •en la monografía •.
Después de funcionar 2 horas con ácido clorhídrico O, 1 N, retirar una alícuota del líquido y proceder de inmediato según se
indica para la Etapa Amortiguada.

3 Filtrar las muestras de prueba inmediatamente después de tomarlas, salvo que se demuestre que la filtración no es necesaria. Usar un filtro inerte que no adsorba
el ingrediente activo y que no contenga sustancias extraíbles que pudieran interferir en el análisis.
4 Un método para eliminar los gases es el siguiente: Calentar el medio, mezclando suavemente, hasta aproximadamente 41 º; inmediatamente filtrar al vacío utili-
zando un filtro con un tamaño de poro de 0,45 ~tm o menor, mezclando vigorosamente y continuar mezclando al vacío durante aproximadamente 5 minutos.
También se puede emplear otra técnica de desgasificación validada para eliminar los gases disueltos.
438 (711 > Disolución / Pruebas Físicas USP 37

Realizar un análisis de la alícuota empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la mo-
nografía individual •.
ETAPA AMOR r IGUADA-[Nm A-Completar la adición de la solución amortiguadora y ajuste de pH dentro de los 5 minutos.]
Con el aparato en funcionamiento a la velocidad indicada •en la monografía., agregar 250 mL de fosfato tri básico de sodio
0,20 M previamente equilibrado a 37 ± 0,5 al líquido del vaso. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico 2 No hidróxi-
do de sodio 2 N a un pH de 6,8 ± 0,05. Dejar el aparato funcionando durante 45 minutos o durante el tiempo especifica-
do •en la monografía individual •. Al finalizar ese período, retirar una alícuota del líquido y efectuar el análisis empleando un
método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la monografía individual. La prueba puede concluir en un
período más corto que el especificado para la Etapa Amortiguada si el requisito de cantidad mínima disuelta se cumple antes de
lo previsto .•
Método B-
Procedimiento •(a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual).-
~TAPA ÁCIDA---Colocar 1000 ml de iÍcido clorhídrico O, 1 N en e!"ª'° y Pnsamblar el aparato. Dejar quP el medio se equilibre
a una temperatura de 37 ± O,Y. Colocar 1 unidad de dosificación en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el
aparato a la velocidad especificada •en la monografía •. Después de funcionar 2 horas con ácido clorhídrico O, 1 N, retirar una
alícuota del líquido y proceder de inmediato según se indica para la Etapa Amortiguada.
Realizar un análisis de la alícuota empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la mo-
nografía individual •.
ETAPA AMORTIGUADA- [NOTA-Para esta etapa del procedimiento, emplear una solución amortiguadora previamente equili-
brada a una temperatura de 37 ± 0,5º.] Escurrir el ácido del vaso y agregarle 1000 mL de una solución amortiguadora de fosfa-
to de pH 6,8, preparada mezclando ácido clorhídrico O, 1 N y fosfato tribásico de sodio 0,20 M (3:1) y ajustando, si fuera nece-
sario, con ácido clorhídrico 2 N o con hidróxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 ± 0,05. [NOTA-Este paso también puede llevarse
a cabo retirando del aparato el vaso que contiene el ácido, reemplazándolo con otro vaso que contenga la solución amortigua-
dora y transfiriendo la unidad de dosificación al vaso que contiene la solución amortiguadora.]
Dejar funcionar el aparato durante 45 minutos o durante el tiempo especificado •en la monografía individual •. Al cabo de
ese período, retirar una alícuota del líquido y analizarla empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se
especifica en la monografía individual. La prueba puede concluir en un período más corto que el especificado para la Etapa
Amortiguada si el requisito de cantidad mínima disuelta se cumple antes de lo previsto .•

Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Colocar el volumen indicado del Medio de Disolución en cada vaso del aparato, ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de
Disolución a 37 ± 0,5º y retirar el termómetro. Colocar 1 unidad de la forma farmacéutica en cada uno de los seis cilindros osci-
lantes, procurando eliminar las burbujas de aire de la superficie de cada unidad de dosificación y poner en funcionamiento el
aparato inmediatamente, según se especifica •en la monografía individual •. Durante el recorrido ascendente y descendente,
los cilindros oscilantes recorren una distancia total de 9,9 cm a 1O,1 cm. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o en ca-
da tiempo especificado, elevar los cilindros oscilantes y retirar una porción de la solución en análisis de una zona equidistante
entre la superficie del Medio de Disolución y el fondo de cada vaso. Efectuar el análisis según se indica •en la monografía indivi-
dual •. Si fuera necesario, repetir la prueba con otras unidades de forma farmacéutica.
Medio de Disolución-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas.de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 3.

Medio de Disolución-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada en Aparato 7 y Aparato
2.
Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada en Aparato 7 y Aparato 2.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada, Método Ben Aparato 7 y Aparato 2 usando una fila
de vasos para los medios de la etapa ácida y la siguiente fila de vasos para los medios de la etapa amortiguada y usando los
volúmenes de medio especificados (generalmente de 300 mL).
Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
USP 37 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 439

Aparato 4 (Celda de Flujo)

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA

Colocar las perlas de vidrio en la celda especificada •en la monografía •. Colocar 1 unidad de dosificación sobre las perlas o,
si así se especifica •en la monografía,. sobre un soporte de alambre. Ensamblar la tapa del filtro y unir las partes mediante una
abrazadera adecuada. Introducir con la bomba el Medio de Disolución entibiado a 37 ± 0,5º a través del extremo inferior de la
celda a fin de obtener la velocidad de flujo especificada •en la monografía individual. y medida con una exactitud del 5%.
Recoger el eluato en fracciones en cada tiempo indicado. Efectuar el análisis según se indica •en la monografía individual •.
Repetir la prueba con otras unidades de forma farmacéutica.
Medio de Disolución-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.
Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4.

Medio de Disolución-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4.
Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada en Aparato 1 y Aparato 2 empleando los medios
indicados.
Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada en Aparato 1 y Aparato 2.

INTERPRETACIÓN

Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata

A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual,. se cumplen los requisitos si las cantidades de ingre-
diente activo disuelto a partir de las unidades de dosificación analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 1. Continuar con las
tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a S1 o a S2 • La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo
disuelto •especificada en la monografía individual,. expresada como un porcentaje del contenido declarado de la unidad de
dosificación; los valores de 5%, 15% y 25% en la Tabla de Aceptación 1 son los porcentajes del contenido declarado de forma
que estos valores y Q están expresados en unidades equivalentes.
Tabla de Aceptación 1
Nº de
Unidades Anall-
Etapa zadas Criterios de Aceptación
s, 6 Ninguna unidad es menor que Q + 5%.
S, 6 El promedio de 12 unidades (S, + 5,) es ig11al o mayor que Q, y ninguna unidad es menor que Q - 15%.
53 12 El promedio de 24 unidades (5 1 + 52 + 53) es igual o mayor que Q, no más de 2 unidades son menores
que Q - 15%, y ninguna unidad es menor que Q - 25%.

•Muestra Combinada para Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata-A menos que se especifique algo diferente
en la monografía individual, se cumple con los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de la muestra
combinada se ajustan a la Tabla de Aceptación para una Muestra Combinada adjunta. Continuar con las tres etapas de prueba a
menos que los resultados se ajusten a S1 o a S2 • La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo disuelto especificada en la
monografía individual, expresada como un porcentaje del contenido declarado.
Tabla de Aceptación para una Muestra Combinada
Nºde
Unidades Anali- Criterios de
Etapa zadas Aceptación
5, 6 La cantidad disuelta promedio no es menor que Q + 10%.
5, 6 La cantidad disuelta promedio (5, + 5,) es igual o mayor que Q + 5%.
5, 12 La cantidad disuelta promedio (S, + 5, + S,) es igual o mayor que Q.

•
440 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 37

Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada

A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos si las cantidades de ingre-
diente activo disuelto a partir de las unidades de dosificación analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 2. Continuar con los
tres niveles de prueba a menos que los resultados se ajusten a L, o a L2 • Los límites de la cantidad de ingrediente activo disuel-
to se expresan como porcentajes del contenido declarado. Los límites comprenden cada valor de Q;, que representa la canti-
dad disuelta en cada intervalo fraccional de dosificación especificado. Si se especifica más de un intervalo •en la monografía
individual., los criterios de aceptación se aplican por separado a cada intervalo.
Tabla de Aceptación 2
Nº de
Unidades Anali-
Nivel zadas Criterios
L, 6 Ningún valor individual se encuentra fuera de los intervalos especificados y, en el momento final de la
prueba, ningún valor individual es menor que la cantidad especificada.
L2 6 El valor promedio de las 12 unidades (L 1 + L2) se encuentra dentro de cada intervalo especificado y no
es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; ningún valor representa más
del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; y ningún valor representa más
del 10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la
prueba.
L3 12 El valor promedio de las 24 unidades (L1 + L2 + L3) se encuentra dentro de los intervalos especificados y
no es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; no más de 2 de las 24
unidades presentan más del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; no
más de 2 de las 24 unidades presentan más del 10%, del contenido declarado, por debajo de la canti-
dad especificada en el momento final de la prueba; y ninguna de las unidades presenta más del 20%
del contenido declarado fuera de cada uno de los intervalos especificados ni presenta más del 20% del
contenido declarado por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba.

Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Etapa Ácida-A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos de esta
parte de la prueba si las cantidades, basadas en el porcentaje de contenido declarado, de ingrediente activo disuelto a partir
de las unidades analizadas, se ajustan a la Tabla de Aceptación 3. Continuar con todos los niveles de prueba a menos que los
resultados de las etapas amortiguada y ácida se ajusten en un nivel previo.
Ta bl a d e Aceptac I'on 3
Nºde
Unidades Anali-
Nivel zadas Criterios
A, 6 Ningún valor individual de la cantidad disuelta excede el 10%.
A2 6 El promedio de la cantidad disuelta de las 12 unidades (A1 + A2) no es más del 10% y ninguna unidad
individual se disuelve más del 25%.
A3 12 El promedio de la cantidad disuelta de las 24 unidades (A1 + A2 + A3) no es más del 10% y ninguna
unidad individual se disuelve más del 25%.

Etapa Amortiguada-A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos si
las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 4. Continuar
con los tres niveles de prueba a menos que los resultados de las dos etapas se ajusten antes de lo previsto. El valor de Q en la
Tabla de Aceptación 4 es el 75% disuelto a menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual •. La cantidad,
Q, •especificada en la monografía individual., representa la cantidad total de ingrediente activo disuelto en las Etapas Ácida y
Amortiguada, expresada como un porcentaje del contenido declarado. Los valores de 5%, 15% y 25% que aparecen en la
Tabla de Aceptación 4 son los porcentajes del contenido declarado de forma que estos valores y Q estén expresados en los
mismos términos.
Tabla de Aceptación 4
Nº de
Unidades Anali-
Nivel zadas Criterios
B, 6 Cada unidad no es menor que Q + 5%.
BJ 6 El promedio de 12 unidades (B 1 + BJ) es igual o mayor que Q y ninguna unidad es menor que Q - 15%.
B3 12 El promedio de 24 unidades (B 1 + B2 + B3) es igual o mayor que Q, no más de 2 unidades son menores
que Q - 15%, y ninguna unidad es menor que Q - 25%.
USP 37 Pruebas Físicas/ (721) Intervalo de Destilación 441

(721) INTERVALO DE DESTILACIÓN

Para determinar el intervalo de temperaturas dentro del cual se destila un líquido oficial, o el porcentaje de material que se
destila entre dos temperaturas especificadas, emplear el Método 1 o el Método 11 según se indica en la monografía individual.
El límite inferior del intervalo es la temperatura indicada por el termómetro cuando la primera gota del condensado deja la pun-
ta del condensador y el límite superior es el Punto Seco, es decir, la temperatura a la cual la última gota de líquido se evapora
del fondo del matraz de destilación, sin tener en cuenta el líquido que pueda quedar en las paredes del matraz, o la tempera-
tura observada al recogerse la proporción especificada en la monografía individual.
NOTA-Enfriar todos los líquidos que destilan por debajo de 80º a entre 1 Oº y 15º antes de medir la muestra a destilar.

Método 1

Aparato-Emplear un aparato similar al especificado para el Método 11, excepto que se debe usar un matraz de destilación
que tenga una capacidad de 50 a 60 mL y que tenga un cuello de 1O a 12 cm de largo y 14 a 16 mm de diámetro interno. La
perforación de la placa aislante superior, si se emplea una, debe ser tal que cuando el matraz se fija en ella, la porción del
matraz que queda por debajo de la superficie superior del material aislante tenga una capacidad de 3 a 4 ml.
Procedimiento-Proceder según se indica en el Método 11, pero colocar en el matraz sólo 25 mL del líquido a analizar.

Método 11

Aparato-Emplear un aparato que conste de las siguientes partes:

Matraz de Destilación-Un matraz de destilación de fondo redondo, de vidrio resistente al calor, de 200 mL de capacidad y
con una longitud total de 17 a 19 cm y un cuello de 20 a 22 mm de diámetro interno. A media distancia del cuello, aproxima-
damente a 12 cm del fondo del matraz, tiene conectado un brazo lateral de 1 O a 12 cm de largo y 5 mm de diámetro interno,
que forma un ángulo de 70º a 75º con la parte inferior del cuello.
Condensador-Un condensador recto de vidrio de 55 a 60 cm de largo con una camisa de agua de aproximadamente
40 cm de largo, o un condensador de otro diseño con una capacidad de condensación equivalente. El extremo inferior del
condensador puede ser curvo para que actúe como tubo de salida, o puede conectarse a un adaptador acodado que cumpla
con el mismo propósito.
Placas Aislantes-Dos piezas de placas aislantes cuadradas de 5 a 7 mm de espesor y de 14 a 16 cm de lado, apropiadas
para concentrar el calor en la parte inferior del matraz. Cada placa tiene un orificio en el centro y las dos placas difieren sólo en
el diámetro del orificio, es decir, los diámetros son 4 cm y 1Ocm, respectivamente. Cuando se utilizan, las placas se colocan
una sobre la otra en un trípode u otro soporte adecuado, con la placa que tiene el orificio más grande colocada sobre la otra.
Receptor-Una probeta graduada de 100 mL con subdivisiones de 1 ml.
Termómetro-Para evitar la necesidad de corrección por vástago emergente, se recomienda un termómetro exactamente
normalizado, de inmersión parcial con subdivisiones lo más pequeñas posibles (no más de 0,2º). Los termómetros adecuados
están disponibles como series ASTM E-1 de 37C a 41 C y de 102C a 107C (ver Termómetros (21 )). Cuando se coloca en posi-
ción, el vástago queda ubicado en el centro del cuello y la parte superior de la cámara de contracción (o bulbo, si se emplea
uno de 37C o 38C) está a la altura del borde inferior de la salida del brazo lateral.
Fuente de Calor-Un mechero Bunsen pequeño, o un calentador o manto.eléctricos con una capacidad de ajuste compara-
ble a la de un mechero Bunsen.
Procedimiento-Ensamblar el aparato y colocar en el matraz 100 mL del líquido a analizar, evitando que penetre líquido
por el brazo lateral. Insertar el termómetro, proteger todo el ensamble de mechero y matraz de las corrientes de aire externas
y aplicar calor, regulándolo para que transcurran entre 5 y 1O minutos hasta que la primera gota del destilado caiga del con-
densador. Continuar la destilación a una velocidad de 4 a 5 mL de destilado por minuto, recogiendo el destilado en el recep-
tor. Observar la temperatura cuando la primera gota del destilado caiga del condensador y nuevamente cuando la última gota
de líquido se evapora del fondo del matraz o cuando el porcentaje especificado haya destilado. A menos que se especifique
algo diferente en la monografía individual, aplicar la corrección por vástago emergente cuando sea necesario e informar las
temperaturas ajustando la presión barométrica por la siguiente fórmula:
t = Ío + [(ta 10-4 + 0,033)(760 - p)]
en donde tes la temperatura de ebullición corregida, en la escala Celsius; ta es la temperatura de ebullición medida, en la
escala Celsius; y pes la presión barométrica al momento de la medición, en mm Hg.
 442 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas USP 37

(724) LIBERACIÓN DE FÁRMACOS

Esta prueba tiene como objetivo determinar el cumplimiento de los requisitos de liberación de fármacos especificados en las
monografías individuales. Emplear el aparato especificado en la monografía individual. Reemplazar las alícuotas extraídas para
el análisis con volúmenes iguales de Medio de Disolución recientemente preparado a la temperatura indicada en la monografía
o, si se demuestra que no es necesario reemplazar el medio, corregir el cambio de volumen en el cálculo. Mantener el vaso
cubierto durante el transcurso de la prueba y verificar la temperatura de la mezcla de prueba a intervalos de tiempo adecua-
dos.

SISTEMAS DE ADMINISTRACIÓN TRANSDÉRMICA-NORMAS GENERALES PARA LIBERACIÓN

DE FÁRMACOS

Aparato 5 (Paleta sobre Disco)

Aparato-Emplear la paleta y el vaso del Aparato 2 como se describe en Disolución (711 ), agregando un dispositivo en for-
ma de disco de acero inoxidable1, cuya función consiste en sostener el sistema transdérmico en el fondo del vaso. Pueden em-
plearse otros dispositivos adecuados, siempre que no adsorban o absorban ni reaccionen o interfieran con la muestra de prue-
ba2. La temperatura se mantiene a 32 ± 0,5º. Mantener una distancia de 25 ± 2 mm entre el aspa y la superficie del disco du-
rante la prueba. El vaso puede estar cubierto durante la prueba para minimizar la evaporación. El disco que contiene el sistema
transdérmico tiene la función de minimizar todo volumen "muerto" entre el disco y el fondo del vaso. El disco mantiene el
sistema plano y se coloca de modo tal que la superficie de liberación esté paralela a la parte inferior del aspa de la paleta (ver
Figura 7).

Vaso de disolución

;-----t--Paleta

Disco ensamblado

Disco ensamblado

Figura 1. Paleta sobre Disco.

(Todas las dimensiones están expresadas en mm, a menos que se indique algo diferente.)

Prueba de Aptitud del Aparato y Medio de Disolución -Proceder como se indica en Aparato 2 en Disolución (711 ).
Procedimiento-Colocar el volumen especificado de Medio de Disolución en el vaso, ensamblar el aparato sin el disco y
equilibrar el medio a 32 ± 0,5º. Colocar el sistema transdérmico sobre el disco, asegurándose de que la superficie de liberación

1 El di'rn (disco inoxiddble de soporte) puede obtenerse de Millipore Corp., Ashley Rd., Bedford, MA 01 730.
2 Un dispositivo apropiado consiste en montar el parche entre un vidrio de reloj y una malla de teflón, está disponible como Transdermal Sandwich TM fabricado
por Hanson Research Corp., 981 O, Va riel Ave., Chatsworth, CA 91311.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 443

del sistema esté lo más plana posible. Se puede adherir el sistema al disco aplicando un adhesivo adecuado 3 sobre el disco.
Dejar secar 1 minuto. Aplicar presión sobre el sistema, con la superficie de liberación hacia arriba, para adherirlo a la pared
cubierta de adhesivo del ensamble del disco. Si se emplea una membrana 4 para sostener el sistema, ésta se aplica de modo
que no queden burbujas de aire entre la membrana y la superficie de liberación. Colocar el disco plano en el fondo del vaso
con la superficie de liberación hacia arriba y paralela al borde del aspa de la paleta y la superficie del Medio de Disolución. El
borde inferior de la paleta está ubicado a 25 ± 2 mm de la superficie del disco. Poner el aparato en funcionamiento de inme-
diato a la velocidad especificada en la monografía. En los intervalos en que se toman las muestras, extraer una muestra de la
zona intermedia entre la superficie del Medio de Disolución y la parte superior del aspa, a no menos de 1 cm de la pared del
vaso. Realizar el análisis de cada alícuota tomada según se indica en la monografía individual corrigiendo, según fuera necesa-
rio, toda pérdida de volumen. Repetir la prueba con otros sistemas transdérmicos.
Tiempo-Los tiempos, que generalmente son tres, se expresan en horas. Las muestras deben tomarse con una tolerancia
de ±15 minutos o ±2% del tiempo especificado, pero debe aplicarse la tolerancia que corresponda al intervalo de tiempo más
corto.
Interpretación-A menos que se especifique algo diferente en la monograha individual, se cumplen los requisitos si ia can-
tidad de ingrediente activo liberado por el sistema se ajusta a la Tabla de Aceptación 7 para sistemas de administración trans-
dérmica de fármacos. Continuar efectuando los tres niveles de prueba a menos que los resultados se ajusten en L1 o en L2 •
Tabla de Aceptación 1
Nºde
Unidades
Nivel Analizadas Criterio
L, 6 Ningún valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado.
L2 6 El valor promedio de las 12 unidades (L 1 + L2) se encuentra dentro del intervalo especifi-
cado. Ningún valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado en más del
10% del promedio del intervalo especificado.
L3 12 El valor promedio de las 24 unidades (L 1 + L2 + L3) se encuentra dentro del intervalo es-
pecificado. No más de 2 de las 24 unidades se encuentran fuera del intervalo especifica-
do en más del 10% del promedio del intervalo especificado; y ninguna de las unidades
se encuentra fuera del intervalo especificado en más del 20% del promedio del intervalo
especificado.

Aparato 6 (Cilindro)

Aparato-Emplear el vaso del Aparato 7 como se describe en Disolución (711 ), pero reemplazar la canastilla y el eje con un
cilindro de acero inoxidable del elemento de agitación y, durante la prueba, mantener la temperatura a 32 ± 0,5º. Los compo-
nentes del eje y del cilindro del elemento de agitación son de acero inoxidable según las especificaciones que aparecen en la
Figura 2. La unidad de dosificación se coloca sobre el cilindro al comienzo de cada prueba. La distancia entre el fondo interno
del vaso y el cilindro se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba.
Medio de Disolución-Emplear el medio especificado en la monografía individual (ver Disolución (711 )).
Procedimiento-Colocar el volumen indicado de Medio de Disolución en el vaso del aparato especificado en la monografía
individual, ensamblar el aparato y equilibrar el Medio de Disolución a 32 ± 0,5º. A menos que se indique algo diferente en la
monografía individual, preparar el sistema de prueba antes de iniciar la prueba del siguiente modo. Quitar el recubrimiento
protector del sistema y colocar el lado adhesivo sobre una porción de Cuprofano4 que no sobresalga más de 1 cm en todos los
lados del sistema. Colocar el sistema con el lado cubierto por el Cuprofano hacia abajo sobre una superficie limpia y aplicar un
adhesivo adecuado 3 sobre los bordes expuestos del Cuprofano. Si fuera necesario, aplicar más adhesivo en la parte posterior
del sistema. Dejar secar 1 minuto. Colocar con cuidado la cara del sistema cubierta de adhesivo sobre el exterior del cilindro,
de modo que el eje largo del sistema quede ajustado alrededor del cilindro. Presionar la cubierta de Cuprofano para eliminar
las burbujas de aire que pudieran haber quedado atrapadas. Colocar el cilindro en el aparato e inmediatamente ponerlo a rotar
a la velocidad especificada en la monografía individual. Dentro del intervalo especificado, o a cada tiempo especificado, ex-
traer para analizar una cantidad de Medio de Disolución de una zona intermedia entre la superficie del Medio de Disolución y la
parte superior del cilindro rotatorio que no esté a menos de 1 cm de la pared del vaso. Realizar el análisis como se indica en la
monografía individual corrigiendo, según fuera necesario, toda pérdida de volumen. Repetir la prueba con otros sistemas de
administración transdérmica adicionales.

3 Utilizar Adhesivo de Silicona Dow Corning, MD7-4502, con 65% de acetato de etilo, o uno equivalente.
4 Emplear Cuprofano, Tipo 150 pm, de grosor 11 ± 0,5 ~tm, un material celulósico poroso e inerte, que produce Medicell lnternational Ltd., 239 Liverpool Road,
Londres NI ILX, Inglaterra.
 444 (724) Liberación de Fármacos / Pruebas Físicas USP 37

ajuste entre piezas

40,640
r

TI
5,079
3,967
¡ J
j
TOLERANCIAS: r--- 4,45 ± 0,02--,!
± 0,0127 -1 1..._ 4,27 - 4,30

TERMINACION
Todas las superficies sta sección del

'T'" l ..·-
deben tener 32 m1cropul· daptador se debe

~9~7~E.'.:'oo """"~~:::
MATERIAL:
Aceroinoxidable304

pared0,178~­
~
lii-
5 ,712

f--- 4,45 ± 0,02 ----i

Fig. 2 Elemento de Agitación de Cilindro. 5

(Todas las dimensiones están expresadas en cm, a menos que se indique algo diferente.)

Tiempo-Proceder según se indica en Aparato 5.

Interpretación-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se cumplen los requisitos si la can-
tidad de ingrediente activo liberado por el sistema se ajusta a la Tabla de Aceptación 7 para sistemas de administración trans-
dérmica de fármacos. Continuar efectuando los tres niveles de prueba a menos que los resultados se ajusten a L1 o a L2 .

Aparato 7 (Soporte Oscilante)

NOTA-Este aparato también puede estar indicado para una variedad de formas de dosificación.
Aparato-El equipo se compone de un grupo de recipientes para soluciones volumétricamente calibrados o tarados, he-
chos de vidrio o de otro material inerte adecuado 6, un motor y una transmisión que hacen oscilar el sistema en sentido vertical
dentro de los vasos y que, de ser necesario, trasladan automáticamente el sistema en sentido horizontal hacia otra hilera de
vasos y un grupo de portamuestras adecuados (ver la Figura 37 y las Figuras 4a-4d). Durante la prueba, los recipientes para
soluciones están parcialmente sumergidos en un baño de agua adecuado de tamaño conveniente que permita mantener la
temperatura, T, dentro de los recipientes a 32 ± 0,5º o dentro del intervalo permitido, como se especifica en la monografía
individual. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en el cual el equipo está colocado, produce una cantidad importante de
movimiento, agitación o vibración, que exceda la suave oscilación vertical del portamuestras. Es preferible emplear un aparato
que permita observar el sistema y el portamuestras durante la prueba. Emplear el recipiente y el portamuestras de los tamaños
que se especifican en la monografía individual.

5 El cilindro puede obtenerse de Accurate Tool, lnc., 25 Diaz St., Stamford, CT 06907 o de VanKel Technology Group, 13000 Weston Parkway, Cary, NC 27513.
6 Los materiales no deben absorber la muestra de prueba ni reaccionar ni interferir con ella.
7 El disco oscilante portamuestras puede obtenerse de ALZA Corp., 1900 Charleston Road, P.O. Box 721 O, Mt. View, CA 94039-721 O o VanKel Technology
Group.
USP 37 Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 445

Radio 0, 1143
Diámetro 0,3175 - Presionar para ajustar el cabezal

e
1-8 (Dibujo típico - el diseño o la forma puede variar)

Las dimensiones están indicadas en centímetros

CABEZAL VARILLA ARGOLLA

Sistemaª A (Diámetro) 8 e Materialb D Materialc (no se muestra)
1,6 cm 2 1,428 0,9525 0,4750 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-113-V884-75
2,5 cm 2 1,778 0,9525 0,4750 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-016-V884-75
5cm 2 2,6924 0,7620 0,3810 SSNT 8,890 SS/P Parker 2-022-V884-75
7cm 2 3,1750 0,7620 0,3810 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-124-V884-75
10 cm 2 5,0292 0,6350 0,3505 SSNT 31,01 SS/P Parker 2-225-V884-75

a Medidas de sistemas típicos

b SSNT = acero inoxidable (SS) o TeflÓn virgen (VT)
e SS/P = acero inoxidable (SS) o Plexiglás (P)

Fig. 3. Disco oscilante portamuestras.7

Argolla Parker
Placa 1,98 0 usar argolla 2-225-V884-75
o
Placa 1,42 0 usar argolla 2-218-V884-75

Tubo de acero inoxidable

12" X 3/16" 0

0 =diámetro

Fig. 4a. Portamuestras de Sistemas Transdérmicos-Disco Angular.

Cilindro de Teflón virgen 3 518" x 1 3/8" 0

I
Varilla de acero inoxidable
8"x1/8"0
Argolla Parker 2-026-V884-75

0 =diámetro

Figura 4b. Portamuestras de Sistemas Transdérmicos-Cilindro.

446 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas USP 37

Varilla de acrílico 12" x 1/8" 0

0 =diámetro

Figura 4c. Portatabletas para Tabletas Orales de Liberación Prolongada -Varilla, Puntiaguda para Encolado.

Tubo de acero inoxidable

Resorte de acero inoxidable 11" X 1/8" 0

Dimensiones del resorte

de acero inoxidable
A B
1,45 ,580
1,40 ,310
,96 ,330
,60 ,250

0 = diámetro

Figura 4d. Portatabletas para Tabletas Orales de Liberación Prolongada -Soporte de Resorte.

Medio de Disolución-Emplear el Medio de Disolución especificado en la monografía individual (ver Disolución (711 )).
Preparación de la Muestra A (Sistema de administración de fármacos en forma de tableta recubierta)-Colocar cada siste-
ma a analizar en un portamuestras adecuado (por ejemplo, pegando el borde del sistema con pegamento de 2-cianoacrilato
sobre el extremo de una varilla plástica o colocando el sistema dentro de una pequeña bolsa de red de nailon en el extremo de
una varilla plástica o dentro de una bobina metálica adherida a una varilla metálica).
Preparación de la Muestra B (Sistema de administración transdérmica de fármacos)-Presionar el sistema sobre una por-
ción de Cuprofano 4 seco y sin usar, una red de nailon o material equivalente con el lado del adhesivo contra el sustrato elegi-
do, teniendo la precaución de eliminar las burbujas de aire que puedan quedar entre el sustrato y la superficie de liberación.
Adherir el sistema a un portamuestras de tamaño adecuado con un anillo de goma adecuado, de modo que la parte posterior
del sistema quede adyacente al fondo del portamuestras con forma de disco y centrada en él o centrada alrededor de la cir-
cunferencia del portamuestras cilíndrico. Recortar el exceso del sustrato con una cuchilla afilada.
Preparación de la Muestra C (Otros sistemas de administración de fármacos)-Adherir cada sistema a analizar a un porta-
muestras adecuado según se describe en la monografía individual.
Procedimiento-Colocar cada portamuestras en un agitador de oscilación vertical de modo que cada sistema esté conti-
nuamente sumergido en un volumen medido con exactitud de Medio de DisoluCión dentro de un recipiente calibrado preequili-
brado a una temperatura T. Hacerlos oscilar a una frecuencia de aproximadamente 30 ciclos por minuto con una amplitud de
aproximadamente 2 cm, o como lo especifique la monografía individual, durante el tiempo especificado en el medio especifi-
cado en cada tiempo. Retirar del baño los recipientes que contiene las soluciones, dejar enfriar a temperatura ambiente y agre-
gar una cantidad suficiente de solución (es decir, agua en la mayoría de los casos) para corregir las pérdidas por evaporación.
Efectuar el análisis como se indica en la monografía individual. Repetir la prueba con otros sistemas de liberación de fármacos
según lo exija la monografía individual.
Interpretación-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se cumplen los requisitos si la can-
tidad del ingrediente activo liberada por el sistema se ajusta a la Tabla de Aceptación 2 en Disolución (711) para sistemas de
administración de fármacos en tabletas recubiertas, a la Tabla de Aceptación 1 para sistemas de administración transdérmica de
fármacos, o según se especifique en la monografía individual. Continuar efectuando los tres niveles de prueba a menos que los
resultados cumplan los requisitos de L1 o de L2 •
USP 37 Pruebas Físicas/ (726) Electroforesis 447

<726) ELECTROFORESIS

La electroforesis se refiere a la migración de proteínas, coloides, moléculas u otra) partículas cargadas eléctricamente cuando
se disuelven o suspenden en un electrólito a través del cual se hace pasar una corriente eléctrica.
Según el tipo de aparato utilizado, los métodos electroforéticos pueden dividirse en dos categorías: la primera recibe el nom-
bre de solución libre o de frente móvil y la segunda recibe el nombre de electroforesis de zona.
En el método de solución libre, una solución de proteínas amortiguada en una celda en forma de U se somete a una corriente
eléctrica que hace que las proteínas formen una serie de capas ordenadas según una movilidad decreciente y separadas por
frentes. Aunque solamente una parte de las proteínas que se mueven con mayor velocidad está físicamente separada de las
demás proteínas, al examinar los frentes móviles con un sistema óptico de estrioscopía se obtienen datos para calcular las mo-
vilidades así como información sobre la composición cualitativa y cuantitativa de la mezcla de proteínas.
En la electroforesis de zona, la muestra se introduce como una mancha o zona estrecha en t1nil colt1mna, piara o película de
solución amortiguadora. La migración de los componentes como zonas estrechas permite su total separación. La posibilidad
de que las zonas separadas se vuelvan a mezclar por convección térmica se evita estabilizando el electrólito en una matriz po-
rosa como, por ejemplo, un sólido en polvo o un material fibroso como el papel o un gel de tipo almidón, agar o poliacrilami-
da.
Existen diferentes métodos de electroforesis de zona cuyo uso está muy extendido. La Electroforesis en gel, especialmente la
variante denominada electroforesis de disco, resulta especialmente útil para la separación de proteínas por su elevada resolu-
ción.
La electroforesis en gel, utilizada por el compendio, se analiza en mayor detalle tras la presentación de algunos principios
teóricos y prácticas metodológicas, comunes en diferente medida a todos los métodos electroforéticos.
La migración electroforética observada en las partículas de una determinada sustancia depende de las características de la
partícula, principalmente de su carga eléctrica, su tamaño o peso molecular y su forma, así como de las características y los
parámetros operativos del sistema. Entre estos últimos se incluyen el pH, la concentración iónica, la viscosidad y la temperatura
del electrólito, la densidad o reticulación de cualquier matriz estabilizante como el gel, y el gradiente de potencial utilizado.
Efecto de la Carga, Tamaño de Partícula, Viscosidad del Electrólito y Gradiente de Voltaje-Las partículas con carga eléctrica
migran hacia el electrodo de carga opuesta y las moléculas con cargas positiva y negativa se desplazan en una dirección que
depende de la carga neta. La velocidad de migración es directamente proporcional a la carga neta de la partícula e inversa-
mente proporcional al tamaño de la partícula, que, a su vez, es directamente proporcional a su peso molecular.
Las partículas esféricas de gran tamaño, que se rigen por la ley de Stokes, presentan una movilidad electroforética, u0, que es
inversamente proporcional a la primera potencia del radio de acuerdo con la ecuación:
u0 = v/E = Q/6nrri

en donde v es la velocidad de la partícula, E es el gradiente de voltaje aplicado al electrólito, Q es la carga de la partícula, r es

el radio de la partícula y ri es la viscosidad del electrólito. La expresión ideal sólo es estrictamente válida para una dilución
infinita y en ausencia de una matriz estabilizante como el papel o un gel.
Los iones y los péptidos con pesos moleculares de como mínimo 5000, especialmente en presencia de medios estabilizantes,
no obedecen a la ley de Stokes y su comportamiento electroforético queda descrito con mayor exactitud con una ecuación del
tipo:
u 0 = Q/ Anr2ri

donde A es un factor de forma que está generalmente en el intervalo de 4 a 6 y cuya movilidad está en relación inversa al
cuadrado del radio. En términos de peso molecular, esto implica que la movilidad está en relación inversa a la 2/3 potencia del
peso molecular.
Efecto del pH-La dirección y la velocidad de migración de las moléculas que contienen diferentes grupos funcionales ioniza-
bles, tales como aminoácidos y proteínas, dependen del pH del electrólito. Por ejemplo, la movilidad de un simple aminoácido
como la glicina varía con el pH aproximadamente como se muestra en la Figura 7.
 1

448 (726) Electroforesis/ Pruebas Físicas USP 37

3 5 7 9 11
pH

Fig. l.

Los valores pK, de 2,2 y 9,9 coinciden con los puntos de inflexión de las porciones sigmoides de la gráfica. Dado que los res-
pectivos grupos funcionales se ionizan en un 50% a valores de pH en los que pH = pK,, las movilidades electroforéticas en
estos puntos son la mitad del valor observado para el catión y el anión totalmente ionizados obtenidos a un pH muy bajo y a
un pH muy alto, respectivamente. El ión híbrido que existe en el intervalo intermedio de pH es eléctricamente neutro y tiene
una movilidad nula.
Efecto de la concentración iónica y Ja temperatura-La movilidad electroforética disminuye al aumentar la concentración ióni-
ca del electrólito de soporte. La concentración iónica, µ, se define como:
µ = 0,5LC;Z; 2

donde C; es la concentración de un ión en moles por L y Z; es su valencia y la suma se calcula para todos los iones de la solu-
ción. En las soluciones amortiguadoras en las que el anión y el catión son ambos univalentes, la concentración iónica es igual a
la molaridad.
Las concentraciones iónicas de los electrólitos utilizados habitualmente en la electroforesis están comprendidos en un inter-
valo de aproximadamente 0,01 a O, 1 O. La concentración adecuada depende en cierta medida de la composición de la muestra
ya que la capacidad amortiguadora debe ser lo suficientemente elevada como para mantener un pH constante en todas las
zonas que lo componen. Las zonas se hacen más nítidas o más compactas a medida que aumenta la concentración iónica.
La temperatura afecta indirectamente la movilidad, ya que la viscosidad, YJ, del electrólito de soporte depende de la tempe-
ratura. La viscosidad del agua disminuye a una velocidad de aproximadamente 3% por ºC en el intervalo de Oº a 5º y a una
velocidad ligeramente más lenta para valores cercanos a la temperatura ambiente. Por tanto, la movilidad aumenta al aumen-
tar la temperatura del electrólito.
Como resultado del paso de la corriente a través del electrólito de soporte se desprende un calor considerable. Este calor
aumenta con el voltaje aplicado y al aumentar la concentración iónica. Especialmente en aparatos de mayor tamaño, y a pesar
de la circulación de refrigerante, este calor produce un gradiente de temperatu·ra a través del lecho que puede dar lugar a una
distorsión de las zonas separadas. Por tanto, las consideraciones prácticas y el diseño de cada aparato dictarán la elección de la
concentración iónica y del voltaje de operación.
Efecto de un medio estabilizante, Electroósmosis--Cuando se pasa una corriente eléctrica a través de un electrólito contenido
en un tubo de vidrio o entre placas de vidrio o plástico, se observa un flujo masivo del electrólito hacia uno de los electrodos.
Este flujo se denomina electroósmosis. Se produce como resultado de la carga superficial en las paredes del aparato, debida a
grupos funcionales ionizables inherentes al material estructural o a iones adsorbidos en las paredes de la celda procedentes del
electrólito con el que están en contacto. El efecto normalmente es mayor cuando la celda está llena con un lecho de sustancia
porosa, como un gel, que se utiliza para estabilizar el electrólito de soporte y evitar que las zonas separadas se vuelvan a mez-
clar por convección térmica o difusión. La solución inmediatamente adyacente a la superficie crea una carga eléctrica igual
pero de signo contrario a la carga superficial, y el campo eléctrico que atraviesa la celda produce un movimiento de la solución
hacia el electrodo de carga opuesta.
Las sustancias utilizadas habitualmente como medios estabilizantes en la electroforesis de zona desarrollan una carga superfi-
cial negativa y, por tanto, el flujo electroosmótico del electrólito se dirige hacia el cátodo. Como resultado, todas las zonas,
incluidas las sustancias neutras, se desplazan hacia el cátodo durante el ciclo electroforético.
El grado de electroósmosis observado varía en función de la sustancia estabilizante. Este hecho resulta apreciable con el gel
de agar y es insignificante con el gel de poliacrilamida.
Tamizado molecular-En ausencia de un medio estabilizante o en aquellos casos en los que el medio es muy poroso, la sepa-
ración electroforética de las moléculas se produce debido a diferencias en el cociente entre su carga eléctrica y su tamaño. En
USP 37 Pruebas Físicas / (726) Electroforesis 449

presencia de un medio estabilizante, las diferencias de adsorción o de otras afinidades de las moléculas por el medio producen
un efecto cromatográfico que permite mejorar la separación.
Si el medio estabilizante es un gel de alta reticulación de forma que el tamaño de los poros resultantes es del orden de la
dimensión de las moléculas que se desean separar, se obtiene un efecto de tamizado molecular. Este efecto es análogo al obte-
nido en separaciones basadas en cromatografía de exclusión molecular o permeación en gel, aunque en la electroforesis en gel
el efecto se superpone a la separación electroforética. El tamizado molecular puede visualizarse como el resultado de oponer
una barrera estérica al paso de las moléculas de mayor tamaño. Las moléculas pequeñas pasan a través de poros con un amp-
lio intervalo de tamaño y, por tanto, su paso electroforético a través del gel no se ve impedido. A medida que aumenta el
tamaño, cada vez menos poros permiten el paso de las moléculas, causando un retardo en la migración de las sustancias de
peso molecular elevado.

Electroforesis en Gel
Los procesos que utilizan un gel como, por ejemplo, agar, almidón o poliacrilamida, como medio estabilizante se denomi-
nan de forma general electroforesis en gel. Este método resulta especialmente ventajoso para la separación de proteínas. La
separación obtenida depende del cociente entre carga eléctrica y tamaño junto con un efecto de tamizado molecular que de-
pende básicamente del peso molecular.
El gel de poliacrilamida presenta varias ventajas que avalan su amplio uso. Presenta propiedades mínimas de adsorción así
como un efecto electroosmótico insignificante. Pueden prepararse de forma reproducible geles con una amplia gama de tama-
ños de poro variando la concentración total del gel (basada en monómero más agente de entrecruzamiento) y el porcentaje
de agente de entrecruzamiento utilizado para formar dicho gel. Estas cantidades se expresan convenientemente como

T(%) == [(a + b)/V] x 100

C(O/o) == [b/(a + b)] X 100
donde T es la concentración total de gel en %; C es el porcentaje de agente de entrecruzamiento utilizado para preparar el
gel; V es el volumen, en mL, de solución amortiguadora utilizada para la preparación del gel, y a y b son los pesos, en g, de
monómero (acrilamida) y agente de entrecruzamiento (normalmente N,N'-metilenbisacrilamida) utilizados para preparar el
gel. Se han preparado geles satisfactorios con concentraciones (T) que varían de aproximadamente 3% a 30%. Normalmente
la cantidad de agente de entrecruzamiento está entre aproximadamente una décima parte y una vigésima parte de la cantidad
de monómero (C == 10% a 5%), utilizándose un porcentaje menor para valores más altos de T.
Para preparar el gel se rellena el lecho del aparato de electroforesis con una solución acuosa de monómero y agente de en-
trecruzamiento, normalmente amortiguado al pH deseado en la última corrida y polimerizado in situ mediante un proceso de
radicales libres. La polimerización puede iniciarse con un proceso químico, normalmente utilizando persulfato de amonio más
N,N,N',N'-tetrametilendiamina o con medios fotoquímicos utilizando una mezcla de riboflavina y N,N,N',N'-tetrametilendiami-
na. La polimerización se inhibe con oxígeno molecular y condiciones ácidas. Debe respetarse rigurosamente la composición
del gel y las condiciones de polimerización elegidas para conseguir una calidad reproducible del gel.
Aparato para la Electroforesis en Gel-En general, el lecho o medio en el que se realiza la electroforesis puede estar so-
portado en sentido horizontal o vertical, dependiendo del diseño del aparato. También pueden realizarse una serie de separa-
ciones comparativas en diferentes tubos individuales o colocando diferentes muestras en pocillos adyacentes, conformados o
cortados en una sola placa de gel. Un conjunto de placa vertical como el que se muestra esquemáticamente en la Figura 2

Electrodo y reservorio
~-------r-- superi04" para solución
amortiguadora

Receptáculos
para muestra

Ganehos

Placa de Gel sostenida

entre dos placas de
vidrio separadas
por espaciadores

VISTA DE PERFIL VISTA FRONTAL

Fig. 2. Aparato de electroforesis en gel de placa vertical.

resulta adecuado para comparar directamente diferentes muestras. Una ventaja particular es la comparación de las muestras
en un único lecho de gel con una composición probablemente más uniforme que la de los geles conformados en una serie de
cámaras.
En muchos tipos de aparatos un elemento, no ilustrado en la vista esquemática, sella la cámara amortiguadora inferior a la
base del lecho y permite igualar el nivel de la solución amortiguadora de la cámara inferior con el de la cámara superior, elimi-
nando así la presión hidrostática en el gel. Además, algunas unidades disponen de circulación de refrigerante en uno o en am-
bos lados del lecho de gel.
450 (726) Electroforesis / Pruebas Físicas USP 37

En la preparación del gel, la base de la cámara de gel está cerrada con un dispositivo adecuado y la unidad se llena con la
solución de monómero, agente de entrecruzamiento y catalizador. Se introduce un peine, con dientes de un tamaño adecua-
do, en la parte superior y se deja que finalice la polimerización. Al retirar el peine quedan conformados una serie de pocillos de
muestra en el gel polimerizado.
En la electroforesis en gel sencilla se utiliza la misma solución amortiguadora para rellenar las cámaras de amortiguación su-
perior e inferior así como en la solución utilizada para preparar el gel. Después de llenar las cámaras, las muestras, disueltas en
sacarosa u otra solución densa y ligeramente viscosa para evitar la difusión, se introducen con una jeringa o micropipeta en el
fondo de los pocillos de muestra y a continuación se inicia inmediatamente la electroforesis.

ELECTROFORESIS DE DISCO

Una variante importante de la electroforesis en gel de poliacrilamida, que utiliza una serie discontinua de soluciones amorti-
guadoras y a menudo también una serie discontinua de capas de gel, recibe el nombre de electroforesis de disco. Este nombre
se debe a la forma discoide de las zonas muy estrechas que se obtienen con esta técnica. Debido a las estrechas zonas obteni-
das, esta técnica presenta una resolución extremadamente elevada y se recomienda para la identificación de mezclas de proteí-
nas y para la detección de contaminantes que pueden tener movilidades próximas a las del componente principal.
La base de la electroforesis de disco se describe en los siguientes párrafos tomando como ejemplo un sistema aniónico ade-
cuado para separar proteínas con una carga negativa neta. Para poder entender la electroforesis de disco resulta esencial cono-
cer los aspectos generales de la electroforesis y el aparato anteriormente descrito.
Bases de la Electroforesis de Disco-La alta resolución obtenida en la electroforesis de disco depende del uso de un siste-
ma amortiguador que sea discontinuo con respecto tanto al pH como a la composición. Esto normalmente se combina con el
uso de series discontinuas de dos o tres geles de diferente densidad.
Un sistema típico se ilustra esquemáticamente en la Figura 3.

Sección Densidad pH

Reservorio superior para

solución amortiguadora 8,3
- Gel para muestra baja 6,7

.............._ Espaciador de gel baja 6,7

Ión
Cloruro Gel de separación o de corrida alta 8,9

Reservorio inferior para

Glicinato solución amortiguadora 8,3
(3% carga negativa)

Fig. 3. Terminología, pH y composición de la solución amortiguadora para la electroforesis de disco en gel de acrilamida.

Un gel separador de alta densidad (T = 10% a 30%) y de varios centímetros de altura se polimeriza en una solución amorti-
guadora de tris-cloruro en el lecho del aparato. Durante la polimerización la solución amortiguadora se cubre con una capa
fina de agua para evitar la formación de un menisco en la parte superior del gel. A continuación se retira la capa superior de
agua y se polimeriza una capa fina, de 3 mm a 1O mm de espesor, de gel de baja densidad (T = 3%), denominado gel espacia-
dor o concentrador, en una solución amortiguadora de tris-cloruro encima del gel separador. Se vuelve a utilizar una capa su-
perior de agua para asegurar que la superficie esté plana. La muestra se mezcla con una pequeña cantidad de solución de
monómero de gel espaciador que se aplica sobre el gel espaciador y se deja polimerizar. El pH del gel separador es de forma
típica 8,9, mientras que el del gel espaciador y el del gel de muestra es 6,7. Los tres geles se preparan utilizando cloruro como
anión.
Los reservorios de solución amortiguadora superior e inferior se llenan con una solución amortiguadora de pH 8,3 preparada
con tris y glicina. A este pH, aproximadamente el 3% de las moléculas de glicina tienen una carga negativa neta.
Cuando se aplica un voltaje al sistema, la interfaz glicinato-cloruro se desplaza bajando hacia el ánodo. Inicialmente estaba
colocada en la unión entre la solución amortiguadora en el reservorio superior y la parte superior de la capa de gel de muestra.
El anión cloruro, por su tamaño pequeño, migra más rápido que cualquiera de las proteínas presentes en la muestra. El pH de
la muestra y de las capas espaciadoras se eligió para que tuviera un valor de aproximadamente 3 unidades por debajo del valor
pKª más alto de la glicina. Por tanto, al atravesar estas capas, solamente cerca de un O, 1% de las moléculas de glicina tienen
una carga negativa neta. Como consecuencia, la glicina migra más lentamente que el cloruro. La tendencia del cloruro, de
movimiento más rápido, a alejarse del glicinato reduce la concentración en la interfaz, produciendo una mayor caída de voltaje
en la interfaz, lo que a su vez hace que el glicinato alcance al cloruro. En estas condiciones se mantiene una interfaz muy clara
que hace que a medida que se desplaza a través de las capas de muestra y espaciadoras, las proteínas en la muestra tiendan a
USP 37 Pruebas Fisicas / (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos 451

concentrarse en la interfaz en capas muy finas ordenadas según su movilidad. El proceso se denomina concentración y es la
causa de la separación de los discos.
Cuando las proteínas concentradas alcanzan el gel separador de alta densidad, se ven lentificadas por un proceso de tamiza-
do molecular. Al encontrar un valor más alto de pH en el gel separador el glicinato migra más rápidamente, de forma que la
interfaz de la solución amortiguadora discontinua adelanta a las proteínas y finalmente alcanza el fondo del gel separador. Du-
rante este periodo, los discos de proteína continúan separándose por electroforesis y tamizado molecular en el gel separador.
Al final del ciclo, el pH del gel separador habrá superado su valor original de 8, 9 para alcanzar un valor de pH de aproximada-
mente 9,5.
Movilidad relativa-El azul de bromofenol se utiliza con frecuencia como estándar para calcular la movilidad relativa de las
zonas separadas y para juzgar visualmente el progreso del ciclo. Este puede añadirse a uno de los pocillos de la muestra o
mezclarse con la propia muestra, o simplemente agregarse a la solución amortiguadora en el reservorio superior de la muestra.
La movilidad relativa, M 8, se calcula como:

M 8 =distancia desde el origen a la zona de la muestr:i/distancia desde el origen a la zona de azul rle bromofenol

Visualización de Zonas-Dado que la poliacrilamida es transparente, las bandas de proteína pueden localizarse mediante
escaneado en un densitómetro con luz UV. Las zonas pueden fijarse mediante inmersión en precipitantes de proteínas tales
como el ácido fosfotúngstico o el ácido tricloroacético al 10%. Puede utilizarse una amplia gama de reactivos de tinción, in-
cluido el negro de naftaleno (negro amida) y el azul brillante de Coomassie R250. Las zonas fijadas o teñidas pueden observar-
se y fotografiarse convenientemente con luz transmitida por un iluminador de película de rayos X.

PRECAUCIONES DE SEGURIDAD

Los voltajes utilizados en la electroforesis pueden producir fácilmente una electrocución letal. El riesgo se ve aumentado por
el uso de soluciones amortiguadoras acuosas y la posibilidad de trabajar en entornos húmedos.
El equipo, con la posible excepción de la fuente de energía, debe estar contenido en una caja de metal con descarga a tierra
o en una caja de material aislante. La caja debe tener un sistema que corte la fuente de energía cuando la caja se abra y evitar
la reactivación hasta que se lleve a cabo un reinicio del interruptor.
Los cables de alto voltaje que van desde la fuente de energía al aparato deben ser preferiblemente de un tipo en el cual un
blindaje de metal trenzado encierre completamente al conductor central aislado y, además, el blindaje debe tener toma a tie-
rra. La base del aparato debe ser de metal con toma a tierra o contener un borde de metal con toma a tierra construido de
forma que cualquier fuga de electrólito produzca un cortocircuito que corte la fuente de energía antes de que el electrólito
pueda salir mas allá de la cubierta protectora.
Si la fuente de alimentación contiene condensadores como parte de un circuito de filtro, también debe contener una resis-
tencia de derivación para garantizar la descarga de los condensadores antes de que se abra la caja de protección. La existencia
de una barra de cortocircuito que se active al abrir la caja puede ser considerada como una precaución adicional.
Dado el riesgo potencial asociado a la electroforesis, el personal de laboratorio debe estar totalmente familiarizado con el
equipo de electroforesis antes de utilizarlo.

(729) DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE GLÓBULOS EN EMULSIONES

INYECTABLES DE LÍPIDOS

INTRODUCCIÓN

Las emulsiones inyectables para administración intravenosa, que se utilizan en la terapia de nutrición parenteral total (TPN,
por sus siglas en inglés), son emulsiones estériles de aceite de soja en agua utilizadas para proveer un suministro amplio de
ácidos grasos esenciales, linoleico y linolénico, que se dispersan con la ayuda de un agente emulsionante en Agua para Inyec-
ción. Como alternativa, se puede mezclar el aceite de soja con otros aceites adecuados (triglicéridos neutros), como el aceite
de cártamo, triglicéridos de cadena media (MCT, por sus siglas en inglés) derivados de aceites de coco o de semilla de palma,
aceite de oliva o un aceite marino como el de arenque. El tamaño de las gotitas de lípidos es crítico: debido a la filtración
mecánica, los glóbulos de grasa de mayor tamaño (>5 ~tm) pueden quedar atrapados en los pulmones. Las características
esenciales del tamaño de una emulsión inyectable de lípidos para uso intravenoso incluyen el diámetro medio de las gotitas de
lípidos y el intervalo de los distintos diámetros de gotitas que se distribuyen alrededor del diámetro medio, lo que se expresa
como la desviación estándar. Específicamente, las cantidades de glóbulos de grasa que constituyen la cola de la curva de distri-
bución correspondiente al mayor tamaño de glóbulos son particularmente importantes con respecto a la seguridad de la infu-
sión. Se debe controlar que estas dos regiones de la distribución del tamaño de glóbulos (el tamaño medio de las gotitas y la
cola de la curva de distribución correspondiente al mayor tarT.año de gotitas) se mantengan dentro de los límites especifica-
dos.
452 (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos ! Pruebas Físicas USP 37

Para la determinación del diámetro medio de las gotitas de lípidos y la distribución de los tamaños de glóbulos de mayor
diámetro en las emulsiones inyectables de lípidos se utilizan los dos métodos que se describen a continuación. El Método I y el
Método 11 deben ser validados. Los métodos que se describen a continuación para evaluar la calidad de las emulsiones inyecta-
bles de lípidos se deben realizar en dos etapas.

MÉTODO 1-MÉTODO DE DISPERSIÓN DE LA LUZ

Para la determinación del tamaño medio de las gotitas de las emulsiones inyectables de lípidos, puede usarse una de las dos
técnicas de dispersión de la luz más comunes: (1) dispersión dinámica de la luz (DDL), conocida también como espectroscopía
de correlación fotónica (ECF) o (2) dispersión clásica de la luz, basada en la teoría de dispersión de Mie. La técnica DDL o ECF
se basa en el análisis de las fluctuaciones temporales rápidas en la intensidad de la luz dispersada que se producen debido al
movimiento Browniano aleatorio, o difusión, de cualquier partícula, incluidas las gotitas de lípidos, suspendidas en un líquido.
La intensidad se mide a un ánqulo determinado (por lo general 90º) por medio de un detector adecuado (p.ej., un tubo foto-
multiplicador) capaz de medir la intensidad de la luz dispersada, que fluctúa rápidamente, producida por las gotitas en difu-
sión, suspendidas. Generalmente, estos datos de intensidad de luz dispersada se utilizan para calcular la función de autocorre-
lación de intensidad, que es una función de decaimiento exponencial simple en función del tiempo para gotitas de tamaño
uniforme. La distribución de los tamaños de las gotitas se expresa por funciones exponenciales de distintos tiempos de decai-
miento. La función de autocorrelación que generan los datos de intensidad de luz dispersada obtenidos a partir de una emul-
sión dada puede ser "invertida" por medio de un algoritmo adecuado de deconvolución para obtener la distribución aproxi-
mada de coeficientes de difusión ponderados por intensidad. A partir de ésta, se calcula la distribución de gotitas de diámetro
pequeño, mediante la ecuación de Stokes-Einstein y las reglas de la dispersión clásica de la luz (Mie).
Por el contrario, la dispersión clásica de la luz basada en la teoría de Mie analiza la variación espacial, no la temporal, de la
intensidad de la luz dispersada al medir a la última como una función del ángulo de dispersión, típicamente a lo largo de un
gran intervalo de ángulos detectados. Las fluctuaciones temporales en la intensidad de dispersión debidas al movimiento
Browniano se promedian en el tiempo para cada medición angular. Esta variación angular se produce como consecuencia de
la interferencia mutua de las ondas individuales dispersadas que llegan al detector con fases distintas desde puntos diferentes
dentro de una gotita de lípidos dada así como desde otras partículas. La amplitud de la variación angular es significativa toda
vez que el diámetro de la gotita no sea pequeño en comparación con la longitud de onda de la luz láser (típicamente, 635
nm). Las gotitas de un tamaño e índice de refracción determinados producen una curva única de intensidad de dispersión en
función del ángulo de dispersión. La distribución de los tamaños de gotitas origina una dependencia angular final que repre-
senta la superposición o suma de las curvas individuales (distintas) de intensidad en función del ángulo. La dependencia angu-
lar medida de la intensidad de dispersión obtenida a partir de una muestra de emulsión dada puede ser invertida por medio de
un algoritmo adecuado de deconvolución y la teoría de dispersión de Míe para obtener la distribución aproximada del tamaño
de gotitas.
Así, la dispersión de la luz, mediante la dispersión dinámica de la luz (es decir, fluctuaciones temporales debidas a la difusión
de las gotitas) o la dispersión clásica de la luz/teoría de Mie (es decir, intensidad promedio en función del ángulo), puede pro-
porcionar resultados aceptables para el diámetro medio y la desviación estándar de la distribución del tamaño de las gotitas.
Para ilustrar el método usado en el Método 1, se describe una técnica de dispersión dinámica de la luz. Para una guía sobre los
instrumentos que utilizan la dispersión clásica de la luz - teoría de Mie, ver Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de
Luz (429).
Aparato-Un instrumento DDL/ECF adecuado, con o sin la capacidad de dilución automática de muestra, y controlado por
un software validado, se utiliza para llevar a cabo la medición con el ángulo de .dispersión generalmente ajustado a 90º. Se
informan los resultados ponderados por intensidad (diámetro medio y desviación estándar), siempre que se indique claramen-
te cuáles son los valores que se proveen y que también se den los valores de los parámetros necesarios para los cálculos reque-
ridos.
Agua-Pasar agua destilada a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm y desgasificar por ultrasonido o usar
Agua Estéril para Inyección almacenada en un envase de vidrio.
Preparación Estándar-Agregar una cantidad adecuada de suspensión concentrada, conteniendo partículas estándar de
látex de poliestireno rastreables al NIST u otras nanoesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suave-
mente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. La suspensión diluida tendrá un aspecto levemente turbio. Si el
instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial
por inyección directa en el instrumento con una jeringa, produciéndose automáticamente una dilución adicional para optimi-
zar la concentración de gotitas para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor con Agua
(típicamente por un factor de 1 O, por lo menos, sobre la primera dilución) y su instilación posterior en una celda de goteo. Las
especificaciones del instrumento determinarán el esquema óptimo de dilución que logre la intensidad de dispersión adecuada
para el análisis por celda. Así, se debe optimizar la concentración de látex en la muestra final para el instrumento DDL/ECF
utilizado. Esto se deberá llevar a cabo separadamente para tres estándares de tamaño distintos de aproximadamente 100 nm,
250 nm y 400 nm (análisis triplicado por tamaño) y los resultados correspondientes del diámetro medio ponderado por inten-
sidad y la desviación estándar deben coincidir con los valores esperados dentro de errores aceptables.
Preparación de Prueba-Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsión inyectable de lípidos a un volumen
preestablecido de agua. Mezclar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. La suspensión diluida ten-
USP 37 Pruebas Físicas/ (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos 453

drá un aspecto levemente turbio. Si el instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, se puede
analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con una jeringa. Automáticamente se producirá
una dilución adicional de la muestra para optimizar la concentración de gotitas para el análisis, lo que asegura que no se pro-
duzcan artefactos debidos a la dispersión múltiple o las interacciones entre las gotitas. Alternativamente, la muestra podría re-
querir una dilución manual mayor con Agua (típicamente por un factor de 1 O, por lo menos, sobre la primera dilución) y su
instilación posterior en una celda "de goteo". Las especificaciones del instrumento determinarán el esquema óptimo de dilu-
ción que logre la intensidad de dispersión adecuada para el análisis por celda. Así, se debe optimizar la concentración de la
emulsión inyectable de lípidos en la muestra final para el instrumento DDL/ECF utilizado.
Aptitud del Sistema-Usando la Preparación Estándar, medir el diámetro medio de partículas ponderado por intensidad y
la desviación estándar correspondiente. El sistema es apto una vez que la temperatura de la muestra alcanza el equilibrio y los
resultados se han estabilizado y se obtienen por triplicado las mediciones del diámetro medio de las gotitas. El coeficiente de
variación (CV) no debe superar el 10% del diámetro medio de las gotitas rastreables al NIST. Un valor mayor de CV indica que
las microesferas de látex no son aptas como estándar porque carecen inherentemente de uniformidad o se han aglomerado a
un nivel inaceptable. En este caso, se debe seleccionar y probar otra suspem1ón látex estándar.
Procedimiento e Interpretación-Si el instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, usar
una jeringa desechable para cargar la Preparación Estándar o la Preparación de Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilución
automático, transferir la preparación adecuadamente diluida a una celda y colocarla en el espectrómetro. Dejar que la muestra
se equilibre a una temperatura controlada preestablecida cercana a la temperatura ambiente (entre 20º y 25º, como en la defi-
nición de la USP que se encuentra en Requisitos de Envases y Almacenamiento (659)). Ajustar el ángulo de dispersión del instru-
mento a 90º y llevar a cabo las mediciones. En tanto que la bondad del ajuste chi cuadrado (x 2 ) se mantenga aceptablemente
bajo (de acuerdo con las especificaciones del instrumento), los resultados para la Preparación de Prueba son aceptables. Los
valores excesivos del parámetro x2 sugieren que la distribución de gotitas no es normal y pueden indicar una emulsión inesta-
ble. El diámetro medio de las gotitas ponderado por intensidad (MDD) para las emulsiones inyectables de lípidos debe ser infe-
rior a 500 nm o 0,5 µm, independientemente de la concentración de la fase lípida dispersa.

MÉTODO U-MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE GLÓBULOS GRANDES POR EL MÉTODO DE

OBSTRUCCIÓN O EXTINCIÓN DE LUZ
Para la determinación de la extensión de la cola de la curva de distribución correspondiente al mayor tamaño de gotita (>5
µm) de las emulsiones inyectables de lípidos se usa un método de obstrucción de la luz (LO, por sus siglas en inglés) o extin-
ción de la luz (LE, por sus siglas en inglés) que emplea la técnica de determinación óptica del tamaño de partículas individuales
(glóbulos) (SPOS, por sus siglas en inglés). Durante la aplicación de la técnica LE/SPOS, el pasaje de una gotita a través de una
zona estrecha de detección óptica causa el bloqueo de una porción del haz de luz incidente, lo que provoca la reducción mo-
mentánea de la intensidad de la luz que alcanza al detector de "extinción". Idealmente, la magnitud de esta reducción en la
señal es proporcional al área de sección transversal de la gotita (considerada más pequeña que el espesor de la zona de detec-
ción), es decir, al cuadrado del diámetro de la gotita. Durante la optimización del instrumento LE/SPOS para una muestra de
emulsión determinada, debe probarse una serie de diluciones para lograr uniformidad entre las muestras. El objetivo es la iden-
tificación de un intervalo estándar de diluciones que produzcan datos uniformes y sean las más adecuadas para la formulación
evaluada. Idealmente, cuando se comparan emulsiones distintas, se utiliza el mismo número aproximado de glóbulos en cada
determinación de tamaño y una vez que se alcanza un estándar, se lo incorpora al plan de muestreo de rutina para las pruebas
de validación. Siempre que la concentración de glóbulos de grasa esté por debajo del "límite de coincidencia" del sensor (de-
terminado por la celda de flujo y el diseño óptico), sólo pasará un glóbulo, como máximo, a través de la zona de detección en
un momento determinado, lo que permite que se lo cuente y se mida con exactitud (con menos de 1% de eventos de coinci-
dencia). Es necesario conocer el límite de coincidencia y la velocidad óptima del flujo para el sensor LE/SPOS usado. Además,
es prudente que se realicen las mediciones de diámetro grande a una concentración reducida de la emulsión para que la con-
centración mensurable de gotitas desde un umbral de detección (p.ej., > 1,8 µm) hasta un límite superior (p.ej., 50 µm) sólo
sea aproximadamente un tercio del límite nominal de coincidencia para el sensor usado. Las alturas resultantes de los pulsos
individuales se convierten en diámetros de gotitas mediante una curva de calibración estándar construida previamente a partir
de microesferas de poliestireno de tamaño uniforme rastreables al NIST con diámetros conocidos. Para una guía adicional en el
uso de la metodología de obstrucción de la luz, consultar el capítulo general Partículas en Inyectables (788).
Aparato-Para la medición se usa un instrumento de obstrucción de la luz adecuado, con o sin capacidad de dilución auto-
mática de la muestra y controlado por un ordenador personal (PC). Se informan los datos de distribución del tamaño de partí-
culas ponderado por número y volumen, siempre que se indique claramente cuáles son los valores que se proveen y que tam-
bién se den los valores de los parámetros necesarios para todos los cálculos requeridos.
Agua-Pasar agua destilada a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm o usar Agua Estéril para Inyección alma-
cenada en un envase de vidrio.
Preparación Estándar-Agregar una cantidad adecuada de suspensión concentrada, conteniendo partículas estándar de
látex de poliestireno rastreables al NIST u otras microesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suave-
mente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un
sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con
una jeringa o una línea de muestreo de Teflón. Luego, se produce automáticamente una dilución adicional de la muestra para
454 (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos / Pruebas Físicas USP 37

optimizar la concentración de partículas para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor
con agua (típicamente por un factor de 1 O, por lo menos, sobre la primera dilución). La muestra diluida resultante se instila
luego en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estéril Tipo 1, antes de pasarla por el sensor. En cual-
quiera de los casos, la concentración final de partículas debe estar por debajo del límite de coincidencia del sensor. Se debe
obtener la exactitud de la determinación de tamaño y recuento del instrumento de obstrucción de la luz mediante dos están-
dares de tamaño distintos de aproximadamente 5 µm y 1 O µm (análisis triplicado por tamaño). Para los estándares después de
la calibración del sistema, ajustar el umbral de detección del instrumento a 1,8 µm, extendido a un límite superior de 50 µm.
Los resultados correspondientes del diámetro medio deben coincidir con los valores esperados, dentro de 10% de la desvia-
ción estándar relativa y una exactitud de tamaño de 90%-110%. Además, el número de recuento de partículas obtenido por
mL también debe coincidir dentro de ±10% con los valores de concentración certificados en la documentación provista con
cada estándar de tamaño rastreable al NIST.
Preparación de Prueba-Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsión inyectable de lípidos (análisis triplicado
por muestra) a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogé-
nea. La emulsión diluida tendrá un aspecto levemente turbio. Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un
sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con
una jeringa o línea de muestreo de Teflón no reactiva*. Luego, se produce automáticamente una dilución adicional de la mues-
tra para optimizar la concentración de gotitas/glóbulos para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución
manual mayor con agua (típicamente por un factor de por lo menos 1O sobre la primera dilución). La muestra diluida resultan-
te se instila en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estéril Tipo l. En cualquiera de los casos, la con-
centración final de gotitas/glóbulos debe estar por debajo del límite de coincidencia del sensor.
Aptitud del Sistema-Realizar antes del procedimiento de prueba, usando la Preparación Estándar de partículas de 5 y de
1 O µm rastreables al NIST. Medir por triplicado el diámetro de partícula ponderado por número y los conteos/mL del estándar.
El sistema es adecuado cuando las mediciones por triplicado del diámetro medio de partícula ponderado por número están
dentro de 10% del valor estipulado, tanto en términos de repetibilidad (CV) como de la cercanía al tamaño certificado en la
etiqueta del estándar rastreable al NIST.
Procedimiento e Interpretación-Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un sistema de dilución au-
tomático, usar una jeringa o línea de muestreo de Teflón desechable para cargar la Preparación Estándar o la Preparación de
Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilución automática, transferir la muestra a un recipiente limpio y adecuado, de gran
volumen, como un vaso de vidrio estéril Tipo 1 conteniendo un volumen adecuado de agua. Dejar que la muestra y el agua se
mezclen bien para obtener una suspensión homogénea. Ajustar el umbral de detección del instrumento a 1,8 µm, extendido a
un límite superior de 50 µm, y variar la concentración y/o los tiempos de la recolección de datos de tal manera que haya al
menos un factor de dos en la diferencia del número total de glóbulos que miden >5 µm entre al menos dos corridas de la
muestra. En cualquier caso, el número de glóbulos que miden >5 µm debe ser lo suficientemente grande para representar un
número de glóbulos adecuado que sea estadísticamente representativo de la población de diámetro mayor de la cola de la
curva de distribución correspondiente a la emulsión nativa. Los límites de la fase dispersa para los glóbulos de grasa de diáme-
tro mayor ponderado por volumen, expresados como el porcentaje de grasa en glóbulos mayores de 5 µm (PFAT5) para una
emulsión inyectable de lípidos dada, no deben exceder de 0,05%.

(730) ESPECTROQUÍMICA DE PLASMA

Las técnicas instrumentales basadas en plasma que se utilizan en el análisis farmacéutico se clasifican en dos grandes grupos:
a) las técnicas que se basan en plasma inductivamente acoplado y b) las técnicas en las que el plasma se genera en la superfi-
cie de la muestra o cerca de ella. El plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés) es una fuente de excitación
de alta temperatura que desolvata, vaporiza y atomiza muestras aerosolizadas e ioniza los átomos resultantes. Estos iones y
átomos excitados pueden detectarse posteriormente mediante la observación de sus líneas de emisión, un método denomina-
do espectroscopía de emisión atómica de plasma inductivamente acoplado (ICP-AES, por sus siglas en inglés), que también se
conoce como espectroscopía de emisión óptica de plasma inductivamente acoplado (ICP-OES, por sus siglas en inglés), o los
iones excitados o en estado fundamental pueden determinarse mediante una técnica que se denomina espectrometría de ma-
sas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS, por sus siglas en inglés). La ICP-AES y la ICP-MS son técnicas que permiten
analizar uno o varios elementos y constituyen procedimientos generales apropiados, tanto para análisis secuenciales como para
análisis simultáneos, con un amplio intervalo lineal y buena sensibilidad.
Una nueva técnica de espectroscopía de plasma es la espectroscopía de descomposición inducida por láser (LIBS, por sus
siglas en inglés). La técnica LIBS consiste en calentar directamente la muestra en estado líquido, sólido o gaseoso con un láser
pulsado o indirectamente por un plasma generado por el láser. Como resultado, la muestra se volatiliza en el punto de contac-

* El cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en inglés) con dietilhexilftalato (DEHP, por sus siglas en inglés) demostró inducir el rompimiento de las emulsiones
inyectables de lípidos (Sistema de Presentación de Informes sobre Problemas con Productos Farmacéuticos. Acceso a Archivo No. 111 73 de la USP, el 15 de mayo,
1991).
 USP 37 Pruebas Físicos/ (730) Espectroquímica de Plasma 455

to con el láser, reduciendo los constituyentes volatilizados a átomos, fragmentos moleculares y grupos más grandes, en el plas-
ma que se forma en la superficie de la muestra o un poco más arriba de ella. La emisión de los átomos e iones de la muestra se
recolecta, generalmente con fibra óptica u otro sistema de visualización remota y se mide con un dispositivo detector, como
por ejemplo un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés). La LIBS se puede utilizar para realizar
análisis cualitativos o cuantitativos con una curva estándar de trabajo. Aunque la industria farmacéutica aún no ha incorporado
la utilización generalizada de la LIBS, ésta puede resultar adecuada para realizar mediciones tanto en el área de producción
como en el laboratorio, en el lugar físico o en línea. Su potencial la convierte en una técnica viable para la espectroquímica de
plasma en el laboratorio farmacéutico, no obstante, siendo la LIBS una técnica relativamente nueva, este capítulo general no la
tratará en forma detallada. 1

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
La preparación de la muestra es de suma importancia en el análisis mediante técnicas basadas en plasma y es el primer paso
en todo análisis por ICP-AES o ICP-MS. Los resultados de las técnicas basadas en plasma dependen en gran medida del trans-
porte de la muestra al plasma. Como el sistema de introducción de muestra de la ICP-AES y la ICP-MS es el mismo, los méto-
dos mediante los cuales se preparan las muestras pueden aplicarse a ambas técnicas. El método más convencional para intro-
ducir la muestra en el plasma es la nebulización de la solución. Si se emplea la nebulización de la solución, es necesario disolver
las muestras sólidas para introducirlas en el plasma para su análisis. Las muestras se pueden disolver en cualquier disolvente
apropiado. Existe una gran preferencia por el uso de soluciones acuosas o diluidas de ácido nítrico porque sus interferencias
son mínimas en comparación con otros disolventes. Para disolver la muestra también se pueden emplear peróxido de hidróge-
no, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido perclórico, distintas combinaciones de ácidos o mezclas de ácidos con distintas
concentraciones. El ácido fluorhídrico diluido también se puede usar, aunque cuando se emplea es necesario tomar las precau-
ciones necesarias para garantizar la seguridad del analista y proteger el equipamiento de cuarzo para introducción de muestra;
específicamente, el nebulizador, la cámara de rocío y el tubo interno de la antorcha los cuales deben estar fabricados con ma-
teriales resistentes al ácido fluorhídrico. Se pueden emplear otras alternativas para disolver la muestra, tales como bases dilui-
das, disolventes orgánicos puros o diluidos, combinaciones de ácidos o bases y distintas combinaciones de disolventes orgáni-
cos, entre otras.
Cuando las muestras se introducen en el plasma por nebulización de la solución, es importante considerar los posibles efec-
tos de la matriz e interferencias que el disolvente pueda generar. En casos en los que la exactitud y la precisión no sean ade-
cuadas, se debe emplear un estándar interno apropiado y/o se debe homologar la matriz del estándar con la matriz de las
muestras en los análisis ICP-AES e ICP-MS. En todo caso, la selección de un estándar interno apropiado debe tener en cuenta
el analito en cuestión, la energía de ionización, las longitudes de onda o las masas y la naturaleza de la matriz de la muestra.
Cuando una muestra no es soluble en ninguno de los disolventes aceptables, se pueden emplear diferentes técnicas de di-
gestión. Entre ellas está la digestión por calentamiento en placa o la digestión asistida por microondas, tanto en recipientes
cerrados como abiertos. La selección del tipo de técnica de digestión depende de la naturaleza de la muestra a digerir y de los
analitos en estudio.
Por lo general no se recomienda la digestión en recipientes abiertos en los análisis de metales volátiles; por ejemplo, selenio
y mercurio. La aptitud de una técnica de digestión, sea en un recipiente abierto o cerrado, debe respaldarse con experimentos
de recuperación de cantidades conocidas agregadas para comprobar que, en un intervalo de tolerancia aceptable, los metales
volátiles no se han evaporado durante la preparación de la muestra. Utilizar ácidos, bases y peróxido de hidrógeno ultra puros,
especialmente cuando se emplea la ICP-MS. El agua desionizada debe tener 18 megaohmios como mínimo. Verificar las posi-
bles interferencias del diluyente antes de utilizarlo en un análisis. Seleccionar los disolventes orgánicos de la calidad más alta
disponible con respecto al contenido de contaminantes metálicos, ya que no siempre es posible obtener estos disolventes
exentos de metales.
Es importante tomar en cuenta la selección del tipo, material de construcción, tratamiento previo y limpieza del instrumental
de laboratorio analítico empleado en los análisis ICP-AES e ICP-MS. El material debe ser inerte y, dependiendo de la aplicación
específica, resistente a cáusticos, ácidos y/o disolventes orgánicos. En algunos análisis, se debe proceder con la diligencia debi-
da para prevenir la adsorción de analitos sobre la superficie de los recipientes, especialmente en los análisis a nivel de ultratra-
za. La contaminación de las soluciones de muestra con metales o iones presentes en el envase puede también generar resulta-
dos inadecuados.
El uso de instrumental que no ha sido certificado para cumplir con las tolerancias Clase A para matraces volumétricos es
aceptable si se ha demostrado experimentalmente que la linealidad, exactitud y precisión del método son adecuadas para el
estudio a realizar.

INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA
Existen dos formas de introducir la muestra en el nebulizador: con una bomba peristáltica o por autosucción. Se prefiere el
uso de la bomba peristáltica, la cual garantiza que la velocidad de flujo de la muestra y de la solución estándar hacia el nebuli-

1 Yueh F-Y, Singh JP, Zhang H. Laser-induced breakdown spectroscopy, elemental analysis. En: Encyclopedio of Analyticol Chemistry: lnstrumentation and Applico-
tions. New York: Wiley; 2000:2066-2087.
456 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Físicas USP 37

zador es la misma, independientemente de la viscosidad de la muestra. En algunos casos, cuando no es indispensable emplear
la bomba peristáltica, puede utilizarse la autosucción.
Existen varios tipos de nebulizadores disponibles: neumáticos (concéntricos y de flujo cruzado), de rejilla y ultrasónicos.
También están disponibles los micronebulizadores, los nebulizadores de alta eficacia, los nebulizadores de alta eficacia por in-
yección directa y los nebulizadores de inyección de flujo. La selección del nebulizador para cada análisis se debe hacer en fun-
ción de la matriz de la muestra, del analito y de la sensibilidad deseada. Algunos nebulizadores son mejores para las soluciones
viscosas o las que contengan sólidos disueltos en altas concentraciones, mientras que otros son mejores para soluciones orgá-
nicas.
Tener en cuenta que la autosucción de un fluido se debe a los efectos de Bernoulli o de Venturi. No se puede obtener auto-
succión con todos los tipos de nebulizadores. Por ejemplo, se requiere de un nebulizador concéntrico para la autosucción de
una solución.
Una vez que la muestra sale del nebulizador en forma de aerosol, ingresa a la cámara de rocío que está diseñada para selec-
cionar sólo las gotitas más pequeñas de la solución de muestra para que ingresen al plasma, como resultado, normalmente
sólo de 1% a 2% del aerosol de muestra llega al ICP, aunque algunos nebulizadores con estos fines específicos están diseñados
para permitir que prácticamente todo el aerosol de la muestra ingrese al ICP. Al igual que con los nebulizadores, existen varios
tipos de cámaras de rocío disponibles para ICP-AES o ICP-MS, como por ejemplo la cámara de rocío de doble pasaje de Scott
y las cámaras de rocío ciclónicas con distintas configuraciones. Seleccionar una cámara de rocío compatible con la muestra y el
disolvente, considerando que es necesario que se equilibre y vacíe en el menor tiempo posible. Cuando se seleccione una cá-
mara de rocío, se debe tener en cuenta la naturaleza de la matriz de la muestra, la sensibilidad deseada y el analito.
Los sistemas de cromatografía de líquidos o de gases pueden interconectarse con ICP-AES e ICP-MS para lograr especiación
molecular, iónica u otros modos de separación química basados en emisión elemental o espectrometría de masas.
En última instancia, se debe demostrar experimentalmente que la selección del equipo de introducción de la muestra ofrece
suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud y precisión en el análisis.
Además de soluciones nebulizadas, también es posible analizar muestras sólidas directamente por ablación láser (LA, por sus
siglas en inglés). En esos casos, la muestra ingresa directamente a la antorcha en forma de humo. En vista de las dificultades
que presenta la obtención de estándares apropiados, las técnicas de LA-ICP y LA-ICP-MS se consideran más adecuadas para
los análisis cualitativos de compuestos farmacéuticos. Sin embargo, se pueden realizar análisis cuantitativos si se demuestra
mediante un método de validación apropiado que los estándares disponibles son adecuados. 2

PREPARACIÓN ESTÁNDAR

Se pueden adquirir soluciones estándar de uno o múltiples elementos, con concentraciones rastreables a estándares de refe-
rencia primarios, como los del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés), para emplearlas en la
preparación de soluciones estándar de trabajo. Como alternativa, se pueden preparar soluciones estándar de elementos a par-
tir de materiales estándar y determinar independientemente sus concentraciones, según corresponda. Las soluciones estándar
de trabajo, especialmente aquellas empleadas en los análisis a nivel de ultratraza, pueden tener una vida útil limitada. Como
regla general, las soluciones estándar de trabajo deben conservarse por un período no mayor a 24 horas a menos que se de-
muestre su estabilidad experimentalmente. La selección de la matriz de la preparación estándar es de vital importancia. Los
experimentos de recuperación de cantidades conocidas agregadas deben realizarse sobre matrices específicas para la muestra
para determinar la exactitud del método. Si los efectos de matriz de la muestra ocasionan demasiadas inexactitudes, los están-
dares, blancos y soluciones de muestra deben ser lo más parecidos posible a la matriz para reducir al mínimo las interferencias.
Cuando no sea posible homologar la matriz, se recomienda utilizar para la 1Cp-AES o ICP-MS un estándar interno apropiado
o el método de estándar adicionado. También se pueden introducir estándares internos a través de un conector "T" en el tubo
de subida de la muestra. En cualquier caso, en la selección de un estándar interno apropiado se debe tener en cuenta los anali-
tos en cuestión, sus energías de ionización y excitación, sus comportamientos químicos, sus longitudes de onda o masas y la
naturaleza de la matriz de la muestra. En última instancia, se debe demostrar experimentalmente que la selección del estándar
interno ofrece suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud y precisión en el análisis.
El método de estándar adicionado consiste en el agregado a la muestra de una concentración conocida del elemento analito
a no menos de dos niveles de concentración además de una preparación de la muestra sin el agregado de cantidades conoci-
das. La respuesta del instrumento se grafica en función de la concentración del elemento analito agregado y se traza la recta
de regresión lineal correspondiente a los datos. La concentración del analito en la muestra se obtiene multiplicando el valor
absoluto del punto donde la recta corta el eje x por el factor de dilución que corresponda.
La presencia de carbón disuelto a concentraciones de pequeño porcentaje en soluciones acuosas eleva la ionización de sele-
nio y de arsénico en un plasma de argón inductivamente acoplado. Este fenómeno por lo general resulta en el sesgado positi-
vo de las medidas cuantitativas de selenio y arsénico mediante ICP-AES e ICP-MS, las cuales pueden corregirse mediante el
método de estándar adicionado o el agregado de un pequeño porcentaje de carbón, como el ácido acético glacial analítica-
mente puro, a los estándares de linealidad.

2 Para información adicional acerca de la ablación láser, ver Russo R, Mao X, Borisov O, Liu H. Laser ablation in atomic spectrometry. En: Encyclopedia of Analytical
Chemistry: lnstrumentation and Appfications. New York: Wiley; 2000.
USP 37 Pruebas Físicas/ (730) Espectrociuímica de Plasma 457

ICP

La fuente de excitación de ICP está compuesta por un suministro de gas argón, una antorcha, una bobina de inducción de
radio frecuencia (RF), una unidad apareadora de impedancia y un generador RF. El gas que se utiliza más comúnmente en la
ICP es el argón. La antorcha de plasma consiste en tres tubos de cuarzo concéntricos, denominados tubo interno, intermedio y
exterior. Los tubos intermedios y externos por lo general están hechos de cuarzo. El tubo interno puede estar hecho de cuarzo
o alúmina si el análisis se realiza con soluciones con ácido fluorhídrico. El flujo del gas nebulizador transporta el aerosol de la
solución de muestra a través del tubo interno de la antorcha y lo introduce en el plasma. El tubo intermedio transporta el gas
intermedio (a veces denominado auxiliar). El flujo del gas intermedio ayuda a elevar el plasma y a hacerlo salir de los tubos
intermedio e interno para evitar que se fundan y que se depositen carbono y sales en el tubo interno. El tubo exterior transpor-
ta el gas exterior (a veces denominado plasma o refrigerante) que se utiliza para crear y mantener el plasma toroidal. El flujo
tangencial del gas refrigerante a través de la antorcha mantiene el plasma donde debe estar, impidiendo que el ICP se expan-
da hacia el tubo exterior y lo llene y que la antorcha se funda. Alrededor de la antorcha se encuentra la bobina de inducción
RF, también denominada bobina de carga, que genera un campo magnet1co osc1latono. Este campo genera a su vez una co-
rriente oscilatoria en los iones y electrones formados a partir del argón. La unidad apareadora de impedancia permite acoplar
eficientemente la energía RF del generador con la de la bobina de carga. La unidad puede ser de tipo activa o pasiva. Una
unidad apareadora activa ajusta la impedancia de la energía RF mediante una red capacitiva, mientras que la de tipo pasiva
ajusta la impedancia directamente a través del circuito generador. La transferencia de energía entre la bobina y el argón que se
produce dentro de la bobina de carga del generador RF genera un plasma autónomo. Los iones y electrones del argón colisio-
nan con los átomos del analito que están en el plasma a alta temperatura, ionizándolos y excitándolos. La temperatura del
plasma es de 6000 a 1 O 000 K, tal que básicamente todas las uniones covalentes y las interacciones entre los analitos se han
eliminado.

ICP-AES

El plasma inductivamente acoplado puede emplearse en sistemas de detección ópticos o de espectrometría de masas. En el
primer caso, ICP-AES, la detección del analito se realiza a alguna de las longitudes de onda de emisión del analito en cuestión.
Existe una amplia variedad de sistemas ICP-AES disponibles con distintas tecnologías, cada uno con distintas capacidades y
con sus propias ventajas y desventajas. Los sistemas de detección simultánea permiten analizar varios elementos al mismo
tiempo, reduciendo los tiempos de análisis, y mejorando la detección y corrección de ruido de fondo. Los sistemas secuencia-
les funcionan con una longitud de onda a la vez y luego pasan a la siguiente y, a menudo, ofrecen una variedad más amplia de
bandas analíticas para seleccionar la de trabajo. Los dispositivos detectores, incluyendo los dispositivos de acoplamiento de
carga y los de inyección de carga, con detectores dispuestos en un chip, brindan la posibilidad de combinar las ventajas que
ofrecen los sistemas secuenciales y los simultáneos. Estos tipos de dispositivos de detección se usan con los espectrómetros
más potentes, ofreciendo un análisis rápido y una amplia selección de bandas analíticas.
El ICP puede observarse en planos axiales o radiales (también llamados laterales). La antorcha se coloca por lo general en
posición horizontal en plasmas de observación axial y la muestra se observa desde el ápice; la antorcha se coloca en posición
vertical en plasmas de observación radial y la muestra se observa lateralmente. La observación axial del plasma puede ofrecer
relaciones señal ruido mayores (mejores límites de detección y precisión); no obstante, también incurre en mayores interferen-
cias espectrales y de matriz. Los métodos validados con un instrumento de configuración radial probablemente no serán cien
por ciento aplicables a un instrumento de configuración axial y viceversa.
También existen sistemas con ambas configuraciones de observación, lo que permite al analista aprovechar la configuración
de antorcha más ventajosa. La selección de la configuración de la antorcha optima dependerá de la matriz de la muestra, del
analito en cuestión, de la(s) longitud(es) de onda analítica seleccionada(s), del costo de la instrumentación, de la sensibilidad
requerida y de los instrumentos disponibles en cada laboratorio.
Independientemente de la configuración de la antorcha o de la tecnología del detector, la ICP-AES es una técnica que pro-
porciona una medición cuantitativa y/o cualitativa de la emisión óptica de átomos e iones excitados a longitudes de onda es-
pecíficas. Estas mediciones luego se utilizan para determinar la concentración del analito en la muestra en estudio. Un átomo o
ión atómico excitado emite un conjunto de diferentes frecuencias de luz características de la transición energética típica de ese
elemento. En general, la intensidad de la luz es proporcional a la concentración del analito. Es necesario realizar correcciones
por emisión de fondo proveniente del plasma. Las concentraciones de la muestra se determinan por lo general a partir de una
curva de trabajo de estándares conocidos sobre el intervalo de concentraciones similar al intervalo de interés. Sin embargo, es
posible realizar calibraciones de un único punto en determinadas circunstancias, como por ejemplo en el caso de las pruebas
de límite, si la metodología se ha validado en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisión,
tolerancia y robustez.
Debido a que las transiciones entre los niveles de energía atómica están bien definidas y a que los átomos en ICP están bas-
tante diluidos, las líneas de emisión tienen anchos de bandas estrechos. Sin embargo, dado que los espectros de emisión de la
ICP contienen muchas líneas y que las "alas" de estas líneas se superponen para producir un ruido de fondo casi continuo por
encima del ruido continuo que resulta de la recombinación de iones de argón con electrones, se requiere un espectrómetro de
alta resolución en la ICP-AES. La decisión respecto a qué línea espectral se va a medir debe incluir una evaluación de las poten-
ciales interferencias espectrales. En la muestra, todos los átomos se excitan simultáneamente; sin embargo la presencia de múl-
 458 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Físicos USP 37

tiples elementos en algunas muestras puede producir una superposición de espectros. Las interferencias espectrales también
pueden deberse a emisiones de fondo de la muestra o del plasma. Los ICP modernos generalmente cuentan con un dispositivo
que permite realizar las correcciones de ruido de fondo así como se pueden aplicar varias técnicas de corrección de ruido de
fondo. La corrección de ruido de fondo simple generalmente consiste en medir la intensidad de la emisión de fondo en algún
punto que no se encuentre cercano al pico principal y restar el valor obtenido de la señal total. Los modelos matemáticos para
restar la señal de la interferencia como corrección de ruido de fondo también pueden emplearse con ciertos tipos de espectró-
metros ICP-AES.
La selección de la línea espectral apropiada para el análisis es fundamental para un buen análisis por ICP-AES, independien-
temente de la configuración de antorcha o del tipo de detector que se utilice. Aunque por lo general se prefieran ciertas longi-
tudes de onda, la selección final debe hacerse en el contexto de la matriz de la muestra, el tipo de instrumento y la sensibilidad
requerida. El analista podría comenzar con las longitudes de onda recomendadas por el fabricante del instrumento y luego
seleccionar otras longitudes de onda alternativas según las recomendaciones del fabricante o en función de las tablas de longi-
tudes de onda publicadas.3, 4,s, 6 J En última instancia, se debe demostrar experimentalmente que la selección de longitudes de
onda para el análisis ofrece suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud y precisión en cada caso particular.
Se pueden optimizar la potencia, las velocidades de flujo del gas, la altura de la visualización y la posición de la antorcha a
fin de obtener la mejor señal. Sin embargo, se debe tener en cuenta que estas variables pueden influir en las interferencias
espectrales y de matriz.
En general, es recomendable utilizar la ICP en condiciones robustas, las cuales se pueden evaluar basándose en el par de
líneas Mgll/Mgl a (280,270 nm/285,213 nm). Si el cociente de las intensidades es mayor de 6,0 en una solución acuosa, la ICP
es robusta, y menos susceptible a interferencias de la matriz. Generalmente se busca un cociente de aproximadamente 10,0.
Tener en cuenta que el término condiciones robustas no guarda relación alguna con el término robustez aplicado a la validación
de métodos analíticos. No es obligatorio utilizar un instrumento con un cociente Mgll/Mgl mayor de 6,0, sin embargo, se su-
giere para optimizar los parámetros del instrumento en circunstancias diversas.
El análisis de los elementos del Grupo 1 puede considerarse una excepción a esta estrategia. Cuando se forman iones atómi-
cos a partir de elementos de este grupo, éstos asumen una configuración electrónica de gas noble, con la correspondiente alta
energía de excitación. Dado que el primer estado de excitación de estos iones es extremadamente alto, se excitan sólo unos
pocos, por lo que la intensidad de la emisión es baja. Esta situación puede mejorarse reduciendo la ionización fraccionada, lo
que puede lograrse ajustando a una potencia menor en combinación con ajustes en la altura de la visualización o el flujo del
gas nebulizador, o mediante el agregado de un agente supresor de la ionización a las muestras y estándares.
Cuando se utilizan disolventes orgánicos, a menudo es necesario usar más potencia, más flujo del gas intermedio e interno y
menos flujo del gas nebulizador que con soluciones acuosas, y reducir el flujo del gas nebulizador. Cuando se emplean disol-
ventes orgánicos, puede ser necesario inyectar pequeñas cantidades de oxígeno para que no se acumule carbón en la antor-
cha.

Calibración

La exactitud de la longitud de onda en ICP-AES debe determinarse de acuerdo con los procedimientos operativos aplicables
del fabricante. Debido a las diferencias inherentes entre los distintos tipos de instrumentos disponibles, no se puede establecer
un procedimiento de aptitud del sistema general. Deben efectuarse las rutinas de calibración recomendadas por el fabricante
de cada ICP-AES. Estas pruebas pudieran incluir, de manera no taxativa, la calibración de la longitud de onda para varios ele-
mentos con una solución de referencia, la calibración de la longitud de onda interna con mercurio (Hg) y el barrido espectral
para ubicar los picos. El analista debe verificar el sistema según las recomendaciones del fabricante.

Estandarización

El instrumento debe estandarizarse para la cuantificación al momento de utilizarlo. Sin embargo, dado que la ICP-AES es
una técnica considerada en general lineal en el intervalo de 6 a 8 órdenes de magnitud, no siempre es necesario demostrar
continuamente la linealidad con una curva estándar compuesta por varios estándares. Una vez que el método se ha desarrolla-
do y se emplea de forma rutinaria, el instrumento se puede calibrar con un blanco y un único estándar. Es apropiado emplear
la calibración de un único punto en las pruebas de límite de materiales de producción y productos finales si la metodología se
ha validado de forma rigurosa en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisión, tolerancia y
robustez. También es aceptable el empleo de estandarización de un único punto en análisis cualitativos ICP-AES en los que el
propósito del experimento es confirmar la presencia o ausencia de elementos sin el requisito de una cuantificación exacta.
Se deben valorar un blanco y soluciones estándares que abarquen el intervalo esperado de concentraciones de la muestra y
graficar la respuesta del detector en función de la concentración del analito, tal como en el caso en que la concentración de un
componente conocido se determina dentro de una tolerancia específica. Sin embargo, no siempre es posible emplear un es-

3 Payling R, Larkins P. Optical Emission Unes of the Elements. New York: Wiley; 2000.
4 Harrison GR. Massachusetts lnstitute af Technalagy Wavelength Tables [también conocida como MIT Wavelength Tables]. Cambridge, MA: MIT Press; 1969.
5 Winge RK, Fassel VA, Peterson VJ, Floyd MA. lnductively Caupled Plasma Atamic Emissian Spectroscopy: An Atlas af Spectrol lnfarmatian. New York: Elsevier; 1985.
6 Boumans PWJM. SpectrachimActaA. 1981;368:169.
7 Boumans PWJM. Une Caincidence Tables far lnductively Caupled Plasma Atamic Emissian Spectrametry. 2nd ed.; Oxford, UK: Pergamon; 1984.
USP 37 Pruebas Físicas/ (730) Espectroquímica de Plasma 459

tándar que abarque estas concentraciones cuando se realiza un análisis en el límite de detección o en su cercanía. En análisis
realizados para demostrar la ausencia o eliminación de elementos por debajo de un límite específico es aceptable prescindir de
un conjunto de estándares que abarquen todas las concentraciones. Es necesario elegir la cantidad y las concentraciones de las
soluciones estándar utilizadas según el propósito de la cuantificación, el analito en estudio, la sensibilidad deseada y la matriz
de la muestra. Se debe emplear el análisis de regresión de la gráfica del estándar para evaluar la linealidad de la respuesta del
detector y, a menudo, las monografías individuales pueden establecer criterios para el error residual de la línea de regresión. En
un escenario óptimo, se debe demostrar un coeficiente de correlación para la curva de trabajo no menor de 0,99 u otro valor
distinto si así se especifica en la monografía individual. Sin embargo, la naturaleza de la matriz de la muestra, el o los analitos,
la sensibilidad deseada y el tipo de instrumentación disponible pueden hacer que un coeficiente de correlación inferior a 0,99
sea aceptable. En estos casos se recomienda que el analista proceda con sumo cuidado y que utilice estándares de trabajo adi-
cionales.
A fin de demostrar la estabilidad de la estandarización inicial del sistema, se debe volver a determinar una solución de las
usadas para trazar la curva estándar inicial, a modo de estándar de verificación, a intervalos apropiados durante el análisis de
todo el conjunto de muestras. El estándar nuevamente analizado debe concordar con una aproximación de±10% con su valor
esperado, o según se especifique en la monografía individual, para el caso de análisis de un único elemento, con longitudes de
onda analíticas comprendidas entre 200 y 500 nm o con concentraciones de> 1 µg por ml. El estándar nuevamente analizado
debe concordar con una aproximación de ±20% con su valor teórico, o según se especifique en la monografía individual, para
el caso de análisis de varios elementos con longitudes de onda analíticas de <200 o >500 nm o con concentraciones de <1 µg
por ml. Si la monografía individual proporciona pautas diferentes para el nuevo análisis del estándar de verificación, rige lo
que especifica la monografía.

Procedimiento

Utilizar los parámetros del instrumento especificados en la monografía individual. Sin embargo, debido a las diferencias en
las configuraciones de los equipos, los parámetros recomendados por el fabricante pueden emplearse y modificarse según sea
necesario. Aunque una monografía especifique los parámetros a utilizar, se pueden utilizar otros parámetros operativos ade-
cuados y ajustar las condiciones de trabajo cuando sea necesario. Pero es necesario contar con datos de validación adecuados
que respalden la utilización de condiciones alternativas, y para fines oficiales, las condiciones especificadas en la monografía
tienen precedencia. La información obtenida de cada introducción de una única muestra se considera un único resultado. Éste
puede ser el promedio de lecturas secuenciales y repetidas de una única introducción de la solución de la muestra o del están-
dar apropiado. Las concentraciones de la muestra se calculan a partir de la curva de trabajo que se obtiene graficando la res-
puesta del detector en función de la concentración del analito en las soluciones estándar. Con frecuencia, el instrumento reali-
za este cálculo directamente.

ICP-MS

Cuando el plasma inductivamente acoplado emplea un sistema de detección de espectrometría de masas, la técnica se de-
nomina de plasma inductivamente acoplado y espectrometría de masas (ICP-MS, por sus siglas en inglés). En esta técnica, los
analitos se detectan directamente a sus masas atómicas. Como estas masas deben estar cargadas para que se puedan detectar
en la ICP-MS, el método depende de la capacidad de la fuente del plasma de atomizar e ionizar los componentes de la mues-
tra. Al igual que en la ICP-AES, se encuentra disponible una amplia variedad de sistemas ICP-MS.
Los sistemas más comunes son los de cuadrupolo. Los sistemas de ICP-MS de "tiempo de vuelo" cobran cada vez mayor
importancia. Si bien aún no se utilizan de forma generalizada, es muy probable que aumente su uso en el futuro. Adicional-
mente, también se encuentran disponibles instrumentos de alta resolución por sectores de campo.
La ICP-MS, cualquiera sea el diseño o la configuración del instrumento, proporciona una medida cuantitativa y cualitativa de
los componentes de la muestra. Los átomos del analito generan iones por efecto del plasma. Estos iones se extraen del plasma
que se encuentra a presión atmosférica a través de un cono de muestreo y se transfieren a una zona de baja presión, que nor-
malmente se mantiene a una presión cercana a 1 Torr. En este proceso de extracción, se forma un haz supersónico a partir de
los gases del plasma muestreados conteniendo los analitos que determina muchas de las propiedades de los iones resultantes
del analito. El cono de selección, ubicado detrás del cono de muestreo, "selecciona" los iones de haz supersónico a medida
que emergen del cono de muestreo. Detrás del cono de selección se encuentra una zona de baja presión, que normalmente se
mantiene cercana a un miliTorr. Finalmente, los iones seleccionados atraviesan el orificio de una tercera etapa e ingresan a una
zona que se mantiene cercana a un microTorr, donde encuentran la óptica para iones y pasan al espectrómetro de masas. Allí
los iones se separan según su relación masa-carga: (miz). El intervalo de masas de ICP-MS comprende hasta 240 unidades de
masa atómica (urna). Según la configuración del equipo, se pueden formar aductos de analito con diluyentes, argón o sus pro-
ductos de descomposición. También se forman óxidos e iones de analito de carga múltiple, los cuales pueden aumentar la
complejidad de los espectros de masa resultantes. La optimización de los parámetros operativos reduce las interferencias; estos
parámetros incluyen los flujos de gas (velocidades de flujo del gas central, intermedio y exterior), flujo de la solución de la
muestra, potencia de RF, voltaje del lente de extracción, etc.; o mediante la utilización de celdas de colisión o de reacción, u
operando con plasma frío, si estuviera disponible en el instrumento. Salvo que el laboratorio genere o analice isótopos que no
existen en la naturaleza, una lista de isótopos naturales proporcionará al analista isótopos aceptables para fines analíticos. Los
 460 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Fisicas USP 37

perfiles isotópicos también facilitan la identificación y confirmación de elementos. Además, existen tablas de interferencias co-
munes y de interferencias isobáricas poliatómicas con factores de corrección.
La ICP-MS generalmente ofrece límites de detección considerablemente más bajos (mejores) que la ICP-AES, en gran medi-
da gracias a que genera un ruido de fondo extremadamente bajo. Esta capacidad es una de las grandes ventajas de la ICP-MS
en la determinación de concentraciones muy bajas de un analito o cuando se requiere la eliminación de interferencias de la
matriz. En el último caso, algunas interferencias se pueden evitar simplemente con una dilución adicional de la solución de
muestra. En algunas aplicaciones, se pueden detectar analitos a concentraciones inferiores a ng por L (ppt) empleando la ICP-
MS. Como regla general, la ICP-MS como técnica requiere que las muestras contengan sustancialmente menos sólidos totales
disueltos que los que requiere la ICP-AES.
El éxito de un análisis ICP-MS depende de la selección correcta de la masa analítica, independientemente del diseño del
instrumento. Si bien algunas masas se consideran primariamente, dada su rica abundancia natural, a veces se utiliza una masa
alternativa para un elemento determinado a fin de evitar la superposición de espectros (interferencias isobáricas). La selección
Je la masa analítica siempre se debe realizar u1 función de la n ,atriz de la muestra, del tipo de instrumento y de las concentra-
ciones a medir. El analista podría comenzar con las masas recomendadas por el fabricante del instrumento en particular y lue-
go seleccionar otras masas alternativas según las recomendaciones del fabricante o en función de las tablas de isótopos natura-
les publicadas.8
La optimización de un método de ICP-MS depende de los parámetros del plasma y el medio de introducción de la muestra.
Estos instrumentos permiten regular la potencia, las velocidades de flujo del gas y la posición de la antorcha a fin de obtener la
señal más adecuada. Cuando se utilizan disolventes orgánicos, a menudo es necesario utilizar más potencia y menos flujo del
gas nebulizador que con soluciones acuosas. En algunos casos puede que sea necesario agregar pequeñas cantidades de oxí-
geno en el gas central o intermedio para que no se deposite carbón en la antorcha o en el orificio del cono de muestreo. Con
algunos disolventes orgánicos puede ser necesario usar conos de muestreo o de selección con punta de platino para disminuir
la degradación del cono.

Calibración

En las determinaciones por ICP-MS, la exactitud del espectro de masas debe estar de acuerdo con lo indicado en los proce-
dimientos operativos aplicables. Debido a las diferencias inherentes en los distintos tipos de instrumentos disponibles, no se ha
establecido un procedimiento de aptitud del sistema general. Se deben consultar las pruebas recomendadas por el fabricante
de cada instrumento de ICP-MS. Estas pruebas pueden incluir, de manera no taxativa, la puesta a punto con una o más masas
de referencia, el barrido espectral para ubicar los picos y la calibración de masas. El analista debe verificar el sistema según las
recomendaciones del fabricante del instrumento.

Estandarización

Se debe estandarizar el instrumento para la cuantificación al momento de su uso. Como la respuesta (señal en función de la
concentración) de la ICP-MS normalmente se considera lineal en el intervalo de 6 a 8 órdenes de magnitud, no siempre es
necesario demostrar continuamente la linealidad mediante una curva de trabajo. Una vez que el método se ha desarrollado y
se emplea de forma rutinaria, el instrumento se puede calibrar con un blanco y un único estándar. Es apropiado emplear la
calibración de un único punto en las pruebas de límite de materiales de producción y productos finales si la metodología se ha
validado de forma rigurosa en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisión, tolerancia y
robustez. Se deben valorar un blanco y soluciones estándares que abarquen el "intervalo esperado de concentraciones de la
muestra y graficar la respuesta del detector en función de la concentración del analito. La selección de la cantidad y concentra-
ción de las soluciones estándar utilizadas se realizará según el analito en estudio, las concentraciones esperadas y la matriz de
la muestra y quedan a criterio del analista. En un escenario óptimo, se debe demostrar un coeficiente de correlación para la
curva estándar de trabajo no menor de 0,99 u otro valor distinto si así se especifica en la monografía individual. Sin embargo,
la naturaleza de la matriz de la muestra, el analito, la sensibilidad deseada y el tipo de instrumentación disponible pueden ha-
cer que un coeficiente de correlación inferior a O, 99 sea aceptable. En estos casos se recomienda que el analista proceda con
sumo cuidado y que utilice estándares de trabajo adicionales.
A fin de demostrar la estabilidad del sistema desde la normalización inicial, se debe volver a determinar una solución de las
usadas para trazar la curva estándar inicial, a modo de estándar de verificación, a intervalos apropiados durante el análisis de
todo el conjunto de muestras. Se pueden establecer intervalos apropiados, como por ejemplo cada 5 ó 1 O muestras o según lo
considere satisfactorio el analista, teniendo en cuenta el tipo de análisis en cuestión. El estándar nuevamente analizado debe
concordar con una aproximación de ±1 0% con su valor esperado para el caso de análisis de un único elemento, con masas
analíticas exentas de interferencias o con concentraciones de> 1 ng por mL. El estándar nuevamente analizado debe concordar
con su valor esperado con una aproximación de ±20% para análisis de múltiples elementos o cuando las concentraciones son
de <1 ng por mL. Si la monografía individual proporciona pautas diferentes para el nuevo análisis del estándar de verificación,
rige lo que especifica la monografía.

8 Horl1ck G, Montaser A. Andlytical characteristics of ICPMS. En: Montaser A, Editor. lnductivefy Coupled Plasma Moss Spectrometry. New York: Wifey· VCH; 7998:5 76-
5l8
USP 37 Pruebas Físicas/ (730) Espectroquímica de Plasma 461

El método de estándar adicionado debe usarse en situaciones en que se esperan o sospechan interferencias de la matriz. Este
método implica agregar una concentración conocida del elemento analito a la solución de muestra a no menos de dos niveles
de concentración. La respuesta del instrumento se grafica en función de la concentración del elemento analito agregado y se
traza la recta de regresión lineal correspondiente a los datos. La concentración del analito en la muestra se obtiene multiplican-
do el valor absoluto del punto donde la recta corta el eje x por el factor de dilución que corresponda.

Procedimiento

Utilizar los procedimientos que se indican en la monografía individual para el modo de detección y los parámetros del ins-
trumento. Aunque una monografía especifique los parámetros a utilizar, se pueden utilizar otros parámetros operativos ade-
cuados y ajustar las condiciones de trabajo según sea necesario. Pero es necesario contar con datos de validación adecuado
que respalden la utilización de condiciones alternativas, y para fines oficiales, las condiciones especificadas en la monografía
tienen precedencia. Sin embargo, debido a las diferencias en las configur::icioncs de los equipos, e! analistJ puede comenzar
con los parámetros por defecto sugeridos por el fabricante y modificarlos según sea necesario. La información obtenida de
cada introducción de una única muestra se considera un único resultado. Éste puede ser el promedio de lecturas secuenciales y
repetidas de una única introducción de la solución de la muestra o del estándar apropiado. Las concentraciones de la muestra
se calculan a partir de la curva de trabajo que se obtiene graficando la respuesta del detector en función de la concentración
del analito en las soluciones estándar. Los instrumentos más modernos cuentan con dispositivos que realizan este cálculo.

GLOSARIO

ANTORCHA: Serie de tres tubos concéntricos, generalmente de cuarzo, donde se genera el plasma inductivamente acoplado.
CELDA DE COLISIÓN: Característica de diseño de algunos de los instrumentos de ICP-MS. Las celdas de colisión permiten redu-
cir las interferencias causadas por el argón o iones poliatómicos y facilitan el análisis de los elementos que podrían estar afecta-
dos por esas interferencias.
CELDA DE REACCIÓN: Es similar a la Celda de Colisión, pero funciona bajo un principio diferente. Está diseñada para reducir o
eliminar las interferencias espectrales.
CONO DE MUESTREO: Un cono de metal (generalmente con la punta de platino, aluminio o níquel) con una pequeña abertura a
través de la cual fluye la muestra ionizada una vez que emergió del plasma.
CONO DE SELECCIÓN: Un cono metálico con una abertura por donde fluye la muestra ionizada luego de pasar por el cono de
muestreo y antes de ingresar a la zona de alto vacío de ICP-MS.
ESTÁNDAR ADICIONADO: Método que se utiliza para determinar la concentración real del analito en la muestra cuando la viscosi-
dad o los efectos de la matriz puedan causar determinaciones erróneas.
ESTÁNDAR INTERNO: El elemento que se agrega o está presente en la misma concentración en los blancos, estándares y mues-
tras, y se usa como referencia de intensidad en el análisis. Es un requisito indispensable en los análisis cuantitativos por ICP-MS
y es recomendable para trabajar con ICP-AES.
GAS AUXILIAR: Ver Gas Intermedio (o Auxiliar).
GAS CENTRAL (o NEBULIZADOR): Uno de los tres flujos de argón en una antorcha ICP. El gas central se emplea para nebulizar la
solución de la muestra, formando una neblina de finísimas partículas, que luego pasa al tubo central de la antorcha para ingre-
sar al plasma.
GAS DE PLASMA: Ver Gas Externo (o Refrigerante o de Plasma).
GAS EXTERNO (o REFRIGERANTE o DE PLASMA): Fuente principal de suministro de gas para el plasma.
GAS INTERMEDIO (o AUXILIAR): Gas que se utiliza para "despegar" el plasma de la superficie de la antorcha, y así se impide que
el tubo intermedio se funda y se acumulen carbón y sales en el tubo interno.
GAS REFRIGERANTE: Ver Gas Externo (o Refrigerante o de Plasma).
IONES CON CARGA MÚLTIPLE: Átomos que se convierten en iones con carga doble o triple (X++, X+++, etc.) cuando se someten a
la alta temperatura de ionización de la ICP. Cuando se detectan por MS, la masa aparente de estos iones será 1/2 ó 1/3 de la
masa atómica.
m: La masa del ión en estudio.
NEBULIZADOR: El dispositivo que se utiliza para transformar la muestra en un aerosol homogéneo que se mezcla con el argón,
que posteriormente se envía a la ICP.
PLASMA FRÍO: Condiciones para el plasma empleado por ICP-MS que producen un plasma más frío que lo habitual en estos
análisis. Esta condición se obtiene mediante menos potencia y mayor velocidad de flujo del gas central, y se emplea para con-
tribuir en la reducción de interferencias isotópicas ocasionadas por el argón y algunos iones poliatómicos.
POTENCIA: El número de vatios necesario para encender el gas y mantener el plasma durante un análisis. Los requisitos de po-
tencia varían según la matriz de la muestra y cada analito.
SECUENCIAL: Una de las posibles configuraciones para la AES o MS en la que las líneas de emisión discretas o picos isotópicos
se observan mediante un barrido o salteo del intervalo espectral con un monocromador o por barrido del espectrómetro de
masas.
 •
462 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Físicas USP 37

SIMULTÁNEA: Una de las posibles configuraciones para la AES o MS en la que las líneas de emisión escogidas o picos isotópicos
se observan al mismo tiempo con un policromador o espectrómetro de masas simultáneo, con lo cual aumenta la velocidad
del análisis en un análisis de muestras con varios elementos.
OBSERVACIÓN AXIAL: Configuración del plasma en la técnica de AES en la que el plasma está orientado hacia el recorrido óptico
del espectrómetro, también conocida con el nombre de "observación desde el ápice".
OBSERVACIÓN LATERAL: Ver Observación Radial.
OBSERVACIÓN RADIAL: Configuración del plasma en la técnica de AES en la que el plasma se visualiza de forma ortogonal con
respecto al recorrido óptico del espectrómetro. También se denomina "observación de lado." Ver también Observación Lateral.

(731) PÉRDIDA POR SECADO

El procedimiento que se establece en este capítulo determina la cantidad de materia volátil de cualquier tipo que se elimina
en las condiciones especificadas. Para sustancias que parecen contener agua como único constituyente volátil, es apropiado
aplicar el procedimiento que se indica en el capítulo Determinación de Agua (921) y así se especifica en la monografía indivi-
dual.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, realizar la determinación en una muestra de prueba
de 1 a 2 g. Mezclar la sustancia a examinar y, si estuviera en forma de partículas grandes, reducir el tamaño de las partículas
aproximadamente a 2 mm, triturando rápidamente la muestra antes de pesarla. Tarar un frasco para pesada adecuado, de po-
ca profundidad, con tapón de vidrio que se haya secado durante aproximadamente 30 minutos bajo las mismas condiciones
que deben emplearse en la determinación y enfriado a temperatura ambiente en un desecador. Colocar la muestra a analizar
en el frasco, volver a colocar el tapón y pesar con exactitud el frasco y el contenido. Distribuir la muestra a analizar tan unifor-
memente como sea posible, agitando suavemente hacia los lados, hasta lograr una profundidad de aproximadamente 5 mm
por lo general, y no más de 1O mm en caso de materiales voluminosos. Colocar el frasco cargado en la cámara de secado,
retirando el tapón y dejándolo también en la cámara. Secar la muestra de prueba a la temperatura y durante el tiempo especi-
ficado en la monografía. [NOTA-La temperatura especificada en la monografía debe considerarse comprendida en el intervalo
de ±2º de la cifra especificada.] Cuando en una monografía se especifica "secar hasta peso constante", el secado deberá conti-
nuarse hasta que dos pesadas consecutivas no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada, realizando la segunda
pesada después de una hora adicional de secado. Al abrir la cámara, cerrar rápidamente el frasco, permitiendo que llegue a
temperatura ambiente en un desecador antes de pesarlo.
Si la sustancia se funde a una temperatura inferior a la que se especifica para la determinación de la Pérdida por Secado, man-
tener el frasco y su contenido durante 1 a 2 horas a una temperatura de 5º a 1Oº inferior a la temperatura de fusión y luego
secar a la temperatura especificada.
Si se van a analizar cápsulas, utilizar una porción del contenido mezclado de no menos de 4 cápsulas.
Si se van a analizar tabletas, utilizar el polvo de no menos de 4 tabletas.
En caso de que la monografía individual indique que la pérdida por secado debe determinarse mediante análisis termogravi-
métrico, utilizar una electrobalanza sensible.
En el caso de que la monografía individual indique secado al vacío sobre un desecador, utilizar un desecador al vacío, una
pistola de secado al vacío u otro aparato de secado al vacío adecuado.
En el caso de que se especifique secado en un desecador, debe tenerse especial cuidado para asegurarse de que el desecante
se mantenga siempre completamente eficaz mediante su recambio frecuente.
En caso de que la monografía individual indique secar en un frasco con tapón con perforación capilar 1 al vacío, utilizar un
frasco o tubo con un tapón con un capilar de 225 ± 25 µm de diámetro y mantener la cámara de calentamiento a una presión
de 5 mm de mercurio o menor. Al final del periodo de calentamiento, dejar entrar aire seco a la cámara de calentamiento,
retirar el frasco y con el tapón con perforación capilar todavía en su sitio, permitir que se enfríe a temperatura ambiente en un
desecador antes de pesar.

(733) PÉRDIDA POR INCINERACIÓN

Este procedimiento tiene como objeto determinar el porcentaje del material de prueba que se volatiliza y se elimina en las
condiciones especificadas. El procedimiento, tal como se aplica generalmente, no es destructivo para la sustancia que se anali-
za; sin embargo, la sustancia puede transformarse, por ejemplo, produciendo un anhídrido.

1 Disponible como "antibiotic moisture content flask" de Kimble-Kontes, 1022 Spruce St., Vineland, Nj 08362-1502.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 463

Realizar la prueba sobre material finamente pulverizado y deshacer los grumos, si fuera necesario, con ayuda de un mortero
antes de pesar la muestra. Pesar la muestra a analizar sin aplicar más tratamientos, a menos que se especifique un secado preli-
minar a una temperatura inferior u otro pretratamiento especial en la monografía individual. A menos que se especifique otro
equipo en la monografía individual, efectuar la incineración en una mufla o un horno adecuado que pueda mantener la tem-
peratura dentro de los 25º de variación con respecto a la temperatura requerida para la prueba, y emplear un crisol adecuado,
completo con su tapa, previamente incinerado durante 1 hora a la temperatura especificada para la prueba, enfriado en un
desecador y pesado con exactitud.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir al crisol tarado una cantidad pesada con
exactitud, en g, de la sustancia que se va a analizar, aproximadamente igual a la calculada por la fórmula:
10/L
en donde Les el límite (o el valor de la media de los límites) para la Pérdida por incineración, en porcentaje. Incinerar el crisol
destapado cargado y cubrir a la temperatura (±25º) y durante el periodo de tiempo indicado en la monografía individual. Inci-
nerar durante periodos sucesivos de 1 hora cuando se indique incineración hasta peso constante. Una vez completada cada
incineración, cubrir el crisol y dejar enfriar en un desecador hasta temperatura ambiente antes de pesar.

Agregar lo siguiente:

•(735) ESPECTOMETRÍA DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X

INTRODUCCIÓN
La espectrometría de fluorescencia de rayos X (XRF, por sus siglas en inglés) es un método instrumental basado en la medi-
ción de fotones de rayos X característicos originados por excitación de electrones de las capas internas atómicas mediante una
fuente primaria de rayos X. El método de XRF se puede usar para análisis cualitativos y cuantitativos de líquidos, polvos y mate-
riales sólidos. Los rayos X producidos por un tubo de rayos X incluyen líneas características que corresponden al material del
ánodo y un continuo conocido como radiación Bremsstrahlung. Se pueden usar ambos tipos de rayos X para excitar átomos e
inducir así los rayos X. El instrumental para XRF se puede dividir en dos categorías: Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de
Longitud de Onda (WDXRF, por sus siglas en inglés) y Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de Energía (EDXRF, por sus siglas en
inglés). El factor principal que distingue a estas tecnologías es el método usado para separar el espectro emitido por los áto-
mos en la muestra. La energía de los fotones de rayos X es característica para una transición electrónica dada en un átomo y es
de carácter cualitativo. La intensidad de la radiación emitida indica el número de átomos excitados en la muestra y constituye el
carácter cuantitativo del método.

CALIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS PARA XRF

Calificación de la Instalación

Ver el capítulo general USP Calificación de Instrumentos Analíticos (1058). ·

Calificación Operativa

El propósito de la calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) es verificar que el sistema opere dentro de las toleran-
cias esperadas usando muestras apropiadas con propiedades espectrales conocidas. La calificación operativa es una verificación
de los parámetros críticos de operación y debe realizarse después de llevar a cabo la instalación, reparaciones o mantenimien-
tos importantes que pudiera afectar el desempeño de los instrumentos. Es importante tomar en cuenta que todas las muestras
de calibración deben manejarse con guantes de algodón o nitrilo y deben almacenarse en envases plásticos sellados. Alternati-
vamente, pueden estar integradas en el instrumento.
Las pruebas y especificaciones de calificación operativa en las secciones siguientes representan únicamente ejemplos típicos
(ver las Tablas 7 y 3). Se pueden usar otras pruebas y estándares para establecer tolerancias para estos propósitos. El proveedor
del instrumento a menudo pone a disposición muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de calificación de la
instalación.
464 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Pruebas Físicos USP 37

Tabla 1. Especificaciones de Callficación Operativa para EDXRF

Prueba Procedimiento
Adquirir un espectro de energía de una muestra de cali-
Posición del pico bración de Al-Cu.
Calcular la resolución (ancho total a la mitad de su altu-
ra máxima) a la misma energía y a la misma velocidad
Resolución del detector de conteo usada para la calificación de la instalación.
Medir la velocidad de recuento en las líneas de Al y Cu
Velocidad de recuento Ka de la muestra de calibración de energía.
Criterios de
Aceptación
El espectro debe tener un conteo de al menos 3000 en
los máximos de los picos de Al Ka y Cu Ka. La energía
correspondiente a los picos de Al Ka y Cu Ka no debe
diferir en más de O, 1% de los valores tabulados.
El valor de resolución no debe cambiar en más de 10%
del valor determinado en la calificación de la instalación.
Cambia <l 0% con respecto a las mediciones iniciales en
la calificación de la instalación en cada pico.

Para propósitos de calibración de espectrómetros EDXRF se ha seleccionado una muestra de calibración de energía que con-
siste en un disco de aleación Al-Cu (EN AW-AICu6BiPb; Alloy (Aleación) 2011, ASTM B211 ). Esta aleación por lo general se
encuentra disponible, es resistente a la corrosión y provee intensidades adecuadas tanto para Al Ka como para Cu Ka. Estas
líneas características abarcan las energías típicas usadas para los análisis de XRF. Asimismo, se puede obtener información sufi-
ciente de los espectros registrados en este material para evaluar la resolución del detector. La Tabla 2 proporciona una especifi-
cación más completa sobre la composición de esta muestra de calibración.
Tabla 2. Especificación de la Concentración de los Elementos de la Aleación Al-Cu (el balance remanente es aluminio)
Límites de Concentración
Elemento (en % en peso)
Cu 5-6
Zn 0,3 máximo
Fe 0,7 máximo
Bi 0,2-0,6
Pb 0,2-0,6
Si 0,4 máximo

Cuando el intervalo de energía de las líneas analíticas para las que se usará el espectrórnetro incluya energías superiores a
50 keV, se deberá usar tungsteno metálico puro W (99,5% mínimo) en lugar de la aleación Al-Cu. Este metal es estable, está
fácilmente disponible y provee líneas características bien definidas a 8,40 keV (línea L) y 59,3 keV (línea K).
Tabla 3. Especificaciones de Calificación Operativa para WDXRF
Criterios de
Prueba Procedimiento Aceptación
El ángulo correspondiente al pico máximo no debe diferir en
Llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento del fabri- más de O, 1O grados 20 del ángulo medido en la calificación
Ángulo del pico cante. Repetir para cada cristal. de la instalación.
Ancho total a la mitad de su altura máxima a longitudes de
onda especificadas a las mismas condiciones de medición
que al momento de la calificación de la instalación. Repe-
Resolución del detector tir para cada detector disponible. No cambia más de 20%
Medir la velocidad de conteo en la muestra de monitoreo
específica a una longitud de onda especificada a las mis-
mas condiciones de medición que al momento de la cali-
ficación de la instalación. Repetir para cada detector dis- Cambia <l 0% con respecto a las mediciones iniciales en la
Velocidad de recuento ponible. calificación de la instalación

Usar lnconel 625 (Special Metals Corporation, New Hartford, NY) como una muestra para espectrómetros de WDXRF. Otras
designaciones para esta aleación son UNS N06625, DIN 2.4856, ASTM B443, ASME SB-443 y AMS 5599. Se trata de una alea-
ción basada en níquel que incluye cromo, molibdeno y niobio como los elementos más importantes de la aleación. La Tabla 4
proporciona una especificación más completa sobre la composición.
Tabla 4. Concentraciones Elementales del lnconel 625
Límites de Concentración
Elemento (en % en Peso)
Ni 58,0 mínimo
Cr 20,0-23,0
Fe 5,0 máximo
Mo 8,0-10,0
Nbª 3,15-4,15
ª Éste puede incluir Ta.
USP 37 Pruebas Físicas/ \735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 465

Una pieza pulida de lnconel 625 jamás debería requerir trabajo de superficie siempre que se almacene y use apropiadamen-
te.
Todos los detectores usados en la WDXRF secuencial, sin importar si se trata de detectores de flujo proporcional, de gas se-
llado o de centelleo, pueden detectar las características de radiación del níquel. En combinación con la radiación Mo K (y L),
las pruebas relacionadas con la posición del pico y la respuesta del detector de los espectrómetros de WDXRF pueden comple-
tarse fácilmente. La Tabla 5 incluye las longitudes de onda o energías típicas que se usan en el análisis de XRF.
~--------~_ _ _T_a_b_l_a_S_._En_e_r-Tg~ía_s~y_ Longitudes de On_«!élª para Al, Ni, Cu, Mo y W
Al Ni Cu Mo w
Transición de la línea Ka, K-L,, K-L,, K-L,
Energía de Ku (e V) 1487 7473 8041 17479 59310

=±
Longitud de onda de Ka 1
(Á) --- ___1_,6_5_9_ _ _ --+-______1_,5_4_2____ ~ _____ __(),70"1__ __ ---·-+------º~'2_0_9_ __,
8,340
-----+-
·:=~~_;~~:___ __ +--~_2_2_9_3,_2
Transición de la línea Lu, N/Ab N/A N/A L -M L,-M,
+---En_e~rg~í_a_d_e_La~c1~(~eV~)____~_ _ _N_/A_ _ _ -+----- _N_/A_______ _ _ _,_______ 83_9_8~,2_ _ -j

Longitud de onda de La 1 1 1

~ ~ ~ ~ ~~ 1,47632
ª Obtenido de: Deslattes RD, Kessler EG, lndelicato P, et al. X-ray transition energies: new approach to a comprehensive evaluation. (Energías de transición de
rayos X: nuevo enfoque para una evaluación integral) Rev Mod Phys. 2003;75(1 ):35-99. Para Al, Ni y Cu, las energías Ka 1 y Ka 2 de la Tabla V se promediaron
con la ponderación 2:1. La conversión de longitud de onda usa el valor he/E de la página 94. Los valores para Mo y W se toman de la Tabla VI.
b N/A =no aplica.

Calificación del Desempeño

El propósito de la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todas las mediciones críticas que impacten en la calidad.
Dependiendo del uso típico, las especificaciones para la calificación de desempeño pueden ser diferentes de las especifica-
ciones del fabricante. Se pueden usar pruebas de calificación de desempeño específicas para cada método, también conocidas
como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificación de desempeño para métodos validados.
Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño de la XRF de-
penden del instrumento y de la aplicación que se va a usar. La demostración de un desempeño estable del instrumento duran-
te periodos prolongados provee cierta garantía de que pueden obtenerse mediciones confiables a partir de los espectros de
muestra, usando experimentos de XRF previamente validados.

PROCEDIMIENTO

Recomendaciones Generales

Los analistas deben verificar la aptitud de todos los reactivos y materiales con respecto a la posibilidad de contaminación
antes de usarlos dependiendo del método usado. El análisis de un elemento ubicuo a menudo requiere el uso del grado más
puro de reactivo o material disponible. Los portamuestras y las ventanas de soporte deben ser apropiadas para el análisis y la
configuración del instrumento. Los analistas deben evaluar la limpieza del equipo usado para preparar muestras para análisis
de XRF a fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras.

MUESTRAS

Líquidos
Las muestras líquidas pueden introducirse directamente en el espectrómetro XRF siempre y cuando la solución conste de
una sola fase y su volatilidad sea suficientemente baja. El análisis de muestras líquidas requiere el uso de un portamuestras es-
pecial para líquidos y de una ventana de soporte disponible comercialmente compuesta por una película de polímero adecua-
do. Alternativamente, las muestras líquidas pueden transferirse a la superficie de un disco y secarse antes de su análisis. Por lo
general, el experimento se lleva a cabo usando un gas para purga. Se pueden agregar cantidades conocidas de estándares en
solución directamente a la muestra líquida en concentraciones apropiadas para facilitar la exactitud, la precisión y las pruebas
de especificidad según se requiera para la validación del método.
Polvos
Los polvos preparados pueden medirse directamente en un portamuestras para líquidos. Alternativamente, se pueden com-
primir en forma de pellets. Si el polvo tiene propiedades autoaglutinantes deficientes, puede ser necesario un aglutinante tal
como una cera o etilcelulosa.
Asimismo, los polvos pueden prepararse para análisis de XRF fundiendo el material de muestra en un vidrio usando un fun-
dente, por lo general tetraborato de sodio, tetraborato de litio y metaborato de litio. Debido a que las temperaturas requeridas
466 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Pruebas Físicas USP 37

para fundir el fundente y disolver la muestra son relativamente elevadas (800º-1300º), este procedimiento no es adecuado
para el análisis de elementos volátiles tales como mercurio y arsénico.
Las muestras de polvos se pueden mezclar con cantidades apropiadas de un material estándar de referencia certificado para
mejorar la exactitud, la precisión y las pruebas de especificidad según se requiera para la validación del método. Alternativa-
mente, se pueden agregar cantidades conocidas apropiadas de estándares en solución a las muestras en polvo y posteriormen-
te secarlas, molerlas si fuera necesario y mezclarlas minuciosamente antes del análisis. Las adiciones de estándares se pueden
usar en los casos en que las propiedades físicas o químicas del polvo pueden introducir un sesgo en la respuesta del analito.

Estándares
Se pueden usar materiales de referencia apropiados que sean rastreables al National lnstitute of Standards and Technology
(Instituto Nacional de Normas y Tecnología)) o equivalentes en la preparación de estándares de XRF.

Análisis
Para los parámetros instrumentales (si fuera aplicable) seguir el procedimiento de la monografía individual. Debido a las dife-
rencias entre fabricantes con respecto a las configuraciones de los equipos, los analistas pueden usar las condiciones predeter-
minadas sugeridas por el fabricante. Al momento de su uso, el instrumento debe estandarizarse para el uso pretendido. Los
analistas deben usar estándares de calibración que abarquen el intervalo esperado de concentraciones típicas de analito. Al lle-
var a cabo un análisis en o cerca del límite de detección, los analistas no siempre pueden usar un estándar que abarque todo el
intervalo, lo cual es aceptable para prueba de límites. Los analistas deberían usar análisis de regresión de la gráfica estándar
para evaluar la linealidad de la respuesta del detector, mientras que las monografías individuales pueden establecer criterios
para el error residual de la línea de regresión.
Para demostrar la estabilidad de la estandarización inicial del sistema, los analistas deben volver a valorar el estándar de cali-
bración usado en la curva estándar inicial como estándar de verificación a intervalos apropiados durante el análisis de la totali-
dad de un conjunto de muestras. También resulta aceptable el uso de un estándar preparado de manera independiente. A
menos que se indique de otro modo en la monografía individual, el estándar revalorado debe coincidir con su valor esperado
con una aproximación de ±2% para la Valoración o de ±20% para un análisis de impurezas.
Las concentraciones de muestra se calculan en función de la curva de trabajo que se genera al graficar la respuesta del ins-
trumento en función de la concentración del analito en las soluciones estándar.

VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN

Las normativas de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes [Título 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de
los métodos analíticos descritos en la USP-NF no están obligados a validar la exactitud y confiabilidad de dichos métodos, sino
que deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. En este contexto, y de acuerdo con dichas normativas, se requiere
de validación cuando se usa un procedimiento de XRF para analizar un artículo no oficial y cuando dicho procedimiento se usa
como una alternativa al procedimiento oficial para analizar un artículo oficial (ver las Advertencias Generales 6.30 de la USP:...NF).
Por otra parte, la verificación se debe realizar la primera vez que se analiza un artículo oficial usando un procedimiento USP
(para fines informativos únicamente, referirse al capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeícos (1226)).

Validación
El objetivo de la validación de un método de XRF es demostrar que el procedimiento de medición sea adecuado para su
propósito esperado, incluyendo la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o forma farmacéutica
(valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o límites de prueba (Categoría 11) y las pruebas de
identificación (Categoría IV). Dependiendo de la categoría de la prueba (ver la Tabla 2 en el capítulo Validación de Procedimien-
tos Farmacopeícos (1225)), el proceso de validación del método analítico para XRF requiere el análisis de linealidad, intervalo,
exactitud, especificidad, precisión, límite de cuantificación y robustez.
Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un método de XRF son similares a las requeridas para cual-
quier procedimiento analítico. El capítulo (1225) trata los principios generales aplicables. Los criterios de aceptación específicos
para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso pretendido del método. Las muestras para validación
deben ser independientes del conjunto de calibración.

EXACTITUD

Para valoraciones de Categoría 1o pruebas de Categoría 11, los analistas pueden determinar la exactitud realizando estudios
de recuperación mediante el uso de la matriz apropiada que tenga concentraciones conocidas agregadas de elementos. Asi-
mismo, se puede usar un material estándar certificado apropiado provisto por la USP. Además, se considera una práctica acep-
table comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el método XRF que se está validando con aquéllos obtenidos
 USP 37 Pruebas Físicas/ (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 467

de un método analítico establecido. Cuando los analistas usan el método de estándar agregado, las evaluaciones de exactitud
se basan en la concentración calculada a partir de la intersección de la curva, con el eje de concentración a ordenada cero, no
en la recuperación calculada a partir de las adiciones de estándares individuales.
Criterios de aceptación: Recuperación de 98,0%-102,0% para valoración de fármacos y formas farmacéuticas, recupera-
ción del 70,0%-150,0% para análisis de impurezas. Estos criterios de aceptación deben cumplirse en todo el intervalo valida-
do.

PRECISIÓN

Repetibilidad
Los analistas deben evaluar el método analítico midiendo las concentraciones de seis estándares distintos al 100% de la con-
centración de prueba de la valoración. Alternativamente, los analistas pueden medir las concentraciones de tres determinacio-
nes repetidas de tres muestras distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente
cercanas de modo que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentración. En este caso, se combina la repeti-
bilidad a las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptación.
Criterios de aceptación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de fármacos, no más de
2,0% para la valoración de formas farmacéuticas y no más de 20,0% para el análisis de impurezas.
Precisión intermedia
Los analistas deben establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisión analítica del método. Las variables típicas
incluyen realizar el análisis en días distintos, usando diferentes instrumentos, o que dos o más analistas realicen el método.
Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para totalizar seis experimentos proveerá una estima-
ción de la precisión intermedia.
Criterios de aceptación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de fármacos, no más de
3,0% para la valoración de formas farmacéuticas y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

El procedimiento debe poder determinar de manera inequívoca cada analito elemental en presencia de otros componentes
que se esperan encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz.
Criterios de aceptación: Se demuestra cumpliendo el requisito de Exactitud.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de
6 mediciones repetidas de un blanco y multiplicando por 1O. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver (1225)). Para con-
firmar la exactitud, se debe realizar una medición de una muestra de prueba preparada a partir de una matriz de muestra re-
presentativa y a la que se le agregan cantidades conocidas de tal manera que la concentración sea similar a la concentración
de límite de cuantificación.
Criterios de aceptación: El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar de manera precisa y exacta al analito
en un nivel equivalente al 50% de la especificación.

LINEALIDAD

Los analistas deben demostrar una relación lineal entre la concentración del analito y la respuesta de XRF corregida prepa-
rando no menos de cinco estándares a concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la muestra de prueba.
Posteriormente, la curva estándar debe evaluarse usando métodos estadísticos apropiados tales como la regresión de cuadra-
dos mínimos. Se deben determinar el coeficiente de correlación (R), la ordenada al origen y la pendiente de la línea de regre-
sión.
Para experimentos que no tienen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta de XRF, se deben aplicar
métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica.
Criterios de aceptación: Res no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1y no menos de 0,99 para pruebas
cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El intervalo se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (inclu-
yendo concentraciones superior e inferior) para el que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecua-
do de precisión, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad y exactitud.
Criterios de aceptación: Para criterios de aceptación centrados en 100,0%: 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación
no centrados: 10% por debajo del límite inferior de la especificación hasta 10% por encima del límite superior de la especifica-
468 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X/ Pruebas Físicas USP 37

ción. Para uniformidad de contenido: 70,0-130,0%. Para la Categoría 11 los requisitos del intervalo son 50,0%-120,0% de los
criterios de aceptación.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medición analítica se debe demostrar realizando cambios deliberados a los parámetros experimenta-
les. Para la XRF esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas.
Criterios de aceptación: La medición de la respuesta de un estándar o de una muestra después de un cambio en los pa-
rámetros experimentales no debe diferir de la medida obtenida con el mismo estándar usando parámetros establecidos en más
de ±2,0% para una valoración de una forma farmacéutica y no más de ±20,0% para un análisis de impurezas.

Verificación

El objetivo de una verificación de un método XRF es demostrar que el procedimiento descrito en la monografía específica, se
está llevando a cabo con una exactitud, sensibilidad y precisión adecuadas. De acuerdo con el capítulo (1226), si no se consi-
gue verificar el procedimiento farmacopeico de acuerdo con la monografía, el procedimiento puede no ser adecuado para su
uso con el artículo en análisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido
en las Advertencias Generales 6.30 de la USP-NF.
Aunque no se requiere la revalidación completa de un método de XRF farmacopeico, la verificación de métodos de XRF far-
macopeicos debe incluir por lo menos la eíecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión y
límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se indica en la sección Validación (anterior).
•USP37

<736) ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Un espectrómetro de masas genera iones a partir de la sustancia en análisis, los separa en función de su relación masa/carga
(m/z) y registra la abundancia relativa de cada especie iónica presente. El instrumento consta de tres componentes principales
(ver Figura 7):

Sistema de Introducción
de Muestra Fuente de Iones t----~

Analizador

,-------- Detector
'
1

'
Computadora

Fig. 1. Componentes principales de un espectrómetro de masas.

una fuente de iones para producir iones gaseosos a partir de la sustancia en estudio, un analizador para resolver los iones en
función de sus masas características según la razón entre sus masas y sus cargas, y un sistema de detección para detectar los
iones y registrar la abundancia relativa de cada una de las especies iónicas resueltas. Además, se necesita un sistema de intro-
ducción de muestras que permita el ingreso de las mismas al generador de iones, mientras se mantienen las exigencias de alto
vacío (-10- 6 a 10--8 mm de mercurio) que la técnica requiere, y se necesita una computadora para controlar el instrumento,
obtener y manipular los datos y comparar los espectros con bibliotecas de referencia.
Este capítulo brinda una perspectiva general de la teoría, construcción y uso de los espectrómetros de masas. La discusión se
limita a aquellos instrumentos y medidas con aplicación real o potencial a los requisitos farmacopeicos y otros requisitos farma-
céuticos: generalmente, la identificación y cuantificación de compuestos específicos.

INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA

Las muestras se pueden introducir en estado gaseoso en una cámara de ionización, o por expulsión de especies moleculares
cargadas desde la superficie de un sólido o desde una solución. En algunos casos, la introducción de la muestra y la ionización
tienen lugar en un único proceso, lo que hace que la diferenciación entre ellas sea un tanto artificial.
USP 37 Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 469

Las sustancias que están en estado gaseoso o líquido a temperatura ambiente y a presión atmosférica, pueden introducirse
en la cámara de ionización como un haz neutro mediante un sistema de paso controlable. Los compuestos volatilizables disuel-
tos en líquidos o adsorbidos en sólidos pueden extraerse y concentrarse con un analizador de vapor confinado en el espacio
superior (headspace). Los vapores se arrastran desde la matriz sólida o líquida con una corriente de gas transportador y se re-
tienen en una columna de adsorción. Los vapores atrapados se desorben luego mediante calentamiento programado de la
trampa y se introducen en el espectrómetro de masas mediante una conexión capilar.
Para sólidos volatilizables, el método de introducción de muestra más frecuente es la sonda de inserción directa. En esta téc-
nica, la muestra se coloca en un crisol pequeño que se encuentra en el extremo de una sonda, y se calienta a alto vacío muy
cerca de la fuente de iones. En una variante de esta técnica, las muestras se desorben desde un alambre dentro de la cámara
de ionización mediante un calentamiento rápido, o con la ayuda de un rayo láser. Las técnicas de desorción, combinadas con
la ionización por electrones, química o de campo, son las preferidas para el análisis de muestras sensibles al calor o poco voláti-
les.
Las técnicas de introducción de muestras que implican la expulsión de moléculas cargadas desde la superficie de muestras
sólidas incluyen el método de desorción por campo y diversas técnicas de desprendimiento por bombardeo (sputtering), en
las que las muestras se bombardean con fotones de alta energía, con un haz de iones primarios o con un haz de partículas
neutras. De manera similar, los iones pueden expulsarse desde soluciones mediante el bombardeo con un haz de iones prima-
rios o por una de las diversas técnicas de rociado descritas a continuación.
Los cromatógrafos de gases y líquidos son ampliamente usados como dispositivos para la introducción de muestras en los
espectrómetros de masas. Dichos cromatógrafos proporcionan una purificación inicial de la muestra, dado que sólo se necesita
introducir en el espectrómetro de masas la porción del efluente cromatográfico que contiene el compuesto de interés. Las
combinaciones cromatografia de gases/espectrometría de masas (GC/MS) y cromatografía de líquidos/espectrometría de ma-
sas (LC/MS) son valiosas herramientas para la identificación de impurezas desconocidas en fármacos. Estos métodos combina-
dos tienen la capacidad de separar mezclas complejas con la posibilidad de obtener información estructural acerca de los com-
ponentes individuales.

Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas

Los efluentes de los cromatógrafos de gases se encuentran en estado de vapor y pueden introducirse directamente en el
espectrómetro de masas. Inicialmente, se usaban dispositivos para separar los gases de transporte y de ese modo superar la
diferencia de varios órdenes de magnitud entre las presiones operativas de ambos sistemas. Sin embargo, con el advenimiento
de las columnas capilares para cromatografía de gases y las bombas de vacío de alta capacidad para espectrómetros de masas,
los efluentes cromatográficos de gases ahora se introducen directamente en la cámara de ionización.

Cromatografía de Líquidos/Espectrometría de Masas

Esta técnica resulta particularmente útil para analizar materiales que no pueden analizarse mediante GC/MS debido a inesta-
bilidad térmica, elevada polaridad o elevado peso molecular. Los compuestos de interés biológico, como por ejemplo los fár-
macos y sus metabolitos, las sustancias endógenas polares y las macromoléculas -incluidos péptidos, proteínas, ácidos nuclei-
cos y oligosacáridos- con frecuencia se pueden clasificar en una de estas categorías.
Las interfases LC/MS disponibles actualmente abarcan una variedad de enfoques para separar el compuesto de interés de la
fase móvil de la cromatografía de líquidos y transformarlo en una especie ionizada apta para la espectrometría de masas. Entre
éstos se incluyen dispositivos de transporte como por ejemplo el haz de partículas, diversas técnicas de rociado incluido el ter-
mospray, el electrospray y el rociado iónico, así como la desorción inducida por partículas como por ejemplo el bombardeo
con atómos acelerados de flujo continuo (CF-FAB, por sus siglas del inglés, continuous-flow fast atomic bombardment).

INTERFASE DE HAZ DE PARTÍCULAS

El disolvente se elimina de un aerosol del efluente cromatográfico de líquidos y las moléculas del analito neutro se introdu-
cen en la fuente de iones del espectrómetro de masas, donde se ionizan mediante ionización por electrones (El, del inglés Elec-
tronic lonization) o ionización química (CI, del inglés Chemical lonization). Los espectros resultantes son por lo tanto espectros
clásicos de El o CI y el primero brinda una gran información estructural. Existen limitaciones con respecto a la polaridad, labili-
dad térmica y peso molecular, por lo que esta técnica es más apropiada para pequeñas moléculas orgánicas con pesos molecu-
lares de menos de 1 000 daltones.

TERMOSPRAY

El compuesto de interés disuelto en una fase móvil con amortiguadores del pH volátiles, como por ejemplo, el acetato de
amonio, se hace pasar a través de una tubería de calibre estrecho caliente directamente en la fuente de iones de un espectró-
metro de masas. La solución se vaporiza en la tubería y los iones del analito se desorben e incorporan a la fase gaseosa y luego
se introducen en el analizador de masas. Las moléculas de analito neutro de la fase gaseosa pueden sufrir una ionización quí-
470 (736) Espectrometría de Masas/ Pruebas Físicas USP 37

mica al reaccionar con los iones del amortiguador de pH en fase gaseosa, como por ejemplo NH 4 +. El termospray es compati-
ble con velocidades de flujo relativamente elevadas de 1 a 2 mL por minuto, con disolventes que contienen un alto porcentaje
de agua y con muchos tipos de analitos polares. Es posible que ocurra degradación térmica, ya que los analitos están expues-
tos a temperaturas relativamente altas durante el proceso de volatilización.

ELECTROSPRAY

La fase móvil se rocía a través de una pequeña abertura (la punta de una aguja) que se mantiene a un potencial de varios
kilovoltios. Las gotitas cargadas así producidas se desolvatan mediante el pasaje a través de un gas seco y los iones resultantes
se inyectan directamente a alto vacío en el analizador a través de un orificio o capilar de vidrio. El electrospray clásico se limita
a velocidades de flujo de 1 a 5 µL por minuto y por lo tanto es compatible con las técnicas de HPLC en columnas de calibre
pequeño (microbore) y con las técnicas de derivatización en post-columna.
Los iones pueden adquirir múltiples cargas, de modo que el valor m/z de las sustancias de alto peso molecular entrará en el
intervalo útil de la mayoría de los analizadores de masas cuadrupolares o de sector magnético (m/z < 4000). Analitos con peso
molecular de hasta 150 000 daltones pueden analizarse con éxito de esta manera.

ROCIADO IÓNICO

Es una variante del electrospray donde se usa la nebulización con un flujo de gas para ayudar a la formación de microgotas
de fase móvil. La técnica puede extender el límite superior de las velocidades de flujo utilizables a O, 1 mL por minuto. Con
ambas técnicas deben usarse amortiguadores del pH volátiles.

TÉCNICAS DE DESORCIÓN

La cromatografía de líquidos por microflujo puede también acoplarse con técnicas de deserción inducida por partículas co-
mo por ejemplo el bombardeo con atómos acelerados (FAB, del inglés fast atomic bombardment) y la espectrometría de ma-
sas de iones secundarios de líquidos (LSIMS del inglés liquid secondary ion mass spectrometry), descritas en la siguiente sec-
ción sobre técnicas de ionización. Normalmente, el efluente de una columna, que fluye a una velocidad de 1 a 1O µL por mi-
nuto, se mezcla con un pequeño porcentaje de líquido no volátil como por ejemplo glicerol. La mezcla se introduce mediante
una entrada capilar en un objetivo dentro de la fuente de iones, donde se bombardea con átomos o iones de alta energía (5 a
20 keV). Los espectros resultantes son similares a los espectros de FAB o LSIMS, pero con el fondo de la matriz de muestra
reducido en gran medida. Frit-FAB es una variante de FAB en flujo continuo, donde la muestra se introduce a través de un foco
de material sinterizado.

TÉCNICAS DE IONIZACIÓN

Impacto de Electrones

Las moléculas de la muestra en análisis entran en la cámara de ionización en estado de vapor. Se producen iones positivos
mediante el impacto con un haz de electrones procedente de filamentos de tungsteno o renio sobre el vapor, que se mantiene
a una presión de 10-4 a 10-6 mm de mercurio. Siempre que la energía del haz de electrones sea mayor que el potencial de
ionización de la sustancia, la muestra se ioniza y/o fragmenta, según se indica-mediante la siguiente ecuación:
e- + M ~ M+ · + 2e-

Ionización Química (CI)

En este proceso, un reactivo gaseoso a una presión entre O, 1 a 1O mm de mercurio ingresa en la cámara y se ioniza por un
haz de electrones o una descarga de alta energía. A estas presiones, ocurren reacciones entre iones y moléculas y los iones
primarios del gas reactivo reaccionan aún más. Los reactivos gaseosos más comúnmente usados son metano, isobutano y
amoníaco. Las reacciones típicas para el metano se muestran en las siguientes ecuaciones:
CH 4 + e- ~ CH 4+ · + 2e-

CH4 + + CH 4 ~ CH 5+ + CH 3 •

CH 3+ + CH 4 ~ C2 H5 + + H2

La especie CH 5 + es un ácido fuerte de Bronsted y transfiere fácilmente un protón a la mayoría de los compuestos orgánicos
CH 5 + + M ~ MH+ + CH 4
USP 37 Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 471

En el caso del metano, el ion protonado (MH)+ formado inicialmente puede ser lo suficientemente energético para disociarse
posteriormente.

Bombardeo con Atómos Acelerados (FAB)

La muestra se ioniza por el bombardeo con un haz de átomos de xenón de alta velocidad producido por el intercambio con
iones de xenón altamente acelerados en una celda de colisión. El proceso se resume del siguiente modo:

Xe ~ Xe+ +e
x~+ +Xe ~ x~+xe+,
donde las flechas en subíndice señalan las partículas en movimiento rápido.
FAB es una técnica de dnál1~is de superficie y se debe tener cuidado durante la preparación de la muestra para optimizar el
estado de la superficie. Cuando la muestra se deposita sobre una sonda por evaporación de una solución, el haz de iones que
se obtiene de la muestra es a menudo transitorio. Los aductos moleculares con metales alcalinos, como por ejemplo (M + Na)
y (M + K), favorecen la formación de iones. Este fenómeno se usa para favorecer la ionización de moléculas biológicas. Así, el
tratamiento de la superficie de la muestra con cloruro de sodio puede mejorar el rendimiento de aductos iónicos. El calenta-
miento de la muestra durante el análisis puede también incrementar el rendimiento iónico.
El rendimiento decreciente de los iones de muestra obtenidos durante el análisis se debe probablemente a la destrucción de
la superficie de la muestra. En efecto, la superficie puede remplazarse continuamente disolviendo la muestra en un líquido no
volátil adecuado y recubriendo la parte superior de la sonda con la mezcla. Mediante el uso de este método, la vida de las
muestras en la fuente se ha extendido a más de 1 hora y se ha expandido la variedad de compuestos que pueden someterse al
análisis por FAB. La larga duración de las muestras y las mayores sensibilidades así logradas hacen del FAB una técnica espectral
de masas importante para el análisis bioquímico, ya que proporciona la fórmula elemental de la muestra mediante la determi-
nación de la masa exacta. Otra ventaja de FAB, a diferencia de CI, es la presencia de iones fragmentados dentro de los espec-
tros, lo que ayuda en la elucidación estructural.
Recientemente, el bombardeo con átomos neutros ha sido reemplazado por el bombardeo con iones de cesio. Aunque a
esta técnica se la conoce todavía como FAB, la describe más correctamente la denominación de espectrometría de masas de
iones secundarios de líquidos (LSIMS).
En los diversos procesos de ionización descritos anteriormente se forman iones negativos y positivos, y ambos son fácilmente
analizables con los espectrómetros de masas modernos. Las muestras con alta capacidad de captura electrónica, particular-
mente aquéllas que contienen átomos de halógenos, producen abundantes iones negativos. Por esta razón, a menudo se pre-
paran derivados halogenados de los compuestos objeto de estudio. La espectrometría de masas de iones negativos se ha apli-
cado con éxito en el análisis de residuos de plaguicidas, dado que las estructuras de dichos compuestos se adecuan bien a esta
técnica.

ANALIZADORES

Los analizadores de masas separan las especies cargadas en la muestra ionizada según sus razones m/z y de ese modo permi-
ten determinar la masa y abundancia de cada especie. Los cuatro analizadores más frecuentes son el analizador de sector mag-
nético, el cuadrupolo, el de tiempo de vuelo y el analizador por la transformada de Fourier.

Analizadores de Sector Magnético

Los iones generados en la fuente de iones se coliman en un haz mediante la acción focalizadora de un campo magnético y
un montaje de ranuras o rendijas. Después de abandonar la fuente, los iones quedan sujetos a un campo magnético perpendi-
cular a la dirección del haz. Cada ion experimenta una fuerza en ángulos rectos tanto en su dirección de desplazamiento como
en la dirección del campo magnético y así desvían el haz. El movimiento de cada ion se describe por
miz= H2 r2 /2V
donde m es la masa en unidades de masa atómica, z es el número de cargas electrónicas, H es la fuerza del campo magnético
en gauss, res el radio de la trayectoria del ion en centímetros y V es el voltaje de aceleración. Se realiza un barrido del espectro
de masas variando la fuerza del campo magnético y detectando aquellos iones que pasan a través de una ranura de salida a
medida que se "enfocan." El espectrómetro de masas de sector magnético permite una resolución espacial de los iones y ge-
neran una trayectoria única para cada valor de m/z a una fuerza de campo dada.
472 (736) Espectrometría de Masas/ Pruebas Físicas USP 37

Analizadores Cuadrupolares

El instrumento se basa en cuatro varillas paralelas dispuestas en los vértices de un cuadrado. El haz de iones se enfoca a lo
largo del eje de esa distribución y se aplica un potencial eléctrico de componentes fijos (DC) y de radiofrecuencia (RF) a las
varillas opuestas diagonalmente. Para una combinación dada de componentes DC y RF, los iones con una razón m/z específica
tienen una trayectoria estable a lo largo del eje. Todos los demás se desvían hacia las paredes y se pierden. El barrido de masas
se consigue cambiando los componentes DC y RF del voltaje y manteniendo una relación fija. El analizador cuadrupolar es un
filtro de masas ya que separa los iones en función de su razón m/z.

Analizador de Trampa de Iones

Este dispositivo de tipo cuadrupolar se compone de un electrodo en anillo ubicado entre dos electrodos terminales. Depen-
diendo de la versión comercial empleada, los terminales se mantienen a potencial de tierra o se les aplica un voltaje RF mien-
tras se aplica un voltaje RF en el electrodo en anillo. Como resultado de estos potenciales, las superficies hiperbólicas de los tres
elementos forman un analizador cuadrupolar tridimensional.
Tanto la ionización como el análisis de masas tienen lugar dentro del campo cuadrupolar tridimensional. En el paso de ioni-
zación, se fija un voltaje RF del electrodo en el anillo lo suficientemente bajo para que los iones que se encuentran dentro del
intervalo de masas de interés queden atrapados dentro del dispositivo. Después de la ionización, el análisis de masas se lleva a
cabo usando el modo de funcionamiento de la "inestabilidad selectiva de masas". Es decir, aumentando el voltaje RF en el
electrodo en anillo, los iones de masas sucesivamente mayores se expulsan de la trampa de iones a un detector multiplicador
de electrones. En su aplicación más común, el analizador de trampa de iones se usa en conjunto con un cromatógrafo de ga-
ses y cubre el intervalo de masas de 1 O a 560 daltones. Sin embargo, los avances recientes en la tecnología de trampa de iones
han extendido el intervalo de masas viables a muchos miles de daltones.

Analizadores de Tiempo de Vuelo

La separación de iones se basa en el principio de que los iones de diferentes masas pero con la misma energía cinética po-
seen diferentes velocidades. Si se fija una distancia de desplazamiento para los iones, el tiempo de desplazamiento variará con
sus masas, desplazándose más rápidamente los iones más livianos y alcanzando el detector en un período de tiempo menor. El
tiempo de vuelo está dado por

donde t¡ es el tiempo de vuelo en segundos. Así, el tiempo de vuelo de diversos iones es directamente proporcional a la raíz
cuadrada del cociente entre la masa y la carga de los iones. Para medir el tiempo de vuelo, los iones se introducen en el espec-
trómetro de masas en paquetes discretos de modo que se pueda establecer un punto de partida para el proceso sincronizado.
Los paquetes de iones se generan a través de un proceso de ionización por pulsos o mediante un sistema de compuerta en el
que los iones se producen continuamente pero se introducen sólo en momentos determinados dentro del tubo de vuelo.

Analizadores por Transformada de Fourier

En un campo magnético de densidad de flujo B, los iones se mueven en órbitas circulares. La frecuencia angular, w, del mo-
vimiento orbital viene dada por
w = (z/m)B
En este tipo de espectrómetro de masas se hacen variar las órbitas sometiendo los iones a un campo eléctrico alterno resonan-
te. Cuando la frecuencia del campo alterno coincide con la frecuencia de la órbita, los iones se aceleran de manera constante a
órbitas cada vez más grandes en un movimiento coherente y desarrollan un alto nivel de energía cinética. Después de la inte-
rrupción del campo eléctrico alterno, los iones en órbita generan una corriente de imagen alterna en los electrodos. El análisis
de la frecuencia de esta señal, da la masa de los iones implicados. Así, la transformada de Fourier en el dominio de tiempo para
las señales transientes genera el correspondiente espectro de frecuencia a partir del cual se calcula el espectro de masas. Ésta es
una técnica de alta resolución que arroja cocientes m/z exactos para aproximadamente una milésima parte de un dalton.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM

Dos espectrómetros de masas conectados en serie (MS/MS), constituyen la espectrometría de masas en tándem, y se refiere
al uso de dos o más pasos secuenciales de análisis de masas. En su forma más simple, MS/MS (Figura 2) consta de dos espec-
trómetros de masas unidos de modo que los iones preseleccionados por el primer analizador de masas (MS1) se modifican
química o energéticamente y los resultados se analizan en el segundo analizador de masas (MS2).
USP 37 Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 473

Introducción
de Muestra

Fuente Región de MS2..

Ms1•
de Iones fragmentación

Computadora Detector
• MS1 • primor oopoQ'6molro do .,....
•MS2·~~dom-

Fig. 2. Espectrometría de Masas en Tándem.

El concepto básico de MS/MS implica la capacidad para determinar la relación de masa entre un ion precursor en MSl y un
ion producto en MS2. Se pueden investigar diferentes relaciones de masas dependiendo de cómo se efectúe el barrido en MSl
y MS2. Entre dichas relaciones se encuentran la fragmentación de un precursor y la medición de todos sus fragmentos (un
barrido de producto), la selección de múltiples precursores y la evaluación de un fragmento común (un barrido de precursor),
o un barrido para determinar si, de una serie de precursores, todos pierden la misma especie neutra (un barrido de pérdida
neutra constante).
La fragmentación del ion precursor puede inducirse por transferencia de impulso mediante colisiones con moléculas de gas
y superficies sólidas o por excitación electrónica por medio de un láser. Estas técnicas se conocen como disociación inducida
por colisiones, disociación inducida por superficies o disociación inducida por láser, respectivamente. Se conoce como des-
composición metaestable a la fragmentación del ion sin activación adicional.
Existen muchas aplicaciones de MS/MS para los problemas farmacéuticos. Los barridos de los productos pueden usarse para
obtener información cualitativa de los iones precursores de fármacos, impurezas y contaminantes. Esto puede ayudar en la
identificación de sustancias desconocidas. El método también puede usarse para determinar la secuencia de aminoácidos de
péptidos y fragmentos de proteínas.
MS/MS ofrece ventajas en el análisis de mezclas. Incluso cuando el espectrómetro de masas se acopla a un dispositivo sepa-
rador como por ejemplo un cromatógrafo de líquidos o gases, es posible que las señales obtenidas sean el resultado de com-
ponentes superpuestos o sin resolver. MS/MS puede emplearse para seleccionar el ion precursor de un componente y obtener
información estructural sin interferencia de los otros.
El seguimiento de la reacción seleccionada se usa para reducir la interferencia encontrada durante el análisis cuantitativo de
bajos niveles de fármacos en matrices biológicas, como los encontrados en estudios farmacocinéticos. Si el análisis es para el
ion específico de un fármaco, las señales de interferencia de otros compuestos de la matriz pueden ocultar la señal deseada. La
interferencia se reduce si se selecciona un fragmento específico del fármaco con MSl y un fragmento específico de la estructu-
ra con MS2. Las probabilidades de que otra molécula produzca la misma relación de masas son en extremo remotas.
MS/MS también puede usarse en estudios de metabolismo para buscar moléculas con características estructurales comunes
como por ejemplo los metabolitos relacionados con el medicamento. Todos los metabolitos podrían contener el mismo grupo
funcional que se pierde como fragmento neutro. En este caso, un barrido de pérdida neutra constante mostrará todas estas
especies. Por ejemplo, todos los ácidos carboxílicos perderán dióxido de carbono neutro. Si la funcionalidad común se pierde
como fragmento iónico, entonces un barrido del precursor mostrará todas las moléculas que producen ese ion fragmentado.

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE DATOS

El experimento de espectros de masas proporciona información acerca del peso molecular de iones derivados de la muestra
y la abundancia relativa de cada uno de estos iones. Los espectros son a menudo complejos y no todos los iones pueden sepa-
rarse mediante el espectrómetro de masas. La capacidad del instrumento para separar iones se llama poder de resolución, ha-
bitualmente descrita por la definición de "valles de 10%". Esto afirma que el poder de resolución es el mayor número de masa
al que dos picos que difieren en una unidad de peso molecular y de igual altura tienen un valle entre ellos que es igual al 1 0%
de la altura de los picos. Para espectrómetros de masa de baja, media y alta resolución, este valor se encuentra entre 100 y
2000, entre 2000 y 1O000 y por encima de 1O000, respectivamente.
Si se quita o agrega un electrón a una molécula neutra, se forma un ion molecular con esencialmente el mismo peso mole-
cular que la molécula que le dio origen. A menudo es posible determinar la masa de este ion con suficiente precisión para
permitir el cálculo de la fórmula empírica del compuesto. Las masas moleculares pueden determinarse con exactitud usando
instrumentos de alta resolución o mediciones de coincidencia de picos con compuestos de referencia.
Los fragmentos iónicos son los que se producen a partir del ion molecular mediante diversos procesos de ruptura de enlaces.
Numerosos artículos de la literatura relacionan los patrones de ruptura de enlaces (patrones de fragmentación) con la estructu-
ra molecular.
Además de la medición de la masa de un ion molecular y sus fragmentos iónicos asociados, los espectrómetros de masas se
usan también para cuantificar compuestos con un alto grado de selectividad, precisión y exactitud. Los compuestos se introdu-
474 (736) Espectrometría de Masas/ Pruebas Físicas USP 37

cen en el espectrómetro de masas mediante la sonda de inserción directa, la entrada de gas o, lo que es más común, mediante
interfases cromatográficas de gases o de líquidos que purifican la muestra. La ionización puede ser por El, CI, FAB, termospray
o electrospray y separación de masas por espectrómetros de masas de sector magnético, cuadrupolo o cuadrupolo de trampa
de iones. La espectrometría de masas cuantitativa implica la medición de la abundancia de un ion específico o conjunto de
iones y la relación de la respuesta con un estándar conocido. Pueden usarse estándares externos o internos, pero se prefieren
estos últimos para una mayor excJctitud.
Para la espectrometría de masas, los estándares internos pueden ser análogos estructurales o isótopos estables. Los primeros
tienen la ventaja de un menor costo y mayor disponibilidad, pero mayor precisión y exactitud se logran normalmente usando
un análogo del analito marcado con un isótopo estable (2H, 13 C, 15 N). Los únicos requisitos para marcar el analito son que el
ion elegido para el estándar interno debe conservar la marca isotópica después de la ionización y la marca no debe ser inter-
cambiable en las condiciones de muestreo, separación o ionización. Para una cuantificación aceptable, a menudo se necesitan
estándares internos de isótopos estables, en particular con las técnicas de FAB y LC/MS como por ejemplo el termospray y el
electrospray.
Las abundancias relativas de los iones del analito y del estándar interno se suelen determinar mediante el seguimiento del
ion seleccionado, por el cual sólo se determinan los iones específicos debidos al analito y al estándar interno. La ventaja de esta
técnica, sobre el barrido completo de masas, es que se invierte más tiempo en integrar la corriente de iones al cociente masa/
carga seleccionado, lo cual incrementa la sensibilidad. El área del pico cromatográfico o la cantidad de analito de una muestra
se calcula a partir del cociente del analito con el área (o altura) del pico del estándar interno y los parámetros de regresión,
según determina la curva de calibración, usando técnicas estándar.

(741) INTERVALO O TEMPERATURA DE FUSIÓN

Para fines farmacopeicos, el intervalo de fusión, la temperatura de fusión o el punto de fusión se define como los puntos de
temperatura entre los cuales o el punto en el que se detecta la primera fase líquida detectable hasta la temperatura en la cual
no hay fase sólida aparente, excepto para las Clases 11 y JJI, según se aclara más adelante. Una transición de fusión puede ser
instantánea para un material altamente puro, pero por lo general se observa un intervalo desde el comienzo hasta el final del
proceso. Los factores que influyen en esta transición incluyen el tamaño de la muestra, el tamaño de las partículas, la eficacia
de la difusión del calor y la velocidad de calentamiento, entre otras variables, que se controlan a través de instrucciones del
procedimiento. En algunos artículos, el proceso de fusión va acompañado por descomposición simultánea, la cual se evidencia
visualmente como un efecto secundario como oscurecimiento del material, carbonización, burbujeo u otro incidente. El im-
pacto visual de esta reacción secundaria con frecuencia oscurece el final del proceso de fusión, por lo cual puede ser imposible
de determinar con exactitud. En esas circunstancias, sólo el comienzo de la fusión se puede establecer con exactitud y se debe
informar como la temperatura de fusión. La exactitud del aparato usado según se describe a continuación debe verificarse a
intervalos adecuados mediante el uso de uno o más de los Estándares de Referencia de Punto de Fusión USP disponibles, prefe-
rentemente aquellos que fundan a temperaturas lo más cercanas posible a las temperaturas de fusión de los compuestos en
análisis (ver Estándares de Referencia USP (11 )).
A continuación se describen ocho procedimientos para la determinación del intervalo o temperatura de fusión, los cuales
varían según la naturaleza de la sustancia. Cuando no se designa ninguna clase en la monografía, emplear el procedimiento
para la Clase Ja para sustancias cristalinas o amorfas y el procedimiento para qase 11 para sustancias cerosas.
El procedimiento conocido como determinación del punto de fusión de mezcla, en el cual el intervalo o temperatura de
fusión de un sólido en análisis se compara con el de una mezcla íntima de partes iguales del sólido y de una muestra auténtica
del mismo, p.ej., el correspondiente Estándar de Referencia USP, si estuviera disponible, puede emplearse como una prueba de
identificación confirmatoria. La coincidencia de las observaciones del original y de la mezcla constituye una evidencia confiable
de identidad química.
Aparato 1-Un ejemplo de Aparato I adecuado para la determinación del intervalo de fusión consiste en un recipiente de
vidrio para un baño de líquido transparente, un dispositivo mezclador apropiado, un termómetro exacto (ver Termómetros
(21 )), *y una fuente controlada de calor. El líquido del baño se selecciona de acuerdo con la temperatura requerida pero, por
lo general, se utiliza parafina líquida y ciertas siliconas líquidas que se adaptan bien a intervalos más altos de temperatura. El
líquido del baño tiene la suficiente profundidad para permitir la inmersión del termómetro a la profundidad especificada de
manera que el bulbo quede aproximadamente a 2 cm del fondo del baño. El calor puede ser suministrado por una llama abier-
ta o eléctricamente. El tubo capilar tiene aproximadamente 1 O cm de largo y entre 0,8 y 1,2 mm de diámetro interno, con
paredes de 0,2 a 0,3 mm de espesor.
Aparato 11-Se puede emplear un instrumento en los procedimientos para las Clases /, Ja y lb. Un ejemplo de Aparato 11
adecuado para la determinación del intervalo de fusión consiste en un bloque de metal que puede calentarse a velocidad con-
trolada, con su temperatura monitoreada mediante un sensor. El bloque permite alojar el tubo capilar que contiene la sustan-
cia de prueba y controlar el proceso de fusión, normalmente por medio de un haz de luz y un detector. Se puede procesar la

* El Método f:77 de lct ASTM trdtct sobre "Vcrificctcion y CJlibración de Termómetros de Líquido en Vidrio."
 USP 37 Pruebas Físicas/ (741) Intervalo o Temperatura de Fusión 475

señal del detector a través de una microcomputadora para determinar y mostrar el punto o intervalo de fusión, o bien la señal
del detector se puede graficar para permitir el cálculo visual del punto o intervalo de fusión.
Procedimiento para la Clase 1, Aparato 1-Reducir la sustancia en análisis a un polvo muy fino y, a menos que se indique
algo diferente, deshidratar la sustancia secándola a la temperatura especificada en la monografía correspondiente cuando con-
tiene agua de hidratación. Si la sustancia no contiene agua de hidratación, secarla sobre un desecante apropiado durante no
menos de 16 horas.
Cargar un tubo capilar de vidrio con un extremo cerrado con suficiente polvo seco para que forme una columna en el fondo
del tubo que tenga entre 2,5 y 3,5 mm de altura al compactarla tanto como sea posible golpeteando suavemente sobre una
superficie sólida.
Calentar el baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 30º por debajo del punto de fusión esperado. Retirar el
termómetro y acoplar rápidamente el tubo capilar al termómetro mojando ambos con una gota del líquido del baño o de
alguna otra manera y ajustar su altura para que el material en el capilar quede a nivel del bulbo del termómetro. Colocar el
termómetro nuevamente en el baño y continuar el calentamiento, mezclando constantemente, de manera que la temperatura
ascienda a una velocidad de aproximadamente 3º por minuto. Cuando la temperatura esté aproximadamente a 3º por debajo
del límite inferior del intervalo de fusión esperado, reducir el calentamiento para que la temperatura ascienda a una velocidad
de aproximadamente 1º a 2º por minuto. Continuar el calentamiento hasta que se complete la fusión.
La temperatura a la cual la columna de la sustancia en análisis se colapsa claramente contra las paredes del tubo en cualquier
punto indica el comienzo de la fusión y la temperatura a la cual la sustancia de prueba se torna completamente líquida corres-
ponde al final de la fusión o punto de fusión. Las dos temperaturas caen dentro de los límites del intervalo de fusión. Si la
fusión ocurre con descomposición, la temperatura de fusión correspondiente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo
especificado.
Procedimiento para la Clase la, Aparato 1-Preparar la sustancia de prueba y cargar el capilar según se indica para la Clase
1, Aparato J. Calentar el baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado y
aumentarla a una velocidad de 1 ± 0,5º por minuto. Insertar el capilar según se indica para la Clase/, Aparato J cuando la tem-
peratura esté aproximadamente a 5º por debajo del límite inferior del intervalo de fusión esperado y continuar el calentamien-
to hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica para la Clase/, Aparato l.
Procedimiento para la Clase lb, Aparato 1-Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una tem-
peratura de 1Oº o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el tubo
capilar según se indica para la Clase 1, Aparato l. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado en un desecador al
vacío y secar a una presión que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente después de retirar del
desecador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo y, tan pronto como sea practicable, proceder con la determinación del
intervalo de fusión según se indica a continuación: Calentar el baño hasta que la temperatura esté a 1O±1 º por debajo del
intervalo de fusión esperado. Luego, introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de ascenso de 3 ± 0,5º por minuto
hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica para la Clase /, Aparato l.
Si el tamaño de partícula del material es demasiado grande para el capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba según
se indicó anteriormente. Luego, aplicando la menor presión posible, triturar las partículas hasta un tamaño adecuado para que
entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo.
Procedimiento para la Clase 1, Aparato 11-Preparar la sustancia en análisis y cargar el tubo capilar según se indica para la
Clase/, Aparato l. Operar el aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté
aproximadamente a 30º por debajo del punto de fusión esperado. Insertar el tubo capilar en el bloque de calentamiento y
continuar el calentamiento hasta que la temperatura aumente entre aproximadamente 1ºy 2º por minuto hasta completar la
fusión.
La temperatura a la cual la señal del detector se desvía por primera vez dé su valor inicial indica el comienzo de la fusión y la
temperatura a la cual la señal del detector alcanza su valor definitivo corresponde al final de la fusión o punto de fusión. Las
dos temperaturas caen dentro de los límites del intervalo de fusión. Si la fusión ocurre con descomposición, la temperatura de
fusión correspondiente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo especificado. Si existieran discrepancias, únicamente
el intervalo o temperatura de fusión obtenido según se indica para la Clase/, Aparato I es definitivo.
Procedimiento para la Clase la, Aparato 11-Preparar la sustancia de prueba y cargar el tubo capilar según se indica para
la Clase /, Aparato J. Operar el aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté
aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado y se eleve a una velocidad de 1 ± 0,5º por minuto. Insertar el
tubo capilar según se indica para la Clase 1, Aparato I cuando la temperatura esté aproximadamente a 5º por debajo del límite
inferior del intervalo de fusión esperado y continuar calentando hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según
se indica para la Clase/, Aparato J. Si la fusión ocurre con descomposición, la temperatura de fusión correspondiente al comien-
zo de la fusión está dentro del intervalo especificado. Si existieran discrepancias, únicamente el intervalo o temperatura obteni-
dos según se indica para la Clase la, Aparato/, es definitivo.
Procedimiento para la Clase lb, Aparato 11-Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una
temperatura de 1Oº, o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el
tubo capilar según se indica para la Clase/, Aparato l. Luego colocar inmediatamente el tubo cargado en un desecador al va-
cío, y secar a una presión que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente después de retirar del dese-
cador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo, y tan pronto como sea practicable, proceder con la determinación del in-
tervalo de fusión según se indica a continuación: operar el aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque
 r
476 (741) Intervalo o Temperatura de Fusión/ Pruebas Físicas USP 37

hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1O± 1º por debajo del intervalo de fusión esperado. Luego introducir el tu-
bo cargado, y calentar a una velocidad de ascenso de 3 ± 0,5º por minuto hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de
fusión según se indica para la Clase/, Aparato l.
Si el tamaño de partícula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba
según se indicó anteriormente. Luego, aplicando la menor presión posible, triturar suavemente las partículas hasta un tamaño
adecuado para que entren en el tubo capilar, y cargar inmediatamente el tubo. Si existieran discrepancias, únicamente el inter-
valo o temperatura obtenidos según se indica para la Clase lb, Aparato 1, es definitivo.
Procedimiento para la Clase 11-Fundir cuidadosamente el material que se desea probar a la menor temperatura posible y
colocarlo en un tubo capilar con ambos extremos abiertos, a una profundidad de aproximadamente 1O mm. Enfriar el tubo
cargado a 1Oº o menos durante 24 horas, o mantenerlo en contacto con hielo durante no menos de 2 horas. Luego unir el
tubo capilar al termómetro por medios adecuados, ajustarlo en un baño de agua de manera que el borde superior del material
quede 1O mm por debajo del nivel del agua y calentar según se indica para la Clase 1, Aparato I excepto que se debe regular la
velocidad de aumento de temperatura a razón de 0,5º a 1,0º por minuto, dentro de los 5º de la temperatura de fusión espera-
da. La temperatura a la cual el material comienza a subir en el tubo capilar es la temperatura de fusión.
Procedimiento para la Clase 111-Fundir lentamente una cantidad de la sustancia de prueba, mientras se agita, hasta que
alcance una temperatura de 90º a 92º. Retirar la fuente de calor y dejar que la sustancia fundida se enfríe a una temperatura de
8º a 1Oº por encima del punto de fusión esperado. Enfriar el bulbo de un termómetro apropiado (ver Termómetros (21 )) a 5º,
secarlo y mientras todavía está frío colocarlo en la sustancia fundida hasta que quede sumergida aproximadamente la mitad
inferior del bulbo. Retirarlo de inmediato y mantenerlo en posición vertical lejos del calor hasta que se opaque la superficie de
la cera. Luego, sumergirlo durante 5 minutos en un baño de agua con una temperatura que no exceda de 16º.
Fijar el termómetro firmemente a un tubo de ensayo de manera que el punto inferior quede 15 mm por encima del fondo
del tubo de ensayo. Suspender el tubo de ensayo en un baño de agua ajustado a aproximadamente 16º y aumentar la tempe-
ratura del baño a una velocidad de 2º por minuto hasta 30º. Luego, cambiar a una velocidad de 1º por minuto y observar la
temperatura a la cual se desprende del termómetro la primera gota de sustancia fundida. Repetir la determinación dos veces
con una porción recién fundida de la sustancia de prueba. Si la variación de las tres determinaciones es de menos de 1º, tomar
el promedio de las tres como punto de fusión. Si la variación de las tres determinaciones es 1º o mayor de 1º, hacer dos deter-
minaciones adicionales y tomar el promedio de las cinco.

(751) PARTÍCULAS METÁLICAS EN UNGÜENTOS OFTÁLMICOS

La siguiente prueba está diseñada para limitar a un nivel que se considera no objetable el número y tamaño de partículas
metálicas que puede haber presentes en ungüentos oftálmicos.
Procedimiento-Extrudir tanto como sea posible, en forma individual, el contenido de 1O tubos en sendas placas de Petri
de 60 mm transparentes, de fondo plano y exentas de marcas de cualquier tipo. Cubrir las placas y calentar a 85º durante 2
horas, aumentando la temperatura levemente, si fuera necesario, para asegurar la obtención del estado líquido. Tomando pre-
cauciones para no perturbar la muestra fundida, dejar enfriar cada una de las placas a temperatura ambiente hasta lograr la
solidificación.
Retirar las tapas e invertir cada placa de Petri en la platina de un microscopio apropiado ajustado para proporcionar un au-
mento de 30x y equipado con un ocular con micrómetro de disco calibrado para el aumento empleado. Además de la fuente
de luz usual, dirigir otra fuente de iluminación por encima del ungüento a un ángulo de 45º. Examinar el fondo de la placa de
Petri en su totalidad para verificar la presencia de partículas metálicas. La variación de la intensidad de la fuente de iluminación
superior permite que se reconozcan estas partículas metálicas por su reflexión característica de la luz.
Contar el número de partículas metálicas de 50 µm o de mayor tamaño en cualquier dimensión: los requisitos se cumplen si
el número total de tales partículas en los 1O tubos no excede de 50 y si no hay más de 1 tubo que contenga más de 8 partícu-
las metálicas. Si no se obtienen estos resultados, repetir la prueba en 20 tubos adicionales: los requisitos se cumplen si el nú-
mero total de partículas metálicas que tienen un tamaño de 50 µm o mayor, en cualquier dimensión, no excede de 150 en los
30 tubos analizados y si no hay más de 3 tubos, individualmente, que contengan más de 8 partículas de este tipo.
USP 37 Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 477

<755) LLENADO MÍNIMO

Las siguientes pruebas y especificaciones se aplican a artículos tales como cremas, geles, jaleas, lociones, ungüentos, pastas,
polvos y aerosoles, incluso los aerosoles tópicos presurizados y no presurizados, en envases cuyo contenido declarado en la
etiqueta no es más de 150 g ó 150 ml.
PROCEDIMIENTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS DIFERENTES A LOS AEROSOLES-
Para envases cuya etiqueta declara un peso, seleccionar una muestra de 1 O envases llenos y quitar todas las etiquetas cuyo
peso pueda variar cuando se extrae el contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los
envases con un medio apropiado y pesar individualmente. Extraer cuantitativamente el contenido de cada envase, cortándolo
de manera tal que quede abierto y lavándolo con un disolvente apropiado, si fuera necesario, teniendo cuidado de retener el
cierre y las otras partes de cada envase. Secar y volver a pesar cada uno de los envases vacíos junto con sus partes correspon-
dientes. La diferencia entre los dos pesos es el peso neto del contenido del envase. Para envases cuya etiqueta declara un volu-
men, verter el contenido de 1 O envases en 1 O probetas graduadas apropiadas y dejar que drenen completamente. Registrar el
volumen del contenido de cada uno de los 1 O envases. El contenido neto promedio de los 1 O envases no es menor que la
cantidad declarada y el contenido neto de cualquier envase individual no es menos de 90% de la cantidad declarada en aque-
llos casos en que la cantidad declarada es de 60 g o 60 mL o menos, o no es menos de 95% de la cantidad declarada cuando
la cantidad declarada es de más de 60 g o 60 mL pero no más de 150 g o 150 mL. Si no se cumple este requisito, determinar el
contenido de 20 envases adicionales. El contenido promedio de los 30 envases no es menor que la cantidad declarada y el
contenido neto de no más de 1 de los 30 envases es menos de 90% de la cantidad declarada en aquellos casos en que la
cantidad declarada es 60 g o 60 mL o menos, o es menos de 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es
más de 60 g o 60 mL pero no más de 150 g o 150 mL.
PROCEDIMIENTO PARA AEROSOLES-
Seleccionar una muestra de 1 O envases llenos y quitar cualquier etiquetado cuyo peso podría variar durante la remoción del
contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con medios apropiados y pesar
individualmente. Retirar el contenido de cada envase empleando una técnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la pre-
sión interna, retirar la válvula y verter). Retirar el contenido residual con disolventes apropiados y luego enjuagar con unas po-
cas porciones de metano!. Retener el envase, la válvula y todas las partes del mismo como una unidad y calentarlas a 100º
durante 5 minutos. Enfriar y volver a pesar cada uno de los envases junto con sus partes correspondientes. La diferencia entre
el peso original y el peso del envase vacío es el peso neto de llenado. Determinar el peso neto de llenado para cada envase
analizado. Los requisitos se cumplen si el peso neto del contenido de cada uno de los 1 O envases no es menor que la cantidad
declarada.

<761) ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

INTRODUCCIÓN

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es un métodQ analítico basado en las propiedades magnéticas de
ciertos núcleos atómicos. Al igual que con otros tipos de espectroscopía, la absorción o emisión de energía electromagnética a
frecuencias características proporciona información sobre la estructura. La RMN difiere de otros tipos de espectroscopía en que
los niveles discretos de energía entre los que ocurren las transiciones se presentan sólo cuando el núcleo se somete a un campo
magnético.
Aunque se la reconoce ampliamente como una de las más poderosas herramientas de elucidación de estructuras químicas
disponibles, también se la puede usar para mediciones cualitativas y cuantitativas exactas, siempre que se use un diseño expe-
rimental apropiado. Consultar el capítulo de información general (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magné-
tica Nuclear. [NOTA-Los capítulos con números superiores a 1000 se proveen únicamente para fines informativos.]
478 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas USP 37

CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS DE RMN

La calificación de un instrumento de RMN se puede dividir en tres etapas: Calificación de Instalación (IQ, por sus siglas en
inglés), Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y Calificación de Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para
un análisis más detallado, ver el capítulo de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).

Calificación de Instalación
Los requisitos de Calificación de Instalación proveen evidencia de una instalación adecuada de hardware y software para el
instrumento de manera segura y efectiva en la ubicación deseada.

Calificación Operativa
En la Calificación Operativa se caracteriza el desempeño del instrumento usando estándares para verificar que el sistema
opera de acuerdo con las especificaciones esperadas. El propósito de la Calificación Operativa es demostrar que el desempeño
del instrumento es apto para una aplicación determinada. Debido a que se encuentran disponibles una gran cantidad de mo-
dos distintos para medir espectros de RMN, se recomienda usar estándares con propiedades espectrales conocidas durante la
Calificación Operativa. Por lo general, se encuentran disponibles estándares de referencia en tubos para RMN sellados para
determinar la relación señal-ruido y la forma de la línea espectral.

Calificación de Desempeño
La Calificación de Desempeño ayuda a determinar que el instrumento sea capaz de cumplir con los requisitos del usuario
para todas las mediciones críticas para la calidad. La documentación de la Calificación del Desempeño debe describir lo si-
guiente:
1. Criterios de desempeño específicos definidos y procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de prueba y
parámetros del instrumento.
2. Los elementos a medir para evaluar los criterios y las especificaciones definidas a priori para dichos criterios.
3. El intervalo de prueba, que puede ser al momento de usar.
4. El uso de muestras extremas (bracketing) o de un grupo de varias muestras.
5. Una lista definida de las acciones correctivas que podrían implementarse si el espectrómetro no cumpliera con las especifi-
caciones.
La Calificación de Desempeño periódica debe incluir un subconjunto de pruebas de Calificación Operativa para asegurar que
el instrumento se desempeña produciendo datos adecuados para el uso que se le intenta dar. Dependiendo del uso típico, las
especificaciones de la Calificación de Desempeño pueden ser más o menos estrictas que las especificaciones de instalación del
fabricante. Las mediciones críticas para la calidad de los espectros incluyen una medición de la relación señal-ruido y pruebas
de resolución para todos los núcleos de interés. Las pruebas de Calificación de Desempeño específicas para un método, tam-
bién conocidas como pruebas de aptitud del sistema, se pueden usar como requisitos de Calificación de Desempeño en el caso
de procedimientos validados.
Las pruebas y muestras para la Calificación de Desempeño citadas en las secciones siguientes son sólo ejemplos típicos. Se
pueden usar otras pruebas y muestras para establecer especificaciones para propósitos específicos. Los proveedores de instru-
mentos a menudo suministran muestras y parámetros de prueba que se puederi usar como parte del paquete de Calificación
de Desempeño.

MEDICIÓN DE LA RESOLUCIÓN y DE LA FORMA DE LA LÍNEA-RMN DE 1 H (ver la Figura 7)

Muestra: Cloroformo al 1o/o en acetona-d 6 (;~ 500 MHz), cloroformo al 3% en acetona-d 6, desgasificada y sellada
Ancho del espectro: < 1 KHz
Tiempo de adquisición de datos: No menos de 1 O segundos
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de relajación: 60 segundos
Velocidad de giro: Estática ó 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento
Procesamiento: Sin ensanchamiento de línea, completado de ceros hasta 128 k
USP 37 Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 479

'~
1
:-
* Satélite de 13C
~§
#
Artefactos de Giro

' oo
i ...
1

#
~- ~

#
* * 8
"'
# #
~o

r
·~·-·~ "i "'" r oü ...... "-·1" r···· "·1 1 .. t-
1
8,1 8,0 7,9 7,8 [ppmJ

Figura 1. Espectro de RMN de 1H de cloroformo en acetona-d 6 obtenido a 400 MHz. El ancho de la línea medido a 0,55% y
a O, 11 % de los satélites 13 C fue 2, 7 y 5,5 Hz, respectivamente.

Compensar el magneto con especial atención a las compensaciones fuera de eje, obtener una sola adquisición, someter a
corrección de fase para obtener una absorción pura y medir el ancho de la línea a 50%, 0,55% y O, 11 % de la intensidad máxi-
ma. El ancho de la línea debe cumplir con las especificaciones para estas alturas y, además, la forma de la línea debe ser lorent-
ziana. Con frecuencia, en los espectrómetros de RMN modernos, la forma de la línea se obtiene en muestras sin girar, puesto
que es posible compensar muy bien fuera de eje, tanto que no existe ninguna diferencia fundamental entre los espectros obte-
nidos girando la muestra y con la muestra sin girar. Además, los espectros bidimensionales se deben obtener sobre muestras
estáticas.

MEDICIONES DE RELACIÓN SEÑAL-RUIDO-RMN DE 1 H (ver la Figura 2)

Muestra: Etilbenceno al O, 1% en cloroformo-d, etilbenceno al 1% en cloroformo-d (< 200 MHz) desgasificado y sellado
Ancho del espectro: 1O ppm
Tiempo de adquisición de datos: 400 milisegundos
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de espera para relajación: 60 segundos
Velocidad de giro: O ó aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento
Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de la línea de 1 Hz
Referencia: Tetrametilsilano (TMS) = 0,0 ppm o el centro del cuarteto = 2,65 ppm
480 (761 > Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear /Pruebas Físicas USP 37

..º·
2,3,4

r ·· ,- ,- , ...... ·r ,. ,_,....,. 1 ·-· .,. ·r··~·-·~--,~- -r-...,.~~··r .. ,~ -,·~~··-.,..

6 5 4

7 6 4 2 1 (ppmJ

Figura 2. Espectro de RMN de 1 H de etilbenceno al O, 1 % obtenido a 400 MHz con una relación señal-ruido de 550:1

Se debe elegir la concentración de etilbenceno para lograr mediciones de relación señal-ruido especificadas en el intervalo
de 20-1000. Las concentraciones que generalmente resultan en mediciones fuera de dicho intervalo tienen una utilidad limita-
da para la evaluación del desempeño del instrumento. Sin embargo, convencionalmente se utilizan soluciones estándar esta-
blecidas. Se debe compensar el magneto lo mejor posible. Idealmente, esta prueba debe realizarse inmediatamente después
de la prueba de la forma de la línea puesto que la mayoría de las compensaciones estarán casi maximizadas. Obtener una sola
adquisición, someter el espectro a corrección de fase en el modo de absorción pura y medir la relación señal-ruido del cuarteto
de etilbenceno. Este experimento se puede realizar girando la muestra o con la muestra estática. Si las compensaciones fuera
de eje están bien ajustadas, el valor de la relación señal-ruido medido sobre muestras giradas sólo debe ser aproximadamente
10% mayor que el obtenido con muestras estáticas. Una relación mayor indica que se puede lograr una compensación fuera
de eje adicional.
Los espectrómetros modernos tienen un software que lleva a cabo la medición de la relación señal-ruido una vez que el ope-
rador ha identificado las regiones de la señal y del ruido. Los cálculos también pueden realizarse manualmente. Medir la ampli-
tud (A) desde el centro de la línea base hasta el pico de la más alta de las dos líneas centrales en el cuarteto. Medir la altura del
ruido entre picos (H) desde el pico de ruido inferior hasta el pico de ruido superior en la región de 3-5 ppm. El ruido puede
multiplicarse verticalmente por un factor para obtener una medición exacta de los espectros con relación señal-ruido alta. Cal-
cular la relación señal-ruido según se indica a continuación:
S/N = k X 2,5 X Al H [1]
donde k es el factor de expansión vertical de la región de ruido usada. El factor de 2,5 convierte la relación señal-
ruido entre picos en la media cuadrática (rms, por sus siglas en inglés) del ruido, que es la convención estándar para informar
la señal-ruido en la espectroscopía de RMN. Se pueden usar cálculos de señal-ruido computarizados siempre que las especifica-
ciones se establezcan y analicen usando el mismo procedimiento. El uso de un valor de relación señal- ruido menor que el
especificado por el fabricante es permisible, a discreción del espectroscopista, siempre y cuando se determine que dicho valor
es suficiente para la aplicación en uso.

MEDICIONES DE RELACIÓN SEÑAL-RUIDO DE RMN DE 13 C (ver la Figura 3)

Muestra: p-Dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: Aproximadamente 200 ppm
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de espera para relajación: 300 segundos
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento
Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de línea de 3,5 Hz, completado de ceros hasta 32k
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del benceno = 128,4 ppm
USP 37 Pruebas Físicas/ (761 > Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 481

Benceno-d6

~~ 1oxano

120 100

-~----·-....,.--,---. - - .---r----,--~-.----·~-~-~-r----r--··-¡-----r-
140 120 100 80 60 (ppm]

Figura 3. Espectro de RMN de ne del estándar ASTM de p-dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) obtenido a 100,6 MHz, con
una relación señal-ruido de 140: 1

Usando un magneto bien compensado, obtener una sola adquisición después de un tiempo de espera mínimo de 300 se-
gundos, colocar el espectro en fase de absorción pura y medir la altura del triplete del benceno a aproximadamente
128,4 ppm desde el centro de la línea base. El ruido entre picos se puede medir según se indicó anteriormente con una expan-
sión vertical apropiada a 80-120 ppm. Los cálculos de la relación señal-ruido se pueden realizar tal como indica la Ecuación 7 o
mediante cálculo computarizado.
El triplete del benceno-d 6 no se intensifica por efecto nuclear de Overhauser (NOE, por sus siglas en inglés). Por consiguien-
te, esta prueba verifica sólo el desempeño del canal ne.

DESEMPEÑO DE LOS CANALES ne Y 1 H (ver la Figura 4)

Muestra: Etilbenceno hasta al 10% en cloroformo-d (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: 200 ppm
Duración de la adquisición de datos: 64k puntos
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de espera para relajación: 300 segundos
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición con desacoplamiento de pulso compuesto ajustado al centro del espectro
de 1 H
Procesamiento: Exponencial con ensanchamiento de línea de 0,3 Hz
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del cloroformo-d = 77,23 ppm
482 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas USP 37

2,3
CH
H-.C,.... 6 3
-~

·~
(;i
4 CDCl 3
1

·---.---..---,---y----,.-...-r--¡---r·--.---.-- '
140 I~ 100 00 40 20 (ppmJ

Figura 4. Espectro de RMN de 13 C de etilbenceno al 10% obtenido con una sonda dual 1 H/ 13 C enfriada criogénicamente a
150,9 MHz, con una relación señal-ruido de 640:1

La compensación debe ser suficiente para cumplir con las pruebas de resolución y de forma de la línea descritas anterior-
mente. La medición de la relación señal-ruido se realiza a partir de la altura del pico de la mayor de las dos resonancias cerca-
nas a 128 ppm. El ruido se mide según se indicó anteriormente en la región de 80-120 ppm, con una expansión vertical apro-
piada. La relación señal-ruido es calculada por la computadora o conforme a la Ecuación 7.

MEDICIONES DE RELAXOMETRÍA-RMN DE CAMPO BAJO

La Calificación de Desempeño debe realizarse antes de la recolección de datos experimentales.

Disolver una cantidad pesada con exactitud de cloruro de manganeso (11) tetrahidrato (peso molecular 197,91) en agua y
diluir cuantitativamente con agua para obtener soluciones de comprobación con concentraciones conocidas de 0,9; 2,7 y 4,5
mM.
Colocar una porción de cada una de las soluciones en portamuestras adecuados para el modelo de espectrómetro de RMN
de campo bajo en uso. Entibiar a 40º durante no menos de 1 O minutos y medir el tiempo de relajación espín-entorno (T,) del
agua. El promedio T, para mediciones repetidas debe estar dentro del 5% de 156; 52 y 32 ms para las soluciones de 0,9; 2,7 y
4,5 mM, respectivamente.

Caracterización del Desempeño del Instrumento

Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño del espectró-
metro de RMN dependen del instrumento y del uso que se pretende dar. Muchas aplicaciones de RMN emplean experimentos
previamente validados que relacionan los espectros de RMN con una propiedad física o química de interés. Se debe demostrar
el desempeño estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta práctica ofrece cierta garantía sobre la confiabilidad
de las mediciones de muestra tomadas a partir de espectros usando experimentos de RMN previamente validados.

ANÁLISIS DE RMN CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

La espectroscopía de RMN se ha utilizado en un amplio rango de aplicaciones tales como elucidación de estructuras, estu-
dios termodinámicos, cinéticos y mecanísticos, y análisis cuantitativo. Algunas de estas aplicaciones están más allá del alcance
de los métodos farmacopeicos.
Todas las características de las señales-desplazamiento químico, multiplicidad, ancho de línea, constantes de acoplamiento,
intensidad relativa y tiempo de relajación- proveen información analítica.
USP 37 Pruebas Flsicm / (761) Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear 483

Aplicaciones Cualitativas
La comparación de un espectro existente en la bibliografía o de un estándar auténtico con el de una muestra de prueba
puede usarse para confirmar la identidad de un compuesto y detectar la presencia de impurezas que generan sena!es extranas.
Los espectros de RMN con estructuras simples pueden describirse adecuadamente mediante el uso de los valores numéricos
para los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento, y mediante el número relativo de núcleos representados
por la integral de cada senal. (Los instrumentos modernos cuentan con software que genera espectros simulados con estos
datos). También deben proporcionarse detalles experimentales, como por ejemplo el disolvente usado y la referencia para el
desplazamiento químico.
Para muestras desconocidas, el análisis de RMN, usualmente combinado con otras técnicas analíticas, es una herramienta
poderosa para la elucidación de estructuras. Los desplazamientos químicos proporcionan información del entorno químico de
los núcleos. Existe una amplia bibliografía de referencia con tablas y reglas de correlación para predecir los desplazamientos
químicos. La multiplicidad de las senJles pror•orcinn;i inform;i(ión Pstructural importante. La magnitud de la constante de aco-
plamiento escalar, }, entre protones residuales en estructuras aromáticas, olefínicas o cicloalquílicas sustituidas se usa para iden-
tificar la posición relativa de los sustituyentes. Los espectros de rutina de 13 C se obtienen en condiciones de desacoplamiento
protónico, lo que anula todos los acoplamientos heteronucleares 1 'C- 1 H. Como resultado de este desacoplamiento, las sena les
de carbono aparecen como singuletes, a menos que estén presentes otros núcleos no desacoplados (p.ej., 14 F, 31 P).
El intercambio químico es un ejemplo del efecto de la velocidad de los procesos intermoleculares e intramoleculares en los
espectros de RMN. Si un protón puede experimentar diferentes ambientes en virtud de tal proceso (tautomerismo, rotación en
torno a un enlace, equilibrios de intercambio, inversión de anillo, etc.), la apariencia del espectro será una función de la veloci-
dad del proceso. Los procesos lentos (en una escala de tiempo de RMN) proporcionan más de una señal de las especies que se
interconvierten, los procesos rápidos promedian estas señales en una línea, y los procesos intermedios producen señales an-
chas, que en ocasiones son difíciles de encontrar en los espectros.
Los programas de los espectrómetros modernos de RMN por Transformada de Fourier toman en cuenta secuencias de pul-
sos mucho más complejas que la acumulación repetitiva de transientes descrita anteriormente. Tales experimentos incluyen
análisis multidimensionales homonucleares o heteronucleares que determinan la correlación de acoplamientos y pueden simpli-
ficar la interpretación de espectros complejos.
Ver el capítulo (l 761) para descripciones detalladas de los experimentos bidimensionales más comunes.

Aplicaciones Cuantitativas
l. Consideraciones generales de la RMN cuantitativa: ver el capítulo (1761 ).
11. El alcance de esta sección se limita a la cuantificación mediante RMN unidimensional. Aunque se puede usar cualquier
núcleo activo de RMN para obtener datos cuantitativos, la información de este capítulo se limita al 1 H. Existen dos tipos
de cuantificación mediante RMN: relativa y absoluta.
(A) La cuantificación relativa implica medir cantidades relativas de las especies en una muestra basándose en la integra-
ción de picos debidos a cada una de las especies medidas. Las integrales se normalizan mediante el factor N, es decir,
la integral se divide por el número de núcleos equivalentes representados por dicho pico para proporcionar la con-
centración molar relativa de cada componente.
(B) La cuantificación absoluta es la medición directa de la cantidad real de analito independiente de otros componen-
tes contenidos en dicha muestra. Existen dos métodos básicos de cuantificación absoluta basados en el tipo de están-
dar de referencia usados para calibrar la señal de RMN.
(1) Estándar de referencia interno:
(a) Definición: El estándar de referencia se disuelve conjuntamente con el analito en lé' solución de prueba.
(b) Procedimiento
Preparación de la solución típica para RMN: Una solución para RMN se prepara con pesos exactos
del analito y del estándar de referencia. La fuente de error más grande en este método de RMN cuanti-
tativo se deriva del pesaje, por lo que se recomienda usar pesos más grandes para minimizar errores.
Este método cuantitativo se basa en una comparación del estándar de referencia y los picos de RMN
del analito y sus respectivas concentraciones. Debido a que el analito y el estándar de referencia se en-
cuentran en la misma solución, el volumen donde el analito y el estándar de referencia están conteni-
dos es el mismo, por lo que únicamente se comparan sus masas. Por lo tanto, no es necesario un volu-
men exacto. Por lo general, las soluciones se preparan por triplicado como mínimo.
Adquisición de datos: Los datos se adquieren en condiciones cuantitativas, ver el capítulo
(l 761 ). Por ejemplo, se debe esperar al menos 5 veces el T1 más largo cuando se usa un pulso de
90º antes de repetir el pulso.
Procesamiento de datos: Procesar los datos, usando completado de ceros si fuera necesario, de
modo que haya un número suficiente de puntos para definir un pico. Por ejemplo, la experiencia
ha demostrado que se necesitan al menos 16 puntos para obtener una buena representación
cuantitativa de un pico.
484 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear /Pruebas Físicas USP 37

Análisis: Integrar los picos apropiados. Por ejemplo, evitar el uso de picos superpuestos o los que
se deban a hidrógenos susceptibles de intercambio. La determinación de la cantidad de analito se
deriva de la proporcionalidad básica entre la intensidad del pico y la concentración del soluto.

[A]1H _ [RS]1H
---- [2]

donde I = integral; N =factor de normalización; y [ ]lH = 1H concentración molar relativa y los

subíndices A y RS representan el analito y el estándar de referencia, respectivamente.
Por consiguiente, la masa del analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación.
I N
M =__¿_x____fil_x MM
_ _A_xM xP (3]
A IRS NA MMRS RS

donde MA = masa del analito, MM = masa molar y P = pureza del estándar de referencia.
(c) Una aplicación común de la cuantificación absoluta es la determinación de la pureza de una muestra. La
pureza porcentual en peso se calcula mediante
M
pureza %en peso =-A x100% [4]
Ms
donde M 5 es la masa total de la muestra con contribuciones del analito más cualquier contaminante que
pudiera estar presente en la muestra como por ejemplo agua y sales. Al combinar las Ecuaciones 3 y 4, la
pureza porcentual en peso se calcula mediante

(2) Estándar de referencia externo

(a) Definición: El método clásico de estándar de referencia externo consiste en soluciones de un estándar de
referencia y un analito que se encuentran en tubos para RMN separados. Una variación del método del es-
tándar de referencia externo es insertar la solución de prueba del estándar contenida en un tubo coaxial en
la solución de prueba del analito contenida en un tubo para RMN. Otra variación consiste en la introduc-
ción de una señal generada por computadora en el espectro de una solución estándar de referencia de con-
centración conocida para calibrar la respuesta de la señal (intensidad por concentración molar 1 H, en el ca-
so de la RMN de 1 H), seguida por la inserción de una señal calibrada generada por computadora en el es-
pectro de una solución de prueba del analito. Esta sección tratará el uso de una referencia externa en el
sentido clásico.
(b) Procedimiento
Preparación de la solución para RMN: Las soluciones para RMN con concentraciones conocidas de
analito y de estándar de referencia se preparan usando pesos y volúmenes exactos. Nuevamente, se
recomienda el uso de pesos más grandes para minimizar el error de pesaje. Por lo regular, se preparan
soluciones repetidas del analito y del estándar de referencia. El analito y el estándar de referencia de-
ben prepararse usando el mismo disolvente para minimizar las diferencias de ajuste.
Adquisición y procesamiento de datos: Igual que en 11.B. l .b, estándar de referencia interno. Aplicar
los mismos parámetros de adquisición y procesamiento a los espectros del analito y del estándar de
referencia.
Análisis: Integrar los picos apropiados en los espectros del analito y del estándar de referencia. La can-
tidad de analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:

MA=~xNRsx~x MMA xMRsxP [6]

IRS NA VRS MMRS
donde V= volumen.
Aplicación a la pureza porcentual en peso: Los valores de pureza porcentual en peso se pueden calcu-
lar de manera similar a la indicada en la Ecuación 5.
(C) Los métodos de estándar de referencia interno y externo tienen cada uno sus propias ventajas y desventajas.
(1) Interacciones químicas: La preparación del estándar de referencia y del material de prueba en soluciones sepa-
radas previene interacciones químicas entre la muestra de prueba y el estándar de referencia que de otro modo
podrían ocurrir con un estándar de referencia interno.
(2) Superposición de espectros: El uso de un estándar de referencia externo también previene la superposición po-
tencial entre los picos del estándar de referencia y de la muestra de prueba que puede ocurrir con un estándar
interno.
USP 37 Pruebas Físicos/ <761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 485

(3) Calibración: Una vez que se ha calibrado la respuesta de RMN con soluciones de estándares de referencia exter-
nos, dicha calibración puede aplicarse a cualquier otra muestra en el mismo disolvente siempre que i) se haya
demostrado la estabilidad del instrumento durante el tiempo entre el que se lleva a cabo la calibración y el mo-
mento en que se adquieren los datos en el material de prueba, ii) se haya establecido la aptitud del sistema en el
día en que se realiza la medición del material de prueba y iii) se comparen las integrales absolutas. Para los es-
tándares de referencia internos, la medición del estándar de referencia y de la muestra de prueba se lleva a cabo
en condiciones absolutamente idénticas.
(4) Exactitud y precisión: Se pueden preparar soluciones múltiples de estándares de referencia para promediar los
errores en las mediciones de masa y volumen durante la preparación de la muestra, con lo que se mejora la
exactitud de la respuesta de RMN calibrada. Para los estándares de referencia internos, se realizan mediciones
individuales del estándar de referencia y del analito para cada solución de prueba duplicada. Los errores combi-
nados que se derivan de las mediciones de masa del estándar de referencia y de la muestra de prueba, así como
las variaciones electrónicas de los instrumentos determinan la desviación estándar del promedio MA o de los va-
lores de pureza porcentual en peso.

VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE RMN

Cuando se proporciona un procedimiento de RMN en una monografía, es necesario verificar su aptitud en las condiciones
reales de uso (ver el capítulo (1226)). La validación es necesaria únicamente cuando un método de RMN se presenta como
alternativa al procedimiento oficial para el análisis de un artículo oficial. El objetivo de la validación de un procedimiento de
RMN es demostrar que la medición es adecuada para su propósito deseado, incluyendo lo siguiente: determinación cuantitati-
va del componente principal en un fármaco o producto farmacéutico (valoraciones de Categoría 1), determinación cuantitativa
de impurezas (valoraciones de Categoría 11) y pruebas de identificación (valoraciones de Categoría IV). [NOTA-Para definicio-
nes sobre las diferentes categorías, consultar el capítulo (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos.] Dependiendo de la
categoría de la prueba, la validación del procedimiento analítico requerirá el análisis de la especificidad, linealidad, intervalo,
exactitud, precisión, límite de cuantificación y robustez. Dichas características de desempeño analítico se aplican a métodos
estandarizados externamente y los métodos de estándares agregados.
El capítulo (1225) ofrece definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios
de validación específicos para cada característica. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario de criterios de
validación específicos que representan las expectativas mínimas para esta tecnología. Podrían requerirse criterios de aceptación
más rigurosos para cada aplicación particular a fin de demostrar la aptitud para el uso deseado.

Validación de Procedimientos Analíticos

El objetivo de la validación de un procedimiento analítico es demostrar que dicho procedimiento es adecuado para el propó-
sito al que está destinado, mediante la realización de experimentos y que los resultados obtenidos a partir de ellos cumplan
con criterios de aceptación predefinidos. Los procedimientos analíticos de RMN pueden incluir lo siguiente: pruebas cuantitati-
vas para componentes principales y contenido de impurezas, pruebas de límite para detectar la presencia de impurezas, cuan-
tificación de componentes en un producto o formulación y/o pruebas de identificación.
Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un procedimiento analítico son similares a las requeridas pa-
ra cualquier procedimiento analítico. El capítulo (1225) presenta una discusión sobre los principios generales aplicables. Los
criterios de aceptación específicos para cada parámetro de validación debE:n ser congruentes con el uso pretendido del proce-
dimiento analítico.
A continuación se proporcionan las características de desempeño requeridas como parte de una validación para cada una de
las categorías de procedimientos analíticos.

ESPECIFICIDAD

El propósito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las señales del analito a medir están exentas
de interferencia proveniente de los componentes e impurezas en el material de prueba. La especificidad se puede aplicar a
todas las categorías y es un requisito de la Categoría IV. Como prueba de especificidad se pueden comparar los espectros de
RMN del analito con los de otros componentes de las formulaciones y las preparaciones de prueba, así como los de impurezas
conocidas derivadas de los procesos sintéticos. Para un procedimiento analítico de identificación por RMN (Categoría IV), las
pruebas de validación pueden incluir experimentos de RMN multidimensionales para validar las correctas asignaciones de los
desplazamientos químicos y así confirmar la estructura del analito.
Criterios de validación: La especificidad se asegura mediante el uso de un estándar de referencia, siempre que sea posi-
ble, así como la demostración de la ausencia de interferencias procedentes de otros componentes.
486 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas USP 37

LINEALIDAD

La relación de linealidad es aquélla exhibida entre la concentración de analito y la respuesta del instrumento, la cual se debe
demostrar midiendo las respuestas del analito de no menos de cinco soluciones estándar a concentraciones que abarquen el
intervalo de concentración anticipado de analitos de la solución de prueba. Para la Categoría 1, las soluciones estándar se pue-
den preparar a partir de materiales de referencia en un disolvente para RMN apropiado. Para la Categoría 11, en procedimien-
tos analíticos de RMN que se usan para cuantificar impurezas, se pueden preparar muestras de linealidad agregando cantida-
des conocidas de muestras de prueba adecuadas que contengan bajas cantidades de analito o agregando cantidades conoci-
das de una matriz conteniendo el analito en concentraciones incluidas en el intervalo esperado. Posteriormente, se debe cons-
truir la curva estándar usando procedimientos analíticos y estadísticos adecuados tales como la regresión de cuadrados míni-
mos. Asimismo, se debe determinar el coeficiente de correlación (R), la ordenada al origen y la pendiente de la línea de regre-
sión. Los valores absolutos determinados para dichos factores deben ser apropiados para el procedimiento que se está validan-
do.
Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R) debe ser no menos de 0,995 para las valoraciones de Categoría 1,
y no menos de 0,99 para las pruebas cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito se proporciona mediante el procedimiento analítico de RMN
cuantitativa. Por lo regular, éste se basa en las especificaciones del artículo de prueba de la monografía USP. Se trata del inter-
valo dentro del cual el procedimiento analítico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisión, obte-
niendo de este modo un valor confiable de dicho procedimiento analítico. A continuación se proporcionan intervalos reco-
mendados para varios procedimientos analíticos de RMN.
Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, cuando los criterios de aceptación está centrados en 100,0%, el in-
tervalo de validación es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación comprende desde
10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo es
70,0%-130,0%. Para las pruebas cuantitativas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios
de aceptación.

EXACTITUD

La exactitud de un procedimiento analítico de RMN cuantitativo se debe determinar a través del intervalo analítico requeri-
do. Por lo general, se evalúan tres niveles de concentración usando preparaciones por triplicado en cada nivel.
Para valoraciones de fármacos (Categoría 1), la exactitud se puede determinar analizando un estándar de referencia de pure-
za conocida. Para productos farmacéuticos (Categoría 1), se debe usar una muestra compuesta de estándar de referencia y de
otros componentes de un producto farmacéutico terminado para la validación del procedimiento analítico. Los resultados de
la valoración se comparan con el valor teórico del estándar de referencia para estimar errores o recuperación porcentual. Para
la cuantificación de impurezas (Categoría 11), la exactitud del procedimiento analítico se puede determinar mediante estudios
con fármacos o productos con cantidades agregadas y concentraciones conocidas del analito en análisis. También resulta
aceptable comparar los resultados de valoración del procedimiento analítico que se está validando con los de un procedimien-
to analítico alternativo ya establecido.
Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación para fármacos, 96,0%-105,0% de recuperación para valoración
de productos farmacéuticos terminados preparados magistralmente y 80,0%-120,0% de recuperación para los análisis cuanti-
tativos de impurezas. Estos criterios deben cumplirse durante todo el intervalo pretendido.

PRECISIÓN

Repetibilidad: El procedimiento analítico debe ser evaluado midiendo las concentraciones de seis soluciones estándar dis-
tintas al 100% de la concentración de prueba. Se debe evaluar el cumplimiento de la desviación estándar relativa de las deter-
minaciones repetidas con los criterios de aceptación. Como alternativa, es posible medir las concentraciones de tres determi-
naciones repetidas de tres soluciones muestra distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo sufi-
cientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentración. Si esto se lleva a cabo, se
combina la repetibilidad de las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptación.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para fármacos, no más de 2,0% para produc-
tos farmacéuticos terminados preparados magistralmente y no más de 20,0% para los análisis cuantitativos de impurezas.
Precisión intermedia: Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del proce-
dimiento analítico. Las variables típicas incluyen llevar a cabo el análisis en diferentes días usando diferentes instrumentos que
sean adecuados de acuerdo con lo especificado en el método analítico y/o que dos o más analistas realicen el procedimiento
analítico. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos ofrece-
rán una estimación de la precisión intermedia.
USP 37 Pruebas Fisicas / (761 > Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 487

Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para fármacos, no más de 3,0% para produc-
tos farmacéuticos terminados preparados magistralmente y no más de 25,0% para análisis cuantitativos de impurezas.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (QL, POR SUS SIGLAS EN INGL~S)

El límite de cuantificación se puede validar midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de prueba con cantidades
agregadas conocidas de analito al 50% de la especificación.
A partir de estas determinaciones repetidas es posible determinar la exactitud y la precisión. Algunos ejemplos de especifica-
ciones para las determinaciones cuantitativas de Categoría 11 son que la concentración medida está dentro del 70,0%-1 30,0%
de la concentración agregada conocida y la desviación estándar relativa es no más de 15%.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medición analítica se debe demostrar mediante cambios deliberados en parámetros experimentales
críticos. Esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, retraso
entre pulsos con una ligera variación, temperatura de la sonda y posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La
robustez es necesaria para los métodos cuantitativos de Categoría 1y Categoría 11.

Verificación de Procedimientos Analíticos

Los reglamentos de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de los EE.UU. [Título 21 del CFR 211. l 94(a)(2)] indican que
los usuarios de procedimientos analíticos descritos en los compendios USP-NF no requieren validar dichos procedimientos
cuando se proporcionen en una monografía, sino que simplemente deben verificar su aptitud ante condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificación de un procedimiento de RMN es demostrar que éste, conforme a lo descrito en una monografía
específica, puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisión adecuadas usando los instrumentos,
analistas y matrices de muestras disponibles. De acuerdo con el capítulo de información general (1226) Verificación de Procedi-
mientos Farmacopeicos, cuando falla la verificación del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografía, el procedimiento
podría no ser adecuado para su uso con el artículo de prueba. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alter-
nativo según lo permitido por las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificación de un procedimiento de RMN farmacopeico debe como mínimo incluir la ejecución de los parámetros de
validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se indica en esta
sección.

GLOSARIO

Estándar interno: Un estándar interno (IS, por sus siglas en inglés) es una sustancia que se agrega a una solución muestra
en una concentración conocida. Se debe seleccionar un estándar interno que presente al menos una resonancia de RMN
que no se superponga con las del analito. El cociente entre las áreas de los picos de un estándar interno específico y un
analito se usa para determinar la concentración del analito. Se debe conocer el número de núcleos correspondiente a los
picos integrados en el estándar interno y los espectros de analito.
Referencia de RMN: Una referencia de RMN, también conocida como referencia de desplazamiento de RMN, es una sus-
tancia agregada a una muestra y a partir de la cual se establece el desplazamiento químico para la escala f3. Los ejemplos
comunes de análisis de protones y de carbono por RMN incluyen tetrametilsilano (TMS) para su uso en disolventes orgá-
nicos y la sal sódica del ácido 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sulfónico (DSS) o 3-trimetilsililpropionato de sodio (TMSP) para
su uso en medios acuosos. En ambos casos, el desplazamiento químico de los picos de metilo se define como 0,0 ppm.
Estándar de referencia: Un estándar de referencia es una sustancia cuya estructura química específica se confirma por
medios experimentales. En la espectroscopía de RMN, un estándar de referencia generalmente se usa para los análisis cua-
litativos de un material de prueba. La estructura se puede confirmar al comparar directamente los desplazamientos quími-
cos y las multiplicidades de los picos en el espectro de RMN del material de prueba contra el espectro del estándar de
referencia adquirido en condiciones experimentales comparables.
488 (771) Ungüentos Oftálmicos / Pruebas Físicas USP 37

(771) UNGÜENTOS OFTÁLMICOS

Sustancias Agregadas-En los ungüentos oftálmicos se pueden agregar sustancias apropiadas para aumentar su estabili-
dad o utilidad, siempre que sean inocuas en las cantidades administradas y no interfieran con la eficacia terapéutica o con las
respuestas a las valoraciones y pruebas especificadas, a menos que se prohíba su uso en la monografía individual correspon-
diente. En un artículo destinado a uso oftálmico no pueden agregarse agentes colorantes con el único fin de colorear el pro-
ducto terminado (ver también Sustancias Agregadas en Advertencias Generales y en Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )).
En los ungüentos oftálmicos que se presentan en envases de más de una dosis debe agregarse una sustancia o una mezcla
de sustancias apropiadas para impedir el crecimiento de microorganismos, independientemente del método de esterilización
empleado, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual correspondiente o a menos que la fórmula por sí
misma sea bacteriostática. Tales sustancias se emplean en concentraciones que matan o impiden el crecimiento de microorga-
nismos en los ungüentos oftálmicos (ver también Prueba de Eficacia Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido
(341 )). Aunque se empleen tales sustancias, se utilizan procesos de esterilización para el ungüento terminado o para todos los
ingredientes si el ungüento se fabrica bajo estrictas condiciones asépticas (ver también Preparaciones Parenterales y Tópicas en
la sección Sustancias Agregadas, en Advertencias Generales, y Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
(1211 )). Los ungüentos oftálmicos que se presentan en envases de una sola dosis no requieren el agregado de agentes anti-
bacterianos; sin embargo, estos ungüentos deben cumplir con los requisitos de las Pruebas de Esterilidad (71 ).
Envases-Los envases para ungüentos oftálmicos, incluidos los cierres, no producen ninguna interacción física o química
con la preparación que pueda alterar la potencia, calidad o pureza más allá de los requisitos oficiales bajo las condiciones nor-
males de manipulación, distribución, almacenamiento, venta y uso.
Partículas Metálicas-Seguir el Procedimiento establecido en Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos (751 ).
Pérdida-Seleccionar 1 O tubos del Ungüento, con sus respectivos sellos aplicados cuando así se especifique. Limpiar y secar
minuciosamente las superficies externas de cada tubo con un paño absorbente. Colocar los tubos en posición horizontal sobre
una hoja de papel secante absorbente en un horno mantenido a una temperatura de 60 ± 3º durante 8 horas. No se produce
ninguna pérdida significativa durante la prueba o al finalizar la misma (no considerar trazas del ungüento cuando se supone
que se originan en forma externa desde el sello plegado del tubo o la rosca de la tapa). Si se observan pérdidas en uno de los
tubos, pero no en más de uno, repetir la prueba con 20 tubos adicionales del Ungüento. El requisito se cumple si no se obser-
va ninguna pérdida en los primeros 1 O tubos probados, o si se observan pérdidas en no más de uno de los 30 tubos probados.

(776) MICROSCOPÍA ÓPTICA

La microscopía óptica para la caracterización de partículas por lo general es una técnica adecuada para partículas con un
tamaño de 1 µm o mayor. El límite inferior está determinado por la resolución del microscopio. El límite superior es menos
estricto y está determinado por las dificultades que presenta para caracterizar partículas de mayor tamaño. Además de la mi-
croscopía óptica, existen diversas técnicas alternativas para la caracterización de partículas. La microscopía óptica es una técni-
ca sumamente recomendable para caracterizar partículas que no son esféricas, método que también puede constituir la base
de otros métodos de calibración más rutinarios y más rápidos.
Aparato-Emplear un microscopio estable y protegido de vibraciones. Es necesario que el aumento del microscopio (resul-
tado del aumento del objetivo, ocular y de otros componentes adicionales) sea suficiente para caracterizar adecuadamente
hasta la partícula más pequeña de la muestra en análisis. Buscar para cada intervalo de aumento, el mayor valor de apertura
numérica del objetivo. En algunos casos, se recomienda usar los filtros polarizadores con analizadores y placas de retardo ade-
cuadas. Con objetivos acromáticos se recomienda emplear un filtro cromático de poca transmisión espectral, de preferencia
apocromáticos, y son necesarios para obtener los colores que correspondan en la microfotografía. Con la lámpara y los acceso-
rios colocados debajo de la platina del microscopio se deben emplear condensadores corregidos al menos por aberración esfé-
rica. La apertura real del diafragma del condensador y la presencia de aceites de inmersión afectan la apertura numérica del
condensador de los accesorios ubicados por debajo de la platina y es necesario que ésta coincida con la del objetivo en las
condiciones de uso.
Ajuste-Es de suma importancia que todos los elementos del sistema óptico estén alineados con precisión y que el enfoque
sea el adecuado. Enfocar los elementos según las recomendaciones del fabricante del microscopio. Se recomienda alinear el eje
con precisión.
Iluminación-Para que la iluminación sea adecuada, es necesario que la intensidad de la luz sea uniforme y regulable en
todo el campo visual. Se recomienda emplear la iluminación de Kohler. Si se trabaja con partículas coloreadas, elegir el color
de los filtros para controlar el contraste y el detalle de la imagen.
Caracterización Visual-Es necesario que el aumento y la apertura numérica sean suficientes para permitir la correcta reso-
lución de las imágenes de las partículas a caracterizar. Determinar el aumento real con un micrómetro de objetivo calibrado
para ajustar un micrómetro ocular. Una forma de reducir los errores al mínimo es trabajar con un aumento suficiente para que
USP 37 Pruebas Físicas/ (776) Microscopía Óptica 489

la imagen de la partícula sea de al menos 1O divisiones del ocular. Calibrar cada objetivo por separado. Para calibrar la escala
del ocular, verificar que la escala del micrómetro del objetivo y la escala del ocular estén alineadas. De esta forma, se puede
determinar con precisión la distancia entre las divisiones del ocular del portaobjeto. En algunos casos, es necesario emplear
distintos aumentos para caracterizar materiales con una amplia distribución de tamaños.
Caracterización Fotográfica-Si se emplean métodos fotográficos para determinar el tamaño de las partículas, tomar las
precauciones necesarias para que el objetivo esté bien enfocado en el plano de la emulsión fotográfica. Fotografiar un micró-
metro de objetivo calibrado con una película fotográfica de velocidad, resolución y contraste adecuados para determinar el
aumento real. La exposición y el procesamiento deben ser idénticos para las fotografías de la muestra de prueba y para la de-
terminación del aumento. Tanto la resolución del microscopio como la exposición y los procesos de revelado e impresión influ-
yen en el tamaño aparente de la imagen fotográfica.
Preparación del Medio de Montaje-El medio de montaje se selecciona según las propiedades físicas de la muestra de
prueba. Para ver los detalles de los bordes de la muestra, es necesario un contraste adecuado, aunque no excesivo, entre la
muestra y el medio de montaje. Para distinguir las partículas individuales en estudio, es necesario que estén dispuestas en un
mismo plano y con la dispersión adecuada. Además, es necesario que las partículas sean representativas de la distribución del
tamaño de las partículas y que no sufran ninguna alteración durante la preparación del medio de montaje. Tomar las precau-
ciones necesarias para que se cumpla este importante requisito. Para seleccionar el medio de montaje adecuado, considerar la
solubilidad del analito.
Caracterización de la Cristalinidad-Si la monografía individual de un fármaco indica caracterizar la cristalinidad, se pue-
de determinar por microscopía óptica. Montar algunas partículas de la muestra en aceite mineral y colocar el preparado sobre
un portaobjetos de vidrio limpio, a menos que la monografía individual especifique algo diferente. Analizar el preparado con
un microscopio de luz polarizada: al girar la platina del microscopio, las partículas presentan birrefringencia (interferencia de
colores) y posiciones de extinción.
Prueba de Límite del Tamaño de Partículas por Microscopía-Pesar una cantidad adecuada del polvo a analizar (entre
1Omgy100 mg, por ejemplo) y suspenderla en 1O mL de un medio adecuado, en el que el polvo no se disuelva y agregar, si
fuera necesario, un agente humectante. Suspender las partículas en un medio de densidad igual o similar y agitar para mante-
ner la homogeneidad de la suspensión de partículas. Introducir una porción de la suspensión homogénea en una celda de con-
teo adecuada, observar en un área del microscopio que corresponda a no menos de 1O µg del polvo a analizar. Contar las
partículas cuya dimensión máxima supera el límite de tamaño indicado. El límite de tamaño y el número máximo de partículas
que exceden el límite se definen para cada sustancia.
Caracterización del Tamaño de Partículas-La complejidad de la medición del tamaño de las partículas varía según la
forma de la partícula, y el número de partículas caracterizadas debe ser suficiente para garantizar un grado de incertidumbre
aceptable en los parámetros de medición. La norma ISO 9276, por ejemplo, proporciona información adicional sobre la medi-
ción del tamaño de las partículas, tamaño de la muestra y análisis de los datos. Si se trata de partículas esféricas, el tamaño está
definido por el diámetro. Si se trata de partículas irregulares, hay distintas definiciones del tamaño de partícula. En general,
para partículas de forma irregular, la caracterización del tamaño debe incluir información sobre el tipo de diámetro medido y
sobre la forma de la partícula. A continuación se describen varias medidas usadas comúnmente para el tamaño de partículas
(ver la Figura 7):

\ Diámetro de Feret

Diámetro de Martín
Diámetro del área proyectada
Intercepción máxima horizontal

Figura 1: Medidas comúnmente usadas para el tamaño de partículas.

Diámetro de Feret-La distancia entre líneas paralelas imaginarias tangentes a una partícula orientada de forma aleatoria y
perpendicular a la escala del ocular.
 1

490 (776) Microscopía Óptica / Pruebas Físicas USP 37

Diámetro de Martín-El diámetro de la partícula en el punto en el que divide una partícula orientada de forma aleatoria en
dos áreas proyectadas iguales.
Diámetro del Área Proyectada-El diámetro de un círculo cuya área proyectada es la misma que la de la partícula.
Longitud-La medida más larga tomada de extremo a extremo de la partícula orientada en paralelo a la escala del ocular.
Ancho-La medida más larga de la partícula tomada en ángulo recto a la longitud.
Caracterización de la Forma de la Partícula-Si se trata de partículas de forma irregular, la caracterización del tamaño
debe incluir información sobre la forma de la partícula. Verificar la homogeneidad del polvo usando el aumento que corres-
ponda. A continuación se describen algunos de los descriptores usados comúnmente para la forma de la partícula (ver la Figura
2):

0---Ll
Cubos o Esferas
/}-~~
Escama

12 ~
Placa

Columnar

Figura 2: Medidas usadas comúnmente para la forma de la partícula.

Acicular-Partícula fina, en forma de aguja, de ancho y espesor similares.

Columnar-Partícula larga y fina, de ancho y espesor superiores a los de una partícula acicular.
Escama-Partícula fina y plana, de longitud y ancho similares.
Placa-Partículas planas de longitud y ancho similares pero de mayor espesor que las escamas.
Listón-Partícula larga y fina en forma de hoja.
Cubos o esferas-Partículas cúbicas o esféricas, de largo, ancho y espesor de dimensiones similares.
Consideraciones Generales-La partícula se considera, en general, la unidad discreta más pequeña. Una partícula puede
estar en estado de gotita líquida o semisólida, un cristal único o policristalina, en estado amorfo o como aglomerado. En algu-
nos casos, las partículas están asociadas. El grado de asociación se puede describir en los siguientes términos:
Laminar-Placas superpuestas.
Agregado-Masa de partículas adheridas.
Aglomerado-Partículas amalgamadas o cementadas.
Conglomerado-Mezcla de dos o más tipos de partículas.
Esferulita-Grupo con estructura radial.
Drusa-Partícula recubierta de pequeñísimas partículas.
La partícula se puede describir en los siguientes términos:
Bordes-Angulares, redondeados, lisos, filosos o fragmentados.
Óptico-Color (usando filtros de compensación del color apropiados), transparente, translúcida, opaca.
Defectos-Oclusiones, inclusiones.
Las características de la superficie se pueden describir en los siguientes términos:
Resquebrajada-División parcial, rotura o fisura.
Lisa-Sin irregularidades, proyecciones ni áreas rugosas.
Porosa-Con orificios o canales.
Áspera-No lisa, con protuberancias o dispareja.
Punteada-Con pequeñas hendiduras.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (781) Rotación Óptica 491

(781) ROTACIÓN ÓPTICA

Muchas sustancias farmacéuticas son ópticamente activas dado que rotan el plano incidente de la luz polarizada de manera
que la luz transmitida surge en un ángulo cuantificable con respecto al plano de la luz incidente. Esta propiedad es característi-
ca de algunos cristales y de muchos líquidos o soluciones de sólidos de uso farmacéutico. En aquellos casos en que un líquido
o un soluto en solución posea esta propiedad, por lo general se debe a la presencia de uno o varios centros asimétricos, nor-
malmente un átomo de carbono con cuatro sustituyentes diferentes. El número de isómeros ópticos es 2n, en donde n es el
número de centros asimétricos. La polarimetría, medición de la rotación óptica de un artículo farmacéutico, puede ser el único
medio conveniente para distinguir entre sí isómeros ópticamente activos y, por lo tanto, es un criterio importante de identidad
y pureza.
Las sustancias que poseen la capacidad de mostrar poder rotatorio óptico son sustancias quira/es. Aquéllas que rotan la luz
en el sentido de las agujas del reloj, observando hacia la fuente de iluminación, son dextrógiras, o isómeros ópticos ( t ). Las que
rotan la luz en la dirección opuesta se llaman levógiras o isómeros ópticos(-). (Los símbolos d- y/- que anteriormente se usa-
ban para indicar isómeros dextro- y levógiros ya no se utilizan, debido a la confusión con los símbolos D- y L-, que se refieren a
las configuraciones relacionadas con el D-gliceraldehído. Los símbolos R y S así como a y f3 también se emplean para indicar la
configuración, es decir, el ordenamiento de los átomos o grupos de átomos en el espacio.)
Las propiedades físicoquímicas de las sustancias quirales no superponibles que rotan el plano de la luz polarizada la misma
cantidad de grados pero en direcciones opuestas, llamadas enantiómeros, son idénticas, salvo por esta propiedad y por sus
reacciones con otras sustancias quirales. Los enantiómeros presentan a menudo diferencias profundas en sus características far-
macológicas y toxicológicas, debido al hecho de que los receptores biológicos y las enzimas son quirales. Muchos artículos de
origen natural, como por ejemplo los aminoácidos, las proteínas, los alcaloides, los antibióticos, los glicósidos y los azúcares,
existen como compuestos quirales. La síntesis de estos compuestos a partir de materiales no quirales da lugar a números igua-
les de enantiómeros, los racematos. Los racematos tienen una rotación óptica neta nula y sus propiedades físicas pueden diferir
de las de los enantiómeros que los componen. Para obtener los isómeros ópticos individuales pueden emplearse métodos de
síntesis estereoselectivos o estereoespecíficos o de separación de mezclas racémicas.
La medición de la rotación óptica se realiza empleando un polarímetro.* La ecuación general usada en polarimetría es:

en donde [a] es la rotación específica a la longitud de onda A., tes la temperatura, a es la rotación observada en grados (º), I es
el paso de la celda en decímetros y e es la concentración del analito en g por 100 ml. Por lo tanto, [a] es 100 veces el valor
medido, en grados (º), para una solución que contiene 1 g en 1 00 mL, medido en una celda con un paso de 1,0 decímetro en
determinadas condiciones de longitud de onda de luz incidente y temperatura. Para algunos artículos Farmacopeicos, especial-
mente los líquidos, tales como los aceites esenciales, el requisito de rotación óptica se expresa en función de la rotación obser-
vada, medida en las condiciones definidas en la monografía correspondiente.
Históricamente, la polarimetría se realizaba empleando un instrumento en el cual se estimaba el grado de rotación óptica al
igualar visualmente la intensidad de los campos divididos. Por este motivo, se empleaba con mayor frecuencia la línea D de la
lámpara de sodio a la longitud de onda de 589 nm en el espectro visible. La rotación específica determinada en la línea D se
expresa con el símbolo:

y gran parte de los datos disponibles se expresan de esta forma. El empleo de longitudes de onda menores, como por ejemplo
las obtenibles con las líneas de la lámpara de mercurio, aisladas a través de filtros de máxima transmitancia, aproximadamente
a 578, 546, 436, 405 y 365 nm en un polarímetro fotoeléctrico, ha demostrado proporcionar ventajas en sensibilidad con una
reducción consiguiente de la concentración del compuesto de prueba. En general, la rotación óptica observada a 436 nm es
aproximadamente el doble y a 365 nm aproximadamente tres veces la observada a 589 nm. La reducción de la concentración
del soluto requerida para la medición a veces puede lograrse mediante la conversión de la sustancia en análisis en una sustan-
cia que tenga una rotación óptica significativamente mayor. La rotación óptica también resulta afectada por el disolvente em-
pleado para la medición y esto debe especificarse en todos los casos.
En la actualidad, es práctica común emplear otras fuentes de luz, tales como lámparas de xenón o halógenas de tungsteno,
con filtros apropiados, puesto que éstas pueden ser menos costosas, además de ser de larga duración y tener un amplio rango
de longitudes de onda de emisión con respecto a las fuentes de luz tradicionales.

*Pueden encontrarse calibradores adecuados disponibles a través de la Otfice of Standard Reference Materials, National lnstitute of Standards and Technology,
NIST (Oficina de Materiales de Referencia Estándar, Instituto Nacional de Normas y Tecnología), Gaithersburg, MD 20899, al igual que lotes vigentes de Materiales
de Referencia Estándar, Dextrosa y Sacarosa. Como alternativa, la calibración puede controlarse empleando un Estándar de Referencia de Polarización, que consiste
de una placa de cuarzo montada sobre un soporte perpendicular al paso de la luz. Estos estándares, normalizados respecto a estándares del NIST, se encuentran
disponibles a través de Rudolph Research Analytical, 354 Route 206, Flanders, NJ 07836, o Rudolph lnstruments, lnc., 40 Pier Lane, Fairfield, NJ 07004-211 3.
492 (781) Rotación Óptica/ Pruebas Físicas USP 37

Rotación Específica-La referencia Rotación Específica (781 S) en una monografía significa que esa rotación específica se cal-
culará a partir de las rotaciones ópticas observadas en la Solución de prueba o Solución muestra, obtenidas según se indica en
ese mismo texto. A menos que se indique de otro modo, las mediciones de rotación óptica se realizan a 589 nm y a 25º.
Cuando se emplea un polarímetro fotoeléctrico, se hace una sola medición corregida por el blanco de disolvente. Cuando se
emplea un polarímetro visual, se utiliza el promedio de no menos de cinco determinaciones, corregidas por la lectura del mis-
mo tubo con un blanco de disolvente. La temperatura, que se aplica a la solución o al líquido en análisis, debe mantenerse con
una aproximación de 0,5º del valor establecido. Emplear la misma celda para la muestra y el blanco. Mantener la misma orien-
tación angular de la celda en cada lectura. Colocar la celda de tal manera que la luz la atraviese en la misma dirección cada
vez. La rotación específica, a menos que se especifique algo diferente, se calcula con respecto a la sustancia seca cuando se
especifica Pérdida por Secado en la monografía correspondiente o con respecto a la sustancia anhidra cuando se especifica
Agua.
La rotación óptica de las soluciones se debe determinar dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación. En el caso de
sustancias que puedan sufrir racemización o mutarotación, se deben tomar precauciones para estandarizar el tiempo entre la
adición del soluto al disolvente y la introducción de la solución en el tubo del polarímetro.
Rotación Angular-A menos que se indique de otro modo, la referencia Rotación Angular (781 A) en una monografía signifi-
ca que la rotación óptica del líquido límpido se mide en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25º, corregida por la lectura del tubo
vacío y seco.

(785) OSMOLALIDAD Y OSMOLARIDAD

INTRODUCCIÓN
La presión osmótica tiene una importancia fundamental en todos los procesos biológicos donde hay difusión de solutos o
transferencia de líquidos a través de membranas. La ósmosis sucede cuando un disolvente, pero no las moléculas de soluto,
pasa a través de una membrana semipermeable desde regiones de menor a mayor concentración para llegar al equilibrio. Es
muy importante para los profesionales conocer las presiones osmóticas para poder determinar si una solución parenteral es
hipoosmótica, isoosmótica o hiperosmótica. Una medición cuantitativa de la presión osmótica facilita la dilución requerida pa-
ra producir una solución isoosmótica con respecto a la sangre entera.

PRESIÓN OSMÓTICA
La presión osmótica de una solución depende del número de partículas en la solución y, por lo tanto, se la considera como
una propiedad coligativa. Una partícula puede ser una molécula o un ión o una especie agregada (por ejemplo, un dímero)
que puede existir en forma diferenciada en solución. Una solución presenta un comportamiento ideal cuando no hay interac-
ción entre los solutos y el disolvente, excepto cuando las moléculas del disolvente están unidas a los solutos mediante enlaces
de hidrógeno o enlaces covalentes coordinados. En el caso de tales soluciones que contienen un soluto no disociado, la pre-
sión osmótica (n) es directamente proporcional a su molalidad (el número de moles de soluto por kilogramo de disolvente):
n = (pRT/l OOO)m

en donde pes la densidad del disolvente a la temperatura T (en la escala absoluta); Res la constante universal del gases; y mes
la molalidad de la solución. Para el caso de una solución real que contiene más de un soluto, la presión osmótica se calcula por
la fórmula:

en donde v; es el número de partículas formadas por la disociación de una molécula del iésimo soluto (el número ordinal del
soluto); v; = 1 para solutos no iónicos (que no se disocian); m; es la molalidad del iésimo soluto (el número ordinal del soluto); y
<Dm,i es el coeficiente osmótico molal del iésimo soluto. El coeficiente osmótico molal tiene en cuenta la desviación de una solu-
ción con respecto al comportamiento ideal. Su valor depende de la concentración del soluto o los solutos en la solución, de
sus propiedades químicas y de sus características iónicas. El valor del coeficiente osmótico molal de un soluto se puede deter-
minar experimentalmente midiendo el descenso del punto de congelación a diferentes concentraciones molales. A concentra-
ciones de interés farmacéutico, el valor del coeficiente osmótico molal es menos de uno. El coeficiente osmótico molal dismi-
nuye al aumentar la concentración del soluto (Tabla 7).

OSMOLALIDAD
La osmolalidad de una solución Sm se representa mediante la fórmula
 USP 37 Pruebas Físicas/ (785> Osmolalidad y Osmolaridad 493

La osmolalidad de una solución real se corresponde con la molalidad de la solución ideal que contiene solutos que no se diso-
cian y se expresa en osmoles o miliosmoles por kilogramo de disolvente (Osmol por kg o mOsmol por kg, respectivamente),
una unidad que es similar a la molalidad de una solución. Así, la osmolalidad es la medida de la presión osmótica ejercida por
una solución real a cada lado de una membrana semipermeable. Al igual que la presión osmótica, otras propiedades coligati-
vas de la solución, tales como la disminución de la presión de vapor, la elevación del punto de ebullición y el descenso del
punto de congelación, también están directamente relacionadas con la osmolalidad de la solución. Así, la osmolalidad de una
solución se determina típicamente con la mayor exactitud y conveniencia midiendo el descenso del punto de congelación
(!'> Tr):
!'>TI= k¡E.,m

en donde k1 es la constante crioscópica molal, que es una propiedad del disolvente. Para el agua, el valor de k1 es 1,860º por
Osmol. Es decir, 1 Osmol de un soluto agregado a 1 kg de agua hace descender el punto de congelación en 1,860º.

OSMOLARIDAD

La osmolaridad de una solución es una cantidad teórica expresada en osmoles por L (Osmol por L) de una solución y se usa
ampliamente en la práctica clínica porque expresa los osmoles en función del volumen. La osmolaridad no se puede medir
pero se calcula teóricamente a partir del valor de osmolalidad medido experimentalmente.
A veces, la osmolaridad (sJ se calcula teóricamente a partir de las concentraciones molares:

en donde v1 es la que se define anteriormente y c1 es la concentración molar del iésimo soluto (el número ordinal del soluto) en
solución. Por ejemplo, la osmolaridad de una solución que se prepara disolviendo 1 g de vancomicina en 100 mL de solución
de cloruro de sodio al 0,9% se puede calcular de la siguiente manera:

[3 x 1Og/L/l449,25(peso mol. de vancomicina) + 2 x 9 g/L/58,44(peso mol. de cloruro de sodio)] x 1000 = 329 mOsmol/L

El resultado sugiere que la solución es ligeramente hiperosmótica dado que la osmolalidad de la sangre está entre 285 y 31 O
mOsmol por kg. Sin embargo, la solución ha resultado ser hipoosmótica y tiene una osmolalidad determinada experimental-
mente de 255 mOsmol por kg. 1 El ejemplo ilustra que los valores de osmolaridad calculados teóricamente a partir de la con-
centración de una solución se deben interpretar con cautela y este valor puede no representar las propiedades osmóticas de las
soluciones de infusión.
La discrepancia entre los resultados teóricos (osmolaridad) y los experimentales (osmolalidad) se debe, en parte, al hecho de
que la presión osmótica está relacionada con la osmolalidad y no con la osmolaridad. Más significativamente, la discrepancia
entre los resultados experimentales y los cálculos teóricos se debe a que la presión osmótica de una solución real es menor que
la de una solución ideal debido a las interacciones entre las moléculas del soluto o entre las moléculas del soluto y del disolven-
te en una solución. Estas interacciones reducen la presión que ejercen las moléculas del soluto sobre la membrana semiper-
meable, lo que reduce los valores experimentales de la osmolalidad en comparación con los valores teóricos. Esta diferencia
está relacionada con el coeficiente osmótico mol al (<Dm;). El ejemplo también ilustra la importancia de determinar experimen-
talmente la osmolalidad de una solución, en vez de cai'cular el valor teóricamente.

MEDICIÓN DE LA OSMOLALIDAD

Normalmente, el valor de osmolalidad de una solución se determina midiendo el descenso del punto de congelación de una
solución.
Aparato-El aparato, un osmómetro para medir el descenso del punto de congelación, consiste en lo siguiente: un medio
para enfriar el recipiente utilizado para la medición; un resistor sensible a la temperatura (termistor), con un dispositivo ade-
cuado para medir la diferencia de potencial o de corriente y que puede graduarse en función de cambios de temperatura o en
osmolalidad; y un mecanismo para mezclar la muestra.
Los osmómetros que miden la presión de vapor de las soluciones se emplean con menor frecuencia. Requieren un volumen
de muestra más pequeño (generalmente aproximadamente 5 µL), aunque la exactitud y precisión de los resultados de las de-
terminaciones de osmolalidad son comparables a las obtenidas mediante el uso de osmómetros que dependen de la observa-
ción del punto de congelación de las soluciones.
Soluciones Estándar-Preparar las Soluciones Estándar como se indica en la Tabla 7, según sea necesario. 2

1 Kastango, E.S. y Hadaway, L. lnternotionol journol of Phormoceuticol Compounding 5, (2001) 465-469.

7 Se pueden usar soluciones comercialmente disponibles para calibración de osmómetros, con osmolalidades iguales o diferentes a las que se listan en la Tablo 1 y
estandarizadas con métodos rastreables al NIST.
494 (785) Osmolalidad y Osmolaridad / Pruebas Físicas USP 37

_ _ _ _ _ _ _ Tabla 1. So~uci~nes E5!~11~ar para Calibración del Osmómetro* _ _ _ _ __

Soluciones Estándar Osmolalidad Coeficiente Descenso del
(Peso en g de cloruro de sodio (mOsmol/kg) Osmótico Molal Punto de Congelación (')
por kg de agua) <~~> 0b ) \ T,

3,087 100 0,9463 O, 186

6,260 200 0,9337 0,372
9,463 300 0,9264 0,558
12,684 400 0,9215 0,744
15,916 500 0,9180 0,930
19, 147 600 0,9157 1,116
22,380 700 0,9140 1,302
• Addplado de la hmnarnpeo turopea, 4a td1uon, 2002, pg. 50.

Solución de Prueba-En el caso de un sólido para inyección, reconstituir con el diluyente apropiado según se indica en las
instrucciones del etiquetado. En el caso de soluciones, usar la muestra tal como se encuentra. [NOTA-Se puede diluir una solu-
ción para que quede dentro del intervalo de medición del osmómetro, si fuera necesario, pero el resultado se deberá expresar
como el resultado de la solución diluida y NO se debe multiplicar por un factor de dilución para calcular la osmolalidad de la
solución original, a menos que se especifique algo diferente en la monografía. El coeficiente osmótico molal es una función de
la concentración. Por lo tanto, cambia con la dilución.]
Procedimiento-Primero, calibrar el instrumento según las instrucciones del fabricante. Confirmar la calibración del instru-
mento con, por lo menos, una solución de la Tabla 7 de manera que la osmolalidad de la Solución Estándar se encuentre den-
tro de 50 müsmol/kg del valor esperado de la Solución de Prueba o en el centro del intervalo esperado de osmolalidad de la
Solución de Prueba. La lectura del instrumento debe estar dentro de ±4 mOsmol por kg de la Solución Estándar. Introducir un
volumen adecuado de cada Solución Estándar en la celda de medición conforme a las instrucciones del fabricante y poner en
marcha el sistema de enfriamiento. En general, el dispositivo de mezcla se programa para que opere a una temperatura inferior
a la temperatura más baja esperada de descenso del punto de congelación. El aparato indica cuando se ha logrado el equili-
brio. Si fuera necesario, calibrar el osmómetro utilizando un dispositivo de ajuste adecuado de modo que la lectura correspon-
da a la osmolalidad o al valor de descenso del punto de congelación de la Solución Estándar que aparece en la Tabla 7. [NOTA-
Si la lectura del instrumento indica el descenso del punto de congelación, la osmolalidad se puede derivar usando la fórmula
apropiada en Osmolalidad.] Repetir el procedimiento con cada Solución de Prueba. Leer la osmolalidad de la Solución de Prueba
directamente o calcularla a partir del valor obtenido para el descenso del punto de congelación.
Suponiendo que el valor del coeficiente osmótico es esencialmente el mismo ya sea que la concentración se exprese en mo-
lalidad o molaridad, la osmolalidad de una solución determinada experimentalmente se puede convertir en osmolaridad de la
misma manera que la concentración de una solución se convierte de molalidad a molaridad. A menos que una solución esté
muy concentrada, la osmolaridad de una solución (s,) se puede calcular a partir de su osmolalidad determinada experimental-
mente Csm):

s, = 1OOOsm / (1 000 / p + 2:w;v;)

donde w, es el peso en g; y v; es el volumen específico parcial, en mL por g, del iésimo soluto (el número ordinal del soluto). El
volumen específico parcial de un soluto es el cambio en volumen de una solución cuando se disuelve 1 g adicional de soluto
en la solución. Este volumen se puede determinar midiendo las densidades de la solución antes y después de agregar el soluto.
Los volúmenes específicos parciales de las sales son generalmente muy pequeños, alrededor de O, 1 mL por g. Sin embargo, los
otros solutos son generalmente mayores. Por ejemplo, los volúmenes específicos parciales de los aminoácidos están entre
0,6 mL y 0,9 mL por g. Se puede demostrar por la ecuación anterior que correlaciona la osmolaridad con la osmolalidad que,

S, = Sm (p- e)
donde pes la densidad de la solución y e es la concentración de soluto total, ambas expresadas en g por ml. Por lo tanto,
alternativamente, la osmolaridad puede calcularse también a partir de la osmolalidad determinada experimentalmente a partir
de la medición de la densidad de la solución mediante un método adecuado y el peso total del soluto, después de la correc-
ción por contenido de agua, disuelto por mL de la solución.
USP 37 Pruebas Físicas/ (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula 495

<786) ESTIMACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE

PARTÍCULA POR TAMIZADO ANALÍTICO

El tamizado es uno de los métodos más antiguos para clasificar los polvos y los gránulos según la distribución del tamaño de
partícula. El tamizado utilizando un lienzo tejido como tamiz, consiste básicamente en clasificar las partículas según su tamaño
intermedio (es decir, según su ancho o amplitud). Se recomienda el tamizado mecánico si la mayoría de las partículas superan
los 75 ~tm aproximadamente. Si se trata de partículas más pequeñas, durante el tamizado se observa que su escaso peso no
ejerce la fuerza suficiente para contrarrestar las fuerzas de adhesión y cohesión superficial, que hacen que las partículas se aglu-
tinen unas con otras y al tamiz. Por este motivo, las partículas que se esperaría que pasaran por el tamiz, en realidad no lo
hacen. Para este tipo de materiales se recomienda emplear otros métodos de agitación, como por ejemplo el tamizado con un
chorro de aire o el tamizado sónico. No obstante, el tamizado se puede emplear en algunos casos para algunos polvos o grá-
nulos cuya mediana de tamaño de partícula sea inferior a 75 ~tm, siempre que el método se pueda validar. En términos farma-
céuticos, el tamizado es el método de preferencia para clasificar polvos o gránulos sin mezclas más gruesos. El método es espe-
cialmente atractivo ya que tanto los polvos como los gránulos se clasifican solamente en función del tamaño de partícula y en
la mayoría de los casos el análisis se puede efectuar con el material seco.
Entre los factores limitantes que presenta el método se encuentran la necesidad de contar con una cantidad de muestra
apreciable (según sea la densidad del polvo o de los gránulos y el diámetro de los orificios del tamiz, generalmente como míni-
mo 25 g) y la dificultad que presentan polvos o gránulos oleosos o cohesivos que obstruyen los orificios del tamiz. En esencia,
el método estima el tamaño en dos dimensiones ya que el pasaje a través del orificio del tamiz a menudo presenta mayor
dependencia del ancho y del espesor máximos que del largo.
El método está destinado a estimar la distribución del tamaño de partícula total de un material sin mezclar. No está diseñado
para determinar la proporción de partículas que pasan o que se retienen por uno o dos tamices.
A menos que la monografía individual especifique algo diferente, estimar la distribución del tamaño de partícula según se
describe en Método de Tamizado en Seco. Si se presentan dificultades para alcanzar el punto final (es decir, el material no pasa
fácilmente por los tamices) o si fuera necesario emplear los tamices con los orificios más pequeños del intervalo de tamizado
(de menos de 75 µm), se debe evaluar si no sería conveniente emplear otro método para determinar el tamaño de partícula.
Se debe tamizar en condiciones tales que no generen ni pérdida ni aumento del contenido de humedad de la muestra. Con-
trolar la humedad relativa ambiente del lugar donde se efectúa el tamizado de forma de impedir que la muestra absorba o
pierda humedad. El tamizado analítico de prueba normalmente se realiza en condiciones de humedad ambiente salvo que hu-
biera pruebas que indicaran lo contrario. Cualquier condición especial aplicable al material en cuestión debe estar detallada en
la monografía individual.
Principios del Tamizado Analítico-Los tamices analíticos constan de una malla de alambre, de tejido simple, que se asu-
me deja aberturas casi cuadrangulares y que está sellada en la base de un recipiente cilíndrico abierto. El método analítico de
base consiste en apilar los tamices uno sobre el otro, encimándolos en orden ascendente de tamaño de orificio y luego colocar
el polvo de muestra en el tamiz superior.
Someter a agitación el grupo de tamices apilados durante un tiempo normalizado y luego determinar con exactitud el peso
del material retenido en cada tamiz. Por este método se calcula el porcentaje, en peso, del polvo retenido en cada uno de los
tamices utilizados.
El procedimiento para estimar la distribución del tamaño de partícula de un único polvo farmacéutico está diseñado, en ge-
neral, para trabajar con polvos en los que al menos el 80% de las partículas supera los 75 µm. El parámetro dimensional que se
emplea para determinar la distribución del tamaño de partícula por tamizado analítico es el largo de uno de los lados del orifi-
cio cuadrangular más pequeño a través del cual pasará la partícula.

TAMICES ANALÍTICOS

Los tamices analíticos adecuados para efectuar las pruebas farmacopeicas cumplen con las especificaciones contenidas en la
versión más actualizada de la Norma ISO 3310-1 de la Organización Internacional de Normalización: Tamices Analíticos-Re-
quisitos Técnicos y Pruebas (ver la Tabla 7). A menos que la monografía especifique algo diferente, emplear los tamices ISO
que se enumeran como tamaño principal en la Tabla 7. A menos que la monografía especifique algo diferente, emplear los
tamices ISO que figuran en la Tabla 7 según la recomendación indicada para ese tamiz.
Tabla 1. Tamaños de las Series de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés
Abertura Nominal ISO
Tamaños Tamices USP Tamiz Tamiz
Principales Tamaños Adicionales Tamiz No. Recomendados Europeo Japonés
R 20/3 R 20 R40/3 EE.UU. (micrones) No. No.
11,20 mm 11,20 mm 11,20 mm 11200
10,00 mm
 ~
\

496 (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula / Pruebas Físicas USP 37

Tabla 1. Tamaños de las Serles de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés (Continuación)
Abertura Nominal ISO
Tamaños
Tamices USP Tamiz Tamiz
Principales Tamaños Adicionales
Tamiz No. Recomendados Europeo Japonés
R 20/3 R20 R40/3 EE.UU. (micrones) No. No.
9,50 mm
9,00 mm
8,00 mm 8,00 mm 8,00 mm
7,lOmm
6,70 mm
6,30 mm
5,60 mm 5,60 mm 5,60 mm 5600 3,5
5,00 mm
4,75 mm 4
4,50 mm
4,00 mm 4,00 mm 4,00 mm 5 4000 4000 4,7
3,55 mm
3,35 mm 6 5,5
3,15 mm
2,80 mm 2,80 mm 2,80 mm 7 2800 2800 6,5
2,50 mm
2,36 mm 8 7,5
2,24 mm
2,00 mm 2,00 mm 2,00 mm 10 2000 2000 8,6
1,80mm
1,70 mm 12 10
l,60mm
1,40 mm 1,40mm 1,40 mm 14 1400 1400 12
1,25 mm
1,18mm 16 14
1,12mm
1,00 mm 1,00mm 1,00mm 18 1000 1000 16
900 µm
850 µm 20 18
800µm
710 µm 710 µm 710 µm 25 710 710 22
630 µm
600 µm 30 26
560 µm
500 µm 500 µm 500 µm 35 500 500 30
450 µm
425 µm 40 36
400µm
355 µm 355 µm 355 µm 45 355 355 42
315 µm
300 µm 50 50
280 µm
250 µm 250 µm 250 µm 60 250 250 60
224 µm
212 µm 70 70
200 µm
180µm 180 µm 180 µm 80 180 180 83
160 µm
150 µm 100 100
140µm
USP 37 Pruebas Físicas/ (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula 497

Tabla 1. Tamaños de las Serles de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés (Continuación)
Abertura Nominal ISO
Tamaños Tamices USP Tamiz Tamiz
Principales Tamaños Adicionales Tamiz No. Recomendados Europeo Japonés
R20/3 R 20 R40/3 EE.UU. (micrones} No. No.
125 µm 125 µm 125 ftm 120 125 125 119
112 µm
106 µm 140 140
100 µm
90 µm 90,im 90 µm 170 90 90 166
80,,m
75 µm 200 200
71 ftm
63 µm 63 µm 63 µm 230 63 63 235
56 µm
53 µm 270 282
50 µm
45 µm 45 µm 45 µm 325 45 45 330
40 µm
38 µm 38 391

Seleccionar los tamices de forma que todos los tamaños de partícula de la muestra de prueba estén comprendidos en el
intervalo. Se recomienda emplear un grupo de tamices encajados con una progresión de >12 del área de los orificios del tamiz.
Encajar los tamices de forma que la malla con orificios más grandes quede en el extremo superior y la que tenga los orificios
más pequeños en el extremo inferior. Clasificar los orificios del tamiz asignándoles un valor en micrómetros o en milímetros.
[NOTA-Los números de malla que figuran en la tabla se proporcionan exclusivamente para realizar conversiones.] Los tamices
analíticos son preferentemente de acero inoxidable o, en su defecto, de bronce o de otro alambre no reactivo adecuado.
Tanto la primera calibración del tamiz analítico como las subsiguientes se realizan según lo dispuesto en la versión más ac-
tualizada de la norma ISO 3310-1. Antes de emplear un tamiz, examinarlo cuidadosamente en busca de fracturas y distorsio-
nes considerables, sobre todo en las juntas de la malla y el cilindro. En algunos casos, se pueden emplear métodos ópticos para
calibrar el tamiz, estimando el tamaño promedio del orificio y la variabilidad que pudieran presentar los orificios de la malla.
Alternativamente también se pueden emplear Esferas de Vidrio Estándar para medir los orificios reales de los tamices analíticos
en el intervalo de 212 µm a 850 µm. A menos que la monografía individual especifique algo diferente, analizar el tamiz con
temperatura ambiente controlada y en condiciones de humedad relativa ambiente.
Limpieza de los Tamices Analíticos-En condiciones ideales se recomienda limpiar los tamices solamente con un chorro de
aire o con un chorro de líquido. Si después del chorro de líquido o de aire, todavía se observan orificios obstruidos por partícu-
las del material en estudio, emplear un cepillo como último recurso pasándolo suavemente y tomando las precauciones nece-
sarias para no dañar el tamiz.
Muestra de Prueba-Si la monografía del material en estudio no indica el peso de la muestra de prueba, emplear una
muestra de prueba de 25 g a 100 g, dependiendo de la densidad aparente, y tamices analíticos de 200 mm de diámetro. Para
tamices de 76 mm calcular la cantidad de material adecuada considerando que es aproximadamente 1/7 de la cantidad que
puede colocarse en un tamiz de 200 mm. Determinar el peso más apropiado. para un material dado, tamizando muestras de
distintos tamaños pesadas con exactitud, por ejemplo 25 g, 50 g y 100 g colocadas en un agitador mecánico durante el mismo
periodo de tiempo. [NOTA-Si los resultados obtenidos con las muestras de 25 g y 50 g son similares, pero el porcentaje obte-
nido en el tamiz de orificios más pequeños con la muestra de 100 g es menor, la muestra de 100 g es demasiado grande.] Si
sólo se dispone de una muestra de 1 Og a 25 g, se pueden emplear tamices analíticos de menor diámetro que cumplan con las
mismas especificaciones de la malla. En este caso, volver a determinar el punto final. En algunos casos, puede ser necesario
emplear muestras con una masa menor (por ejemplo, hasta 5 g). Para materiales con densidad de partículas aparente baja, o
de materiales compuestos principalmente por partículas de forma muy isodiamétrica, puede ser necesario emplear una mues-
tra de menos de 5 g en un tamiz de 200 mm, para así evitar la obstrucción excesiva de los orificios del tamiz. En la validación
de un método de tamizado analítico en particular, se asume que el problema de la obstrucción de los orificios se tomó en
consideración.
Si el material en estudio es propenso a absorber o a perder cantidades de agua considerables con las variaciones de hume-
dad, efectuar la prueba en un ambiente controlado apropiado. De forma análoga, si se sabe que el material en estudio genera
carga electrostática, tomar las precauciones necesarias para garantizar que esa carga no altere los resultados del análisis. En
algunos casos, se recomienda agregar un 0,5 por ciento (m/m) de un agente anti-estático, como un dióxido de silicio coloidal
u óxido de aluminio, para reducir el efecto a un mínimo. Si no se puede eliminar la carga estática ni la absorción o pérdida de
agua, es necesario emplear otra técnica para determinar el tamaño de partícula.
498 (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula / Pruebas Físicas USP 37

Métodos de Agitación-Todos los distintos tipos de dispositivos de agitación para tamices y polvos están disponibles co-
mercialmente y son adecuados para el tamizado analítico. Sin embargo, las distintas fuerzas y las diferencias de magnitud de
estas fuerzas sobre las partículas en estudio que emplean los distintos métodos de agitación producirán resultados distintos y
tendrán puntos finales distintos. Algunos métodos emplean la agitación mecánica o electromagnética que induce un cierto
grado de oscilación vertical o de movimiento circular en el plano horizontal o golpes suaves o una combinación de golpes
suaves y de movimiento circular en el plano horizontal. Otro método consiste en arrastrar las partículas en un chorro de aire.
Es necesario indicar en los resultados qué método de agitación se empleó y con qué parámetros (si están sujetos a variación),
ya que los cambios en las condiciones de agitación generan cambios en los resultados del tamizado analítico y en la determi-
nación del punto final y en algunos casos la variación es lo suficientemente amplia como para dar resultados que no cumplan
con los requisitos en ciertas circunstancias.
Determinación del Punto Final-El tamizado analítico se da por concluido cuando el peso de cualquiera de los tamices no
presenta variaciones de más de 5% o de O, 1 g (10% si se emplean tamices de 76 mm) del peso previo obtenido en ese mismo
tamiz. Si en cualquiera de los tamices hay menos del 5% del total de la muestra, aumentar el punto final para ese tamiz hasta
un cambio de peso de no más de 20% del peso previo obtenido e11 ese tamiz.
Si se encuentra más del 50% del peso total de la muestra en cualquiera de los tamices, a menos que esta circunstancia esté
indicada en la monografía, repetir la prueba agregando a e~e conjunto de tamicPs un tamiz con orificios más grandes, de ta-
maño intermedio entre el tamaño del tamiz que contiene el exceso de peso y el siguiente tamiz en el orden del grupo original,
es decir, agregando el tamiz de la serie ISO omitido en el conjunto de tamices.

MÉTODOS DE TAMIZADO

Agitación Mecánica

Método de Tamizado en Seco-Tarar cada tamiz con una aproximación de O, l g. Colocar una cantidad de la muestra de
prueba pesada con exactitud en el tamiz superior (el de orificios más grandes) y tapar. Agitar el conjunto de tamices durante 5
minutos. A continuación desmontar cuidadosamente cada tamiz del conjunto de tamices sin que haya pérdida de material.
Volver a pesar cada tamiz y determinar el peso del material en cada uno de ellos. Determinar el peso del material utilizando
una bandeja recolectora u otro adminículo similar para recolectar el material. Volver a montar el conjunto de tamices y agitar
durante 5 minutos. Desmontar y pesar cada uno de los tamices como se describió anteriormente. Repetir los pasos hasta obte-
ner los resultados del punto final (ver Determinación del Punto Final en Tamices Analíticos) Una vez completado el análisis, conci-
liar los pesos del material. Las pérdidas totales no exceden de 5% del peso de la muestra original.
Repetir el análisis con una muestra nueva, pero usando un solo tiempo de tamizado igual a la sumatoria de los tiempos men-
cionados anteriormente. Confirmar que este tiempo de tamizado cumple con los requisitos de la determinación de punto final.
Una vez validado el punto final para un material específico, ese tiempo único de tamizado fijado se puede usar en los próximos
análisis, siempre y cuando la distribución del tamaño de partícula esté comprendida dentro de los límites de la variación nor-
mal.
Si se observara que las partículas retenidas en uno cualquiera de los tamices están en forma de agregados y no de partículas
individuales, es poco probable que el tamizado mecánico en seco proporcione una buena reproducibilidad. En ese caso se de-
be emplear otro método de análisis del tamaño de partícula.

Métodos de Arrastre por Aire

Tamizado con un Chorro de Aire o Tamizado Sónico-Hay disponibles comeréialmente varios tipos distintos de equipos para
tamizar que utilizan una corriente de aire circulante. El sistema que emplea un único tamiz por vez se denomina tamizado por
chorro de aire. En líneas generales, la metodología es similar a la descrita para el Método de Tamizado en Seco con un chorro de
aire normalizado en lugar del mecanismo de agitación descrito. La distribución del tamaño de partícula se obtiene mediante
análisis secuenciales en tamices individuales comenzando por el tamiz con orificios más pequeños. A menudo, el tamizado por
chorro de aire se realiza con tamices de orificios más pequeños que los empleados en el tamizado en seco. La técnica resulta
más adecuada si sólo es necesario cuantificar las fracciones que estén por encima o por debajo de un límite de tamaño.
El método de tamizado sónico emplea un conjunto de tamices y la muestra circula en un columna de aire que oscila vertical-
mente y eleva la muestra y la devuelve a los orificios de la malla a un cierto número de pulsos por minuto. En algunos casos, si
se emplea el tamizado sónico es necesario disminuir el tamaño de la muestra a 5 g.
Los métodos de tamizado por chorro de aire y sónico pueden ser útiles para polvos o gránulos con los que no se obtienen
un análisis significativo empleando las técnicas de tamizado mecánico.
Estos métodos dependen en gran medida de que la dispersión del polvo en la corriente de aire sea apropiada. Puede ocurrir
que se encuentren dificultades para cumplir con este requisito si el método se emplea con los tamices en el extremo inferior
del intervalo (es decir, de menos de 75 µm), cuando las partículas tienden a tener mayor cohesión y en particular si el material
presenta una tendencia a cargarse electrostáticamente. Los motivos expuestos subrayan la importancia de la determinación del
punto final y que es crucial confirmar que el material cuyo tamaño excede el previsto está compuesto de partículas aisladas y
no de agregados.
USP 37 Pruebas Físicas/ (788) Partículas en Inyectables 499

INTERPRETACIÓN

Los datos sin procesar deben incluir el peso de la muestra en análisis, el tiempo total de tamizado y la descripción precisa de
la metodología de tamizado empleada así como los valores fijados para todo parámetro variable, además de los pesos del ma-
terial retenido en cada tamiz individual y del peso en la bandeja. En algunos casos se recomienda convertir estos datos en una
distribución acumulativa del peso y, si se desea expresar la distribución en términos del peso acumulado de partículas de tama-
ño inferior al esperado, el intervalo de tamices empleados debe incluir un tamiz por cuyos orificios pasa todo el material. Si se
observan indicios de que el material retenido en los tamices está compuesto por agregados formados durante el proceso de
tamizado, el análisis no es válido.

<788) PARTÍCULAS EN INYECTABLES

Este capítulo general está armonizado con los textos correspondientes de ia Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. Las partes del tex-
to de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están indicadas
con símbolos e·.) para especificar este hecho.
Las partículas en inyectables e infusiones parenterales consisten en partículas no disueltas móviles extrañas, que no son bur-
bujas gaseosas, accidentalmente presentes en las soluciones.
•Según se indica en Inyectables (1 ), las soluciones para inyección que se administran por vía intramuscular o subcutánea de-
ben cumplir con los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Este requisito ha sido pospuesto indefinidamente para produc-
tos de uso veterinario. Las preparaciones parenterales envasadas y etiquetadas exclusivamente para usar como soluciones de
irrigación están exentas de los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Las preparaciones radiofarmacéuticas están exentas
de los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Los productos parenterales cuyo etiquetado especifica el uso de un filtro
final antes de la administración están exentos de los requisitos de Partículas en Inyectables (788), siempre que se disponga de
datos científicos que justifiquen dicha exención .•
Para la determinación de las partículas, se especifican a continuación dos procedimientos, el Método 1 (Prueba de Conteo de
Partículas por Obstrucción de Luz) y el Método 2 (Prueba de Conteo Microscópico de Partículas). Cuando se examinan inyecciones
e infusiones parenterales para detectar la presencia de partículas subvisibles, es preferible aplicar el Método 1. Sin embargo,
puede ser necesario analizar algunas preparaciones mediante la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz seguida
de la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas para determinar en forma concluyente si cumple con los requisitos.
No todas las preparaciones parenterales se pueden examinar con uno de estos métodos o con ambos para detectar la pre-
sencia de partículas subvisibles. Cuando el Método 1 no es aplicable, p.ej., en el caso de preparaciones que presenten una
transparencia reducida o una viscosidad aumentada, se debe llevar a cabo la prueba según el Método 2. Las emulsiones, coloi-
des y preparaciones liposomales son algunos ejemplos. De la misma manera, los productos que producen burbujas de aire u
otro gas cuando se aspiran dentro del sensor también pueden requerir un análisis de conteo microscópico de partículas. Si la
viscosidad de la preparación a analizar es lo suficientemente alta como para impedir el análisis por cualquiera de los dos méto-
dos, se puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente adecuado para reducir su viscosidad, según sea necesario, y
así permitir la realización del análisis.
Los resultados obtenidos al analizar una unidad discreta o un grupo de unidades para detectar la presencia de partículas no
pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo tanto, si se desean realizar inferencias váli-
das a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partículas en un grupo grande de unidades, se deben desarro-
llar planes de muestreo estadísticamente confiables.
•A los fines de este capítulo, preparación parenteral de pequeño volumen es sinónimo de inyección de pequeño volumen, y
preparación parenteral de gran volumen es sinónimo de inyección de gran volumen .•

Cambio en la redacción:

MÉTODO 1
PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS
POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ

Usar un aparato adecuado basado en el principio de bloqueo de la luz que permita una determinación automática del tama-
ño de las partículas y el número de partículas según el tamaño. La definición de agua exenta de partículas se proporciona en
Especificaciones de Reactivos-Reactivos, Indicadores y Soluciones.
Calibrar el aparato usando dispersiones que contengan partículas esféricas de tamaños conocidos entre 1 O ~tm y 25 µm. Dis-
persar el estándar de partículas en agua exenta de partículas. Se deben tomar las precauciones necesarias para evitar el agrega-
do de partículas durante la dispersión. •La aptitud del sistema puede verificarse usando el ER Partículas para Conteo USP .•
500 (788) Partículas en Inyectables / Pruebas Físicas USP 37

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partículas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y equipo de filtración usados, excepto los filtros de membrana, con una
solución de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente. Inmedia-
tamente antes de usar, enjuagar el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y luego por adentro, con agua exenta de partí-
culas.
Procurar no introducir burbujas de aire en la preparación a analizar, especialmente cuando se transfieren porciones de la
preparación al recipiente en el cual se llevará a cabo la determinación.
Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio se ha limpiado correctamente y que el
agua a usar se encuentra exenta de partículas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presencia de partículas en cinco
muestras de agua exenta de partículas de 5 mL cada una, según el método que se describe más adelante. Si el número de partí-
culas con un tamano igual o mayor de 1 O ~1m excede de 25 para la muestra combinada de 25 mL, las precauciones tomadas
para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas preparatorias hasta que el ambiente, material de vidrio y agua
sean adecuados para la prueba.

Método

Mezclar el contenido de la muestra invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidadosa-
mente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partículas y quitar el cierre, evitando la contaminación del contenido. Eliminar las burbujas gaseosas mediante las medidas
apropiadas tales como dejar en reposo durante 2 minutos o someter a ultrasonido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pe-
queño volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1 O o más unidades en un recipiente limpio para obtener un
volumen de no menos de 25 mL; la solución de prueba puede prepararse mezclando el contenido de un número adecuado de
viales y diluyéndolo hasta 25 mL con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas adecuado cuando el
agua exenta de partículas no es adecuada. Las preparaciones parenterales de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o
más pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas apropiado
cuando el agua exenta de partículas no es adecuada.
•En el caso de envases a granel para farmacias para uso parenteral etiquetados con la leyenda "No Destinado para Infusión
Directa", proceder según se indica para preparaciones parenterales de pequeño volumen cuando el volumen sea 25 mL o más.
Calcular el resultado de la prueba en una porción que sea equivalente a la dosis máxima provista en el etiquetado. Por ejem-
plo, si el volumen total del envase a granel es 100 mL y el volumen de dosis máxima es 1 O mL, entonces el conteo promedio
de partículas por mL se multiplicaría por 1O para obtener el resultado de prueba basándose en la dosis máxima de 1O mL.
[NOTA-Para los cálculos de los resultados de la prueba, considerar esta porción de dosis máxima equivalente al contenido de
un envase lleno.]
Los productos envasados con compartimentos duales diseñados para contener un producto farmacéutico y un disolvente
deben ser preparados y analizados según se indica para preparaciones parenterales de gran volumen o preparaciones parente-
rales de pequeño volumen, dependiendo del volumen del envase. Mezclar cada unidad según se indica en el etiquetado, acti-
vando y agitando para asegurar el mezclado minucioso de los componentes individuales y la disolución del medicamento .•
El número de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una· evaluación estadísticamente válida. Para prepa-
raciones parenterales de gran volumen o de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más, se pueden analizar menos de
1 O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Tomar cuatro porciones, de no menos de 5 mL cada una, y contar el número de partículas iguales o mayores de 1O µm y 25
µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porción y calcular el número medio de partículas para la prepa-
ración a examinar.

Evaluación

Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de más de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
7.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
1.B.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 1.B.
[NOTA-La Farmacopea japonesa usa la •Prueba 1.A. ERR (Ol-ene- 2014 ))
Si el número promedio de partículas excede los límites, analizar la preparación mediante la Prueba de Conteo Microscópico de
Partículas.
Prueba l .A (Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal
de más de 100 mL)-La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presentes en las unidades anali-
 •
USP 37 Pruebas Físicas/ (788) Partículas en Inyectables 501

zadas no excede de 25 partículas iguales o mayores de 1 O ~tm por mL y no excede de 3 partículas iguales o mayores de 25 µm
por ml.
Prueba l .B (Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal
de menos de 700 mL)-La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presentes en las unidades
analizadas no excede de 6000 partículas iguales o mayores de 1 O µm por envase y no excede de 600 partículas iguales o ma-
yores de 25 µm por envase.

MÉTODO 2
PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS

Usar un microscopio binocular adecuado, un dispositivo de filtración para retener partículas y un filtro de membrana para el
análisis.
Ajustar el microscopio con aumentos de 100 ± 1Ox y equiparlo con un micrómetro ocular calibrado con un micrómetro ob-
jetivo, una platina mecánica capaz de sostener y recorrer toda la superficie de filtración del filtro de membrana y dos ilumina-
dores adecuados para proporcionar iluminación episcópica además de la iluminación oblicua.
El micrómetro ocular es una retícula circular para la medición del diámetro de partículas (ver la Figura 7) y consiste en un
círculo grande que tiene filamentos señaladores que lo dividen en cuadrantes, círculos de referencia transparentes y de color
negro, con diámetros de 1O µm y 25 µm en aumentos de 1 OOx, y una escala lineal con graduaciones en incrementos de 1 O
µm. Calibrar empleando un micrómetro de platina, certificado por una institución de normalización nacional o internacional.
Un error relativo de la escala lineal de la retícula dentro de ±2% es aceptable. El círculo grande se denomina campo reticular
(GFOV, por sus siglas en inglés).

_ . - Círculo GFOV

O• •O Cruce de filamentos
---- señaladores

O• •O

Escala lineal
O••e /

11111111111111111111¡1111111111111111111¡111111111¡111111n1¡11111111111111111111111111111¡1111111111
o ~ w w ~ w w ro ~ ~ ~

Fig. 1. Retícula circular para la medición del diámetro de partículas. El círculo grande que está dividido por filamentos en
cuadrantes se denomina campo reticular (GFOV, por sus siglas en inglés). Los círculos transparentes y de color negro, con diá-
metros de 1 O µm y 25 µm en 1 OOx, se proporcionan como elementos de comparación para clasificar las partículas por tama-
ño.

Se requieren dos iluminadores. Uno es un iluminador episcópico interno de campo brillante, el otro es un auxiliar externo de
foco regulable para dar iluminación oblicua reflejada en un ángulo de incidencia de 10º-20º.
El dispositivo de filtración para retener las partículas consiste en un soporte de filtro, de vidrio u otro material adecuado,
provisto de una fuente de vacío y un filtro de membrana adecuado.
El filtro de membrana tiene un tamaño adecuado, de color negro o gris oscuro, reticulado o no y con un tamaño nominal
de poro de 1,0 µm o menor.

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partículas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y de ensamblaje para filtración usados, excepto los filtros de membrana,
con una solución de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente.
Inmediatamente antes de usar, enjuagar ambos lados del filtro de membrana y el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y
luego por adentro, con agua exenta de partículas.
Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio y el filtro de membrana se han limpiado
correctamente y que el agua a usar se encuentra exenta de partículas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presen-
502 (788) Partículas en Inyectables/ Pruebas Físicas USP 37

cia de partículas en 50 mL de agua exenta de partículas, según el método que se describe más adelante. Si más de 20 partículas
con un tamaño igual o mayor de 1O pm o si más de cinco partículas con un tamaño igual o mayor de 25 ~tm están presentes
dentro del área de filtración, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas prepara-
torias hasta que el ambiente, material de vidrio, filtro de membrana y agua sean adecuados para la prueba.

Método
Mezclar el contenido de las muestras invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidado-
samente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partículas y quitar el cierre, evitando la contaminación del contenido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pe-
queño volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1O o más unidades en un recipiente limpio; la solución de
prueba puede prepararse mezclando el contenido de un número adecuado de viales y diluyéndolo hasta 25 mL con agua exen-
ta de partículas o con un disolvente exento de partículas apropiado cuando el agua exenta de partículas no es adecuada. Las
preparaciones parenterales de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas adecuado
cuando el agua exenta de partículas no es adecuada.
El número de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluación estadísticamente válida. Para prepa-
raciones parenterales de gran volumen o de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más, se pueden analizar menos de
1O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Humedecer con varios mL de agua exenta de partículas el interior del soporte de filtro provisto con el filtro de membrana.
Transferir al embudo de filtración el volumen total de una solución combinada o una unidad individual y aplicar vacío. Si fuera
necesario, agregar gradualmente porciones de la solución hasta filtrar todo el volumen. Después de la última adición de solu-
ción, empezar a enjuagar las paredes internas del soporte de filtro empleando un chorro de agua exenta de partículas. Mante-
ner el vacío hasta que la superficie del filtro de membrana se encuentre exenta de líquidos. Colocar el filtro de membrana en
una placa de Petri y dejarlo secar al aire con la tapa ligeramente abierta. Después de que el filtro de membrana se haya secado,
colocar la placa de Petri en la platina del microscopio, recorrer todo el filtro de membrana bajo la luz reflejada por un dispositi-
vo de iluminación y contar el número de partículas mayores o iguales a 1O pm y el número de partículas mayores o iguales a
25 pm. Como alternativa, se permite el conteo parcial del filtro de membrana y la determinación del conteo total del filtro por
cálculos. Calcular el número medio de partículas para la preparación que se va a analizar.
El proceso de medición del tamaño de partículas usando la retícula circular se lleva a cabo estimando el diámetro equivalen-
te de la partícula en comparación con los círculos de referencia de 1O pm y 25 pm de la retícula. De esta forma, no se mueven
las partículas de sus lugares originales dentro del campo reticular y no se superponen en los círculos de referencia para la com-
paración. El diámetro interno de los círculos de referencia transparentes de la retícula se usa para medir las partículas blancas y
transparentes, mientras que el diámetro externo de los círculos de referencia negro opaco de la retícula se usa para medir el
tamaño de las partículas oscuras.
Cuando se realiza la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas, no se debe intentar la medición o el conteo de materiales
amorfos, semilíquidos, o morfológicamente indiferenciados y que tengan la apariencia de una mancha o decoloración en el
filtro de membrana. Estos materiales muestran poco o ningún relieve y presentan un aspecto gelatinoso o similar al de una
película. En tales casos, puede facilitarse la interpretación del conteo analizando una muestra de la solución mediante la Prueba
de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz.

Evaluación

Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de más de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.8.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 2.8.
[NOTA-La Farmacopea japonesa usa la Prueba 2.A.]
Prueba 2.A (Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal
de más de 700 mL)-La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades anali-
zadas no excede de 12 partículas iguales o mayores de 1O pm por mL y no excede de 2 partículas iguales o mayores de 25 pm
por ml.
Prueba 2.B (Soluciones para infusión parentera/ o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal
de menos de 700 mL)-La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades
analizadas no excede de 3000 partículas iguales o mayores de 1O pm por envase y no excede de 300 partículas iguales o ma-
yores de 25 pm por envase.
 USP 37 Pruebas Físicas/ (789) Partículas en Soluciones Oftálmicas 503

(789) PARTÍCULAS EN SOLUCIONES OFTÁLMICAS

Las partículas están formadas por sustancias extrañas, móviles, de diversos orígenes, que no son burbujas de gas, que no
pueden cuantificarse por medio de un análisis químico debido a la pequeña cantidad de material que representan y debido a
su composición heterogénea. Las soluciones oftálmicas deben estar esencialmente exentas de partículas que se puedan obser-
var en una inspección visual. Las pruebas aquí descritas son pruebas físicas desarrolladas con el propósito de contar las partícu-
las extrañas dentro de intervalos específicos de tamaño.
Cada solución oftálmica para la cual la monografía incluya una prueba para Partículas está sujeta a los límites de partículas
establecidos para la prueba que se esté aplicando, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.
Cuando sean adecuados límites más altos, éstos estarán especificados en la monografía individual. Las preparaciones oftálmicas
que sean suspensiones, emulsiones o geles están exentas de estos requisitos, al igual que lo están los dispositivos médicos.
Consultar la monografía específica cuando surja alguna duda sobre la aplicación de la prueba.
Los procedimientos de obstrucción de luz y microscópico para la determinación de partículas en soluciones oftálmicas son
idénticos a los de las inyecciones; por lo tanto, cuando corresponda, habrá una referencia cruzada con Partículas en Inyectables
(788). Este capítulo describe un método de prueba consistente en dos etapas. En primer lugar, la solución oftálmica se analiza
por medio del procedimiento de obstrucción la luz (etapa 1 ). Si no cumple con los límites establecidos, se debe pasar a la
prueba microscópica (etapa 2) con sus límites propios. Cuando por razones técnicas la solución oftálmica no pueda ser analiza-
da por obstrucción de luz, se podrá utilizar la prueba microscópica exclusivamente. Se requiere documentación que demuestre
que no se puede analizar la ~olución oftálmica por el procedimiento de obstrucción de luz, o que éste produce resultados invá-
lidos.
Se espera que la mayoría de los artículos cumplan con los requisitos usando simplemente la prueba de obstrucción de luz;
sin embargo podría ser necesario someter algunos artículos a la prueba de obstrucción de luz seguida de la prueba microscópi-
ca para determinar en forma concluyente si se cumple con los requisitos. Todo producto que no sea una solución pura y que
tenga una transparencia y viscosidad que se aproximen a las del agua puede proporcionar datos erróneos cuando se lo analiza
con el método de conteo por obstrucción de luz. Estos materiales pueden analizarse por medio del método de conteo micros-
cópico. En ciertos casos, la viscosidad de un material a analizar puede ser lo suficientemente alta como para impedir el análisis
por cualquiera de los dos métodos de prueba. En este caso, se puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente ade-
cuado para reducir la viscosidad lo necesario y permitir la realización del análisis.
En las pruebas descritas a continuación, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o un grupo de unidades
para detectar la presencia de partículas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo
tanto, si se desean realizar inferencias válidas a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partículas en un gru-
po grande de unidades, se deben desarrollar planes de muestreo estadísticamente confiables basados en factores de operación
conocidos. Los planes de muestreo deben basarse en el volumen de producto, el número de partículas encontrado histórica-
mente en comparación con los límites, la distribución de tamaños de partículas presentes y la variabilidad del conteo de partí-
culas entre unidades.

PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ

Esta prueba se aplica a las soluciones oftálmicas, incluidas las soluciones que han sido reconstituidas a partir de sólidos estéri-
les, para los cuales se especifica una prueba de detección de Partículas en la monografía individual. La prueba cuenta las partí-
culas sólidas o líquidas en suspensión.
Aparato de Prueba, Normalización del Instrumento, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba y Cálculos-Proce-
der como se indica en la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz en Partículas en Inyectables (788).
Interpretación-La solución oftálmica cumple con los requisitos de la prueba si el número promedio de partículas presente
en las unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 7. Si el número promedio de partículas
excede del límite, analizar el artículo mediante la Prueba de Conteo de Partículas Microscópicas.
Tabla 1. Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz

_N_ú_m_e_ro_d_e_p-ar-tí-c-ul-as-------------------+U-5-o1-~-o~>;-:-L-
,_¡ -·~~:,~:- _ J
PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS

Algunos artículos no pueden analizarse en forma satisfactoria con el método de obstrucción de luz. En dichos casos, las mo-
nografías individuales especifican claramente que sólo se debe realizar un recuento microscópico de partículas. La prueba de
recuento de partículas microscópicas enumera partículas subvisibles, esencialmente sólidas, en soluciones oftálmicas, luego de
recogerlas sobre un filtro de membrana microporosa. Algunas soluciones oftálmicas, tales como soluciones que no se filtran
fácilmente debido a su alta viscosidad, pueden quedar exentas de análisis utilizando la prueba microscópica.
 •
504 (789) Partículas en Soluciones Oftálmicas / Pruebas Físicas USP 37

Cuando se realiza la prueba microscópica, no se debe intentar la medición o el conteo de materiales amorfos, semilíquidos o
morfológicamente indiferenciados de algún otro modo y que tengan la apariencia de una mancha o coloración en la superficie
de la membrana. Estos materiales muestran poco o ningún relieve en la superficie y presentan un aspecto gelatinoso o similar
al de una película. Debido a que este material en solución consiste en unidades en el orden de 1 ~tm o menores, que se pue-
den contar sólo después de la agregación o deformación en una membrana analítica, puede facilitarse la interpretación del
recuento analizando una muestra de la solución por medio del método de recuento de partículas por obstrucción de luz.
Aparato de Prueba, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba y Enumeración de Partículas-Proceder según se
indica para la Prueba de Conteo de Partículas Microscópicas en Partículas en Inyectables (788).
Interpretación-La solución oftálmica cumple con los requisitos de la prueba si el número promedio de partículas presente
en las unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 2.
Tabla 2. Conteo de Partículas por Método Microscópico
Diámetro
2" 10 µm 1 2"25 µm 1 2"50µm
Número de partículas 50 por ml 1 5 por ml 1 2 por ml

(791) pH

Para propósitos farmacopeicos, se define el pH como el valor dado por un instrumento potenciométrico (medidor de pH)
apropiado, adecuadamente normalizado, capaz de reproducir valores de pH de hasta 0,02 unidades de pH que emplea un
electrodo indicador sensible a la actividad del ión hidrógeno, el electrodo de vidrio y un electrodo de referencia apropiado. El
instrumento debe ser capaz de detectar el potencial a través del par de electrodos y, a los fines de normalización del pH, de
aplicar un potencial regulable al circuito mediante la manipulación de los controles de "normalización", "cero", "asimetría" o
"calibración" y debe poder controlar el cambio en milivoltios por cada cambio de unidad en la lectura de pH a través de un
control de "temperatura" y/o "pendiente". Las mediciones se hacen a 25 ± 2º, a menos que se especifique algo diferente en la
monografía individual o en este texto.
La escala de pH se define por la ecuación:
pH = pHs + (E - ES)/k
en donde E y Es son los potenciales medidos cuando la celda galvánica contiene la solución en análisis, representada por pH y
la Solución Amortiguadora de Normalización apropiada, representada por pHs, respectivamente. El valor de k es el cambio en el
potencial por cambio de unidad en el pH y teóricamente es [0,05916 + 0,000198(t - 25º)] voltios a cualquier temperatura t.
Se debe enfatizar que las definiciones de pH, la escala de pH y los valores asignados a las Soluciones Amortiguadoras de Nor-
malización tienen el propósito de establecer un sistema práctico y operativo para que los resultados se puedan comparar entre
laboratorios. Los valores de pH así medidos no se corresponden exactamente con los obtenidos por la definición, pH = - log
aH+. Siempre que la solución que se está midiendo sea lo suficientemente similar en composición a la solución amortiguadora

usada para la normalización, el pH operacional será bastante cercano al pH teórico. Aunque no se hace ninguna afirmación
con respecto a la aptitud del sistema para medir la actividad o la concentración del ión hidrógeno, los valores obtenidos están
estrechamente relacionados con la actividad del ión hidrógeno en soluciones acuosas.
Cuando un medidor de pH se normaliza mediante el uso de una solución amortiguadora acuosa y luego se la emplea para
medir el "pH" de una solución o suspensión no acuosa, la constante de ionización del ácido o de la base, la constante dieléctri-
ca del medio, el potencial de unión líquida (que puede originar errores de aproximadamente 1 unidad de pH) y la respuesta
del ión hidrógeno del electrodo de vidrio cambian totalmente. Por estas razones, los valores así obtenidos con soluciones que
son sólo de carácter parcialmente acuoso pueden considerarse únicamente como valores aparentes de pH.

SOLUCIONES AMORTIGUADORAS DE NORMALIZACIÓN DE MEDIDORES DE pH

Las Soluciones Amortiguadoras de Normalización se deben preparar como se indica en la tabla adjunta.* Las sales amortigua-
doras de la pureza requerida pueden obtenerse en el National lnstitute of Science and Technology. Las soluciones se pueden
almacenar en frascos de polietileno o vidrio duro con un cierre impermeable o con un tubo de absorción de dióxido de carbo-
no (cal sodada). Se deben preparar soluciones nuevas a intervalos que no excedan los 3 meses usando agua libre de dióxido
de carbono. La tabla indica el pH de las soluciones amortiguadoras como una función de la temperatura. Las instrucciones que
se presentan en este documento son para la preparación de soluciones que tengan las concentraciones molales (m) especifica-

* Se pueden emplear soluciones amortiguadoras disponibles comercialmente para la normalización de medidores de pH, normalizadas mediante métodos recono-
cidos por el National lnstitute of Standards and Technology (NIST) cuya etiqueta indica un valor de pH con una aproximación de 0,01 unidades de pH. Para las
soluciones de normalización que tengan un pH menor que 4, se acepta una exactitud etiquetada de 0,02. Se pueden usar soluciones preparadas con materiales de
grado reactivo de la ACS u otros materiales adecuados, en las cantidades declaradas, siempre y cuando el pH de la solución resultante sea el mismo que el de la
solución preparada con el material certificado por el NIST.
USP 37 Pruebas Físicas/ (791) pH 505

das. Sin embargo, por conveniencia y para facilitar su preparación, las instrucciones se dan en función de la dilución a un volu-
men de 1000 mL en lugar de especificar el uso de 1000 g de disolvente, que es la base de la concentración de soluciones en el
sistema de molalidad. Las cantidades indicadas no se pueden calcular simplemente sin información adicional.
Valores de pH de Soluciones Amortiguadoras de Normalización
Tempera- Tetraoxalato de Po- Biftalato de Potasio, Fosfato Equimolal, Tetraborato de Hidróxido de Calcio,
tura, ºC tasio, 0,05 m 0,05m 0,05m Sodio, 0,01 m Saturado a 25º
10 1,67 4,00 6,92 9,33 13,00
15 1,67 4,00 6,90 9,28 12,81
20 1,68 4,00 6,88 9,23 12,63
25 1,68 4,01 6,86 9,18 12,45
30 1,68 4,02 6,85 9,14 12,29
35 1,69 4,02 6,84 9,10 12, 13
40 1,69 4,04 6,84 9,07 11,98
45 1,70 4,05 6,83 9,04 11,84
50 1,71 4,06 6,83 9,01 11,71
55 1,72 4,08 6,83 8,99 11,57
60 1,72 4,09 6,84 8,96 11,45

Tetraoxalato de Potasio, 0,05 m-Disolver 12,61 g de KH 3(Cp 4 ) 2 • 2HP en agua para obtener 1000 mL.
Biftalato de Potasio, 0,05 m-Disolver 1O,12 g de KHC 8 H4 0 4, previamente secado a 11 Oº durante 1 hora, en agua para
obtener 1000 ml.
Fosfato Equimolal, 0,05 m-Disolver 3,53 g de Na 2 HP04 y 3,39 g de KH 2 P0 4 cada uno previamente secado a 120º duran-
te 2 horas, en agua para obtener 1000 ml. '
Tetraborato de Sodio, 0,01 m-Disolver 3,80 g de Na 2 B4 0 7 • 1OH 2 0 en agua para obtener 1000 ml. Proteger de la absor-
ción de dióxido de carbono.
Hidróxido de Calcio, saturado a 25º-Agitar un exceso de hidróxido de calcio con agua y decantar a 25º antes de usar.
Proteger de la absorción de dióxido de carbono.
Debido a las variaciones en la naturaleza y funcionamiento de los medidores de pH disponibles, no es práctico dar instruc-
ciones de aplicación universal para las determinaciones potenciométricas del pH. Los principios generales a seguir para llevar a
cabo las instrucciones estipuladas para cada instrumento por su fabricante se establecen en los párrafos siguientes. Examinar
los electrodos y, si está presente, el puente salino antes de usar. Si fuera necesario, volver a llenar la solución del puente salino
y cumplir con otras precauciones indicadas por el fabricante del instrumento o del electrodo.
Para normalizar el medidor de pH, seleccionar dos Soluciones Amortiguadoras de Normalización cuya diferencia de pH no ex-
ceda de 4 unidades y de tal manera que el pH esperado del material en análisis se encuentre entre éstos. Llenar la celda con
una de las Soluciones Amortiguadoras de Normalización a la temperatura a la que se medirá el material de prueba. Ajustar el
control de "temperatura" a la temperatura de la solución y ajustar el control de calibración para que el valor de pH observado
sea idéntico al valor tabulado. Enjuagar los electrodos y la celda con varias porciones de la segunda Solución Amortiguadora de
Normalización, luego llenar la celda con esa solución a la misma temperatura que el material a medir. El pH de la segunda
solución amortiguadora está dentro de ±0,07 unidades de pH del valor tabulado. Si se observa una desviación mayor, exami-
nar los electrodos y, si estuvieran defectuosos, reemplazarlos. Ajustar la "pendiente" o control de "temperatura" para hacer
que el valor de pH observado sea idéntico al tabulado. Repetir la normalización hasta que ambas Soluciones Amortiguadoras de
Normalización den valores de pH observados con una aproximación de 0,02 unidades de pH del valor tabulado sin ajuste adi-
cional de los controles. Cuando el sistema está funcionando satisfactoriamente, enjuagar los electrodos y la celda varias veces
con unas pocas porciones del material de prueba, llenar la celda con el material de prueba y leer el valor de pH. Usar agua
libre de dióxido de carbono (ver Agua en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones) para disolver o diluir el material de prue-
ba para las determinaciones de pH. En todas las mediciones de pH, dejar que transcurra un tiempo suficiente para la estabiliza-
ción.
Cuando los valores de pH aproximados sean suficientes, los indicadores y papeles de prueba (ver Indicadores y Papeles de
Prueba, en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones) pueden ser adecuados.
Para ver una discusión sobre las soluciones amortiguadores del pH y la composición de las soluciones amortiguadoras están-
dar necesarias para las pruebas y valoraciones farmacopeicas, ver Soluciones Amortiguadoras en la sección Reactivos, Indicadores
y Soluciones.
506 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

(795) PREPARACIÓN MAGISTRAL-PREPARACIONES NO ESTÉRILES

INTRODUCCIÓN

El propósito de este capítulo es proporcionar a los preparadores pautas sobre la aplicación de buenas prácticas de prepara-
ción magistral para la preparación magistral de formulaciones no estériles para su dispensación y/o administración en huma-
nos o animales. La preparación magistral es una parte integral de la práctica farmacéutica y es esencial para brindar atención
médica. Este capítulo y las monografías aplicables sobre formulación ayudan a definir las buenas prácticas de preparación ma-
gistral. Asimismo, este capítulo proporciona información general para mejorar la capacidad del preparador en las instalaciones
de preparación magistral para que elabore preparaciones magistrales extemporáneas de contenido, calidad y pureza acepta-
bles. Los farmacéuticos, profesionales de la salud y demás personas implicadas en la preparación magistral de medicamentos
deben cumplir con las legislaciones, reglamentaciones y pautas estatales y federales sobre preparación magistral.

DEFINICIONES

INGREDIENTE FARMACÉUTICO ACTIVO (API, por sus siglas en inglés)-Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a su uso
en una preparación magistral de fármacos, convirtiéndose así en el ingrediente activo de dicha preparación y que proporciona
una actividad farmacopeica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermeda-
des en humanos y animales o que afecta la estructura y función del cuerpo.
SUSTANCIAS AGREGADAS-Son ingredientes necesarios para elaborar una preparación pero sin la intención ni la expectativa de
causar una respuesta farmacológica si se administran aisladamente en la cantidad o concentración contenida en una dosis úni-
ca de la preparación magistral. El término se usa como sinónimo con los términos ingredientes inactivos, excipientes e ingredien-
tes farmacéuticos.
FECHA LÍMITE DE Uso (FLU)-Es la fecha después de la cual no debe usarse una preparación magistral y se determina a partir de
la fecha de elaboración de la preparación.
COMPONENTE-Cualquier ingrediente usado en la elaboración de una preparación magistral de fármacos, incluyendo cualquier
ingrediente activo o sustancia agregada que se usa en su preparación.
PREPARADOR-Profesional autorizado por la jurisdicción apropiada para elaborar preparaciones magistrales de acuerdo con una
receta u orden de medicación de un prescriptor autorizado.
PREPARACIÓN MAGISTRAL-La preparación, mezcla, reconstitución, alteración, envasado y etiquetado de un medicamento, dispo-
sitivo de administración del medicamento o dispositivo de acuerdo con la prescripción, orden de medicación o iniciativa de un
profesional autorizado basado en la relación entre el profesional, el paciente, el farmacéutico y el preparador en el curso de
una práctica profesional. La preparación magistral incluye lo siguiente:
• La preparación de formas farmacéuticas para pacientes humanos y animales
• La preparación de medicamentos o dispositivos anticipando recetas de medicamentos basadas en patrones rutinarios de
prescripción observados con regularidad
• La reconstitución o manipulación de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o más ingredientes
• La preparación de medicamentos o dispositivos con el propósito de investigación (clínica o académica), enseñanza o aná-
lisis químico, o como resultado incidental de los mismos
• La preparación de medicamentos y dispositivos para uso en el lugar de trabajo der prescriptor cuando así lo permita la
legislación federal y estatal
FÁRMACO PELIGROSO-Cualquier fármaco identificado por al menos uno de los seis criterios siguientes:
• Carcinogenicidad
• Teratogenicidad o toxicidad en el desarrollo
•Toxicidad reproductiva en humanos
•Toxicidad en órganos a dosis bajas en humanos o animales
• Genotoxicidad
• Nuevos fármacos que reproduzcan fármacos peligrosos en su estructura o toxicidad [se pueden encontrar ejemplos en las
publicaciones vigentes del National lnstitute far Occupational Safety and Health (NIOSH)]
FABRICACIÓN-La producción, propagación, conversión o procesamiento de un fármaco o dispositivo médico, ya sea directa o
indirectamente, mediante extracción del fármaco de sustancias de origen natural o mediante síntesis química o biológica. La
fabricación también puede incluir cualquier envasado o reenvasado de las sustancias o etiquetado o reetiquetado de envases
para su reventa en farmacias, por parte de profesionales a otras personas.
PREPARACIÓN-A los efectos de este capítulo, se refiere a una forma farmacéutica o suplemento dietético elaborado por prepara-
ción magistral o un dispositivo en el que el preparador ha introducido un fármaco. Este término se usará para describir formu-
laciones preparadas magistralmente; el término producto se usará para describir formas farmacéuticas fabricadas. (Para las defi-
niciones de sustancia oficial y productos oficiales, ver Advertencias y Requisitos Generales.)
 1

USP 37 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 507

ESTABILIDAD-Se define como la conservación, dentro ciertos límites específicos y durante todo el periodo de almacenamiento y
utilización, de las mismas propiedades y características que poseía la preparación cuando se elaboró (ver en Consideraciones
Sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación (1191 ), la tabla Criterios de Niveles Aceptables de Estabilidad)
VEHÍCULO-Componente de uso interno o externo empleado como portador o diluyente en el que se suspenden o disuelven
líquidos, semisólidos o sólidos. Ejemplos de vehículos incluyen, entre otros, agua, jarabes, elixires, líquidos oleaginosos, porta-
dores sólidos y semisólidos y productos de propiedad exclusiva.

CATEGORÍAS DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL

Cada una de las tres categorías generales de preparaciones no estériles descritas en esta sección está asociada con diferentes
niveles de experiencia, capacitación e instalaciones físicas.
Los criterios usados para determinar la clasificación general incluyen:
• grado de dificultad o complejidad del proceso de preparación magistral
• información y advertencias sobre la estabilidad
• requisitos de envasado y almacenamiento
• formas farmacéuticas
• complejidad de los cálculos
• disposición biológica local contra sistémica
• nivel de riesgo del preparador
• potencial de riesgo de daños al paciente
Ver Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797) para niveles de riesgo relacionados con preparaciones estériles. Las
áreas de especialidad tales como la de preparados radiofarmacéuticos requieren de capacitación especial y sobrepasan el alcan-
ce del presente capítulo. Los preparadores deberán adquirir y mantener conocimientos y habilidades en todas la áreas (p.ej.,
formas farmacéuticas, población de pacientes y especialidad médica) para las que elaboran preparaciones.

Descripción de las Categorías

Simple-Elaboración de una preparación que cuenta con una monografía de preparación magistral en la Farmacopea de Jos
Estados Unidos de América (USP) o que se presenta en un artículo de una publicación de referencia que contiene cantidades
específicas de todos los componentes, un procedimiento y equipo de preparación magistral y datos de estabilidad para dicha
formulación con las FLU apropiadas; o reconstitución o manipulación de productos comerciales que puedan requerir el agre-
gado de uno o más ingredientes según lo indicado por el fabricante. Entre los ejemplos se incluye Captopril, Solución Oral,
lndometacina, Gel Tópico y Bromuro de Potasio, Solución Oral para Uso Veterinario.
Moderada-Elaboración de una preparación que requiere de cálculos o procedimientos especiales (tales como calibración
de cavidades en moldes de unidades de dosificación) para determinar las cantidades de los componentes por cada prepara-
ción o por cada unidad de dosificación individualizada; o elaborar una preparación que carece de datos de estabilidad para su
formulación específica. Entre los ejemplos se incluye Sulfato de Morfina, Supositorios, trociscos de clorhidrato de difenhidramina
y mezcla de dos o más cremas fabricadas cuando no se conoce la estabilidad de la mezcla.
Compleja-Elaboración de una preparación que requiere de capacitación, entorno de trabajo, instalaciones, equipo y pro-
cedimientos especiales para asegurar resultados terapéuticos apropiados. Entre los ejemplos de posibles preparaciones comple-
jas se incluyen formas farmacéuticas transdérmicas, preparaciones de liberación modificada y algunos insertos y supositorios
para efectos sistémicos.

RESPONSABILIDADES DEL PREPARADOR

La responsabilidad del preparador es obtener preparaciones magistrales de contenido, calidad y pureza aceptables de con-
formidad con la receta u orden de medicación. Además, es responsabilidad del preparador dispensar la preparación terminada,
con el envasado y etiquetado apropiados y conforme a los requisitos establecidos por las agencias estatales, consejos de farma-
cia estatales, legislaciones federales y demás agencias reglamentarias aplicables, cuando corresponda. Los individuos que parti-
cipen en la preparación magistral de medicamentos o suplementos dietéticos deberán tener la competencia necesaria en pre-
paración magistral y deberán expandir sus conocimientos continuamente sobre la preparación magistral participando en semi-
narios y/o estudiando la literatura apropiada. Además, deberán tener conocimiento sobre el contenido de este capítulo y estar
familiarizados con los capítulos Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797), Formas Farmacéuticas (1151 ), Cálculos Far-
macéuticos en la Preparación Magistral de Prescripciones (1160), Garantía de Calidad en la Preparación Magistral (1163), Balanzas
y Aparatos Volumétricos para Prescripciones (11 76), Consideraciones Sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación (1191 ), Infor-
mación Escrita de los Medicamentos Recetados-Guías (1265) y demás legislaciones, pautas y normas sobre preparación magis-
tral aplicables.
Para asegurar la calidad de las preparaciones magistrales, los preparadores deberán apegarse a los siguientes principios ge-
nerales (se proporciona información adicional sobre estos principios generales en la sección siguiente).
 ,.
508 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Principios Generales de Preparación Magistral

1 . El personal está capacitado de manera apropiada y tiene la competencia y calificaciones necesarias para realizar las tareas
asignadas. Dicha capacitación debe estar documentada.
2. Los ingredientes para la preparación magistral tienen la identidad, pureza y calidad apropiadas, se adquieren de fuentes
confiables, y se almacenan de manera apropiada de acuerdo con las especificaciones del fabricante o las normas USP.
3. Los envases de componentes a granel cuentan con las etiquetas apropiadas de comunicación de riesgo de la Occupatio-
nal Safety and Health Administration (OSHA) (ver OSHA.gov), y las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales (MSDS,
por sus siglas en inglés) para todos los fármacos y químicos usados en la preparación están disponibles para el personal de
preparación magistral.
4. Todo el equipo usado en la preparación magistral se conserva limpio, recibe el mantenimiento apropiado, y se usa de
manera apropiada.
5. El ambiente de preparación magistral es adecuado para su propósito previsto; y se implementan pr0cedimientos para pre-
venir la contaminación cruzada, especialmente cuando se elaboran preparaciones con fármacos (p.ej., fármacos peligro-
sos y alérgenos conocidos como la penicilina) que requieren de precauciones especiales.
6. Sólo se permite personal autorizado en las inmediaciones de las operaciones de preparación magistral.
7. Existe garantía que los procesos siempre se llevan a cabo según se especifica o en la forma prevista y que son reproduci-
bles.
8. Las condiciones de la preparación magistral son adecuadas a fin de prevenir errores.
9. Todos los aspectos de la preparación magistral se documentan de manera apropiada.
1 O. Existen procedimientos y registros adecuados para investigar y corregir fallas o problemas en la preparación magistral, el
análisis o la preparación misma.

PROCESO DE PREPARACIÓN MAGISTRAL

El preparador es responsable de asegurar que cada preparación magistral individual cumpla con los criterios provistos en
esta sección (se proporciona información adicional sobre estos criterios en las secciones siguientes).

Criterios para la Elaboración de una Preparación Magistral para Cada Fármaco

1. Se ha evaluado la aptitud de la dosis, la seguridad y el uso previsto de la preparación o dispositivo en términos de:
• las propiedades químicas y físicas de los componentes
• forma farmacéutica
• aptitud terapéutica y vía de administración, incluyendo la disposición biológica local y sistémica
• limitaciones legales, si las hubiera
2. Se debe crear un Registro Maestro de Formulación antes de elaborar la preparación por primera vez. Este registro deberá
seguirse cada vez que se elabore dicha preparación. Además, debe completarse un Registro de Preparación Magistral cada
vez que se elabore una preparación.
3. Los ingredientes usados en la formulación deberán tener la identidad, calidad y pureza esperadas. Si la formulación es
para uso en humanos, los ingredientes no deberán estar incluidos en la lista de fármacos o medicamentos específicos re-
conocidos en instancias federales que hayan sido retirados o extraídos del mercado por razones de seguridad o eficacia
(ver www.FDA.gov). Si la formulación es para animales con los que se producen alimentos, los ingredientes no deberán
estar incluidos en una lista de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos. Se
han consultado los Certificados de Análisis, cuando sea aplicable, y las MSDS para todos los ingredientes usados.
4. La preparación magistral se elabora en un área limpia y sanitizada de manera apropiada, dedicada a esta actividad (ver la
sección Instalaciones de Preparación Magistral).
5. Se elabora únicamente una preparación a la vez en un espacio de trabajo específico.
6. Se ha seleccionado el equipo de preparación magistral apropiado y se ha inspeccionado su limpieza y funcionamiento
correcto, y se usa de manera apropiada.
7. Se establece una FLU confiable para asegurar que la preparación terminada tiene su potencia, pureza, calidad y caracterís-
ticas aceptadas, al menos hasta que se incluya una FLU en el etiquetado.
8. El personal que participa en la preparación magistral mantiene una buena higiene de manos y usa vestimenta limpia,
apropiada para el tipo de preparación magistral que se elabora (p.ej., protectores para el cabello, chaquetas, batas, guan-
tes, máscaras faciales, zapatos, delantales u otros artículos) según sea necesario para proteger al personal de la exposición
a sustancias químicas y para prevenir la contaminación de los fármacos.
9. La preparación se elabora de acuerdo con este capítulo, otras normas oficiales referidas en este capítulo, e información y
datos científicos pertinentes.
1 O. El preparador verifica los procesos críticos (incluyendo, entre otros, pesaje, medición y mezclado) para asegurar que los
procedimientos, cuando se usen, darán constantemente como resultado la calidad esperada de la preparación terminada.
USP 37 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 509

11 . La preparación final se evalúa usando factores tales como peso, aptitud de mezclado, claridad, olor, color, consistencia,
pH y análisis analítico, según sea apropiado; y esta información se registra en el Registro de Preparación Magistral (ver
Capítulo (1163)).
12. La preparación se envasa según se recomienda en la sección Envasado y Envases de Preparaciones Magistrales de este capí-
tulo.
13. El envase de la preparación se etiqueta de conformidad con todas las legislaciones estatales y federales aplicables. El eti-
quetado deberá incluir la FLU y la información de almacenamiento y manipulación. El etiquetado debe indicar que "esta
es una preparación magistral".
14. El preparador ha revisado el Registro Maestro de Formulación y el Registro de Preparación Magistral para asegurarse que
no hayan ocurrido errores en el proceso de preparación magistral y que la preparación es adecuada para su uso.
15. La preparación se entrega al paciente o al proveedor de cuidados con la consulta apropiada.

INSTALACIONES DE PREPARACIÓN MAGISTRAL

Las instalaciones de preparación magistral deberán tener un espacio adecuado específicamente diseñado para preparar las
prescripciones. Este espacio deberá mantener la colocación ordenada del equipo y materiales para prevenir confusiones entre
ingredientes, envases, etiquetas, materiales en proceso y preparaciones terminadas; asimismo, su diseño, disposición y uso se
enfoca en prevenir contaminación cruzada accidental. Las áreas destinadas a las preparaciones estériles deberán estar separa-
das y ser distintas de las usadas para las preparaciones no estériles (ver el Capítulo (797), Calidad y Control Ambienta0.
Se debe proveer agua potable para el lavado de manos y equipo. Esta agua cumple con normas establecidas en National
Primary Drinking Water Regulations (Reglamentaciones Básicas sobre Agua Potable) de la Environmental Protection Agency
(Agencia de Protección Ambiental) (40 CFR Parte 141 ). Se deberá usar Agua Purificada (ver la monografía de Agua Purificada)
para elaborar preparaciones de medicamentos no estériles cuando las formulaciones indiquen el uso de agua. Se debe usar
Agua Purificada para enjuagar el equipo y los utensilios. Cuando se usa agua para elaborar una preparación estéril, se deben
seguir las monografías y los capítulos generales apropiados (ver Agua para Uso Farmacéutico (1231 )).
El sistema de cañerías deberá estar libre de defectos que pudieran contribuir a la contaminación de las preparaciones magis-
trales. Se debe contar con acceso fácil a instalaciones de lavado de manos y equipo en las áreas de preparación magistral. Di-
chas instalaciones deberán incluir, entre otros, agua caliente y fría, jabón o detergente y secadores de aire o toallas desecha-
bles o de un solo uso. Las áreas usadas para la preparación magistral deberán mantenerse limpias, ordenadas y en condición
sanitaria, y deberán mantenerse en buenas condiciones de mantenimiento. La basura debe depositarse y desecharse de mane-
ra sanitaria y oportuna y de conformidad con las pautas locales, estatales y federales.
Toda el área de preparación magistral y de almacenamiento debe mantenerse bien iluminada. Hay que controlar los siste-
mas de calefacción, de ventilación y de aire acondicionado para evitar la descomposición y contaminación de los productos
químicos (ver Temperatura y Humedad de Almacenamiento en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Adverten-
cias y Requisitos Generales y las condiciones de almacenamiento dispuestas por el fabricante). Se debe mantener un monitoreo
adecuado de temperatura y humedad según se requiera para ciertos componentes y formas farmacéuticas preparadas. Todos
los componentes, equipos y envases se deben almacenar alejados del piso a fin de prevenir la contaminación y permitir la ins-
pección y limpieza del área de elaboración y almacenamiento de la preparación magistral.
Los fármacos peligrosos deben ser almacenados, preparados y manipulados por personal adecuadamente capacitado en
condiciones que protejan a los trabajadores del cuidado de la salud y demás personal. A continuación se presentan referencias
para la manipulación segura de fármacos antineoplásticos y peligrosos en instalaciones de cuidados de la salud:
• OSHA Technical Manual (Manual Técnico de OSHA)-Sección VI: Capítulo 2, Controlling Occupational Exposure to Hazar-
dous Drugs (Control de Exposición Ocupacional a Fármacos Peligrosos)
• NIOSH Alert (Alerta de NIOSH): Preventing Occupational Exposure to Antineoplastic and Other Hazardous Drugs in Health
Care Settings (Prevención de Exposición Ocupacional a Fármacos Antineoplásticos y Otros Fármacos Peligrosos en Instala-
ciones de Cuidados de la Salud) (DHHS (NIOSH) Publicación No. 2004-165) y actualizaciones.
La eliminación de todos los fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales Todo el
personal que lleve a cabo la eliminación de desechos y actividades de limpieza rutinaria en las áreas de almacenamiento y pre-
paración de fármacos peligrosos deberá estar capacitado en los procedimientos adecuados para protegerse a sí mismos y pre-
venir la contaminación.

EQUIPO PARA ELABORAR LA PREPARACIÓN MAGISTRAL

El equipo y los utensilios usados para elaborar la preparación magistral de un medicamento deberán tener un diseño y capa-
cidad apropiados. Para no afectar ni alterar la pureza de las preparaciones, la composición del equipo deberá ser adecuada, de
modo que las superficies que entran en contacto con los componentes no reaccionen, no provoquen adiciones, ni los adsor-
ban. El tipo y las dimensiones del equipo dependen de las formas farmacéuticas y las cantidades que se preparen (ver el Capí-
tulo (11 76) y los manuales de instrucciones suministrados por el fabricante del equipo).
El equipo deberá almacenarse para protegerlo de la contaminación y deberá estar ubicado de forma tal que se facilite su
uso, mantenimiento y limpieza. El equipo automatizado, mecánico, electrónico y de otros tipos usado en la elaboración o aná-
lisis de la preparación magistral deberá inspeccionarse de manera rutinaria, calibrarse según sea necesario, y verificarse para
51 O (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

asegurar el desempeño adecuado. El preparador deberá inspeccionar el equipo para determinar su aptitud de uso inmediata-
mente antes de realizar las operaciones de preparación. El equipo deberá limpiarse apropiadamente después de su uso.
Se debe tener extremo cuidado al limpiar el equipo usado en la elaboración de preparaciones que requieran de precaucio-
nes especiales (p.ej., antibióticos, materiales citotóxicos y otros materiales peligrosos). Cuando sea posible, se debe destinar
equipo especial para tal propósito, o cuando se use el mismo equipo para todos los productos farmacéuticos, se debe contar
con procedimientos adecuados para permitir la limpieza meticulosa del equipo antes de usarlo con otros medicamentos.
Cuando sea posible, se debe usar equipo desechable para reducir la probabilidad de biocarga o contaminación cruzada.

SELECCIÓN, MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE COMPONENTES

Las siguientes pautas se deben seguir al seleccionar, manipular y almacenar componentes para las preparaciones.
1. Se recomienda una sustancia de calidad Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP), Formulario Nacional (NF), o
Food Chemicals Codex (FCC) como fuente de ingredientes para elaborar todas las preparaciones.
2. Los preparadores deben intentar primero usar componentes fabricados en una instalación registrada con la FDA. Cuando
no sea posible obtener componentes de una instalación registrada con la FDA, los preparadores deben usar su competen-
cia profesional al seleccionar una fuente aceptable y confiable y deben establecer la pureza y la seguridad mediante méto-
dos razonables, los cuales deben incluir un Certificado de Análisis, reputación del fabricante y confiabilidad de la fuente.
3. Las preparaciones magistrales oficiales se elaboran a partir de ingredientes que cumplen con los requisitos de la monogra-
fía oficial para los ingredientes que cuentan con monografía. Estas preparaciones se pueden etiquetar con las siglas USP o
NF, según corresponda.
4. Cuando no sea posible obtener componentes de calidad farmacopeica, se pueden usar componentes de alta calidad tales
como aquellos que son químicamente puros, de grado reactivo analítico o certificados por la American Chemical Society.
No obstante, estos componentes se deben usar con cuidado puesto que los estándares para reactivos analíticos o los ma-
teriales de grado certificado por la American Chemical Society no consideran si una impureza presente implica riesgos de
seguridad para humanos o animales.
5. Para componentes en envases con una fecha de caducidad proporcionada por el fabricante o distribuidor, el material pue-
de usarse en la preparación magistral antes de dicha fecha de caducidad (a) cuando el material se almacene en su envase
original en condiciones que eviten la descomposición de las sustancias químicas (ver el Capítulo (1191) y Requisitos de
Envases y Almacenamiento (659), a menos que se citen otras condiciones en la etiqueta), (b) cuando exista una exposición
mínima del material remanente cada vez que se extrae material del envase, y (c) cuando cualquier extracción del envase
es llevada a cabo por personal capacitado en la manipulación adecuada del material. Si el componente ha sido transferido
a un envase distinto, dicho envase deberá identificarse con el nombre del componente, proveedor original, lote o número
de control, fecha de transferencia y fecha de caducidad, y deberá ofrecer una integridad equivalente o mejor que la del
envase original.
6. Para componentes que no tienen fechas de caducidad asignadas por el fabricante o el proveedor, el preparador deberá
etiquetar el envase con la fecha de recepción y asignar una fecha de caducidad prudente al componente que no exceda
de tres años a partir de la fecha de recepción (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación,
Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales) basándose en la naturaleza del componente
y su mecanismo de degradación, el envase en el que está envasado y las condiciones de almacenamiento.
7. Cuando se usa un medicamento fabricado como fuente del ingrediente activo, el medicamento deberá haber sido fabrica-
do en una instalación registrada con la FDA y el envase del producto provisto por el fabricante deberá estar etiquetado
con un número de control de partida y una fecha de caducidad. Cuando se elaboran preparaciones magistrales con medi-
camentos fabricados, el preparador debe considerar todos los ingredientes, incluidos los excipientes presentes en el medi-
camento con respecto al uso previsto de la preparación, así como el efecto que tendrá la manipulación del medicamento
sobre la aptitud terapéutica y la estabilidad de los componentes.
8. Cuando la preparación esté destinada para su uso como suplemento dietético o nutricional, el preparador deberá respetar
este capítulo y deberá cumplir con todos los requisitos federales y estatales. En general, los suplementos dietéticos se pre-
paran con ingredientes que cumplen con las normas USP, FCC o NF. Cuando no existan tales estándares, se pueden usar
sustancias con una calidad de grado alimenticio comprobada usando otros procedimientos adecuados.
9. Cuando un componente se deriva de animales rumiantes (p.ej., bovinos, caprinos, ovinos), el proveedor deberá propor-
cionar garantía por escrito de que el componente cumple con todas las leyes federales que rigen los requisitos de procesa-
miento, uso e importación para estos materiales.
1 O. Cuando se elaboran preparaciones magistrales para humanos, el preparador deberá consultar la lista de componentes que
han sido retirados o extraídos del mercado por la FDA por razones de seguridad o eficacia (ver www.FDA.gov). Cuando se
elaboran preparaciones magistrales para animales con los que se producen alimentos, el preparador debe consultar la lista
de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos.
11. Todos los componentes usados en la elaboración de preparaciones magistrales deben almacenarse según las instrucciones
del fabricante o de acuerdo con los requisitos de la monografía USP, NF, o FCC, en un área limpia y en condiciones de
temperatura y humedad apropiadas (temperatura ambiente controlada, refrigerador o congelador). Todos los componen-
tes deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminación, y rotarse de modo que
se use primero el componente más antiguo. Todos los envases deben etiquetarse apropiadamente.
USP 37 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 511

CRITERIOS DE ESTABILIDAD V DETERMINACIÓN DE LA FECHA LÍMITE DE USO

La FLU es la fecha después de la cual la preparación magistral no debe usarse y se determina a partir de la fecha de elabora-
ción de la preparación. Debido a que las preparaciones magistrales están destinadas a administrarse inmediatamente o luego
de un período de almacenamiento corto, las fechas límite de uso pueden determinarse en función de criterios distintos a los
utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados.
Las FLU deben fijarse de manera conservadora. Para determinar la FLU los preparadores deben consultar y aplicar la informa-
ción disponible en la documentación y literatura sobre la estabilidad en general y la del fármaco en particular, y deben consi-
derar:
• la naturaleza del fármaco y su mecanismo de degradación
• la forma farmacéutica y sus componentes
• el potencial de proliferación microbiana en la preparación
• el envase en el que está envasado
• las condiciones de almacenamiento esperadas
• la duración prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación, Envasado,
Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales).
Cuando se usa un producto fabricado como fuente del ingrediente activo farmacéutico para una preparación magistral no
estéril, la fecha de caducidad del producto no podrá usarse como único elemento para fijar una FLU para la preparación magis-
tral, sino que el preparador deberá referirse a la información de estabilidad provista por el fabricante y a la literatura para obte-
ner información aplicable sobre estabilidad, compatibilidad y degradación de ingredientes, además de considerar los factores
de estabilidad presentados en el Capítulo (1191 ); asimismo, deberá usar sus conocimientos de preparación magistral y expe-
riencia. Todos los datos de estabilidad deben ser cuidadosamente interpretados en función de la formulación realmente prepa-
rada.
Es necesario que el preparador observe el medicamento preparado para detectar signos de inestabilidad durante todas las
etapas del proceso de preparación, dispensación y almacenamiento. En el Capítulo (1191 ), Consideraciones Sobre Estabilidad en
la Práctica de Dispensación, se encuentran detalles más específicos sobre algunos signos físicos de deterioro comunes. Sin em-
bargo, la degradación química excesiva y otras pérdidas de concentración del fármaco ocasionadas por reacciones suelen ser
invisibles.

Pautas Generales Para Fijar la Fecha Límite de Uso

Ante la ausencia de información de estabilidad del fármaco y de la preparación específica, la siguiente tabla presenta las fe-
chas límite de uso máximas recomendadas para (1) preparaciones magistrales de fármacos no estériles que se envasan en en-
vases impermeables y resistentes a la luz y se almacenan a temperatura ambiente controlada, a menos que se indique algo
distinto; y para (2) preparaciones estériles para las que se cuenta con un programa de esterilidad (ver Conservación, Envasado,
Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales). Los fármacos o químicos que tienden a descomponerse
requerirán de fechas límite de uso más cortas.

FLU por Tipo de Formulaciónª

Para Formulaciones No Acuosas-La FLU no deberá ser mayor al tiempo restante hasta la fecha de caducidad más cercana de cualquier ingrediente
activo farmacéutico o 6 meses, lo que ocurra primero.
Para Formulaciones Orales que Contienen Agua-La FLU no será mayor de 14 días cuando se almacenan a temperaturas frías controladas.
Para Formulaciones Líquidas o Semisólidos que Contienen Agua, de aplicación Tópica/Dérmica o sobre Mucosas-La fecha límite de uso no será
mayor de 30 días.
ª Las siguientes FLU máximas se recomiendan para preparaciones magistrales de medicamentos no estériles cuando no se cuenta con información de estabilidad
del fármaco o la preparación específica. La FLU no deberá ser mayor a la fecha de caducidad indicada en el envase de cualquier componente.

Las preparaciones susceptibles deben contener agentes antimicrobianos adecuados que las protejan de la contaminación
por bacterias, levaduras y hongos introducidos inadvertidamente durante o después del proceso de preparación magistral.
Cuando existe una contraindicación para conservantes antimicrobianos en estas preparaciones magistrales, será necesario al-
macenar la preparación a temperatura fría controlada; para asegurar el almacenamiento y la manipulación adecuados de tales
preparaciones magistrales por parte del paciente o el proveedor de cuidados, resulta esencial instruir y ofrecer consulta apro-
piada al paciente. No se deben usar conservantes antimicrobianos como sustitutos de las buenas prácticas de preparación ma-
gistral.
Para información sobre asignación de fechas límite de uso para medicamentos reenvasados para dispensación o administra-
ción, ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en
Advertencias y Requisitos Generales y Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (11 36).
Es obligatorio garantizar la esterilidad de una preparación magistral estéril. La preparación y el envasado de medicamentos
estériles, (incluidas las preparaciones oftálmicas) requieren un cumplimiento estricto de las pautas contenidas en el Capítulo
(797) y en las instrucciones de etiquetado del fabricante.
512 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

ENVASADO V ENVASES DE PREPARACIONES MAGISTRALES

El preparador debe asegurar que los envases y cierres de envases usados en el envasado de preparaciones magistrales cum-
plen con los requisitos de USP (ver Requisitos de Envases y Almacenamiento (659); Envases-Vidrio (660); Envases-Plástico (661 );
Envases-Pruebas de Desempeño (671 ); el Capítulo (1136)); y cuando estén disponibles, las monografías de preparación magis-
tral. No se espera que los preparadores realicen las pruebas descritas en los capítulos mencionados, pero deben tener conoci-
miento acerca de las normas en ellos descritas. Los proveedores de envases deben proporcionar, cuando se les solicite, la verifi-
cación del cumplimiento del envase con USP. Los envases y cierres de envases destinados para la elaboración de preparaciones
magistrales estériles deben manipularse según se indica en el Capítulo (797).
Los envases y cierres deberán estar fabricados con material limpio y adecuado a fin de no alterar la calidad, contenido o
pureza de la preparación magistral. Utilizar un envase seleccionado según las propiedades físicas y químicas de la preparación
magistral. Se debe considerar la interacción envase-fármaco para sustancias con propiedades adsortivas o de lixiviación.
Los envases y cierres deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminación, y rotarse
de modo que se usen primero los más antiguos. Los envases y cierres de envases deben almacenarse de modo que se permita
la inspección y limpieza del área de almacenamiento.

DOCUMENTACIÓN SOBRE PREPARACIÓN MAGISTRAL

La documentación, escrita o electrónica, permite al preparador rastrear, evaluar y repetir sistemáticamente los pasos inclui-
dos en todo el proceso de elaboración de una preparación magistral, siempre que lo necesite. Todos los preparadores que dis-
pensan recetas deben cumplir con los requisitos de manutención de registros de sus consejos estatales de farmacia. No se re-
quiere documentación adicional cuando el preparador elabora una preparación magistral de acuerdo con las instrucciones del
etiquetado provistas por el fabricante. Todas las demás preparaciones magistrales requerirán de documentación adicional se-
gún se describe en esta sección.
El período de conservación de los registros es idéntico al período dispuesto por la legislación estatal para cualquier receta
médica. El registro puede ser una copia de la prescripción, escrita o en forma de registro electrónico, que incluya el Registro
Maestro de Formulación y el Registro de Preparación.

Registro Maestro de Formulación

Este registro deberá incluir:

• nombre oficial o asignado, contenido y forma farmacéutica de la preparación
•cálculos requeridos para determinar y verificar cantidades de componentes y dosis de ingredientes farmacéuticos activos
• descripción de todos los ingredientes y sus cantidades
• compatibilidad e información sobre estabilidad, incluyendo referencias cuando estén disponibles
• equipo necesario para elaborar la preparación, cuando corresponda
• instrucciones de mezclado que deberán incluir:
1. orden de mezclado
2. temperaturas de mezclado u otros controles ambientales
3. duración del mezclado
4. otros factores pertinentes a la reproducción de la preparación a medida que se elabora
• información de etiquetado de la muestra, que deberá contener, además de la información legalmente requerida:
1. nombre genérico y cantidad o concentración de cada ingrediente activo
2. FLU asignada
3. condiciones de almacenamiento
4. número de prescripción o de control, según corresponda
• envase usado para la dispensación
• requisitos de envasado y almacenamiento
• descripción de la preparación final
• procedimientos de control de calidad y resultados esperados

Registro de Preparación Magistral

El Registro de Preparación Magistral deberá contener:

• el nombre oficial o asignado, contenido y dosis de la preparación
• referencia al Registro Maestro de Formulación para la preparación
• nombres y cantidades de todos los componentes
• fuentes, números de lote y fechas de caducidad de los componentes
• cantidad total preparada
USP 37 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 51 3

• nombre de la persona que elaboró la preparación, nombre de la persona que llevó a cabo los procedimientos de control
de calidad y nombre del preparador que aprobó la preparación
• fecha de preparación
• número de control o prescripción asignado
• FLU asignada
• doble etiqueta según se describe en el Registro Maestro de Formulación
• descripción de la preparación final
• resultados de los procedimientos de control de calidad (p.ej., intervalo de peso de las cápsulas llenadas, pH de líquidos
acuosos)
• documentación de cualquier problema de control de calidad y cualquier reacción adversa o problema de la preparación
informados por el paciente o el proveedor de cuidados

Procedimientos Operativos Estándar

Todos los procedimientos significativos realizados en el área de preparación magistral deben estar cubiertos por procedi-
mientos operativos estándar (POE) escritos. Deben desarrollarse procedimientos para instalaciones, equipo, preparación, enva-
sado y almacenamiento de preparaciones magistrales para asegurar la confiabilidad, exactitud, calidad, seguridad y uniformi-
dad de la preparación magistral. La aplicación de POE establece una uniformidad en los procedimientos, además de proveer
referencias para la orientación y capacitación del personal.

Archivos de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales

Las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales (MSDS, por sus siglas en inglés) deben ser de fácil acceso para todos los
empleados que trabajan con medicamentos o productos químicos a granel ubicados en las instalaciones de preparación ma-
gistral. Debe instruirse a los empleados acerca de cómo conseguir e interpretar la información necesaria.

CONTROL DE CALIDAD

La seguridad, la calidad y el desempeño de las preparaciones magistrales dependen de una correcta utilización de los ingre-
dientes, cálculos bien hechos, mediciones precisas y exactas, condiciones y procedimientos de formulación adecuados y el
ejercicio prudente del criterio farmacéutico. El preparador deberá realizar una última verificación de cada procedimiento utili-
zado en el proceso de preparación magistral. El preparador, con el fin de asegurar la exactitud y la integridad, deberá observar
la preparación terminada para determinar que su apariencia es la esperada y deberá investigar cualquier discrepancia, adop-
tando las medidas necesarias para corregirlas antes de dispensar la receta médica al paciente.

Controles para la Preparación Magistral

1. Es necesario seguir el Registro Maestro de Formulación, el Registro de Preparación, y los procedimientos escritos relacio-
nados durante la ejecución del proceso de preparación magistral. Cualquier desviación en los procedimientos debe ser
documentada.
2. El preparador deberá realizar una verificación y posteriormente volver a verificar cada procedimiento en cada etapa del
proceso. Cuando sea posible, una segunda persona capacitada debe verificar cada etapa crítica del proceso de prepara-
ción.
3. El preparador deberá contar con procedimientos establecidos por escrito que describan las pruebas o exámenes realizados
a la preparación magistral (p.ej., el grado de variación de peso entre cápsulas) para asegurar su uniformidad e integridad.
4. Se deben establecer procedimientos de control adecuados para monitorear los resultados y para verificar el desempeño
de los procesos de preparación y equipos que pudieran ser responsables de las variaciones en las preparaciones magistra-
les finales.
5. Para más información y pautas sobre los procesos de control de calidad recomendados, ver el Capítulo (1163).

CONSEJOS AL PACIENTE

Al momento de dispensar la receta, se debe aconsejar al paciente o al representante del paciente sobre el uso, almacena-
miento, manipulación y desecho apropiados de la preparación. Además, se debe instruir al paciente o al representante del pa-
ciente para que informe sobre cualquier evento adverso y para que observe e informe al preparador sobre cualquier cambio en
las características físicas de la preparación magistral (ver el Capítulo (1191 ), Responsabilidad del Farmacéutico). El preparador
deberá investigar y documentar cualquier problema informado que se relacione con una preparación magistral, y deberá to-
mar las medidas correctivas.
514 (795) Preparación Magistral~Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

CAPACITACIÓN

Todo el personal implicado en la preparación, evaluación, envasado y dispensación de preparaciones magistrales deberá re-
cibir capacitación adecuada para el tipo de preparación magistral realizada. Es responsabilidad del preparador asegurar la im-
plementación de un programa de capacitación y que éste se aplique de manera continua. El personal de preparación magistral
debe ser evaluado por lo menos una vez al año. Las etapas en el proceso de capacitación incluyen lo siguiente:
•Todos los empleados implicados en la preparación magistral farmacéutica deberán leer y familiarizarse con este capítulo.
Además, deben estar familiarizados con el contenido de la USP Pharmacists' Pharmacopeia y demás publicaciones perti-
nentes, lo cual incluye cómo leer e interpretar las MSDS.
•Todos los empleados deberán leer y familiarizarse con cada uno de los procedimientos relacionados con la preparación
magistral, incluyendo aquellos que involucren las instalaciones, equipo, personal, preparación magistral en sí rnisrna, eva-
luación, envasado, almacenamiento y dispensación.
•Todo el personal que elabore preparaciones magistrales de fármacos peligrosos deberá estar totalmente capacitado en al-
macenamiento, manipulación y desecho de estos fármacos. Esta capacitación se debe dar antes de preparar o manipular
fármacos peligrosos. Para información sobre capacitación de personal que elabora preparaciones magistrales de fármacos
peligrosos, ver las referencias en la sección Instalaciones de Preparación Magistral de este capítulo.
•Todas las actividades de capacitación deberán quedar documentadas. El preparador deberá reunirse con los empleados
para revisar su trabajo y responder cualquier pregunta de los empleados en relación con los procedimientos de prepara-
ción magistral.
• El preparador deberá hacer una demostración de los procedimientos para el empleado y deberá observar y guiar al em-
pleado durante todo el proceso de capacitación. Posteriormente, el empleado repetirá el procedimiento sin recibir ayuda
alguna por parte del preparador pero bajo su supervisión directa.
• Cuando el empleado haya demostrado al preparador un conocimiento verbal y funcional del procedimiento se le permiti-
rá realizar el procedimiento sin supervisión directa. No obstante, el preparador deberá estar presente físicamente y deberá
aprobar todos los ingredientes y sus cantidades, así corno la preparación final.
• Cuando el preparador esté satisfecho con el conocimiento y competencia del empleado, el preparador deberá firmar los
registros de documentación para demostrar que el empleado ha recibido la capacitación adecuada.
• El preparador deberá rnonitorear continuamente el trabajo del empleado y asegurar que los cálculos y el trabajo del em-
pleado sean exactos y se realicen de manera adecuada.
• El preparador es el único responsable de la preparación terminada.

PREPARACIONES MAGISTRALES PARA PACIENTES ANIMALES

La responsabilidad del preparador para proporcionar preparaciones magistrales de alta calidad a los pacientes se extiende
más allá de los seres humanos. Todas las partes de este capítulo aplican a preparaciones magistrales formuladas para pacientes
animales. Se deberá determinar antes de realizar la preparación magistral si la rnisrna está destinada al uso de un paciente ani-
mal (p.ej., de compañía, de competición, para alimento).
Debido a que el alimento derivado de pacientes animales puede ser consumido por seres humanos, se debe tener cuidado
para prevenir que los residuos del fármaco ingresen a la cadena alimenticia humana cuando se elaboran preparaciones magis-
trales para su uso en pacientes animales. Por esta razón, todos los preparadores que preparan formulaciones para animales
deben tener conocimientos funcionales sobre regulación y aplicación de fármacos en pacientes animales. Por ley, los veterina-
rios están obligados a proporcionar a los cuidadores de animales con los que se producen alimentos un periodo de retención
de los tejidos animales tratados (p.ej. carne, leche, huevo) antes de introducirlos en el suministro alimenticio humano. A este
periodo se le denomina como tiempo de retiro (WDT, por sus siglas en inglés) y, por ley, también se debe incluir en la etiqueta
de dispensación de cada prescripción preparada para especies que se usan en la producción de alimentos.
El uso de fármacos en cualquier animal de competición está estrictamente regulado por los gobiernos federal y estatales,
además de los órganos que rigen cada una de las disciplinas específicas. Las penas por infringir dichas reglas pueden ser seve-
ras para todos los que contribuyan con la falta, incluidos veterinarios, farmacéuticos y cuidadores.
El farmacéutico deberá estar apercibido de las limitantes para las especies específicas en su capacidad fisiológica y metabóli-
ca que pudieran resultar en toxicidad cuando se usan ciertos fármacos o excipientes en las preparaciones magistrales. Por esta
razón, los preparadores que elaboran preparaciones para animales deben usar, cuando sea posible, formulaciones desarrolla-
das específicamente para pacientes animales. Cuando dichas formulaciones no estén disponibles, el preparador deberá revisar
la literatura para determinar si un componente específico de la fórmula es tóxico para las especies a tratar. La extrapolación de
formulaciones que se preparan magistralmente destinadas para su uso en humanos puede no ser adecuada para especies ani-
males y puede ocasionar resultados negativos.
Los veterinarios y farmacéuticos que elaboran preparaciones para pacientes animales deben estar familiarizados con todas las
legislaciones estatales y federales relacionadas con el uso de fármacos en animales, incluyendo, entre otras, la Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley de Alimentos, Fármacos y Cosméticos); la Animal Drug Amendment (Enmienda sobre Fármacos en Anima-
les); la Animal Medicinal Drug Use Clarification Act (Ley de Aclaración del Uso Medicinal de Fármacos en Animales); y la Com-
pliance Policy Guideline for Compounding of Drugs for Use in Animal Patients (Guía sobre las Políticas de Preparación Magis-
tral de Fármacos para su Uso en Pacientes Animales) de la FDA.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 515

(797) PREPARACIÓN MAGISTRAL-PREPARACIONES ESTÉRILES

INTRODUCCIÓN

El objetivo de este capítulo es describir las condiciones y prácticas para evitar lesiones, e incluso la muerte de pacientes como
resultado de (1) contaminación microbiana (no esterilidad), (2) endotoxinas bacterianas en exceso, (3) variabilidad en la con-
centración pretendida de los ingredientes correctos, que exceda bien sea los límites de la monografía para artículos oficiales
(ver "Oficial" y "Artículos Oficiales" en las Advertencias y Requisitos Generales) o 10% para los artículos no oficiales, (4) contami-
nantes químicos y físicos no esperados, y (5) ingredientes de calidad inadecuada en las preparaciones magistrales estériles
(PME). Las PME contaminadas son potencialmente más riesgosas para los pacientes cuando se administran en cavidades cor-
porales, los sistemas nervioso y vascular, los ojos y las articulaciones y cuando se usan como baños para órganos y tejidos vi-
vos. Cuando las PME contienen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) son potencial-
mente más riesgosas para los pacientes cuando se administran dentro del sistema nervioso central.
A pesar de la exhaustiva atención dedicada en este capítulo a la provisión, mantenimiento y evaluación de la calidad de aire,
resulta fundamental evitar la contaminación directa o por contacto físico. Por lo general, se reconoce que el contacto físico o
directo de sitios críticos de las PME con contaminantes, especialmente fuentes microbianas, representa la más alta probabilidad
de riesgo para los pacientes. Por lo tanto, el personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente
cuidadoso en evitar la contaminación por contacto de las PME, tanto dentro de las áreas ISO Clase 5 (ver Tabla 1), como fuera
de ellas.
Con el fin de conseguir las cinco condiciones y prácticas descritas anteriormente, este capítulo proporciona las normas míni-
mas de práctica y calidad para las PME de fármacos y nutrientes, basadas en la información científica actual, así como en las
mejores prácticas para preparaciones magistrales estériles. El uso de tecnologías, técnicas, materiales y procedimientos distin-
tos de los descritos en este capítulo no está prohibido mientras se pruebe que son equivalentes o superiores, con significación
estadística, a los descritos aquí. Las normas de este capítulo no se refieren a la administración clínica de PME a pacientes me-
diante aplicación, implantación, infusión, inhalación, inyección, inserción, instilación e irrigación, que son las rutas de adminis-
tración. En este capítulo se describen cuatro categorías específicas de PME: nivel de riesgo bajo, nivel de riesgo mediano y nivel
de riesgo alto, y uso inmediato. La preparación magistral estéril difiere de la preparación no estéril (ver Preparación Magistral-
Preparaciones No Estériles (795) y Buenas Prácticas de Preparación Magistral (l 075)) principalmente al requerir el mantenimiento
de la esterilidad cuando se preparan exclusivamente con ingredientes y componentes estériles (es decir, PME de uso inmedia-
to, PME de nivel de riesgo bajo y PME de nivel de riesgo mediano) y la consecución de esterilidad al prepararlas con ingredien-
tes y componentes no estériles (es decir, PME de nivel de riesgo alto). Algunas diferencias entre las normas para la preparación
magistral estéril en este capítulo y aquellas de las preparaciones magistrales no estériles en Preparación Magistral-Preparacio-
nes No Estériles (795) incluyen, entre otras, ambientes de aire con clasificación ISO (ver Tabla 1); vestimenta y guantes del per-
sonal; capacitación del personal y pruebas sobre principios y prácticas de manipulaciones asépticas y esterilización; especifica-
ciones de calidad ambiental y monitoreos; y desinfección de guantes y superficies de fuentes ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
Tabla 1. Clasificación ISO de Partículas en el Aire Ambiental (los límites se expresan en partículas mayores o iguales a 0,5 µm por metro cúbico
[ISO actual] y pie cúbico [anteriormente Norma Federal Nº 209E, y en lo sucesivo FS 209E (siglas en inglés)])*
Nombre de la Clase Recuento de Partículas
Clase ISO FS 209E de EE.UU. ISO,m 1 FS 209E, piel
3 Clase 1 35,2 1
4 Clase 1 O 352 10
-
5 Clase 100 3520 100
6 Clase 1000 35 200 1000
7 Clase 1O000 352 000 10000
8 Clase 1 00 000 3 520 000 100000
* Adaptado de la FS Nº 209E, Administración de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1 :1999, Cleanrooms
and associated controlled environments-Part 1: Classification of air cleanliness. Por e¡emplo, 3520 partículas mayores o iguales a 0,5 pm por m 1 (ISO Clase 5)
equivalen a 100 partículas por pie 1 (Clase 1 00) (1 m 3 ~ 35,2 pies 1 ).

Las normas en este capítulo están destinadas a todas las personas que elaboren PME y todos los sitios donde se preparen
PME (p.ej., hospitales y otras instituciones de salud, clínicas de tratamiento de pacientes, farmacias, instituciones de práctica
médica y otras instalaciones y sitios en donde se preparen, almacenen y transporten PME). Entre las personas que hacen las
preparaciones magistrales estériles se cuentan farmacéuticos, enfermeras, técnicos de farmacia y médicos. Estos términos reco-
nocen que la mayoría de las preparaciones magistrales estériles las realizan o supervisan farmacéuticos en farmacias y también
que este capítulo aplica a todo el personal de salud que prepara, almacena y transporta PME. A los efectos de este capítulo,
PME incluye cualquiera de las siguientes:
(1) Preparaciones magistrales de productos biológicos, de diagnóstico, fármacos, nutrientes y productos radiofarmacéuticos,
incluyendo, entre otras, a las siguientes formas farmacéuticas que deben estar estériles cuando se administran a pacientes:
inhalaciones bronquiales y nasales acuosas, baños y soluciones para órganos y tejidos vivos, inyecciones (p.ej., dispersio-
 ,.
516 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas USP 37

nes coloidales, emulsiones, soluciones, suspensiones), irrigaciones para heridas y cavidades corporales, gotas y ungüentos
oftálmicos e implantes tisulares.
(2) Productos estériles fabricados, que se preparan estrictamente de acuerdo con las instrucciones que aparecen en el etique-
tado aprobado del fabricante (prospectos adjuntos del producto) o se preparan en forma diferente a lo publicado en di-
cho etiquetado. [NOTA-La FDA estipula que "la Preparación Magistral no incluye mezclado, reconstitución o acciones
similares que se efectúen de acuerdo con las instrucciones contenidas en el etiquetado aprobado suministrado por el fa-
bricante del producto, así como otras instrucciones del fabricante que concuerden con el etiquetado" [21 use 321 (k) y
(m)]. Sin embargo, el etiquetado aprobado por la FDA (prospecto adjunto del producto) rara vez describe la calidad am-
biental (p.ej., designación de Clase ISO del aire, la duración de la exposición a aire no clasificado por ISO, la vestimenta y
guantes del personal, ni otras precauciones asépticas bajo las cuales se preparan los productos estériles para administra-
ción). La fecha o el tiempo límite de uso y almacenamiento (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparación Magis-
tral-Preparaciones No Estériles (795)) para productos estériles que han sido abiertos o preparados para administración no
se especifican en todos los prospectos adjuntos de todos los productos estériles. Además, cuando se especifican, tales du-
raciones pueden referirse a la estabilidad química y no necesariamente a la pureza o seguridad microbiológicas.]

ORGANIZACIÓN DE ESTE CAPÍTULO

Las secciones de este capítulo están organizadas para facilitar a los profesionales de salud la comprensión de las prácticas
fundamentales relativas a la exactitud y calidad requeridas para preparar las PME. Proporcionan la base para el desarrollo e
implementación de procedimientos esenciales para la elaboración segura de PME de niveles de riesgo bajo, mediano y alto, y
PME de uso inmediato, las cuales se clasifican según el potencial de contaminación microbiana, química y física. El capítulo se
divide en las siguientes secciones principales:
• Definiciones
• Responsabilidad del Personal de Preparación Magistral
• Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME
• Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica
• PME de Uso Inmediato
• Envases Monodosis y Multidosis
• Fármacos Peligrosos como PME
• Preparados Radiofarmacéuticos como PME
• Extractos de Alérgenos como PME
•Verificación de la Exactitud y Esterilidad de la Preparación Magistral
• Calidad y Control Ambiental
• Procedimientos Operativos Estándares (POE) Sugeridos
• Elementos de Control de Calidad
• Verificación de Dispositivos Automatizados de Preparación Magistral (DAP) para Nutrición Parenteral
• Controles y Pruebas de Liberación de las Preparaciones Terminadas
• Almacenamiento y Fechado de Límite de Uso
• Mantenimiento de la Esterilidad, Pureza y Estabilidad de las PME Dispensadas y Distribuidas.
• Capacitación del Paciente o Persona Encargada de Su Cuidado
• Monitoreo del Paciente e Informe de Eventos Adversos
• Programa de Garantía de Calidad (QA)
• Abreviaturas y Acrónimos
• Apéndices 1-V
Los requisitos y recomendaciones en este capítulo se resumen en el Apéndice /. Al final del texto principal, antes de los Apén-
dices, se incluye una lista de abreviaturas y acrónimos.
Todo el personal que participa en la elaboración de PME tiene la responsabilidad de comprender estas prácticas y precaucio-
nes fundamentales, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos proce-
dimientos y la calidad de la PME final para evitar daños.

DEFINICIONES

Aislador Aséptico de Contención para Preparación Magistral (CACI, por sus siglas en inglés)-Un aislador aséptico pa-
ra preparación magistral (CAi, por sus siglas en inglés) diseñado para proteger al trabajador de la exposición a concentraciones
indeseables de fármacos dispersados en el aire durante los procesos de preparación y transferencia del material y para propor-
cionar un ambiente aséptico para la elaboración de preparaciones magistrales estériles. No debe ocurrir intercambio de aire
con el medio que lo rodea, a menos que el aire pase primero a través de un sistema de filtro de retención microbiana (HEPA,
como mínimo) capaz de retener las concentraciones de partículas aéreas del tamaño y estado físico del fármaco que se está
preparando magistralmente. Cuando se trabaja con fármacos volátiles peligrosos, el aire de salida del aislador se debe extraer a
través de una ventilación debidamente diseñada en el edificio.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 51 7

Aislador Aséptico para Preparación Magistral (CAi, por sus siglas en inglés)-Una forma de aislador específicamente
diseñado para la elaboración magistral de ingredientes o preparaciones farmacéuticas. Está diseñado para mantener un am-
biente aséptico de preparación dentro del aislador, durante los procesos de preparación magistral y transferencia de material.
No debe ocurrir intercambio de aire entre el aislador y el medio que lo rodea, a menos que el aire haya pasado primero a
través de un filtro de retención microbiana (HEPA, como mínimo). 2
Antesala-Una sala ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o mejor, donde el personal efectúa procedimientos de higiene de manos y
vestimenta, clasificación de componentes, ingreso de órdenes, etiquetado de PME y otras actividades que producen gran can-
tidad de partículas. Es también un área de transición que (1) brinda la garantía de que las relaciones de presión se mantienen
constantemente de forma que el aire fluya de las zonas limpias a las sucias y (2) reduce la necesidad de que el control del
sistema de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC) responda a perturbaciones grandes. 1
Área Crítica-Un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
Área Directa de Preparación Magistral (ADP)-Un área crítica dentro de un control de ingeniería primario (CIP) ISO Clase
5 (ver Tabla 7) donde los sitios críticos se exponen a aire unidireccional filtrado por HEPA, conocido también como primer aire.
Área Segregada para Elaboración de Preparaciones Magistrales-Un espacio reservado, bien sea un área demarcada o
un cuarto, que se restringe a la preparación de PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Dicha área debe
contener un dispositivo que proporcione flujo de aire unidireccional de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la elaboración de
PME y no debe destinarse a actividades ni contener materiales que sean extraños a la preparación magistral estéril.
Cabina de Seguridad Biológica (CSB)-Una cabina ventilada para protección ambiental, de la PME, del personal y del
producto, que tiene un frente abierto, con flujo de aire hacia el interior para protección del personal, flujo de aire laminar des-
cendente con filtración de alta eficiencia para partículas aéreas (HEPA, por sus siglas en inglés) para protección del producto y
salida de aire con filtración HEPA para protección ambiental.
Control de Ingeniería Primario (CIP)-Un dispositivo o cuarto que brinda un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la
exposición de sitios críticos cuando se elaboran las PME. Dichos dispositivos incluyen, entre otros, cabinas de flujo laminar
(CFL), cabinas de seguridad biológica (CSB), aisladores asépticos para preparación magistral (CAi) y aisladores asépticos de
contención para preparación magistral (CACI).
Cuarto de Presión Negativa-Un cuarto que está a presión más baja que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo
neto de aire es hacia el cuarto.1
Cuarto de Presión Positiva-Un cuarto que está a presión más alta que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo neto
de aire es hacia afuera del cuarto.1
Cuarto Limpio (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) y también la definición
de Zona Amortiguadora)-Un cuarto en el que se controla la concentración de partículas en el aire para que cumpla con una
clasificación de limpieza especificada de partículas aéreas. Se monitorean los microorganismos en el ambiente para que la con-
centración microbiana en el aire, las superficies y el atuendo del personal no exceda el límite de limpieza especificado.
Desinfectante-Un agente, generalmente un agente químico pero en ocasiones físico, que libra de la infección y destruye
los patógenos causantes de enfermedad u otros microorganismos peligrosos, pero que no necesariamente elimina esporas
bacterianas o fúngicas. Se refiere a sustancias aplicadas a objetos inanimados.
Empaque a Granel para Farmacias (ver Envases para Inyecciones en Inyectables (1 ))-Un envase de una preparación estéril
para uso parenteral que contiene muchas dosis únicas. El contenido está destinado para su uso en un programa de mezclas de
farmacia y está restringido a la preparación de mezclas para infusión o, a través de un dispositivo de transferencia estéril, para
el llenado de jeringas estériles vacías. El cierre se perforará sólo una vez después de la reconstitución, usando un dispositivo de
transferencia o set de dispensación estéril y adecuado que permita la distribución medida del contenido. El empaque a granel
para farmacias sólo se empleará en un área de trabajo adecuada, como por ejemplo una campana de flujo de aire laminar (o
un área equivalente de preparación magistral de aire limpio).
Cuando se ofrezca un envase como empaque a granel para farmacias, la etiqueta debe (a) indicar en forma visible "Empa-
que a Granel para Farmacias, No Usar para Infusión Directa," (b) contener o referir a información sobre las técnicas apropiadas
para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una leyenda que limite el plazo dentro del cual se puede utili-
zar el envase una vez que ha sido perforado, siempre y cuando se mantenga bajo las condiciones de almacenamiento declara-
das.
Envase Monodosis (ver Advertencias y Requisitos Generales y Envases para Inyecciones en Inyectables (1 ))-Un envase mono-
dosis es un envase unitario para artículos (ver Advertencias y Requisitos Generales) o preparaciones destinadas solamente a la
administración por vía parenteral. Está destinado a un solo uso. Debe estar etiquetado como envase monodosis. Ejemplos de
envases monodosis son: jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por fusión y envases con cierres sellados, cuando se
los etiquete como tales.
Envase Multidosis (ver Advertencias y Requisitos Generales y Envases para Inyecciones en Inyectables (1 ))-Un envase de uni-
dades múltiples para artículos o preparaciones destinadas a administración parenteral solamente y que por lo general contiene
conservantes antimicrobianos. La fecha límite de uso (FLU) para un envase multidosis abierto o perforado (p.ej., perforado con
aguja), que tiene conservantes antimicrobianos, es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fa-
bricante especifique algo distinto.

2 CETA Applications Cuide far the Use of Compounding lsolators in Compounding Sterile Preparations in Healthcare Facilities, CAG-001-2005, Controlled Environment
Testing Association (CETA), 8 de noviembre de 2005.
1 Ver Laboratory Design Cuide (Guía de diseño del laboratorio) de la American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers, /ne. (ASHRAE).
518 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Esterilización por Filtración-Paso de un líquido o solución a través de una membrana de grado de esterilización para pro-
ducir un efluente estéril.
Esterilización Terminal-Aplicación de un proceso letal (p.ej., vapor bajo presión o autoclavado) a los envases sellados,
con el fin de conseguir un nivel de garantía de esterilidad predeterminado, generalmente menor que 10- 6, o una probabilidad
de menos de uno en un millón de que haya una unidad no estéril.3
Etiquetado [ver Advertencias y Requisitos Generales y 21 USC 321 (k) y (m)]-Término que se refiere a todas las etiquetas o
marbetes y demás materiales escritos, impresos o gráficos que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artículo
o preparación, sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio en que esté incluido, con excepción de los embalajes exter-
nos destinados al transporte. El término "etiqueta" designa la parte del etiquetado que se encuentra sobre el envase primario.
Fármacos Peligrosos-Los fármacos se clasifican como peligrosos si los estudios en animales o humanos indican que la ex-
posición a ellos tiene potencial para causar cáncer, toxicidad reproductiva o del desarrollo, o daños a los órganos. (Ver la publi-
cación actual de NIOSH).
Fecha Límite de Uso (FLU) (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles
(795))-A los efectos de este capítulo, la fecha u hora después de la cual no se debe almacenar o transportar una PME. Esta
fecha se determina a partir de la fecha u hora de preparación.
Flujo Unidireccional (ver nota 3 al pie de página)-Un flujo de aire que se mueve en una sola dirección de una forma
robusta y uniforme y a una velocidad suficiente como para barrer las partículas lejos del área crítica de prueba o procesamien-
to, en forma reproducible.
Membranas de Grado de Esterilización-Membranas para las que se ha documentado que retienen 100% de un cultivo
de 10 7 microorganismos de una cepa de Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta por centímetro cuadrado de superficie de
membrana bajo una presión de no menos de 30 psi (2,0 bar). Dichas membranas de filtro tienen tamaño de poro nominal de
0,22 µm o 0,2 µm, dependiendo de la práctica utilizada por el fabricante.
Preparación-Una preparación, o una PME, que es un medicamento o nutriente estéril preparado magistralmente en una
farmacia autorizada u otra institución relacionada con la salud, de acuerdo con la orden de un prescriptor autorizado; el artícu-
lo puede contener productos estériles o no.
Primer Aire-El aire que sale del filtro HEPA en una corriente unidireccional que carece prácticamente de partículas.
Procesamiento Aséptico (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116))-Una mo-
dalidad de procesar productos farmacéuticos y médicos que involucra la esterilización por separado del producto y del empa-
que (envases y cierres o material de empaque para dispositivos médicos) y la transferencia del producto al envase y su cierre en
condiciones ISO Clase 5 (ver Tabla 7) como mínimo.
Producto-Un medicamento o nutriente estéril fabricado comercialmente, cuya seguridad y eficacia han sido evaluadas por
la FDA. Los productos van acompañados de información completa para prescribir, la cual se conoce comúnmente como el
etiquetado del fabricante aprobado por la FDA o prospecto adjunto del producto.
Prueba de Llenado de Medios (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116))-Una
prueba utilizada para calificar los procesos o la técnica aséptica del personal que elabora la preparación magistral, y con el fin
de garantizar que con los procesos usados se puedan elaborar productos estériles sin contaminación microbiana. Durante esta
prueba, se sustituye el producto farmacéutico real con un medio de crecimiento microbiano, como el Medio de Digerido de
Caseína y Soja, para simular la mezcla de la preparación magistral. 3 Los puntos que se deben considerar en el desarrollo de la
prueba de llenado de medios son: procedimientos de llenado de medios, selección de medios, volumen de llenado, incuba-
ción, tiempo y temperatura, inspección de las unidades llenas, documentación, interpretación de los resultados y posibles ac-
ciones correctivas requeridas.
Sitio Crítico-Un sitio que incluye cualquier componente o superficies de recorrido de líquidos (p.ej., septos de viales,
puertos de inyección, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores de agujas) expuestos y en
riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secreciones orales o mucosas) o
contaminación por contacto. En el sitio crítico, el riesgo de contaminación microbiana por partículas aumenta con el tamaño
de las aberturas y el tiempo de exposición.
Zona Amortiguadora-El sitio donde está localizado físicamente el control de ingeniería primario (CIP). Las actividades que
ocurren en esta área incluyen la preparación y clasificación de componentes y suministros usados al preparar la PME.

RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIÓN MAGISTRAL

El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de asegurar que las PME estén debidamente identificadas, me-
didas, diluidas y mezcladas, y correctamente purificadas, esterilizadas, envasadas, selladas, etiquetadas, almacenadas, dispensa-
das y distribuidas. Estas responsabilidades incluyen el mantenimiento de condiciones higiénicas apropiadas y el suministro de
etiquetado e instrucciones suplementarias para la administración clínica correcta de las PME.
Los supervisores de preparación magistral deben asegurar, ya sea mediante la evaluación directa o a través de fuentes de
información apropiadas, que cada PME mantiene el contenido declarado hasta su FLU dentro de los límites de la monografía

3 U.S. Food and Drug Administration, Guidance far lndustry, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice, septiembre
de 2004.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 519

correspondiente de USP, o dentro de un 10% de variación en los casos no especificados. Todas las PME deben prepararse de
manera tal que se mantenga la esterilidad y se reduzca al mínimo la introducción de partículas.
Todo procedimiento escrito de garantía de calidad debe incluir los siguientes controles de proceso, los cuales deberán apli-
carse, según corresponda, a las PME específicas: exactitud y precisión de la medición y pesado; requisitos de esterilidad; méto-
dos de esterilización y purificación; intervalos y límites seguros de concentración de ingredientes, endotoxinas bacterianas y
partículas; pH; totalidad y exactitud de la información incluida en el etiquetado; asignación de la FLU; y requisitos de empaque
y almacenamiento. El dispensador deberá, cuando corresponda y sea factible, obtener y evaluar los resultados de las pruebas
de identidad, contenido, pureza y esterilidad antes de dispensar una PME. Los profesionales de la salud, calificados y autoriza-
do, a cargo de supervisar la preparación magistral y la dispensación de las PME deberán asegurar que se cumplan los siguien-
tes objetivos:
1. El personal de preparación magistral debe contar con las habilidades, educación, instrucción y capacitación apropiadas
para realizar y documentar correctamente las siguientes actividades relacionadas con sus responsabilidades en la prepara-
ción estéril:
a. realizar la limpieza antiséptica de manos y desinfección de las superficies de preparación no estériles;
b. seleccionar y colocarse la vestimenta en forma apropiada;
c. mantener o conseguir la esterilidad de las PME en dispositivos CIP, ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y proteger al personal y
a los ambientes de preparación magistral de la contaminación por fármacos radioactivos, citotóxicos y quimiotóxicos
(ver Fármacos Peligrosos como PME y Preparados Radiofarmacéuticos como PME);
d. identificar, pesar y medir los ingredientes; y
e. manipular los productos estériles en forma aséptica, esterilizar las PME de nivel de riesgo alto y etiquetar e inspeccio-
nar la calidad de las PME.
2. Los ingredientes deben tener la identidad, calidad y pureza correctas.
3. Los envases de ingredientes abiertos o parcialmente usados que se van a emplear posteriormente en PME deben almace-
narse apropiadamente bajo condiciones de acceso restringido en las instalaciones donde se realiza la preparación magis-
tral. Dichos envases no podrán utilizarse cuando se detecte en una inspección visual que hay roturas no autorizadas en el
envase, cierre y sello; cuando el contenido no posea el aspecto, aroma y textura esperados; cuando el contenido no pase
las pruebas de identificación especificadas por la institución responsable de la preparación magistral, y cuando haya exce-
dido la FLU o fecha de caducidad.
4. Las PME que contienen agua y que son no estériles durante cualquier fase del procedimiento de preparación deben esteri-
lizarse dentro de las 6 horas posteriores a la finalización de la preparación, para reducir al mínimo la generación de endo-
toxinas bacterianas.
5. Los métodos de esterilización deben lograr la esterilidad de las PME, manteniendo el contenido declarado de los ingre-
dientes activos y la integridad física del envase.
6. Los dispositivos utilizados para medición, mezclado, esterilización y purificación deben estar limpios y ser apropiadamente
exactos y eficaces para los usos a los que están destinados.
7. Se debe evaluar cuidadosamente el daño potencial relacionado con las sustancias agregadas, y las diferencias en el grado
y la velocidad de biodisponibilidad de los ingredientes activos para las vías de administración no oral antes de dispensar y
administrar dichas PME.
8. El envase seleccionado para las PME debe ser apropiado para conservar la esterilidad y el contenido hasta la FLU.
9. Durante su uso, el entorno de preparación magistral debe mantener la esterilidad o la pureza previa a la esterilización de
la PME, según corresponda.
1 O. Las etiquetas de las PME deben indicar los nombres y las cantidades o concentraciones de los ingredientes activos; y las
etiquetas o etiquetado de inyecciones (ver Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Re-
quisitos Generales) enumeran los nombres y las cantidades o concentraciones de todos los ingredientes (ver Inyectables
(l )). Antes de su dispensación o administración, debe verificarse visualmente la transparencia de las soluciones y, además,
deben revisarse la identidad y la cantidad de los ingredientes, los procedimientos de preparación y esterilización de las
PME y los criterios de liberación específicos para asegurarse de que sean exactos y completos.
11. Las FLU deben asignarse basándose en pruebas directas o por extrapolación de publicaciones de referencia y otra docu-
mentación confiables (ver Criterios de Estabilidad y Fecha Límite de Uso en Preparación Magistral--Preparaciones No Estériles
(795)).
12. Los procedimientos para medir, mezclar, diluir, purificar, esterilizar, envasar y etiquetar deben ajustarse a la secuencia co-
rrecta y al nivel de calidad establecido para cada PME en particular.
13. Las deficiencias en la preparación magistral, etiquetado, envasado y pruebas e inspección de calidad deben poder detec-
tarse y corregirse rápidamente.
14. Cuando el tiempo y la disponibilidad de personal lo permitan, las manipulaciones y los procedimientos de preparación
magistral deben estar separados de la inspección y revisión de calidad postpreparación que se llevan a cabo antes de la
dispensación de las PME.
Este capítulo enfatiza la necesidad de mantener estándares elevados de calidad y control en relación con los procesos, com-
ponentes y ambientes de preparación, y en relación con las habilidades y los conocimientos del personal a cargo de la elabora-
ción de las PME. El rigor de los controles de calidad durante el proceso, de la inspección y pruebas de calidad posteriores a la
preparación, aumenta en forma proporcional al nivel de riesgo potencial que supone la vía de administración. Por ejemplo, la
 111

520 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

falta de esterilidad, la contaminación excesiva con endotoxinas bacterianas, los errores significativos en la concentración de los
ingredientes y el uso de ingredientes incorrectos en las PME son potencialmente más peligrosos para los pacientes cuando és-
tas se administran en el sistema vascular y en el sistema nervioso central que cuando se lo hace a través de las otras vías.

NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN LAS PME

Las tres categorías de contaminación descritas para PME en esta sección se asignan principalmente de acuerdo con el poten-
cial de contaminación microbiana durante la preparación magistral de PME de nivel de riesgo bajo y nivel de riesgo mediano o
el potencial que representa la falta de esterilización de las PME de nivel de riesgo alto, en donde cualesquiera de éstas podría
ocasionar daños, o incluso la muerte del paciente. Las PME de nivel de riesgo alto se deben esterilizar antes de administrarlas a
los pacientes. Para asignar a una PME el nivel de riesgo correspondiente-bajo, mediano o alto-deben tenerse en cuenta las
probabilidades de que ésta sufra (1) contaminación microbiana (p.ej., microorganismos, esporas y endotoxinas) y (2) contami-
nación química y física (p.ej., sustancias químicas y materias físicas extrañas). Las fuentes potenciales de contaminación inclu-
yen, entre otras, sustancias sólidas y líquidas provenientes del personal y los objetos utilizados en la preparación magistral;
componentes no estériles empleados e incorporados antes de la esterilización terminal; las condiciones inapropiadas dentro del
ambiente controlado de preparación; los procedimientos de preesterilización prolongados en el caso de preparaciones acuo-
sas; y formas farmacéuticas no estériles usadas en la elaboración de las PME.
Las características que se describen a continuación para PME de nivel de riesgo bajo, mediano y alto deben considerarse
como una guía sobre el grado y rigor de cuidado necesario en la preparación magistral, pero no es exhaustiva ni prescriptiva.
Los profesionales de la salud autorizados, a cargo de supervisar las preparaciones magistrales tienen la responsabilidad de de-
terminar las prácticas de calidad de los procedimientos y del ambiente, y los atributos necesarios para el nivel de riesgo asigna-
do a cada PME.
Estos niveles de riesgo se aplican a la calidad de las PME inmediatamente después del mezclado o llenado asépticos finales o
inmediatamente después de la esterilización final, a menos que lo impidan las características específicas de la preparación. Des-
pués del almacenamiento y transporte de las PME recién terminadas, debe esperarse un aumento en los riesgos de degrada-
ción química de los ingredientes, contaminación por daños físicos en los envases y permeabilidad de los envases de plástico y
elastoméricos. En estos casos, el personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de considerar los riesgos adiciona-
les potenciales para la integridad de las PME al momento de asignar las FLU. La duración del almacenamiento previo a la admi-
nistración y los límites de temperatura especificados en las siguientes subsecciones se aplican cuando no existan resultados di-
rectos de pruebas de esterilidad que justifiquen límites diferentes para las PME específicas.

PME de Nivel de Riesgo Bajo

Las PME preparadas en las siguientes condiciones tienen un riesgo bajo de contaminación.
Condiciones de Riesgo Bajo-
1. Las PME se preparan mediante manipulación aséptica y en un ambiente con una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7)
o una calidad de aire superior usando únicamente ingredientes, productos, componentes y dispositivos estériles.
2. La preparación magistral sólo incluye manipulaciones de transferencia, medición y mezclado usando no más de tres em-
paques de productos estériles fabricados comercialmente y no más de dos ingresos en cualquier envase estéril o empaque
(p.ej., bolsa, vial) del producto estéril o envase/dispositivo de administración para preparar la PME.
3. Las manipulaciones se limitan a la apertura aséptica de ampollas, la penetración de tapones desinfectados de viales con
agujas y jeringas estériles, y la transferencia de líquidos estériles en jeringas estériles a dispositivos de administración esté-
ril, envases de otros productos estériles y envases para almacenamiento y dispensación.
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo bajo, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas de
Esterilidad (71 )), los períodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administración,
las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no más de 48 horas a temperatura ambiente con-
trolada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no más de 14 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requisitos
Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación entre -25º y -1 Oº.
Ejemplos de Preparación Magistral de Riesgo Bajo-
1. Transferencias únicas de formas farmacéuticas estériles desde ampollas, frascos, bolsas y viales, usando jeringas estériles
con agujas estériles, otros dispositivos de administración y otros envases estériles. El contenido de la solución de las ampo-
llas debe pasarse a través de un filtro estéril para retirar cualquier partícula.
2. Medición y transferencia aséptica simple con no más de tres empaques de productos estériles fabricados comercialmente,
incluyendo una solución para infusión o diluyente para elaborar las mezclas de fármacos y soluciones nutricionales.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos-Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los
requisitos descritos en Colocación de Controles de Ingeniería Primarios o es una cabina de flujo laminar (CFL) o una cabina de
seguridad biológica (CSB) que no puede ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces sólo
se pueden preparar PME no peligrosas y preparados radiofarmacéuticos de nivel de riesgo bajo, según las órdenes de un médi-
co para un paciente específico y la administración de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparación o
según lo recomendado en el prospecto adjunto del fabricante, cualquiera que sea menor. Las PME de nivel de riesgo bajo y
con FLU de 12 horas o menos deben cumplir con los cuatro criterios siguientes:
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 521

1. Los CIP (CFL, CSB, CAi, CACI) deben certificarse y mantenerse como ISO Clase 5 (ver Tabla 7) según se describe en Diseño
de la Instalación y Controles Ambientales para la exposición de sitios críticos y deben estar en un área segregada de prepa-
ración magistral y restringida a actividades de preparación estéril que minimicen el riesgo de contaminación de la PME.
2. El área segregada de preparación magistral no debe estar en una instalación que tenga ventanas o puertas sin sellar que
conecten con el exterior o que tenga un flujo de tráfico alto, o que esté adyacente a sitios de construcción, almacena-
miento o preparación de alimentos. Se debe tener en cuenta que ésta no pretende ser una lista exhaustiva.
3. El personal debe seguir los procedimientos descritos en Limpieza y Vestimenta del Personal y Requisitos Adiciona/es del Perso-
nal antes de la preparación magistral. Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
Los lavabos deben estar separados del área inmediata del dispositivo de CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
4. Según se describe en el capítulo, se deben seguir las especificaciones de Limpieza y Desinfección de las Áreas de Preparación
Magistral Estéril, Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Pro-
cedimientos de Limpieza y Desinfección, así como Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) para Partículas Viables y No Viables.
El personal de preparación magistral debe reconocer que la ausencia de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7)
en un ambiente general no controlado aumenta la probabilidad de contaminación microbiana, y que la duración de la admi-
nistración de PME contaminadas con microbios que exceda de unas cuantas horas aumenta el potencial de colonización mi-
crobiana clínicamente significativa y por lo tanto de daño para el paciente, especialmente si se trata de pacientes críticamente
enfermos o inmunocomprometidos.
Garantía de Calidad-Las prácticas de garantía de calidad incluyen, entre otras, las siguientes:
1. Desinfección rutinaria y pruebas de calidad del aire del entorno de preparación directo para reducir al mínimo la contami-
nación microbiana de las superficies y mantener una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
2. Verificación visual de que el personal de preparación magistral está usando correctamente los elementos y los tipos de
vestimenta protectora apropiados, incluyendo gafas y máscaras.
3. Revisión de todas las órdenes y envases de ingredientes para asegurar que la identidad y cantidad de los ingredientes in-
corporados en la preparación magistral fueron los correctos.
4. Inspección visual de las PME para asegurar la ausencia de partículas en las soluciones, la ausencia de fugas en los viales y
bolsas y la información exacta y completa del etiquetado.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe ser efectuada al menos una vez
al año por cada persona autorizada para realizar una preparación en un entorno de nivel de riesgo bajo, en condiciones que
simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de PME de nivel de riesgo bajo. Una
vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de un entorno de
calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7), transferir tres series de cuatro alícuotas de 5 mL de Medio de Digerido de Caseína y
Soja estéril (también conocido como caldo tripticasa de soja o agar tripticasa de soja [TSA]), con la misma combinación de
jeringa de 1 O mL y aguja con venteo estériles, a viales separados de 30 mL, transparentes, vacíos, sellados y estériles (es decir,
cuatro alícuotas de 5 mL a cada uno de los tres viales de 30 mL). Fijar asépticamente sellos adhesivos estériles a los tapones de
goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20º y 25º o entre 30º y 35º durante un mínimo de 14 días. Si
se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubar-
se durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico
(1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbiano, según se describe en la sec-
ción Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de
Limpieza y Desinfección.

PME de Nivel de Riesgo Mediano

Cuando las PME se preparan asépticamente bajo Condiciones de Riesgo Bajo, y existe una o más de las siguientes condiciones,
dichas PME tienen un riesgo mediano de contaminación.
Condiciones de Riesgo Mediano-
1. Se combinan o agrupan múltiples dosis individuales o pequeñas de productos estériles para preparar una PME que se ad-
ministrará a varios pacientes o a un solo paciente en varias ocasiones.
2. El proceso de preparación magistral incluye manipulaciones asépticas complejas, aparte de la transferencia de volumen
única.
3. El proceso de preparación magistral tiene una duración inusualmente prolongada, como la requerida para completar la
disolución o el mezclado homogéneo.
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo mediano, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas
de Esterilidad (71 )), los períodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administra-
ción, las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no más de 30 horas a temperatura ambiente
controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no más de 9 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requi-
sitos Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación entre -25º y -1 Oº.
Ejemplos de Preparación Magistral de Riesgo Mediano-
1. Preparación magistral de líquidos para nutrición parenteral total usando dispositivos manuales o automatizados durante la
que se realizan varias inyecciones, desconexiones y conexiones de los productos que se usan como fuente de nutrientes al
dispositivo o máquina para suministrar todos los componentes nutricionales a un envase estéril final.
522 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

2. Llenado de los reservorios de dispositivos de inyección e infusión con más de tres productos farmacéuticos estériles y eva-
cuación del aire presente en dichos reservorios antes de dispensar el dispositivo llenado.
3. Transferencia de volúmenes de múltiples ampollas o viales a uno o más envases estériles finales.
Garantía de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo mediano incluyen los mismos
procedimientos utilizados para las PME de riesgo bajo y, además, una prueba de llenado de medios más exigente, que debe
realizarse en forma anual o con mayor frecuencia.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe realizarse al menos anualmente
en condiciones que simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de preparaciones
magistrales. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de
un entorno de calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7), transferir asépticamente por gravedad seis alícuotas de 100 mL de
Medio Digerido de Caseína y Soja estéril a través de tubuladuras separadas, a sendos recipientes estériles evacuados. A conti-
nuación, distribuir los seis recipientes en tres pares y usar una combinación estéril de jeringa de 1 O mL y aguja de calibre
18 para intercambiar dos alícuotas de 5 mL de medio de un recipiente al otro del par. Por ejemplo, después de agregar una
alícuota de 5 mL del primer recipiente al segundo recipiente del par, agitar este último durante 1 O segundos, tomar una alí-
cuota de 5 mL y volver a colocarla en el primer recipiente del par. Luego, agitar el primer recipiente durante 1 O segundos y
transferir la siguiente alícuota de 5 mL de vuelta al segundo recipiente del par. Después de los dos intercambios de alícuotas de
5 mL en cada par de recipientes, inyectar asépticamente una alícuota de 5 mL de medio de cada recipiente en un vial de
1 O mL, transparente, vacío, sellado y estéril, usando una jeringa de 1 O mL y una aguja con venteo estériles. Fijar aséptica mente
sellos adhesivos estériles a los tapones de goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20º y 25º o entre 30º
y 35º por un mínimo de 14 días. Si se usan dos temperaturas para la incubación de las muestras de llenado de medios, enton-
ces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo
de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento mi-
crobiano, según se describe en la sección Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asép-
ticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección.

PME de Nivel de Riesgo Alto

Las PME elaboradas bajo cualquiera de las condiciones indicadas a continuación están contaminadas o tienen un riesgo alto
de contaminarse.
Condiciones de Riesgo Alto-
1. Se incorporan ingredientes no estériles, incluyendo productos fabricados comercialmente que no están destinados para
vías de administración estériles (p.ej., oral) o se emplea un dispositivo no estéril antes de la esterilización terminal.
2. Cualquiera de los siguientes elementos se exponen a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante más de 1
hora (ver PME de Uso Inmediato):
• contenido estéril de productos fabricados comercialmente,
• PME que carecen de conservantes antimicrobianos eficaces, y
• superficies estériles de dispositivos y envases para la preparación, transferencia, esterilización y envasado de PME.
3. El personal de preparación magistral tiene vestimenta y guantes inapropiados (ver Limpieza del Personal y Uso de Equipo
Protector de Barrera).
4. Las preparaciones no estériles que contienen agua se almacenan durante más de 6 horas antes de su esterilización.
5. Se presume, sin verificar el etiquetado y la documentación de los proveedores o sin determinación directa, que la pureza
química y el contenido de los ingredientes cumplen con sus especificaciones originales o farmacopeicas en envases no
abiertos o abiertos de ingredientes a granel (ver Selección de Ingredientes en Preparación Magistral-Preparaciones No Estéri-
les (795)).
Si las preparaciones esterilizadas de nivel de riesgo alto no han pasado una prueba de esterilidad, los períodos de almacena-
miento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administración, las PME deben almacenarse de forma apropiada
y exponerse durante no más de 24 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante
no más de 3 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación
entre -25º y -1 Oº. [NOTA- No se requieren pruebas de esterilidad para PME esterilizadas en autoclave, a menos que se prepa-
ren en lotes de más de 25 unidades.]
Todos los dispositivos de medición, mezclado y purificación no estériles deben enjuagarse bien con agua estéril apirógena y
luego deben escurrirse o secarse en su totalidad inmediatamente antes de utilizarlos para realizar preparaciones magistrales de
riesgo alto. Todas las soluciones PME de nivel de riesgo alto sometidas a esterilización terminal deben prefiltrarse, pasándolas
por un filtro con un tamaño de poro nominal de no más de 1,2 ~tm, antes o durante el llenado de los envases finales, con el fin
de retirar las partículas. La esterilización por filtración de las PME de nivel de riesgo alto debe realizarse con un filtro estéril de
tamaño de poro nominal de 0,2 ~1m o 0,22 pm, totalmente en un entorno con calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7) o
superior.
Ejemplos de Condiciones de Riesgo Alto-
1. Disolución de polvos de fármacos y nutrientes a granel no estériles para preparar soluciones que se esterilizarán en forma
terminal.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 523

2. Exposición de los ingredientes y componentes estériles usados para preparar y envasar PME en una calidad de aire inferior
a ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante más de 1 hora (ver PME de Uso Inmediato).
3. Medición y mezclado de ingredientes estériles en dispositivos no estériles antes de su esterilización.
4. Se supone, sin evidencia apropiada ni determinación directa, que los envases de ingredientes a granel contienen al menos
un 95% en peso de su parte química activa y que no se han contaminado ni adulterado entre un uso y otro.
Garantía de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo alto incluyen los mismos procedi-
mientos que para las PME de riesgo bajo. Además, cada persona autorizada para elaborar PME de riesgo alto, debe realizar
semestralmente una prueba de llenado de medios que represente una preparación magistral de nivel de riesgo alto.
Procedimiento de Llenado de Medios para PME Esterilizadas por Filtración-Esta prueba, u otra equivalente, debe reali-
zarse en condiciones que simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de prepara-
ciones magistrales de nivel de riesgo alto. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo del proce-
dimiento de prueba (en la siguiente secuencia):
1. Disolver en 1 00 mL de agua no bacteriostática 3 g de Medio de Digerido de Caseína y Soja no estéril disponible comer-
cialmente para preparar una solución no estéril al 3%.
2. Extraer 25 mL del medio en tres jeringas estériles de 30 ml. Transferir 5 mL de cada jeringa a sendos viales de 1 O mL esté-
riles. Estos viales son los controles positivos para generar un crecimiento microbiano exponencial, el cual se evidencia por
una turbidez visible después de su incubación.
3. Bajo condiciones asépticas y utilizando técnicas asépticas, fijar a cada jeringa una unidad de filtración estéril con un tama-
ño de poro nominal de 0,2 µm o 0,22 µm y una aguja de calibre 20. Inyectar los siguientes 1 O mL de cada jeringa en tres
viales de 1 O mL estériles. Repetir el proceso en tres viales más. Etiquetar todos los viales, fijar sellos adhesivos estériles al
cierre de los nueve viales e incubarlos a una temperatura de 20º a 25º o de 30º a 35º durante un mínimo de 14 días. Si se
usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incu-
barse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento
Aséptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbiano, según se descri-
be en la sección Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y
Procedimientos de Limpieza y Desinfección.

CAPACITACIÓN V EVALUACIÓN DEL PERSONAL EN TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN ASÉPTICA

El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de per-
sonal experto, con ayuda de instrucción audiovisual y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conoci-
mientos prácticos en las manipulaciones asépticas, así como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO
Clase 5 (ver Tabla 7) antes de empezar a preparar las PME. Inicialmente, el personal de preparación magistral deberá realizar
una revisión didáctica y pasar pruebas escritas y de llenado de medios para evaluar la destreza en la manipulación aséptica; en
adelante, se someterán a dichas pruebas al menos una vez al año, en el caso de preparaciones magistrales de niveles de riesgo
bajo y mediano, y semestralmente, en el caso de preparaciones de nivel de riesgo alto. El personal de preparación magistral
que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonización microbiana profu-
sa, deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en
preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica.
Prueba de Desafío de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME asépticamente se puede evaluar
usando una verificación de llenado de medios de cultivos bacterianos líquidos y estériles 3 (es decir, transferencia de un medio
de cultivo bacteriano estéril a través de una jeringa y aguja estériles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
práctica aséptica del personal de preparación magistral. Las pruebas de llenado de medios representan las condiciones más
exigentes o difíciles con las que el personal en proceso de evaluación puede encontrarse durante la elaboración de PME de un
determinado nivel de riesgo y durante la esterilización de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafío de llenado de
medios que simulan la elaboración de PME de nivel de riesgo alto se usan también para verificar la capacidad del ambiente y
del proceso de preparación magistral para producir una preparación estéril.
Los medios líquidos de cultivo estériles disponibles comercialmente, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja (ver Prue-
bas de Esterilidad (71 )), deberán promover la colonización exponencial de las bacterias que el personal de preparación magis-
tral y el entorno suelen transmitir a las PME. Los viales llenados con medios deben incubarse a una temperatura de 20º a 25º o
de 30º a 35º durante 14 días como mínimo. Si se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios,
entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Mo-
nitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Si el medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 días, signifi-
ca que no se ha pasado la prueba.

PME DE USO INMEDIATO

La provisión de uso inmediato está destinada sólo a aquellas situaciones en las cuales es necesario administrar de emergencia
o en forma inmediata una PME a un paciente. Dichas situaciones pueden incluir reanimación cardiopulmonar, tratamiento en
sala de emergencias, preparación de agentes de diagnóstico, o terapia crítica donde la preparación de la PME bajo las condi-
ciones descritas para PME de Nivel de Riesgo Bajo somete al paciente a un riesgo adicional debido a las demoras en la terapia.
524 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicos USP 37

Las PME de uso inmediato no están destinadas a almacenamiento para necesidades anticipadas o preparación magistral de
lotes. Las preparaciones magistrales que tienen nivel de riesgo mediano y nivel de riesgo alto no deben prepararse como PME
de uso inmediato.
Las PME de uso inmediato están eximidas de los requisitos descritos para PME de Nivel de Riesgo Bajo, sólo cuando se cum-
plen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparación magistral incluye la transferencia simple de no más de tres empaques fabricados comercialmen-
te de productos estériles no peligrosos o productos radiofarmacéuticos de diagnóstico desde los envases originales del fa-
bricante, y no más de dos ingresos dentro de cualquier envase estéril o empaque individual (p.ej., bolsa, vial) de solución
estéril para infusión o envase/dispositivo de administración. Por ejemplo, los antineoplásticos no deben prepararse como
PME de uso inmediato porque son fármacos peligrosos.
2. A menos que la preparación lo requiera, el procedimiento de preparación magistral es un proceso continuo que no debe
exceder 1 hora.
3. Durante la preparación, se sigue una técnica aséptica y, de no administrarse inmediatamente, la PME terminada permane-
ce bajo supervisión continua para minimizar el potencial de contacto con superficies no estériles, la introducción de partí-
culas o líquidos biológicos, la mezcla con otras PME y el contacto directo de las superficies externas.
4. La administración comienza a más tardar una hora después de haber comenzado la preparación de la PME.
5. A menos que el prepador administre inmediata y completamente la PME, o el preparador vigile la administración inme-
diata y completa de la misma, la PME debe llevar una etiqueta que indica la información de identificación del paciente, los
nombres y las cantidades de todos los ingredientes, el nombre o iniciales de la persona que preparó la PME, así como la
FLU de 1 hora y la hora exactas.
6. Si la administración no ha comenzado dentro de 1 hora de haberse iniciado la preparación de la PME, ésta debe descar-
tarse de inmediato en forma segura y adecuada.
La preparación en condiciones inferiores a ISO Clase 5 (ver Tabla 7) aumenta la probabilidad de contaminación microbiana,
y la duración de la administración de PME contaminadas con microbios cuando excede de unas cuantas horas aumenta el po-
tencial de colonización microbiana clínicamente significativa y por lo tanto de daño para el paciente, especialmente si se trata
de pacientes críticamente enfermos o inmunocomprometidos.

ENVASES MONODOSIS Y MULTIDOSIS

Los envases monodosis abiertos o perforados con aguja, tales como bolsas, frascos, jeringas y viales de productos estériles y
PME se deben usar dentro de 1 hora si se abren en aire de calidad inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 7) (ver PME de Uso Inmedia-
to) y desechar cualquier contenido restante. Los viales monodosis expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7) o más limpio se
pueden usar hasta 6 horas después de la perforación inicial con la aguja. Las ampollas monodosis abiertas no se deben almace-
nar por ningún período. Los envases multidosis (p.ej., viales) están formulados para retirar porciones en múltiples ocasiones,
porque generalmente contienen conservantes antimicrobianos. La FLU después de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto.

FÁRMACOS PELIGROSOS COMO PME

Aunque los beneficios terapéuticos potenciales de las preparaciones magistrales estériles de fármacos peligrosos por lo gene-
ral sobrepasan los riesgos de sus efectos adversos en pacientes enfermos, los profesionales de la salud expuestos se arriesgan a
efectos adversos similares, sin ningún beneficio terapéutico. La exposición ocupacional a fármacos peligrosos pueden llevar a
(1) efectos agudos, como erupciones cutáneas; (2) efectos crónicos, incluso eventos adversos reproductivos; y (3) posiblemen-
te cáncer (ver Apéndice A de NIOSH Publication Nº 2004-165).
Los fármacos peligrosos se deben preparar para administración sólo bajo condiciones que protejan a los profesionales de la
salud y a otro personal en las áreas de preparación y almacenamiento. Los fármacos peligrosos se deben almacenar separados
de otro inventario, de manera que se evite la contaminación y la exposición del personal. Muchos fármacos peligrosos tienen
presiones de vapor suficientes que permiten la volatilización a temperatura ambiente; por lo tanto, se prefiere el almacena-
miento dentro de un área de contención, tal como un cuarto de presión negativa. El área de almacenamiento debe tener sufi-
ciente ventilación general de salida, con al menos 12 cambios de aire por hora (CAPH) 4 para diluir y retirar cualquier contami-
nante aéreo.
Los fármacos peligrosos se deben manejar con precaución en todo momento, usando guantes apropiados para quimiotera-
pia durante la recepción, distribución, aprovisionamiento, inventariado, preparación para administración y eliminación. Los fár-
macos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7), con controles de ingeniería protectores y si-
guiendo las prácticas asépticas especificadas para los niveles de riesgo de contaminación apropiados definidos en este capítulo.
Se debe limitar el acceso a las áreas donde se almacenen y elaboren preparaciones de fármacos para proteger a las personas
que no están involucradas en tal proceso.

4Guidelines for Environmental lnfection Control in Health-Care Facilities, Recommendations of CDC and the Healthcare lnfection Control Practices Advisory Com-
mittee (HICPAC), MMWR, vol. 52, no. RR-1 O, junio 6, 2003, figura 3, pág. 12.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 525

Todos los fármacos peligrosos se deben preparar en una CSB 5 o un CACI que cumple o excede los estándares para CACI en
este capítulo. Las CSB o los CACI ISO Clase 5 (ver Tabla 7) deben ubicarse en un área ISO Clase 7 (ver Tabla 7) que esté física-
mente separada (es decir, un área diferente de las áreas de preparación) y que tenga óptimamente una presión negativa de no
menos de 0,01 pulgadas de columna de agua con respecto a las antesalas adyacentes de presión positiva ISO Clase 7 (ver
Tabla 7) o mejor, proporcionando así un flujo hacía adentro para contener cualquier partícula de fármaco presente en el aire.
Se debe instalar un indicador de presión en el que pueda consultarse fácilmente la correcta presurización del cuarto. Las CSB y
los CACI deben estar óptimamente ventilados en un 1 00% al exterior a través de filtración HEPA.
Si un CACI que cumple los requisitos de este capítulo se usa fuera de una zona amortiguadora, el área de preparación ma-
gistral debe mantener una presión negativa mínima de 0,01 pulgadas de columna de agua y tener un mínimo de 12 CAPH.
Cuando se usan dispositivos de sistema cerrado para transferencia de vial (CSTD, por sus siglas en inglés) (es decir, sistemas
de transferencia del vial que no permiten ventilación ni exposición de la sustancia peligrosa al ambiente), deben estar dentro
del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) de una CSB o un CACI. Se prefiere el uso de un CSTD debido a su proceso de sistema
cerrado inherente. En instalaciones que preparan un volumen bajo de fármacos peligrosos, se acepta el uso de dos niveles de
contención (p.ej., un CSTD dentro de una CSB o un CACI que esté ubicado en un cuarto de presión no negativa).
Cuando se usan CSTD y se realiza una preparación magistral en una CSB o un CACI, debe usarse equipo protector para el
personal (EPP) apropiado. El EPP debe incluir batas, máscaras, gafas protectoras, gorras, cubrecalzado o calzado destinado a
ese propósito, doble enguantado con guantes estériles similares a los usados en quimioterapia y el cumplimiento con las reco-
mendaciones del fabricante al usar un CACI.
Todo el personal que elabora preparaciones con fármacos peligrosos debe capacitarse ampliamente en el almacenamiento,
manipulación y eliminación de estos fármacos. La capacitación debe ocurrir antes de preparar o manipular PME peligrosas y su
eficacia debe ser verificada probando técnicas específicas de preparación para fármacos peligrosos. Dicha verificación debe ser
documentada para cada persona al menos anualmente. Esta capacitación debe incluir el repaso didáctico de los fármacos peli-
grosos, incluyendo las propiedades mutagénicas, teratogénicas y carcinogénícas, y debe incluir capacitación continua para ca-
da nuevo fármaco peligroso que entre al mercado. El personal de preparación magistral que esté en edad reproductiva debe
confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los fármacos peligrosos. La capacitación debe incluir al menos los
siguientes puntos: (1) prácticas de manipulación aséptica segura; (2) técnicas de presión negativa cuando se utiliza una CSB o
un CACI; (3) uso correcto de dispositivos CSTC; (4) procedimientos de contención, limpieza y eliminación en caso de rupturas
y derramamientos; y (5) tratamiento del personal en caso de exposición por contacto o inhalación.
NOTA-Dado que las normas de valoración y las cantidades inaceptables de contaminación de cada fármaco no han sido estable-
cidos en la literatura, el siguiente párrafo es sólo una recomendación. A medida que se desarrollen y prueben estos métodos de ensa-
yo se adoptarán las normas apropiadas.
Con el fin de garantizar la contención, especialmente en operaciones de preparación que involucren grandes volúmenes de
fármacos peligrosos, se deben tomar muestras ambientales rutinariamente para detectar fármacos peligrosos no contenidos
(p.ej., inicialmente como punto de referencia y al menos cada 6 meses o más a menudo según sea necesario para verificar la
contención). Este muestreo ambiental debe incluir la obtención de muestras con paños (wípe sampling) de la superficie del
área de trabajo de una CSB y un CACI; mostradores donde se colocan las preparaciones terminadas; áreas adyacentes a una
CSB y un CACI, incluso el piso directamente debajo del área de trabajo; y áreas de administración a pacientes. Los marcadores
comunes de fármacos peligrosos que se pueden analizar incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, metotrexato y fluorouracilo. Si se
encuentra alguna contaminación mensurable (se ha visto que concentraciones de ciclofosfamida mayores que 1,00 ng por cm 2
causan captación del fármaco en humanos) por cualquiera de estos procedimientos de garantía de calidad, los profesionales
de salud deben tomar la decisión de identificar, documentar y contener la causa de la contaminación. Tal acción puede incluir
la recapacitacíón, limpieza cuidadosa (utilizando un jabón de pH elevado y agua) y mejora de los controles de ingeniería. Algu-
nos ejemplos de formas de mejorar los controles de ingeniería incluyen (1) ventilar la CSB o el CACI 100% hacía el exterior; (2)
implementar un CSTD; o (3) reevaluar los tipos de CSB o CACI.
La eliminación de desechos de fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales. Todo
el personal que efectúa las actividades rutinarias de eliminación de desechos y limpieza en las áreas de almacenamiento y pre-
paración con fármacos peligrosos debe recibir capacitación en los procedimientos apropiados para protegerse y prevenir la
contaminación.

PREPARADOS RADIOFARMACÉUTICOS COMO PME

En el caso de la producción de preparados radiofarmacéuticos para tomografía por emisión de positrones (PET), el capítulo
Preparados Radiofarmacéuticos para Tomografía por Emisión de Positrones-Preparación Magistral (823) reemplaza este capítulo.
Después de la liberación de un preparado radíofarmacéutico para PET como producto farmacéutico terminado de una instala-
ción de producción, el posterior manejo, manipulación o uso del producto será considerado como preparación magistral y el
contenido de esta sección y capítulo es aplicable.
A los efectos de este capítulo, los preparados radiofarmacéuticos magistrales elaborados a partir de componentes estériles en
envases estériles cerrados y con un volumen de 100 mL o menos para una inyección monodosis o no más de 30 mL tomados

5 NSF/ANSI 49.
526 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

de un envase multidosis (ver Inyectables (1 )) se deben nombrar según las normas para PME de Nivel de Riesgo Bajo y cumplir
con ellas.
Al preparar magistralmente estos productos radiofarmacéuticos, se deben usar jeringas y viales apropiadamente blindados
dentro de un CIP que funcione adecuadamente y que esté certificado como ISO Clase 5 (ver Tabla 1), localizado en un am-
biente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o más limpio, que permita el cumplimiento con los requisitos especiales de manipula-
ción, protección y flujo de aire negativo.
Los viales de productos radiofarmacéuticos destinados a múltiples usos, preparados magistralmente con tecnecio 99m, ex-
puestos a un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y perforados por agujas sin contaminación por contacto directo, pueden usar-
se hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante. El almacenamiento y transporte de los viales adecuadamente
blindados de PME radiofarmacéuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado sin una designación especifica de clase
ISO.
Los sistemas generadores de tecnecio 99m/molibdeno 99 deben almacenarse y eluirse (manejarse) bajo las condiciones re-
comendadas por el fabricante y las reglamentaciones estatales y federales aplicables. Dichos sistemas generadores deben eluir-
se en un ambiente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o más limpio que permita cumplir con los requisitos especiales de manipu-
lación, protección y flujo de aire. Para limitar la exposición aguda y crónica del personal de inspección a un nivel de radiación
tan bajo como sea razonablemente posible (ALARA), se debe efectuar la inspección visual directa, de acuerdo con ALARA, de
las PME radiofarmacéuticas que contengan concentraciones altas de dosis de radioactividad.
Los preparados radiofarmacéuticos elaborados como PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos se deben pre-
parar en un área segregada. Se debe fijar una línea de demarcación que defina el área de preparación magistral segregada. Los
materiales y la vestimenta expuestos en el área de atención y tratamiento del paciente no deben cruzar una línea de demarca-
ción dentro del área de preparación magistral segregada.

EXTRACTOS DE ALÉRGENOS COMO PME

Los extractos de alérgenos como PME son inyecciones monodosis y multidosis para uso intradérmico o subcutáneo, prepara-
dos por médicos especialmente capacitados y el personal bajo su supervisión directa. Los extractos de alérgenos como PME
quedan exentos de los requisitos indicados para el personal, ambiente y almacenamiento de todos los Niveles de Riesgo de Con-
taminación Microbiana en las PME descritos en este capítulo, sólo cuando se cumplen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparación magistral involucra la transferencia simple por medio de agujas y jeringas de productos estériles
comerciales de alérgenos y sustancias estériles apropiadas agregadas (p.ej., glicerina, fenol y cloruro de sodio para inyec-
ción).
2. Todos los extractos de alérgenos como PME deben contener sustancias apropiadas en concentraciones eficaces para pre-
venir el crecimiento de microorganismos. Los extractos de alérgenos no conservados deben cumplir con los requisitos
apropiados de nivel de riesgo para PME en este capítulo.
3. Antes de comenzar las actividades de preparación magistral, el personal sigue un procedimiento cuidadoso de lavado de
manos para quitar los detritos bajo las uñas con un limpiador de uñas bajo agua tibia corriente, seguido por un lavado
vigoroso de manos y brazos hasta el codo, durante al menos 30 segundos, con un jabón antimicrobiano o no antimicro-
biano y agua.
4. El personal de preparación magistral se coloca gorras, mascarillas que cubran el vello facial, batas y máscaras.
5. El personal de preparación magistral realiza el lavado antiséptico de manos con un exfoliante quirúrgico a base de alcohol
con actividad persistente.
6. El personal de preparación magistral utiliza guantes estériles exentos de polvo que sean compatibles con alcohol isopropí-
lico al 70% (IPA) antes de comenzar las manipulaciones de la preparación magistral.
7. El personal de preparación magistral desinfecta los guantes intermitentemente con IPA estéril al 70% cuando prepara
múltiples extractos de alérgenos como PME.
8. Los cuellos de las ampollas y los tapones de viales en los envases de ingredientes estériles fabricados comercialmente se
desinfectan frotándolos cuidadosamente con hisopos empapados en IPA estéril al 70% para garantizar que los sitios críti-
cos estén húmedos durante al menos 1O segundos y se dejen secar antes de usarlos para la preparación de extractos de
alérgenos como PME.
9. Las manipulaciones asépticas de las preparaciones magistrales minimizan la contaminación directa por contacto (p.ej., de
las puntas de los dedos de los guantes, sangre, secreciones orales y nasales, piel y cosméticos descamados, otros materia-
les no estériles) con sitios críticos (p.ej., agujas, ampollas abiertas, tapones de viales).
1O. La etiqueta de cada vial multidosis (VMD) de extractos de alérgenos como PME incluye el nombre de un paciente específi-
co así como la FLU y el intervalo de temperatura de almacenamiento que se asignan basándose en las recomendaciones
del fabricante o publicaciones de referencia.
11. Las ampollas monodosis de extractos de alérgenos como PME no se deben almacenar para uso adicional subsiguiente.
El personal que prepara extractos de alérgenos como PME debe ser consciente del mayor riesgo potencial de contaminación
microbiana y con materia extraña cuando los extractos de alérgenos como PME se preparan cumpliendo con criterios anterio-
res en vez de seguir las normas más rigurosas de este capítulo para Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME.
Aunque los extractos de alérgenos como PME pueden representar riesgos para la salud de los pacientes cuando se inyectan
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 527

intradérmica o subcutáneamente, estos riesgos son sustancialmente mayores si el extracto se inyecta por vía intravenosa inadver-
tidamente.

VERIFICACIÓN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL

Los procedimientos de preparación magistral y los métodos de esterilización de PME deben corresponder con los especifica-
dos en la documentación escrita, debidamente confeccionada y verificada por la institución responsable de la preparación ma-
gistral. La verificación requiere pruebas planificadas, monitoreo y documentación que permitan demostrar el cumplimiento de
los requisitos de calidad ambiental, las prácticas del personal y los procedimientos críticos para conseguir y mantener la esterili-
dad, exactitud y pureza de las PME terminadas. Por ejemplo, pueden realizarse pruebas de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad
para el Producto a Examinar en Pruebas de Esterilidad (71 )) con muestras de PME de riesgo bajo y mediano, y deben agregarse
indicadores biológicos (IB) estándar autocontenidos a muestras no dispensables de PME de nivel de riesgo alto antes de su
esterilización terminal para determinar en la evaluación posterior si el ciclo de esterilización fue adecuado (ver Indicadores Bioló-
gicos para Esterilización (1035)). Las PME envasadas y etiquetadas deben inspeccionarse visualmente para verificar su integridad
física y aspecto esperado, incluyendo la cantidad de llenado final. La exactitud de las identidades, concentraciones, cantidades
y purezas de los ingredientes de las PME se deben confirmar revisando las etiquetas en los envases, observando y documentan-
do las mediciones correctas con los dispositivos aprobados y correctamente estandarizados, y revisando la información en el
etiquetado y en los certificados de análisis proporcionados por los proveedores. Cuando no se pueda confirmar la identidad, la
pureza, el contenido y la esterilidad correctas de los ingredientes y componentes de las PME (por ejemplo, en caso de jeringas
sin etiquetado, ampollas abiertas, tapones de viales y bolsas perforados, envases de ingredientes con etiquetado incompleto),
dichos ingredientes y componentes se deben desechar de inmediato.
Algunos ingredientes individuales, como fármacos a granel, no se etiquetan con las fechas de caducidad cuando se mantie-
nen estables indefinidamente en sus empaques comerciales, bajo las condiciones de almacenamiento declaradas. Sin embargo,
a pesar de conservar estabilidad química completa, dichos ingredientes pueden ganar o perder humedad durante el almacena-
miento y uso. Los cambios en el contenido de humedad pueden requerir pruebas (ver Pérdida por Secado (731 )) para determi-
nar la cantidad correcta que se debe pesar para obtener el contenido exacto de las partes químicas activas en las PME (ver
Cálculos Farmacéuticos en la Preparación Magistral de Prescripciones (1160)).
Aunque no se requiere, se recomienda realizar un ensayo químico cuantitativo indicador de estabilidad para garantizar la
exactitud de la preparación de las PME, especialmente de aquellas que contienen ingredientes farmacéuticos con un estrecho
intervalo de concentración terapéutica en plasma.

Métodos de Esterilización

Los profesionales de la salud autorizados que están a cargo de supervisar las preparaciones magistrales son responsables de
asegurar que el método de esterilización seleccionado (ver Métodos de Esterilización en Esterilización y Garantía de Esterilidad de
Artículos Farmacopeicos (1211 )) esterilice y mantenga el contenido, pureza, calidad e integridad del envase de las PME. El pro-
ceso de esterilización seleccionado se obtiene a partir de la experiencia y de las fuentes de información apropiadas (p.ej., ver
Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )) y, preferentemente, se verifica hasta donde sea posible
para conseguir la esterilidad de las PME específicas. Éstas son algunas guías generales para asignar un método de esterilización
apropiado a una PME y sus componentes:
1. Debe comprobarse que las PME se mantienen física y químicamente estables cuando se las somete al método de esterili-
zación seleccionado.
2. Los dispositivos de vidrio y metal pueden cubrirse herméticamente con papel de aluminio y luego exponerse a calor seco
en un horno a una temperatura media de 250º durante 30 minutos para lograr la esterilidad y despirogenización (ver
Esterilización por Calor Seco en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )) y Prueba de Endoto-
xinas Bacterianas (85)). Dichos artículos deben usarse de inmediato o almacenarse hasta su uso en un ambiente adecuado
para la elaboración de las PME de Nivel de Riesgo Bajo y Mediano.
3. El personal debe determinar, a partir de fuentes de referencia apropiadas, si el filtro de membrana microporosa estéril usa-
do para esterilizar las soluciones de PME, ya sea durante su preparación magistral o su administración, es química y física-
mente compatible con la PME.

ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR FILTRACIÓN

Los filtros estériles disponibles comercialmente deben estar aprobados para la esterilización de líquidos farmacéuticos de uso
en seres humanos. Los filtros estériles usados para esterilizar las PME deben estar exentos de pirógenos y tener un tamaño no-
minal de poro de 0,2 ó 0,22 µm. El fabricante debe certificar que retienen al menos 10 7 microorganismos de una cepa de
Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta en cada centímetro cuadrado del área superficial de la cara superior del filtro en condi-
ciones similares a las que se utilizarán para esterilizar las PME (ver Condiciones de Alto Riesgo en PME de Nivel de Riesgo Alto).
El supervisor de preparación magistral debe asegurar, en forma directa o a partir de documentación apropiada, que los fil-
tros sean química y físicamente estables en las condiciones de presión y temperatura que se utilizarán, que tengan capacidad
528 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

suficiente para filtrar los volúmenes requeridos y que logren la esterilidad y mantengan la calidad farmacéutica previa a la filtra-
ción, incluida la concentración de ingredientes de la PME específica. Las dimensiones del filtro y el líquido a esterilizar deben
permitir que el proceso de esterilización se complete rápidamente sin reemplazar el filtro durante el proceso. Cuando se sabe
que la PME contiene una cantidad excesiva de partículas, debe colocarse un prefiltro de membrana con un tamaño nominal de
poro mayor, antes del filtro de esterilización, para eliminar las partículas contaminantes grandes y aumentar al máximo la efica-
cia del filtro de esterilización.
Las unidades de filtración usadas para esterilizar las PME también deben someterse a las pruebas de integridad recomenda-
das por el fabricante, como la prueba de punto de burbuja.
El personal de preparación magistral debe verificar que los filtros seleccionados logren la esterilización de las PME que se
están esterilizando. Las desviaciones significativas respecto de las propiedades químicas y físicas normales o esperadas de las
PME (p.ej., alcoholes miscibles en agua) podrían causar daños no detectables en la integridad del filtro y la reducción de los
microorganismos a un tamaño más pequeño que el de los poros del filtro.

ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR VAPOR

El proceso de esterilización térmica utilizando vapor saturado bajo presión, o esterilización en autoclave, es el método prefe-
rido para la esterilización terminal de preparaciones acuosas que, según se ha verificado, mantienen su estabilidad química y
física bajo las condiciones empleadas (ver Esterilización por Vapor en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmaco-
peicos (1211 )). Para lograr la esterilidad, todos los materiales deben exponerse al vapor a una temperatura de 121 º, bajo una
presión de aproximadamente 1 atmósfera o 15 psi, durante un tiempo que, según se haya verificado mediante pruebas, logre
la esterilidad de los artículos. Por lo general, este tiempo es de 20 a 60 minutos en el caso de las PME. Debe contemplarse el
tiempo requerido para que el material alcance los 121 º antes de medir la duración de la exposición de esterilización.
Si no se exponen directamente los artículos a vapor presurizado, pueden sobrevivir algunos microorganismos y esporas. An-
tes de su esterilización, los dispositivos de plástico, vidrio y metal deben envolverse herméticamente en un papel o tela de bajo
desprendimiento de partículas o sellarse en sobres que impidan la penetración microbiana después de su esterilización. Inme-
diatamente antes de llenar las ampollas y viales que se esterilizarán con vapor, las soluciones deben pasarse por un filtro con
un tamaño nominal de poro de no más de 1,2 µm para eliminar las partículas. Los envases sellados deben poder generar vapor
internamente; en consecuencia, los viales vacíos con tapón y precintados deben contener una pequeña cantidad de humedad
para generar vapor.
La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por vapor para cada PME debe estar documentada por escri-
to en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización con vapor debe verificarse utilizando
IB apropiados de Bacillus stearothermophilus (ver Indicadores Biológicos (1035)) y otros métodos de verificación, como los dispo-
sitivos sensores de temperatura (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211) y Pruebas de Esterili-
dad (71 )).

ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR CALOR SECO

La esterilización por calor seco se realiza por lo general como un proceso por lotes en un horno destinado a esterilización. El
aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a través de la cámara, por medio de un dispositivo ventilador. El horno
debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposición. La esterilización por calor seco requie-
re temperaturas más altas y tiempos de exposición más prolongados que la esterilización por vapor. El calor seco se debe usar
sólo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daña el material o éste es impermea-
ble. Durante la esterilización se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulación del aire
caliente. La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por calor seco para cada PME debe estar documenta-
da por escrito en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización por calor seco debe veri-
ficarse utilizando IB apropiados de Bacillus subtilis (ver Indicadores Biológicos (1035)) y otros métodos de verificación, como los
dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211) y Pruebas de
Esterilidad (71 )). [NOTA-La esterilización por calor seco se puede efectuar a una temperatura más baja de la que podría ser
eficaz para la despirogenización].

Despirogenización por Calor Seco

La despirogenización por calor seco se debe usar para eliminar los pirógenos y los microbios viables de los materiales o enva-
ses de vidrio, como los viales. Un ciclo típico sería de 30 minutos a 250º. La descripción del ciclo de despirogenización por
calor seco y su duración para artículos de una carga específica debe estar documentada por escrito en la institución responsa-
ble de la preparación magistral. La eficacia del ciclo de despirogenización por calor seco se debe verificar usando viales para
desafío de endotoxinas (VDE). La prueba de endotoxinas bacterianas se debe efectuar en los VDE para verificar que el ciclo es
capaz de conseguir una reducción de 3 lag en endotoxinas (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
(1211) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)).
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 529

CALIDAD V CONTROL AMBIENTAL

Lograr y mantener la esterilidad y la ausencia total de contaminación de una PME depende de la calidad de los componen-
tes incorporados, del proceso utilizado, del desempeño del personal y de las condiciones ambientales en las que se realiza el
proceso. Los niveles de exigencia requeridos en relación con las condiciones ambientales dependen del grado de exposición
esperado de la PME al entorno inmediato durante su procesamiento. En esta sección se describen la calidad y el control de las
condiciones ambientales para cada nivel de riesgo de operación. Además, las operaciones que utilizan componentes no estéri-
les requieren el uso de un método de preparación diseñado para obtener una preparación estéril.

Exposición de Sitios Críticos

Mantener la esterilidad y la limpieza (es decir, ausencia de materia extraña estéril) de los sitios críticos es una salvaguarda
importante para las PME. Los sitios críticos son aquellos que incluyen cualquier componente o superficie de recorrido de líqui-
dos (p.ej., septos de viales, puertos de inyección, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores
de agujas) expuestos y en riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secre-
ciones orales o mucosas), o contaminación por contacto. El riesgo o probabilidad de que los sitios críticos se contaminen con
microorganismos y materia extraña se incrementa con el aumento del área expuesta de los sitios críticos, la densidad o con-
centración de los contaminantes y la duración de la exposición a una calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 7). Los
ejemplos incluyen una ampolla abierta o un tapón en un vial de 1 O mL o de mayor volumen o un puerto de inyección en un
envase de solución intravenosa que tiene un área más grande que la punta de la aguja o de una jeringa.
Las características del sitio crítico también influyen en el grado de riesgo de contaminación. Después de frotarla con una
gasa embebida en IPA estéril al 70%, la superficie relativamente áspera y permeable de un tapón elastomérico retiene microor-
ganismos y otros contaminantes con más facilidad que la superficie de vidrio más lisa del cuello de una ampolla. En conse-
cuencia, puede esperarse que la desinfección de la superficie sea más eficaz en el caso de una ampolla.
En la práctica de preparación magistral estéril, se debe dar la más alta prioridad a la protección de los sitios críticos, evitando
el contacto físico y los contaminantes aéreos. Los contaminantes aéreos, especialmente aquellos generados por el personal de
preparación magistral estéril, tienen muchas más probabilidades de llegar a los sitios críticos que los contaminantes que están
adheridos al piso o a otras superficies por debajo del nivel de trabajo. Más aún, las partículas grandes y de alta densidad que se
generan e introducen mediante las manipulaciones de la preparación magistral y el personal tienen el potencial de asentarse
en los sitios críticos incluso cuando dichos sitios están expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7).

Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas

Las fuentes más comunes de aire de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para exposición de sitios críticos son CFL horizontales y
verticales, CAi y CACI. Un cuarto limpio (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116))
es un ambiente para preparaciones magistrales provisto con HEPA o aire filtrado con HEPA, el cual cumple con ISO Clase 7 (ver
Tabla 7), y cuyo acceso está limitado al personal capacitado y autorizado para realizar la preparación magistral estéril y la lim-
pieza de las instalaciones. Una zona amortiguadora es un área provista con aire de calidad ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como
mínimo.
La Figura 7 es una representación conceptual de la colocación de un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) en un área de preparación
magistral segregada, usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Este plano muestra el área de
operación más crítica localizada dentro del CIP en un área designada (ver definición de Área de Preparación Magistral Segrega-
da) separada de las actividades no esenciales para la preparación de las PME. La colocación de dispositivos (p.ej., computado-
ras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales para la preparación magistral en el área segregada
debe estar restringida o limitada, dependiendo de su efecto sobre la calidad del aire en el CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
530 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Representación conceptual de los

requ1s1tos de las instalaciones del
Capítulo <797> de la USP

Figura 1. Representación conceptual de la colocación de un CIP ISO Clase 5 en un área de preparación magistral segregada,
usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos.

La Figura 2 es una representación conceptual de la distribución de una instalación para la preparación de PME clasificadas
como de nivel de riesgo bajo, mediano y alto. La calidad del aire ambiental aumenta con el movimiento desde el límite exter-
no hacia el área directa de preparación magistral (ADP). La colocación de dispositivos en las antesalas y las zonas amortiguado-
ras está dictada por su efecto sobre la calidad ambiental designada de las atmósferas y superficies, que debe ser verificada por
monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables). Cada instalación de preparación magis-
tral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para exposición de sitios críti-
cos y esterilización por filtración estén adecuadamente ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.

Figura 2. Representación conceptual de la distribución de una instalación para la preparación de PME clasificadas como de
riesgo bajo, mediano y alto.

La colocación de los dispositivos (p.ej., computadoras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales
para la preparación magistral en las antesalas y las zonas amortiguadoras está dictada por su efecto sobre la calidad ambiental
requerida para las atmósferas y superficies, que debe ser verificada por monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de
Partículas Viables y No Viables). Cada instalación de preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes
de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposición de sitios críticos y esterilización por filtración estén adecuadamente
ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.

Diseño de la Instalación y Controles Ambientales

Las instalaciones de preparación magistral están físicamente diseñadas y ambientalmente controladas para minimizar el con-
tacto de la contaminación aérea con los sitios críticos. Estas instalaciones deben proporcionar también un ambiente de trabajo
cómodo y bien iluminado, por lo general con una temperatura de 20º o menos, para brindar condiciones de comodidad al
personal de preparación magistral para que se desempeñe correctamente mientras está ataviado con la vestimenta requerida
para la preparación magistral aséptica. Los CIP por lo general incluyen, entre otros, CFL, CSB, CAi y CACI, los cuales brindan
un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para la exposición de sitios críticos. Los CIP deben mantener las condiciones ISO Clase 5
(ver Tabla 7) o mejores para las partículas de 0,5 pm (condiciones dinámicas de funcionamiento) mientras se preparan PME.
USP 37 Pruebas Fisicos / (797! Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 531

Los controles de ingenieríd secundarios, tales corno zonas amortiguadoras y antesalas, por lo gene1al s1rvo1·1 corno centro para
la ubicación del CIP. Las zonas amortiguadoras están diseñadas para mantener condiciones ISO Clase 7 (ver Tabla 7) corno
mínimo, para partículas de 0,5 prn bajo condiciones dinámicas, y condiciones ISO Clase 8 (ver Tabla I) para partículas iguales
o mayores de 0,5 pm bajo condiciones dinámicas para las antesalas. El control de contaminación aére,1 se loqra en el CIP por
medio de filtros HEPA. El flujo de aire en el CIP debe ser unidireccional (flujo laminar) y debido a la eí1c1enc1d de recolección de
partículas del filtro, cuando se trata de preparación magistral aséptica, el "primer aire" en la cara del fritro e'>ta libre de conta-
minación por partículas aéreas. El aire filtrado por HEPA debe suministrarse en las áreas críticas (ISO Cldse 5, ver Tabla 7) a una
velocidad suficiente para arrastrar las partículas lejos del área de preparación magistral v mantener el flujo de aire unidireccio-
nal durante las operaciones. El diseño y control apropiados evitan la turbulencia y el aire estancado en el área crítica. En el área
crítica se debe realizar un análisis del patrón de aire in situ por medio de estudios con humo para demostrar el flu¡o unidirec-
cional del aire y la acción de arrastre sobre el producto bajo condiciones dinámicas.
Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar
en el proceso de preparación magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas. la'> políticas y procedi-
mientos para el mantenimiento y trabajo dentro del área del CIP se deben poner por escrito y cumplir. Las políticas y procedi-
mientos estarán determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparación mac1istral aséptica utilizadas
durante la preparación de las PME. El ambiente de trabajo de la PME está diseñado para tener las superficies de trabajo más
limpias (CIP) localizadas en una zona amortiguadora. La zona amortiguadora deberá mantener condiciones ISO Clase 7 (ver
Tabla 7) como mínimo, para las partículas iguales o mayores de 0,5 pm bajo condiciones de operación dinámicas. El cuarto
debe estar segregado de los espacios circundantes no clasificados, para reducir el riesgo de que se soplen, arrastren o introduz-
can de otra manera contaminantes dentro del ambiente de flujo unidireccional de aire filtrado y tal segregación debe monito-
rearse en forma constante. Para cuartos que proporcionan una separación física por medio de paredes, puertas y cabinas de
transferencia de materiales (pass-throughs), se requiere una presión positiva diferencial mínima de 0,02 a 0,05 pulgadas de co-
lumna de agua. Para zonas amortiguadoras no físicamente separadas de las antesalas, se debe emplear el principio de despla-
zamiento del flujo de aire. Este concepto utiliza un principio de baja presión diferencial y alto flujo de aire. El uso de desplaza-
miento del flujo de aire requiere por lo general una velocidad de aire igual o mayor a 40 pies por minuto desde la zona amorti-
guadora, pasando por la línea de demarcación hacia la antesala.
El concepto de desplazamiento no debe usarse para preparación magistral de alto riesgo.'' El CIP debe estar ubicado dentro
de una zona amortiguadora de tal manera que se eviten condiciones que podrían afectar adversamente su funcionamiento.
Por ejemplo, las corrientes de aire fuertes provenientes de las puertas abiertas, el tráfico del personal o los flujos de aire prove-
nientes de los sistemas de HVAC pueden alterar el flujo de aire unidireccional en cabinas de frente abierto. Los operadores tam-
bién pueden producir alteraciones en el flujo de aire con sus propios movimientos y a! colocar objetos sobre la superficie de
trabajo. El CIP debe ubicarse fuera del flujo de tráfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto
no causen perturbaciones. Los intercambios de aire del cuarto por lo general se expresan como CAPH. Se necesita un adecua-
do flujo de aire filtrado por HEPA y suministrado a la zona amortiguadora y a la antesala, con el fin de mantener la ciasificación
de limpieza durante la actividad operativa a través de los CAPH. Los factores que deben considerarse al determinar los requisi-
tos de cambio de aire incluyen la cantidad de personas que trabajan en el cuarto y los procesos de preparación magistral que
generan partículas, así como los efectos de la temperatura. Una zona amortiguadora y una antesala ISO Clase 7 (ver Tabla 7)
provistas de aire filtrado por HEPA deben recibir no menos de 30 CAPH. El CIP es una buena forma de incrementar los cambios
de aire en el suministro de aire de un área, pero no puede ser la única fuente de aire filtrado por HH'A Cua'.1do el área cuenta
con un dispositivo de recirculación ISO Clase 5 (ver Tabla 1) se considera adecuado un mínimo de 15 CAPh a través de los
filtros HEPA que abastecen el área, siempre y cuando los CAPH combinados no sean menores de 30. Se pueden requerir más
intercambios de aire, dependiendo de la cantidad de personas y procesos. El suministro de aire íiltrado por HEPA se debe intro-
ducir por el cielo raso y los retornos se deben montar a un nivel bajo en la pared, creandose así 'Jna dilCJción general, de arriba
hacia abajo, del aire del área con el aire filtrado por HEPA. No se recomienda ubicar los retorne~ en el cielo raso. Debe probar-
se la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamaño de partícula más penetrante y deben probai-st: por fugas en la fábrica
y de nuevo in situ después de la instalación.7
Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se tra-
baja en un ambiente controlado. Sólo pueden llevarse a este cuarto los muebles, equipos. suministros y otros materiales reque-
ridos para realizar las actividades de preparación magistr·al y éstos deben ser impermeables, lavables, resistentes a los desinfec-
tantes y no desprender partículas. Cada vez que se lleva alguno de estos elementos al cuarto, primern se lo debe limpiar y
desinfectar. Siempre que sea posible, los equipos y otros elementos usados en la zon.1 amortiguadora 110 deben retirarse del
cuarto, salvo para su calibración, reparación u otras actividades asociadas con el mantenimiento correctu del equipo.
Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la 101121 amortiguadora de-
ben ser lisos e impermeables, no deben tener grietas y no deben desprender partículas pdra facilitar su limpie1a y reducir al
mínimo los espacios en los que podrían acumularse microorganismos y otros contaminantes. Las superficies deben ser resisten-
tes a los daños causados por agentes desinfectantes. La) uniones de los cielos rasos Lun la:> pai eJes clelk1, >ci al.Jo\ ei:iacias o
enmasilladas para evitar la formación de grietas donde pueda acumularse polvo. Si los cielos rasos constar> Lie paneles incrusta-

6 ISO 14644-4:2001 Cleanrooms and associated controlled environments-Design, construct1on, c1nd start-up, Cose Pow11c )Ó, Ch- 1) i i e ,,.11evc lO, '>wil1eriand,
tel. +4122749 01 11.
7 Por definición (IEST RP ce 0001 .4 ), lo') filtros HEPA tienen como nllílÍlll<J Llfld ef IC dlÍtl de 99/1 7'~() (lJdíhll) ,( L,\(l! 1cln LJ 1 1 i(J\' \f'h'l )l.l \' Prll lle uld\ de O, 3
pm generadas termalme11te o clasificada; segun el ta mano de partícula más penetrante, usando un contad"' uart1culas.
532 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

dos, éstos se deben impregnar con un polímero para hacerlos impermeables e hidrófobos y, además, se debe enmasillar todo
su perímetro para sellar la unión con el armazón que hace de soporte. Las paredes pueden ser de material flexible (p.ej., polí-
mero de alta densidad), paneles unidos entre sí y sellados o placas de yeso con revestimiento epóxico. Preferentemente, los
pisos deben cubrirse con planchas anchas de revestimiento vinílico, térmicamente soldadas y arqueadas hacia los zócalos. De-
be evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberías de servicios que pasan por el cielo raso o
las repisas de las ventanas. La superficie externa de los artefactos de iluminación embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar
sellada y al ras del cielo raso. Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado. La zona
amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar cons-
truidas con materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plástico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfec-
tarse fácilmente. Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plástico no poroso o planchas metálicas, con ruedas de
buena calidad y fáciles de limpiar para facilitar su movilidad. Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben
ser lisos, de material impermeable y fáciles de limpiar y desinfectar y, además deben estar libres de grietas y no desprender
partículas; la cantidad, el diseño, y la forma de instalación deben ser tales que faciliten una limpieza y sanitización eficaces.

Colocación de los Controles de Ingeniería Primarios

Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) de acceso res-
tringido (ver Figura 1), con las siguientes excepciones para CAl/CACI:
• Sólo el personal autorizado y los materiales requeridos para la preparación magistral y la limpieza deben permitirse en la
zona amortiguadora.
• Los procedimientos de preesterilización para las PME de alto riesgo, como por ejemplo pesar y mezclar, se deben comple-
tar en un ambiente no inferior a ISO Clase 8 (ver Tabla 1).
• Los CIP deben ubicarse fuera de las vías de tráfico y lejos de las corrientes de aire del cuarto que pudieran perturbar los
patrones de flujo de aire deseados.
Los CAi y los CACI deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) a menos que cumplan con
todas las condiciones siguientes:
• El aislador debe proporcionar aislamiento del cuarto y mantener la ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante las condiciones diná-
micas de operación, incluso la transferencia de ingredientes, componentes y dispositivos dentro y fuera del aislador y du-
rante la preparación de PME.
• Los recuentos de partículas de muestras tomadas aproximadamente 6 a 12 pulgadas más arriba del sitio de exposición
crítica deben mantener niveles ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la preparación magistral.
• No se deben contar más de 3520 partículas (0,5 µm y más grandes) por m3 durante la transferencia de material, con la
sonda del contador de partículas ubicada tan cerca de la puerta de transferencia como sea posible, sin obstruir la transfe-
rencia. 8
El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de obtener del fabricante la documentación indicando que los
CAl/CACI cumplirán con esta norma cuando se ubiquen en ambientes donde los recuentos de partículas excedan ISO Clase 8
(ver Tabla 1) para partículas iguales o mayores de 0,5 µm. Cuando se usen aisladores para la preparación magistral estéril, el
tiempo de recuperación para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) se debe documentar y se deben desarrollar
los procedimientos internos para garantizar que deje transcurrir el tiempo de recuperación adecuado después de transferir los
materiales, antes y durante las operaciones de preparación magistral.
Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los requisitos arriba mencionados o es una CFL o una CSB que no se
puede ubicar dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces sólo se pueden preparar PME no peligro-
sas y radiofarmacéuticas de nivel de riesgo bajo, según las órdenes de un médico, para un paciente específico, y la administra-
ción de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparación o según lo recomendado en el prospecto del em-
paque del fabricante, cualquiera que sea menor.

Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables

El programa de muestreo ambiental debe proporcionar información al personal y a los directivos para demostrar que el CIP
mantiene un ambiente dentro del área de preparación magistral, que garantiza en forma constante niveles de partículas via-
bles y no viables aceptablemente bajas. El área de preparación magistral incluye los CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) (CFL, CSB,
CAi y CACI), las zonas amortiguadoras, las antesalas y las áreas segregadas de preparación magistral.
El muestreo ambiental se debe tomar como parte de un programa integral de gestión de la calidad y se llevará a cabo, como
mínimo, bajo cualquiera de las siguientes condiciones:
• como parte de la puesta en servicio y certificación de nuevas instalaciones y equipo;
• después de cualquier reparación de las instalaciones y equipos;
•como parte de la recertificación de las instalaciones y equipos (es decir, cada 6 meses);
• en respuesta a problemas identificados en los productos terminados o técnicas del personal; o

8 Los procedimientos de muestreo se detallan en CETA Applications Cuide CAG-002-2006, sección 2.09.
USP 37 Pruebas Físicas / (79 7) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 5 3 3

•en respuesta a problemas con las PME, prácticas de trabajo observadas del personal de preparación magistral o infeccio-
nes relacionadas con el paciente (donde la PME se considera una fuente potencial de la infección).

PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTÍCULAS AMBIENTALES NO VIABLES

Un programa de muestras de partículas aéreas no viables difiere del de partículas viables en que está planeado para que
mida directamente el desempeño de los controles de ingeniería usados para crear los diversos niveles de limpieza de aire, por
ejemplo, ISO Clase 5, 7, u 8 (ver Tabla 7).
Verificación del Desempeño de los Controles de Ingeniería-Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) y los controles de ingeniería
secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) son componentes esenciales de la estrategia de control general de contamina-
ción para la preparación magistral aséptica. Por lo tanto, es fundamental que funcionen tal como están diseñados y que los
niveles de contaminación resultantes estén dentro de límites aceptables. Los procedimientos de certificación, como aquellos
señalados en "Certification Cuide for Sterile Compounding Facilities (CAG-003-2006)" 9 deben ser efectuados por una persona
calificada, por lo menos cada 6 meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique o altere o se haga una reparación
mayor en las instalaciones.
Recuento Total de Partículas-La certificación que cada área con clasificación ISO, por ejemplo, ISO Clase 5, 7 y 8 (ver
Tabla 7) está dentro de las normas establecidas, se debe realizar al menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o
el CACI se reubiquen o la estructura física de la zona amortiguadora o de la antesala se alteren. Las pruebas deben ser efectua-
das por operadores calificados, usando equipo electrónico de última tecnología con los siguientes resultados:
• ISO Clase 5: no más de 3520 partículas iguales o mayores de 0,5 ~tm por metro cúbico de aire para cualquier CFL, CSB,
CAi y CACI;
• ISO Clase 7: no más de 352 000 partículas iguales o mayores de 0,5 ~tm por metro cúbico de aire para cualquier zona
amortiguadora;
• ISO Clase 8: no más de 3 520 000 partículas iguales o mayores de 0,5 ~tm por metro cúbico de aire para cualquier antesa-
la.
El personal de supervisión u otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificación para
garantizar que los ambientes controlados cumplan con la limpieza de aire, las presiones del cuarto y CAPH apropiados.

MONITOREO DE LA PRESIÓN DIFERENCIAL

Se debe instalar un manómetro o velocímetro para supervisar el diferencial de presión o flujo de aire entre la zona amorti-
guadora y la antesala y entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparación magistral. Los resultados debe-
rán revisarse y documentarse en un cuaderno de bitácora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mínima debe
ser diariamente) o mediante un dispositivo de grabación continua. La presión entre el área ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y el área
general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua). En instalaciones donde se preparan
PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mínima de 0,2 metros por
segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.

PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTÍCULAS AÉREAS AMBIENTALES VIABLES

El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prácticas de vestuario apropiadas, de la técnica aséptica del personal de preparación magistral
y de la presencia de contaminación superficial, asumiendo que todo el trabajo se desempeña en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla
7) y controles de ingeniería secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 7),
certificados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacien-
tes porque el personal de preparación magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estériles
con el fin de conseguir la esterilidad.
Un programa de muestreo junto con una auditoría de observación están diseñados para evaluar la competencia de las prác-
ticas de trabajo del personal de preparación magistral, permitiendo la implementación de las acciones correctivas de manera
continua (ver Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedi-
mientos de Limpieza y Desinfección).
Plan de Muestreo-Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partículas aéreas viables, basado
en la evaluación de riesgo de las actividades de preparación magistral efectuadas.
Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y en las zonas
ISO Clase 7 y 8 (ver Tabla 1), así como en las zonas segregadas de preparación magistral con más alto rit'~go de contamina-
ción (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5 [ver Tabla 1], mostradores cercanos a las puertas, cabinas de trans-
ferencia de materiales (pass-through boxes)). El plan debe incluir: ubicación de la muestra, método de recolección, frecuencia
de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del día, en lo que respecta a la actividad de la zona de preparación magistral
y los niveles de acción.

9 Controlled Environment Testing AS>ociation, 1500 Sunday Drive, Ste. 102, Raleigh, NC 27607; www.CETAinle111alio11al.orq.
534 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

La revisión de los datos generados durante un muestreo puede detectar cantidades elevadas de biocarga microbiana aérea;
dichos cambios pueden ser indicio de cambios adversos en el ambiente. Se recomienda que el personal de preparación magis-
tral se remita a Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) y a las "Guidelines for Environ-
mental lnfection Control in Healthcare Facilities, 2003", de los CDC (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades)
para más información.
Medio de Crecimiento-Para facilitar el crecimiento bacteriano se debe utilizar un medio de crecimiento microbiológico
general, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja. En los ambientes de preparación magistral con nivel de riesgo alto se
debe usar un agar con extracto de malta u otro medio que facilite el crecimiento de hongos. Los medios usados para el mues-
treo de superficies deben complementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej., TSA
con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partículas Aéreas Viables-La evaluación de microorganismos aéreos usando métodos volumétricos de reco-
lección en los ambientes de aire controlado (CFL, CAi, cuarto limpio o zonas amortiguadoras y antesalas) debe efectuarla per-
sonal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
El método de impacto debe ~er el método preferido de muestreo volumétrico de aire. El uso de placas de sedimentación
para muestreo cualitativo de aire puede no ser capaz de determinar adecuadamente la calidad del aire en el ambiente contro-
lado. La sedimentación de partículas por gravedad en placas de cultivo depende del tamaño de la partícula y puede estar in-
fluenciada por el movimiento del aire. Por consiguiente, la cantidad de unidades formadoras de colonias (ufc) en una placa de
sedimentación puede no siempre estar relacionada con las concentraciones de las partículas viables en el ambiente muestrea-
do.
Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares pro-
pensos a la contaminación, durante las actividades de preparación magistral y otras actividades como clasificación de compo-
nentes, etiquetado, vestimenta y limpieza. Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro
de la CFL y otras áreas donde la turbulencia de reflujo de aire puede ingresar a la zona de preparación magistral (puertas de
entrada, dentro y alrededor del CIP y ambientes ISO Clase 5 [ver Tabla 7]). Debe considerarse el efecto general que el método
de muestreo escogido tendrá sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de preparación magistral.
Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, preparada en un CIP (CFL, CSB, CAi) que mantiene una ISO
Clase 5 (ver Tabla 1), el muestreo del aire se debe efectuar en lugares dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras áreas (ver Tabla
7) que estén muy cerca del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la certificación del CIP.
Dispositivos de Muestreo de Aire-Existe una gran cantidad de fabricantes de equipos electrónicos para muestreo de aire.
Es importante que el personal consulte los procedimientos recomendados por el fabricante al usar un equipo para efectuar el
muestreo volumétrico de aire. Se deben seguir las instrucciones en el manual del usuario provisto por el fabricante en lo que
respecta a la verificación y uso de muestreadores eléctricos de aire que recolectan activamente volúmenes de aire para análisis.
Se debe evaluar un volumen suficiente de aire ( 400 a 1000 litros) en cada lugar seleccionado, con el fin de maximizar la sensi-
bilidad. Los dispositivos volumétricos para muestreo de aire tienen que calibrarse y repararse según lo recomendado por el
fabricante.
Se recomienda que el personal de preparación magistral se remita también a Metodología e Instrumental para Cuantificación
de Microorganismos Viables Transportados por el Aire en Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asépti-
co (1116), que proporciona más información sobre el uso de muestreadores volumétricos de aire y el volumen de aire que se
debe recolectar para detectar variaciones de la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire-Como parte de la recertificación de instalaciones y equipos, el muestreo del
aire se debe efectuar al menos dos veces al año (es decir, cada 6 meses). Si la preparación magistral se realiza en múltiples
ubicaciones dentro de una institución (p.ej., farmacia principal, satélites), se requiere el muestreo ambiental para cada área de
preparación individual. Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo
electrónico para muestreo de aire. Cualquier actividad de construcción o de reparación de equipos dentro de una instalación
puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Período de Incubación-Al final del período de muestreo o exposición indicado para la toma de muestras de aire se recu-
peran las placas de medio de crecimiento microbiano, se aseguran sus tapas (p.ej., con cinta) y luego se invierten e incuban a
una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El TSA se debe incubar a una tempe-
ratura de 30º a 35º durante un período de 48 a 72 horas. El agar con extracto de malta u otro medio apto para hongos se
debe incubar entre 26º y 30º durante 5 a 7 días. Se debe contar e informar la cantidad de colonias discretas de microorganis-
mos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de muestreo ambiental. Los recuentos de las muestras de
aire se deben transformar en ufc por metro cúbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos-El muestreo microbiano viable del aire en el ambiente de
preparación magistral adquiere valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una situación inaceptable. Los datos
de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
preparación magistral. Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consul-
tar al personal competente de microbiología.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción (ver Tabla 2) debe dar lugar a una reevaluación de la
aptitud de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtración de aire dentro de las instalaciones de preparación magistral aséptica. Se debe investigar la fuente de la contamina-
USP 37 Pruebas Físicas/ <797) Preparación Magistral---Preparaciones Estériles 535

ción. Las posibles fuentes incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA dai1ados y cambios en la vestimenta o prácticas de traba-
jo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el área afectada y tomar nuevas muestras.
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de acción se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 2 deben usarse sólo como guía. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la tarmacia, las acciones
correctivas futuras se tomarán de acuerdo con la identificación de los microorganismos recuperados (al menos el género) he-
cha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc, usando un muestreador de
aire por impacto. Los microorganismos altamente patógenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilococos coagulasa positivo,
hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben PME y deben ser elimina-
dos de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbiólogo competente. un profesional de
control de infecciones o un higienista industrial.
Tabla 2. Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana'
t(ufc por metro cúbico [l 000 litros] de aire por placa)

~ : ~ ~ ~ : ~: ~:7~-o~m~e~n~o~r~ca~l~id~a~d~C~l~a~si~fi~c~ac~i~ó~n~ ~·~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~-f-'- - - ~ - - -~ - ~ =:~·~;O::_=-=-n- ~ .·~

* Guidance for lndustry-Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice-US HHS, FDA, septiembre de 2004.

Requisitos Adicionales para el Personal

Los alimentos, bebidas y materiales expuestos en áreas de cuidado y tratamiento de pacientes no deben introducirse en an-
tesalas, zonas amortiguadoras o áreas segregadas para preparación magistral en las que haya componentes e ingredientes de
PME. Cuando las actividades de preparación magistral requieran la manipulación de materiales derivados de la sangre del pa-
ciente u otros materiales biológicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones
deben hacerse claramente aparte de los procedimientos de rutina para manejo de material y equipo usado en las actividades
de preparación de PME y deben controlarse por medio de POE específicos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. Los
suministros y componentes empacados para preparación magistral, como agujas, jeringas, sets de tubos y soluciones parente-
rales de pequeño y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA
estéril al 70%) de ser posible en una antesala de calidad de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1), antes de pasarlos a las zonas amorti-
guadoras. La higiene de manos y los procedimientos de vestimenta del personal se efectúan también e11 la antesaia, la cual
puede contener un lavabo que se pueda accionar sin usar las manos y un sistema cerrado dispensador de jabón para minimizar
el riesgo de contaminación extrínseca. Deberá existir algún tipo de demarcación que separe la antesala de la zona amortigua-
dora. Después de entrar a la zona amortiguadora deben tomarse las medidas adecuadas para efectuar la limpieza antiséptica
de manos usando un exfoliante quirúrgico a base de alcohol con actividad persistente, seguido del uso de guantes estériles.

Limpieza y Desinfección del Área de Preparación Magistral

El contacto ambiental es una fuente importante de contaminación microbiana de las PME. Por consiguiente, se requiere
atención escrupulosa en la limpieza y desinfección de las áreas de preparación magistral estéril para minírrnzar dicha tuente de
contaminación de las PME.
Las prácticas de limpieza y desinfección, así como las frecuencias mencionadas en esta sección aplican a las zonas de prepa-
ración magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposición de sitios críticos, así como a las zonas amortiguadoras, antesalas y
zonas segregadas de preparación magistral. El personal de preparación magistral es responsable de garantizar que la frecuen-
cia de limpieza esté de acuerdo con los requisitos estipulados en la Tabla 3 y determinar los productos par<i limpieza y desin-
fección que se van a usar (ver Apéndice 11). El personal de preparación magistral debe tener en cuenta toda política organizacio-
nal o institucional relacionada con la selección de desinfectantes. Todas las prácticas y políticas de limpieza y desinfección para
la preparación de PME se deben incluir por escrito en los POE y las debe seguir todo el personal de precia ración magistral.
La selección y uso de desinfectantes en instituciones de salud está dictada por varias propiedades, la les como actividad mi-
crobicida, inactivación por materia orgánica, residuos y vida útil (ver Apéndice 11). En general, los des1ntectantes altamente tóxi-
cos, como el glutaraldehído no se usan sobre las superficies del ambiente (p.ej., pisos, mostradores) Muchos desinfectantes
registrados por la EPA son de un solo paso. Esto significa que el desinfectante está formulado para ser eficaz en presencia de
suciedad leve a moderada, sin un paso previo de limpieza.
Las superficies en CFL, CSB, CAi y CACI, a las que están expuestos los sitios críticos, requieren desintección más frecuente
que las superficies del ambiente como paredes y cielos rasos. La desinfección de zonas de preparac1cw maq1stral estenl debe
hacerse de manera periódica con los intervalos mencionados en la Tabla 3 cuando ocurren dErr<:mictrníerii m, e uando las super-
ficies están visiblemente sucias y cuando se sabe o se sospecha que se ha introducido c.ontarn1nacon crnuob1ana en las zonas
de preparación magistral.
Cuando la superficie que se va a desinfectar está muy sucia, se recomienda una limpieza antes cir:· 1a apl1cac1on del desintec-
tante. El personal de preparación magistral capacitado es responsable de desarrollar, 1'11picnwntar ;1 f' >"I"' (•n P'il(t1ca los pro-
536 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Flsicas USP 37

cedimientos de limpieza y desinfección del área directa de preparación magistral (ADP) escritos en los POE. La limpieza y de-
sinfección deben hacerse antes de la preparación magistral. Para hacer la limpieza, se deben quitar todos los artículos y limpiar
las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos sólidos solubles en agua
se quitan con agua estéril (para inyección o irrigación) y paños que no desprendan partículas. Luego se pasa un paño con un
agente desinfectante que no deje residuos, como IPA al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparación magistral.
Las prácticas más críticas antes de la preparación de las PME son la limpieza y desinfección de las superficies en CFL, CSB,
CAi y CACI. Por consiguiente, dichas superficies se deben limpiar y desinfectar con frecuencia: al comenzar cada turno de tra-
bajo, antes de la preparación de cada lote, cada 30 minutos durante los períodos continuos de preparación de PME individua-
les, cuando haya derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie está contaminada debido a fallas procedimen-
tales.
Las superficies de trabajo en las zonas amortiguadoras ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y las antesalas ISO Clase 8 (ver Tabla 7), así
como las zonas segregadas de preparación magistral se deben limpiar y desinfectar por lo menos diariamente, y el polvo y los
detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparación
magistral, usando un método que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8 (ver Tabla 7) (ver Desinfectantes y Antisépticos
(l 072)).
Tabla 3. Frecuencia Mínima de limpieza y Desinfección de las Zonas de Preparación Magistral
Lugar 1 Frecuencia Mínima
Control de Ingeniería Primario ISO Clase 5 (ver Tabla 1lfAI comenzar cada t~rno, antes de cada lote, a más tardar 30 minutos después de la de-
(p.ej., CFL, CSB, CAi, CACI) sinfección previa de la superficie cuando se están llevando a cabo actividades de prepa-
ración magistral, después de derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la su-
perficie está contaminada --- .
Mostradores y superfi- Diariamente
cies de trabajo fácilmente limpiables
Pisos Diariamente
Paredes Mensualmente
Cielos rasos Mensualmente
Estantes de almacenamiento Mensualmente

Los pisos en la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona de preparación magistral segregada se friegan con un agente
limpiador y desinfectante una vez al día, a una hora en que no se esté realizando ninguna operación aséptica. La limpieza del
suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE
escritos. El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que dicha limpieza se haga apropiadamen-
te. En la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona segregada de preparación magistral, se deben limpiar y desinfectar
mensualmente las paredes, cielos rasos y estanterías. Sólo deben utilizarse agentes de limpieza y desinfección aprobados te-
niendo en cuenta su compatibilidad, eficacia y la generación de residuos inapropiados o tóxicos (ver Apéndice//). Sus crono-
gramas de uso y métodos de aplicación deben concordar con los POE escritos y el personal de apoyo y el de preparación ma-
gistral deben cumplirlos.
Todos los materiales de limpieza, como paños, esponjas y trapeadores, no deben desprender partículas, y deben estar com-
puestos preferentemente por microfibras sintéticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras o limpias, antesalas y áreas
segregadas de preparación magistral, de las cuales no deben retirarse a menos que sea para desecharlos. Pueden usarse tra-
peadores, tanto en la zona amortiguadora o cuarto limpio como en la antesala, pero únicamente en ese orden. Lo ideal sería
que todas los enseres de limpieza se descartaran después de un uso, recolectándolos en bolsas plásticas apropiadas y retirándo-
los del lugar con la mínima agitación. Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar proce-
dimientos (basándose en las recomendaciones de los fabricantes) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se
mantiene y el uso repetido no incrementa la biocarga del área que se está limpiando.
Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej.,
IPA estéril al 70%), empleando un frasco rociador u otro método de aplicación adecuado. Después de rociar o limpiar con el
desinfectante la superficie a desinfectar, ésta se debe dejar secar y durante este tiempo el artículo no se debe usar para la pre-
paración magistral.
Para desinfectar puntos de entrada de bolsas y viales, es preferible limpiar con hisopos pequeños estériles impregnados en
IPA al 70%, los cuales se consiguen comercialmente en envases laminados sellados individuales (o un método comparable),
dejando secar el IPA antes de perforar los tapones con agujas estériles y de romper los cuellos de las ampollas. La superficie de
los hisopos estériles con IPA al 70% usados para desinfectar puntos de entrada de envases y dispositivos estériles no debe en-
trar en contacto con ningún otro objeto antes de tocar la superficie del punto de entrada. No se deben utilizar compresas de
gasa empapadas en IPA estéril al 70% ni otros materiales que desprendan partículas para desinfectar los puntos de entrada
estériles de envases y dispositivos.
Cuando se reciben suministros estériles en bolsas selladas destinadas a conservarlos estériles hasta el momento de abrirlos,
los suministros estériles se pueden retirar de las bolsas que los recubren cuando se introducen en el CIP (CFL, CSB, CAi, CACI)
ISO Clase 5 (ver Tabla 7) sin que sea necesario desinfectar los artículos individuales del suministro estéril. No se pueden llevar
cajas de embalaje ni otros envases externos a la zona amortiguadora o limpia ni al área segregada de preparación magistral.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral--Preparaciones Estériles 537

Limpieza y Vestimenta del Personal

La cuidadosa limpieza de manos y brazos y el uso correcto del adecuado equipo protector para el personal (EPP) por parte
del personal de preparación magistral constituye el primer paso más importante en la prevención de contaminación microbia-
na de las PME. Además, el personal debe ser completamente competente y estar muy motivado para realizar manipulaciones
asépticas impecables con ingredientes, dispositivos y componentes de las PME. Del cuerpo humano normalmente se despren-
den células escamosas a una velocidad de 10 6 o más por hora y esas partículas de la piel están cargadas de microorganis-
mos.10.11 Cuando los individuos tienen prurito, quemaduras de sol, úlceras exudantes, conjuntivitis, infección respiratoria activa
o usan cosméticos, estas partículas se desprenden incluso a mayor velocidad. Las partículas desprendidas por el personal de
preparación magistral representan un incremento en el riesgo de contaminación microbiana de los sitios críticos de PME. Por
lo tanto, el personal de preparación magistral que presenta alguna de las afecciones antes mencionadas debe ser excluido del
trabajo en zonas de preparación magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 7) e ISO Clase 7 (ver Tabla 7), hasta que dichas afecciones
desaparezcan.
Antes de ingresar en una zona amortiguadora o en una zona segregada de preparación magistral (ver PME de Nivel de Riesgo
Bajo con FLU de 72 Horas o Menos), el personal de preparación magistral debe quitarse las prendas personales exteriores (p.ej.,
banda nas, abrigos, sombreros, chaquetas, bufandas, suéteres, chalecos), todos los cosméticos, porque desprenden escamas y
partículas, y todas las joyas de las manos y muñecas, así como otras joyas y accesorios visibles (p.ej., aretes, pendientes para
labios o cejas (pirsins)) que puedan interferir con la eficacia del EPP (p.ej., ajuste de guantes y puños de mangas). El uso de
uñas postizas o prolongaciones está prohibido mientras se trabaja en el ambiente estéril de preparación magistral. Las uñas
naturales se deben mantener limpias y recortadas.
El personal debe usar el siguiente EPP en un orden que vaya de las actividades consideradas más sucias hasta las más limpias.
Las actividades de vestimenta consideradas más sucias incluyen el calzado de zapatos destinados a la preparación magistral o
cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial (p.ej., cubiertas para la barba, además de máscaras), máscaras pro-
tectoras para la cara y ojos. Los protectores para los ojos son opcionales, a menos que se trabaje con irritantes como agentes
germicidas desinfectantes o se elaboren preparaciones con fármacos peligrosos.
Después de ponerse el calzado especial o cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial, y máscaras, se debe
realizar un procedimiento de limpieza de manos para retirar los detritos debajo de las uñas con un limpiador de uñas, bajo
agua tibia corriente, seguido de una limpieza meticulosa de las manos. Las manos y los antebrazos se deben lavar hasta los
codos con agua y jabón (bien sea antimicrobiano o no), durante 30 segundos al menos, mientras se está en la antesala. No se
recomienda el uso de cepillos antimicrobianos porque causan irritación y lesiones cutáneas. Se secan las manos y los antebra-
zos completamente hasta los codos, bien sea con toallas desechables sin pelusas o con un secador de manos electrónico. Des-
pués de completar el lavado de manos, se viste una bata con mangas que no desprenda partículas, que ajuste de manera có-
moda alrededor de las muñecas y cierre en el cuello. Se deben usar batas destinadas para la zona amortiguadora, que sean de
preferencia desechables. Si se visten batas reutilizables, se deben lavar apropiadamente para uso en la zona amortiguadora.
Una vez dentro de la zona amortiguadora o del área segregada de preparación magistral (ver PME de Nivel de Riesgo Bajo con
FLU de 72 Horas o Menos) y antes de calzar guantes estériles sin talco, se debe efectuar una limpieza antiséptica de manos con
un exfoliante quirúrgico para manos exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistenteu, siguiendo las recomenda-
ciones del fabricante. Las manos se deben dejar secar completamente antes de calzar los guantes estériles.
Los guantes estériles deben ser el último artículo puesto antes de comenzar la preparación magistral. Los guantes se conta-
minan cuando entran en contacto con superficies no estériles durante las actividades de preparación magistral. La desinfección
de las manos enguantadas se debe hacer frotando o untando IPA estéril al 70% en todas las superficies de contacto de los
guantes y dejando secar completamente las manos enguantadas. Usar sólo guantes cuya compatibilidad con la desinfección
con alcohol haya sido probada por el fabricante. Durante todo el procedimiento de preparación magistral se debe aplicar IPA
estéril al 70% en forma rutinaria, al igual que siempre que se toquen superficies no estériles (p.ej., viales, mostradores, sillas,
carros). Los guantes se deben inspeccionar rutinariamente, durante el uso, en busca de orificios, pinchazos o rasgones, reem-
plazándolos de inmediato si éstos se detectan. La limpieza antiséptica de manos se debe efectuar como se indicó anteriormen-
te. Se debe capacitar y evaluar al personal de preparación magistral sobre cómo evitar el contacto con los sitios críticos.
Cuando el personal de preparación magistral sale del área de preparación durante un turno de trabajo, se debe quitar la
bata exterior, conservándola en el área de preparación magistral si no está visiblemente sucia, para volvérsela a poner durante
ese mismo turno únicamente. Sin embargo, los cubrecalzado, las mascarillas que cubran el vello facial y gorras, máscaras pro-
tectoras para la cara y ojos, así como los guantes se deben reemplazar por otros nuevos antes de volver a entrar al área de
preparación magistral y se debe efectuar de nuevo la higiene de las manos.
Durante las actividades de preparación magistral de alto riesgo que preceden a la esterilización terminal, como son el pesa-
do y mezclado de ingredientes no estériles, el personal de preparación magistral debe estar vestido y enguantado igual que si
estuviera realizando una preparación magistral en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7). El personal de preparación magistral
adecuadamente vestido y enguantado que se exponga a un aire cuya calidad se sepa o sospeche inferior a ISO Clase 7 (ver
Tabla 7) debe cambiar EPP, además de lavarse las manos apropiadamente, efectuando limpieza antiséptica de la manos con un

10 Agalloco J, Akers )E. Aseptic Processing: A Vision of the Future. Pharmaceuticol Technoloc¡y, 2005. Asepti< Processing supplernent, s16
11 Eaton T. Microbial Risk Assessrnent for Aseptically Prepared Products. Am Pharm Rev. 2005; 8 (5, Sep/Oct): 46-51.
1 2 Guideline for Hand Hygiene in Health care Settings, MMWR, el 25 de octubre de 2002, vol. 51, N RR-16 d1>¡}()11ible en lnlemet "" illlp·' www cdc.govlhdndhy-
giene/.
538 (797> Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicos USP 37

exfoliante quirúrgico a base de alcohol, sin agua, y calzar guantes estériles al volver a ingresar a la zona amortiguadora ISO
Clase 7 (ver Tabla 7). Cuando las fuentes del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) son CAi o CACI, los requisitos de vestimenta y
guantes para el personal de preparación magistral deben ser iguales a los descritos anteriormente, a menos que el fabricante
del aislador pueda proporcionar documentación por escrito, basada en pruebas ambientales validadas, de que no se requiere
algún componente del EPP o de la limpieza del personal.

Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de

Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección
El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de per-
sonal experto, con ayuda de instrucción multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conoci-
mientos prácticos de los procedimientos de vestimenta, prácticas asépticas de trabajo, así como en la forma de conseguir y
mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y procedimientos de limpieza y desinfección. Esta capacitación se
debe completar y documentar antes de que cualquier miembro del personal comience la elaboración de PME. El personal de
preparación magistral debe completar la capacitación didáctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a
evaluaciones de destreza usando herramientas de auditoría de observación y pruebas de llenado de medios (ver Apéndices ///-
\/).
Las pruebas de las destrezas para el trabajo aséptico mediante el llenado de medios se efectúan inicialmente antes de co-
menzar a preparar PME y luego anualmente, al menos, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y
semestralmente para preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto.
El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o las auditorías de observación o cuyos viales de prue-
ba de llenado de medios tengan una o más unidades que muestren contaminación microbiana visible deberá recibir de inme-
diato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para
asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica. El personal de preparación magistral
debe aprobar todas las evaluaciones antes de reiniciar la práctica de preparación magistral estéril. Además de la evaluación
didáctica y llenado aséptico de medios, el personal de preparación magistral debe demostrar competencia en la higiene apro-
piada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza.
En caso de que el personal de apoyo (p.ej., personal de limpieza/mantenimiento y servicios ambientales institucionales) efec-
túe también procedimientos de limpieza y desinfección, un experto calificado en preparación magistral aséptica debe capaci-
tarlos en la higiene de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza y desinfección. Después de terminar la capacita-
ción, el personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluación de desempeño en la higiene apropiada de las ma-
nos, vestimenta y todos los procedimientos de limpieza y desinfección, que llevará a cabo un experto calificado en preparación
magistral aséptica.

EVALUACIÓN DE COMPETENCIA EN VESTIMENTA Y PRÁCTICAS ASÉPTICAS DE TRABAJO

El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prácticas de vestuario apropiadas; de la técnica aséptica del personal de preparación magistral
y de la presencia de contaminación superficial, asumiendo que todo el trabajo se realiza en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y
controles de ingeniería secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 7), certifi-
cados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacientes
porque el personal de preparación magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estériles con
el fin de conseguir la esterilidad. El personal de preparación magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la
elaboración de PME y siempre que se efectúe un llenado de medios aséptico, usando un formulario como el Formulario de
Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magis-
tral (ver Apéndice JI/) y el procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal, según se indica a
continuación.
Evaluación de la Práctica Aséptica de Trabajo por Medio del Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del
Personal-El muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral se debe realizar en la
elaboración de PME de todos los niveles de riesgo, dado que la contaminación por contacto directo es la fuente más probable
de introducción de microorganismos en las PME preparadas por seres humanos. El muestreo de las puntas de los dedos en-
guantados se debe usar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de las manos y vestimenta,
así como para educar al personal de preparación magistral en las prácticas de trabajo apropiadas, las cuales incluyen desinfec-
ción frecuente y repetida de guantes, usando IPA estéril al 70% durante la preparación de las PME. Todo el personal debe
demostrar competen e ia en los procedimientos adecuados de higiene de las manos y vestimenta, así como en las prácticas
asépticas de trabajo (p.ej., desinfección de las superficies de los componentes, desinfección rutinaria de manos enguantadas,
etc.).
Se deben usar placas estériles de contacto con agar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del
personal de preparación magistral después de vestirse, con el fin de evaluar la competencia en el uso de vestimenta, y después
de completar la prPparación de llenado de medios (sin aplicar IPA estéril al 70%) con el fin de evaluar si las prácticas asépticas
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación MagistrJI-- Prf'paraciones Estérile<> 539

de trabajo son adecuadas, antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano y para que el personal rnc1'>
experimentado mantenga su calificación en el proceso mencionado.
Evaluación de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes-El personal de preparación mcJq1stral debe ser inspeccio-
nado visualmente durante los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestirne11tc1 (ver L1n1pir¿u y Vestimento del Per-
sonal en Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica, arriba). La impección visuJI debe docu-
mentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de la Higiene de los Manoo y Prácticm Relacionados
con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral (ver Apéndice 111) y mantenerse para tener un registro permanente y eva-
luación a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados-Todo el personal de preparación magistral debe completar exitosa-
mente una evaluación inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados (cero
ufc) no menos de tres veces antes de que se le permita comenzar a elaborar PME para uso humano. Inmediatamente después
de que el empleado de preparación magistral complete la higiene de las manos y el procedimiento de wslirnenta (p.ej., calza-
do de guantes estériles antes de cualquier desinfección con IPA estéril al 70%), el evaluador recolect.na u11c1 muestra de las
puntas de los dedos y pulgares enguantados de ambas manos del empleado en placas de agar apropiddas, pre:-,ionando ligera-
mente el agar con cada dedo. Las placas se incubarán durante un período de incubación apropiado .1 ia ternperatura adecuada
(ver Período de Incubación). Después de completar la evaluación inicial de competencia en el uso de vestimt:11La y guantes, una
vez al año, como mínimo, se debe hacer una reevaluación de la competencia de todo el personal de preparación magistral que
elabore PME de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestralmente al personal que elabore PME de nivel de riesgo alto, usando
una o más muestras recolectadas durante cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios, antes de que se les permi-
ta continuar elaborando PME para uso humano.
No se deben desinfectar los guantes con IPA estéril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras. La desinfección
de los guantes inmediatamente antes de la toma de muestras proporcionará resultados falsos negativos. Cuando se tornen
muestras de las puntas de los dedos del personal se usarán placas que contengan agar nutritivo co11 agentes neutralizantes
como lecitina y polisorbato 80. El personal debe "tocar" el agar con las puntas de los dedos de ambas manos en placas separa-
das, de manera que se cree una ligera impresión en el agar. Después de la torna de muestras, los guantes se deben desechar
de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar nutritivo se deben incubar corno se estipula a
continuación (ver Período de Incubación). Los resultados se deben informar por separado corno la cantidad de ufc por emplea-
do por mano (mano izquierda, mano derecha). El nivel de acción de ufc para las manos enguantadas estara basado en la canti-
dad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
Período de Incubación-Al final del período de muestreo indicado para las actividades de evaluación de la competencia
del personal de preparación magistral (superficie o personal), se recuperan las placas de agar, se aseguran sus tapas y luego se
invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El TSA con leci-
tina y polisorbato 80 se debe incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 48 a 72 horas
Evaluación de la Competencia en Manipulación Aséptica-Después de completar exitosamente una Fvaiuación de Com-
petencia en Higiene de las Manos y Vestimenta, todo el personal de preparación magislral Jebe -,omuer'>l' u1 'ªevaluación de
su competencia en la técnica aséptica y prácticas relacionadas, inicialmente durante ei Procedimiento de Prueba de Llenado de
Medios y en los subsiguientes Procedimientos de Prueba de Llenado de Medios, anual o semestralmente. Los registros de estas
evaluaciones se mantendrán usando un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de Técnicas Asépticas y Prácti-
cas Relacionadas del Personal de Preparación Magistral (ver Apéndice IV) y se conservarán para lene;- un registro permanente de
la evaluación a largo plazo de la competencia del personal.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME asépticamente se debe evaluar
usando la verificación de llenado de medios de cultivos bacterianos líquidos y estériles (es decir, transferencia de un medio de
cultivo bacteriano estéril por medio de una jeringa y aguja estériles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
práctica aséptica del personal de preparación magistral. Las pruebas de llenado de medios deben representar las condiciones
más exigentes o difíciles con las que el personal puede encontrarse durante la elaboración de PME de nivel de riesgo bajo y
mediano y durante la esterilización de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafío de llenado de medios se usan tam-
bién para verificar la aptitud del ambiente de preparación magistral y de los procesos para producir una pn:'paración estéril.
Por lo general, se usa un medio líquido de cultivo estéril disponible comercialmente, corno el Medio de Digerido de Caseína
y Soja (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), que sea capaz de promover la colonización exponencial de las bacterias que el personal
de preparación magistral y el entorno suelen transmitir a las PME. Para PME de nivel de riesgo alto se puede usar un Medio de
Digerido de Caseína y Soja no estéril, disponible comercialmente, para preparar una solución al 3%. Se deben imitar los pasos
de procesamiento normales, incluyendo la esterilización por filtración. Los viales llenados con rnedim deben incubarse a una
temperatura de 20º a 25º o de 30º a 35º durante 14 días como mínimo. Si se usan dos temperaturas para la incubación de
muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura
(ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico <11161). Si cualquiera de las unidades llenas de
medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 días, significa que no se ha pasado la prueba. Se pueden considerar
otros métodos recomendados por un microbiólogo competente para mejorar el tiempo de recuperación y IJ '>ensibilidad par-a
detectar contaminación microbiana (ver ejemplos de procedimientos de llenado de medios en Niwles df' Rie,qo df' Contamina-
ción Microbiana en las PME).
540 (797) Preparación Magistral--Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas USP 37

MUESTREO Y EVALUACIÓN DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES

La toma de muestras de superficies es un componente importante del mantenimiento de un ambiente microbiológicamente

controlado para elaboración de PME, especialmente si se considera que la transferencia de contaminación microbiana a partir
del contacto inadvertido por parte del personal de preparación magistral con superficies desinfectadas inadecuadamente, pue-
de ser una fuente potencial de contaminación para las PME. Además, se considera útil para evaluar los procedimientos de lim-
pieza y desinfección de las instalaciones y superficies de trabajo, así como la competencia de los empleados en las prácticas de
trabajo como la desinfección de superificies de componentes/viales. En todas las áreas ISO se deben tomar muestras de las
superficies en forma periódica. Los muestreos se pueden hacer usando placas de contacto o hisopos y se deben realizar al ter-
minar la preparación magistral. Se deben definir los lugares en donde se van a tomar muestras en un plan o formulario de
muestreo. El tamaño de la placa que se va a usar para cada lugar muestreado tiene, por lo general, entre 24 y 30 cm 2 . Las
placas de contacto se llenan con medio agar sólido de crecimiento general y agentes neutralizantes por encima del borde de la
placa y se usan para tomar muestras de superficies parejas o planas. Se pueden usar hisopos para tomar muestras de superfi-
cies irregulares, especialmente para equipos (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico
(1116)).
Evaluación de Competencia en Limpieza y Desinfección-Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparación
magistral y demás personal responsable de la limpieza durante la realización de los procedimientos de limpieza y desinfección,
durante la capacitación inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y
después de la terminación de cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios (ver Limpieza y Desinfección del Área de
Preparación Magistral).
La inspección visual debe documentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de Procedimientos
de Limpieza y Desinfección (ver Apéndice \!)y conservarse para tener un registro permanente y la evaluación a largo plazo de la
competencia del personal.
Métodos de Recolección en la Superficie-Para tomar muestras usando una placa de contacto, se debe tocar suavemente
el área de muestreo con la superficie del agar y deslizar la placa sobre la superficie a muestrear. La placa de contacto dejará un
residuo de medio de crecimiento; por lo tanto, inmediatamente después de tomar la muestra con la placa de contacto, el área
muestreada se debe limpiar cuidadosamente con un paño que no desprenda partículas, empapado en IPA estéril al 70%.
Si se toma una muestra con el método del hisopo, la recolección de la muestra se hace con los procedimientos apropiados
que determinen un área superficial equivalente a la de la placa de contacto. Después de pasar los hisopos por la superficie
muestreada, los hisopos se colocan en un diluyente apropiado y una alícuota se siembra en el agar nutritivo especificado. Los
resultados se deben informar como ufc por unidad de área superficial.

Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos

El monitoreo microbiano viable de las puntas de los dedos enguantados y de las superficies de los componentes, así como
del ambiente de preparación magistral adquieren valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una práctica de
trabajo inaceptable. Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el
control general del ambiente de preparación magistral. Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de creci-
miento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiología.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción (ver Tabla 4) debe dar lugar a una reevaluación de la
aptitud de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtración de aire dentro de las instalaciones de preparación magistral aséptica. Se debe investigar la fuente de la contamina-
ción. Las posibles fuentes de contaminación incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA dañados y cambios en la vestimenta o
prácticas de trabajo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el área afectada y tomar nuevas muestras.
Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de acción después de la
incubación apropiada, se debe efectuar y documentar una revisión de los procedimientos de higiene de las manos y de vesti-
menta, así como de los procedimientos de desinfección de guantes y superficies y prácticas de trabajo. Puede ser necesario
capacitar al empleado para corregir la fuente del problema.
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de acción se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 4 deben usarse sólo como guía. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la instalación de prepara-
ción magistral, las acciones correctivas futuras se tomarán de acuerdo con la identificación de los microorganismos recupera-
dos (al menos el género), hecha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc,
usando un muestreador de aire por impacto. Los microorganismos altamente patógenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilo-
cocos coagulasa positivo, hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben
PME y deben ser eliminados de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbiólogo compe-
tente, un profesional de control de infecciones o un higienista industrial.
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Tabla 4. Niveles de Acción Recomendados para

Contaminación Microbiana*
Muestra de las Puntas Muestra de Superficie (Placa de Contacto)
Clasificación de los Dedos (ufc por placa)
ISO Clase 5 >3 >3
ISO Clase 7 N/D >5
ISO Clase 8 o menor calidad N/D > 100
* Pharmaceutical lnspection Co-operation Scheme (PIC/S) Cuide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes PE 009-6, 5 de abril de 2007.

PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDARES (POE) SUGERIDOS

La instalación de preparación magistral debe tener POE escritos y debidamente aprobados, diseñados para asegurar la cali-
dad del entorno en el que se elabora la PME. Se recomienda adoptar los siguientes procedimientos:
1. Restringir el acceso a la zona amortiguadora a personal calificado con responsabilidades específicas o tareas asignadas en
el área de preparación magistral.
2. Descontaminar en el área todos los materiales empacados, retirándolos de sus cajas y limpiándolos o rociándolos con un
agente desinfectante que no deje residuos, mientras se los transfiere a un carro limpio y adecuadamente desinfectado o a
otro medio de transporte para su introducción en la zona amortiguadora. Se seguirán las instrucciones del fabricante o los
datos publicados para el tiempo mínimo de contacto. No es necesario limpiar los materiales que vienen en bolsas indivi-
duales estériles, ya que las bolsas pueden retirarse a medida que se introducen los materiales en la zona amortiguadora.
3. Los suministros requeridos con frecuencia o que deben tenerse a mano pero que no son necesarios para las operaciones
programadas en un determinado turno deben descontaminarse y almacenarse en los estantes de la antesala.
4. Los carros usados para llevar materiales desde la sala de almacenamiento no pueden desplazarse más allá de la línea de
demarcación de la antesala y aquellos usados en la zona amortiguadora no pueden llevarse más allá de la línea de demar-
cación a menos que se limpien y desinfecten antes de volverlos a introducir.
5. Por lo general, los materiales requeridos para las operaciones programadas en cada turno deben limpiarse con un agente
desinfectante apropiado y llevarse a la zona amortiguadora, preferiblemente en uno o más carros móviles. Los materiales
de reserva o de uso general para las operaciones pueden almacenarse en el estante designado en la zona amortiguadora,
pero debe evitarse la acumulación excesiva de materiales.
6. Los objetos no esenciales que desprendan partículas no pueden llevarse a la zona amortiguadora, incluyendo lápices, cajas
de cartón, toallas de papel y artículos de algodón (p.ej., compresas de gasa).
7. Los productos esenciales a base de papel (p.ej., envolturas de papel de las jeringas, registros de trabajo guardados en una
funda protectora), se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado antes de llevarlos a la zona amortiguadora.
8. Debe reducirse al mínimo el flujo de tráfico hacia y desde la zona amortiguadora.
9. El personal que se prepara para entrar a la zona amortiguadora debe retirarse todas las prendas personales externas, cos-
méticos (porque desprenden escamas y partículas) y todas las joyas de manos y muñecas, así como otras joyas y acceso-
rios visibles que puedan interferir con la eficacia del EPP.
1 O. El personal que entra en la antesala debe vestir la ropa descrita en Limpieza y Vestimenta del Personal y Capacitación del
Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desin-
fección.
11. El personal deberá luego lavarse cuidadosamente las manos y los antebrazos hasta el codo con agua y jabón, por lo me-
nos durante 30 segundos. Después de lavarse, se debe usar un secador de aire o toallas desechables que no desprendan
partículas para secarse las manos y los antebrazos.
12. El personal que entra en la zona amortiguadora debe efectuar la limpieza antiséptica de manos con un exfoliante quirúrgi-
co exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente, antes de calzarse guantes estériles.
1 3. No se puede ingresar con goma de mascar, bebidas, golosinas ni ningún tipo de alimentos a la zona amortiguadora ni a
la antesala. Los materiales expuestos en áreas de cuidado y tratamiento de pacientes nunca deben introducirse en áreas
en las que hayan presentes componentes e ingredientes para la elaboración de PME.
14. Al comienzo de cada sesión de preparación magistral, y siempre que se derrame un líquido, las superficies del ambiente
directo de preparación magistral deben limpiarse primero con Agua Purificada USP para eliminar los residuos hidrosolu-
bles. Inmediatamente después, se desinfectan las mismas superficies con un agente que no deje residuos, usando un paño
que no suelte pelusa.
15. Los controles de ingeniería primarios deben estar en funcionamiento continuo durante la actividad de preparación magis-
tral. Cuando el sistema ventilador está apagado, y antes de que ingrese otro personal para realizar actividades de prepara-
ción magistral, sólo una persona debe ingresar en la zona amortiguadora a los efectos de encender el ventilador (durante
al menos 30 minutos) y desinfectar las superficies de trabajo.
16. El tráfico en el área directa de preparación magistral (ADP) debe reducirse al mínimo y controlarse.
17. Se deben juntar los materiales a usar en el ADP para los procedimientos planificados y luego descontaminarse limpiando o
rociando la superficie externa de los mismos con solución de IPA al 70% o retirando el envoltorio externo en el límite del
ADP a medida que se introduce el artículo en el área aséptica de trabajo.
542 :797'\ Preparacion Magistral--Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicos USP 37

18. Los mdteriille, debe11 d1sporwrst> en el ADP de manera tal que se evite su acumulación y que se logre el flujo de trabajo
más eficrenlc y ordenddu posible.
19. Después de introducir en forma correcta en el ADP únicamente los materiales requeridos para las operaciones asignadas,
deuer1 orgdr11Ldr'>e de manera tal que un flujo ininterrumpido transparente de aire filtrado por HEPA bañe todos los sitios
crít1cm rn todo momento durante los procedimientos planificados. Es decir, no se debe colocar ningún objeto entre el
primer air·e de los filtros HEPA y un sitio crítico expuesto.
20. Todos lm procedimientos deben realizarse de manera tal de reducir al mínimo el riesgo de contaminación por contacto.
Los guantes deben desinfectarse con la frecuencia necesaria con un desinfectante aprobado, como IPA estéril al 70%.
21. Todos los tapones de goma de los viales y frascos y el cuello de las ampollas se desinfectan pasándoles un paño con IPA
ester·il di 70% durante al menos 1 O segundos antes de usarlos para preparar PME.
22. Después de la preparación de Cdda PME, el contenido del envase se debe mezclar bien y luego inspeccionar para asegu-
rarse de que no tenga partículas, srgnos de incompatibilidad u otros defectm.
23. Una vez finalizcJdos los procedimientos, se retiran las jeringas, frascos, viales y otros materiales utilizados, pero con un mí-
rnmo de salida-, y entradas al ADP para reducir al mínimo las probabilidades de introducir contaminación en el espacio
aséptrco de trabajo.

ELEMENTOS DE CONTROL DE CALIDAD

En cada centro debe desarrollarse una descripción por escrito del programa de capacitación específica y de evaluación del
desempeño para lodo el personal que utiliza técnicas asépticas en la preparación de productos estériles. Este programa debe
preparar al personal otorgándole los conocimientos apropiados y la instrucción necesarias en el desarrollo de las habilidades
requeridas para realizar las tareas asignadas. Cada una de las personas asignadas al área aséptica para la preparación de pro-
ductos estériles debe completar con éxito un curso de capacitación especializado en técnicas asépticas y prácticas del área
aséptica antes de poder elaborar PME (ver la sección Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica
y Capaciioción del Personal y Evoluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Lim-
pieza y Desinfección).

Ingredientes y Dispositivos

El personal de preparación magistral debe establecer que los ingredientes utilizados en la elaboración de las PME tengan la
identidad y calidad correctas, utilizando la siguiente información: etiquetas del proveedor, etiquetado del producto, certifica-
dos de análisis, análisis químico directo y conocimiento de las condiciones de almacenamiento de las instalaciones de prepara-
ción.

INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS ESTÉRILES

Los productos farmacéuticos estériles disponibles comercialmente y los envases y dispositivos estériles listos para usar son
ejemplos de componentes estériles. Debe seguirse un procedimiento escrito para la inspección física de cada unidad antes de
su uso para asegurarse de que estos componentes sean estériles, estén libres de defectos y sean adecuados para el uso al que
están destinados.

INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS NO ESTÉRILES

Si se usan componentes no estériles, incluyendo envases e ingredientes, para elaborar una PME, dicha PME debe ser de alto
riesgo. Los ingredientes activos y sustancias agregadas o excipientes no estériles utilizados en la elaboración de PME deben ser
preferentemente artículos que cumplan con las normas oficiales de la USP o NF. Cuando se utilizan ingredientes no oficiales,
deben estiir acompañados por certificados de análisis de sus proveedores para que el personal de preparación magistral pueda
evaluar su identidad, calidad y pureza en relación con el uso que se les dará en cada PME. Es necesario realizar una inspección
física del envase de los ingredientes para asegurarse de que no tenga roturas, tapas o cierres flojos y que el contenido no tenga
ninguna desviación en relación con el aspecto, aroma y textura esperados.
Las sustancias farmacéuticas a granel, o no formuladas, y las sustancias agregadas o excipientes deben almacenarse en enva-
ses herméticamente cerrados bajo las condiciones de temperatura, humedad e iluminación indicadas en las monografías oficia-
les o aprobadas por los proveedores. La fecha de recepción en la instalación de preparación magistral debe estar clara e indele-
blemente marcada en cada envase del ingrediente. Una vez recibidos por la institución responsable de la preparación magis-
tral, los envases de ingredientes que no tienen una techa de caducidad del proveedor no podrán utilizarse después de transcu-
rrido un año, a menos que una inspección o análisis apropiado indique que el ingrediente ha conservado su pureza y calidad
para su uso en la elaboración de PME.
Deberán considerarse y evaluarse cuidadosamente las fuentes de ingredientes no estériles, especialmente cuando la PME ha
de administrarse en el sistema vascular, en el sistema nervioso central o en los ojos.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 543

La persona a cargo de la preparación magistral debe realizar una inspección visual de cada lote dP t,irmaco o excipiente a
granel recibido que se utilizará en la elaboración de las PME para detectar cualquier deterioro, otras cJracterísticas de calidad
inaceptable o identificación errónea. La inspección visual de la sustancia farmacéutica o excipiente a granel debe realizarse pe-
riódicamente según se describe en el protocolo escrito correspondiente.

Equipos

Es necesario que los equipos, aparatos y dispositivos utilizados en la preparación magistral de una PME funcionen correcta-
mente en todo momento y dentro de los límites de tolerancia aceptables. Deben establecerse por escrito, y seguirse, los proce-
dimientos de calibración del equipo, mantenimiento anual, monitoreo de funcionamiento correcto, y procedimientos controla-
dos para el uso del equipo, así como las frecuencias específicas para todas estas actividades. En estos POE se deben describir el
mantenimiento de rutina y las frecuencias. Los resultados de la calibración de los equipos, informes de rnantenirniPnto anual y
mantenimiento de rutina deben conservarse en los archivos durante toda la vida útil del equipo. Se prepara al personal me-
diante una combinación apropiada de capacitación específica y experiencia, para hacer funcionar o manipular cualquier equi-
po, aparato o dispositivo que pudieran tener que usar para la elaboración de PME. La capacitación debe incluir los conocimien-
tos necesarios para determinar si un equipo determinado está funcionando correctamente o si tiene algún desperfecto.

VERIFICACIÓN DE DISPOSITIVOS AUTOMATlZADOS DE PREPARACIÓN MAGISTRAL (DAP) PARA

NUTRICION PARENTERAL

Los DAP para la preparación de mezclas para nutrición parenteral son ampliamente utilizados por los farmacéuticos en hos-
pitales y otros ámbitos de atención de la salud. Están diseñados para agilizar los procesos más engorrosos requeridos para la
preparación magistral de estas formulaciones de varios componentes, administrando automáticamente los componentes nutri-
cionales individuales en una secuencia predeterminada bajo control computarizado. Por lo general, las mezclas para nutrición
parenteral contienen 20 o más aditivos individuales que representan hasta 50 o más componentes individuales (p.ej., 15 a 20
aminoácidos cristalinos, dextrosa monohidrato y lípidos; 1 O a 12 sales electrolíticas; 5 a 7 oligorninerales y 12 vitaminas). En
consecuencia, los DAP pueden mejorar la exactitud y precisión del proceso de preparación magistral en comparación con los
métodos de preparación magistral manuales tradicionales.

Exactitud

La exactitud de un DAP puede determinarse de varias maneras para asegurar que se suministren las cantidades correctas de
nutrientes, electrólitos u otros componentes nutricionales al envase de infusión final. Inicialmente, debe evaluarse el DAP para
verificar la exactitud del volumen y peso. Para verificar la exactitud del volumen, debe programarse el DAP para administrar un
volumen adecuado de Agua Estéril para Inyección USP, que represente un volumen típico de aditivo (p.ej., 40 mL para un in-
tervalo de volumen pequeño de 1 a 100 mL; o 300 mL para un intervalo de volumen grande de 100 a 1000 mL) y administrar-
se al recipiente volumétrico apropiado. Luego, el personal de preparación magistral debe consultar en la sección Aparatos Volu-
métricos (31) los parámetros apropiados para evaluar el desempeño volumétrico del DAP. Para verificar la exactitud gravimétri-
ca, debe evaluarse la balanza utilizada junto con el DAP, usando diferentes tamaños de pesas que representen las cantidades
normalmente usadas para administrar los diferentes aditivos. El personal de preparación magistral debe consultar en la sección
Pesas y Balanzas (41) las tolerancias aceptables de las pesas usadas. Además, debe pesarse posteriormente el mismo volumen
de Agua Estéril para Inyección usado para evaluar la exactitud volumétrica en la balanza usada con el DAP. Por ejemplo, si se
utilizaron 40 mL de agua en la evaluación volumétrica, su peso correspondiente debería ser de aproximadamente 40 g (supo-
niendo que la densidad relativa del agua es de 1,0). Además, durante el uso del DAP, también pueden probarse ciertos aditi-
vos, como cloruro de potasio (corregido según las diferencias de densidad) como si fuera una prueba realizada durante el pro-
ceso.
Por último, pueden realizarse pruebas adicionales de exactitud para determinar el contenido de ciertos ingredientes en el
volumen final de la mezcla para nutrición parenteral. Por lo general, los departamentos de una farmacia no tienen la capacidad
para realizar en forma rutinaria análisis químicos, como análisis de concentraciones de dextrosa o electrólitos. En consecuencia,
es posible que los laboratorios de los hospitales o instituciones deban encargarse de realizar estas pruebas de garantía de cali-
dad. No obstante, los métodos utilizados por dichos laboratorios suelen estar diseñados para sistemas biológicos, no farmacéu-
ticos. En consecuencia, debe verificarse que sus procedimientos de prueba cumplan con los requisitos USP especificados en la
monografía individual correspondiente al componente que se desea analizar. Por ejemplo, en Dextrosa, Inyección, se especifica
lo siguiente: Contiene no menos de 95,0% y no más de 105,0% de la cantidad declarada de C6 H 12 0ó · Hp. Los laboratorios
de química de la institución u hospital pertinente deben validar sus métodos para aplicctrlü~ ct c:slc: inlt:1 vil lo y corregirlos según
su medición típica de dextrosa anhidra en relación con dextrosa monohidrato. Existen intervalos y cuestiones similares, por
ejemplo, para las inyecciones de gluconato de calcio, sulfato de magnesio y cloruro de potasio. El punto crítico es el uso de
referencias USP y posibles diferencias de procedimiento entre laboratorios.
544 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas USP 37

Precisión

La precisión intermedia del DAP puede determinarse teniendo en cuenta las variaciones diarias en los resultados de las medi-
ciones de exactitud. En consecuencia, el personal de preparación magistral debe llevar un registro diario de las evaluaciones de
exactitud antes descritas y revisar los resultados a lo largo del tiempo. Esta revisión debe realizarse al menos cada semana para
evitar errores acumulativos clínicamente significativos con el tiempo, especialmente en el caso de aditivos con un índice tera-
péutico estrecho, como el cloruro de potasio.

CONTROLES V PRUEBAS DE LIBERACIÓN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS

Las siguientes mediciones de calidad se deben efectuar para todas las PME antes de dispensarlas o administrarlas.

Inspección de Formas Farmacéuticas en Solución y Revisión de los Procedimientos de Preparación

Magistral

Todas las PME que se preparan como soluciones deben examinarse visualmente para asegurarse de que no contengan partí-
culas y, en caso afirmativo, no deben administrarse ni dispensarse. Antes de administrar o dispensar las PME de cualquier nivel
de riesgo de contaminación, se deben inspeccionar las recetas, los procedimientos escritos de preparación magistral, los regis-
tros de preparación y los materiales usados en su elaboración, para verificar las identidades y cantidades correctas de sus ingre-
dientes, el mezclado aséptico y esterilización, el envasado, etiquetado y aspecto físico esperado.

INSPECCIÓN FÍSICA

Después de su preparación magistral, las PME terminadas deben inspeccionarse en forma individual, según los procedimien-
tos por escrito. Si no se distribuyen de inmediato, estas PME deben inspeccionarse en forma individual justo antes del momen-
to en que abandonan el área de almacenamiento. Las PME que no se distribuyen de inmediato deben almacenarse en un lugar
apropiado según se describe en los procedimientos escritos. Inmediatamente después de su preparación magistral y como
condición para su liberación, se debe inspeccionar cada unidad de PME, siempre que sea posible, contra un fondo blanco o
negro iluminado, o ambos, para asegurarse de que no contenga partículas visibles ni otras materias extrañas. La inspección
previa a la liberación también incluye la inspección de la integridad del sistema de envase-cierre y cualquier otro defecto visual
evidente. Las PME que presenten defectos deben desecharse de inmediato o marcarse y aislarse de los productos aceptables de
manera que evite su administración. Cuando las PME no se distribuyan de inmediato después de su preparación, debe realizar-
se una inspección previa a la distribución para asegurarse de que una PME con defectos como precipitado, turbidez y pérdidas,
que pueden desarrollarse entre el momento de su liberación y su distribución, no sea liberada.

Controles de Exactitud de la Preparación Magistral

Deben seguirse los procedimientos por escrito para verificar la exactitud de la preparación magistral de cada PME durante su
preparación e inmediatamente antes de su liberación. El sistema de doble verificación debe cumplir con las reglamentaciones
estatales e incluir la exactitud de la información incluida en la etiqueta y de la adición de todos los productos farmacéuticos o
ingredientes usados para preparar el producto terminado, así como sus volúmenes o cantidades. Los envases de los aditivos
usados y, en el caso de aditivos para los que no se consumió la totalidad del envase, las jeringas usadas para medir el aditivo
deben dejarse en cuarentena con los productos finales hasta haber terminado el control del producto final. El personal de pre-
paración magistral debe confirmar visualmente que los ingredientes medidos en las jeringas coincidan con los indicados en la
receta escrita que se está preparando. Preferentemente, una persona que no sea la que realizó la preparación magistral debe
verificar que se hayan medido correctamente los volúmenes de ingredientes utilizados en la elaboración de cada PME. Por
ejemplo, el personal de preparación magistral debería colocar de nuevo el émbolo de la jeringa en el volumen medido.
En aquellos casos en que sea factible, debe confirmarse la exactitud de las mediciones, pesando un volumen del líquido me-
dido y calculando luego ese volumen, dividiendo el peso por el valor exacto de la densidad, o peso específico, del líquido me-
dido. Debe confirmarse que los valores de densidad o peso específico programados en los DAP, que miden según el peso
usando el cociente del volumen programado dividido por la densidad o peso específico, sean exactos antes y después de ad-
ministrar los volúmenes de los líquidos asignados a cada canal o puerto. Estos controles de exactitud del volumen y los siguien-
tes controles adicionales de seguridad y exactitud que se describen en esta sección deben incluirse en el manual de POE de la
institución responsable de la elaboración de PME.

Pruebas de Esterilidad

Todas las PME de nivel de riesgo alto que se preparan en grupos de más de 25 envases individuales monodosis idénticos
(p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis (VMD) para administración a múltiples pacientes o que están
expuestos por más de 12 horas a temperaturas entre 2º y 8º y por más de 6 horas a temperaturas superiores a 8º antes de ser
USP 37 Pruebas F/sicas / (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 545

esterilizados deben cumplir con la prueba de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad (71 )) antes de ser dispensadas o administra-
das. El método de Filtración por Membrana es el método preferido en los casos en que sea factible (p.ej., cuando los compo-
nentes son compatibles con la membrana). Puede usarse un método no descrito en la USP si los resultados de la verificación
demuestran que la alternativa es al menos tan eficaz y confiable como el método de Filtración por Membrana USP o el método
de Inoculación Directa del Medio de Cultivo USP cuando el método de Filtración por Membrana no es factible.
Cuando las PME de nivel de riesgo alto se dispensan antes de que los resultados de sus pruebas de esterilidad estén disponi-
bles, debe haber un procedimiento escrito que exija la observación diaria de las muestras de prueba en incubación y el retiro
inmediato de la PME dispensada cuando exista evidencia de crecimiento microbiano en las muestras de prueba. Además, el
paciente al que se pudo haber administrado una PME contaminada, y su médico, deben ser notificados acerca del riesgo po-
tencial. Si los resultados de la prueba de esterilidad son positivos, debe realizarse una investigación inmediata y sistemática de
la técnica aséptica, control ambiental y otros controles de garantía de esterilidad para identificar las fuentes de contaminación
y solucionar los problemas existentes en los métodos o procesos.

Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirógenos)

Todas las PME de nivel de riesgo alto, excepto las destinadas a inhalación o administración oftálmica, que se preparan en
grupos de más de 25 envases individuales monodosis idénticos (p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis
(VMD) para administración a múltiples pacientes o que están expuestos por más de 12 horas a temperaturas entre 2º y 8º y
por más de 6 horas a temperaturas superiores a 8º antes de ser esterilizados deben examinarse para garantizar que no contie-
nen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) y Prueba de Pirógenos (151 )). En caso de
que no se indique un límite de endotoxinas bacterianas en la monografía oficial o en otra fuente de la formulación de la PME,
aquel no deberá exceder la cantidad de Unidades USP de Endotoxinas (Unidades por hora por kg de peso corporal o metros
cuadrado de superficie corporal) especificadas en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), mencionada anteriormente, según la
vía de administración apropiada.

Verificación de la Identidad y Concentración de los Ingredientes

La institución responsable de la elaboración de preparaciones magistrales debe contar como mínimo con los siguientes pro-
cedimientos escritos para verificar la identidad y calidad de las PME antes de dispensarlas y administrarlas:
1. Que las etiquetas de las PME tengan los nombres y cantidades o concentraciones de ingredientes correctos, el volumen
total, la FLU, las vías de administración apropiadas, las condiciones de almacenamiento y otra información para su uso
seguro.
2. Que las identidades, purezas y cantidades de ingredientes sean correctas, comparando la receta original con el registro de
preparación magistral escrito de la PME.
3. Que se han obtenido los volúmenes de llenado correctos en las PME y las cantidades correctas de unidades llenadas de las
PME. Cuando no se puede confirmar que el contenido de las PME terminadas es exacto, según las tres inspecciones que
se describen más arriba, las PME deben valorarse utilizando métodos específicos para los ingredientes activos.

ALMACENAMIENTO V FECHADO DE LÍMITE DE USO

Por lo general, las FLU para preparaciones magistrales se asignan basándose en la experiencia profesional, que debería incluir
la cuidadosa interpretación de las fuentes de información apropiadas para las mismas formulaciones u otras formulaciones si-
milares (ver Criterio de Estabilidad y Fechado de Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)). Las
fechas límite de uso de las PME rara vez se basan en los resultados de valoraciones químicas específicas a cada preparación, las
cuales se usan con la ecuación de Arrhenius para determinar las fechas de caducidad (ver Advertencias y Requisitos Generales)
de productos fabricados. La mayoría de las PME son soluciones acuosas en las que la reacción de degradación química más
común es la hidrólisis de los ingredientes disueltos. El grado de hidrólisis y otras reacciones de degradación catalizadas por
calor en cualquier momento en particular de la vida útil de una PME representan la suma termodinámica de las temperaturas y
duraciones de exposición. Dicha exposición de la estabilidad de la vida útil del producto está representada en el cálculo de la
temperatura cinética media (ver Cálculos Farmacéuticos en la Preparación Magistral de Prescripciones (1160)). Las velocidades de
hidrólisis de los fármacos aumentan en forma exponencial con el aumento aritmético de la temperatura; en consecuencia, la
exposición de una solución de un antibiótico beta-lactámico durante un día a temperatura ambiente controlada (ver Adverten-
cias y Requisitos Generales) tendrá un efecto equivalente sobre el grado de hidrólisis de aproximadamente 3 a 5 días a tempera-
turas frías (ver Advertencias y Requisitos Generales).
El personal a cargo de preparar, dispensar y administrar las PME debe almacenarlas estrictamente conforme a las condicio-
nes especificadas en la etiqueta de los ingredientes y PME terminadas. Cuando se sabe que las PME han estado expuestas a
temperaturas superiores al límite declarado o a temperaturas por encima de 40º (ver Advertencias y Requisitos Generales) duran-
te más de 4 horas, dichas PME deberían desecharse a menos que se verifique su estabilidad a través de la documentación apro-
piada o una valoración directa.
546 (797) Preparación Magistral--Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas USP 37

Determinación de las Fechas Límite de Uso

Las fechas límite de uso y fecha de caducidad no son lo mismo (ver Advertencias y Requisitos Generales). Las fechas de caduci-
dad para la estabilidad química y física de los productos estériles fabricados comercialmente se determinan a partir de los resul-
tados de rigurosas pruebas analíticas y de desempeño y son específicas de una formulación en particular en su envase y a las
condiciones de exposición indicadas de iluminación y temperatura. Cuando las PME se desvían de las condiciones indicadas en
el etiquetado aprobado de los productos fabricados contenidos en las PME, el personal de preparación magistral puede solici-
tar al fabricante del producto en cuestión asesoramiento sobre la asignación de FLU basada en parámetros de estabilidad quí-
mica y física. Las FLU de las PME que se preparan estrictamente conforme al etiquetado del producto del fabricante deben ser
las especificadas en dicho etiquetado o deben basarse en la literatura apropiada o en pruebas directas. Las FLU para las PME
que carecen de justificación proveniente de fuentes de literatura apropiadas o de pruebas directas se deben asignar según se
describe en CritPrios de Estabilidad y Fechas Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795).
El personal de píe~Jaracíón magistral podrá también consultar las publicaciones pertinentes para obtener información acerca
de la estabilidad, compatibilidad y degradación del fármaco o de fármacos similares. Al asignar una fecha límite de uso, el per-
sonai de preparación magistral debería consultar la documentación y literatura específicas sobre la estabilidad en general y la
del tármaco en particular en aquellos casos en que se cuente con ellas, y debería considerar la naturaleza del fármaco y su
mecanismo de degradación, el envase en el que está contenido, las condiciones de almacenamiento esperadas y la duración
prevista de ia terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales). La
información de estabilidad debe interpretarse cuidadosamente en relación con la formulación preparada y sus condiciones de
almacenamiento y uso. Las predicciones basadas en otra evidencia como publicaciones, cuadros, tablas sólo permiten obtener
fechas límite de uso teóricas. El fechado de límite de uso estimado en forma teórica está sujeto a diferentes grados de hipótesis
y, en consecuencia, a una probabilidad de error o al menos de inexactitud. El grado de error o inexactitud dependería del
grado de las diferencias entre las características de la PME (p.ej., composición, concentración de ingredientes, volumen de lle-
nado o tipo y material del envase) y las características de los productos de los que deben extrapolarse los datos o información
de estabilidad. Cuanto mayor sea la duda respecto de la exactitud de las fechas límite de uso estimadas en forma teórica, ma-
yor será la necesidad de determinar el fechado de períodos en forma experimental. Las fechas límite de uso estimadas en for-
ma teórica deberían considerarse con cuidado para las PME preparadas a partir de ingredientes activos a granel no estériles
que tienen actividad terapéutica, especialmente en aquellos casos en que se prevé que la preparación de la PME se realizará en
forma rutinaria. Cuando las PME son para distribución y administración en domicilios particulares y no en centros de salud, al
asignar las FLU debe tenerse en cuenta el efecto de las condiciones de temperatura potencialmente no controladas y no vigila-
das. Debe establecerse que las PME no estén expuestas a temperaturas cálidas (ver Advertencias y Requisitos Generales) a menos
que la institución responsable de la preparación magistral tenga evidencia que justifique la estabilidad de las PME a esas tem-
peraturas.
Debe reconocerse que la única evidencia válida de estabilidad para predecir el fechado de límite de uso puede obtenerse
solamente a travé~ de estudios experimentaies especifícos con cada producto. Los procedimientos semicuantitativos, como
una cromatografía en capa delgada (TLC), pueden ser aceptables para muchas PME. No obstante, los ensayos cuantitativos
indicadores de estabilidad, como las valoraciones por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), serían más apropiados
para ciertas PME, como por ejemplo aquellas con un índice terapéutico reducido, en las que se requiere un monitoreo ovalo-
ración estrictos de las dosis para asegurar su eficacia terapéutica y evitar la toxicidad; aquellas en que el período de fechado de
límite de uso estimado en forma teórica sólo es avalado por evidencia marginal, o en aquellos casos en que no se puede verifi-
car un margen significativo de seguridad para el período de fechado de límite de uso propuesto. En síntesis, debido a que los
períodos de fechado de límite de uso establecidos a partir de datos específicos de un producto obtenidos mediante análisis
con instrumental apropiado son sin duda más confiables que los determinados en forma teórica, se recomienda enfáticamente
utilizar el primer enfoque para avalar los períodos que superen los 30 días.
Para asegurar prácticas constantes en la determinación y asignación de fechas límite de uso, la instalación de preparación
magistral debe contar con normas y procedimientos escritos para la determinación de las fechas límite de uso para todos los
productos preparados magistralmente. Cuando se intente predecir una fecha límite de uso teórica, un producto preparado o
mezclado magistralmente debe considerarse como un sistema único que tiene propiedades físicas y químicas y características
de estabilidad que difieren de las de sus componentes. Por ejemplo, las propiedades antioxidantes, de amortiguación o antimi-
crobianas de un vial estéril para inyección (VEI) pueden perderse al diluirlo y podrían afectar seriamente la estabilidad química
del ingrediente activo del VEI o la estabilidad física o microbiológica de la formulación de dicho vial. En consecuencia, por lo
general no puede esperarse que las propiedades estabilizadas en la formulación del VEI se trasladen al producto preparado o
mezclado magistralmente. Se prefieren los protocolos de evaluación de datos de estabilidad determinados en forma experi-
mental para cada preparación, en lugar de la información sobre estabilidad publicada.
Cuando se carece de resultados de valoraciones químicas directas, el personal de preparación 111agistral que asigna fechas
límite de uso a PME debe interpretar y evaluar en forma crítica las fuentes de información disponibles más apropiadas para
determinar una FLU conservadora y segura. El manual de POE de la institución responsable de la preparación magistral y los
registros de formulación de cada PME deben describir los fundamentos generales sobre los que debe basarse la asignación de
la FLU y las condiciones de almacenamiento.
Cuando se usan viales multidosís (ver Envases Multidosis en Conservalirín, Envasado. Almarp11amiento y Etiquetado en las Ad-
vertencia> y Re'{uisitoo Gene•'Jit"\) de ingredientes estériles fabricados comercialmente en ia elaboración de PME, se inspecciona
USP 37 Pruebas FFsicas / (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 547

la integridad física de los tapones de los VMD y se desinfectan frotándolos con un hisopo empapado en IPA estéril al 70%
antes de cada penetración con un dispositivo estéril para retirar el contenido. Cuando se sospechan u observan contaminantes
o propiedades anormales en un VMD, éste deberá descartarse. La FLU después de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51) ), a menos que el fabricante especifique algo distinto.

Sistemas de Bolsas y Viales de Propiedad Exclusiva

Las fechas límites de uso para la estabilidad, esterilidad y almacenamiento de pares de envases de productos farmacéuticos
para administración intravascular (p.ej., ADD-Vantage@, Mini Bag Plus 0'1) conectados y activados (activado significa que se pro-
dujo el contacto entre el diluyente y el fármaco que estaban separados previamente) se deben aplicar según lo indica el fabri-
cante. Es decir, se deben seguir las instrucciones del fabricante para manipular y almacenar los productos ADD-Vantage®, Mini
Bag Plus'0 , Add A Vial®, Add-Ease® y cualquier otro.

Monitoreo de Áreas de Almacenamiento Controladas

Para asegurarse de que el producto conserva su potencia hasta la fecha de caducidad indicada por el fabricante en la etique-
ta, el personal de preparación magistral debe monitorear las áreas de almacenamiento de fármacos dentro de las instalaciones
de preparación magistral. Las áreas de temperatura controlada en las instalaciones de preparación magistral incluyen tempera-
tura ambiente controlada, entre 20º y 25º con temperatura cinética media de 25º; temperatura fría controlada, entre 2º y 8º
con temperatura cinética media de 8º; temperatura fría, entre 2º y 8º; temperatura de congelación, entre -25º y -1 Oº (ver
Advertencias y Requisitos Generales) si se necesita alcanzar la congelación, y el intervalo de temperatura específico del medio
para medios de cultivo microbianos. Un área de temperatura controlada se debe monitorear al menos una vez al día, docu-
mentando los resultados en una bitácora de temperatura. Asimismo, el personal de preparación magistral debe observar la
temperatura de almacenamiento al colocar el producto en la unidad de almacenamiento o al retirarlo de ella a fin de controlar
cualquier desvío en la temperatura. Los dispositivos de registro de temperatura adecuados pueden incluir un dispositivo de
registro continuo calibrado o un termómetro calibrado según las normas del National lnstitute of Standards and Technology
(Instituto Nacional de Normas y Tecnología, NIST) que tenga una exactitud y sensibilidad satisfactorias para el propósito al
que está destinado y sea calibrado correctamente a intervalos adecuados. Si la instalación de preparación magistral usa un dis-
positivo continuo de registro de la temperatura, el personal debe verificar al menos una vez al día que dicho dispositivo esté
funcionando correctamente.
Los mecanismos detectores de temperatura deben colocarse en forma adecuada en el área de almacenamiento de tempera-
tura controlada para que reflejen de forma exacta su temperatura real. Asimismo, la instalación de preparación magistral debe
seguir procedimientos apropiados para todas las áreas de almacenamiento controlado, para asegurar que dichos espacios no
estén sometidos a fluctuaciones de temperatura significativamente prolongadas como las que podrían ocurrir, por ejemplo, al
dejar la puerta de un refrigerador abierta demasiado tiempo.

MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA V ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS V

DISTRIBUIDAS

Esta sección resume las responsabilidades de las instalaciones de preparación magistral para mantener la calidad y el control
de las PME que se dispensan y administran dentro de sus organizaciones matrices de salud.
El personal de preparación magistral debe garantizar el adecuado almacenamiento y la seguridad de las PME preparadas o
dispensadas por la instalación de preparación magistral hasta que se alcance su FLU o sean administradas a los pacientes. Co-
mo parte de esta responsabilidad general, la instalación de preparación magistral es responsable del envasado, manipulación,
transporte y almacenamiento correctos de las PME que prepara o dispensa, incluyendo la enseñanza, capacitación y supervi-
sión apropiadas del personal de preparación magistral asignado a dichas funciones. La instalación de preparación magistral de-
bería colaborar en la enseñanza y capacitación del personal ajeno a la preparación magistral responsable de llevar a cabo cual-
quier aspecto de estas funciones.
La instalación de preparación magistral también tiene la responsabilidad de establecer, mantener y asegurar el cumplimiento
de las políticas y procedimientos escritos relacionados con dichas responsabilidades. Cuando se asigna personal que no es de
preparación magistral a tareas que involucran cualquiera de estas responsabilidades, las políticas y procedimientos que abarcan
estas tareas deben ser desarrolladas por los supervisores de preparación magistral. Las actividades de calidad y control relacio-
nadas con la distribución de las PME se resumen en las cinco subsecciones siguientes. Las actividades o asuntos que debe aten-
der la instalación de preparación magistral como parte de dichas responsabilidades son los que se indican a continuación.

Envasado, Manipulación y Transporte

Los procesos o técnicas inapropiados relacionados con el envasado, manipulación y transporte pueden afectar adversamente
la calidad y la integridad del envase de las PME. Aunque el personal de preparación magistral realiza en forma rutinaria muchas
de las tareas asociadas con estas funciones, algunas de ellas, como el transporte, manipulación y almacenamiento, pueden rea-
548 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

!izarlas personal ajeno a la preparación magistral que no se encuentra bajo el control administrativo directo de la instalación de
preparación magistral. En estos casos, la instalación de preparación magistral deberá establecer POE apropiados, en colabora-
ción con los departamentos o servicios cuyo personal sea responsable de llevar a cabo las tareas relacionadas con las PME en
las que la instalación de preparación magistral tiene un interés directo. Se debe controlar el desempeño del personal ajeno a la
preparación magistral para asegurarse de que cumpla con las políticas y procedimientos establecidos.
Los requisitos fundamentales que son exclusivos de las PME y necesarios para asegurar la calidad de la PME y la integridad
del envase se deben tratar por escrito en POE. Por ejemplo, deberían especificarse técnicas para evitar el empuje de los émbo-
los de las jeringas o que las puntas de las jeringas se salgan durante su manipulación y transporte. Además, debe evitarse la
desconexión de los componentes de un sistema (p.ej., cuando las PME se dispensan con equipos de administración conecta-
dos a estas) hasta la FLU de la PME. Los insertos o rellenos de espuma resultan particularmente útiles cuando las PME deben
transportarse mediante sistemas de tubos neumáticos. Independientemente de los métodos usados, la instalación de prepara-
ción magistral debe evaluar la eficacia y la confiabilidad de la protección utilizada. La evaluación debería ser continua, por
ejemplo, mediante un sistema de vigilancia, incluyendo un sistema de reporte de problemas a la instalación de preparación
magistral.
El transporte y la manipulación inapropiados pueden afectar adversamente la calidad de ciertas PME que tienen requisitos de
estabilidad únicos. Por ejemplo, la agitación física que puede tener lugar durante el transporte mediante tubo neumático, o la
exposición indebida al calor o a la luz, debe tratarse en cada preparación de forma específica. Podrían ser necesarios modos de
transporte alternativos o medidas de embalaje adicionales para asegurar debidamente la calidad de estas PME. El uso de cierres
y sellos que evidencian alteración intencional en los puertos de las PME puede ser una medida adicional de seguridad para
asegurar la integridad del producto independientemente del método de transporte usado.
Las PME quimiotóxicas u otras PME peligrosas requieren salvaguardas para mantener su integridad y reducir al mínimo el
potencial de exposición de estos productos al entorno y al personal que podría entrar en contacto con ellos. El transporte por
tubo neumático no es recomendable debido a posibles roturas y contaminación. Los requisitos especiales asociados con el en-
vasado, transporte y manipulación de estos agentes incluyen la prevención de exposición o derrame accidentales y la capacita-
ción del personal en caso de una exposición o derrame. Otros ejemplos de requisitos especiales para estos agentes incluyen las
estrategias de reducción de la exposición, como el uso de jeringas con cierre Luer y conexiones, tapas para jeringas, tapas en
los puertos de los envases, bolsas plásticas selladas, envases resistentes a los impactos y etiquetas con las precauciones perti-
nentes.

Uso y Almacenamiento

La instalación de preparación magistral es responsable de asegurar que las PME que se encuentran en el entorno en que se
prestan cuidados al paciente mantengan su calidad hasta el momento de su administración. El etiquetado inmediato del enva-
se de la PME debe mostrar en forma prominente y clara los requisitos para su almacenamiento correcto y su fecha de caduci-
dad. El personal de suministro y del entorno de cuidado del paciente debe estar debidamente capacitado para colocar la PME
en el lugar de almacenamiento apropiado. Las PME vencidas y no utilizadas deben devolverse a la instalación de preparación
magistral para su eliminación.
Debe contarse con POE para asegurar que las condiciones de almacenamiento en el entorno en que se prestan cuidados al
paciente sean adecuadas para los requisitos específicos de cada PME. Estos procedimientos incluyen la supervisión y documen-
tación diaria de los refrigeradores de almacenamiento de las preparaciones de fármacos para asegurarse de que mantienen una
temperatura entre 2º y 8º y la inspección mensual de todos los lugares de almacenamiento de preparaciones de fármacos por
el personal de preparación magistral. Las inspecciones deben confirmar el cumplimiento de las condiciones de almacenamien-
to apropiadas, la separación de fármacos y alimentos, el uso correcto de VMD y que no se usen productos monodosis como
VMD. Las PME, así como todos los demás productos farmacéuticos, deben almacenarse en el área en donde se prestan cuida-
dos al paciente de tal manera que el personal no autorizado, los visitantes y los pacientes no tengan acceso a ellos.

Preparación para Administración

Los procedimientos esenciales para asegurar la calidad general del producto, especialmente su esterilidad, al preparar una
PME para su posterior administración, incluyen el lavado apropiado de las manos, el uso de técnica aséptica, el cuidado del
sitio y el cambio de los equipos de administración. También pueden ser fundamentales otros procedimientos adicionales para
ciertas PME, dispositivos o técnicas, por ejemplo, en la filtración en línea, la operación de dispositivos de control de infusión
automáticos y la reposición de PME en los reservorios de bombas de infusión implantables o portátiles. Cuando es probable
que las PME se expongan a temperaturas superiores a 30º por más de 1 hora durante su administración a pacientes, se debe
confirmar que mantengan su esterilidad y estabilidad, bien sea por medio de fuentes confiables y relevantes o por pruebas
directas.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 549

Redispensación de PME

La instalación de preparación magistral debe tener toda la autoridad de determinar cuándo se pueden volver a dispensar las
PME devueltas, sin abrir. Las PME devueltas pueden volverse a dispensar sólo cuando el personal responsable de la preparación
magistral estéril pueda garantizar que dichas PME son estériles, puras y estables (contienen la concentración de ingredientes
declarada). Puede considerarse que una PME brinda dicha garantía si: la PME se mantuvo bajo refrigeración continua y prote-
gida de la luz, de ser necesario, y no presenta evidencia de alteración intencional ni de ninguna preparación para el uso fuera
de la instalación de preparación magistral. La asignación de nuevas fechas de almacenamiento y fechas límites de uso que ex-
cedan las fechas originales para las PME devueltas se permite tan sólo cuando existe evidencia de respaldo proveniente de
pruebas de esterilidad y valoración cuantitativa de los ingredientes. En consecuencia, la preparación inicial y los tiempos de
descongelación deben documentarse y realizarse mediciones confiables para evitar y detectar cualquier alteración intencional.
El cumplimiento con todos los procedimientos asociados con el mantenimiento de la calidad del producto es fundamental. Las
PME no deben volver a dispensarse si no puede asegurarse de manera satisfactoria que se mantuvieron en forma continua la
calidad de la preparación y la integridad del envase (incluyendo las conexiones de los dispositivos, cuando corresponda) entre
el momento en que la PME egresó de la instalación de preparación magistral y el momento en que volvió a ella. Asimismo, las
PME no deben volver a dispensarse si la redispensación no puede respaldarse con la FLU originalmente asignada.

Educación y Capacitación

La garantía de calidad de la PME y de la integridad del envasado depende en gran medida de que todo el personal cumpla
con los POE pertinentes. El personal de preparación magistral debe diseñar, implementar y mantener un programa formal de
enseñanza, capacitación y evaluación de competencia que cubra todas las funciones y tareas descritas en las secciones anterio-
res y que incluya a todo el personal al que se asignen dichas funciones y tareas. Este programa incluye la evaluación y docu-
mentación de incumplimientos del procedimiento, errores de administración, efectos colaterales, reacciones alérgicas y com-
plicaciones asociadas con la dosificación o administración, como la extravasación. Este programa debe coordinarse con los pro-
gramas de informe de eventos adversos e incidentes de la institución responsable.

Envase y Transporte de PME

Las siguientes secciones describen cómo mantener la esterilidad y estabilidad de las PME hasta que sean entregadas en los
sitios de atención del paciente para su administración.

EMBALAJE DE PME PARA SU TRANSPORTE

Cuando las PME se distribuyen a lugares fuera de las instalaciones en las que se preparan, el personal de preparación magis-
tral debe seleccionar envases y materiales de embalaje que mantengan la integridad física, esterilidad y estabilidad de las PME
durante su transporte. Debe seleccionarse un embalaje que proteja las PME contra daños, pérdidas, contaminación y degrada-
ción y, al mismo tiempo, que proteja de posibles lesiones al personal a cargo de transportarlas. El manual de POE de la institu-
ción responsable de la preparación magistral describe específicamente los envases de embalaje y los materiales de aislamiento
y relleno apropiados, según las especificaciones del producto, la información de los proveedores y la experiencia del personal
de preparación magistral. Se proporcionan instrucciones escritas a los pacientes y otros destinatarios que explican claramente
cómo abrir en forma segura los envases de las PME embaladas.

TRANSPORTE DE PME

Las instituciones responsables de la preparación magistral que envían PME a otros lugares deben seleccionar modos de
transporte que permitan entregarlas debidamente embaladas sin que sufran daños, y en condiciones estériles y estables a sus
destinatarios.
El personal de preparación magistral debe verificar que las temperaturas de las PME durante el transporte por el medio selec-
cionado no excedan las temperaturas más altas especificadas en el intervalo de temperatura de almacenamiento indicado en
las etiquetas de las PME. Se recomienda que el personal de preparación magistral se comunique directamente con la empresa
de transporte para conocer la duración del transporte y las condiciones de exposición que pueden encontrar las PME.
El personal de preparación magistral debe incluir instrucciones de manipulación y exposición específicas en la parte externa
de los embalajes que contienen las PME que se deben transportar, y debe obtener una garantía razonable de cumplimiento de
dichas condiciones por parte de los transportistas. El personal de preparación magistral debe evaluar periódicamente el desem-
peño de las empresas de transporte para verificar que las PME se están transportando en forma eficiente y apropiada.
 ,.
550 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Almacenamiento en Sitios Fuera de las Instalaciones de Preparación Magistral

Las instituciones responsables de la preparación magistral que envían PME a pacientes y otros destinatarios que se encuen-
tran en otros lugares deben verificar o garantizar, según sea apropiado, lo siguiente:
1. Las etiquetas y etiquetado accesorio de las PME incluyen en forma claramente legible las FLU, instrucciones de almacena-
miento e instrucciones de eliminación para las unidades vencidas.
2. Los pacientes u otros destinatarios pueden almacenar las PME en forma correcta, incluyendo el uso de un refrigerador y
congelador que funcionen adecuadamente si el etiquetado indica que las PME necesitan dicho tipo de almacenamiento.

CAPACITACIÓN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO

Debe proporcionarse un programa de capacitación formal a fin de que el paciente o la persona encargada de su cuidado
pueda entender y cumplir con las numerosas responsabilidades especiales y complejas que tiene en cuanto al almacenamiento,
manipulación y administración de PME. Los objetivos instructivos del programa de capacitación incluyen todas las responsabili-
dades del cuidado domiciliario de la PME que se espera que asuma el paciente o la persona encargada del cuidado de éste y
deben especificarse en términos de competencias del paciente o de la persona encargada de su cuidado.
Al terminar el programa de capacitación, el paciente o la persona encargada de su cuidado debería estar en condiciones de
hacer lo siguiente, en forma correcta y consistente:
1. Describir la terapia en cuestión, incluyendo la enfermedad o trastorno para la que se receta la PME, los objetivos de la
terapia, el resultado terapéutico esperado y los efectos colaterales potenciales de la PME.
2. Inspeccionar todos los productos farmacéuticos, PME, dispositivos, equipos y materiales en el momento de recibirlos para
asegurarse de que se han mantenido las temperaturas correctas durante el transporte y que los artículos recibidos no pre-
sentan evidencia de deterioro o defectos.
3. Manipular, almacenar y controlar todos los productos farmacéuticos, PME y materiales y equipos relacionados en la casa,
incluyendo todos los requisitos especiales relacionados con ellos.
4. Inspeccionar visualmente todos los productos farmacéuticos, PME, dispositivos y otros elementos que el paciente o la per-
sona encargada de su cuidado debe utilizar inmediatamente antes de la administración, en una forma que garantice que
todos los elementos estén en condiciones de ser utilizados. Por ejemplo, las PME deben estar libres de pérdidas, grietas en
los envases, partículas, precipitado, turbidez, decoloración u otras desviaciones respecto de su aspecto normal esperado y
los envases inmediatos de los dispositivos estériles deben estar completamente sellados sin que haya evidencia de deterio-
ro de la integridad del envase.
5. Verificar las etiquetas inmediatamente antes de su administración para asegurar que se trate del medicamento, la dosis, el
paciente y el momento de administración correctos.
6. Limpiar el área de preparación en el domicilio, lavar y refregar las manos, usar la técnica aséptica apropiada y manipular
todos los envases, equipos, aparatos, dispositivos y materiales usados para la administración.
7. Emplear todas las técnicas y precauciones asociadas con la administración de PME, por ejemplo, preparación de materia-
les y equipos, manipulación de dispositivos, preparación de las tuberías e interrupción de una infusión.
8. Cuidar los catéteres, cambiar vendajes y mantener la patencia del sitio según lo indicado.
9. Monitorear y detectar las ocurrencias de complicaciones terapéuticas, tales como infecciones, flebitis, desequilibrio elec-
trolítico y mala colocación del catéter.
1O. Responder de inmediato a situaciones de emergencia o críticas, como rotura o salida de su lugar del catéter, desconexión
de una tubería, formación de coágulos, bloqueo del flujo y mal funcionamiento de equipos.
11 . Saber cuándo y cómo recurrir a servicios de emergencia profesional o asesoramiento profesional.
12. Manipular, contener y eliminar el material desechado, como agujas, jeringas, dispositivos, derrames o residuos que consti-
tuyan un riesgo biológico y sustancias infecciosas.
Los programas de capacitación deben incluir demostraciones prácticas y la práctica con elementos reales que el paciente o la
persona encargada de su cuidado deberán utilizar, como envases de PME, dispositivos y equipos. El paciente o la persona en-
cargada de su cuidado debe practicar las técnicas asépticas y de inyección bajo la observación directa del profesional de la
salud.
La instalación de preparación magistral, junto con el personal de enfermería o médico, es responsable de asegurar inicial-
mente y en forma continua que el paciente o la persona encargada de su cuidado comprenda, domine y esté en condiciones y
dispuesto a cumplir con todas estas responsabilidades relacionadas con el cuidado domiciliario. Esto se logra a través de un
programa de evaluación formal por escrito. Todas las competencias especificadas en el programa de capacitación del paciente
o la persona encargada de su cuidado deben evaluarse de manera formal. El paciente o la persona encargada de su cuidado
debe demostrar al personal pertinente del cuidado de la salud su dominio de las actividades asignadas antes de que se le per-
mita administrar la PME sin la supervisión de un profesional de la salud.
El material impreso, como listas de control o instrucciones proporcionadas durante la capacitación, pueden servir como re-
fuerzo del aprendizaje después de la capacitación o como recordatorio de las responsabilidades específicas del paciente o la
persona encargada de su cuidado. También puede utilizarse periódicamente el asesoramiento oral después de la capacitación,
según sea apropiado, para reforzar la capacitación y asegurar el cumplimiento correcto y completo de las responsabilidades.
USP 37 Pruebas Físicas / (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 551

MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS

Las instituciones responsables de la preparación magistral deben monitorear clínicamente a los pacientes tratados con PME
según las reglamentaciones y guías establecidas por las juntas reguladoras del ejercicio de la medicina de su respectivo estado
o las normas de práctica aceptadas. Las instituciones responsables de la preparación magistral deben proporcionar a los pa-
cientes y otros destinatarios de PME alguna manera de obtener respuestas a sus preguntas e informar cualquier inquietud que
pudieran tener en relación con las PME y sus dispositivos de administración.
Los manuales de POE de la institución responsable de la preparación magistral deben describir las instrucciones específicas
para recibir, acusar recibo y fechar los informes recibidos, y para registrar, o archivar, y evaluar los informes de eventos adver-
sos y de la calidad de la preparación asociada con las PME. Los informes de eventos adversos con PME deben ser analizados de
inmediato y a fondo por los supervisores de preparación magistral para tomar medidas correctivas y evitar que se vuelvan a
repetir en el futuro. Se recomienda al personal de preparación magistral que participe en los programas de informe de eventos
adversos y defectos de productos de la FDA y la USP.

PROGRAMA DE GARANTÍA DE CALIDAD

Un proveedor de PME debe implementar un programa formal de garantía de calidad destinado a ofrecer un mecanismo pa-
ra monitorear, evaluar, corregir y mejorar las actividades y procesos descritos en este capítulo. El énfasis del programa de ga-
rantía de calidad debe centrarse en mantener y mejorar la calidad de los sistemas y la provisión de cuidados al paciente. Ade-
más, el programa de garantía de calidad asegura que cualquier plan enfocado a corregir los problemas identificados incluya
también el seguimiento apropiado para garantizar que se tomaron las acciones correctivas eficaces. 13
Un plan de garantía de calidad debe incluir las siguientes características:
1. Formalización por escrito;
2. Consideración de todos los aspectos de las preparaciones y dispensación de los productos según se describe en este capí-
tulo, incluyendo las pruebas ambientales y los resultados de la verificación;
3. Descripción de las actividades específicas de monitoreo y evaluación;
4. Especificación de cómo se deben informar y evaluar los resultados;
5. Identificación de los mecanismos de seguimiento apropiados cuando se exceden los límites o umbrales de acción; y
6. Descripción de las personas responsables de cada aspecto del programa de garantía de calidad.
Al desarrollar un plan específico, debe ponerse énfasis en establecer indicadores objetivos y mensurables para las actividades
de monitoreo y los procesos considerados de alto riesgo, de volumen elevado o propensos a problemas. En general, la selec-
ción de indicadores y la eficacia del programa de garantía de calidad deben reevaluarse anualmente.

ABREVIATURAS V ACRÓNIMOS

ADP área directa de preparación magistral

IPA alcohol isopropílico
ALARA tan bajo como sea razonablemente posible
ASHRAE American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers
CACI aislador aséptico de contención para preparación magistral
CAi aislador aséptico para preparación magistral
CAPH cambios de aire por hora
CDC Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
CETA Controlled Environment Testing Association
CFL cabina de flujo laminar
CIP control de ingeniería primario
CSB cabina de seguridad biológica
CSTD dispositivo de sistema cerrado para transferencia de
vial
HVAC calefacción, ventilación y aire acondicionado
DAP dispositivo automatizado de preparación magistral
EPP equipo protector para el personal
FDA Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos)
FLU fecha límite de uso
HEPA alta eficiencia para partículas aéreas
HICPAC Healthcare lnfection Control Practices Advisory Committee

13 El uso de recursos adicionales, tales como el Accreditation Manual for Home Care de la ]oint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations, pueden
resultar útiles en el desarrollo de un plan de garantía de calidad.
552 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

IB indicador biológico
ISO lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la Normalización)
MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report
NIOSH Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional
NIST National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnología)
PME preparación magistral estéril
psi libras por pulgada cuadrada
QA garantía de calidad
POE procedimiento operativo estándar
PET tomografía por emisión de positrones
TSA agar tripticasa de soja
UE Unidad de Endotoxina
ufc unidad(es) formadora(s) de colonias
USP Farmacopea de los Estados Unidos de América (United States Pharmacopeia)
VDE vial para desafío de endotoxinas
VEI vial estéril para inyección
VMD viales multidosis

APÉNDICES

A éndlce l.
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
NOTA-Este apéndice tabular resume y condensa selectivamente el texto completo del capítulo (797) sólo para referencia rápida. El personal de prepa-
ración magistral es responsable de leer, comprender y cumplir con el texto completo y toda la terminología, contenido y condiciones oficiales de la
USP.
INTRODUCCIÓN
:j: El propósito del capítulo consiste en evitar daños y muerte a pacientes tratados con PME.
t El capítulo se refiere a la preparación, el almacenamiento y el transporte de PME, mas no a su administración.
t Personal e instituciones a las cuales se aplica el (797); por lo tanto, para quién y para las cuáles puede ser ejecutable por las autoridades reglamenta-
rias y de acreditación.
t Los tipos de preparaciones diseñadas como PME según sus formas físicas y los sitios y rutas de administración a los pacientes.
t El personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente cuidadoso en evitar la contaminación por contacto de las PME,
tanto dentro como fuera de las áreas ISO Clase 5.
ORGANIZACIÓN
t Todo el personal que participa en la elaboración de PME tiene la responsabilidad de comprender las prácticas y precauciones fundamentales que se
encuentran en el capítulo (797) de la USP, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos proce-
dimientos y la calidad de la PME final para evitar daños.
DEFINICIONES
t Se definen veintiocho términos que forman parte integral del cumplimiento con el capítulo (797) de la USP.
RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIÓN MAGISTRAL
t Las prácticas y garantías de calidad requeridas para preparar, almacenar y transportar PME que son estériles y aceptablemente precisas, puras y esta-
bles.
NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN LAS PME
t La capacitación apropiada y la evaluación del personal, la limpieza y vestimenta adecuada del personal, la limpieza y desinfección adecuada de los
ambientes de trabajo de preparación magistral y el mantenimiento y monitoreo apropiados de las instalaciones de ambiente controlado (todas las
cuales se detallan en sus respectivas secciones).
PME de Nivel de Riesgo Bajo
t Manipulaciones asépticas dentro de un ambiente ISO Clase 5 usando tres, o menos de tres, productos estériles y entradas en cualquier envase.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 48 horas a temperatura ambiente controlada, 14 días a temperatura fría y 45 días en
estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparación magistral.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos
t Cumplir totalmente con los cuatro criterios específicos.
:j: Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP ISO Clase 5.
:j: Los lavabos deben estar separados del área inmediata del CIP ISO Clase 5.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 553

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
PME de Nivel de Riesgo Mediano
t Manipulaciones asépticas dentro de un ambiente ISO Clase 5, usando mezclado y transferencia prolongados y complejos, más de tres productos
estériles y entradas dentro de cualquier envase, y combinación de ingredientes de múltiples productos estériles para preparar múltiples PME.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 30 horas a temperatura ambiente controlada, 9 días a temperatura fría y 45 días en
estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparación magistral.
PME de Nivel de Riesgo Alto
t Presencia confirmada de ingredientes y dispositivos no estériles, o exposición confirmada o sospechada de ingredientes estériles por más de una
hora a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 antes de la esterilización final.
t Método de esterilización verificado para conseguir la esterilidad para la cantidad y tipo de envases.
t Cumplir los límites permisibles para endotoxinas bacterianas.
t Mantener la concentración y pureza aceptables de los ingredientes y la integridad de los envases involucrados después de la esterilización.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 24 horas a temperatura ambiente controlada, 3 días a temperatura fría y 45 días en
estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos semestralmente, hecha por el personal de preparación magistral.
CAPACITACIÓN Y EVALUACIÓN DEL PERSONAL EN TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN ASÉPTICA
t Inicialmente, aprobar la evaluación didáctica y práctica de destrezas y llenado de medios, seguida por una evaluación anual para preparación magis-
tral de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestral para preparación magistral de nivel de riesgo alto.
t El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonización
microbiana profusa, deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en prepa-
ración magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica.
PME DE USO INMEDIATO
t Cumplir totalmente con los seis criterios especificados.
ENVASES MONODOSIS Y MULTIDOSIS
t Fecha límite de uso de 28 días, a menos que el fabricante especifique lo contrario, para envases multidosis de cierre sellado, después de la apertura o
entrada inicial.
t Fecha límite de uso de 6 horas, a menos que el fabricante especifique lo contrario, para envases monodosis de cierre sellado en aire ISO Clase 5 o
más limpio, después de la apertura o entrada inicial.
t Fecha límite de uso de 1 hora para envases monodosis de cierre sellado después de su apertura o entrada bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase
5.
t No se permite el almacenamiento de ampollas monodosis abiertas.
FÁRMACOS PELIGROSOS COMO PME
t Equipo protector apropiado para el personal.
t Los controles de ingeniería primarios apropiados (CSB y CACI) se usan para la protección simultánea del personal y la exposición de sitios críticos.
t Los fármacos peligrosos se deben almacenar separados de otro inventario, de manera que se evite la contaminación y la exposición del personal.
t Presión negativa al menos de 0,01 pulgadas de columna de agua y 12 cambios de aire por hora en cuartos no limpios en donde se ubiquen los
CACI.
t Los fármacos peligrosos se deben manejar con precaución en todo momento, usando guantes apropiados para quimioterapia durante la recepción,
distribución, aprovisionamiento, inventariado, preparación para administración y eliminación.
t Los fármacos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5, con controles de ingeniería protectores y siguiendo las prácticas asépticas
especificadas para los niveles de riesgo de contaminación apropiados.
t El acceso a áreas de elaboración de preparaciones de fármacos debe estar limitado al personal autorizado.
t Se debe instalar un indicador de presión que pueda monitorear fácilmente la presurización del cuarto, que se documenta diariamente.
t Documentación anual para la capacitación completa del personal en lo que respecta a almacenamiento, manipulación y eliminación de fármacos
peligrosos.
t Si se usa un CSTD, éste se empleará en un dispositivo de control de ingeniería primario ISO Clase 5.
t Se requiere presión negativa de al menos 0,01 pulgadas de columna de agua para la preparación magistral de fármacos peligrosos.
:j: La zona amortiguadora de presión negativa no se requiere para preparaciones magistrales de bajo volumen cuando se usa un CSTD en una CSB o
un CACI.
t El personal de preparación magistral que esté en edad reproductiva debe confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los fármacos
peligrosos.
t La eliminación de todos los desechos de fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales.
:j: Salida externa total de los controles de ingeniería primarios.
:j: Ensayo de muestras de frotación de superficies cada 6 meses.
554 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
PREPARADOS RADIOFARMACÉUTICOS COMO PME
t Tomografía de Emisión de Positrones se rige por el capítulo (823) de la USP.
t Controles de ingeniería primarios apropiados y contención y blindaje de radioactividad.
t Los preparados radiofarmacéuticos elaborados a partir de componentes estériles en recipientes estériles cerrados y con un volumen de 100 mL o
menos para inyección monodosis, o no más de 30 mL tomados de envases multidosis se deben nombrar según las normas para PME de nivel de
riesgo bajo y cumplir con ellos.
t Los viales de preparados radiofarmacéuticos destinados a múltiples usos, preparados con tecnecio 99m, expuestos a ambiente ISO Clase 5 y perfora-
dos por agujas, sin contaminación directa, pueden usarse hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante.
t Ubicación de controles de ingeniería primarios permitidos en un ambiente controlado ISO Clase 8.
t Generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 usados de acuerdo con los requisitos federales, estatales y del fabricante.
t Los preparados radiofarmacéuticos como PME de nivel de riesgo bajo, con fecha límite de uso de 12 horas o menos se deben preparar en un área
segregada.
t Los materiales y la vestimenta expuestos en el área de atención y tratamiento del paciente no deben cruzar una línea de demarcación dentro del
área de preparación magistral segregada.
t Los generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 se deben eluir en condiciones ISO Clase 8.
t El área de preparación magistral segregada se indicará con una línea de demarcación.
:j: El almacenamiento y transporte de los viales debidamente blindados de PME radiofarmacéuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado
sin una designación específica de clase ISO.
EXTRACTOS DE ALÉRGENOS COMO PME
t Los extractos de alérgenos como PME no están sujetos a los requisitos descritos para personal, ambiente y almacenamiento de PME de todos los
Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana cuando se cumplen ciertos criterios.
VERIFICACIÓN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL
t Revisar etiquetas y documentar las mediciones, manipulaciones asépticas y procedimientos de esterilización correctos para confirmar la identidad,
pureza, concentración de ingredientes y esterilidad de la PME.
:j: Valorar las PME terminadas para confirmar la identidad correcta y/o concentración de ingredientes.
:j: Prueba de esterilidad para PME terminadas.
Métodos de Esterilización
t Verificar que los métodos permiten lograr la esterilidad a la vez que mantienen el contenido, pureza, calidad e integridad del envase apropiados.
:j: Probar la eficacia según el capítulo (71) de la USP, o mediante pruebas de esterilidad equivalentes o superiores.
Esterilización de PME de Nivel de Riesgo Alto por Filtración
t Membranas estériles de tamaño nominal de poro de 0,2 µm que sean química y físicamente compatibles con la PME.
t Completar rápidamente sin reemplazar el filtro.
t Someter el filtro a la prueba de integridad recomendada por el fabricante (p.ej., prueba del punto de burbuja) después de filtrar la PME.
Esterilización de PME de Nivel de Riesgo Alto por Vapor
t Probar hasta verificar que todos los envases que se van a esterilizar queden estériles después del tiempo de exposición seleccionado en el autoclave
particular.
t Garantizar que el vapor vivo entre en contacto con todos los ingredientes y superficies que se van a esterilizar.
t Pasar las soluciones a través de un filtro de tamaño nominal de poro de 1,2 µm o menor a los envases finales para retirar las partículas antes de la
esterilización.
t El aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a través de la cámara, por medio de un ventilador.
t El calor seco se debe usar sólo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daña el material o éste es imper-
meable.
t Se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulación del aire caliente.
t La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por calor seco para cada PME debe estar documentada por escrito en la institución
responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización por calor seco se debe verificar usando los indicadores biológicos apropiados y
otros métodos de confirmación.
:j: El horno debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposición.
Despirogenización por Calor Seco
t La despirogenización por calor seco se debe usar para eliminar los pirógenos y los microbios viables de los artículos o envases de vidrio, como viales.
t La descripción del ciclo de despirogenización por calor seco y su duración para una carga específica de artículos debe estar documentada por escrito
en la institución responsable de la preparación magistral.
t La eficacia del ciclo de despirogenización por calor seco se debe verificar usando viales para desafío de endotoxinas (VDE).
:j: La prueba de endotoxinas bacterianas debe efectuarse en los VDE con el fin de verificar si el ciclo es capaz de conseguir una reducción de 3 log en
endotoxinas.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 555

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL
Exposición de Sitios Críticos
t Aire ISO Clase 5 o mejor.
t Evitar la contaminación por contacto directo (p.ej., tacto y secreciones).
Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas
t Una zona amortiguadora es un área provista con aire de calidad ISO Clase 7 como mínimo.
t Nuevas representaciones de la distribución de la instalación.
t Toda instalación de preparación magistral debe garantizar que cada fuente de ambiente ISO Clase 5 para exposición de sitios críticos y esterilización
por filtración esté adecuadamente ubicada, manejada, mantenida, supervisada y verificada.
t Los dispositivos (p.ej., computadoras e impresoras) y objetos (p.ej., carros y gabinetes) se pueden ubicar en zonas amortiguadoras y deben verificar-
se mediante pruebas o monitoreo.
Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables
t El muestreo ambiental se debe realizar como parte de un programa integral de gestión de la calidad y deberá ocurrir como mínimo cuando existan
varias condiciones.
t El programa de muestreo ambiental debe proporcionar información al personal y directivos para demostrar que los controles de ingeniería mantie-
nen un ambiente dentro del área de preparación magistral que garantiza en forma constante concentraciones de partículas viables y no viables acep-
tablemente bajas.
Programa de Pruebas para Partículas Ambientales No Viables
t La certificación y pruebas de los controles de ingeniería primarios (CFL, CSB, CAi y CACI) y secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) las debe
efectuar una persona calificada por lo menos cada seis meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique, altere o se haga una reparación
importante a la instalación. Se deben usar los procedimientos de certificación, como aquellos señalados en Certification Guide for Sterile Compoun-
ding Facilities (CAG-003-2006) de CETA.
Recuento Total de Partículas
t La certificación por medio de la cual se certifica que cada área con clasificación ISO, (p.ej., ISO Clase 5, 6, 7 y 8) está dentro de las normas estableci-
das, se debe hacer por lo menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o el CACI se reubiquen o la estructura física de la zona amortigua-
dora o de la antesala se alteren.
t Las pruebas las deben efectuar operadores calificados, usando equipo electrónico de última tecnología con resultados que cumplan con ISO Clase 5,
7 u 8, dependiendo de los requisitos de la zona.
t El personal de supervisión y otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificación para garantizar que los am-
bientes controlados cumplan con la limpieza de aire, presiones del cuarto y CAPH apropiados.
Monitoreo de la Presión Diferencial
t Se debe instalar un manómetro o velocímetro para supervisar el diferencial de presión o flujo de aire entre la zona amortiguadora y la antesala y
entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparación magistral.
t Los resultados deberán revisarse y documentarse en un cuaderno de bitácora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mínima debe ser
diaria) o en un dispositivo de grabación continua.
t La presión entre el área ISO Clase 7 y la zona general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua (w.c.)).
t En instalaciones donde se preparan PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mínima de 0,2
metros por segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.
Programa de Pruebas para Partículas Aéreas Ambientales Viables-Plan de Muestreo
t Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partículas aéreas viables, basado en la evaluación de riesgo de las actividades
de preparación magistral efectuadas.
t Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 y en las zonas ISO Clase 7 y 8, así como en las zonas
segregadas de preparación magistral con más alto riesgo de contaminación (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5, mostradores
cerca de las puertas, cabinas de transferencia de materiales (pass-through boxes)).
t El plan debe incluir: ubicación de la muestra, método de recolección, frecuencia de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del día, relativa a
la actividad de la zona de preparación magistral, y niveles de acción.
t Se recomienda que el personal de preparación magistral consulte el Capítulo Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asépti-
co (1116) de la USP y las Guidelines for Environmental lnfection Control in Healthcare Facilities-2003 de los CDC para más información.
Medio de Crecimiento
t Se debe utilizar un medio de crecimiento microbiano como el Medio de Digerido de Caseína y Soja (también conocido como caldo (TSB) o agar
(TSA) tripticasa de soja) para propiciar el crecimiento de bacterias.
t En los ambientes de preparación magistral con nivel de riesgo alto se debe usar un agar con extracto de malta (MEA) u otro medio que facilite el
crecimiento de hongos.
t Los medios usados para el muestreo de superficies deben suplementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej.,
TSA con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partículas Aéreas Viables
t La evaluación de microorganismos aéreos usando métodos volumétricos de recolección en los ambientes de aire controlado debe efectuarla perso-
nal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
556 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
t El método de impacto debe ser el método preferido de muestreo volumétrico de aire.
t Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares propensos a la contamina-
ción durante actividades de preparación magistral y otras actividades como preparación, etiquetado, vestimenta y limpieza.
t Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro de la cabina de flujo laminar y otras áreas en donde la turbulen-
cia de reflujo de aire pueda ingresar en el área de preparación magistral.
t Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, el muestreo de aire se debe hacer en sitios dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras
áreas que estén muy cerca del ambiente ISO Clase 5, durante la certificación del control de ingeniería primario.
:j: Debe considerarse el efecto general que el método de muestreo escogido tendrá sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de
preparación magistral.
Dispositivos de Muestreo de Aire
t Se deben seguir las instrucciones en el manual de usuario del fabricante en lo que respecta a la verificación y uso de muestreadores eléctricos de aire
que recolectan activamente volúmenes de aire para evaluación.
t Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar de muestreo, con el fin de maximizar la sensibilidad.
:j: Se recomienda que el personal de preparación magistral consulte también el Capítulo USP (1116) que puede proporcionar más información sobre el
uso de muestreadores volumétricos de aire y el volumen de aire que debe tomarse para detectar variaciones en la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire
t Como parte de la recertificación de instalaciones y equipos, se debe efectuar el muestreo del aire al menos dos veces al año (es decir, cada 6 meses)
en el área donde estén ubicados los controles de ingeniería primarios.
t Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo electrónico para muestreo de aire.
:j: Cualquier construcción o reparación de equipo en una instalación puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Período de Incubación
t Las placas de medio para crecimiento microbiano usadas para recolectar muestreos ambientales se recuperan, se aseguran las tapas (p.ej., con cin-
ta), se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos.
t Se debe contar e informar el número de colonias discretas de microorganismos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de
monitoreo ambiental. Los recuentos de las muestras de aire se deben transformar en ufc por metro cúbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
:j: El TSA se debe incubar a una temperatura de 35º ±2 º durante un período de 2 a 3 días.
:j: MEA u otro medio apto para hongos se debe incubar a 28º ± 2 ºdurante 5 a 7 días.
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos
t Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparación
magistral.
t Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiología.
t Se debe investigar la fuente de la contaminación.
:j: Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción debe dar lugar a una reevaluación de la idoneidad de las prácticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de la instalación de preparación magistral aséptica.
:j: La tabla titulada Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana se debe usar sólo como guía.
Diseño de la Instalación y Controles Ambientales
t Las instalaciones de preparación magistral están físicamente diseñadas y ambientalmente controladas para minimizar el contacto de la contamina-
ción aérea con los sitios críticos.
t Las instalaciones de preparación magistral deben proporcionar un ambiente de trabajo cómodo y bien iluminado, por lo general con una tempera-
tura de 20º o menos, para brindar condiciones de comodidad al personal de preparación magistral mientras está ataviado con la vestimenta requeri-
da para la preparación magistral aséptica.
t Los controles de ingeniería primarios proporcionan aire HEPA unidireccional (es decir, laminar) a una velocidad suficiente para prevenir el contacto
de partículas aéreas con los sitios críticos.
t En el área crítica se debe realizar un análisis del patrón de aire in situ por medio de estudios de humo para demostrar el flujo unidireccional del aire y
la acción de barrido sobre el producto bajo condiciones dinámicas.
t Las políticas y procedimientos para mantener y trabajar dentro del área de control de ingeniería primario se deben poner por escrito y cumplir. Las
políticas y procedimientos estarán determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparación magistral aséptica utilizadas du-
rante la preparación de las PME.
t Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar en el proceso de prepara-
ción magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas.
t Los cuartos limpios para PME no peligrosas y no radioactivas se suministran con HEPA que entra desde el cielo raso, con ventilaciones de retorno en
la parte baja de las paredes, y proporciona no menos de 30 cambios de aire por hora.
t Las zonas amortiguadoras mantienen una presión positiva de 0,02 a 0,05 pulgadas de columna de agua y no contienen lavabos ni drenajes.
t La velocidad de aire de las zonas o cuartos amortiguadores a las antesalas es al menos 40 pies/minuto.
t El control de ingeniería primario debe estar ubicado dentro de una zona amortiguadora, de tal manera que se eviten condiciones que podrían afec-
tar adversamente su funcionamiento.
t El control de ingeniería primario debe ubicarse fuera del flujo de tráfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto no
causen perturbaciones.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 557

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "de-
bieran") en el Capítulo 1797) de la USP
t El suministro de aire filtrado por HEPA se debe introducir por el cielo raso.
t Debe probarse la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamaño de partícula más penetrante y someterlos a pruebas contra fugas en la fábrica,
y nuevamente in situ después de la instalación.
t Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se trabaja en un ambiente con-
trolado.
t Al cuarto sólo se deben llevar los muebles, equipos, suministros y otros materiales requeridos para las actividades de preparación magistral que se
van a desempeñar.
t Las superficies y el amoblado esencial en los cuartos o zonas amortiguadoras y en los cuartos limpios deben ser lisos, impermeables, limpiables,
resistentes a desinfectantes y no ser porosos ni desprender partículas.
t Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e impermea-
bles, no deben tener grietas o rajaduras, y no deben desprender partículas para facilitar su limpieza y reducir al mínimo los espacios en los que po-
drían acumularse microorganismos y otros contaminantes.
t Las superficies deben ser resistentes a los daños causados por agentes desinfectantes.
t Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o enmasilladas para evitar la formación de grietas donde pueda acumularse
polvo.
t Los paneles del cielo raso se deben enmasillar en todo su perímetro para sellarlas al armazón de soporte.
t La superficie externa de los artefactos de iluminación embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar sellada y al ras del cielo raso.
t Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado.
t La zona amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con
materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plástico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfectarse fácilmente.
t Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plástico no poroso o planchas metálicas, con ruedas de buena calidad y fáciles de limpiar para
facilitar su movilidad.
t Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben ser lisos, de material impermeable y fáciles de limpiar y desinfectar y, además de-
ben estar libres de grietas y no desprender partículas.
t La cantidad, el diseño y la forma de instalación de los artículos antes mencionados debe facilitar la limpieza y desinfección eficaces.
:j: Si los cielos rasos tienen paneles incrustados, éstos deben impregnarse con un polímero para hacerlos impermeables e hidrófobos.
:j: Debe evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberías de servicio que pasan por el techo o las repisas de las venta-
nas.
:j: Los retornos de aire deben estar instalados en la parte inferior de la pared para crear una dilución general de arriba hacia abajo del aire ambiental
con el aire filtrado por HEPA.
Colocación de los Controles de Ingeniería Primario dentro de Zonas Amortiguadoras ISO Clase 7
t Los controles de ingeniería primarios para PME no peligrosas y no radiactivas se colocan en las zonas amortiguadoras, excepto en el caso de CAi que
prueben mantener aire ISO Clase 5 cuando los recuentos de partículas se hacen entre 6 y 12 pulgadas más arriba de las áreas de exposición del sitio
crítico durante la realización de la transferencia normal de materiales hacia adentro y afuera, y durante manipulaciones de preparación magistral,
cuando dichos CAi se ubican bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase 7.
t Los procedimientos de preesterilización para las PME de alto riesgo, como el pesado y mezclado, se deben completar en un ambiente no inferior a
ISO Clase 8.
t Los controles de ingeniería primarios deben ubicarse fuera de las vías de tráfico y lejos de corrientes de aire que pudieran perturbar los patrones de
flujo de aire deseados del cuarto.
t Cuando se usen aisladores para la preparación magistral estéril, el tiempo de recuperación para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 se debe docu-
mentar y desarrollar los procedimientos internos para garantizar que se permita el tiempo de recuperación adecuado después de la transferencia de
materiales, antes y durante las operaciones de preparación magistral.
t Cuando las actividades de preparación magistral requieran la manipulación de materiales derivados de la sangre del paciente u otros materiales bio-
lógicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones deben hacerse claramente aparte de los procedi-
mientos de rutina para manejo de material y equipos usados en las actividades de preparación de PME y deben controlarse por medio de POE especí-
ficos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas.
t Alimentos, bebidas y artículos expuestos en las zonas de atención de paciente, así como desempacar suministros a granel y actividades de aseo y
vestimenta del personal están prohibidos en los cuartos o zonas amortiguadores.
t Designación de demarcación entre cuartos o zonas amortiguadoras y antesalas.
t Limpieza antiséptica de manos y guantes estériles en los cuartos o zonas amortiguadoras.
:j: Los suministros y componentes empacados para preparación magistral, como agujas, jeringas, conjuntos de tubos y soluciones parenterales de pe-
queño y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA estéril al 70%) de ser posible en una
antesala de calidad de aire ISO Clase 8, antes de pasarlos a las zonas amortiguadoras.
limpieza y Desinfección del Área de Preparación Magistral Estéril
t El personal capacitado escribe los procedimientos detallados que incluyen limpiadores, desinfectantes y materiales para refregar y trapear que no
desprenden partículas.
t Las superficies de la CFL, la CSB, el CAi y el CACI se deben limpiar y desinfectar con frecuencia, incluyendo: al comenzar cada turno de trabajo, antes
de la preparación de cada lote, cada 30 minutos durante los períodos continuos de preparación de PME individuales, cuando haya derramamientos y
cuando se sepa o sospeche que la superficie está contaminada debido a fallas procedimentales.
558 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
t El personal de preparación magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en práctica los procedimientos de limpieza y
desinfección del área directa de preparación (ADP) escritos en los POE.
t La limpieza y desinfección deben hacerse antes de la preparación magistral. Se deben quitar todos los artículos de las áreas a limpiar y a continua-
ción limpiar las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos sólidos solubles en agua se quitan
con Agua Estéril (para Inyección o Irrigación) y paños que no desprendan partículas. Luego se pasa un paño con un agente desinfectante que no deje
residuos, como IPA estéril al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparación magistral.
t Las superficies de trabajo en zonas ISO Clase 7 y 8 y en las zonas de preparación magistral segregadas se limpian al menos una vez al día.
t El polvo y los detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparación magistral,
con un método que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8.
t Los pisos en las áreas ISO Clase 7 y 8 se limpian diariamente cuando no hay preparación magistral en proceso.
t El IPA (alcohol isopropílico al 70%) permanece en las superficies que se van a desinfectar al menos durante 30 segundos antes de que se usen para
elaborar PME.
t Los estantes vacíos, las paredes y los cielos rasos en las antesalas se limpian y desinfectan al menos una vez al mes.
t La limpieza del suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE escri-
tos.
t Los agentes limpiadores y desinfectantes, sus cronogramas de uso y métodos de aplicación deben concordar con los POE escritos y el personal de
apoyo y/o el de preparación magistral debe cumplirlos.
t Todos los materiales de limpieza, como paños, esponjas y trapeadores deben ser del tipo que no desprenda partículas, de preferencia compuestos
por microfibras sintéticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras, antesalas y áreas segregadas de preparación magistral, de las cuales no
deben retirarse a menos que sea para desecharlos.
t Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar procedimientos (basándose en las recomendaciones del fabrican-
te) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se mantiene y que el uso repetido no incrementa la biocarga del área que se está lim-
piando.
t Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej., IPA estéril al 70%), aplica-
do con un frasco rociador u otro método de aplicación adecuado.
t Después de rociar o limpiar con el desinfectante la superficie a desinfectar, se debe dejar secar y durante este tiempo el artículo no se debe usar para
preparación magistral.
t Las compresas de gasa empapadas en IPA estéril al 70% u otro material que desprenda partículas no se deben usar para desinfectar los puntos de
entrada estériles de paquetes y dispositivos.
Limpieza y Vestimenta del Personal
t El personal debe ser también competente y estar muy motivado para desempeñar manipulaciones asépticas impecables con ingredientes, dispositi-
vos y componentes de las PME.
t El personal con prurito, quemaduras de sol, úlceras exudantes, conjuntivitis, infección respiratoria activa y cosméticos tiene prohibido preparar PME.
t El personal de preparación magistral debe retirarse los atuendos personales exteriores, cosméticos, uñas postizas, joyas de las manos, muñecas y
cuerpo que puedan interferir con el uso de batas y guantes; también debe retirarse los pirsins visibles por encima del cuello.
t Orden para asearse y vestir atuendo de preparación magistral en la antesala: zapatos y cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran la barba, más-
caras, limpieza de uñas, lavado y secado de manos y antebrazos, bata que no desprende partículas.
t Orden para asearse y calzarse los guantes en el cuarto o zona amortiguadora: lavado de manos con un producto de actividad persistente a base de
alcohol, dejar secar las manos, calzar guantes estériles.
t Desinfectar rutinariamente los guantes con IPA estéril al 70% después de tocar objetos no estériles.
t Inspeccionar los guantes para determinar que no estén agujereados y reemplazarlos cuando se detecten fallas.
t El personal repite los procedimientos apropiados después de exponerse a contaminación por contacto directo o aire inferior a ISO Clase 8.
t De estos requisitos están eximidos las PME de uso inmediato y los CAi para los cuales los fabricantes proporcionan documentación escrita, basada en
pruebas validadas, de que dichas prácticas no son necesarias para mantener la esterilidad en las PME.
Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y De-
sinfección
t El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda
de instrucción multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conocimientos prácticos de los procedimientos de vesti-
menta, prácticas asépticas de trabajo, así como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 y procedimientos de lim-
pieza y desinfección.
t Esta capacitación se debe completar y documentar antes de que ningún miembro del personal comience a elaborar PME.
t El personal de preparación magistral debe completar la capacitación didáctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a eva-
luaciones de destreza usando herramientas de auditoría de observación y pruebas de llenado de medios.
t Las pruebas de las destrezas asépticas de trabajo mediante el llenado de medios se efectúan inicialmente antes de comenzar a preparar PME y al
menos anualmente, en adelante, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para preparaciones magistrales
de nivel de riesgo alto.
t El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o las auditorías de observación o cuyos viales de prueba de llenado de medios
tengan una o más unidades que muestren contaminación microbiana visible deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una
nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en prácticas
asépticas de trabajo.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 559

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "de-
bieran") en el Capítulo í797\ de la USP
t El personal de preparación magistral debe pasar todas las evaluaciones antes de reiniciar la práctica de preparación magistral estéril.
t Además de la evaluación didáctica y llenado aséptico de medios, el personal de preparación magistral debe demostrar competencia en higiene apro-
piada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza congruentes.
t Cuando los procedimientos de limpieza y desinfección los efectúa personal de apoyo, éste debe recibir de un experto calificado en preparación
magistral aséptica, capacitación cuidadosa en procedimientos apropiados de higiene de las manos, vestimenta, limpieza y desinfección.
t El personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluación de desempeño en la apropiada higiene de las manos, vestimenta y todos los
procedimientos de limpieza y desinfección, la que llevará a cabo un experto calificado en preparación magistral aséptica.
Evaluación de Competencia en Vestimenta y Prácticas Asépticas de Trabajo
t El personal de preparación magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la elaboración de PME y siempre que se efectúe un llenado
de medios aséptico, usando un Formulario para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de
Preparación Magistral y los procedimientos de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal.
Evaluación de la Práctica Aséptica de Trabajo por Medio de Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del Personal
t El monitoreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral se debe efectuar para todos los niveles de riesgo de
elaboración de PME.
t El muestreo de las puntas de los dedos enguantados se debe utilizar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de
las manos y vestimenta, así como para educar al personal de preparación magistral en las prácticas de trabajo apropiadas.
t Todo el personal debe demostrar competencia en procedimientos apropiados de higiene de las manos y vestimenta, además de las prácticas asépti-
cas de trabajo.
t Las placas estériles de contacto con agar se deben usar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación
magistral después de vestirse para evaluar la competencia en el uso de vestimenta y después de completar la preparación de llenado de medios.
t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estéril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras.
Evaluación de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes
t El personal de preparación magistral debe ser inspeccionado visualmente durante el proceso de higiene de las manos y uso de vestimenta.
t La inspección visual debe documentarse en un Formulario para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del
Personal de Preparación Magistral y conservarse para tener un registro permanente y una evaluación a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados
t Inmediatamente después de que el preparador magistral completa el procedimiento de higiene de las manos y vestimenta, el evaluador debe reco-
lectar una muestra de la punta de los dedos y pulgar enguantados de ambas manos del preparador en placas de agar apropiadas, presionando lige-
ramente el agar con cada dedo.
t Las placas se deben incubar durante un período de incubación apropiado a la temperatura adecuada.
t Todos los empleados deben completar exitosamente una evaluación inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los
dedos enguantados (cero ufc) no menos de tres veces antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano.
t Después de completar la evaluación inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, se debe hacer una reevaluación de todo el personal
de preparación magistral al menos anualmente para PME de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para PME de nivel de riesgo alto antes
de permitírsele continuar elaborando PME.
t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estéril al 70% antes de la prueba.
t Después de la toma de muestras, los guantes se deben desechar de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar
nutritivo se deben incubar como se estipula más adelante.
t El nivel de acción de ufc para las manos enguantadas estará basado en la cantidad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
:j: Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por empleado por mano (mano izquierda, mano derecha).
Período de Incubación
t Al final del período de muestreo designado, las placas de agar se recuperan, se aseguran las tapas, se invierten e incuban a una temperatura y por un
tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El agar tripticasa de soja (TSA) con lecitina y polisorbato 80 se debe incubar a 35º ± 2º
por 2 a 3 días.
Evaluación de la Competencia en Manipulación Aséptica
t Todo el personal de preparación magistral deberá someterse a la evaluación de su competencia en técnicas asépticas y prácticas relacionadas, inicial-
mente durante el procedimiento de prueba de llenado de medios, así como en los subsiguientes procedimientos de prueba de llenado de medios
anuales o semestrales, mediante el Formulario para Evaluación de Técnicas Asépticas y Prácticas relacionadas del Personal de Preparación Magistral.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios
t La destreza del personal en la elaboración aséptica de PME se debe evaluar por medio de una verificación de llenado de medios líquidos de cultivo
bacteriano estéril.
t Los viales llenos de medio se deben incubar a 35º ± 2º durante un período de 14 días.
Muestreo y Evaluación de Limpieza y Desinfección de Superficies
t La toma de muestras de superficies se debe hacer en todas las áreas clasificadas ISO en forma periódica y por medio de placas de contacto y/o
hisopos, al momento de terminar la preparación magistral.
t Se deben definir los lugares donde se van a tomar muestras en un plano o formulario de muestreo.
Evaluación de Competencia en Limpieza y Desinfección
 .
560 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
t Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparación magistral y demás personal responsable de la limpieza durante el proceso de limpieza y
desinfección, durante la capacitación inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y al termi-
nar cualquier Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios.
t La inspección visual debe documentarse en un Formulario para Evaluación de Procedimientos de Limpieza y Desinfección y conservarse para tener
un registro permanente y una evaluación a largo plazo de la competencia del personal.
Métodos de Recolección en la Superficie
t Inmediatamente después de tomar la muestra de una superficie con la placa de contacto, el área muestreada se debe frotar cuidadosamente con un
paño que no desprenda partículas, empapado en IPA estéril al 70%.
:j: Los resultados se deben informar como ufc por unidad de área superficial.
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos
t Los datos de muestreo ambiental se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
preparación magistral.
t Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar el personal competente de microbiología.
t Se debe investigar la fuente de la contaminación.
t Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de acción después de la incubación apropiada, se
debe efectuar y documentar una revisión de los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta, así como de los procedimientos de
desinfección de guantes y superficies y las prácticas de trabajo.
:j: Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción debe dar lugar a una reevaluación de la idoneidad de las prácticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de las instalaciones en las que se elaboran preparacio-
nes magistrales asépticas.
PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR SUGERIDOS
t Todas las instalaciones deben contar con los mismos y los procedimientos deben incluir al menos los puntos enumerados en esta sección.
CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIÓN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS
Inspección de Formas Farmacéuticas en Solución y Revisión de los Procedimientos de Preparación Magistral
t Revisar procedimientos y documentos para garantizar la esterilidad, pureza, identidades y cantidades de ingredientes correctas, y estabilidad.
t Inspeccionar visualmente para determinar que no tenga partículas y color anormales, y que los envases y sellos estén intactos.
Pruebas de Esterilidad
t PME de nivel de riesgo alto preparadas en lotes de más de 25 envases idénticos o expuestas por más de 12 horas entre 2º y 8º y 6 horas a más de 8º
antes de ser esterilizadas.
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirógenos)
t PME de nivel de riesgo alto, excluyendo aquellas para administración oftálmica o inhalación, preparadas en lotes de más de 25 envases idénticos o
expuestas por más de 12 horas entre 2º y 8º y 6 horas a más de 8º antes de ser esterilizadas.
Verificación de la Identidad y Concentración de los Ingredientes
t Procedimientos escritos para verificar la identidad, calidad, cantidad y pureza correctas de los ingredientes usados en PME.
t Procedimientos escritos para garantizar que las etiquetas de las PME contengan los nombres correctos y las cantidades o concentraciones de ingre-
dientes, volúmenes totales, fechas límite de uso, condiciones de almacenamiento y vías de administración.
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LÍMITE DE USO
Determinación de la Fecha Límite de Uso
t Usar los criterios generales del capítulo (795) de la USP en ausencia de ensayos directos indicadores de estabilidad o literatura autorizada que respal-
de la duración más prolongada.
MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y DISTRIBUIDAS.
t Procedimientos escritos para envasado, almacenamiento y condiciones de transporte apropiados para mantener la esterilidad, calidad, pureza y con-
tenido de las PME.
Redispensación de PME
t Cuando se pueden garantizar la esterilidad, pureza, contenido y calidad aceptables.
t La asignación de tiempos de almacenamiento en esterilidad y fechas límite de uso en estabilidad posteriores a las de las PME originalmente dispensa-
das debe basarse en resultados de pruebas de esterilidad y valoración cuantitativa de ingredientes.
Envase y Transporte de las PME
t El envase mantiene la integridad física, esterilidad, estabilidad y pureza de las PME.
t Modos de transporte que mantienen las temperaturas apropiadas y evitan daños a las PME.
USP 37 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 561

Apéndice l. (Continuación)
Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "de-
bieran") en el Capítulo (797) de la USP
CAPACITACIÓN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO
t Programa formal de capacitación en múltiples componentes para garantizar que los pacientes y las personas encargadas de su cuidado entienden el
almacenamiento, manipulación, uso y eliminación apropiados para las PME.
MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS
t Los procedimientos estándar escritos describen la manera en que los pacientes pueden preguntar e informar inquietudes y eventos adversos relacio-
nados con PME y, en el caso de los supervisores de preparación magistral, la forma de corregir y prevenir futuros problemas.
:j: Los eventos adversos y los defectos de las PME se informan a los programas MedWatch de la FDA y a MEDMARX de la USP.

Apéndice 11. Desinfectantes Comunes Usados en la Atención de Salud para Superficies Inanimadas y Dispositivos no Críticos y su
Actividad Microbiana y Propiedades 1
Categoría Química del Desinfectante

Amonio Cloro
Cuaternario (p.ej., Vodófo-
Peróxido (p.ej., do- hipo- ros
Alcohol de hidró- ruro de do- el o rito (p.ej.,
isopropíli- geno decil dime- Fenóli- de so- povido-
co acelerado til amonio) cos dio) na-yodo)
100-
0,4-1,6°/o 0,4- 5000 30-50
Concentración Usada 60-95% 0,5°/o 3 aq 1,6°/o aq ppm ppm
Bacterias + + + + + +
Virus lipofílicos + + + + + +
Virus hidrofílicos ± + ± ± + ±
lnactivación Microbiana2
M. tuberculosis + + ± + + ±
Agentes micóticos (hongos) + + + + + ±
Esporas Bacterianas - - - - + -

Vida útil > 1 semana + + + + + +

Propiedades Físicas &
Químicas Importantes
Efectos corrosivos o perjudiciales ± - - - ± ±
Residuo no evaporable - - + + - +
lnactivado por materia orgánica + ± + ± + +
Irritante cutáneo ± - + + + ±
Irritante ocular + - + + + +
Irritante respiratorio - - - - + -

Toxicidad sistémica + - + + + +
Clave para las abreviaturas y símbolos: aq = diluido en agua; ppm = partes por millón; +=sí; - = no; ± = resultados variables.
1 Modificado de World Health Organization, Laboratory Bio Safety Manual 1983 y Rutala WA, "Antisepsis, disinfection and sterilization in the hospital and rela-
ted institutions," Manual of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1995, páginas 227-245.
2 La inactivación de los microorganismos más comunes (es decir, bacterias) ocurre con un tiempo de contacto de sl minuto; Ja inactivación de esporas requiere
tiempos de contacto más prolongados (p.ej., 5 a 1O minutos para solución de cloro a 5000 ppm contra esporas de C. difficile). Referencia: Perez /, Springthorpe
VS, Sattar SA, "Activity of selected oxidizing microbicides against the spores of Clostridium difficile: Relevance to environmental control", American journal of lnfection
Control, August 2005, páginas 320-325.
3 El peróxido de hidrógeno acelerado pertenece a una nueva generación de germicidas basados en peróxido de hidrógeno en los cuales la potencia y el desem-
peño del ingrediente activo se ha mejorado y acelerado por medio del uso de ácidos y detergentes apropiados.
562 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Apéndice 111. Formulario de Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del
Personal de Preparación Magistral

Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institución o instalación:

Higiene de las Manos y Prácticas de la Vestimenta: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona
evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/ A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o N/O si la activi-
dad no se observó.*

Se presenta aseado y con ropa limpia apropiada.

No usa cosméticos ni joyas (reloj, anillos, aretes, etc., incluidos pirsins) al entrar en las antesalas.
No lleva ni conserva alimentos o bebidas en las antesalas o zonas amortiguadoras.
Está consciente de la línea de demarcación que separa los lados limpios y sucios y observa las actividades requeridas.
Se pone el cubrecalzado o los zapatos destinados al área limpia, uno a la vez, colocando el pie cubierto o calzado en el lado limpio de la
línea de demarcación, según sea apropiado.
Utiliza mascarillas para cubrir la barba, de ser necesario.
Usa gorra y se asegura de que todo el cabello esté cubierto.
Se pone máscara para cubrir el puente de la nariz e incluir la barbilla.
Efectúa el procedimiento de higiene de manos humedeciendo las manos y antebrazos y lavándolos con agua tibia y jabón durante 30
segundos por lo menos.
Se seca las manos y los antebrazos con una toalla que no suelte pelusa o con un secador de manos.
Selecciona la bata de talla apropiada y revisa que no tenga agujeros, rasgones u otros defectos.
Se pone la bata y se asegura de que esté bien cerrada.
Se desinfecta las manos de nuevo con un exfoliante quirúrgico a base de alcohol, sin agua, y con actividad persistente, y las deja secar
completamente antes de ponerse los guantes estériles.
Calza guantes estériles del tamaño apropiado, asegurándose que queden bien ajustados y no sobre material del guante en las puntas de
los dedos.
Examina los guantes, verificando que no tengan defectos, agujeros o rasgones.
Mientras desempeña actividades de preparación magistral estéril, desinfecta periódicamente los guantes con IPA estéril al 70% antes de
trabajar en el área directa de preparación magistral (ADP) y después de tocar artículos o superficies que podrían contaminar los guan-
tes.
Se quita el EPP en el lado limpio de la antesala.
Se quita los guantes y se higieniza las manos.
Se quita la bata y la descarta o la cuelga en un gancho si la va a reutilizar el mismo día de trabajo.
Se quita y descarta la máscara, gorra y mascarilla que protege la barba (si la usa).
Se quita el cubrecalzado o los zapatos, uno a la vez, asegurándose de colocar el pie descubierto en el lado sucio de la línea de demarca-
ción y se higieniza las manos nuevamente. (Se quita y desecha los cubrecalzado todas las veces que sale del área de preparación ma-
gistral).

*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/O) y se le muestran e informan las correcciones específicas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letra de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

USP 37 Pruebas Físicos/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 563

Apéndice IV. Formularlo de Muestra para Evaluación de las Técnicas Asépticas y Prácticas Relacionadas del Personal de Preparación
Magistral

Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: ____________________

Nombre de la institución o instalación:
-------------------

Técnica Aséptica, Seguridad y Prácticas de Garantía de Calidad: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el
que la persona evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o
N/O si la actividad no se observó.*

Completa el Formulario de Evaluación de Competencia en Higiene de Manos y Procedimientos de Vestimenta.

Efectúa los procedimientos apropiados de higiene de manos, vestimenta y enguantado de acuerdo con los POE.
Desinfecta las superficies de los dispositivos ISO Clase 5 con un agente apropiado.
Desinfecta los componentes/viales con un agente apropiado antes de colocarlos en áreas de trabajo ISO Clase 5.
Introduce sólo los materiales esenciales en un orden apropiado en el área de trabajo ISO Clase 5.
No interrumpe, obstaculiza o desvía el flujo de primer aire a los sitios críticos.
Se asegura de que las jeringas, agujas y tubos permanezcan en su empaque individual y sólo se abran en un área de trabajo ISO Clase 5.
Efectúa las manipulaciones sólo en el ADP apropiada del dispositivo ISO Clase 5.
No expone los sitios críticos a contaminación por contacto o aire de calidad infeior a ISO Clase 5.
Desinfecta los tapones, los puertos de inyección y los cuellos de las ampollas, frotándolos con IPA estéril al 70% y los deja secar durante
el tiempo suficiente.
Fija las agujas a las jeringas sin contaminación por contacto.
Perfora los tapones de viales y conecta los puertos de infusión sin contaminación por contacto.
Etiqueta las preparaciones correctamente.
Desinfecta los guantes estériles en forma periódica, frotándolos con IPA estéril al 70% durante manipulaciones de preparación magistral
prolongadas.
Limpia, gradúa y calibra el dispositivo automatizado de preparación magistral (p.ej., "preparador magistral de NPT") de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Desecha los elementos cortantes y desperdicios de acuerdo con las políticas institucionales o las guías reconocidas.

*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/O) y se le muestran e informan las correcciones específicas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letra de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

564 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 37

Apéndice V. Formularlo de Muestra para Evaluación de Procedimientos de Limpieza y Desinfección

Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institución o instalación:

Prácticas de Limpieza y Desinfección: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona evaluada ha
completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o N/0 si la actividad no se
observó.*

Tareas Diarias:
Prepara la concentración correcta de solución desinfectante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Usa un envase apropiadamente etiquetado para el tipo de superficie que va a limpiar (piso, pared, tolvas de producción, etc.).
Documenta la preparación de solución desinfectante.
Sigue los procedimientos de vestimenta cuando efectúa cualquier actividad de limpieza.
Al comienzo de cada turno, limpia todos los dispositivos ISO Clase 5 antes de la preparación magistral, en el siguiente orden: paredes,
barra IV, preparadores magistrales automatizados y superficies de trabajo.
Utiliza un paño que no suelte pelusa, empapado en IPA estéril al 70% u otra solución desinfectante aprobada y deja secar por comple-
to.
Al final de cada turno, retira todos los componentes del preparador y limpia todas las áreas ISO Clase 5 como se especificó anteriormen-
te.
Limpia todos los mostradores y superficies de trabajo fácilmente limpiables.
Friega pisos, usando los trapeadores etiquetados como "pisos", comenzando en la pared opuesta a la puerta de entrada del cuarto, con
movimientos uniformes del trapeador, hacia el operador. Mueve los carros según sea necesario para limpiar toda la superficie del piso.
El uso de un sistema de limpieza de microfibra es una alternativa aceptable a los trapeadores.
En la antesala, limpia los lavabos y todas las superficies de contacto; limpia el piso con una solución desinfectante o usa un sistema de
limpieza de microfibra.

Tareas Mensuales:
Efectúa la limpieza mensual en un día designado. Prepara una solución desinfectante según se especificó en las tareas diarias, que es
apropiada para las superficies que se van a limpiar.
Limpia el cielo raso de las zonas amortiguadoras y las antesalas, las paredes y los estantes de almacenamiento con una solución desin-
fectante y un trapeador o un sistema de limpieza de microfibra.
Una vez que el área ISO Clase 5 está limpia, limpia el cielo raso del cuarto de preparación magistral, seguido de las paredes y por último
el piso. Usa los trapeadores o el sistema de limpieza de microfibra debidamente etiquetados.
Limpia todas las cajas y los estantes de almacenamiento de la zona amortiguadora, retirando el contenido y, usando un paño que no
suelte pelusa, empapado en detergente germicida, limpia las superficies internas de la caja y luego toda la superficie externa. Deja
secar las cajas. Antes de volver a poner el contenido dentro de las mismas, las frota con IPA estéril al 70% para quitar el residuo de
desinfectante. Usa paños nuevos de ser necesario.
Limpia todos los carros de la zona amortiguadora, retirando el contenido y usando paños que no suelten pelusa empapados en deter-
gente germicida, limpia todos los carros, comenzando desde el estante superior y la parte superior de la barra, avanzando hacia abajo,
hasta las ruedas. Limpia la parte de abajo de los estantes de la misma manera. Usa un paño nuevo para cada carro. Deja secar. Frota
los carros con un paño que no suelte pelusa, empapado en IPA estéril al 70% para quitar cualquier residuo de desinfectante. Usa paños
nuevos de ser necesario.
Limpia las sillas de la zona amortiguadora, el interior y exterior de los recipientes de basura, usando un paño que no suelte pelusa, em-
papado en solución desinfectante.
Documenta todas las actividades de limpieza anotando quién las efectuó, con fecha y hora.

*La persona evaluada es informada de inmediato de todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A
o N/O) y se le muestran e informan las correcciones específicas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letras de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

USP 37 Pruebas Físicas/ (801) Polarografía 565

(801) POLAROGRAFÍA

La polarografía es un método de análisis electroquímico basado en la medición del flujo de corriente resultante de la electró-
lisis de una solución en un microelectrodo polarizable, en función de un voltaje aplicado. El polarograma (ver Figura 1) obteni-
do por esta medición proporciona información cualitativa y cuantitativa de sustancias electro-reducibles y electro-oxidables. El
intervalo normal de concentraciones para las sustancias que se analizan es de 1O 2 molar a 1O 5 molar.
En la polarografía de corriente directa (cd), el microelectrodo es un electrodo de goteo de mercurio (EGM) que consiste en
pequeñas gotas de mercurio reproducibles que fluyen del orificio de un tubo capilar conectado a un reservorio de mercurio. El
electrodo de referencia más comúnmente empleado es un electrodo de calomel saturado (ECS) que posea una superficie ex-
tensa. El voltaje aplicado a la celda se aumenta gradualmente y sólo fluye una corriente residual muy pequeña hasta que la
sustancia que se valora experimenta reducción u oxidación. Al principio la corriente aumenta gradualmente, luego lo hace de
manera casi lineal con el voltaje y gradualmente alcanza un valor límite, como se muestra en la Figura 7.

w
1-
z
w ---
a:
a:
8

VOLTAJE APLICADO

Fig. 1. Polarograma típico que muestra el cambio en el flujo de corriente en función del aumento del potencial aplicado al
electrodo de goteo de mercurio.

En la porción ascendente inicial de la onda polarográfica, el aumento del flujo de corriente provoca una disminución en la
concentración de las especies electroactivas en la superficie del electrodo. A medida que aumentan el voltaje y la corriente, la
concentración de las especies reactivas disminuye aún más hasta alcanzar un valor mínimo en la superficie del electrodo. La
corriente queda limitada entonces por la velocidad de difusión de las especies reaccionantes desde el seno de la solución hasta
la superficie del microelectrodo. El incremento final de la corriente es provocado por la reacción del electrólito soporte. Esta
gran concentración de electrólito es inerte dentro del intervalo de potencial utilizado para el análisis e impide que las especies
reactivas alcancen el electrodo por migración eléctrica. De este modo, se asegura que la corriente limitante esté controlada por
la difusión.
Dado que, en el caso del EGM, la superficie del electrodo se renueva constantemente en forma cíclica, la corriente aumenta
desde un valor pequeño, cuando la gota comienza a formarse, hasta alcanzar un valor máximo cuando la gota cae. Mediante
el empleo de un registrador apropiado para medir la corriente, se obtiene el registro característico con perfil dentado. La co-
rriente limitante es la suma de las corrientes residual y de difusión. La corriente residual se resta de la corriente limitante para
obtener la altura de la onda.
Ecuación de llkovic-La relación lineal entre la corriente de difusión (id) y la concentración de especies electro-activas se
muestra por la ecuación de llkovic:
 ,.
566 (801) Polarografía / Pruebas Físicos USP 37

en la cual id es la corriente máxima en microamperios; n es el número de electrones requeridos por molécula de sustancia elec-
tro-activa; D es el coeficiente de difusión, en centímetros cuadrados por segundo; C es la concentración, en milimoles por L; m
es la velocidad de flujo de mercurio del EGM, en mg por segundo; y tes el tiempo de caída de la gota, en segundos.
Los polarógrafos modernos están equipados con registradores capaces de determinar la corriente hasta la última porción de
la vida de la gota; en consecuencia, registran la máxima fluctuación de corriente. Cuando la corriente se mide sólo al final de la
vida de la gota, la técnica se denomina polarografía cd por muestreo. En este caso, sólo se registran los máximos de corriente y
no se observan las oscilaciones debidas al crecimiento de la gota.
Para instrumentos equipados con galvanómetros para medir la corriente, o en el caso de los registradores operados en mo-
dalidad de curva suavizada, las ondas dentadas son oscilaciones alrededor de la corriente promedio. En el último caso, la medi-
da de la corriente es el promedio de las oscilaciones. Para los polarogramas obtenidos de esta manera, la id dada por la ecua-
ción de llkovic es la corriente promedio en microamperios observada durante la vida de la gota en lugar de la corriente máxi-
ma, y entonces el coeficiente 708 se reemplaza por 607.
Control de la Corriente de Difusión-La ecuación de llkovic identifica las variables que deben ser controladas para asegu-
rar que la corriente de difusión sea directamente proporcional a la concentración de material electro-activo. A 25º los coefi-
cientes de difusión para soluciones acuosas de muchos iones y moléculas orgánicas aumentan 1% a 2% por grado de aumento
en la temperatura. Por lo tanto, la temperatura de la celda polarográfica debe controlarse en un margen de± 0,5º. Las cantida-
des m y t dependen de las dimensiones del capilar y de la altura de la columna de mercurio por encima del electrodo. Si bien
es posible comparar resultados obtenidos con capilares diferentes si se conoce el producto m 2 i 3t 1t 6 , es recomendable utilizar el
mismo capilar con una altura de mercurio constante durante una serie de análisis. La corriente de difusión es proporcional a la
raíz cuadrada de la altura de la columna de mercurio. Un reservorio de mercurio con un diámetro de más de 4 cm previene
una disminución significativa del nivel de mercurio durante una serie de determinaciones.
El capilar para el EGM tiene un orificio de aproximadamente 0,04 mm y una longitud de 6 cm a 15 cm. La altura de la co-
lumna de mercurio, medida desde el extremo del capilar hasta la parte superior del depósito de mercurio, oscila entre 40 cm y
80 cm. La longitud exacta del capilar y la altura de la columna de mercurio se ajustan de modo que el tiempo de caída esté
entre 3 y 5 segundos con el circuito abierto y con el capilar inmerso en la solución de prueba.
Se encuentran disponibles equipos que permiten controlar los tiempos de goteo desde fracciones de segundo hasta varios
segundos. Como el detalle dentro de un polarograma se relaciona con el número de gotas proporcionadas durante un cambio
de potencial dado, los tiempos cortos de goteo permiten un registro más rápido del polarograma.
La corriente que fluye a través de la solución de prueba durante el registro de un polarograma está en el orden de los mi-
croamperios. Por lo tanto, el flujo de corriente produce cambios inapreciables en la solución de prueba y es posible realizar
varios polarogramas con la misma solución de prueba sin obtener diferencias significativas.
Potencial de Media Onda-El potencial de media onda (E 112) tiene lugar, en el polarograma, al punto medio de la distan-
cia entre la corriente residual y la meseta de la corriente limitante. Este potencial es característico de las especies electro-activas
y, por lo general, es independiente de su concentración o del capilar empleado para obtener la onda. Depende de la composi-
ción de la solución y puede cambiar con variaciones en el pH o en el sistema de disolventes, o con la adición de agentes for-
madores de complejos. El potencial de media-onda, por lo tanto, sirve como criterio para la identificación cualitativa de una
sustancia.
El potencial del EGM es igual al voltaje aplicado frente al electrodo de referencia después de la corrección para la caída iR (el
potencial necesario para pasar la corriente, i, a través de la solución con una resistencia R). Resulta especialmente importante
hacer esta corrección para soluciones no acuosas, las cuales suelen poseer alta resistencia, si se necesita un potencial exacto
para el EGM. No se necesita la corrección del potencial de media-onda para el análisis cuantitativo. A menos que se indique de
otro modo, se entiende que los potenciales representan mediciones realizadas frente al ECS.
Eliminación del Oxígeno Disuelto-Puesto que el oxígeno se reduce en el EGM en dos pasos, primero a peróxido de hi-
drógeno y después a agua, interfiere cuando los polarogramas deben realizarse a potenciales más negativos que aproximada-
mente O voltio en función de ECS, y por lo tanto debe ser eliminado. Esto puede realizarse introduciendo burbujas de nitróge-
no libre de oxígeno a través de la solución durante 1O a 15 minutos inmediatamente antes de registrar la onda; el nitrógeno
primero debe pasarse a través de una porción separada de la solución para "acondicionarlo" y de este modo reducir al mínimo
los cambios debidos a la evaporación.
Es necesario que la solución esté en reposo y libre de vibraciones durante el tiempo en que se registra la onda, a fin de ase-
gurar que la corriente dependa solamente de la difusión. Por lo tanto, el burbujeo con nitrógeno debe detenerse y el gas se
debe dirigir para que fluya sobre la superficie de la solución antes de registrar un polarograma.
En medios alcalinos, se puede agregar bisulfito de sodio para eliminar el oxígeno, siempre que el reactivo no reaccione con
otros componentes del sistema.
Medición de la Altura de la Onda-Para usar un polarograma cuantitativamente, es necesario medir la altura de la onda.
Como ésta es una medida de la magnitud de la corriente de difusión, se mide verticalmente. Para compensar la corriente resi-
dual, el segmento de la curva que precede al aumento de la onda se extrapola más allá del ascenso en la onda. Para una onda
bien formada donde esta extrapolación es paralela a la meseta de la corriente limitante, la medición no es ambigua. Para on-
das no muy bien definidas, puede utilizarse el siguiente procedimiento a menos que se especifique algo difrente en la mono-
grafía individual. Se extrapolan con líneas rectas tanto la corriente residual como la corriente limitante, tal como se muestra en
el gráfico (Figura 7). La altura de la onda se toma como la distancia vertical entre las líneas extrapoladas medida a nivel del
potencial de media onda.
USP 37 Pruebas Físicas / (801) Polarografía 567

Procedimiento-[ Precaución-El vapor de mercurio es tóxico y el mercurio metálico tiene una presión de vapor significativa a
temperatura ambiente. El lugar de trabajo donde se utiliza mercurio debe construirse de modo que cualquier salpicadura o gota de
mercurio derramada pueda recuperarse completamente con relativa facilidad. Limpiar meticulosamente los derrames de mercurio
después de cada uso del instrumento. Trabajar en un laboratorio bien ventilado, teniendo cuidado de limpiar cualquier derrame de
mercurio.] Transferir una porción de la dilución final de la sustancia valorada a una celda polarográfica apropiada inmersa en un
baño de agua regulado a 25 ± 0,5º. Pasar una corriente de nitrógeno a través de la solución durante 1O a 15 minutos para
eliminar el oxígeno disuelto. Comenzar el goteo de mercurio desde el capilar, insertar el capilar en la solución de prueba y
ajustar la altura del reservorio de mercurio. Modificar el flujo de nitrógeno de modo que pase sobre la superficie de la solución
y registrar el polarograma en el intervalo de potencial indicado en la monografía individual, empleando un registrador o galva-
nómetro de sensibilidad adecuada para obtener una onda apropiada. Medir la altura de la onda y, a menos que se indique de
otro modo en la monografía, compararla con la altura de la onda obtenida con el Estándar de Referencia USP apropiado, me-
dida bajo las mismas condiciones.
Polarografía de Pulsos-En la polarografía de cd convencional, la corriente se mide continuamente mientras se aplica un
potencial como una rampa lineal (ver Figura 2).

imedida continuamente

TIEMPO

Fig. 2. Polarografía de Corriente Directa (cd).

Esta corriente se compone de dos elementos. El primero, la corriente de difusión (faradaica), que se produce por la sustancia
que experimenta la reducción u oxidación en el electrodo de trabajo y es directamente proporcional a la concentración de esta
sustancia. El segundo elemento es la corriente capacitativa (relacionada con la carga de la doble capa electroquímica). Ambas
corrientes cambian a medida que varía el tamaño de la gota de mercurio. Estos cambios producen las oscilaciones presentes
en los típicos polarogramas de cd.
En la polarografía de pulso normal, se aplica un pulso de potencial al electrodo de mercurio cerca del final de la vida de la
gota, manteniendo el potencial inicial durante el período de crecimiento de la gota (ver Figura 3).

Ímedida

/~
f--TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO-j

Fig. 3. Polarografía de pulso.

A cada gota siguiente se le aplica un pulso ligeramente mayor, con una constante de incremento determinada por la velocidad
de barrido seleccionada. La corriente se mide al final del pulso cuando la corriente capacitativa es cercana a cero y, por lo
tanto, se mide principalmente la corriente faradaica (ver Figura 4).
568 (801) Polarografía / Pruebas Físicas USP 37

w
1-
zw
o:a:
o
ü

1
• 1
TIEMPO l medida

Fig. 4 Gráfico de corriente en función del tiempo en polarografía de pulso.

Además, como el pulso que se aplica es de corta duración, la capa de difusión no se agota tanto como en la polarografía de
cd, y se obtienen niveles de corriente más elevados para concentraciones equivalentes. Se pueden medir concentraciones de
tan sólo 1 0- 6 M, lo que permite una sensibilidad aproximadamente 1O veces mayor que la polarografía de cd. Los valores de la
corriente limitante se miden más fácilmente, dado que las ondas están libres de oscilaciones.
La polarografía de pulso diferencial es una técnica mediante la cual se aplica un pulso de altura fija al final de la vida de cada
gota, superpuesta a una corriente directa aumentada linealmente (ver Figura 5).

f.-- TIEMPO DE GOTEO -f--- TIEMPO DE GOTEO--j

Fig. 5. Polarografía de pulso diferencial.

El flujo de corriente se mide justo antes de la aplicación del pulso y nuevamente al final del pulso. La diferencia entre estas dos
corrientes se mide y se representa en el registrador. Dicha señal diferencial proporciona una curva que se aproxima a la deriva-
da de la onda polarográfica y presenta un pico. El potencial del pico es equivalente a:

E112 - i'.E/2

en donde i'.E es la altura del pulso. La altura del pico es directamente proporcional a la concentración a velocidades de barrido
constantes y a alturas de pulso constantes. Esta técnica es especialmente sensible (pueden determinarse concentraciones de
10- 7 M) y proporciona mejor resolución entre ondas poco espaciadas.
Voltamperometría de Redisolución Anódica-La voltamperometría de redisolución anódica es una técnica electroquímica
por la cual se concentran (reducen) vestigios de sustancias en solución sobre un electrodo y luego se redisuelven (oxidan) en la
solución barriendo anódicamente el voltaje aplicado. La medición del flujo de corriente como una función de este voltaje y la
velocidad de barrido proporcionan información cualitativa y cuantitativa sobre dichas sustancias. El paso de concentración per-
mite realizar análisis a concentraciones de 1 0- 7 M a 1 0- 9 M.
USP 37 Pruebas Físicas/ (811) Finura de Polvos 569

El instrumental básico incluye un generador de rampa de voltaje, un conjunto de circuitos para medición de corriente, una
celda con electrodos de trabajo, electrodos de referencia y contraelectrodos, y un registrador u otro dispositivo de lectura. Los
instrumentos que tienen capacidades polarográficas de cd o de pulso generalmente son muy adecuados para aplicación en
redisolución. El electrodo de trabajo comúnmente utilizado es el electrodo de gota de mercurio colgante (EGMC), si bien el
electrodo de capa fina de mercurio (ECFM) ha sido aceptado. Para el análisis de metales como por ejemplo plata, platino y
oro, cuyos potenciales de oxidación son más positivos que los del mercurio, y del mercurio mismo, se requiere el uso de elec-
trodos sólidos como por ejemplo platino, oro y carbón. Un electrodo de calomel saturado o un electrodo de plata-cloruro de
plata sirve como electrodo de referencia excepto para el análisis de mercurio o de plata. Como contraelectrodo se suele utilizar
un alambre de platino.
Las muestras que contienen el electrólito adecuado se colocan con pipeta en la celda. El oxígeno disuelto se elimina hacien-
do burbujear nitrógeno en la celda durante 5 a 1O minutos.
En general, se aplica un potencial de electrólisis equivalente a 200 a 300 mV más negativo que el potencial de media onda
del material que se debe analizar (aunque este potencial se debe determinar experimentalmente), con agitación durante 1 a
1 O minutos. Para obtener resultados reproducibles, hay que mantener condiciones constantes (a saber, tiempo de deposición,
velocidad de agitación, temperatura, volumen de la muestra y tamaño de la gota, si se utiliza EGMC).
Después de la deposición, la agitación se suspende y la solución y el electrodo se dejan equilibrar durante un breve período.
El potencial luego se barre anódicamente con rapidez (1 O mV/segundo o más en polarografía de cd y 5 mV/segundo en pola-
rografía de pulso diferencial). Al igual que en la polarografía, la corriente limitante es proporcional a la concentración de las
especies (altura de la onda en cd y pulso, altura del pico en pulso diferencial), mientras que el potencial de media onda (cd,
pulso) o el potencial de pico (pulso diferencial) identifica la especie. Para obtener un desempeño satisfactorio, es fundamental
elegir cuidadosamente el electrólito de soporte. Por lo general, la cuantificación se logra por el método de adición del estándar
o por calibración.
Esta técnica es apropiada para el análisis de vestigios de metales pero tiene un uso limitado en las determinaciones orgáni-
cas, dado que muchas de estas reacciones son irreversibles. Al analizar sustancias tales como el cloruro, se puede emplear vol-
tamperometría de redisolución catódica. La técnica es la misma que la voltamperometría de redisolución anódica, excepto en
que la sustancia se deposita anódicamente y luego se redisuelve mediante un barrido de voltaje catódico.

(811) FINURA DE POLVOS

La distribución del tamaño de partícula se debe calcular mediante Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por
Tamizado Analítico (786) o aplicando otros métodos, cuando resulte conveniente. En este capítulo, se proporciona una clasifi-
cación de finura de polvos, en términos descriptivos y sencillos. La medida de la finura de los polvos se realiza, por motivos
prácticos, mediante tamices. El tamizado es el método más adecuado si la mayoría de las partículas superan aproximadamente
los 75 µm, aunque también se puede usar para algunos polvos cuyos tamaños de partícula son inferiores, cuando el método se
pueda validar. La difracción de luz es otra técnica que también se utiliza ampliamente para medir el tamaño de una gran varie-
dad de partículas.
Clasificación de Finura de Polvos-Cuando la distribución acumulativa se determina mediante tamizado analítico u otros
métodos, la finura de los polvos se puede clasificar de la siguiente manera:
x90 = dimensión de partícula correspondiente al 90% de la distribución acumulativa de partículas de tamaño inferior al
esperado
x50 =mediana de la dimensión de partícula (es decir, 50% de las partículas son de menor tamaño y 50% de las partículas
son de mayor tamaño)
x 10 =dimensión de partícula correspondiente al 10% de la distribución acumulativa de partículas de tamaño inferior al
esperado
Se reconoce que el símbolo d también se utiliza ampliamente para designar estos valores. Por tanto, se pueden emplear los
símbolos d 90, d50 y d 10 •
Los siguientes parámetros se pueden definir basándose en la distribución acumulativa. Q,¡(x) = distribución acumulativa de
partículas con una dimensión menor o igual a x, donde el subíndice R representa el tipo de distribución.

R Tipo de Distribución
o Número
Longitud
2 Área
3 Volumen

Por consiguiente, por definición:

1. QR(x) = O, 90 cuando x = X 90
2. QR(x) = 0,50 cuando x = x50
570 (811) Finura de Polvos /Pruebas Físicas USP 37

3. Qix) =O, 1 O cuando x = x, 0

La tabla que figura a continuación presenta un método alternativo, aunque menos informativo, para clasificar la finura de los
polvos.
Clasificación de los Polvos según su Finura
-
Distribución Acumulativa
Término Basada en Volumen,
--
Descriptivo x50 (rtm) Q,(x)
Grueso
~~~-----~·----·
>355 Q,(355) <0,50
Moderadamente Fino 180--355 Q ,(1 80) <0,50 y Q ,(355) >0,50
Fino 125-180 Q,(125) <0,50 y Q,(180) 20,50
Muy Fino c,125 Q,(125) 20,50

(821) RADIOACTIVIDAD

Los productos farmacéuticos radioactivos requieren técnicas especializadas para su manejo y análisis para poder obtener re-
sultados correctos y reducir al mínimo los riesgos para el personal. Todas las operaciones deben ser llevadas a cabo o supervi-
sadas por personal capacitado en el manejo de materiales radioactivos.
Por lo general, las instalaciones para la producción, uso y almacenamiento de productos farmacéuticos radioactivos están
sujetas a la obtención de una licencia que otorga la Comisión de Reglamentación Nuclear Federal (Nuclear Regulatory Com-
mission), aunque en ciertos casos esta atribución ha sido delegada a agencias estatales. El Departamento de Transporte, en el
orden federal, reglamenta las condiciones del transporte de materiales radioactivos. Las agencias estatales y locales suelen apli-
car reglamentaciones especiales adicionales. Todos los fabricantes o usuarios deben conocer exhaustivamente las reglamenta-
ciones federales aplicables de la Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (Food, Drug, and Cosmetic Act), así como
los requisitos adicionales del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos (U. S. Public Health Service) y de los organismos
estatales y locales relativos a los artículos en cuestión.
En este capítulo se establecen definiciones, consideraciones especiales y procedimientos relativos a las monografías de la Far-
macopea sobre medicamentos radioactivos.

CONSIDERACIONES GENERALES

Ley Fundamental de Desintegración

La velocidad de desintegración de una fuente radioactiva se describe por la ecuación:

en donde N, es el número de átomos de la sustancia radioactiva en el tiempo transcurrido t, N es el número de átomos cuan-
0

do t = O y/, es la constante de transformación o desintegración, la cual tiene un valor característico para cada radionucleido.
La vida media, T 1w es el tiempo requerido para que una actividad dada de un radionucleido alcance la mitad de su valor inicial
y está relacionada con la constante de desintegración por la ecuación:
T 112 = 0,69315/Iº
La actividad de una fuente radioactiva (A) está relacionada con el número de átomos radioactivos presentes, por la ecuación:

a partir de la cual puede calcularse el número de átomos radioactivos en el tiempo t y, por lo tanto, puede determinarse la
masa del material radioactivo.
La actividad de una sustancia radioactiva pura en función del tiempo puede obtenerse a partir de la ecuación exponencial o
de tablas de desintegración, o bien por medio de gráficas basadas en la vida media (ver Gráfica Normalizada de Desintegración,
Figura 7).
USP 37 Pruebas Flsicas / (821) Radioactividad 5 71

0,5
VIDA MEDIA

Figura 1. Gráfica Normalizada de Desintegración.

La actividad de un material radioactivo se expresa como el número de transformaciones nucleares por unidad de tiempo. La
unidad fundamental de radioactividad, el curio (Ci), se define como 3, 700 x 101 º transformaciones nucleares por segundo. El
milicurio (mCi) y el microcurio (µCi) son subunidades de uso común. El "número de transformaciones nucleares por unidad de
tiempo" es la suma de las velocidades de desintegración de todos los modos de desintegración concurrentes del nucleido de
origen. Antes de que la actividad de cualquier radionucleido en una muestra medida pueda expresarse en curios, suele ser ne-
cesario conocer las abundancias de las radiaciones emitidas y medidas.

Geometría

La validez de la calibración y medición relativas de radionucleidos depende de la reproducibilidad de la relación de la fuente

con el detector y su entorno. Debe tenerse en cuenta la configuración de la fuente.

Radiación de Fondo

Los rayos cósmicos, la radioactividad presente en el detector y en los materiales de protección y la radiación proveniente de
fuentes radioactivas que no cuentan con un blindaje adecuado y que están en las inmediaciones del equipo de medición son
factores que contribuyen al conteo de la radiación de fondo. Todas las mediciones de radioactividad deben corregirse restando
el conteo de radiación de fondo del conteo bruto de la muestra de prueba.

Estadísticas de Conteo

Dado que el proceso de desintegración radioactiva es un fenómeno aleatorio, los eventos a contar también forman una se-
cuencia aleatoria en función del tiempo. Por esta razón, el conteo durante un tiempo definido sólo permite obtener una esti-
mación del conteo real. La precisión de esta estimación, sujeta a fluctuaciones estadísticas, depende del número de cuentas
acumuladas en una medición dada y puede expresarse en función de la desviación estándar o. Una estimación de o es

en donde n es el número de conteos acumulados en una medición dada. La probabilidad de que una sola medición se en-
cuentre dentro de
±iooNn%
con respecto a la media de una serie de mediciones es 0,68. Es decir, si se realizara una serie de mediciones de un número n
de conteos cada una, aproximadamente dos tercios de las observaciones se encontrarían dentro de
572 (821 > Radioactividad / Pruebas Físicos USP 37

±1001m%
de la media y el resto quedaría fuera.
Debido a la naturaleza estadística de la desintegración radioactiva, el conteo repetido de una fuente no alterada en un dis-
positivo para conteo produce valores de conteo que se ajustan a la frecuencia de una distribución normal. Las desviaciones de
estos valores respecto de la distribución normal responden a la prueba de x2 • Por este motivo, suele aplicarse la prueba de x2
para determinar el rendimiento y correcto funcionamiento de un dispositivo para conteo. En la selección de instrumentos y
condiciones para la valoración de fuentes radioactivas, debe maximizarse la cifra del valor i: 2 /B (en donde i: =eficiencia del
contador = velocidad observada de conteo/velocidad de desintegración de la muestra y B = velocidad de conteo de radiación
de fondo).

Pérdidas en el Conteo

El tiempo mínimo requerido para que el contador resuelva dos pulsos de señal consecutivos se denomina tiempo muerto.
Por lo general, el tiempo muerto varía entre unos microsegundos, en el caso de contadores proporcionales y de centelleo, has-
ta cientos de microsegundos, en el caso de contadores de Geiger-Müller. Los eventos nucleares producidos durante el tiempo
muerto del contador no se registrarán. Para obtener la velocidad de conteo corregida, R, a partir de la velocidad de conteo
observada, r, es necesario emplear la fórmula:

R = r/(1 - r,)

en donde ' es el tiempo muerto. La fórmula de corrección anterior supone un tiempo muerto no prolongable. Por lo tanto,
para la validez general, el valor de r, no debe exceder de O, 1. La velocidad de conteo observada, r, se refiere a la velocidad de
conteo bruto de la muestra y no se debe corregir por la radiación de fondo antes de su uso en la ecuación anterior.

Estándares de Calibración

Realizar todas las valoraciones de radioactividad empleando sistemas de medición calibrados con estándares de radioactivi-
dad debidamente certificados. Estos estándares de calibración pueden adquirirse directamente del Instituto Nacional de Nor-
mas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés) o de otras fuentes con valores rastreables al Instituto Nacional de Normas y
Tecnología mediante su participación en un programa de mediciones intercomparadas. En aquellos casos en que estos están-
dares de calibración no se encuentren disponibles, la Farmacopea proporciona los datos de desintegración nuclear requeridos
para la calibración. Estos datos, así como los valores de vida media, se obtienen del Archivo de Datos sobre Estructura Nuclear
Evaluada del Proyecto de Datos Nucleares de Oak Ridge (Evaluated Nuclear Structure Data File of the Oak Ridge Nuclear Data
Project) y reflejan los últimos valores disponibles a la fecha de publicación.

Transportador

La masa total de átomos o moléculas radioactivas en una fuente radioactiva dada es directamente proporcional a la actividad
del radionucleido para una vida media dada y, por lo general, la cantidad presente en los preparados radiofarmacéuticos es
demasiado pequeña para ser medida por métodos químicos o físicos comunes. Por ejemplo, la masa de 131 1 con una actividad
de 100 mCi es 8 x 10-7 g. Como cantidades tan pequeñas de material se comportan químicamente de manera anómala, se
pueden agregar isótopos no radioactivos del mismo radionucleido para actuar como transportadores durante el procesamiento
para facilitar su manipulación. En muchos casos, la adsorción puede impedirse simplemente aumentando la concentración de
iones hidrógeno en la solución. Sin embargo, las cantidades de este material deben ser lo suficientemente pequeñas como
para que no se produzcan efectos fisiológicos indeseables. La expresión "sin transportador" se refiere únicamente a preparacio-
nes radioactivas donde no hay isótopos no radioactivos del radionucleido. Esto implica que los preparados radiofarmacéuticos
producidos a través de (n, y) reacciones no pueden considerarse exentas de transportador.
La actividad por unidad de volumen o peso de un medio o vehículo que contiene un radionucleido, ya sea con o sin trans-
portador, se denomina concentración radioactiva, en tanto que el término actividad específica se refiere a la actividad de un
radionucleido por gramo de su elemento.

Pureza Radioquímica

La pureza radioquímica de una preparación radiofarmacéutica se refiere a la fracción del radionucleido declarado presente
en la forma química declarada. Las impurezas radioquímicas en preparados radiofarmacéuticos pueden ser el resultado de la
descomposición y de procedimientos de preparación indebidos. La radiación causa la descomposición del agua, uno de los
ingredientes principales de la mayoría de los preparados radiofarmacéuticos, lo cual produce átomos reactivos de hidrógeno y
radicales hidroxilo, electrones hidratados, hidrógeno, iones hidrógeno y peróxido de hidrógeno. Este último se forma en pre-
sencia de radicales oxígeno, los cuales se originan a partir de la descomposición radiolítica del oxígeno disuelto. Muchos pre-
parados radiofarmacéuticos tienen mejor estabilidad si se excluye el oxígeno. La radiación también puede afectar al preparado
radiofarmacéutico en sí mismo, produciendo un aumento de iones, radicales y estados excitados. Estas especies se pueden
 1

USP 37 Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 573

combinar entre sí o con las especies activas formadas a partir del agua. La descomposición por radiación puede reducirse al
mínimo mediante el uso de agentes químicos que captan electrones o radicales. Los electrones atrapados en sólidos provocan
un cambio de color debido a la formación de centros F y un ejemplo del caso es el oscurecimiento de los envases de vidrio que
contienen preparados radiofarmacéuticos. La pureza radioquímica de los preparados radiofarmacéuticos se determina por cro-
matografía en columna, papel o en capa delgada u otras técnicas apropiadas de separación analítica, según se especifique en
la monografía individual correspondiente.

Pureza Radionucléidica

La pureza radionucléidica de una preparación radiofarmacéutica se refiere a la proporción de radioactividad debida al radio-
nucleido deseado en la radioactividad total medida. La pureza radionucléidica es importante para la estimación de la dosis de
radiación recibida por el paciente cuando se le administra la preparación. Las impurezas radionucléidicas pueden surgir de im-
purezas en los materiales originales, diferencias en los valores de diferentes secciones cruzadas de producción competentes y
funciones de excitación a la energía o energías de las partículas bombardeantes durante la producción.

Términos y Definiciones

La fecha de fabricación es la fecha en la cual se completa el ciclo de fabricación del producto terminado.
La fecha de valoración es la fecha (y hora, si fuera aplicable) en la cual se realiza la valoración concreta de la radioactividad.
La fecha de calibración es una fecha y hora arbitrariamente asignadas, momento en el que se calcula la radioactividad del
producto para la comodidad del usuario.
La fecha de caducidad es la fecha límite para el uso del producto. El período de caducidad (es decir, el tiempo transcurrido
entre la fecha de fabricación y la fecha de caducidad) se basa en el conocimiento de las propiedades radioactivas del producto
y los resultados de los estudios de estabilidad de la forma farmacéutica terminada.

Etiquetado

Las monografías correspondientes a cada producto radiofarmacéutico indican la fecha de caducidad, la fecha de calibración
y la advertencia "Precaución-Material Radioactivo". El etiquetado indica que, al realizar los cálculos de dosificación, deben
hacerse las correcciones necesarias por desintegración radioactiva y asimismo indica cuál es la vida media radioactiva del radio-
nucleido. Los artículos que son Inyecciones deben cumplir con los requisitos de Etiquetado en Inyectables (1 ), mientras que los
que son Productos Biológicos deben cumplir con los requisitos de Etiquetado en Productos Biológicos (1041 ).

IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE RADIONUCLEIDOS

Instrumental

CÁMARAS DE IONIZACIÓN

Una cámara de ionización es un instrumento donde se aplica un campo eléctrico a través de un volumen de gas con el pro-
pósito de recoger los iones producidos por un campo de radiación. Los iones positivos y los electrones negativos migran a lo
largo de las líneas de fuerza del campo eléctrico y se captan en electrodos, produciendo una corriente de ionización. En una
cámara de ionización de tipo pozo adecuadamente diseñada, la corriente de ionización no debe depender demasiado de la
posición de la muestra radioactiva y el valor de la corriente por unidad de actividad, conocido como factor de calibración, es
característico de cada radionucleido emisor de rayos gamma.
La corriente de ionización producida en una cámara de ionización está relacionada con la energía media de la radiación emi-
tida y es proporcional a la intensidad de la radiación. Si se emplean fuentes estándar de velocidad de desintegración conocida
para calibrar la eficiencia, se puede utilizar la cámara de ionización para determinaciones de actividad entre algunos microcu-
rios y varios cientos de milicurios o más. Por lo general, el límite superior de actividad que puede medirse en una cámara de
ionización no está definido con exactitud y puede estar limitado por consideraciones relativas a la saturación, la capacidad del
amplificador y el diseño de la cámara en sí. Deben revisarse los datos suministrados u obtenidos de un instrumento específico
para evaluar los intervalos útiles de energías e intensidades del dispositivo.
Se puede alcanzar fácilmente una reproducibilidad con un margen de aproximadamente un 5% en alrededor de 1O segun-
dos, con una cámara de pozo profundo re-entrante. La forma más comúnmente empleada de cámara de ionización para me-
dir las actividades de preparados radiofarmacéuticos se conoce como calibrador de dosis.
Aunque el factor de calibración para un radionucleido puede interpolarse a partir de la curva de respuesta a la energía de la
cámara de ionización, en este procedimiento hay varias fuentes posibles de error. Por lo tanto, se recomienda que todas las
calibraciones de la cámara de ionización se lleven a cabo con el uso de fuentes auténticas de referencia de los radionucleidos
individuales, según se describe más adelante.
574 (821) Radioactividad/ Pruebas Físicas USP 37

La calibración de un calibrador de dosis debe mantenerse relacionando la respuesta medida de un estándar con la de un
estándar de larga vida, como es el caso del radio 226 en equilibrio con sus productos de desintegración. El instrumento debe
verificarse diariamente con 226 Ra u otra fuente para evaluar su estabilidad durante un período prolongado. Esta verificación de-
be incluir lecturas del estándar de funcionamiento en todas las posiciones de radionucleido empleadas. Para obtener la activi-
dad (A.) del radionucleido medido, emplear la relación:
Ax== RxR/R 0
en donde R0 es la nueva lectura para el radio u otra fuente, Rx es la lectura para la misma fuente obtenida durante el procedi-
miento de calibración inicial y R es la lectura observada para la muestra del radionucleido. Obviamente, primero hay que apli-
car las correcciones necesarias por desintegración radioactiva de la fuente de referencia. El uso de este procedimiento debe
reducir al mínimo cualquier efecto debido a la desviación en la respuesta del instrumento. La actividad recomendada del 22 6 Ra
u otro indicador usado en el procedimiento descrito anteriormente es entre 75 µCi y 150 µCi. Se recomienda también verificar
la reproducibilidad o estabilidad de instrumentos de intervalos múltiples para todos los intervalos con el uso de estándares
apropiados.
El tamaño y la forma de una fuente radioactiva pueden afectar la respuesta de un calibrador de dosis y suele ser necesario
realizar una pequeña corrección cuando se mide una muestra voluminosa.

DETECTORES DE CENTELLEO Y DETECTORES SEMICONDUCTORES

Cuando se disipa la totalidad o parte de la energía de la radiación beta o gamma dentro de los centelladores, se producen
fotones de intensidad proporcional a la cantidad de energía disipada. Un fototubo multiplicador de electrones detecta estos
pulsos y los convierte en pulsos eléctricos, que posteriormente se analizan con un analizador de altura de pulso para obtener
un espectro de altura de pulso relacionado con el espectro de energía de la radiación emitida por la fuente. En general, un
espectro de altura de pulso por centelleo de partículas beta se aproxima al espectro verdadero de energía beta, siempre que la
fuente de partículas beta esté preparada de tal manera que la autoabsorción se reduzca al mínimo. Se pueden obtener espec-
tros de rayos beta utilizando fluoruro de calcio o antraceno como centellador, mientras que los espectros de rayos gamma
suelen obtenerse con un cristal de yoduro de sodio activado con talio o con un detector semiconductor de gran volumen de
germanio desplazado por litio. Los espectros de partículas cargadas también pueden obtenerse empleando detectores semi-
conductores de silicio y/o contadores proporcionales de gas. Los detectores semiconductores son, en esencia, cámaras de ioni-
zación de estado sólido, pero la energía requerida para crear un par electrón-hueco o para elevar un electrón desde la capa de
valencia a la capa de conducción en el semiconductor es aproximadamente de un décimo de la energía requerida para crear
un par iónico en una cámara de ionización llena de gas o un contador proporcional y es mucho menor que la requerida para
producir un fotón en un cristal Nal(TI) de centelleo. En la espectrometría de rayos gamma, un detector de Ge(Li) puede produ-
cir una resolución de energía de 0,33% para rayos gamma de 1,33 MeV provenientes de 6 °Co, mientras que un cristal de
Nal(TI) de 3 x 3 pulgadas (7,6 x 7,6 cm) permite obtener un valor de 5,9% para la misma energía de rayos gamma. La resolu-
ción de energía es una medida de la capacidad para distinguir la presencia de dos rayos gamma estrechamente espaciados en
energía y se define por convención como el ancho total del fotopico a la mitad de su altura máxima (FWHM por sus siglas en
inglés), expresado como porcentaje de la energía del fotopico.
Los espectros de rayos gamma presentan uno o más fotopicos nítidos típicos o picos de energía total, como resultado de la
absorción total en el detector de la energía completa de radiaciones gamma provenientes de la fuente; estos fotopicos son
útiles para fines de identificación. Otros picos secundarios se observan como consecuencia de retrodispersión, radiación de ani-
quilación, suma de coincidencia, rayos X fluorescentes, etc., acompañados por una banda amplia conocida como el efecto
continuo Compton que surge de la dispersión de los fotones en el detector y de los materiales circundantes. Dado que la res-
puesta del fotopico varía con la energía del rayo gamma, la calibración de un espectrómetro de rayos gamma debe realizarse
con estándares de radionucleidos que tengan energías de rayos gamma y velocidades de emisión conocidas. La forma del es-
pectro de rayos gamma depende de la forma y tamaño del detector y los tipos de materiales de blindaje empleados.
Para verificar la identidad de un radionucleido por espectrometría de rayos gamma, es necesario hacer una comparación del
espectro de la muestra con el de una muestra de pureza conocida del mismo radionucleido obtenida con parámetros instru-
mentales idénticos e idéntica geometría de muestra. Cuando los radionucleidos emiten radiaciones coincidentes X o gamma, el
carácter de la distribución de la altura de pulso suele cambiar drásticamente debido al efecto de suma de estas radiaciones
coincidentes en el detector a medida que aumenta la eficiencia de la detección (por ejemplo, al acercar la fuente al detector).
Este efecto es particularmente evidente en el caso del yodo 125. Entre las aplicaciones más útiles de la espectrometría de rayos
gamma están aquellas que sirven para la identificación de radionucleidos y la determinación de impurezas radionucléidicas.
Cuando no es posible confirmar la identidad de un radionucleido dado a través de una comparación directa con el espectro
de una muestra del mismo radionucleido de pureza conocida, la identidad del radionucleido en cuestión debe establecerse
con el siguiente método. Deben medirse dos o más de los siguientes parámetros del esquema de desintegración nuclear de la
muestra del radionucleido que se desea identificar, los cuales deben concordar dentro de ±10%: (1) vida media, (2) energía de
rayos gamma o rayos X emitidos, (3) la abundancia de cada emisión y (4) el Emáx para aquellos radionucleidos que se desinte-
gren con emisión de partículas beta. Estas mediciones deben realizarse según se indica en las secciones Identificación y Valora-
ción de este capítulo. La coincidencia de dos o más de los parámetros medidos con los datos correspondientes publicados del
esquema de desintegración nuclear constituye la confirmación de la identidad del radionucleido.
USP 37 Pruebas Flsicas / (821) Radioactividad 575

CONTADORES DE CENTELLEO LÍQUIDO

Los radionucleidos emisores de radiación alfa y beta pueden analizarse con un sistema de detectores de centelleo líquido. En
el líquido de centelleo, la energía de radiación se transforma finalmente en cuantos de luz que son detectados generalmente
por dos fototubos multiplicadores preparados para contar sólo radiación de coincidencia. El líquido de centelleo es una solu-
ción constituida por un disolvente, solutos primarios y secundarios, y aditivos. La partícula cargada disipa su energía en el di-
solvente y una fracción de esta energía se transforma en fluorescencia en el soluto primario. La función del soluto secundario
es desplazar la radiación de fluorescencia a longitudes de onda más largas que son detectadas más eficientemente por los foto-
tubos multiplicadores. Los disolventes empleados con más frecuencia son tolueno y p-xileno; los solutos primarios son 2,5-dife-
niloxazol (PPO) y 2-(4' -terc-butilfenil)-5-(4-bifenilil)- l, 3,4-oxadiazol (butil-PBD) y los solutos secundarios son 2,2'-p-fenilen-
bis[4-metil-5-feniloxazol] (dimetil-POPOP) y p-bis(o-metilestrilil)benceno (bis-MSB). Para lograr compatibilidad y miscibilidad
con muestras acuosas a analizar, se incorporan también en el centellador muchos aditivos, tales como agentes tensoactivos y
agentes de solubilización. Para una determinación exacta de la radioactividad de la muestra se debe prestar atención al prepa-
rar una muestra verdaderamente homogénea. La presencia de impurezas o color en la solución disminuye la producción de
fotones del centellador, lo cual se denomina extinción. Una medición exacta de la radioactividad requiere una corrección por
pérdida de velocidad de conteo debida a extinción.
La velocidad de desintegración de una fuente de partículas beta puede determinarse mediante un procedimiento que con-
siste en medir el conteo total de la muestra en función del umbral discriminador de la altura de pulso y la velocidad de emisión
se obtiene luego extrapolando a un umbral de cero. Los emisores de partículas alfa energéticas pueden medirse de forma simi-
lar utilizando este método.

Identificación

Un radionucleido puede identificarse por su modo de desintegración, su vida media y las energías de sus emisiones nuclea-
res.
La vida media radioactiva se determina fácilmente mediante el conteo sucesivo de una fuente dada del radionucleido duran-
te un período más prolongado que su vida media. La respuesta del dispositivo para conteo cuando se emplea para la medición
de la desintegración de radionucleidos de larga vida debe supervisarse con una fuente de referencia de vida aCm más larga
para evaluar y compensar errores que surjan de la derivación electrónica del aparato. Para radionucleidos de vida corta, cuan-
do el período de conteo es una fracción significativa de la vida media del radionucleido, la velocidad de conteo registrada de-
be corregirse al tiempo en que se inicia el conteo, del siguiente modo:
Rt = rAt/(l - e-it)
en donde R, es la velocidad de conteo al comienzo de un período de conteo, res la velocidad del conteo observada a través
del período total de conteo, tes la duración del período total de conteo, 'A es la constante de desintegración del radionucleido
y e es la base del logaritmo natural. Cuando tes pequeño en comparación con la vida media del radionucleido en análisis, de
tal modo que 'A'< 0,05, (1 - e-u) se aproxima a At y no se necesita corrección.
La energía de emisiones nucleares suele determinarse por el intervalo máximo de penetración de la radiación en la materia
(en el caso de partículas alfa y beta) y por el pico o fotopico de energía total en el espectro de rayos gamma (en el caso de
rayos X y rayos gamma). Puesto que las partículas beta son emitidas con un espectro de energía continuo, la energía beta
máxima, Emáx' es un índice único para cada radionucleido emisor beta. Además del intervalo máximo y del espectro de energía
de las partículas beta, el coeficiente de absorción, cuando se obtiene bajo condiciones de conteo reproducibles, puede servir
como un índice confiable para la identificación de un emisor beta. Fortuitamente, las partículas beta se absorben en la materia
de una manera aproximadamente exponencial y la gráfica del logaritmo de la velocidad de conteo de partículas beta en fun-
ción del espesor del absorbente se conoce como la curva de absorción. La porción inicial de la curva de absorción muestra
linealidad, a partir de la cual puede obtenerse el coeficiente de absorción. El intervalo máximo está determinado por el uso de
absorbentes de espesor variable y el espectro de energía se mide por espectrometría de centelleo de rayos beta.
La absorción de rayos gamma en la materia es estrictamente exponencial pero las capas de valor medio de atenuación no
han sido muy útiles para la caracterización de radionucleidos. Los rayos gamma de cada transición isomérica son monoenergé-
ticos; su energía puede ser medida directamente por espectrometría de rayos gamma. Debido a su resolución de alta energía,
los detectores de estado sólido [Ge(Li)] son muy superiores a los detectores de centelleo [Nal(TI)] en la espectrometría de rayos
gamma.
Las actividades de las soluciones radiofarmacéuticas suelen aproximarse a los milicurios por mL. Por lo general, estas solucio-
nes deben diluirse considerablemente antes de que puedan valorarse con exactitud. El diluyente debe ser compatible con el
preparado radiofarmacéutico en lo que se refiere a factores como pH y potenciales redox, para que no ocurra ninguna hidróli-
sis o cambio en el estado de oxidación con la dilución, lo que podría conducir a adsorción y separación del radionucleido de la
solución.
 ,.
576 (821) Radioactividad/ Pruebas Físicas USP 37

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA

Procedimiento del Coeficiente de Absorción de Masa-Depositar y secar una alícuota de la solución de fósforo 32 ra-
dioactivo sobre una película plástica delgada para reducir al mínimo la retrodispersión y colocar la alícuota bajo un contador
apropiado. Determinar sucesivamente las velocidades de conteo, empleando no menos de seis "espesores" diferentes de alu-
minio, cada uno entre 20 mg/cm2 y 50 mg/cm 2 y un solo absorbente de espesor no mayor de 800 mg/cm2, que se emplea
para medir la radiación de fondo. (Los absorbentes se insertan entre la muestra de prueba y el contador pero se colocan más
cerca de la ventana del contador para reducir al mínimo la dispersión.) El conteo neto de partículas beta se obtiene después de
restar la velocidad de conteo hallada con el absorbente de espesor de 800 mg/cm2 o mayor. Graficar el logaritmo de la veloci-
dad neta de conteo de partículas beta en función del "espesor" total del absorbente. El "espesor" total del absorbente es el
"espesor" de los absorbentes de aluminio más el "espesor" de aire equivalente (la distancia en centímetros entre la muestra y
la ventana del contador multiplicada por 1,205 mg/cm 3 a 20º y 76 cm de mercurio), expresado en mg/cm2. El resultado es
una línea aproximadamente recta.
Elegir dos "espesores" totales del absorbente que difieran en 20 mg/cm 2 o más y que caigan sobre la gráfica lineal y calcular
el coeficiente de absorción de masa, µ, por medio de la ecuación:
µ = 1 /(t2 - t,) · In (Nu/N 12) = (2,303/(t2 - t,)) x (log N11 - log N12)

en donde t, y t 2 representan el total de los "espesores," en mg/cm 2, siendo t 2 el absorbente de mayor espesor; y Nt, y Nt2 son
las velocidades de conteo neto de partículas beta con los absorbentes t, y t 21 respectivamente.
Para la caracterización del radionucleido, el coeficiente de absorción de masa debe estar dentro de un ±5% del valor encon-
trado para una muestra pura del mismo radionucleido cuando se determina bajo condiciones idénticas de conteo y geometría.
Otros Métodos de Identificación-Otros métodos para la determinación de la identidad de un emisor beta también de-
penden de la determinación de la Emáx· Se puede llevar a cabo de varias maneras. Por ejemplo, (1) mediante la utilización de
relaciones de intervalos de energía entre partículas beta en un absorbente o (2) mediante la determinación de Emáx a partir de
un espectro de partículas beta obtenido con un espectrómetro para radiación beta calibrado por energía empleando una fuen-
te delgada del radionucleido (ver Detectores de Centelleo y Detectores Semiconductores en este capítulo).

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA

El espectro de rayos gamma de un radionucleido es una herramienta valiosa para la identificación cualitativa de radionuclei-
dos emisores de rayos gamma. Se identifica el pico de energía total, o el fotopico, por la energía de transición de rayos gamma
que se libera en el esquema de desintegración del radionucleido.
Para determinar la pureza e identidad de un radionucleido, se obtiene el espectro de rayos gamma de una sustancia radioac-
tiva por medio de un cristal de Nal(TI) o un detector semiconductor de Ge(Li). La resolución de este último es mayor en más
de una orden de magnitud que el anterior y es el preferido para fines analíticos. El espectro obtenido es idéntico en forma al
de una muestra del radionucleido puro, medido con el mismo sistema de detección y en la misma geometría. El espectro de
rayos gamma del producto radiofarmacéutico deberá contener sólo fotopicos identificables por las energías de transición de
los rayos gamma encontrados en el esquema de desintegración del mismo radionucleido. En el caso de eficiencias geométricas
bajas, las áreas bajo los fotopicos, después de corregir por la eficiencia de medida del detector, son proporcionales a la abun-
dancia o velocidad de emisión de los respectivos rayos gamma en el radionucleido.

IMPUREZAS RADIONUCLÉIDICAS

Debido a que los nucleidos emisores de rayos alfa son sumamente tóxicos, debe limitarse su uso en preparaciones radiofar-
macéuticas. Los procedimientos para la identificación de radionucleidos activos gamma y beta, según se ha indicado previa-
mente, se aplican a la detección de contaminantes gamma y, comúnmente, contaminantes beta.
La actividad bruta de partículas alfa en preparaciones radiofarmacéuticas puede medirse mediante el uso de un contador
proporcional sin ventanas o un detector de centelleo que emplee un detector fosforescente de sulfuro de cinc activado por
plata o por las técnicas de conteo de centelleo líquido.
La gran ionización causada por partículas alfa facilita la medición de radionucleidos emisores de rayos alfa en presencia de
grandes cantidades de nucleidos beta y gamma activos mediante el uso de técnicas apropiadas para diferenciar la amplitud de
los pulsos de señal. En el conteo proporcional, la región de voltaje operativo para conteo de partículas alfa denominada "mese-
ta alfa" es considerablemente menor que la "meseta beta" para conteo de radiaciones beta y gamma. La calibración de voltaje
típica para la "meseta alfa" y la "meseta beta" con gas de conteo P-1 O es de 900 voltios a 1 300 voltios y de 1600 voltios a
2000 voltios, respectivamente.
Cuando se emplean detectores fosforescentes de sulfuro de cinc activado por plata para la detección de partículas alfa, éstas
pueden distinguirse de otras radiaciones de interferencia por la diferenciación de la altura de pulso. Se debe tomar la precau-
ción de reducir al mínimo la autoabsorción en la fuente cuando se preparan las muestras para el conteo de partículas alfa.
USP 37 Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 577

Valoración

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA

Procedimiento-La velocidad de desintegración (A) de una muestra emisora de partículas beta se obtiene mediante el con-
teo de una alícuota cuantitativamente depositada en una geometría fija según la fórmula:

A= R/(¡; X f, X fb X f,)

en donde E es la eficiencia del contador, f, es el factor de corrección por tiempo muerto del contador, fb es el factor de correc-
ción por retrodispersión y f, es el factor de corrección por autoabsorción. La velocidad de conteo para un absorbente cero se
obtiene por extrapolación de la porción lineal inicial de la curva de absorción a un "espesor" cero del absorbente, consideran-
do los mg/cm 2 de "espesor" de cubierta de la muestra, la ventana del contador y el espacio de aire presente entre la muestra y
la ventana del contador. La eficiencia del contador, E, se determina mediante el uso de un estándar secundario de larga vida
con características espectrales similares. RaD + E se ha utilizado con frecuencia para la calibración de eficiencia de los contado-
res para fósforo 32. Mediante el uso de condiciones de medición idénticas para la muestra y el estándar (y extrapolación a
absorbente cero), el cociente entre los valores de f,, fb y f, para el estándar y la muestra se acerca a la unidad.
La relación anterior es válida también cuando se ha calibrado el contador con un estándar del radionucleido que se va a
analizar. En este caso, sin embargo, no se requieren las extrapolaciones a "espesor" cero del absorbente para la muestra y el
estándar, ya que las dos correcciones para absorción se cancelan para una geometría dada.
Otro método útil que se emplea con frecuencia para la determinación de la velocidad de desintegración de radionucleidos
emisores de rayos beta es el conteo por centelleo líquido, que también utiliza una extrapolación del conteo de la muestra a un
umbral cero para el discriminador de altura de pulso.

RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA

Se proporcionan tres métodos para la valoración de radionucleidos emisores de rayos gamma. La selección del método pre-
ferido depende de la disponibilidad de un estándar de calibración del radionucleido a analizar y la pureza radionucléidica del
producto en sí.
Se requiere la comparación directa con un estándar de calibración si el estándar de calibración del radionucleido a analizar
está disponible y si se ha determinado que el límite superior de error aceptable en la determinación de las actividades debido a
la presencia de impurezas radionucléidicas es menos de 3%. Cuando el estándar de calibración requerido no es fácil de obte-
ner, como probablemente sea el caso para un radionucleido de vida corta, pero ha estado disponible en algún momento pre-
vio a la ejecución de la valoración para determinar la eficiencia del sistema de conteo del radionucleido a analizar, emplear un
sistema de conteo calibrado siempre que el contenido de impurezas radionucléidicas de la muestra cumpla los requisitos esta-
blecidos para el método de comparación directa. Si los requisitos de cualquiera de los dos primeros métodos no se pueden
cumplir, emplear el método para determinación de la actividad a partir de una curva de calibración.
Con excepción del primer método, se realiza un seguimiento de los sistemas de conteo empleados para verificar la estabili-
dad. Este requisito se cumple mediante verificaciones diarias con una fuente de larga vida para verificar el funcionamiento y
verificaciones semanales con al menos tres fuentes que cubran una gama amplia de energías de emisión de rayos gamma (por
ejemplo, 57 Co, 137Cs y 6°Co). Si se encuentra una discrepancia en cualquiera de las medidas antedichas, recalibrar completa-
mente el sistema o reparar y recalibrar el sistema antes de volver a usarlo.
Valoración por Comparación Directa con un Estándar de Calibración-Para este procedimiento no se requiere un siste-
ma de medición selectiva de energía (por ejemplo, un analizador de altura de pulso). Se emplea una cámara de ionización o
un sistema integral de conteo con un detector de Nal(TI). Para obtener resultados exactos es esencial un factor de geometría
reproducible de manera constante de muestra a muestra. Tomando precauciones adecuadas, la exactitud de este método se
aproxima a la exactitud con la cual se determina la velocidad de desintegración del estándar de calibración.
Determinar la velocidad de conteo del sistema de detectores para un estándar de calibración del radionucleido a valorar (por
ejemplo, suficientemente activo para dar estadísticas confiables de medición dentro de un lapso razonable, pero no tan activo
como para causar problemas graves de tiempo muerto), seleccionando un estándar que permita una exactitud óptima con el
equipo específico utilizado. Colocar una alícuota exactamente medida de la muestra desconocida a valorar (diluida, si fuera
necesario) en un recipiente idéntico al usado para el estándar y medir la muestra aproximadamente al mismo tiempo y bajo las
mismas condiciones geométricas que el estándar. Si el tiempo transcurrido entre las mediciones del estándar de calibración y
la muestra excede las 12 horas, verificar la estabilidad del sistema de medición dentro de las 8 horas a partir del momento en
que se midió la muestra, con una fuente de larga vida para verificación del funcionamiento. Registrar la respuesta del sistema
con respecto a la misma fuente de verificación en el momento de la calibración y, si las verificaciones posteriores exceden la
respuesta original registrada en más de ±3%, recalibrar el sistema. Corregir ambas determinaciones de actividad por radiación
de fondo y calcular la actividad, en µCi por mL, por la fórmula:

SD(g/b)
578 (821 >Radioactividad/ Pruebas Físicas USP 37

en donde S es la concentración ~1Ci del estándar; D es el factor de dilución; y g y b son los valores medidos de la velocidad de
conteo para la muestra y el estándar, respectivamente.
Valoración con un Sistema de Conteo Integral Calibrado-Se aplican el procedimiento y las precauciones mencionadas
para el método anterior de comparación directa, excepto que se debe determinar y registrar la eficiencia del sistema de detec-
tores para cada radionucleido que se desea analizar, en lugar de registrar simplemente la velocidad de conteo del estándar. Por
lo tanto, la eficiencia para un radionucleido determinado, x, se determina por ¡;x = bxfsx, en donde bx es la velocidad de con-
teo, corregida por radiación de fondo y tiempo muerto, para el estándar de calibración del radionucleido, x, y sx es la actividad
correspondiente al estándar de calibración certificado en transformaciones nucleares por segundo. Para valoraciones posterio-
res de la muestra, la actividad está dada por la fórmula:
Ax= DgjEx
en donde Des el factor de dilución, gx es la velocidad de conteo de la muestra (corregida por la radiación de fondo y el tiem-
po muerto) y ¡;x es la eficiencia correspondiente para el radionucleido.
Determinación de la Actividad a Partir de una Curva de Calibración-La versatilidad en las mediciones de intensidad
absoluta de rayos gamma puede lograrse mediante un análisis de altura de pulso en canales múltiples. La eficiencia de un siste-
ma de detección para fotopicos puede determinarse como una función de la energía de los rayos gamma a través de una serie
de muestras de estándares de emisores de rayos gamma; la velocidad de emisión de rayos gamma de un radionucleido para el
cual no se disponga de ningún estándar puede determinarse por la interpolación en la curva de eficiencia. Sin embargo, es
necesario definir la curva de eficiencia para el sistema de detección adecuadamente sobre la región total de interés, usando un
número suficiente de puntos de calibración a lo largo del eje de energía del fotopico.
Selección de un Equipo de Conteo-Para la identificación de radionucleidos que emiten rayos X o gamma en su desintegra-
ción se emplea un espectrómetro de rayos gamma. Los requisitos para un equipo apropiado para la identificación y valoración
de los radionucleidos empleados en productos radiofarmacéuticos son: (a) que la resolución del detector basada en el fotopico
de 137Cs- 137 mBa de 662-keV sea 8,0% o mejor, (b) que el detector cuente con un soporte de muestra diseñado para facilitar la
repetición exacta de la geometría de conteo y (c) que el analizador de altura de pulso tenga canales suficientes para delinear
claramente el fotopico bajo observación.
Procedimiento-Los requisitos mínimos para el mantenimiento de las calibraciones del instrumento son verificaciones sema-
nales de funcionamiento con una fuente apropiada de referencia y una recalibración semestral completa. Si la verificación de
funcionamiento semanal se desvía del valor determinado en el momento de la calibración en más de 4,0%, debe recalibrarse
totalmente el instrumento.
Este método se divide en tres pasos básicos: la integración del fotopico, la determinación de la curva de eficiencia para foto-
picos y el cálculo de la actividad de la muestra.
INTEGRACIÓN DEL FOTOPICO-EI método para determinar el área de un fotopico utiliza una aproximación gausiana para el
ajuste del fotopico. Puede obtenerse una fracción fija del número total de conteos del fotopico tomando el ancho del pico, a, a
una fracción del máximo donde se ha determinado experimentalmente que la forma es muy cercana a la gausiana y multipli-
cándolo por el canal de conteo máximo, P, después de corregir por contribuciones por el efecto Compton y la radiación de
fondo. Por lo general, esta radiación de fondo puede determinarse correctamente mediante una interpolación lineal. Este pro-
cedimiento se ilustra en la Figura 2.

so
;:¡:
¡:::: 70
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UJ
!>'. 60
oUJ
r-
~ 50
(.)
UJ
o 40
o
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g 30
g
...J
g; 20
___ j __ _
'º
ENERGÍA-

Fig. 2 Espectro Típico de Rayos Gamma que muestra la Selección del Canal de Conteo Máximo, P, después de la Corrección
por Contribuciones por el Efecto Compton y la Radiación de Fondo.

La curva del fotopico adopta una forma cercana a una línea recta a 0,606P y la contribución al valor de a de los canales
fraccionarios puede calcularse exactamente por interpolación. Calcular a por la ecuación:
USP 37 Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 579

a= D' - D + [(d - 0,606P)/(d - c)] + [(d' - 0,606P)/(d' - c')]

en donde c y d y también c' y d' son los canales de conteo individuales a cada lado de 0,606P y D y D' son los números de los
canales (ubicación) de d y d', respectivamente. La posición de las variables requeridas sobre el fotopico se ilustra en la Figura 3.

- + - - - - - - - - - ; - - - - 0,606 p
ow
....
z 1 1

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o
u
w
e
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e<(
e
u
~o'-o~I
g
w
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1
d-0,606 p
1 !
d' - 0,606 p
d-c d' -e'

ENERGÍA--+

Fig. 3 Ubicación de las Variables Requeridas para la Determinación del Ancho del Pico, a, a 0,606P.

A partir de los valores conocidos de velocidad de conteo P en el canal de conteo máximo del fotopico y el ancho del pico
0,606P, a, se obtiene una fracción calibrada del área del fotopico a partir del producto, (aP).
Para resumir los procedimientos utilizados para obtener una fracción calibrada del área del fotopico empleando este méto-
do, las etapas o cálculos necesarios se detallan paso a paso a continuación:
(1) Restar del fotopico que se desea medir cualquier contribución por efecto Compton y radiación de fondo.
(2) Determinar la velocidad de conteo P del canal de conteo máximo (máxima velocidad de conteo del canal después de
restar el valor Compton y la radiación de fondo).
(3) Multiplicar P por 0,606 y ubicar la línea horizontal correspondiente al ancho del pico, a.
(4) Obtener el ancho del pico, a, asignando los valores de las variables (obtenidos según se muestra en la figura precedente)
en la ecuación correspondiente para calcular a.
(5) La fracción calibrada del área del pico es igual al producto de a por P o F = aP, en donde F es un área fraccionaria del
pico proporcional a la velocidad de emisión de la fuente.
Este método proporciona un medio rápido y exacto para determinar la velocidad de emisión de los rayos gamma de las
fuentes mientras que evita, en gran medida, las estimaciones subjetivas de la forma detallada de las colas de los picos. El error
debido al empleo de la máxima velocidad de conteo del canal, en lugar del canal de conteo máximo teórico, es del orden de
1,0% si a es 6 o mayor.
CALIBRACIÓN DE LA EFICIENCIA DEL FOTOPICO-Los radionucleidos como los listados en la tabla siguiente junto con algunos de
sus datos de desintegración nuclear, se encuentran disponibles como estándares certificados de referencia.* Debe seleccionarse
un número suficiente de fuentes radioactivas de referencia estándar para obtener la curva de calibración en el intervalo desea-
do. En lo posible, se deben incluir fuentes estándar de los radionucleidos que se desean analizar.
Propiedades Nucleares de los Estándares de Calibración
Seleccionados(l,2)
Fotones
Energía por100
Emisiones de Fotones Principales (ke V) Desintegraciones
13 3 Ba (T,,, = 10,5 años)
(l) En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoración, la radiación fluorescente de blindaje de plomo (específicamente, rayos X -76 ke V por
K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiación; una manera satisfactoria
de absorber esta radiación es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con
cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor.
<2 > Por lo general, sólo se incluyen aquellas emisiones del fotón que tienen ;o, 1% de abundancia.
(3) La notación K se refiere a emisiones de rayos X.
<4 > Se proporcionan las energías medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de Nal(TI).
(S) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen.
<6 > Cascada.

* Se pueden obtener estos estándares de referencia certificados del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés), Washington, DC
20234.
580 (821 > Radioactividad / Pruebas Físicas USP 37

Propiedades Nucleares de los Estándares de Calibración

Seleccionados< 1, 2 ) (Continuación)
Fotones
Energía porlOO
Emisiones de Fotones Principales (ke V) Desintegraciones
K,,, 30,97 63,4
K,,, 30,62 34,2
K11 35,0 22,8
y, 53, 15 2,14
y, 79,62 2,55
y, 80,99 33,0
Y< 276,39 6,9
Y7 302,83 17,8
y. 356,0 60,0
Yo 383,85 8,7
137Cs-137mBa (Tl/J = 30,17 años)
K,,, 32,19 3,82
K.. 7 31,82 2,07
K,, 36,4 1,39
Media Ponderada(4) (32,9) (7,28)
Y1 661,6 89,98
22Na (T117 = 2,60 años)
hv 511 179,80(5)
y, 1274,54 99,94
60Co (T117 = 5,27 años)
y, 1173,2(6) 100,0
y, 1332,5(6) 100,0
57Co (T117 = 270,9 días)
LXK 7,0 56,0
y, 14,4 9,5
y, 122,06 85,51
y, 136,47 10,60
Media Ponderada (125,0) (96, 11)
(y,+ y,)(4)
54Mn (Tl/J = 312,7 días)
¿X" 6,0 25,0
y, 834,83 99,98
109Cd-109Ag (Tl/J = 464 días)
K,,, 22,16 35,3
K.. 7 21,99 18,6
Ka 24,9 11,4
Media Ponderada(4) 63,5
y, 88,0 3,72
129¡ (T,,, = 1,57 x 10 7 años)
K,,,<3) 29,78 37,0
K,,, 29,46 20,0
K11 13,2 37,0
y, 39,58 7,52
Media Ponderada(4J (31,3) (77,80)
(l)En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoración, la radiación fluorescente de blindaje de plomo (específicamente, rayos X -76 ke V por
K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiación; una manera satisfactoria
de absorber esta radiación es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con
cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor.
(2) Por lo general, sólo se incluyen aquellas emisiones del fotón que tienen ;>1 % de abundancia.
(3) La notación K se refiere a emisiones de rayos X.
<4) Se proporcionan las energías medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de Nal(TI).
(S) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen.
<6) Cascada.
USP 37 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 581

Calcular la velocidad de emisión de rayos gamma por la ecuación:

en donde As es la actividad, en desintegraciones por segundo, del estándar usado y b es el número de rayos gamma por desin-
tegración a ese nivel de energía. Medir con exactitud cantidades de soluciones estándar de cada radionucleido en recipientes
idénticos y determinar el área fraccionaria del fotopico (F) para cada uno de los estándares.
Empleando la ecuación Er = F/r, calcular la eficiencia del fotopico, Er y construir una gráfica log-log de eren función de la
energía de rayos gamma como se muestra en la Figura 4.

1,0
~----:--.....--.. ~ -- ~-

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-----
-----
'\~ ~-:-- - 1 1 1 1 1

0,5
-\"\ ~~ POZO DE 3 x 3;
"112 x 1 112 pulgadas

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a: POZO DE 1 314 X 2; _
~ 'o-2x2
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518 X 1 1/2 pulgadas \ ~
\
\
(.) 0,1 3Xf-
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w
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ü:: "\
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0,05
CRISTALES SÓLIDOS: FUENTE A 9,3 cm
CRISTALES DE POZO: FUENTE EN EL POZO

0,02
~---

--¡--- -¡-- --- - --- -- - -----

0,1 0,2 0,5 1,0 2,0

ENERGIA (Mev)

Fig. 4. Curvas Típicas de Calibración de la Eficiencia de Fotopicos para Varios Detectores de Nal(TI).

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA MUESTRA-De la misma manera que en la preparación de la curva de calibración, deter-
minar el área fraccionaria (F) del fotopico principal de la muestra valorada o una alícuota medida con exactitud ajustada al
mismo volumen en un recipiente idéntico al usado para los estándares. A partir de la curva de calibración, determinar el valor
de Er para este radionucleido. Empleando la ecuación 1 = F/i:r, calcular la velocidad de emisión de los rayos gamma (r). Calcu-
lar la ay:tividad (A), en desintegraciones por segundo, de la muestra empleando la ecuación A= (í/b)(D), en donde bes el
número de rayos gamma por desintegración y D es el factor de dilución. Para obtener la actividad, en µCi o mCi, dividir A por
3,7 x 10 4 ó 3,7 x 10 7, respectivamente. La relación anterior es igualmente válida para la obtención de la actividad de una
muestra no diluida o una cápsula; en este caso, el factor de dilución, D, es la unidad.

(823) FÁRMACOS PARA TOMOGRAFÍA DE EMISIÓN DE POSITRONES

PARA USO EN PREPARACIONES MAGISTRALES, INVESTIGACIÓN
CLÍNICA Y ESTUDIOS CIENTÍFICOS

INTRODUCCIÓN

Los radionucleidos usados para la tomografía de emisión de positrones (TEP) a menudo tienen vidas medias físicas cortas,
T112 (p.ej., T112 de 15 0 = 2,03 min, 6 2 Cu = 9,67 min, 13 N = 9,96 min, 11 C = 20,4 min, 6BGa = 67,7 min, 18 F = 109,8 min, 64 Cu =
12,7 h). Como resultado, estos radionucleidos a menudo se obtienen mediante técnicas de aceleración de partículas (p.ej.,
ciclotrones) o en generadores, y luego se procesan para fabricar el producto farmacéutico terminado para TEP, muy cerca del
sitio donde se llevará a cabo el procedimiento de TEP.
 ,.
582 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones / Pruebas Físicas USP 37

Las cortas vidas medias de los radionucleidos para TEP derivan en limitaciones únicas para la preparación y análisis de pro-
ductos farmacéuticos para TEP. Este capítulo describe guías para la elaboración y análisis de productos farmacéuticos para TEP,
basándose en las siguientes limitaciones:
• No es posible completar todo el análisis antes de usar los productos farmacéuticos para TEP.
• Un solo vial puede contener una partida o subpartida completa de producto farmacéutico para TEP. Las muestras retira-
das para el análisis de control de calidad (CC) son representativas de toda la partida o subpartida.
• Una partida o subpartida completa puede administrarse a un único paciente.
• La masa del fármaco para TEP en un producto farmacéutico para TEP a menudo se encuentra en cantidades que varían
desde nanogramos hasta microgramos.
• Los productos farmacéuticos para TEP no entran en una cadena de distribución de medicamentos tradicional, sino que
estos se usan internamente o se entregan en el lugar de uso por servicios de distribución especializados.
• Las instalaciones de producción a pequeña escala para la preparación de productos farmacéuticos para TEP cuentan con
personal y recursos limitados, los cuales requieren lo siguiente:
- Facilitar la realización de operaciones múltiples en un área con controles adecuados;
- Facilitar la fabricación y el análisis de múltiples productos farmacéuticos para TEP usando equipo compartido;
- Requerimientos apropiados para operaciones asépticas;
- Requerimientos apropiados para la aptitud del equipamiento y demás actividades en el día de uso;
- Requisitos de control de calidad para componentes, materiales e insumos;
- Autoverificación de etapas importantes en la producción de radionucleidos, producción de fármacos para TEP o pre-
paración magistral y análisis; y
- Supervisión de la producción y preparación magistral, revisión de registros de partida y autorización para la libera-
ción por parte de una sola persona.
El alcance de este capítulo incluye la producción y preparación magistral de productos farmacéuticos para TEP para adminis-
tración en humanos para su uso (a) de conformidad con la práctica médica y farmacéutica regulada por el estado, (b) de con-
formidad con una solicitud de nuevo fármaco en investigación aprobada (JND, por sus siglas en inglés) (ver el Título 21 del
CFR 312) y (c) de conformidad con los requisitos para uso en estudios científicos bajo la supervisión de un Comité de Estudios
Científicos para Fármacos Radioactivos (Radioactive Drug Research Committee o RDRC; ver el Título 21 del CFR 361 ). El alcan-
ce de este capítulo no incluye actividades de dispensación conforme a lo definido en otros capítulos generales de la USP.

DEFINICIONES

Las siguientes definiciones se aplican a los términos y frases empleados en este capítulo.
Actividad Específica: La radioactividad de un radionucleido por unidad de masa del elemento o compuesto. La unidad de
actividad específica se expresa en unidades de radioactividad por unidad de masa en gramos o en moles, (p.ej., mCi/µg
[MBq/µg], Ci/mmol [GBq/mmol]).
Certificación del Fabricante: Documentación que incluye, entre otros, certificados de análisis, certificados de cumpli-
miento o certificados de calidad obtenidos del fabricante, proveedor o vendedor de un material o componente, el cual
describe las características de calidad críticas usadas para determinar la aceptabilidad de uso.
Concentración: La concentración de radioactividad del fármaco para TEP en el producto farmacéutico para TEP por uni-
dad de volumen, determinada al momento de la calibración. La unidad de concentración es la cantidad de radioactividad
por unidad de volumen al momento de la calibración (p.ej., mCi/mL [MBq/mL]).
Control de Calidad (CC): Sistema para analizar la calidad de los componentes, materiales, insumos y productos farma-
céuticos para TEP mediante procedimientos, pruebas, métodos analíticos y criterios de aceptación.
Fármaco para TEP: Sustancia radioactiva (ingrediente farmacéutico activo) que presenta núcleos inestables de desintegra-
ción espontánea mediante la emisión de positrones y que se incorpora en un producto farmacéutico para TEP para produ-
cir un efecto directo en el diagnóstico o seguimiento de una enfermedad o manifestación de una enfermedad en huma-
nos, o para el seguimiento del tratamiento de una enfermedad o procedimientos terapéuticos (p.ej., terapia para tumo-
res).
Fuera de la Especificación (OOS, por sus siglas en inglés): Resultado de la prueba de control de calidad para un pro-
ducto farmacéutico para TEP que no cumple con los criterios de aceptación establecidos.
Garantía de Calidad (GC): Sistema planeado para asegurar, mediante procedimientos, pruebas y métodos analíticos,
que un producto farmacéutico para TEP posee la identidad, concentración, calidad y pureza requeridos para el propósito
esperado.
Liberación Condicionada Final: Se refiere a una liberación final para administración en pacientes antes de haber comple-
tado las pruebas requeridas debido a una falla del equipo analítico.
Liberación de Línea: Segregación y limpieza de diferentes áreas de procesamiento y trabajo para evitar la contaminación
cruzada y las mezclas entre la producción y/o la preparación magistral de diferentes productos farmacéuticos para TEP.
Lote: Cantidad de materiales (p.ej., reactivos, disolventes, gases, columnas de purificación y demás materiales auxiliares)
que tienen un carácter y calidad uniformes dentro de los límites especificados y que se usan para fabricar un producto
farmacéutico para TEP.
USP 37 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 583

Partida: Cantidad de producto farmacéutico para TEP que se supone tiene un carácter y calidad uniformes, dentro de los
límites especificados, y que se prepara en un solo ciclo operativo de acuerdo con una o más órdenes de producción.
Preparación Magistral: Conforme a lo descrito en la Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, (Food, Drug and
Cosmetic Act) (1997) Capítulo 11, Sección 121 (a) (ii) (1) (B), se refiere a la práctica de sintetizar o formular un producto
farmacéutico para TEP, por parte o por orden de un profesional acreditado por un Estado para preparar magistralmente o
para ordenar la preparación magistral de un producto farmacéutico para TEP, y que se prepara magistralmente de confor-
midad con la ley de dicho Estado, para un paciente o con propósitos de estudios científicos, de enseñanza o de control de
calidad.
Producto Farmacéutico para TEP: Forma farmacéutica terminada que contiene un fármaco para TEP, sin importar si se
encuentra o no en asociación con uno o más ingredientes.
Producción: Proceso de síntesis o formulación de un producto farmacéutico para TEP que incluye procesamiento, envasa-
do, etiquetado, reprocesamiento y análisis para investigación médica o estudios científicos.
Subpartida: Cantidad de producto farmacéutico para TEP con carácter y calidad uniformes, dentro de los límites especifi-
cados, que se produce durante una sucesión de irradiaciones múltiples, usando una operación de síntesis o purificación
determinada. Un grupo de subpartidas forman colectivamente una partida que se supone cuenta con un carácter y cali-
dad uniformes, dentro de los límites especificados. Las subpartidas pueden ser necesarias para productos farmacéuticos
para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas (p.ej., 13 N y 15 0) debido a que no es posible completar las pruebas de
control de calidad antes de su uso.
Validación: Confirmación mediante evidencia documental de que un método, proceso o sistema cumple con los requisi-
tos de desempeño esperados.
Verificación: Confirmación de que un método, proceso o sistema establecido cumple con los criterios de aceptación pre-
determinados.

PERSONAL

Se debe contar con un número suficiente de personal con educación, capacitación y experiencia apropiadas para la prepara-
ción y análisis de productos farmacéuticos para TEP. El número depende del tamaño y la complejidad de las operaciones efec-
tuadas en cada instalación.
Requisitos de Capacitación: Se debe capacitar al personal antes de que comience a fabricar y a analizar productos farma-
céuticos para TEP. La capacitación se puede llevar a cabo mediante diversos métodos, que incluyen la instrucción presencial, la
instrucción audiovisual y el estudio de publicaciones. La capacitación debe tratar, pero no limitarse a, técnicas de producción
de radionucleidos, métodos de síntesis y purificación, materiales, componentes, reactivos, soluciones madre, aparatos automa-
tizados y manuales usados para fabricar productos farmacéuticos para TEP, así como métodos de ce, incluyendo equipos, soft-
ware y documentación. La capacitación se debe documentar.
Capacitación en Operaciones Asépticas: La capacitación debe tratar las manipulaciones asépticas y las técnicas y equipos
usados para lograr y mantener las condiciones ambientales Clase 5 de la lnternational Organization far Standardization (ISO). La
capacitación también debe tratar todas las operaciones asépticas, incluyendo el ensamble de componentes estériles, la prepa-
ración magistral y el filtrado. Las manipulaciones de soluciones estériles deben ser llevadas a cabo por operadores calificados
para el uso de técnicas asépticas (ver Instalaciones y Equipo a continuación).
Se debe evaluar periódicamente al personal implicado en operaciones asépticas mediante simulaciones asépticas en las que
se utilice medio de crecimiento microbiológico para evaluar la calidad de la operación aséptica. Las simulaciones asépticas de-
ben cumplir con lo siguiente:
• Incluir todas las manipulaciones requeridas para el montaje aséptico del ensamble del vial de producto farmacéutico para
TEP (p.ej., vial, filtro y ensamble de jeringa, entre otros).
• Representar los casos más extremos para operaciones asépticas.
• Deben realizarse por triplicado para calificar a un nuevo operador. Cada operador debe someterse anualmente a una reca-
lificación mediante por lo menos un llenado de medios.
• Se debe realizar siempre que se presenten cambios significativos en los procedimientos.
Después del proceso de simulación, los medios deben estar exentos de contaminación después de la incubación a una tem-
peratura adecuada durante 14 días. Un operador que no apruebe las evaluaciones escritas o cuyas simulaciones asépticas pre-
senten crecimiento microbiano deberá ser inmediatamente reinstruido y reevaluado a fin de asegurar la corrección de las defi-
ciencias en su práctica aséptica.

GARANTÍA DE CALIDAD

La GC es un concepto amplio que abarca todos los aspectos que influyen en la identidad, concentración, calidad y pureza
de un producto farmacéutico para TEP. El control de calidad es un subconjunto de la GC que trata el análisis de materiales y de
productos farmacéuticos para TEP para determinar si cumplen con los criterios de aceptación. La función de la GC por lo gene-
ral consiste en actividades de supervisión, mientras que la función del control de calidad se basa en actividades de ejecución.
Las funciones del control de calidad incluyen lo siguiente.
584 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas USP 37

• Evaluar cada lote de material entrante para asegurar que cumple con las especificaciones establecidas antes de su uso en
la preparación o análisis de productos farmacéuticos para TEP.
• Evaluar cada partida de un producto farmacéutico para TEP para asegurar que ésta cumple con las especificaciones esta-
blecidas antes de autorizar su liberación final.
Las funciones de supervisión relacionadas con la GC incluyen lo siguiente:
• Revisar los registros de partida una vez completos para verificar su exactitud y que estén completos.
• Aprobar procedimientos, especificaciones, procesos y métodos.
• Asegurar que el personal esté apropiadamente capacitado y calificado, según corresponda.
•Asegurar que los productos farmacéuticos para TEP posean una identidad, concentración, calidad y pureza suficientemen-
te definidos.
• Asegurar que los cambios en la calidad de los componentes, proveedores, cambios en los procedimiento de producción y
los cambios en los procedimientos de análisis y especificaciones sean apropiados y que se implementen de manera corres-
pondiente.
• Investigar errores y asegurar que se tomen las acciones correctivas y de prevención correspondientes para prevenir su re-
currencia.
• Gestión de quejas.
• Asegurar que la producción, análisis, etiquetado, liberación y distribución de los productos farmacéuticos para TEP se lle-
ven a cabo de conformidad con los procedimientos y prácticas establecidos en la instalación para productos farmacéuti-
cos para TEP.
• Llevar a cabo auditorías periódicas para monitorear el cumplimiento de los procedimientos y prácticas establecidos para
productos farmacéuticos para TEP.
El personal de la instalación puede ejercer funciones tanto de GC como de CC.

INSTALACIONES Y EQUIPO

Las instalaciones deben ser adecuadas para la producción, preparación magistral y análisis de productos farmacéuticos para
TEP. Las áreas de trabajo deben mantenerse organizadas para evitar contaminación cruzada, mezclas y errores, especialmente
en las áreas usadas para la fabricación de múltiples productos farmacéuticos para TEP. El personal debe limpiar las áreas de
trabajo periódicamente para prevenir la contaminación de equipos, materiales, componentes o productos farmacéuticos para
TEP o aquellas condiciones del entorno, que pudieran tener un impacto negativo sobre la calidad del producto farmacéutico
para TEP. Estos requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio rutinario de
los mismos.
Controles Ambientales para Productos Farmacéuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas
de esterilidad para productos farmacéuticos parenterales para TEP se obtienen después de la liberación, las instalaciones y
equipos deben salvaguardar la esterilidad de un producto farmacéutico para TEP.
Estación de Trabajo Aséptica-El control ambiental primario para operaciones asépticas es un filtro de partículas del aire de alta
eficiencia (HEPA, por sus siglas en inglés) capaz de producir aire con un nivel de limpieza ISO Clase 5. Esto se puede lograr con
una estación de trabajo con flujo de aire laminar, aislador aséptico, cabina de seguridad biológica u otro dispositivo adecuado
(reciben el nombre genérico de estaciones de trabajo asépticas). La estación de trabajo aséptica debe estar protegida de fuen-
tes de contaminación microbiana y se debe situar en un área en la que el tránsito de personal sea limitado. El área circundante
a la estación de trabajo aséptica no debe usarse para el almacenamiento de materiales que desprendan grandes cantidades de
partículas (p.ej., cajas corrugadas).
La operación adecuada de la estación de trabajo aséptica se debe certificar midiendo las partículas en el aire, analizando la
integridad del filtro HEPA, analizando la presión diferencial, o por otros medios. Las pruebas específicas a realizar dependen del
tipo de estación de trabajo aséptica. La certificación debe llevarse a cabo al inicio de las operaciones y, posteriormente, por lo
menos una vez al año o después de reparar o reemplazar el filtro HEPA. Estos requisitos reemplazan cualquier otro requisito
provisto en los capítulos de información general de la USP (p.ej., Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesa-
miento Aséptico (1116)).
El área de trabajo dentro de la estación de trabajo aséptica debe estar limpia. Las superficies internas deben ser fáciles de
limpiar y desinfectar. Las superficies internas se deben limpiar y desinfectar usando desinfectantes apropiados esterilizados por
filtración o con certificación de esterilidad demostrada mediante certificado del fabricante.
Pruebas Microbiológicas-Se deben llevar a cabo pruebas microbiológicas del ambiente para evaluar la calidad del aire y la de-
sinfección de la superficie de las áreas asépticas. Esto se puede lograr mediante placas de muestreo por sedimentación o con
placas activas para muestreo de aire. La desinfección de superficies críticas (p.ej., la superficie de trabajo de la estación de tra-
bajo aséptica o los dedos del operador) se debe evaluar con un hisopo o placas de contacto. Para el análisis microbiológico de
la estación de trabajo aséptica, se debe analizar el aire como parte de la calificación de la estación de trabajo (p.ej., semestral-
mente), mientras que la superficie se debe evaluar (usando un hisopo o placas de contacto) después de su uso, cada día de
uso. Los recuentos de partículas no viables se pueden determinar con menor frecuencia después de la certificación de la Esta-
ción de Trabajo Aséptica (ver anteriormente).
Se deben establecer límites de alerta e intervención para muestras obtenidas durante las pruebas microbiológicas. Los niveles
de alerta típicos se establecen a menos de tres unidades formadoras de colonias (ufc) por placa. Más de tres ufc requieren
USP 37 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 585

acciones correctivas que pueden incluir la recapacitación del operador, recertificación de la estación de trabajo aséptica u otras
acciones. Los resultados de las pruebas microbiológicas también deben usarse para la investigación de pruebas de esterilidad
positivas.
Equipo: El equipo usado para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP debe ser apropiado para el propósito al
que se destina y se debe instalar, limpiar y mantener de la manera correspondiente. El equipo debe ser capaz de producir re-
sultados uniformes.
Los siguientes requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio de los mis-
mos.
1. Instalación de Equipo Nuevo-El equipo recién instalado debe ser calificado con suficiente detalle antes de usarlo en la fa-
bricación o análisis de productos farmacéuticos para TEP, basándose en la complejidad del equipo. Todas las actividades
de calificación deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona que llevó a ca-
bo la calificación. Para equipos más complejos, la calificación consiste en tres fases:
• Calificación de la Instalación (Cl)-La CI es una verificación de los puntos requeridos para la instalación apropiada del
equipo, los cuales incluyen ubicación física, servicios e insumos requeridos, interfases y condiciones ambientales. La
CI debe describir el procedimiento de instalación para el equipo.
• Calificación Operativa (CO)-La CO es una verificación de las especificaciones operativas del equipo, las cuales inclu-
yen configuración del equipo, pruebas de funcionalidad de subsistemas y la operación general adecuada. La CO de-
be describir los procedimientos operativos para el equipo.
• Calificación del Desempeño (CD)-La CD demuestra que el equipo es capaz de realizar las tareas requeridas para la
fabricación y análisis de productos farmacéuticos para TEP en el ambiente operativo y que el equipo proporciona los
resultados pretendidos. La CD debe describir las tareas que el equipo debe desempeñar.
2. Calibración del Equipo-La calibración del equipo analítico se debe llevar a cabo antes de su uso, según corresponda. Se
debe desarrollar un programa de recalibración que cuente con una frecuencia suficiente para asegurar resultados exactos.
Las actividades de calibración deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona
que llevó a cabo la calibración.
3. Mantenimiento Preventivo del Equipo-Se debe desarrollar un programa de mantenimiento preventivo para equipo impor-
tante de producción y análisis, incluyendo módulos de análisis químicos automatizados, cromatógrafos de gases, croma-
tógrafos de líquidos de alta resolución, entre otros. El programa debe contar con una frecuencia suficiente para minimizar
el tiempo de inactividad del equipo. Las reparaciones serias pueden requerir recalibración y recalificación. Las actividades
de mantenimiento preventivo deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha de la acción y el nombre
de la persona que la llevó a cabo.
Limpieza de Equipos y Componentes: El equipo usado en la producción o preparación magistral de productos farmacéuti-
cos para TEP incluye dispositivos automatizados controlados por computadoras, así como aparatos de operación manual. An-
tes de su uso en la fabricación de productos farmacéuticos para TEP, el equipo debe limpiarse de manera apropiada para ase-
gurar que el producto farmacéutico para TEP resultante cumpla con las especificaciones establecidas de identidad, concentra-
ción, calidad y pureza (ver Controles y Criterios de Aceptación para Productos Farmacéuticos para TEP Terminados a continuación).
Una vez limpio, el equipo debe mantenerse en dicho estado antes de su uso.
Es posible utilizar el equipo para fabricar múltiples partidas de uno o más productos farmacéuticos para TEP. Por lo que se
debe demostrar mediante estudios documentados la efectividad de los procesos de limpieza entre partidas. Se deben controlar
todas las impurezas a niveles que cumplan con las especificaciones establecidas para identidad, concentración, calidad y pure-
za. Los procedimientos escritos para la liberación de líneas entre partidas de diferentes productos farmacéuticos para TEP de-
ben describir la realización de los procesos de limpieza.
Verificaciones en el Día de Uso: Son necesarias ciertas verificaciones en el día de uso para asegurar el funcionamiento apro-
piado del equipo de procesamiento. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos para las verificaciones en el día de
uso. Estos procedimientos deben estar diseñados para verificar parámetros clave al inicio de cada ciclo de operaciones (p.ej.,
temperatura, integridad de la presión, suministro de gas, suministro de vacío, selección de línea de entrega apropiada, volú-
menes de entrega de reactivos, velocidades de flujo de gases, monitores de radiación y demás sensores del proceso). Algunos
parámetros pueden verificarse periódicamente como parte de los programas de calibración y mantenimiento preventivo, se-
gún se describió anteriormente.
Aptitud del Sistema para Equipo de CC: Las pruebas de aptitud del sistema para el equipo de CC son necesarias para ase-
gurar que el conjunto de equipo, sus componentes y el personal operador (es decir, el sistema considerado como un todo)
funcionen apropiadamente para ejecutar el método analítico deseado. Las pruebas de aptitud del sistema se deben realizar
antes de usar el equipo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos
para las pruebas de aptitud del sistema, y se deben documentar los resultados de dichas pruebas.
Las pruebas de aptitud del sistema requeridas para métodos cromatógraficos incluyen factor de asimetría, inyecciones repe-
tidas y resolución. Cuando el cromatograma de prueba usado para la aptitud del sistema contiene un único pico, entonces el
factor de asimetría, las inyecciones repetidas y la eficiencia de la columna (platos teóricos) son suficientes. Para estas determi-
naciones, es necesario el uso de estándares internos o externos con una concentración conocida. Los estándares deben prepa-
rarse a partir de materiales bien caracterizados o materiales certificados por el fabricante. A continuación se presentan dos en-
foques aceptables que se pueden usar para métodos cromatográficos:
586 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas USP 37

1. Crear una curva de calibración a partir de una serie de estándares en un intervalo de concentraciones conocidas. Las con-
centraciones de los estándares deben comprender las condiciones de uso para el método cromatográfico. La curva de ca-
libración se debe utilizar durante un periodo adecuadamente especificado (p.ej., seis meses), después del cual se debe
crear una nueva curva de calibración. Se debe crear una nueva curva de calibración cada vez que se altere el sistema cro-
matográfico. La aptitud del sistema de rutina para inyecciones repetidas consiste en una sola inyección de un estándar
conocido y una medición de la concentración basada en la curva de calibración. Si la concentración medida concuerda
con la concentración conocida dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 1 0% para inyecciones manuales y 5% para in-
yecciones automatizadas) esto demuestra la aptitud del sistema en inyecciones repetidas y asegura que la curva de cali-
bración es apropiada para su uso en inyecciones de muestra subsiguientes. El factor de asimetría y la resolución (o eficien-
cia de la columna, según corresponda) se deben determinar a partir del mismo cromatograma.
2. Al inicio de cada ciclo de análisis, crear una calibración de un solo punto, a partir de dos inyecciones de un estándar cono-
cido. El área medida de los picos para estas inyecciones debe concordar dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10%
para inyecciones manuales y 5% para inyecciones automatizadas). Posteriormente, los resultados se promedian y utilizan
con la concentración estándar para proporcionar un factor de calibración que se usa en inyecciones de muestra subsi-
guientes para ese día. El factor de asimetría y la resolución (o eficiencia de la columna, según corresponda) se deben de-
terminar a partir de uno de los dos cromatogramas.
Otros parámetros cromatográficos, tales como la relación señal-ruido, el límite de detección y el límite de cuantificación, se
pueden determinar como parte de un análisis rutinario de la aptitud del sistema.
Las pruebas de aptitud del sistema también pueden ser apropiadas para otro equipo de CC, incluyendo calibradores de do-
sis, escáneres para radio-cromatografía en capa delgada (radio-TLC) y analizadores multicanal. Cuando se utilizan, estas prue-
bas deben realizarse al momento de instalar, reubicar y, posteriormente, en intervalos apropiados. En estas pruebas, se deben
usar estándares conocidos para demostrar el funcionamiento apropiado del equipo, por ejemplo:
1 . Calibrador de Dosis-La exactitud, geometría y linealidad se deben evaluar al momento de la instalación y, posteriormen-
te, en intervalos apropiados. El instrumento debe calibrarse de conformidad con estándares reconocidos a nivel nacional o
con las instrucciones del fabricante. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificación de cons-
tancia con una fuente de radionucleidos de alta energía adecuada.
2. Escáner para Radio-TLC-La unformidad, exactitud posicional, linealidad del detector y resolución se deben evaluar con
una fuente de radionucleido adecuada. La prueba de aptitud del sistema de rutina debe incluir verificaciones para estos
parámetros.
3. Analizador Multicanal-La sensibilidad y la resolución se deben evaluar al momento de la instalación y, posteriormente, en
intervalos apropiados. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificación de constancia con una
fuente de radionucleidos de alta energía adecuada.

CONTROL DE COMPONENTES, MATERIALES E INSUMOS

Se deben controlar los componentes, materiales e insumos que se usan en la preparación de productos farmacéuticos para
TEP para evitar la contaminación, mezclas y errores. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas
actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de exámenes y pruebas completados para
componentes, materiales e insumos se deben conservar durante un año después de su vencimiento o durante un año después
de la liberación del lote, lo que represente el periodo más largo. Es necesario establecer y llevar a cabo las siguientes activida-
des:
1. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de ingredientes, reactivos, materia-
les diana y gases.
2. Establecer especificaciones escritas para la identidad y calidad de viales vacíos estériles, líneas de transferencia, llaves de
paso estériles, agujas estériles, filtros de membrana estériles y otros componentes usados en el ensamble del vial del pro-
ducto farmacéutico para TEP.
3. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de insumos analíticos (p.ej., disol-
ventes, columnas cromatográficas y estándares auténticos), medios de pruebas de esterilidad y reactivos para pruebas de
endotoxinas usados en el análisis de productos farmacéuticos para TEP.
4. Establecer condiciones de almacenamiento apropiadas (basadas en calor, luz, humedad y otros factores) para componen-
tes, materiales e insumos usados para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP.
5. Almacenar componentes, materiales e insumos en un área con acceso controlado, de acuerdo con las condiciones de al-
macenamiento establecidas. Segregar componentes, materiales e insumos, según corresponda, para evitar mezclas y erro-
res.
6. Anotar cada lote de envío de componentes, materiales e insumos, y registrar la fecha de recepción, cantidad recibida,
fabricante, número de lote del fabricante y fecha de caducidad. Si el fabricante no designa una fecha de caducidad, asig-
nar una basándose en el conocimiento de sus propiedades físicas y químicas y en la experiencia de uso previa. Para sustra-
tos orgánicos y reactivos que son potencialmente susceptibles a la degradación o a cambios en su composición, la fecha
de caducidad se debe basar en la estabilidad del material.
7. Determinar que cada lote de componentes, materiales e insumos cumple con las especificaciones escritas establecidas. El
cumplimiento de las especificaciones se puede demostrar inspeccionando el etiquetado o inspeccionando la certificación
USP 37 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 587

del fabricante. La identidad de cada lote de componentes, materiales e insumos debe ser verificada mediante procedi-
mientos y pruebas definidas, o con la certificación documentada del fabricante, según corresponda. Realizar una prueba
de identidad para precursores (p.ej., determinación del punto de fusión u otras pruebas adecuadas). Como alternativa, se
puede usar la certificación del fabricante como el único criterio de aceptación para un precursor, si se asegura mediante el
análisis del producto farmacéutico para TEP que se ha utilizado el precursor correcto. Los estándares de referencia usados
en los procedimientos cromatográficos deben contar con documentación adecuada sobre identidad y pureza. Se pueden
aceptar otros componentes basándose únicamente en la certificación del fabricante.
8. Los filtros de membrana usados con productos farmacéuticos parenterales para TEP deben contar con la certificación del
fabricante. Examinar la certificación del fabricante para cada lote a fin de asegurar el cumplimiento de la especificaciones
escritas.
9. Los medios usados en las pruebas de esterilidad de productos farmacéuticos para TEP se pueden obtener de fuentes co-
merciales. Si los medios se obtienen de fuentes comerciales, entonces la prueba de promoción de crecimiento que emplea
una sola especie de organismo adecuada se debe llevar a cabo durante la calificación inicial del proveedor y, en adelante,
periódicamente (p.ej., trimestralmente).

CONTROLES DE PROCESO V OPERATIVOS

Controles de Proceso: Los siguientes controles de proceso deben establecerse y resumirse en una fórmula maestra para el
producto farmacéutico para TEP. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas actividades se lle-
ven a cabo y se completen de manera apropiada.
1. Se deben establecer criterios de aceptación escritos para la identidad, concentración, calidad y pureza de cada producto
farmacéutico para TEP. Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, las especifica-
ciones deben incluir esterilidad y endotoxinas bacterianas. Cuando existe una monografía de la USP o cuando existen es-
pecificaciones previamente aceptadas por la agencia reglamentaria correspondiente (p.ej., FDA), entonces estos estánda-
res, si corresponde, pueden utilizarse como los criterios de aceptación mínimos.
2. Los procedimientos escritos para la preparación de cada producto farmacéutico para TEP deben incluir lo siguiente:
• Incorporar, para cada producto farmacéutico para TEP destinado para administración parenteral, filtración por mem-
brana estéril (0,22 pm) o esterilización por vapor;
• Incorporar, para cada producto farmacéutico para TEP destinado para inhalación, filtración de partículas (0,45 ~tm);
• Describir procedimientos de limpieza de rutina para el equipo y las instalaciones;
• Describir componentes, materiales e insumos usados para fabricar productos farmacéuticos para TEP, incluyendo pre-
cursores, estándares, reactivos, soluciones madre y artículos relacionados;
• Describir el proceso y los pasos empleados para fabricar el producto farmacéutico para TEP;
• Describir el proceso de formulación, incluyendo el uso de estabilizadores, soluciones amortiguadoras y otros agentes;
• Describir los cálculos realizados para parámetros CUéllltitativos relacionados con la fabricación y el análisis de ce del
producto farmacéutico para TEP (p.ej., incluir rendimiento radioquímico, pureza radioquímica, actividad específica,
cantidades de disolvente, etc.);
• Describir pruebas de control de calidad para el producto farmacéutico final para TEP (ver Controles y Criterios de Acep-
tación para Productos Farmacéuticos para TEP Terminados a continuación), incluyendo un programa que defina las
pruebas que se deben realizar para cada partida y que indique si los resultados deben estar completados al momento
de la liberación.
3. Se debe verificar la calidad de cada partida de un producto farmacéutico para TEP, mediante el análisis del producto ter-
minado total, antes de su uso para asegurar que el producto cumple con todas las especificaciones.
4. Para los casos en los que no sea posible o práctico llevar a cabo el análisis descrito en el párrafo anterior, la calidad de un
producto farmacéutico para TEP también se puede asegurar mediante estudios de validación documentados, en lugar de
pruebas previas a la liberación. Estos estudios deben cumplir con lo siguiente:
• Demostrar que el proceso es uniforme y adecuado para la preparación del producto farmacéutico para TEP deseado;
• Realizarse en tres partidas fabricadas de acuerdo con la fórmula maestra, en donde todas estas partidas deben cum-
plir con los criterios de aceptación;
• Incluir la evaluación de identidad y pureza radioquímica, identidad y pureza radionucléidica, actividad específica, es-
terilidad (para productos farmacéuticos parenterales para TEP), endotoxinas bacterianas (para productos farmacéuti-
cos parenterales para TEP), pH, apariencia, pureza estereoquímica (para compuestos aplicables), disolventes residua-
les, otros productos químicos tóxicos que pudieran haberse usado durante el procedimiento de síntesis o purifica-
ción, concentración efectiva de un estabilizante (si lo hubiere), pureza química del producto farmacéutico para TEP y
equivalencia de subpartidas iniciales y finales (ver la sección anterior, Definiciones);
• Repetirse si el proceso y los pasos descritos en la fórmula maestra han sido alterados de alguna manera que pudiera
cambiar la identidad, concentración, calidad o pureza del producto farmacéutico para TEP;
5. Los procesos y pasos descritos en la fórmula maestra deben actualizarse según se requiera y revisarse anualmente para
asegurar su vigencia. Antes de implementar cualquier actualización, será necesario llevar a cabo y aprobar una validación
y/o verificación.
588 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas USP 37

Los controles apropiados de los equipos controlados por computadora deben asegurar que los cambios en el proceso sean
instituidos únicamente por personal autorizado y que tales cambios sean documentados y verificados. Es indispensable crear
copias de seguridad y controlar los métodos de producción, preparación magistral y análisis para evitar el uso accidental de
métodos desactualizados. En lo que respecta a procesos o métodos de prueba de un proveedor que se usan sin alteraciones, es
aceptable basarse en la certificación del proveedor para la verificación del software y la operación adecuada.
Controles Operativos: Los controles operativos siguientes deben establecerse y resumirse en un registro de partida que es
una parte de la fórmula maestra para el producto farmacéutico para TEP. El registro de partida debe documentar de manera
adecuada el proceso de rutina para la fabricación del producto farmacéutico para TEP. Se debe designar a una persona como
responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de partida
completados y la documentación relacionada deberá conservarse durante un año después de la liberación de partida.
1. Se deben ejecutar los procedimientos de liberación de línea adecuados para evitar mezclas y contaminación cruzada, que
incluyan la inspección de áreas usadas para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP y la inspección de la lim-
pieza y aptitud de todo el equipo antes de su uso. Retirar materiales y etiquetas que no correspondan a la partida de estas
áreas y equipos.
2. Asegurar la identidad, concentración, calidad y pureza correctos de componentes, materiales e insumos usados en la pre-
paración del producto farmacéutico para TEP. Etiquetar componentes según corresponda para propósitos de identidad y
rastreabilidad.
3. Ejecutar procedimientos de limpieza de rutina para los equipos e instalaciones.
4. Preparar el producto farmacéutico para TEP de acuerdo con la fórmula maestra vigente y mantener un registro de partida
para cada partida. Los registros de partida pueden constar de documentación en papel, registros electrónicos o una com-
binación de los mismos. Se deben verificar las planillas de cálculo y demás herramientas electrónicas para conservación de
registros, a fin de asegurar la rastreabilidad, integridad de los datos, exactitud de resultados para cálculos, entre otros. El
registro de partida debe incluir lo siguiente:
• Los número de lote u otros identificadores únicos para todos los componentes, materiales e insumos usados para fa-
bricar el producto farmacéutico para TEP;
• Una descripción de los procedimientos individuales realizados;
• Las iniciales, firma u otro identificador del individuo responsable de confirmar que se hayan completado los pasos y
procesos críticos usados para fabricar y analizar el producto farmacéutico para TEP;
• El rendimiento porcentual calculado con respecto a la cantidad conocida o esperada del radionucleido inicial que se
incorpora sintéticamente al producto farmacéutico para TEP;
• Los datos analíticos brutos de cada partida de producto farmacéutico para TEP;
• Etiquetado para el producto farmacéutico para TEP (ver Etiquetado a continuación);
• Cálculos para parámetros clave definidos en la fórmula maestra;
• Resultados obtenidos de las pruebas de control de calidad del producto farmacéutico para TEP, incluyendo cromato-
gramas, listados impresos y demás datos de prueba;
• Las iniciales del analista que realizó cada prueba de control de calidad;
• Indicación del resultado de cada prueba de control de calidad, indicando si el resultado cumple o no con los criterios
de aceptación;
• La fecha y hora de la liberación y la firma del individuo que asume la responsabilidad general y el cumplimiento con
los procedimientos definidos para fabricar la partida y que autoriza la liberación de la partida para administración en
humanos; y
• Documentación de las desviaciones del proceso en el registro de partida, cuando corresponda.
Las entradas en los registros de partida se deben realizar inmediatamente después de haber llevado a cabo la actividad y
deben incluir las iniciales, firma u otro identificador de la persona que registra la entrada. Las correcciones a las entradas en
papel deben incluir fechas e iniciales, firmas o anotaciones con un identificador de la persona que efectúa las correcciones pero
dejando la entrada original legible.
Operaciones Asépticas para Productos Farmacéuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas
de esterilidad para productos farmacéuticos parenterales para TEP se obtienen después de la liberación para administración en
humanos, las operaciones y procedimientos asépticos deben asegurar de manera adecuada la esterilidad del producto farma-
céutico para TEP estéril. Todos los productos farmacéuticos para TEP preparados asépticamente para administración parenteral
se deben filtrar a través de un filtro de membrana estéril con un tamaño de poro de 0,22 µm o menor en un vial o envase
cerrado estéril o esterilizado mediante esterilización por vapor. Aunque la síntesis química de un producto farmacéutico paren-
teral para TEP se puede llevar a cabo en un aparato abierto o cerrado, la filtración por membrana del producto farmacéutico
para TEP se debe realizar en un sistema cerrado posterior al filtro de membrana. Este sistema se debe ensamblar asépticamen-
te, usando componentes preesterilizados, disponibles comercialmente.
Componentes-Los componentes estériles usados en el aparato ensamblado asépticamente, por lo general, consisten en un vial
vacío, agujas, filtros de membrana, agujas de venteo, jeringas, sistemas de tubos, llaves de paso, entre otros. Todos los compo-
nentes deben ser artículos preesterilizados disponibles comercialmente y de un solo uso. Si los componentes del aparato en-
samblado asépticamente se esterilizan en la instalación donde se lleva a cabo la TEP, se deben verificar los procesos de esterili-
zación. La configuración exacta del ensamble del vial de producto farmacéutico para TEP depende de cada proceso. Un ejem-
plo típico es un vial vacío, estéril, con un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,22 µm, unido a una aguja que se
USP 37 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 589

inserta a través del septo del vial para filtración, un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,22 pm unido a una aguja
que se inserta a través del septo del vial para ventear el vial durante la filtración, y una jeringa con una aguja insertada a través
del septo del vial para retirar la muestra de control de calidad después de completar la filtración.
Ensamble del Vial de Producto Farmacéutico para TEP-Se deben usar técnicas asépticas en el ensamblaje del vial de producto
farmacéutico para TEP, especialmente en el ensamble de todos los componentes subsiguientes al filtro de esterilización por
membrana. Estas operaciones deben llevarse a cabo en un ambiente ISO Clase 5 (ver la sección anterior, Instalaciones y Equi-
po).
Después de ensamblar el vial de producto farmacéutico para TEP en el ambiente ISO Clase 5, el ensamble puede ser retirado
hacia otra localización para filtración. Esta ubicación puede ser un ambiente no controlado siempre que no se comprometa
durante el proceso la integridad del ensamble del vial de producto farmacéutico para TEP. Todo ensamble de vial de producto
farmacéutico para TEP cuya integridad se vea comprometida durante dicho proceso, deberá ser desechado.
Técnicas Asépticas-Cualquier componente estéril posterior al filtro de membrana que entre en contacto con el producto far-
macéutico para TEP, deberá manipularse usando técnicas asépticas adecuadas, dentro de la estación de trabajo aséptica. Du-
rante las operaciones asépticas, los operadores deben usar vestimentas adecuadas, que incluyen una bata de laboratorio lim-
pia, mangas para antebrazos, cubre cabello, guantes higienizados que cubran las muñecas y cubrebarbas/bigote (según co-
rresponda). Durante un solo ciclo operativo aséptico es posible preparar múltiples ensambles de viales de productos farmacéu-
ticos para TEP. Las condiciones de almacenamiento y el tiempo de ensamble de los viales debe basarse en datos obtenidos de
simulaciones asépticas.
Inoculaciones para Pruebas de Esterilidad-Se deben llevar a cabo pruebas de esterilidad para evaluar la calidad de los productos
farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral. La inoculación de los medios para pruebas de esterilidad se
debe realizar de tal manera que se ajuste a los requisitos de exposición del personal a la radiación, al tiempo que minimice el
riesgo de falsos positivos ocasionados por contaminación adventicia durante el proceso de inoculación. Para tubos de medios
con abertura mediante tapa de rosca, la inoculación se debe realizar en la estación de trabajo aséptica. Los tubos de medios
con una tapa de septo se pueden inocular en un área blindada que no contenga un filtro HEPA.

ESTABILIDAD

Se deben establecer especificaciones escritas para la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento de cada pro-
ducto farmacéutico para TEP. La fecha de caducidad debe basarse en los resultados de las pruebas de estabilidad (y en requisi-
tos de actividad específicos, según corresponda). Las pruebas de estabilidad del producto farmacéutico para TEP se deben lle-
var a cabo a la concentración más alta del producto farmacéutico para TEP y en el vial o envase final previsto. Se deben alma-
cenar por lo menos tres partidas del producto farmacéutico para TEP de acuerdo con las condiciones propuestas y deberán
examinarse una vez transcurrido un periodo equivalente a la vida útil propuesta. Asimismo, el producto farmacéutico para TEP
debe cumplir con los criterios de aceptación para pureza radioquímica, apariencia (color y claridad), pH y efectividad del esta-
bilizante (según corresponda) y pureza química al momento de la caducidad. Los métodos analíticos deben ser confiables, sig-
nificativos y específicos. Los estudios de estabilidad deben repetirse si se presenta un cambio en la concentración, en el conte-
nido de estabilizante (o conservante) que pudiera afectar la estabilidad, el vial o envase final, las condiciones de almacena-
miento o la fecha de caducidad. Se deben documentar los resultados de las pruebas de estabilidad.

CONTROLES Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA PRODUCTOS FARMACÉUTICOS PARA TEP

TERMINADOS

Se deben establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de cada producto farmacéu-
tico para TEP. Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, se deben incluir especificacio-
nes sobre esterilidad y endotoxinas bacterianas.
Se deben desarrollar procedimientos escritos para pruebas de control de calidad. Se deben establecer requisitos sobre con-
trol de calidad y documentación para cada partida o subpartida de un producto farmacéutico para TEP (ver la sección anterior,
Controles de Proceso y Operativos). Todas las pruebas de control de calidad deben ser ejecutadas por personal calificado y capa-
citado de acuerdo con los procedimientos escritos.
La corta vida media de los radionucleidos para TEP con frecuencia impide completar todas las pruebas de control de calidad
antes del envío del producto farmacéutico para TEP, lo que genera dos niveles de liberación, uno para distribución y el otro
para administración en humanos. Lo anterior es aceptable siempre y cuando las pruebas de control de calidad requeridas para
la liberación del producto farmacéutico para TEP para administración en humanos (ver a continuación) se completen antes de
la administración. Los controles usados en la liberación para distribución deberán establecerse previamente por escrito y docu-
mentarse de manera rutinaria. No es necesario conservar muestras de reserva de productos farmacéuticos para TEP.
Cuando se usa un procedimiento farmacopeico de la USP, éste deberá ser verificado para demostrar que la prueba funciona
en las condiciones de uso reales. Los procedimientos de prueba no farmacopeicos usados para analizar un producto farmacéu-
tico para TEP deben ser confiables y específicos. Los datos que respaldan todos los métodos analíticos deben estar documenta-
dos. Algunas pruebas de control de calidad se pueden omitir basándose en datos obtenidos de controles realizados durante el
proceso o de estudios realizados sobre el proceso. Un ejemplo de este tipo de procedimiento es la exención de la determina-
590 <823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicos USP 37

ción de clorodesoxiglucosa cuando se analiza [18 F]fludesoxiglucosa. Se deben documentar los controles durante el proceso y
los datos que respaldan los estudios realizados sobre los procesos.
Pruebas de Control de Calidad: Las siguientes pruebas de control de calidad se deben llevar a cabo en cada partida antes
de su liberación para adminstración:
1. Apariencia mediante inspección visual del color y transparencia (ausencia de partículas) para formas farmacéuticas paren-
terales.
2. Medición del pH para formas farmacéuticas parenterales.
3. Determinación de la pureza radioquímica e identidad para todas las formas farmacéuticas.
4. Determinación de la identidad radionucléidica de todas las formas farmacéuticas por medición de vida media.
5. Determinación de la concentración.
6. Determinación de la actividad específica de productos farmacéuticos para TEP cuya localización sea dependiente de la
masa o cuya toxicidad sea preocupante.
7. Determinación de disolventes residuales usados en los procesos de síntesis o purificación.
8. Determinación de la pureza química y compuestos residuales usados en los procesos de síntesis o purificación (p.ej., el
criptando [2.2.2]).
9. Determinación de conservante o estabilizante, si estuvieran presentes.
Para productos farmacéuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas, preparar una subpartida inicial para control
de calidad que sea representativa de las subpartidas subsiguientes que se preparan en un ciclo operativo definido. Las pruebas
de control de calidad descritas en el párrafo anterior se deben tomar en cuenta para la subpartida de control de calidad antes
de la liberación de subpartidas subsiguientes para administración en humanos. Para partidas subsiguientes de formas farma-
céuticas parenterales y de inhalación, se debe llevar a cabo una inspección visual antes de la administración en humanos. En
algunos casos, puede ser apropiado realizar un análisis limitado de cada subpartida antes de su administración (p.ej., determi-
nación de pH en el caso de [13 N]amoníaco producido por la aleación de Devarda).
Pruebas Periódicas Indicadoras de Calidad: En todos los productos farmacéuticos para TEP, se debe medir periódicamente
la pureza radionucléidica de muestras desintegradas del producto, a fin de evaluar la presencia de radionucleidos de vida larga
producidos durante el bombardeo con el acelerador de partículas. En productos farmacéuticos para TEP marcados con ciertos
radionucleidos (p.ej., 94 mTc, 12 41, 64 Cu, 76Br, entre otros), se deberá considerar la medición de pureza radionucléidica mediante
espectrometría por emisión de rayos gamma. Las pruebas periódicas indicadoras de calidad de productos farmacéuticos para
TEP también incluyen impurezas no tóxicas de bajo nivel (p.ej., disolventes residuales Clase 3). Las pruebas periódicas deben
llevarse a cabo en intervalos predeterminados en lugar de partida por partida.
Pruebas Microbiológicas para Productos Farmacéuticos para TEP Estériles: Para productos farmacéuticos para TEP desti-
nados para administración parenteral, realizar las siguientes pruebas de control de calidad, además de las descritas anterior-
mente:
1. Determinar la integridad del filtro de membrana. Las unidades de filtro usadas para esterilizar productos farmacéuticos
para TEP deben someterse a las pruebas de integridad recomendadas por el fabricante, como por ejemplo, la prueba de
punto de burbuja. La prueba de integridad del filtro se realiza después de completar la filtración y antes de liberar el pro-
ducto farmacéutico para TEP para administración en humanos. En el caso de productos farmacéuticos para TEP con
T112 < 1 O minutos, el producto farmacéutico para TEP se puede liberar para administración en humanos antes de comple-
tar la prueba de integridad del filtro. En este caso, la prueba debe completarse lo más pronto posible, después de la libe-
ración.
2. Efectuar una prueba de endotoxinas bacterianas en cada partida o subpartida de control de calidad de un producto far-
macéutico para TEP. La prueba se puede llevar a cabo usando los procedimientos reconocidos en la USP (ver Prueba de
Endotoxinas Bacterianas <85)). Independientemente de la prueba que se utilice, ésta debe iniciarse antes de la liberación de
cada partida para administración en humanos. Para productos farmacéuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy
cortas, completar la prueba en la subpartida de control de calidad antes de la liberación de subpartidas subsiguientes para
administración en humanos. Luego de haber registrado el éxito de una prueba de endotoxinas bacterianas en un produc-
to farmacéutico para TEP en particular, sólo será necesario analizar la primera partida de cada día para dicho producto.
3. Efectuar una prueba de esterilidad en cada partida o en cada subpartida de control de calidad. La prueba de esterilidad
consiste en la inoculación e incubación de una muestra en cada uno de dos medios: caldo tripticasa de soja y tioglicolato
líquido. El volumen inoculado se puede ajustar para evitar pérdidas excesivas debidas a la prueba de esterilidad (p.ej.,
O, 1 mL inoculados en 1O mL de medio). El periodo de incubación para pruebas de esterilidad debe comenzar dentro de
las 30 horas posteriores a la filtración por membrana. Las muestras se pueden inocular inmediatamente después de com-
pletar la filtración por membrana, o se puede dejar que se deterioren en un área blindada durante un máximo de 30 ho-
ras antes de la inoculación. Se permite exceder el periodo de 30 horas debido a fines de semana o días feriados siempre y
cuando se demuestre que dicha extensión no reduce de manera significativa la viabilidad de un organismo indicador ade-
cuado en la muestra. La prueba de esterilidad se puede llevar a cabo usando otros procedimientos reconocidos en la USP
(ver Pruebas de Esterilidad (71 )). Las muestras deben analizarse individualmente y no se pueden combinar. Una vez que se
haya establecido el registro de una prueba de esterilidad exitosa para un producto farmacéutico para TEP en particular,
sólo será necesario analizar la primera partida preparada cada día para dicho producto farmacéutico para TEP.
Pruebas de Liberación Condicionada Final: Puede ser apropiado liberar condicionalmente una partida cuando no sea posi-
ble completar una prueba de control de calidad requerida para un producto farmacéutico para TEP debido a una falla en el
USP 37 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 591

equipo de análisis. Los productos farmacéuticos para TEP no pueden ser liberados sin determinar su identidad y pureza radio-
químicas. La partida puede liberarse siempre que se cumplan las siguientes condiciones:
1. Revisar los datos históricos de control de calidad para evaluar la frecuencia de resultados fuera de la especificación o fallas
relacionadas con la prueba de control de calidad. La liberación condicionada es apropiada únicamente cuando los datos
históricos develan un registro de culminación exitosa de la prueba de control de calidad.
2. Confirmar que los criterios de aceptación se cumplen para todas las demás pruebas de control de calidad para la partida.
3. Conservar una muestra de la partida que es objeto de liberación condicionada.
4. Corregir lo antes posible la falla del equipo de prueba.
5. Completar la prueba de control de calidad omitida en la muestra lo más pronto posible, después de que se haya corregi-
do la falla. Este último paso no será necesario si el resultado del control de calidad omitido es intrascendente una vez que
el producto farmacéutico para TEP se haya desintegrado.
6. Si la muestra no pasa la prueba de control de calidad omitida, notificar inmediatamente al médico o a la instalación re-
ceptora que ordenó el producto farmacéutico para TEP.
7. Documentar todas las acciones relacionadas con la liberación condicionada del producto farmacéutico para TEP, incluyen-
do la justificación de la liberación, los resultados de la prueba completada, así como cualquier notificación y acción co-
rrectiva y preventiva que haya resultado del incidente.
Además de la prueba de control de calidad terminada, otras determinaciones de laboratorio apropiadas pueden implicar lo
siguiente: análisis durante el proceso de un atributo que sea equivalente al análisis del producto terminado de dicho atributo;
monitoreo estadístico continuo del proceso; o una combinación de estos procedimientos con el análisis concluido de cada pro-
ducto farmacéutico para TEP.

PRODUCTOS FARMACÉUTICOS PARA TEP QUE NO CUMPLEN CON LAS ESPECIFICACIONES

Cuando el resultado de una prueba de control de calidad para un producto farmacéutico para TEP no cumple con los crite-
rios de aceptación establecidos, el resultado se considera fuera de la especificación. Un resultado fuera de la especificación no
necesariamente significa que el producto farmacéutico para TEP es fallido y que debe rechazarse, sino que se debe llevar a
cabo una investigación para resultados fuera de la especificación a fin de determinar si dicho resultado indica una falla real o
un error analítico.
Si la investigación de los resultados fuera de especificación determina que dicho resultado fue ocasionado por un error analí-
tico, se debe invalidar la prueba original. Si hay una impresión de los resultados de la prueba, se debe marcar dicho resultado
impreso como inválido, conservarlo en el registro de partida y repetir la prueba.
Si la investigación de los resultados fuera de especificación determina que dicho resultado fue una falla real, la partida debe-
rá ser rechazada y no se podrá liberar para administración en humanos. Segregar la partida para evitar que sea utilizada. Inves-
tigar todas las fallas y documentar los resultados de acuerdo con los procedimientos escritos. La investigación debe incluir, en-
tre otros elementos, la evaluación de procesos, operaciones y registros de partidas previas, así como quejas y demás fuentes de
información pertinentes. De ser posible, se debe asignar una causa real o probable a la falla, además de documentar las accio-
nes correctivas tomadas como resultado de la investigación. Dependiendo de la naturaleza de la falla, el producto farmacéuti-
co para TEP puede reprocesarse de acuerdo con los procedimientos escritos preestablecidos (ver la sección Reprocesamiento a
continuación).
Cuando una prueba de esterilidad de un producto farmacéutico para TEP presenta señales de crecimiento microbiano, el
resultado de la prueba se considera fuera de especificación, por lo que deberá ser investigado. Una vez completada la investi-
gación, notificar de inmediato a todas las instalaciones receptoras si el producto no cumple con el criterio de esterilidad, inclu-
yendo los hallazgos microbiológicos de la investigación.

REPROCESAMIENTO

Si un producto farmacéutico para TEP es rechazado debido a una falla real, la partida podría reprocesarse de acuerdo con los
procedimientos establecidos. Aunque resulta imposible describir todas las operaciones de reprocesamiento, a continuación se
presentan algunos ejemplos:
• Ajuste de pH;
• Cuando se presente una prueba de integridad del filtro fallida, un segundo pasaje a través de un filtro de membrana; y
• Un segundo pasaje por una columna de purificación para eliminar una impureza.
Cuando se reprocesa un producto farmacéutico para TEP, la partida reprocesada debe someterse a pruebas para asegurar
que cumple con los criterios de aceptación establecidos para el producto farmacéutico para TEP antes de su liberación para
administración en humanos.

ETIQUETADO

La siguiente información debe aparecer en la etiqueta adherida al envase final del producto farmacéutico para TEP:
• El nombre del producto farmacéutico para TEP, incluyendo la forma farmacéutica;
 111

592 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicos USP 37

• El número de partida asignado; y

• Declaraciones o símbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigación clínica, radioactivo).
La siguiente información debe aparecer en el blindaje del producto farmacéutico para TEP:
• El nombre del producto farmacéutico para TEP, incluyendo la forma farmacéutica;
• El número de partida asignado;
• La fecha y hora de la calibración;
• Declaraciones o símbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigación clínica, radioactivo);
•La radioactividad total en MBq (o mCi) o la concentración en MBq/mL (o mCi/mL) al momento de la calibración, según
corresponda;
• Fecha y hora de caducidad;
• Sustancias agregadas (p.ej., ingredientes inactivos del estabilizante);
• El nombre del establecimiento productor donde se fabricó el producto farmacéutico para TEP o el nombre del distribui-
dor;
• Cualquier otra advertencia aplicable (p.ej., "No usar si presenta turbidez o si contiene partículas" o etiquetado para uso
en investigación clínica); y
• Cualquier otra información relevante (si se requiere), como por ejemplo, condiciones de almacenamiento y vida media.

(831) ÍNDICE DE REFRACCIÓN

El índice de refracción (n) de una sustancia es la relación entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz en la
sustancia. Es valioso en la identificación de sustancias y en la detección de impurezas.
La temperatura estándar en las determinaciones farmacopeicas es 25º pero a menudo las especificaciones en las monografías
individuales indican que es necesario calcular el valor del índice de refracción a 20º. Es necesario ajustar y mantener la tempe-
ratura cuidadosamente ya que el índice de refracción varía considerablemente con la temperatura.
Los valores del índice de refracción indicados en esta Farmacopea son para la línea D de sodio (doblete a 589,0 nm y 589,6
nm). La mayoría de los instrumentos disponibles están diseñados para usarse con luz blanca pero están calibrados para expre-
sar el índice de refracción con respecto a la línea D de la luz de sodio.
El refractómetro Abbé mide la gama de índices de refracción de los materiales farmacopeicos para los cuales se indican di-
chos valores. Se pueden utilizar otros refractómetros de igual o mayor precisión.
Para lograr la exactitud teórica de ±0,0001, es necesario calibrar el instrumento contra un estándar suministrado por el fabri-
cante y comprobar con frecuencia el control de temperatura y la limpieza del instrumento mediante la determinación del índi-
ce de refracción de agua destilada, cuyos valores son 1,3330a20ºy1,3325 a 25º.

(841) PESO ESPECÍFICO

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, la determinación del peso específico sólo se aplica a
líquidos y, a menos que se especifique algo diferente, se calcula como el cociente entre el peso de un líquido en el aire a 25º y
el de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Si en la monografía individual se indica una temperatura, el peso
específico es el cociente entre el peso del líquido en el aire a la temperatura indicada y el de un volumen igual de agua a la
misma temperatura. Si la sustancia es un sólido a 25º, determinar el peso específico del material fundido a la temperatura indi-
cada en la monografía individual y referirse al agua a 25º.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, la densidad se define como la masa de una unidad
de volumen de la sustancia a 25º, expresada en kilogramos por metro cúbico o en gramos por centímetro cúbico (1 kg/m 3 =
10-3 g/cm3). Cuando se conoce la densidad, la masa se puede convertir a volumen o viceversa, mediante la fórmula: volumen
= masa/densidad.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l.

MÉTODO 1
Procedimiento-Seleccionar un picnómetro escrupulosamente limpio y seco que haya sido previamente calibrado median-
te la determinación de su peso y el peso de agua recién hervida contenida en él a 25º. Ajustar la temperatura del líquido apro-
ximadamente a 20º y llenar el picnómetro. Ajustar la temperatura del picnómetro lleno a 25º, retirar todo exceso de líquido y
pesar. Cuando la monografía especifique una temperatura diferente a 25º, los picnómetros llenos deben elevarse a la tempera-
tura de la balanza antes de ser pesados. Restar el peso de tara del picnómetro del peso llenado.
USP 37 Pruebas Físicas/ (846) Área Superficial Específica 593

El peso específico del líquido es el cociente que se obtiene al dividir el peso del líquido contenido en el picnómetro por el
peso del agua contenida en éste, ambos determinados a 25º, a menos que en la monografía individual se especifique algo
diferente.

MÉTODO 11

El procedimiento incluye el uso del densímetro transductor oscilante. El aparato consiste en lo siguiente:
• un tubo en forma de U, por lo general de vidrio de borosilicato, que contiene el líquido que se va a examinar;
• un sistema de excitación magnetoeléctrico o piezoeléctrico que hace oscilar al tubo como un oscilador en voladizo a una
frecuencia característica que depende de la densidad del líquido que se va a examinar;
• un medio para determinar el período de oscilación (7), que el aparato puede convertir para arrojar una lectura directa de
densidad o que puede ser utilizado para calcular densidades a través de las constantes A y B descritas más adelante; y
• un medio para determinar y/o controlar la temperatura del transductor oscilante que contenga el líquido que se va a pro-
bar.
El período de oscilación es una función de la constante del resorte (e) y de la masa del sistema:
T2 = {(M/c) + [(p x V)/c]} x 4rrz
en donde pes la densidad del líquido que se va a analizar, Mes la masa del tubo y V es el volumen del tubo lleno.
La introducción de dos constantes A= c/(4rr 2 x V) y B = (M/V), lleva a la ecuación clásica del transductor oscilante:
p=Ax T2-B
El peso específico del líquido se provee mediante la fórmula:

P(t/P!W!
en donde p(L) y P<w! son las densidades del líquido y del agua, respectivamente, ambas determinadas a 25º, a menos que se
especifique algo diferente en la monografía individual.
Calibración-Las constantes A y B se determinan al operar el instrumento con el tubo en forma de U llenado con dos mues-
tras diferentes con densidad conocida (p.ej., agua desgasificada y aire). Llevar a cabo las mediciones de control diariamente
usando agua desgasificada. Los resultados mostrados para la medición de control usando agua desgasificada no se desvían del
valor de referencia (p25 = 0,997043 g/cm 3) más allá del error especificado. La precisión es una función de la capacidad de repe-
tición y de la estabilidad de la frecuencia del oscilador. Los densímetros pueden obtener mediciones con un error del orden de
1xl0-3 g/cm 3 a 1xl0-5 g/cm 3 y una capacidad de repetición de 1xl0-4 g/cm 3 a 1xl0-6 g/cm 3 . Por ejemplo, un instrumento
especificado a ± 1xl0-4 g/cm3 debe mostrar 0,9970 ± 0,0001 g/cm 3 para poder usarse en mediciones posteriores o, de lo con-
trario, necesitará un ajuste. Se debe llevar a cabo la calibración regular con materiales de referencia certificados.
Procedimiento-Seguir las instrucciones del fabricante para llevar a cabo mediciones empleando el mismo procedimiento
utilizado para la Calibración. Si fuera necesario, equilibrar el líquido que será examinado a 25º antes de introducirlo en el tubo
para evitar la formación de burbujas y reducir el tiempo necesario para obtener la medición. Los factores que afectan la preci-
sión incluyen los siguientes:
• uniformidad de la temperatura en todo el tubo,
• falta de linealidad en un rango de densidad,
• efectos resonantes parásitos, y
• viscosidad, si los densímetros transductores oscilantes empleados no proporcionan compensación automática para la in-
fluencia de la viscosidad de la muestra.

(846) ÁREA SUPERFICIAL ESPECÍFICA

INTRODUCCIÓN
El área superficial específica de un polvo se determina mediante la adsorción física de un gas sobre la superficie del sólido,
calculando la cantidad de gas adsorbida que corresponde a una capa monomolecular en la superficie. La adsorción física es el
resultado de fuerzas relativamente débiles (fuerzas de van der Waals) entre las moléculas del gas adsorbato y la superficie ad-
sorbente del polvo de prueba. Generalmente, la determinación se lleva a cabo a la temperatura del nitrógeno líquido. La canti-
dad de gas adsorbido puede medirse por un procedimiento volumétrico o de flujo continuo.
594 (846) Área Superficial Específica / Pruebas Físicas USP 37

TEORÍA DE BRUNAUER, EMMETT Y TELLER (BET) Y DETERMINACIÓN DE ÁREA ESPECÍFICA

Medición de Múltiples Puntos

Los datos se tratan según la ecuación de la isoterma de adsorción de Brunauer, Emmett y Teller (BET):

p = presión parcial de vapor de gas adsorbato en equilibrio con la superficie a 77,4 K (punto de ebullición del nitrógeno líquido),
en Pa,
pº = presión de saturación del gas adsorbato, en Pa;
Vd = volumen de gas adsorbido a temperatura y presión estándar (STP, por sus siglas en inglés) [273, 15 K y presión atmosférica de
(1,01 3 x 1 0 5 Pa)J, en ml;
vm = volumen de gas adsorbido a STP que produce una monocapa aparente en la superficie de la muestra, en ml;
c = una constante adimensionada relacionada con la entalpía de adsorción del gas adsorbato sobre la muestra de polvo.

Se mide un valor de Vª en cada uno de no menos de tres valores de P/P 0 •

Luego, el valor BET

1/[Vª((P )P) - 1)]

se grafica en función de P/P 0 , conforme a la ecuación (1 ). Este gráfico debe producir una línea recta en el intervalo de presión
relativo aproximado de 0,05 a 0,3. Los datos se consideran aceptables si el coeficiente de correlación, r, de la regresión lineal
no es menor de 0,9975; es decir, r2 no es menor de 0,995. A partir de la gráfica lineal resultante, la pendiente, que es igual a
(C - 1)/Vme y la intersección, que es igual a 1/VmC, se evalúan por análisis de regresión lineal. A partir de estos valores, Vm se
calcula como 1 /(pendiente+ intersección), mientras que C se calcula como (pendiente/ intersección) + 1. A partir del valor de Vm
así determinado se calcula el área específica, S, en m 2 • g- 1, por la ecuación:

S = (VmNa)/(m x 22 400) (2)

N = constante de Avogadro (6,022 x 1023 mol-1),

a = área efectiva de sección transversal de una molécula de adsorbato, en nanómetros cuadrados (O, 162 nm 2 para el nitró-
geno y O, 195 nm 2 para el criptón),
m = masa de polvo de prueba, en g
22 400 = volumen, en ml, ocupado por 1 mol de gas adsorbato a STP, admitiendo pequeñas desviaciones del estado ideal.

Es necesario un mínimo de tres datos. Se pueden llevar a cabo mediciones adicionales, especialmente cuando falta linealidad
a un valor P/P 0 cercano a 0,3. Como la no linealidad se obtiene a menudo con valores P/P 0 por debajo de 0,05, no se reco-
miendan los valores en esta región. La prueba de linealidad, el tratamiento de los datos y el cálculo del área superficial específi-
ca de la muestra se han descrito anteriormente.

Medición con un Único Punto

Normalmente se necesitan como mínimo tres mediciones de Vª, cada una a distintos valores de P/P 0 , para determinar el área
superficial específica mediante la técnica de la adsorción de gas por flujo dinámico (Método /)o mediante la técnica volumétri-
ca de adsorción de gas (Método //). Sin embargo, bajo ciertas circunstancias que se describen a continuación, puede ser acep-
table determinar el área superficial específica de un polvo con un único valor de Vª medido a un único valor de P/P 0 como por
ejemplo 0,300 (correspondiente a 0,300 moles de nitrógeno o a una fracción molar de criptón de 0,001038), empleando la
siguiente ecuación para calcular Vm:

Luego se calcula el área superficial específica a partir del valor de Vm con la ecuación (2) indicada anteriormente.
El método de un único punto puede emplearse directamente para una serie de muestras de polvo de un material dado
cuando la constante del material C es mucho mayor que la unidad. Estas circunstancias pueden verificarse por comparación de
los valores de área específica determinados por el método de un único punto con los valores determinados por el método de
puntos múltiples para una serie de muestras de polvo. La semejanza estrecha entre los valores obtenidos con un único punto y
con múltiples puntos sugiere que 1/C se aproxima a cero.
El método de un único punto puede emplearse indirectamente para una serie de muestras de polvo similares de un material
dado cuando la constante del material C no es infinita, pero se puede suponer que no varía. En estas circunstancias, el error
asociado al método de un único punto puede reducirse o eliminarse empleando el método de puntos múltiples para evaluar C
para una de las muestras de las serie a partir del gráfico de BET, en el cual C se calcula como (1 +pendiente/ intersección).
Luego se calcula Vm a partir del valor único de Vª medido a un único valor de P/P 0 , por la ecuación:
USP 37 Pruebas Físicas/ (846) Área Superficial Específica 595

vm = Vd[(PjP) - l] ((1 /C) + ((C - 1 )/C) X (P/Po)l (4)

Luego se calcula el área específica a partir del valor de Vm con la ecuación (2) antedicha.

TÉCNICAS EXPERIMENTALES

Esta sección describe los métodos que se utilizan para la preparación de la muestra, la técnica de adsorción de gas por flujo
dinámico (Método /)y la técnica volumétrica de adsorción de gas (Método //).

Preparación de la Muestra

DESGASIFICACIÓN

Antes de determinar el área superficial específica de la muestra, es necesario eliminar los gases y vapores adsorbidos física-
mente en la superficie después de la fabricación y durante el tratamiento, manipulación y almacenamiento. Si no se logra la
desgasificación, el área superficial específica podría reducirse o variar, puesto que parte de la superficie estaría cubierta con
moléculas de los gases o vapores previamente adsorbidos. Las condiciones de desgasificación son de vital importancia para
obtener la precisión y la exactitud requeridas de las mediciones de área específica de sustancias farmacéuticas debido a la sen-
sibilidad de la superficie de los materiales.
Se debe demostrar que las condiciones de desgasificación proporcionan gráficos BET reproducibles, un peso constante de
polvo de prueba y ningún cambio físico o químico detectable en el polvo de prueba.
Las condiciones de desgasificación definidas por la temperatura, la presión y el tiempo deben elegirse de tal modo que la
superficie original del sólido se reproduzca lo más posible. Con frecuencia, la desgasificación de muchas sustancias se logra
mediante la aplicación de vacío o purgando la muestra en una corriente de un gas no reactivo, seco o aplicando un método
de ciclos de desorción y adsorción. En cualquiera de los casos, algunas veces se aplican temperaturas elevadas para aumentar
la velocidad de eliminación de los contaminantes desde la superficie. Se debe tener cuidado cuando se desgasifiquen muestras
de polvo con temperaturas elevadas, con el fin de evitar la degradación de la muestra.
Si se emplea calor, la temperatura y el tiempo de desgasificación recomendados deben ser tan bajos como sea posible para
lograr mediciones de área superficial específica reproducibles dentro de un plazo aceptable. Para desgasificar muestras sensi-
bles, se pueden emplear otros métodos de desgasificación, tal como el método de los ciclos de desorción y adsorción.

ADSORBATO

La técnica estándar es la adsorción de nitrógeno de calidad analítica a la temperatura del nitrógeno líquido.
Para polvos de área superficial específica pequeña (< 0,2 m 2 g-1 ), la proporción adsorbida es pequeña. En tales casos, se pre-
fiere usar criptón a la temperatura del nitrógeno líquido porque su baja presión de vapor reduce el error en gran medida. El
uso de cantidades mayores de muestra, cuando fuera posible (equivalentes a áreas totales de 1 m 2 o mayores empleando ni-
trógeno), pueden compensar los errores para determinar áreas pequeñas.
Todos los gases empleados deben estar exentos de humedad.

CANTIDAD DE MUESTRA

Medir con exactitud una cantidad de polvo de prueba desgasificado de forma tal que el área de la superficie total sea como
mínimo de 1 m 2 cuando el adsorbato es nitrógeno y de 0,5 m 2 cuando el adsorbato es criptón.
Se pueden emplear cantidades menores de muestra después de la validación correspondiente.

Mediciones

Como la cantidad de gas adsorbido a una presión dada tiende a aumentar cuando disminuye la temperatura, las mediciones
de adsorción por lo general se realizan a temperaturas bajas. Las mediciones se realizan a 77,4 K, el punto de ebullición del
nitrógeno líquido.

Método 1: Método de Flujo Dinámico

PRINCIPIO

En el método de flujo dinámico (ver Figura 1), el gas adsorbato recomendado es criptón o nitrógeno secos, mientras que se
emplea helio como gas diluyente, el cual no se adsorbe bajo las condiciones recomendadas.
Se requiere un mínimo de tres mezclas del gas adsorbato apropiado con helio dentro de un intervalo de P/P entre 0,05 y
0

0,30.
596 (846) Área Superficial Específica / Pruebas Físicas USP 37

El detector de gas-integrador debe proporcionar una señal que sea aproximadamente proporcional al volumen de gas que
lo atraviesa en condiciones definidas de presión y temperatura. Con este fin, entre los distintos tipos de dispositivos adecuados
se cuenta un detector de conductividad térmica con un integrador electrónico. Se determina un mínimo de tres puntos dentro
del intervalo recomendado de 0,05 a 0,30 de P/P 0 •

Aqi;ollas
de sello

\"álYula
de rnntrnl
¡ Difusor
de flujo

tram- Celda de Estación

pa frí muestra de desga-
Contrnlador sificación
de flujo Balastro
diferencial de paso Balastro
corto de paso
Válvula de
..---largo
encendido/
apagado
B Venteo
Entrada
Detector Detector
de Gas

Figura 1 . Diagrama esquemático del aparato para el método por flujo dinámico.

PROCEDIMIENTO

Se hace pasar una mezcla conocida de gases, por lo general nitrógeno y helio, a través de una celda de conductividad térmi-
ca, nuevamente a través de la muestra, a través de la celda de conductividad térmica y posteriormente hasta un potencióme-
tro registrador.
La celda de muestra se sumerge en nitrógeno líquido y la muestra adsorbe nitrógeno de la fase móvil. Esto desequilibra la
celda de conductividad térmica y se genera un pulso en la gráfica del registrador.
Se retira la muestra del refrigerante; esto proporciona un pico de desorción igual en área y en dirección opuesta al pico de
adsorción. Debido a que éste está mejor definido que el pico de adsorción, es el que se emplea para la determinación.
Para efectuar la calibración, se inyecta en el sistema una cantidad conocida de adsorbato, suficiente para proporcionar un
pico de magnitud similar al pico de desorción y se obtiene la proporción de volumen de gas por unidad de área de pico.
Para una determinación en un único punto se emplea una mezcla de nitrógeno y helio; y para la determinación de puntos
múltiples se usan varias mezclas similares o mezclas previas de dos corrientes de gas.
Los cálculos son los mismos que en el método volumétrico.

Método 11: Método Volumétrico

PRINCIPIO

En el método volumétrico (ver Figura 2), el gas adsorbato recomendado es nitrógeno, que puede acceder al espacio vacío
ubicado encima de la muestra de polvo previamente desgasificada para proporcionar una presión de equilibrio definida, P, del
gas. El empleo de un gas diluyente, tal como helio, es por lo tanto innecesario, a pesar de que el helio puede emplearse para
otros fines, como por ejemplo para medir el volumen muerto.
Dado que se emplea solamente gas adsorbato puro, en lugar de una mezcla de gases, al emplear este método se evitan los
efectos de interferencia de la difusión térmica.
USP 37 Pruebas Físicas/ (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz 597

9
A las trampas frías
' bombas de Yacío

Manómetro de
presión de vapor

Figura 2. Diagrama esquemático del aparato para el método volumétrico.

PROCEDIMIENTO

Colocar una cantidad pequeña de nitrógeno seco en el tubo de la muestra para evitar la contaminación de la superficie lim-
pia, retirar el tubo de la muestra, taparlo y pesarlo, y calcular el peso de la muestra. Conectar el tubo de la muestra al aparato
volumétrico. Cuidadosamente aplicar vacío sobre la muestra a la presión especificada (por ejemplo, entre 2 Pa y 1 O Pa). Alter-
nativamente, algunos instrumentos se operan aplicando vacío a una velocidad definida de cambio de presión (por ejemplo,
menos de 13 Pa/30 s) y manteniéndola durante un período de tiempo antes de comenzar el siguiente paso.
Si el principio de operación del instrumento requiere la determinación del volumen muerto en el tubo de la muestra, por
ejemplo, mediante la admisión de un gas no adsorbido, tal como helio, este procedimiento se lleva a cabo en este momento,
seguido de la aplicación de vacío a la muestra. La determinación del volumen muerto se puede evitar usando mediciones dife-
renciales: es decir, por medio de tubos de referencia y de muestra conectados mediante un transductor diferencial. Luego se
mide la adsorción de nitrógeno gaseoso como se describe a continuación.
Elevar el vaso Dewar que contiene nitrógeno líquido a 77,4 K hasta un punto definido en la celda de muestra. Dejar entrar
una cantidad suficiente de gas adsorbato para proporcionar la presión relativa deseada más baja. Medir el volumen adsorbido,
v•. Para mediciones de múltiples puntos, repetir la medición de v. a valores P/P0 sucesivamente mayores. Cuando se utiliza
nitrógeno como gas adsorbato, los valores de P/P 0 de O, 1O; 0,20 y 0,30 son a menudo adecuados.

Materiales de Referencia

Verificar periódicamente el funcionamiento del aparato empleando materiales de referencia apropiados de áreas conocidas
que tengan un área superficial específica similar a la de la muestra que se debe examinar.

(851) ESPECTROFOTOMETRÍA Y DISPERSIÓN DE LUZ

MEDICIONES EN EL ULTRAVIOLETA, VISIBL,E, INFRARROJO, !\BSORCIÓN ATÓMICA,

FLUORESCENCIA, TURBIDIMETRIA, NEFELOMETRIA V RAMAN

La espectrofotometría de absorción es la medición de una interacción entre una radiación electromagnética y las moléculas o
átomos de una sustancia química. Las técnicas que se emplean frecuentemente en el análisis farmacéutico incluyen la espec-
troscopia de absorción atómica, en el espectro UV, en el visible y en el IR. La medición espectrofotométrica en la región visible
anteriormente se denominaba colorimetría; sin embargo, es más preciso emplear el término "colorimetría" sólo en aquellos ca-
sos en que se considera la percepción humana del color.
La Espectrofotometría de Fluorescencia es la medición de la emisión de luz de una sustancia química cuando se expone a la
radiación UV, visible u otra radiación electromagnética. Por lo general, la luz emitida por una solución fluorescente tiene una
intensidad máxima a una longitud de onda mayor que la de la radiación de excitación, por lo general en aproximadamente 20
ó 30 nm.
 111

598 (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz / Pruebas Físicas USP 37

La Dispersión de Luz implica la medición de la luz dispersada debido a inhomogeneidades submicroscópicas de densidad óp-
tica de las soluciones y es útil para la determinación de pesos moleculares promedio de sistemas polidispersos en el intervalo
de pesos moleculares que varían desde 1 000 a varios cientos de millones. Dos de estas técnicas utilizadas en el análisis farma-
céutico son la turbidimetría y la nefelometría.
La Espectroscopia Raman (dispersión de luz inelástica) es un proceso de dispersión de luz en el que la muestra a examinar se
irradia con luz monocromática intensa (generalmente luz láser) y luego se analiza la luz dispersada por la muestra para detec-
tar cambios de frecuencia.
El intervalo de longitud de onda disponible para estas mediciones se extiende desde las longitudes de onda corta del UV
hasta el IR. Por conveniencia, este intervalo espectral está aproximadamente dividido en el UV (190 a 380 nm), el visible (380 a
780 nm), el IR cercano (780 a 3000 nm) y el IR (2,5 a 40 µm o 4000 a 250 cm- 1).

UTILIDAD COMPARATIVA DE INTERVALOS ESPECTRALES

En el caso de muchas sustancias farmacéuticas, las mediciones pueden hacerse con mayor exactitud y sensibilidad en las
regiones del UV y visible del espectro que en las del IR cercano e IR. Cuando se observan soluciones en celdas de 1 cm, las
concentraciones de aproximadamente 1 O µg de muestra por mL a menudo producen absorbancias entre 0,2 y 0,8 en el UV o
la región de luz visible. En el IR e IR cercano, pueden ser necesarias concentraciones de 1 a 1 O mg por mL y de hasta 100 mg
por mL, respectivamente, para que se produzca una absorción suficiente; para estos intervalos espectrales, se utilizan celdas
con longitudes de 0,01 mm a más de 3 mm.
Por lo general, los espectros UV y visible de las sustancias no tienen un alto grado de especificidad. Sin embargo, son muy
apropiados para realizar valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son útiles como medios adicionales de
identificación.
Se ha observado un creciente interés en el uso de la espectroscopia del IR cercano en análisis farmacéuticos, especialmente
para la identificación rápida de un gran número de muestras y también para la determinación del agua.
La región del IR cercano es especialmente apropiada para la determinación de grupos -OH y-NH, como por ejemplo agua
en alcohol, -OH en presencia de aminas, alcoholes en hidrocarburos y aminas primarias y secundarias en presencia de aminas
terciarias.
El espectro IR es único para cualquier compuesto químico dado, con la excepción de los isómeros ópticos que tienen espec-
tros idénticos. Sin embargo, en algunas ocasiones, el polimorfismo puede ser responsable de una diferencia en el espectro IR
de un compuesto en estado sólido. Con frecuencia, pequeñas diferencias en la estructura producen diferencias significativas en
los espectros. Debido al gran número de valores máximos en un espectro de absorción IR, a veces es posible medir cuantitati-
vamente los componentes individuales de una mezcla con una composición cualitativa conocida sin separación previa.
El espectro Raman y el espectro IR proporcionan datos similares, aunque las intensidades de los espectros están gobernadas
por diferentes propiedades moleculares. La espectroscopia Raman y la IR muestran diferentes sensibilidades relativas para dife-
rentes grupos funcionales; por ejemplo, la espectroscopia Raman es particularmente sensible a enlaces múltiples C-S y C-C y
algunos compuestos aromáticos se identifican más fácilmente mediante sus espectros Raman. El agua tiene un espectro de ab-
sorción IR muy intenso, pero un espectro Raman particularmente débil. En consecuencia, el agua tiene únicamente "ventanas"
limitadas en el IR, que se pueden utilizar para examinar solutos acuosos, mientras que su espectro Raman es casi completa-
mente transparente y útil para la identificación de solutos. Las dos limitaciones principales de la espectroscopia Raman son que
la concentración mínima detectable de la muestra generalmente es de 10-1 M a 10- 2 M y que las impurezas presentes en mu-
chas sustancias son fluorescentes e interfieren con la detección de la señal Raman dispersada.
Las mediciones de reflectancia óptica proporcionan información espectral similar a la obtenida por mediciones de transmi-
sión. Dado que las mediciones de reflectancia investigan sólo la composición superficial de la muestra, las dificultades asocia-
das con el espesor óptico y las propiedades de dispersión de luz de la sustancia se eliminan. De esta manera, frecuentemente
es más sencillo realizar mediciones de reflectancia en materiales que absorben intensamente la radiación. Una técnica particu-
larmente común empleada para las mediciones de reflectancia IR se denomina reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas
en inglés), también conocida como reflectancia interna múltiple (MIR, por sus siglas en inglés). En la técnica de ATR, el haz del
espectrómetro IR se hace pasar a través de una ventana construida con un material apropiado para la radiación IR (por ejem-
plo, KRS-5, una mezcla eutéctica de TIBr-Tll), que está cortado con un ángulo tal que el haz IR atraviesa la primera superficie
de la ventana (frente) pero se refleja totalmente cuando incide en la segunda superficie (posterior); es decir, el ángulo de inci-
dencia de la radiación sobre la segunda superficie de la ventana excede el ángulo crítico para ese material. Mediante la cons-
trucción de ventanas adecuadas es posible obtener muchas reflexiones internas del haz IR antes de que éste se transmita fuera
de la ventana. Si una muestra se coloca en contacto con la ventana a lo largo de los lados que reflejan totalmente el haz IR, la
intensidad de la radiación reflejada se reduce con cada longitud de onda (frecuencia) que absorbe la muestra. De este modo,
la técnica de ATR proporciona un espectro de reflectancia que se ha incrementado en intensidad, en comparación con una
medición de reflectancia sencilla, el número de veces que el haz IR se refleja dentro de la ventana. La técnica de ATR propor-
ciona una sensibilidad excelente, pero produce mala reproducibilidad y no es una técnica cuantitativa confiable a menos que
cada muestra de prueba se mezcle muy bien con un estándar interno.
La Espectrofotometría de Fluorescencia es a menudo más sensible que la espectrofotometría de absorción. En mediciones de
absorción, se compara la transmitancia de la muestra con la de un blanco y a concentraciones bajas, ambas soluciones propor-
cionan señales altas. Por el contrario, en la espectrofotometría de fluorescencia, el blanco de disolvente tiene emisiones bajas
USP 37 Pruebas Físicas / (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz 599

en vez de altas, de manera que la radiación de fondo, que puede interferir con las determinaciones a concentraciones bajas, es
mucho menor. Debido a que pocos compuestos pueden determinarse de manera conveniente mediante absorción de luz a
concentraciones por debajo de 1 O 5 M, no es inusual emplear concentraciones de 1 O / M a 1 O 8 M en la espectrofotometría de
fluorescencia.

TEORÍA Y DEFINICIONES

La potencia de un haz de luz radiante disminuye en relación con la distancia que recorre en un medio de absorción. Tam-
bién disminuye en relación a la concentración de moléculas o iones absorbentes con los que se encuentra en ese medio. Estos
dos factores determinan la proporción de la energía incidente total que emerge. La disminución de la potencia de una radia-
ción monocromática que atraviesa un medio de absorción homogéneo se determina cuantitativamente mediante la ley de
Beer, log 10 (1 /T) =A= abe, en donde los términos son los definidos a continuación.
Absorbancia [Símbolo: A]-Es el logaritmo, en base 1 O, del recíproco de la transmitancia (T). [NOTA-Los términos descrip-
tivos empleados anteriormente incluyen densidad óptica, absorbencia y extinción.]
Absortividad [Símbolo: a]-Es el cociente de la absorbancia (A) dividido por el producto de la concentración de la sustan-
cia (e), expresada en g por L, y la longitud de paso de absorción (b) en cm. [NOTA-No debe confundirse con el índice de
absorbancia, la extinción específica o el coeficiente de extinción.]
Absortividad Molar [Símbolo: E]-Es el cociente de la absorbancia (A) dividido por el producto de la concentración de la
sustancia, expresado en moles por L y la longitud de paso de absorción en cm. También es el producto entre la absortividad (a)
y el peso molecular de la sustancia. [NOTA-Los términos empleados anteriormente incluyen el índice de absorbancia molar, el
coeficiente de extinción molar y el coeficiente de absorción molar.]
Para la mayoría de los sistemas empleados en espectrofotometría de absorción, la absortividad de una sustancia es una cons-
tante independiente de la intensidad de la radiación incidente, la longitud interna de las celdas y la concentración, por lo cual
la concentración puede determinarse fotométricamente.
La ley de Beer no da indicaciones del efecto de la temperatura, la longitud de onda o el tipo de disolvente. Para la mayoría
de los trabajos analíticos, los efectos de la variación normal de la temperatura son inapreciables.
Las desviaciones de la ley de Beer pueden ser causadas por variables químicas o instrumentales. Una falla aparente de la ley
de Beer puede ser el resultado de un cambio de concentración en las moléculas de soluto debido a la asociación entre las mo-
léculas de soluto o entre el soluto y las moléculas del disolvente, o debido a disociación o ionización. Otras desviaciones pue-
den estar causadas por efectos instrumentales, como por ejemplo la radiación policromática, los efectos de ancho de rendija o
de luz espuria.
Incluso a una temperatura fija en un disolvente dado, es posible que la absortividad no sea verdaderamente constante. Sin
embargo, en el caso de muestras que tienen un solo componente absorbente, no es necesario que el sistema de absorción se
ajuste a la ley de Beer para utilizarlo en análisis cuantitativos. La concentración de una sustancia desconocida se puede deter-
minar mediante la comparación con una curva estándar determinada experimentalmente.
Aunque, en el sentido más estricto, la ley de Beer no es aplicable en la espectrofotometría de absorción atómica debido a la
falta de propiedades cuantitativas de la longitud de la celda y la concentración, el proceso de absorción que tiene lugar en la
llama bajo condiciones de aspiración reproducibles, en principio, se ajusta a la relación de Beer. Específicamente, el logaritmo
negativo de la transmitancia, o de la absorbancia, es directamente proporcional al coeficiente de absorción y, por consiguien-
te, es proporcional al número de átomos absorbentes. Sobre esta base, pueden elaborarse curvas de calibración para permitir
la evaluación de valores de absorción desconocidos en función de la concentración del elemento en solución.
Espectro de Absorción-Es una representación gráfica de la absorbancia, o cualquier función de absorbancia, en función
de la longitud de onda o a una función de la longitud de onda.
Transmitancia [Símbolo: n-Es el cociente entre la potencia radiante transmitida por una muestra y la potencia radiante
incidente sobre la muestra. [NOTA-Los términos empleados anteriormente incluyen la transmitancia y la transmisión.]
Intensidad de Fluorescencia [Símbolo: n-Es una expresión empírica de la actividad fluorescente, comúnmente expresada
en función de unidades arbitrarias proporcionales a la respuesta del detector. El espectro de emisión de fluorescencia es una re-
presentación gráfica de la distribución espectral de la radiación emitida por una sustancia activada, que muestra la intensidad
de la radiación emitida como la ordenada y la longitud de onda como la abscisa. El espectro de excitación de fluorescencia es
una representación gráfica del espectro de activación, que muestra la intensidad de la radiación emitida por una sustancia acti-
vada como la ordenada y la longitud de onda de la radiación incidente (activante) como la abscisa. Como en la espectrofoto-
metría de absorción, las regiones importantes del espectro electromagnético abarcadas por la fluorescencia de compuestos or-
gánicos son el UV, el visible y el IR cercano; es decir, la región de 250 a 800 nm. Después de que una molécula ha absorbido
radiación, la energía puede perderse como calor o puede liberarse en forma de radiación de la misma longitud de onda que la
absorbida o mayor. Tanto la absorción como la emisión de radiación se deben a las transiciones de electrones entre diferentes
niveles de energía, u orbitales, de la molécula. Existe una demora de tiempo entre la absorción y la emisión de luz; este inter-
valo, la duración del estado de excitación, se ha medido y dura aproximadamente de 1 0- 9 segundos a 1 O 8 segundos para la
mayoría de las soluciones fluorescentes orgánicas. La corta vida de la fluorescencia distingue este tipo de luminiscencia de la
fosforescencia, que es una posluminiscencia que excede el tiempo de excitación y que puede durar de 1 O 3 segundos hasta
varios minutos.
600 (851 ) Espectrofotometría y Dispersión de Luz / Pruebas Físicas USP 37

Turbidancia [Símbolo: 5]-Es el efecto de dispersión de luz causado por partículas en suspensión. La cantidad de materia
en suspensión se puede medir mediante la observación de la luz transmitida (turbidimetría) o de la luz dispersada (nefelome-
tría).
Turbidez [Símbolo: t]-En mediciones de dispersión de luz, la turbidez es la medida de la disminución de intensidad del
haz incidente por unidad de longitud de una suspensión dada.
Actividad Dispersante Raman-Es la propiedad molecular (expresada en unidades de cm 4 por g) que gobierna la intensi-
dad de una banda observada en el espectro Raman para una muestra orientada aleatoriamente. La actividad dispersante se
determina a partir de la derivada de la polarizabilidad molecular en lo que se refiere al movimiento molecular que eleva la
banda desplazada de Raman. En general, la intensidad de la banda Raman es linealmente proporcional a la concentración del
analito.

USO DE ESTÁNDARES DE REFERENCIA

Con pocas excepciones, las pruebas y valoraciones espectrofotométricas Farmacopeicas requieren una comparación con un
Estándar de Referencia USP. Esto tiene como propósito asegurar la medición en condiciones idénticas para la muestra de prue-
ba y la sustancia de referencia. Estas condiciones incluyen el ajuste de la longitud de onda, el ajuste del ancho de rendija, la
ubicación y corrección de las celdas y los niveles de transmitancia. Debe observarse que las celdas que presentan una transmi-
tancia idéntica a una longitud de onda dada pueden diferir considerablemente en transmitancia a otras longitudes de onda.
Cuando sea necesario, se deben establecer y emplear correcciones apropiadas para las celdas.
Las expresiones "preparación similar" y "solución similar," tal como se emplean en las pruebas y valoraciones relacionadas
con la espectrofotometría, indican que la muestra de referencia, generalmente un Estándar de Referencia USP, debe prepararse
y observarse de manera idéntica, para todos los propósitos prácticos, a la que se emplee para la muestra de prueba. General-
mente, al preparar la solución del Estándar de Referencia especificado, se prepara una solución de aproximadamente la con-
centración deseada (por ejemplo, con una aproximación del 10%) y se calcula la absortividad con respecto a la cantidad de
sustancia exactamente pesada; si no se ha utilizado un Estándar de Referencia previamente secado, la absortividad se calcula
con respecto a la sustancia anhidra.
Las expresiones, "determinar concomitantemente" y "medido concomitantemente," tal como se emplean en las pruebas y
valoraciones relacionadas con la espectrofotometría, indican que las absorbancias de la solución que contiene la muestra de
prueba y la solución que contiene la muestra de referencia, en relación con el blanco especificado en la prueba, se medirán en
sucesión inmediata.

APARATOS

Están disponibles muchos tipos de espectrofotómetros. Fundamentalmente, la mayoría de ellos, excepto los empleados para
espectrofotometría IR, proporcionan un pasaje de energía radiante esencialmente monocromática a través de una muestra en
forma adecuada y una medición de la fracción de la intensidad que se transmite. Los espectrofotómetros IR por transformada
de Fourier emplean una técnica interferométrica mediante la cual la radiación policromática pasa a través del analito y llega a
un detector que genera datos de intensidad en función del tiempo. Los espectrofotómetros UV, visibles e IR dispersivos com-
prenden una fuente de energía, un dispositivo de dispersión (por ejemplo, un prisma o red de difracción), ranuras para selec-
cionar la banda de longitud de onda, una celda o un soporte para la muestra de prueba, un detector de energía radiante,
amplificadores asociados y dispositivos de medición. En los espectrofotómetros con red de diodos, la energía de la fuente atra-
viesa la muestra de prueba y luego se dispersa a través de un retículo, incidiendo sobre varios cientos de diodos sensibles a la
luz y cada uno de estos diodos genera a su vez una señal proporcional al número de fotones dentro de un pequeño intervalo
de longitudes de onda. Luego, estas señales pueden ser computadas a intervalos de tiempo cortos, seleccionados para obtener
un espectro completo. Los sistemas IR por transformada de Fourier utilizan un interferómetro en lugar de un dispositivo de
dispersión y una computadora digital para procesar los datos del espectro. Algunos instrumentos se operan manualmente,
mientras que otros proporcionan un registro automático y continuo. Los instrumentos que están conectados por interfaz a una
computadora digital también tienen la capacidad de combinar y almacenar espectros, permitiendo la comparación de espec-
tros y la realización de técnicas de espectroscopia diferencial (con el uso de un método de substracción digital de absorban-
cia).
Existen instrumentos disponibles que se pueden utilizar en la región visible del espectro; en las regiones visible y UV del es-
pectro; en las regiones visible, UV e IR cercano del espectro; y en las regiones IR del espectro. La elección del tipo de análisis
espectrofotométrico y del instrumento a emplear dependerá de factores tales como la composición y cantidad de la muestra
de prueba disponible, el grado de exactitud, sensibilidad y selectividad deseado y la manera en la que se manipula la muestra.
Los aparatos empleados en espectrofotometría de absorción atómica tienen varias características exclusivas. Para cada ele-
mento a determinar, debe seleccionarse una fuente específica que emita la línea espectral a ser absorbida. La fuente es gene-
ralmente una lámpara de cátodo hueco y el cátodo de esta lámpara está diseñado para emitir la radiación deseada cuando se
lo excita. Dado que la radiación a ser absorbida por el elemento de la muestra de prueba tiene generalmente la misma longi-
tud de onda que la línea de emisión, el elemento de la lámpara de cátodo hueco será el mismo elemento que se desea deter-
minar. El aparato está equipado con un aspirador para introducir la muestra de prueba en una llama que generalmente está
generada por una mezcla de aire-acetileno, aire-hidrógeno o en el caso de materiales refractarios, óxido nitroso-acetileno. La
USP 37 Pruebas Físicas/ \851 > Espectrofotornetría y Dispersió11 de Luz 601

llama, en efecto, es una cámara de calentamiento para la muestra. Se emplea un detector para leer la serial ele IJ camara. l_a
radiación interferente producida por la llama durante la combustión puede ser anulada mediante el uso de u11a lámpara que
emita una señal intermitente a una frecuencia definida. El detector debe ajustarse a e-,ta frecuencia de corriente alterna de ma-
nera que la señal de corriente continua que surge de la llama se ignore. El sistema de detección, en consecuencia, lee sólo el
cambio en la señal de la fuente de cátodo hueco, que es directamente proporcional al número de átomos a determinar en la
muestra de prueba. Para los fines Farmacopeicos, generalmente se necesita un aparato que proporcione las lecturas directa-
mente en unidades de absorbancia. Sin embargo, los instrumentos que proporcionan lecturas en porcentajes de transmisión,
porcentaje de absorción o concentración pueden emplearse si las fórmulas de cálculo proporcionadas en las monografías indi-
viduales se revisan, en la medida que sea necesario, para producir los resultados cuantitativos requeridos. El porcentaje de ab-
sorción o el porcentaje de transmitancia pueden convertirse en absorbancia, A, mediante las dos ecuaciones siguientes:
A= 2 - log 10 (100 - % absorción)

o:
A= 2 - log 10 (% transmitancia)

Dependiendo del tipo de aparatos que se empleen, el dispositivo de lectura puede ser un medidor, un contador digital, un
registrador o una impresora. Existen en el comercio instrumentos de haz simple y de haz doble y cualquiera de los dos tipos es
adecuado.
La medición de intensidad de fluorescencia puede hacerse con un simple fluorómetro de filtro. Este instrumento consta de
una fuente de radiación, un filtro primario, una cámara para muestras, un filtro secundario y un sistema de detección de fluo-
rescencia. En la mayoría de estos fluorómetros, el detector se coloca en un eje a 90º con respecto al haz de excitación. Esta
geometría de ángulo recto permite que la radiación excitante pase a través de la muestra de prueba y no contamine la señal
de salida recibida por el detector de fluorescencia. Sin embargo, el detector recibe inevitablemente algo de la radiación de
excitación como resultado de las propiedades de dispersión inherentes a las soluciones, o si están presentes, polvo u otros sóli-
dos. Se utilizan filtros para eliminar esta dispersión residual. El filtro primario selecciona la radiación de longitud de onda corta
capaz de excitar la muestra de prueba, mientras que el filtro secundario es normalmente un filtro de corte agudo que permite
que la fluorescencia de longitud de onda más larga se transmita pero que bloquea la excitación dispersada.
La mayoría de los fluorómetros emplean tubos fotomultiplicadores como detectores; están disponibles diferentes tipos de
estos fluorómetros, cada uno con características especiales en lo que se refiere a la región espectral de máxima sensibilidad,
ganancia y ruido eléctrico. La fotocorriente se amplifica y se lee en un medidor o registrador.
La diferencia entre un espectrofluorómetro y un fluorómetro de filtro es que en el espectrofluorómetro los filtros son reempla-
zados por monocromadores, ya sea un prisma o una red de difracción. Para fines analíticos, el espectrofluorómetro es superior
al fluorómetro de filtro en lo que respecta a la selectividad de la longitud de onda, flexibilidad y conveniencia, de la misma
manera en que un espectrofotómetro es superior a un fotómetro de filtro.
Se dispone de muchas fuentes de radiación. Las lámparas de mercurio son relativamente estables y emiten energía principal-
mente a longitudes de onda discretas. Las lámparas de tungsteno proporcionan energía continua en la región visible. La lám-
para de arco de xenón de alta presión a menudo se emplea en espectrofluorómetros porque es una fuente de alta intensidad
que emite energía continua desde el UV al IR.
En los espectrofluorómetros, los monocromadores están equipados con ranuras. Una ranura estrecha proporciona alta reso-
lución y pureza espectral, mientras que una ranura grande proporciona alta sensibilidad en detrimento de los parámetros ante-
riores. La elección de la dimensión de la ranura se determina por la separación entre la longitud de onda de excitación y la
longitud de onda de emisión, así como por el grado de sensibilidad necesario.
Las celdas para muestras que se emplean en mediciones de fluorescencia pueden ser tubos circulares o celdas rectangulares
similares a las utilizadas en espectrofotometría de absorción, excepto que en este caso se pulen las cuatro caras verticales. El
tamaño de muestra de prueba adecuado para la medición es de 2 a 3 mL, pero algunos instrumentos pueden equiparse con
celdas pequeñas que contienen de 1 00 a 300µL o con un soporte capilar que requiere una cantidad aún más pequeña de
muestra.
Existen instrumentos para la medición de la dispersión de luz y por lo general consisten en una lámpara de mercurio con
filtros para las líneas espectrales verdes o azules fuertes, un obturador, un conjunto de filtros neutros con transmitancia conoci-
da y un fotomultiplicador sensible, montado en un brazo que puede rotarse alrededor de la celda con la solución y fijarse en
cualquier ángulo de -135º a Oº a+ 135º mediante un comando exterior al receptáculo hermético. Las celdas para la solución
son de diversas formas: cuadradas para mediciones de dispersión a 90º; semioctagonales para mediciones de dispersión a 45º,
90º y 1 35º y cilíndricas para mediciones de dispersión en todos los ángulos. Dado que la determinación del peso molecular
requiere una medida precisa de la diferencia de índice de refracción entre la solución y el solvente [(n - n0 )/c], se necesita un
segundo instrumento, un refractómetro diferencial, para medir esta pequeña diferencia.
Los espectrómetros Raman incluyen los siguientes componentes principales: una fuente de radiación monocromática intensa
(invariablemente un rayo láser); un sistema óptico para recoger la luz dispersada por la muestra de prueba; un monocromador
(doble) para disipar la luz dispersada y rechazar la frecuencia incidente intensa; y un sistema apropiado para la detección y
amplificación de luz. La medición Raman es sencilla ya que la mayor parte de las muestras se examinan directamente en capi-
lares para punto de fusión. Debido a que la fuente láser puede concentrarse en un punto, se necesitan solamente unos pocos
microlitros de muestra.
602 (851 > Espectrofotometría y Dispersión de Luz / Pruebas Físicas USP 37

PROCEDIMIENTO

Espectrofotometría de Absorción

Los fabricantes proporcionan instrucciones detalladas para operar los espectrofotómetros. Para lograr resultados significati-
vos y válidos, el operador de un espectrofotómetro debe conocer los límites de éste y las fuentes potenciales de error y varia-
ción. El manual de instrucciones debe seguirse con suma atención en lo que se refiere al cuidado, limpieza y calibración del
instrumento y las técnicas de manipulación de las celdas de absorción, así como también las instrucciones para la operación.
Se debe poner un énfasis especial en los siguientes puntos.
Controlar la exactitud de la calibración del instrumento. Cuando se emplee una fuente de energía radiante continua, se de-
be prestar atención tanto a la longitud de onda como a la escala fotométrica; en el caso de que se emplee una fuente con una
línea espectral, sólo se necesitará controlar la escala fotométrica. Hay varias fuentes de energía radiante que tienen líneas es-
pectrales de intensidad adecuada, espaciadas apropiadamente en todo el intervalo espectral seleccionado. La mejor fuente de
espectros de calibración de UV y visible es el arco de cuarzo-mercurio, del cual pueden emplearse las líneas a 253,7; 302,25;
313,16; 334, l 5; 365,48; 404,66 y 435,83 nm. El arco de vidrio-mercurio es igualmente útil por encima de 300 nm. También
se pueden emplear las líneas a 486, 1 3 nm y 656,28 nm de una lámpara de descarga de hidrógeno. La escala de longitud de
onda puede calibrarse también a través de filtros de vidrio apropiados, que tengan bandas de absorción útiles a través de las
regiones visible y UV. Se han empleado ampliamente vidrios estándar que contienen didimio (una mezcla de praseodimio y
neodimio), a pesar de que los vidrios que contienen holmio se consideran superiores. Recientemente, la solución de óxido de
holmio estándar ha reemplazado el empleo del vidrio con holmio. 1 Las escalas de longitud de onda de los espectrofotómetros
IR e IR cercano se controlan fácilmente mediante el uso de bandas de absorción proporcionadas por películas de poliestireno,
dióxido de carbono, vapor de agua o amoníaco gaseoso.
Para verificar la escala fotométrica se encuentran disponibles diferentes filtros de vidrio inorgánico estándar, así como solu-
ciones estándar de transmitancias conocidas, como por ejemplo el dicromato de potasio. 2
Por lo general, las mediciones cuantitativas de absorbancias se realizan en soluciones de la sustancia colocadas en celdas pa-
ra contener líquidos. Como el disolvente y la ventana de la celda absorben luz, debe hacerse un ajuste para compensar esta
contribución a la absorbancia medida. Comercialmente se pueden obtener celdas iguales para comparación para espectrofoto-
metría UV y visible, para las cuales no se necesita ninguna corrección de celda. Sin embargo, en los procedimientos con espec-
trofotometría IR, por lo general se deben realizar correcciones por causa de las diferencias de los valores de las celdas. En tales
casos, se llenan pares de celdas con el disolvente seleccionado y se determina la diferencia en sus absorbancias a la longitud de
onda seleccionada. La celda que presenta una mayor absorbancia se emplea para la solución de la muestra de prueba y la
absorbancia medida se corrige restando la diferencia entre las celdas.
Esta corrección no es necesaria cuando se usa un sistema IR por transformada de Fourier computarizado, ya que la misma
celda puede emplearse tanto para el blanco de disolvente como para la solución de prueba. Sin embargo, es necesario asegu-
rarse de que las propiedades de transmisión de la celda sean constantes.
Una muestra de prueba se podrá comparar mejor con un Estándar de Referencia en un pico de absorción espectral para el
compuesto relevante. Las valoraciones que prescriben el uso de espectrofotometría proporcionan la longitud de onda común-
mente aceptada para los picos de absorción espectral de la sustancia en cuestión. Se sabe que diferentes espectrofotómetros
pueden mostrar una variación pequeña en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prácticas requieren que las
comparaciones se lleven a cabo a la longitud de onda en la que ocurra un pico de absorción. Si esto difiriere en más de ± 1 nm
de la longitud de onda especificada en la monografía individual, se puede requerir la recalibración del instrumento.

PREPARACIÓN DE PRUEBA

En las determinaciones que utilizan espectrofotometría UV o visible, la muestra usualmente se disuelve en un disolvente. A
menos que se indique otra cosa en la monografía, las determinaciones se hacen a temperatura ambiente empleando una lon-
gitud de paso de 1 cm. Hay muchos disolventes apropiados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloroformo, hi-
drocarburos de cadena corta, éteres y soluciones diluidas de ácidos y álcalis fuertes. Se deben tomar precauciones para utilizar
disolventes libres de contaminantes que absorban en la región espectral que se utiliza. Por lo general, es aconsejable emplear
como disolvente metanol o alcohol libre de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adición de metanol pero que no con-
tenga benceno u otras impurezas que interfieran con la prueba. Existen en el comercio disolventes de calidad espectrofotomé-
trica especial que garantizan la ausencia de contaminantes. Otros disolventes orgánicos de grado reactivo analítico pueden
contener trazas de impurezas que tienen alto grado de absorción en la región UV. Deberá verificarse la transparencia de lotes
nuevos de estos disolventes y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparación de la solución de
prueba, la solución estándar y el blanco.

1 National lnstitute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg, MD 20899: "Spectral Transmittance Characteristics of Holmium Oxide in Perchloric Acid,"
}. Res. Natf. Bur. Stds. 90, No. 2; 115 (1985). Se debe verificar el rendimiento de un filtro no certificado por comparación con un estándar certificado.
2 Para más detalles referentes a la verificación de la escala fotométrica de un espectrofotómetro, consultar las siguientes publicaciones del NIST: }. Res. Naft. Bur.
Stds. 76A, 469 (1972) [re: SRM 931, "Liquid Absorbance Standards for UV and Visible Spectrophotometry" y también la información referente a los patrones de
croma to de potasio y dicromato de potasio]; NIST Spec. Pub/. 260-116 (1994) [re: SRM 930 and SRM 1930, "Glass Filters for Spectrophotometry".
USP 37 Pruebas Físicas/ (851 > Espectrofotometría y Dispersión de Luz 603

Ningún disolvente con un espesor apreciable es completamente transparente en todo el espectro IR cercano e IR. El tetraclo-
ruro de carbono (hasta 5 mm de espesor) es prácticamente transparente a 6 ~tm (1666 cm- 1). El disulfuro de carbono (1 mm
de espesor) es adecuado como disolvente a 40 µm (250 cm- 1 ) con la excepción de la región de 4,2 ~tm a 5,0-~tm (2381 cm- 1 a
2000 cm- 1) y de la región de 5,5 µm a 7,5 µm (1819 cm- 1 a 1 333 cm- 1 ), donde presenta una fuerte absorción. Otros disolven-
tes tienen regiones relativamente estrechas de transparencia. Otra condición adicional para que un disolvente se considere
apropiado para espectrofotometría IR es que no debe afectar el material del que está hecha la celda (generalmente cloruro de
sodio). La muestra de prueba también se puede preparar dispersando en aceite mineral la muestra sólida reducida a polvo fino
o mezclándola muy bien con una sal de haluro alcalino previamente secada (por lo general bromuro de potasio). Las mezclas
con sales de haluros alcalinos pueden examinarse directamente o como discos transparentes o perlas obtenidos mediante la
compresión de dichas mezclas en una matriz. Las condiciones de secado típicas para el bromuro de potasio son 105º al vacío
durante 12 horas, aunque existen grados comercialmente disponibles que no requieren secado. Es preferible la microscopía de
infrarrojo o una dispersión en aceite mineral cuando haya una desproporción entre el haluro alcalino y la muestra de prueba.
En el caso de materiales adecuados, la muestra de prueba se puede preparar pura como una muestra delgada para microsco-
pía IR o puede suspenderse pura como una película delgada para dispersión en aceite mineral. La mayoría de los disolventes
más comunes son apropiados para la espectrometría Raman, en la cual pueden emplearse celdas normales de vidrio (no fluo-
rescente). La región IR del espectro electromagnético se extiende desde 0,8 hasta 400 µm. La región de 800 a 2500 nm (0,8 a
2,5µm) se considera generalmente como la región IR cercano (NIR, por sus siglas en inglés); la región de 2,5 a 25 µm, (4000 a
400 cm- 1) se considera generalmente como la región intermedia (mid-IR, por sus siglas en inglés); y la región de 25 a 400 µm
es considerada la región de IR lejano (FIR, por sus siglas en inglés). A menos que se indique otra cosa en la monografía indivi-
dual, se debe utilizar la región de 3800 a 650 cm- 1 (2,6 a 15 µm) para asegurar el cumplimiento con las especificaciones de la
monografía para absorción IR.
Cuando se proporcionan los valores de los picos del espectro IR en una monografía individual, las letras s, m y w significan
absorción fuerte, mediana y débil, respectivamente; sh significa un hombro, bd significa una banda y v significa "muy". Los
valores pueden variar tanto como O, 1 µm o 1Ocm- 1 , según el instrumento específico empleado. El polimorfismo aumenta las
variaciones en los espectros IR de muchos compuestos en estado sólido. En consecuencia, cuando se realicen pruebas de ab-
sorción IR, si aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del estándar, disolver en volúmenes iguales de un disol-
vente apropiado porciones iguales de la sustancia en análisis y del estándar, evaporar las soluciones hasta sequedad en envases
similares bajo condiciones idénticas y repetir la prueba con los residuos.
En la espectroscopía NIR la mayor parte del interés actual está centrado en la facilidad del análisis. Se pueden analizar mues-
tras en polvo o, mediante técnicas de reflectancia, con poca o ninguna preparación. El cumplimiento de las especificaciones
internas del laboratorio puede determinarse mediante una comparación computarizada de los espectros previamente obteni-
dos a partir de materiales de referencia. Muchos de los materiales farmacéuticos muestran poca absortividad en esta región del
espectro, lo que permite que la radiación del IR cercano incidente penetre las muestras más profundamente que la radiación
UV, visible o IR. La espectrofotometría NIR se puede emplear para observar modificaciones en las matrices y con una calibra-
ción apropiada se puede usar en análisis cuantitativos.
En la espectrofotometría de absorción atómica se debe prestar especial atención a la naturaleza del disolvente y la concen-
tración de sólidos. Un disolvente ideal es aquel que interfiere en grado mínimo en la absorción o en los procesos de emisión y
que produce átomos neutros en la llama. Si hay una diferencia significativa entre la tensión en la superficie o la viscosidad de la
solución de prueba y la solución estándar, las soluciones se aspiran o atomizan a velocidades diferentes, lo que causa diferen-
cias significativas en las señales generadas. La concentración de ácidos de las soluciones también afecta a los procesos de ab-
sorción. Así, los disolventes empleados en la preparación de la muestra de prueba y el estándar deben ser los mismos, o tan
parecidos como sea posible, y deben producir soluciones que se aspiren fácilmente a través del tubo de muestra del mechero-
aspirador. Dado que los sólidos no disueltos presentes en las soluciones pueden producir interferencias de matriz o de volu-
men, el contenido total de los sólidos no disueltos en todas las soluciones debe mantenerse, en lo posible, debajo de 2%.

CÁLCULOS

Por lo general, la aplicación de la espectrofotometría de absorción en una valoración o una prueba requiere el uso de un
Estándar de Referencia. Cuando tal medición se especifica en una valoración, se proporciona una fórmula para permitir el cál-
culo del resultado deseado. Con frecuencia, se incluye en la fórmula una constante numérica. La siguiente derivación se pro-
porciona para introducir un enfoque lógico a la deducción de las constantes que aparecen en las fórmulas en las valoraciones
de muchas monografías.
La ley de Beer es válida para las soluciones tanto del Estándar de Referencia (S) como de la muestra de prueba (U):

As= abCs (1)

Au = abCu (2)

en donde As es la absorbancia de la Solución estándar de concentración Cs.: y Au es la absorbancia de la solución de la muestra

de prueba de concentración Cu. Si Cs y Cu se expresan en las mismas unidades y las absorbancias de ambas soluciones se mi-
den en celdas iguales que tienen las mismas dimensiones, la absortividad, a, y el espesor de la celda, b, son iguales; entonces,
las dos ecuaciones pueden combinarse y volver a enunciarse para hallar el valor de Cu:
604 (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz / Pruebas Físicas USP 37

La cantidad de la muestra de prueba sólida que se debe tomar para el análisis se especifica generalmente en mg. En la valo-
ración se proporcionan instrucciones para la dilución y, como se utilizan soluciones diluidas para las mediciones de absorban-
cia, por lo general las concentraciones se expresan por conveniencia en unidades de µg por ml. Si se toma una cantidad, en
mg, de una muestra de prueba de un fármaco o una forma farmacéutica sólida para su análisis, se entiende que un volumen
(Vu), en L, de una solución de concentración Cu se puede preparar a partir de la cantidad de muestra de prueba que contiene
una cantidad Wu, en mg, del fármaco [NOTA-Cu es numéricamente igual, ya sea que se exprese como µg por mL o mg por
L], de manera que:

La forma en la cual la fórmula aparece en la valoración en una monografía para un artículo sólido se puede derivar mediante
la sustitución de Cu de la ecuación (3) en la ecuación (4). En resumen, el uso de la ecuación (4), considerando debidamente
cualquier conversión de unidades necesaria para lograr la igualdad en la ecuación (5), permite calcular el factor constante (Vu)
que figura en la fórmula final:

La misma derivación se aplica a las fórmulas que aparecen en las monografías para artículos líquidos que son valorados por
espectrofotometría de absorción. Para formas farmacéuticas líquidas, los resultados de los cálculos se expresan, en general, en
función de la cantidad, en mg, de fármaco en cada mL del artículo. Por lo tanto es necesario incluir en el denominador un
término adicional, el volumen (V), en mL, de la preparación de prueba tomada.
Las valoraciones en la región visible requieren generalmente la comparación concomitante entre la absorbancia producida
por la Preparación de valoración y la producida por una Preparación estándar que contiene aproximadamente una cantidad
igual de un Estándar de Referencia USP. En algunas situaciones, se admite la omisión del uso de un Estándar de Referencia.
Esto es así en el caso de valoraciones espectrofotométricas con frecuencia rutinaria y cuando se dispone de una curva estándar
apropiada, preparada con el Estándar de Referencia USP respectivo y cuando la sustancia analizada se ajusta a la ley de Beer
dentro de un intervalo de aproximadamente entre 75% y 125% de la concentración final usada en la valoración. En estas cir-
cunstancias, la absorbancia determinada en la valoración se puede interpolar en la curva estándar y el resultado de la valora-
ción se calcula a partir de esa interpolación.
Tales curvas estándar deben confirmarse con frecuencia y cada vez que se emplee un espectrofotómetro nuevo o lotes nue-
vos de reactivos.
En las valoraciones espectrofotométricas que indican la preparación y uso de una curva estándar, es permisible y preferible,
cuando la valoración se realiza con poca frecuencia, no emplear la curva estándar y hacer la comparación directamente en
función de una cantidad de Estándar de Referencia aproximadamente igual a la cantidad de muestra tomada y que ha sido
tratada de manera similar.

Espectrofotometría de Fluorescencia

La medición de la fluorescencia es una técnica analítica útil. La fluorescencia es la luz emitida por una sustancia en estado
excitado que se ha alcanzado mediante la absorción de energía radiante. Se dice que una sustancia es fluorescente si puede
emitir fluorescencia. Muchos compuestos se pueden valorar mediante procedimientos que se basan en su fluorescencia inhe-
rente o la fluorescencia de derivados adecuados.
Las muestras de prueba preparadas para espectrofotometría de fluorescencia por lo general están de un décimo a un centé-
simo más concentradas que las que se emplean en espectrofotometría de absorción, por los motivos que se indican a conti-
nuación. En las aplicaciones analíticas, es preferible que la señal de fluorescencia esté relacionada linealmente con la concentra-
ción; pero si una muestra de prueba estuviera demasiado concentrada, una parte significativa de la luz entrante será absorbida
por la muestra más próxima a la superficie de la celda y la luz que llega al centro se reduce. Es decir, la misma muestra actúa
como un "filtro interno". Sin embargo, la espectrofotometría de fluorescencia es intrínsicamente una técnica de alta sensibili-
dad y, con frecuencia, se emplean concentraciones de 10-5 M a 10- 7 M. Para cualquier procedimiento analítico, es necesario
realizar una curva de trabajo de intensidad de fluorescencia en función de la concentración para establecer una relación lineal.
Todas las lecturas deben corregirse para un blanco de disolvente.
Las mediciones de fluorescencia son sensibles a la presencia de polvo y otras partículas sólidas en la muestra de prueba. Tales
impurezas pueden reducir la intensidad del haz de excitación o proporcionar lecturas erróneamente altas debido a los reflejos
múltiples en la celda de la muestra. Por lo tanto, es conveniente eliminar las partículas sólidas mediante centrifugación; tam-
bién se puede emplear la filtración, aunque algunos papeles de filtro contienen impurezas fluorescentes.
A menudo, la regulación de la temperatura es importante en la espectrofotometría de fluorescencia. Para algunas sustancias,
la eficiencia de la fluorescencia puede reducirse hasta entre 1% y 2% por grado de ascenso de temperatura. En tales casos, si
se desea mayor precisión, es conveniente el uso de celdas para muestra con temperatura controlada. Para los análisis de rutina,
puede ser suficiente realizar las mediciones con la rapidez necesaria como para que la muestra no se caliente demasiado debi-
do a la exposición a la fuente de iluminación intensa. Muchos compuestos fluorescentes son fotosensibles. Expuestos en un
fluorómetro, pueden ser fotodegradados en productos más o menos fluorescentes. Dichos efectos pueden detectarse a través
USP 37 Pruebas Físicas / (851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz 605

de la observación de la respuesta del detector en relación al tiempo y pueden reducirse atenuando la fuente de iluminación
con filtros o pantallas.
Los cambios de disolvente pueden afectar notablemente la intensidad y distribución espectral de la fluorescencia. Por lo tan-
to, no es aconsejable alterar el disolvente especificado en los métodos establecidos sin una cuidadosa investigación preliminar.
Muchos compuestos son fluorescentes en disolventes orgánicos pero prácticamente no son fluorescentes en agua; por lo tan-
to, se deben probar varios disolventes antes de que se decida si un compuesto es o no fluorescente. En muchos disolventes
orgánicos, la intensidad de la fluorescencia aumenta mediante la eliminación del oxígeno disuelto, que ejerce un fuerte efecto
de extinción. El oxígeno puede eliminarse mediante burbujeo de un gas inerte, como por ejemplo nitrógeno o helio, a través
de la muestra de prueba.
Una medida semicuantitativa de la fuerza de la fluorescencia está dada por el cociente entre la intensidad de fluorescencia
de una muestra de prueba y la de un estándar obtenido con los mismos parámetros de ajuste de los instrumentos. Frecuente-
mente, se emplea como estándar de referencia una solución de concentración conocida de quinina en ácido sulfúrico O, 1 N o
de fluoresceína en hidróxido de sodio O, 1 N.

Dispersión de Luz

La turbidez puede medirse con un espectrofotómetro o un fotómetro de filtro fotoeléctrico estándar, preferentemente con
iluminación en la porción azul del espectro. Las mediciones nefelométricas requieren un instrumento con una fotocélula situa-
da para recibir la luz dispersada en lugar de la luz transmitida; esta geometría se aplica también a los fluorómetros, de manera
que, en general, los fluorómetros pueden emplearse como nefelómetros, mediante la selección de filtros adecuados. Un turbi-
dímetro de relación combina la tecnología de la nefelometría a 90º y la de la turbidimetría: contiene fotocélulas que reciben y
miden la luz dispersada a un ángulo de 90º de la muestra así como también reciben y miden la dispersión directa frente a la
muestra; también mide la luz transmitida directamente a través de la muestra. La linealidad se obtiene al calcular la relación
entre la medición de la luz dispersada a un ángulo de 90º y la suma de la medida de la luz dispersada directa y la medida de la
luz transmitida. La ventaja de emplear un sistema de turbidimetría de relación es que la medida de la luz perdida es inaprecia-
ble.
En la práctica, es aconsejable asegurarse de que la sedimentación de las partículas que serán medidas sea inapreciable. Ge-
neralmente esto se logra incluyendo un coloide protector en el medio de suspensión líquido. Es importante que los resultados
sean interpretados mediante comparación de lecturas con las de un material en suspensión de concentración conocida, produ-
cidas exactamente bajo las mismas condiciones.
La turbidimetría o nefelometría puede ser útil para la medición de precipitados formados por la interacción de soluciones
altamente diluidas de reactivos u otras partículas, como por ejemplo suspensiones de células bacterianas. Para que puedan lo-
grarse resultados consistentes, todas las variables deben controlarse cuidadosamente. En los casos en los que dicho control sea
posible, se pueden medir suspensiones sumamente diluidas.
La muestra se disuelve en el disolvente a varias concentraciones diferentes conocidas con exactitud, la elección de las con-
centraciones depende del peso molecular del soluto y varía desde 1o/o para Mw = 1O000 a 0,01 o/o para Mw = 1 000 000. Cada
solución debe limpiarse muy cuidadosamente antes de la medición mediante filtración repetida a través de filtros finos. Una
partícula de polvo en la solución vicia la intensidad de la luz dispersada medida. Un criterio para una solución transparente es
que la disimetría, la relación de intensidad dispersada a 45°/135º, haya alcanzado un mínimo.
Se miden la turbidez y el índice de refracción de las soluciones. A partir de la ecuación general de dispersión de luz a 90º, se
traza un gráfico de HC/i: en función de C y se extrapola a dilución infinita y se calcula el peso molecular promedio, M, a partir
de la intersección, 1 / M.

Comparación Visual

Cuando se indica una comparación de color o una comparación de turbidez, deben utilizarse tubos para comparación de
color que sean tan idénticos como sea posible en diámetro interno y en cualquier otra característica. Para la comparación de
color, los tubos deben observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con la ayuda de una fuente de iluminación dirigida
desde debajo de la parte inferior de los tubos, mientras que para la comparación de turbidez los tubos deben observarse hori-
zontalmente, contra un fondo oscuro, con la ayuda de una fuente de iluminación lateral.
Al realizar pruebas de límites que incluyan una comparación de color en dos recipientes iguales (por ejemplo, tubos para
comparación de color iguales), podrá utilizarse un instrumento apropiado, en lugar de realizar una observación visual directa.
606 (861) Suturas-Diámetro / Pruebas Físicas USP 37

(861) SUTURAS-DIÁMETRO

El calibrador para determinar el diámetro de las suturas es del tipo de peso muerto, mecánico o eléctrico, y está equipado
con un dial de lectura directa, un visor digital o una impresora. Emplear un calibrador graduado a 0,002 mm o un calibrador
más pequeño. El yunque del calibrador tiene aproximadamente 50 mm de diámetro y el pie compresor es de 12, 70 ±
0,02 mm de diámetro. El pie compresor y las partes móviles conectadas a éste se gradúan de manera que se aplique una carga
total de 21 O± 3 g a la muestra. Las superficies del pie compresor y del yunque son planas, con desviaciones no mayores de
0,005 mm, y paralelas entre sí con una aproximación de 0,005 mm. Para medir el diámetro de las suturas de 0,4 y menor ta-
maño métrico, retirar el peso adicional del pie compresor para que la carga total sobre la sutura no exceda de 60 g.
Sutura Quirúrgica Absorbible de Colágeno-Determinar el diámetro inmediatamente después de haberla retirado del en-
vase primario y sin estirarla. Colocar el hilo a través del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta
que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir el diámetro de cada hilo en tres puntos correspondientes, aproximadamen-
te, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos de su longitud.
Sutura Quirúrgica Absorbible Sintética-Proceder según se indica para Sutura Quirúrgica No Absorbible.
Sutura Quirúrgica No Absorbible-Colocar el hilo a través del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el
pie hasta que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir las suturas no absorbibles, ya sea que estén envasadas en seco o en
líquido, inmediatamente después de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos.
Medir el diámetro de la sutura en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos
de su longitud. En el caso de suturas trenzadas de tamaños mayores de 3-0 (tamaño métrico 2), hacer dos mediciones en cada
punto, una en ángulo recto respecto de la otra, y emplear el promedio como el diámetro observado en ese punto.
Cuando se midan suturas de multifilamento, fijar una porción de la sección designada del hilo en una pinza fija, de manera
que el hilo pase a través del centro del yunque. Mientras se sostiene el hilo en el mismo plano que la superficie del yunque,
someter el hilo a tensión por medios adecuados, como por ejemplo, pasando el extremo libre del hilo alrededor de un cilindro
o polea y uniendo dicho extremo libre a una pesa de aproximadamente la mitad del límite de nudo-tracción para la sutura de
Clase 1 no esterilizada del tamaño en cuestión, con cuidado de no dejar que el hilo, si fuera retorcido, pierda la torsión. Medir
el diámetro en los puntos designados en el hilo y calcular el diámetro promedio según las indicaciones dadas.

(871) SUTURAS-SUJECIÓN DE AGUJAS

Las suturas quirúrgicas absorbibles (de colágeno) y las no absorbibles con Sujeción de Aguja Estándar tienen las agujas sujetas
firmemente y están diseñadas para que éstas no se desprendan. Las suturas suministradas con sujeción de agujas sin ojo corres-
ponden a las categorías de suturas con Sujeción de Aguja Estándar o con Sujeción de Aguja Desprendible. La Sujeción de Aguja
Desprendible, tanto de las suturas quirúrgicas absorbibles como de las no absorbibles, permite separar la aguja a voluntad con
un simple tirón. Ambos tipos de sujeción son sometidos a pruebas con un equipo, según se especifica en Resistencia a la Ten-
sión (881 ).
Procedimiento-Tomar 5 suturas y colocar una por una en el tensiómetro, sujetando la aguja con la pinza fija, dejando
toda la parte embutida expuesta, y en la misma dirección de la fuerza que ejerce la pinza móvil sobre la sutura. Determinar la
fuerza necesaria para desprender la sutura de la aguja. En el caso de suturas con Sujeción de Aguja Estándar, la sutura puede
romperse sin desprenderse de la aguja.
Sujeción de Aguja Estándar-Cumple con los requisitos si ni el promedio de los 5 valores ni ningún valor individual es inferior
al límite fijado para el tamaño especificados en la Tabla 7.
Tabla 1. Sujeción de Aguja Estándar para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamaño Métrico (Calibre Nº) Límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Ah-
Sutura sorbible y Ah-
Absorbible de sorbible Sintéti- Promedio Individual Promedio Individual
Colágeno ca Tamaño USP (en kgf) (Mín.) (en kgf) (Mín.) (en N) (Mín.) (en N) (Mín.)
0,1 11-0 0,007 0,005 0,069 0,049
0,2 10-0 0,014 0,010 O, 137 0,098
0,4 0,3 9-0 0,021 0,015 0,206 0,147
0,5 0,4 8-0 0,050 0,025 0,490 0,245
0,7 0,5 7-0 0,080 0,040 0,784 0,392
1 0,7 6-0 O, 17 0,08 1,67 0,784
1,5 1 5-0 0,23 O, 11 2,25 1,08
USP 37 Pruebas Físicas/ (881) Resistencia a la Tensión 607

Tabla 1. Sujeción de Aguja Estándar para Suturas Absorbibles y No Absorbibles (Continuación)

Tamaño Métrico (Calibre Nº) Límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Ah-
Sutura sorbible y Ah-
Absorbible de sorbible Sintéti- Promedio Individual Promedio Individual
Colágeno ca Tamaño USP (en kgf) (Mín.) (en kgf) (Mín.) (en N) (Mín.) (en N) (Mín.)
2 1,5 4-0 0,45 0,23 4,41 2,25
3 2 3-0 0,68 0,34 6,67 3,33
3,5 3 2-0 1,10 0,45 10,8 4,41
4 3,5 o 1,50 0,45 14,7 4,41
5 4 1 1,80 0,60 17,6 5,88
6 y superior 5 y superior 2 y superior 1,80 0,70 17,6 6,86

Sujeción de Aguja Desprendible---Cumple con los requisitos si los valores individuales de las 5 suturas se encuentran dentro de
los límites establecidos en la Tabla 2.
Tabla 2. Sujeción de Aguja Desprendible para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamaño Métrico (Calibre) límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Ah-
Sutura sorbible y Ah-
Absorbible de sorbible Sintéti- Mínimo Máximo Mínimo Máximo
Colágeno ca Tamaño USP (en kgf) (en kgf) (en N) (en N)
1,5 1 5-0 0,028 1,59 0,274 15,6
2 1,5 4-0 0,028 1,59 0,274 15,6
3 2 3-0 0,028 1,59 0,274 15,6
3,5 3 2-0 0,028 1,59 0,274 15,6 -~

4 3,5 o 0,028 1,59 0,274 15,6

5 4 1 0,028 1,59 0,274 15,6
6 5 2 0,028 1,59 0,274 15,6

[NOTA-Para ambos tipos de sutura, si no más de uno de los valores individuales se encuentra fuera de los límites establecidos,
repetir la prueba con 1O suturas adicionales: cumple con los requisitos si ninguno de los 1 O valores adicionales se encuentra
fuera de los requisitos del límite individual.]

(881) RESISTENCIA A LA TENSIÓN

Los dispositivos para la medición de la resistencia a la tensión empleados en los Estados Unidos pueden calibrarse en unida-
des del sistema inglés de medidas. Las siguientes instrucciones se dan en unidades métricas con la comprensión de que pue-
den emplearse los equivalentes ingleses correspondientes.

Sutura Quirúrgica

Determinar la resistencia a la tensión de las suturas quirúrgicas en una máquina a motor para medir la resistencia a la ten-
sión, que tenga pinzas adecuadas para sostener la muestra con firmeza, y emplear el principio de velocidad de carga constante
sobre la muestra o el principio de velocidad de elongación constante de la muestra, según se describe a continuación. El apa-
rato tiene dos pinzas para sostener el hilo de la sutura. Una de estas pinzas es móvil. Las pinzas están diseñadas para que la
sutura que se va a probar pueda ser fijada sin posibilidad de que se deslice. La longitud calibrada de prueba se define como la
distancia interior entre las dos pinzas. Para longitudes calibradas de prueba entre 125 y 200 mm, la pinza móvil es accionada a
una velocidad de elongación constante de 30 ± 5 cm por minuto. Para longitudes calibradas de menos de 125 mm, la veloci-
dad de elongación por minuto se ajusta para que equivalga a 2 veces la longitud calibrada por minuto. Por ejemplo, si la longi-
tud es de 5 cm, la velocidad de elongación será de 1 O cm por minuto.
Determinar la resistencia a la tensión de la sutura, ya sea que esté envasada en seco o con líquido, inmediatamente después
de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos. Sujetar uno de los extremos de la sutura a la pinza
del extremo de carga de la máquina, pasar el otro extremo a través de la pinza opuesta, aplicando tensión suficiente para que
la muestra quede tirante entre las pinzas, y cerrar la segunda pinza. Realizar tantas rupturas como se especifiquen en la mono-
grafía individual. Si la ruptura ocurre en la pinza, descartar la lectura de la muestra.
608 (881) Resistencia a la Tensión / Pruebas Físicas USP 37

Procedimiento para una máquina que opera por el principio de velocidad de carga constante sobre la muestra-Esta
descripción se aplica a la máquina conocida como Comprobador de Plano Inclinado ("Incline Plane Tester").
El carro empleado en cualquier prueba es de un peso tal que al ocurrir la ruptura, la posición de la pluma registradora sobre
la gráfica queda entre el 20% y el 80% de la capacidad que pueda registrarse en la gráfica. La fricción en el carro es suficiente-
mente baja como para permitir que la pluma registradora se aparte de la línea cero de la gráfica en un grado que no exceda
de 2,5% de la capacidad de la gráfica cuando no haya ninguna muestra sujeta en las pinzas.
Para suturas quirúrgicas de tamaños intermedios y más grandes, la pinza para sostener la muestra es del tipo rodillo, con
una superficie de sujeción plana. El rodillo tiene un diámetro de 19 mm y la superficie de sujeción plana no es menor de
25 mm de longitud. La longitud de la muestra, una vez que se inserta en las pinzas, es de por lo menos 127 mm de un extre-
mo a otro. La velocidad de inclinación del plano del comprobador es tal que alcanza su inclinación máxima de 30º sobre la
horizontal en 20 ± 1 segundos desde el comienzo de la prueba.
Para suturas quirúrgicas de tamaños pequeños, la pinza apropiada tiene una superficie de sujeción plana de no menos de
1 3 mm de longitud. La velocidad de inclinación del plano es tal que alcanza su inclinación máxima de 30º sobre la horizontal
en 60 ± 5 segundos desde el comienzo de la prueba.
Excepto cuando en la monografía de la sutura se indique tracción recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba reali-
zando un nudo de cirujano con una vuelta de sutura, alrededor de un tubo de goma flexible con un diámetro interno de
6,5 mm y un espesor de pared de 1,6 mm. El nudo de cirujano es un nudo cuadrado en el cual el extremo libre se pasa prime-
ro dos veces por el lazo, en lugar de una vez, y se ajusta tirante, luego se pasa una vez por un segundo lazo y se tensan los
extremos de manera que quede un nudo sencillo superpuesto a un nudo doble. Comenzar el primer nudo con el extremo
izquierdo sobre el extremo derecho, ejerciendo tensión suficiente para atar el nudo con firmeza. Cuando la muestra de prueba
incluya un nudo, colocar la muestra en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las
pinzas. Dejar el tubo de goma flexible en su lugar mientras dure la prueba.
Procedimiento para una máquina que opera por el principio de velocidad de elongación constante de la muestra-
Esta descripción se aplica a cualquier máquina adecuada para determinar la resistencia a la tensión que opera según el princi-
pio de velocidad constante de elongación de la muestra.
Excepto cuando en las monografías de las suturas se indique tracción recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba
por medio de un nudo simple, colocando un extremo del hilo, sostenido con la mano derecha, por encima del otro extremo,
sostenido con la mano izquierda, pasando un extremo sobre el hilo y a través del lazo que se formó y luego ajustando el nudo
con firmeza. La muestra se coloca en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pin-
zas.

Telas Textiles y Películas

Determinar la resistencia a la tensión de las telas textiles, incluyendo la cinta adhesiva, en un aparato comprobador de velo-
cidad constante o de tipo péndulo, con la siguiente descripción general.
Las pinzas para sostener la muestra son mordazas lisas, planas y paralelas, de no menos de 25 mm de longitud en paralelo a
la dirección de aplicación de la carga. Cuando el ancho de la tira a probar no excede de 19 mm, las mordazas de la pinza
deben tener al menos 25 mm de ancho. Si el ancho de la tira es mayor de 19 mm y no mayor de 44 mm, el ancho de las
mordazas de la pinza debe ser de no menos de 50 mm. Si el ancho de la muestra es más de 44 mm, cortar una tira de 25 mm
y usar una pinza con mordazas de no menos de 50 mm de ancho. Redondear todos los bordes que puedan tener una acción
cortante sobre la muestra hasta un radio de 0,4 mm. Las mordazas tienen una separación entre sí de 76,2 mm al comienzo de
la prueba y se separan a una velocidad de 30,5 cm ± 1 3 mm por minuto. La máquina tiene una capacidad tal que cuando se
produce la ruptura, la desviación del péndulo de la vertical está entre 9º y 45º.

(891) ANÁLISIS TÉRMICO

INTRODUCCIÓN

Los sucesos termodinámicos determinados con precisión, como por ejemplo un cambio de estado, pueden indicar la identi-
dad y la pureza de los fármacos. Desde hace mucho tiempo se han venido estableciendo normas farmacopeicas para las tem-
peraturas de fusión y de ebullición de las sustancias. Estas transiciones ocurren a temperaturas características y de esta manera
las normas far-macopeicas contribuyen a la identificación de las sustancias. Dado que las impurezas afectan a estos cambios de
manera predecible, las mismas normas farmacopeicas contribuyen al control de la pureza de las sustancias.
El análisis térmico, en el sentido más amplio, es la medición de las propiedades físicas y químicas de los materiales en fun-
ción de la temperatura. Los métodos instrumentales han suplantado, en gran medida, a métodos más antiguos, que depen-
dían de la inspección visual y de mediciones bajo condiciones fijas o arbitrarias, debido a que los métodos instrumentales son
objetivos, proporcionan más información, generan registros permanentes, y por lo general son más sensibles, precisos y exac-
USP 37 Pruebas Físicas/ (891) Análisis Térmico 609

tos. Además, pueden suministrar información sobre la desolvatación, la deshidratación, la descomposición, la perfección del
cristal, el polimorfismo, la temperatura de fusión, la sublimación, las transiciones vítreas, la evaporación, la pirólisis, las interac-
ciones sólido-sólido y la pureza. Tales datos resultan útiles para la caracterización de sustancias en lo que respecta a la compati-
bilidad, estabilidad, envasado y control de calidad. A continuación se describen las mediciones que se utilizan con mayor fre-
cuencia en el análisis térmico, es decir, temperaturas de transición y punto de fusión mediante calorimetría diferencial de barri-
do (DSC, por sus siglas en inglés), análisis termogravimétrico, microscopía de platina caliente y análisis de impurezas eutécti-
cas.

TEMPERATURAS DE PUNTO DE FUSIÓN V DE TRANSICIÓN

Cuando se calienta una muestra, se pueden observar las transiciones usando DSC, análisis térmico diferencial (DTA, por sus
siglas en inglés), o microscopía de platina caliente (hot-stage microscopy). La DSC por flujo de calor (heat-flux DSC) sirve para
determinar el diferencial de calor entre la muestra y el material de referencia. En la DSC por compensación de calor (power
compensation DSC), la muestra y los materiales de referencia se mantienen a la misma temperatura, usando elementos de ca-
lentamiento individuales, y se registra la diferencia en el consumo de energía de los dos calentadores. La DTA monitorea la
diferencia de temperaturas entre la muestra y la referencia. Las transiciones que se pueden observar incluyen aquellas que se
presentan en la Tabla 1 a continuación. En el caso de la fusión, puede determinarse en forma objetiva y reproducible tanto el
"inicio" como el "pico" de temperatura, a menudo con una aproximación de unas pocas décimas de grado. Aunque estas
temperaturas son útiles para la caracterización de sustancias y la diferencia entre las dos temperaturas es un indicador de pure-
za, los valores no pueden compararse directamente con valores de "intervalos de fusión" o de "punto de fusión" visuales ni con
constantes tales como el punto triple del material puro.
Asimismo, se debe tener cuidado al comparar los resultados obtenidos a través de diferentes métodos de análisis. Los méto-
dos ópticos pueden medir el punto de fusión como la temperatura en la que se funde la última traza de material sólido. Por el
contrario, los puntos de fusión medidos con DSC pueden referir a la temperatura de inicio o a la temperatura en la que se
observó la velocidad de fusión máxima (vertex). No obstante, el vertex es sensible al peso de la muestra, a la velocidad de
calentamiento y a otros factores, mientras que la temperatura de inicio se ve menos afectada por tales factores. Cuando se
emplean técnicas térmicas, es necesario considerar las limitantes de la formación de soluciones sólidas, la insolubilidad en la
fusión, el polimorfismo y la descomposición durante el análisis.
Tabla 1
Sólido a líquido Fusión Endotérmica
Líquido a gas Vaporización Endotérmica
Congelación Exotérmica
Líquido a sólido
Cristalización Exotérmica
Sólido a gas Sublimación Endotérmica
Transición vítrea Evento de segundo orden
Desolvatación Endotérmica
Sólido a sólido
Amorfo a cristalino Exotérmica
Polimorfo Endotérmica o Exotérmica

Informe de Resultados de Métodos Instrumentales-Cada termograma debería estar acompañado por una descripción
completa de las condiciones empleadas, incluyendo la marca y el modelo del instrumento; el registro de la última calibración;
el tamaño y la identificación de la muestra (incluyendo el historial térmico); el envase; la identidad, la velocidad de flujo y la
presión de la atmósfera gaseosa; la dirección y la velocidad de cambio de temperatura; y la sensibilidad del instrumento y del
registrador.

DETERMINACIÓN DE TEMPERATURA DE TRANSICIÓN (TEMPER)\TURA DE INICIO DE FUSIÓN)

V TEMPERATURA DE PUNTO DE FUSION

Aparato-Usar instrumental para DTA o DSC equipado con un dispositivo de programación de temperatura, detector( es)
térmico(s) y un sistema de registro que se pueda conectar a una computadora, a menos que la monografía individual para la
que se emplea el capítulo indique algo distinto.
Calibración-Calibrar el instrumental para cambios de temperatura y entalpía usando indio u otro material adecuado certi-
ficado. La calibración de la temperatura se lleva a cabo calentando un estándar a través de la transición de fusión y comparan-
do el inicio extrapolado del punto de fusión del estándar con el inicio certificado de punto de fusión. La calibración de la tem-
peratura se debería realizar a la misma velocidad de calentamiento que el experimento. La calibración de la entalpía se lleva a
cabo calentando un estándar a. través de la transición de fusión y comparando el calor de fusión calculado con el valor teórico.
Procedimiento-Pesar con exactitud una cantidad apropiada de la sustancia a examinar en el receptáculo de la muestra
(sample pan), según se describe en la monografía específica. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento, la
dirección del cambio de temperatura y la temperatura final según se especifica en la monografía. Si no se especifican en la
61 O (891) Análisis Térmico/ Pruebas Físicas USP 37

monografía, estos parámetros se determinan según se indica a continuación: realizar un análisis preliminar sobre un amplio
intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposición, o aproxi-
madamente 1 Oº a 20º por encima del punto de fusión) y sobre un amplio intervalo de velocidades de calentamiento (1 º a 20º
por minuto) para evidenciar cualquier efecto inesperado. Posteriormente, determinar una velocidad de calentamiento más baja
de modo que se minimice la descomposición y que no se comprometa la temperatura de transición. Determinar un intervalo
de temperatura que comprenda la transición de interés de modo que la línea base se pueda extender hasta intersectar con la
tangente de la fusión (ver Figura 7).

j _,,I
,-
1
~
i----1!
188,79ºC
·102.3J/g
-~-~+--~--
1
/
1

} "1

:•+----~190.31"C~-----il
Exo Up
1~ 210

Figura 1. Termograma.

Al examinar materiales cristalinos puros, pueden ser apropiadas velocidades tan bajas como 1 º por minuto, mientras que
para materiales poliméricos y demás materiales semicristalinos resultan más apropiadas velocidades de hasta 20º por minuto.
Comenzar el análisis y registrar la curva del análisis térmico diferencial con la temperatura en el eje x y el cambio de energía en
el eje y. La temperatura de fusión (temperatura de inicio de fusión) es la intersección (188,79º) de la extensión de la línea base
con la tangente al punto de mayor pendiente (punto de inflexión) de la curva (ver Figura 7). El vértice es la temperatura en el
pico de la curva (190,31 º). La entalpía del evento es proporcional al área bajo la curva después de aplicar una corrección de la
línea base.

ANÁLISIS TERMOGRAVIMÉTRICO
El análisis termogravimétrico incluye la determinación de la masa de una muestra como una función de la temperatura, o
del tiempo de calentamiento, o ambos. Por lo general se usa para investigar los procesos de deshidratación/desolvatación y la
descomposición de compuestos. Cuando la termogravimetría se aplica apropiadamente, ésta suministra información de mayor
utilidad que la pérdida por secado a temperatura fija, que frecuentemente se realiza durante un tiempo fijo y por lo general en
una atmósfera mal definida. Por lo general, la pérdida de disolvente absorbido en la superficie puede distinguirse del disolven-
te en la red cristalina y de las pérdidas por degradación. Las mediciones pueden llevarse a cabo en atmósferas con una hume-
dad y una concentración de oxígeno controladas para revelar interacciones con el fármaco, entre fármacos y entre sustancias
activas y excipientes o materiales del envase.
Aparato-Mientras que los detalles dependen del fabricante, las características esenciales del equipo son una balanza que
registra los pesos y una fuente de calor programable. Los equipos difieren en la capacidad para manejar muestras de diversos
tamaños, la manera en que se registra la temperatura de la muestra y el intervalo de control de la atmósfera.
Calibración-Se requiere una calibración para todos los sistemas; es decir, la balanza se calibra usando pesas estándar, y la
calibración de temperatura implica el uso de materiales estándar, puesto que se asume que la temperatura de la muestra es la
temperatura del horno. La calibración de peso se lleva a cabo midiendo la masa de una pesa certificada o estándar y compa-
rando la masa medida con el valor certificado. La calibración de la temperatura se lleva a cabo analizando un estándar magné-
tico de alta pureza, tal como níquel, para determinar su temperatura de Curie y comparando el valor medido con el valor teó-
rico.
Procedimiento-Aplicar el método a la muestra, empleando las condiciones descritas en la monografía, y calcular la ga-
nancia o pérdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje. Alternativamente, colocar una cantidad adecuada
de material en el portamuestras y registrar el peso. Debido a que la atmósfera de análisis es crítica, se especifica la presión o
velocidad de flujo y la composición del gas. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento y la temperatura final
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e iniciar el aumento de temperatura. Alternativamente, analizar el termograma
sobre un amplio intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descompo-
sición, o 1 Oº a 20º por encima del punto de fusión a una velocidad de calentamiento de 1 ºa 20º por minuto). Calcular la
ganancia o pérdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje.
USP 37 Pruebas Físicas/ (891 >Análisis Térmico 611

MICROSCOPÍA DE PLATINA CALIENTE

La microscopía de platina caliente es una técnica analítica que implica el monitoreo de las propiedades ópticas de la muestra
como una función de la temperatura usando un microscopio. La microscopía de platina caliente se puede usar como técnica
complementaria de otras técnicas de análisis térmico, tales como DSC, DTA y difracción de rayos X de temperatura variable
para polvos, para la caracterización del estado sólido de compuestos farmacéuticos. Resulta de utilidad para confirmar transi-
ciones tales como fusiones, recristalizaciones y transformaciones al estado sólido usando una técnica visual. El microscopio de
platina caliente debe someterse a una calibración de temperatura.

ANÁLISIS DE IMPUREZAS EUTÉCTICAS

La base de cualquier método de pureza calorimétrica es la relación entre la disminución del punto de fusión y de congela-
ción y el nivel de impurezas. La fusión de un compuesto está caracterizada por la absorción del calor latente de fusión, t>Hr, a
una temperatura específica, T0 • En teoría, una transición de fusión para un compuesto cristalino totalmente puro debe ocurrir
dentro de un intervalo infinitamente estrecho. Una ampliación del intervalo de fusión, debido a impurezas, proporciona un
criterio de pureza sensible. El efecto es evidente mediante el examen visual de termogramas de muestras que difieren por unas
pocas décimas de porcentaje en el contenido de impurezas. Un material con 99% de pureza se funde aproximadamente en un
20% a una temperatura de 3º por debajo del punto de fusión del material puro (ver Figura 2).

- Temperatura

Ácido Benzoico

Patrón Primario (NIST)

Figura 2. Termogramas superpuestos en los que se muestra el efecto de las impurezas sobre la forma del pico de fusión en
una DSC.

Los parámetros de fusión (intervalo de fusión, t>H 1 y la pureza eutéctica calculada) se obtienen fácilmente a partir del termo-
grama de un solo evento de fusión empleando una muestra de prueba pequeña y el método no requiere mediciones múltiples
de temperatura reales y precisas. Las unidades del termograma se convierten directamente a transferencia de calor, en milica-
lorías por segundo.
El descenso del punto de congelación en soluciones diluidas por moléculas de tamaño casi igual se expresa mediante la ecua-
ción de van't Hoff modificada:

en donde T =temperatura absoluta en grados Kelvin; X2 =fracción molar del componente menor (soluto; impureza), t>Hr =
calor molar de fusión del componente principal en Joules por mol: R = constante de gases en Joules por mol x grados Kelvin; y
K0 =cociente de distribución del soluto entre la fase sólida y la fase líquida.
Asumiendo que el intervalo de temperatura es pequeño y que no se forman sólidos en solución (K 0 =O), la integración de la
ecuación de van't Hoff proporciona la siguiente relación entre la fracción molar de la impureza y la disminución del punto de
fusión:

(2)

en donde T0 =punto de fusión del compuesto puro, en grados Kelvin, y Tm =punto de fusión de la muestra de prueba, en
grados Kelvin.
Sin formación de sólidos en la solución, la concentración de la impureza en la fase líquida, a cualquier temperatura durante
la fusión, es inversamente proporcional a la fracción fundida a esa temperatura y la disminución del punto de fusión es directa-
612 (891) Análisis Térmico/ Pruebas Físicas USP 37

mente proporcional a la fracción molar de la impureza. Un gráfico de la temperatura observada de la muestra de prueba, T,,
frente al recíproco de la fracción fundida, 1 / F, a una temperatura T,, debe producir una línea recta con una pendiente igual a
la disminución del punto de fusión (T 0 - Trn). El punto de fusión teórico del compuesto puro se obtiene mediante extrapola-
ción a 1 /F = O:

RT 2 X ( 1 )
T~T- '' F (3)
s º i\H1

La sustitución de los valores obtenidos en forma experimental para T0 - Trn' L'lHr y T0 en la ecuación (2) produce la fracción
molar de la impureza eutéctica total, la cual, cuando se multiplica por 100 da el porcentaje molar de impurezas eutécticas
totales.
Las desviaciones del gráfico lineal teórico también pueden ser producto de la formación de soluciones sólidas (K 0 et O), por lo
tanto se debe prestar atención al interpretar estos datos.
Para observar el efecto lineal de la concentración de impurezas sobre la disminución del punto de fusión, la impureza debe
ser soluble en la fase líquida o la fase fundida del compuesto, pero insoluble en la fase sólida, es decir, no se forma ninguna
solución sólida. Para que se produzca la solubilidad en el material fundido son necesarias algunas semejanzas químicas. Por
ejemplo, la presencia de compuestos iónicos en compuestos orgánicos neutros y la descomposición térmica quizá no se refle-
jen en las estimaciones de pureza. El alcance de estas limitaciones teóricas se ha estudiado sólo en forma parcial.
Las impurezas presentes provenientes de la ruta sintética a menudo son similares al producto final, en consecuencia no hay
generalmente ningún problema de solubilidad en el material fundido. Las impurezas compuestas por moléculas de igual for-
ma, tamaño y carácter que las del componente principal pueden acomodarse en la matriz del componente principal sin modi-
ficar la retícula, formando soluciones sólidas o inclusiones; tales impurezas no son detectables por DSC. En tales casos, las esti-
maciones de pureza son demasiado altas. Esto es más común con cristales menos ordenados, según lo indican los valores bajos
de calor de fusión.
Además, el método es confiable cuando la pureza del componenete principal es mayor de 98,5 mol% y los materiales no se
descomponen durante la fase de fusión.
Los niveles de impurezas calculados a partir de los termogramas son reproducibles y generalmente confiables con una apro-
ximación de O, 1 % para compuestos ideales.
Los compuestos que existen en forma polimorfa no pueden usarse en la determinación de pureza a menos que el compues-
to se convierta completamente a una forma. Por otro lado, la DSC y el DTA son intrínsicamente útiles para detectar y en con-
secuencia realizar el seguimiento del polimorfismo.
Procedimiento-El procedimiento vigente y los cálculos a emplear para el análisis de impurezas eutécticas dependen del
instrumento específico usado. Consultar la técnica más apropiada para un instrumento dado en la bibliografía del fabricante
y/o en la bibliografía de análisis térmico. De todas formas, es imperativo recordar las limitaciones de formación de soluciones
sólidas, la insolubilidad en el material fundido, el polimorfismo y la descomposición durante el análisis.

(905) UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

Este capítulo de pruebas generales ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y la Farma-
copea japonesa. Los textos del capítulo que son textos USP de aplicación nacional y que no forman parte del texto armonizado
están marcados con los símbolos e•.) para indicar esta situación.
•NOTA-En este capítulo, los términos unidad y unidad de dosificación son sinónimos .•
Para garantizar la uniformidad de las unidades de dosificación, cada unidad en un lote debe tener un contenido de fármaco
dentro de un intervalo estrecho alrededor de la cantidad declarada. Las unidades de dosificación se definen como formas far-
macéuticas que contienen una única dosis o parte de una dosis de un fármaco en cada unidad. Para suspensiones, emulsiones
o geles en envases de dosis única destinadas para administración externa o cutánea no se aplica la especificación de uniformi-
dad de unidades de dosificación.
El término "uniformidad de unidades de dosificación" se define como el grado de uniformidad en el contenido del fármaco
entre las unidades de dosificación. Por lo tanto, los requisitos de este capítulo son aplicables a cada fármaco incluido en unida-
des de dosificación que contengan uno o más fármacos, a menos que se especifique algo diferente en otra parte de esta Far-
macopea.
La uniformidad de las unidades de dosificación se puede demostrar mediante uno de los siguientes métodos, Uniformidad de
Contenido o Variación de •Peso. (ver la Tabla 7). La prueba de Uniformidad de Contenido para preparaciones que se presentan
en unidades de dosificación se basa en la valoración individual del contenido de un fármaco o fármacos en un número de
unidades de dosificación para determinar si el contenido individual se encuentra dentro de los límites fijados. El método de
Uniformidad de Contenido se puede aplicar en todos los casos.
La prueba de Variación de •Peso. es aplicable para las siguientes formas farmacéuticas:
USP 37 Pruebas Físicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación 613

(Wl) Soluciones contenidas en envases de dosis única y en cápsulas blandas;

(W2) Sólidos (incluidos los polvos, gránulos y sólidos estériles) envasados en envases unitarios y que no contienen sustancias activas o
inactivas agregadas;
(W3) Sólidos (incluidos los sólidos estériles) envasados en envases unitarios, con o sin sustancias activas o inactivas agregadas, que
hayan sido preparados por liofilización a partir de soluciones verdaderas en sus envases finales y que declaran este método de
preparación; y
(W4) Cápsulas duras, tabletas sin cubierta o tabletas recubiertas con películas que contengan 25 mg o más de un fármaco que co-
rresponda al 25% o más, en peso, de la unidad de dosificación o, en el caso de cápsulas duras, el contenido de las cápsulas,
excepto que se demuestre la uniformidad de otros fármacos presentes en proporciones menores en cumplimiento de los re-
quisitos de Uniformidad de Contenido.

La prueba de Uniformidad de Contenido se requiere para todas las formas farmacéuticas que no cumplen las condiciones enu-
meradas anteriormente para la prueba de Variación de • Peso•. 1
Tabla 1. Aplicación de las Pruebas de Uniformidad de Contenido (UC) y Variación de Peso (VP) para Formas Farmacéuticas
Dosis y
Proporción de
Fármaco
Forma 2".25mg <25 mg
Farmacéutica Tipo Subtipo y2".25% 0<25%
Tabletas Sin cubierta VP uc
Recubiertas Película VP uc
Otras uc uc
Cápsulas Duras VP uc
Blandas Suspensión, emulsión o uc uc
gel
Soluciones VP VP
Sólidos en envases Componente único VP VP
unitarios Varios componentes Solución liofilizada en en- VP VP
vase final
Otros uc uc
Soluciones en envases de dosis única •y VP VP
en cápsulas blandas ...
Otros uc uc
UNIFORMIDAD DE CONTENIDO

Seleccionar no menos de 30 unidades y proceder según se indica a continuación para cada forma farmacéutica especificada.
Cuando se utilizan procedimientos diferentes para la valoración de la preparacion y para la prueba de Uniformidad de Conte-
nido, puede ser necesario establecer un factor de corrección que deberá aplicarse a los resultados de esta última.

Formas Farmacéuticas Sólidas

Valorar 1O unidades individualmente usando un método analítico apropiado. Calcular el valor de aceptación (ver la Tabla 2).

Formas Farmacéuticas Líquidas o Semisólidas

Valorar 1 O unidades individualmente usando un método analítico apropiado. Realizar la valoración sobre la cantidad de ma-
terial bien mezclado que se retira de un envase individual en condiciones normales de uso y expresar los resultados como la
dosis entregada. Calcular el valor de aceptación (ver la Tabla 2).

Cálculo del Valor de Aceptación

Calcular el valor de aceptación, por la fórmula:

1 •Textos de la Farmacopea Europea y Ja Farmacopea Japonesa no aceptados por la Farmacopea de los Estados Unidos: Como alternativa, para los productos
listados en el punto (4) anterior que no cumplen con el límite de umbral de 25 mg/25%, se puede analizar la uniformidad de las unidades de dosificación median-
te Variación de Masa en lugar de la prueba de Uniformidad de Contenido si la desviación estándar relativa (RSD) de la concentración del fármaco en las unidades
de dosificación finales no es más de 2%, basándose en los datos de validación del proceso y en los datos de desarrollo, y si existiese una aprobación reglamentaria
para dicho cambio. La RSD de la concentración es la RSD de Ja concentración por unidad de dosificación (p/p o p/v), en donde Ja concentración por unidad de
dosificación es igual al resultado de la valoración por unidad de dosificación dividido por el peso de la unidad de dosificación individual. Ver la fórmula para la RSD
en la Tabla 2.+
614 (905> Uniformidad de Unidades de Dosificación / Pruebas Físicas USP 37

en donde los términos se definen en la Tabla 2.

Tabla 2
Variable Definición Condiciones Valor
Media de los contenidos individuales (z 1,
x2 , ... , Xn), expresados como el porcenta-
X je de la cantidad declarada
X¡, X2, · · · , Xn Contenido individual de las unidades anali-
zadas, expresado como porcentaje de la
cantidad declarada
n Tamaño de la muestra (número de unida-
des en una muestra)
k Constante de aceptabilidad Si n = 1O, entonces k = 2,4
Si n = 30, entonces k = 2,0
s Desviación estándar de la muestra 1

~(x,-X)
rl" n -1
'r
RSD Desviación estándar relativa (la desviación 1OOs/X
estándar de la muestra expresada como
porcentaje de la media)
M (caso 1) a aplicar cuando Valor de referencia Si 98,5% 5X 5101,5%,
T 5101,5 entonces M =X (AV= ks)
M = 98,5%
Si X <98,5%, entonces (AV= 98,5 - X+ ks)
Si X> 101,5%, M=lOl,5%
entonces (AV= X-101,5 + ks)
M (caso 2) a aplicar cuando Valor de referencia Si 98,5 5X 5T, M=X
T>101,5 entonces (AV= ks)
M = 98,5%
Si X <98,5%, entonces (AV= 98,5 - X+ ks)
M=T%
Si X >T, entonces (AV= X - T + ks)
Valor de aceptación (AV) Fórmula general:

Ll Máximo valor de aceptación permitido
L2 Máximo intervalo permitido para la desvía-
ción de cada unidad de dosificación anali-
zada a partir del valor calculado de M
T Contenido deseado por unidad de dosifica-
ción al momento de la fabricación, expre-
sacio como porcentaje de la cantidad de-
clarada. A menos que se indique de otro
modo, Tes 100,0% o Tes el contenido
deseado aprobado por el fabricante por
unidad de dosificación.
JM-XJ+ks
(Más arriba se especifican cálculos
para cada uno de los casos.)
L1 = 15,0 a menos que se especifi-
que algo diferente
Para los valores inferiores, nin- L2 = 25,0 a menos que se especifi-
gún resultado de unidad de que algo diferente
dosificación puede ser menor
de [1-(0,01 )(L2)]M, mientras
que para los valores superiores,
ningún resultado de unidad de
dosificación puede ser mayor
de [1 + (0,01 )(L2)]M. (Esto es-
tá basado en un valor de L2 de
25,0.)
USP 37 Pruebas Físicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación 615

VARIACIÓN DE •PESO.

Llevar a cabo una valoración del (de los) fármaco(s) en una muestra representativa del lote usando un método analítico
apropiado. Este valor es el resultado A, expresado como porcentaje de la cantidad declarada (ver Cálculo del Valor de Acepta-
ción). Se debe asumir que la concentración (peso del fármaco por peso de unidad de dosificación) es uniforme. Seleccionar no
menos de 30 unidades de dosificación y proceder según se indica a continuación para la forma farmacéutica designada.

Tabletas sin Cubierta o Recubiertas con Película

Pesar con exactitud 1 O tabletas individualmente. Calcular el contenido, expresado como porcentaje de la cantidad declara-
da, a partir del •peso• de la tableta individual y del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.

Cápsulas Duras

Pesar con exactitud 1 O cápsulas individualmente, teniendo cuidado de preservar la identidad de cada cápsula. Retirar el con-
tenido de cada cápsula por un medio adecuado. Pesar individualmente con exactitud las cubiertas vacías y calcular para cada
cápsula el •peso• neto de su contenido restando el •peso• de la cubierta del •peso• bruto respectivo. Calcular el contenido de
fármaco de cada cápsula a partir del •peso neto• del •contenido• de la cápsula individual y del resultado de la Valoración.
Calcular el valor de aceptación.

Cápsulas Blandas

Pesar con exactitud 1 O cápsulas intactas individualmente para obtener sus •pesos• brutos, teniendo cuidado de preservar la
identidad de cada cápsula. Luego cortar y abrir las cápsulas con ayuda de un instrumento cortante seco, limpio y adecuado,
como por ejemplo una tijera o una cuchilla afilada, y retirar el contenido lavando con un disolvente adecuado. Dejar que el
disolvente ocluido se evapore de las cubiertas a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30 minutos,
tomando precauciones para evitar la absorción o la pérdida de humedad. Pesar las cubiertas individuales y calcular el conteni-
do neto. Calcular el contenido de fármaco en cada cápsula a partir del •peso• del producto retirado de la cápsula individual y
del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.

Formas Farmacéuticas Sólidas Diferentes de Tabletas y Cápsulas

Proceder según se indica para Cápsulas Duras, tratando cada unidad como allí se describe. Calcular el valor de aceptación.

Formas Farmacéuticas Líquidas

Pesar con exactitud la cantidad de líquido que se retira de cada uno de 1 O envases individuales en condiciones normales de
uso. Si fuera necesario, calcular el volumen equivalente después de determinar la densidad. Calcular el contenido de fármaco
en cada envase a partir de la masa de producto retirada de los envases individuales y del resultado de la Valoración. Calcular el
valor de aceptación.

Cálculo del Valor de Aceptación

Calcular el valor de aceptación como se muestra en Uniformidad de Contenido con la excepción de que el contenido indivi-
dual de las unidades se reemplaza por el contenido estimado individual, como se define a continuación.

x,, x,, ... , Xn = contenido estimado individual de las unidades analizadas, en donde x =w x A/ W,
w,,w?, ... ,wn = •pesos. individuales de las unidades analizadas
A = contenido de fármaco (% de la cantidad declarada) obtenido usando un método analítico
apropiado
w = media de •pesos+ individuales
(w,, w,, ... , wJ

CRITERIOS

Aplicar los siguientes criterios, a menos que se especifique algo diferente.

616 (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación/ Pruebas Físicas USP 37

Formas Farmacéuticas Sólidas, Líquidas y Semisólidas

Se cumple con los requisitos de uniformidad de dosificación si el valor de aceptación de las primeras 1O unidades de dosifi-
cación es menor o igual a L1%. Si el valor de aceptación es mayor que L1%, analizar las siguientes 20 unidades y calcular el
valor de aceptación. Se cumple con los requisitos si el valor de aceptación final de las 30 unidades de dosificación es menor o
igual a L1 %, y si el contenido individual de •ninguna. unidad de dosificación es menor de [1 - (0,01 )(L2)]M ni mayor de [1 +
(0,01 )(L2)]M •como se especifica. en Cálculo del Valor de Aceptación en Uniformidad de Contenido o en Variación de •Peso•. A
menos que se especifique algo diferente, L1 es 15,0 y L2 es 25,0.

(911) VISCOSIDAD-MÉTODOS DEL VISCOSÍMETRO CAPILAR

Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una vis-
cosidad que es independiente de la tensión o velocidad de corte o cizallamiento. A menos que se indique de otro modo en
la monografía individual, usar el Método l.
• MÉTODO l. VISCOSÍMETRO (APILAR TIPO UBBELOHDE
Aparato: La determinación se puede llevar a cabo con un viscosímetro capilar tipo Ubbelohde (Figura 7) que cuente con
las especifiaciones descritas en la Tabla 7 o la Tabla 2.
Tabla 1
Constante Intervalo de Diámetro Diámetro
Nominal Viscosidad Interno Volumen Interno
Número de del Viscosímetro Cinemática Medible del Tubo, del Bulbo, del Tubo,
Tamaño (mm 2 /s 2 ) (mm 2 /s) R (mm) (±2%) c (ml) (±5%) N (mm)
1 0,01 3,5-10 0,64 5,6 2,8-3,2
lA 0,03 6-30 0,84 5,6 2,8-3,2
2 0,1 20-100 1,15 5,6 2,8-3,2
2A 0,3 60-300 1,51 5,6 2,8-3,2
3 1,0 200-1000 2,06 5,6 3,7-4,3
3A 3,0 600-3000 2,74 5,6 4,6-5,4
4 10 2000-1o000 3,70 5,6 4,6-5,4
4A 30 6000-30 000 4,07 5,6 5,6-6,4
5 100 20 000-1 00 000 6,76 5,6 6,8-7,5

Tabla 2
Constante Intervalo de Diámetro Diámetro
Número Nominal Viscosidad Interno Volumen Interno
de del Viscosímetro Cinemática Medible del Tubo, del Bulbo, del Tubo,
Tamaño (mm 2 /s 2 ) (mm 2 /s) R (mm) (±2%) c (ml) (±5%) N (mm)
o 0,001 0,3-1 0,24 1,0 6,0
oc 0,003 0,6-3 0,36 2,0 6,0
OB 0,005 1-5 0,46 3,0 6,0
1 0,01 2-10 0,58 4,0 6,0
lC 0,03 6-30 0,78 4,0 6,0
1B 0,05 10-50 0,88 4,0 6,0
2 0,1 20-100 1,03 4,0 6,0
2C 0,3 60-300 1,36 4,0 6,0
2B 0,5 100-500 1,55 4,0 6,0
3 1,0 200-1000 1,83 4,0 6,0
3C 3,0 600-3000 2,43 4,0 6,0
3B 5,0 1000-5000 2,75 4,0 6,5
4 10 2000-1o000 3,27 4,0 7,0
4C 30 6000-30 000 4,32 4,0 8,0
4B 50 1o000-50000 5,20 5,0 8,5
5 100 20 000-1 00 000 6,25 5,0 10,0
USP 37 Pruebas Físicas/ (911) Viscosidad-Métodos del Viscosímetro Capilar 617

L M N

- R

Figura 1. Viscosímetro Capilar Tipo Ubbelohde

Procedimiento: Llenar el viscosímetro a través del tubo (L) con una cantidad suficiente de muestra líquida que sea apro-
piada para el viscosímetro en uso o siguiendo las instrucciones del fabricante. Llevar a cabo el experimento con el tubo en
posición vertical. Llenar el bulbo (A) con el líquido y asegurarse de que el nivel del líquido en el bulbo (B) esté por debajo
de la salida del tubo de venteo (M). Sumergir el viscosímetro en un baño de agua o aceite estabilizado a la temperatura
especificada en la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1º, a menos que se especifique algo distinto en la
monografía individual. Mantener el viscosímetro en posición vertical durante un periodo de no menos de 30 minutos para
permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Cerrar el tubo (M) y elevar el nivel del líquido en el tubo
(N) hasta un nivel de aproximadamente 8 mm por encima de la marca (E = h 1). Mantener el líquido a este nivel cerrando el
tubo (N) y abriendo el tubo (M). Abrir el tubo (N) y medir el tiempo requerido para que el nivel del líquido baje desde la
marca (E= h 1) hasta (F = h2), usando un dispositivo apropiado para la medición exacta del tiempo. [NOTA-En la Tabla 1, el
tiempo de flujo mínimo debe ser 350 segundos para el tamaño número 1 y 200 segundos para todos los demás tamaños.
En la Tabla 2, el tiempo de flujo mínimo debe ser 300 segundos para el tamaño número O y 200 segundos para todos los
demás tamaños.]
Calibración: Calibrar cada viscosímetro a la temperatura de prueba usando fluidos con viscosidades conocidas de estánda-
res de viscosidad apropiados para determinar la constante del viscosímetro, k. Los valores de viscosidad de los estándares
de calibración deben abarcar el valor de viscosidad esperado de la muestra líquida. Determinar la constante del viscosíme-
tro a la misma temperatura que la muestra líquida en análisis.
Calcular la constante del viscosímetro, k, en mm 2/s 2, a partir de la ecuación:

k = Tjf(p X t)
TJ =viscosidad conocida del líquido (mPa · s)
p = densidad del líquido (g/ml)
t = tiempo de flujo requerido para que el líquido pase desde la marca superior hasta la marca inferior (s)
Cálculo de las viscosidades cinemática y newtoniana del fluido muestra: Seleccionar un viscosímetro capilar de modo
que el tiempo de flujo, t, esté entre 200 y 1000 segundos, y la corrección de energía cinemática sea, por lo regular, menos
de 1%. Si se conoce la constante de viscosidad, k, usar la siguiente ecuación para calcular la viscosidad cinemática, v, in
mm2/s, a partir del tiempo de flujo, t, en segundos.
V=kxt
Si se conoce la densidad del fluido a la temperatura de la medición de viscosidad, entonces la viscosidad newtoniana, 11, en
mPa · s, se calcula mediante la siguiente ecuación:
618 (911) Viscosidad-Métodos del Viscosímetro Capilar/ Pruebas Físicas USP 37

p = densidad del fluido (g/mL)

El tiempo de flujo del fluido en análisis es la media de no menos de tres determinaciones consecutivas. El resultado es váli-
do si la desviación estándar relativa porcentual (o/oRSD) para las tres lecturas es no más de 2,0%.
• MÉTODO 11. VISCOSÍMETRO CAPILAR TIPO 0STWALD
Aparato: La determinación se puede llevar a cabo con un viscosímetro capilar tipo Ostwald (Figura 2).

J_

Figura 2. Viscosímetro Capilar Tipo Ostwald

Procedimiento: Llenar el tubo con una cantidad de la muestra que sea apropiada para el viscosímetro en uso o siguiendo
las instrucciones del fabricante. El volumen de fluido usado debe ser tal que el bulbo inferior no se vacíe completamente
cuando el fluido se direcciona hacia arriba a través del tubo capilar hasta la marca de graduación más alta. Llevar a cabo el
experimento con el tubo en posición vertical. Sumergir el viscosímetro en un baño de agua o aceite estabilizado a la tem-
peratura especificada en la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1º, a menos que se especifique algo dis-
tinto en la monografía individual. Mantener el viscosímetro en posición vertical durante un periodo de no menos de 30
minutos para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Usando succión, direccionar el fluido a través
del tubo capilar hasta que el menisco alcance el nivel de la graduación más alta. Con el tubo de llenado y el tubo capilar
abiertos a la presión atmosférica, registrar el tiempo, en segundos, requerido para que el líquido fluya desde la marca supe-
rior hasta la marca inferior en el tubo capilar. [NOTA-El tiempo de flujo mínimo debe ser 200 segundos.]
Calibración y Cálculo de las viscosidades cinemática y newtoniana del fluido muestra: Proceder según se indica en el
Método l.

(912) MÉTODOS DEL REÓMETRO ROTATORIO

El principio del método se basa en medir la fuerza (torque) que actúa sobre un rotor cuando éste rota a una velocidad angular
constante (velocidad de rotación) en un líquido. Los reómetros o viscosímetros rotatorios se usan para medir la viscosidad de
fluidos newtonianos, es decir, fluidos que tienen una viscosidad independiente de la tensión o velocidad de corte, o la visco-
sidad aparente de fluidos no newtonianos, los cuales pueden presentar un comportamiento reológico diferente, dependien-
do de la velocidad y tensión de corte y de la temperatura. Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosi-
dad de fluidos newtonianos o la viscosidad aparente de fluidos no newtonianos. La viscosidad calculada de los fluidos new-
tonianos debe ser la misma (dentro del error experimental), independientemente de la velocidad de corte (o velocidad de
rotación). Dada la dependencia de la viscosidad con respecto a la temperatura, la temperatura de la sustancia que se está
midiendo se debe controlar dentro de ±0, 1º, a menos que se especifique de otro modo en la monografía individual. A me-
nos que se indique de otro modo en la monografía individual, usar el Método l.
USP 37 Pruebas Físicas / (912) Métodos del Reómetro Rotatorio 619

• MÉTODO l. REÓMETROS DE ROTOR, HUSILLO o Huso (SPINDLE)(REÓMETROS RELATIVOS-VISCOSÍMETROS DE ROTOR)

Aparato: En el reómetro de rotor, la viscosidad aparente se determina haciendo girar un rotor con forma de cilindro o dis-
co, según se muestra en las Figuras 7 y 2, respectivamente, sumergido en un gran volumen de líquido.

Figura 1. Rotores con forma de cilindro

Figura 2. Rotores con forma de disco

Procedimiento: En ciertas condiciones de prueba, la velocidad de corte entre la superficie externa del rotor y la superficie
interna del vaso de precipitados o vaso que contiene la sustancia de prueba puede variar. Como resultado, se debe descri-
bir la siguiente información adicional junto con la viscosidad medida:
1. Tamaño y geometría del rotor
2. Velocidad angular del rotor
3. Dimensiones internas del recipiente de la sustancia de prueba
4. Temperatura de la sustancia de prueba
5. Uso de accesorios para el instrumento, por ejemplo, un protector de rotor
La preparación de la muestra de prueba, incluyendo la equilibración de temperatura, se especifica en cada monografía in-
dividual. Se deben seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento con respecto a la carga de la muestra, selec-
ción del rotor y operación del reómetro.
Calibración: Seleccionar al menos dos estándares de calibración apropiados para la configuración del reómetro en uso y
cuyas viscosidades difieran en un valor apropiado dentro del intervalo de viscosidad de la sustancia de prueba que se está
midiendo. Medir las viscosidades aparentes de cada estándar a múltiples velocidades de rotación, conforme a lo descrito
anteriormente.
Se considera que un reómetro está calibrado cuando las viscosidades aparentes medidas están dentro de ±5% de los valo-
res declarados.
En general, la calibración, operación y limpieza de los reómetros se deben llevar a cabo de acuerdo con las recomendacio-
nes del fabricante del instrumento.
• MÉTODO 11. REÓMETROS DE CILINDRO CONCÉNTRICO
Aparato: En los reómetros de cilindro concéntrico, la viscosidad aparente se determina colocando el líquido en el espacio
entre el cilindro interno y el cilindro externo. Los reómetros rotatorios de tensión controlada y de velocidad controlada es-
tán disponibles comercialmente en configuraciones con especificaciones geométricas absolutas (p.ej., espacios anulares
muy pequeños entre cilindros concéntricos) que pueden proveer datos reológicos uniformes y significativos para fluidos no
newtonianos. Los reómetros de tensión controlada generan datos a tensión controlada y miden la velocidad de corte resul-
620 (912) Métodos del Reómetro Rotatorio / Pruebas Físicas USP 37

tante. Los reómetros de velocidad controlada generan datos a una velocidad controlada y miden la tensión de corte resul-
tante que se mide como torque en el eje del rotor. Los reómetros rotatorios de cilindro concéntrico en ocasiones reciben el
nombre de reómetros de vaso y cilindro ("cup-and-bob"). El uso de estos reómetros implica consideraciones adicionales de
diseño, dependiendo de si lo que gira es el cilindro externo (el vaso) o el cilindro interno. Los reómetros de vaso rotatorio
reciben el nombre de sistemas Couette, mientras que a los reómetros de cilindro interno rotatorio se les denomina sistemas
Searle, según se muestra en las Figuras 3 y 4, respectivamente.

Ro-
R1---+:

r-
h

_ ¡_ _ - -'- - - - - -
T/ V

Figura 3. Sistema de cilindro concéntrico Couette para reometría rotacional

USP 37 Pruebas Físicas/ (912) Métodos del Reómetro Rotatorio 621

~ ~
(Ú

"'---- v
M
1 1

~Ro~
-+--R1-:
1
-

Figura 4. Sistema de cilindro concéntrico Searle para reometría rotacional

Procedimiento: Colocar una cantidad suficiente de una solución o fluido de prueba en el reómetro y dejar que la muestra
alcance el equilibrio térmico, según se indica en la monografía individual. Poner en funcionamiento el reómetro siguiendo
el procedimiento recomendado por el fabricante del instrumento. Para sistemas no newtonianos, la monografía indica el
tipo de reómetro que se debe usar y las velocidades de corte a las que se deben realizar las mediciones. [NOTA-También
debe registrarse cualquier evidencia de comportamiento reológico dependiente del tiempo (p.ej. tixotrópico o reopécti-
co).] Conforme a lo indicado anteriormente, la viscosidad aparente se debe determinar de preferencia en un intervalo de
velocidades de corte apropiado para el material en análisis. El procedimiento empleado para medir la viscosidad aparente
del líquido se repite, usando una serie de diferentes velocidades de rotación o torques. A partir de una serie de mediciones
de viscosidad, se puede obtener la relación entre la velocidad de corte y la tensión de corte de un líquido no newtoniano-
es decir, las características de flujo del fluido no newtoniano.
Cálculo de la velocidad de corte, tensión de corte y viscosidad: Para líquidos no newtonianos, resulta esencial especifi-
car la tensión de corte, o; o la velocidad de corte y, a la que se mide la viscocidad. Cuando se presentan condiciones de
espacio estrecho (condiciones satisfechas en reómetros absolutos), la velocidad de corte yen s- 1 y la tensión de corte a, en
Pa (N · m- 2 o kg · m- 1 • s- 2 ), se calculan usando las Ecuaciones (7) y (2) siguientes:

(1)

(2)

R0 = radio del cilindro externo (m)

R1 = radio del cilindro interno (m)
w =velocidad angular (radianes/s)
M = torque que actúa sobre la superficie del cilindro (N · m)
h = altura de inmersión del cilindro interno en el medio líquido (m)
 •
622 (912) Métodos del Reómetro Rotatorio / Pruebas Físicas USP 37

Por lo general, la velocidad angular se puede calcular usando la Ecuación (3):

w=( ~~ )n (3)

n =velocidad rotatorio, en revoluciones/min (rpm)

Para flujo laminar, la viscosidad ri (o viscosidad aparente YlApp), en Pa · s, se proporciona mediante la siguiente ecuación:
[NOTA-1 Pa · s = 1000 mPa ·s.)

(4)

k = la constante del aparato (radianes/m 3)

Calibración: Los reómetros rotatorios requieren una calibración con estándares reológicos apropiados para los intervalos
de velocidad o tensión de corte y para la naturaleza del fluido o material que se está evaluando. Para determinar o confir-
mar la constante del aparato, se deben realizar de antemano las pruebas necesarias usando fluidos de viscocidades conoci-
das de estándares de viscosidad apropiados a la temperatura requerida.
• MÉTODO 111. REÓMETROS DE CONO Y PLACA
Aparato: En los reómetros de cono y placa, el líquido se introduce en el espacio entre un disco o placa planos y un cono
los cuales forman un ángulo definido. La medición de viscosidad se puede realizar haciendo girar el cono o la placa, según
se muestra en las Figuras 5 y 6, respectivamente. [NOTA-Puesto que el volumen de muestra es pequeño, incluso una pe-
queña pérdida absoluta de disolventes puede ocasionar un gran cambio porcentual en la viscosidad. Dicha pérdida tiene
una importancia particularmente relevante para disolventes volátiles pero puede ser significativa incluso para disolventes no
volátiles como el agua.]

Figura 5. Reómetro rotatorio de cono y placa con cono giratorio

USP 37 Pruebas Físicas/ (913) Método del Viscosímetro de Bola Rodante 623

--R-' 1

1
1

Figura 6. Reómetro rotatorio de cono y placa con placa giratoria

Procedimiento: Proceder según se indica en el Método 11. Reómetros de Cilindro Concéntrico.

Cálculo de la velocidad de corte, tensión de corte y viscosidad: La velocidad de corte yen s- 1 , y la tensión de corte cr,
en Pa, se calculan mediante las Ecuaciones (5) y (6).

r~(: }o (5)

~~[ ~~R' JM (6)

a =ángulo entre la placa plana y el cono (radianes)
R = radio del cono (m)
w =velocidad angular (radianes/s)
M = torque que actúa sobre la placa plana o la superficie del cono (N · m)
Para flujo laminar, la viscosidad r¡ (o viscosidad aparente llApp), en Pa · s, se provee mediante la siguiente ecuación:

ry 0 ryApp =( 2 ~~3 )(: )=k: (7)

k =constante del aparato (radianes/m3)

Calibración: Proceder según se indica en Calibración en el Método 11. Reómetros de Cilindro Concéntrico

(913) MÉTODO DEL VISCOSÍMETRO DE BOLA RODANTE

El siguiente procedimiento se usa para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una viscosi-
dad que es independiente de la tensión o velocidad de corte.
Aparato: Ver la Figura 7.
El diseño básico de un viscosímetro de bola rodante consiste en un tubo (o capilar) que contiene la muestra líquida en análi-
sis y una bola cuyo tiempo de rodado debe ser al menos 20 segundos en el ángulo de medición en el líquido de muestra.
624 (913) Método del Viscosímetro de Bola Rodante/ Pruebas Físicas USP 37

Fv: Fuerza de viscosidad

F8 : Fuerza de flotación
Fe: Gravedad
Tubo o Capilar - Fv

FB 0
...,.~--- Bola
.....,""'-___ Muestra

Figura 1. Diseño básico para un viscosímetro de bola rodante.

Principio de Medición: La medición de viscosidad por medio de la bola rodante se basa en la Ley de Stokes y se ve influen-
ciada por el ángulo de inclinación del tubo (o capilar). La viscosidad newtoniana, r¡, en mPa · s, se calcula usando la siguiente
ecuación:

p 1 = densidad de la bola usada (g/mL)

p 2 = densidad de la muestra líquida (g/mL)
g = constante gravitacional (mm/s 2)
r = radio de la bola (mm)
0= ángulo de inclinación del tubo (o capilar)
v00 = velocidad terminal de la bola (mm/s)
Determinar la viscosidad del líquido observando el tiempo de rodado de una esfera sólida (bola) bajo la influencia de la gra-
vedad en un tubo cilíndrico inclinado relleno del líquido de muestra. Medir el tiempo que toma a la bola recorrer la distancia
establecida entre dos marcas de anillo o sensores de medición. Para cada uno de los tiempos de rodado medidos, la viscosidad
resultante se puede expresar como viscosidad dinámica (mPa · s) o como viscosidad cinemática (mm 2/s) para una muestra con
una densidad conocida.
Procedimiento: Seleccionar un sistema de medición [combinación de tubo (o capilar) y bola] dentro del intervalo anticipado
de viscosidad del líquido de muestra. Calentar el tubo limpio y seco y la bola del viscosímetro a la temperatura especificada en
la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1º, a menos que se especifique algo distinto en la monografía indivi-
dual. Seleccionar un ángulo de medición para obtener un tiempo de rodado mínimo de 20 segundos. Llenar el tubo con el
líquido de muestra, procurando evitar la formación de burbujas. Cerrar el tubo y colocarlo en el instrumento. Para un viscosí-
metro de bola rodante con un tubo de diámetro grande, dejar que se equilibre a la temperatura especificada durante no me-
nos de 15 minutos. Para un viscosímetro de microbola rodante, seguir las instrucciones del fabricante con respecto al equilibrio
de la temperatura. Soltar la bola y registrar el tiempo requerido para que la bola ruede desde la marca de anillo superior hasta
la marca inferior (o sensor de medición). Repetir la prueba al menos cuatro veces.
El tiempo de rodado en el fluido en análisis es la media de no menos de cuatro determinaciones consecutivas. El resultado es
válido si la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) para las cuatro lecturas no es más de 2,0%.
Cálculo y Calibración: Calcular la viscosidad newtoniana, r¡, en mPa · s, usando la fórmula:

r¡ = k X (p, - P2) X t
k = constante de calibración del instrumento (mm 2/s 2) a un ángulo y temperatura de medición especificados
p 1 = densidad de la bola usada (g/mL)
p 2 = densidad del líquido de muestra (g/mL)
t = tiempo de rodado de la bola (s).
Calibrar cada combinación de tubo (o capilar) y bola a la temperatura y ángulo de prueba usando fluidos con viscosidades y
densidades conocidas (estándares de viscosidad) para determinar la constante del sistema de medición, k. [NOTA-Algunos vis-
cosímetros automatizados emplean una función polinómica para determinar la calibración para diversos ángulos y temperatu-
ras.] Los valores de viscosidad de los estándares de calibración deben contener el valor de viscosidad esperado del líquido de
muestra.
Las calibraciones son específicas para el radio y densidad de la bola, la temperatura y ángulo de prueba. Siempre que se
cambie alguno de estos parámetros será necesaria una recalibración.
Cuando no se dispone de valores de referencia a la temperatura de prueba requerida, se deben seguir las instrucciones del
fabricante para correcciones matemáticas a la función de calibración. Cuando los materiales de la bola y el tubo no son simila-
res, se deben aplicar correcciones calculadas usando los coeficientes de expansión térmica lineal de los materiales.
USP 37 Pruebas Físicas/ (921) Determinación de Agua 625

(921) DETERMINACIÓN DE AGUA

Numerosos artículos farmacopeicos son hidratos o contienen agua en forma adsorbida. Como consecuencia, la determina-
ción del contenido de agua es importante para demostrar el cumplimiento con las normas farmacopeicas. Por lo general, en
cada monografía se exige uno de los métodos que se describen a continuación, en función de la naturaleza del artículo. En
algunos casos poco comunes se permite elegir entre dos métodos. Si el artículo contiene agua de hidratación, se utiliza el
Método I (Volumétrico), el Método 11 (Azeotrópico) o el Método 111 (Gravimétrico), según se indica en la monografía individual, y el
requisito se especifica bajo el encabezado Agua. ·
El encabezado Pérdida por Secado (ver Pérdida por Secado (731 )) se utiliza en aquellos casos en los que la pérdida por calenta-
miento puede no ser totalmente de agua.

MÉTODO 1 (VOLUMÉTRICO)
Determinar el agua mediante el Método Ja, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.

Método la (Valoración Volumétrica Directa)

Principio-La determinación volumétrica del agua está basada en la reacción cuantitativa del agua con una solución anhi-
dra de dióxido de azufre y yodo en presencia de una solución amortiguadora que reacciona con los iones hidrógeno.
En la solución volumétrica original, conocida como Reactivo de Karl Fischer, el dióxido de azufre y el yodo se disuelven en
piridina y metanol. La muestra de prueba puede valorarse con el Reactivo directamente o el análisis puede realizarse mediante
un procedimiento de valoración residual. La estequiometría de la reacción no es exacta y la reproducibilidad de la determina-
ción depende de factores tales como las concentraciones relativas de los ingredientes del Reactivo, la naturaleza del disolvente
inerte utilizado para disolver la muestra de prueba y la técnica utilizada en la determinación en cuestión. Por lo tanto, para
conseguir la exactitud deseada se utiliza una técnica empíricamente estandarizada. La precisión del método depende en gran
parte de la medida en que la humedad atmosférica es eliminada del sistema. Normalmente la valoración de agua se realiza
utilizando metano! anhidro como disolvente para la muestra de prueba. En algunos casos pueden utilizarse otros disolventes
adecuados para muestras de prueba especiales o no habituales. En estos casos, se recomienda la adición de al menos 20% de
metanol u otro alcohol primario.
Aparato-Puede utilizarse cualquier aparato que garantice una exclusión de la humedad atmosférica y una determinación
del punto final adecuadas. En el caso de una valoración directa de una solución incolora, el punto final se puede observar vi-
sualmente como un cambio de color de amarillo canario a ámbar. El caso inverso se observa cuando se realiza una valoración
residual de una muestra de prueba. Sin embargo, de forma más habitual el punto final se determina de forma electrométrica
utilizando un aparato con un circuito eléctrico simple que genera un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV entre
un par de electrodos de platino sumergidos en la solución que se desea valorar. En el punto final de la valoración un ligero
exceso de reactivo aumenta el flujo de corriente entre 50 y 150 microamperios durante un período de 30 segundos a 30 mi-
nutos, dependiendo de la solución que se esté valorando. Este período es menor en el caso de sustancias que se disuelven en
el reactivo. En algunos valoradores volumétricos automáticos el cambio abrupto de corriente o de potencial en el punto final
hace cerrar una válvula operada por solenoide que controla la bureta que suministra la solución volumétrica. Los aparatos dis-
ponibles comercialmente comprenden por lo general un sistema cerrado que consta de una o dos buretas automáticas y un
vaso de valoración cubierto herméticamente equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magnético. El aire en el
sistema se mantiene seco con un desecante adecuado y el vaso de valoración puede purgarse mediante una corriente de nitró-
geno seco o de aire seco.
Reactivo-Preparar el Reactivo de Karl Fischer según se indica a continuación. Agregar 125 g de yodo a una solución que
contenga 670 mL de metano! y 170 mL de piridina, y enfriar. Colocar 100 mL de piridina en una probeta graduada de 250 mL
y, manteniendo la piridina fría en un baño de hielo, introducir dióxido de azufre seco hasta alcanzar un volumen de 200 ml.
Agregar lentamente esta solución a la mezcla de yodo enfriada, agitando. Agitar hasta disolver el yodo, transferir la solución al
aparato y dejar la solución en reposo durante la noche antes de estandarizar. Un mL de esta solución recientemente preparada
equivale aproximadamente a 5 mg de agua; como esta solución se deteriora gradualmente, se recomienda estandarizarla den-
tro de un período de 1 hora antes de su uso o diariamente si su uso es continuo. Proteger la solución de la luz mientras se esté
utilizando. Almacenar el reactivo preparado a granel en un recipiente con tapón de vidrio adecuadamente sellado, totalmente
protegido de la luz y refrigerado. Para determinar agua en cantidades de trazas (menos de 1%), es preferible usar un Reactivo
con un factor de equivalencia de agua de no más de 2,0, el cual generará el consumo de un volumen más significativo de
solución volumétrica.
Puede utilizarse una solución estabilizada de reactivo de tipo Karl Fischer disponible comercialmente. También pueden utili-
zarse reactivos disponibles comercialmente que contengan disolventes o bases diferentes a la piridina o alcoholes diferentes al
metanol. Éstos pueden ser soluciones individuales o reactivos formados in situ combinando los componentes de los reactivos
presentes en dos soluciones distintas. El Reactivo diluido requerido en algunas monografías debe diluirse de acuerdo con las
 •
626 (921) Determinación de Agua / Pruebas Físicas USP 37

instrucciones del fabricante. Como diluyente puede utilizarse metanol u otro disolvente adecuado, como el éter monometílico
de etilenglicol.
Preparación de Prueba-A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, utilizar una cantidad pesa-
da o medida con exactitud de la muestra en análisis con un contenido de agua estimado de 2-250 mg. La cantidad de agua
depende del factor de equivalencia de agua del Reactivo y del método de determinación del punto final. En la mayoría de los
casos, se puede estimar la cantidad mínima de la muestra, en mg, por la fórmula:

FCV/KF

en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo, en mg por ml; Ces el volumen usado, en porcentaje, de la capa-
cidad de la bureta; V es el volumen de la bu reta, en ml; y KF es el límite o contenido razonable de agua esperado en la mues-
tra, en porcentaje. C está generalmente entre 30% y 100% para la valoración manual, y entre 10% y 100% para el método
instrumental de determinación del punto final. [NOTA-Se recomienda que el producto de FCV sea mayor o igual a 200 para el
cálculo, a fin de asegurar que la cantidad mínima de agua valorada sea mayor o igual a 2 mg.]
Si la muestra en análisis es un aerosol con propelente, conservarla en el congelador durante no menos de 2 horas, abrir el
envase y analizar 10,0 ml de la muestra bien mezclada. Para valorar la muestra, determinar el punto final a una temperatura
de 1Oº o mayor.
Si la muestra en análisis son cápsulas, utilizar una porción del contenido mezclado de no menos de 4 cápsulas.
Si la muestra en análisis son tabletas, utilizar el polvo de no menos de cuatro tabletas molidas hasta polvo fino en una at-
mósfera con valores de temperatura y humedad relativa que se sepa que no afectan los resultados.
En los casos en los que la monografía especifique que la muestra en análisis es higroscópica, colocar una porción del sólido,
pesada con exactitud, en un vaso de valoración, procediendo inmediatamente y procurando evitar la absorción de humedad
atmosférica. Si la muestra está constituida por una cantidad definida de sólido como producto liofilizado o polvo dentro de un
vial, utilizar una jeringa seca para inyectar un volumen adecuado de metanol, u otro disolvente adecuado, medido con exacti-
tud, en un recipiente tarado y agitar hasta disolver la muestra. Con la misma jeringa, retirar la solución del recipiente y transfe-
rirla a un vaso de valoración preparado según se indica en Procedimiento. Repetir el procedimiento con una segunda porción
de metanol u otro disolvente adecuado, medido con exactitud, agregar este lavado al vaso de valoración y valorar inmediata-
mente. Determinar el contenido de agua, en mg, de una porción de disolvente con el mismo volumen total que el utilizado
para disolver la muestra y para lavar el recipiente y la jeringa, según se indica en Estandarización de la Solución de Agua para
Valoraciones Volumétricas Residuales, y restar este valor del contenido de agua, en mg, obtenido en la valoración de la muestra
en análisis. Secar el recipiente y su cierre a 100º durante 3 horas, dejar que se enfríen en un desecador y pesar. Determinar el
peso de la muestra analizada a partir de la diferencia en peso con respecto al peso inicial del recipiente.
Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conecta-
do al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrógeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formación de agua como resultado de la deshidratación debida a la descomposición de los componentes de la muestra, lo cual
puede invalidar este método.
Estandarización del Reactivo-Colocar una cantidad suficiente de metano! o de otro disolvente adecuado en el vaso de
valoración para cubrir los electrodos y agregar suficiente Reactivo para obtener el color característico del punto final, o
100±50 microamperios de corriente continua con un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV.
Se puede usar Agua Purificada, tartrato de sodio dihidrato, un Estándar de Referencia USP, o estándares comerciales con un
certificado de análisis rastreable hasta un estándar nacional para estandarizar el Reactivo. El factor de equivalencia del reactivo,
el volumen de valoración recomendado, el tamaño de la bureta y la cantidad de estándar que se va a medir son factores a
considerar al momento de seleccionar el estándar y la cantidad que se va a usar. 1 Para Agua Purificada o estándares de agua,
agregar rápidamente el equivalente a entre 2 y 250 mg de agua. Calcular el factor de equivalencia del agua, F, en mg de agua
por ml de reactivo, por la fórmula:

W/V
en donde W es el peso, en mg, del agua contenida en la alícuota de estándar usado; y V es el volumen, en ml, del Reactivo
usado en la valoración. Para tartrato de sodio dihidrato, agregar rápidamente 20-125 mg de tartrato de sodio dihidrato
(C 4 H4 Na 2 0 6 • 2H 2 0), pesados con exactitud por diferencia, y valorar hasta el punto final. El factor de equivalencia de agua F, en
mg de agua por ml de reactivo, se calcula por la fórmula:
W/V (36,04/230,08)
en donde 36,04 es dos veces el peso molecular de agua y 230,08 es el peso molecular de tartrato de sodio dihidrato; W es el
peso, en mg, del tartrato de sodio dihidrato; y V es el volumen, en ml, del Reactivo consumido en la segunda valoración. To-
mar en cuenta que la solubilidad del tartrato de sodio dihidrato en metanol es tal que podría necesitarse metanol nuevo para
valoraciones adicionales del estándar de tartrato de sodio dihidrato.

1 Considerar una configuración en la que el factor de equivalencia del reactivo sea de 5 mg/ml y el volumen de la bureta sea de 5 ml, así como un punto final
instrumental. Se pueden usar cantidades de estándar equivalentes a entre 2,5 mg y 22,5 mg de agua (10%-90% de la capacidad de la bureta) basándose en la
bureta y el factor de equivalencia del reactivo. El límite superior de este intervalo implicaría una cantidad excesiva de tartrato de sodio dihidrato. Si se pesa Agua
Purificada o un estándar, se requiere una balanza analítica apropiada para la cantidad pesada.
USP 37 Pruebas Físicas/ \921) Determinación de Agua 627

Procedimiento-A menos que se especifique algo diferente, transferir suficiente metano! u otro disolvente adecuado al va-
so de valoración asegurándose de que el volumen sea suficiente para cubrir los electrodos (aproximadamente 30-40 mL) y va-
lorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual para consumir la humedad que pudiera estar presente. (No
tomar en cuenta el volumen consumido, ya que no se utiliza en los cálculos). Agregar rápidamente la Preparación de Prueba,
mezclar, y volver a valorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual. Calcular el contenido de agua de la
muestra tomada, en mg, por la fórmula:
SF
en donde Ses el volumen, en mL, del Reactivo consumido en la segunda valoración; y Fes el factor de equivalencia de agua
del Reactivo.

Método lb (Valoración Volumétrica Residual)

Principio-Ver la información que figura en la sección Principio en Método la. En la valoración residual se agrega un exceso
de Reactivo a la muestra de prueba, se espera un tiempo suficiente para que se complete la reacción y se valora el Reactivo no
consumido con una solución estándar de agua en un disolvente como el metano!. El procedimiento de valoración residual se
aplica de forma general y evita los problemas que pueden surgir en la valoración directa de sustancias en las que el agua unida
se libera lentamente.
Aparato, Reactivo y Preparación de Prueba-Usar el Método la.
Estandarización de la Solución de Agua para Valoraciones Volumétricas Residuales-Preparar una Solución de Agua di-
luyendo 2 mL de agua con metano! u otro disolvente adecuado hasta 1000 mL. Estandarizar esta solución valorando 25,0 mL
con el Reactivo, previamente estandarizado según se indica en Estandarización del Reactivo. Calcular el contenido de agua, en
mg por mL, de la Solución de Agua tomada, por la fórmula:

V'F/25
en donde V' es el volumen del Reactivo consumido y Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo. Determinar el conteni-
do de agua de la Solución de Agua semanalmente y estandarizar periódicamente el Reactivo contra éste según sea necesario.
Procedimiento-Si la monografía individual especifica que el contenido de agua debe ser determinado por el Método lb,
transferir suficiente metano! u otro disolvente adecuado al vaso de valoración, asegurándose de que el volumen sea suficiente
para cubrir los electrodos (aproximadamente 30-40 mL) y valorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual.
Agregar rápidamente la Preparación de Prueba, mezclar y agregar un exceso, medido con exactitud, de Reactivo. Esperar un
tiempo suficiente para que se complete la reacción y valorar el Reactivo no consumido con la Solución de Agua estandarizada
hasta el punto final electrométrico o visual. Calcular el contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la fórmula:

F(X' - XR)

en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo; X' es el volumen, en mL, del Reactivo agregado después de intro-
ducir la muestra; X es el volumen, en mL, de la Solución de Agua estandarizada necesaria para neutralizar el Reactivo no consu-
mido; y Res el cociente, V'/25 (mL de Reactivo/mL de Solución de Agua), determinado a partir de la Estandarización de la Solu-
ción de Agua para Va/oraciones Volumétricas Residuales.

Método le (Valoración Culombimétrica)

Principio-Para la determinación culombimétrica del agua se utiliza la reacción de Karl Fischer. El yodo, sin embargo, no se
agrega en forma de solución volumétrica sino que se obtiene por oxidación anódica en una solución que contiene yoduro. La
celda de reacción consta normalmente de un amplio compartimiento anódico y de un pequeño compartimiento catódico, se-
parados entre sí por un diafragma. También pueden utilizarse otros tipos adecuados de celdas de reacción (p.ej., sin diafrag-
ma). Cada compartimiento tiene un electrodo de platino que conduce la corriente a través de la celda. El yodo, que se produ-
ce en el electrodo anódico, reacciona inmediatamente con el agua que está presente en el compartimiento. Cuando se ha
consumido toda el agua, se produce un exceso de yodo que normalmente se detecta electrométricamente, lo que indica el
punto final. La humedad se elimina del sistema mediante pre-electrólisis. No es necesario cambiar la solución de Karl Fischer
después de cada determinación ya que las diferentes determinaciones pueden realizarse de forma sucesiva en la misma solu-
ción reactivo. Un requisito de este método es que cada componente de la muestra de prueba sea compatible con los demás
componentes y que no se produzcan reacciones secundarias. Normalmente las muestras son transferidas al vaso en forma de
solución mediante la inyección a través de un septo. Los gases se pueden introducir en la celda utilizando un tubo de entrada
de gas adecuado. La precisión del método depende fundamentalmente del grado de eliminación de la humedad atmosférica
en el sistema; por tanto, la introducción de sólidos en la celda puede requerir precauciones tales como trabajar en una cámara
cerrada con guantes en una atmósfera de gas inerte seco. El control del sistema se puede efectuar midiendo la deriva de la
línea base, lo cual no excluye la necesidad de una corrección con un blanco cuando se usa como vehículo de introducción de
la muestra. Este método es especialmente adecuado para sustancias químicas inertes como hidrocarburos, alcoholes y éteres.
En comparación con la valoración volumétrica de Karl Fischer, la culombimetría es un micrométodo.
628 (921) Determinación de Agua / Pruebas Físicas USP 37

Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conecta-
do al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrógeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formación de agua como resultado de reacciones de descomposición por la deshidratación de los componentes de la muestra,
lo cual puede invalidar este método.
Aparato-Resulta adecuado cualquier aparato comercialmente disponible que conste de un sistema absolutamente hermé-
tico equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magnético. El microprocesador del instrumento controla el proce-
dimiento analítico y muestra los resultados. No es necesario calibrar el instrumento ya que la corriente consumida puede me-
dirse de forma absoluta.
Reactivo-Ver las recomendaciones del fabricante.
Preparación de Prueba-Cuando la muestra sea un sólido soluble, se puede disolver una cantidad apropiada, pesada con
exactitud, en metano! anhidro u otros disolventes adecuados.
Cuando la muestra sea un sólido insoluble, se puede extraer una cantidad apropiada, pesada con exactitud, usando un di-
solvente anhidro adecuado y se puede inyectar en la solución del anolito. Alternativamente, se puede usar una técnica de eva-
poración en la que el agua se libere y evapore por calentamiento de la muestra en un tubo en una corriente de gas inerte seco.
El gas pasa luego al interior de la celda.
Cuando la muestra se va a usar directamente sin disolver en un disolvente anhidro adecuado, se puede introducir una canti-
dad apropiada, pesada con exactitud, directamente en la cámara.
Cuando la muestra es un líquido y es miscible con metanol anhidro u otros disolventes adecuados, se puede agregar una
cantidad apropiada, pesada con exactitud, al metano! anhidro u otros disolventes adecuados.
Procedimiento-Usando un dispositivo seco, inyectar o agregar directamente en el anolito una cantidad, medida con
exactitud, de la muestra o de la preparación de la muestra que se estima contiene entre 0,5 y 5 mg de agua, o la cantidad
recomendada por el fabricante del instrumento, mezclar, y llevar a cabo la valoración culombimétrica hasta el punto final elec-
trométrico. Leer el contenido de agua de la Preparación de Prueba líquida directamente de la pantalla del instrumento y calcu-
lar el porcentaje presente en la sustancia. Realizar una determinación con un blanco, según sea necesario, y realizar las correc-
ciones necesarias.

MÉTODO 11 (AZEOTRÓPICO-DESTILACIÓN CON TOLUENO)

Aparato-Utilizar un matraz de vidrio de 500 mL, A, conectado mediante una trampa, B, a un condensador de reflujo, C,
usando juntas de vidrio esmerilado (ver la Figura 1).

Figura 1. Aparato para Determinación Azeotrópica con Tolueno

Las dimensiones críticas de las piezas del aparato son las siguientes. El tubo de conexión, D, tiene un diámetro interno de 9-
11 mm. La trampa tiene una longitud de 235-240 mm. El condensador, si es del tipo de tubo recto, tiene una longitud aproxi-
mada de 400 mm y un diámetro interior de no menos de 8 mm. El tubo receptor, E, tiene una capacidad de 5 mL y su parte
cilíndrica, con una longitud de 146-156 mm, está graduada en subdivisiones de O, 1 mL, de forma que el error de lectura no es
mayor de 0,05 mL para cualquier volumen indicado. La fuente de calor es preferiblemente un calentador eléctrico con control
de reóstato o un baño de aceite. La parte superior del matraz y el tubo de conexión pueden estar aislados.
USP 37 Pruebas Físicas / (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 629

Limpiar el tubo receptor y el condensador con un limpiador adecuado, enjuagar exhaustivamente con agua y secar en un
horno. Preparar el tolueno que se va a utilizar agitando con una pequeña cantidad de agua, separando el exceso de agua y
destilando el tolueno.
Procedimiento-Colocar en un matraz seco una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud al centígramo más próxi-
mo, para obtener de 2-4 mL de agua. Si la sustancia es de tipo pastoso, pesar sobre una lámina metálica ovalada con un tama-
ño que pase justo a través del cuello del matraz. Si existe la posibilidad de que al ingresar la sustancia se produzcan proyeccio-
nes, agregar una cantidad suficiente de arena lavada y seca para cubrir el fondo del matraz o una serie de tubos capilares de
punto de fusión, con una longitud aproximada de 1 00 mm, sellados por el extremo superior. Colocar aproximadamente
200 mL de tolueno en el matraz, conectar el aparato y llenar el tubo receptor, E, con tolueno vertido a través de la parte supe-
rior del condensador. Calentar el matraz suavemente durante 15 minutos y, una vez que el tolueno empiece a hervir, destilar a
una velocidad de aproximadamente dos gotas por segundo hasta que la mayor parte del agua haya sido arrastrada y después
de aumentar la velocidad de destilación aproximadamente a cuatro gotas por segundo. Cuando aparentemente se haya desti-
lado toda el agua, enjuagar el interior del tubo del condensador con tolueno mientras se cepilla el tubo en forma descendente
con un cepillo para tubos fijado a un alambre de cobre y saturado con tolueno. Continuar la destilación durante cinco minu-
tos; luego retirar la fuente del calor y dejar que el tubo receptor se enfríe a temperatura ambiente. Si quedan gotitas de agua
adheridas a las paredes del tubo receptor, arrastrarlas hacia abajo con un cepillo formado por una cinta de goma envuelta
alrededor de un alambre de cobre y humedecida con tolueno. Una vez que el agua y el tolueno se hayan separado totalmente,
leer el volumen de agua y calcular el porcentaje que estaba presente en la sustancia.

MÉTODO 111 (GRAVIMÉTRICO)

Procedimiento para Sustancias Químicas-Proceder según se indica en la monografía individual preparando la sustancia
química según se indica en Pérdida por Secado (731 ).
Procedimiento para Sustancias Biológicas-Proceder según se indica en la monografía individual.
Procedimiento para Artículos de Origen Botánico-Colocar en una cápsula de evaporación tarada aproximadamente
1O g del fármaco, pesados con exactitud, y preparados según se indica (ver Métodos de Análisis en Artículos de Origen Botánico
(561 )). Secar a 105º durante 5 horas y pesar. Continuar el secado y la pesada a intervalos de l hora hasta que la diferencia
entre dos pesadas sucesivas no sea mayor de 0,25%.

(941) CARACTERIZACIÓN DE SÓLIDOS CRISTALINOS Y

PARCIALMENTE CRISTALINOS POR DIFRACCIÓN DE RAYOS X SOBRE
POLVO (DRXP)

INTRODUCCIÓN
Toda fase cristalina de una sustancia determinada produce un patrón característico de difracción de rayos X. Los patrones de
difracción (o difractogramas) se pueden obtener a partir de un polvo cristalino orientado aleatoriamente, compuesto de crista-
litos o fragmentos de cristal de tamaño finito. En esencia, de un patrón de difracción de un polvo se pueden obtener tres tipos
de información: la posición angular de las líneas de difracción (dependiendo de la geometría y el tamaño de la celda unidad),
las intensidades de las líneas de difracción (dependiendo principalmente del tipo y arreglo de los átomos y de la orientación de
las partículas dentro de la muestra) y los perfiles de las líneas de difracción (dependiendo de la resolución instrumental, el ta-
maño de los cristalitos, la tensión y el espesor de la muestra).
Los experimentos que arrojan posiciones angulares e intensidades de las líneas se pueden utilizar para aplicaciones como el
análisis cualitativo de las fases (p.ej., la identificación de las fases cristalinas) y el análisis cuantitativo de las fases de materiales
cristalinos. También se puede hacer un cálculo de las fracciones amorfas y cristalinas. 1
El método de difracción de rayos X sobre polvo (DRXP) ofrece una ventaja sobre otros métodos de análisis pues por lo gene-
ral es de naturaleza no destructiva (para garantizar una muestra orientada aleatoriamente, la preparación de la muestra se limi-
ta habitualmente a una molienda). Las investigaciones por DRXP se pueden efectuar también bajo condiciones in situ en mues-
tras expuestas a condiciones no ambientales, tales como temperatura y humedad bajas o altas.

1 Existen muchas otras aplicaciones de la técnica de difracción de rayos X sobre polvo que se pueden aplicar a las sustancias farmacéuticas cristalinas, como son la
determinación de las estructuras cristalinas, el refinamiento de las estructuras cristalinas, la determinación de la pureza cristalográfica de las fases cristalinas y la
caracterización de la textura cristalográfica. Estas aplicaciones no se describen en este capítulo.
630 (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas F(sicas USP 37

PRINCIPIOS

La difracción de rayos X resulta de la interacción entre los rayos X y las nubes de electrones de los átomos. Dependiendo del
ordenamiento atómico, pueden surgir interferencias de los rayos X dispersados. Estas interferencias son constructivas cuando la
diferencia de recorrido entre dos ondas difractadas de rayos X es un múltiplo entero de la longitud de onda. Esta condición
selectiva está descrita por la ecuación de Bragg, llamada también ley de Bragg (ver la Figura 7).

1
t11
I

/~ •

I
I

I
I

,
I

• • •
Figura 1. Difracción de rayos X por un cristal, de acuerdo con la ley de Bragg.

La longitud de onda, Je, de los rayos X es del mismo orden de magnitud que la distancia entre planos sucesivos de la red
cristalina, o dhkl (también llamada espaciamiento d). tlhkl es el ángulo entre el rayo incidente y la familia de planos reticulares y
sen 8hkl es inversamente proporcional a la distancia entre planos cristalinos sucesivos o espaciamiento d.
La dirección y espaciado de los planos con referencia a los ejes de la celda unidad están definidos por los índices de Miller
{hkl}. Estos índices son los recíprocos, reducidos al número entero inmediatamente inferior, de las intersecciones que realiza un
plano con los ejes de la celda unidad. Las dimensiones de la celda unidad están dadas por los espaciamientos a, by c, y los
ángulos entre ellos a, fi y y.
El espaciado interplanar para un conjunto específico de planos paralelos hkl se indica por dhki· Cada una de estas familias de
planos puede presentar órdenes de difracción mayores cuando los valores d para las familias de planos relacionados nh, nk, ni
son reducidos por el factor 1 /n (siendo n un número entero: 2, 3, 4, etc.).
Cada conjunto de planos en un cristal tiene un ángulo de difracción de Bragg correspondiente, Ohw asociado con él (para
una Je específica).
Se supone que una muestra de polvo es policristalina, de manera que en cualquier ángulo 8hkl hay siempre cristalitos en una
orientación que permite la difracción de acuerdo con la ley de Bragg. 2 Para una longitud de rayos X determinada, las posicio-
nes de los picos de difracción (también conocidos como "líneas", "reflexiones" o "reflexiones de Bragg") son características de
la red cristalina (espaciamientos d), sus intensidades teóricas dependen del contenido de la celda unidad cristalográfica (natu-
raleza y posiciones de los átomos) y los perfiles de las líneas dependen de la perfección y extensión de la red cristalina. Bajo
estas condiciones, el pico de difracción tiene una intensidad finita que depende del arreglo atómico, tipo de átomos, desplaza-
miento térmico e imperfecciones estructurales, así como de las características del instrumento.
La intensidad depende de muchos factores como la estructura, la temperatura, la cristalinidad, la polarización, la multiplici-
dad y el factor de Lorentz.
Las principales características de los perfiles de las líneas de difracción son: posición 28, altura del pico, área del pico y forma
del pico (caracterizada, por ejemplo, por el ancho o asimetría del pico, o por una función analítica o representación empírica).
Un ejemplo del tipo de patrones de polvo obtenidos para cinco fases sólidas diferentes de una sustancia se presenta en la
Figura 2.

2 Un polvo ideal para experimentos de ditraccion consta de un gran número de cristalitos pequeños, esféricos, orientados aleatoriamente (dominios cristalinos que
difractan coherentemente). Si este néimero es suficientemente grande, siempre habrá suficientes cristalitos en cualquier orientación difractante para producir patro·
nes de difracción reproducibles.
USP 37 Pruebas Físicas/ (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 631

amo ria

28(!. Cu)- Escala

Figura 2. Patrones de difracción de rayos X sobre polvo obtenidos para cinco fases sólidas diferentes de una sustancia (las
intensidades están normalizadas).

Además de los picos de difracción, un experimento de difracción de rayos X genera también un ruido de fondo más o me-
nos uniforme sobre el cual se superponen los picos. Aparte de la preparación de la muestra, otros factores contribuyen al ruido
de fondo, por ejemplo, el portamuestras, la dispersión difusa del aire y el equipo, y otros parámetros instrumentales como el
ruido del detector y la radiación general del tubo de rayos X. La relación pico-ruido puede aumentarse minimizando el ruido
de fondo y escogiendo tiempos de exposición prolongados.

INSTRUMENTO

Configuración del Instrumento

Los experimentos de difracción de rayos X generalmente se efectúan usando difractómetros de polvo o cámaras de polvo.
Un difractómetro de polvo por lo general consta de cinco partes principales: una fuente de rayos X; el sistema óptico del haz
incidente, el cual puede efectuar la monocromatización, filtrado, colimación y/o enfoque del haz; un goniómetro; el sistema
óptico del haz de difracción, que puede incluir monocromatización, filtrado, colimación y enfoque o paralelización del haz; y
un detector. También se requieren sistemas de recolección y procesamiento de datos, que por lo general están incluidos en los
equipos modernos de medición de difracción.
Dependiendo del tipo de análisis que se va a efectuar (identificación de fases, análisis cuantitativo, determinación de los pa-
rámetros de la red, etc.) se requieren diferentes configuraciones y niveles de desempeño del instrumento de DRXP. Los instru-
mentos más simples para medir los patrones de difracción de polvo son las cámaras de polvo. El reemplazo de la película foto-
gráfica, como método de detección, por los detectores fotónicos ha llevado al diseño de difractómetros en los cuales el arreglo
geométrico del sistema óptico no hace un enfoque real sino un paraenfoque, tal como en la geometría de Bragg-Brentano. La
configuración de paraenfoque de Bragg Brentano es la más usada actualmente y por lo tanto se describe aquí brevemente.
Un instrumento dado puede proporcionar una geometría 0/20 horizontal o vertical o una geometría O/O vertical. Para ambas
geometrías, el haz incidente de rayos X forma un ángulo (J con el plano de superficie de la muestra y el haz de rayos X difracta-
do forma un ángulo 20 con la dirección del haz de rayos X incidente (un ángulo O con el plano de superficie de la muestra). En
la Figura 3 se representa el arreglo geométrico básico. El haz de radiación divergente del tubo de rayos X (llamado haz prima-
632 <941) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas USP 37

rio) pasa a través de un conjunto de colimadores de placas paralelas y de una ranura de divergencia e ilumina la superficie
plana de la muestra. Todos los rayos difractados por cristalitos adecuadamente orientados en la muestra en un ángulo 28 con-
vergen en una línea en la ranura receptora. Un segundo set de colimadores de placas paralelas y una ranura de dispersión se
puede colocar bien sea detrás o delante de la ranura receptora. Los ejes del foco de la línea y de la ranura receptora están a
igual distancia del eje del goniómetro. Los cuantos de rayos X se cuentan con un detector de radiación, por lo general un
contador de centelleo, un contador proporcional de gas sellado o un detector de estado sólido sensible a la posición, tal como
una placa de imágenes o un detector de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés). El montaje de la ranura recep-
tora y el detector se ensamblan juntos y se mueven tangencial mente al círculo de enfoque. Para barridos 0/28 el goniómetro
hace rotar la muestra sobre el mismo eje que el detector, pero a la mitad de la velocidad de rotación, en un movimiento O/
20.La superficie de la muestra permanece de esa manera tangencial al círculo de enfoque. El colimador de placas paralelas
limita la divergencia axial del haz y por lo tanto controla parcialmente la forma del perfil de la línea difractada.

/
!
\
\' I
J F

/
A tubo de rayos X D. ranura de anti-difusión G. ranura receptora del detector

B. ranura de divergencia E ranura receptora H. detector

C. muestra F. monocromador J. círculo de enfoque

Figura 3. Arreglo geométrico de la geometría de paraenfoque de Bragg-Brentano.

También se puede usar un difractómetro en modo de transmisión. La ventaja de esta tecnología es que disminuye los efec-
tos debidos a la orientación preferencial. También se puede usar un capilar de aproximadamente 0,5 a 2 mm de espesor para
cantidades pequeñas de muestra.

Radiación de Rayos X

En el laboratorio, los rayos X se obtienen bombardeando un ánodo metálico con electrones emitidos por efecto termoiónico
y acelerados en un campo eléctrico fuerte (usando un generador de alto voltaje). La mayor parte de la energía cinética de los
electrones se convierte en calor, lo cual limita la potencia de los tubos y requiere un enfriamiento eficaz del ánodo. Con el uso
de ánodos rotatorios y sistemas ópticos de rayos X se puede obtener un aumento de 20 a 30 veces en brillantez. Como alter-
nativa, se pueden producir fotones de rayos X en instalaciones a gran escala (sincrotrón).
El espectro emitido por un tubo de rayos X que funciona a un voltaje suficiente consta de un fondo continuo de radiación
policromática y una radiación característica adicional que depende del tipo de ánodo. Solo esta radiación característica se usa
en experimentos de difracción de rayos X. Las fuentes principales de radiación usadas para difracción de rayos X son tubos de
vacío que usan cobre, molibdeno, hierro, cobalto o cromo como ánodos; los rayos X del cobre, molibdeno o cobalto se em-
plean más comúnmente para sustancias orgánicas (el uso de un ánodo de cobalto puede preferirse especialmente para separar
distintas líneas de rayos X). La elección de la radiación que se va a usar depende de las características de absorción de la mues-
tra y la posible fluorescencia de los átomos presentes en la muestra. Las longitudes de onda usadas en la difracción de polvos
generalmente corresponden a la radiación K" del ánodo. Por consiguiente, resulta ventajoso hacer que el haz de rayos X sea
"monocromático", eliminando todos los demás componentes del espectro de emisión. Esto puede conseguirse parcialmente
con filtros K1; es decir, con filtros metálicos seleccionados por tener una discontinuidad de absorción entre las longitudes de
USP 37 Pruebas Físicas/ (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 633

onda K,, y K11 emitidas por el tubo. Dicho filtro usualmente se inserta entre el tubo de rayos X y la muestr·a. Otra forma más
comúnmente usada para obtener un haz de rayos X monocromático consiste en usar un cristal monocromador grande (deno-
minado por lo general "monocromador"). Este cristal se coloca delante o detrás de la muestra y difracta los diferentes picos
característicos del haz de rayos X (es decir, K,, y K11) a diferentes ángulos, de forma que sólo uno de ellos puede seleccionarse
para ingresar al detector. Incluso es posible separar las radiaciones K,, 1 y K" 2 usando un monocromador especializado. Desafor-
tunadamente, la ganancia producida por la obtención de un haz monocromático al usar un filtro o un monocromador se con-
trarresta por una pérdida en intensidad. Otra forma de separar longitudes de onda K,, y K11 consiste en usar espejos curvos para
rayos X que puedan simultáneamente monocromar y enfocar o paralelizar el haz de rayos X.

PROTECCIÓN CONTRA LA RADIACIÓN

La exposición de cualquier parte del cuerpo humano a los rayos X puede ser nociva para la salud. Por lo tanto, siempre que
se use equipo de rayos X es fundamental tomar las precauciones adecuadas para proteger al operador y a cualquier persona
que se encuentre cerca. La práctica recomendada para protegerse de la radiación, así como los límites de los niveles de exposi-
ción a los rayos X son los establecidos por la legislación nacional de cada país. Si no existieran reglamentaciones o recomenda-
ciones oficiales en un país, se deben aplicar las recomendaciones más recientes de la Comisión Internacional de Protección
Radiológica.

PREPARACIÓN Y MONTAJE DE LA MUESTRA

La preparación del material en polvo y el montaje de la muestra en un soporte adecuado son pasos críticos en muchos mé-
todos analíticos, en particular para el análisis por difracción de rayos X sobre polvo, puesto que pueden afectar en gran medida
la calidad de los datos que se van a recolectar. 3 Las principales fuentes de error debido a la preparación y montaje de la mues-
tra se discuten brevemente en la siguiente sección para instrumentos que operan en la geometría de paraenfoque de Bragg-
Brentano.

Preparación de la Muestra

En general, la morfología de muchas partículas cristalinas tiende a dar una muestra que presenta cierto grado de orientación
preferencial en el soporte de la muestra. Esto es especialmente evidente para los cristales en forma de aguja o de placa cuando
la reducción de tamaño proporciona agujas o plaquetas más finas. La orientación preferencial en la muestra influye sobre la
intensidad de las diversas reflexiones, de forma que algunas son más intensas y otras menos intensas, comparado con lo que se
esperaría de una muestra completamente aleatoria. Se pueden emplear diversas técnicas para mejorar la aleatoriedad en la
orientación de los cristalitos (y por lo tanto para minimizar la orientación preferencial), pero una reducción mayor del tamaño
de la partícula es a menudo el mejor y más simple de los métodos. La cantidad óptima de cristalitos depende de la geometría
del difractómetro, la resolución requerida y la atenuación del haz de rayos X por la muestra. En algunos casos, tamaños de
partículas tan grandes como 50 µm pueden proporcionar resultados satisfactorios en la identificación de las fases. Sin embar-
go, una molienda excesiva (tamaños de cristalitos de menos de aproximadamente 0,5 µm) puede ocasionar un ensanchamien-
to de las líneas y cambios significativos en la muestra misma, tales como:
• contaminación de la muestra por partículas desprendidas de los instrumentos de molienda (mortero, mano de mortero,
bolas, etc.),
• reducción del grado de cristalinidad,
• transición del estado sólido a otro polimorfo,
• descomposición química,
• introducción de tensión interna, y
• reacciones en estado sólido.
Por lo tanto, es aconsejable comparar el patrón de difracción de la muestra sin moler con el patrón correspondiente a una
muestra de tamaño de partícula más pequeño (p.ej., una muestra molida). Si el patrón de difracción de rayos X sobre polvo es
de la calidad adecuada teniendo en cuenta el uso previsto, entonces es posible que la molienda no sea necesaria.
Cabe anotar que si una muestra contiene más de una fase y si se usa el tamizado para aislar partículas de un tamaño especí-
fico, se puede alterar la composición inicial.

3 De manera similar, pueden ocurrir cambios en la muestra durante la recolección de datos, en el caso de muestras que no están en equilibrio (temperatura,
humedad).
634 (941 > Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas USP 37

Montaje de la Muestra

EFECTO DEL DESPLAZAMIENTO DE LA MUESTRA

Una superficie de muestra compensada por D con referencia al eje de rotación del difractómetro causa errores sistemáticos
que son muy difíciles de evitar totalmente; para el modo de reflexión, esto produce desplazamientos absolutos D · cos0 4 en las
posiciones 20 (por lo general del orden de 0,01 º en 28 en los ángulos inferiores

[cose~ 1]
para un desplazamiento D = 15 ~tm) y ensanchamiento asimétrico del perfil hacia valores 20 bajos. El uso de un estándar inter-
no apropiado permite la detección y corrección de este efecto simultáneamente con el efecto debido a la transparencia de la
muestra. Este efecto constituye la mayor fuente de errores en los datos recolectados con difractómetros bien alineados.

EFECTO DEL ESPESOR Y TRANSPARENCIA DE LA MUESTRA

Cuando el método de DRXP se aplica en modo de reflexión, a menudo es preferible trabajar con muestras de "espesor infini-
to". Para minimizar el efecto de transparencia, es aconsejable usar un sustrato no difractante (soporte con ruido de fondo nu-
lo); por ejemplo, una placa de silicio monocristalino cortada en paralelo a los planos reticulares 510. 5 Una ventaja del modo de
transmisión es que los problemas relacionados con la altura y transparencia de la muestra son menos importantes.
El uso de un estándar interno apropiado permite la detección y corrección de este efecto simultáneamente con el efecto
debido al desplazamiento de la muestra.

CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

El goniómetro y el sistema óptico correspondiente del haz de rayos X incidente y difractado tienen muchas partes mecánicas
que necesitan ajuste. El grado de alineación o desalineación influye directamente sobre la calidad de los resultados de una in-
vestigación por DRXP. Por lo tanto, los diferentes componentes del difractómetro se deben ajustar cuidadosamente (sistemas
ópticos y mecánicos, etc.) para minimizar adecuadamente los errores sistemáticos a la vez que se optimizan las intensidades
recibidas por el detector. La búsqueda de intensidad y resolución máximas es siempre antagónica cuando se alinea un difractó-
metro. Por ello, se debe buscar el mejor equilibrio entre ambas cuando se efectúa el procedimiento de alineación. Existen mu-
chas configuraciones diferentes y los equipos de cada proveedor requieren procedimientos de alineación específicos. El desem-
peño general del difractómetro se debe examinar y monitorear periódicamente usando materiales de referencia certificados
adecuados. Dependiendo del tipo de análisis, también se pueden emplear otros materiales de referencia bien definidos, aun-
que se prefiere el uso de materiales de referencia certificados.

ANÁLISIS CUALITATIVO DE LAS FASES (IDENTIFICACIÓN DE FASES)

La identificación de la composición de las fases de una muestra desconocida por DRXP por lo general se basa en la compara-
ción visual o asistida por computadora, de una porción de su patrón de difracción de rayos X con el patrón experimental o
calculado de un material de referencia. Idealmente, estos patrones de referencia se obtienen de muestras monofásicas bien
caracterizadas. Este método permite, en la mayoría de los casos, identificar una sustancia cristalina por sus ángulos de difrac-
ción 20 o espaciamientos d y por sus intensidades relativas. La comparación asistida por computadora del patrón de difracción
de la muestra desconocida con los datos de referencia se puede basar bien sea en un intervalo 20 más o menos extendido del
patrón de difracción total o en un conjunto de datos reducidos derivados del patrón. Por ejemplo, la lista de espaciamientos d
y de las intensidades normalizadas, lnorm' llamada lista (d, lnorm) extraída del patrón, es la huella cristalográfica del material y
puede compararse con listas (d, lnorm) de muestras monofásicas compiladas en bases de datos.
Para la mayoría de los cristales orgánicos, al usar radiación Cu K,,, resulta apropiado registrar el patrón de difracción en un
intervalo 20 desde lo más cerca posible a Oº hasta por lo menos 40º. La concordancia en los ángulos de difracción 20 entre la
muestra y la referencia está dentro de 0,2º para la misma forma cristalina, mientras que las intensidades relativas entre la mues-
tra y la referencia pueden variar considerablemente debido a los efectos de la orientación preferencial. Por su misma naturale-
za, se sabe que los hidratos y solvatos variables tienen dimensiones de celda unidad variables y por esa razón ocurren desplaza-
mientos en las posiciones de los picos de los patrones de DRXP medidos para estos materiales. En estos materiales exclusivos,
no es inesperada una discrepancia en las posiciones 20 mayores de 0,2º. Por esa razón, las variaciones dentro de 0,2º en la
posición del pico no son aplicables a estos materiales. Para otros tipos de muestras (p.ej., sales inorgánicas), puede ser necesa-

4 Cabe anotar que un desplazamiento en la alineación en cero del goniómetro ocasionaría un desplazamiento constante en todas las posiciones 20 observadas; es
decir, todo el patrón de difracción se mueve en este caso por una desviación de Zº en 20.
5 En el caso de una muestra delgada con baja atenuación, se pueden hacer mediciones exactas de las posiciones de las líneas con configuraciones de enfoque del
difractómetro en geometría de transmisión o de reflexión. Las mediciones exactas de las posiciones de las líneas sobre muestras con baja atenuación se hacen
preferiblemente con difractómetros que tengan sistemas ópticos de haces paralelos. Esto ayuda a reducir los efectos del espesor de la muestra.
USP 37 Pruebas F(sicas / \941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 635

rio ampliar el barrido de la región 20 hasta bastante más allá de los 40º. Por lo general es suficiente hacer un barrido de las 1 O
reflexiones más fuertes identificadas en las bases de datos de difracción de rayos X sobre polvo monofásico.
En ocasiones es difícil o incluso imposible identificar fases en los siguientes casos:
• sustancias no cristalizadas o amorfas,
• los componentes a identificar están presentes en bajas fracciones de masa respecto a las cantidades del analito (general-
mente menos de 10% m/m),
• efectos de orientación preferencial pronunciados,
• la fase no está archivada en la base de datos usada,
• la formación de soluciones sólidas,
• la presencia de estructuras desordenadas que alteran la celda unidad,
• la muestra comprende demasiadas fases,
• la presencia de deformaciones de la red cristalina,
• la similitud estructural de diferentes fases.

ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LAS FASES

Si la muestra bajo investigación es una mezcla de dos o más fases conocidas, de las cuales no más de una es amorfa, en
muchos casos se puede determinar el porcentaje (en volumen o masa) de cada fase cristalina y de la fase amorfa. El análisis
cuantitativo de las fases se puede basar en las intensidades integradas, en las alturas de los picos de varias líneas de difracción
individuales 6 o en el patrón de difracción completo. Estas intensidades integradas, alturas de los picos o datos del patrón com-
pleto se comparan con los valores correspondientes de los materiales de referencia. Estos materiales de referencia deben ser
monofásicos o una mezcla de fases conocidas. Las dificultades encontradas durante el análisis cuantitativo se deben a la prepa-
ración de la muestra (la exactitud y precisión de los resultados requieren, en particular, homogeneidad de todas las fases y una
distribución apropiada del tamaño de partículas en cada fase) y a los efectos de la matriz.
En casos favorables, en matrices sólidas se pueden determinar cantidades de fases cristalinas tan pequeñas como 10%.

Muestras Polimórficas

Para una muestra compuesta de dos fases polimórficas a y b, se puede usar la siguiente expresión para cuantificar la fracción
F de la fase a:
0

La fracción se obtiene midiendo la relación de intensidad entre las dos fases, si se conoce el valor de la constante K. K es la
relación de las intensidades absolutas de las dos fases polimórficas puras l0 jl 0 b. Su valor puede determinarse midiendo mues-
tras del estándar.

Métodos que Usan un Estándar

Los métodos más comúnmente usados para el análisis cuantitativo son:

• el método del estándar externo,
• el método del estándar interno, y
•el método de adición (también llamado a menudo método de adición de estándar o método de estándar agregado).
El método del estándar externo es el más general y consiste en comparar el patrón de difracción de rayos X de la mezcla, o
las intensidades de las líneas respectivas con las medidas de una mezcla de referencia o con las intensidades teóricas de un
modelo estructural, si se conoce totalmente.
Para limitar errores debidos a los efectos de la matriz, se puede usar un material de referencia interno que tenga un tamaño
de cristalitos y un coeficiente de absorción de los rayos X comparables con los de los componentes de la muestra y un patrón
de difracción que no se solape en absoluto con el de la muestra que se va a analizar. Una cantidad conocida de este material
de referencia se agrega a la muestra a analizar y a cada una de las mezclas de referencia. Bajo estas condiciones existe una
relación lineal entre la intensidad de las líneas y la concentración. Esta aplicación, llamada el método del estándar interno, re-
quiere mediciones precisas de las intensidades de difracción.
En el método de adición (o método de adición de estándar), parte de la fase pura a se agrega a la mezcla que contiene la
concentración desconocida de a. Se hacen múltiples adiciones para preparar una gráfica de intensidad en función de la con-
centración en donde la intersección negativa del eje x es la concentración de la fase a en la muestra original.

6 Si se conocen las estructuras cristalinas de todos los componentes, se puede usar el método de Rietveld para cuantificarlas con una buena exactitud. Si no se
conocen las estructuras cristalinas de los componentes se puede usar el método de Pawley o el método de rnadrados minirnos parciales (PLS, por sus siglas en
inglés).
 1

636 (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas USP 37

CÁLCULO DE LAS FRACCIONES AMORFAS Y CRISTALINAS

En una mezcla de fases amorfas y cristalinas se pueden calcular las fracciones amorfas y cristalinas de varias maneras. La elec-
ción del método usado depende de la naturaleza de la muestra:
• Si la muestra consta de fracciones cristalinas y una fracción amorfa de composiciones químicas diferentes, las cantidades
de cada una de las fases cristalinas individuales puede calcularse usando sustancias estándar apropiadas, según se descri-
bió anteriormente. La fracción amorfa se deduce luego indirectamente por sustracción.
• Si la muestra consta de una fracción amorfa y una cristalina, bien sea como una mezcla de 1 fase o 2 fases, con la misma
composición elemental, la cantidad de la fase cristalina (el "grado de cristalinidad") se puede calcular midiendo tres áreas
del difractograma:
A= área total de los picos que surgen de la difracción de la fracción cristalina de la muestra,
B = área total por debajo del área A,
C =área de ruido de fondo (debido a dispersión del aire, fluorescencia, equipo, etc.).
Una vez medidas estas áreas, el grado de cristalinidad se puede calcular en forma aproximada como:
% de cristalinidad = 1 OOA/(A + B - C)
Debe mencionarse que este método no arroja un grado absoluto de valores de cristalinidad y por lo tanto se usa generalmente
para propósitos comparativos únicamente. También se cuenta con métodos más sofisticados, como el de Ruland.

ESTRUCTURA DEL MONOCRISTAL

En general, la determinación de las estructuras cristalinas se efectúa a partir de los datos de difracción de los rayos X obteni-
dos usando monocristales. Sin embargo, el análisis de la estructura cristalina de los cristales orgánicos es una tarea exigente,
puesto que los parámetros de la red son comparativamente grandes, la simetría es baja y las propiedades de dispersión son
normalmente muy bajas. Para cualquier forma cristalina dada de una sustancia, el conocimiento de la estructura cristalina per-
mite el cálculo del patrón correspondiente de DRXP, proporcionando en consecuencia un patrón de referencia de DRXP exen-
to de orientación preferencial, el cual se puede usar para la identificación de las fases.
USP 37 Información General/ (1005) Emisión Acústica 637

Capítulos Generales
Información General

Información General

Los capítulos de esta sección son de carácter informativo y no contienen normas, pruebas, valoraciones, ni otras especifica-
ciones de cumplimiento obligatorio para ningún artículo farmacopeico, a excepción de las citas de Leyes y reglamentos federa-
les que puedan ser aplicables. Las citas de Leyes y reglamentos federales se incluyen en esta sección debido a que no son de la
autoría de la Farmacopea. Las revisiones o reformas de los requisitos federales que afecten al contenido de estas citas se publi-
carán en los Suplementos de los compendios USP-NF a la brevedad posible. Los requisitos oficiales de los artículos farmacopeicos
se establecen en las Advertencias Generales, las monografías individuales y en los capítulos referentes a Pruebas y Valoraciones
Generales de esta Farmacopea.

(1005) EMISIÓN ACÚSTICA

INTRODUCCIÓN

Las técnicas ultrasónicas se pueden categorizar en dos tipos específicos: emisión acústica (modo pasivo) y espectroscopía
ultrasónica (modo activo). Ambas técnicas tienen muchas aplicaciones.
La técnica de emisión acústica se basa en la detección y análisis de sonidos producidos por un proceso o sistema. En esencia
esto es equivalente a escuchar el proceso o sistema, aunque estos sonidos a menudo están muy por encima de las frecuencias
que el oído humano puede detectar. Por lo general, las frecuencias son audibles hasta 15 kHz aproximadamente.
En el caso de la espectroscopía ultrasónica, el instrumento está diseñado para generar ondas de ultrasonido en un intervalo
de frecuencia definido. Estas ondas viajan a través de la muestra y se miden por medio de un receptor. Se puede establecer
una analogía con la espectroscopía UV visible o la espectroscopía IR, por cuanto el espectro ultrasónico detectado refleja cam-
bios en la velocidad o atenuación del sonido debido a la interacción con una muestra a través de un intervalo de frecuencias.
Sin embargo, puesto que el alcance de este capítulo se limita a la emisión acústica, no discutiremos en detalle la espectrosco-
pía ultrasónica.
La emisión acústica es bien conocida en el estudio de la mecánica de fractura, y por lo tanto, se usa ampliamente entre los
científicos de materiales. También se usa mucho como una técnica de pruebas no destructiva y se aplica en forma rutinaria
para la inspección de alas de aviones, recipientes de presión, estructuras y componentes de soporte de carga. La emisión acús-
tica también se usa en ingeniería para monitorear el desgaste de máquinas.
En términos de aplicaciones farmacéuticas, la dependencia de la medición de la emisión acústica de propiedades físicas co-
mo el tamaño de las partículas, la resistencia mecánica y la cohesión de los materiales sólidos permite el uso de esta técnica
para el control y detección del punto final de procesos como la granulación de alta velocidad, secado en lecho fluido, molien-
da y micronización.

Principios Generales

Las emisiones acústicas se pueden propagar por diferentes modos. En sólidos, los modos compresionales y de corte o trans-
versales son importantes. Los modos compresionales tienen la velocidad más alta y por lo tanto alcanzan el detector acústico
(o transductor de emisión acústica) primero. Sin embargo, en la mayoría de las aplicaciones de emisión acústica en procesos,
existen muchas fuentes y cada una de ellas produce descargas cortas de energía; por consiguiente, los diferentes modos no se
pueden resolver fácilmente. Por ejemplo, la señal detectada en la pared de un vaso es una mezcla compleja de muchas formas
de ondas superpuestas provenientes de muchas fuentes y modos de propagación.
638 (1005) Emisión Acústica/ Información General USP 37

En las interfases, dependiendo de la impedancia acústica relativa de los dos materiales, mucha de la energía se refleja de
vuelta hacia la fuente. En un lecho fluido, por ejemplo, las emisiones acústicas sólo serán detectadas a partir de partículas que
impacten directamente las paredes del lecho próximas al transductor.
Un método conveniente de estudiar la emisión acústica de los procesos es usar el "nivel medio de señal". Se puede usar un
convertidor de valor eficaz a corriente continua (convertidor RMS a CC; RMS-to-DC, por sus siglas en inglés) para convertir la
señal portadora de amplitud modulada (AM) en una señal de corriente continua (CC) que varía más lentamente. Esto se cono-
ce como nivel medio de señal (ASL, por sus siglas en inglés). El ASL puede entonces muestrearse digitalmente (por lo general a
una frecuencia de muestreo de aproximadamente 50 Hz) y almacenarse electrónicamente para el procesamiento adicional de
la señal.
La forma más sencilla de estudiar los datos acústicos consiste en examinar cambios en el ASL. Sin embargo, se puede recabar
otra información al examinar el espectro de potencia del ASL. El espectro de potencia se calcula tomando el cuadrado comple-
jo del espectro de amplitud y se puede obtener efectuando una Transformada Rápida de Fourier (TRF) sobre el registro de
datos digitalizados sin procesar. Los espectros de potencia se pueden promediar para producir un cálculo confiable de la densi-
dad espectral de potencia o para obtener una "huella digital (fingerprint)" de un régimen de proceso particular. La interpreta-
ción del espectro de potencia se complica por el hecho de que la señal acústica originada en el sistema se distorsiona por va-
rios factores, incluyendo la transmisión, reflexión y características de la señal de transferencia.
La forma del espectro de potencia en el registro del ASL es una función de la dinámica del proceso. Los procesos periódicos
(p.ej., mezclado mecánico o burbujeo periódico de un lecho fluido) muestran alta potencia a determinadas frecuencias discre-
tas. Los procesos aleatorios muestran propiedades de tipo parpadeante (flicker noise), donde la potencia es inversamente pro-
porcional a la frecuencia, o propiedades del ruido blanco en donde la potencia es independiente de la frecuencia. La amplitud
del espectro de potencia también se ve afectada por la energía de las emisiones acústicas producidas por el proceso. Por ejem-
plo, si se está procesando un material duro, la emisión acústica producida por el impacto de las partículas será mayor que la
producida por un material blando.

INSTRUMENTACIÓN
Por lo general, los sensores piezoeléctricos se usan para detectar y cuantificar las señales acústicas producidas por un proce-
so. Los transductores piezoeléctricos se fabrican a partir de sólidos cristalinos piezoeléctricos conectados a circuitos de control
de transductores por contactos eléctricos. Cuando está configurado como un detector, una onda acústica que incide sobre el
elemento piezoeléctrico se transforma en una señal eléctrica en el circuito de control del transductor. Cuando se lo configura
como generador acústico, una señal eléctrica aplicada al elemento piezoeléctrico por el circuito de control genera una onda
acústica que puede propagarse por el medio al cual está conectado el transductor. Por lo general, esto significa que los detec-
tores de emisión acústica pueden funcionar también como generadores de ondas acústicas y esta característica se usa para
garantizar el buen desempeño del sensor según se describe más adelante (ver Calificación y Verificación de Instrumentos de Emi-
sión Acústica).
En las aplicaciones generales de emisión acústica, a menudo se usan sensores con frecuencias de resonancia diferentes (p.ej.,
70 y 190 kHz, aunque frecuencias más altas podrían ser más apropiadas a menores escalas de funcionamiento), que compren-
den varios pasos de banda. A medida que el sonido (ultrasonido) del intervalo de frecuencia apropiada alcanza estos sensores,
se genera una señal eléctrica cuya amplitud es directamente proporcional a la energía (amplitud) de las ondas de sonido inci-
dentes.
Estas señales se procesan por medio de:
(1) un preamplificador (que incluye filtrado de señales),
(2) un convertidor RMS a CC,
(3) un amplificador de ganancia variable y
(4) una terminal de recolección de datos conectada a una computadora, la cual cuenta también con un software de control.
El equipo de emisión acústica por lo general permite usar varios sensores simultáneamente, con la incorporación de múlti-
ples canales electrónicos en un solo instrumento.

Procesamiento de la Señal

La señal de un transductor resonante se asemeja a una señal de radio de amplitud modulada (AM). A la frecuencia de reso-
nancia del transductor, la señal consiste en una onda transportadora cuya amplitud es modulada por el proceso. Para demodu-
lar la señal se usa un convertidor RMS a CC. La potencia de salida de este dispositivo es la señal o envolvente de modulación.
El envolvente se vuelve a muestrear digitalmente a una frecuencia apropiada para el proceso. Por ejemplo, 50 Hz es la tasa
habitual de muestreo digital para un secador de lecho fluido o un granulador de alta velocidad.

FACTORES QUE AFECTAN LA MEDICIÓN

Los siguientes factores pueden afectar los datos acústicos obtenidos y deben tenerse en consideración al instalar un sistema
de emisión acústica.
USP 37 Información General/ (1005) Emisión Acústica 639

1. Falla o Daño Físico-Al igual que cualquier otro tipo de sensor, los sensores de emisión acústica pueden fallar con el tiem-
po o como resultado de daño físico. Es importante verificar la función del sensor como parte del mantenimiento de rutina
del instrumento. Si se instalan múltiples sensores en el mismo recipiente, se puede generar una señal activa desde un sen-
sor y ésta se puede usar para verificar la detección en otro sensor. Este ejercicio debería garantizar que los sensores estén
detectando las señales acústicas generadas por el proceso. Al comenzar, en la mitad y al final del proceso se debe deter-
minar y monitorear también la "señal acústica aceptable mínima" para los sensores, que sea estadísticamente válida, con
el fin de garantizar el desempeño de los sensores durante una corrida del proceso. Esto se puede establecer a partir de
experimentos rutinarios de la señal de mantenimiento o basándose en los datos históricos de los sensores.
2. Problemas de Interfase del Sensor-Los sensores se instalan por lo general en la pared exterior del recipiente usado en el
proceso. Para asegurar el sensor a la pared exterior se pueden usar varios tipos de adhesivos (temporales o permanentes).
Durante las limpiezas y movimientos repetidos del recipiente, se puede alterar la unión del sensor al recipiente. La verifica-
ción de la integridad de la instalación debe formar parte del mantenimiento rutinario. En forma similar al punto 1 tratado
anteriormente, se puede usar una señal activa para garantizar la unión apropiada entre el sensor y el recipiente, lo cual
ayuda a confirmar la correspondencia de la impedancia acústica.
3. Influencia del Ruido Mecánico-El uso de altas frecuencias reduce significativamente la contribución del ruido mecánico a la
señal acústica detectada, especialmente en funcionamiento a menor escala, aunque no lo elimina completamente. Si se
analiza el efecto de varios ajustes de motor, por ejemplo, se puede determinar si la señal acústica detectada es una fun-
ción del ruido mecánico. Si el efecto es significativo, puede ser necesario usar frecuencias más altas. Es importante recono-
cer y considerar la contribución del ruido mecánico, no importa qué tan reducido sea, a medida que los motores enveje-
cen o se reemplazan.
4. Influencia de las Características de la Pared del Recipiente-Dado que los sensores se colocan a menudo en la pared exterior
del recipiente, el espesor de dicha pared puede afectar la calidad de la señal detectada. Si el recipiente está encamisado,
la amplitud de la señal acústica se puede reducir. Si se agregan más sensores al recipiente se puede mejorar la calidad de
la señal. Como alternativa, se puede obtener un aumento en la señal si se colocan sensores en un lugar donde exista con-
tacto entre las paredes exteriores e interiores, lo que básicamente proporciona una guía de onda entre el sensor y la fuen-
te de sonido. Las guías de onda se pueden incluir también en el diseño del equipo de fabricación para permitir el monito-
reo de la emisión acústica. Es necesario efectuar la validación apropiada para garantizar que esto no afecte adversamente
el desempeño del equipo.
5. Efecto de las Propiedades de los Materiales-Durante el funcionamiento, la señal acústica recolectada es una suma de diver-
sos eventos que ocurren en el proceso. Por ejemplo, la señal acústica generada cuando las partículas golpean la pared en
un granulador es una función de las propiedades materiales de los gránulos (es decir, densidad, tamaño, porosidad). Por
lo tanto, los cambios significativos en cualquiera de estos parámetros pueden afectar la señal acústica y la calidad de la
predicción resultante.
6. Influencia de Factores Relacionados con el Proceso-En forma similar al punto 5 mencionado anteriormente, las propiedades
relacionadas con el proceso (es decir, fuerza del impacto, frecuencia del impacto, cantidad de material) pueden afectar
también la señal acústica y la calidad de la predicción resultante.
7. Impacto de las Condiciones Ambientales-Por último, también se debe tener en cuenta la influencia de los factores ambien-
tales (es decir, temperatura, humedad).
Los datos de emisión acústica recolectados son específicos del recipiente o equipo. No es aconsejable aplicar a un equipo un
modelo generado en otro, porque la información acústica puede diferir como resultado de los problemas comentados en los
puntos 3, 4 y 5.

Calificación y Verificación de Instrumentos de Emisión Acústica

Se debe adoptar un enfoque de aptitud del sistema en lo que respecta al desempeño del instrumento, estableciendo la ópti-
ma configuración de las mediciones y comparando después el desempeño del instrumento con los valores obtenidos durante
el uso rutinario con aquellos obtenidos durante la calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés).
Este enfoque ofrece respuesta a las inquietudes relacionadas con el muestreo porque, a diferencia de otros sistemas analíti-
cos en línea, los transductores pueden ubicarse óptimamente y conectarse para recibir la señal máxima sin modificación del
recipiente.
Las tasas de muestreo tienen que cumplir con el teorema de muestreo de Nyquist, el cual afirma que una señal se debe
muestrear a una tasa que sea el doble del componente de frecuencia más alto en la señal. Se debe usar un filtro de paso bajo
para retirar los componentes de frecuencia que sean mayores que la mitad de la frecuencia de muestreo (frecuencia de
Nyquist). Si no se cumple con este criterio se puede incurrir en solapamiento (aliasing).
Debido a la naturaleza de los transductores piezoeléctricos y dado que las frecuencias de resonancia son propiedades natura-
les de los cristales, no es necesario analizar la variación (reproducibilidad) o derivar en el dominio de trecuencia. Esto puede ser
necesario si se usan otros tipos de transductores. Cualquier cambio considerable en el dominio de frecuencia se registrará co-
mo un descenso en la intensidad de la potencia a la frecuencia de resonancia y por lo tanto está cubierto por los análisis de
intensidad de potencia.
Las dos áreas principales para la verificación del desempeño del instrumento son la intensidad de la potencia y la temporiza-
ción. Cualquier cambio en la intensidad de la señal afectará la senal cruda y el ASL y, por lo tanto, afectará también el espectro
640 (1005) Emisión Acústica/ Información General USP 37

de la potencia. Como consecuencia de los cambios en el proceso (p.ej., variación en dureza o humedad en las partículas que
impactan la pared del recipiente) o de los cambios en la conducción acústica del proceso al transductor se pueden presentar
cambios en la intensidad de la potencia.
La reproducibilidad de la conducción acústica se debe evaluar usando un segundo transductor para registrar un pulso o
"ping" en la frecuencia de resonancia del sensor receptor. Este valor de reproducibilidad representa el ruido de la señal y pue-
de usarse en cálculos del límite de detección (LOD, por sus siglas en inglés) y el límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en
inglés), donde LOD se define como tres veces el ruido de la señal y LOQ es diez veces el ruido de la señal. El ruido a nivel de la
señal de fondo (en la emisión acústica, esta señal de fondo se debe principalmente al ruido del amplificador) se debe calcular a
partir de veinte valores secuenciales de ASL adquiridos a la frecuencia de muestreo usada para el funcionamiento normal. Esta
prueba se debe repetir a la inversa con el fin de establecer que se pueden obtener valores de intensidad estadísticamente simi-
lares en ambos canales.
La reproducibilidad a corto plazo permite calcular el ruido. Sin embargo, no proporciona una medida de la integridad de la
conducción acústica en el tiempo o, más específicamente, de los cambios causados por el proceso (p.ej., variaciones en las
propiedades adhesivas con cambios del proceso tales como calentamiento y enfriado). La prueba de ruido se debe repetir
mientras se ejecutan los parámetros normales de procesamiento (usando un recipiente vacío) y se debe calcular la deriva en el
ASL. Se deben tomar las precauciones necesarias para garantizar que la deriva en la señal (debido a la variación normal en los
parámetros del proceso) no impacte los modelos quimiométricos usados para la determinación del punto final. Para los gráfi-
cos de tendencia, se debe demostrar que la deriva no es estadísticamente significativa; caso contrario, se deberá corregir la
deriva. Los valores de ruido, deriva y ASL absoluto se deben registrar y guardar, y repetir las pruebas si se hacen cambios al
equipo de procesamiento o al sistema de emisión acústica. Si no se hacen cambios, las pruebas se deben repetir todos los me-
ses. De esta forma se puede demostrar que la calidad de la conducción acústica está intacta y cualquier cambio a la intensidad
de la señal se puede aislar y atribuir al proceso mismo.
Durante el uso rutinario se recomienda ejecutar la prueba de ruido (como se describe anteriormente) antes de cada corrida
del proceso y calcular la intensidad de la potencia y el ruido. Estos valores se deben registrar y comparar con los generados
tanto durante el uso previo como durante la instalación. El impacto de la desviación con respecto a valores previos dependerá
del modelo de predicción y se debe considerar mediante la validación del método.
Los datos de ruido (de lo anterior) se pueden usar también para calcular el tiempo de vuelo del pulso. Si la activación del
pulso y la recepción de la señal están sincronizados, se puede medir el tiempo tomado por el pulso para transmitir a través del
recipiente. Esta es una buena indicación de la medición electrónica, así como de la condición general de la conducción acústi-
ca. Sin embargo, esta prueba se debe considerar como una medición de la condición del "sistema" y se debe ejecutar sólo si
se han hecho cambios al equipo del proceso o al sistema de emisión acústica, o cada 6 meses. La correlación de los tiempos
medidos con los históricos debe ser estadísticamente válida. De no ser así, esto es un indicador de que el sistema de emisión
acústica puede necesitar recalificación por parte del fabricante o proveedor del instrumento o de que hay cambios en la con-
ducción acústica.
Todas estas pruebas requieren el uso de un pulso acústico generado eléctricamente. Una falla en cualquiera de las pruebas
antes mencionadas se puede atribuir a la generación misma de la señal. Se recomienda que el sistema de generación de pulsos
eléctricos sea recalificado y certificado de acuerdo con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología
(NIST, por sus siglas en inglés) cada 12 meses.

ANÁLISIS DE LOS DATOS

La emisión acústica de granuladores y secadores de lecho fluido se conoce como emisión acústica continua. La emisión acús-
tica continua es afásica (es decir, la señal no tiene comienzo ni interrupción). Esto significa que no es necesario usar las técnicas
de procesamiento de la señal que preservan la fase. El análisis espectral de potencia es una técnica útil para procesar las señales
de emisión acústica. La información en los espectros de potencia, a diferencia de las señales crudas de emisión acústica, es
coherente en el corto plazo, permitiendo promediar la señal. Esto proporciona un mejor cálculo de la densidad espectral de
potencia que el proporcionado por un único espectro de potencia.
Para detectar puntos finales en procesos de lotes (p.ej., punto final de granulación o secado) es apropiado un modelo multi-
variado cualitativo (p.ej., PCA o SIMCA). Efectuar la siguiente secuencia de operaciones:
(1) Entrenamiento o Calibración-Obtener los espectros de emisión acústica que sean representativos del punto final.
(2) Modelado-Crear un modelo multivariado que describa la distribución de las señales de emisión acústica en el punto final.
(3) Predicción-Comparar los espectros de emisión acústica contra el modelo. Monitorear el ajuste al modelo (expresado por
lo general en términos de un número de desviaciones estándar). A medida que el sistema se aproxima al punto final, el
ajuste mejora y se establece la finalización del proceso una vez que el modelo concuerda con los criterios predefinidos. El
modelo de predicción se genera a partir de los espectros de emisión acústica obtenidos del proceso funcionando en con-
diciones normales. Las perturbaciones (p.ej., la aglomeración indeseada en los equipos de recubrimiento) se detectan ob-
servando las desviaciones estadísticamente válidas con respecto al modelo.
El modelado adaptativo también se ha propuesto para la detección de perturbaciones. Esto implica generar continua-
mente modelos multivariados a medida que se adquieren las señales de emisión acústica. La desviación inusual de la señal
de emisión acústica indica la ocurrencia de una perturbación del proceso. La ventaja del modelo adaptativo es que no es
necesario efectuar un paso de calibración por separado.
USP 37 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 641

GLOSARIO
Amplitud-La magnitud o potencia de una forma de onda variable.
Convertidor RMS a CC (RMS-to-DC, por sus siglas en inglés)-Es un dispositivo electrónico que convierte una señal alter-
na a un nivel de voltaje proporcional a la potencia promedio en la señal.
Densidad Espectral de Potencia-La medida de la potencia de emisión acústica en cada elemento de resolución del espec-
tro de potencia.
Emisión Acústica Continua-Señales de emisión acústica que no se pueden separar en el tiempo y son típicas de procesos
farmacéuticos tales como granulación y secado en lecho fluido.
Espectro de Potencia-El espectro de potencia de una señal es una representación de la potencia de la señal en función de
la frecuencia. El espectro de potencia se calcula a partir de la señal del dominio tiempo por medio de un algoritmo de Trans-
formada Rápida de Fourier (TRF). Resulta útil estudiar las señales de emisión acústica en el dominio espectral o de frecuencia,
ya que a menudo el espectro es característico del mecanismo. Se pueden obtener mejoras en la relación señal-ruido al prome-
diar un número de espectros de potencia, ya que estos son coherentes.
Filtrado de Señal-Filtrar una señal significa atenuar las frecuencias por fuera de un rango prescrito. En trabajos de emisión
acústica, se usa el filtrado de paso de banda para mejorar la relación señal-ruido al atenuar el ruido fuera del ancho de banda
del sensor. El filtrado de paso bajo se usa para eliminar frecuencias más altas que la frecuencia Nyquist con el fin de evitar el
solapamiento.
Frecuencia Nyquist-La frecuencia Nyquist está definida como la mitad de la tasa de muestreo digital y es la frecuencia más
alta que se puede reproducir confiablemente.
Frecuencia Resonante-La frecuencia a la cual es más sensible un sensor de emisión acústica. Los sensores de emisión acús-
tica resonantes tienen una frecuencia de resonancia claramente definida, pero por lo general son sensibles a otras frecuencias.
Ganancia-El factor de amplificación para un componente, expresado generalmente en términos de decibeles (dB).
Ganancia en dB = 20 loglO (Voltajede salida Voltajedeentrada>·
Impedancia Acústica-La impedancia acústica (Z) se define como Z = pv (donde pes la densidad y ves la velocidad del
sonido). Es un dato importante que informa la proporción de la energía del sonido transmitida de un medio a otro y la canti-
dad de energía reflejada en la interfase.
Modelado Adaptativo-Es un método que predice el estado de un proceso sin el uso de un modelo generado previamente
(es decir, no hay un entrenamiento ni un paso de calibración previos).
Modo Compresional-Un modo longitudinal de transmisión acústica encontrado en sólidos, líquidos y gases.
Modo de Corte (Cizalladura)-Un modo transverso de transmisión acústica que se presenta solo en sólidos.
Modo Transversal-Un modo de propagación de la onda donde el desplazamiento del material es perpendicular a la direc-
ción de la propagación. Estos modos sólo se encuentran en materiales sólidos.
Nivel Medio de Señal (ASL}-Una medida de la potencia promedio en una señal de emisión acústica.
Paso de Banda-El intervalo de frecuencias dentro de las cuales funciona un componente.
Piezoeléctrico-Un material que al comprimirse genera un campo eléctrico. Los materiales piezoeléctricos se usan en la
construcción de sensores de emisión acústica. Un material común es el titanato de circonio y plomo (PZT).
Propiedades de Tipo Parpadeante (flicker noise}-Un tipo de señal asociada con muchos procesos naturales. Las caracterís-
ticas del ruido parpadeante son: la potencia del ruido es directamente proporcional a la señal y tiene aproximadamente una
distribución de densidad espectral de 1/f (f =frecuencia).
Ruido Blanco-El ruido blanco se caracteriza por un espectro de potencia de densidad espectral uniforme y está asociado
con procesos puramente aleatorios.
Solapamiento (a/iasing}-Los componentes espurios de baja frecuencia que aparecen en la señal y son en realidad frecuen-
cias por encima de la frecuencia Nyquist.
Transductor de Emisión Acústica-Un dispositivo en estado sólido que incorpora por lo general un elemento piezoeléctrico
para convertir la onda de emisión acústica a una señal eléctrica.

(101 O) DATOS ANALÍTICOS-INTERPRETACIÓN Y TRATAMIENTO

INTRODUCCIÓN
Este capítulo proporciona información acerca de las prácticas aceptables para el análisis e interpretación uniforme de los da-
tos obtenidos de los análisis químicos y otros análisis. Se describen además algunos métodos estadísticos básicos para la eva-
luación de datos y se analiza en cierto detalle el tratamiento de los resultados aberrantes y la comparación de métodos analíti-
cos.
642 (101 O) Datos Analíticos/ Información General USP 37

NOTA-No debe inferirse que las herramientas de análisis mencionadas en este capítulo conforman una lista exhaus-
tiva. Pueden utilizarse otros métodos estadísticos igualmente válidos a criterio del fabricante y demás usuarios de este
capítulo.
La garantía de calidad de los productos farmacéuticos se logra combinando una serie de prácticas, que incluyen un diseño
robusto de la formulación, validación, análisis de materias primas, análisis durante el proceso y pruebas del producto final. Ca-
da una de estas prácticas depende de métodos de prueba confiables. Durante el proceso de desarrollo, se desarrollan y validan
procedimientos de prueba para asegurar que los productos fabricados estén perfectamente caracterizados. Las pruebas del
producto final permiten comprobar que los productos son uniformemente seguros y eficaces y que cumplen con sus especifi-
caciones.
Las mediciones son intrínsecamente variables y la USP reconoce tal variabilidad para las pruebas biológicas desde hace mu-
cho tiempo. La necesidad de tener en cuenta esta variabilidad cuando se analizan datos de pruebas biológicas, por ejemplo, se
trata en el capítulo Diseño y Análisis de Va/oraciones Biológicas (111 ). Las mediciones de análisis químicos comúnmente utiliza-
das para productos farmacéuticos también son intrínsecamente variables, aunque en menor grado que las pruebas biológicas.
No obstante, en muchos casos los criterios de aceptación son proporcionalmente más estrictos y, en consecuencia, debe te-
nerse en cuenta esta menor variabilidad aceptable cuando se analizan datos obtenidos por procedimientos analíticos. Si no se
caracteriza ni especifica la variabilidad de una medición junto con el resultado obtenido, los datos sólo pueden interpretarse en
el sentido más limitado. Por ejemplo, si se especifica que la diferencia entre los promedios de los resultados obtenidos por dos
laboratorios al analizar el mismo conjunto de muestras es del 1 0%, la interpretación es limitada en cuanto a la importancia de
dicha diferencia a menos que se especifique la variabilidad dentro de cada laboratorio.
Este capítulo proporciona indicaciones para el tratamiento e interpretación científicamente aceptables de los datos. Se des-
criben además las herramientas estadísticas que pueden resultar útiles para la interpretación de los datos analíticos. Muchas
estadísticas descriptivas, como la desviación estándar y la media, son de uso difundido. Otras herramientas estadísticas, como
las pruebas de resultados aberrantes, pueden realizarse utilizando diferentes métodos científicamente válidos, de los cuales
también se incluyen ejemplos y sus aplicaciones. El marco dentro del cual se interpretan los resultados de una prueba farmaco-
peica se describe en detalle en Resultados de las Pruebas, Estadísticas y Normas en Advertencias y Requisitos Generales. En el
Apéndice Fal final de este capítulo, se incluye una selección de referencias útiles para obtener información adicional sobre las
herramientas estadísticas aquí descritas. La USP no avala específicamente las referencias citadas, que no constituyen una lista
exhaustiva. Puede encontrarse información adicional sobre cualquiera de los métodos citados en este capítulo en la mayoría de
los textos de estadística.

PREREQUISITOS PARA LAS PRÁCTICAS Y PRINCIPIOS DE LABORATORIO

La correcta aplicación de los principios estadísticos a los datos de laboratorio supone que estos datos han sido obtenidos de
forma rastreable (es decir, documentada) y sin sesgo. Para asegurarse de ello, son útiles las prácticas siguientes.

Mantenimiento Adecuado de Registros

Los registros de laboratorio deben mantenerse con suficiente detalle para que otros analistas igualmente calificados puedan
reconstruir las condiciones experimenta/es y revisar los resultados obtenidos. Por lo general, al obtener datos, deben utilizarse
más decimales que los requeridos en la especificación y las cifras sólo deben redondearse una vez realizados los cálculos finales,
conforme a lo establecido en las Advertencias y Requisitos Generales.

Consideraciones Relativas al Muestreo

Un muestreo eficaz es un paso importante para la evaluación de un atributo de calidad de una población. El objetivo del
muestreo es proporcionar datos representativos (la muestra) para estimar las propiedades de la población. La manera en que
se obtiene dicha muestra depende totalmente de la pregunta que se busca responder con los datos de la muestra. Por lo gene-
ral, un proceso aleatorio se considera la manera más adecuada de seleccionar una muestra. De hecho, es necesario utilizar una
muestra aleatoria e independiente para asegurar que los datos obtenidos produzcan estimaciones válidas acerca de las propie-
dades de la población. La generación de una muestra no aleatoria o "de conveniencia" conlleva el riesgo de que las estimacio-
nes estén sesgadas. El tipo de muestreo aleatorio más directo se conoce como muestreo aleatorio simple y es un proceso en el
que cada unidad de la población tiene la misma probabilidad de aparecer en la muestra. No obstante, en algunos casos, este
método de selección de muestra aleatoria no es óptimo ya que no garantiza la misma representatividad en relación con todos
los factores (es decir, tiempo, lugar, máquina) que podrían influir en las propiedades críticas de la población. Por ejemplo, si se
requieren 12 horas para fabricar todas las unidades de un lote y es fundamental que la muestra sea representativa de todo el
proceso de producción, no sería adecuado tomar una muestra aleatoria simple al finalizar la producción ya que no se puede
garantizar que contenga una cantidad similar de unidades fabricadas en cada período del proceso de 12 horas. En estos casos
es mejor tomar una muestra aleatoria sistemática, seleccionando al azar una unidad del proceso de producción a intervalos o
en lugares sistemáticamente seleccionados (p.ej., muestreando cada 30 minutos, entre las unidades producidas durante ese
período) para asegurarse de incluir en la muestra unidades tomadas durante todo el proceso de fabricación. Se requerirá otro
USP 37 Información General/ 1, 101 O) Datos Analíticos 643

tipo de procedimiento de muestreo aleatorio si, por ejemplo, un producto se introduce en los viales usando cuatro máquinas
de llenado diferentes. En este caso, sería importante tomar una muestra aleatoria de los viales de cada una de las máquinas de
llenado. Una muestra aleatoria estratificada, método que consiste en tomar una muestra al azar del mismo número de viales en
cada una de las cuatro máquinas de llenado, cumple con este requisito. Independientemente del motivo del muestreo (p.ej.,
prueba de liberación de partida), debe establecerse un plan de muestreo que indique detalladamente cómo se debe obtener la
muestra para asegurar que sea representativa de toda la población y que los datos resultantes tengan la sensibilidad requerida.
La estrategia de muestreo óptima depende del conocimiento de los procesos de fabricación y medición analítica. Una vez defi-
nido el plan de muestreo, es probable que incluya cierto elemento de selección aleatoria. Por último, debe obtenerse una can-
tidad de muestra suficiente para el análisis original, los análisis de verificación subsiguientes y otros análisis. Se recomienda
consultar a un estadístico para identificar la estrategia de muestreo óptima.
Las pruebas que se describen en el resto de este capítulo suponen que se ha realizado un muestreo aleatorio simple.

Uso de Estándares de Referencia

Cuando se especifica el uso de un Estándar de Referencia USP, debe utilizarse el Estándar de Referencia USP o un estándar
secundario rastreable al Estándar de Referencia USP. Debido a que la asignación de un valor a un estándar es uno de los facto-
res más importantes de la exactitud de un análisis, es fundamental hacerlo correctamente.

Verificación del Desempeño del Sistema

La verificación de un nivel del desempeño aceptable de un sistema analítico que se utiliza en forma rutinaria o continua pue-
de ser una práctica valiosa. Esto se puede lograr analizando una muestra de control a intervalos adecuados o examinando
otros factores, como la variación entre estándares, las relaciones señal-ruido de fondo, etc. Si se realiza un seguimiento del
parámetro medido, por ejemplo graficando los resultados del análisis de una muestra de control, se pueden detectar cambios
en el desempeño que requieren el ajuste del sistema analítico. El Apéndice A proporciona un ejemplo de una gráfica de control.

Validación de Métodos

Todos los métodos deben validarse según se especifica en Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). Los métodos
publicados en la USP-NF se han validado y cumplen con los requisitos reglamentarios de Buenas Prácticas de Fabricación vi-
gentes establecidos en el Código de Reglamentos Federales. Los métodos validados pueden utilizarse para analizar una nueva
formulación (por ejemplo, un nuevo producto, forma de dosificación o producto intermedio de un proceso) únicamente des-
pués de verificar que la nueva formulación no interfiere con la exactitud, linealidad ni precisión del método. No puede supo-
nerse que un método validado puede medir correctamente el ingrediente activo de una formulación que es diferente a la utili-
zada para establecer la validez original del método. [NOTA sobre terminología-La definición de exactitud en Validación de Pro-
cedimientos Farmacopeicos (1225) y en ICH Q2 corresponde únicamente a insesgadez. Para el Vocabulario Internacional de Me-
trología (VIM) y la documentación de la Organización Internacional de Normalización (ISO, por sus siglas en inglés), exactitud
tiene un significado distinto. Para ISO, exactitud combina los conceptos de ausencia de sesgo (denominada certeza) y preci-
sión. Este capítulo sigue a la definición del capítulo (1225), que corresponde únicamente a veracidad.]

PRINCIPIOS DE MEDICIÓN V VARIACIÓN

Todas las mediciones son, en el mejor de los casos, estimaciones del valor real ("verdadero" o "aceptado"), ya que contie-
nen una variabilidad aleatoria (también denominada error aleatorio) y, en algunos casos, un error sistemático (sesgo). En con-
secuencia, el valor medido difiere del valor real debido a la variabilidad intrínseca de la medición. Si un conjunto de medicio-
nes consta de resultados individuales representativos del todo, pueden usarse métodos estadísticos para estimar propiedades
informativas de la totalidad y otras pruebas estadísticas para determinar si es probable que dichas propiedades cumplen con
los requisitos establecidos. Los análisis estadísticos resultantes deben considerar la variabilidad asociada con el proceso de me-
dición, así como la variabilidad de la entidad que se está midiendo. Las mediciones estadísticas usadas para evaluar la dirección
y magnitud de estos errores incluyen la media, la desviación estándar y expresiones derivadas de éstas, como el coeficiente de
variación porcentual (%CV, también denominado desviación estándar relativa porcentual o %RSD). La variabilidad estimada
puede usarse para calcular intervalos de confianza para la media, o medidas de variabilidad, e intervalos de tolerancia que cap-
turan una proporción especificada de las mediciones individuales.
El uso de mediciones estadísticas debe complementarse con el buen juicio, especialmente con respecto al muestreo repre-
sentativo. Los datos deberían ser congruentes con las suposiciones estadísticas usadas para el análisis. Puede ser necesario el
uso de métodos alternativos para la evaluación de los datos si se considera que una o más de estas suposiciones han sido viola-
das. En particular, la mayoría de las mediciones estadísticas y pruebas citadas en este capítulo suponen que la distribución de
la población total es una distribución normal y que la muestra analizada es un subconjunto representativo de dicha población.
La distribución normal (o gaussiana) tiene forma de campana, es simétrica respecto de su centro y tiene ciertas características
requeridas para que estas pruebas sean válidas. No siempre se puede esperar que los datos sigan una distribución normal, pu-
 •
644 (101 O) Datos Analíticos / Información General USP 37

diéndose requerir de una transformación para que se ajusten a la misma. Por ejemplo, existen variables que tienen distribucio-
nes cuyo gráfico muestra una cola más larga hacia la derecha que hacia la izquierda. Por lo general, estas distribuciones pue-
den volverse aproximadamente normales mediante una transformación logarítmica. Un método alternativo sería el uso de pro-
cedimientos estadísticos "independientes de la distribución" o "no paramétricos" que no requieren que la población tenga
una distribución normal. Cuando el objetivo es determinar un intervalo de confianza para la media o para la diferencia entre
dos medias, por ejemplo, la suposición de normalidad no es tan importante debido al teorema de límite central. No obstante,
debe verificarse la normalidad de los datos para calcular intervalos de confianza válidos para desviaciones estándar y relaciones
de desviaciones estándar, para realizar algunas pruebas de resultados aberrantes y para determinar límites de tolerancia esta-
dística válidos. En este último caso, la normalidad es una suposición fundamental. Los métodos gráficos simples, como gráficos
de puntos, histogramas y gráficos de probabilidad normales, son útiles para verificar esta suposición.
Una medición analítica simple puede ser útil para evaluar la calidad si la muestra proviene de un lote que se ha preparado
utilizando un proceso documentado debidamente validado y si los errores analíticos son bien conocidos. El resultado analítico
obtenido puede condicionarse incluyendo una estimación de los errores asociados. En algunos casos puede considerarse el uso
de promedios ya que la variabilidad asociada con un valor promedio siempre es menor que la variabilidad de las mediciones
individuales. La opción de utilizar mediciones individuales o promedios depende de la aplicación de la medición y su variabili-
dad. Por ejemplo, cuando se obtienen mediciones múltiples con la misma alícuota de muestra, como en el caso de varias in-
yecciones de muestra en cromatografía líquida de alta resolución, por lo general es aconsejable promediar los datos obtenidos,
por la razón que se mencionó anteriormente.
La variabilidad se asocia con la dispersión de observaciones en torno al centro de una distribución. El parámetro estadístico
más comúnmente utilizado para medir el centro es la media de la muestra (x):

La variabilidad del método puede estimarse de varias maneras diferentes. La evaluación más común y útil de la variabilidad
de un método es la determinación de la desviación estándar basada en mediciones independientes repetidas 1 de una muestra.
La desviación estándar de la muestra, s, se calcula por la fórmula:
n 2
s= L:(xi-x)
,_ 1
!(n-1)

en donde X; es la medición individual en un conjunto de n mediciones; y x es la media de todas las mediciones. A continua-
ción, se calcula la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) como:

%RSD=i · 100%

y se expresa como un porcentaje. Si los datos requieren la transformación logarítmica para lograr la normalidad (p.ej., para
valoraciones biológicas), existen métodos alternativos. 2
Debe realizarse un estudio de precisión para obtener una mejor estimación de la variabilidad del método. El estudio de pre-
cisión puede diseñarse para determinar la precisión intermedia (que incluye los componentes de variabilidad "entre análisis" e
"intra-análisis") y la repetibilidad (variabilidad "intra-análisis"). Los estudios de precisión intermedia deben permitir cambios en
las condiciones experimentales que podrían esperarse, como por ejemplo diferentes analistas, diferentes preparaciones de
reactivos, diferentes días y diferentes instrumentos. Para realizar un estudio de precisión, la prueba debe repetirse varias veces.
Cada análisis debe ser completamente independiente de los demás para obtener estimaciones exactas de los diferentes com-
ponentes de variabilidad. Además, dentro de cada análisis, deben realizarse determinaciones repetidas para estimar la repetibi-
lidad. Ver un ejemplo de un estudio de precisión en el Apéndice B.
Puede considerarse un intervalo de confianza en la interpretación de los datos. Estos intervalos se calculan a partir de varios
datos usando la media (x) y la desviación estándar de la muestra(s) según la fórmula:

1 Las mediciones múltiples (o, por equivalencia, los errores experimentales asociados con las mediciones múltiples) son independientes entre sí cuando se puede
suponer que representan una muestra aleatoria de la población. En estas muestras, la magnitud de una medición no está influenciada por otra medición ni influye
en la magnitud de ninguna otra medición. La falta de independencia implica que las mediciones están correlacionadas en función del tiempo o del espacio. Consi-
deremos, por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos. Supongamos que, por causa desconocida, se produce un error experimental con valor bajo
(error negativo) en una muestra colocada en la primera columna, y que entonces esta misma causa produce un valor bajo para una muestra colocada en la segun-
da columna; en este caso, las dos mediciones resultantes no son estadísticamente independientes. Una manera de evitar dichas posibilidades sería aleatorizar la
colocación de las muestras en la placa.
2 Cuando los datos se han transformado logarítmicamente (base e) para lograr la normalidad, la %RSD es:

%RSD -100%- ,e··

Esto puede aproximarse razonablemente según:

%RSD ·100% (e' 1)

en dondes es la desviación estándar de los datos transformados logarítmicamente (base e).

USP 37 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 645

( -X - t., 2.n s - s 1
1 Jíl 'X +t., 2n 1 Tn)
en donde t., 12 n 1 es un número estadístico que depende del tamaño de la muestra (n), el número de grados de libertad (n - 1)
y el nivel de confianza deseado (1 - a). Sus valores se obtienen a partir de las tablas publicadas de la distribución t de Student.
El intervalo de confianza proporciona una estimación del intervalo donde cae la media de la población "verdadera" (~1) y, ade-
más, evalúa la confiabilidad de la media de la muestra como una estimación de la media verdadera. Si se repitiera la misma
configuración experimental una y otra vez y se calculara cada vez un intervalo de confianza del 95% (por ejemplo) para la
media verdadera, entonces se esperaría que el 95% de dichos intervalos incluyera la media verdadera, µ. No se puede afirmar
con seguridad si el intervalo de confianza derivado de un conjunto de datos específicos obtenidos contiene µ. No obstante,
suponiendo que los datos representan mediciones independientes entre sí generadas en forma aleatoria a partir de una pobla-
ción normalmente distribuida, el procedimiento usado para determinar el intervalo de confianza garantiza que el 95% de di-
chos intervalos de confianza contienen µ. Debe tenerse en cuenta que es importante definir la población apropiadamente para
capturar todas las fuentes de variación pertinentes. [NOTA sobre terminología-La documentación de la Organización Interna-
cional de Normalización (ISO) utiliza diferente terminología para algunos de los conceptos aquí descritos. En la documenta-
ción de la ISO, al término s/-0n, comúnmente denominado como error estándar de la media, se le denomina incertidumbre
estándar. Asimismo, la ISO denomina al término t., 12 , 0 _ 1 S/-0n como incertidumbre expandida, mientras que a t., 12 , 0 _ 1 lo llama
factor de cobertura. Cuando la desviación estándar se calcula combinando los estimados de variabilidad de diversas fuentes,
recibe el nombre de incertidumbre estándar combinada. Algunas de estas fuentes podrían tener estimaciones no estadísticas
de incertidumbre, denominadas incertidumbres Tipo B, como la incertidumbre en la calibración de una balanza.]

RESULTADOS ABERRANTES

Ocasionalmente, los resultados analíticos observados son muy diferentes de los esperados. Las observaciones aberrantes,
anómalas, contaminadas, discordantes, falaces, sospechosas o absurdas, así como otros tipos de valores erráticos, se denomi-
nan resultados aberrantes. Al igual que todos los resultados de laboratorio, estos resultados aberrantes se deben documentar,
interpretar y manejar. Dichos resultados pueden ser mediciones exactas de lo que se está midiendo aunque diferentes de los
valores esperados. En otros casos, debido a un error en el sistema analítico, los resultados pueden no ser típicos, aunque la
entidad que se mide sea típica. Cuando se obtiene un resultado aberrante, deben realizarse investigaciones sistemáticas del
laboratorio y de los procesos para establecer la causa de ese resultado. Los factores que deben considerarse al investigar un
resultado aberrante incluyen, entre otros, error humano, error de instrumentación, error de cálculo y deficiencias del producto
o de sus componentes. Si se encuentra una causa no relacionada con la deficiencia del producto o de sus componentes, pue-
den repetirse las pruebas con la misma muestra, en lo posible, o con una muestra nueva. Deben examinarse la precisión y
exactitud del método, el Estándar de Referencia, las tendencias del proceso y los límites de la especificación. Los datos pueden
considerarse no válidos, según esta investigación documentada, y eliminarse de los cálculos posteriores.
Si no se encuentra una causa atribuible que se pueda documentar para el resultado aberrante de laboratorio, el resultado
puede analizarse, como parte de toda la investigación, para determinar si se trata de un resultado aberrante.
No obstante, se requiere una cuidadosa consideración cuando se utilizan estas pruebas. Pueden producirse dos tipos de
errores en las pruebas de resultados aberrantes: (a) identificar observaciones como resultados aberrantes cuando en realidad
no lo son; y (b) no identificar resultados aberrantes que sí existen. Cualquier conclusión acerca de la aceptabilidad de los datos
en que se observan resultados aberrantes requiere una interpretación cuidadosa.
La "designación de resultado aberrante" es el reconocimiento informal de valores de laboratorio sospechosos que deben in-
vestigarse con métodos más formales. La elección de la técnica correcta para la identificación de resultados aberrantes suele
depender del reconocimiento inicial del número y ubicación de los valores. Frecuentemente, la designación de resultado abe-
rrante se hace visualmente con técnicas gráficas. La "identificación de resultados aberrantes" es el uso de pruebas de significan-
cia estadística para confirmar que los valores no cumplen con el modelo estadístico conocido o supuesto.
Cuando se utilizan adecuadamente, las pruebas de resultados aberrantes son herramientas valiosas para los laboratorios far-
macéuticos. Existen varias pruebas para detectar resultados aberrantes. Se incluyen en el Apéndice C ejemplos ilustrativos de
tres de estos procedimientos: la Prueba de Desviación Estudentizada Extrema (ESD, por sus siglas en inglés), la Prueba de Di-
xon y la Regla de Hampel.
La elección de la prueba de resultados aberrantes adecuada depende del tamaño de la muestra y de las suposiciones de
distribución. Muchas de estas pruebas (p.ej., la Prueba ESD) requieren la suposición de que los datos generados por el labora-
torio puedan considerarse como una muestra aleatoria de una población normalmente distribuida, posiblemente después de
su transformación. Si se realiza una transformación de los datos, la prueba de resultado aberrante se aplica a los datos transfor-
mados. Las transformaciones más comunes incluyen tomar el logaritmo o la raíz cuadrada de los datos. Existen otros métodos
para la manipulación de un resultado aberrante simple y un resultado múltiple que también pueden utilizarse, e incluyen prue-
bas que utilizan medidas robustas de dispersión y tendencia central, como por ejemplo la mediana y la desviación absoluta de
la mediana y métodos de análisis exploratorio de datos (EDA, por sus siglas en inglés). El "Acomodamiento de resultados abe-
rrantes" es el uso de técnicas robustas, tales como pruebas basadas en el orden o rango de cada valor en el conjunto de datos
en lugar del valor real, para producir resultados que no estén adversamente influidos por la presencia de resultados aberrantes.
El uso de dichos métodos reduce los riesgos asociados con ambos tipos de error en la identificación de resultados aberrantes.
646 (1010) Datos Analíticos / Información General USP 37

El "rechazo de resultados aberrantes" es la eliminación efectiva del resultado aberrante identificado del conjunto de datos.
No obstante, una prueba de resultado aberrante no puede ser el único medio para eliminar un resultado aberrante de los da-
tos de laboratorio. Una prueba de resultado aberrante puede resultar útil como parte de la evaluación de la significancia de ese
resultado, junto con otros datos. Las pruebas de resultado aberrante no son válidas en aquellos casos en que se está evaluando
la variabilidad del producto, como por ejemplo la uniformidad del contenido, la disolución o la determinación de la velocidad
de liberación. En estos casos, un valor considerado como resultado aberrante puede ser en realidad un resultado exacto de un
producto no uniforme. Todos los datos, especialmente los resultados aberrantes, deben conservarse para su análisis futuro. Los
datos inusuales, cuando se observan en el contexto de otros datos históricos, por lo general no son tales sino que reflejan las
influencias de fuentes adicionales de variación.
En resumen, el rechazo o la conservación de un resultado aparentemente aberrante puede ser una fuente grave de sesgo.
Deben tenerse en cuenta las características de las pruebas, así como el conocimiento científico del proceso de fabricación y el
método analítico, para determinar el origen del resultado aparentemente aberrante. Una prueba de resultado aberrante nunca
puede reemplazar una investigación de laboratorio exhaustiva sino que debe realizarse únicamente cuando la investigación no
es concluyente y no se observaron desviaciones en la fabricación o pruebas del producto. Incluso si dichas pruebas estadísticas
indicaran que uno o más valores son resultados aberrantes, deben conservarse igualmente en los registros. La inclusión o ex-
clusión de resultados aberrantes en los cálculos para evaluar la conformidad del producto con los criterios de aceptación debe
basarse en el juicio científico y en las normas internas del fabricante. Suele ser útil realizar los cálculos con y sin los resultados
aberrantes para evaluar su impacto.
Los resultados aberrantes que se atribuyen a errores en el proceso de medición deben informarse (es decir, mediante una
nota al pie de página), pero no incluirse en los cálculos estadísticos posteriores. Al evaluar si el producto cumple con un criterio
de aceptación en particular, es importante definir si el resultado a informar (el resultado que se compara con los límites) es un
valor promedio, una medición individual u otra cosa. Por ejemplo, si el criterio de aceptación se establece para un promedio,
entonces no es estadísticamente apropiado requerir que las mediciones individuales también cumplan con el criterio, ya que la
variabilidad asociada con el promedio de una serie de mediciones es menor que la de cualquier medición individual.

COMPARACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Con frecuencia es necesario comparar dos métodos para determinar si hay una diferencia importante en sus resultados pro-
medios o sus variabilidades. El objetivo de un experimento de comparación de métodos es generar datos que permitan evaluar
la equivalencia de los dos métodos en toda una gama de concentraciones. En esta sección se describen algunos de los factores
que se deben tener en cuenta al realizar dichas comparaciones.

Precisión

La precisión es el grado de coincidencia entre los resultados de pruebas individuales cuando el método analítico se aplica
repetidamente a una muestra homogénea. Para considerar que un método alternativo tiene una precisión "comparable" a la
del método vigente, su precisión (ver Características de Desempeño Analítico en Validación de Procedimientos Farmacopeicos
(1225)) no debe ser peor que la del método vigente en un valor considerado importante. Una disminución en la precisión (o
aumento en la variabilidad) puede aumentar el número de resultados que no cumplen con las especificaciones requeridas. Por
el contrario, un método alternativo que proporciona una precisión superior es aceptable.
Una manera de comparar la precisión de dos métodos es estimando la varianza de cada método (la varianza de la muestra,
s2 , es el cuadrado de la desviación estándar de la muestra) y calculando un intervalo de confianza superior unilateral para la
relación de varianzas (verdaderas), en donde relación se define como la varianza del método alternativo dividida por la varian-
za del método vigente. Se incluye un ejemplo basado en esta suposición en el Apéndice D. El límite de confianza superior unila-
teral debe compararse con un límite superior considerado aceptable, a priori, por el laboratorio analítico. Si el límite de con-
fianza superior unilateral es inferior a este límite aceptable superior, la precisión del método alternativo se considera aceptable,
ya que el uso del método alternativo no llevará a una pérdida importante de precisión. Debe tenerse en cuenta que si el límite
de confianza superior unilateral es inferior a uno, se ha comprobado que el método alternativo tiene una precisión superior a la
del método vigente.
El método de intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la prueba F en dos muestras para evaluar la
significancia estadística de la relación de varianzas. Para realizar la prueba F de dos muestras, la relación de varianzas calculada
con las muestras se compara con un valor crítico basado en los valores tabulados de la distribución F para el nivel de confianza
deseado y el número de grados de libertad de cada varianza. La mayoría de los textos de estadística incluyen tablas con los
valores F. Si la relación calculada excede este valor crítico, se dice que existe una diferencia estadísticamente significativa en la
precisión de los dos métodos. No obstante, si la relación calculada es inferior al valor crítico, esto no prueba que los métodos
tengan la misma precisión o una precisión equivalente, sino que no hay suficiente evidencia para probar que existe una dife-
rencia estadísticamente significativa.
USP 37 Información General/< 101 O) Datos Analíticos 647

Exactitud

La comparación de la exactitud de los métodos (ver Características de Desempeno Analítico en Validacion de Procedimientos
Farmacopeicos (1225)) proporciona información útil para determinar si el nuevo métodri es equivalente, en general, al método
vigente. Un método sencillo para realizar esta comparación es calcular un i11tervalo de confianza para la diferencia entre las
medias verdaderas, donde la diferencia se calcula restando la media del método vigente de la media de la muestra obtenida
con el método alternativo.
El intervalo de confianza debe compararse con un límite inferior y un límite superior considerados aceptables, a priori, por el
laboratorio. Si el intervalo de confianza cae totalmente dentro del rango aceptable, los dos métodos pueden considerarse equi-
valentes, ya que la diferencia promedio entre ellos es insignificante en la práctica. El límite inferior y el superior del intervalo de
confianza sólo muestran el tamaño de la posible diferencia real entre los dos métodos y no si la diferencia se considera tolera-
ble. Dicha evaluación sólo puede realizarse dentro del contexto científico adecuado.
El método del intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a !a aplicación de una prueba t para evaluar la
significancia estadística de la diferencia en promedios. Una manera de realizar la prueba tes calculando el intervalo de confian-
za y examinando si contiene o no el valor cero. Los dos métodos muestran una diferencia estadísticamente significativa en
promedios si el intervalo de confianza excluye el valor cero. Una diferencia estadísticamente significativa puede no tent'r una
magnitud suficiente para tener importancia práctica en el laboratorio ya que puede haber surgido de datos muy precisos o de
una muestra de un tamaño mayor. Por otra parte, es posible que no se encuentre ninguna diferencia estadísticamente signifi-
cativa, lo cual ocurre cuando el intervalo de confianza incluye el cero y, de todas maneras, no puede descartarse una diferencia
práctica importante. Esto podría ocurrir, por ejemplo, si los datos son muy variables o si el tama11o de la muestra es demasiado
pequeño. En consecuencia, si bien el resultado de la prueba t indica si se ha observado o no una diferencia estadísticamente
significativa, no determina la presencia o ausencia de una diferencia de importancia práctica.

Determinación del Tamaño de la Muestra

La determinación del tamaño de la muestra se basa en la comparación de ia exactitud y precisión de los dos métodos' y es
similar al método utilizado para evaluar la hipótesis acerca de diferencias de promedio y relaciones de varianza, respectivamen-
te, aunque el significado de algunos de los datos es diferente. El primer componente que se debe especificar es jJ, la diferencia
aceptable más grande entre los dos métodos que, si se logra, permite llegar a una conclusión de equivalencia. Es decir, si los
dos métodos difieren en no más de /J, en el promedio, se consideran aceptablemente similares. La comparación puede ser
bilateral como se acaba de expresar, considerando una diferencia de /3 en cualquier dirección, como cuando se comparan me-
dias. Alternativamente, puede ser unilateral, como cuando se comparan varianzas, en cuyo caso es deseable una reducción en
la variabilidad y se considera que los métodos son equivalentes si la relación entre las varianzas (método nuevo/método vigen-
te) no es más de 1,0 +/J. El investigador deberá especificar el /J basándose en el conocimiento del método vigente y/o en su
uso, o bien puede calcularlo. Un factor que se debe tener en cuenta cuando hay que cumplir con ciertas especificaciones es
que el nuevo método no debe diferir demasiado del método vigente para que no se generen resultados fuera de la especifica-
ción. En estos casos, se elige un /J que represente una baja probabilidad de que esto ocurra, por ejemplo, comparando la distri-
bución de datos para el método vigente con los límites de especificación. Esto puede hacerse gráficamente o usando un inter-
valo de tolerancia, del que se incluye un ejemplo en el Apéndice E. En general, la elección de /J depende de los requisitos cientí-
ficos del laboratorio.
Los dos componentes siguientes se refieren a la probabilidad de error. Los datos podrían llevar a una conclusión de similitud
cuando los métodos son inaceptablemente diferentes (según lo definido por el /3). Esto se llama falso positivo o error de Tipo l.
El error también podría darse en sentido opuesto, es decir, los métodos podrían ser similares pero los datos no permiten esa
conclusión. Esto se llama falso negativo o error de Tipo 11. Con los métodos estadísticos, no es posible eliminar completamente
la posibilidad de cualquiera de estos errores. No obstante, al elegir bien el tamaño de la muestra, la probabilidad de cada uno
de estos errores puede reducirse aceptablemente. La probabilidad máxima aceptable de un error de Tipo 1 comúnmente se
denomina u. y suele considerarse del orden del 5%, pero puede elegirse otro valor. La probabilidad máxima deseada de un
error de Tipo 11 comúnmente se denomina fJ. Con frecuencia, jJ se especifica indirectamente eligiendo un nivel deseado de 1 -
/3, que se denomina la "potencia" de la prueba. En el contexto de pruebas de equivalencia, la potencia es la probabilidad de
concluir correctamente que dos métodos son equivalentes. Normalmente, se toma una potencia del orden del 80% o 90%
(correspondiente a un /3 de 20% o 10%), aunque pueden elegirse otros valores. El protocolo para el experimento debe especi-
ficar el /3, el ci y la potencia. El tamaño de la muestra depende de todos estos componentes. Se incluye un ejemplo en el
Apéndice E. Aunque el Apéndice E sólo determina un valor único, suele ser útil determinar una tabla de tamaños de muestras
para diferentes opciones de /J, a y potencia. Dicha tabla permite una elección mejor fundamentada del tamaño de la muestra
para equilibrar mejor los recursos y los riesgos (conclusiones falsamente negativas y falsamente pmitivas).

3 En general, el tamaño de muestra requerido para comparar la precisión de dos métodos es 1n,1yor qu" el reqc1erido par,1 cornpdrdr su exdctitud.
648 (1010) Datos Analíticos/ Información General USP 37

APÉNDICE A: GRÁFICAS DE CONTROL

La Figura 7 muestra una gráfica de control para valores individuales. Existen varios métodos diferentes para calcular el límite

, UCL ,, 1(6.5

105
e;;
"
"O
:~
"O Media= 102 O
E
o
e;; : lX1
>
LCL' 97,5

ll í(XJ

Número de Observación

Fig. 1. Gráfica de control para cada X o mediciones individuales de muestras de control. En este ejemplo particular, la media
de todas las muestras (X) es 102,0, el UCL es 106,5 y el LCL es 97,5.

de control superior (UCL, por sus siglas en inglés) y el límite de control inferior (LCL, por sus siglas en inglés). Un método
utiliza el intervalo móvil, que se define como la diferencia absoluta entre dos mediciones consecutivas ( X; - X¡_1 1Estos inter-
1 ).

valos móviles se promedian (l'VfR) y se usan en las siguientes fórmulas:

- MR
UCL=x+3-
d2
- MR
LCL=x-3-
d2
en donde X es la media de la muestra y d 2 es una constante comúnmente usada para este tipo de gráfica, que está basada en
el número de observaciones asociadas con el cálculo del intervalo móvil. Cuando n = 2 (dos mediciones consecutivas), como
aquí, d 2 = 1, 128. Para el ejemplo de la Figura 7, el lVfR era de 1,7:

UCL=102,0+3 1\~ 8 =106,5

LCL=102 0-3--12_=97 5
' 1, 128 '
Existen otros métodos que permiten detectar mejor pequeñas variaciones en la media del proceso, como la suma acumulativa
(también conocida como "CUSUM") y el intervalo móvil exponencialmente ponderado ("EWMA").

APÉNDICE B: ESTUDIO DE PRECISIÓN

La Tabla 1 muestra datos obtenidos de un estudio de precisión. En este estudio se hicieron cinco análisis independientes y,
dentro de cada análisis, se obtuvieron los resultados de tres determinaciones repetidas.
Un análisis de varianza (ANOVA) con los datos de la Tabla 7 genera la tabla ANOVA (Tabla 7A). Como había un número
igual de determinaciones repetidas por análisis en el estudio de precisión, los valores de VarianzaAnálisis y VarianzaRep pueden
conseguirse directamente de la tabla ANOVA. Las siguientes ecuaciones calculan la variabilidad asociada con los análisis y las
determinaciones repetidas, donde MSintrd representa el cuadrado medio de "error" o "intra-análisis" y M\nire representa el cua-
drado medio "entre análisis".

VarianzaRep = MSintra = O, 1 02

.
Varianza
_MSentre
-
- MS1ntra _3,550-0,102_1149
---------
Anál1s1s Nº repeticiones por análisis 3 '

[NOTA-Una práctica común consiste en utilizar un valor de O para VarianzaAnálrrn cuando el valor calculado es negativo]. Las
estimaciones también pueden obtenerse con determinaciones repetidas desiguales, pero las fórmulas son más complejas. Mu-
chos programas de software estadístico pueden manejar fácilmente determinaciones repetidas desiguales. Es importante estu-
diar la magnitud relativa de los dos componentes de la varianza cuando se diseña e interpreta un estudio de precisión. El cono-
USP 37 Información General/ (1 01 O) Datos Analíticos 649

cimiento adquirido puede enfocarse en cualquier esfuerzo de mejoramiento del método continuo y, lo más importante, se
puede utilizar para asegurar que los métodos tienen la capacidad de respaldar los usos para los que están destinados. Al definir
cuidadosamente lo que constituye un resultado (es decir, un valor informable), se está aprovechando el poder de promediar,
con lo que se puede lograr prácticamente cualquier precisión deseada. Esto significa que, al basar el valor de informe en un
promedio a través de determinaciones repetidas y/o análisis, en vez de en un solo resultado, es posible reducir la %RSD y ha-
cerlo de manera predecible.
La Tabla 2 muestra la varianza computada y la %RSD de la media (es decir, del valor de informe) para diferentes combina-
ciones de número de análisis y número de determinaciones repetidas por análisis, usando las siguientes fórmulas:
Varianza de la media =
VarianzaAnalisis
~~~~-+~~~~~~~~~~-
Varianza Rep
(Nºde análisis) (Nº de anál)(Nºde rep. por anál.)

Desviación estándar de la media =.Jvarianza de la media

RSD = Desviación estándar de la media x 1 OO%
Promedio de todos los resultados

Por ejemplo, la Varianza de la media, Desviación estándar de la media y %RSD de una prueba de dos análisis y tres determina-
ciones repetidas por cada análisis son 0,592; 0,769 y 0,76%, respectivamente, según se indica a continuación.

2 (2·3) •
º· º
Varianza de la media = 1·1 49 + 1 2 =0 592

Desviación estándar de la media= ~0.592 =0,769

RSD = (0,769/l 00,96) X 100% = 0,76%

en donde 100,96 es la media para todos los datos en la Tabla 7. Como se muestra en la Tabla 2, aumentar el número de
análisis de uno a dos permite obtener una reducción más importante en la variabilidad del valor de informe que aumentar el
número de determinaciones repetidas por análisis.
No se hicieron suposiciones de distribución sobre los datos de la Tabla 7 ya que el propósito de este Apéndice es mostrar los
cálculos en un estudio de precisión.

APÉNDICE C: EJEMPLOS DE PRUEBAS DE RESULTADOS ABERRANTES PARA DATOS ANALÍTICOS

Considerando el siguiente conjunto de 1O mediciones: 100,0; 100, 1; 100,3; 100,0; 99,7; 99,9; 100,2; 99,5; 100,0 y 95,7
(media = 99,5, desviación estándar= 1,369), ¿hay algún resultado aberrante?

Prueba de Desviación Estudentizada Extrema (ESO) Generalizada

Esta prueba es una versión modificada de la Prueba ESD que permite analizar hasta un número previamente especificado, r,
de resultados aberrantes de una población normalmente distribuida. Para la detección de un solo resultado aberrante (r = 1),
al procedimiento de ESO generalizado también se conoce como prueba de Grubb. No se recomienda la prueba de Grubb para
la detección de múltiples resultados aberrantes. Supongamos que r es igual a 2 y que n es igual a 1O.
Etapa 7 (n= 10)-Normalizar cada resultado restando la media de cada valor y dividiendo esta diferencia por la desviación
estándar (ver la Tabla 3). 4
Tomar el valor absoluto de estos resultados, seleccionar el valor máximo ( R1 = 2,805), y compararlo con un valor crítico
1 1

tabulado, previamente especificado, A. 1 (2,290) basado en el nivel de significancia seleccionado (por ejemplo, 5%). El valor má-
ximo es más grande que el valor tabulado y se determina que no concuerda con los datos restantes. Las fuentes de los valores
A. se incluyen en muchos textos de estadística. Las tablas estadísticas deben usarse con cautela para asegurarse de utilizar las
notaciones correctas (es decir, el nivel de error aceptable) cuando se extraen los valores de la tabla.
Etapa 2 (n= 9)-Eliminar la observación correspondiente al resultado normalizado absoluto máximo del conjunto de datos
originales, de modo tal que n sea ahora igual a 9. Nuevamente, determinar la media y desviación estándar (Tabla 3, las dos
columnas de la derecha), normalizar cada valor y tomar el valor absoluto de estos resultados. Determinar el máximo de los
valores absolutos de los 9 resultados normalizados ( 1R2 I = 1,905), y compararlo con A. 2 (2,215). El valor máximo no es mayor
que el valor tabulado.
Conclusión-El resultado de la primera etapa, 95,7, se declara resultado aberrante, pero el resultado de la segunda etapa,
99,5, no es un resultado aberrante.

4 La diferencia entre cada valor y la media se denomina residual. Existen otras pruebas de resultados aberrantes residuales estudentizados donde el residual, en
lugar de dividirse por la desviación estándar, se divide por la desviación estándar multiplicada por la raíz cuadrada den -1 dividido por n.
650 (1010) Datos Analíticos/ Información General USP 37

Pruebas tipo Dixon

La prueba de Dixon puede ser unilateral o bilateral, dependiendo de si se decide con anterioridad que únicamente se consi-
derarán resultados aberrantes en uno de los lados. Al igual que con la prueba de ESD, la prueba de Dixon supone que los
datos, en ausencia de resultados aberrantes, provienen de una sola población normal. Siguiendo la estrategia usada para la
prueba de ESD, se procede como si no se hubiera tomado una decisión a priori en relación con uno de los lados y se utiliza
una Prueba de Dixon bilateral. A partir del análisis de los datos del ejemplo, se observa que los dos más pequeños son los que
se examinarán como resultados aberrantes. La prueba de Dixon permite el análisis de dos resultados aberrantes de manera
simultánea; sin embargo, estos procedimientos están más allá del alcance de este Apéndice. El procedimiento por pasos que se
discute a continuación no es un procedimiento exacto para realizar una prueba para el segundo resultado aberrante, ya que el
resultado de la segunda prueba depende del primero. Debido a que el tamaño de la muestra también se reduce en la segunda
etapa, el resultado final es un procedimiento que no suele tener la sensibilidad de los procedimientos exactos de Dixon.
Etapa 7 (n= 10)-Los resultados se ordenan según su magnitud (es decir, X" es la observación más grande, X" 1 es la segun-
da observación más grande, etc., y X1 es la observación más pequeña). Las relaciones de la prueba de Dixon se basan en el
tamaño de la muestra (en este ejemplo, n = 1 O); para declarar que X1 es un valor aberrante, se calcula la relación, r11 , según la
fórmula siguiente:

X2-X1
í11=~~-
xn_1-X1

Se utilizaría otra relación si el dato más grande se analiza como resultado aberrante. El resultado r11 se compara con un valor
r11 . 005 en una tabla de valores críticos. Si r11 es mayor que r11 . 0051 se declara que es un resultado aberrante. Para el conjunto de
da'tós anterior, r11 = (99,5 - 95,7)/(100,2 - 95,7) = 0,84. Está ~elación es mayor que r11 0 05 , que es 0,52979 al nivel de signifi-
cancia del 5% para una Prueba de Dixon bilateral. Las fuentes de los valores r11 . 005 se ¡~¿luyen en muchos textos de estadísti-
ca.5
Etapa 2-Eliminar la observación más pequeña del conjunto de datos original, de modo que n ahora sea 9. Se utiliza la
misma ecuación r11 , pero se requiere un nuevo valor crítico r11 . 005 paran= 9 (r11 . 005 = 0,56420). Ahora r11 =(99,7-99,5)/
(100,2 - 99,5) = 0,29, que es menor que r11 ; 0, 05 y no es signitiéativo al nivel del 5%.
Conclusión-Por lo tanto, 95,7 se declara como resultado aberrante, mientras que 99,5 no es un resultado aberrante.

Regla de Hampel

Paso 7-EI primer paso para aplicar la Regla de Hampel es normalizar los datos. No obstante, en lugar de restar la media de
cada dato y dividir la diferencia por la desviación estándar, se resta la mediana de cada dato y las diferencias resultantes se
dividen por la MAD (ver a continuación). El cálculo de MAD se realiza en tres etapas. En primer lugar, se resta la mediana de
cada dato. A continuación, se obtienen los valores absolutos de las diferencias, que se denominan desviaciones absolutas. Por
último, se calcula la mediana de las desviaciones absolutas y se multiplica por la constante 1,483 para obtener la MAD. 6
Paso 2-EI segundo paso es tomar el valor absoluto de los datos normalizados. Cualquier resultado mayor que 3,5 se decla-
ra como un resultado aberrante. La Tabla 4 resume los cálculos.
El valor de 95,7 vuelve a identificarse como un resultado aberrante. Luego, este valor puede extraerse del conjunto de datos
y volver a aplicarse la Regla de Hampel a los datos restantes. La tabla resultante aparece como la Tabla 5. Al igual que en los
ejemplos anteriores, 99,5 no se considera un resultado aberrante.

APÉNDICE D: COMPARACIÓN DE MÉTODOS-PRECISIÓN

El siguiente ejemplo muestra el cálculo de un intervalo de confianza del 90% para la relación de varianzas (verdaderas) a fin
de comparar la precisión de dos métodos. Se supone que la distribución subyacente de las mediciones de la muestra está bien
caracterizada por distribuciones normales. Para este ejemplo, supongamos que el laboratorio aceptará el método alternativo si
su precisión (medida por la varianza) no es más de cuatro veces mayor que la del método vigente.
Para determinar el tamaño de muestra adecuado para la precisión, existe un método de tanteos sucesivos utilizando la si-
guiente fórmula:

Potencia=P/F>]_F
L 4 a,n-
1 1
,n-~
1
donde n es el tamaño de muestra más pequeño requerido para proporcionar la potencia deseada, que es la probabilidad de
afirmar correctamente que el método alternativo tiene una precisión aceptable cuando los dos métodos realmente tienen la
misma precisión; a es el riesgo de afirmar erróneamente que el método alternativo tiene una precisión aceptable; y 4 es el

5 Los valores críticos para r en este ejemplo se toman de la Referencia 2 en Apéndice F, Pruebas de Resultados Aberrantes.
6 Suponiendo una distribución normal subyacente, 1,483 es una constante utilizada de modo que la MAD resultante es un estimador uniforme de la desviación
estándar de la población. Esto significa que a medida que aumenta el tamaño de la muestra, MAD se acerca a la desviación estándar de la población.
USP 37 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 651

límite superior permitido para un aumento en la varianza. Los valores F se encuentran en tablas comúnmente disponibles de
valores críticos de la distribución F. F '·" 1 ., 1 es el percentil u superior de una distribución F con numerador n - 1 y denomina-
dor de n - 1 grados de libertad; es decir, el valor excedido con la probabilidad u. Supongamos inicialmente que el laboratorio
estimó necesario un tamaño de muestra de 11 por método (1 O grados de libertad para el numerador y el denominador); el
cálculo de la potencia sería el siguiente: 1

Pr [F > 1/1F,,,, 1 ,, 1] = Pr [F > 1/4F 00510 10 ] = Pr [F > (2,978/4)] = 0,6751

En este caso, la potencia fue de sólo 68%; es decir, aunque los dos métodos tenían varianzas exactamente iguales, con sólo 11
muestras por método, existe solamente una probabilidad de 68% de que el experimento lleve a datos que permitan concluir
que la varianza ha aumentado no más de cuatro veces. Lo más común es elegir un tamaño de muestra que tenga una poten-
cia de al menos 80% y en algunos casos de 90% o más. Para determinar el tamaño de muestra adecuado, pueden probarse
diversos números hasta encontrar una probabilidad que exceda el límite aceptable (p.ej., potencia> 0,90). Por ejemplo, la de-
terminación de la potencia para tamaños de muestra de 12-20 se muestran en la Tabla 6. En este caso, la suposición inicial de
un tamaño de muestra de 11 no fue adecuada para comparar la precisión, pero 15 muestras por método proporcionarían un
tamaño de muestra lo suficientemente grande para una potencia del 80%, o 20 por método para una potencia del 90%.
Típicamente, el tamaño de la muestra para las comparaciones de precisión debe ser mayor que para las comparaciones de
exactitud. Si el tamaño de la muestra para comparar la precisión es demasiado grande y no es factible llevar a cabo el estudio
en el laboratorio, existen algunas opciones. La primera es reconsiderar la elección de un aumento permitido en la varianza.
Para aumentos mayores permitidos en la varianza, el tamaño de la muestra requerida para una potencia fija es más pequeño.
Otra alternativa es planificar un análisis intermedio con un tamaño de muestra más pequeño, con la posibilidad de continuar
con un tamaño de muestra más grande, si fuera necesario. En este caso, es muy recomendable buscar ayuda profesional de un
experto en estadística.
Supongamos ahora que el laboratorio opta por una potencia de 90% y obtiene los resultados presentados en la Tabla 7
basados en los datos generados con 20 análisis independientes por método.

Relación = varianza del método alternativo/varianza del método vigente= 45,0/25,0 = 1,8
Límite inferior del intervalo de confianza = relación/F. 05 = 1,8/2, 168 = 0,83

Límite superior del intervalo de confianza = relación/F. 95 = 1,8/0,461 = 3, 90

Para esta aplicación, se utiliza un intervalo de confianza del 90% (bilateral) cuando se busca una prueba unilateral del 5%.
Esta prueba es unilateral ya que sólo importa el aumento en la desviación estándar del método alternativo. Hay que tomar
algunas precauciones al usar intervalos bilaterales de esta manera, ya que deben tener colas iguales (los intervalos más comu-
nes tienen esta propiedad). Como el límite de confianza superior unilateral (3, 90) es inferior al límite permitido ( 4,0), el estu-
dio ha demostrado que el método alternativo tiene una precisión aceptable. Si se hubieran obtenido los mismos resultados de
un estudio con un tamaño de muestra de 15-como si se hubiera elegido una potencia del 80%-el laboratorio no hubiera
podido concluir que el método alternativo tiene una precisión aceptable (límite de confianza superior de 4,47).

APÉNDICE E: COMPARACIÓN DE MÉTODOS-DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DIFERENCIA

ACEPTABLE, j], ENTRE DOS MÉTODOS

Este Apéndice describe un método para determinar la diferencia, /3, entre dos métodos (alternativo-vigente), diferencia que,
si se logra, también permite concluir que dos métodos son equivalentes. Si no existe otra información previa que guíe al labo-
ratorio en la elección del /3, ésta es una manera razonable de proceder. En este Apéndice se describen los cálculos del tamaño
de la muestra en diferentes situaciones.

Determinación del Intervalo de Tolerancia

Suponer que no se conocen la media ni la desviación estándar del proceso, pero una muestra de tamaño 50 produjo una
media y una desviación estándar de 99,5 y 2,0, respectivamente. Estos valores se calcularon usando los últimos 50 resultados
generados por este método específico para una muestra (de control) en particular. Con esta información, pueden calcularse
los límites de tolerancia según la siguiente fórmula:

x± Ks
en donde .X es la media, ses la desviación estándar, y K se basa en el nivel de confianza, la proporción de resultados a capturar
en el intervalo y el tamaño de la muestra, n. Hay disponibles Tablas que proporcionan los valores de K. En este ejemplo, el

7 Esto podría calcularse usando una planilla de cálculo de computadora. Por ejemplo, en lv11crosoft@ rxcel la fórmula sería: FDIST((R/ A)'FINV(alfa, n - 1, n - 1 ), n -
1, n 1), donde R es la relación de varianzas a las que se determina la potencia (p.e1 .. R = 1, que fue el valor escogido en los cálculos de potencia provistos en la
Tabla 6) y A es la relación m,ixirna pdla aceptación (p.e¡., A= 4). Alfa es el nivel de signif1canc 1a, normalmente 0,05.
652 (101 O) Datos Analíticos/ Información General USP 37

valor de K requerido para incluir el 95% de la población con una confianza del 95% para 50 muestras es de 2,382. 8 Los límites
de tolerancia se calculan de la siguiente manera:

99,5 ± 2,382 X 2,0

en consecuencia, el intervalo de tolerancia es de (94,7; 104,3).

Comparación de los Límites de Tolerancia con los Límites de la Especificación

Supongamos que el intervalo especificado para este método es de (90,0; 11 0,0) y que la media y la desviación estándar del
proceso no han cambiado desde que se estableció este intervalo. Pueden definirse las siguientes cantidades: el límite inferior
de la especificación (LSL, por sus siglas en inglés) es 90,0; el límite superior de la especificación (USL, por sus siglas en inglés)
es 11 0,0; el límite de tolerancia inferior (LTL, por sus siglas en inglés) es 94, 7 y el límite de tolerancia superior (UTL, por sus
siglas en inglés) es 104,3. Calcular la diferencia aceptable, (jf), de la siguiente manera:

A = LTL - LSL para LTL :::> LSL

(A= 94,7 - 90,0 = 4,7);

B = USL - UTL para USL :::> UTL

(B = 110,0-104,3 = 5,7); y

..-A-->

90,0
,B=mínimo (A, B) = 4,7

94,7
--s-
104,3 110,0
Figura 2. Gráfica de los valores calculados anteriormente.

Con esta opción de ,By suponiendo que los dos métodos tienen una precisión comparable, el intervalo de confianza para la
diferencia en medias obtenidas con los dos métodos (alternativo-vigente) debe encontrarse entre -4,7 y +4,7 para afirmar que
no existe ninguna diferencia importante entre los dos métodos.
Los laboratorios analíticos de control de calidad a veces utilizan límites de tolerancia del 99%, en cuyos casos el intervalo es
mayor. Usando el ejemplo anterior, el valor de K requerido para incluir el 99% de la población con una confianza del 99%
para 50 muestras es de 3,390. Los límites de tolerancia se calculan de la siguiente manera:

99,5 ± 3,390 X 2,0

El intervalo de tolerancia más amplio resultante es de (92,7; 106,3). De la misma manera, el nuevo LTL de 92,7 y UTL de
106, 3 producirían un ,B más pequeño:
A= LTL - LSL para LTL :::> LSL

(A= 92,7 - 90,0 = 2,7);

B = USL - UTL para USL :::> UTL

(B = 110,0 - 106,3 = 3,7); y

,B = mínimo (A, B) = 2,7
Aunque un fabricante puede elegir cualquier ,B que funcione adecuadamente para la determinación de equivalencia, la elec-
ción de un /3 más grande, aún cuando lleva a un n más pequeño, presenta el riesgo de una pérdida de capacidad para la discri-
minación entre métodos.

Tamaño de la Muestra

Existen fórmulas que pueden utilizarse para un ,B específico, suponiendo que se conocen las varianzas de la población y que
son iguales, para calcular el número de muestras que se debe analizar por método, n. El nivel de confianza y la potencia tam-
bién deben especificarse. [NOTA-Potencia se refiere a la probabilidad de llegar a la conclusión correcta de que dos métodos
idénticos son equivalentes.] Por ejemplo, si ,B = 4,7 y se supone que las varianzas de las dos poblaciones son iguales a 4,0;
entonces, para una prueba de un nivel del 5% 9 y una potencia del 80% (con los correspondientes valores z de 1,645 y 1,282,
respectivamente), el tamaño de la muestra aproximado se calcula según la siguiente fórmula:

8 Existen tablas de factores de tolerancia que indican los valores aproximados y, en consecuencia, difieren ligeramente de los valores aquí informados.
9 Cuando se analiza la equivalencia, una prueba de nivel del 5% corresponde a un intervalo de confianza del 90%.
USP 37 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 653

2a 2 2
n ;e: 52 (zª + Z~12 )

2(4) 2
n ¿ - -2 (1,645+1,282) =3,10
(4,7)

En consecuencia, suponiendo que cada método tiene una varianza poblacional, cr 2 , de 4,0, el número de muestras, n, requeri-
do para concluir con una probabilidad de 80% de que los dos métodos son equivalentes (el intervalo de confianza del 90%
para la diferencia en las medias verdaderas se encuentra entre -4,7 y +4,7) cuando, en realidad, son idénticos (la diferencia de
medias verdadera es cero) es 4. Como se utilizó la distribución normal en la fórmula anterior, 4 es en realidad un límite inferior
en el tamaño de muestra requerido. Si es factible, podría convenir un tamaño de muestra más grande. Los valores de z para
niveles de confianza comunes se presentan en la Tabla 8. La fórmula anterior se basa en tres suposiciones: 1) la varianza usada
en el cálculo del tamaño de la muestra se basa en una cantidad de datos previos suficientemente grande que pueden tratarse
como conocidos; 2) se utiliza la varianza conocida previa en el análisis del nuevo experimento, o el tamaño de la muestra para
el nuevo experimento es lo suficientemente grande como para que la distribución normal sea una buena aproximación a la
distribución t; y 3) el laboratorio está seguro de que no existe ninguna diferencia real en las medias, que es el caso más opti-
mista. No es común que se den estas tres suposiciones. La fórmula anterior debe tratarse con más frecuencia como una aproxi-
mación inicial. Las desviaciones de estas tres suposiciones conlleva la necesidad de utilizar un tamaño de muestra más grande.
En general, se recomienda recurrir a alguna persona familiarizada con los métodos necesarios.
Cuando se requiere una transformación logarítmica para lograr la normalidad, la fórmula de tamaño de la muestra debe
ajustarse ligeramente según se indica a continuación. En lugar de formular los problemas con respecto a la varianza de la po-
blación y la diferencia aceptable más grande, /J, entre los dos métodos, ahora se formula con respecto a la %RSD de la pobla-
ción y la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos métodos.
2a 2 2
n¿--f( za +Z~12)
ÓL

en donde

a~ =log( (%RSD/100) 2 +1)

y p representa la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos métodos ((alternativo-vigente)/vigente) y se su-
pone que las %RSDs de la población son conocidas e iguales.

APÉNDICE F: FUENTES DE INFORMACIÓN ADICIONALES

Es posible utilizar una gran variedad de pruebas estadísticas para evaluar un conjunto de datos. Este capítulo presenta varias
pruebas que permiten interpretar y manejar datos analíticos, pero pueden emplearse muchas otras pruebas semejantes. En es-
te capítulo simplemente se ilustra el análisis de datos usando métodos estadísticamente aceptables. Como se menciona en la
Introducción, las pruebas específicas se incluyen con fines ilustrativos únicamente y USP no avala ninguna de estas pruebas co-
mo único método para el tratamiento de los datos analíticos. Puede encontrarse información adicional y pruebas alternativas
en las referencias enumeradas a continuación o en muchos textos de estadística.
Gráficas de Control:
1. Manual on Presentation of Data and Control Chart Analysis, 6• ed., American Society for Testing and Materials (ASTM), Phi-
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2. Grant, E.L., Leavenworth, R.S., Statistical Quality Control, 7• ed., McGraw-Hill, New York, 1996.
3. Montgomery, D.C., lntroduction to Statistical Quality Control, 3• ed., ]ohn Wiley and Sons, New York, 1997.
4. Ott, E., Schilling, E., Neubauer, D., Process Quality Control: Troubleshooting and lnterpretation of Data, 3• ed., McGraw-Hill,
New York, 2000.
Diferencias Detectables y Determinación del Tamaño de Muestra:
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5. juran, ].A., Godfrey, B., juran's Quality Handbook, 5• ed., McGraw Hill, 1999, Sección 44, Basic Statistical Methods.
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3. Buncher, C.R., Tsay, j, Statistics in the Pharmaceutical Jndustry, Marcel Dekker, New York, 1981.
4. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbool< 97, National lnstitute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg,
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5. Zar·, J., Biostafotical Analysis, 2' ed., Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1984.
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2. Katernan, G., Buydens, L., Quality Control in Analytical Chemistry, 2• ed., john Wiley and Sons, New York, 1993.
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4. Mandel, J., Evaluation and Control of Measurements, Marcell Dekker, New York, 1991.
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Pruebas de Resultados Aberrantes:
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2. Bi:ihrer, Armin, "One-sided and Two-sided Critica! Values for Dixon's Outlier Test for Sample Sizes up to
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3. Davies, L., Gather, U., "The identification of multiple outliers," joumal of the American Statistical Association (with com-
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2. Kirk, R.E., Experimental Design: Procedures far the Behavioral Sciences, Brooks/Cole, Belmont, CA, 1968, págs. 61-63.
3. Kirkwood, T.B.L., "Geometric means and measures of dispersion," Letter to the Editor, Biometrics, 1979; 35(4).
4. Miliiken, G.A., johnson, D.E., Analy:iis of Me.11y Dota, Volumen l: Designed Experiments, Van Nostrand Reinhold Company,
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7. Norma E-69 7 -87: Practice for Conducting an lnterlaboratory Study to Determine the Precision of a Test Method, ASTM, West
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USP 37 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 655

8. Hauck, W. W., Koch, W., Abernethy, D., Williams, R. "Making Sense of Trueness, Precision, Accuracy, and Uncertainty,"
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2. Odeh, R.E., "Tables of two-sided tolerance factors for a normal distribution," Communications in Statistics: Simulation and
Computation, 1978; 7: 183-201.
Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisión
Nº del Análisis
Nº de la Repetición 1 2 3 4 5
1 100,70 99,46 99,96 101,80 101,91
2 101,05 99,37 100,17 102,16 102,00
3 101,15 99,59 101,01 102,44 101,67
Media 100,97 99,47 100,38 102,13 101,86
Desviación Estándar 0,236 0,111 0,556 0,321 0,171
%RSD 1 0,234% 0,111% 0,554% 0,314% 0,167%
1 o/oRSD (desviación estándar relativa porcentual)= 100% x (desviación estándar/media)

Tabla lA. Tabla de Análisis de Varianza para los Datos Presentados en la Tabla 7
Fuente de Grados de Libertad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios 1
Variación (df) (SS) (MS) F =MS 0 /MSw
Entre Análisis 4 14,200 3,550 34,886
lntra-análisis 10 1,018 0,102
Total 14 15,217
1 Los Cuadrados Medios Entre (MSR) = SSFnt,efdfFnt'e y los Cuadrados Medios lntra (MSw) = SS 1n1c)df 1""'

Tabla 2. El Impacto Previsto del Plan de Prueba (Nº de Análisis y Nº de Determinaciones Repetidas por Análisis) sobre la Precisión
de la Media
Nº de
Nº de Determinaciones Repe- Varianza Desviación Estándar
Análisis tidas por Análisis de la Media de la Media %RSD 1
1 1 1,251 1,118 1,11
1 2 1,200 1,095 1,09
1 3 1,183 1,088 1,08
2 1 0,625 0,791 0,78
2 2 0,600 0,775 0,77
2 3 0,592 0,769 0,76
1 La o/oRSD se calculó utilizando un valor de la media de 100,96 (como el divisor), basado en los 15 puntos de datos presentados en la Tabla 7.

Tabla 3. Resultados de la Prueba RSD Generalizada

n = 10 n=9
Datos Normalizados Datos Normalizados
100,3 +0,555 100,3 +1,361
100,2 +0,482 100,2 +0,953
100,1 +0,409 100,l +0,544
100,0 +0,336 100,0 +0,136
100,0 +0,336 100,0 +0,136
100,0 +0,336 100,0 +0,136
99,9 +0,263 99,9 -0,272
99,7 +O, 117 99,7 -1,089
99,5 -0,029 99,5 -1,905
95,7 -2,805
Media= 99,54 99,95
SD = 1,369 0,245
656 (101 O) Datos Analíticos / Información General USP 37

Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel

n = 10
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100,3 0,3 0,3 1,35
100,2 0,2 0,2 0,90
100,1 O, 1 O, 1 0,45
100 o o o
100 o o o
100 o o o
99,9 -0,1 0,1 0,45
99,7 -0,3 0,3 1,35
99,5 -0,5 0,5 2,25
95,7 -4,3 4,3 19,33
Mediana= 100 o, 15
MAD= 0,22

Tabla 5. Resultados de la Prueba Reutilizando la Regla de Hampel

n=9
Desviaciones
con Respecto a la Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100,3 0,3 0,3 2,02
100,2 0,2 0,2 1,35
100,1 0,1 o, 1 0,67
100 o o o
100 o o o
100 o o o
99,9 -0,1 0,1 0,67
99,7 -0,3 0,3 2,02
99,5 -0,5 0,5 3,37
Mediana= 100 0,1
MAD= 0,14

Tabla 6. Determinaciones de Potencia para Diferentes Tamaños de Muestras (Específicas para el Ejemplo del Apéndice D)
Tamaño de la Muestra Pr[F >'/• f0,05; n-1; n-1]
12 0,7145
13 0,7495
14 0,7807
15 0,8083
16 0,8327
17 0,8543
18 0,8732
19 0,8899
20 0,9044

Tabla 7. Ejemplo de Mediciones de Varianza para Análisis Independientes (Específicos para el Ejemplo del Apéndice D)
Varianza Tamaño de la Grados de
Método (desviación estándar) Muestra Libertad
Alternativo 45,0 (6,71) 20 19
Vigente 25,0 (5,00) 20 19

Tabla 8. Valores Comunes para una Distribución Normal Estándar

Valores z
Nivel de confianza Unilateral (u) 1
Bilateral (u/2)
99% 2,326 1
2,576
USP 37 Información General/ (1015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica 657

Tabla 8. Valores Comunes para una Distribución Normal Estándar (Continuación)

Valores z
Nivel de confianza Unilateral ('1) Bilateral ( '1/2)
95% 1,645 1,960
90% 1,282 1,645
80% 0,842 1,282

(1015) APARATOS AUTOMATIZADOS DE SÍNTESIS RADIOQUÍMICA

La preparación y el control de calidad de radiofármacos de diagnóstico marcados con nucleidos de vida media muy corta
que emiten positrones (p.ej., 15 0, 13 N, 11 C y 18 F cuyas vidas medias son de 2, 1 O, 20 y 110 minutos, respectivamente), están
sujetos a restricciones diferentes de las que se aplican a los fármacos de uso terapéutico: (1) La síntesis debe ser rápida, aunque
se deben tomar medidas para proteger al químico o al farmacéutico de la excesiva exposición a la radiación. (2) Excepto en un
grado limitado para el 18 F, la síntesis debe producirse en el momento del uso. (3) A excepción del 18 F, cada partida de radiofár-
macos generalmente se dirige a una sola administración.
Estos factores aumentan la importancia del control de calidad del producto farmacéutico final con relación a la validación
del proceso de síntesis. Dado que cada dosis se prepara de forma individual, salvo contadas excepciones, lo ideal sería que
cada dosis fuera sometida a pruebas de control de calidad de pureza radioquímica y otros aspectos de calidad esenciales antes
de su administración. Debido a que no es posible realizar el control de calidad de cada partida, se seleccionan partidas a inter-
valos regulares para establecer y caracterizar completamente su pureza radiofarmacéutica. Esta prueba de calidad rutinaria y
rigurosa de las partidas seleccionadas constituye la base de la validación del proceso, que es absolutamente esencial para la
evaluación anticipada de la calidad y pureza de las partidas cuando se trata de radiofármacos de vida media extremadamente
corta. Puesto que los radiofármacos empleados en tomografía por emisión de positrones (TEP) se administran por vía intrave-
nosa o (en el caso de gases radioactivos) por inhalación, la variabilidad entre partidas, en relación con la biodisponibilidad, no
constituye un problema. Es más, la síntesis en muy pequeña escala de radiofármacos (casi siempre menos de 1 miligramo y a
menudo dentro del rango de los microgramos) y el hecho de que los pacientes generalmente reciben sólo una dosis única de
fármaco radioactivo reducen al mínimo la posibilidad de administrar cantidades nocivas de impurezas químicas. Estas afirma-
ciones no intentan rebatir la necesidad del control de calidad en el manejo de equipos automatizados de síntesis, sino colocar
la fabricación de radiofármacos que emiten positrones en una perspectiva adecuada y enfatizar una vez más la enorme impor-
tancia de la validación anticipada de procesos y el control de calidad del producto terminado.
La síntesis de rutina de radiofármacos puede exponer al personal a dosis innecesariamente altas de radiación. Los dispositi-
vos automatizados de síntesis radioquímica se han ideado, en parte, para cumplir con el concepto de reducir las exposiciones
del personal a la radiación "hasta el menor grado razonablemente posible" (ALARA, del inglés "as low as reasonably achieva-
ble"). Estos dispositivos automatizados de síntesis pueden ser más precisos y eficaces que los métodos manuales existentes.
Dichos métodos automatizados son particularmente útiles cuando una síntesis radioquímica requiere manipulaciones repetiti-
vas y uniformes a diario.
Los productos de estos dispositivos automatizados de radiosíntesis deben cumplir los mismos criterios de garantía de calidad
que los productos obtenidos mediante síntesis manual convencional. En el caso de radiofármacos que emiten positrones, estos
criterios incluyen muchas de las mismas determinaciones que se usan para los radiofármacos utilizados en medicina nuclear
convencional, por ejemplo, pruebas de esterilidad y de endotoxinas bacterianas. Se aplican muchas de las mismas limitaciones.
En general, no se pueden aplicar los procedimientos típicos, como por ejemplo la espectroscopia, debido a que la cantidad de
producto es tan pequeña que cae debajo del nivel de detección mínima del método. En todos los casos, el método farmaco-
peico aplicable es el árbitro decisivo (ver Procedimiento en Pruebas y Valoraciones en las Advertencias Generales).
La preparación de la Inyección de Fludesoxiglucosa F 18 y otros radiofármacos que emiten positrones se puede adaptar fácil-
mente a la síntesis automatizada. En general, el equipo necesario para los métodos manuales es más sencillo y menos costoso
que el que se emplea en los métodos automatizados, pero requiere mayor trabajo. Son de particular interés los métodos rela-
cionados con la validación del rendimiento correcto de un aparato automatizado. En un procedimiento manual, la interven-
ción humana y la corrección mediante inspección pueden evitar muchos errores de procedimiento. En un sistema automatiza-
do, la retroalimentación eficaz también puede comenzar durante la síntesis. Por ejemplo, los detectores de radiación pueden
controlar la actividad en varias etapas de la radiosíntesis. Cuando no se logra la actividad adecuada se puede activar un sistema
de alarma que conduce a la intervención humana.
Radioquímicos frente a Radiofármacos-Se debe establecer una distinción entre un radioquímico y el radiofármaco co-
rrespondiente. En los centros de investigación de TEP, los equipos automatizados se emplean para preparar compuestos mar-
cados para experimentos con animales. Estos radioquímicos no se consideran radiofármacos si (1) no están preparados de
acuerdo a un proceso validado que proporcione un alto grado de seguridad y garantice que la preparación cumpla todos los
658 (1015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica / Información General USP 37

requisitos establecidos de calidad y pureza; y (2) no han sido certificados por personal calificado (farmacéuticos y médicos au-
torizados) de conformidad con los métodos farmacopeicos publicados para los radiofármacos individuales.
Equipo Automatizado-Las consideraciones que se hacen en este capítulo corresponden a la síntesis que se lleva a cabo
mediante robots de uso general y aparatos especiales. Ambos son dispositivos automatizados que se emplean en la síntesis de
radioquímicos. El método exacto de control de los dispositivos de síntesis es variable. Tanto los dispositivos de síntesis contro-
lados electrónicamente como los controladm por programas informáticos caen dentro de la designación general y tienen un
espectro que varía desde el equipo manual tradicional, pasando por dispositivos semiautomatizados, hasta dispositivos com-
pletamente automáticos.
Elementos Comunes de Equipos Automatizados de Síntesis-Para manipular un aparato químico que efectúe la síntesis de un
radioquímico, es necesario controlar parámetros tales como el tiempo, la temperatura, la presión, el volumen y la secuencia.
Estos parámetros se pueden controlar y restringir para que estén dentro de ciertos límites.
Garantía de Calidad del Equipo-El objetivo de la garantía de calidad es ayudar a asegurar que el radiofármaco posterior
cumpla las normas farmacopeicas. Aunque los reglamentos sobre las buenas prácticas de fabricación (21 CFR 820) no sean
aplicables, pueden resultar útiles para crear un programa de garantía de calidad. En la práctica, esto comprende la medición y
el control documentados de todos los parámetros físicos pertinentes controlados por los aparatos de síntesis.
Prueba de Control de Calidad de Rutina-La prueba de control de calidad de un equipo automatizado implica el examen
periódico de todos los parámetros certificados inicialmente durante la calificación de garantía de calidad. La frecuencia de la
prueba puede ser diaria, dependiendo de la importancia y la estabilidad de los parámetros. Esta evaluación del funcionamiento
del proceso se debe aumentar por medio de pruebas periódicas del producto final. Por ejemplo, se pueden aceptar las varia-
ciones en la temperatura de un baño de aceite si el radioquímico (producto final) demuestra que cumple todos los criterios
pertinentes de la prueba.
Auditoría de Verificación de Calidad de los Reactivos-Los materiales y reactivos utilizados para la síntesis de radiofárma-
cos deben ajustarse a las especificaciones y las pruebas establecidas de control de calidad. Se deben establecer los procedi-
mientos para las pruebas, el almacenamiento y el uso de estos materiales. En este contexto, un reactivo se define como cual-
quier producto químico utilizado en el procedimiento que conduce al producto radioquímico final, mientras que los materiales
se definen sólo como suministros complementarios (tubos, materiales de vidrio, viales, etc.). Por ejemplo, en algunos procesos
se emplea nitrógeno comprimido para mover reactivos líquidos. En este caso, tanto el nitrógeno como los tubos deben cum-
plir las especificaciones establecidas.
Documentación de Parámetros del Aparato-Se deben identificar, controlar y documentar las variables fundamentales de
la síntesis. Estas características comprenden importantes atributos físicos, químicos, eléctricos y de funcionamiento. Para micro-
procesadores y dispositivos controlados por computadora es particularmente importante un método para especificar, probar y
documentar los programas y las piezas de la computadora. Este procedimiento debe incluir un análisis general y periódico de
los componentes de la computadora. Además, se debe examinar periódicamente el código del programa informático para de-
terminar que no se haya modificado y que continúa dando como resultado el producto final que cumple todas las especifica-
ciones. La retroalimentación durante el proceso es un medio para confirmar que la síntesis está bajo control. Los cambios de
código en los programas deben incluir un procedimiento de autorización formal y se deben documentar.
Cada tipo de dispositivo de síntesis radioquímica requiere un conjunto de procedimientos específicos para probar y controlar
la confiabilidad y reproducibilidad de los diversos subsistemas que conforman el sistema total de síntesis.
Es esencial que la calibración de cada uno de los componentes se confirme de acuerdo con un cronograma de manteni-
miento establecido y que las mediciones o el control se realicen bajo las condiciones reales de síntesis.
Se deben medir los tiempos de entrega, los volúmenes de reactivo, las temperaturas, las presiones de los gases y las veloci-
dades de flujo y deben demostrar ser estables y reproducibles dentro de los límites establecidos. El agregado de los reactivos y
disolventes se debe calibrar periódicamente. Otros componentes que se deben calibrar de forma rutinaria incluyen el sistema
de detección de radiaciones y los sensores y el sistema de control de procesos.
Como ejemplo, se indican a continuación los elementos de validación de los sistemas de varios componentes representativos
de un dispositivo automático de síntesis:
Los recipientes de reacción se pueden limpiar e inspeccionar mediante un método establecido y documentado. Los recipien-
tes se pueden enumerar y se puede hacer un seguimiento de su desempeño.
Los sistemas de calentamiento y enfriamiento (como por ejemplo los baños de aceite) se pueden controlar por medio de
termómetros o termocuplas. Las temperaturas se pueden registrar en una hoja de partida o se pueden imprimir automática-
mente como parte de un registro computarizado. El mantenimiento implica la calibración periódica.
Los gases y el funcionamiento del sistema de entrega de gas se pueden controlar por medio de manómetros y flujómetros.
La pureza del gas se puede establecer por medio de certificados de análisis emitidos por el proveedor o se puede verificar me-
diante una prueba independiente. El mantenimiento de los manómetros y flujómetros implica la calibración periódica con es-
tándares.
El desempeño motriz dependiente de la posición se puede verificar por medio de interruptores de límite. El mantenimiento
podría implicar la medición real de la distancia recorrida y el tiempo transcurrido.
Las válvulas solenoides se pueden controlar eléctricamente, por medio de pruebas de flujo y presión.
El rendimiento .del calentador se evidencia por medio de lecturas adecuadas de la termocupla. Otras pruebas podrían incluir
determinaciones de resistencia.
USP 37 Información General/ (1024) Suero Bovino 659

Los reactivos se pueden aceptar sobre la base de los certificados de análisis del proveedor. Como alternativa, el producto
químico se podría analizar internamente o enviar a un laboratorio independiente. Según el grado de estabilidad, puede ser
necesaria la repetición periódica de pruebas.
Los programas informáticos se pueden probar mediante la documentación del tiempo de síntesis transcurrido, con impresos
que verifiquen que se efectuaron todas las manipulaciones adecuadas, inclusive impresiones de los parámetros pertinentes co-
mo tiempos, temperatura, presiones y actividades.
Los patrones de distribución de actividades, como por ejemplo la cantidad absoluta de producto, el porcentaje de rendi-
miento y los niveles individuales de actividad de las impurezas, brindan al usuario experimentado una oportunidad para locali-
zar fallas del sistema.
Cambios en el Método de Síntesis-Algunos cambios en los aparatos de síntesis se pueden considerar no significativos. A
menudo, esta categoría incluye cambios que no afectan a ninguno de los parámetros controlados. Sin embargo, es importante
tener cuidado para garantizar que los cambios que parecen inofensivos no tengan un efecto inesperado. Por ejemplo, cambios
en una línea de comentario de un programa informático pueden provocar un cambio inadvertido o la eliminación de una ins-
trucción importante. Cualquier cambio en los parámetros controlados puede cambiar el resultado del proceso. Si el radioquí-
mico resultante no cumple con las especificaciones o si el radiofármaco posterior no satisface los criterios farmacopeicos, el
cambio del proceso es inaceptable; se debe corregir la falla y volver a validar el proceso.

(1024) SUERO BOVINO

INTRODUCCIÓN
El suero bovino es la fracción líquida de la sangre coagulada de buey (Bos taurus, entre otras especies), de la que se han
eliminado células, fibrina y factores de coagulación. Desde la aparición del cultivo celular moderno, los fabricantes de produc-
tos biológicos han usado ampliamente el suero bovino como suplemento de crecimiento para cultivos celulares. Su composi-
ción altamente nutricional de proteínas, factores de crecimiento, hormonas, aminoácidos, vitaminas, azúcares, lípidos, oligoe-
lementos y demás componentes sustenta una amplia gama de aplicaciones de cultivo celular para la investigación y fabrica-
ción comercial de vacunas, productos biológicos de origen natural y recombinantes (en lo sucesivo, productos biológicos), teji-
dos obtenidos por ingeniería y otros productos celulares terapéuticos destinados para uso humano o veterinario. El Suero Fetal
Bovino (FBS, por sus siglas en inglés) es el tipo predominante de suero usado en las aplicaciones de investigación. El suero de
ternero (de animales recién nacidos o mayores) se usa con mucho menor frecuencia, aunque por su bajo costo, sería amplia-
mente usado en la fabricación comercial.
Al igual que con otros productos de origen animal, el suero bovino conlleva el riesgo potencial de introducir agentes extra-
ños en el cultivo celular. Los fabricantes de suero y reguladores deben adoptar procedimientos rigurosos de obtención y análi-
sis, además de estrictas guías de procesamiento y producción para asegurar la calidad del suero bovino.
Con el objetivo de incrementar la calidad y seguridad de los productos biológicos producidos con suero bovino, y de mitigar
las exigencias reglamentarias, los desarrolladores han investigado alternativas a la suplementación con suero, lo que ha resulta-
do en formulaciones de medios exentos de suero para aplicaciones específicas. Aunque se reconoce que debe evitarse el uso
de suero bovino siempre que exista la opción de emplear medio exento de suero, hay casos en los que resulta técnicamente
imposible o poco práctico.
Este capítulo describe cuestiones relacionadas con la obtención, producción y caracterización de suero bovino para asegurar
su uso seguro. El Apéndice 7 presenta una lista de guías y documentos reglamentarios pertinentes. Los fabricantes de suero y
los usuarios finales de suero (fabricantes de productos biológicos) deben considerar y aplicar, según se requiera, los controles y
procedimientos establecidos en este capítulo para asegurar el uso seguro de componentes de suero bovino en la investigación
y fabricación farmacéutica.

Tipos de Suero Bovino

• El suero fetal bovino (FBS) se obtiene de fetos, previo al parto, de hembras reproductoras bovinas sanas que se consideran
aptas para consumo humano mediante inspección ante y postmortem realizada por veterinarios autorizados. El suero se
recolecta en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
• El suero de ternero recién nacido (también conocido como suero de bovino recién nacido) se obtiene de animales con
una edad menor de 20 días en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
• El suero de ternero se obtiene de animales con una edad entre 20 días y 12 meses en mataderos sujetos a inspección y
registro gubernamental.
• El suero de bovino donante (también conocido como suero de ternero donante) se obtiene mediante el sangrado repeti-
do de animales donantes pertenecientes a manadas donantes controladas, y sujetas a inspección y registro gubernamen-
tal. Los animales tienen entre 12-36 meses de edad.
660 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 37

• El suero de bovino adulto se obtiene de ganado con una edad mayor de 12 meses que se declara apto para consumo
humano en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.

SUERO BOVINO: HISTORIA Y TIPOS DE USOS

Historia del Uso de Suero Bovino

El suero animal y demás materiales biológicos complejos se han empleado durante aproximadamente 100 años en el cultivo
de células de mamíferos. Fueron varios los factores que llevaron a la adopción de suero bovino como suplemento estándar
para el cultivo de tejidos. En comparación con el suero de otras especies animales (caballo, cabra), el suero bovino se obtiene
fácilmente por lo que resulta más económico. Muchos investigadores deciden usar suero fetal en sus sistemas experimentales
debido a las inquietudes relacionadas con anticuerpos presentes en suero de recién nacido y de adulto que podrían provocar
una reacción cruzada con las células en cultivo y ocasionar lisis celular mediada por complemento. A fin de terminar con tales
inquietudes, se comenzó a usar calor para inactivar el complemento potencialmente presente en el suero. Los estudios de FBS
realizados en la década de 1950 en el cultivo de células humanas de baja densidad para dilucidar mecanismos de crecimiento
celular demostraron que (1) el componente albúmina puede actuar como portador de moléculas pequeñas esenciales; (2) la
fetuína, una glicoproteína que se presenta en altos niveles en la fracción alfa globulina, facilita la adhesión y extensión celular;
y (3) la fetuína inhibe considerablemente la tripsina, y tal actividad antiproteolítica puede jugar un papel en la capacidad de la
fetuína para estimular el crecimiento celular.
Durante las décadas de 1960 y 1970, la suplementación con suero de los medios de cultivo de tejidos se convirtió en una
práctica normal, lo que facilitó tanto la investigación biomédica como los primeros procesos de fabricación de vacunas a gran
escala. La suplementación con suero redujo la necesidad de optimizar las formulaciones de medios para diferentes tipos de
células. Además, se demostró que el FBS proporcionaba una variedad de factores de crecimiento polipeptídicos. Presuntamen-
te, la albúmina promovía el crecimiento celular debido a sus capacidades para funcionar como proteína portadora de molécu-
las pequeñas o lípidos, para unir iones metálicos, para servir como amortiguador del pH, y para proteger a las células de la
ruptura. Asimismo, se encontraron funciones similares en otros componentes del suero como transferrina, hormonas y otros
factores de adhesión derivados del suero como fibronectina, vitronectina y laminina.

Usos del Suero Bovino

El suero es una mezcla compleja de macromoléculas requerida para el crecimiento celular y la producción de virus, y su uso
como materia prima presenta diversos retos, entre los que se incluyen su composición lote a lote y el riesgo de contaminación
por agentes adventicios. El desarrollo de medios exentos de suero ha reemplazado al suero en algunas aplicaciones biotecnoló-
gicas nuevas de fabricación; sin embargo, muchas líneas celulares usadas en la fabricación aún no han sido adaptadas a estos
medios exentos de suero. Las restricciones reglamentarias y los retos científicos por lo general vuelven poco práctico alterar los
procesos de fabricación existentes en los que se usa suero como materia prima.
En ocasiones, el FBS es necesario para el bioprocesamiento de células y tejidos, lo cual a menudo implica el cultivo de células
provenientes de explantes y biopsias de tejidos. Además, para algunos procesos biológicos puede ser necesario mantener ca-
racterísticas celulares específicas durante el cultivo. El FBS a menudo parece facilitar tales procedimientos y puede afectar el
comportamiento biológico de los tipos de células exigentes (fastidious cells). Se ha demostrado que el FBS afecta la transcrip-
ción de genes importantes para el desarrollo, la apoptosis y la expresión génica relacionada con la apoptosis, además de que
proporciona factores neuroprotectores y antioxidantes, todo lo cual puede ser beneficioso para la supervivencia y el desarrollo
de células en cultivo. Por lo tanto, el FBS seguirá jugando un papel importante como suplemento para cultivos celulares en la
producción de terapias celulares y de tejidos.
En la mayoría de los procesos de fabricación de vacunas de virus los medios usados para la expansión de cultivos celulares y
la infección/producción de virus se suplementan con diferentes tipos de suero a diversas concentraciones. En estos procesos, el
suero bovino ayuda a generar una masa de células en un estado fisiológico óptimo para una replicación viral eficiente.

RECOLECCIÓN Y PRODUCCIÓN DE SUERO BOVINO

Recolección de Sangre

Para todos los tipos de suero bovino, la sangre se debe recolectar en instalaciones sujetas a inspección y registro guberna-
mental (mataderos y granjas de donantes). La sangre debe ser recolectada por operarios capacitados siguiendo los procedi-
mientos escritos aprobados por el fabricante de suero y usando dispositivos de recolección desechables para un sólo uso o
equipo de recolección reutilizable que cuente con procedimientos de limpieza validados.
USP 37 Información Cenera// (1 024) Suero Bovino 661

SUERO DE BOVINO DONANTE

Para cada lote de suero de animales donantes, los fabricantes de suero deben asegurar la rastreabilidad a la manada donante
mediante registros de producción y certificados de salud y de origen de los animales. Los animales donantes están sujetos a
inspecciones veterinarias regulares y se les desangra varias veces siguiendo los procedimientos establecidos. Debe ser posible
rastrear a los animales introducidos a la manada por origen, raza e historial de crianza. Los recolectores deben introducir nue-
vos animales a la manada siguiendo procedimientos especificados y aprobados que incluyen inspección y análisis del animal
previos a la compra, transporte adecuado, un periodo de cuarentena, examen y análisis veterinario durante el periodo de cua-
rentena y criterios de liberación de los animales en cuarentena para la producción del suero. Los recolectores no deben vacu-
nar a los animales donantes contra la diarrea viral bovina (DVB). Los recolectores deben someter los animales a análisis para
determinar la presencia de cualquier agente y anticuerpo de los que se declara estar exenta la manada.

SUERO DE TERNERO RECIÉN NACIDO, SUERO DE TERNERO Y SUERO DE BOVINO ADULTO

Los certificados de salud y de origen de los animales y/o los registros de producción de suero deben asegurar que los fabri-
cantes de suero puedan rastrear el origen del suero bovino derivado de animales sacrificados hasta el matadero. Los fabricantes
de suero deben requerir que los mataderos mantengan la documentación del origen de los animales para sacrificio. La sangre
se debe recolectar de animales que hayan sido sacrificados para consumo humano en mataderos inspeccionados por la autori-
dad competente del país de origen. Los inspectores deben inspeccionar a los animales de manera rutinaria tanto antemortem
como postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros proble-
mas o condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfer-
medades infecciosas al momento del sacrificio. Deben implementarse procedimientos de recolección sanguínea que preven-
gan la contaminación cruzada con otros tejidos y fluidos corporales y el ambiente aledaño. El procedimiento de sacrificio es-
tándar consiste en un método aprobado de aturdimiento del animal seguido de desangrado.

SUERO FETAL BOVINO

Las especificaciones de producto y los procedimientos de análisis para FBS se presentan en el capítulo general propuesto
Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90). Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre
fetal bovina a partir de fetos bovinos provenientes de hembras reproductoras que hayan sido sacrificadas. Las hembras repro-
ductoras deben ser declaradas aptas para consumo humano y deben haber sido sacrificadas en mataderos inspeccionados por
la autoridad competente del país de origen. Los inspectores deben examinar a todos los animales tanto antemortem como
postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros problemas o
condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfermedades
infecciosas al momento del sacrificio. El útero debe extraerse y transportarse a un espacio dedicado para recolección de sangre
fetal bovina, en donde el personal de recolección sanguínea evalúa el feto para detectar signos de muerte fetal, que incluyen
hinchazón, decoloración de la piel, olor, deformación, y caída del pelaje. Asimismo, los recolectores deben verificar el color, la
cantidad y la claridad del fluido amniótico. Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre de fetos aceptables mediante
punción cardíaca en un sistema cerrado de recolección en condiciones diseñadas para minimizar la contaminación microbiana.
Los fabricantes deben implementar procedimientos que prevengan la contaminación cruzada con otros tejidos fetales y fluidos
corporales y el ambiente aledaño.

Recolección y Procesamiento del Suero

La separación (recolección) del suero y demás actividades de procesamiento deben ser realizadas por personal capacitado
siguiendo procedimientos escritos y aprobados. El suero primero se separa y combina, y luego se filtra y deposita en envases
limpios y desinfectados. Si el suero se somete a uno o más tratamientos de inactivación viral en el proceso de producción, los
fabricantes de suero deben validar los procesos de inactivación viral contra una gama de virus pertinentes. Se recomienda in-
cluir al virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en cualquier estudio de validación viral debido a que este virus es ubicuo.

SEPARACIÓN Y RECOLECCIÓN DEL SUERO

El procesamiento de sangre bovina y la separación (recolección) del suero deben realizarse en una manera que minimice la
contaminación bacteriana y micoplasmática, lo cual a su vez minimiza los niveles de endotoxinas en el producto del suero. El
procesamiento cuidadoso y rápido de la sangre ayuda a minimizar la hemólisis, lo que mejor·a aún más la calidad del producto
del suero. Después de la recolección, primero se deja que la sangre coagule durante un periodo específico y en condiciones
controladas, y luego se centrifuga en una centrífuga refrigerada. Posteriormente, el suero se separa del coágulo, generalmente
por centrifugación, se combina y mezcla en un recipiente de combinación, se transfiere a envases etiquetados, y se congela, a
menos que se esterilice inmediatamente por filtración. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso y reali-
662 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 37

zar las actividades de procesamiento del suero, incluyendo la recolección de muestras y las pruebas de control de calidad du-
rante el proceso, siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.

COMBINACIÓN DE SUEROS ANTES DEL FILTRADO

Debido a la limitada cantidad de sangre que se puede recolectar de cada animal, los fabricantes de suero combinan el suero
bruto de muchos animales para crear lotes de tamaño comercial. Después de descongelar el suero bruto y antes de la filtra-
ción, el suero se combina en un recipiente de combinación y se mezcla a una velocidad y temperatura controladas. Las combi-
naciones o lotes de suero de bovino donante pueden consistir en muchas recolecciones separadas de miembros individuales
de la manada. Los lotes de FBS pueden consistir en el suero combinado de miles de animales. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de combinación de sueros previa al filtrado y deben realizar la descongelación del suero, la
combinación previa al filtrado y las actividades de mezclado siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.

FILTRACIÓN

El suero combinado se mezcla y se pasa asépticamente a través de filtros con un tamaño de poro de 0,2 ~tm o menor, de-
pendiendo de la aplicación prevista. Deben validarse los procesos de filtración. Se ha demostrado que la filtración triple usando
filtros con un tamaño de poro de 0, 1 ~1m resulta en un alto grado de eliminación de micoplasmas. Aunque la filtración puede
eliminar algunos virus de gran tamaño y agregados virales del suero, los virus generalmente no pueden eliminarse por comple-
to mediante esta técnica. Además, no se ha demostrado que los filtros eliminen el agente causante de la encefalopatía espon-
giforme bovina (BSE, por sus siglas en inglés). Después de la filtración, los fabricantes de suero llenan envases estériles con el
suero filtrado mediante procesamiento aséptico en un ambiente adecuadamente controlado. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de filtración y deben realizar las actividades de filtrado, llenado y recolección de muestras de
suero siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.

RADIACIÓN

El tratamiento del suero por radiación gamma es muy común y representa uno de los métodos más efectivos de inactivación
viral. La dosis mínima usada con más frecuencia es de 25 kilograys (kGy). Algunos países especifican requerimientos de dosis
mayores (>30 kGy) para suero importado. La radiación gamma puede inactivar virus, micoplasma y bacterias, pero los usuarios
finales del suero deben asegurarse de que el proceso de radiación gamma no afecte negativamente sus aplicaciones específi-
cas. La radiación puede tener efectos adversos sobre la calidad del suero, los cuales tienden a incrementarse a mayores dosis.
La validación de la radiación gama presenta dos aspectos: (1) la administración de la dosis en una configuración de carga
definida y (2) la capacidad de inactivación. Los parámetros críticos del proceso de radiación incluyen la temperatura del pro-
ducto (suero), el tamaño y la configuración del envasado, la distribución de dosímetros y la dosis mínima/máxima definida de
radiación recibida. Los dosímetros deben usarse para monitorear las posiciones de dosis alta y dosis baja en cada aplicación de
radiación. Si el fabricante de suero declara haber realizado inactivaciones, éstas deben estar sustentadas mediante estudios de
inactivación viral bien diseñados por el mismo fabricante.

TRATAMIENTO ULTRAVIOLETA (UV)

Los fabricantes de suero pueden usar tratamiento UV para inactivar virus, micoplasmas y bacterias, sin embargo deben vali-
dar el proceso para demostrar su eficacia. Además, los fabricantes deben ser conscientes de que el tratamiento UV puede tener
un efecto adverso sobre la calidad del suero y por consiguiente deben considerar los efectos del tratamiento UV para cada
aplicación, como deben hacerlo también los usuarios finales del suero.

INACTIVACIÓN CON CALOR

La inactivación con calor implica elevar la temperatura del suero a >56º durante al menos 30 minutos para inactivar el com-
plemento. La inactivación con calor también puede inactivar virus, micoplasmas y bacterias, aunque puede tener un efecto
adverso sobre la calidad del suero, por lo que los fabricantes deben validar la aptitud del procedimiento para aplicaciones es-
pecíficas. En comparación con la radiación, la inactivación con calor proporciona una garantía de inactivación significativamen-
te menor.

ESTUDIOS DE DEPURACIÓN VIRAL

El capítulo general Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Huma-
no o Animal (1050) y otros documentos reglamentarios proporcionan guías sobre la realización de estudios de depuración viral
que ayudan a validar los procesos de eliminación/inactivación. Los fabricantes de suero deben también realizar estudios forma-
USP 37 Información General/ (1024) Suero Bovino 663

les con agregado (spiking) de virus pertinentes y representativos (modelo), y deben analizar y comparar muestras de suero con
virus agregado e inactivado, controles negativos y controles positivos.

TRATAMIENTO CON CARBÓN

Algunos fabricantes de suero usan tratamientos con carbón/dextrano para reducir los niveles de hormonas del suero.

DIÁLISIS

Algunos fabricantes utilizan diálisis o diafiltración para eliminar componentes de bajo peso molecular del suero.

LIMPIEZA Y ESTERILIDAD DEL EQUIPO

Las tuberias y sistemas de acero inoxidable usados en la fabricación de suero bovino deben limpiarse y esterilizarse para pre-
venir la contaminación cruzada y el crecimiento de agentes adventicios. Los fabricantes de suero deben validar sus procesos de
limpieza para la eliminación e inactivación de agentes de interés. Posteriormente, los fabricantes deben implementar controles
de proceso que verifiquen de manera rutinaria los ciclos de limpieza. La esterilización por vapor en el sitio (sterilization-in-pla-
ce) es una técnica de esterilización común y efectiva. Los fabricantes de suero que usan esta tecnología deben validar los ciclos
de vapor para demostrar su uniformidad y capacidad para destruir esporas bacterianas resistentes al calor. Los fabricantes pue-
den, alternativamente, usar sistemas desechables estériles que no requieren de validación de limpieza.

Control de Calidad

RASTREABILIDAD

Recolección en Mataderos
Los materiales recolectados en EE.UU. deben obtenerse de instalaciones registradas en el Departamento de Agricultura de
EE.UU. (USDA, por sus siglas en inglés). Los fabricantes de suero deben conservar documentación que permita rastrear un su-
blote de suero específico hasta el matadero donde se recolectó. Los mataderos mantienen registros del origen del animal. La
práctica industrial general es conservar esta información como parte del Registro Maestro del Dispositivo (DMR, por sus siglas
en inglés). Los requisitos generales de conservación de registros en mataderos autorizados por el USDA se citan en el Título 9
del Código de Reglamentaciones Federales (en lo sucesivo CFR, por sus siglas en inglés) 320.
Los materiales recolectados en países aprobados por el USDA para la importación de productos bovinos a EE.UU. deben
cumplir con los requisitos de la autoridad competente del país de origen. Además, los fabricantes de suero deben conservar
registros de análisis de seguridad requeridos por el USDA para materiales importados (si fuera requerido) como parte de su
Registro Histórico del Dispositivo (DHR, por sus siglas en inglés).
Los fabricantes de suero deben consultar el Título 9 del CFR 309 y el Título 9 del CFR 31 O con respecto a los requisitos de
inspección de animales para diversas enfermedades antes y después del sacrificio. Se recomienda cumplir con tales requisitos
para materiales recolectados fuera de EE.UU.
Recolección en Manadas Donantes
Los fabricantes de suero deben mantener la rastreabilidad hasta la granja de animales donantes en la que se recolectó la
sangre de los animales donantes. En la mayoría de los casos, los fabricantes de suero identifican de manera individual a los
animales de la granja y conservan registros sobre las fechas de sangrado y procesamiento, lo que permite rastrear la recolec-
ción sanguínea hasta un animal en particular. Los animales deben ser inspeccionados con regularidad por un veterinario auto-
rizado o individuo designado bajo la guía de un veterinario, quienes deben certificar que los animales están libres de enferme-
dades y son aptos para consumo humano, de conformidad con el Título 9 del CFR 309.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DEL PRODUCTO

El suero debe almacenarse en estado de congelación a una temperatura de -1 Oº o menor. El suero se congela tan rápido
como sea posible para preservar la calidad del producto y se almacena en condiciones controladas de almacenamiento. Los
fabricantes de suero deben establecer la estabilidad del producto del suero para respaldar la fecha de caducidad propuesta. La
fecha de caducidad típica para el suero bovino es de 5 años a partir de la fecha de filtración y envasado. El uso de cualquier
tipo de suero bovino después de la fecha de caducidad indicada depende de la aplicación y el usuario del suero debe estable-
cer la aptitud continua del producto para su uso.

Etiquetado

Las etiquetas del producto terminado deben contener la siguiente información: descripción del producto, número de lote,
condiciones de almacenamiento, nombre y dirección del fabricante y una declaración que indique el uso previsto. Los materia-
664 (1024) Suero Bovino / Información General USP 37

les destinados para propósitos de investigación están exentos de las reglamentaciones de etiquetado (Título 21 del CFR 801 ).
Por lo general, los fabricantes de suero proporcionan un Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) específico del
lote, el cual se clasifica como parte del etiquetado del producto. Ver los requisitos para el COA en la sección siguiente.

Certificación/Documentación

CERTIFICADO DE ANÁLISIS

El COA debe proveer información sobre un lote de suero específico, incluidas las pruebas realizadas y los resultados de las
mismas (de acuerdo con las especificaciones de liberación del fabricante del suero), así como los identificadores críticos del
etiquetado tales como número de lote, número de catálogo, descripción del tipo de suero bovino, país de origen y fecha de
fabricación o caducidad, o ambas. Este documento es distinto al certificado de salud emitido por la autoridad competente del
país de origen.

CERTIFICADO DE ORIGEN Y CERTIFICADO DEL ESTADO DE SALUD DEL ANIMAL

El Certificado de Origen establece el país en el que se recolectó la sangre bovina, así como la certificación veterinaria de la
salud de los animales antes y después de la recolección (Título 9 del CFR 327.4).

DOCUMENTOS DE IMPORTACIÓN/EXPORTACIÓN

Los documentos de importación/exportación incluyen una certificación formal del estado de las enfermedades animales en
el país de origen y las disposiciones de certificación negociadas/acordadas, las cuales varían de país a país. Cada país define sus
requisitos de importación/exportación a fin de controlar la introducción de enfermedades animales exóticas y su impacto eco-
nómico, así como evaluaciones de seguridad del producto (riesgo vs. investigación, diagnóstico y/o beneficios terapéuticos).

INFORMES DE PRODUCCIÓN

Los informes de producción son generalmente registros de partidas que documentan las materias primas de manera identifi-
cable y rastreable, métodos de producción (centrifugación o filtración) usados en la fabricación, limpieza de equipo e instala-
ciones, pruebas de control de calidad y personal que realiza las actividades requeridas. La materia prima con Certificados de
Origen o registros de producción de suero facilita la rastreabilidad hasta el origen de la sangre que se usó para crear el suero.
Cuando se usa suero como una materia prima para fabricación, la documentación del proceso también ayuda a demostrar la
fabricación controlada del suero bovino.

EVALUACIÓN DE RIESGO DE BSE

A pesar del bajo potencial de riesgo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE, por sus siglas en inglés) en el suero
bovino, diversas agencias reguladoras de EE.UU. e internacionales han desarrollado guías para ayudar a manejar y reducir aún
más los riesgos potenciales de transmisión. Ante la ausencia de métodos de prueba apropiados para detectar al agente infec-
cioso en fluidos como la sangre, la recomendación acordada por varias agencias reguladoras es adoptar buenas estrategias de
evaluación de riesgos. Esta sección del capítulo proporciona algunos antecedentes de la enfermedad y los métodos de detec-
ción vigentes; además señala estrategias de evaluación de riesgos y de reducción de riesgos para prevenir potencialmente la
transmisión de la enfermedad a través del uso de suero en la fabricación de productos medicinales.

Descripción de la Enfermedad

Las TSE son enfermedades animales y humanas transmisibles que se caracterizan por una degeneración del cerebro, relacio-
nada con severos signos y síntomas neurológicos. Debido a las epidemias de TSE en ganado bovino, denominadas BSE, las
cuales se transmitieron a otras especies, los funcionarios de salud pública están preocupados por el riesgo de infección de TSE,
incluida la posibilidad de transmisión de TSE por el uso de productos terapéuticos que se fabrican usando suero bovino. Se han
encontrado titulos bajos en el fluido cerebroespinal, pulmón, tejido linfático, bazo, riñón, hígado e íleon del ganado bovino
infectado con BSE. Los estudios han demostrado que la transfusión sanguínea a partir de una oveja infectada con BSE o prurito
lumbar pero sin enfermedad evidente puede infectar a una oveja que no ha sido expuesta previamente a la infección. Aunque
siempre está presente el riesgo de contaminación cruzada, a la fecha, ningún estudio ha demostrado que la enfermedad pue-
de transmitirse a partir de la sangre de ganado bovino con BSE. Los embriones de ganado bovino afectado por BSE no han
transmitido enfermedades a ratones. Los terneros nacidos de hembras reproductoras que recibieron embriones de ganado bo-
vino afectado por BSE han sobrevivido por hasta 7 años, y el examen practicado a los cerebros de las hembras reproductoras
no afectadas y de sus crías no revelaron encefalopatía espongiforme.
USP 37 Información General/ (1024) Suero Bovino 665

Estrategias de Detección

Ninguno de los procedimientos actualmente disponibles cuenta con una sensibilidad validada que sea suficiente para llevar a
cabo la detección antemortem en animales asintomáticos, aunque se encuentran en desarrollo métodos analíticos para la de-
tección y cuantificación en materiales de baja infectividad como la sangre. La prueba clásica de diagnóstico para TSE es el exa-
men histológico postmortem de tejido cerebral para confirmar la característica degeneración vacuolar. Otras opciones de aná-
lisis incluyen pruebas inmunohistoquímicas que pueden confirmar la presencia de PrPSc, la conformación anormal específica
para la enfermedad de la proteína priónica (PrP), en las regiones vacuoladas del cerebro; y pruebas inmunoquímicas como
transferencias Western y enzimoinmunoensayos que pueden detectar PrPSc en tejidos con titulos altos o moderadamente al-
tos. Estas pruebas generalmente toman menos tiempo que el examen histológico (6-8 horas vs. semanas, respectivamente) y
se pueden automatizar parcial o totalmente. Aunque muchas de éstas pruebas son postmortem, los estudios han demostrado
la viabilidad de las pruebas antemortem de muestras de tejido linfoide obtenido de las amígdalas o de la membrana nictitante
de animales infectados. Las pruebas inmunoquímicas requieren de una extensa recolección y preparación de muestras y pue-
den ser demasiado caras para emplearse como pruebas y monitoreos de rutina de la enfermedad en manadas grandes. Las
estrategias de diagnóstico deben considerar la sensibilidad del análisis en ciertos tejidos, así como la capacidad de la prueba
para detectar la infectividad en los animales antes del desarrollo de signos clínicos de enfermedad. Los resultados negativos no
aseguran la ausencia de infectividad. La detección de infectividad es posible si se inocula el tejido sospechoso en animales ex-
perimentales intracranealmente donde el agente causante puede amplificarse. Esta metodología de detección de baja infectivi-
dad puede tomar desde meses hasta años para arrojar un resultado positivo.

Estrategias de Evaluación y Reducción de Riesgos

Los fabricantes de suero deben emplear estrategias de reducción de riesgos para eliminar el peligro de contaminación cruza-
da de sangre fetal con otros tejidos, que incluyan la obtención apropiada de artículos de origen animal y el uso de prácticas
que han demostrado eliminar o minimizar el riesgo de transmisión de TSE mediante productos alimenticios o para el cuidado
de la salud. Los usuarios finales del suero deben realizar una evaluación de riesgos relacionada con su estrategia de obtención
del material en la que se considere la cantidad de suero bovino usada en su aplicación, y deben realizar auditorías a los provee-
dores para asegurar la rastreabilidad del origen, manejo y sistemas de control de calidad apropiados.

ÜRIGEN Y EDAD DE LOS ANIMALES

Los fabricantes de suero deben monitorear la rastreabilidad de cada lote de suero para asegurar la calificación del suero bovi-
no, según se describió previamente en las secciones Recolección y Procesamiento del Suero y Control de Calidad. Además de la
rastreabilidad, la selección cuidadosa de materiales de origen es el criterio más importante para la seguridad de los productos
medicinales. La certificación de origen debe estar disponible por parte del proveedor y los fabricantes deben conservar esta
información en sus archivos. Las recomendaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA, por sus
siglas en inglés) prohíben el uso en productos regulados por la FDA (con excepción de la gelatina) de cualquier material bovi-
no originario de países con casos reportados de BSE autóctona. La regla vigente propuesta califica al FBS como una fuente
improbable de material infeccioso de BSE, puesto que la evidencia actual sugiere que la transmisión de BSE de la vaca al terne-
ro es poco probable. La regla propuesta indica además que los materiales de ganado bovino prohibidos no incluyen materiales
derivados de fetos de terneros provenientes de vacas inspeccionadas y aprobadas, siempre que los materiales se hayan obteni-
do mediante procedimientos que puedan prevenir la contaminación con materiales de riesgo especificados. Para productos
biológicos veterinarios, los reglamentos vigentes aplicados por el Centro de Productos Biológicos Veterinarios del USDA (US-
DA's Center for Veterinary Biologics o CVB) indican que los ingredientes de origen animal deben obtenerse de países sin o con
un riesgo bajo de BSE, según lo definido por el Centro Nacional de Importaciones y Exportaciones de EE.UU. y el Título 9 del
CFR 94.18.
Las fuentes de materiales más satisfactorias provienen de países con las siguientes características:
• Sin casos reportados de BSE autóctona
• Notificación obligatoria de pruebas positivas
• Verificación obligatoria clínica y en el laboratorio de casos sospechosos
• Prohibición de uso de harina de carne y huesos que contengan proteínas de animales rumiantes como fuente alimenta-
ción de animales rumiantes
• Sin importación de ganado bovino de países donde se haya presentado una alta incidencia de BSE
• Sin importación de progenie de hembras afectadas
La infectividad de la BSE puede incrementarse con la edad del animal. Aunque el suero bovino se considera un material de
bajo riesgo de transmisión de TSE, algunos usuarios finales consideran prudente obtener el suero a partir de hembras repro-
ductoras menores de una edad máxima establecida. Si los fabricantes no pueden determinar la fecha de nacimiento de la
hembra reproductora, deben considerar tanto la fecha de implementación de la prohibición alimentaria en el país de origen y
el periodo de incubación de BSE a fin de determinar la seguridad de la fuente. En julio de 1988 se impuso una prohibición
alimentaria para animales rumiantes en el Reino Unido. Estas consideraciones son específicas del lote, por lo que las auditorías
del proveedor de materia prima deben incluir una revisión de los registros.
 ,.
666 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 37

PROCESO DE PRODUCCIÓN

El usuario final debe contar con sistemas de fabricación para monitorear el proceso de producción y para delinear la partida
(definición de partida, separación de partidas y limpieza entre partidas). El control de contaminación cruzada potencial con
material posiblemente infeccioso es de primera importancia. Debido a la resistencia documentada de los agentes de TSE a la
mayoría de los procedimientos de inactivación, la obtención controlada de materiales es el criterio más importante para lograr
una seguridad aceptable del producto.
Siempre que sea posible, los fabricantes deben identificar las etapas que teórica o demostrativamente eliminen o inactiven
agentes durante la fabricación del material. Los fabricantes deben continuar sus investigaciones sobre métodos de eliminación
e inactivación para identificar etapas/procesos que ayuden a asegurar la eliminación o inactivación de agentes de TSE. Los fa-
bricantes deben diseñar procesos de producción usando métodos disponibles que presenten la mayor probabilidad de inacti-
var o eliminar agentes de TSE. Por ejemplo, la exposición prolongada de tejidos a calor húmedo alto y pH elevado inactiva al
agente de BSE. No obstante, dichos tratamientos son inapropiados para la extracción de muchos otros tipos de artículos bovi-
nos tales como el suero, debido a que estos tratamientos conllevan a la destrucción del material. Los procedimientos conven-
cionales químicos y bioquímicos de extracción y aislamiento pueden ser suficientes para eliminar al agente infeccioso. Técnicas
similares pueden ser efectivas para otros artículos bovinos. La investigación adicional ayudará a desarrollar una comprensión de
la metodología más apropiada para los estudios de validación. Las cuestiones a considerar durante la validación de un proceso
para eliminar los agentes de TSE incluyen lo siguiente:
• La naturaleza del material contaminado intencionalmente (spiked material) y su relevancia para la situación natural
• Diseño del estudio (incluyendo metodologías de reducción de escala de los procesos)
• Método para detectar al agente (ensayos in vitro o in vivo) después de la contaminación intencional y después del trata-
miento
• Caracterización y estandarización de materiales de referencia para la contaminación intencional
•Tratamiento y análisis de datos (ver Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ))
Debido a que ningún estudio ha validado con éxito métodos analíticos para la detección de pequeñas cantidades del agente
de TSE, los estudios de validación para depuración de TSE por lo general emplean la inyección intracraneal de material en pro-
ceso en roedores para la amplificación y detección de infectividad residual potencial.

ANÁLISIS Y CONTROL DE AGENTES ADVENTICIOS

Introducción

Los procedimientos de análisis rigurosos, las guías estrictas de procesamiento y producción, y las evaluaciones de riesgos
apropiadas ayudan a asegurar la seguridad de los diferentes tipos de suero bovino. Esta sección analiza pruebas específicas que
pueden detectar y controlar agentes adventicios.

Análisis de Agentes Adventicios

Los análisis de agentes adventicios requeridos para la evaluación de siembras maestras, células maestras y productos brutos y
finales se describen en el Título 9 del CFR 113.53 y en las directivas de la Agencia Europea para la Evaluación de Productos
Medicinales (EMEA, por sus siglas en inglés) (EMEA/CVMP/743/00 y EMEA/CPMP/BWP/1793/02). Los métodos de análisis se-
ñalados en estos documentos pueden detectar una amplia gama de agentes microbianos bovinos en productos de suero. Estos
métodos de análisis cumplen con los requisitos de la mayoría de las agencias reguladoras mundiales. Los fabricantes de suero
deben analizar una muestra representativa de cada lote de suero para determinar la presencia de agentes adventicios. El análi-
sis se realiza después de la filtración pero antes de cualquier procesamiento destinado a inactivar o eliminar virus.
La filtración con filtros con un tamaño de poro de 100 nm (O, 1 µm) es un método aceptado de eliminación de micoplasmas,
mientras que la radiación gamma (> 25 kGy cuando está congelado) y los tratamientos químicos (p.ej. con betapropiolactona)
son métodos aceptados de inactivación de virus y micoplasmas; los fabricantes de suero usan rutinariamente estas herramien-
tas en las instalaciones de producción y análisis. Estos tratamientos no eliminan anticuerpos que puedan interferir con algunas
aplicaciones. Además, los tratamientos no aseguran la eliminación ni la inactivación total de virus, pero pueden reducir signifi-
cativamente el riesgo de actividad viral. La serie de análisis para determinar la ausencia de agentes adventicios en el suero bovi-
no generalmente incluye lo siguiente:
•Análisis de esterilidad bacteriana y fúngica, según se describe en el Título 9 del CFR 113.26
•Análisis de micoplasmas según se describe en el Título 9 del CFR 113.28
•Análisis viral según se describe en el Título 9 del CFR 113.53
Los procedimientos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) confirman la ausencia de infección bacteriana y fúngica. En lo que
respecta a virus, únicamente el cultivo usando células sustrato adecuadas puede indicar infectividad y replicación viral. Aque-
llos que usan suero para investigación o producción deben analizar el suero para demostrar la ausencia de agentes adventicios
de una manera que sea congruente con la aplicación prevista del producto, teniendo en cuenta que el análisis únicamente
indica la presencia o ausencia de agentes adventicios dentro de los límites de los procedimientos de análisis usados.
USP 37 Información General/ (1024) Suero Bovino 667

Análisis de Micoplasmas
La contaminación con micoplasmas en el cultivo de tejidos puede surgir de muchas fuentes de origen animal, incluido el
suero, pero resulta con mayor regularidad de la contaminación cruzada de cultivos infectados. Los micoplasmas son contami-
nantes particularmente insidiosos en el cultivo celular debido a que
• no pueden visualizarse mediante microscopia de luz incluso a alta densidad (> 10 7 unidades formadoras de colonias/mL);
• no ocasionan cambios observables de turbidez o pH del fluido de cultivo;
• no se pueden eliminar rutinariamente mediante filtros de esterilización individuales, aunque se puede lograr la eliminación
a través de una serie de tres filtros de O, 1 µm;
• los antibióticos tradicionales que se usan en el cultivo celular no los afectan; y
•provocan una variedad extremadamente amplia de efectos adversos en el cultivo de tejidos.
El capítulo Pruebas para Micoplasmas (63) describe la detección clásica de micoplasmas.
Además de estos métodos, los procedimientos de detección más recientes incluyen los ensayos luminiscente y de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). El capítulo Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación
(1127) describe los principios generales de los ensayos de PCR. El ensayo sensible luminiscente de 20 minutos mide una activi-
dad enzimática específica de molicutes que convierte el difosfato de adenosina a trifosfato de adenosina mediante una reac-
ción de luciferasa/luciferina. Los resultados son inequívocos y semicuantitativos. Los métodos de PCR son rápidos y sensibles y
su funcionamiento es bastante fiable, aunque los resultados falsos positivos ocasionales representan una preocupación en lo
que respecta a laboratorios de servicios de análisis comerciales. La PCR puede detectar fragmentos de ADN micoplasmáticos
no infecciosos.

Análisis Viral
Los procedimientos de análisis viral para productos de suero se citan en el Título 9 del CFR 113.52 y en el Título 9 del CFR
113.53. Además, existen otros documentos que pueden incluir análisis equivalentes o pertinentes, como por ejemplo EMEA/
CVMP/743/00-Rev.2 del Comité para Productos Medicinales Veterinarios (Committee for Veterinary Medicinal Products o
CVMP) Guía Revisada de Requisitos y Controles Aplicados al Suero Bovino Usado en la Producción de Productos Medicinales Veterina-
rios Inmunológicos (Revised Guideline on Requirements and Controls Applied to Bovine Serum Used in the Production of lmmunologi-
cal Veterinary Medicinal Products) y EMEA/CPMP/BWP/1793/02 del Comité para Productos Medicinales de Patente (Committee
for Proprietary Medicinal Products o CPMP) Guías sobre el Uso de Suero Bovino en la Fabricación de Productos Medicinales Biológi-
cos de Uso Humanos (Note for Guidance on the Use of Bovine Serum in the Manufacture of Human Biological Medicinal Pro-
ducts). Los fabricantes de suero deben realizar análisis de virus que cumplan con esta reglamentación, usando por lo menos
dos líneas de células detectoras diferentes y sensibles, de las cuales una debe ser de origen bovino. Las pruebas incluyen el
cultivo de células detectoras en medios de cultivo celular suplementados con el suero de prueba al 15% durante al menos 21
días. Las células se subcultivan por lo menos dos veces durante este periodo, generalmente a los 7 y 14 días posteriores a la
inoculación. Una vez terminado el último subcultivo (después de un total de al menos 21 días de incubación), las células se
examinan para detectar signos generales de amplificación del virus. Los siguientes puntos finales se usan para la detección ge-
neral de virus: examen microscópico celular para agentes citopatogénicos tales como el virus de la rinotraqueitis bovina infec-
ciosa, tinción celular y examen microscópico para cuerpos de inclusión, y prueba de hemadsorción para detectar agentes he-
madsorbentes tales como Pl-3. Además de esta serie de análisis y al finalizar el último subcultivo (después de un total de al
menos 21 días de incubación), las células se tiñen con anticuerpos específicos fluorescentes contra los siguientes agentes vira-
les específicos:
• BVDV
• Parvovirus bovino
• Adenovirus bovino
• Virus de la lengua azul
• Virus respiratorio sincicial bovino
• Reovirus
• Virus de la rabia
Además de los virus listados anteriormente, otros virus pueden ser agentes causantes de enfermedades y que requieren de
análisis en diversas aplicaciones del suero bovino. El usuario final del suero es el responsable de determinar si el análisis com-
pleto del Título 9 del CFR es suficiente y si se deben analizar otros agentes virales específicos. Ejemplos de virus específicos no
cubiertos por la guía de análisis viral vigente pueden incluir akabane, virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1 ), virus de la parain-
fluenza tipo 3 (Pl-3), leucemia bovina, rotavirus bovino, circovirus bovino, poliomavirus bovino, coronavirus, torovirus, entero-
virus bovino, astrovirus bovino, virus de fiebre aftosa (VFA) y peste bovina. El Apéndice 2 proporciona una descripción general
de estos virus, así como de aquellos para los que se requiere de análisis. El análisis de riesgos extensivo por parte del usuario
final del suero debe determinar el alcance del análisis y las opciones para el tratamiento del suero.
668 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 37

Estrategias de Evaluación y Detección de Riesgos

Los fabricantes de suero y los usuarios finales de suero deben llevar a cabo evaluaciones integrales de riesgos basadas en
datos científicos (p.ej. análisis de modos y efectos de falla) a fin de comprender de mejor manera el perfil de seguridad del
producto del suero. Se pueden tomar en cuenta los siguientes elementos de evaluación de riesgos, aunque es posible incluir
otros elementos según sea apropiado: país de origen, región del país, estado de enfermedad animal del país/región de origen,
edad del animal, proceso de recolección sanguínea, método de aturdimiento del animal y método de desangrado, proceso de
fabricación del suero, tipo de sistema de calidad de producción, controles de producción durante el proceso, análisis del pro-
ducto final, inactivación del virus, segregación del equipo, procedimiento de limpieza del equipo, capacitación del personal,
uso/aplicación del suero, tipo de producto farmacéutico y uso previsto.
La barrera de especies proporciona un grado de protección en contra de infecciones por algunos agentes etiológicos anima-
les. Esta barrera no es una alternativa para asegurar de manera proactiva que los productos farmacéuticos se fabriquen única-
mente a partir de materias primas de origen animal que presentan niveles indetectables de agentes adventicios. La inoculación
de organismos viables en especies no anfitrionas conlleva el riesgo de que los organismos puedan cruzar la barrera de especies.
Por lo tanto, un régimen apropiado de análisis del material del suero debe incluir exámenes para determinar la presencia de
contaminantes potenciales relacionados con la especie de origen y la especie objetivo. Los tratamientos del suero para inactivar
agentes virales son un factor para establecer el régimen de análisis adecuado para un material en particular. El nivel de riesgo
más bajo de contaminación se relaciona con materiales biológicos que se esterilizan de manera terminal.
Un nivel de riesgo igual a cero es imposible e irrazonable. Los fabricantes de suero deben describir completamente los regí-
menes de análisis específicos en las especificaciones del producto, los cuales variarán dependiendo del tipo y origen del suero.
Por tanto, las pautas de detección descritas en este capítulo únicamente son ejemplificativas y es posible que no se requiera de
la detección de todos los virus citados para un material en particular. Algunos fabricantes pueden realizar ciertas pruebas sobre
el producto terminado o los mater·iales en proceso en lugar de realizarlas sobre los componentes individuales. Los fabricantes
también deben evaluar el efecto de dilución en relación con el límite de detección del procedimiento de análisis. La interferen-
cia con el crecimiento o neutralización de actividad viral por parte del suero puede ser indicativo de un anticuerpo específico o
de ciertos factores inespecíficos de enmascaramiento del agente viral por parte del suero. Se recomienda que los fabricantes de
suero consideren esta posibilidad al momento de determinar un nivel adecuado de tratamiento en sus estudios de inactivación
viral o aplicaciones de análisis viral.
Los fabricantes de suero deben confirmar que la especie de origen es bovina para asegurar la ausencia de otros agentes no
bovinos. Los fabricantes deben realizar análisis de virus extraños en cultivos celulares apropiados (ver Métodos de Pruebas Viro-
lógicas (1237) para seleccionar adecuadamente las líneas celulares, dependiendo del ensayo y del agente buscado). Si fuera
necesario, se deben realizar estudios de seroconversión en especies animales susceptibles al virus, usando una respuesta inmu-
ne mediada por anticuerpos en la especie anfitriona como método de detección. Los estudios deben usar este procedimiento
después de una etapa de inactivación para detectar si el virus estaba presente antes del proceso de inactivación viral.
Los procesos de fabricación de suero deben realizarse de manera congruente, siguiendo los procedimientos de fabricación
establecidos, con sistemas de calidad adecuados incorporados al proceso de producción. Además, la segregación de equipo
(por especies de origen), los procedimientos de limpieza de equipo e instalaciones, y la capacitación de personal son elemen-
tos importantes en la evaluación de riesgos del proceso.

Consideraciones de Seguridad

Los usuarios finales de suero bovino de donante pueden requerir que el suero no presente anticuerpos detectables contra el
VDVB u otros agentes específicos, de modo que los usuarios puedan propagar cultivos celulares usados en la producción de
vacunas, en el análisis de diagnóstico, y en la preparación de kits de pruebas, especialmente para el mantenimiento de reservas
de células maestras y de siembra. Se encuentran disponibles más de 40 tipos de células para la producción de productos bioló-
gicos veterinarios, pero menos de 1 O tipos de medios para su propagación. Algunos investigadores han propuesto medios
exentos de suero como alternativa para propagar ciertas células y virus; sin embargo, esto significa adaptar los procedimientos
de cultivo, lo que puede alterar las células y cambiar los resultados de producción. Si se importan sueros nuevos o diferentes a
EE.UU., los usuarios finales del suero requerirán confirmación de origen, especies y documentación de origen de los sueros en
países libres de FA y peste bovina.

CARACTERIZACIÓN DE SUERO BOVINO

Introducción

Ante la ausencia de requisitos específicos del producto final, se debe analizar cada lote de FBS para confirmar que el suero
cumpla con los requisitos del capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
(90). Esta sección describe diversos procedimientos claves de caracterización para todos los demás tipos de suero. Estos proce-
dimientos no son obligatorios pero representan guías que los fabricantes pueden considerar para sus aplicaciones individuales.
La tabla de la sección Hemoglobina presenta ejemplos de especificaciones para los diversos tipos de suero bovino.
USP 37 Información General/ (1024) Suero Bovino 669

Identificación de Especies

El suero bovino debe someterse a ensayos de identificación tanto inter como intraespecies para confirmar la identidad de la
especie y la integridad de los productos del suero, así como para asegurar que no se encuentren presentes agentes no bovinos.
El ensayo más comúnmente usado para la identificación de la especie bovina se basa en el perfil electroforético de proteínas
específicas del suero. Con la electroforesis, las proteínas del suero por lo general se separan hasta en seis fracciones: albúmina,
alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gamma globulinas.
Otros procedimientos usados para la determinación de especies bovinas incluyen la inmunodifusión radial (IDR) y el método
de difusión doble de Ouchterlony. Estos procedimientos permiten mediciones cualitativas o cuantitativas de los niveles de in-
munoglobulina G en el suero. El método por IDR se basa en la difusión de un antígeno desde un pocillo circular en un gel
homogéneo que contiene un antisuero específico para cada antígeno en particular. Se forma un círculo de antígeno y anti-
cuerpo precipitados y continúa creciendo hasta que alcanza el equilibrio. Los diámetros de los anillos son una función de con-
centración de antígeno. El método de Ouchterlony es una prueba de difusión doble en gel en la que el antígeno y el anticuer-
po difunden uno hacia el otro en un medio semisólido hasta un punto en el medio en el que se alcanza una concentración
óptima de cada uno, formando un precipitado. Las placas de Ouchterlony contienen pocillos cilíndricos-un pocillo de antíge-
no central de 8 mm de diámetro, rodeado por seis pocillos de antisuero de 3 mm-que posibilitan el monitoreo simultáneo de
múltiples sistemas de antígeno-anticuerpo y la identificación de antígenos particulares en una preparación. El capítulo general
propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) describe el procedimiento aceptado.

Hemoglobina

La hemoglobina es una proteína de subunidades múltiples que forma una unión inestable y reversible con el oxígeno en los
eritrocitos. La forma cargada de oxígeno se denomina oxihemoglobina y es de color rojo brillante. La forma que no está carga-
da de oxígeno se denomina desoxihemoglobina y es de color azul púrpura. La oxihemoglobina es la forma predominante en
los eritrocitos.
El bajo contenido de hemoglobina en los sueros es ampliamente aceptado como una buena indicación general de procesa-
miento rápido y cuidadoso de la sangre que se usará para el suero. Los eritrocitos son frágiles y se rompen fácilmente, liberan-
do hemoglobina en el suero. La manipulación brusca de la sangre recolectada, el pobre control de temperatura o los retrasos
en el procesamiento elevan el contenido de hemoglobina en el suero. Los niveles aceptables de hemoglobina pueden variar
dependiendo de la aplicación prevista. Los niveles de hemoglobina se miden usando procedimientos espectrofotométricos (ver
Espectrofotometría y Dispersión de Luz (851 )) según se describe en el capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de
Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90).

Suero de Terne- Suero Suero de

ro de Bovino Bovino
FBS Recién Nacido Suero de Ternero Donante Adulto
Prueba de Esterilidad No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta
crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento
Micoplasmas No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Análisis de virus No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Hemoglobina (mg/dl) <30 <30 <30 <30 <30
Proteínas totales (g/dl) 3,0-4,5 3,5-6,0 5,0-8,0 5,0-8,0 6,0-10,0
pH 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00
Osmolalidad (mOsmol/Kg) 280-360 240-340 240-340 240-340 240-340

Perfil Químico

El análisis de componentes tales como colesterol, alfa globulina, beta globulina, gamma globulina, albúmina, creatinina, bili-
rubina, glucosa, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, fósforo, potasio, calcio y sodio por lo general no se con-
sidera un criterio para liberación del lote de suero bovino. Algunos fabricantes no realizan análisis de manera rutinaria sino úni-
camente como análisis auxiliares. En algunas ocasiones, los laboratorios clínicos hospitalarios pueden llevar a cabo los análisis.
Los niveles de estas sustancias químicas en el suero son importantes para los usuarios finales y se pueden usar también para
evaluar la variabilidad de lote a lote.

Niveles de Endotoxinas

Aunque los niveles altos de endotoxina no son adecuados para aplicaciones que involucren inyectables, los niveles acepta-
bles en suero bovino varían dependiendo de la aplicación prevista. Algunos fabricantes pueden pasar por alto la importancia
de los niveles bajos de endotoxinas en el suero bovino usado en aplicaciones de cultivo celular. Las endotoxinas influyen en
más de 30 actividades biológicas, algunas de las cuales incluyen activación de macrófagos, estimulación mitogénica y la induc-
670 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 37

ción de interferones y de factor estimulante de colonias (para algunas aplicaciones, estas pueden ser actividades positivas). Las
endotoxinas también pueden conllevar a citoxicidad al iniciar la activación del complemento. Los métodos más comúnmente
usados para la detección de endotoxinas son el procedimiento semicuantitativo de coagulación con lisado de amebocitos de
Limulus y el método cromogénico cinético cuantitativo descritos en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Tanto para el ensa-
yo de coagulación como el ensayo cromogénico cinético, un ensayo válido de endotoxinas requiere de tratamiento apropiado
por calor o dilución a fin de evitar efectos adversos de sustancias interferentes en el suero. Los investigadores deben incluir un
control de producto positivo en cada ensayo para confirmar que se ha superado cualquier interferencia por el tratamiento por
calor o dilución.

Osmolalidad

La prueba de osmolalidad está diseñada para evaluar la concentración de electrolitos en el suero bovino. Las sustancias quí-
micas que afectan la osmolalidad del suero incluyen sodio, cloruro, bicarbonato, potasio, proteínas y glucosa. Los fabricantes
de suero deben medir la osmolalidad de cada partida de suero para verificar el cumplimiento con las especificaciones del pro-
ducto, usando equipos calibrados con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (National lnstitu-
te of Standards and Technology). El capítulo Osmolalidad y Osmolaridad (785) describe la forma en que se determina la osmo-
lalidad mediante disminución del punto de congelamiento de la solución de suero bovino. Los científicos emplean por lo me-
nos dos estándares para calibrar el instrumento. La osmolalidad de cada muestra se calcula y relaciona con el contenido de
agua del suero y se expresa en müsmol/kg H2 0.

Nivel de Proteínas Totales

El nivel de proteínas totales en el suero se mide para verificar la edad del animal y el cumplimiento con las especificaciones
del producto. El capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057) describe dos procedi-
mientos, los métodos de Biuret y de Bradford, para determinar la concentración de proteína. El usuario final debe evaluar el
nivel aceptable de proteína en el suero basándose en la aplicación prevista.

Propiedades de Crecimiento Celular

Se debe analizar la capacidad de cada lote de suero para sustentar el crecimiento in vitro de líneas celulares específicas. Los
sueros bovinos son muy variables por lo que lotes distintos pueden producir resultados diferentes. Debido a esta variabilidad,
los usuarios finales deben caracterizar y estandarizar las líneas celulares que usarán para este tipo de análisis. Los usuarios fina-
les deben diseñar procedimientos de crecimiento celular que les ayuden a verificar la eficacia del suero bovino en la promoción
del crecimiento celular. Los fabricantes de suero se beneficiarán del monitoreo de la promoción de crecimiento celular durante
varias generaciones de subcultivos para detectar cualquier evidencia de citoxicidad o cambios en la morfología celular. Los fa-
bricantes de suero usan distintos tipos de células, y los estudios de crecimiento y las líneas celulares usadas por los fabricantes
de suero también pueden variar de aquellos aplicados por los usuarios finales del suero. Al evaluar las propiedades de creci-
miento de una línea celular específica en respuesta a un lote específico de suero, los fabricantes de suero deben tomar en
cuenta la eficiencia del plaqueo y/o la promoción de crecimiento o algunas otras pruebas de funcionalidad que califiquen al
lote de suero para su uso previsto.
La eficiencia del plaqueo a baja densidad celular es un método preferido para analizar la capacidad de proliferación y la su-
pervivencia de células individuales en condiciones óptimas de crecimiento. Este procedimiento puede revelar diferencias en la
velocidad de crecimiento dentro de la población y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tama-
ño de las colonias) y la supervivencia de las células (número de las colonias). La cinética del crecimiento es otro aspecto impor-
tante en el diseño de experimentos celulares. Determinar la curva de crecimiento de cada línea celular ayuda a definir condi-
ciones de cultivo óptimas, debido a que la variación en el suero y otros aditivos de crecimiento pueden tener influencia sobre
los parámetros de crecimiento, lo cual puede afectar el resultado del experimento.
Ante la ausencia de pruebas específicas diseñadas para sus productos particulares, los usuarios del suero pueden referirse a
las pruebas de funcionalidad descritas en el capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de
Funcionalidad (90) para determinar si un lote de suero es adecuado para sus aplicaciones. Este capítulo proporciona guías sobre
cómo realizar las pruebas de promoción de crecimiento y de eficiencia del plaqueo.

Citotoxicidad In Vitro

Los fabricantes de suero deben usar una línea celular apropiada para analizar cada lote de suero y deben realizar estudios de
crecimiento a través de varias generaciones subcultivadas para asegurar que el suero no tenga efectos citotóxicos sobre las cé-
lulas. La elección de una línea celular depende del uso previsto del suero. Los ensayos de crecimiento celular y de citotoxicidad
deben realizarse en el lote final de suero después de cualquier etapa de inactivación viral o de cualquier procesamiento adicio-
nal.
USP 37 Información General/ \1024) Suero Bovino 671

CONCLUSIÓN

Es probable que el suero bovino se mantenga como un componente importante en la fabricación de muchos productos bio-
lógicos, en particular de aquellos que dependen del cultivo celular. Al igual que otros materiales similares, la calidad del suero
bovino es intrínsecamente variable. Por consiguiente, los usuarios finales del suero deben establecer pruebas, procedimientos y
criterios de aceptación adecuados para la introducción de materiales en el proceso de una aplicación particular que utilice sue-
ro. Lo anterior puede requerir el análisis de múltiples lotes de suero bovino para determinar aquellos lotes que cumplen con la
especificación (ver la sección Caracterización de Suero Bovino).
Los fabricantes de productos terapéuticos que usan suero bovino son responsables de asegurar y documentar su calidad, así
como el impacto sobre la calidad, seguridad y eficacia del producto final. Además, es importante asegurar que el desempeño
de cada lote de suero sea equivalente durante la fabricación. El suero también puede interferir con la purificación del producto
final; por lo tanto, es importante comprender el efecto del suero bovino sobre el proceso de fabricación a fin de entender el
efecto que pueden tener varios procesos sobre el producto final. Por último, es posible disminuir los riesgos a través del diseño
de procesos que incluyan etapas que eliminen adecuadamente el material bovino mediante dilución, separación o inactiva-
ción, así como el desarrollo de ensayos analíticos para evaluar el contenido residual del material bovino durante los procesos y
en el producto terapéutico final. Diversos ensayos sensibles pueden proporcionar un medio cuantitativo para detectar el mate-
rial bovino en niveles de picogramos.

APÉNDICE 1

El suero bovino y los productos relacionados con el suero usados en la fabricación de productos biológicos se encuentran
reglamentados en el contexto de Requisitos para Ingredientes de Origen Animal Usados en la Producción de Productos Biológicos
(Requirements for lngredients of Animal Origin Used for the Production of Biologics), Título 9 del CFR 113.53. En la actualidad,
cada fabricante de suero realiza estudios de detección para identificar virus contaminantes. Debido a la potencial comercializa-
ción internacional del suero, los fabricantes de suero necesitan tener en cuenta otros requisitos reglamentarios. Los fabricantes
pueden usar los documentos listados en este capítulo como guía para la determinación de contaminación por agentes adventi-
cios en sueros bovinos. Debido al riesgo que conllevan los productos de suero derivado de animales, los fabricantes de suero y
los usuarios finales deben asegurar que el país de origen del material cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables. Aun-
que en la actualidad ningún ensayo de desempeño celular demuestra la ausencia de BSE en el suero, los fabricantes de suero
deben cumplir con los requisitos reglamentarios de los países donde el suero se obtiene y comercializa a fin de asegurar un
riesgo mínimo de infección por BSE/TSE.
Más allá de los capítulos de USP pertinentes referidos en este capítulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios
así como las mejores prácticas para el desarrollo, fabricación, control de calidad y garantía de calidad del producto y los proce-
sos.
CFR
•Título 9 del CFR 94.18 (CVB, 2001)
• Título 9 del CFR 11 3.46
•Título 9 del CFR 11 3.47
•Título 9 del CFR 11 3.52
•Título 9 del CFR 113.53
•Título 9 del CFR 113.55
• Título 9 del CFR 320
• Título 9 del CFR 327.4
•Título 21 del CFR 211 Subparte E
•Título 21 del CFR 801 .1
•Título 21 del CFR 809.1 O
FDA
• FDA. Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). 2000. Letter to manufacturers of biological products (Carta a
los fabricantes de productos biológicos). Disponible en http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/
ucml 05877.htm
• Use of materials derived from cattle in medicinal products intended for use in humans and drugs intended for use in rumi-
nants (Uso de materiales derivados de ganado bovino en productos medicinales destinados para uso en humanos y medi-
camentos destinados para uso en animales rumiantes) (Regla propuesta). Federal Register (Registro Federal). 2007; 72(8):
1582-1619. Disponible en http://www.reginfo.gov/public/
Reglamentos Internacionales y Documentos Guía
• CPMP/Biotechnology Working Party/EMEA (CPMP/BWP/EMEA). 1996. Note for guidance on virus validation studies (Nota
de orientación sobre estudios de validación de virus): the design, contribution and interpretation of studies validating the inacti-
vation and removal of viruses (diseño, contribución e interpretación de estudios para validar la inactivación y eliminación de
virus). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/026895en.pdf.
672 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 37

• CPMP/BWP/EMEA. 2003. Note far guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal pro-
ducts (Nota de orientación sobre el uso de suero bovino en Ja fabricación de productos medicinales biológicos para uso huma-
no). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/179302en.pdf.
• EMEA/CVMP/743/00-Rev.2 del Committee for Veterinary Medicinal Products (Comité para Productos Medicinales Veteri-
narios o CVMP). Revised guideline on requirements and controls applied to bovine serum used in the production of immunologi-
cal veterinary medicinal products (Guía revisada sobre requisitos y controles aplicados al suero bovino usado en Ja producción de
productos medicinales inmunológicos para uso veterinario). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/vet/iwp/
074300en.pdf.
• EMEA/CPMP/BWP/1793/02, del CPMP. Note far guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological
medicinal products (Nota de orientación sobre el uso de suero bovino en la fabricación de productos medicinales biológicos para
uso humano). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/179302en.pdf.
• CPMP/CVMP. Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents vio human
and veterinary medicinal products (Nota de orientación sobre la minimización del riesgo de transmisión de agentes de encefalo-
patía espongiforme animal mediante productos medicinales para uso humano y veterinario). Disponible en http://
www .e mea .europa.eu/ pdfs/h uman/bwp/TSE%20N FG%2041 O-rev2. pdf.
• Organización Mundial de la Salud (OMS), Organización Mundial de Sanidad Animal. Código sanitario para los animales
terrestres 2007. Disponible en http://www.oie.int/eng/normes/mcode/code2007 /anc-en_summry.htm.
• OMS. 2006. WHO guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible spongiform encephalopathies (Guías de Ja OMS
sobre la distribución tisular de la infectividad de encefalopatías espongiformes transmisibles). http://www.who.int/bloodpro-
ducts/cs/TSEPUBLISHEDREPORT.pdf.

APÉNDICE 2

A continuación se presenta una descripción general de los virus que los fabricantes pueden considerar al determinar la au-
sencia de agentes adventicios en suero bovino. La lista se proporciona únicamente para propósitos de información general. La
lista de análisis requeridos se proporciona en este capítulo en la sección Análisis Viral.
Akabane-Virus transmitido por insectos que ocasiona anormalidades congénitas del sistema nervioso central de animales
rumiantes. La enfermedad debida al virus de Akabane ha sido reconocida en Australia, Israel, Japón y Corea. Se han encontrado
anticuerpos contra este virus en varios países en el Sureste Asiático, el Medio Oriente y África. La enfermedad afecta a los fetos
de ganado bovino, ovejas y cabras. Se ha demostrado serológicamente la infección asintomática en caballos, búfalos y vena-
dos (aunque no en humanos ni cerdos) en áreas endémicas.
Lengua Azul-Enfermedad viral infecciosa no contagiosa transmitida por artrópodos que afecta principalmente a animales
rumiantes domésticos y salvajes. La infección por el virus de la lengua azul es común a nivel mundial pero por lo general es
subclínica o moderada. El virus de la lengua azul corresponde a la especie tipo del género Orbivirus de la familia Reoviridae. Se
han identificado 24 serotipos a nivel mundial, aunque no todos los serotipos existen en una sola área geográfica: p.ej., se han
reportado únicamente 5 serotipos (2, 1O, 11, 1 3 y 17) en los EE.UU. La distribución a nivel mundial es análoga a la distribución
espacial y temporal de las especies vector de los jejenes Culicoides, que representan el único transmisor natural significativo del
virus.
Adenovirus bovino-Se relaciona con un amplio espectro de enfermedades. El adenovirus bovino tipo 3 es el serotipo más
comúnmente asociado con la enfermedad respiratoria bovina. Los adenovirus bovinos son virus de ADN que se han separado
en dos géneros: el Mastadenovirus o adenovirus mamífero y el Aviadenovirus o adenovirus aviar. El género Mastadenovirus com-
prende numerosos serotipos específicos de especie, de los cuales se han identificado nueve en el ganado bovino. También se
han podido aislar adenovirus epiteliotrópicos de animales rumiantes que por lo general son clínicamente inaparentes. La enfer-
medad clínica está dictada por varios factores que incluyen la cepa del virus, la infección concurrente, el estrés, las condiciones
ambientales y las prácticas de manejo.
Virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1)-Se relaciona con diversas enfermedades en el ganado bovino entre las que se
incluyen la rinotraqueitis infecciosa bovina, vulvovaginitis pustular infecciosa, balanopostitis, conjuntivitis, aborto, encefalomie-
litis y mastitis. Las infecciones por VHB-1 están muy extendidas en la población de ganado bovino. La forma respiratoria es la
más común en el ganado bovino de engorde a corral.
Leucemia bovina-Oncovirus exógeno tipo C de la familia Retroviridae. La leucemia bovina es una enfermedad viral del
ganado bovino adulto que se caracteriza por la neoplasia de linfocitos y nodos linfáticos. La infección ocurre por la transferen-
cia iatrogénica de linfocitos infectados seguida por una respuesta de anticuerpos permanente. Aunque la prevalencia de la in-
fección en una manada puede ser elevada, sólo unos pocos animales desarrollan linfosarcoma fatal. La infección se propaga
por el contacto con la sangre contaminada de un animal infectado.
Reovirus bovino-Virus de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) con viriones esféricos sin envoltura de 60-80 nm
de diámetro, los cuales ocasionan enfermedades respiratorias bovinas.
Virus respiratorio sincicial bovino (VRSB)-Virus de ARN clasificado como pneumovirus de la familia Paramixovirus. El
nombre del virus se deriva de su efecto citopático característico: la formación de células sinciciales. Además del ganado bovi-
no, las ovejas y cabras también pueden resultar infectadas por virus respiratorios sinciciales. El virus respiratorio sincicial huma-
no (VRSH) es un patógeno respiratorio importante en infantes y niños pequeños. El VRSH comprende subtipos antigénicos y la
evidencia preliminar sugiere la existencia de subtipos antigénicos de VRSB. El VRSB está distribuido por todo el mundo y es
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 673

autóctono de la población de ganado bovino. Las infecciones por VRSB relacionadas con enfermedades respiratorias ocurren
predominantemente en ganado bovino joven para producción de carne y leche.
Rotavirus bovino-Virión esférico de ARNdc de 60-80 nm de diámetro que carece de envoltura. Es la causa viral más co-
mún de diarrea en terneros y corderos.
Virus de la diarrea viral bovina (VDVB)-Virus de ARN clasificado como Pestivirus de la familia Flaviviridae. El BDVB puede
atravesar la placenta y parece ser es capaz de inducir la inmunosupresión, lo que permite el desarrollo de neumonía bacteriana
secundaria. Se ha informado que el VDVB es el virus asociado con mayor frecuencia con múltiples infecciones virales del tracto
respiratorio en terneros.
Fiebre aftosa (FA)-Enfermedad viral altamente infecciosa del ganado bovino, cerdos, ovejas, cabras, búfalos y especies de
artiodáctilos silvestres. En una población susceptible, la morbilidad se acerca al 100%. La enfermedad sólo es fatal en raras oca-
siones, excepto en animales jóvenes. La FA es ocasionada por un Aftovirus de la familia Picornaviridae. Se conocen siete seroti-
pos inmunológicamente distintos y dentro de cada serotipo existe un gran número de cepas que presentan un espectro de
características antigénicas.
Virus de la parainfluenza tipo 3 (Pl-3)-Virus de ARN clasificado en la familia Paramixovirus. Aunque el Pl-3 es capaz de
ocasionar enfermedad, el virus por lo general se asocia con infecciones moderadas a subclínicas. El papel más importante del
Pl-3 es actuar como un iniciador que puede llevar al desarrollo de neumonía bacteriana secundaria. Las infecciones ocasiona-
das por Pl-3 son comunes en el ganado bovino.
Parvovirus-Virus de ADN de cadena simple relativamente estable al calor de aproximadamente 20 nm de diámetro que se
ha aislado del ganado bovino pero que en condiciones naturales se desconoce si ocasiona enfermedades.
Rabia-Encefalomielitis viral aguda que afecta principalmente a carnívoros y murciélagos, aunque puede afectar a cualquier
mamífero. La rabia es ocasionada por Lisavirus de la familia Rabdovirus. Aunque generalmente están confinados a una especie
principal de reserva en un área geográfica, es común la extensión a otras especies.
Peste bovina-Morbillivirus estrechamente relacionado con los virus que ocasionan moquillo canino y sarampión. Las cepas
pueden variar en gran medida en cuanto a la gama de huéspedes y virulencia. El suero de ganado recuperado o vacunado
provoca una reacción cruzada con todas las cepas en las pruebas de neutralización, aunque se han demostrado diferencias
antigénicas menores. El virus es frágil y se inactiva rápidamente con calor y luz, pero permanece viable durante largos periodos
en tejidos enfriados o congelados. La peste bovina es endémica en muchos países de Asia y África. Históricamente, el virus se
ha distribuido en gran medida en Europa y África, pero a la fecha no se ha establecido por sí mismo en Norteamérica, Centroa-
mérica, las Islas del Caribe, Sudamérica, Australia ni Nueva Zelanda. La peste bovina se incluye en la lista de enfermedades
transmisibles de la Organización Mundial de Sanidad Animal (Oficina Internacional de Epizootias) de la OMS que tienen un
potencial de propagación muy rápida y seria, sin distinción de fronteras nacionales, que representan serias consecuencias so-
cioeconómicas o de salud pública, y que son de alta importancia en el mercado internacional de ganado y productos ganade-
ros.

(1027) CITOMETRÍA DE FLUJO

INTRODUCCIÓN
La citometría de flujo es un método analítico que desempeña un papel crítico en la evaluación cuantitativa y cualitativa de
poblaciones de células en muestras de pacientes y de productos celulares. La capacidad de la citometría de flujo se basa en su
aptitud para analizar de manera rápida y confiable múltiples atributos de células individuales dentro de poblaciones de células
heterogéneas. A pesar del valor de los datos obtenidos mediante citometría de flujo, validar el método presenta desafíos-qui-
zás más que para otros métodos analíticos-debido a los errores y artefactos derivados de múltiples fuentes.
Aunque los métodos de la citometría de flujo también se pueden usar para clasificar y aislar células como parte del proceso
de fabricación para productos biológicos derivados de células y tejidos, el alcance de este capítulo se limita al uso de la citome-
tría de flujo como método analítico. Este capítulo presenta los aspectos técnicos del método, incluyendo el instrumental, el
manejo y la tinción de muestras y el análisis de datos. Las fuentes de error se consideran en el contexto de las características
técnicas, y en consideraciones de control de calidad, garantía de calidad y normalización. Por último, se presentan las aplica-
ciones actuales y principios de resolución de problemas del ensayo. Para información adicional sobre los fundamentos y aspec-
tos prácticos de la citometría de flujo, ver la edición vigente de Practica/ Flow Cytometry (Citometría de Flujo Práctica) (Shapiro,
2003).
La citometría de flujo se usa ampliamente en la caracterización de productos derivados de células y tejidos, aunque la mayo-
ría de los métodos de ensayo aún no han sido normalizados. Además de los aspectos relacionados con la complejidad técnica,
se presentan desafíos para la normalización de los métodos de citometría de flujo para clases o tipos específicos de productos
en relación con la naturaleza heterogénea de los mismos, incluso para aquellos con procesos de fabricación y usos clínicos si-
milares. Es posible que las innovaciones vigentes y futuras relacionadas con los instrumentos, los reactivos analíticos, los algo-
ritmos analíticos y la automatización, mejoren las capacidades de la tecnología, pero es poco probable que eliminen los desa-
fíos (p.ej., valoración biológica, pruebas de identificación y otras aplicaciones).
674 (1027) Citometría de Flujo/ Información General USP 37

PRINCIPIOS DE OPERACIÓN, MÉTODOS, CALIDAD Y NORMALIZACIÓN

El proceso de citometría de flujo requiere que las células pasen por una fuente de luz fija que consiste en uno o más láseres,
de manera que cada célula, individualmente, se pueda observar o se puedan analizar sus características tales como tamaño,
granularidad y presencia de antígenos o moléculas intracelulares o en la superficie de la membrana. Las células se suspenden
en un líquido en el que el movimiento se controla mediante el tamaño y la configuración de las conexiones de tubos, cámaras
y bombas específicas del instrumento de citometría de flujo. El patrón de las señales de luz producido a partir de la interacción
de la luz láser con las células se captura mediante un sistema de detección, también específico del instrumento, y las señales
detectadas se transforman en datos que se pueden analizar y combinar con datos de otras células en una muestra dada. Los
datos de una suspensión de células se pueden expresar posteriormente en formatos visuales uni, bi o tridimensionales, o en
formatos numéricos, para caracterizar la muestra celular y sus subpoblaciones de manera cuantitativa y cualitativa.

Instrumental de Citometría de Flujo

A continuación se describen los citómetros de flujo, los cuales incorporan elementos para el procesamiento de señales ópti-
cas, electrónicas y de fluidos.

FLUIDOS

El sistema de fluidos mueve una mezcla a granel de células de manera que se forme una corriente de células individuales.
Dentro del citómetro de flujo, la suspensión de células individuales pasa a través de una región confinada en la que cada célula
es iluminada secuencialmente por una fuente de luz uniforme en el punto de observación (punto de análisis). La mayoría de
los instrumentos emplean una cámara de flujo (celda de flujo) la cual, después de que la muestra de células se introduce en la
punta de inyección de muestra, combina las células con fluido envolvente isotónico, usando un ensamble de boquilla cónica
diseñado geométricamente para producir un flujo laminar de fluido (Figura 7). La boquilla de salida de líquido por lo general
tiene un orificio de 50-250 ~im de diámetro, a través del cual sale el fluido a una alta velocidad de flujo. Las presiones diferen-
ciales entre la corriente de la muestra de células (presión más baja) y la corriente envolvente (presión más alta) trasladan las
células/partículas en una corriente confinada. La corriente coaxial resultante dentro de una corriente es altamente eficiente y la
corriente de la muestra en el punto de observación es, por lo general, ligeramente más grande que las células o partículas
contenidas en el interior. Un fabricante emplea, por lo menos, una metodología alternativa en la que la estrategia de corriente
coaxial se reemplaza mediante el uso de microcapilares para enfocar y dirigir las células. Posteriormente, se mide y analiza la
señal de luz desviada o emitida por la célula.

Flu10 Larninar

p----- Salida de Flujo

Figura 1. Diagrama esquemático de una celda de flujo.

ÓPTICA

Cuando las células se tiñen con colorantes fluorescentes o con reactivos con anticuerpos fluorescentes, la luz emitida por el
láser interacciona con el colorante fluorescente para producir una emisión estimulada que presenta ondas coherentes (parale-
las) de luz de longitud de onda, de fase y de polarización uniformes. Las señales de luz fluorescente generadas en la interac-
ción de la luz láser con las células se recolecta mediante un arreglo de detectores orientados en línea directa y a 90º con res-
pecto al rayo láser que ingresa. Los láseres para citómetros de flujo más comunes disponibles comercialmente (con longitudes
de onda correspondientes) son el láser de argón azul (488 nm), el láser de diodos rojos (635 nm) y el láser violeta (405 nm).
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 675

PROCESAMIENTO DE SEÑALES ELECTRÓNICAS Y GENERACIÓN DE DATOS

Cuando una célula pasa a través del sistema óptico de un citómetro de flujo, los patrones de dispersión de luz o fluorescen-
cia de cualquier fluorocromo sobre la célula o dentro de la misma son detectados por varios tipos de fotodetectores o tubos
fotomultiplicadores (PMT, por sus siglas en inglés) que transforman la información sobre las características de la célula en una
lectura computarizada. Cada célula analizada genera un evento en cada parámetro (dispersión frontal, dispersión lateral, fluo-
rescencia) para el cual se mide. La Figura 2 presenta un ejemplo de una configuración típica de un citómetro de flujo de dos
colores. Los diferentes tipos de células presentan conjuntos distintivos de señales en los diversos parámetros. Por ejemplo,
cuando la célula pasa a través de un haz de luz, a la luz deflectada en dirección frontal (por lo regular aproximadamente 20º
de la dirección frontal del láser) se denomina dispersión frontal y se recolecta usando un detector conocido como canal de
dispersión frontal (FSC, por sus siglas en inglés). La cantidad de deflexión en el FSC es proporcional al tamaño de la célula. La
luz deflectada a un ángulo de 90º se conoce como dispersión lateral y se recolecta mediante el canal de dispersión lateral (SSC,
por sus siglas en inglés). Este proporciona una medida de la complejidad estructural de la célula provocada por gránulos, rugo-
sidad de la membrana o núcleo, los cuales se asocian con un SSC más alto. La luz deflectada por otros PMT usando un filtro de
paso de banda específico se recolecta mediante canales de fluorescencia específicos (FL 1 y FL2 en la Figura 2). Los pulsos eléc-
tricos, que se originan de la luz detectada por los PMT, se procesan mediante una serie de amplificadores lineales y logarítmi-
cos. La amplificación logarítmica a menudo se usa para medir la fluorescencia de las células. Las Figuras 3-7 presentan histo-
gramas para células teñidas con anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos (ver la Tabla 7). Los anticuerpos son es-
pecíficos para algunos marcadores de grupos de diferenciación (CD, por sus siglas en inglés) analizados en lnmunofenotipifica-
ción (ver más adelante).

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El) T
1
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Rayo Láser () (
1
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Celd;·de Flujo
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Detector del FSC

Figura 2. Citómetro de flujo típico de 2 colores con detectores para FSC, SCC y fluorescencia.
Tabla 1. Fluorocromos Usados Comúnmente en Citometría de Flujo
Excitación
Típica Pico de
Fluorocromo del Láser (nm) Emisión (nm)
Azul Cascada 375; 401 423
Azul Pacífico 403 455
Ficoeritrina-R (R-PE, por sus siglas en inglés) 480; 565 578
--
Conjugados PE-Cy5 480; 565; 650 670
Conjugados PE-Cy7 480; 565; 743 767
Rojo 613 (Rojo Texas) 480; 565 613
Clorofil Peridina (PerCP, por sus siglas en inglés) 490 675
Fluoresceína (FITC) 495 519
Aloficocianina (APC) 650 660
Conjugados APC-Cy7 650; 755 767

La versatilidad de la citometría de flujo proviene de la capacidad de marcar con fluorescencia la superficie celular, el citoplas-
ma o el núcleo o productos de la célula. Los marcadores fluorescentes unidos a la célula se pueden excitar usando láseres para
emitir luz con longitudes de onda específicas y, posteriormente, esta luz se detecta y analiza de la manera descrita con anterio-
ridad. El tipo y la cantidad de fluorescencia detectada ofrece información cualitativa y cuantitativa sobre la célula.
Los fotodetectores convierten la luz en resultados analizables generando una pequeña corriente cuyo voltaje tiene una am-
plitud proporcional a la cantidad de luz. El voltaje se amplifica y convierte en señales eléctricas lo suficientemente grandes para
ser graficadas por la computadora de distintas maneras. De esta forma, el FSC, el SSC y los detectores fluorescentes recolectan
676 (1027) Citometría de Flujo / Información General USP 37

la luz y la convierten en señales eléctricas que pueden ser analizadas por la computadora. De esta manera, las señales deriva-
das de cada fotodetector se pueden medir por su intensidad (baja a alta) y clasificarse en canales. Los canales se disponen de
manera continua de tal forma que una población de células con muchas células grandes tendrán una gran cantidad de even-
tos en los canales más altos, y una con muchas células pequeñas tendrá una gran cantidad de evento en los canales más bajos.

ANÁLISIS DE DATOS

Los datos generados por el citómetro de flujo pueden representarse de diversas maneras, de las cuales la más básica es el
histograma de un sólo parámetro (Figura 3), en el que los eventos con intensidades de luz similares (dispersión frontal, disper-
sión lateral o fluorescencia) se recolectan en canales y posteriormente se grafican. Esta gráfica demuestra el número de células
con características ópticas similares. La Figura 4 es un ejemplo de gráficas que presentan dos parámetros de medición, una en
el eje x y una en el eje y, y el recuento de células como una gráfica de densidad (puntos) o mapa acotado. Los parámetros
podrían ser el SSC, el FSC o la fluorescencia. Estos parámetros se pueden recolectar en un canal.
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o - - ---------- ----- ------- ----------------------------------- ------1
o
c:o

Positivo
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e:
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Figura 3. Histograma de un sólo parámetro que presenta la expresión del antígeno celular CD3 en una mezcla de células.

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o
o
C'J
1

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--, _----------------~-----¡
400 600 800 1000
Altura del FSC
Figura 4. Gráfica de puntos de dos variables de células presentadas por el FSC y el SSC.
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 677

Una gráfica de puntos presenta un punto para cada célula, mientras que las gráficas de densidad y acotadas presentan un
mapa de calor o un mapa topográfico lineal, respectivamente, basándose en el número relativo de células en cada canal. El
histograma de dispersión frontal y dispersión lateral es el método más común para la identificación de diferentes tipos de célu-
las hematopoyéticas. La Figura 5 presenta una gráfica acotada que es una representación tridimensional del número relativo de
células en los diversos canales.

o...-N
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o,.....

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o ~----'
o
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CDS
Figura 5. Gráfica acotada de dos variables que presenta números relativos de células presentes en cada canal que coexpresa
2 marcadores CD.

Cuando las células se tiñen con anticuerpos para epitopes diferentes que portan dos fluorocromos diferentes, los datos se
presentan como una gráfica en la que los dos parámetros se grafican uno en función del otro. Se pueden establecer cursores
en cada eje para separar poblaciones positivas de poblaciones negativas para cada uno de los atributos. Esto resulta en una
representación gráfica de células que son positivas para ambos marcadores, negativas para ambos marcadores y positivas para
uno de los dos marcadores (Figura 6).

..,..
Población Positiva..----......- - - - - - - - - Población Positiva
para 1 Marcador 2 Marcadores

'
,'
Población Negativa

Población Positiva
para 1 Marcador

Figura 6. Presentación esquemática de un histograma de 2 parámetros.

El citómetro de flujo permite al usuario establecer límites positivos y negativos para cada marcador. Los datos del citómetro
de flujo se recolectan en forma de lista, en la que cada señal electrónica de una célula respectiva se presenta en la secuencia en
la que se adquirió. Los archivos en modo de lista se pueden editar posteriormente para incluir o excluir algún evento. Una
678 (1027) Citometría de Flujo / Información General USP 37

ventaja básica de la citometría de flujo es la capacidad para separar los datos correspondientes a las células de interés del fon-
do y células muertas (p.ej., partículas o desechos no celulares) cuando se trata de dispersiones frontales y laterales y células de
otras poblaciones. El usuario debe decidir que señales son precisamente resultantes de la luz relacionada con las células, dise-
ñar ventanas electrónicas y ordenar a la computadora que considere positivos únicamente los eventos que caigan dentro de
dicha ventana. Las poblaciones celulares pueden variar ampliamente dependiendo de la fuente de tejido o de células y las ca-
racterísticas del citómetro de flujo usado. El uso de ventanas permite al usuario determinar las señales que se deben considerar
eventos reales, por lo que este proceso es de primordial importancia para normalizar los datos de la citometría de flujo (Figura
1).
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º1
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j

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Lin
Figura 7. Generación de ventanas para una población celular con dispersión lateral baja y dispersión frontal alta, la cual es
diferente de otras poblaciones celulares en la muestra.
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 679

Se puede usar una técnica conocida como compensación para separar superposiciones espectrales de fluorocromos con lon-
gitudes de onda similares. Para citómetros de flujo análogos fabricados antes del final de la década de 1990, la compensación
debe establecerse antes de la adquisición de datos. En los instrumentos digitales modernos, la compensación se puede estable-
cer ya sea antes o después de la adquisición de datos. El ajuste de compensación puede ser más un arte que una ciencia, mien-
tras que una gran parte de la literatura se ha enfocado en los méritos relativos de diversos métodos para determinar la com-
pensación correcta para tipos celulares o condiciones experimentales. El analista debe contar con conocimientos considerables
acerca del tipo celular en análisis a fin de evitar errores en la fenotipificación que puedan resultar del ajuste inadecuado de
compensación.
El número de eventos contados debe ser adecuado para generar confianza estadística en los resultados. El instrumento se
puede ajustar de manera que la recolección de datos se lleve a cabo hasta que se haya medido cierto número de eventos en
un canal. Esta característica permite al operador variar la duración o el número de eventos de la muestra de modo tal que se
generen datos estadísticamente confiables. De esta manera, una muestra que mide un evento poco común analizará más célu-
las totales que una muestra que mide un evento común. El uso de archivos en forma de lista, los archivos de datos electrónicos
que representan a la mayoría de los datos no censurados, ofrece una ventaja debido a que estos archivos se pueden analizar
después de la adquisición de datos. Es necesario que los investigadores aseguren que todos los datos sin procesar, la documen-
tación, los protocolos, las muestras y los informes finales se archiven cuando concluye el estudio. Para asegurar la integridad y
calidad de los datos brutos recopilados, es necesario que los investigadores se apeguen a las Regulations far Good Laboratory
Practices (Reglamentaciones para Buenas Prácticas de Laboratorio o GLP) de la FDA de los EE.UU., conforme a lo prescrito en el
Título 21 del CFR Parte 58, Good Laboratory Practice far Nonclinical Laboratory Studies (Buenas Prácticas de Laboratorio para
Estudios de Laboratorio No Clínicos); y Parte 11, Electronic Records and Electronic Signatures (Registros y Firmas Electrónicos).

Citometría de Flujo: Elementos de un Procedimiento

Los métodos de citometría de flujo incluyen la manipulación, la preparación y la tinción de la muestra; configuración y ope-
ración del instrumento; recopilación, análisis y almacenamiento de datos; y medidas de control de calidad asociadas.

MANIPULACIÓN Y TINCIÓN DE LAS MUESTRAS

Recolección, Manipulación y Anticoagulación de las Muestras

Con el objetivo de generar conclusiones exactas sobre el producto farmacéutico derivado de células, el analista debe asegu-
rar que las muestras de productos celulares sean lo más representativas del producto completo. Las muestras de sangre, afére-
sis y productos de suspensión celular se deben mezclar bien antes del muestreo y se debe tener cuidado de obtener volúmenes
de muestra adecuados.
Las muestras celulares que contienen sangre/plasma humano deben someterse a un proceso de anticoagulación. La hepari-
na o los anticoagulantes basados en citrato (p.ej., Solución Anticoagulante A de Citrato Dextrosa) se recomiendan más que el
EDTA, ya que conservan de manera óptima las muestras que se deben manterner por más de unas pocas horas. En lo que
respecta a muestras que deben mantenerse por plazos más largos, pueden ser necesarios medios específicos de transporte/
almacenamiento, y se deben realizar estudios de validación para asegurar que dichas muestras sean equivalentes a las muestras
preparadas en el momento de ser analizadas por citometría de flujo.
Las muestras destinadas a lisis de sangre entera y tinción de antígenos de superficie se deben transportar y almacenar, de
preferencia, en un mezclador de oscilación lenta a temperatura ambiente. Las muestras fijadas o las preparaciones de células
vivas se deben almacenar a 4º. Cuando existe la posibilidad de que la muestra sea expuesta a temperaturas extremas, pueden
ser necesarios materiales con control de temperatura (empaques para temperatura ambiente, empaques fríos y aislamiento) y
se deben llevar a cabo estudios de validación para garantizar la integridad de la muestra. Para muestras críticas o de alto valor,
pueden ser necesarios dispositivos de monitoreo de temperatura durante el transporte.
Una vez obtenidas las muestras, se deben analizar lo más pronto posible. Resulta necesario prestar atención especial a aque-
llas situaciones en las que la proliferación celular y la depleción metabólica de fuentes de energía dentro del medio de trans-
porte/almacenamiento puedan generar apoptosis. Cuando no se requiere un recuento exacto o cuando se sospecha la presen-
cia de agentes infecciosos, se puede usar una solución comercial para lisado/fijación para aumentar el tiempo de almacena-
miento y reducir el riesgo de transmisión de enfermedades. Para muestras separadas mediante centrifugación en gradiente de
densidad, se recomienda el almacenamiento en una solución de paraformaldehído amortiguado (0, 1% a 2,0%) después de
que ha ocurrido el marcado de las células.
Procesamiento, Tinción y Fijación de las Muestras
Los reactivos usados en el procesamiento, tinción y fijación de las muestras deben calificarse para su uso previsto. El docu-
mento Q6B de la ICH, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criterio for Biotechnological/Biological Products (Especifica-
ciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para Productos Biotecnológicos/Biológicos), proporciona pautas
adicionales. Cuando se emplean kits de reactivos, se deben seguir las instrucciones del fabricante para el procesamiento de las
muestras.
El procesamiento de las muestras que requiere centrifugación, lavado, eliminación o lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en
inglés), o separación en gradiente de densidad, por lo general se usa en muchas de las aplicaciones de la citometría de flujo,
pero puede introducir errores y artefactos. Se encuentran disponibles diversas técnicas y reactivos para la eliminación y lisis de
680 (1027) Citometría de Flujo/ Información General USP 37

RBC. Para una calidad óptima, se recomiendan los reactivos de grado clínico [diagnósticos in vitro (IVD, por sus siglas en in-
glés) o específicos para analitos (ASR, por sus siglas en inglés)], aunque aún pueden presentarse artefactos. La centrifugación
en gradiente de densidad puede introducir errores relacionados con pérdidas de células variables entre las subpoblaciones que
se están midiendo. Estas fuentes de error y artefactos se pueden evitar analizando la sangre entera viva siempre que sea posi-
ble.
La mayoría de las instrucciones para el lisado de la sangre entera recomiendan la tinción a temperatura ambiente y en la
oscuridad. Muchos métodos incluyen una solución fijadora diluida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internaliza-
ción de fluorocromo. Por el contrario, las preparaciones de células (preparaciones de células en gradiente de densidad, mues-
tras por aféresis, cultivo de tejidos) se deben teñir a 4º, lavarse con solución amortiguadora fría y almacenarse en frío hasta el
momento del análisis.
La fijación que también conserva los antígenos de la superficie celular se puede conseguir mediante conservantes de leucoci-
tos comerciales o con formaldehído o paraformaldehído amortiguados. Existe muy poca información sobre la validación de los
tiempos de almacenamiento, unión de anticuerpos o intensidad de fluorocromo. Cualquier laboratorio que considere el análi-
sis de partidas de muestras fijas debe validar estas técnicas de manera cabal antes de implementarlas.

USO Y SELECCIÓN DE FLUOROCROMOS

Fluorocromos
Los fluorocromos se usan para la tinción directa de células o como agentes unidos a anticuerpos u otros reactivos para teñir
antígenos celulares u otras estructuras. La Tabla 7 cita ejemplos de fluorocromos comunes usados en citometría de flujo y sus
longitudes de onda de excitación y emisión. Las longitudes de onda (nm) pueden variar ligeramente, dependiendo del entor-
no. También se encuentran disponibles sondas sintéticas de fabricantes específicos. 1 Los fluorocromos deben coincidir con el
intervalo espectral para los conjuntos de láseres y filtros específicos del citómetro de flujo del usuario.
Al momento de seleccionar fluorocromos para fenotipificación multicolor, el operador debe referirse a los métodos estableci-
dos para el instrumento en particular. En general, los fluorocromos más brillantes se deben usar para detectar antígenos de los
que se espera presenten una baja expresión en la superficie de la célula. El brillo de los colorantes en tándem también se pue-
de reducir usando diversos fijadores, algunos de los cuales son menos problemáticos que otros. Cuando se diseña un procedi-
miento de flujo y de coloración en tándem multicolor que no ha sido previamente validado, el operador debe consultar con el
servicio técnico del fabricante, comparar las combinaciones de fijador y colorante en tándem y validar la combinación de fluo-
rocromo final para asegurar la uniformidad de muestra a muestra.
Los colorantes fluorescentes en tándem son moléculas fluorescentes conjugadas duales. Cuando las dos marcas están muy
cerca una de otra, la energía producida por el láser que excita al fluorocromo dador se transfiere al fluorocromo receptor, libe-
rando un fotón a la longitud de onda de emisión del flúor receptor (también conocido como transferencia de energía de reso-
nancia de fluorescencia o FRET, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, el PECy5 se excitará a la longitud de onda de excitación
para PE (565 nm), transferirá energía a Cy5 y emitirá a la longitud de onda de emisión para Cy5 (670 nm).
Anticuerpos Marcados con Fluorescencia
La mayoría de los anticuerpos disponibles comercialmente son monoclonales, pero puede haber disponibles reactivos poli-
clonales, recomendados, para algunas aplicaciones. La calidad y especificidad de un anticuerpo puede variar ampliamente. Los
anticuerpos dirigidos a un antígeno dado pueden diferir en su especificidad de unión para diferentes epitopes de antígenos o
en la fuerza de unión al mismo epitope. De ser posible, emplear combinaciones de fluorocromo-anticuerpo conjugadas de
grado IVD o ASR. La optimización de la concentración de los anticuerpos para la población de células deseada es específica del
protocolo pero por lo general se consigue usando concentraciones de anticuerpos en aumento con un número fijo de células
para establecer el brillo óptimo entre la autofluorescencia y la extinción. La extinción es provocada por el fenómeno de prozo-
na, que se presenta cuando un exceso de anticuerpos genera la inmunoprecipitación y pérdida de intensidad de la fluorescen-
cia. Los manuales de métodos tales como Current Protocols in lmmunology (Protocolos Actuales de Inmunología (Coligan et al.
1994), presentan detalles adicionales.
Tinción del Antígeno de la Superficie de la Célula
Las técnicas de tinción del antígeno de la superficie varían dependiendo del tipo de muestra. Las técnicas de lisis de sangre
entera por lo general requieren el marcado de la superficie a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15-30 minutos,
seguido por lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en inglés) y, si se desea, fijación. Las técnicas publicadas utilizan cloruro de
amonio (NH 4 CI) para producir la lisis de sangre entera o muestras de médula seguido por el lavado y posterior marcado de
anticuerpos para inmunofenotipificación de leucemia. Las muestras de células mononucleares o de cultivo que se tiñen vivas
deben conservarse a 4º o en una solución amortiguadora con azida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internaliza-
ción de anticuerpos.
Tinción Intracelular
Existen también diversos procedimientos normalizados para el marcado de antígenos intracelulares y citoquinas. El operador
debe consultar el protocolo del fabricante y los reactivos estandarizados para estos procedimientos. Debido a que los reactivos
permeabilizantes varían entre procedimientos y fabricantes, no se deben mezclar ni homologar reactivos. Para el marcado de
citoquinas, a menudo se requiere de una etapa de activación y un bloqueo del Golgi para permitir que se acumule una canti-

1 La serie AlexaFluor (Sondas lnVitrogen/Moleculares) o la serie Cy (GE Healthcare).

USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 681

dad suficiente de citoquina para su detección. Si no se dispone de reactivos o procedimientos estandarizados por parte del
fabricante o si se requiere el análisis de funciones especializadas, existe un gran número de procedimientos y técnicas habitua-
les en fuentes tales como Current Protocols in lmmunology (Protocolos Actuales de Inmunología) (Coligan et al., 1994).
Cuantificación de Antígenos
Algunas aplicaciones requieren cuantificar el número promedio y la densidad de moléculas de antígenos por célula para pro-
veer una imagen más completa del comportamiento inmunológico de las células (p.ej. en estudios en los que los antígenos
extracelulares se expresan de forma diferencial en relación con el estímulo de activación). La intensidad de una preparación de
células con anticuerpos marcados con fluorocromos se compara con la intensidad de un conjunto de estándares de microper-
las de fluorescencia recolectados a la misma configuración de voltaje del PMT. Los estándares se calibran en unidades de molé-
culas de fluorescencia soluble (MESF, por sus siglas en inglés), de las que se puede determinar la relación efectiva entre la fluo-
rescencia y el anticuerpo (F/P), el número de moléculas de antígeno por célula y la densidad de los sitios disponibles por célu-
la.

CONFIGURACIÓN Y OPERACIÓN DEL INSTRUMENTO

Compensación
La mayoría de de los fabricantes de instrumentos ofrecen software y reactivos de prueba (por lo regular perlas fluorescentes)
para configurar los PMT y la compensación a fin de captar valores hallados con las pruebas clínicas más comunes (p.ej., fenoti-
pificación de linfocitos, análisis de CD34). Asimismo, el operador debe emplear un control biológico tal como sangre conserva-
da o células mononucleares.• las cuales se encuentran disponibles comercialmente. La compensación se debe establecer antes
de adquirir datos en instrumentos análogos. Los PMT de los instrumentos digitales deben instalarse de manera correcta puesto
que los valores para estas configuraciones no podrán cambiarse una vez que haya sido generado el archivo en forma de lista.
Cuando se examinan eventos poco comunes y/o se usan colorantes intracelulares (p.ej., 7-amino actinomicina D [7-AAD], yo-
duro de propidio [PI, por sus siglas en inglés], Syto-16, entre otros.) en conjunto con anticuerpos marcados por fluorescencia,
el balance de voltaje de los PMT y la superposición espectral debe monitorearse muy de cerca.
La autofluorescencia (AF) es fluorescencia por encima de la línea base en ausencia de tinción con fluorocromo. Lo anterior se
presenta en algunas células, por lo regular en células mieloides (especialmente macrófagos alveolares) y en células primarias
cultivadas. Cuando resulte deseable o necesario, la AF puede medirse directamente en un voltaje de PMT fijo o se puede calcu-
lar a partir de un estándar de referencia de preparaciones de perlas fluorescentes (ver la sección Cuantificación de Antígenos
anterior). Evitar el uso de la longitud de onda de excitación a 488 ó 532 nm y la compensación espectral subsiguiente de la AF
como un fluorocromo adicional.
Adquisición de Datos y Estrategias para la Creación de Ventanas
Siempre que sea posible, los eventos deben presentarse en modo de lista, es decir, sin la creación de ventanas selectivas para
eventos. Las Ventanas vivas, definidas como la creación de ventanas selectivas para eventos durante la adquisición, se deben
emplear sólo cuando el subconjunto deseado es lo suficientemente raro, y se deben analizar >2 millones de eventos totales
para contar un número de eventos significativo (100 o mayor) de la población deseada. Los datos en forma de lista se pueden
adquirir sin compensar cuando se emplea instrumental digital, pero la mayoría de los operadores indican que el análisis es mu-
cho menos difícil y más rápido si los datos se encuentran en el intervalo de compensación apropiado antes de su adquisición.
Además, a menudo se recomienda establecer umbrales para exclusión de desechos. Por ejemplo, si se establece un umbral de
dispersión frontal se excluyen eventos por debajo de un tamaño predeterminado a fin de prevenir un archivo en forma de lista
de gran tamaño, que podría formarse si se contaran estos eventos.
Uso de Controles
Las preparaciones de perlas conjugadas con fluorocromo se usan para estandarizar los PMT y la compensación y para cuanti-
ficar la expresión de marcadores específicos. Asimismo, se recomienda ampliamente el uso de controles biológicos. Se deben
teñir las muestras de células con un control de isotipos y anticuerpos primarios y secundarios para evaluar la unión no específi-
ca, a menos que el laboratorio haya determinado mediante procedimientos rigurosos de validación que la unión no específica
no interfiere con los resultados del ensayo.
Las poblaciones de células con antígenos positivos y negativos (preparadas y teñidas de manera idéntica a las de los artículos
de prueba) proporcionan estándares internos de aptitud del sistema. Tales poblaciones de células de control también permiten
al laboratorio evaluar variaciones entre lotes en preparaciones de anticuerpos y reactivos de tinción.
Uso de Colorantes y Ventanas para Viabilidad Celular
Los colorantes para viabilidad celular tales como 7-AAD, PI y yoduro TO-PRO se usan comúnmente para determinar la pro-
porción de células muertas en un producto de terapia celular. Estos colorantes por lo general se excluyen de las células vivas,
pero pasan a través de las membranas celulares de células muertas, tiñendo su ADN. La coloración para viabilidad de las célu-
las se puede combinar con la tinción intracelular o de la membrana de la superficie para evaluar subpoblaciones y la propor-
ción de células vivas y muertas teñidas con un marcador determinado. La tinción para viabilidad también se puede usar en
conjunto con un colorante de membrana en ensayos de citotoxicidad usando citometría de flujo. Estos colorantes para viabili-
dad no deben confundirse con la gran cantidad de reactivos para detección de apoptosis disponibles en la actualidad. Las téc-
nicas de validación para colorantes para viabilidad que no se usan en IVD implican la preparación de una población de células
muertas que se agregan diluidas en serie a un producto de células vivas y, posteriormente se evalúa la fidelidad de la mezcla
de células con respecto a la población conocida tiñendo con el colorante de interés.
682 (1027) Citometría de Flujo/ Información General USP 37

Enumeración de Células
El recuento celular absoluto, expresado como el número de células en un volumen de muestra dado, se puede determinar
por métodos de plataforma doble o simple. El método de plataforma doble se basa en un instrumento de recuento automati-
zado separado o en un método de recuento manual para enumerar primero la población de células. Después, se determina el
porcentaje de subgrupos de interés mediante citometría de flujo, el cual se multiplica por el recuento celular y el resultado se
divide por 1OO. Los métodos de plataforma simple enumeran la población de células y del subgrupo directamente contando
las células de la muestra simultáneamente con perlas de referencia que se han agregado al volumen de muestra en una con-
centración conocida. Las perlas de referencia a menudo se ofrecen como suspensión de perlas que se agrega a la muestra. De
manera alternativa, se puede agregar un volumen dado de muestra a un número conocido de perlas de referencia provistas
como una matriz de fase sólida en tubos de poliestireno. Estas metodologías están sujetas a error de pipeteo, por lo que se
debe tener mucho cuidado para asegurar la exactitud y reproducibilidad.
Configuración del Instrumento y Garantía de Calidad
Cada laboratorio debe tener un plan de calidad que defina los procedimientos operativos estándar para la configuración y
calibración del instrumento, así como el monitoreo, mantenimiento y limpieza regular del instrumento. Los registros del instru-
mento deben documentar estas actividades y a los operadores. En general, se debe seguir el programa del calidad del fabri-
cante para el instrumento a menos que se haya establecido una alternativa adecuada.
Los parámetros del instrumento, como por ejemplo la corriente láser, el voltaje, la respuesta y los voltajes de PMT durante la
calibración, deben ser monitoreados y registrados siempre que se utilice el instrumento. El monitoreo cuidadoso de los pará-
metros de configuración del instrumento puede ser de utilidad para detectar tendencias y predecir fallas en el láser o el PMT.
Asimismo, los resultados de las pruebas de control biológico deben monitorearse y registrarse para detectar y prevenir la deriva
del método analítico.
El laboratorio también debe participar en un programa de análisis de competencia que refleje su menú de pruebas. Depen-
diendo de las necesidades, esto puede variar de un programa formal como el administrado por el College of American Patho-
logists (Colegio de Patólogos Estadounidenses o CAP) a compartir muestras y análisis con otro laboratorio. Asegurar que los
operadores estén capacitados, calificados y que su competencia para realizar procedimientos específicos sea evaluada periódi-
camente ayudará a garantizar la uniformidad de las técnicas y los controles.

GESTIÓN DE DATOS Y CONSIDERACIONES ESTADÍSTICAS

Gestión y Almacenamiento de Datos

Los ensayos de control de calidad y los ensayos de análisis de muestras (en forma de lista) se deben almacenar de tal manera
que se cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables al laboratorio. Lo anterior se puede lograr mediante transferencia a
discos duros, medios extraíbles o a un servidor tal como un sistema de información de laboratorio comercial. El almacenamien-
to de los resultados deberá ser rastreable en todo momento hasta el archivo en forma de lista FCS, la configuración del instru-
mento y los parámetros de control de calidad originales para la muestra en particular. Se debe crear un respaldo de datos para
evitar la pérdida de archivos. Se deben establecer procedimientos de almacenamiento y respaldo para registros manuales (en
papel) que podrán ser usados para cálculos y resumen de datos.
Análisis de Datos y Consideraciones Estadísticas
Para la mayoría de las aplicaciones de citometría de flujo, el análisis de datos implica presentar los datos de los archivos en
forma de lista o de las ventanas en vivo mediante una gráfica (gráfica de histograma de un sólo parámetro, gráfica de puntos
de dos parámetros con regiones o gráfica tridimensional) y medir la distribución de eventos dentro de la gráfica. El análisis
adicional de datos dentro de poblaciones seleccionadas se puede llevar a cabo mediante ventanas para poblaciones de células
específicas. La descripción de los datos por lo regular incluye el porcentaje de eventos dentro de la población con una caracte-
rística dada (dispersión frontal, dispersión lateral, marcador fluorescente). El numerador es el número de eventos que presen-
tan la característica, mientras que el denominador puede ser el número de eventos totales contados o el número de eventos
contados que caen dentro de la ventana. Para gráficas bidimensionales, el análisis a menudo se lleva a cabo usando un softwa-
re informático que analiza e informa estadísticas regionales (p.ej., cuadrante). Debido a que los grupos de poblaciones de célu-
las pueden cambiar de posición en un archivo de datos con respecto al siguiente, se ha desarrollado un software para el análi-
sis de grupos.
El análisis estadístico de las aplicaciones cuantitativas de citometría de flujo difiere de las aplicaciones cualitativas en las que
una célula es considerada positiva o negativa para un marcador dado. Para una aplicación cuantitativa típica en la que se esti-
ma el número de moléculas en la superficie celular, la intensidad de fluorescencia media o mediana de las células de la muestra
marcadas con un anticuerpo fluorescente, unido a la molécula de interés, se puede comparar con controles apropiados, inclu-
yendo curvas estándar de células o partículas con cantidades conocidas de dicha molécula o anticuerpo.
Una consideración práctica común para el análisis por citometría de flujo de productos de terapia celular, en especial los
productos autólogos y alogénicos relacionados con el donante, es que el tamaño de la muestra que se debe analizar a menudo
está restringido debido al contenido limitado de células del producto terapéutico mismo. Esto genera desafíos especiales cuan-
do las células que contienen el marcador de interés se presentan como eventos poco comunes. En tales casos, antes de tomar
una decisión con respecto al tamaño de la muestra, el usuario debe considerar las expectativas de detección de eventos poco
comunes dentro de un número dado de células totales (es decir, la prevalencia, variabilidad, y el error de muestreo) en rela-
ción con la precisión deseada del estimado.
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 683

Calidad y Estandarización

La estandarización del uso de la citometría de flujo y de los equipos requiere de prácticas de validación, garantía de calidad
(QA) y control de calidad (QC). Aunque la citometría de flujo se usa ampliamente tanto en la investigación como en laborato-
rios clínicos, el análisis de células para el desarrollo de aplicaciones de diagnóstico clínico y terapéutico se encuentra en creci-
miento, lo que conlleva a requisitos reglamentarios más amplios y al énfasis en la normalización. Por ejemplo, tradicionalmen-
te, los operadores de citometría de flujo han empleado microesferas fluorescentes (perlas) o celdas para la configuración del
instrumento y el QC, a menudo basándose en las recomendaciones del fabricante. Sin embargo, no ha sido posible convenir
instrucciones uniformes para la aplicación de estos estándares de control a la configuración del instrumento y al QC.
Cuando se aplica de manera apropiada, la validación proporciona evidencia documentada de que el proceso de de fabrica-
ción o análisis genera constantemente productos que cumplen con las especificaciones predeterminadas. Cuando se basa en
una comprensión cabal de los parámetros críticos del proceso, la validación ayuda a definir la calidad del producto y a garanti-
zar procesos de fabricación o análisis bien controlados y uniformes. La validación de métodos por citometría de flujo debe in-
cluir la calificación del instrumental, la validación del método analítico y la calificación del operador.

DOCUMENTACIÓN

Los procesos que cumplen con las BPL y las BPF requieren de documentación adecuada tal como procedimientos operativos
estándar (SOP, por sus siglas en inglés) para todos los procesos del laboratorio. Los SOP deben ser actualizados periódicamen-
te y aprobados para reflejar las prácticas vigentes. La capacitación y la calificación son indispensables para que el personal de
laboratorio tenga el nivel de competencia apropiado para su responsabilidad asignada. Las competencias del operador deben
ser revisadas y evaluadas de manera continua en relación con las SOP y los reglamentos.
La integración de procesos de calidad internos y externos es un elemento importante para la garantía de calidad. Dichos
procesos incluyen la validación del equipo, los controles y límites de fabricación y las especificaciones del producto. Los proce-
sos de validación de procesos y equipo por lo general requieren de calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés), la
calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés).

CALIFICACIÓN DE EQUIPOS Y ENSAYOS

La IQ establece que el instrumento sea recibido con su diseño y especificaciones originales, y que sea instalado adecuada-
mente en un ambiente apropiado. Por lo general, esto significa verificar los requisitos físicos y de la instalación para determinar
si el citómetro de flujo se puede instalar adecuadamente. Los factores de calificación verificados a menudo incluyen la tempe-
ratura, humedad, espacio y capacidades eléctricas de las instalaciones en relación con los requisitos del fabricante para el ins-
trumento. Los procedimientos de IQ también garantizan que todos los componentes de hardware y software se instalen ade-
cuadamente por el representante del fabricante del instrumento.
LA OQ demuestra que un instrumento funcionará de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Esto generalmente se
refiere al análisis de niveles de componentes por parte del representante del fabricante del instrumento o usando los manuales
de validación del fabricante que guía al usuario final para llevar a cabo esta función. Siempre que sea posible, estas pruebas
deben contar con especificaciones con límites de control cuantitativos correspondientes. Este análisis asegura que el hardware
y software del instrumento esté en condiciones de operar comparándolos con las especificaciones del fabricante.
La PQ demuestra que tanto el instrumento como las pruebas tienen un desempeño conforme a las especificaciones. Para
citometría de flujo, estas especificaciones, por lo general, son determinadas por el laboratorio que realiza el análisis por citome-
tría de flujo y a menudo incluyen las especificaciones diarias del instrumento y de las pruebas de control de la valoración. Para
valoraciones específicas, la PQ debe incorporar metodología normalizada, configuración y compensación específica para la
aplicación y especificaciones de linealidad, precisión y exactitud de los resultados informados de la valoración. En algunos citó-
metros de flujo digitales, puede ser necesario configurar la línea base del instrumento a fin de determinar la configuración ópti-
ma del instrumento para una valoración dada.

DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

Las especificaciones de desempeño pueden ser identificadas por el fabricante del citómetro de flujo y posiblemente no abar-
quen todos los requisitos especificados por el operador. Después de identificar las especificaciones del fabricante, el laboratorio
debe establecer especificaciones que sean apropiadas para las configuraciones del hardware que se utilizarán, y se deben nor-
malizar las especificaciones. Por ejemplo, el fabricante puede tener una especificación base para un citómetro de flujo de doble
láser y cuatro colores. Si la especificación base requiere un láser de diodo rojo estándar a 635 nm, pero se sustituye con un
láser de helio-neón enfriado con aire a 633 nm, la especificación base deja de ser válida para el sistema. De manera similar, si
las especificaciones se basan en el uso de un filtro de paso de banda a 660 nm pero se sustituye con un filtro de paso largo a
675 nm, la especificación base deja de ser válida debido a las diferencias en las características del filtro de emisión.
684 (1027) Citometría de Flujo / Información General USP 37

MONITOREO DEL DESEMPEÑO

El desempeño del instrumento debe monitorearse a diario, usando perlas fluorescentes comercialmente disponibles. Los de-
tectores de luz tales como PMT, fotodiodos (PD, por sus siglas en inglés) y fotodiodos en avalancha (APD, por sus siglas en
inglés) se usan en la mayoría de los sistemas para detectar señales y sus ganancias se pueden cambiar para aumentar o dismi-
nuir la sensibilidad de los detectores. Por lo tanto, el monitoreo de las configuraciones de estos detectores es tan importante
como el monitoreo de las señales, y dichas configuraciones deben asociarse con cada archivo de datos sin procesar. La meto-
dología más simple consiste en mantener diariamente la misma configuración del detector del instrumento para medir la in-
tensidad de las señales de fluorescencia. Esta metodología debe implementarse para todos los parámetros que se deben validar
usando las perlas apropiadas. La sensibilidad del instrumento se basa en la capacidad del sistema de detección para resolver la
poblaciones de células o perlas con fluorescencia atenuada. Por esta razón, la medición del coeficiente de variación (CV) de
poblaciones de perlas con fluorescencia atenuada a moderadamente intensa es una forma de monitorear diariamente la sensi-
bilidad de la fluorescencia. Se deben usar las recomendaciones del fabricante del instrumento para monitorear el desempeño.
La temperatura ambiente alta puede afectar el desempeño del láser y del PMT y también debe monitorearse a diario.
La compensación incorrecta para la superposición espectral puede afectar en gran medida a los datos durante el análisis
multicolor. Se han establecido muchas metodologías para este propósito y se han usado algoritmos matemáticos recientes en
lugar del circuito análogo. Los algoritmos, tales como aquéllos que emplean álgebra de matrices, permiten al operador o a los
investigadores aplicar criterios objetivos para compensar la superposición espectral después de haber recopilado todos los da-
tos. En sistemas más antiguos, la metodología estándar ha consistido en compensar usando un ajuste de hardware de sustrac-
ción para los datos preliminares observados, antes de que se hayan recopilado todos los datos. Esta metodología puede ser
subjetiva y puede no generar resultados exactos como la compensación por métodos más novedosos. Las perlas de captura
unidas a anticuerpos son herramientas valiosas de compensación debido a que se pueden usar con los mismos colorantes de
anticuerpos y en tándem para todos los fluoróforos que se usarán en las células. Se debe validar el uso de perlas en lugar de
celdas para propósitos de compensación.

ESTÁNDARES

Los estándares de fluorescencia basados en microesferas para citometría de flujo han sido categorizados en base a su propó-
sito:
• Los estándares Tipo 1 son estándares de alineación que se usan para realizar ajustes en la alineación óptica del instrumen-
to. Estos son usados generalmente por los ingenieros de servicio del campo y por los usuarios de sistemas ajustados por el
operador para verificar la alineación de la señal óptica a fin de mejorar la sensibilidad del instrumento. Por lo regular, estas
partículas son pequeñas ("' 2 µm) y brillantes y proporcionan la iluminación más uniforme.
• Los estándares Tipo 11 son perlas de referencia y son los estándares de perlas más comúnmente usados. Estos estándares
por lo general se usan a diario, tienen una intensidad de fluorescencia tenue a moderada y pueden obtenerse con varios
fluoróforos insertados. Asimismo, se pueden usar para imitar células y, usando un software dedicado, determinar la sensi-
bilidad relativa del instrumento.
• Los estándares Tipo 111 se usan para calibrar la fluorescencia. Estos se usan para aplicaciones especializadas que requieren
la calibración de uno o más detectores de fluorescencia para cuantificación de moléculas de fluorocromo. La determina-
ción de la relación entre los fluoróforos y el anticuerpo (relación F/P) permite el cálculo subsiguiente del número de anti-
cuerpos unidos por célula.

CONFIGURACIÓN DEL INSTRUMENTO Y GARANTÍA DE CALIDAD

La configuración del instrumento y la garantía de calidad deben ser actividades independientes de la valoración biológica.
Muchas variables relacionadas con el instrumental pueden producir artefactos en los resultados de la valoración biológica. Para
garantizar la calidad instrumental se puede usar: la configuración de la línea base y la configuración diaria.
Configuración de la Línea Base
En los instrumentos digitales más novedosos, se recomienda establecer una configuración de la línea base en la configura-
ción del instrumento que provea una sensibilidad óptima. Esta configuración no es un procedimiento diario, pero debe llevarse
a cabo si la configuración del instrumento ha sido cambiada o si se ha dado servicio al instrumento. Debido a que los voltajes
del PMT y la configuración del instrumento pueden afectar sobremanera la sensibilidad de éste último, este método debe usar-
se para generar objetividad y una sensibilidad mejorada. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que pro-
vea un CV menor (Figura 8). Estas configuraciones pueden ser usadas para la valoración biológica, aunque no aplica para todos
los casos.
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 685

IUU[IU ~--------------~

490V 605V
1m10 --+-- F' 1 FITC.i\ ::.\'
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P 1 ~'erCP-C·~·-S-5-A
o-:?.
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G 111! \
_...__p¡ APCACV
100 --- --~~\-- --+-- P1 PE-Cy7-11 CV

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... -------.
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-- . -------- -·•·-
10+-----~---~---~--~

20[1 400 50[1 10[10

Voltaje de PMT
Figura 8. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que provea una CV menor.

Configuración Diaria
Se pueden usar estándares Tipo 11, tales como partículas de referencia, para monitorear la intensidad de la señal, la separa-
ción de partículas moderadamente brillantes y tenues y la resolución de la señal. Las perlas con fluoróforo homologado pro-
porcionan una herramienta de compensación y un medio para saber si el instrumento es capaz de detectar tales longitudes de
onda. Sin embargo, las perlas con fluoróforo homologado no tienen la uniformidad de fluorescencia requerida para medir CV.
Basándose en el desempeño óptico del instrumento, los CV se miden mejor usando perlas duras teñidas con brillo moderado y
tenue tales como micropartículas teñidas con coumarina que se muestran fluorescentes en un intervalo espectral amplio.
Resulta fácil confundir los controles de valoración con los controles instrumentales. Las perlas proveen una fluorescencia uni-
forme y constante que no es posible obtener con células y, por consiguiente, son útiles para monitorear el desempeño del
instrumento. Por esta razón, resulta mejor emplear una preparación de células para control de proceso a fin de verificar la
compensación y la aceptabilidad del fluoróforo.
Los ajustes que se realizan al instrumento para configurarlo diariamente son, por lo general, los mismos que se usan para los
ensayos. No todas las valoraciones se pueden usar con la misma configuración instrumental, y no siempre es necesario llevar a
cabo estas actividades para cada configuración instrumental a menos que la validación así lo requiera.
Las actividades diarias incluyen configurar el instrumento de manera uniforme día por día, usar una amplia variedad de per-
las de intensidad tenue a moderada y monitorear parámetros clave, incluida la intensidad de fluorescencia de las perlas (abso-
luta y CV%), valores de PMT, temperatura, potencia y longitud de onda del láser.

CONTROL Y GARANTÍA DE CALIDAD DE LA VALORACIÓN

La configuración instrumental para una valoración específica debe establecerse para demostrar que todas las poblaciones ce-
lulares pueden identificarse en gráficas bivariables para fluorescencia y dispersión de luz. Es de suma importancia que las po-
blaciones positivas estén en escala y apropiadamente compensadas. Esto es crítico cuando las células se excitan con láseres
rojos, los cuales no provocan que las células generen autofluorescencia significativa. Por esta razón, es importante verificar que
la configuración sea adecuada para que la población positiva se encuentre en la parte superior de su escala de fluorescencia,
puesto que puede ser extremamente difícil identificar las células negativas.
La compensación de fluorescencia es un ajuste crítico. Los instrumentos digitales ofrecen ajustes objetivos fuera de línea du-
rante el análisis; asimismo, se encuentran disponibles instrucciones detalladas para la configuración adecuada de la compensa-
ción. El uso de células o perlas de captura teñidas con un solo fluorocromo unido a anticuerpos es, por lo general, la mejor
metodología, aunque las mezclas de perlas marcadas con fluorocromo específicas también pueden funcionar bien para com-
pensar la adquisición y el análisis multicolor.

CONTROLES DE ISOTIPOS

Un control de isotipo es un control negativo de anticuerpo que no debe reaccionar con el antígeno de interés y que es el
mismo isotipo que el anticuerpo de prueba. La proteína de mieloma o la inmunoglobulina que no tiene especificidad para las
especies que se analizan, tienen la misma clase y subclase de cadena lg a medida que el anticuerpo de prueba se conjuga con
un fluorocromo idéntico al del anticuerpo de prueba. Resulta ideal que la unión sea mínima o nula cuando se usa el control de
isotipo en paralelo con la prueba. Aunque la unión idiotípica no específica ocurre con frecuencia, ésta es independiente del
isotipo del anticuerpo. Esto muy probablemente se relaciona con otras diferencias en la química del anticuerpo y puede ser
especialmente problemático con ensayos de detección de eventos poco comunes, tales como aquellos para ensayos de células
madre hematopoyéticas en sangre periférica.
686 (10271 Citometría de Flujo/ Información General USP 37

CONTROLES DE FLUORESCENCIA MENOS UNO

Los controles de fluorescencia menos uno (FMO, por sus siglas en inglés) se usan para controlar la tinción no específica du-
rante un ensayo multicolor. Después de que sea establecida la compensación, se analiza un tubo que contiene todos los anti-
cuerpos marcados con fluorocromo, excepto por uno. Si la compensación se ha establecido de manera apropiada, cualquier
fluorescencia positiva en el parámetro correspondiente al anticuerpo marcado con fluorocromo faltante es ocasionada por tin-
ción no específica y puede ser indicativa de un exceso de anticuerpos o la degradación de los colorantes en tándem relaciona-
dos. Aunque los controles de FMO son muy útiles para estimar la sensibilidad de un detector particular en el contexto de otros
reactivos, los controles no toman en cuenta la unión específica que puede presentarse con la adición del anticuerpo de prueba.
El uso de los tubos de control de FMO es más apropiado para resolver problemas o para establecer un nuevo cóctel de reacti-
vos multicolor.

CONTROLES DURANTE EL PROCESO

Los controles durante el proceso, también conocidos como estándares de aptitud del sistema, toman en cuenta la prepara-
ción de la muestra y la adquisición de datos. Estos pueden incluir células de control conservadas, líneas de células o líneas de
células comercialmente disponibles, tales como sangre periférica común. Asimismo, los controles durante el proceso se pueden
usar para analizar nuevos lotes de reactivos de anticuerpos contra lotes antiguos.

CONTROLES BIOLÓGICOS

Cuando se comparan células tratadas o estimuladas con células sin tratar o sin estimular, en ocasiones, las células sin tratar o
sin estimular pueden representar el control más útil para establecer un límite positivo o negativo. No obstante, el uso de con-
troles de isotipo también puede aplicarse a estas situaciones, debido a que la estimulación puede llevar a la regulación crecien-
te de los receptores para Fe, lo que a su vez conlleva a un aumento en la tinción de fondo, cuya presencia puede dilucidarse
mediante un control de isotipo.

APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO PARA MUESTRAS CELULARES Y PRODUCTOS DE

TERAPIA CELULAR

Se ha desarrollado una gran variedad de aplicaciones de citometría de flujo para investigación, diagnóstico clínico y monito-
reo, desarrollo de fármacos y caracterización de productos celulares y evaluación de su calidad (es decir, controles para la libe-
ración del lote). Las aplicaciones clínicas tradicionales incluyen el monitoreo de la enfermedad por VIH y el diagnóstico y moni-
toreo de leucemia y linfoma. Los laboratorios de investigación farmacéutica y académica han ampliado la aplicación de la cito-
metría de flujo desde inmunofenotipificación hasta ensayos celulares funcionales, así como ensayos multiplex basados en mi-
croesferas capaces de medir parámetros funcionales múltiples en células individuales. Los ensayos funcionales de la actualidad
incluyen ensayos que permiten el estudio directo del estado de activación celular midiendo la producción de citoquinas intra-
celulares o la secreción de quimioquinas o citoquinas, usando un ensayo en emparedado de unión a ligandos en microesferas.

lnmunofenotipificación

La citometría de flujo permite caracterizar subtipos de leucocitos marcando células con anticuerpos monoclonales conjuga-
dos con fluorocromos. El sistema de grupo de diferenciación, CD, define anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos
únicos en la superficie celular. Muchas aplicaciones clínicas toman ventaja de las capacidades de la citometría de flujo para
medir múltiples antígenos CD en miles de células individuales.

ENUMERACIÓN DE CD4

Al inicio de la década de 1980, los investigadores descubrieron que el VIH infecta las células T CD4 positivas y que el recuen-
to de células T CD4 de la sangre periférica del paciente es un indicador útil del estado inmune. La enumeración de CD4 se ha
convertido en la prueba de diagnóstico más comúnmente usada en pacientes infectados con VIH para determinar la necesidad
de terapia antiretroviral (ARV) y para monitorear la efectividad de los fármacos ARV. Los recuentos de subconjuntos de células
Ta menudo se expresan en términos de células por microlitro y como porcentaje de linfocitos, usando un reactivo estandariza-
do, software y sistema de instrumentos.

LEUCEMIA Y LINFOMA

El análisis por citometría de flujo multidimensional permite identificar poblaciones de células aberrantes en la médula ósea,
en el tejido linfático y en la sangre periférica de pacientes con leucemia o linfoma. Esto se logra mediante cócteles de anticuer-
pos monoclonales pertinentes a la oncología o para linajes específicos. Mediante fluoróforos óptimos y configuraciones ópti-
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 687

cas/electrónicas mejoradas en instrumental de la citometría de flujo, se pueden detectar marcadores celulares adicionales para
identificar de manera más precisa fenotipos de células de leucemia o linfoma y para mejorar la evaluación del médico sobre el
estado del paciente. Los métodos de detección de eventos poco comunes han mejorado la capacidad de detectar enfermeda-
des residuales mínimas.

CÉLULAS DENDRÍTICAS

Las células dendríticas (OC, por sus siglas en inglés) actúan como células que presentan antígenos que pueden influenciar la
naturaleza y potencia de la respuesta inmune a antígenos específicos. Este hallazgo ha llevado al desarrollo de las OC como
terapias celulares para cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Las OC tienen morfologías y fenotipifi-
caciones diversas y se pueden derivar de diferentes tipos de células. Es posible segregar dos linajes de OC principales, conoci-
das como OC mieloides y plasmocitoides, basándose en su expresión de CDl 1cyCDl23, respectivamente. Asimismo, la ex-
presión de las moléculas coestimulantes CD80 y CD86 se puede monitorear para determinar el estado de madurez de las OC.

CÉLULAS MADRE Y PROGENITORAS

La expresión de CD34 a menudo se usa para caracterizar las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés)
en sangre periférica, sangre del cordón, médula ósea y preparaciones de HSC purificadas de estas fuentes. La identificación y
enumeración por citometría de flujo de HSC es posible mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos para el epíto-
pe CD34 clase 111, junto con otros reactivos bien caracterizados, software de análisis y protocolos. La combinación de anticuer-
pos anti-CD45, anti-CD34 y un colorante de viabilidad tal como 7-AAD se usa ampliamente en aplicaciones clínicas. El crecien-
te interés por el desarrollo de terapias celulares a partir de fuentes de tejido embriónico, fetal y adulto ha llevado al uso de una
amplia variedad de marcadores convencionales fenotípicos novedosos para caracterizar células de origen y su progenie más
diferenciada. Se están desarrollando ensayos por citometría de flujo como parte de baterías de ensayos para evaluar productos
celulares diferenciados derivados de fuentes de células madre pluripotentes. Estos ensayos ayudan a definir números apropia-
dos y tipos de poblaciones celulares deseadas, además de que ayudan a detectar células no deseadas tales como células pluri-
potentes residuales que pueden ser tumorigénicas en el receptor.

LEUCOCITOS

La leucoreducción de hemoderivados es un proceso que se usa para producir hemoderivados con un contenido de leucoci-
tos residuales de menos de 5 x 106 por unidad. Los datos clínicos sugieren que las reacciones febriles no hemolíticas posteriores
a la transfusión se pueden evitar mediante leucodepleción. La leucodepleción también previene la aloinmunización a antígenos
HLA en pacientes que requerirán repetidamente transfusión de hemoderivados. La citometría de flujo se usa a menudo para
cuantificar la contaminación leucocitaria en hemoderivados sometidos a leucodepleción.

PLAQUETAS

La citometría de flujo es un método útil y rápido para diagnosticar muchos trombocitopatías primarias asociadas con defec-
tos en glicoproteínas estructurales o funcionales (p.ej., expresión anormal de gpllb/llla en trombastenia de Glanzmann o gplb
en el síndrome de Bernard-Soulier). El uso de anaranjado de tiazol, un colorante fluorescente que se une al ARN, permite la
cuantificación de plaquetas inmaduras (plaquetas reticuladas). El recuento de plaquetas reticuladas se puede usar para deter-
minar la velocidad de trombopoyesis. Esta medición puede separar las trombocitope-
nias inexplicables en aquellas con un aumento en la destrucción y aquellas con defectos en la producción de plaquetas.

ERITROCITOS

Las mujeres Rhesus D negativo reciben inmunoglobulina Rh profiláctica para prevenir la aloinmunización de eritrocitos (RBC)
Rh(D)+. Si se sospecha hemorragia fetomaterna, la sangre de la madre se analiza para determinar la presencia y cantidad de
RBC fetales, usando anticuerpos contra el antígeno Rh(D) o la hemoglobina F marcados con fluorescencia.
El recuento de reticulocitos ayuda a determinar si la médula ósea responde adecuadamente a la necesidad del cuerpo de
RBC y ayuda a clasificar diversos tipos de anemia. Los recuentos de reticulocitos se basan en la identificación de ribosomas y
ARN residuales en los RBC inmaduros sin núcleo. La enumeración de reticulocitos por citometría de flujo y su discriminación de
RBC maduros emplea colorantes fluorescentes que se unen al ARN residual (p.ej., anaranjado de tiazol).

lnmunoensayos Basados en Perlas

Los ensayos por citometría de flujo basados en microesferas multiplex combinan una serie de partículas de tamaño discreto
y/o intensidad de fluorescencia con pares de anticuerpos homologados que permiten la detección simultánea de analitos solu-
bles múltiples en un citómetro de flujo. La capacidad del citómetro de flujo para discriminar partículas basándose en el tamaño
688 (1027) Citometría de Flujo / Información General USP 37

y color permite determinar múltiples resultados de un solo tubo o pocillo. Muchos investigadores emplean tales ensayos para
medir quimioquinas o citoquinas, kinasas, y anticuerpos anti-HLA secretados.

Ensayos de Proliferación

INCORPORACIÓN DEL COLORANTE EN EL ADN

La Bromodesoxiuridina (BrdU) es un análogo de timidina que se puede incorporar en el ADN de las células durante la fase S
y que se puede detectar posteriormente usando anticuerpos monoclonales marcados específicos. Mediante la aplicación de
pulsos a un cultivo de células estimulado con BrdU, es posible identificar a las células que han proliferado (pasado a través de
la fase S) durante el tiempo del pulso. Este ensayo se ha convertido en una alternativa útil a la incorporación de 3H-timidina
como una medición de proliferación debido a su radioactividad nula y a que puede identificar fenotipos de células que prolife-
ran usando marcadores múltiples y citometría de flujo.

INCORPORACIÓN DEL COLORANTE EN PROTEÍNAS CELULARES O EN LA MEMBRANA CELULAR

Loe colorantes para el rastreo de células tales como succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE, por sus siglas en inglés) y
PKH26 han demostrado ser útiles en la evaluación de la proliferación celular. El CFSE se une de manera covalente al citosol y a
las proteínas de la membrana, mientras que el PKH26 se une de manera no covalente a las membranas celulares. Cuando las
células se dividen, el marcado con CFSE/PKH26 se divide equitativamente entre las células hijas, las cuales, por consiguiente,
tienen la mitad de fluorescencia que las células paternas. La fluorescencia de cada célula se divide adicionalmente por la mitad
con cada generación subsiguiente. Esta propiedad hace de los ensayos con CFSE/PKH26 útiles, no solo para determinar la frac-
ción de células que han proliferado en un cultivo estimulado, sino también, en condiciones ideales, el número de generaciones
que han transcurrido. De esta manera, se pueden calcular las frecuencias precursoras de poblaciones pequeñas que han proli-
ferado durante varios días en cultivo.

Ensayos Funcionales

EXPRESIÓN DE CITOQUINAS INTRACELULARES

Las técnicas de marcado de superficies celulares e intracelulares han sido aplicadas a la identificación de subconjuntos de
células con características funcionales específicas. Por ejemplo, una estimulación breve de las células, tales como PBMC con
antígenos proteicos o peptídicos, puede resultar en la expresión de los marcadores y citoquinas de activación, los cuales puede
medirse posteriormente junto con otros marcadores fenotípicos en la superficie de las células que responden. El uso de un inhi-
bidor de secreción tal como brefeldina A o monensina permite la acumulación intracelular de citoquinas. Posteriormente, las
células se fijan, permeabilizan y detectan por un método de citrometría de flujo. Dichos ensayos son útiles para monitorear
subpoblaciones de células T que responden a vacunas, agentes de enfermedades infeccionas o cáncer. Las propiedades funcio-
nales de otros tipos de células, incluidos monocitos, DC y células NK, también pueden monitorearse usando ensayos funciona-
les con estímulo apropiado.

QUI NASAS

Los intermediarios fosforilados de la activación celular se pueden identificar usando anticuerpos fosfoespecíficos y citometría
de flujo. Estos reactivos son útiles para mapear mecanismos de señalización intracelulares, a menudo en el contexto de otros
marcadores fenotípicos de superficie celular. Por lo tanto, la citometría de flujo multicolor puede proveer una evaluación de
células individuales en estados de activación intracelular en poblaciones de células complejas. Estos ensayos pueden ser útiles
para la detección de estados de señalización alterados en células cancerosas o en la dirección terapias apropiadas basadas en
las propiedades de señalización de las células tumorales de un paciente.

APOPTOSIS

La apoptosis, comúnmente descrita como muerte celular, es el proceso de muerte celular ocasionada por procesos fisiológi-
cos regulados. El proceso apoptótico se presenta como una serie de cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares en la
célula y se puede iniciar mediante estímulos externos o internos. Un evento central durante la apoptosis es la activación de
caspasas, una familia de enzimas proteolíticas. Las caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas y se activan mediante
otras caspasas o moléculas similares. Éstas forman una cascada que puede llevar a la ruptura de varias proteínas citoplasmáticas
o nucleares. Se ha informado que la caspasa-3 es crucial para el proceso apoptótico, la cual se activa durante las etapas tem-
pranas de la apoptosis.
USP 37 Información General/ (1027) Citometría de Flujo 689

Los métodos por citometría de flujo para detectar células apoptóticas incluyen la medición de la morfología, cambios en la
estructura de la membrana, ruptura del ADN por endonucleasas y potencial de la membrana mitocondrial. Se han usado para
este propósito sustratos de caspasas naturales o artificiales o anticuerpos contra la forma activada de la enzima.

VIABILIDAD DE LA CÉLULA

La citometría de flujo a menudo se usa para discriminar células vivas de células muertas. El principio de exclusión con colo-
rante de ácido nucleico es la base de esta aplicación. Un colorante de ácido nucleico tal como PI o 7-AAD se agrega a las célu-
las en suspensión. Durante el análisis por citometría de flujo, las células que muestran fluorescencia por encima del fondo se
consideran no viables debido a que no pueden excluir el colorante, el cual presenta fluorescencia cuando se une al ADN celu-
lar.

Ensayos de lnmunoglobulinas por Citometría de Flujo

COMPATIBILIZACIÓN CRUZADA POR CITOMETRÍA DE FLUJO

Antes del transplante de órganos, se realiza la compatibilización cruzada por citometría de flujo (FCXM, por sus siglas en
inglés) en los receptores para detectar anticuerpos antiHLA que puedan ocasionar el rechazo. Los anticuerpos antiHLA se de-
tectan incubando leucocitos con determinado HLA, líneas de células B o perlas recubiertas con antígenos HLA con la muestra
de suero, seguido por anticuerpos marcados con fluorescencia de inmunoglobulina antihumana. Los leucocitos se inmunoti-
ñen para identificar células T y B para distinguir entre la actividad de clase 1y11 de anti-HLA, respectivamente. Además, tam-
bién ha aumentado el uso del análisis de donaciones de sangre para detectar anticuerpos anti-HLA para identificar donantes
cuyos hemoderivados pueden presentar un mayor riesgo de ocasionar en los receptores lesiones pulmonares agudas relaciona-
das con la transfusión (TRALI, por sus siglas en inglés).

ANTICUERPOS NEUTRÓFILOS HUMANOS

Los anticuerpos contra neutrófilos humanos (anti-HNA, por sus siglas en inglés) pueden ocasionar neutropenia y se han rela-
cionado con las TRALI. Las neutropenias autoinmunes se pueden desarrollar en pacientes con trastornos autoinmunes tales co-
mo síndrome de Felty, lupus eritematoso sistémico y tiroiditis de Hashimoto. La ausencia de anticuerpos anti-HNA estrecha el
diagnóstico diferencial a causas no inmunes tales como deficiencia en la médula ósea, mielodisplasia o procesos de infiltración
medular. La citometría de flujo puede detectar anticuerpos antineutrófilos y puede confirmar el origen de la neutropenia o las
TRALI.

ANTICUERPOS CONTRA PLAQUETAS HUMANAS

Los anticuerpos contra plaquetas humanas (anti-HPA, por sus siglas en inglés) se detectan mediante ensayos directos o indi-
rectos de inmunoglobulinas asociadas con plaquetas basados en citometría de flujo. En la púrpura trombocitopénica autoin-
mune, no se encuentran con tanta frecuencia anticuerpos libres circulantes (en el suero) como los anticuerpos unidos a pla-
quetas. En los casos de formación de aloanticuerpos, los anticuerpos del suero se pueden detectar sin evidencia de anticuerpos
asociados con plaquetas.

RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS EN ENSA VOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO

Cuando se desarrolla un método de citometría de flujo, se debe determinar primero el propósito final del ensayo. Para ensa-
yos con propósitos de investigación, puede ser difícil estandarizar las muestras de células, reactivos y protocolos. Los ensayos
destinados para diagnóstico de pacientes o para calificar un producto celular para su liberación antes de la administración a un
paciente requieren de una estandarización más estricta de ensayos y muestras. Los requisitos reglamentarios, el tipo y etapa de
investigación clínica y el propósito final del ensayo determinan el nivel de rigor requerido para el ensayo.
El desarrollo de ensayos por citometría de flujo debe incluir el establecimiento y calificación de los parámetros y límites de
tinción, manipulación, instrumental y análisis. Si se asume que el método ha sido desarrollado adecuadamente, que los opera-
dores están bien capacitados, que el instrumento se ha ajustado de manera adecuada, que se han aplicado los controles apro-
piados para el ensayo y el instrumental y, si fuera necesario, que se han llevado a cabo validaciones del instrumental y del
método, los operadores pueden toparse con instancias en las que será necesario resolver ciertas problemáticas.
Los desafíos más comunes de la citometría de flujo son la alta fluorescencia o fondo con dispersión lateral, tasas anormales
de eventos, alta intensidad de fluorescencia y baja señal de fluorescencia. A continuación se describen metodologías para dis-
minuir estos problemas.
690 (1027) Citometría de Flujo / Información General USP 37

Alto Contenido de Partículas de Fondo

La manipulación de células en exceso (p.ej., demasiado vórtice), la fijación inadecuada y la contaminación bacteriana de las
células pueden incrementar las partículas de fondo. Asimismo, si el umbral frontal del instrumento se configura demasiado ba-
jo, los desechos celulares se detectarán como eventos. La manipulación suave de las células, los reactivos frescos y la configura-
ción adecuada del instrumental ayudan a garantizar perfiles de dispersión lateral uniformes.

Alta Fluorescencia de Fondo

La alta intensidad de la fluorescencia se puede atribuir a una concentración de anticuerpos en exceso, al lavado inadecuado
de las células o al bloqueo inadecuado del receptor Fe. Además, una ganancia inapropiadamente alta del instrumento PMT
puede resultar en un fondo elevado. La concentración de anticuerpos y la densidad celular uniformes, el lavado y bloqueo ade-
cuados y la configuración apropiada del instrumento ayudarán a evitar una fluorescencia de fondo anormalmente elevada

Tasa Alta de Eventos

Las tasas anormalmente altas de eventos a menudo se atribuyen a densidades altas de células durante la tinción del anticuer-
po o en la muestra de células finales. El mezclado inadecuado y la sedimentación de la muestra de células puede resultar en
tasas altas de eventos celulares, al igual que el uso de ventanas inapropiadas o poco uniformes.

Tasa Baja de Eventos

La aglomeración celular, las densidades celulares finales bajas, los bloqueos en los fluidos del instrumento o el uso de venta-
nas inapropiadas pueden, generalmente, resultar en una detección anormalmente baja de eventos. La limpieza, el manteni-
miento y la configuración adecuadas del instrumento, así como los protocolos de tinción uniformes, pueden lograr resultados
uniformes con sensibilidad suficiente.

Alta Intensidad de Fluorescencia

Al igual que con alta fluorescencia del fondo, una alta fluorescencia celular promedio puede resultar de una cantidad en ex-
ceso de anticuerpos marcados, del lavado de células inadecuado o poco uniforme o del bloqueo inadecuado. La inclusión de
detergente en la solución amortiguadora de lavado, especialmente durante la tinción intracelular, puede ayudar a prevenir la
unión no específica de anticuerpos.

Intensidad Débil de Fluorescencia

Son muchos los factores que pueden generar una fluorescencia con intensidad débil. Los parámetros del instrumento tales
como alineación deficiente del láser, compensación inadecuada, configuración inapropiada, configuraciones de ganancia poco
uniformes y respuesta débil del láser, pueden afectar negativamente la intensidad de la fluorescencia. Además, las cuestiones
relacionadas con la fisiología celular o la preparación de reactivos, tales como concentración insuficiente de anticuerpos, antí-
geno blanco lábil o secretado, reactivos de baja calidad o almacenados inadecuadamente (lo que resulta en decaimiento del
fluorocromo) o antígeno blanco inaccesible, pueden resultar en una señal débil. El desarrollo adecuado de ensayos, el mante-
nimiento apropiado del instrumental y el cumplimiento con protocolos calificados pueden mejorar la intensidad de la señal de
fluorescencia.
La citometría de flujo permite a los investigadores analizar células para una gran cantidad de aplicaciones diversas. El núme-
ro y alcance de los ensayos inmunofenotípicos y funcionales está en aumento. Es posible estudiar la presencia de proteínas, así
como los procesos celulares y la detección de poblaciones poco comunes o anormales. El lector debe referirse a la literatura
técnica para obtener detalles sobre la aplicación y el método.

REFERENCIAS

Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Strober W. Current Protoco/s in lmmunology. Fourth ed. Hoboken, Nj:
john Wiley and Sons; 1994.
Shapiro HM. Practica/ Flow Cytometry. Fourth ed. Hoboken, Nj; john Wiley and Sons; 2003.
USP 37 Información General/ (1030> Capítulos de Valoraciones Biológicas 691

(1030) CAPÍTULOS DE VALORACIONES BIOLÓGICAS-INFORMACIÓN

GENERAL Y GLOSARIO

El compendio USP-NF contiene cuatro capítulos generales relacionados con el desarrollo, validación y análisis de valoracio-
nes biológicas: Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ), Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (l 032), Validación
de Valoraciones Biológicas (l 033) y Análisis de Valoraciones Biológicas (l 034). Este nuevo capítulo propuesto, Capítulos de Valora-
ciones Biológicas-Información General y Glosario (l 030), provee información general y algo de material común para los capítu-
los (1032), (1033) y (l 034), e incluye un glosario de términos relacionados con valoraciones biológicas.
El conjunto de capítulos de la USP sobre valoraciones biológicas se enfoca en valoraciones de potencia relativa. Estas valora-
ciones reconocen la variabilidad inherente en los sistemas de pruebas biológicas (tanto en animales como en células) que se
puede observar entre laboratorios y de un día a otro, la cual compromete la confiabilidad de una medida absoluta de la poten-
cia. En las valoraciones de potencia relativa, la actividad biológica de un material de Prueba se compara con la actividad de un
Estándar en un sistema de valoración en el que el uso de un Estándar reduce la influencia de la variabilidad inherente del siste-
ma en la estimación de la potencia relativa. Las valoraciones de potencia relativa también se enfocan en la variabilidad impor-
tante relacionada con la respuesta debida a las diferencias entre los materiales de Prueba y Estándar (si existiese dicha diferen-
cia). Se espera que la Prueba se comporte como una dilución o concentración del Estándar y debe presentar la propiedad de
similitud. Aunque están destinados para las valoraciones biológicas de potencia relativa, los principios y prácticas desarrollados
en estos capítulos pueden tener una aplicación más amplia-por ejemplo, en inmunoensayos y valoraciones por unión de re-
ceptor-ligando usadas para determinar la potencia relativa.
El capítulo (l 032) provee información para científicos que se encuentren desarrollando una nueva valoración biológica. Con-
forme a lo mostrado en la Tabla 7, el capítulo abarca una variedad de actividades realizadas durante el ciclo de vida de la valo-
ración, con énfasis en el desarrollo que lleva a la validación, incluyendo la selección del sistema de prueba y las consideraciones
del diseño (p.ej., diseño de las placas (plate layout)). Asimismo, el capítulo trata estrategias de análisis de datos que deben
considerarse durante el desarrollo (antes de la validación) pero que, de rutina, no se tratan posteriormente. Entre dichas estra-
tegias está la selección de un esquema de ponderación, transformación de datos, si los hubiere, y la selección de un modelo
estadístico. Los detalles estadísticos que sustentan estas secciones del capítulo (1032) se encuentran en el capítulo (l 034).
Tabla 1. Secciones Principales del capítulo Diseño y Desarrollo de Va/oraciones Biológicas (1032)
Sección Título de la Sección
1 Introducción
1.1 Propósito y Alcance
1.2 Partes Interesadas
2 Aptitud de las Valoracione'> Biológicas para Su Uso Previsto
2.1 Desarrollo del Proceso
2.2 Caracterización del Proceso
2.3 Liberación de Productos
2.4 Productos Intermedios del Proceso
2.5 Estabilidad
2.6 Calificación de Reactivos
2.7 Integridad de los Productos
3 Aspectos Fundamentales de la Valoración Biológica
3.1 Valoraciones Biológicas In Vivo
3.2 Valoraciones Biológicas Ex Vivo
3.3 Valoraciones Biológicas (Basadas en Células) In Vitro
3.4 Estándar
4 Aspectos Estadísticos de los Elementos Fundamentales de las Valoraciones Biológicas
4.1 Datos
4.2 Suposiciones
4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderación y Transformación
4.4 Normalidad
4.5 Lir1ealidad de los Dalos de Currcentración-Respuesta
4.6 Modelos Comunes de Valoración Biológica
4.7 Análisis de Aptitud
4.8 Valores Aberrantes
4.9 Efectos Fl[o_s.r..Aleatorios en ~odelos d~~puesta ~'.f¿¡lo_racio_ne~Jó_srcc"._S___ ____ -·-·---
5 Etapas del Proceso de Desarrollo de la Valoración Biológicc1 ___...
·------ ----·--- --._
 r
692 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

Tabla 1. Secciones Principales del capítulo Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032) (Continuación)
Sección Título de la Sección
5.1 Diseño: Planificación de la Valoración, Distribución por Bloques y Aleatorización
5.2 Desarrollo
5.3 Análisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoración
5.4 Validación de la Valoración Biológica
5.5 Mantenimiento de Valoraciones Biológicas

El capítulo (1034) provee información sobre los análisis de datos apropiados para las valoraciones biológicas de potencia re-
lativa comunes, incluyendo modelos de líneas paralelas, de cociente de pendientes, de curvas paralelas y cuantales. El capítulo
incluye además análisis que sustentan la evaluación de la aptitud del sistema y de la muestra, y métodos para combinar resul-
tados de valoraciones independientes (ver la Tabla 2). Este capítulo es el más avanzado estadísticamente de los tres capítulos,
pero está diseñado para su uso por parte de biólogos y estadísticos. El material conceptual requiere únicamente de experiencia
estadística mínima. Las secciones sobre métodos requieren una experiencia estadística al nivel del capítulo Datos Analíticos-
Interpretación y Tratamiento (101 O) y estar familiarizado con la regresión lineal.
Tabla 2. Secciones Principales del capítulo Análisis de Va/oraciones Biológicas (1034)
Sección Título de la Sección
1 Introducción
2 Aspectos Generales del Análisis de los Datos de la Valoración Biológica
3 Modelos de Análisis
3.1 Respuestas de Valoración Cuantitativas y Cualitativas
3.2 Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas
3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas
3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas
3.5 Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes
3.6 Valoraciones Dicotómicas (Cuanta/es)
4 Intervalos de Confianza
4.1 Combinación de Resultados de Múltiples Valoraciones
4.2 Combinación de Valoraciones Independientes (Métodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras)
4.3 Métodos Basados en Modelos
5 Fuentes Adicionales de Información

El propósito del capítulo (1033) es dar continuación a los capítulos (1032) (desarrollo de valoraciones) y (1034) (desarrollo
de planos para el análisis de datos). En otras palabras, el capítulo (1033) supone una valoración biológica completamente de-
sarrollada (incluyendo un plano para el análisis de datos y al menos valores tentativos para los criterios de aptitud del sistema y
de la muestra, y el formato de la valoración biológica) y provee pautas sobre la validación de dicha valoración. El capítulo trata
las características de validación pertinentes a las valoraciones biológicas de potencia relativa y provee mayores detalles sobre
los métodos estadísticos usados en la validación que el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). Aunque los
principios y prácticas desarrollados en el capítulo (1033) están destinados para las valoraciones biológicas de potencia relativa,
pueden tener una aplicación más amplia. El capítulo enfatiza las metodologías de validación que proveen flexibilidad para
adoptar nuevos métodos de valoración biológica, nuevos medicamentos biológicos, o ambos (ver la Tabla 3).
Tabla 3. Secciones Principales del capítulo Validación de Va/oraciones Biológicas (1033)
Sección Título de la Sección
1 Introducción
2 Fundamentos de la Validación de la Valoración Biológica
2.1 Protocolo de Validación para Valoraciones Biológicas
2.2 Documentación de los Resultados de la Validación de la Valoración Biológica
2.3 Diseño de Validación para Valoraciones Biológicas
2.4 Estrategias de Validación de las Características de Desempeño de la Valoración Biológica
2.5 Criterios de Aceptación Propuestos para la Validación
2.6 Mantenimiento de la Valoración
2.7 Consideraciones Estadísticas
3 Ejemplo de Validación de una Valoración Biológica
3.1 Precisión Intermedia
3.2 Exactitud Relativa
3.3 Intervalo
USP 37 Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 693

Tabla 3. Secciones Principales del capítulo Validación de Valoraciones Biologicas, 1033 (Continuwion)
Sección Título de la Sección
3.4 Uso de los Resultados de la Validación para Caracterizar una Valoración Biológica
3.5 Confirmación de la Precisión Intermedia y Revalidación
4 Fuentes Adicionales de Información
Apéndice Medidas de Localización y de Dispersión para Variables de Distribución Logarítmica Normal

GLOSARIO

Este glosario corresponde a valoraciones biológicas y provee una perspectiva farmacopeica que es congruente con el conjun-
to de capítulos sobre valoraciones biológicas del compendio USP-NF; asimismo, se considera complementario al uso autoriza-
do previo y ofrece un enfoque útil para el contexto de las valoraciones biológicas. En muchos casos, los términos aquí citados
son de uso común, aunque carezcan de documentación, o se definen en el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos
(1225) y en la Pauta Q2(R1) de la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonización
o ICH), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Validación de Procedimientos Analíticos: Texto y Metodolo-
gía).1 (El capítulo (1225) y la Pauta Q2(R1) de la ICH concuerdan en las definiciones.) Este Glosario pretende apegarse a estos
usos precedentes, y se proveen notas cuando exista alguna diferencia basada en el contexto de la valoración biológica. Las
definiciones del capítulo (1225) y de la pauta Q2(R1) de la ICH se identifican, por ejemplo, mediante"(l 225)" si se tomó tal
como se encuentra, o "adaptado del capítulo (1225)" si se realizó alguna modificación menor para su aplicación en las valora-
ciones biológicas. La mayoría de las definiciones se acompañan con notas que proveen mayor detalle sobre el contexto de las
valoraciones biológicas.
Los términos se organizan alfabéticamente dentro de cinco secciones por temas:
l. Términos generales relacionados con las valoraciones biológicas
11. Términos relacionados con la realización de una valoración biológica
111. Términos relacionados con la precisión y la exactitud
IV. Términos relacionados con la validación
V. Términos relacionados con el diseño y análisis estadístico
La Tabla 4 presenta cada término y la sección del Glosario en la que se puede encontrar.
Tabla 4. Términos listados en el Glosario
Término Sección Término Sección
Exactitud 111 Modelo de efectos mixtos V
Análisis de varianza (ANOVA) V Generación de modelos estadísticos V
Procedimiento analítico [adaptado de Q2(Rl )] 1 Anidado V
Valoración 1 Fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés) 11
Conjunto de datos de la valoración 1 Paralelismo (de las curvas de concentración-respuesta) V
Valoración biológica 1 Parcialmente cruzado V
Valoración biológica 1 Estimación puntual V
Distribución en bloques V Potencia [Título 21 del CFR 600.3(s)] 1

Diseño completo por bloques V Precisión 111

Intervalo de confianza V Determinaciones pseudo-repetidas V
Cruzado (y parcialmente cruzado) V Valor P (probabilidad de significancia) V
Diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés) Límite de cuantificación (límite inferior de cuantificación;
[ICH Q8(R2)] V adaptado del capítulo (1225)) IV
Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225)) IV Efecto aleatorio V
Valoraciones biológicas directas 1 Error aleatorio 111
Prueba de equivalencia V Factor aleatorio V
Tipos de errores 111 Aleatorización V
Cuadrado medio esperado V Intervalo (adaptado del capítulo (1225)) IV
Diseño experimental V Sesgo relativo 111
Unidad experimental V Potencia relativa 1
Factor V Repetibilidad ((1225)) 111
Diseño factorial V Determinaciones repetidas V
Efecto fijo V Valor de informe 1
Factor fijo V Reproducibilidad (1225) 111

1 Disponible en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2 Rl /Step4/Q2 Rl __ Guideline.pdL Consultada el 29 de mar-

zo de 2012,
694 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

Tabla 4. Términos listados en el Glosario (Continuacion)

Término Sección Término Sección
Variabilidad del formato 111 Robustez (adaptado del capítulo (1225)) IV
Formato de la valoración biológica 11 Corrida 1
Diseño factorial fraccionado V Aptitud de la muestra 11
Diseño factorial completo V Probabilidad de significancia V
Modelo lineal general V Preparaciones similares 1
Coeficiente geométrico de variación 111 Similitud (algebraica) 1
Desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en in-
glés) 111 Especificidad (1225) 111
Diseño en bloques incompleto V Error estándar de estimación V
Independencia V Control estadístico del proceso V
Valoraciones biológicas indirectas 1 Aptitud del sistema 11
1nteracción V Error sistemático 111
Precisión intermedia (adaptado del capítulo (1225)) 111 Determinaciones repetidas verdaderas V
Nivel V Sesgo por truncado 111
Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225)) IV Error tipo 1 V
Distribución logarítmica normal V Error tipo 11 V

r Límite inferior de cuantificación (adaptado del capítulo

(1225))
_Cuadrado medio
IV
V
Validación de la valoración
Análisis de los componentes de la varianza
IV
V

l. Términos Generales Relacionados con las Valoraciones Biológicas

Procedimiento analítico [adaptado de Q2(Rl )]-Descripción detallada de las etapas necesarias para realizar el análisis.
Notas: 1. El procedimiento puede incluir, entre otros, la preparación de la muestra, el Estándar de Referencia y los reactivos;
el uso de equipo; la generación de la curva estándar; el uso de fórmulas para los cálculos; etcétera. 2. La Pauta de la FDA2
provee una lista de la información que, por lo general, se debe incluir en la descripción de un procedimiento analítico.
Valoración-Procedimiento analítico para determinar la cantidad de uno o más componentes o la presencia o ausencia de
uno o más componentes.
Notas: 1. El término Valorar a menudo se usa como verbo sinónimo de analizar o evaluar, tal como en "Voy a valorar (anali-
zar, evaluar) la presencia de impurezas en el material". En este glosario, valoración es un sustantivo y es sinónimo de procedi-
miento analítico (q.v.). 2. La frase correr la valoración significa llevar a cabo el procedimiento analítico conforme a lo especifica-
do. 3. En la práctica común, valoración y corrida (q.v.) a menudo se usan de manera intercambiable. Para propósitos de este
glosario, dichos términos son diferentes. Además, se puede consultar valoración biológica y conjunto de datos de la valoración.
Conjunto de datos de la valoración-Se refiere al conjunto de datos usado para determinar una potencia o potencia relativa
únicas para todas las muestras incluidas en la valoración biológica.
Notas: 1. La definición de un conjunto de datos de la valoración se puede interpretar, según sea necesario, como conjunto
mínimo. Puede ser posible determinar una potencia o potencia relativa a partir de un conjunto de datos, pero dicho proceso
podría no realizarse adecuadamente. Esta definición no pretende dar a entender que un conjunto de datos de la valoración es
el conjunto mínimo de datos que se pueden usar para determinar una potencia relativa. En la práctica, un conjunto de datos
de la valoración debe incluir, por lo menos, datos suficientes para evaluar la similitud (q.v.). También puede incluir datos sufi-
cientes para evaluar otras suposiciones. 2. Esta definición tampoco implica que los conjuntos de datos de la valoración usados
en conjunto para determinar un valor de informe (q.v.) sean necesariamente independientes el uno del otro, aunque podría
ser conveniente que lo fueran. Cuando una corrida (q.v.) consta de múltiples conjuntos de datos de la valoración, se debe
evaluar la independencia de los conjuntos de la valoración dentro de la corrida.
Biovaloración, valoración biológica (En inglés, los términos bioassay y biological assay se usan de manera intercambiable)-
Análisis (como el de un fármaco) para cuantificar la actividad/actividades biológicas de uno o más componentes mediante la
determinación de su capacidad para producir una actividad biológica esperada en un cultivo de células vivas (in vitro) o en
organismos de prueba (in vivo), la cual se expresa en términos de unidades.
Notas: 1. Los componentes de una valoración biológica incluyen el procedimiento analítico, el diseño estadístico para la re-
colección de datos y el método de análisis estadístico que eventualmente genera la potencia estimada o la potencia relativa. 2.
Las valoraciones biológicas pueden ser directas o indirectas.
Valoraciones biológicas directas-Valoraciones biológicas que miden la concentración de una sustancia requerida para
obtener una respuesta específica. Por ejemplo, la potencia de la digital is se puede estimar directamente a partir de la con-
centración requerida para detener el corazón de un gato. En una valoración directa, la respuesta debe ser clara y sin ambi-

2 FDA. Guidance for lndustry. Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. 2000. Disponible en:
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070489.pdf. Consultada el 27 de diciembre de 2011
USP 37 Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 695

güedades. La sustancia se debe administrar de tal manera que se pueda medir y registrar fácilmente la cantidad exacta
(umbral de concentración) requerida para obtener una respuesta.
Valoraciones biológicas indirectas-Valoraciones biológicas que comparan la magnitud de las respuestas para concen-
traciones nominalmente iguales de las preparaciones de referencia y de prueba en lugar de las concentraciones de refe-
rencia y de prueba que son necesarias para lograr una respuesta específica. La mayoría de las valoraciones biológicas en
los compendios USP-NF son valoraciones indirectas que se basan en respuestas cuantitativas o cuantales (sí/no).
Potencia [Título 21 del CFR 600.3(s)]-Habilidad o capacidad específica del producto, según se indica mediante pruebas de
laboratorio apropiadas o mediante datos clínicos adecuadamente controlados y obtenidos a través de la administración del
producto de la manera prevista, para provocar un resultado determinado.
Notas: 1. A diferencia de una muestra potente, una muestra impotente no tiene capacidad para producir la respuesta especí-
fica esperada. Las muestras equipotentes producen respuestas iguales con dosis iguales. Por lo regular, la potencia se mide con
respecto a un Estándar de Referencia o preparación a la que se le ha asignado un valor individual único (p.ej., 100,0) para la
valoración; ver potencia relativa. En ocasiones, se usan calificadores adicionales para indicar el estándar físico empleado (p.ej.,
"unidades internacionales"). 2. Algunos productos biológicos tienen usos múltiples y valoraciones múltiples. Para tales produc-
tos, pueden existir diferentes lotes de referencia que no presentan respuestas ordenadas uniformemente en toda una colección
de distintas valoraciones pertinentes. 3. [Título 21 del CFR 610.1 O] Las pruebas para potencia consistirán en pruebas in vitro o
in vivo, o ambas, que habrán sido específicamente diseñadas para cada producto para indicar su potencia de manera adecua-
da a fin de satisfacer la interpretación de potencia provista por la definición del Título 21 del CFR 600.3(s).
Potencia relativa-Medida que se obtiene a partir de la comparación de una Prueba con un Estándar, basándose en la capaci-
dad para producir la potencia esperada.
Notas: 1. Una perspectiva frecuentemente utilizada se centra en que la potencia relativa es el grado en el que se diluye o
concentra la preparación de Prueba con respecto al Estándar. 2. La potencia relativa no tiene unidad y se proporciona en la
definición de cualquier material de prueba, únicamente con respecto al material de referencia y a la valoración.
Valor de informe-Valor que se comparará con un criterio de aceptación.
Notas: 1. El criterio de aceptación para la comparación puede encontrarse en la monografía USP o haber sido establecido
por la compañía, p.ej., para la liberación del producto. 2. El término valor de informe está inseparablemente vinculado con el
"uso previsto" de un procedimiento analítico. Las valoraciones se llevan a cabo en muestras para generar resultados que pue-
dan usarse para evaluar algún parámetro. Las valoraciones pueden tener diferentes formatos o valores sumarios para diversos
propósitos (p.ej., liberación del lote vs calibración de un nuevo estándar de referencia). El valor de informe probablemente será
diferente incluso si la mecánica misma de la prueba es idéntica. La validación es necesaria para sustentar las propiedades de
cada tipo de valor de informe. En la práctica, puede existir un documento físico, que es el procedimiento analítico usado para
más de una aplicación, aunque dicho documento debe incluir por separado información detallada de cada aplicación. Alterna-
tivamente, pueden existir documentos distintos para cada aplicación. 3. Cuando la variabilidad inherente de una respuesta
biológica, o la del logaritmo de la potencia, impide obtener con un solo conjunto de datos de la valoración un valor lo sufi-
cientemente exacto y preciso como para cumplir con una especificación, el formato de la valoración puede cambiarse, según
se requiera. El número de bloques o repeticiones completas requeridas depende de la exactitud y precisión inherentes de la
valoración y del uso previsto del valor de informe. Resulta práctico mejorar la precisión de un valor de informe al informar la
potencia media geométrica de múltiples valoraciones. El número de valoraciones usado se determina mediante la relación en-
tre la precisión requerida para el uso previsto y la precisión inherente del sistema de valoración.
Corrida-Se refiere a la realización del procedimiento analítico con el que se espera obtener precisión y veracidad uniformes;
generalmente, es la valoración, es decir, el trabajo que puede llevar a cabo un solo analista en un tiempo establecido con un
conjunto determinado único de factores de valoración (p.ej., preparaciones estándar).
Notas: 1. La corrida no necesariamente está relacionada con el conjunto de datos de la valoracion (q.v.). El término corrida
es específico para laboratorio y se relaciona con la capacidad física y el ambiente del laboratorio para realizar el trabajo de una
valoración. Un ejemplo de corrida sería la valoración simultánea de varias muestras por parte de un analista en un día de traba-
jo práctico. Durante el transcurso de una sola corrida, puede ser posible determinar múltiples valores de informe. Por el contra-
rio, un solo valor de informe puede incluir datos de múltiples corridas. 2. Desde un punto de vista estadístico, una corrida es la
consecución de los factores asociados con la precisión intermedia (q.v.). Por tanto, la variabilidad dentro de la corrida es la
repetibilidad. Se considera una buena práctica asociar las corridas con factores que representen fuentes significativas de varia-
ción en la valoración. Por ejemplo, si un número de pasajes celulares es una fuente importante de variación en la respuesta
obtenida de la valoración, entonces cada cambio en el número de pasajes celulares dará inicio a una nueva corrida. Si la va-
rianza asociada con todos los factores que se pudieran asignar a las corridas fuera inapreciable, entonces se podría ignorar la
influencia de las corridas en el análisis y el análisis se podría enfocar en combinar conjuntos de datos de análisis independien-
tes. 3. Cuando una corrida incluye múltiples valoraciones, es necesario tomar precauciones con respecto a la independencia de
los resultados de las valoraciones. Los factores que por lo general se asocian a corridas y que pueden generar una falta de inde-
pendencia incluyen preparaciones celulares, grupos de animales, analista, día, una preparac1on de un rnaterial de referencia
común y análisis con otros datos de la misma corrida. Aunque se puede infringir un estricto sentido de independencia debido
a que los conjuntos de valoraciones dentro de una corrida comparten ciertos elementos, el grado en el que se compromete la
independencia puede tener una influencia insignificante sobre los valores de informe obtenidos, lo cual se debe verificar y mo-
nitorear.
696 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

Preparaciones similares-Se refiere a la propiedad que indica que la Prueba y el Estándar contienen el mismo componente
efectivo, o los mismos componentes efectivos en proporciones fijas, y todos los demás componentes no tienen efecto en algún
contexto específico de la valoración.
Notas: 1. Contar con preparaciones similares a menudo se resume como la propiedad que indica que la Prueba se comporta
como una dilución (o concentración) del Estándar. 2. Las preparaciones similares son fundamentales en los métodos para la
determinación de la potencia relativa. El uso de preparaciones similares permite calcular, informar e interpretar una potencia
relativa. Ante la ausencia de preparaciones similares, no se puede informar ni interpretar una potencia relativa significativa. 3.
La consecuencia práctica de preparaciones similares es la similitud algebraica (q.v.). (Ver también Paralelismo, sección V.)
Similitud (algebraica)-Las curvas de concentración-respuesta de la Prueba y el Estándar se relacionan algebraicamente de
manera constante con preparaciones similares.
Notas: 1. Entre los ejemplos de similitud se incluyen el paralelismo (q.v.) de las curvas de concentración-respuesta y la igual-
dad de las ordenadas al origen en los modelos de cociente de pendientes. 2. El no poder demostrar estadísticamente la falta
de similitud entre una Referencia y una Prueba no se considera una demostración de similitud. Resulta apropiado demostrar la
similitud en un enfoque de equivalencia; ver los capítulos (1032) y (1034). 3. La similitud es por lo regular un criterio de apti-
tud de la muestra (q.v.). No obstante, se debe tomar en cuenta que la aptitud es una condición necesaria, pero no suficiente,
para que las preparaciones sean similares. En la práctica, ante el desconocimiento de las diferencias entre los materiales de
Prueba y Estándar, la demostración de similitud se acepta como la demostración de preparaciones similares.

11. Términos Relacionados con la Realización de una Valoración Biológica

Configuración de la valoración biológica (también conocido como formato de la valoración)-Estrategia de replicación
dentro de la corrida y entre corridas para la replicación de los conjuntos de datos de la valoración que se han determinado por
análisis de varianza para sustentar el uso de las valoraciones biológicas.
Notas: 1. Las modificaciones al formato de la valoración biológica pueden ocurrir a medida que se dispone de nueva infor-
mación sobre las fuentes de variabilidad. Dichas modificaciones no incluyen cambios en el esquema de dilución de las mues-
tras de Prueba o del Estándar ni en la estrategia de replicación (parte de lo que en ocasiones se denomina configuración de la
valoración biológica). La configuración de la valoración puede incluir dimensiones anidadas tales como diseño de la placa,
múltiples placas por día, placas individuales en múltiples días, entre otros. 2. La potencia relativa geométrica media determina-
da a partir del formato de la valoración biológica es el valor de informe, el cual se puede usar para evaluar el cumplimiento con
las especificaciones o como un componente de análisis subsiguiente (p.ej., evaluación de la estabilidad).
Fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés)-Se refiere a la propiedad de un valor de informe que cae fuera de
su criterio de aceptación especificado.
Nota: El término fuera de la especificación no es una propiedad de la valoración biológica, sino de las muestras de Prueba. El
término se introduce en el capítulo (1033) junto con el establecimiento de los criterios de aceptación para la validación que
limitan el riesgo de producir resultados de prueba fuera de la especificación debido a las características de desempeño de la
valoración biológica.
Aptitud de la muestra-Una muestra es apta (se puede usar en la estimación de potencia) si su curva de respuesta cumple
con los límites sobre propiedades críticas definidas en el procedimiento de la valoración.
Nota: Las propiedades de la curva de respuesta se deben considerar desde un punto de vista general, es decir, incluyendo
valores aberrantes y variabilidad. La más significativa de estas propiedades para las valoraciones biológicas es la similitud (q.v.)
con la curva de respuesta del estándar. Asimismo, todos los sistemas de valoración tienen límites para el intervalo de valores
sobre los que pueden informar. En el caso de muestras que no cumple con uno o más de los criterios de aptitud de la muestra
en una valoración biológica, no se debe usar la estimación de potencia obtenida de dichas muestras como un valor de informe
o como un contribuidor para un valor de informe. Para más información consultar también el término sesgo por truncado en
este Glosario, así como las secciones Aptitud de la Muestra e Intervalo en el capítulo general (1032).
Aptitud del sistema-Un sistema de valoración es adecuado para su uso previsto si es capaz de proveer mediciones legítimas
conforme a lo definido en el protocolo de la valoración.
Nota: La aptitud del sistema se puede considerar como la evaluación de la posibilidad de que exista evidencia acerca de un
problema en el sistema de valoración. Un ejemplo serían controles positivos y negativos cuando los valores fuera de sus inter-
valos normales sugieren qué sistema de valoración no trabaja adecuadamente.

111. Términos Relacionados con la Precisión y la Exactitud

Exactitud (1225)-Expresión de la proximidad entre los resultados de prueba obtenidos por el procedimiento y el valor real.
Notas: 1. La ICH y la USP ofrecen la misma definición de exactitud. No obstante, la ISO específicamente considera que la
exactitud tiene dos componentes, el sesgo y la precisión. 3 Esto significa que, para lograr la exactitud conforme a ISO, una me-
dición debe estar dentro de la diana (tener poco sesgo) y ser precisa. Por el contrario, la pauta Q2(Rl) de la ICH indica que la
exactitud, en ocasiones, se denomina "veracidad", aunque no define dicho término. La ISO define veracidad como "la proximi-

3 ISO. Norma Internacional 5725-1. Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and Results-Part 1: General Principies and Definitions. Geneva,
Switzerland; 1994.
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dad de acuerdo entre el valor promedio obtenido a partir de una serie grande de resultados de prueba y un valor de referencia
aceptado" e indica que "la veracidad, por lo general, se expresa en términos de sesgo". La pauta Guidance on Bioanalytical
Method Validation del año 2001 de la FDA 4 define el término exactitud en términos de la "proximidad de los resultados de
prueba medios, obtenidos por el método, con el valor verdadero (concentración) del analito" (énfasis agregado) y es, por lo
tanto, uniforme con el uso de la ICH. Este glosario adopta el enfoque de USP/ICH. Por tanto, exactitud se define como el acuer-
do entre la media (o los resultados esperados) de una valoración y el valor verdadero, y emplea la frase exacto y preciso para
indicar un sesgo bajo (exacto) y una variabilidad baja (preciso). 2. Se recomienda tomar precauciones considerables durante la
lectura o uso del término exactitud. Además de la falta de uniformidad entre la USP/ICH y la ISO, el uso común también es
poco uniforme. 3. Para propósitos de validación de una valoración biológica, los términos exactitud y sesgo han sido reempla-
zados con exactitud relativa y sesgo relativo.
Tipos de errores-Dos fuentes de incertidumbre que afectan los resultados de una valoración biológica son el error sistemáti-
co y el error aleatorio.
Un error sistemático es aquél que se presenta repetidamente con una magnitud similar y dirección uniforme. Éste intro-
duce un sesgo en la determinación. El diseño experimental efectivo, que incluye aleatorización y/o división en bloques,
puede reducir el error sistemático.
Un error aleatorio es aquél cuya magnitud y dirección varían sin un patrón. El error aleatorio es una variabilidad o incerti-
dumbre inherente de la determinación. La conversión de error sistemático a aleatorio, a través del diseño experimental o
la aleatorización, incrementa la robustez de una valoración biológica y permite un análisis comparativamente simple de
los datos de la valoración, aunque puede requerir un tamaño de muestra mayor.
Variabilidad del formato-Se refiere a la variabilidad prevista para un formato de valoración biológica particular.
Coeficiente geométrico de variación-Determinado como antilog(S)-1, donde Ses la desviación estándar determinada en la
escala logarítmica.
Nota: El coeficiente geométrico de variación a menudo se informa como un porcentaje (%GCV, por sus siglas en inglés). Es
importante no confundir el %GCV con el %CV. El %GCV es una medición de dispersión pertinente a los datos analizados en la
escala [Y= log(X)] transformada logarítmicamente, mientras que el %CV es una medición pertinente a los datos analizados en
la escala (X) original.
Desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés)-Se refiere a la variabilidad de los valores transformados en
logaritmos de una respuesta logarítmica normal expresada como porcentaje en la escala sin transformar. Se determina como
antilog(S), donde Ses la desviación estándar determinada en la escala logarítmica.
Nota: Por ejemplo, si la desviación estándar de la potencia logarítmica es S usando logaritmo en base 2, la GSD de la poten-
cia es 1 00 * 2s.
Precisión intermedia (adaptado del capítulo (1225))-Expresa la precisión dentro del laboratorio relacionada con los cam-
bios en las condiciones operativas.
Notas: 1. Los factores que contribuyen a la precisión intermedia implican cualquier aspecto que pudiera cambiar dentro de
un laboratorio dado y que podrían afectar la valoración, e incluyen días distintos, analistas distintos, equipo distinto, entre
otros. Por consiguiente, la precisión intermedia tiene un alcance "intermedio" entre los extremos de repetibilidad (dentro de la
valoración) y reproducibilidad (entre laboratorios). 2. Cualquier declaración de precisión intermedia debe identificar los facto-
res variables. Por ejemplo, "La precisión intermedia asociada con los cambios de equipo y operador es .... " 3. Asimismo, podría
ser valioso identificar por separado la precisión asociada con cada fuente (p.ej., precisión entre analistas). Esto puede formar
parte del desarrollo y la validación de la valoración cuando tiene algún valor identificar aquellos factores que contribuyen de
manera importante a la precisión intermedia. 4. Cuando se informa la precisión intermedia, en particular para fuentes indivi-
duales, los analistas deben tener cuidado de distinguir entre la varianza de la precisión intermedia y los componentes de dicha
varianza. La varianza de la precisión intermedia incluye la repetibilidad y, por lo tanto, debe ser necesariamente al menos tan
grande como la varianza de repetibilidad. Un componente de la varianza, p.ej., para el analista, también forma parte de la va-
rianza de la precisión intermedia para el analista, pero puede ser insignificante y quizás no requiera tener una magnitud mayor
que la varianza de repetibilidad.
Precisión ((1225))-Medición del grado de concordancia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimien-
to se aplica repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea.
Notas: 1. La precisión se puede considerar en tres niveles: repetibilidad (q.v.), precisión intermedia (q.v.) y reproducibilidad
(q.v.). 2. La precisión se debe investigar usando muestras auténticas y homogéneas. No obstante, si no es posible obtener una
muestra homogénea, la precisión puede investigarse usando muestras con cantidades agregadas conocidas que simulen una
muestra o solución muestra verdaderas. 3. La precisión a menudo se expresa como la varianza, desviación estándar, coeficiente
de variación o coeficiente de variación geométrica.
Sesgo relativo-Medición del grado de diferencia entre el valor esperado (o medio) y el valor verdadero, expresado como
porcentaje del valor verdadero.
Repetibilidad ((1225))-Se refiere a la expresión de la precisión dentro de un laboratorio en las mismas condiciones operati-
vas durante un intervalo corto de tiempo.

4FDA. Guidance far lndustry. Bioanalytical Method Validation. May 2001 http://www.fda.gov1downloads;Drugs/Gu1cianceCompliamcReguldtoryl11for1nallon/
Guidances/UCM070107.pdf. Consultada el 7 de diciembee de 2011.
698 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

Notas: 1. La pauta ICH Q2A indica que la repetibilidad también recibe el nombre de precisión "intravaloración". En el con-
texto de la valoración biológica, el mejor término es intra corrida, mientras que un "intervalo corto de tiempo" se usa para
describir dentro de la corrida. 2. La idea de un "intervalo corto de tiempo" puede ser problemática con las valoraciones biológi-
cas. Si una corrida toma varias semanas y consta de un solo conjunto de valoraciones, entonces no sería posible determinar la
precisión intracorrida. Alternativamente, si una corrida consta de dos conjuntos de datos de las valoraciones y se puede llevar a
cabo en un solo día, sería posible evaluar la repetibilidad de la determinación de la potencia relativa.
Reproducibilidad (1225)-Expresa la precisión entre laboratorios.
Notas: 1. La reproducibilidad incluye contribuciones derivadas de la repetibilidad y de todos los factores que contribuyen a
la precisión intermedia, así como cualquier contribución adicional de las diferencias entre laboratorios. 2. La reproducibilidad
se aplica a estudios en colaboración, tales como aquéllos realizados para estandarización o portabilidad de la metodología. De-
pendiendo del diseño del estudio en colaboración, puede ser posible describir por separado los componentes de la varianza
asociados con las fuentes de variabilidad intra y entre laboratorios.
Especificidad (1225)-Se refiere a la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de aquellos compo-
nentes cuya presencia resulta previsible.
Notas: 1. Por lo general, estos componentes pueden incluir impurezas, productos de degradación, componentes de la ma-
triz, entre otros. Ver el capítulo (1225) para más información. 2. Esta definición también se relaciona con la selectividad en
otras pautas para métodos analíticos. 3. La especificidad puede significar la medición del analito específico de interés y no la
de otro analito similar.
Sesgo por truncado-Se refiere al sesgo que ocurre cuando no se observa o registra alguna porción de la distribución de las
respuestas.
Notas: 1. Cuando existe sesgo por truncado, la distribución de observaciones registradas no se corresponde con la distribu-
ción real de respuestas. 2. El sesgo por truncado puede ocurrir en una valoración biológica que no informa estimaciones de
potencia logarítmica fuera de un intervalo de potencia establecido. Por ejemplo, se espera que una muestra con una potencia
real en un límite de este intervalo no produzca (informe) una estimación de potencia en aproximadamente la mitad de las
valoraciones en las que aparece. En este ejemplo, la media de las potencias observadas estará sesgada hacia la potencia logarít-
mica O.

IV. Términos Relacionados con la Validación

Linealidad de las diluciones (adaptado del capítulo (1225))-Se refiere a la capacidad (dentro de un intervalo determinado)
de una valoración biológica para obtener potencias relativas medidas que sean directamente proporcionales a la potencia rela-
tiva verdadera de la muestra.
Notas: 1. Para determinar la linealidad de las diluciones, en ocasiones denominada linealidad analítica de la valoración bioló-
gica, a través de un intervalo conocido de valores de potencia relativa, los analistas examinan la relación entre la potencia loga-
rítmica conocida y la potencia logarítmica media observada. Si dicha relación genera una línea esencialmente recta con una
ordenada al origen de O y una pendiente de 1, la valoración tiene una proporcionalidad directa. Si la gráfica genera una línea
esencialmente recta pero la ordenada al origen no es O o la pendiente no es 1, la valoración tiene una respuesta lineal propor-
cional. 2. Evaluar si una pendiente es (cercana a) 1,0 requiere una equivalencia o intervalo de indiferencia a priori. Resulta ina-
decuado en la práctica estadística analizar la hipótesis nula que indica que la pendiente es 1,0 contra la alternativa que indica
que no es 1,0 y concluir que una pendiente es 1,0 si esto no se rechaza. La linealidad analítica de la valoración biológica se
separa de la consideración de la forma de la curva de concentración-respuesta. La linealidad de la concentración-respuesta no
es un requisito de la linealidad analítica de la valoración biológica debido a que ésta última es posible independientemente de
la forma de la curva de concentración-respuesta. 3. La linealidad de las diluciones se trata en mayor detalle en el capítulo
(1033).
Límite de cuantificación (límite inferior de cuantificación; adaptado del capítulo (1225))-Se refiere a la potencia relativa
conocida más baja para la que la valoración tiene una precisión y exactitud adecuadas.
Notas: 1. Esto se aplica a los resultados de valoración (potencia logarítmica) en lugar del valor de informe. 2. No es común
determinar el límite de cuantificación para las valoraciones biológicas de potencia relativa. Las valoraciones realizadas en ani-
males con puntos finales de determinación serológicos son ejemplos de uso de este término.
Intervalo (adaptado del capítulo (1225))-EI intervalo entre las potencias relativas conocidas superior e inferior (incluyendo
aquellas potencias relativas) por el que se demuestra que la valoración biológica tiene un nivel adecuado de precisión, exacti-
tud y linealidad analítica.
Nota: Esto se aplica a valores de informe (típicamente una media geométrica) en lugar de los resultados individuales de la
valoración.
Robustez (adaptado del capítulo (1225))-Se refiere a una medida de la capacidad de un procedimiento analítico para man-
tenerse intacto ante variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método listados en la documentación del
procedimiento.
Notas: 1. La robustez es una indicación de la confiabilidad de la valoración biológica durante el uso normal. Por ejemplo, un
sistema de valoración de cultivo celular que es robusto para el número de pasajes de células puede proveer valores de potencia
con exactitud y precisión aceptables en todo un intervalo uniforme de números de pasajes. 2. La norma Q2(R1) de la ICH
indica que:
USP 37 Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 699

La evaluación de robustez se debe considerar durante la fase de desarrollo y depende del tipo de procedimiento que se
está estudiando. Ésta debe mostrar la confiabilidad de un análisis con respecto a las variaciones deliberadas en los paráme-
tros del método. Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones analíticas, éstas últimas se deben contro-
lar adecuadamente o se debe incluir una declaración precautoria en el procedimiento. Una consecuencia de la evaluación
de la robustez deberá ser que se establezca una serie de parámetros [q.v.] de aptitud del sistema (p.ej., prueba de resolu-
ción) para asegurar que la validez del procedimiento analítico se mantiene cada vez que se usa. 1
Validación de la valoración-Proceso mediante el cual se demuestra y documenta que las características de desempeño del
procedimiento y su método subyacente cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que la valoración es, por tanto,
adecuada para su uso previsto.
Nota: Las validaciones formales se realizan prospectivamente de acuerdo con un plan escrito que incluye criterios de acepta-
ción justificables sobre los parámetros de validación. Ver el capítulo (1033).

V. Términos Relacionados con el Diseño y Análisis Estadístico

Análisis de varianza (ANOVA)-Herramienta estadística usada para evaluar la contribución de factores experimentales en la
variabilidad.
Distribución en bloques-Agrupación de unidades experimentales relacionadas en diseños experimentales.
Notas: 1. La distribución en bloques a menudo se usa para reducir la variabilidad relacionada con un factor que no es de
interés primario. 2. Los bloques pueden consistir, por ejemplo, en grupos de animales (una jaula, una camada o un cargamen-
to), placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas enteras de 96 pocilllos agrupadas por analis-
ta, día o partida de células. 3. El objetivo es aislar, mediante diseño y análisis estadístico, un efecto sistémico, por ejemplo una
jaula, de modo que no obstruya las comparaciones de interés.
En un diseño completo por bloques todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valoración biológica, los facto-
res de tratamiento primario son la muestra y la concentración) se pueden aplicar a las unidades experimentales para dicho
factor dentro de un solo bloque. Se debe tomar en cuenta que los dos factores de tratamiento muestra y concentración
pueden tener unidades experimentales diferentes. Por ejemplo, si a todos los animales dentro de una jaula se les asigna la
misma concentración, pero se les asignan muestras únicas, entonces la unidad experimental para concentración es la jaula
y la unidad experimental para la muestra es el animal; la jaula es un factor de división en bloque para la muestra.
En un diseño en bloques incompleto el número de niveles de un factor de tratamiento excede el número de unidades
experimentales para dicho factor dentro del bloque.
Intervalo de confianza-Se refiere a un intervalo aleatorio producido por un método estadístico que contiene un valor para-
metral verdadero (fijo pero desconocido) con un nivel de confianza declarado en una aplicación repetida del método estadísti-
co.
Nota: Ver el capítulo (101 O) para más información.
Cruzado (y parcialmente cruzado)-Se dice que dos factores están cruzados (o completamente cruzados) si cada nivel de
cada factor aparece con cada nivel del otro factor. Dos factores están parcialmente cruzados cuando no están completamente
cruzados, pero múltiples niveles de un factor aparecen con un nivel común del otro factor.
Notas: 1. Por ejemplo, en una valoración biológica en la que todas las muestras aparecen en todas las diluciones, las mues-
tras y las diluciones están (completamente) cruzadas. En un experimento de validación de valoración biológica en el que dos
de cuatro analistas llevan cada uno a cabo valoraciones con el mismo conjunto de muestras durante cada uno de seis días y se
usa un par diferente de analistas en cada día, los analistas están parcialmente cruzados con los días. 2. Cada factor se puede
aplicar a diferentes unidades experimentales, y los factores pueden ser totalmente cruzados y anidados (q.v.), lo que genera un
diseño de unidad dividida o de gráfica dividida (q.v.). 3. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con factores que
están parcialmente cruzados para llevar a cabo análisis adecuados. 4. Un diseño en bloques completo aleatorizado (q.v.) es un
diseño en el que un factor de bloque (que a menudo se trata como un factor aleatorio) se cruza con el factor de tratamiento
(que a menudo se trata como un efecto fijo).
Diseño de experimentos (DOE, por sus siglas en inglés) [ICH Q8(R2)]5-Método estructurado y organizado para determi-
nar la relación entre factores que afectan un proceso y el resultado de dicho proceso.
Nota: El DOE se usa en el desarrollo de valoraciones biológicas y en la validación; ver los capítulos (1032) y (1033).
Prueba de equivalencia-Se refiere a una prueba para demostrar la equivalencia (p.ej., similitud o cumplimiento con los crite-
rios de aceptación de la validación) de dos cantidades mediante el cumplimiento de un criterio de aceptación para un interva-
lo.
Notas: 1. Una prueba de equivalencia difiere de las pruebas estadísticas más comunes en la naturaleza de las hipótesis esta-
dísticas. La mayoría de las pruebas estadísticas comunes son pruebas de diferencia-es decir, la hipótesis nula estadística es la
ausencia de diferencias y la alternativa es que existe alguna diferencia, sin importar la magnitud o la importancia de la misma.
La diferencia puede estar entre una característica de dos poblaciones o entre una característica de una sola población y un
valor aceptado. En el análisis de equivalencia, la hipótesis nula es que la diferencia no es lo suficientemente pequeña, y la hipó-
tesis alternativa es que la diferencia es lo suficientemente pequeña para que no exista diferencia importante. En una prueba de

5 ICH. Guidance Q8(R2) Pharmaceutical Development. November 2009. Disponible en http://www.fda.gov/downloads/Drugs/

GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM073507.pdf. Consultado el 27 de diciembre de 2011.
700 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

diferencia estadística común, se puede concluir que no existen pruebas suficientes para establecer el incumplimiento con un
criterio de aceptación. Éste puede ser el resultado de un exceso de variabilidad y/o un diseño inadecuado. En una prueba de
equivalencia, se concluye que los datos cumplen con el criterio de aceptación (p.ej., las pendientes son paralelas). 2. El proce-
dimiento de pruebas doblemente unilaterales (TOST, por sus siglas en inglés) es un procedimiento estadístico común usado
para las pruebas de equivalencia. 3. El criterio de aceptación para el intervalo puede ser unilateral o bilateral. Un ejemplo de
intervalo unilateral es un criterio de aceptación de validación para una %GCV de no más de XX%.
Cuadrado medio esperado-Expresión matemática de las varianzas estimadas mediante un ANOVA de cuadrados medios.
Diseño experimental-Se refiere a la estructura de asignación de tratamientos a unidades experimentales.
Notas: 1. La distribución en bloques (q.v.), la aleatorización (q.v.), la replicación (q.v.) y la selección específica del diseño
(ver el capítulo (l 032)) son algunos aspectos del diseño experimental. 2. Los componentes importantes del diseño experimen-
tal incluyen el número de muestras, el número de concentraciones y la forma en que se asignan las muestras y concentracio-
nes a unidades experimentales y su agrupación en bloques. 3. El diseño experimental influye en la selección de la metodología
estadística que se debe usar para lograr el objetivo analítico.
Unidad experimental-Se refiere a la unidad más pequeña a la que se asigna aleatoriamente un nivel de tratamiento distinto.
Notas: 1. La asignación aleatoria de los factores de tratamiento a unidades experimentales es esencial en las valoraciones
biológicas. 2. Los factores de tratamiento diferentes se pueden aplicar a unidades experimentales distintas. Por ejemplo, las
muestras se pueden asignar a las filas en una placa de 96 pocillos, y las diluciones se pueden asignar a las columnas de la placa.
En este caso, las hileras son las unidades experimentales para las muestras, las columnas son las unidades experimentales para
las concentraciones y los pocillos son las unidades experimentales para la interacción entre muestra y concentración. 3. Una
unidad experimental debe distinguirse de una unidad de muestreo, en cuya unidad más pequeña se registra una medición
distinta (p.ej., un pocillo). Debido a que la unidad de muestreo es a menudo más pequeña que la unidad experimental, tratar
unidades de muestreo como si fueran unidades experimentales es un error fácil de cometer. Este error se demonina pseudo-
repiicación (q.v.).
Factor-Parámetro de la valoración o elemento operativo que puede afectar la respuesta de la misma y que varía en un experi-
mento y entre experimentos.
Nota: En una valoración biológica, habrá por lo menos dos factores de tratamiento: muestra y concentración.
Un factor fijo (efecto fijo) es un factor que se controla y establece deliberadamente a niveles específicos en una valora-
ción biológica. Se realiza inferencia en los niveles usados en el experimento o en los niveles intermedios. En una valora-
ción biológica, la muestra y la concentración son ejemplos de factores fijos.
Un factor aleatorio (efecto aleatorio) es aquél que por lo general no puede ser controlado y cuyos niveles representan
una demostración de las formas en que dicho factor puede variar. En una valoración biológica, los organismos de prueba,
la placa y el día a menudo se consideran factores aleatorios. Tratar un factor como aleatorio o fijo dependerá del experi-
mento y de las preguntas formuladas.
Diseño factorial-Se refiere al diseño experimental en el que se encuentran múltiples factores, los cuales están parcial o total-
mente cruzados.
En un diseño factorial completo, cada nivel de un factor se presenta con cada combinación de niveles de todos los de-
más factores. Por ejemplo, si los factores son la partida de reactivo y el tiempo de incubación, para un diseño factorial
completo, se deben incluir todas las combinaciones de tiempo de incubación y partida de reactivo.
Un diseño factorial fraccionado es un diseño reducido en el que cada nivel de un factor aparece únicamente con un
subconjunto de combinaciones de niveles de todos los demás factores, y algunos efectos de factores (efectos y/o interac-
ciones principales) se confunden deliberadamente con otras combinaciones de efectos de factores. Se debe prestar espe-
cial cuidado al considerar los diseños factoriales fraccionados para propósitos de detección y optimización. Se considera
que este diseño no presenta riesgos de perder información para la validación.
Modelo lineal general-Modelo estadístico lineal que relaciona factores de estudio, que pueden ser continuos o discretos,
con respuestas experimentales.
Independencia-Para que dos mediciones u observaciones A y B (datos brutos, conjuntos de valoraciones o potencias relati-
vas) sean independientes, los valores de A no deben verse afectados por las respuestas de By viceversa.
Nota: Una consecuencia de no reconocer la falta de independencia es la caracterización deficiente de la varianza. En la prác-
tica, esto significa que si dos mediciones de potencia o de potencia relativa comparten un factor común que podría influenciar
el resultado de la valoración (p.ej., un analista, preparación celular, incubadora, grupo de animales o alícuota de Muestras es-
tándar) entonces la suposición inicial correcta es que estas mediciones de potencia relativa no son independientes. Lo mismo
sucede con la falta de independencia cuando se estiman en conjunto dos mediciones de potencia o de potencia relativa a par-
tir del mismo modelo, o si se relacionan de alguna manera sin incluir en el modelo algún término que capture el hecho de que
hay dos o más mediciones de potencia. A medida que se gana experiencia en las valoraciones, se puede establecer (y monito-
rear) un fundamento empírico razonable para tratar las mediciones de potencia como independientes incluso si comparten un
nivel común de un factor. Este es el caso cuando se ha demostrado que un factor prácticamente no tiene efecto significativo
en los resultados a largo plazo de la valoración biológica.
Interacción-Se dice que dos factores interactúan cuando la respuesta de un factor depende del nivel del otro.
Nivel-Se refiere a la ubicación en la escala de medición de un factor.
Notas: 1. Los factores tienen dos o más niveles distintos. Por ejemplo, si un experimento de validación de valoración biológi-
ca emplea tres valores de tiempo de incubación y dos partidas de un reactivo clave, los niveles son las tres veces para el factor
USP 37 Información General/ (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas 701

tiempo de incubación y las dos partidas para el factor partida. 2. Los niveles de un factor en una valoración biológica pueden ser
cuantitativos, tales como concentración, o categóricos, tales como muestra (es decir, de prueba y de referencia).
Distribución logarítmica normal-Distribución de valores (respuestas o potencias de la valoración) en las que los logaritmos
de los valores tienen una distribución normal.
Notas: 1. La mayoría de las mediciones en la valoración biológica de potencia relativa presentan una distribución logarítmica
normal. 2. La distribución logarítmica normal es una distribución sesgada que se caracteriza por un incremento en la variabili-
dad con un aumento en el nivel de respuesta.
Cuadrado medio-Cálculo dentro del ANOVA que representa la variabilidad asociada con un factor experimental.
Modelo de efectos mixtos-Modelo estadístico que incluye efectos fijos y aleatorios.
Generación de modelos estadísticos-Especificación matemática de la relación entre ingresos (Xs) y salidas (Ys) de un proce-
so, p.ej., la relación concentración-respuesta en la valoración biológica o la generación de un modelo de los efectos de fuentes
importantes de variación en la medición de potencia.
Notas: 1. La generación de modelos incluye métodos para capturar la dependencia que tiene la respuesta de las muestras, la
concentración, unidades experimentales y los grupos o distribución de factores en bloques en la configuración de la valora-
ción. 2. La generación de modelo para datos de la valoración biológica requiere tomar una gran cantidad de decisiones, algu-
nas de las cuales se basan en el diseño de la valoración y en los datos. Para datos continuos, se puede seleccionar entre mode-
los lineales o no lineales. Para datos discretos, se puede seleccionar entre modelos logit/log dentro de una familia más grande
de modelos lineales generalizados. Existe literatura enfocada en la limitación de valoraciones con diluciones en la que se aboga
por los modelos de Poisson y los modelos de binomios en cadena de Markov. Para los datos de la valoración biológica, se
pueden usar modelos de efectos fijos o modelos de efectos mixtos. Por un lado, existe una mayor disponibilidad de software
para modelos de efectos fijos cuya configuración es menos exigente para los estadísticos. Por otra parte, los modelos mixtos
tienen algunas ventajas sobre los fijos: se acomodan más a los datos faltantes y, lo más importante, pueden permitir que cada
bloque tenga distintas pendientes, asíntotas, concentraciones medias efectivas, requeridas para inducir un efecto del 50%
(EC 50 ) o potencias relativas. En particular, cuando el analista emplea modelos de líneas rectas ajustados a respuestas no lineales
o en sistemas de valoración en los que la curva de concentración-respuesta varía entre bloques, el modelo mixto captura el
comportamiento del sistema de valoración de manera más realista e interpretable. 3. Resulta esencial que cualquier metodolo-
gía para la generación de modelo para datos de la valoración biológica utilice todos los datos disponibles de manera simultá-
nea para estimar la variación (o, en un modelo mixto, cada una de varias fuentes de variación). Puede ser necesario transfor-
mar las observaciones antes de generar el modelo; incluir un modelo de varianza; o ajustar un modelo de medias (en el que
existe un efecto previsto para cada combinación de muestra y concentración) para obtener estimaciones combinadas de varia-
ción.
Anidado-Se dice que un factor A está anidado dentro de otro factor B si los niveles de A son diferentes para cada nivel de B.
Notas: 1. Por ejemplo, en un experimento de validación de valoración biológica, dos analistas pueden cada uno llevar a cabo
valoraciones en cinco días. Si los días naturales para el primer analista son distintos de los del segundo analista, los días están
anidados dentro del analista. 2. Los factores anidados tienen una relación jerárquica. 3. Para que dos factores estén anidados,
deben cumplir con lo siguiente: a) aplicarse a unidades experimentales de diferentes tamaños; b) la unidad experimental más
grande contiene más de una de las unidades experimentales más pequeñas; y c) el factor aplicado a la unidad experimental
más pequeña no está totalmente cruzado (q.v.) con el factor aplicado a la unidad experimental más grande. Cuando se cum-
plen las condiciones (a) y (b), y los factores están parcialmente cruzados, entonces el experimento está parcialmente cruzado y
parcialmente anidado. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con esta estructura para llevar a cabo análisis ade-
cuados.
Paralelismo (de las curvas de concentración-respuesta)-Cualidad en la que las curvas de concentración-respuesta de la
muestra de Prueba y del Estándar de Referencia son idénticas en forma y presentan únicamente una diferencia horizontal que
es una función constante de la potencia relativa.
Notas: 1. Cuando las preparaciones de Prueba y de Referencia son similares (q.v.) y las respuestas de la valoración se grafican
en función de los logaritmos de las concentraciones, la curva resultante para la preparación de Prueba será la misma que para
el Estándar pero desviada horizontalmente por una cantidad que es el logaritmo de la potencia relativa. Debido a esta relación,
la similitud (q.v.) a menudo se equipara con paralelismo, pero son conceptos distintos. Ver la sección 3.5, Modelos de Concen-
tración-Respuesta de Cociente de Pendientes, del capítulo (1034), en los que las muestras con relaciones similares de concentra-
ción-respuesta tienen una ordenada al origen común (o casi común) pero pueden diferir en sus pendientes. 2. En la práctica,
no es posible demostrar que las formas de dos curvas sean idénticas. En lugar de esto, las dos curvas demuestran tener una
forma algebraica los suficientemente similar (equivalente). Se debe tomar en cuenta que similar debe interpretarse como "se
cuenta con evidencia de que las dos curvas son lo suficientemente cercanas en forma" en lugar de "no se cuenta con evidencia
de que las dos curvas sean diferentes en forma". 3. La evaluación de paralelismo depende del tipo de función usada para ajus-
tar la curva de respuesta. El paralelismo para una valoración no lineal que usa un ajuste logístico de cuatro parámetros significa
que (a) las pendientes de las curvas de la Prueba y del Estándar de Referencia que cambian rápidamente (es decir, la pendiente
de la tangente con la curva, donde la primera derivada es un máximo) deben ser similares; y (b) las asíntotas superior e inferior
de las curvas de la respuesta (mesetas) deben ser similares. Para análisis de líneas rectas, las pendientes de las líneas deben ser
similares.
Estimación puntual-Estimación de un valor individual obtenida a partir de cálculos estadísticos.
702 (1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

Notas: 1. Los ejemplos son el sesgo relativo promedio, la %CVG y la potencia relativa. 2. La estimación puntual puede ser
más relevante con una estimación de intervalo (intervalo de confianza; q.v.) que emplea un intervalo para expresar la incerti-
dumbre en la determinación de la estimación puntual.
Determinaciones pseudo-repetidas-Se refiere a la identificación incorrecta de muestras obtenidas a partir de unidades ex-
perimentales como independientes y, por tanto, como determinaciones repetidas verdaderas cuando en realidad no son inde-
pendientes.
Notas: Las determinaciones pseudo-repetidas resultan en inferencias erróneas debido a la asignación incorrecta de variabili-
dad y a la aparición de un número de determinaciones repetidas aparentemente mayor al real. 2. El no reconocer las determi-
naciones pseudo-repetidas es peligroso puesto que se trata de un error fácil de cometer y sus consecuencias pueden ser serias.
Por ejemplo, las determinaciones pseudo-repetidas comúnmente surgen cuando los analistas realizan una serie de diluciones
para cada muestra en tubos (la serie de diluciones se puede realizar mediante diluciones en serie, mediante diluciones de un
solo punto o mediante cualquier esquema de dilución conveniente). Posteriormente, el analista transfiere cada dilución de ca-
da muestra a varios pocillos en una o más placas de valoración. Por consiguiente, los pocillos son determinaciones pseudo-
repetidas puesto que son simplemente alícuotas de un solo proceso de dilución y por tanto no representan preparaciones in-
dependientes. 3. Una manera simple para analizar datos obtenidos de determinaciones pseudo-repetidas es promediar las de-
terminaciones pseudo-repetidas (si se usa una transformación de los datos observados, ésta debe aplicarse antes de promediar
las determinaciones pseudo-repetidas) antes de ajustar cualquier tipo de modelo de concentración-respuesta. En muchos siste-
mas de valoración, promediar determinaciones pseudo-repetidas dejaría a la valoración sin ninguna determinación repetida.
Una forma más compleja de usar los datos que contienen determinaciones pseudo-repetidas consiste en emplear un modelo
mixto que trate las determinaciones pseudo-repetidas como un efecto aleatorio distinto. Aunque el valor de las determinacio-
nes pseudo-repetidas es generalmente limitado, pueden ser útiles cuando se cumplen dos condiciones: (a) la variación de las
determinaciones pseudo-repetidas (es decir, entre pocillos) es muy grande en comparación con la variación asociada con las
determinaciones repetidas y (b) el costo de las determinaciones pseudo-repetidas es mucho menor que el costo de las unida-
des experimentales repetidas.
Valor P (probabilidad de significancia)-Se refiere a la probabilidad de observar, en ensayos repetidos, que el resultado ex-
perimental es tan o más extremo que el observado si la hipótesis nula fuera verdadera.
Notas: 1. Más extremo significa más lejano a la hipótesis nula. 2. Comúnmente, P< 0,05 se considera un umbral para indicar
las diferencias estadísticamente significativas, aunque se puede usar cualquier valor para el umbral. Las bases para seleccionar
el umbral son los riesgos (costos) de tomar decisiones erróneas; ver error tipo I y error tipo 11.
Aleatorización-Proceso de asignación para tratamiento de unidades experimentales basado en la probabilidad de que todos
los subgrupos de unidades de igual tamaño tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado.
Notas: 1. El mecanismo de probabilidad puede ser un proceso físico sin sesgo (tirar dados sin sesgo, lanzar una moneda,
sacar de una urna bien revuelta), tablas de números aleatorios o números aleatorizados generados por computadora. Se debe
tener cuidado con la selección y uso del método. Resulta una buena práctica utilizar un generador de números aleatorios com-
putarizado validado. 2. El uso de aleatorización puede ayudar a prevenir que el error sistemático se asocie con muestras parti-
culares o con un patrón de dilución y que ocasione sesgo. Por ejemplo, en valoraciones biológicas de 96 pocillos, los efectos de
la placa pueden ser importantes y ocasionar sesgo en respuestas observadas o medidas sumarias. En estudios con animales,
son varios los factores relacionados con animales individuales que pueden influenciar las respuestas. Si no se demuestra de ma-
nera rutinaria que los factores extraños que influencian los estudios que usan placas o los estudios que usan animales han sido
eliminados o minimizados hasta un grado que los convierta en insignificantes, la aleatorización será esencial para obtener da-
tos sin sesgo requeridos para el cálculo de la potencia verdadera. 3. La aleatorización es una buena práctica incluso cuando
existen pruebas de que factores operativos (p.ej., ubicación, tiempo, lote de reactivo) tienen un efecto menor o nulo sobre el
sistema de valoración. Aunque la aleatorización puede no proteger una valoración individual (o quizás un bloque de una valo-
ración) de un factor operativo (quizás recientemente) importante, la aleatorización provee la seguridad de que los resultados
de un conjunto de valoraciones no presentan sesgo debido a factores operativos.
Determinaciones repetidas-Se refiere al proceso en el que múltiples unidades experimentales independientes reciben el mis-
mo nivel de un factor de tratamiento.
Notas: 1. El propósito de las determinaciones repetidas es minimizar los efectos de fuentes de variabilidad aleatoria incontro-
lables. 2. Las determinaciones repetidas pueden ocurrir completamente en bloques aleatorios o en todos los bloques. Por lo
general, las determinaciones repetidas dentro de bloques se denominan pseudo-replicación (q.v.). 3. La determinación repeti-
da de factores que contribuyen en mayor medida a la variabilidad, o factores que están en los niveles más altos en un diseño
anidado, por lo general generan la reducción más efectiva de variabilidad aleatoria.
Determinaciones repetidas verdaderas-Se refiere a las muestras basadas en unidades experimentales independientes.
Error estándar de estimación-Se refiere a una medición de la incertidumbre de una estimación de un valor de informe u
otro parámetro debida a la variación del muestreo
Notas: 1. En las valoraciones biológicas, el enfoque se centra en la precisión (error estándar) de la potencia relativa. 2. Los
errores estándar se pueden minimizar con determinaciones repetidas adicionales. 3. Técnicamente, el error estándar de una
estimación es la desviación estándar de la distribución de muestreo de la estimación. El término error estándar se usa para dis-
tinguir entre este uso de desviación estándar (que depende del tamaño de la muestra) y el uso común en el laboratorio en el
que la desviación estándar (o coeficiente de variación) se usa para caracterizar la precisión de mediciones individuales obteni-
das de un procedimiento. Esta última precisión no depende del tamaño de la muestra.
USP 37 Información General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 703

Control estadístico del proceso-Conjunto de métodos estadísticos empleados para monitorear desviaciones y tendencias en
un proceso.
Error tipo 1-Se refiere al error cometido al juzgar el análisis de los datos, en el cual se acepta la hipótesis alternativa cuando
ésta es falsa.
Nota: La probabilidad de un error tipo 1 por lo general se indica mediante a.
Error tipo 11-Se refiere al error cometido al juzgar el análisis de los datos, en el cual se rechaza la hipótesis alternativa cuando
ésta es verdadera.
Nota: La probabilidad de un error tipo 11 por lo general se indica mediante /J.
Análisis de los componentes de la varianza-Análisis estadístico que separa las contribuciones a la variabilidad total de los
componentes asociados con los factores que influyen en la valoración tales como el analista, el día o el instrumento.

(1031) BIOCOMPATIBILIDAD DE LOS MATERIALES USADOS EN

ENVASES DE MEDICAMENTOS, DISPOSITIVOS MÉDICOS E IMPLANTES

Este capítulo proporciona pautas para la identificación y realización de los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad
de los envases de medicamentos, cierres elastoméricos, dispositivos médicos e implantes. La biocompatibilidad se refiere a la
tendencia de estos productos a mantenerse biológicamente inertes durante todo su período de contacto con el organismo.
Los procedimientos de prueba de biocompatibilidad nombrados en este capítulo están diseñados para detectar las característi-
cas no específicas de reactividad biológica, físicas o químicas de los productos médicos o de los materiales usados en su cons-
trucción. junto con las pruebas químicas, estos procedimientos biológicos se pueden usar para detectar e identificar la toxici-
dad inherente o adquirida de los productos médicos antes o durante su fabricación y procesamiento.
En los siguientes capítulos generales se hace referencia a los procedimientos de prueba preclínicos para evaluar la seguridad
de los elastómeros, plásticos u otros polímeros usados en la elaboración de productos médicos: Inyectables (1 ), Pruebas de
Reactividad Biológica, In Vitro (87), Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88), Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositivos
Médicos Similares (161 ), Tapones Elastoméricos para Inyectables (381) y Envases-Plásticos (661 ). Los procedimientos de prueba
in vitro e in vivo específicos para evaluar la biocompatibilidad de productos médicos en pacientes se describen en Pruebas de
Reactividad Biológica, In Vitro (87) y en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88).
Los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad de un producto médico o de los materiales empleados en su elabora-
ción se han categorizado como un panel de efectos biológicos (procedimientos de toxicidad): citotoxicidad, sensibilización,
irritación o reactividad intracutánea, toxicidad sistémica aguda, toxicidad subcrónica (repetida), genotoxicidad, implantación,
hemocompatibilidad, toxicidad crónica (duración de más de 10% de la expectativa de vida del animal de prueba o mayor de
90 días), carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación. 1 En la Tabla 1 se indican los capítulos
generales de la USP referentes a los procedimientos de toxicidad para estas categorías. Además, la pirogenicidad, un tema de
toxicidad especial, se evalúa en Prueba de Pirógenos (151) y en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Actualmente no existen
capítulos generales que detallen los requisitos 2 de las pruebas de toxicidad subcrónica, genotoxicidad, toxicidad crónica, carci-
nogenicidad, hemotoxicidad, toxicidad reproductiva o biodegradación.

~ Documento ISO 10993-1 :1997 (o versión actualizada) titulado Biological Evaluation of Medica/ Devices-Part 1: Evaluation and Testing.
Ver OECD Guidelines far Testing of Chemicals en www.oecd.org.

Tabla 1. Procedimientos de Determinación de Toxicidad en los Capítulos Generales de la USP

Efecto Biológico Capítulo General de la USP
Citotoxicidad Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87)*
Sensibilización Pruebas de Sensibilización (1184)
Irritación o reactividad intracutánea Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)t
Toxicidad sistémica (toxicidad aguda) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)
Implantación Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)
* Los capítulos generales adicionales que se refieren a este efecto biológico incluyen Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositivos Médicos Similares (161 ),
Tapones Elastoméricos para Inyectables (381) y Envases-Plásticos (661 ).
t Los capítulos generales adicionales que se refieren a este efecto biológico incluyen Inyectables (1 ), Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositivos Médicos
Similares (161 ), Tapones Elastoméricos para Inyectables (381) y Envases-Plásticos (661 ).
704 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados/ Información General USP 37

ENVASES DE MEDICAMENTOS

Biocompatibilidad de los Envases de Plástico y de Otros Polímeros para Medicamentos

Los envases farmacéuticos consisten en un recipiente y un cierre. Los envases de plástico pueden estar formados por políme-
ros que tras su extracción no alteran la estabilidad del producto que contienen ni muestran toxicidad. Los requisitos de la
prueba de biocompatibilidad para los envases de medicamentos se especifican en Inyectables (1) y Envases-Plásticos (661 ).
Según se indica en estos capítulos, el plástico u otras porciones poliméricas de estos productos se prueban según los procedi-
mientos definidos en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87). Los plásticos u otros polímeros que no cumplan con los
requisitos de las Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) no son materiales adecuados para envases de medicamentos. Los
materiales que cumplen con los requisitos in vitro están calificados como materiales biocompatibles sin la necesidad de prue-
bas adicionales y se pueden usar para fabricar envases de medicamentos. Si se desea una designación de clase (clases 1-VI)
para los plásticos u otros polímeros, hay que realizar los procedimientos de prueba adecuados que se presentan en la sección
Pruebas In Vivo y Designación de Clase.

Cierres Elastoméricos

Los cierres elastoméricos son cierres que se pueden perforar con una jeringa y mantener su integridad debido a sus propie-
dades elásticas. Los materiales elastoméricos pueden estar compuestos de varias entidades químicas, incluyendo materiales de
relleno, pigmentos, plastificantes, estabilizadores, aceleradores, agentes vulcanizantes y un polímero natural o sintético. Estos
materiales se usan para la fabricación de un producto que tenga las propiedades físicas elastoméricas deseadas y a menudo
demuestran reactividad biológica-degeneración y malformación celular-cuando se someten a pruebas con cultivos celulares
in vitro.
La biocompatibilidad de un material elastomérico se evalúa según el protocolo de prueba de dos etapas especificado en
Procedimientos para Prueba Biológica en Tapones Elastoméricos para Inyectables (381 ). A diferencia de los plásticos u otros polí-
meros, un material elastomérico que no cumple con los requisitos de las pruebas de la primera etapa (in vitro) puede aceptarse
como material biocompatible si pasa las pruebas de la segunda etapa (in vivo) que son la Prueba de Inyección Sistémica y la
Prueba lntracutánea descritas en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). No se hace distinción de clase ni de tipo entre los
materiales elastoméricos que cumplen con los requisitos de las pruebas de la primera etapa y los aceptables como materiales
biocompatibles al cumplir con los requisitos de la segunda etapa. Los materiales elastoméricos no reciben una designación de
clase 1-VI.

DISPOSITIVOS MÉDICOS E IMPLANTES

Los dispositivos médicos e implantes etiquetados como apirógenos, en contacto directo o indirecto con el sistema cardiovas-
cular u otros tejidos blandos del cuerpo, cumplen con los requisitos descritos en Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositi-
vos Médicos Similares (161 ). Los productos detallados en este capítulo que cumplen con los criterios son equipos de administra-
ción de soluciones, equipos de extensión, equipos de transferencia, equipos de administración de sangre, catéteres intraveno-
sos, dializadores y tubos y accesorios para diálisis, equipos para transfusión e infusión y catéteres para la administración intra-
muscular de fármacos. Los criterios descritos no se aplican a los productos médicos tales como productos ortopédicos, guantes
de látex y apósitos para heridas.
Los requisitos de prueba descritos o a los que se hace referencia en Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositivos Médicos
Similares (161) incluyen los requisitos de Esterilidad, Endotoxinas bacterianas, Pirógenos y Otros requisitos. En Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas (85) se define un procedimiento para evaluar la presencia de endotoxinas bacterianas y los límites se definen
en Endotoxinas Bacterianas en Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositivos Médicos Similares (161 ). Para los dispositivos en
que no se puede realizar la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) debido a características de promoción o inhibición no elimi-
nables, se aplica la Prueba de Pirógenos (151 ). Los procedimientos para evaluar dispositivos médicos que contienen vías estériles
se definen en Dispositivos Estériles en Pruebas de Esterilidad (71 ). En la Prueba de Seguridad en Pruebas de Reactividad Biológica, In
Vivo (88) se define un procedimiento para evaluar la seguridad de los dispositivos médicos.
Los componentes de plástico o de otros polímeros de los dispositivos médicos cumplen con los requisitos especificados para
los plásticos y otros polímeros en Envases-Plásticos (661 ); los fabricados con elastómeros cumplen con los requisitos en Tapo-
nes Elastoméricos para Inyectables (381 ). Según se indica en estos capítulos, la biocompatibilidad de las porciones de plástico,
de otros polímeros y los elastómeros de estos productos se analizan conforme a los procedimientos descritos en Pruebas de
Reactividad Biológica, In Vitro (87). Si también se requiere la designación de clase para un plástico u otro polímero, se realizan
procedimientos de prueba adecuados descritos en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88).
Al igual que para los cierres elastoméricos, los materiales elastoméricos que no cumplen con los requisitos in vitro pueden
estar calificados como materiales biocompatibles y usarse en la elaboración de dispositivos médicos si cumplen con los requisi-
tos de la Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba lntracutánea en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Al igual que
para los envases de medicamentos, los plásticos y otros polímeros que no cumplen con los requisitos de la prueba in vitro no
son materiales aptos para ser utilizados en dispositivos médicos.
USP 37 Información General/ (1031 > Biocompatibilidad de los Materiales Usados 705

PRUEBAS IN VITRO, PRUEBAS IN VIVO V DESIGNACIÓN DE CLASE PARA PLÁSTICOS V OTROS

POLÍMEROS

Los requisitos de prueba especificados en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) y Pruebas de Reactividad Biológica, In
Vivo (88) están diseñados para determinar la reactividad biológica de cultivos celulares de mamíferos y la respuesta biológica
de animales a los materiales elastoméricos, plásticos y de otros polímeros que están en contacto directo o indirecto con el pa-
ciente. La reactividad biológica de estos materiales puede depender tanto de las características de sus superficies como de sus
componentes químicos extraíbles. Los procedimientos de prueba detallados en estos capítulos a menudo se pueden realizar
con el material o un extracto del material en análisis, a menos que se especifique algo diferente.

Preparación de Extractos

La evaluación de la biocompatibilidad de un producto médico completo a menudo no es realista; por lo tanto, el uso de
porciones o extractos representativos de materiales seleccionados puede ser la única alternativa práctica para realizar los ensa-
yos. Cuando se usan porciones representativas de los materiales o extractos de los materiales en análisis, es importante tener
en cuenta que las materias primas pueden sufrir cambios químicos durante la fabricación, el procesamiento y la esterilización
de un producto médico. Si bien la prueba in vitro de materias primas puede servir como un procedimiento de examen inicial
importante, hay que hacer una evaluación final de la biocompatibilidad de un producto médico con porciones del producto
terminado y esterilizado.
Los extractos se preparan de acuerdo con los procedimientos expuestos en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) y en
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Las extracciones se pueden realizar a diversas temperaturas (121 º, 70º, 50º o 37º)
durante diferentes intervalos de tiempo (1 hora, 24 horas o 72 horas) y en medios de extracción diferentes. La elección del
medio de extracción para los procedimientos de las Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) incluye la Inyección de Cloruro
de Sodio (0,9% NaCI) o un medio de cultivo de tejidos con o sin suero. Cuando se usa un medio con suero, la temperatura de
extracción no puede exceder de 37º. El medio de extracción in vivo incluye los medios descritos en Pruebas de Reactividad Bio-
lógica, In Vivo (88) o el disolvente al cual se expone el medicamento o dispositivo médico.
Al elegir las condiciones de extracción, hay que seleccionar las variables de temperatura, disolvente y tiempo que mejor si-
mulen las condiciones "de uso" del producto. Se pueden realizar muchas pruebas en diferentes condiciones para simular varia-
ciones en las condiciones "de uso". Si bien la selección cuidadosa de las condiciones de extracción permite la simulación de las
condiciones de fabricación y procesamiento en la prueba de materias primas, se realizará una prueba de la biocompatibilidad
del producto con el producto terminado y esterilizado.

Pruebas In Vitro

Los procedimientos descritos en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) incluyen una Prueba de Difusión en Agar (prue-
ba de contacto indirecto), una Prueba de Contacto Directo y una Prueba de Elución (prueba de extracción). La muestra es bio-
compatible si los cultivos celulares no muestran más que una reactividad leve (Grado 2) al material de prueba, como se descri-
be en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87). La Prueba de Difusión en Agar está diseñada para evaluar la biocompatibili-
dad de los materiales elastoméricos. El material se coloca sobre una capa de agar superpuesta a la monocapa celular, que pro-
tege a las células contra el daño físico debido al material y permite que las sustancias químicas o materiales lixiviables difundan
desde el elastómero y entren en contacto con la monocapa celular. Los extractos de materiales elastoméricos se analizan colo-
cando papel de filtro saturado con un extracto del elastómero sobre la superficie del agar solidificado. La Prueba de Contacto
Directo está diseñada para materiales elastoméricos o plásticos que no dañarán físicamente las células con las que entren en
contacto directo. Toda sustancia química lixiviable difunde desde el material al medio de crecimiento suplementado con suero
y entra en contacto directo con la monocapa celular. La Prueba de Elución está diseñada para evaluar los extractos de materia-
les poliméricos. El material se puede aplicar directamente al medio de cultivo de tejidos.
La realización de la Prueba de Difusión en Agar o la Prueba de Contacto Directo junto con la Prueba de Elución es el protocolo
de prueba preferido. La extracción del producto o los materiales para la Prueba de Difusión en Agar o la Prueba de Elución se
efectúa según se describe en Preparación de Extractos.

Pruebas In Vivo y Designación de Clase

De acuerdo con los requisitos de inyección e implantación especificados en la Tabla 7 en Pruebas de Reactividad Biológica, In
Vivo (88), los plásticos y otros polímeros reciben una designación de clase entre la clase 1 y la clase VI. Para obtener la designa-
ción de clase de un plástico u otro polímero, se producen extractos del material de prueba en diversos medios según los pro-
cedimientos especificados.
Para evaluar la biocompatibilidad, los extractos se inyectan por vía sistémica e intracutánea en ratones y conejos o cobayos.
Según los requisitos de inyección especificados, un plástico u otro polímero puede pertenecer inicialmente a la clase 1, 11, 111 o
V. Si además de la prueba de inyección, se realiza una prueba de implantación usando el material en sí, el plástico u otro polí-
mero puede clasificarse como clase IV o clase VI.
706 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General USP 37

Cambio en la redacción:

BIOCOMPATIBILIDAD DE DISPOSITIVOS MÉDICOS E IMPLANTES

Además de la evaluación de productos médicos para propósitos farmacopeicos según los procedimientos especificados en
Inyectables (l ), Esterilidad (71 ), Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87), Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88), Equi-
pos para Transfusión e Infusión y Dispositivos Médicos Similares (161 ), Tapones Elastoméricos para Inyectables (381) y Envases-
Plásticos (661 ), los dispositivos médicos e implantes se evalúan en cuanto a su capacidad de sensibilización, toxicidad subcróni-
ca, genotoxicidad, hemocompatibilidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biode-
gradación según lo exijan los organismos regulatorios.
Las pautas suministradas por los organismos regulatorios indican que el número de pruebas al que se somete un dispositivo
médico o un implante depende de los siguientes factores: (1) la similitud y singularidad del producto con respecto a los pro-
ductos previamente comercializados ("comparables") según se considera en el Diagrama de Flujo de Decisión; (2) la magnitud y
duración del contacto entre el producto y el paciente, según se describen en la Categorización de Dispositivos Médicos; y (3) los
materiales que componen el producto según se considera en los apartados Diagrama de Flujo de Decisión y Prueba In Vivo y
Designación de Clase.

Diagrama de Flujo de Decisión

Las pautas para la comparación de un dispositivo médico o un implante con productos previamente comercializados se pro-
porcionan en el Diagrama de Flujo de Biocompatibilidad (ver la Figura 13) según la adaptación del Blue Book Memorandum
#G95-1 de la FDA. El propósito del diagrama de flujo es determinar si los datos disponibles de dispositivos previamente comer-
cializados son suficientes para asegurar la seguridad del dispositivo en consideración. Según se indica en el diagrama de flujo,
los materiales de composición y las técnicas de fabricación de un producto se comparan con aquéllas de productos previamen-
te comercializados para dispositivos que entran en contacto directo con el cuerpo. Además, el diagrama de flujo exige una
evaluación de la toxicidad de todo material especial que no se haya usado en dispositivos comparables. Las respuestas a las
preguntas formuladas en el diagrama de flujo llevan a la conclusión de si los datos disponibles son suficientes o si se necesitan
pruebas adicionales para asegurar la seguridad del producto. Cuando se necesitan pruebas adicionales, en la sección Matriz de
Selección de Prueba se proporcionan las pautas para la identificación de los procedimientos de prueba adecuados.

1 Adaptado de Blue Book Memorandum #G95- 1 de la eDA ("Use of lnternational Standard 150-1099 3. 'Biological Evaludtron of Medie al Devices-Part 1: Evaluation
and Testing."')
USP 37 Información General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 707

¿Material
en contacto NO
directo con
el cuerpo?

si

¿Mismo
¿Misma si
material en otro
composición
dispositivo
química?
en el mer-
cado? NO
NO
NO NO

¿Jus-
tificación
NO aceptable o
fecha de
análisis?

¿Con-

<'~""
¿El
si iene sustan-
material del NO tal, aleación
cias tóxicas: NO
dispositivo es metálica o
un polímero? n mat. ce- ºPb,."""''•'"'"Ni,
rámico? Cd, Zr,
etc?

SÍ NO SÍ

Consultar el perfil de ¿Sufi-

toxicología específico del NO SÍ
ciente justifica-
dispositivo para definir l..,.f---------~---------< ción provista?
las pruebas adecuadas

¿Se
cumplen los SÍ Requisitos de
requisitos de Biocompatibilidad
biocompa- Cumplidos
tibilidad?

NO

Material Tóxico

Fig. 1. Diagrama de flujo de biocompatibilidad

708 (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General USP 37

Categorización de Dispositivos Médicos

Para facilitar la identificación de los procedimientos de prueba adecuados, los dispositivos médicos se dividen y subdividen
según se muestra en la Tabla 2, de acuerdo con el tipo y grado de contacto con el cuerpo. Las principales categorías de dispo-
sitivos médicos son los dispositivos de superficie, los dispositivos de comunicación externa y los dispositivos de implante. Éstas
a su vez se subcategorizan. En la Tabla 2 también se presentan algunos ejemplos de dispositivos médicos e implantes pertene-
cientes a cada una de las subcategorías.
Tabla 2. Clasificación y Ejemplos de Dispositivos Médicos
Categoría del Subcategoría del
Dispositivo Dispositivo Tipo o Grado de Contacto
Dispositivos en contacto sólo con la superfi-
Piel cie de la piel intacta
Dispositivos de Superficie
Dispositivos que se comunican con mem-
Membrana Mucosa branas mucosas intactas
Dispositivos en contacto con superficies
Superficies Lesionadas o corporales lesionadas o afectadas de algún
Afectadas modo
Dispositivos en contacto con la vía sanguí-
nea en un punto y que sirven de conducto
Vía Sanguínea, Indirecta para ingresar al sistema vascular
Dispositivos y materiales en comunicación
En Comunicación con Teji- con tejidos, hueso, o el sistema de pulpa y
Dispositivos Externos de Co-
do, Hueso o Dentina dentina
municación
Dispositivos en contacto con sangre en cir-
Sangre en Circulación culación
Dispositivos de Implante Dispositivos principalmente en contacto
con huesos o con tejidos y fluidos de teji-
Tejido o Hueso dos
Dispositivos principalmente en contacto
Sangre con sangre
Algunos Ejemplos
Electrodos, prótesis externas, cintas de fija-
ción, vendas para compresión y monitores
de varios tipos
Lentes de contacto, catéteres urinarios, dis-
positivos intravaginales e intraintestinales
(tubos estomacales, sigmoidoscopios, co-
lonoscopios, gastroscopios), tubos endo-
traqueales, broncoscopios, prótesis denta-
les, dispositivos de ortodoncia y dispositi-
vos intrauterinos
Dispositivos para curación o apósitos para
úlceras, quemaduras y tejido de granula-
ción, y parches oclusivos
Equipos para administración de soluciones,
equipos de extensión, equipos de transfe-
rencia y equipos para administración de
sangre
Laparoscopios, artroscopios, sistemas de
drenaje, cementos dentales, materiales de
oclusión dental y grapas para piel
Catéteres intravasculares, electrodos tem-
porales de marcapasos, oxigenadores, tu-
bos y accesorios de oxigenador extracor-
pareo, dializadores, tubos y accesorios pa-
ra diálisis, hemoadsorbentes e inmunoad-
sorbentes
Ejemplos de los primeros son clavos ortopé-
dicos, placas, articulaciones de reemplazo,
prótesis óseas, cementos y dispositivos in-
traóseos; ejemplos de los segundos son
marcapasos, dispositivos de administra-
ción de fármacos, sensores y simuladores
neuromusculares, tendones de reemplazo,
implantes mamarios, laringes artificiales,
implantes subperiosteales y pinzas de liga-
dura
Electrodos de marcapasos, fístulas arteria-
venosas artificiales, válvulas cardíacas, in-
jertas vasculares, catéteres internos de ad-
ministración de fármacos y dispositivos de
asistencia ventricular

Matriz de Selección de Prueba

La matriz proporciona pautas para la identificación de procedimientos apropiados de pruebas biológicas para las tres catego-
rías de dispositivos médicos: pruebas para Dispositivos de Superficie (ver la Tabla 3), pruebas para Dispositivos Externos de Comu-
nicación (ver la Tabla 4) y pruebas para Dispositivos de Implante (ver la Tabla 5). Cada categoría de dispositivos se subcategoriza
y luego se subdivide aún más según la duración del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. La duración del contacto se defi-
ne como (A) limitada (menos de 24 horas); (B) prolongada (de 24 horas a 30 días); o (C) permanente (más de 30 días). Los
efectos biológicos que se incluyen en la matriz son citotoxicidad, sensibilización, irritación o reactividad intracutánea, toxicidad
sistémica, toxicidad subcrónica, genotoxicidad, implantación, hemocompatibilidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad, toxi-
cidad reproductiva o del desarrollo y biodegradación. Los capítulos generales que contienen el procedimiento de prueba de
toxicidad para estos efectos biológicos se indican en la Tabla 1.
Cada subcategoría de la matriz tiene un panel asociado de requisitos de prueba. Generalmente, la cantidad de pruebas en el
panel aumenta cuando aumenta la duración del contacto entre el dispositivo y el cuerpo, y a medida que el dispositivo o im-
USP 37 Información General/ (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados 709

plante está en contacto más cercano con el sistema circulatorio. Dentro de varias subcategorías, la opción de realizar pruebas
adicionales a las requeridas se deberá considerar caso por caso. Para tomar decisiones con respecto a la inclusión de pruebas
reproductivas o de desarrollo, el fabricante deberá tomar en cuenta situaciones específicas, como por ejemplo el uso de dispo-
sitivos de implante permanente o dispositivos externos de comunicación para mujeres embarazadas y niños. En la matriz se
proporcionan las pautas para la identificación de posibles procedimientos de prueba adicionales para cada subcategoría de dis-
positivos médicos.

PAUTAS PARA LA SELECCIÓN DE LA DESIGNACIÓN DE CLASE DEL PLÁSTICO U OTRO

POLÍMERO PARA UN DISPOSITIVO MÉDICO
Para proporcionar pautas para la selección de la designación de clase adecuada de un plástico u otro polímero para un dis-
positivo médico, se asigna a cada subcategoría de los Dispositivos de Superficie (ver la Figura 2) y los Dispositivos Externos de
Comunicación (ver la Figura 3) una designación según la Clase de Plástico de la USP (ver Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
(88)). Si las pruebas para cada designación de clase de la USP no son suficientes para un dispositivo específico, el fabricante o
profesional debe desarrollar un conjunto de pruebas adecuado. El número de clase numérica indicado aumenta en relación a
la duración (riesgo) del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. En la categoría de Dispositivos de Implante es obligatorio usar
exclusivamente la clase VI. La asignación de la designación de la Clase de Plástico de la USP se basa en las matrices de selec-
ción de prueba ilustradas en las Tablas 3, 4 y 5.

Dispositivos
de Superficie

Membranas Superficies Lesionadas

Piel
Mucosas o Afectadas

Limitada* Permanente

USPClaset USP Clase

1 VI

Fig. 2. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polímeros para dispositivos de superficie.
·Categorización basada en la duración del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 días; per-
manente-más de 30 días.
t Designación de la Clase de Plástico según la USP.
71 O (1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General USP 37

La asignación de una designación de clase de plástico u otro polímero a una subcategoría no está destinada a restringir el
uso de clases superiores de plásticos u otros polímeros. Si bien la clase asignada define la clase numérica más baja de plástico u
otro polímero que se puede usar en el dispositivo correspondiente, el uso de una clase numérica superior de plástico es opcio-
nal. Cuando un dispositivo se puede definir como perteneciente a más de una categoría de dispositivo, el plástico u otro polí-
mero debe cumplir con los requisitos de la clase numérica más alta.

Dispositivos Externos
de Comunicación

Vía sanguínea En comunicación con Sangre en

indirecta tejido/hueso/dentina circulación

Limitada* Permanente

USP Claset USP Clase

IV VI

Fig. 3. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polímeros para dispositivos externos de comunicación.
·Categorización basada en la duración del contacto: limitada-menos de 24 horas; prolongada-de 24 horas a 30 días; per-
manente-más de 30 días.
t Designación de la Clase de Plástico según la USP.
 Tabla 3. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos de Superficie* eVl
Categoría del Dispositivo Efecto Biológicob u
w
Irritación Toxicidad '-.1
o Reacti- Toxici- Hemo- Reproduc-
Duración vidad In- dad Sis- Toxici- Geno- compa- Toxici- Carci- tiva o del Biode-
del Con- Citoto- Sensibi- tracu- témica dad Sub- to- Implan- tibili- dad Cró- nogeni- Des a- grada-
Contacto Corporal tactoª xicidad lización tánea (Aguda) crónica xicidad tación dad nica cid ad rrollo ción
A X X X - - - - - - - -- -

Piel B X X X - - - - - - - - -

e X X X - - - - - - - - -

A X X X - - - - - - - - -
Dispositivos
Membrana
de Superfi-
Mucosa
B X X X o o - o - - - - -

cie e X X X o X X o - o - - -

Superficies A X X X o - - - - - - - -
Lesionadas
o
B X X X o o - o - - - - -
S-
Afectadas e X X X o X X o - o - - - O'
ª
b
Leyenda: A-limitada (menos de 24 horas); B-prolongada (de 24 horas a 30 días); (-permanente (más de 30 días).
Leyenda: X-pruebas de evaluación ISO a considerar; O-pruebas adicionales que pueden ser aplicables.
*Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 7. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar).
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Tabla 4. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos Externos de Comunicación* '-1
~

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Categorías del Dispositivo Efecto Biológicob
Irritación Toxicidad
o Reacti- Toxici- Toxici- Hemo- Reproduc- o
w
Duración vidad In- dad Sis- dad Geno- compa- Toxici- Carci- tiva o del Biode-
del Con- Citoto- Sensibi- tracu- té mica Subcró- to- Implan- tibili- dad Cró- nogeni- Des a- grada- ~
Contacto Corporal tactoª xicidad lización tánea (Aguda) nica xicidad tación dad nica cid ad rrollo ción c;·
n
Dispositivos Vía Sanguí- A X X X X - - - X - - - - o
Externos de nea, 3
Comunica-
B X X X X o - - X - - - -
-o
Indirecta CJ
ción c X X o X X X o X X X - - ~-
0-
En Comuni- A X X X o - - - - - - - -

cación a.:
B X X o o o X X - - - - - CJ
o...
con
Tejido, c X X o o o X X - X X - - o...
ro
Hueso o
Dentina o
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Sangre en A X X X X - o - X - - - - ~
CJ
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Circulación
B X X X X o X o X - - - -
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c X X X X X X o X X X - - CJ
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d Leyenda: A-limitada (menos de 24 horas); B-prolongada (de 24 horas a 30 días); C-permanente (más de 30 días). V>

b Leyenda: X-pruebas de evaluación ISO a considerar; O-pruebas adicionales que pueden ser aplicables. e
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*Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 7. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar). CJ
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 Tabla 5. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos de Implante* eVl
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Categoría del Dispositivo Efecto Biológicob
w
Irritación Toxicidad '-1
o Reacti- Toxici- Toxici- Hemo- Reproduc-
Duración vidad In- dad Sis- dad Geno- compa- Toxici- Carci- tiva o del
del Con- Citoto- Sensibi- tracu- témica Subcró- toxici- Implan- tibili- dad Cró- nogeni- Des a- Biodegra-
Contacto Corporal tactoª xicidad lización tánea (Aguda) nica dad tación dad ni ca cid ad rrollo dación
Dispositivos A X X X o - - - - - - - -
de Implante
Tejido o
B X X o o o X X - - - - -

Hueso e X X o o o X X - X X - -

Sangre A X X X X - - X X - - - -

B X X X X o X X X - - - -

e X X X X X X X X X X - -

ª Leyenda: A-limitada (menos de 24 horas); B-prolongada (de 24 horas a 30 días); C-permanente (más de 30 días).
b Leyenda: X-pruebas de evaluación ISO a considerar; O-pruebas adicionales que pueden ser aplicables.
*Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 7. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar). S-
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714 (1 032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

(1032) DISEÑO Y DESARROLLO DE VALORACIONES BIOLÓGICAS

1 INTRODUCCIÓN

1.1 Propósito y Alcance

El capítulo general Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032) presenta metodologías para el desarrollo de procedi-
mientos de valoración biológica que cuentan con un diseño experimental sólido, capaces de proporcionar datos que pueden
ser analizados mediante principios estadísticos bien fundamentados, y adecuados para su uso específico.
El capítulo general (1032) forma parte del grupo de cinco capítulos generales enfocados en valoraciones de potencia relati-
va, en las cuales se cuantifica la actividad de un material de Prueba mediante su comparación con la actividad de un material
Estándar. No obstante, muchos de los principios se pueden aplicar a otros sistemas de valoración.
El propósito de este capítulo general es servir como guía para el diseño y el desarrollo de una valoración biológica para un
fármaco o producto farmacéutico destinado para su distribución comercial. Aunque la adopción de los métodos recomenda-
dos en este capítulo puede requerir de una importante inversión de recursos durante el desarrollo de la valoración, su imple-
mentación temprana puede generar beneficios. Finalmente, las perspectivas y los métodos descritos en este capítulo son los
recomendados entre una gran variedad de alternativas ofrecidas por la teoría y práctica contemporáneas de las valoraciones
biológicas.
Énfasis en la Potencia Relativa-Debido a la variabilidad inherente de los sistemas de análisis biológicos (incluyendo aquellos
que emplean animales, células, instrumentos, reactivos y los que se emplean a diario y entre laboratorios), una medición abso-
luta de la potencia es más variable que una medición de la actividad pertinente a un Estándar, lo cual ha llevado a la adopción
de la metodología de la potencia relativa. Para poder suponer que los materiales Estándar y de Prueba son similares biológica-
mente, debería demostrarse una similitud estadística (una consecuencia de la similitud del material de Prueba y del Estándar), y
se podría esperar que la muestra de Prueba se comporte como una concentración o dilución del Estándar. La potencia relativa
es una medida sin unidad qµe se obtiene a partir de la comparación de las relaciones dosis-respuesta de las preparaciones far-
macéuticas de Prueba y Estándar. Para los fines de la comparación relativa del material de Prueba con el Estándar, generalmen-
te se asigna a la potencia del Estándar un valor de 1 (o 100%). El Estándar puede ser un material establecido como tal por una
organización nacional (p.ej., la USP) o internacional (p.ej., la OMS), o puede tratarse de un Estándar interno.

1.2 Partes Interesadas

Este capítulo está dirigido tanto a expertos en estadística, como a analistas dedicados a la práctica de valoraciones biológi-
cas, quienes participan en el desarrollo de una valoración biológica. Este capítulo servirá al analista como guía para implemen-
tar la estructura y metodología de la valoración biológica a fin de alcanzar las metas analíticas, a la vez que demuestra de ma-
nera fidedigna la actividad biológica de interés; por otra parte, servirá al estadista para obtener información relacionada con las
limitaciones biológicas que pudieran ser difíciles de equilibrar con una práctica rigurosa de estadística.

2. APTITUD DE LAS VALORACIONES BIOLÓGICAS PARA SU USO PREVISTO

Para evaluar la aptitud de una valoración para su uso previsto, el analista debe especificar claramente los propósitos con los
que se lleva a cabo la valoración biológica. Los usos comunes para una valoración biológica incluyen la liberación de lotes de
fármacos (ingredientes farmacéuticos activos) y productos farmacéuticos; la evaluación de estabilidad; la calificación del Están-
dar y de otros reactivos críticos; la caracterización de productos intermedios del proceso y formulaciones; la caracterización de
contaminantes y productos de degradación; y la validación de los cambios en el proceso de producción del producto. Los re-
quisitos de exactitud relativa, especificidad, precisión y robustez pueden ser diferentes para cada uno de los usos potenciales.
Una buena estrategia consiste en desarrollar y validar una valoración biológica para sustentar múltiples usos previstos; por
ejemplo, una valoración biológica desarrollada principalmente para la liberación de partidas puede servir para otros propósitos.
Las decisiones relacionadas con la aptitud de uso deben basarse en consideraciones científicas y estadísticas, así como en consi-
deraciones prácticas tales como costos, tiempo de culminación del proceso y requisitos de rendimiento para la valoración.
Cuando las valoraciones se usan para la liberación de lotes, una valoración biológica de modelo lineal permitiría evaluar la
similitud suficientemente. Para valoraciones biológicas que se usan para sustentar la estabilidad, la comparabilidad, para califi-
car materiales de referencia o reactivos críticos, o que se relacionan con cambios en los procesos de producción o valoración,
generalmente resulta útil evaluar la similitud usando la curva de concentración-respuesta completa, incluyendo las asíntotas (si
estuvieran presentes).

2.1 Desarrollo del Proceso

Las valoraciones biológicas por lo general son necesarias para el desarrollo y la optimización de la fabricación de productos,
incluidos los procesos de formulación y aumento de la escala de producción. Las valoraciones biológicas pueden usarse para
USP 37 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 715

evaluar las estrategias de purificación, optimizar el rendimiento del producto y medir la estabilidad del mismo. Dado que las
muestras tomadas durante todo el proceso se analizan y comparan con regularidad, es necesario estudiar cuidadosamente los
efectos de la matriz de muestras que pudieran afectar la respuesta de la valoración a fin de determinar la aptitud de una valo-
ración para su uso. Para las mediciones de potencia relativa, puede ser necesario diluir el material Estándar en una matriz ade-
cuada para cuantificación. La precisión y exactitud de la valoración biológica deben ser suficientes para medir el desempeño
del proceso o para evaluar y comparar la estabilidad de las formulaciones propuestas.

2.2 Caracterización del Proceso

Las valoraciones biológicas pueden llevarse a cabo para evaluar los efectos sobre la potencia de la droga relacionados con las
diferentes etapas de la fabricación del fármaco o con los cambios en el proceso de fabricación (p.ej. para demostrar la equiva-
lencia del producto antes y después de aplicar cambios en el proceso). Las valoraciones biológicas usadas en este tipo de apli-
cación pueden ser cualitativas o cuantitativas.

2.3 Liberación de Productos

Las valoraciones biológicas se usan para evaluar la potencia del fármaco antes de la liberación del producto comercial. En la
medida de lo posible, la valoración debe reflejar o imitar el mecanismo de acción conocido o esperado del producto. Cuando
la valoración biológica no incluye la biología funcional directamente relacionada con el mecanismo de acción, puede ser nece-
sario demostrar una relación entre las determinaciones de la potencia estimada por la valoración biológica y las obtenidas con
alguna otra valoración que refleje mejor o de manera distinta la actividad funcional hipotética.
Para las pruebas de liberación del producto, las especificaciones del mismo se establecen para definir valores mínimos o in-
tervalos de potencia aceptables para el producto. La precisión del valor de informe obtenido de la valoración biológica debe
sustentar el número de dígitos significativos establecidos en la especificación (ver el capítulo general Validación de Valoraciones
Biológicas (1033)) y, junto con la exactitud relativa, sustentar el intervalo de la especificación. A fin de cumplir con estas especi-
ficaciones, el control de calidad de la fabricación deberá contar con especificaciones para la liberación del producto con límites
lo suficientemente estrechos como para acomodar cualquier pérdida de actividad por inestabilidad o incertidumbre en la valo-
ración de liberación.

2.4 Productos Intermedios del Proceso

La evaluación de la valoración biológica de los productos intermedios del proceso puede proveer información con respecto a
la especificidad. Las estrategias de formulación y llenado pueden basarse en valoraciones biológicas para asegurarse de que el
producto farmacéutico, incluido aquél que se encuentra en el envase final, cumplirá con las especificaciones establecidas. Por
ejemplo, se pueden retener los materiales a granel sin formular y evaluar su potencia. Basándose en los resultados de potencia,
se puede decidir si los materiales a granel se combinan con otros lotes de material a granel, si se diluyen, o si se someten a
reprocesamiento. Para estos tipos de aplicaciones, las valoraciones biológicas deben ser capaces de medir la actividad del pro-
ducto en diferentes matrices. En algunos casos, se puede preparar un material Estándar distinto y utilizarlo para calcular la po-
tencia relativa del producto intermedio del proceso.

2.5 Estabilidad

Las valoraciones de potencia pueden usarse para evaluar la estabilidad de vacunas y productos obtenidos por biotecnología.
La información derivada de los estudios de estabilidad realizados durante el desarrollo en condiciones de almacenamiento rea-
les y/o aceleradas o sometidas a estrés, puede emplearse para establecer la duración de la vida útil, así como para identificar y
estimar velocidades y productos de degradación. Asimismo, se pueden usar estudios de estabilidad posteriores al otorgamien-
to de la licencia, a fin de monitorear la estabilidad del producto. Es importante contar con conocimientos acerca de la variabili-
dad a corto y largo plazo de la valoración biológica para garantizar un nivel aceptable de incertidumbre en las medidas de
potencia obtenidas.

2.6 Calificación de Reactivos

La caracterización cuantitativa de un nuevo Estándar requiere una medición exacta y precisa de la actividad biológica del
nuevo Estándar. Esta medición se usa para establecer que el lote del nuevo Estándar es equivalente al lote previo o para asig-
narle una potencia declarada con la que se puedan comparar las muestras de Prueba. Además, puede ser necesaria una deter-
minación repetida adicional (que va más allá del análisis de rutina) para lograr una mayor precisión en la medición de potencia
del nuevo material Estándar. Asimismo, la valoración biológica se puede usar para calificar un reactivo para cultivo celular tal
como suero fetal bovino. La aptitud de uso en dichos casos se vincula con la capacidad de la valoración para examinar lotes de
reactivo y para asegurar el rechazo de lotes que pudieran generar sesgo o comprometer las mediciones de potencia relativa.
716 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

2.7 Integridad de los Productos

Las vacunas, los productos obtenidos por biotecnología y los productos biológicos pueden contener una población de mate-
rial heterogéneo, incluido el material que se espera predomine en el producto. Algunas impurezas del proceso y productos de
degradación pueden ser activos, parcialmente activos, inactivos o antagónicos a la respuesta medida en la valoración biológi-
ca. Para variantes o derivados del producto cuyos cambios en la estructura o en la composición relativa pudieran relacionarse
con cambios sutiles aunque característicos en la respuesta de la valoración biológica (p.ej., cambio en la pendiente o asíntota),
la valoración biológica puede resultar útil para detectar y medir dichos derivados o variantes. Los estudios que identifican cam-
bios característicos asociados con variantes del producto esperado ayudan a garantizar el desempeño uniforme del producto.
Siempre que resulte práctico, la valoración biológica debe estar acompañada de métodos ortogonales sensibles a las variantes
del producto, a las impurezas del proceso y/o a los productos de degradación.

3. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA

3.1 Valoraciones Biológicas In Vivo

Las valoraciones de potencia in vivo son valoraciones biológicas en las que se administran grupos de diluciones de los mate-
riales Estándar y de Prueba a animales, y donde las relaciones de concentración-respuesta se usan para estimar la potencia.
Para algunas valoraciones con animales, el punto final es simple (p.ej., una valoración de aumento de peso corporal de la rata
para la hormona de crecimiento humano o una valoración de peso de los ovarios de la rata para la hormona estimulante del
folículo), pero otras requieren el procesamiento adicional de muestras recolectadas de los animales tratados (p.ej., recuento de
reticulocitos para eritropoyetina, esteroideogénesis para gonadotropinas, recuento de neutrófilos para factor estimulante de
colonias de granulocitos o titulación de anticuerpos después de la administración de vacunas). Con la llegada de líneas celula-
res específicas para el mecanismo fisiológico de acción (MOA, por sus siglas en inglés) hipotético, el uso de animales para la
medición de potencia ha disminuido de manera importante. Los costos, el bajo rendimiento, así como cuestiones éticas y de
otro tipo abogan contra el uso de valoraciones biológicas con animales. Asimismo, las agencias reglamentarias han promovido
la limitación responsable, siempre que sea posible, del uso de animales (ver The lnteragency Coordinating Committee on the
Validation of Alternative Methods, Mission, Vision, and Strategic Priorities; Febrero de 2004). Cuando la actividad in vitro no
está plenamente asociada con la actividad in vivo (p.ej., EPO), la combinación de valoraciones in vitro basadas en células y de
un método fisicoquímico adecuado (p.ej., IEF, análisis de glicanos) puede ser un reemplazo para las valoraciones in vivo. No
obstante, las valoraciones in vivo pueden continuar siendo necesarias cuando las valoraciones in vitro no son capaces de detec-
tar diferencias críticas relacionadas con la función biológica prevista o esperada del fármaco.
Las respuestas fisiológicas de los animales a los fármacos biológicos (incluyendo vacunas) pueden predecir las respuestas de
los pacientes. La selección de animales de prueba por especie, cepa, género y madurez o intervalo de peso debe guiarse por el
objetivo de desarrollar un modelo representativo y sensible con el cual se evalúe la actividad de las muestras de Prueba.
Algunos métodos de valoración se adaptan al uso de colonias, en lugar de animales que no hayan sido previamente expues-
tos. Por ejemplo, las pruebas de pirógenos e insulina se benefician del uso de conejos de colonias que han sido previamente
expuestas, los cuales proveen una capacidad de respuesta confiable. Si los animales introducidos de manera reciente en la co-
lonia no responden según lo esperado después de administrarles varias veces un compuesto, se les deberá separar de la colo-
nia para que no provoquen futuros resultados de valoración inválidos o indeterminados. No obstante, para la valoración de
compuestos altamente antigénicos para pirógenos, se deben usar animales que no hayan sido previamente expuestos, a fin de
evitar resultados inexactos o confusos. Otras ventajas de las colonias incluyen condiciones ambientales controladas (macro/
ambiente y micro/gradilla), programas de alimentación, aprovisionamiento de agua y rutinas de crianza uniformes.
Se pueden usar datos históricos que incluyan registros de la colonia y datos de la valoración para identificar factores que
pudieran influenciar el desempeño de la valoración. Es posible reducir la influencia de factores que pudieran generar sesgo
mediante la aplicación de principios de aleatorización tales como la distribución de intervalos de peso a través de grupos de
dosis, asignación de grupos de los contenedores de transporte a jaulas distintas o uso de patrones generados por computadora
o de plataforma para inyección/dosificación. Para que el animal de prueba sea adecuado para su uso en una valoración bioló-
gica, éste debe estar sano y se le debe dar tiempo para que se estabilice en su ambiente. Los factores que se combinan para
influenciar el estado de salud del animal incluyen una nutrición adecuada, hidratación, exención de factores de estrés físicos y
sicológicos, saneamiento adecuado del lugar donde se hospeda, ciclo de luz controlado (diurno/nocturno), manipulación ex-
perimentada, inyecciones y sangrados diestros y ausencia de ruido o vibración. La observación diaria de los animales de prueba
es esencial para mantener su salud, además de que se debe contar con cuidados veterinarios para evaluar cualquier cuestión
que pudiera comprometer la validez de los resultados de la valoración biológica.

3.2 Valoraciones Biológicas Ex Vivo

Las células o tejidos de donantes humanos o animales se pueden cultivar en el laboratorio y usarse para evaluar la actividad
de una muestra de Prueba. En el caso de las citoquinas, la mayoría de las valoraciones emplean células del sistema hematopo-
yético o subconjuntos de células hematopoyéticas de sangre periférica, tales como células mononucleares de la sangre periféri-
USP 37 Información General/ (1 032) Valoraciones Biológicas 71 7

ca o linfocitos de la sangre periférica. Para proteínas que actúan sobre tejidos sólidos, como por ejemplo factores y hormonas
del crecimiento, el tejido específico sobre el que actúan puede ser extraído de animales, disociado y cultivado durante un pe-
riodo limitado, ya sea como células adherentes o semiadherentes. Aunque un sistema de valoración ex vivo tiene la ventaja de
ser similar al ambiente natural, también puede sufrir de variabilidad importante entre donantes, así como dificultades relacio-
nadas con la disponibilidad de células apropiadas.
Las valoraciones biológicas que involucran el uso de tejidos o células de un animal (p.ej., el método de glucagón en hepato-
cito de rata) requieren un procesamiento similar al de las valoraciones in vivo para minimizar la variabilidad de la valoración y el
sesgo. El nivel de esfuerzo para manejar el sesgo (p.ej., mediante aleatorización) debe ser adecuado para los propósitos de la
valoración. Los factores adicionales que podrían afectar los resultados de la valoración incluyen la hora del día, el peso o madu-
rez del animal, el anestésico usado, los componentes de las soluciones amortiguadoras/reactivos, la temperatura y posición del
baño de incubación y la viabilidad de las células.

3.3 Valoraciones Biológicas (Basadas en Células) In Vitro

Resulta posible utilizar valoraciones biológicas que empleen líneas celulares que respondan a ligandos o agentes infecciosos
específicos para las valoraciones de liberación de lote. Estas líneas celulares pueden derivarse de tumores, inmortalizarse como
líneas celulares dependientes de factores o líneas celulares transfectadas con receptores adecuados obtenidas por ingeniería
genética. Asimismo, también es posible utilzar líneas celulares no transformadas que se puedan mantener durante un número
suficiente de pasajes (p.ej., fibroblastos). Independientemente de la línea celular, se espera una respuesta de potencia adecua-
damente equivalente durante un número de pasajes continuos. Los avances en la tecnología de ADN recombinante y el enten-
dimiento de los mecanismos de señalización celular han permitido la generación de líneas celulares modificadas por ingeniería
con respuesta mejorada, expresión estable de receptores y mecanismos de señalización, así como una estabilidad más perdura-
ble. Las respuestas celulares relacionadas con la proteína de interés dependen del mecanismo de acción del fármaco y de la
duración de la exposición. Dichas respuestas incluyen la proliferación celular, muerte celular, actividad antiviral, diferenciación,
secreción de citoquinas/mediador y activación de enzimas. Para las valoraciones que implican estas respuestas puede ser nece-
sario incubar las células durante varios días, tiempo en el cual puede presentarse contaminación, evaporación poco uniforme y
otros efectos de ubicación. Las autoridades reglamentarias han aceptado las respuestas comparativamente rápidas basadas en
mecanismos de señalización intracelular, tales como mensajeros secundarios, activación de proteína kinasa o expresión génica
del indicador. Finalmente, la mayoría de las líneas celulares usadas para valoraciones biológicas expresan receptores para múlti-
ples citoquinas y factores de crecimiento. Es posible que dicha falta de especificidad no sea perjudicial si se demuestra la espe-
cificidad de la muestra de Prueba.
El diseño de la valoración biológica basada en células debe reflejar el conocimiento que se tiene sobre los factores que influ-
yen sobre la respuesta de las células con respecto al analito activo. La variabilidad de la respuesta a menudo se refleja en pará-
metros tales como la pendiente, EC 50 de la curva de concentración-respuesta o el intervalo de respuesta (respuesta máxima
menos mínima). Aunque la metodología de la potencia relativa minimiza los efectos de la variación de estos parámetros entre
valoraciones y entre bloques dentro de una valoración, en las estimaciones de la potencia relativa, dicha variabilidad de la res-
puesta puede ocasionar que una valoración sea difícil de administrar (es decir, puede ser difícil evaluar la aptitud del sistema).
Por consiguiente, aunque el desarrollo de la valoración se debe enfocar principalmente en las propiedades de potencia, tam-
bién resultan adecuados los esfuerzos para identificar y controlar la variación en la relación concentración-respuesta. En el caso
de valoraciones por bloques (p.ej., múltiples placas de cultivo celular en una valoración) con variación apreciable en la forma
de la curva entre bloques, un análisis que no incluya apropiadamente los bloques generaría estimaciones infladas de variación
dentro de la valoración, ocasionando que la evaluación de la similitud sea particularmente difícil. Se dispone de dos estrategias
para tratar la variación entre bloques: la primera es un esfuerzo del laboratorio para identificar y controlar fuentes de variación,
y la segunda es un esfuerzo estadístico para construir y emplear un diseño y análisis en bloques. La combinación de estas estra-
tegias puede resultar particularmente efectiva.
El desarrollo de una valoración biológica basada en células comienza con la selección o generación de una línea celular. Uno
de los primeros pasos importantes para desarrollar una valoración basada en células para la evaluación de un producto comer-
cial consiste en verificar que el uso de la línea celular de interés no se restrinja únicamente a investigación. De ser posible, para
asegurar el abastecimiento adecuado y uniforme de células para el análisis de productos, se debe generar un banco de células.
Resulta necesario documentar en la medida de lo posible la información relacionada con las características funcionales y gené-
ticas de la línea celular de la valoración biológica, incluyendo detalles del historial de la línea celular desde el origen hasta su
incorporación al banco, por ejemplo, la información sobre una línea celular recombinante que podría incluir la identificación
de la fuente de la línea celular madre (banco de células interno, almacén externo, etc.), de las secuencias de ADN usadas para
transfección, y del régimen subsiguiente de selección y análisis funcional que resultó en la selección de la línea celular. Aunque
no siempre resulta práctico, es convienente contar con información suficiente que permita recrear una línea celular similar en
caso necesario. La información pertinente puede incluir: identidad (p.ej., isoenzima, marcadores fenotípicos, análisis genético);
morfología (p.ej., imágenes fotográficas archivadas); pureza (p.ej., análisis de detección de micoplasmas, bacterias, hongos y
virus); crioconservación; condiciones de descongelación y cultivo (p.ej., componentes de los medios, temperatura y método
de descongelación, métodos de propagación, densidades de siembra, condiciones de recolección); viabilidad de la desconge-
lación (inmediatamente después de haber sido congelada y después de un tiempo de almacenamiento); características de cre-
cimiento (p.ej., tiempos de duplicación de las células); y estabilidad funcional (p.ej., ploidía).
718 (1032) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

La caracterización de células y la vigilancia relacionada con cuestiones del desempeño de la valoración que se reflejan en el
estado de las células son necesarias para asegurar la calidad y longevidad de los bancos de células que se usan en el entorno
de Control de Calidad. La salud general y el estado metabólico de las células al momento de la valoración biológica puede
influir de manera importante sobre los resultados de las pruebas. Cuando una línea celular ha sido caracterizada y está lista
para su inclusión en el banco, los analistas a menudo preparan un banco de dos niveles (Maestro y de Trabajo). El Banco de
Células Maestro se crea como fuente para el Banco de Células de Trabajo. El Banco de Células de Trabajo se obtiene a partir de
la expansión de uno o más viales del Banco de Células Maestro. El tamaño de los bancos depende de las características de
crecimiento de las células, del número de células requerido para cada valoración y de la frecuencia con que se realizará la valo-
ración. Algunas células pueden ser sensibles a la crioconservación, a la descongelación y a las condiciones de cultivo, por lo
que los bancos se deben preparar y caracterizar cuidadosamente antes de usarlos en estudios de validación y para su uso regu-
lar en el laboratorio de Control de Calidad.
Además, existen factores que pueden afectar la respuesta de la valoración biológica y la evaluación de la potencia, los cuales
son comunes en muchas valoraciones biológicas basadas en células: tipo de célula (adherente o no adherente); descongela-
ción de las células; densidad de plaqueo (durante la descongelación y durante el mantenimiento de la sucesión de siembra) y
confluencia (células adherentes); frascos de cultivo; crecimiento, montaje de placas y medios de valoración; requisitos del sue-
ro (fuente, inactivación con calor, irradiación con rayos gamma); condiciones de incubación (temperatura, C0 2 , humedad,
tiempos de cultivo desde la descongelación); reactivos y técnicas para recolección de células (para células adherentes, método
de disociación); separación y clasificación de células; recuento de células; determinación de la salud de las células (velocidad de
crecimiento, viabilidad, rendimiento); número de pasajes de células y programa de pasajes; estabilidad de la línea celular (a
nivel genético, de receptor, de marcador, de expresión génica); y etapas de inanición o estimulación. La lista anterior no es
definitiva, por lo que el desarrollo de la valoración debe incluir analistas que cuenten con una amplia comprensión y experien-
cia con respecto a la línea celular. Estos analistas experimentados deben identificar factores que podrían influir en los resulta-
dos de la valoración y, siempre que sea posible, establecer estrategias para un nivel de control adecuado.

3.4 Estándar
El Estándar es un reactivo crítico en las valoraciones biológicas debido a la necesidad de contar con un material de prueba
confiable contra el que se pueda comparar cuantitativamente una preparación de Prueba. Se puede asignar al Estándar una
cantidad de unidades o actividad específica que represente un material con una potencia total (100%). Siempre que sea posi-
ble, un Estándar debe ser representativo de las muestras que se van a analizar en la valoración biológica. El análisis que se lleva
a cabo para calificar un Estándar puede ser más riguroso que el análisis de rutina usado para la liberación del lote.
Un Estándar debe almacenarse en condiciones que ayuden a conservar toda su potencia durante el tiempo esperado de uso.
Con este propósito, el Estándar se puede almacenar en condiciones diferentes a las del almacenamiento normal del fármaco o
producto farmacéutico. Esto puede incluir una temperatura diferente (p.ej., -70º o -20º, en lugar de 2º-8º), un envase dife-
rente (p.ej., viales de plástico en lugar de jeringas), una formulación diferente (p.ej., formulación liofilizable o la adición de
proteínas portadoras tales como albúmina sérica humana, estabilizantes, etc.). El material Estándar debe analizarse para deter-
minar su estabilidad en intervalos apropiados. Los criterios de aptitud del sistema para la valoración biológica tales como res-
puesta máxima o de fondo, pendiente EC 50 o potencia del control de la valoración, pueden usarse para detectar cambios en la
actividad del Estándar. Se pueden realizar estudios de estabilidad acelerados para estimar las velocidades de degradación y pa-
ra establecer características reconocibles de inestabilidad del Estándar.
En las etapas posteriores del desarrollo clínico, el Estándar puede prepararse usando el proceso de fabricación empleado en
los ensayos clínicos claves. Si la formulación del Estándar es diferente de la usada en el proceso de fabricación del producto
farmacéutico, será importante demostrar que la evaluación de la similitud y la estimación de la potencia realizadas en la valora-
ción no son afectadas por las diferencias en la formulación. Un Estándar inicial puede recibir el nombre de Estándar Primario.
Los Estándares subsiguientes se pueden preparar usando procesos de fabricación vigentes y se pueden denominar Estándares
de Trabajo. Puede ser necesario implementar distintos Procedimientos Operativos Estándares, a fin de establecer tales estánda-
res para cada producto. En ocasiones, las mediciones de potencia pueden presentar sesgo si la actividad del Estándar cambia
gradualmente. Asimismo, se puede observar una pérdida de similitud si, con el tiempo, el Estándar sufre cambios en la glicosi-
lación. Resulta prudente archivar alícuotas de cada lote de Estándar para evaluar la comparabilidad con Estándares posteriores
y para investigar cualquier desviación en la valoración.

4. ASPECTOS ESTADÍSTICOS DE LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES DE LAS VALORACIONES

BIOLÓGICAS
Los elementos estadísticos del desarrollo de valoraciones biológicas incluyen el tipo de datos, la medición de la respuesta a
concentraciones variadas, el diseño de la valoración, el modelo estadístico, el tratamiento de los datos previo al análisis, los
métodos de análisis de datos, la prueba de aptitud y el análisis de valores aberrantes. Tales componentes forman el sistema de
valoración biológica que se utilizará para estimar la potencia de una muestra de Prueba.
USP 37 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 719

4.1 Datos

Existen, fundamentalmente, dos tipos de datos de valoración biológica: cuantitativos y cuantales (categóricos). Los datos
cuantitativos pueden ser continuos (que no se limitan a observaciones discretas; p.ej., recopilados de un instrumento), de re-
cuento (p.ej., unidades formadoras de placas) o discretos (p.ej., títulos de dilución determinados por punto final). Los datos
cuantales a menudo son dicotómicos; por ejemplo, vida/muerte en un modelo de respuesta animal o positivo/negativo en un
ensayo de infectividad basado en placa que resulte en la destrucción de una monocapa celular después de la administración de
un agente infeccioso. Los datos cuantitativos se pueden transformar en datos cuantales seleccionado un umbral que distinga
una respuesta positiva de una respuesta negativa. Dicho umbral se puede calcular a partir de datos obtenidos de un control
negativo, por ejemplo, sumando (o restando) una medida de incertidumbre (tal como dos o tres veces la desviación estándar
de las respuestas de control negativo) al promedio del control negativo. Los analistas deben ser cuidadosos con respecto a la
transformación de datos cuantitativos en datos cuantales, puesto que dicha operación resulta en una pérdida de información.

4.2 Suposiciones

Una suposición clave para el análisis de la mayoría de las valoraciones biológicas es que las muestras Estándar y de Prueba
contienen el mismo analito efectivo o población de analitos y, por consiguiente, se puede esperar que se comporten de mane-
ra similar en la valoración biológica. A esto se le denomina similitud. Tal como se presentará en mayor detalle en el capítulo
general Análisis de Datos de Va/oraciones Biológicas (1 034) para modelos estadísticos específicos, la similitud biológica implica la
presencia de similitud estadística (para modelos de líneas paralelas y curvas paralelas, las curvas del Estándar y de la muestra de
Prueba son paralelas; para modelos de cociente de pendiente, las líneas del Estándar y de la muestra de Prueba tienen una
misma ordenada al origen). Cualquier afirmación contraria es falsa. La similitud estadística (líneas paralelas, curvas paralelas o
misma ordenada al origen, según corresponda) no asegura la similitud biológica. No obstante, incumplir con la similitud esta-
dística puede tomarse como evidencia contra la similitud biológica. Por lo tanto, la existencia de un par Estándar-muestra de
Prueba que pase la evaluación de similitud estadística es una condición necesaria, pero no suficiente, para cumplir con la supo-
sición clave de la similitud biológica. En consecuencia, la similitud biológica sigue siendo, inevitablemente, una suposición. Las
desviaciones de la similitud estadística que presenten valores constantes a través de valoraciones repetidas pueden indicar efec-
tos de la matriz o diferencias reales entre los materiales Estándar y de Prueba. Lo anterior resulta cierto incluso si la desviación
de la similitud estadística es lo suficientemente pequeña como para sustentar la determinación de una potencia relativa.
En muchas valoraciones, múltiples compuestos proporcionarán curvas de concentración-respuesta similares, por lo que pue-
de resultar razonable emplear un sistema de valoración biológica para describir o incluso comparar las curvas de respuesta de
diferentes compuestos. No obstante, no es apropiado informar la potencia relativa a menos que las muestras Estándar y de
Prueba contengan únicamente el mismo analito o población de analitos activos. Los productos biológicos a menudo presentan
variaciones entre lotes con respecto a la distribución de analitos (es decir, la mayoría de los productos biológicos contienen un
producto de interés y, en niveles aceptablemente bajos, algunos contaminantes del proceso que pueden mostrarse activos en
la valoración biológica). Por lo tanto, la evaluación de la similitud es, al menos en parte, una evaluación que determina si la
distribución de analitos en la muestra de Prueba es lo suficientemente cercana a la distribución en la muestra Estándar como
para que la potencia relativa sea significativa; en otras palabras, la valoración es una comparación de características. Cuando
existe evidencia (derivada de métodos diferentes a la valoración biológica) de que las muestras Estándar y de Prueba no contie-
nen los mismos compuestos activos, no se cumple con la suposición de similitud biológica, por lo que no es apropiado infor-
mar la potencia relativa.
Otras suposiciones estadísticas comunes en el análisis de valoraciones biológicas cuantitativas son la varianza constante de
las respuestas alrededor de un modelo ajustado (ver la sección 4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderación y Transformación
para un análisis más profundo), residuos normalmente distribuidos (un residuo es la diferencia entre una respuesta observada y
la respuesta prevista por el modelo) e independencia de los residuos.
La varianza constante, normalidad e independencia están interrelacionadas en la práctica de la valoración biológica. Para va-
loraciones biológicas con una respuesta cuantitativa, se puede usar una transformación de datos bien seleccionada para obte-
ner una varianza aproximadamente constante y una distribución de residuos casi normal. Una vez que se ha impuesto la trans-
formación, queda pendiente tratar la suposición de independencia reflexionando sobre la estructura del diseño de la valora-
ción biológica en el modelo de análisis. La independencia de los residuos es importante para evaluar la aptitud del sistema y de
la muestra.

4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderación y Transformación

Los análisis simples de los datos de valoraciones biológicas cuantitativas requieren que los datos presenten una distribución
aproximadamente normal con una varianza casi constante cercana de un extremo a otro del intervalo de los datos. Para los
modelos de regresión lineal y no lineal, la varianza referida en este capítulo es la varianza residual derivada del ajuste del mode-
lo. A menudo, no se observa la varianza constante; la heterogeneidad de la varianza se puede manifestar como un incremento
en la variabilidad con un incremento en la respuesta. Si las varianzas no son iguales, pero los datos se analizan como si lo fue-
ran, la estimación de la potencia relativa aún podría ser razonable; no obstante, si no se trata la varianza inconstante alrededor
del modelo de concentración-respuesta ajustado se obtendrá una estimación poco confiable de la varianza dentro de la valora-
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ción. Asimismo, la evaluación de la similitud estadística puede no ser exacta y no se deben usar los errores estándar ni los inter-
valos de confianza para todos los parámetros (incluyendo un intervalo para la potencia relativa basado en el Teorema de Fie-
ller). Los intervalos de confianza para la potencia relativa que combinan estimaciones de potencia de múltiples valoraciones
pueden ser erróneos si se usa el error dentro de la valoración para calcular el intervalo de confianza.
La constancia de la varianza se puede evaluar mediante gráficas de residuos, análisis Box-Cox (o ley del poder) o la prueba
de Levene. Con la prueba de Levene, en lugar de basarse en el valor p, el cambio obtenido en la estadística es útil como funda-
mento para juzgar si se ha mejorado o deteriorado la homogeneidad. La varianza se evalúa mejor en un conjunto grande de
datos de valoración. Resulta inapropiado usar únicamente la varianza entre determinaciones repetidas de la valoración vigente,
debido a que existen muy pocos datos para determinar de manera adecuada varianzas verdaderamente representativas, espe-
cíficas para cada concentración. Los datos sobre la varianza son escasos durante el desarrollo; resulta prudente reevaluar la va-
rianza durante la validación y monitorearla periódicamente durante el uso continuo de la valoración.
Dos métodos usados para mitigar la heterogeneidad de la varianza son la transformación y la ponderación. La falta de va-
rianza constante puede tratarse mediante una transformación adecuada. Asimismo, la transformación puede mejorar la norma-
lidad de los residuos y el ajuste de algunos modelos estadísticos a los datos. Se debe seleccionar una transformación para un
sistema de valoración durante el desarrollo, verificarla durante la validación, usarla de manera uniforme en las valoraciones de
rutina y verificarla periódicamente. Los datos de la valoración biológica comúnmente se presentan con la concentración trans-
formada por logaritmo; las valoraciones de cociente de la pendiente se presentan con la concentración en la escala original.
La transformación se puede aplicar a los datos de la respuesta, así como a los datos de la concentración. Las opciones comu-
nes para una transformación de la respuesta incluyen la transformación logarítmica, por raíz cuadrada (para recuentos), recí-
proca y, para el recuento de datos con asíntotas conocidas, por logit del porcentaje de máxima respuesta. Las transformacio-
nes logarítmicas son de uso común, debido a que convierten un segmento útil de la relación concentración-respuesta en un
segmento casi lineal y debido a su facilidad para transformar de vuelta a la escala original para fines de interpretación. Se pue-
de llevar a cabo un ajuste log-log con datos que presentan un comportamiento no lineal. Asimismo, existen otras alternativas
disponibles, p. ej., los datos se pueden transformar mediante la inversa de la función del Poder de la Media (POM, por sus siglas
en inglés). Un coeficiente del Poder de la Media de k = 2 corresponde a una transformación logarítmica de los datos. Para un
análisis más extenso de las relaciones entre datos transformados por logaritmos y datos sin transformar, ver el Apéndice del
capítulo general Validación de Valoraciones Biológicas (1033).
Se debe tomar en cuenta que la transformación de los datos requiere la reevaluación del modelo usado para ajustar los da-
tos. Desde el punto de vista estadístico, no existe nada especial con respecto a la escala original de medición; resulta aceptable
cualquier transformación que mejore la concordancia con las suposiciones. No obstante, los analistas deben reconocer que las
transformaciones, la selección del modelo estadístico y la selección del esquema de ponderación están interrelacionadas. El uso
de una transformación puede afectar la selección del modelo estadístico, es decir, transformar la respuesta mediante un loga-
ritmo o raíz cuadrada, por ejemplo, puede cambiar la forma de la curva de respuesta y, para un modelo lineal, puede cambiar
el intervalo de concentraciones cuyas respuestas sean casi rectas y casi paralelas.
Para valoraciones con varianza no constante, una opción razonable es la adopción de un análisis ponderado. Aunque la pon-
deración no puede tratar la falta de normalidad residual, se considera una metodología estadística válida para poner énfasis en
datos más precisos. Idealmente, las ponderaciones se pueden basar en la inversa de la varianza prevista dentro de la valoración
(o dentro de los bloques) de cada respuesta donde los factores que predicen la varianza son independentes de las respuestas
observadas en una valoración específica.
En la práctica, muchas valoraciones biológicas presentan variaciones relativamente grandes en el logaritmo EC 50 (en compa-
ración con la variación en el logaritmo de la potencia relativa) entre valoraciones (y, en ocasiones, entre bloques dentro de la
valoración). Cuando no se trata en el modelo de varianza, esta variación en el logaritmo EC 50 provoca lo que parece ser una
gran variación en las respuestas cercanas a la media logarítmica EC 50 , lo cual a menudo resulta en ponderaciones demasiado
bajas para las observaciones cercanas al EC 50 .
Si la valoración es lo suficientemente estable (baja variabilidad en el EC 50 ), la varianza puede considerarse alternativamente
como una función de la concentración. Aunque no es lo ideal, podría ser razonable una metodología que utiliza varianzas de-
pendientes de la concentración cuando las ponderaciones se estiman a partir de un gran número de valoraciones, las varianzas
son pequeñas, cualquier desequilibrio en el número de observaciones de todas las concentraciones es tratado en el modelo de
varianza y no se presentan observaciones inusuales (valores aberrantes). Esta posibilidad se puede examinar graficando la va-
rianza de la respuesta en cada concentración (de preferencia, combinada a través de múltiples valoraciones) en función de la
concentración y luego contra una función de la concentración (p.ej., concentración cuadrada). La varianza será proporcional a
la función de concentración donde esta línea trazada se aproxime a una línea recta. La pendiente aparente de esta línea es
informativa, debido a que una línea horizontal indica que no es necesaria la ponderación. Si se puede encontrar una función
que genere una gráfica lineal, entonces las ponderaciones se consideran proporcionales a la recíproca de dicha función. Dicha
función puede no existir, en particular si la variación es mayor (o menor) en ambos extremos del intervalo de concentración
estudiado.
Independientemente de si se emplea un modelo o datos históricos, el objetivo es capturar la variabilidad relativa en cada
concentración. No es necesario asumir que el nivel de variabilidad absoluto de la valoración en uso es idéntico al de los datos
usados para determinar la ponderación, sino que únicamente los intervalos de las varianzas entre concentraciones sean unifor-
mes con los datos históricos o con los datos usados para determinar la función de la varianza.
USP 37 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 721

La capacitación y experiencia apropiadas en métodos estadísticos son esenciales para determinar una estrategia para generar
un modelo de varianza adecuada. Las fuentes de variabilidad pueden identificarse de manera errónea si se emplea el modelo
incorrecto de varianza. Por ejemplo, los datos pueden presentar una variación constante a lo largo de una curva logística de
concentración-respuesta de cuatro parámetros, pero también puede tener una variación apreciable en el parámetro EC 50 entre
bloques dentro de la valoración, o entre valoraciones. Si no se reconoce la variabilidad entre bloques o entre valoraciones, po-
dría parecer que esta valoración tiene una gran variación en la respuesta para concentraciones cercanas al valor promedio a
largo plazo del EC 50 . Un modelo ponderado con ponderaciones bajas para concentraciones cerca del EC 50 podría representar
erróneamente una característica principal del sistema de valoración.

4.4 Normalidad

Muchos métodos estadísticos para el análisis de respuestas cuantitativas suponen la normalidad de los residuos. Si no se
cumple la suposición de normalidad, la estimación de la potencia relativa y su error estándar pueden considerarse razonables,
pero las pruebas de aptitud y un intervalo de confianza para la estimación de la potencia relativa podrían ser inválidos. La ma-
yoría de los métodos usados en este capítulo son razonablemente robustos frente a desviaciones de la normalidad, por lo que
el objetivo es detectar anormalidades importantes. Durante el desarrollo de la valoración, y con el objeto de descubrir desvia-
ciones importantes de la normalidad, se pueden usar herramientas gráficas tales como una gráfica de probabilidad normal o
un histograma (o una herramienta similar como las gráficas de tallo y hoja o de caja) de los residuos a partir del ajuste del
modelo. El histograma debe ser unimodal y simétrico. La gráfica de probabilidad normal debe aproximase a una línea recta;
una gráfica de probabilidad normal que no es recta (p.ej., curva en un extremo, en ambos extremos, o en la parte media)
indica la presencia de anormalidad. Un patrón sobre una línea recta es indicativo de anormalidad. El comportamiento anormal
puede deberse a mediciones que son logarítmicas normales y presentan una variabilidad mayor a niveles más altos de respues-
ta. Lo anterior se puede considerar un patrón cóncavo en los residuos en una gráfica normal.
Las pruebas estadísticas de normalidad pueden no ser útiles. De acuerdo con la discusión previa sobre análisis estadístico de
la constancia de la varianza, cambiar el valor de una estadística de la prueba de normalidad, en lugar de basarse en un valor p,
funciona para juzgar si la normalidad se ha mejorado o empeorado. En lo que respecta a la evaluación de la varianza, se debe
evaluar la normalidad en un conjunto de datos tan grande como sea posible durante el desarrollo, reevaluarlos durante la vali-
dación y monitorearlos periódicamente durante el uso de la valoración. Las desviaciones importantes de la normalidad a me-
nudo pueden mitigarse mediante una transformación adecuada. La falta de evaluación y mitigación de desviaciones importan-
tes de la normalidad conlleva el riesgo de inhabilitar la detección apropiada de valores aberrantes, así como una pérdida en la
capacidad de obtener estimaciones confiables de variación.

4.5 Linealidad de los Datos de Concentración-Respuesta

Algunos análisis de valoraciones biológicas suponen que la forma de la curva de concentración-respuesta es una línea recta
o se aproxima a una línea recta para un intervalo limitado de concentraciones. En dichos casos, se puede evaluar un modelo
de respuesta lineal para determinar si se justifica para los datos disponibles. Los métodos de análisis de diferencias para evaluar
la linealidad enfrentan los mismos problemas que los métodos de análisis de diferencias aplicados al paralelismo-más datos y
una mejor precisión incrementan la posibilidad de detectar la falta de linealidad. Debido a que casi siempre la falta de lineali-
dad afecta la estimación de la potencia, los analistas deben evaluar las desviaciones de la linealidad de manera rutinaria si de-
sean emplear un modelo de respuesta lineal para estimar la potencia.
Si el examen de una gráfica revela claramente una desviación de la linealidad, es suficiente para concluir la falta de lineali-
dad. Sin embargo, una alta variabilidad de los datos puede ocultar una desviación de la linealidad. Por consiguiente, una me-
todología general para linealidad puede corresponder con la usada para la similitud, que se desarrolla de manera más elabora-
da en la sección 4.7 Análisis de Aptitud y Aplicación del Análisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo).
(1) Especificar una medida de desviación de la linealidad que se pueda combinar con todas las muestras o que sea específica
para una muestra. Las posibilidades incluyen la suma de la falta de linealidad de coeficientes cuadrados o cuadráticos.
(2) Se puede emplear una de las cuatro metodologías del Paso 2 de Aplicación del Análisis de Equivalencia para Similitud (para-
lelismo) para determinar, durante el desarrollo, un intervalo de valores aceptables (intervalo de aceptación) para la medida
de la falta de linealidad.
(3) Determinar un intervalo de confianza bilateral del 90% en la medición de la falta de linealidad, siguiendo el procedimien-
to de Pruebas Doblemente Unilaterales (TOST, por sus siglas en inglés) y comparar el resultado con el intervalo de acepta-
ción según se determina en (2).
A menudo, se seleccionará un subconjunto de concentraciones medidas en la valoración para establecer una curva lineal de
concentración-respuesta, el cual puede identificarse gráficamente. Las concentraciones en los extremos del intervalo deben ser
examinadas cuidadosamente, debido a que a menudo tienen un gran impacto sobre la pendiente y los cálculos derivados de
la pendiente. Si la intención en la valoración final es usar únicamente concentraciones en el intervalo lineal, se debe seleccionar
un intervalo de concentraciones que genere líneas rectas paralelas para las potencias relativas esperadas durante el uso rutina-
rio de la valoración; de otro modo, la valoración no pasará las pruebas de paralelismo cuando la potencia produzca valores de
respuesta de la valoración que estén fuera del intervalo lineal de respuesta. Cuando la potencia está fuera del intervalo lineal,
podría resultar apropiado ajustar la concentración de la muestra basándose en dicha potencia estimada y analizar de nuevo
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722 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

para obtener un resultado de potencia válido. Las valoraciones repetidas en conjunto con las valoraciones válidas pueden ge-
nerar una estimación de potencia sesgada, debido al proceso selectivo de repetir valoraciones cuando la respuesta está en los
extremos de la curva de concentración-respuesta.
El problema es más complejo para valoraciones en las que existe incluso una modesta variación en la forma o ubicación de la
curva de concentración-respuesta de corrida a corrida o entre bloques dentro de una valoración. En tales valoraciones, puede
resultar apropiado seleccionar subconjuntos para cada muestra en cada valoración, o incluso en cada bloque dentro de una
valoración. Se debe tomar en cuenta que un modelo de efectos fijos eliminará la necesidad de subconjuntos diferentes en blo-
ques diferentes, pero un modelo de efectos mixtos puede revelar y acomodar diferentes subconjuntos en diferentes bloques
(ver la sección 4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Va/oraciones Biológicas).
Las pautas adicionales con respecto a la selección de subconjuntos de datos para la estimación de potencia relativa mediante
modelo lineal incluyen: usar al menos tres, y de preferencia cuatro, concentraciones adyacentes; que la pendiente del segmen-
to lineal sea lo suficientemente pronunciada; que las líneas que se ajustan a las muestras Estándar y de Prueba sean rectas; y
que las líneas de regresión para el ajuste sean paralelas. Una forma de derivar un criterio de pronunciamiento es calcular una
estadística t para evaluar si la pendiente es significativamente diferente de cero. Si la pendiente no es significativa, es posible
que la valoración biológica tenga un desempeño deficiente; lo anterior se puede observar como un aumento de variación en
los resultados de potencia. Otro aspecto que sustenta el requisito de pronunciamiento adecuado de la pendiente es el uso de
algoritmos para la selección de subconjuntos. Sin un criterio de pronunciamiento de la pendiente, un algoritmo para la selec-
ción de subconjuntos, que busca identificar subconjuntos de tres o más puntos de datos contiguos que sean rectos y paralelos,
podría seleccionar concentraciones en una asíntota. Evidentemente, dichos subconjuntos son inapropiados para su uso en la
estimación de la potencia. El pronunciamiento o la importancia del pronunciamiento de la pendiente deben depender de la
valoración. Este criterio debe establecerse durante el desarrollo de la valoración y, posiblemente, redefinirse durante la valida-
ción de la valoración.

4.6 Modelos Comunes de Valoración Biológica

La mayoría de las valoraciones biológicas consisten en una serie de concentraciones o diluciones de una muestra de Prueba y
de un material Estándar. Un modelo matemático se ajusta a los datos de concentración-respuesta y, posteriormente, se puede
calcular una potencia relativa a partir de los parámetros del modelo. La selección del modelo puede depender de si se están
analizando datos cuantitativos o cualitativos.
Para datos cuantitativos, los modelos que emplean perfiles de respuestas paralelas, los cuales sustentan la evaluación compa-
rativa para determinar la potencia relativa, pueden ofrecer ventajas estadísticas. Si se emplean dichos modelos, las concentra-
ciones o diluciones por lo general se modifican usando una escala geométrica, p.ej., en incrementos duplicativos, logarítmicos
o de logaritmo medio. Si se usa el modelo de cociente de la pendiente, las concentraciones o diluciones se pueden espaciar de
igual manera en la concentración, en lugar del logaritmo de la concentración. Es posible usar diversas funciones para ajustar
un modelo de respuesta paralelo a datos cuantitativos, incluyendo una función lineal, una función polinómica de orden mayor,
una función logística de cuatro parámetros (sigmoidea simétrica) y una función logística de cinco parámetros para sigmoideas
asimétricas. Dichas funciones requieren un número suficiente de concentraciones o diluciones para ajustarse al modelo. Para
evaluar la falta de ajuste de cualquier modelo, es necesario contar con al menos una concentración (o dilución) -preferible-
mente varias- más que el número de parámetros que se estimarán en el modelo. Asimismo, por lo regular se usa por lo me-
nos una concentración -de preferencia dos- para sustentar cada asíntota.
En ocasiones, se selecciona un modelo lineal debido a su eficiencia aparente y facilidad de procesamiento. Debido a que los
perfiles de respuesta de la valoración biológica son, por lo general, no lineales, el laboratorio puede realizar un experimento
con un amplio intervalo de concentraciones para identificar la región aproximadamente lineal del perfil de concentración-res-
puesta. Para datos que siguen un modelo logístico de cuatro parámetros, éstas son las concentraciones cercanas al centro de la
región de la respuesta, a menudo una respuesta de 20% a 80% cuando se modifica nuevamente la escala de los datos para las
asíntotas. Se deben tomar precauciones apropiadas cuando se emplea un modelo lineal, debido a las diversas razones por las
que una región aparentemente lineal podría cambiar. Es posible identificar una región lineal estable después de acumular sufi-
ciente experiencia con la valoración y con la variedad de muestras que se espera analizar con la misma. Los datos que siguen la
función logística de cuatro parámetros también se pueden linealizar mediante transformación. La región inferior de la función
es aproximadamente lineal cuando los datos se transforman con logaritmos (ajuste log-log).
Por lo regular, los datos cuantales se ajustan usando modelos matemáticos más complejos. Se puede utilizar un modelo de
probita o de logit para estimar un percentilo de la curva de respuesta (a menudo el percentilo 50) o, de manera más directa, la
potencia relativa de la Prueba con respecto al Estándar. El análisis Spearman-Karber es un método sin modelo que se puede
emplear para la determinación del percentilo 50 de una curva de concentración-respuesta cuantal.

4.7 Análisis de Aptitud

La evaluación de la aptitud del sistema y de la aptitud de la muestra son necesarias para asegurar la calidad de los resultados
de la valoración biológica. La aptitud del sistema en la valoración biológica, al igual que en otros métodos analíticos, consta de
criterios previamente especificados mediante los cuales se evalúa la validez de una valoración (o, posiblemente, una corrida
que contenga varias valoraciones). Los analistas pueden evaluar la aptitud del sistema determinando si algunos de los paráme-
USP 37 Información Grnf'rai / (1032> Valoraciones Biológicas 723

tros de la respuesta del btándar y algunas propiedades (p.ej., variación residual) de los datos se encuentran en sus intervalos
habituales. A fin de obtener altas tasas de aceptación en la valoración, se recomienda aceptar grandes fracciones de estos inter-
valos habituales (99% o más) y evaluar la aptitud del sistema usando únicamente unos pocos parámetros de respuesta del Es-
tándar sin correlación. La selección de los parámetros de aptitud del sistema y de sus intervalos también se puede informar
mediante estudios empíricos o de simulación que midan la influencia de los cambios sobre un parámetro en la estimación de
la potencia.
La aptitud de la muestra en una valoración biológica se evalúa mediante criterios previamente especificados para la validez
de la estimación de la potencia de una muestra de Prueba individual y, por lo regular, se enfoca en la evaluación de la simili-
tud. Es necesario establecer los criterios de aptitud del sistema y de la muestra durante el desarrollo de la valoración biológica y
antes de su validación. Cuando se cuente con poca experiencia con respecto a la valoración biológica, dichos criterios pueden
considerarse provisionales.
Aptitud del Sistema-Los parámetros de aptitud del sistema se pueden seleccionar basándose en el diseño y en el modelo
estadístico. No obstante, independientemente del diseño o modelo, los parámetros de aptitud del sistema debe estar directa-
mente relacionados con la calidad de la valoración biológica. Dichos parámetros por lo regular se basan en muestras estándar
y de control. Por ejemplo, en las valoraciones de líneas paralelas, los valores bajos de la pendiente del Estándar a menudo ge-
neran estimaciones de potencia de baja precisión. En lugar de rechazar las valoraciones con pendientes bajas, el uso de valora-
ciones repetidas adicionales podría resultar más efectivo para los analistas hasta que pueda mejorarse el sistema de valoración
para generar estimaciones de potencia con una precisión más alta de manera constante. El monitoreo del intervalo de niveles
de respuesta y ubicación de las asíntotas asociadas a controles o con la muestra del Estándar puede ser particularmente impor-
tante para establecer niveles de respuesta apropiados. Cualquier desviación o tendencia en alguno de los criterios puede ser
indicativa de la degradación de un reactivo crítico o del material Estándar. Se deben implementar métodos de Control Estadís-
tico de Procesos (SPC, por sus siglas en inglés) para detectar tendencias en los parámetros de aptitud del sistema.
Dos medidas comunes de aptitud del sistema son la evaluación de la idoneidad del modelo (capacidad de ajuste) y de la
precisión. El uso de determinaciones repetidas en un diseño completamente aleatorizado permite separar un término de error
puro de la evaluación de falta de ajuste. Se debe tener cuidado al derivar un criterio para la falta de ajuste; el uso de un térmi-
no de error puro incorrecto puede provocar una evaluación artificial. La falta de ajuste de la suma de cuadrados obtenida a
partir del ajuste del modelo al Estándar puede ser una medida útil de idoneidad del modelo, dependiendo de las concentracio-
nes usadas y de cómo difieran los datos obtenidos del modelo. Es posible establecer un umbral basándose en el análisis de
sensibilidad (evaluación de la sensibilidad de la valoración a los cambios en el analito) y/o datos históricos, más allá de los cua-
les el valor de falta de ajuste indica que los datos no son adecuados. Se debe tomar en cuenta que los datos de Prueba no se
usan en esta parte; la idoneidad del modelo para la Prueba es parte de la aptitud de la muestra.
Existen dos alternativas a considerar para evaluar la precisión. Un método emplea el error cuadrático medio (varianza resi-
dual) a partir del ajuste del modelo con el Estándar únicamente. Dado que esta metodología puede tener pocos grados de
libertad para la estimación de la varianza, podría resultar más útil emplear un error cuadrado medio combinado a partir de
ajustes de modelos separados con el Estándar y la Prueba. Una vez que se haya seleccionado la medida, se usan datos históri-
cos y análisis de sensibilidad para determinar un umbral de aceptación.
Aptitud de la Muestra-La aptitud de la muestra en la valoración biológica por lo general consiste en la evaluación de la
similitud, la cual únicamente se puede realizar dentro del intervalo de valoración. La potencia relativa se puede informar única-
mente a partir de muestras que presenten una similitud con el Estándar, que tengan la calidad requerida para el ajuste del
modelo y que hayan sido diluidas para generar un EC 50 (y potencia) dentro del intervalo del sistema de valoración.
Similitud-En el contexto de evaluación de similitud, el análisis de hipótesis clásico (diferencia) evalúa la hipótesis nula que
establece que una medida (un parámetro de no similitud que mide la diferencia entre las curvas de concentración--respuesta
del Estándar y de la Prueba) es cero, con una hipótesis alternativa implícita que establece que la medida no es cero o que no se
han cumplido las suposiciones estadísticas. El criterio habitual (la "prueba de diferencia") que indica que el valor p debe ser
mayor que cierto valor crítico para poder declarar que la muestra es similar a la referencia controla la probabilidad de que las
muestras sean falsamente declaradas como no similares; éste es el riesgo del productor, que muestras adecuadas sean rechaza-
das. El riesgo del consumidor (es decir, el riesgo de que muestras no similares se declaren similares) se controla mediante la
precisión de la medida de ausencia de similitud y la cantidad de determinaciones repetidas en la valoración; por lo regular, la
evaluación de éstas es muy deficiente, dejando sin control el riesgo del consumidor.
En contraste con el análisis de diferencias, el análisis de equivalencia para similitud (es decir, evaluar si un intervalo de con-
fianza del 90% para una medición de ausencia de similitud está contenido dentro de los límites de equivalencia especificados)
permite únicamente una probabilidad del 5% de que muestras con medidas de ausencia de similitud que están fuera de los
límites de equivalencia sean declaradas similares (controlando así el riesgo del consumidor). Con el análisis de equivalencia,
resulta práctico examinar y administrar el riesgo del productor asegurando que la valoración cuente con suficientes determina-
ciones repetidas para tener una buena precisión al estimar las medidas de ausencia de similitud.
Para la comparación de pendientes, se han usado tradicionalmente las pruebas de d1terencía para establecer el paralelismo
entre una muestra de Prueba y la muestra Estándar. No obstante, el uso de esta metodología no permite al laboratorio concluir
que las pendientes sean iguales, puesto que los datos pueden ser demasiado variables o el diseño de la valoración puede ser
demasiado débil para establecer una diferencia. Sin embargo, el laboratorio puede concluir que las pendientes son lo suficien-
temente similares usando la metodología del análisis de equivalencia.
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724 (1 032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

El análisis de equivalencia presenta ventajas prácticas en comparación con el análisis de diferencias, incluyendo que una ma-
yor cantidad de determinaciones repetidas resulta en una mejor precisión de la valoración, la cual incrementará las probabili-
dades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; que una menor cantidad de determinaciones repetidas o de
precisión de la valoración reducirá las probabilidades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; y que se obtie-
nen metodologías sólidas para combinar datos de múltiples valoraciones de la misma muestra para comprender de mejor ma-
nera si una muestra es verdaderamente similar al Estándar o no.
Debido a las ventajas asociadas con el uso del análisis de equivalencia en la evaluación de similitud, los analistas pueden
cambiar las valoraciones existentes a análisis de equivalencia o pueden implementar métodos de análisis de equivalencia cuan-
do se realizan cambios a las valoraciones existentes. Con este propósito, es conveniente examinar el riesgo de que la valoración
no apruebe muestras adecuadas. Este riesgo depende de la precisión del sistema de valoración, de la estrategia para determi-
naciones repetidas en el sistema de valoración y de los valores críticos de los parámetros de similitud (esto constituye un análi-
sis de capacidad del proceso). Una metodología para cambiar una valoración establecida a partir del análisis de diferencia a un
análisis de equivalencia (para similitud) consiste en usar la capacidad de proceso de la valoración para establecer valores críti-
cos para parámetros de similitud. Esta metodología resulta razonable para una valoración establecida, debido a que los riesgos
(de declarar falsamente muestras como similares o no similares) son implícitamente aceptables, dado el historial de uso exitoso
de la valoración.
Las medidas de similitud se pueden basar en los parámetros de la curva de concentración-respuesta y pueden incluir la pen-
diente para una valoración de línea paralela recta; la ordenada al origen para una valoración de cociente de la pendiente; la
pendiente y asíntotas para una valoración logística de líneas paralelas de cuatro parámetros; o la pendiente, las asíntotas y el
parámetro de falta de simetría en un modelo de sigmoideo de cinco parámetros. En algunos casos, estas medidas de similitud
tienen un significado interpretable y práctico en la valoración; algunos cambios en la forma de la curva, por ejemplo, pueden
relacionarse con cambios específicos (tales como la presencia de un contaminante activo específico) en el producto. Siempre
que sea posible, discutir dichos cambios y sus probables efectos será de gran valor para establecer los límites de equivalencia.
Aplicación del Análisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo)--C.onforrne a lo indicado anteriormente, muchos procedi-
mientos estadísticos para evaluar la similitud se basan en una hipótesis nula que indica la presencia de similitud y en la hipóte-
sis alternativa que indica un estado de ausencia de similitud. Posteriormente, la incapacidad para determinar que la similitud es
improbable desde el punto de vista estadístico se toma corno una conclusión de similitud. Sin embargo, dicha incapacidad
para establecer un fundamento probabilístico de ausencia de similitud en realidad no prueba la existencia de similitud. El análi-
sis de equivalencia ofrece un método para que el analista llegue a una conclusión (si los datos así lo requieren) de similitud
suficiente al tiempo que controla el riesgo de hacerlo inadecuadamente. A continuación se proporciona una secuencia para el
proceso de aplicación del análisis de equivalencia.
Paso 7: Seleccionar una medida de ausencia de similitud.
Para el caso de líneas paralelas, ésta puede ser la diferencia o el cociente de las pendientes. (El cociente de las pendientes
puede ser menos sensible al valor de la pendiente. Enmarcar la diferencia de la pendiente como un cambio proporcional a
partir del Estándar en lugar de usar unidades de pendiente absolutas tiene la ventaja de ser invariable a las unidades en los
ejes de concentración y respuesta.) Para una valoración de cociente de la pendiente, la medida de ausencia de similitud
puede ser la diferencia en las ordenadas al origen entre las muestras de Prueba y Estándar. Nuevamente, enmarcar esta
diferencia como una proporción del intervalo de respuesta (posiblemente transformado) del Estándar para hacer que la
medida sea invariable a las unidades de la respuesta podría presentar ventajas.
La determinación de similitud se puede basar en los parámetros individuales, de uno en uno; para el modelo logístico de
cuatro parámetros, la similitud entre las muestras Estándar y de Prueba se pueden evaluar de manera discreta para la asín-
tota superior, la pendiente y la asíntota inferior. Si se utilizan curvas sigmoideas con parámetros adicionales para ajustar
los datos de la valoración biológica, también es importante considerar el tratamiento de la similitud entre las preparacio-
nes Estándar y de Prueba de los parámetros de curva adicionales (p.ej., parámetro de asimetría del modelo de cinco pará-
metros). Como alternativa, la evaluación de similitud se puede basar en una sola medida compuesta de falta de paralelis-
mo, tal como la suma de paralelismo de cuadrados. Ésta se determina como la diferencia en la suma residual de errores
cuadrados (RSSE, por sus siglas en inglés) entre el valor obtenido del ajuste de las curvas del Estándar y de la Prueba por
separado y el valor obtenido de la imposición de paralelismo:
Suma de paralelismo de cuadrados = RSSEP - RSSE, - RSSEt
donde los subíndices p, s y t denotan el modelo Paralelo, el modelo Estándar y el modelo de Prueba, respectivamente.
Para cualquier medida compuesta, el analista debe considerar la ponderación relativa implícita de la importancia de las
tres (o más) regiones de la curva y si la ponderación es apropiada para el problema en cuestión. Por ejemplo, para la suma
de paralelismo de cuadrados con modelos no lineales, la ponderación provista a la comparación de las asíntotas depende
de la cantidad de datos en la valoración en uso sobre y cerca de las asíntotas.
Paso 2: Especificar un intervalo de valores aceptables, por lo regular denominado intervalo de equivalencia o "zona de indiferen-
cia", para la medida de falta de similitud.
El desafío de implementar un análisis de equivalencia radica en establecer límites de equivalencia apropiados para las me-
didas de ausencia de similitud. Idealmente, se cuenta con información disponible para vincular la variación en las medidas
de similitud con diferencias significativas en la función biológica (según se miden con la valoración biológica). La informa-
ción puede estar disponible a partir de la evaluación de valoraciones ortogonales. Las cuatro metodologías siguientes pue-
USP 37 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 725

den usarse para determinar este intervalo. Si se han especificado límites farmacopeicos para una medida definida de falta
de similitud, entonces la valoración debe satisfacer dichos requisitos.
a. La primera metodología consiste en compilar datos históricos que comparen el Estándar contra sí mismo y usar di-
chos datos para determinar el intervalo de equivalencia como un intervalo de tolerancia para la medida de falta de
paralelismo. La ventaja de usar datos históricos radica en que dan control al laboratorio sobre la tasa de incumpli-
miento falso (la tasa de incumplimiento de una muestra que es en realidad una muestra aceptable). La desventaja es
que no hay control sobre la tasa de cumplimiento falso (la tasa de cumplimiento de una muestra que pudiera tener
una diferencia inaceptable en el desempeño con respecto al Estándar). La especificación del intervalo de equivalencia
desarrollado de esta manera se basa únicamente en la capacidad de la valoración. Los laboratorios que emplean esta
metodología deben ser precavidos debido a que una valoración imprecisa que requiera mejoría podría generar un
intervalo de equivalencia tan amplio que no sería posible contar con una discriminación útil para ausencia de simili-
tud.
b. La metodología (a) es simple de implementar en la rutina y se puede emplear con diseños de valoraciones que no
ofrezcan estimaciones confiables de variación dentro de la valoración y, por ende, intervalos de confianza. No obs-
tante, existe el riesgo de que las valoraciones con cantidades de variación dentro de la valoración, mayores a las habi-
tuales, puedan cumplir inapropiadamente. Por consiguiente, la alternativa preferida a la metodología (a) es determi-
nar un intervalo de tolerancia para el intervalo de confianza para la medida de falta de paralelismo. Lo siguiente re-
sulta particularmente apropiado para cambiar una valoración existente, con un conjunto importante de datos históri-
cos sobre las muestras Estándar y de Prueba obtenidos a partir de una metodología de análisis de diferencia, a una
metodología de equivalencia:
i. Para cada valor de la medida de falta de paralelismo obtenido a partir de los datos históricos, se debe determi-
nar un intervalo de confianza de 95%, (m,n).
ii. Para cada intervalo de confianza, determinar su desviación máxima del paralelismo perfecto. Esto es máx(lml, 1

ni) para diferencias, máx(l /m,n) para cocientes y simplemente n para cantidades que deben ser positivas, tales
como la suma de cuadrados.
iii. Determinar un intervalo de tolerancia para las desviaciones máximas obtenidas en (ii), el cual será un intervalo
de tolerancia unilateral para estas cantidades necesariamente positivas. Se prefiere una metodología de intervalo
de tolerancia no paramétrico.
iv. Se concluye que los nuevos datos son "suficientemente paralelos" si el intervalo de confianza para la medida de
falta de paralelismo cae completamente dentro del intervalo determinado en (iii).
Las metodologías (a) y (b), basándose en la capacidad del ensayo, controlan únicamente la tasa de incumplimiento
falso y pasan por alto la tasa de cumplimiento falso. La incorporación de información de fuentes distintas a la evalua-
ción de la capacidad de la valoración provee control sobre la tasa de cumplimiento falso. Las metodologías (c) y (d)
son medios que se pueden usar con este propósito.
c. La tercera metodología comienza con datos históricos que comparan el Estándar consigo mismo y agrega datos que
comparan el Estándar con fallas conocidas, p.ej., muestras degradadas. Comparar los valores de la medida de ausen-
cia de similitud para datos para los que sea apropiada una conclusión de similitud (Estándar contra sí mismo) y para
datos para los que no sea apropiada una conclusión de similitud, p.ej., muestras degradadas. Basándose en esta com-
paración, determinar un valor de la medida de ausencia de similitud que discrimine entre los dos casos. Si se emplea
esta metodología, se debe utilizar un intervalo de muestras para el que no sea apropiada una conclusión de similitud,
incluyendo muestras con la más mínima ausencia de similitud importante. Para modelos no lineales, esta compara-
ción también se puede usar para determinar aquellos parámetros que deben evaluarse; algunos pueden no ser sensi-
bles a las fallas que pueden ocurrir con la valoración específica o con la recolección de muestras no similares.
d. La cuarta metodología se basa en combinar un análisis de sensibilidad de la curva de valoración para parámetros de
ausencia de similitud con lo que se conozca acerca del producto y de la valoración. Lo anterior es particularmente
útil si se dispone de información que vincule un cambio en una o más medidas de ausencia de similitud con las pro-
piedades del producto. Estas medidas pueden ser directas (p.ej., cambios en la conformación de una proteína) o in-
directas (p.ej., cambios en la eficiencia o seguridad de un modelo animal). Otra metodología complementaria es un
análisis de sensibilidad limitada, el cual combina el juicio del analista y del biólogo con respecto a la lectura de la
magnitud de los cambios en un parámetro de ausencia de similitud que sean significativos, mediante experimentos
de simulación y/o en el laboratorio, para demostrar los umbrales para parámetros de similitud que ofrecen protec-
ción contra una ausencia de similitud importante. Asimismo, los análisis de riesgo se pueden informar utilizando el
índice terapéutico del fármaco.
Paso 3. Examinar si el valor de la medida de falta de similitud se encuentra dentro del intervalo de equivalencia de valores acep-
tables.
Para las metodologías (a) y (b), comparar el valor obtenido de la medida de falta de paralelismo (a) o su intervalo de
confianza (b) con el intervalo obtenido al inicio del Paso 2. El valor debe estar dentro de los límites si se utiliza (a), o el
intervalo de confianza debe estar completamente dentro de los límites si se utiliza (b).
Una alternativa a la metodología descrita anteriormente [para (a)] consiste en usar un valor promedio (histórico) para la
varianza del cociente o diferencia en un parámetro de similitud-obtenido a partir de algún número de valoraciones indi-
viduales-para calcular un intervalo de aceptación para una estimación puntual del parámetro de similitud. Esta metodo-
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726 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

logía es más simple de implementar en la rutina y se puede usar con diseños de valoraciones que no sean capaces de
proveer estimaciones fidedignas de variación dentro de la valoración, aunque existe un precio. La metodología de análisis
de equivalencia que se basa en las mediciones de variación específica de la valoración (dentro de la valoración) (es decir,
los intervalos de confianza) presenta una postura conservadora en el sentido de que no aprobará la similitud de las mues-
tras de valoraciones con cantidades mayores a las habituales de variación dentro de la valoración. El uso de una región de
aceptación para un parámetro de similitud -en lugar de una región de aceptación para intervalos de confianza para el
parámetro de similitud-pierde dicho conservadurismo y, por ende, no es la opción preferida ante la existencia de alter-
nativas.
Para la metodología (c), se puede emplear una metodología que esencialmente trate el paralelismo como un problema de
diferenciación. La selección del punto de corte en la metodología (c) debe tomar en cuenta las tasas de decisiones de
falsos positivos y falsos negativos (así como los riesgos aceptables para el laboratorio) y debe reflejar con precisión la varia-
bilidad entre valoraciones. Por lo tanto, resulta razonable comparar la estimación puntual de la medida de falta de parale-
lismo con el punto de corte y no usar intervalos de confianza. Esta metodología es más simple de implementar en la ruti-
na y se puede usar con diseños de valoraciones que no son capaces de proveer estimaciones confiables de variación den-
tro de la valoración.
Para la metodología (d), se debe demostrar que la medida de ausencia de similitud es significativamente mayor que el
punto final inferior del intervalo de aceptación y significativamente menor que el punto final superior. (Si el intervalo de
aceptación es unilateral, se realiza únicamente la prueba individual aplicable.) Este es el uso de la metodología de Pruebas
Doblemente Unilaterales. En la mayoría de los casos, la metodología de Pruebas Doblemente Unilaterales se puede imple-
mentar de manera simple calculando un intervalo de confianza bilateral del 90%, que corresponde a una prueba de equi-
valencia del 5%. Si este intervalo de confianza cae totalmente dentro del intervalo de equivalencia especificado al inicio
del Paso 2, entonces se habrá demostrado con suficiencia la similitud. Para modelos de líneas paralelas, se puede usar (1)
un intervalo de confianza basado en el valor de la diferencia de las pendientes ±k veces el error estándar de dicho valor o
(2) el Teorema de Fieller para el cociente de las pendientes. Para modelos de cociente de pendientes, se emplea el interva-
lo de confianza para la diferencia de las intersecciones. Para modelos no lineales, existe evidencia de que estos métodos
simples de intervalo de confianza no alcanzan el nivel de confianza declarado, mientras que los métodos basados en perfi-
les de probabilidad o remuestreo son más apropiados.
Intervalo-El intervalo para una valoración biológica de la potencia relativa es el intervalo entre las potencias superior e infe-
rior para las que la valoración biológica presenta niveles de precisión adecuados, exactitud relativa, linealidad del logaritmo de
potencia y tasas de éxito para la aptitud del sistema y de la muestra. Resulta fácil determinar si una muestra, que es similar a
un Estándar, tiene o no una potencia relativa dentro del intervalo (validado) del sistema de valoración. Para muestras que no
son similares de conformidad con los criterios establecidos, resulta más complicado determinar si se puede obtener una esti-
mación de la potencia relativa para la muestra. En una valoración no lineal de líneas paralelas, se puede suponer que una
muestra que no presenta datos sobre una asíntota está fuera del intervalo de potencia de la valoración. En una valoración de
línea recta paralela, una muestra que no tiene tres o más puntos en la porción pronunciada de la curva de respuesta puede
estar fuera del intervalo de potencia de la valoración. Para muestras que no hayan mostrado similitud con la referencia, resulta
inapropiado informar la potencia o generar un cociente de los EC 50 a partir de ajustes no restringidos. Puesto que dichas mues-
tras pueden estar fuera del intervalo de la valoración, podría ser útil cambiar la dilución de la muestra de prueba para una
valoración subsiguiente, basándose en una estimación de la actividad relativa. Esta actividad relativa estimada puede obtenerse
mediante el cociente entre las concentraciones del Estándar y la Prueba que genera respuestas que coinciden con la respuesta
de referencia en el EC 50 de referencia.

4.8 Valores Aberrantes

Es necesario analizar los datos de la valoración biológica para detectar valores aberrantes antes del análisis de la potencia
relativa. Los valores aberrantes pueden ser simples eventos aleatorios o una señal de un problema sistemático en la valoración
biológica. El error sistemático que genera valores aberrantes puede deberse a un error de dilución en una o más concentracio-
nes de una muestra de Prueba o del Estándar, o debido a un error mecánico (p.ej., mal funcionamiento del sistema). Se pue-
den tener en cuenta diversas metodologías para detectar valores aberrantes. La inspección visual se utiliza con frecuencia, aun-
que se debe aumentar su alcance con una metodología más objetiva para prevenir un posible sesgo.
Un valor aberrante es un dato que aparentemente está fuera de lugar con respecto a los otros datos presentes. Un valor
aberrante puede tener una causa distinta e identificable, como por ejemplo, un error en la práctica, mal funcionamiento del
equipo o un error de registro de datos, o simplemente puede ser un valor inusual con respecto a la variabilidad comúnmente
observada y puede aparecer sin una causa identificable. La pregunta esencial con respecto a un valor aberrante es: ¿El valor
aberrante aparente se obtiene a partir de la misma población que los otros datos menos discrepantes o forma parte de otra
población? Si proviene de la misma población y, por lo tanto, el dato es un valor inusual (aunque legítimo) obtenido de casua-
lidad, entonces el dato debe mantenerse. Si proviene de otra población y el valor inusual del dato se debe a un error humano
o al mal funcionamiento de un instrumento, entonces el dato debe omitirse de los cálculos. En la práctica, a menudo se desco-
noce la respuesta a esta pregunta básica y las investigaciones sobre las causas a menudo son inconclusas. La administración de
valores aberrantes se basa en procedimientos y prácticas para generar la mejor respuesta posible a dicha pregunta esencial y
para guiar hacia una respuesta correcta.
USP 37 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 727

El capítulo general Interpretación y Tratamiento de Datos Analíticos (l 01 O) trata la designación, la identificación y el rechazo
de valores aberrantes, e incluye métodos estadísticos. Asimismo, el Capítulo General (1010> cita fuentes adicionales de infor-
mación que pueden ofrecer una revisión exhaustiva de la metodología estadística pertinente. El Capítulo General (101 O) no
ofrece comentarios explícitos con respecto al análisis de valores aberrantes en regresiones lineales o no lineales. Se pueden usar
técnicas de análisis de valores aberrantes apropiadas para datos obtenidos de la regresión de la respuesta sobre la concentra-
ción. Este capítulo ofrece algunos comentarios sobre valores aberrantes para el contexto de valoraciones biológicas a fin de
enfatizar o complementar la información del capítulo (101 O>.
De todos los procedimientos empleados para el análisis de compuestos farmacéuticos y fármacos biológicos, se puede espe-
rar que la valoración biológica presente la mayor tendencia a producir datos aberrantes. La administración de valores aberran-
tes es adecuada para los datos de valoración biológica en al menos dos niveles: cuando se puede verificar un dato individual o
un grupo de datos (p.ej., datos a una concentración) en función de las respuestas esperadas para la muestra y la concentra-
ción; y, por separado, cuando se pueden verificar la uniformidad de las estimaciones de potencia relativa de una valoración en
función de otras estimaciones independientes de la potencia del mismo material.
Tres aspectos importantes de la administración de valores aberrantes son la prevención, la designación y la identificación.
La prevención de valores aberrantes se prefiere por razones obvias, y se facilita mediante procedimientos que sean menos
propensos a errores y mediante verificaciones que sean sensibles a los tipos de errores que, dada la experiencia obtenida en el
desarrollo de la valoración, podrían esperarse. En efecto, el error nunca se convierte en un valor aberrante puesto que se pre-
vee su ocurrencia.
Una buena práctica requiere examinar los datos para detectar valores aberrantes y designar ("marcado") las observaciones
sobre aparentes valores aberrantes para su investigación. Si la investigación detecta una causa, entonces el dato aberrante se
puede excluir del análisis. Debido a la presencia común de variabilidad importante en la respuesta de las valoraciones biológi-
cas, es probable que una investigación del laboratorio sobre la observación de valores aberrantes no determine una causa. Sin
embargo, la falta de evidencia relacionada con la causa de un valor aberrante no es una indicación clara de que se requiera un
análisis estadístico de valores aberrantes. El conocimiento sobre el intervalo típico de la variabilidad de la respuesta de la valo-
ración debe usarse como justificación para utilizar análisis estadísticos para valores aberrantes.
La identificación de valores aberrantes consiste en utilizar reglas para confirmar que los valores no son uniformes con el mo-
delo estadístico conocido o asumido. En el caso de valores aberrantes sin una causa determinada, resulta tentador el uso de
procedimientos estadísticos de identificación de valores aberrantes para descartar valores inusuales. Descartar datos basándose
únicamente en consideraciones estadísticas debe realizarse con la menor frecuencia posible. El descarte falso de datos conlleva
a estimaciones de variabilidad demasiado optimistas y puede sesgar las estimaciones de potencia. El laboratorio debe monito-
rear la tasa de incumplimiento para su procedimiento de valores aberrantes y debe tomar acciones cuando ésta sea significati-
vamente más alta de lo esperado.
Los procedimientos estadísticos para la identificación de valores aberrantes depende de suposiciones con respecto a la distri-
bución de datos sin valores aberrantes. La identificación de datos como valores aberrantes podría significar únicamente que la
suposición con respecto a la distribución es incorrecta. Si es común la reducción de valores aberrantes debido a consideracio-
nes estadísticas, en particular si los valores aberrantes tienden a presentarse en valores o respuestas altos, entonces esto puede
indicar que los datos requieren de algún ajuste, por ejemplo una transformación logarítmica, como parte del procedimiento de
valoración. Dos metodologías para la evaluación estadística de valores aberrantes están basadas en determinaciones repetidas
y en modelos.
Metodologías Basadas en Determinaciones Repetidas-Cuando se llevan a cabo determinaciones repetidas en concentra-
ciones de una muestra de Prueba y del Estándar, se puede emplear un criterio de "variabilidad extra" (EV, por sus siglas en
inglés) para detectar valores aberrantes. Los datos históricos pueden analizarse para determinar el intervalo en la variabilidad
comúnmente observada entre determinaciones repetidas y dicha distribución de intervalos se puede usar para establecer un
extremo en el intervalo que puede señalar un valor aberrante. Las métricas que pueden emplearse incluyen el intervalo simple
(repetición máxima menos repetición mínima), la desviación estándar, o el coeficiente de variación o desviación estándar rela-
tiva (RSD, por sus siglas en inglés) entre determinaciones repetidas. No obstante, si la valoración biológica presenta heteroge-
neidad en la variabilidad, las suposiciones con respecto a la dispersión uniforme de datos son infundadas. Los analistas pueden
usar un criterio variable a través de distintos niveles de la valoración biológica, o pueden transformar los datos a una escala que
produzca una variabilidad homogénea. La transformación se puede llevar a cabo con una metodología de Poder de la Media,
según se discutió con anterioridad. Cuando está presente la heterogeneidad, es muy probable que exista una falta de normali-
dad, por lo que se debe usar el intervalo en lugar de la desviación estándar o la desviación estándar relativa.
Las acciones tomadas al detectar un valor aberrante potencial dependen en parte del número de determinaciones repetidas.
Si se detecta una variabilidad extra dentro de un par (n = 2) a una concentración de una muestra de Prueba o del Estándar, no
siempre resultará claro cuál de las determinaciones repetidas es aberrante, por lo que el laboratorio deberá eliminar la concen-
tración de cualquier otro procesamiento adicional. Cuando se llevan a cabo más de dos determinaciones repetidas en cada
dilución, el laboratorio puede optar por una estrategia que identifique cuál de los extremos puede ser el valor aberrante. Como
alternativa, el laboratorio puede optar por eliminar la dilución del procesamiento adicional.
Metodologías Basadas en Modelos-Las metodologías basadas en modelos se pueden usar para detectar valores aberrantes
dentro de los datos de la valoración biológica. Estas metodologías emplean los residuos derivados del ajuste de un modelo
apropiado. En general, si se emplean métodos basados en modelos para identificar valores aberrantes potenciales, los modelos
728 (1032> Valoraciones Biológicas/ Información Cenera/ USP 37

usados pueden realizar menos suposiciones sobre los datos que los modelos usados para evaluar la aptitud y la potencia esti-
mada. Por ejemplo, un modelo de regresión no paramétrico (suavizado) puede ser útil.
Por último, una alternativa para descartar datos aberrantes consiste en usar métodos robustos que sean menos sensibles a la
influencia de observaciones de valores aberrantes. El uso de la mediana en lugar de la media para describir el centro de los
datos es un ejemplo de una perspectiva robusta. Asimismo, una regresión empleando el método de cuadrados mínimos, que
sustenta muchos de los métodos tratados en este capítulo, no es robusta ante la presencia de valores aberrantes. El uso de
métodos tales como una regresión robusta puede ser adecuado, pero no está cubierto en los capítulos de valoraciones biológi-
cas de la USP.

4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biológicas

La elección de tratar factores como fijos o aleatorios es importante para el diseño de las valoraciones biológicas, los experi-
mentos de desarrollo, el análisis estadístico de datos y la validación de la valoración biológica. Los efectos fijos son factores
para los que todos los niveles, o todos los niveles de interés, se presentan discretamente, como muestra, concentración, tem-
peratura y duración de la descongelación, y tiempo de incubación. Los datos para una respuesta a cierto nivel o a una combi-
nación de niveles de un factor fijo puede predecir respuestas futuras. Se espera que los efectos fijos ocasionen un cambio uni-
forme en las respuestas. Los analistas estudian los efectos fijos controlándolos en el diseño y examinando los cambios en las
medias a distintos niveles del factor.
Los efectos aleatorios son factores cuyos niveles en una corrida particular de una valoración se consideran representativos de
los niveles que pudieran estar presentes. Es decir, no se espera que ningún valor específico del factor aleatorio tenga influencia
sobre la respuesta, si no que dicho valor pueda variar dependiendo de cierta distribución de valores esperada y que, por consi-
guiente, pueda ser una fuente de variabilidad. Por ejemplo, no se desea predecir la respuesta de la valoración para un día espe-
cífico, pero existe interés en predecir la variación en la respuesta relacionada con el factor "día". Los ejemplos de los efectos
aleatorios incluyen el lote de reactivo, el operador o el día si no existe interés en lotes de reactivos, operadores o días específicos
como fuentes de variabilidad. Los analistas pueden estudiar los efectos aleatorios midiendo los componentes de varianza que
corresponden a cada efecto aleatorio. Los componentes de varianza sólo se pueden estimar de manera adecuada si existe un
número apreciable de niveles de cada efecto aleatorio. Si, por ejemplo, se cuenta únicamente con dos o tres lotes de reactivo o
analistas presentes, la estimación de la variación asociada con dichos factores será deficiente.
Realizar una selección correcta con respecto a la forma de tratar un factor como fijo o aleatorio es importante para el diseño
de la valoración y para informar apropiadamente su precisión. Por ejemplo, tratar todos los factores como fijos conlleva a su-
bestimar la variabilidad de la valoración, puesto que ignora todas las fuentes de variabilidad distintas a las determinaciones
repetidas. El objetivo es identificar las fuentes específicas de variabilidad que puedan ser controladas para incluir de manera
apropiada aquellos factores en el diseño y, posteriormente, incluir otros factores como aleatorios.
Si el factor puede cambiar de aleatorio a fijo o viceversa, el factor debe incluirse en el modelo generalmente como un efecto
aleatorio. Por ejemplo, cuando los lotes de reactivo no pueden ser controlados, por lo regular se considera que diferentes lotes
ocasionan variabilidad, por lo que el lote de reactivo se consideraría un efecto aleatorio. No obstante, si se ha detectado un
gran cambio en los valores de respuesta en un lote determinado, se puede llevar a cabo una comparación entre un conjunto
de lotes usando un lote de reactivo como efecto fijo. De manera similar, la secuencia o ubicación dentro de la valoración (p.ej.,
bloque, placa, fila de la placa, columna de la placa o pocillo) se puede considerar como una fuente de variación aleatoria o una
fuente de un efecto constante (fijo).
Los diseños de valoraciones que constan de múltiples factores son eficientes, pero requieren de las técnicas estadísticas co-
rrespondientes que incorporen los factores en el análisis como efectos fijos o aleatorios. Cuando todos los factores son fijos, el
modelo estadístico recibe el nombre de modelo de efectos fijos. Si todos son aleatorios, se le denomina modelo de efectos
aleatorios. Si algunos factores son fijos y otros son aleatorios, se trata de un modelo de efectos mixtos. Se debe tomar en cuen-
ta que los conceptos de efectos fijos y aleatorios aplican a modelos para respuestas cuantitativas, cualitativas e integrales. Para
diseños de valoración que incluyan múltiples unidades experimentales (p.ej., muestras asignadas a conjuntos de tubos y con-
centraciones asignadas a tubos pre-placas), resulta particularmente efectivo un modelo de efectos mixtos en el que las unida-
des experimentales se tratan como efectos aleatorios. La presencia de diseños con efectos aleatorios cruzados (p.ej., cada ope-
rador usó material de una o más partidas de reactivo, pero muchas partidas de reactivos fueron empleadas por múltiples ope-
radores) agrega todavía más complejidad. Esto puede ocasionar desafíos metodológicos y de cálculo adicionales para el ajuste
del modelo, en especial cuando los diseños están desequilibrados.

5. ETAPAS DEL PROCESO DE DESARROLLO DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA

Dada la ubicuidad de las valoraciones basarlas en células y la motivación para emplear un sistema de valoración biológica
para ofrecer un contexto de discusión, el desarrollo de una valoración biológica basada en células se utilizará para ilustrar las
etapas del continuum del desarrollo de la valoración biológica.
USP 37 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 729

5.1 Diseño: Distribución de la Valoración, Distribución por Bloques y Aleatorización

La mayoría de las valoraciones basadas en células se llevan a cabo usando una placa de cultivo celular (placa de microtitula-
ción de 6; 12; 96 ó 384 pocillos). Idealmente, una placa puede proporcionar un sustrato uniforme para tratamientos experi-
mentales en todos los pocillos, incluyendo las etapas posteriores al lavado e incubación. No obstante, independientemente de
las condiciones de la valoración con las que se pretenda minimizar el potencial de sesgo (p.ej., buena técnica del analista, cali-
bración cuidadosa de pipetas, tiempo de incubación controlado y temperatura), se pueden observar gradientes sistemáticos en
la placa, independientes de los tratamientos experimentales. Estos gradientes pueden ocurrir a través de filas, columnas o des-
de el borde hacia el centro de la placa, y a menudo se denominan efectos de placa. Incluso los efectos de placa moderados o
inconsistentes deben tratarse durante el desarrollo de la valoración, mediante estrategias de distribución de placa, distribución
por bloques, aleatorización y determinaciones repetidas.
Los efectos de placa se pueden evaluar en un ensayo de uniformidad en el que se usa en todos los pocillos de la placa un solo
tratamiento experimental, como por ejemplo una concentración de valoración seleccionada a partir de la sección media de la
curva de concentración-respuesta. La Figura 7 ofrece un ejemplo de lo que puede llegar a observarse; una tendencia de la
señal a disminuir de derecha a izquierda es evidente. En este caso, se descubrió que la lavadora de placas estaba lavando de
manera más enérgica el lado izquierdo de la placa y fue necesario ajustarla para proveer una intensidad de lavado uniforme y
eliminar el gradiente. Otro efecto de placa común es un patrón de crecimiento celular diferencial en el que los pocillos exter-
nos de la placa cultivan células de tal manera que se atenúa la señal de la valoración. Éste es un problema tan persistente que a
menudo se opta por no utilizar los pocillos externos de la placa de valoración. Debido a que los efectos de ubicación son muy
comunes, se deberían evitar los diseños que emplean determinaciones repetidas (p.ej., de muestra por combinaciones de con-
centración) en pocillos adyacentes.

Uniformidad

•:1000-2500
AFU
a 1500-2000
e 1000-1500
•roo-1000
•D-500

Figura 1 . Gráfica de cambio en la respuesta de la valoración a través de la placa.

La Distribución por Bloques es el agrupamiento de unidades experimentales relacionadas en diseños experimentales. Los blo-
ques pueden consistir en placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas de 96 pocillos agrupa-
das por analista, por día o por partida de células. El objetivo es aislar cualquier efecto sistemático de modo que no oscurezca
los efectos de interés. Un diseño completo en bloques ocurre cuando todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valo-
ración biológica, los factores de tratamiento primario son la muestra y la concentración) se aplican a unidades experimentales
para dicho factor dentro de un solo bloque. Un diseño incompleto en bloques ocurre cuando el número de niveles de un factor
de tratamiento excede el número de unidades experimentales para dicho factor dentro del bloque.
La Aleatorización es un proceso de asignación de tratamiento a unidades experimentales basado en probabilidad de tal ma-
nera que todas las unidades experimentales tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado. Aunque re-
sulta complicada en la práctica, la aleatorización de tratamientos experimentales ha sido defendida como la mejor metodolo-
gía para minimizar el sesgo de la valoración o, más precisamente, para proteger los resultados de la valoración de fuentes co-
nocidas y desconocidas de sesgo, convirtiendo el sesgo en varianza. Aunque la aleatorización de muestras y concentraciones
en pocillos individuales de placas puede no resultar práctico, la distribución de la placa puede diseñarse para minimizar los
efectos de placa, alterando las posiciones de la muestra a través de las placas y el patrón de diluciones dentro y a través de las
placas. Cuando se requieren múltiples placas en una valoración, el diseño de distribución de la placa debe, por lo menos, alter-
730 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

nar posiciones de muestras a través de las placas dentro de una corrida de valoración para evitar un posible sesgo introducido
por los analistas o el equipo en un día determinado. Resulta prudente emplear una rotación equilibrada de distribuciones en
las placas de modo que la recolección de determinaciones repetidas (cada una de las cuales utiliza una distribución distinta)
proporcione algo de protección contra fuentes problables de sesgo.
La Figura 2 presenta un diseño de valoración en patrones que carece de aleatorización y es susceptible al sesgo. Las dilucio-
nes y las determinaciones repetidas de las preparaciones de Prueba (A y B) y del Estándar (R) se colocan juntas de manera
secuencial en la placa. El sesgo debido a un efecto de placa o incubadora puede influenciar parte o la totalidad de las concen-
traciones de una de las muestras. Se debe tomar en cuenta que en las Figuras 2 a 5 los pocillos exteriores de la placa se dejan
como blancos para proteger contra el efecto del borde.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
e
D
E
F
G
H

Figura 2. Placa con patrones muy marcados.

Una distribución que ofrece algo de protección de los efectos de placa y que se puede realizar de forma manual es un diseño
de gráfica en filas, que se presenta en la Figura 3. En dicha distribución, las muestras se distribuyen aleatoriamente en filas de
una placa y se llevan a cabo series de diluciones en distintas direcciones en diferentes secciones (bloques) de la placa para
mitigar el sesgo a través de las columnas de la placa. Una ventaja extra del diseño de gráfica en tiras es su capacidad para
detectar efectos de ubicación mediante la interacción de la muestra y la dirección de la dilución (de izquierda a derecha o
viceversa).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
e
D
E
F
G
H

Figura 3. Diseño de una gráfica en tiras

La Figura 4 presenta una alternación de las posiciones de la Prueba (muestra de Prueba 1 = "l ";muestra de Prueba 2 = "2")
y del Estándar ("R") en múltiples placas, dentro de una sola corrida de valoración; esto ofrece protección contra los efectos de
fila en la placa. Combinar los dos métodos ilustrados en las Figuras 3 y 4 puede ayudar a convertir de manera efectiva el sesgo
de la placa en varianza de la valoración. Posteriormente, se puede tratar la varianza de la valoración, según se requiera, me-
diante un número mayor de determinaciones repetidas de la valoración (mayor número de placas en una valoración).
USP 37 Información General/ (1032) Valoraciones Biológicas 731

Fila de la Placa Placa 1 Placa 2 Placa 3

B R 2 1

e 1 R 2

D 2 1 R

E R 2 1

F 1 R 2

G 2 1 R

Figura 4. Valoración de placas múltiples con posiciones de Prueba y Estándar variadas.

El diseño de gráfica dividida, una alternativa que asigna muestras a las filas de las placas de manera aleatoria y que distribuye
aleatoriamente las diluciones (concentraciones) dentro de cada fila, se presenta en la Figura 5. Dicha estrategia puede ser difícil
de implementar, incluso con el uso de instrumentos robóticas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
e
D
E
F
G
H

Figura 5. Diseño de gráfica dividida.

Estrategia de Dilución-Las concentraciones de valoración de una muestra de Prueba y del Estándar se pueden obtener de
diversas maneras. Los laboratorios a menudo llevan a cabo diluciones en serie, en las que cada dilución se prepara a partir de
una dilución previa, en sucesión. Como alternativa, el laboratorio puede preparar diluciones completamente independientes a
partir de la muestra de Prueba y del Estándar para obtener series de concentraciones independentes. Estas dos estrategias re-
sultan en las mismas concentraciones nominales, pero tienen propiedades distintas con respecto al error. Las diluciones seriales
están sujetas a la propagación del error a través de las series de diluciones y un error de dilución cometido en una dilución
temprana tendrá como resultado observaciones correlacionadas no independientes. Las correlaciones también se pueden in-
troducir empleando pipetas multicanal. Las diluciones independientes ayudan a mitigar el sesgo que resulta de los errores de
dilución.
Es importante mencionar que cuando se trabaja para mejorar la precisión, las reducciones más grandes de varianza se logran
mediante determinaciones repetidas en los niveles más altos posibles de los efectos aleatorios anidados. Lo anterior resulta par-
ticularmente efectivo cuando dichos niveles altos son fuentes de variabilidad. Por ejemplo: llevar a cabo muchas determinacio-
nes repetidas en un día para una valoración que se sabe presenta una gran variación entre días no es una forma efectiva de
mejorar la precisión de los valores de informe.

5.2 Desarrollo

Una meta del desarrollo de la valoración biológica es obtener una exactitud relativa de ia valoración biológica y una preci-
sión de la estimación de potencia óptimas. Un punto final del desarrollo de la valoración consiste en el desarrollo completo del
procedimiento de valoración, un protocolo para la realización de la valoración biológica. El procedimiento debe incluir detalles
suficientes para que un laboratorio calificado con un analista capacitado pueda realizar el procedimiento de manera rutinaria.
Una parte estratégica del desarrollo es buscar que se mantenga el desempeño. Los procedimientos operativos estándar para
732 (1032) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

calificación de reactivos y de técnicos, así como para la calibración del Estándar de trabajo, ayudan a completar el paquete de
desarrollo de la valoración biológica.
La Metodología de Un Factor a la Vez contra el Diseño de Experimentos-El desarrollo de la valoración biológica avanza a
través de una serie de experimentos en los que las condiciones y los niveles de los factores de la valoración se varían para iden-
tificar aquéllos que sustentan una valoración biológica confiable y robusta, calificada para el uso rutinario. Dichos experimen-
tos se pueden llevar a cabo mediante la metodología de un factor a la vez (OFAT, por sus siglas en inglés), estudiando cada
parámetro por separado para identificar condiciones ideales, o mediante el uso de un diseño de experimentos de factores múl-
tiples (DOE, por sus siglas en inglés). El diseño de experimentos de factores múltiples es una estrategia eficiente y efectiva para
desarrollar una valoración biológica y mejorar el desempeño de la misma, ayudando de esta manera a obtener un sistema de
medición que cumple con los requisitos. En comparación con la metodología de un factor a la vez, el diseño de experimentos
de factores múltiples por lo regular requiere una menor cantidad de experimentos y también ofrece una perspectiva sobre las
interacciones de los factores que afectan el desempeño de la valoración biológica. El desarrollo de la valoración mediante un
diseño de experimentos de factores múltiples puede proseguir a través de una serie de etapas: mapeo del proceso y análisis de
riesgos, examen, optimización de la respuesta y confirmación.
Mapeo del Proceso y Análisis de Riesgos-La optimización de la valoración biológica puede comenzar con un examen siste-
mático y una evaluación de riesgos para identificar aquellos factores que podrían influenciar la respuesta de la valoración bioló-
gica. Resulta útil visualizar factores de la valoración biológica empleando un mapa del proceso de la misma, como por ejem-
plo, un diagrama de causa y efecto o de espina de pescado. Mediante el uso del mapa de proceso como guía, el laboratorio
puede examinar los factores que podrían afectar el desempeño de la valoración, tales como pH de la solución amortiguadora,
temperatura de incubación y tiempo de incubación. Históricamente, la experiencia con una o más de las etapas de la valora-
ción biológica, junto con un juicio científico fundamentado, pueden identificar factores claves que requieran de evaluación adi-
cional. Una herramienta que se puede emplear para priorizar factores es un análisis del modo y los efectos de la falla. Los facto-
res generalmente se contabilizan combinando su potencial para influenciar la respuesta de la valoración y su probabilidad de
ocurrir. El laboratorio debe prestar atención para reconocer interacciones potenciales entre los factores de la valoración.
Examen-Una vez que se han identificado los factores claves mediante el mapeo del proceso y el análisis de riesgos, el labora-
torio puede llevar a cabo un experimento inicial para explorar los efectos para los que podría ser necesario aplicar controles.
Los diseños de examen como los de tipo factorial y factorial fracciona! se emplean comúnmente con este propósito. Existe soft-
ware disponible para ayudar al practicante con la selección del diseño y el análisis subsiguiente. No obstante, el analista debe
tener cuidado de comprender sus suposiciones sobre la selección del diseño y el análisis para asegurar la identificación exacta
de los factores experimentales.
Optimización de la Respuesta-Un diseño de examen, por lo general, podrá detectar unos cuantos factores importantes de
entre aquéllos que se estudian. Dichos factores se pueden estudiar aún más en un diseño de optimización de la respuesta. Los
diseños de optimización de la respuesta, tales como los diseños centrales compuestos, se llevan a cabo para determinar las
configuraciones óptimas para las combinaciones de factores de la valoración biológica, a fin de obtener la respuesta adecuada.
La información obtenida a partir de la optimización de la respuesta se puede representar como una superficie de respuesta y
puede emplearse para establecer intervalos que provean un desempeño aceptable de la valoración y que se incorporarán en el
procedimiento de la valoración biológica.
En el lenguaje de Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés), la "región" en la que los niveles combinados de varia-
bles de ingreso y parámetros del proceso han demostrado proveer un desempeño aceptable de la valoración se describe como
el espacio del diseño para la valoración biológica. Establecer un verdadero espacio del diseño para una valoración biológica re-
presenta un desafío; no todos los factores y niveles de factores aleatorios se incluirán en el Diseño de Experimentos de Factores
Múltiples del desarrollo, y no existe certeza de que el espacio del diseño no sea sensible a factores aleatorios no estudiados. De
manera similar, no se puede asegurar del todo que la valoración (espacio de diseño) sea robusta para factores aleatorios que se
estudian usando muestras pequeñas (o muestras de niveles no aleatorias). Los elementos del Diseño de Experimentos de Facto-
res Múltiples que se pueden considerar incluyen el uso de bloques; confusión deliberada entre interacciones que son de poco
interés o que no se consideran importantes; diseño robusto (diseños de superficie de respuesta con efectos aleatorios); y uso
de diseños de gráfica dividida, gráfica en tiras o lote dividido.
Confirmación-El modelo matemático que representa el desempeño de la valoración como una función de cambios en los
factores claves de la valoración es una aproximación; por consiguiente, se acostumbra a confirmar el desempeño en las confi-
guraciones ideales de la valoración biológica. La confirmación puede adquirir la forma de un ensayo de calificación en el que
se lleva a cabo la valoración, de preferencia en múltiples ocasiones independientes usando valores óptimos para factores. Alter-
nativamente, el laboratorio puede determinar que la valoración fue adecuadamente desarrollada y que se puede proseguir con
la validación. La calificación es una buena práctica, no un requisito reglamentario. La decisión de llevar a cabo corridas de cali-
ficación confirmatorias o de proceder con la validación depende de la fuerza de la información acumulada obtenida durante el
desarrollo.

5.3 Análisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoración

El análisis de los datos de la valoración biológica durante el desarrollo de la valoración permite a los analistas tomar decisio-
nes en relación con el modelo estadístico que se utilizará para el análisis de rutina, incluyendo la transformación y/o la ponde-
ración de datos, así como el desarrollo de criterios de aptitud del sistema y de la muestra. El análisis también ofrece informa-
USP 37 Información General/ <l 032) Valoraciones Biológicas 733

ción relacionada con los elementos de la estructura del diseño que deberían usarse durante la detección de valores aberrantes
y el ajuste de un modelo completo. Lo anterior puede incluir además un plan para seleccionar subcon¡untos de datos, como
por ejemplo una porción lineal para análisis, o para valoraciones biológicas no lineales, una estrategia de reducción del modelo
para muestras similares al Estándar. Una vez que estas decisiones han sido tomadas y que se muestras sólidas durante la valida-
ción, no será necesario volverlas a evaluar con cada desempeño de la valoración. A continuacion se presenta una metodología
de proceso para permitir la toma de dichas decisiones.
Paso 7: Seleccionar un modelo estadístico apropiado (ver también la sección 4. 6 Modelos Comunes de Valoración Biológica).
Debido a la complejidad de las valoraciones biológicas y a la motivación para emplear una metodología que se considere
fidedigna, los modelos analíticos adecuadamente estandarizados son comunes en el campo de los análisis de valoraciones
biológicas. No obstante, existen muchas consideraciones implícitas en la selección del modelo estadístico más apropiado.
Primero, el modelo debe ser adecuado para el tipo de punto final de la valoración-continuo, recuento o dicotómico.
Segundo, el modelo debe incorporar la estructura del diseño de valoración. Para cualquier diseño distinto al completa-
mente aleatorizado, existirán términos en el modelo para los elementos estructurales. Por ejemplo, la distribución en blo-
ques dentro de las placas, la ubicación de la jaula en la instalación que alberga los animales, el día, entre otros. Una terce-
ra consideración, aplicable a los puntos finales continuos, implica decidir si se usa un modelo de regresión o un modelo
de media (un análisis del modelo de varianza que se ajusta a una media distinta en cada nivel de dilución de cada muestra
analizada), con términos de error apropiados. Un modelo de media puede ser apropiado en esta etapa debido a que no
realiza ninguna suposición sobre la forma de la curva de concentración-respuesta.
Paso 2: Ajustar el modelo estadístico seleccionado a los datos sin la suposición de paralelismo y posteriormente evaluar la distri-
bución de los residuos, examinándolos específicamente para detectar desviaciones de la normalidad y de la varianza constante.
Transformar los datos según se requiera o, si fuera necesario, seleccionar un esquema de ponderación (ver la sección 4.3
Heterogeneidad de la Varianza, Ponderación y Transformación). Usar un cuerpo de datos de valoración, a partir de valoracio-
nes independientes, tan grande como sea posible. El objetivo primario es tratar cualquier desviación de la normalidad y
de la varianza constante de las respuestas en todo el intervalo de concentraciones en la valoración. El paso 2 probable-
mente alternará entre imponer una transformación y evaluar la distribución de los residuos.
Paso 3: Examinar para detectar valores aberrantes y eliminarlos de manera apropiada.
Esta etapa, por lo regular, sigue a la selección inicial de una transformación adecuada y/o método de ponderación. El mo-
delo usado para detectar valores aberrantes idealmente contiene los elementos importantes de la estructura del diseño de
la valoración, permite curvas no similares y realiza menos suposiciones con respecto a la forma funcional de la curva de
concentración-respuesta que el modelo usado para evaluar la similitud. Ver la Sección 4.8. Valores Aberrantes y el capítulo
general (1 01 O> para información sobre la detección y eliminación de valores aberrantes. En algunos casos, los valores abe-
rrantes pueden ser tan severos que un modelo razonable podría no ajustarse, por lo que los residuos no estarían disponi-
bles. En tales casos, resulta necesario examinar los datos brutos para detectar valores aberrantes antes de intentar el ajuste
del modelo.
Durante el desarrollo de la valoración, se debe desarrollar una estrategia para la investigación y tratamiento de una obser-
vación de valores aberrantes, incluyendo cualquier límite sobre la cantidad aceptable de valores aberrantes. Estas instruc-
ciones deben incluirse en el Procedimiento Operativo Estándar de la valoración. La buena práctica incluye registrar el pro-
ceso de una investigación, las pruebas para valores aberrantes aplicadas y los resultados de las mismas. Se debe tomar en
cuenta que los procedimientos para valores aberrantes deben considerarse de manera independiente a la investigación y
el tratamiento de un resultado fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés) (valor de informe). Las decisiones
para eliminar un valor aberrante del análisis de los datos no debe tomarse basándose en el efecto que sufrirá el valor de
informe (p.ej., un resultado potencial fuera de la especificación). La eliminación de datos como valores aberrantes no de-
be practicarse con regularidad. Si se eliminan muchos valores como valores aberrantes de una corrida, dicha corrida se
debe considerar sospechosa.
Paso 4: Reajustar el modelo con la transformación y/o ponderación previamente impuesta (Paso 2) sin las observaciones identi-
ficadas como valores aberrantes (Paso 3) y volver a evaluar la idoneidad del modelo.
Paso 5: Cuando resulte necesario o deseable, seleccionar un esquema para identificar los subconjuntos de datos para su uso en
la estimación de potencia, ya sea el modelo lineal o no lineal (ver la sección 4.5 Linealidad de los Datos de Concentración-Res-
puesta).
Paso 6: Calcular una estimación de potencia relativa analizando los datos de la Prueba y del Estándar al mismo tiempo median-
te un modelo que deberá tener líneas o curvas paralelas o intersecciones idénticas.

5.4 Validación de la Valoración Biológica

La validación de la valoración biológica es un estudio basado en protocolos que demuestra que el procedimiento es adecua-
do para su uso. Se puede considerar una metodología por etapas para la validación, tal como en una validación "adecuada
para el uso pretendido" para sustentar la liberación de material de ensayo clínico, y una validación final exhaustiva antes de
tramitar la Solicitud para Productos Biológicos Terapéuticos (BLA, por sus siglas en inglés) o la Solicitud para Autorización de
Comercialización (MAA, por sus siglas en inglés). Se deben establecer y describir de manera clara los controles de aptitud del
sistema preliminar y de la muestra en el procedimiento de la valoración; dichos factores se pueden determinar basándose en la
734 (1032) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

experiencia adicional obtenida en el ejercicio de validación. El capítulo (1033) ofrece una discusión exhaustiva sobre la valida-
ción de valoraciones biológicas.

5.5 Mantenimiento de Valoraciones Biológicas

Aunque se trata de operaciones discretas, el desarrollo y la validación de una valoración biológica llevan a la realización de
actividades continuas. Las mejoras de la valoración se pueden implementar a medida que cambia la tecnología, conforme el
laboratorio se vuelve más versado con el procedimiento y los cambios a la metodología de la valoración biológica requieran la
reevaluación del desempeño de la misma. Algunos de estos cambios pueden ser respuestas a un desempeño inesperado du-
rante el procesamiento de rutina. Se deben monitorear las acciones correctivas usando procedimientos de control rutinario.
Los cambios importantes pueden requerir de un estudio para verificar que la valoración biológica sigue siendo adecuada para
su uso. Se puede emplear una metodología de análisis de equivalencia para demostrar que el cambio ha generado un desem-
peño adecuado. Asimismo, se puede llevar a cabo un estudio de orientación estadística para demostrar que el cambio no com-
promete las características de desempeño de la valoración previamente aceptables.
Transferencia de la Valoración-La transferencia de la valoración supone un uso pretendido conocido de la valoración bioló-
gica en el laboratorio receptor y la capacidad requerida asociada para el sistema de valoración. Estos dos factores demarcan
implícitamente, aunque quizás no precisamente, los límites relacionados con la cantidad de sesgo y la pérdida de precisión
permitida entre laboratorios. Para utilizar dos laboratorios de manera intercambiable para sustentar un producto será necesario
tomar en cuenta la variación entre laboratorios, además de la precisión intermedia para los requisitos de tamaño de las mues-
tras a fin de determinar la capacidad del proceso. Para información y ejemplos relacionados con la interrelación entre sesgo,
capacidad del proceso y validación, ver Ejemplo de Validación de Valoraciones Biológicas en el capítulo general (1033).
Mejoramiento o Actualización de un Sistema de Valoración Biológica-Una nueva versión de una valoración biológica pue-
de mejorar la calidad de sesgo, precisión, intervalo, robustez, especificidad, disminuir los costos de operación u ofrecer otras
ventajas convincentes. Se puede utilizar un estudio puente al momento de mejorar o actualizar una valoración biológica para
comparar el desempeño de la nueva valoración con la ya establecida. Además, se puede usar una variedad de muestras (p.ej.,
liberación del lote, estabilidad, sometidas a estrés, isoformas críticas) para demostrar la equivalencia de las potencias estima-
das. Aunque los sistemas de valoración pueden presentar algunas diferencias (p.ej, una valoración biológica en animales frente
a una valoración biológica basada en células), si las valoraciones emplean tanto el mismo Estándar como el mismo mecanismo
de acción, existe una expectativa razonable de obtener potencias comparables. Si la nueva valoración emplea un Estándar dife-
rente, el requisito mínimo para una comparación aceptable es una pendiente de uno en la relación logarítimica lineal entre las
potencias estimadas. Un aspecto importante a considerar sobre esta recomendación es que cualquier precisión deficiente o
valoración con sesgo que se haya usado previamente podría tener un impacto duradero sobre los requisitos de las determina-
ciones repetidas, incluso si la valoración se reemplaza posteriormente con una valoración mejorada.

(1033) VALIDACIÓN DE VALORACIONES BIOLÓGICAS

1. INTRODUCCIÓN
Las Valoraciones Biológicas forman una parte integral de la evaluación de calidad requerida para la fabricación y comercializa-
ción de muchos productos biológicos y de algunos medicamentos no biológicos. Las valoraciones biológicas que comúnmente
se utilizan para estimar la potencia de un fármaco se pueden distinguir de las pruebas químicas por su dependencia de un
sustrato biológico (p.ej., animales, células vivas o complejos funcionales de receptores diana). Debido a los múltiples factores
operativos y biológicos que surgen de su fundamento biológico, por lo general presentan una mayor variabilidad que las prue-
bas químicas.
Las valoraciones biológicas representan una de las diversas pruebas fisicoquímicas y biológicas con procedimientos y criterios
de aceptación que controlan los atributos críticos de calidad de un medicamento biológico. Conforme a lo descrito en las
Guías de la ICH titulada Specifications: Test Procedures And Acceptance Criteria For Biotechnological/Biological Products
(Q6B), sección 2.1 .2, las técnicas de valoración biológica pueden medir la respuesta biológica de un organismo al producto;
una respuesta bioquímica o fisiológica a nivel celular; velocidades de reacción enzimáticas o respuestas biológicas inducidas
mediante interacciones inmunológicas; o unión de ligandos y receptores. A medida que surgen nuevos medicamentos biológi-
cos y nuevas tecnologías, es probable que aumente el alcance de las metodologías de valoración biológica. Por lo tanto, el
presente capítulo general, Validación de Va/oraciones Biológicas (1033) se centra en metodologías que ofrecen flexibilidad para
adoptar nuevos métodos de valoración biológica, nuevos medicamentos biológicos, o la combinación de ambos para evaluar
la potencia del fármaco.
Las buenas prácticas de fabricación requieren que los métodos de prueba usados para evaluar el cumplimiento de los pro-
ductos farmacéuticos con los requisitos de calidad cumplan con los estándares apropiados de exactitud y confiabilidad. La vali-
dación de la valoración es el proceso de demostrar y documentar que las características de desempeño del procedimiento y de
USP 37 Información General/ (1033) Valoraciones Biológicas 735

su método de base cumplen con los requisitos para la aplicación prevista y que la valoración es, por lo tanto, adecuada para su
uso previsto. El capítulo general de la USP Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y la guía ICH Q2(Rl) describen las
características (parámetros) de desempeño de la valoración que se deben evaluar para procedimientos que sustenten produc-
tos farmacéuticos de pequeñas moléculas. Aunque resulta fácil evaluar estos parámetros de validación para muchos tipos de
medicamentos bien caracterizados por procesos químicos, aún no se ha delineado claramente su interpretación y aplicabilidad
para algunos tipos de valoraciones biológicas. Este capítulo trata la validación de valoraciones biológicas desde el punto de
vista de la medición de actividad, en lugar de mediciones de masa o fisicoquímicas, con el propósito de alinear las característi-
cas del desempeño de la valoración biológica con los usos en la práctica de las valoraciones biológicas.
La evaluación del desempeño de las valoraciones biológicas es un proceso continuo, pero debe realizarse una vez completa-
do el desarrollo. La validación de valoraciones biológicas se guía por un protocolo de validación que describe los objetivos y el
diseño del estudio de validación. El capítulo general (l 033) ofrece objetivos de validación relacionados con las valoraciones
biológicas de la potencia relativa. Las valoraciones biológicas de la potencia relativa se basan en una comparación de las res-
puestas de la valoración biológica para una muestra de Prueba contra las de un Estándar designado y ofrecen una medida
cuantitativa de la actividad biológica de la Prueba con respecto a la del Estándar.
Los parámetros de validación discutidos incluyen exactitud relativa, especificidad, precisión intermedia e intervalo. Los laborato-
rios pueden usar la linealidad de las diluciones para verificar la exactitud relativa y el intervalo del método. Aunque la robustez no
es un requisito de validación, el presente capítulo general (l 033) recomienda evaluar la robustez de la valoración biológica
antes de la validación. Asimismo, el capítulo (l 033) describe metodologías para el diseño de la validación (selección de mues-
tras y estrategia para determinaciones repetidas), criterios de aceptación de la validación, análisis e interpretación de datos y,
finalmente, monitoreo del desempeño de la valoración biológica a través del control de calidad. Además, se analiza la docu-
mentación de los resultados de la validación de la valoración biológica, con respecto a los experimentos previos a la validación
que se llevan a cabo para optimizar el desempeño de la valoración biológica. Para los objetivos del presente capítulo general
(l 033), el término "valoración biológica" deberá interpretarse con el sentido de "valoración biológica de la potencia relativa".

2. FUNDAMENTOS DE LA VALIDACIÓN DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA

El objetivo de la validación de la valoración biológica radica en confirmar que las características operativas del procedimiento
sean las adecuadas para el uso previsto del procedimiento. Las cuestiones implicadas en el desarrollo de una valoración bioló-
gica se describen con mayor detalle en el capítulo general (l 032) y se asume que han sido resueltas al momento en que la
valoración biológica entra en la etapa de validación. Dichas decisiones deberán incluir una identificación de los componentes
de una valoración y de una corrida para la valoración biológica. Las diluciones (concentraciones) múltiples del Estándar y de
una o más muestras de Prueba constituyen un conjunto de determinaciones repetidas (también conocido como conjunto míni-
mo), que contiene un sustrato de prueba (p.ej., un grupo de animales o frascos de células) en cada dilución para cada mues-
tra (Pruebas y Estándar). Una corrida se identifica como el trabajo realizado durante un periodo en el que existe una expectati-
va razonable de que la exactitud (certeza) y la precisión en el sistema de valoración se mantengan estables. En la práctica, una
corrida con frecuencia consiste en el trabajo realizado por un solo analista en un laboratorio, con un conjunto de equipo, en
un tiempo corto (típicamente un día). Una valoración es el conjunto de datos usados para evaluar la similitud y potencia esti-
mada para cada muestra de Prueba relativa a un Estándar. Una corrida puede contener múltiples valoraciones, una sola valora-
ción o parte de una valoración. Se pueden combinar múltiples valoraciones para generar un valor de informe para una mues-
tra. El valor de informe es el valor que se compara con una especificación de producto.
Para valoraciones que implican grupos en cada dilución (p.ej., 6 muestras, cada una en 1 O diluciones, en los pocillos no lo-
calizados en los bordes de cada una de las placas de cultivo celular de 96 pocillos usadas) los grupos (placas) constituyen blo-
ques estadísticos que deben ser elementos en la valoración y en los análisis de validación (los bloques se analizan en el capítulo
(1032)). Las determinaciones repetidas dentro de los bloques para muestras de Prueba no son generalmente rentables. Este
capítulo no proporciona un mayor análisis sobre los bloques, pues éste se encuentra disponible en el capítulo general (1032).
Inicialmente, se asigna un valor de 1,0 ó 1 00% a la cantidad de actividad (potencia) del Estándar, y la potencia de la mues-
tra de Prueba se calcula comparando las curvas de concentración-respuesta para el par de la Prueba y el Estándar, cuyo resul-
tado es una medida sin unidad, que es la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la potencia del Estándar. En
algunos casos, se asigna un valor al Estándar correspondiente a otra propiedad, como por ejemplo, la concentración de proteí-
na. En dicho caso, la potencia de la muestra de Prueba es la potencia relativa multiplicada por el valor asignado del Estándar.
Una suposición de las valoraciones biológicas de líneas paralelas o de curvas paralelas (p.ej., logísticas de cuatro parámetros) es
que las curvas de dosis-respuesta generadas usando un Estándar y una Muestra de Prueba tienen una forma de curva similar
(paralela), que se diferencia únicamente por un cambio horizontal en la dosis logarítmica. Para valoraciones biológicas de co-
ciente de pendientes, las curvas generadas para las muestras Estándar y la Muestra deben ser lineales, pasar a través de una
misma ordenada al origen y diferir únicamente en sus pendientes. La información sobre cómo evaluar el paralelismo se propor-
ciona en los capítulos generales (1032) y (1034).
Para establecer la exactitud relativa y el intervalo de la valoración biológica, la validación de las muestras de Prueba se puede
construir usando una serie de diluciones del Estándar para evaluar la linealidad de las diluciones (linealidad de la relación entre
la potencia relativa conocida y la medida). Asimismo, el estudio de validación debe generar una estimación representativa de
la variabilidad de la determinación de potencia relativa. Aunque los estudios de robustez por lo general se realizan durante el
desarrollo de la valoración biológica, se pueden incluir en la validación factores claves de estos estudios, tales como el tiempo y
736 (1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

la temperatura de incubación y, para valoraciones biológicas basadas en células, el número de pasajes de células y el número
de células, en particular si interactúan con otro factor que se introduzca durante la validación (p.ej., un reactivo sensible a la
temperatura cuya sensibilidad varía entre lotes). Debido a la potencial influencia sobre la valoración biológica de factores como
múltiples analistas, instrumentos o procedencia de los reactivos, el diseño de la validación de la valoración biológica debe con-
siderar dichos factores. La variabilidad de la potencia causada por estos elementos combinados define la precisión intermedia
(IP, por sus siglas en inglés) de la valoración biológica. Un estudio adecuado de la variabilidad de los valores de potencia obte-
nidos, incluyendo el impacto de factores intravaloración y entre corridas, puede ayudar al laboratorio a confirmar una estrate-
gia de análisis adecuada y a predecir la variabilidad inherente del valor de informe (que puede ser el promedio de múltiples
determinaciones de potencia). Las estimaciones de variabilidad también se pueden usar para establecer la magnitud de las di-
ferencias que se pueden distinguir entre muestras analizadas en la valoración biológica. (Ver la sección 3.4 Uso de los Resultados
de la Validación para la Caracterización de Valoraciones Biológicas.)
Para demostrar la especificidad (también conocida como selectividad) se requiere evidencia sobre la falta de influencia de los
componentes de la matriz tales como componentes del proceso de fabricación o productos de degradación, de modo que las
mediciones cuantifiquen únicamente la molécula diana. Otros métodos analíticos pueden complementar una valoración bioló-
gica mediante la medición o identificación de otros componentes en una mezcla.

2.1 Protocolo de Validación para Valoraciones Biológicas

Un protocolo de validación para valoraciones biológicas debe incluir el número y los tipos de muestras que se estudiarán en
la validación; el diseño del estudio, incluyendo los factores entre corridas e intracorridas; la estrategia para determinaciones
repetidas; los parámetros de validación predeterminados y los criterios de aceptación diana justificados para cada parámetro; y
el plan propuesto para el análisis de los datos. Se debe tomar en cuenta que, con respecto al cumplimiento de los criterios de
aceptación, el no encontrar un efecto importante desde el punto de vista estadístico no representa una base adecuada para
definir un desempeño aceptable en una valoración biológica; el cumplimiento con los criterios de aceptación se puede evaluar
de mejor manera usando una metodología de equivalencia.
Asimismo, se deben especificar los criterios de aceptación para la valoración, corrida y muestra, tales como la aptitud del
sistema y la similitud, antes de realizar la validación. Dependiendo del grado de desarrollo de la valoración biológica, los crite-
rios se pueden proponer como tentativos y se pueden actualizar con los datos de la validación. Los incumplimientos de la valo-
ración, de la corrida o de las muestras se pueden reevaluar de acuerdo con criterios definidos en el protocolo de la validación
y, con justificación sólida, incluirse en la evaluación general de la validación. Pueden ser necesarios ensayos de validación adi-
cionales para sustentar cambios en el método.
El protocolo de validación de la valoración biológica debe incluir criterios de aceptación diana para los parámetros de valida-
ción propuestos. Los pasos a tomar cuando no se cumpla un criterio de aceptación diana se deben especificar en el protocolo
de validación y pueden resultar en un límite en el intervalo de potencias que se puede medir en la valoración biológica o en
una modificación de la estrategia de determinaciones repetidas en el procedimiento de la valoración biológica.

2.2 Documentación de los Resultados de la Validación de la Valoración Biológica

Los resultados de la validación de la valoración biológica deben documentarse en un informe de validación. El informe de
validación debe sustentar la conclusión que indica que el método es adecuado para su uso o debe indicar una acción correcti-
va (tal como un incremento en la estrategia de determinaciones repetidas) que se llevará a cabo para generar resultados lo
suficientemente confiables como para conseguir que sea apto para uso. El informe debe incluir los datos brutos y los resultados
intermedios (p.ej., se deben proveer las estimaciones de los componentes de la varianza además de la precisión intermedia
general) que facilitarían la reproducción del análisis de validación de la valoración biológica por parte de un revisor indepen-
diente. Las estimaciones de los parámetros de validación se deben informar para cada nivel y a nivel general, según correspon-
da. Las desviaciones del protocolo de validación deben documentarse con su respectiva justificación. Las conclusiones obteni-
das del estudio se deben describir claramente con referencias a las acciones de seguimiento, según sea necesario. Las acciones
de seguimiento pueden incluir enmiendas en el sistema o en los criterios de aptitud del sistema o modificaciones a la estrategia
de determinaciones repetidas de la valoración biológica. Se pueden incluir referencias a experimentos de prevalidación como
parte del informe del estudio de validación. Los experimentos de prevalidación pueden incluir experimentos de robustez, en
los que se hayan identificado los parámetros de la valoración biológica y se hayan establecido intervalos para parámetros signi-
ficativos; asimismo, pueden incluir experimentos de calificación, en los que se haya llevado a cabo el procedimiento final para
confirmar el desempeño satisfactorio durante la operación de rutina. Las conclusiones derivadas de los experimentos de preva-
lidación y calificación realizados durante el desarrollo contribuyen a la descripción de las características operativas del procedi-
miento de valoración biológica.

2.3 Diseño de Validación para Valoraciones Biológicas

La validación de valoraciones biológicas debe incluir muestras representativas de los materiales que se analizarán en la valo-
ración biológica y debe establecer de manera efectiva las características de desempeño del procedimiento. Para evaluar la exac-
USP 37 Información General/ 1 1033) Valoraciones Biológicas 737

titud relativa, se deben usar los niveles de potencia relativa de la muestra que delimitan el intervalo de potencias y que son
susceptibles de análisis en la valoración biológica. De tal manera, se pueden estudiar muestras que abarcan un amplio intervalo
de potencias para un medicamento o producto biológico con un amplio intervalo de especificación o para un producto con
una inestabilidad inherente, pero se puede usar un intervalo más estrecho para un producto más duradero. Se requiere un
mínimo de tres niveles de potencia, pero se recomiendan cinco para una evaluación fidedigna. Si se cumplen los criterios de
valoración para exactitud relativa y precisión intermedia, los niveles de potencia seleccionados constituirán el intervalo de la
valoración biológica. Como resultado, se obtendrá un intervalo limitado a partir de los niveles que no cumplan con sus crite-
rios de aceptación diana. También se pueden generar muestras para la validación de la valoración biológica sometiendo una
muestra a un nivel de estrés que pudiera observarse en la práctica rutinaria (es decir, investigaciones de estabilidad). Asimismo,
las influencias de la matriz de la muestra (excipientes, constituyentes del proceso o componentes de combinación) se pueden
estudiar estratégicamente variando de manera intencionada dichas influencias con el analito de interés, usando una metodolo-
gía multifactorial, lo cual a menudo habrá de realizarse durante el desarrollo, antes de generar los datos de liberación y estabili-
dad.
El diseño de la valoración biológica debe considerar todas las facetas del proceso de medición. Las fuentes de variabilidad en
las mediciones de la valoración biológica incluyen la preparación de la muestra, factores intracorridas y factores entre corridas.
La estimación representativa de la variabilidad de la valoración biológica requiere tomar en cuenta dichos factores. La prepara-
ción de la muestra de Prueba y del Estándar se deben llevar a cabo de manera independiente durante cada corrida de valida-
ción.
La estrategia de determinaciones repetidas usada en la validación debe reflejar el conocimiento adecuado de los factores que
pudieran influenciar la medición de la potencia. La variabilidad intracorridas puede verse afectada: por los factores operativos
de la valoración biológica que por lo general se establecen durante el desarrollo (temperatura, pH, tiempos de incubación,
etc.); por el diseño de la valoración biológica (número de animales, número de diluciones, determinaciones repetidas por dilu-
ción, espaciado de diluciones, etc.); por los criterios de aceptación de la valoración y de la muestra; y por el análisis estadístico
(cuando los puntos finales primarios son la evaluación de similitud para cada muestra y las estimaciones de potencia para las
muestras de referencia). Las restricciones operativas y el diseño de la valoración biológica (fórmulas dentro y entre corridas que
resultan en un valor de informe para un material de prueba) por lo general se especifican durante el desarrollo y pueden con-
vertirse en una parte del procedimiento operativo de la valoración biológica. La precisión intermedia se estudia mediante corri-
das independientes del procedimiento, posiblemente mediante el uso de un diseño experimental que altera aquellos factores
que pueden impactar el desempeño del procedimiento. Los experimentos (incluyendo aquéllos que implementan diseños for-
malizados de experimentos [DOE, por sus siglas en inglés]) con estructuras de diseño anidado o cruzado pueden revelar fuen-
tes importantes de variabilidad en el procedimiento, así como asegurar una estimación representativa de variabilidad a largo
plazo. Durante la validación no es necesario emplear el formato requerido para obtener el valor de informe de una solución de
Prueba. Un experimento de validación bien diseñado que combine fuentes de variabilidad entre corridas e intracorridas provee
estimaciones de componentes independientes de la variabilidad de la valoración biológica. Estos componentes se pueden usar
para verificar o pronosticar la variabilidad del formato de la valoración biológica.
Un análisis extenso de los datos de validación debe incluir resúmenes gráficos y estadísticos de los resultados de los paráme-
tros de validación y su cumplimiento con los criterios de aceptación diana. El análisis debe seguir las especificaciones del plan
de análisis de datos descrito en el protocolo de validación. En la mayoría de los casos, el logaritmo de la potencia relativa debe
analizarse para cumplir con las suposiciones de los métodos estadísticos (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Escala
del Análisis). Dichas suposiciones incluyen la normalidad de la distribución a partir de la que se muestrearon los datos y la ho-
mogeneidad de la variabilidad a través del intervalo de resultados observados en la validación. Es posible explorar tales suposi-
ciones usando técnicas gráficas tales como gráficas de caja y gráficas de probabilidad. La suposición de normalidad se puede
investigar usando análisis estadísticos de normalidad a través de una colección de datos históricos de tamaño adecuado. Se
deben buscar métodos alternativos de análisis cuando las suposiciones pudieran ser cuestionables. Los intervalos de confianza
deben calcularse para los parámetros de la validación usando los métodos descritos en este capítulo y en el capítulo general
Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (101 O).

2.4 Estrategias de Validación de las Características de Desempeño de la Valoración Biológica

Los parámetros que deben verificarse en una valoración biológica son: exactitud relativa, especificidad, precisión intermedia
(que incorpora la repetibilidad) e intervalo. Otros parámetros discutidos en el capítulo general (1225/ y en la guía ICH Q2(Rl ),
tales como el límite de detección y el límite de cuantificación, no han sido incluidos en este capítulo debido a que, por lo
general, no son relevantes para una valoración biológica que informa la potencia relativa. No obstante, éstos pueden ser rele-
vantes para la validación de una valoración auxiliar, tal como la empleada para contabilizar los elementos que responden o
medir la respuesta en conjunto con una valoración de potencia in vivo. Asimismo, la linealidad no forma parte de la validación
de una valoración biológica, excepto por su relación con la exactitud relativa (linealidad de las diluciones). A continuación, se
presentan estrategias para tratar los parámetros de validación de la valoración biológica.
Exactitud Relativa-La exactitud relativa de una valoración biológica de potencia relativa es la relación entre la potencia relati-
va medida y la potencia relativa conocida. La exactitud relativa en la valoración biológica se refiere a una pendiente unitaria
(pendiente = 1) entre el logaritmo de la potencia relativa medida y el logaritmo de la potencia relativa conocida. La metodolo-
gía más común para demostrar la exactitud relativa para las valoraciones biológicas de potencia relativa es mediante la cons-
738 (1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

trucción de potencias diana a través de la dilución del material estándar o de una muestra de Prueba con una potencia conoci-
da. Este tipo de estudio a menudo se denomina estudio de linealidad de las diluciones. Los resultados obtenidos de un estudio
de linealidad de las diluciones se deben evaluar usando el sesgo relativo estimado en niveles individuales y mediante una ten-
dencia en el sesgo relativo a través de los niveles. El sesgo relativo en niveles individuales se calcula de la manera siguiente:

·
S esgo Relativo = 100.
1 Potencia Medida
1 - ~- -,- -, - - 1 ,0Yo
1

\ Potencia Diana !

La tendencia en el sesgo se mide por la pendiente estimada del logaritmo de la potencia medida en función del logaritmo
de la potencia diana, el cual se debe ajustar a un criterio de aceptación diana. Si no existe una tendencia en el sesgo relativo a
través de los niveles, el sesgo relativo estimado en cada nivel se puede ajustar a un criterio de aceptación diana previamente
especificado y definido en el protocolo de validación (ver la sección 3 Ejemplo de Validación de una Valoración Biológica).
Especificidad-Para productos o productos intermedios asociados con matrices complejas, la especificidad implica demostrar
la ausencia de interferencia de componentes de la matriz o de componentes relacionados con el producto que se esperaría
que estuvieran presentes. Lo anterior se puede evaluar mediante la dilución paralela del Estándar con o sin la adición de canti-
dades conocidas del compuesto potencialmente interferente. Si las curvas son similares y la potencia cumple con las expectati-
vas de una comparación entre Estándares, la valoración biológica es específica para el compuesto. Para estas evaluaciones, tan-
to la similitud como la potencia se pueden evaluar usando análisis de equivalencia apropiados.
La especificidad también se puede referir a la capacidad de la valoración biológica para distinguir entre moléculas biofarma-
céuticas diferentes pero relacionadas. Se debe buscar un buen entendimiento con respecto a la molécula y a cualquier forma
relacionada, así como de las oportunidades de que moléculas relacionadas se introduzcan en la valoración biológica.
Precisión Intermedia-Debido a la potencial influencia sobre la valoración biológica de factores tales como analistas, instru-
mentos o procedencia de los reactivos, el diseño de la validación de la valoración biológica debe considerar dichos factores. La
variabilidad general a partir de las mediciones tomadas en una variedad de condiciones normales de análisis dentro de un la-
boratorio define la precisión intermedia de la valoración biológica. La precisión intermedia (IP, por sus siglas en inglés) es el
término usado por la ICH y la USP para referirse a lo que comúnmente se conoce como variabilidad entre corridas. Las medi-
das de precisión intermedia analizan la influencia de factores que variarán con el tiempo después de haber implementado la
valoración biológica. Dichas influencias, por lo general, son inevitables e incluyen factores tales como cambios de personal
(nuevos analistas), recepción de lotes de nuevos reactivos, entre otros.
Cuando se ha planeado la valoración usando un Diseño de Experimento multifactorial, se puede explorar el impacto de cada
factor gráficamente para establecer contribuciones importantes a la variabilidad de la potencia. La identificación de factores
importantes debe guiar hacia los procedimientos que buscan controlar sus efectos, como por ejemplo, ampliar las restricciones
para las condiciones operativas intravaloraciones o procedimientos de calificación estratégicos para factores entre corridas tales
como analistas, instrumentos y lotes de reactivos.
Las contribuciones de los factores de estudio de la validación a la precisión intermedia general de la valoración biológica se
pueden determinar mediante un análisis de componentes de la varianza aplicado a los resultados de la validación. La mejor for-
ma de llevar a cabo el análisis de componentes de la varianza es utilizar un software estadístico que sea capaz de realizar un
análisis de modelo mixto con una estimación de probabilidad máxima restringida (RMLE, por sus siglas en inglés).
Un análisis de componentes de la varianza genera estimaciones de componentes de la varianza tales como

y
~ 2
O Entre

que corresponden a la variación intracorridas y entre corridas, y que se pueden usar para estimar la precisión intermedia de la
valoración biológica, así como la variabilidad del valor de informe para distintos formatos de valoraciones biológicas (variabili-
dad del formato). La precisión intermedia expresada como el coeficiente geométrico porcentual de variación (%GCV, por sus
siglas en inglés) se obtiene con la siguiente fórmula, usando para este caso el logaritmo natural de la potencia relativa en el
análisis (ver la sección 2.7 Consideraciones Estad(sticas, Escala del Análisis):

Precisión Intermedia = 100 • (e v~:,,,,e - "':"'" - 1) º/o

La variabilidad del valor de informe derivado del análisis realizado con n conjuntos de determinaciones repetidas en cada una
de las k corridas (variabilidad del formato) es igual a:

Variabilidad del Formato= 100 , (e\ :¿,

0 k + <,., • (~k) __ 1) %

Esta fórmula se puede usar para determinar un formato de análisis adecuado para varios usos de la valoración biológica (p.ej.,
análisis de liberación y evaluación de la estabilidad).
USP 37 Información General/ (1033) Valoraciones Biológicas 739

Intervalo-El intervalo de la valoración biológica se define como las potencias verdadera o conocida para las que se ha demos-
trado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de exactitud relativa y de precisión intermedia. El intervalo es
normalmente derivado del estudio de la linealidad de las diluciones y, por lo menos, debe cubrir el intervalo de especificación
del producto para la potencia. Para los análisis de estabilidad y para minimizar la necesidad de diluir o concentrar muestras de
Prueba con altas o bajas potencias para ajustarlas al intervalo de la valoración biológica, resulta beneficioso validar la valoración
biológica usando un intervalo más amplio.

2.5 Validación de los Criterios de Aceptación Diana

Se debe optar por una validación de los criterios de aceptación diana para minimizar los riesgos inherentes al tomar decisio-
nes derivadas de las medidas de la valoración biológica y para que la capacidad de la técnica sea razonable. Cuando existe una
especificación de producto, los criterios de aceptación deben justificarse basándose en el riesgo de que las medidas podrían
caer fuera de la especificación del producto. Se pueden usar las consideraciones derivadas de un índice de capacidad del pro-
ceso (Cp, por sus siglas en inglés) para informar los límites del sesgo relativo (RB, por sus siglas en inglés) y la precisión interme-
dia de la valoración biológica. Este capítulo emplea el siguiente índice de capacidad del proceso:

C m= USL-LSL
p ~ 2 2 2
6 ·()Producto + RB + CiRA
donde el Límite de Especificación Superior (USL, por sus siglas en inglés) y el Límite de Especificación Inferior (LSL, por sus
siglas en inglés) son la especificación superior e inferior de liberación, el sesgo relativo, (RB) es un límite para el grado de sesgo
relativo en la valoración
2
O Producto

son la varianza del producto de interés (es decir, la variabilidad entre lotes) y la varianza de la valoración de liberación (RA, por
sus siglas en inglés) (con formato asociado) respectivamente. (Ver en la sección 3, Ejemplo de una Validación de Valoración Bioló-
gica, un ejemplo de determinación de

y de la capacidad de procesamiento.) Esta formulación requiere conocer con anticipación la variabilidad diana del producto o
la inclusión de una selección aleatoria de lotes para estimar estas características como parte de la validación. Debido al conoci-
miento limitado sobre el desempeño de la valoración, del historial de fabricación y de las especificaciones finales durante el
desarrollo, esta metodología puede usarse simplemente como guía para definir los criterios de aceptación de la validación.
La selección de un límite con respecto a la capacidad del proceso es una decisión empresarial. La proporción de lotes que se
pronostica estarán fuera de sus límites de especificación es una función de la capacidad de proceso. Algunos laboratorios nece-
sitan una capacidad de proceso correspondiente a un índice de capacidad del proceso mayor o igual a 1,3. Esto corresponde a
una posibilidad aproximada de 1 en 1 O 000 de que un lote con potencia en el centro del intervalo de especificación caiga por
fuera de los límites de especificación.
Cuando no se hayan establecido las especificaciones para un producto, se puede formular una restricción para el sesgo relati-
vo o la IP basándose en la capacidad de la técnica de la metodología de la valoración biológica. Por ejemplo, aunque las valo-
raciones químicas y los inmunoensayos a menudo son capaces de obtener un porcentaje de coeficiente de variación (%CV, por
sus siglas en inglés, o desviación estándar relativa porcentual, %RSD) de casi un solo dígito, se puede establecer una restricción
más liberal a las valoraciones biológicas, tales como valoraciones biológicas de potencia en animales, que operan con una va-
riabilidad mucho mayor (medida como %GCV, que se puede comparar con el %CV; ver el Apéndice). En este caso, el objetivo
de la validación puede ser la caracterización del método, usando los resultados de la validación para establecer un formato de
valoración con el que se espera generar medidas de producto fidedignas. El protocolo de validación debe incluir una justifica-
ción sólida para los criterios de aceptación aceptables o para el uso de una caracterización.

2.6 Mantenimiento de la Valoración

La implementación de la valoración biológica se lleva a cabo una vez que ésta ha sido validada. ~~o obstante, resulta impor-
tante monitorear su comportamiento con el paso del tiempo, lo cual se logra fácilmente manteniendo diagramas de controles
estadísticos del proceso (SPC, por sus siglas en inglés) para parámetros adecuados de la curva de respuesta del Estándar y de la
potencia de las muestras de Control de Calidad de la valoración. El propósito de estos diagramas es identificar en una etapa
temprana cualquier cambio o desvío en la valoración biológica. Si se observa una tendencia en cualquiera de los diagramas de
controles estadísticos del proceso, se deberá identificar la razón de dicha tendencia. Si la resolución requiere modificar la valo-
740 (1033) Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

ración biológica o si se ha presentado una modificación seria en la valoración biológica por otras razones (por ejemplo, un
cambio tecnológico mayor), la valoración biológica deberá revalidarse o vincularse a la valoración biológica original mediante
un estudio puente adecuadamente diseñado con criterios de aceptación que utilicen análisis de equivalencia.

2. 7 Consideraciones Estadísticas
Algunas consideraciones estadísticas se relacionan con el diseño de la validación de una valoración biológica y con el análisis
de los datos. Asimismo, se relacionan con las propiedades de las mediciones de la valoración biológica, así como con las herra-
mientas estadísticas que se pueden usar para resumir e interpretar los resultados de validación de la valoraciones biológicas.
Escala del Análisis-La escala del análisis de la validación de una valoración biológica, en la que los datos son las potencias
relativas de las muestras en el estudio de validación, se debe tomar en cuenta para obtener conclusiones fidedignas del estu-
dio. El presente capítulo asume que se han establecido previamente métodos apropiados para calcular la potencia relativa a
partir de los datos brutos de la respuesta de la valoración biológica (según se indica en el capítulo general (1034)). Las medi-
ciones de potencia relativa por lo general están normalmente distribuidas en logaritmos. Las medidas distribuidas normalmente en
logaritmos presentan sesgo y se caracterizan por la heterogeneidad de la variabilidad, donde la desviación estándar es proporcio-
nal al nivel de respuesta. Los métodos estadísticos citados en este capítulo requieren que los datos sean simétricos, aproximán-
dose a una distribución normal, aunque algunos otros procedimientos requieren de homogeneidad de la variabilidad en las me-
diciones a través del intervalo de potencia. Por lo regular, el análisis de potencia posterior a la transformación logarítmica gene-
ra datos que se acercan más al cumplimiento de ambos requisitos. La base de la transformación logarítmica no es de importan-
cia, siempre que se mantenga una base uniforme durante todo el análisis. De esta forma, por ejemplo, si el logaritmo natural
(logaritmo en base e) se usa para transformar las mediciones de potencia relativa, los resultados recopilados se convierten de
nuevo a la escala de la valoración biológica utilizando la base e.
La distribución de las mediciones de potencia deben evaluarse como parte del desarrollo de la valoración biológica (según se
describe en (1032)). Si se determina que las mediciones de potencia están distribuidas con normalidad, la validación se puede
llevar a cabo usando los métodos descritos en el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225).
Como consecuencia de la transformación logarítmica habitual (para valoraciones de líneas paralelas) de mediciones de po-
tencia relativa, existen ventajas cuando los niveles seleccionados para el estudio de validación se encuentran espaciados unifor-
memente en la escala logarítmica. Un ejemplo con cinco niveles sería 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Los niveles intermedios se
obtienen como la media geométrica (GM, por sus siglas en inglés) de dos niveles adyacentes. De esta forma, por ejemplo, el
nivel medio entre 0,50 y 1,0 se deriva de la manera siguiente:

GM=J0,50·1,0 =0,71

Asimismo, las medidas recopiladas de la validación se ven influenciadas por la escala logarítmica normal. La respuesta pro-
nosticada debe informarse como la media geométrica de las mediciones individuales de potencia relativa, mientras que la varia-
bilidad se expresa como %GCV. El GCV se calcula como el antilogaritmo de la desviación estándar, 5109, de mediciones de po-
tencia relativa transformadas. La fórmula provista es:

GCV == antilog(S 109 ) - 1

La variabilidad se expresa como GCV en lugar de RSD de la distribución logarítmica normal a fin de conservar la continuidad
usando la transformación logarítmica (ver la discusión adicional en el Apéndice de este capítulo). Los intervalos que pueden
calcularse a partir de la GCV serán uniformes con respecto a los intervalos calculados a partir de la media y de la desviación
estándar de los datos transformados en logaritmos. La Tabla 7 presenta un ejemplo del cálculo de la media geométrica (GM,
por sus siglas en inglés) y el sesgo relativo asociado, con el %GCV para una serie de mediciones de potencia relativa realizadas
con muestras analizadas en el nivel 1,00. El logaritmo base e se usa en la ilustración.
Tabla 1. Ilustración de los Cálculos de Media Geométrica y %GCV
Potencia Relativa 1 In de la Potencia Relativa
1, 1299 0,1221
0,9261 -0,0768
1,1299 0,1221
1,0143 0,0142
1,0027 0,0027
1,0316 0,0311
1,1321 0,1241
1,0499 0,0487

Promedio 0,0485 GM = 1,0497

RB = 4,97%
SD 0,0715 o/oGCV= 7,4%
USP 37 Información General/ (1033) Valoraciones Biológicas 741

Tabla 1. Ilustración de los Cálculos de Media Geométrica y %GCV (Continuación)

Potencia Relativa 1 In de la Potencia Relativa
1 La otencia relativa es la media eométrica de las otencias du licadas medidas en las ocho corridas del ejem lo rovisto en la Tabla 4.

En este ejemplo, la media geométrica de las mediciones de potencia relativa se calcula como el antilogaritmo de las medicio-
nes promedio del logaritmo de potencia relativa y luego se expresa como sesgo relativo, la desviación porcentual a partir de la
potencia diana:
GM = erromed10 = eo.04s5 = 1,0497

RB=100·( ~-1)%=100·( 1 ·º497 -1)%=4.97%

l
Diana 1, 00

y el coeficiente de variación geométrico porcentual (%GCV) se calcula como:

%GCV = 100. (eDesv1ación Estándac _ 1 )% = 100. (e0,0715 _ 1)% = 7,4%
Se debe tomar en cuenta que el %GCV calculado para este ejemplo no es igual a la IP determinada en el ejemplo de validación
de valoración biológica para el nivel 1,00 (8,5%); ver la Tabla 6. Este ejemplo utiliza el promedio de determinaciones repetidas
dentro de la corrida, mientras que la IP en el ejemplo de validación representa la variabilidad de las determinaciones repetidas
individuales.
Informe de Resultados de Validación Mediante Intervalos de Confianza-Las estimaciones de los parámetros de validación
de la valoración biológica deben presentarse como una estimación puntual junto con un intervalo de confianza. Una estimación
puntual es el valor numérico obtenido para el parámetro, como por ejemplo la media geométrica GM o el %GCV. La interpre-
tación más común de un intervalo de confianza es en forma de un intervalo probable del valor verdadero del parámetro. El
ejemplo previo determina un intervalo de confianza de 90% para el logaritmo de la potencia relativa promedio, C1¡ 0 , según se
indica a continuación:

Cl 10 =Promedio± tdf ·SO I Jn

=0,0485±1,89·0,0715/.JS = (0,0007; 0,0963)

Para el sesgo relativo, esto significa que:

eº·ººº7 J eº·º963 ( J
C!Re =100· ( - - - 1 %;100· - - - 1 %=(0,07%, 10,1%)
1,00 1,00

La constante estadística (1,89) se deriva de una tabla t, con grados de libertad iguales al número de mediciones menos uno
(grados de libertad = 8 - 1 = 7). Se puede formular un intervalo de confianza para la IP o para la variabilidad del formato
usando métodos para componentes de varianza; este capítulo general no abarca dichos métodos.
Evaluación del Cumplimiento de los Criterios de Aceptación-Los resultados de la validación de la valoración biológica se
comparan con criterios de aceptación diana a fin de demostrar que la valoración biológica es adecuada para su uso. El proceso
para establecer el cumplimiento de los parámetros de validación con respecto a los criterios de aceptación para la validación
no debe confundirse con establecer el cumplimiento de las mediciones de potencia relativa para las especificaciones del pro-
ducto. Las especificaciones del producto deben proveer información sobre el proceso para establecer criterios de aceptación
para la validación.
Una práctica común consiste en aplicar criterios de aceptación al parámetro de validación estimado. Esto, sin embargo, no
se toma en cuenta para la incertidumbre en el parámetro de validación estimado. Una solución es mantener el intervalo de
confianza en el parámetro de validación con respecto al criterio de aceptación, lo cual es una metodología estadística estándar
que se usa para demostrar el cumplimiento con las expectativas y que recibe el nombre de análisis de equivalencia. No se debe
confundir con la práctica de realizar una prueba de significancia, como por ejemplo, una prueba t, que busca establecer una
diferencia a partir de algún valor diana (p.ej., sesgo relativo de 0%). Una prueba de significancia relacionada con un valor P
>0,05 (equivalente a un intervalo de confianza que incluye el valor diana para el parámetro) indica que no existe suficiente
evidencia para concluir que el parámetro es diferente al valor diana. Esto no es lo mismo que concluir que el parámetro cum-
ple con el valor diana. El diseño del estudio puede tener muy pocas determinaciones repetidas, o los datos de validación pueden
ser demasiado variables para descubrir una diferencia significativa del valor diana. Asimismo, una prueba de significancia pue-
de detectar una pequeña desviación del valor diana que sea de poca importancia. Estos escenarios se ilustran en la Figura 1.
742 (1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

UAL - - - - - - -f--------------------
º I !

~L---------------------------

a b e
Figura 1. Uso de intervalos de confianza para establecer que los resultados de validación cumplen con un criterio de acepta-
ción.

La línea sólida horizontal representa el valor diana (posiblemente un sesgo relativo de 0%) y las líneas punteadas forman los
límites de aceptación inferior (LAL) y superior (UAL). En el escenario a, el límite de confianza incluye la diana y, por consiguien-
te, se puede concluir que no existe evidencia suficiente para establecer una diferencia con respecto a la diana (la metodología
de la prueba de significancia). No obstante, aunque la estimación puntual (el diamante sólido) cae dentro del intervalo de acep-
tación, el intervalo se extiende fuera del rango, lo que significa que el sesgo relativo verdadero puede estar fuera del intervalo
aceptable. En el escenario b, el intervalo cae dentro del intervalo de aceptación, lo que significa que cumple con el criterio de
aceptación. El intervalo en el escenario c también cae dentro del rango de aceptación, pero excluye la diana. Por lo tanto, para
el escenario c, aunque la diferencia de la estimación puntual a partir de la diana es estadísticamente significativa, ces aceptable
debido a que el intervalo de confianza cae dentro de los límites de aceptación diana.
Mediante el intervalo de confianza de 90%, calculado previamente, se puede establecer si la valoración biológica tiene un
sesgo relativo aceptable en el nivel 1,00 en comparación con un criterio de aceptación diana no mayor de, por ejemplo,
+12%. Debido a que el intervalo de confianza de 90% para el sesgo relativo porcentual (0,07%, 1O,1 %) cae dentro del inter-
valo (100*[(1/l,12) - 1]%, 100*[(1, l 2/l) - 1]%) = (- 11 %, 12%), se puede concluir que existe un sesgo relativo aceptable en
el nivel 1,00. Se debe tomar en cuenta que un intervalo de confianza de 90% se usa en una prueba de equivalencia en lugar
de un intervalo de confianza convencional de 95%. Esto es una práctica común y es igual que la metodología de pruebas do-
blemente unilaterales (TOST, por sus siglas en inglés) usada en el análisis de bioequivalencia farmacéutica.
Riesgos Implícitos en la Toma de Decisiones y en el Número de Corridas de Validación-La aplicación de análisis estadísti-
cos, incluyendo la evaluación del cumplimiento de un parámetro de validación con sus criterios de aceptación, implica riesgos,
uno de éstos es que el parámetro no cumpla con su criterio de aceptación inclusive si la propiedad asociada con dicho pará-
metro es satisfactoria; mientras que el otro riesgo, por el contrario, consiste en que el parámetro cumpla con su criterio de
aceptación aunque dicho parámetro sea verdaderamente insatisfactorio. Un aspecto relacionado con dichos riesgos es el tama-
ño de la muestra.
Los dos tipos de riesgo se pueden controlar simultáneamente mediante un diseño estratégico, incluyendo la selección del
número de corridas que se llevarán a cabo en la validación. Específicamente, el número mínimo de corridas requeridas para
establecer el cumplimiento con un criterio de aceptación para sesgo relativo se obtiene mediante la fórmula siguiente:

donde ta,gl y tp,gl son los puntos de distribución de una distribución t de Student; a y fJ son errores unilaterales tipo 1y tipo 11, y
representan los riesgos asociados con generar la conclusión errónea en la validación; gl son los grados de libertad relacionados
con el diseño del estudio (por lo general, n - 1);

es una estimación preliminar de precisión intermedia; y 0 es la desviación aceptable (criterio de aceptación diana).
Por ejemplo, si un criterio de aceptación para sesgo relativo es ± O, 11 log (es decir, e = O, 11 ), la variabilidad de la valoración
biológica es

&1P = 0,076 log

y a= fJ= 0,05,

(1. 89+ 2,36}2 0,076 2

n> "" 8 corridas
- 0,1f
USP 37 Información General/ (1033) Valoraciones Biológicas 743

Se debe tomar en cuenta que esta formulación de tamaño de la muestra asume la ausencia de sesgo intrínseco en la valora-
ción biológica. Una solución más conservadora incluye algo de sesgo diferente a cero en la determinación del tamaño de la
muestra, lo cual resulta en un mayor tamaño de la muestra para compensar el impacto del sesgo sobre las conclusiones de la
validación. En el ejemplo actual, el tamaño de la muestra se incrementa a 1 O corridas, si se asume un sesgo intrínseco igual a
2%. Asimismo, debe tomarse en cuenta que este cálculo representa una solución recurrente (puesto que los grados de libertad
dependen de n) que requiere software estadístico o un algoritmo que emplee metodología iterativa.
Además, es necesario considerar que la selección de a y fi debe justificarse basándose en los riesgos correspondientes de
generar una conclusión errónea a partir de la validación.
Generación de un Modelo para Resultados de Validación Usando Modelos de Efectos Mixtos-Muchos análisis relaciona-
dos con la validación de una valoración biológica deben tomar en cuenta múltiples factores de diseño, tales como efectos fijos
(p.ej., nivel de potencia), así como efectos aleatorios (p.ej., analista, corrida y determinaciones repetidas). Los modelos estadísti-
cos compuestos por efectos fijos y aleatorios reciben el nombre de modelos de efectos mixtos y, por lo general, requieren de
software estadístico sofisticado para su análisis. Los resultados del análisis se pueden resumir en una tabla de análisis de varian-
za (ANOVA, por sus siglas en inglés) o en una tabla de estimaciones de los componentes de la varianza. El objetivo principal
del análisis es estimar parámetros críticos en lugar de establecer la significancia de un efecto. Los resultados de la generación
del modelo ofrecen estimaciones de parámetros junto con sus errores estándar de estimaciones que se pueden emplear para
establecer el cumplimiento del criterio de aceptación. De esta forma, el sesgo relativo promedio en cada nivel se obtiene como
una porción del análisis junto con su variabilidad asociada. Éstos constituyen un intervalo de confianza que se compara con el
criterio de aceptación, conforme a lo descrito anteriormente. Cuando resulta posible combinar las varianzas de los niveles, la
generación de un modelo estadístico también puede determinar el sesgo relativo general y la precisión intermedia, combinan-
do la información obtenida a través de los niveles utilizados en la validación. De manera similar, los modelos de efectos mixtos
se pueden usar para obtener los componentes de la varianza para factores del estudio de validación y para combinar los resul-
tados a través de las muestras y niveles del estudio de validación.
Diseño Estadístico-Los diseños estadísticos, tales como el Diseño de Experimento multifactorial o anidado, pueden usarse
para organizar valoraciones y corridas en una validación de valoración biológica. Resulta útil incorporar aquellos factores que
se piense podrían influenciar la respuesta de la valoración biológica y que varían durante el uso a largo plazo del procedimien-
to en estos diseños. Usando estos métodos de diseño, es posible caracterizar las fuentes de variabilidad y se puede desarrollar
un plan de análisis estratégico para administrar la variabilidad de la valoración biológica.
La Tabla 2 presenta un ejemplo de un Diseño de Experimento multifactorial que incorpora múltiples analistas, múltiples pre-
paraciones de cultivo celular y múltiples lotes de reactivos en el plan de validación.
Tabla 2. Ejemplo de un Diseño de Experimento Multifactorial con 3 Factores
Lote de
Corrida Analista Preparación de Células Reactivo
1 1 1 1
2 1 1 2
3 1 2 1
4 1 2 2
5 2 1 1
6 2 1 2
7 2 2 1
8 2 2 2

En este diseño, cada analista lleva a cabo la valoración biológica con ambas preparaciones de células y con ambos lotes de
reactivo. Éste es un ejemplo de diseño factorial completo debido a que todas las combinaciones de factores se llevan a cabo en
el estudio de validación. Para reducir el número de corridas en el estudio, se pueden emplear diseños factorial fraccionarios
cuando se hayan identificado más de tres factores. Por ejemplo, si resultara práctico para un analista realizar cuatro valoracio-
nes en una corrida, se podría usar un diseño de unidad dividida considerando a los analistas como el factor de la gráfica com-
pleta y la preparación de células y el lote de reactivo como los factores secundarios de la gráfica. A diferencia de los experi-
mentos de comprobación, el diseño de validación debe incorporar la mayor cantidad de factores en la mayor cantidad de ni-
veles posible para obtener una estimación representativa de la precisión intermedia. Siempre que sea posible, se deberán em-
plear más de dos niveles de un factor en el diseño. Lo anterior se puede lograr de una forma menos estructurada, sin relación
alguna con el diseño factorial estricto. Las corridas de validación se deben aleatorizar siempre que sea posible para mitigar las
influencias potenciales del orden o tiempo de corrida.
La Figura 2 presenta un ejemplo de validación que emplea un diseño anidado (determinaciones repetidas anidadas dentro de
la placa; la placa anidada dentro del analista).
744 (1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

Figura 2. Ejemplo de un diseño anidado usando dos analistas.

Para estos dos tipos de diseños, así como para las combinaciones de los mismos, se pueden estimar componentes de variabi-
lidad a partir de los resultados de la validación. Estos componentes de variabilidad se pueden usar para identificar las fuentes
significativas de variabilidad, así como para derivar un formato de valoración biológica que cumpla con los requisitos de preci-
sión del procedimiento. Se debe tomar en cuenta que las fuentes significativas de variabilidad podrían haber sido identificadas
durante el desarrollo. En dicho caso, la validación debe confirmar tanto el impacto de estos factores como el cumplimiento del
formato de la valoración con los requisitos de precisión.
Cifras Significativas-El número de cifras significativas en un resultado informado a partir de una valoración biológica se rela-
ciona con la precisión de ésta última. En general, una valoración biológica con un %GCV entre 2% y 20% sustentará dos cifras
significativas. El número de cifras significativas no debe confundirse con el número de lugares decimales-los valores de infor-
me iguales a 1,2yO,12 tienen el mismo número (dos) de cifras significativas. Este estándar de redondeo es adecuado para
mediciones en escala logarítmica que presentan una variación constante en la escala logarítmica y una variabilidad proporcio-
nal, no aditiva, en la escala original (o en la escala usada originalmente para interpretación). Se debe tomar en cuenta que el
redondeo se presenta al final de una serie de cálculos cuando la medición final se informa y se emplea para tomar decisiones,
tales como el cumplimiento con las especificaciones. De esta forma, si la medición final es un valor de informe obtenido a
partir de múltiples valoraciones, el redondeo no debe realizarse antes de determinar el valor de informe. Asimismo, las especifi-
caciones deben declararse con el número apropiado de cifras significativas.

3. EJEMPLO DE VALIDACIÓN DE UNA VALORACIÓN BIOLÓGICA

A continuación se presenta un ejemplo que ilustra los principios descritos en este capítulo. La valoración biológica se utilizará
para sustentar un intervalo de especificación de 0,71 a 1,41 para el producto. Usando la capacidad de proceso descrita en la
sección 2.5 Validación de Criterios de Aceptación Diana, se deriva una tabla que muestra la tasa proyectada de resultados fuera
de la especificación para diversas restricciones de sesgo relativo y precisión intermedia. La capacidad del proceso se calcula con
respecto a la variabilidad de un valor de informe usando tres corridas independientes de la valoración biológica (ver la discu-
sión anterior sobre variabilidad del formato). Se asume que la variabilidad del producto es igual a O en los cálculos. El laborato-
rio podría optar por incluir una variabilidad de producto diana. Se puede obtener una estimación de la variabilidad del produc-
to diana a partir de los datos de un producto que, por ejemplo, se fabrica usando un proceso similar.
Tabla 3. Capacidad del Proceso y Probabilidad de Resultados Fuera de la Especificación para Diversas Restricciones
de Sesgo Relativo y Precisión Intermedia
Límite de Especifica-
ción Inferior-Límite de Probabilidad (resultados fuera de la
Especificación Supe- Precisión Intermedia Sesgo Capacidad del Pro- especificación)
rior (%) Relativo(%) ceso (%)
0,71-1,41 20 20 0,54 10,5
0,71-1,41 8 12 0,94 0,48
0,71-1,41 10 5 1,55 0,0003

El cálculo se presenta para una precisión intermedia igual a 8% y un sesgo relativo igual a 12% (n = 3 corridas):

Cpm= . ln(1,41)-ln(0,71) =0. 94

6 \f(ln(1,08)] 2 /3+[1n(1,12)] 2

Probabilidad (resultados fuera de la especificación)= 2 · <D(-3 · 0,94) = 0,0048 (0,48%),

donde <t> representa la función de distribución acumulativa normal estándar.

A partir de la Tabla 3, se puede esperar un desempeño aceptable (una probabilidad menor de 1% de obtener un resultado
fuera de la especificación debido al sesgo y a la variabilidad de la valoración biológica), si la precisión intermedia es -<::8% y el
sesgo relativo es -<::12%. La fórmula de tamaño de la muestra provista en la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Riesgos de la
Toma de Decisiones y Número de Corridas de Validación, se puede usar para derivar el número de corridas requeridas para esta-
blecer el cumplimiento con el criterio de aceptación para un sesgo relativo igual a 12% (usando %GCVrrec,,,ón intermedia = 8%; a =
/3= 0,05):
(1. 89 + 2.36)2 (ln(1. 08)]2 " 8 corridas
n2 (ln(1, 12)]2
USP 37 Información General/ (1033) Valoraciones Biológicas 745

Por consiguiente, serían necesarias ocho corridas para tener un 95% de probabilidad de cumplir con el criterio de acepta-
ción diana para sesgo relativo si el sesgo relativo verdadero es cero. Tomar en cuenta que el cálculo del tamaño de la muestra
asume que se llevará a cabo un singulete de las muestras de validación en cada corrida de validación. El uso de múltiples con-
juntos para determinaciones repetidas y/o múltiples valoraciones proporcionará información valiosa la cual permitirá separar
las estimaciones para variabilidad intracorrida y entre corridas, y reducirá el riesgo de incumplimiento de los criterios de acep-
tación diana de la validación.
En la validación se estudian cinco niveles del analito diana: 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Dos analistas capacitados generan
dos corridas en cada nivel usando dos lotes de medios. Se pueden tomar en cuenta otros factores e incorporarlos en el diseño
usando una distribución factorial fraccionaria. El laboratorio debe esforzarse para diseñar la validación con la mayor cantidad
posible de niveles para cada factor a fin de obtener el mejor modelo para el desempeño a largo plazo de la valoración biológi-
ca. En este ejemplo, cada analista lleva a cabo dos corridas en cada nivel usando cada lote de medios. Una corrida consiste en
una serie de diluciones completas del Estándar, conforme a lo descrito en el procedimiento operativo de la validación biológi-
ca, junto con dos series de diluciones independientes de la muestra de Prueba. Lo anterior genera mediciones por duplicado
de la potencia relativa en cada corrida; ver la Tabla 4 para todas las observaciones de potencia relativa. Es necesario considerar
que las dos estimaciones de potencia en cada nivel de potencia en una corrida no son independientes debido a los analistas y
lotes de medios en común.
Tabla 4. Ejemplo de Validación de una Valoración Biológica con Dos Analistas, Dos Lotes de Medios
y Corridas por Nivel para cada Combinación de Analista y Lote
Lote de Medios/
Analista 1/1 1/2 2/1 2/2
Corrida 1 2 1 2 1 2 1 2
0,50 0,5215 0,4532 0,5667 0,5054 0,5222 0,5179 0,5314 0,5112
0,50 0,5026 0,4497 0,5581 0,5350 0,5017 0,5077 0,5411 0,5488
0,71 0,7558 0,6689 0,6843 0,7050 0,6991 0,7463 0,6928 0,7400
0,71 0,7082 0,6182 0,8217 0,7143 0,6421 0,6877 0,7688 0,7399
1,00 1,1052 0,9774 1, 1527 0,9901 1,0890 1,0314 1,1459 1,0273
1,00 1,1551 0,8774 1,1074 1,0391 0,9233 1,0318 1,1184 1,0730
1,41 1,5220 1,2811 1,5262 1,4476 1,4199 1,3471 1,4662 1,5035
1,41 1,5164 1,3285 1,5584 1,4184 1,4025 1,4255 1,5495 1,5422
2,00 2,3529 1,8883 2,3501 2,2906 2,2402 2,1364 2,3711 2,0420
2,00 2,2307 1,9813 2,4013 2,1725 2,0966 2,1497 2,1708 2,3126

2,00-

1,41-

l,00- + Analista 1
., Analista 2
_Linea Unitaria

0,71-

0,50-

1 1 1 j 1
0,50 0,71 1,00 1,41 2,00
Potencia Relativa Conocida

Figura 3. Gráfica de los resultados de la validación en función de los niveles de muestra.

Se utiliza una gráfica para revelar cualquier irregularidad en los resultados experimentales. En particular, una gráfica adecua-
damente preparada puede revelar una falla en la concordancia de los resultados de la validación con los niveles de validación,
así como heterogeneidad de la variabilidad a través de los niveles (ver la discusión sobre transformación logarítmica en la sec-
ción 2.7 Consideraciones Estadísticas). La gráfica del ejemplo de la Figura 3 incluye la línea unitaria (línea con una pendiente
igual a 1, la cual pasa por el origen). Los datos del analista 1 y del analista 2 se desalinearon deliberadamente con respecto a la
potencia esperada para permitir una visualización y comparación claras de los conjuntos de datos obtenidos por cada analista.
 .
746 <1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

Se puede llevar a cabo un análisis formal de los datos de validación mediante el siguiente procedimiento: (1) una evaluación
de la variabilidad (precisión intermedia) debe preceder a una evaluación de la exactitud o especificidad de la potencia relativa
a fin de establecer que se cumple la suposición de que se pueden combinar las varianzas a través de los niveles de muestra; y
(2) se evalúa la exactitud relativa en niveles separados o mediante un análisis combinado, dependiendo de qué tan bien se
puedan combinar los datos a través de los niveles. Estas etapas se demuestran usando los datos de validación del ejemplo,
junto con algunos detalles de los cálculos para propósitos ilustrativos. Debe tomarse en cuenta que los cálculos ilustrados en
las secciones siguientes son apropiados únicamente con un conjunto de datos equilibrados. Los diseños o conjuntos de datos
sin equilibrar y faltos de mediciones de potencia relativa deben analizarse usando un análisis de modelo mixto con estimación
de probabilidad máxima restringida (REML, por sus siglas en inglés).

3.1 Precisión Intermedia

Los datos en cada nivel se pueden analizar usando un análisis de componentes de la varianza. Con datos equilibrados, como
en el ejemplo actual, se pueden medir los componentes de la varianza a partir de un ANOVA estándar de sentido único. La
Tabla 5 presenta un ejemplo del cálculo realizado en un solo nivel (0,50).
Tabla 5. Análisis de Componentes de la Varianza Realizado a las Mediciones del Logaritmo de la Potencia Relativa en el Nivel 0,5
Fuente gl* Suma de Cuadrados Cuadrado Medio Cuadrado Medio Esperado
Corrida 7 0,055317 0,007902 Var(Error) + 2 Var(Corrida)
Error 8 0,006130 0,000766 Var(Error)
Corregida total 15 0,061447
Estimaciones de los Componentes de la Varianza
Var(Corrida) = 0,003568
Var(Error) = 0,000766
* ql = qrados de libertad

La parte superior de la tabla representa un ANOVA estándar. No han sido incluidos los analistas ni los lotes de medios debi-
do al pequeño número de niveles (2 niveles) para cada factor. El factor "Corrida" en este análisis representa las corridas combi-
nadas a través del analista mediante combinaciones de lotes de medios. El Cuadrado Medio Esperado es la combinación lineal
de componentes de la varianza que genera el cuadrado medio (MS, por sus siglas en inglés) para cada fuente. Las estimaciones
de componentes de la varianza se derivan solucionando la ecuación "Cuadrado Medio Esperado = Cuadrado Medio" para ca-
da componente. Para comenzar, el cuadrado medio para estimaciones de Error Var(Error), el componente de variabilidad den-
tro de la corrida, es
Var(Error) = MS(Error) = 0,000766

De manera subsiguiente, se calcula el componente de variabilidad entre corridas, Var(Corrida), estableciendo el cuadrado me-
dio por Corrida con la expresión matemática para el cuadrado medio esperado y, posteriormente, resolviendo la ecuación para
Var(Corrida) de la manera siguiente:
MS(Corrida) = Var(Error) + 2 · Var( Corrida)
Var(Corrida) = MS(Corrida) - MS(Error)
2
=0,007902-0,000766 =o 003568
2 '

Estas estimaciones de los componentes de la varianza se combinan para establecer un valor de 0,50 a la precisión intermedia
general de la valoración biológica:

IP = 100. ( e-iv;;¡¡;o;;;¡¡"' Voc(fa;;;;¡ -1 )%

= 100 . (e v0.003568~.00Ü766 -1) % = 6, 8 %
El mismo análisis se realizó con cada nivel de la validación y se presenta en la Tabla 6.
Tabla 6. Estimaciones de Componentes de la Varianza y Variabilidad General para Cada Nivel de Validación y el Promedio
Nivel
Componente 0,50 0,71 1,00 1,41 2,00 Promedio
Var(Corrida) 0,003568 0,000648 0,003639 0,003135 0,002623 0,002723
Var(Error) 0,000766 0,004303 0,002954 0,000577 0.002258 0,002172
General 6,8% 7,3% 8,5% 6,3% 7,2% 7,2%
USP 37 Información General/ (1033) Valoraciones Biológicas 747

Se puede realizar un análisis combinado si los componentes de la varianza son similares a través de los niveles. Por lo gene-
ral, se emplea el método heurístico para esta evaluación. Es posible mantener el cociente de la varianza máxima y la varianza
mínima a un valor no mayor de 1O (se usa 1O debido al número limitado de corridas realizadas en la validación). En este ejem-
plo, los cocientes asociados con el componente de la varianza entre corridas, 0,003639/0,000648 = 5,6 y con el componente
dentro de la corrida, 0,004303/0,000577 = 7,5, cumple con el criterio de 1O veces. Si el cociente hubiese excedido de 1O y si
se hubiese debido a un exceso de variabilidad en uno o otro de los extremos en los niveles analizados, dicho extremo habría
de eliminarse de los análisis adicionales y el intervalo tendría que limitarse para excluir dicho nivel.
El análisis puede continuar usando un software estadístico capaz de aplicar un modelo de efectos mezclados a los resultados
de la validación. Dicho análisis debe tomar en cuenta cualquier desequilibrio en el diseño, los efectos aleatorios como el analis-
ta o el lote de medios y los efectos fijos, tales como cada uno de los niveles (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas,
Generación de un Modelo para los Resultados de la Validación Usando Modelos de Efectos Mixtos). Los componentes de la varianza
se pueden determinar por separado para el analista y el lote de medios a fin de caracterizar sus respectivas contribuciones a la
variabilidad general de la valoración biológica.
En el ejemplo, se puede obtener el promedio de los componentes de la varianza a través de niveles para informar la preci-
sión intermedia de la valoración biológica. Este método de combinación de estimaciones es exacto únicamente, si un diseño
balanceado ha sido empleado en la validación (p.ej., la misma estrategia para determinaciones repetidas en cada nivel). Se
empleó un diseño balanceado para el ejemplo de validación, de modo que la precisión intermedia se puede informar como
7,2% GCV.
Debido a la recomendación para informar los resultados de la validación con alguna medida de incertidumbre, se puede
calcular un límite superior de confianza unilateral de 95% para la precisión intermedia de la valoración biológica. La literatura
contiene métodos para calcular los límites de confianza para componentes de la varianza. El límite superior en la precisión in-
termedia para el ejemplo de valoración biológica es 11,8% GCV. El límite superior de confianza no se calculó por separado en
cada nivel debido a la limitación de datos un nivel individual con respecto al diseño general del estudio.

3.2 Exactitud Relativa

El análisis puede proceder con una evaluación de la exactitud relativa en cada nivel. La Tabla 7 presenta el promedio y el
intervalo de confianza de 90% de los resultados de la validación en la escala logarítmica, así como la potencia correspondiente
y el sesgo relativo.
Tabla 7. Potencia Promedio y Sesgo Relativo en Niveles lndlvlduales
Logaritmo de Potencia Potencia Sesgo Relativo
(90% Intervalo de Con- (90% Intervalo (90% Intervalo
Nivel nª Promedio fianza) Promedio de Confianza) Promedio de Confianza)
0,50 8 -0,6613 (-0,7034, -0,6192) 0,52 (0,49; 0,54) 3,23% (-1,02; 7,67)
0,71 8 -0,3419 (-0,3773, -0,3064) 0,71 (0,69; 0,74) 0,06% (-3,42; 3,67)
1,00b 8 0,0485 (0,0006, 0,0964) 1,05 (1,00, 1, 1O) 4,97% (0,06; 1o,12)
1,41 8 0,3723 (0,3331; 0,4115) 1,45 (1,40; 1,51) 2,91% (-1,04; 7,03)
2,00 8 0,7859 (0,7449; 0,8269) 2,19 (2, 11; 2,29) 9,72% (5,31; 14,32)
ª Análisis realizado a los promedios de los duplicados de cada corrida.
b Cálculo ilustrado en la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Escala del Análisis.

El análisis se ha realizado al promedio de los duplicados de cada corrida (n = 8 corridas) puesto que las mediciones duplica-
das se correlacionan dentro de una corrida mediante factores compartidos de precisión intermedia (analista, lote de medios y
corrida, para este caso). Se puede usar una gráfica de sesgo relativo contra el nivel para examinar los patrones de los resultados
experimentales y para establecer el cumplimiento del criterio de aceptación diana para sesgo relativo (12%).

12%

f
0%

-11%

0,50 0,71 1,00 1.41 2,00

Figura 4. Gráfica de intervalos de confianza de 90% para sesgo relativo contra el criterio de aceptación. Tomar en cuenta
que el criterio de aceptación inferior es igual a 100 · [(l /1, 12) - 1] = -11 %.

La Figura 4 presenta un sesgo positivo promedio en todos los niveles de muestra (es decir, el sesgo relativo promedio es
positivo en todos los niveles). Esta uniformidad se debe en parte a la falta de independencia de los resultados de la valoración
748 (1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

biológica en todos los niveles. Asimismo, no parece haber una tendencia en el sesgo relativo en todos los niveles. Esto último
indicaría que una comparación de muestras con potencias relativas medidas de manera diferente (por ejemplo, muestras de
estabilidad) presenta sesgo, lo que posiblemente podría resultar en una conclusión errónea. El análisis de tendencia se puede
llevar a cabo usando una regresión del logaritmo de la potencia relativa en función del logaritmo del nivel. Se puede conside-
rar la introducción de un criterio de aceptación durante el desarrollo de la validación de la valoración biológica para una ten-
dencia en la exactitud relativa a través del intervalo.
Después de establecer que no existe una tendencia significativa en todos los niveles, el analista procede a realizar una eva-
luación de la exactitud relativa en cada nivel. La valoración biológica presenta sesgo relativo aceptable en los niveles que van
de 0,50 a 1,41, produciendo límites de confianza de 90% (equivalentes a una prueba t doblemente unilatera0 que caen dentro
de la región de aceptación de sesgo relativo de -11 % a 12%. El intervalo de confianza de 90% en 2,0 cae fuera de la región
de aceptación, lo que indica que el sesgo relativo puede exceder de 1 2%.
Se puede realizar un análisis combinado usando un software estadístico capaz de aplicar un modelo de efectos mixtos a los
resultados de la validación. El análisis toma en cuenta exactamente el diseño del estudio de validación. Asimismo, el análisis
acomoda los efectos aleatorios tales como analista, lote de medios y corrida (ver la sección 2.7 Consideraciones Estadísticas, Ge-
neración de un Modelo para Resultados de Validación Usando Modelos de Efectos Mixtos).

3.3 Intervalo

Las conclusiones derivadas de la evaluación de la precisión intermedia y la exactitud relativa se pueden usar para establecer el
intervalo de la valoración biológica que demuestra un desempeño satisfactorio. Basándose en el criterio de aceptación para
una precisión intermedia igual a 8% GCV (ver la Tabla 6) y para un sesgo relativo igual a 12% (ver la Tabla 7), el intervalo de
la valoración biológica es de 0,50 a 1,41. En este intervalo, el nivel 1,0 presenta una estimación ligeramente mayor que la esti-
mación de precisión intermedia (8,5% contra el criterio de aceptación diana ::::8,0%), lo cual se puede deber a la variabilidad
de la estimación que resulta de un conjunto de datos pequeño. Debido a lo anterior y a otros resultados de la Tabla 6, se
puede concluir que se ha demostrado una precisión intermedia satisfactoria a lo largo del intervalo.

3.4 Uso de los Resultados de la Validación para Caracterizar una Valoración Biológica

Cuando el estudio se ha realizado para estimar las características de la valoración biológica (caracterización), también se
pueden usar las estimaciones de los componentes de Ja varianza para predecir la variabilidad en diferentes formatos de valoración
biológica y determinar así un formato con el nivel de precisión deseado. La variabilidad pronosticada para k corridas indepen-
dientes, con n series de diluciones individuales de la preparación de prueba dentro de una corrida, se proporciona mediante la
fórmula siguiente para variabilidad del formato:
Variabilidad del Formato= 1 00 . (e'Var(Carrida)!k + Var(ErrorJ)(nk) _ 1)

Usando estimaciones de los componentes de la varianza entre corridas e intracorrida a partir de la Tabla 6 [Var(Corrida) =
0,002723 y Var(Error) = 0,002172], si la valoración biológica se realiza en tres corridas independientes, la variabilidad pronosti-
cada del valor de informe (media geométrica de los resultados de potencia relativa) es igual a:
Variabilidad del Formato= 100. (e -:0,00212111 + o,00211210 JJ_ 1) = 4, 1 %

Este cálculo se puede expandir para que incluya diversas combinaciones de corridas y conjuntos mínimos (asumiendo que los
números de muestras, diluciones y determinaciones repetidas en los conjuntos mínimos se mantengan constantes) dentro de
las corridas conforme a lo mostrado en la Tabla 8.
Tabla 8. Variabilidad del Formato para Diferentes Combinaciones de Número de Corridas (k) y Número de Conjuntos Mínimos
dentro de la Corrida (n)
Número de Corridas (k)
Determinaciones
Repetidas (n) 1 2 3 6
1 7,2% 5,1% 4,1% 2,9%
2 6,4% 4,5% 3,6% 2,6%
3 6,0% 4,2% 3,4% 2,4%
6 5,7% 4,0% 3,3% 2,3%

Resulta claro que el medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la potencia media geométrica en
todas las corridas y conjuntos mínimos) es mediante corridas independientes del procedimiento de la valoración biológica. Asi-
mismo, los límites de confianza para los componentes de la varianza usados para derivar la precisión intermedia se pueden
usar para establecer la variabilidad del formato de la valoración biológica.
Las fuentes significativas de variabilidad deben incorporarse a corridas para lograr la reducción de la varianza. Un análisis
más extenso del ejemplo de validación de la valoración biológica incluiría al analista y al lote de medios en el modelo estadísti-
co. Las estimaciones de los componentes de la varianza obtenidos a partir de dichos análisis se presentan en la Tabla 9.
USP 37 Información General/ (1033) Valoraciones Biológicas 749

Tabla 9. Estimaciones de Probabllldad Máxima Restringida de los Componentes de la Varianza Asociados con el Analista, el Lote de
Medios y la Corrida
Varianza Estimado del Componente
Var(Lote de Medios) 0,0000
Var(Analista) 0,0014
Var(Analista*Lote de Medios) 0,0000
Var(corrida(Analista*Lote de Medios)) 0,0019
Var(Error) 0,0022

Idealmente, la identificación del analista como un factor significativo de la valoración biológica se debe tratar durante el de-
sarrollo de la valoración biológica. Sin embargo, el laboratorio puede optar por tratar la contribución aparente de la variabili-
dad entre analistas mediante capacitación o usando múltiples analistas en el desarrollo del formato de la valoración para el
desempeño de rutina de la valoración biológica.
Las estimaciones de variabilidad entre corridas e intracorrida también se pueden usar para determinar los tamaños de las
diferencias (número de diferencias) que se pueden distinguir entre las muestras analizadas de la valoración biológica. Para k
corridas, con n conjuntos mínimos dentro de cada corrida, usando un valor crítico bilateral aproximado, a partir de la distribu-
ción normal estándar con z = 2, el número de diferencias críticas entre los valores de informe para dos muestras que se anali-
zan en las mismas corridas de la valoración biológica se proporcionan mediante la fórmula siguiente:
Número de Diferencias Críticas = e2 · Nar(Carrida)/k+vár(ErrO/Jl(nk)

Cuando las muestras han sido analizadas en corridas diferentes de la valoración biológica (tales como muestras para estabili-
dad a largo plazo), el número de diferencias críticas se provee (asumiendo que se usa el mismo formato para analizar las dos
series de muestras) mediante:
Número de Diferencias Críticas= e2. ffTvar(Corrido)/k+Var(Error)/(nk)}

Para la comparación de muestras, el laboratorio puede seleccionar un diseño (formato de valoración biológica) que cuente con
una precisión adecuada para detectar un número de diferencias significativo entre muestras.

3.5 Confirmación de la Precisión Intermedia y Revalidación

La estimación de la precisión intermedia derivada de la validación presenta una alta incertidumbre debido al pequeño núme-
ro de corridas realizadas. Después de que el laboratorio acumula experiencia adecuada con la valoración biológica, la estima-
ción puede ser confirmada o actualizada mediante el análisis de las mediciones de las muestras de control, tal como la variabili-
dad de un control positivo. Dicho análisis se puede llevar a cabo con el control preparado y analizado al igual que una muestra
de Prueba (es decir, una serie de diluciones y estrategia para determinaciones repetidas idénticas o similares). Esta evaluación
se realizará después de haber llevado a cabo suficientes valoraciones para obtener una estimación alternativa de la precisión
intermedia de la valoración biológica, incluida la implementación de cambios (p.ej., analistas diferentes, lotes de reactivos cla-
ves diferentes y preparaciones celulares diferentes) relacionados con el protocolo de valoración estandarizado. La precisión in-
termedia de la valoración biológica se debe modificar a manera de enmienda en el informe de validación en caso de que la
evaluación revele una disparidad importante de los resultados.
La valoración biológica debe revalidarse siempre que se apliquen cambios sustanciales en el método, los cuales incluyen, pe-
ro no se limitan a cambios tecnológicos o cambios en la lectura. La revalidación puede constar de una repromulgación total de
la validación de la valoración biológica o de un estudio puente que compare los métodos actuales y los modificados.

4. FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIÓN

Para información adicional y métodos alternativos, se pueden consultar las referencias citadas a continuación.
1. ASTM. Standard Practice for Using Significant Digits in Test Data to Determine Conformance with Specifications, ASTM
E29-08. Conshohocken, PA: ASTM; 2008.
2. Berger R, Hsu J. Bioequivalence trials, intersection-union tests and equivalence confidence intervals. Stat Sci 1996;11 (4):
283-319.
3. Burdick R, Graybill F. Confidence lntervals on Variance Components. New York: Marcel Dekker; 1992:28-39.
4. Haaland P. Experimental Design in Biotechnology. New York: Marcel Dekker; 1989;64-66.
5. Schofield TL. Assay validation. In: Chow SC, ed. Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics. 2nd ed. New York: Marcel
Dekker; 2003.
6. Schofield TL. Assay development. In: Chow SC, ed. Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics. 2nd ed. New York: Marcel
Dekker; 2003.
7. Winer B. Statistical Principies in Experimenta/ Design. 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 1971 :244-251.
750 (1033) Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

APÉNDICE-MEDIDAS DE UBICACIÓN Y DISPERSIÓN PARA VARIABLES NORMALMENTE

DISTRIBUIDAS EN LOGARITMOS
Los procedimientos estadísticos comunes, tales como ANOVA o la estimación del intervalo de confianza, presentan dos su-
posiciones: (1) la variación en la respuesta de la valoración biológica alrededor de su media está normalmente distribuida y (2)
la desviación estándar de los valores de la respuesta observados es constante en un intervalo de respuestas que son de interés.
Se dice que dichas respuestas tienen una "distribución normal" y una "estructura de error sumatorio". Cuando no se cumplen
estas dos condiciones, podría resultar útil considerar una transformación antes de emplear procedimientos estadísticos comu-
nes.
A menudo se determina que la variación en las respuestas de la valoración biológica son anormales (sesgadas hacia valores
más altos) con una desviación estándar aproximadamente proporcional (o casi) a la respuesta media. Dichas respuestas por lo
regular tienen una "estructura de error multiplicativo" y siguen una "distribución normal logarítmica" con un coeficiente de
variación porcentual (%CV) que es constante en todo el intervalo de respuesta de interés. En tales casos, se encontrará que
una transformación logarítmica de la respuesta de la valoración biológica es aproximadamente normal con una desviación es-
tándar casi constante en el intervalo de respuesta. Después de aplicar la transformación logarítmica, se cumplen las dos suposi-
ciones y se pueden llevar a cabo procedimientos estadísticos comunes con la respuesta transformada en logaritmos. La siguien-
te discusión asume una distribución normal logarítmica para la respuesta de la valoración biológica.
Esto se refiere a un valor de respuesta de valoración biológica observado, X, que se encuentra en la "escala original de medi-
ción" y a una respuesta transformada en logaritmos, Y= log(X), que se encuentra en la "escala transformada en logaritmos".
Aunque los procedimientos estadísticos comunes pueden ser apropiados únicamente en la escala transformada en logaritmos,
se pueden recopilar las respuestas de la valoración biológica estimando las mediciones de ubicación (p.ej., media o mediana),
las mediciones de dispersión (p.ej., desviación estándar) o intervalos de confianza en cualquiera de las escalas de medición,
siempre que se indique la escala que se está utilizando. El %CV es útil en la escala original cuando es constante en el intervalo
de respuesta. Por la misma razón, la desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) es relevante en la escala transformada en
logaritmos. Informar los resúmenes estadísticos basándose en la escala transformada en logaritmos (Y) ofrece ventajas. No obs-
tante, a menudo se puede obtener información importante al transformar de nuevo las medidas informadas a su escala origi-
nal de medición (X).
Para cualquier valor dado de X, sólo existe un valor único de Y= log(X), y viceversa. Algo similar ocurre con las mediciones
de ubicación y dispersión, en donde existe una correspondencia única entre cada medición de ubicación y dispersión obteni-
das en la escala original y transformada en logaritmos. Además, así como existe una relación simple entre X e Y= log(X), exis-
ten relaciones simples que permiten la conversión entre las medidas correspondientes de cada escala, según se indica a conti-
nuación en la Tabla A- 7. En dicha tabla, "Promedio" y "Desviación Estándar", siempre que aparezcan, harán referencia a medi-
ciones calculadas en la escala transformada en logaritmos (Y).
Tabla A-1. Comparación de Mediciones de Ubicación y Dispersión
Escala de Medición
Transformada en Loga-
Medición ritmos (Y) Original (X)
Media geométrica (GM)

Ubicación Media (promedio)

=ro X¡= ePromed10

Desviación estándar geométrica

Dispersión Desviación estándar (SD) (GSD) = eSD
Intervalos de confianza Inferior Promedio - k · SD/,tn GM/GSDki'n
(k es una constante apropiada Superior Promedio+ k . SD/,ln GM · GSDki"1
basada en la distribución to
una aproximación grande ancho (superior - inferior) Cociente(superior/inferior)
de la muestra z) Tamaño = 2 · k · SD/,tn = GSD2khn
Coeficiente de variación
porcentual (%CV) %GCV = 100 · (GSD-1) %CV 1OO~e 50 ' -1 <%GCV
La media geométrica (GM, por sus siglas en inglés) no debe malinterpretarse como una estimación de la media de la varia-
ble de la escala original (X), sino que es una estimación de la mediana de X. La mediana es una medición más apropiada de
ubicación para variables con distribuciones de error sesgadas tales como las distribuciones normales logarítmicas, así como las
distribuciones de error simétricas, donde la mediana es igual a la media.
De manera similar, la desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés) no se debe malinterpretar como la des-
viación estándar de la variable de la escala original (X). Sin embargo, la desviación estándar geométrica es un factor multiplica-
tivo útil para obtener intervalos de confianza en la escala original (X), que se correspondan con los de la escala transformada
en logaritmos (Y), según lo presentado en la tabla anterior. Una desviación estándar geométrica con un valor de 1 corresponde
a una ausencia de variación (desviación estándar con un valor de Y= O). El cociente entre los límites de confianza Superior e
Inferior, en la escala no transformada (X), será igual a la GSD 2 kl' 11 , según se aprecia en la Tabla A-7.
USP 37 Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 751

El coeficiente de variación geométrica porcentual (%GCV) se aproxima al %CV en la escala original (X) cuando el %CV es
menos de 20%. Es importante no confundir estas mediciones de dispersión. El %GCV es una medida relevante para la escala
transformada en logaritmo (Y) y el %CV es una medida relevante para la escala original (X). Dependiendo del marco de refe-
rencia preferido, puede ser útil una o incluso ambas mediciones.

APÉNDICE DE FUENTES DE INFORMACIÓN

1. Limpert E, Stahel WA, Abbt M. (2001) Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. BioScience 51 (5):
341-252.
2. Kirkwood TBL. (1979) Geometric means and measures of dispersion. Biometrics 35: 908-909.
3. Bohidar NR. (1991) Determination of geometric standard deviation for dissolution. Drug Development and Industrial
Pharmacy 1 7(1 O): 1 381-1 387.
4. Bohidar NR. (1993) Rebuttal to the "Reply". Drug Development and Industrial Pharmacy 19(3): 397-399.
5. Kirkwood TBL. (1993) Geometric standard deviation-reply to Bohidar. Drug Development and Industrial Pharmacy
19(3): 395-396.
6. (101 O) Datos Analíticos- Interpretación y Tratamiento. USP 34. En: USP34-NF 29. Volúmen 1. Rockville (MD): Farmaco-
pea de los Estados Unidos de América; c2011. p. 419.
7. Tan CY. (2005) RSD and other variability measures of the lognormal distribution. Pharmacopeial Forum 31 (2): 653-655.

(1034) ANÁLISIS DE VALORACIONES BIOLÓGICAS

1. INTRODUCCIÓN

Aunque los avances en la caracterización química han reducido el uso de las valoraciones biológicas para valorar muchos
productos, éstas continúan siendo esenciales para la determinación de la potencia y para garantizar la actividad de una gran
cantidad de proteínas, vacunas, mezclas complejas y productos de terapia celular y génica, además de su importante papel en
el seguimiento de la estabilidad de productos biológicos. El capítulo general Análisis de Valoraciones Biológicas (1034) pretende
abarcar las pautas para el análisis de los resultados de las valoraciones biológicas descritas en la Farmacopea de los Estados Uni-
dos de América (USP) y de las valoraciones biológicas no pertenecientes a la USP, pero que intentan cumplir con las pautas de
calidad de los análisis de valoración biológica recomendados por la USP. Se debe tomar en cuenta que el énfasis del diseño y la
validación de los análisis se tratan en los capítulos complementarios (Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032) y
Validación de Valoraciones Biológicas (1033), respectivamente).
Los temas tratados en el capítulo (1034) incluyen conceptos y métodos estadísticos de análisis para el cálculo de la potencia
y de los intervalos de confianza para una variedad de valoraciones biológicas de potencia relativa, incluyendo aquéllos citados
en la USP. El capítulo (1034) está destinado para su uso principalmente por parte de aquéllos que no cuentan con una capaci-
tación o conocimientos extensos en estadística, así como estadísticos que no cuentan con experiencia en el análisis de valora-
ciones biológicas. Las secciones que presentan principalmente conceptos requieren una mínima base de conocimiento de esta-
dística. No obstante, la mayor parte del capítulo y todas las secciones de métodos requieren que aquéllos que no sean exper-
tos en estadística posean conocimientos mínimos al nivel tratado en el capítulo general de la USP Datos Analíticos-Interpreta-
ción y Tratamiento (101 O) y de regresión lineal. La mayor parte de las secciones 3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuanti-
tativas y 3.6 Valoraciones Dicótomas (Cuanta/es) requieren una base de conocimiento de estadística más extensa y, por consi-
guiente, está dirigido principalmente a estadísticos. Asimismo, el capítulo (1034) introduce métodos selectos complejos cuya
implementación requiere la guía de un estadístico experimentado.
Aunque se reconoce la posibilidad de uso de procedimientos alternativos, se recomienda emplear las metodologías del pre-
sente capítulo (1034). Asimismo, la información del capítulo (1034) se presenta asumiendo el uso de computadoras y software
adecuado para el análisis de datos. Dicha perspectiva no libera al analista de su responsabilidad ni de las consecuencias relacio-
nadas con la selección del diseño y análisis de una valoración biológica.

2. ASPECTOS GENERALES DEL ANÁLISIS DE LOS DATOS DE LA VALORACIÓN BIOLÓGICA

A continuación se presenta una lista de pasos a seguir que ayudarán a guiar el análisis de una valoración biológica. La pre-
sente sección asume que se ha utilizado un conjunto de pasos similares en la toma de decisiones durante el desarrollo y poste-
rior verificación durante la validación y por lo tanto, no es necesario seguir estos pasos rutinariamente. Dichas etapas y decisio-
nes se tratan en el capítulo de información general Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032). La Sección 3, Modelos
de Análisis, ofrece información detallada para los diversos modelos considerados.
1. Como parte del análisis elegido, se debe seleccionar el subconjunto de datos que se utilizará para determinar la potencia
relativa, usando el esquema previamente especificado. Se deben excluir únicamente aquellos datos que se sepa provienen
752 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

de problemas técnicos conocidos, tales como pocillos contaminados, curvas de concentración-respuesta no monotónicas,
etc.
2. Es necesario ajustar el modelo estadístico para detectar valores aberrantes potenciales, conforme a lo seleccionado duran-
te el desarrollo, incluyendo cualquier ponderación y transformación. Esto se lleva a cabo primeramente sin asumir simili-
tud alguna entre las curvas de la Prueba y del Estándar, pero se deben incluir elementos importantes de la estructura de
diseño, idealmente empleando un modelo que realice menos suposiciones acerca de la naturaleza de la función de la res-
puesta que el modelo usado para evaluar la similitud.
3. Se debe determinar cuáles de los valores aberrantes potenciales se van a eliminar y se debe ajustar el modelo que se va a
emplear para la evaluación de la aptitud. Por lo general, antes de eliminar valores aberrantes, se lleva a cabo una investi-
gación de sus causas. Algunos sistemas de valoración pueden emplear una regla estadística de eliminación de valores abe-
rrantes (no investigativa), aunque la eliminación de valores aberrantes mediante dicho método no debe usarse con regu-
laridad. Una metodología para valores aberrantes "extraños" consiste en seleccionar la regla para valores aberrantes de
modo que el número esperado de identificaciones de valores aberrantes falsos positivos no sea mayor de uno; p.ej., utili-
zar una prueba al 1 % si el tamaño de la muestra es aproximadamente 1 OO. Si se encuentra un gran número de valores
aberrantes por encima del esperado a partir del uso de la regla, se debe cuestionar inmediatamente la valoración.
4. Se debe evaluar la aptitud del sistema. La aptitud del sistema evalúa si la preparación Estándar de la valoración y cualquier
control usado se comportaron de manera uniforme con respecto al desempeño anterior de la valoración. Si una valora-
ción (o una corrida) no cumple con la aptitud del sistema, se debe descartar toda la valoración (o corrida) y no se debe
informar ningún resultado excepto la falla de la valoración (o corrida). La evaluación de la aptitud del sistema por lo regu-
lar incluye la idoneidad del ajuste del modelo usado para evaluar la similitud. Para los modelos lineales, la idoneidad del
modelo puede incluir la evaluación de la linealidad de la curva del Estándar. Si no se cumple el criterio de aptitud para
linealidad del Estándar, la exclusión de una o más concentraciones de los extremos podría resultar en el cumplimiento
con dicho criterio. Otros ejemplos de posibles criterios de aptitud del sistema incluyen blanco, controles positivos, máx/
mín, máx/fondo, pendiente, IC 50 (o EC 50 ) y variación alrededor del modelo ajustado.
5. Se debe evaluar la aptitud de la muestra para cada muestra de Prueba. Esto se hace para confirmar que los datos para
cada muestra de Prueba cumplen con las suposiciones necesarias. Si una muestra de Prueba no cumple con la aptitud de
la muestra, los resultados de dicha muestra se informan como "No Cumple con la Aptitud de la Muestra". No obstante,
aún se pueden informar las potencias relativas para otras muestras de Prueba de la valoración. La similitud es el más pro-
minente de los criterios de aptitud de la muestra, como el paralelismo en modelos paralelos o la equivalencia de las orde-
nadas al origen para modelos de cociente de pendiente. Para modelos no lineales, la evaluación de la similitud implica
todos los parámetros de la curva distintos a EC 50 (o IC 50 ).
6. Para aquellas muestras de Prueba en la valoración que cumplen con el criterio de similitud con el Estándar (es decir, cur-
vas de concentración-respuesta lo suficientemente similares o subconjuntos de concentraciones lineales similares), se de-
ben calcular las estimaciones de potencia relativa asumiendo la similitud entre la Prueba y el Estándar, es decir, analizando
los datos de la Prueba y del Estándar de manera conjunta usando un modelo limitado para tener líneas o curvas exacta-
mente paralelas u ordenadas al origen idénticas.
7. Por lo regular, una sola valoración no es suficiente para obtener un valor de informe, mientras que los resultados de po-
tencia de múltiples valoraciones se pueden combinar en una sola estimación de potencia. Repetir los pasos 1-6 la canti-
dad de veces especificada en el protocolo de valoración o en la monografía, antes de determinar una estimación final de
potencia y un intervalo de confianza.
8. Generar una estimación de la varianza y una medición de incertidumbre de la estimación de potencia (p.ej., intervalo de
confianza). Ver la sección 4, Intervalos de Confianza.
Un paso no mostrado es el reemplazo de datos faltantes. La metodología estadística y el software más modernos no requie-
ren números iguales en cada combinación de concentración y muestra, por lo que, a menos que se indique algo distinto en la
monografía específica, el analista no se verá obligado a reemplazar los valores faltantes.

3. MODELOS DE ANÁLISIS
Se puede utilizar con éxito una variedad de funciones matemáticas para describir una relación de concentración-respuesta.
La primera consideración tenida en cuenta al seleccionar un modelo es la naturaleza de la respuesta de la valoración. ¿Se refie-
re a un número, un recuento o a una categoría, como por ejemplo, Vivo/Muerto? La naturaleza identificará los posibles mode-
los que podrán tomarse en consideración.
Las demás consideraciones para la selección de un modelo incluyen la necesidad de incorporar elementos del diseño en el
modelo y los posibles beneficios de los modelos de medias en comparación con los modelos de regresión. Con el propósito de
presentar los puntos esenciales de las opciones de modelos, la sección 3, Modelos de Análisis asume un diseño completamente
aleatorio, de modo que no contempla elementos del diseño, y presenta los modelos en su forma de regresión.

3.1 Respuestas de Valoración Cuantitativas y Cualitativas

Los términos cuantitativa y cualitativa se refieren a la naturaleza de la respuesta de valoración usada en la construcción del
modelo de concentración-respuesta. Se pueden usar valoraciones con respuestas cuantitativas o cualitativas para cuantificar la
USP 37 Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 753

potencia del producto. Se debe tomar en cuenta que las respuestas de la valoración en las concentraciones medidas no son la
potencia relativa de la valoración biológica. Los analistas deben comprender las diferencias entre respuestas, las funciones de
concentración-respuesta y la potencia relativa.
Una respuesta cuantitativa produce un número en una escala continua. Los ejemplos comunes incluyen las respuestas espec-
trofotométricas y de luminiscencia, los pesos y medidas corporales y los datos calculados relativos a la curva estándar (p.ej.,
concentración de citoquina). Los modelos para respuestas cuantitativas pueden ser lineales o no lineales (ver las secciones 3.2-
3.5).
Una medición cualitativa resulta en una respuesta clasificable en categorías. Para la valoración biológica, las respuestas cuali-
tativas son generalmente cuantales, lo que significa que conllevan a dos posibles categorías tales como Positiva/Negativa, 0/1,
o Muerto/Vivo. Las respuestas cuantales se pueden informar como proporciones (p.ej., la proporción de animales en un grupo
que presentan una propiedad). Los modelos cuantales se presentan en la sección 3.6. Las respuestas cualitativas pueden tener
más de dos categorías posibles, tales como las determinaciones de título por punto final. Los modelos para más de dos catego-
rías no se consideran en este capítulo general.
Las respuestas de la valoración también pueden ser recuentos, tales como el número de placas o colonias. Las respuestas a
manera de recuentos en ocasiones se tratan como cuantitativas, en otras ocasiones como cualitativas y en algunas más se utili-
zan modelos específicos para números enteros. La selección a menudo se basa en el intervalo de recuentos. Si el recuento es
en su mayoría O y en raras ocasiones es mayor de 1, la valoración se puede analizar como cuanta! y la respuesta es Alguna/
Ninguna. Si los recuentos son grandes y abarcan un intervalo amplio, tal como de 500 a 2500, entonces la valoración se pue-
de analizar como cuantitativa, posiblemente después de aplicar una transformación a los recuentos. Para dichos análisis, a me-
nudo resulta útil una transformación cuadrática del recuento, a fin de cumplir de mejor manera con la homogeneidad de las
varianzas. Si el intervalo de recuentos incluye o es cercano a O, pero O no es el valor preponderante, puede ser preferible em-
plear un modelo específico para las respuestas de números enteros. La regresión de Poisson y los modelos de regresión de
binomios negativos representan a menudo buenas opciones. El presente capítulo general no proporciona información adicio-
nal sobre modelos específicos para números enteros.
Las valoraciones con respuestas cuantitativas se pueden convertir en respuestas cuantales. Por ejemplo, lo que podría impor-
tar es definir si se excedió algún umbral definido. Entonces, el modelo podría ser cuantal-de umbral excedido o no. En gene-
ral, los sistemas de valoración presentan estimaciones más precisas de potencia cuando el modelo emplea toda la información
en la respuesta. El uso de un umbral superior o inferior, en lugar de las respuestas cuantitativas medidas, podría subestimar el
desempeño de una valoración.

3.2 Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas

En las valoraciones cuantitativas, la medición es un número en una escala continua. Los valores de densidad óptica obteni-
dos en las valoraciones basadas en placas son dichas mediciones. Los modelos para valoraciones cuantitativas pueden ser linea-
les o no lineales. Aunque ambos presentan una diferencia aparente en los niveles de complejidad, los modelos de líneas parale-
las (lineales) y de curvas paralelas (no lineales) comparten muchos aspectos en común. Debido a la forma diferente de sus
ecuaciones, las valoraciones de cociente de pendiente se consideran por separado (sección 3.5 Modelos de Concentración-Res-
puesta de Cociente de Pendientes).
Suposiciones-Los modelos básicos de líneas paralelas, curvas paralelas y cociente de pendiente comparten algunas suposi-
ciones. Todos incluyen un término residual, e, que representa el error (variabilidad), el cual se asume que es independiente de
medición a medición y que tiene una varianza constante de concentración a concentración y de muestra a muestra. A menu-
do, se asume que el término residual también sigue una distribución normal. Las suposiciones de independencia e igualdad de
varianzas a menudo se infringen, por lo que el objetivo del análisis es incorporar la falta de independencia y la desigualdad de
las varianzas en el modelo estadístico o en el método de estimación.
A menudo, la falta de independencia surge a causa del diseño o la realización de la valoración. Por ejemplo, si la valoración
consiste en respuestas obtenidas de múltiples placas, es probable que las observaciones de la misma placa compartan alguna
influencia en común que no se comparte con las observaciones de otras placas. Éste es un ejemplo de correlación intraplacas.
Una metodología simple para tratar esta falta de independencia es incluir un término de bloque en el modelo estadístico para
placas. Con tres o más placas, éste debe ser un término de efectos aleatorios de modo que se obtenga una estimación de la
variabilidad entre placas.
En general, el modelo debe reflejar en detalle el diseño. Las ecuaciones básicas del modelo provistas en las secciones 3.3-3.5
se aplican únicamente a diseños completamente aleatorizados. Cualquier otro diseño requerirá términos adicionales en el mo-
delo estadístico. Por ejemplo, si las placas o porciones de las placas se usan como bloques, serán necesarios los términos para
bloques.
Cálculo de la Potencia-Una suposición primaria subyacente de los métodos que se usan para el cálculo de la potencia relati-
va es la suposición de la similitud. Dos preparaciones son similares si contienen el mismo componente efectivo o los mismos
componentes efectivos en las mismas proporciones. Si esta condición se mantiene, la preparación de Prueba se comporta co-
mo una dilución (o concentración) de la preparación Estándar. La similitud se puede representar matemáticamente de la ma-
nera siguiente: F1 es la función de concentración-respuesta para la Prueba y F, es la función de concentración-respuesta para
el Estándar. El modelo matemático subyacente para la similitud es:
754 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

[3.1]

donde z representa la concentración y p representa la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la muestra
Estándar.
Los métodos para estimar p en algunos de los modelos de concentración-respuesta comunes se analizan más adelante. Para
modelos lineales, la distinción entre modelos de líneas paralelas (sección 3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuanti-
tativas) y modelos de cociente de pendiente (sección 3.5 Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes) se ba-
sa en si ajustar las líneas rectas al logaritmo de concentración o a la concentración generará un mayor alineamiento entre el
modelo y los datos en un intervalo de concentraciones de interés.

3.3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas

En esta sección, un modelo lineal se refiere a una relación de concentración-respuesta. El logaritmo de la concentración, x, y
la respuesta, y, sigue una función de línea recta (lineal). y puede ser la respuesta en la escala conforme se mida o una transfor-
mación de la respuesta. La forma funcional de esta relación es y= a + bx. Los ajustes de líneas rectas se pueden usar para
porciones de las curvas de concentración-respuesta no lineales, aunque esto requiere de un método para seleccionar las con-
centraciones a usar para cada una de las muestras de Prueba y Estándar (ver el capítulo general (1032)).
Modelo de Medias contra Regresión-Un modelo lineal de concentración-respuesta casi siempre se analiza mediante la regre-
sión de cuadrados mínimos. Dicho análisis genera estimaciones de los coeficientes desconocidos (ordenadas al origen y pen-
diente) y sus errores estándar, así como mediciones de la aptitud del ajuste [p.ej., R2 y error cuadrático medio (RMSE, por sus
siglas en inglés)].
La regresión lineal funciona mejor cuando se pueden usar todas las concentraciones y existe una curvatura inapreciable en
los datos de concentración-respuesta. Otro método estadístico para analizar las curvas de concentración-respuesta lineales es
el modelo de medias. Éste es un método de análisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) que ofrece algunas ventajas,
particularmente cuando no se usan una o más concentraciones de una o más muestras para estimar la potencia. Puesto que el
modelo de medias incluye una media distinta para cada combinación única de muestra y dosis (así como un bloque u otros
efectos asociados con la estructura del diseño) es equivalente a un modelo de regresión polinómica saturado. Por consiguien-
te, un modelo de medias provee una estimación del error que es independiente de la falta de ajuste de la regresión. Por el
contrario, una estimación de error basada en la regresión residual es una mezcla del error de la valoración, según se estima en
el modelo de medias, combinada con la falta de ajuste del modelo de regresión. Al menos en este sentido, el error del modelo
de medias es una mejor estimación de la variación del error residual en el sistema de valoración.
Modelos de Concentración-Respuesta de Líneas Paralelas-Si el modelo general de concentración-respuesta (3.1 Respuestas
de Valoración Cuantitativas y Cualitativas) se puede hacer lineal en x = log(z), entonces la ecuación resultante es:
y = a + ,úlog(z) + e = a + f3x + e,
donde e es el residuo o término de error y la intersección, a, y la pendiente, /3, diferirán entre la Prueba y el Estándar. Con la
suposición de paralelismo (pendientes iguales), el modelo se vuelve

y5 = tx + /Jlog(z) + e = a 5 + fJx + e
[3.2]
YT =a+ fJlog(pz) +e= [a+ fJlog(p)] + fJx +e= aT + fJx +e,

donde S es el Estándar, T es la Prueba, a 5 = a es la ordenada al origen para el Estándar y aT = a + ,úlog(p) es la ordenada al

origen para la Prueba (ver la Figura 3. 7).

---------:::··'·
, .... ""'

,
, stándar
- Prueba

log 10 de la Concentración

Figura 3.1. Ejemplo de un modelo de líneas paralelas.

Cuando las líneas de concentración-respuesta son paralelas, según se muestra en la Figura 3. 7, una separación o desplaza-
miento horizontal indica una diferencia en el nivel de actividad biológica que se está valorando. Esta diferencia horizontal es
numéricamente log(p), el logaritmo de la potencia relativa, y se encuentra como la distancia vertical entre las líneas aT y a 5
dividida por la pendiente, f3. La potencia relativa es entonces
USP 37 Información General/ \1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 755

Estimación de Modelos de Líneas Paralelas-Los modelos de líneas paralelas se ajustan usando el método de cuadrados míni-
mos. Si se mantiene la suposición de varianzas iguales, se seleccionan los parámetros de la ecuación [3.2] para minimizar

[3.3]

donde los acentos circunflejos representan estimaciones. Ésta es una regresión lineal con dos variables independientes, T y x,
donde Tes una variable que es igual a 1 para observaciones a partir de la Prueba y O para observaciones a partir del Estándar.
La sumatoria en la ecuación [3.3] es para todas las observaciones de la Prueba y del Estándar. Si la suposición de varianzas
iguales no se mantiene, pero se sabe que la varianza es inversamente proporcional a un valor, w, que no depende de las res-
puestas en curso, es decir, las y, y se puede determinar para cada observación, entonces el método se pondera con cuadrados
mínimos

[3.4]

La ecuación 3.4 es apropiada únicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los datos
en curso (ver el capítulo (l 032) para pautas para la determinación de ponderaciones). En las ecuaciones [3.3] y [3.4] fJ es igual
que la jJ de la ecuación [3.2] y /J = aT - a 5 = ,b1og p. Por tanto, la estimación de la potencia relativa, p, es

El software estadístico y las hojas de cálculo comúnmente disponibles ofrecen rutinas para cuadrados mínimos. No todo el
software disponible puede proveer análisis ponderados.
Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada.
Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones,
se deben usar los métodos de lq_ se.cción 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de
Fieller (sección 4.3) aplicado a c5 I /J.
Medición de Falta de Paralelismo-El paralelismo para modelos lineales se evalúa considerando la diferencia o el cociente de
las dos pendientes. Para la diferencia, esto se puede llevar a cabo ajustando el modelo de regresión,
y= a 5 + pr + fJ5x + yxT +e
donde fJ = aT - a 5, y= A - /J5, y T = 1 para los datos de Prueba y T = O para los datos del Estándar. Posteriormente, se emplea
el intervalo de confianza de distribución t estándar para y. Para el cociente de las pendientes, se ajusta
y= a 5 + ¡rr + /J5x(l - T) + f3rxT + e
y se usa el Teorema de Fieller, ecuación [4.3], para obtener un intervalo de confianza para A/ /J5 •
3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas

Los modelos no lineales de concentración-respuesta son, por lo regular, funciones con forma de S y se presentan cuando el
intervalo de concentraciones es lo suficientemente amplio como para que las respuestas sean limitadas por asíntotas superiores
e inferiores. El más común de estos modelos es la función logística de cuatro parámetros provista a continuación.
y representa la respuesta observada, mientras que z denota la concentración. Una forma del modelo logístico de cuatro pa-
rámetros es
A D
y-D+----+e [3.5]
1+ (d
Una forma alternativa, pero equivalente, es
d
Y~ªº+ ~ "- e
1, antilog "M(logz b)

Las dos formas se corresponden de la manera siguiente:

Asíntota inferior: D = a 0
Asíntota superior: A= a 0 + d
Pendiente: B = M (en relación con la pendiente de la curva en el EC 50 )
Concentración efectiva al 50% (EC 50 ): C = antilog(b) (también se puede denominar ED 5 ,J
756 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

Resulta adecuada cualquier base logarítmica conveniente; a menudo conviene trabajar con logaritmo en base 2, en particu-
lar cuando las concentraciones están en serie duplicativa.
La curva logística de cuatro parámetros es simétrica al rededor del EC 00 cuando se grafica en función del logaritmo de con-
centración, debido a que las velocidades de acercamiento de las asíntotas superior e inferior son las mismas (ver la Figura 3.2).
Para valoraciones en las que no se mantiene dicha simetría, se podrían aplicar las funciones del modelo asimétrico. Estos mo-
delos no se analizan en mayor medida en este capítulo general.

e
·O
¡¡
ro
o
-¡¡;
>
-"'<lJ
"O

~
~
<lJ
O:'.

log 10 de la Concentración

Figura 3.2. Ejemplos de sigmoides simétricos (logísticos de cuatro parámetros) y asimétricos.

En muchos casos, el analista tiene que tomar algunas decisiones estratégicas durante el desarrollo de la valoración (ver Dise-
ño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032)). Por ejemplo, las respuestas se pueden transformar y ajustar a un modelo de
curva logística de cuatro parámetros o se pueden ponderar y ajustar a una curva sigmoidea asimétrica. Asimismo, a menudo
resulta importante incluir términos en el modelo (por lo general efectos aleatorios) para tratar la variación en las respuestas (o
parámetros de la respuesta) asociados con bloques o unidades experimentales en el diseño de la valoración. Para valoraciones
simples en las que las observaciones son independientes, estas decisiones estratégicas son bastante sencillas. Para valoraciones
realizadas con diluciones agrupadas (como en el caso de pipetas multicanal), valoraciones con diluciones en serie o diseños de
valoración que incluyen bloques (como en el caso de múltiples placas por valoración), ignorar la estructura del diseño a menu-
do se considera una violación seria de las suposiciones estadísticas. Para dichas valoraciones, una buena metodología implica
una transformación que aproxime una solución a una varianza no constante, a una falta de normalidad y a una asimetría, com-
binada con un modelo que capture las partes importantes de la estructura del diseño.
Modelos de Concentración-Respuesta de Curvas Paralelas-El concepto de paralelismo no se restringe a modelos lineales. Para
curvas no lineales, paralelas o medias similares, las curvas de concentración-respuesta se pueden superponer siguiendo un des-
plazamiento horizontal de una de las curvas, según se muestra en la Figura 3.3 para curvas logísticas de cuatro parámetros. En
términos de los parámetros de la ecuación [3.5], esto significa que los valores de A, D y B para la Prueba son los mismos que
para el Estándar.

e
·O
¡¡
["
o
-¡¡;
>
-"'<lJ
"O
ro
u;
!!l
f.l"
<lJ
O:'.

lag 10 de la Concentración

Figura 3.3. Ejemplo de curvas paralelas de un modelo no lineal.

Las ecuaciones correspondientes a la figura (con el término de error, e, agregado) son

A-D
Ys =D+---B +e
1+ (é)
A-D
yT ~D+---0 +e
1+ (re l
o
A D
y =D 1 ---------~----•e
s 1+antilog¡M(logz-b)j
A-D
y 1 =D+ +e
1"antilog [M(logz b+logp)]
USP 37 Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 757

Log pes el logaritmo de la potencia relativa y la distancia horizontal entre las dos curvas, al igual que para el modelo de
líneas paralelas. Puesto que el EC 50 del estándar es antilog(b) y el de la Prueba es antilog(b - log p) = antilog(b)/p, la potencia
relativa es el cociente de EC 50 (estándar sobre Prueba) cuando se mantiene el modelo de curvas paralelas.
Estimación del Modelo de Curvas Paralelas-La estimación de modelos de curvas paralelas no lineales es similar a la de los
modelos de líneas paralelas, posiblemente después de la transformación de la respuesta y posiblemente con la ponderación.
Para el modelo logístico de cuatro parámetros, las estimaciones de los parámetros se determinan minimizando:

I[
,)

- . Á-Ó 1

y - O - - - - - - . --·-.-- - -
1+ antilog 1 M(logz-b + IT)j J

sin ponderación, o

[3.6]

con ponderación. (Al igual que para la ecuación [3.4], la ecuación [3.6] es apropiada únicamente si las ponderaciones se deter-
minan sin usar las respuestas, es decir las y, de los datos en curso.) En cualquiera de los casos, la estimación de res la estima-
ción del logaritmo de la potencia relativa. Para algunos paquetes de software, podría ser más fácil trabajar con d =A - D.
Los parámetros de la función logística de cuatro parámetros y aquéllos de los modelos sigmoideos asimétricos no son posi-
bles de calcular mediante rutinas de regresión de cuadrados mínimos ordinarias (lineales). Se deben usar programas informáti-
cos con técnicas de estimación no lineales.
Los analistas no deben usar el ajuste de regresión no lineal para evaluar el paralelismo o estimar la potencia si se presenta
alguno de los siguientes casos: a) se dispone de información inadecuada sobre las asíntotas; o b) una comparación de los erro-
res combinados de una regresión no lineal con los errores combinados de un modelo de medias determina que el modelo no
lineal no se ajusta de manera adecuada; o c) otras medidas apropiadas de aptitud del ajuste determinan que el modelo no
lineal no es apropiado (p.ej., las gráficas de residuos presentan evidencia de un "gancho").
Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada.
Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones,
se deben usar los métodos de la sección 4.2. Para un intervalo de confianza de una sola valoración, se requieren técnicas avan-
zadas, tales como perfiles de probabilidad o método de remuestreo (bootstrapping), para obtener un intervalo de confianza
para el logaritmo de la potencia relativa, r.
Medición de Falta de Paralelismo-Evaluar el paralelismo de un modelo logístico de cuatro parámetros significa evaluar el
parámetro de la pendiente y las dos asíntotas. Durante el desarrollo (ver el capítulo (1032)), se debe tomar una decisión con
respecto a qué parámetros son importantes y la forma en que se medirá la falta de paralelismo. Tal como se analiza en el capí-
tulo (1 032), la medida de falta de similitud puede ser una medida compuesta que considere todos los parámetros juntos en
una sola medición, tal como la suma de cuadrados de paralelismo (ver el capítulo (1 032)), o se puede considerar cada paráme-
tro por separado. En el último caso, la medida puede consistir en funciones de los parámetros, tal como una asíntota dividida
por la diferencia de asíntotas o el cociente de las asíntotas. Para cada parámetro (o función de parámetros), los intervalos de
confianza se pueden calcular mediante métodos de remuestreo o de perfil de probabilidad. Dichos métodos no se presentan
en este capítulo general.

3.5 Modelos de Concentración-Respuesta de Cociente de Pendientes

Cuando una regresión lineal se ajusta bien a los datos de concentración-respuesta no transformados, se puede usar un mo-
delo de cociente de pendientes. Las ecuaciones para el modelo de cociente de pendientes cuando se asume la similitud son:

Ys = r1 + fJz +e= n + jJ5z +e

[3.7]
YT = n + ji(pz) + e = u + (!5pz + e = n + /l.rz + e

Una característica que identifica el modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes, la cual se puede observar
en los resultados de un estudio de intervalos, es que las líneas para diferentes potencias de un estudio de intervalos tienen la
misma ordenada al origen y diferentes pendientes. Por consiguiente, una gráfica para el estudio de intervalos tiene forma de
abanico. La Figura 3.4 presenta un ejemplo de un modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes. Se debe
tomar en cuenta que la ordenada al origen común no necesariamente está en el origen.
758 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

Estándar

Prueba

Concentración

Figura 3.4. Ejemplo de un modelo de cociente de pendientes.

Una valoración con un modelo de concentración-respuesta de cociente de pendientes para medir la potencia relativa cons-
ta, como mínimo, de una muestra Estándar y una muestra de Prueba, cada una medida en una o más concentraciones y, por
lo general, una respuesta medida sin muestra (concentración cero). Debido a que las concentraciones no se transforman en
logaritmos, a menudo se espacian equitativamente sobre la escala original, en lugar de la escala logarítmica. El modelo consis-
te en una ordenada al origen común, una pendiente para los resultados de la muestra de Prueba y una pendiente para los
resultados de la muestra Estándar como en la ecuación [3.7]. La potencia relativa se determina entonces a partir del cociente
de las pendientes:
Potencia Relativa=
Pendiente de la muestra de Prueba/Pendiente de la muestra Estándar=
(Jp/ /J= p
Suposiciones y Estimación para Modelos de Cociente de Pendientes-Las suposiciones para el modelo de cociente de pendien-
tes son las mismas que para los modelos de líneas paralelas: Los términos residuales son independientes, tienen una varianza
constante y podría ser necesario que tuvieran una distribución normal. El método de estimación también es el de cuadrados
mínimos. Esto se puede implementar con o sin ponderación, según se demuestra en las ecuaciones [3.8] y [3.9], respectiva-
mente.

I (
A

y-a-/5 5 z(1- T)-µTzT

A )2 [3.8]

[3.9]

La ecuación [3.9] es apropiada únicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los
datos en curso. Ésta es una regresión lineal con dos variables independientes, z(l - T) y zT, donde T = 1 para los datos de la
Prueba, y T =O para los datos del Estándar. ¡'J es la pendiente estimada para la Prueba, ¡'J, es la pendiente estimada para el
1

Estándar y, por tanto, la estimación de la potencia relativa es

Puesto que el modelo de cociente de pendiente es un modelo de regresión lineal, se pueden usar la mayoría de los progra-
mas estadísticos y hojas de cálculo para obtener la estimación de la potencia relativa. En algunos sistemas de valoración, en
ocasiones resulta apropiado omitir la concentración cero (p.ej., si los controles sin dosis se manejan de manera distinta en la
valoración) y algunas veces una o más de las concentraciones altas (p.ej., si existe un efecto de gancho en el que las concen-
traciones más altas no contienen las respuestas más altas). La discusión sobre el uso de un modelo de medias y la selección de
subconjuntos de concentraciones para valoraciones biológicas de líneas rectas paralelas se aplica también a las valoraciones de
cociente de pendientes.
Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada.
Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones,
se deben usar los métodos de la sección 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de
Fieller (sección 4.3) aplicado a

Medición de Falta de Similitud-Para modelos de cociente de pendientes, la similitud estadística corresponde a ordenadas al
origen iguales para el Estándar y la Prueba. Para evaluar la suposición de similitud, es necesario contar con al menos dos con-
centraciones diferentes a cero para cada muestra. Si las ordenadas al origen no son iguales, la ecuación [3. 7] se convierte en

ys = u, + /i'5z + e
YT = "T + f~z +e
USP 37 Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 759

Las desviaciones de la similitud a menudo se miden mediante la diferencia de las ordenadas al origen, u 1 - u,. Una manera
fácil de obtener un intervalo de confianza es ajustar el modelo,
y= u,+ ¡rr + /l,z(l - T) + /írzT +e,
donde fJ = u T - u, y usar para /l el intervalo de confianza estándar basado en la distribución t.

3.6 Valoraciones Dicótomas (Cuantales)

Para valoraciones cuantales, la medición de la valoración tiene un resultado dicotómico o binario, p.ej., en valoraciones con
animales, el animal está muerto o vivo, o se puede observar o no cierta respuesta fisiológica. Para valoraciones celulares, la
respuesta cuanta! puede relacionarse con la aparición o no de una respuesta más allá de algún umbral en la célula. En una
titulación viral basada en células o en valoraciones de formación de colonias, la respuesta cuantal puede ser un límite de res-
puesta en número entero, como por ejemplo un número entero de partículas o colonias. Cuando es posible determinar fácil-
mente la presencia de algunas partículas-pero no su número real-entonces la valoración se puede analizar como cuanta!.
Cabe tomar en cuenta que si la reacción se puede cuantificar en una escala continua, por ejemplo, con una densidad óptica,
entonces la valoración no es cuantal.
Modelos Para Análisis Cuanta/es-La clave para los modelos de respuestas cuantales es trabajar con la probabilidad de una
respuesta (p.ej., probabilidad de muerte), al contrario de las respuesta cuantitativas en las que el modelo es para la respuesta
misma. Para cada concentración, z, un animal tratado, por ejemplo, tiene una probabilidad de responder a dicha concentra-
ción, P(z). A menudo, la curva P(z) se puede aproximar a una curva sigmoidea cuando se grafica en función del logaritmo de
concentración, según se muestra en la Figura 3.5. Esta curva muestra que la probabilidad de respuesta se incrementa con la
concentración. La concentración que corresponde a una probabilidad de 0,5 es el EC 50 .

.75
u
~"'
.o .50
e"'
n
o. ,25

log 1o de la Concentración

Figura 3.5. Ejemplo de curva sigmoidea para P(z).

El modelo de la curva sigmoidea a menudo se genera basándose en la distribución normal o en la distribución logística. Si se
emplea la distribución normal, el análisis resultante se denomina análisis de probitas, y si se emplea la distribución logística, el
análisis se denomina análisis logit o logístico. Los modelos de probitas y logit son prácticamente indistinguibles, por lo que
cualquiera representa una opción aceptable. La selección de uno u otro se puede basar en la disponibilidad de software que
satisfaga las necesidades de análisis e informe del laboratorio. Debido a que los modelos logísticos cuentan con una disponibili-
dad de software mayor (a menudo denominado de regresión logística) la presente discusión se enfocará en el uso e interpreta-
ción del análisis logit. Las consideraciones discutidas en esta sección para el análisis logit (usando una transformación logística)
también se aplican a los análisis de probitas (usando una transformación con probitas).
Modelo Logít-EI modelo logit para la probabilidad de respuesta, P(z), se puede expresar en dos formas equivalentes. Para la
cruva sigmoidea,
1
P(z) =
1 1 antilog [ {J0 ·· {J 1 log(z)]
1

donde log(ED 50 ) = - fiof /11 • Una forma alternativa presenta la relación con los modelos lineales:
( p
Transformación logit de P = log 1 = /)<1 + /1, log(z) [3.1 O]
\ 1-P

La forma lineal a menudo se presenta usando logaritmos naturales y es útil recordar que muchas de las consideraciones, en
particular la linealidad y el paralelismo, analizadas para los modelos de líneas paralelas en !a secc:ón 3 3 Modelos de Líneas Para-
lelas para Respuestas Cuantitativas también se aplican a los modelos cuantales.
Para un análisis logit con preparaciones Estándar y de Prueba, T representa una variable que toma el valor 1 para animales
que reciben la preparación de Prueba y O para animales que reciben el Estándar. Entonces, asumiendo el paralelismo de las
curvas de Prueba y Estándar, el modelo logit para estimar la potencia relativa es:
760 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

El logaritmo de la potencia relativa de la Prueba en comparación con la preparación Estándar es, por lo tanto, /l¿//11 • Las dos
curvas de la Figura 3.6 son sigmoideas paralelas del Estándar y de la Prueba. (Si se presentaran las formas lineales correspon-
dientes de la ecuación [3.1 O], éstas serían dos líneas rectas paralelas.) El logaritmo de la potencia relativa es la distancia hori-
zontal entre las dos curvas, de la misma forma que para los modelos lineales y logísticos de cuatro parámetros provistos para
respuestas cuantitativas (secciones 3. 3 Modelos de Líneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas y 3.4 Modelos No Lineales para
Respuestas Cuantitativas).

75
u
ro
~
n ,50
ro
n
o
et
,25

log1ode la Concentración

Figura 3.6. Ejemplo de Curvas Sigmoideas Paralelas.

Estimación de los Parámetro~ del Modelo y de la Potencia Relativa-Se encuentran disponibles dos métodos para estimar los
parámetros de los modelos logit y de probitas: la probabilidad máxima y los cuadrados mínimos ponderados. La diferencia no
tiene importancia práctica y el laboratorio puede aceptar la selección realizada por el software. Lo siguiente asume un progra-
ma de software de regresión logística general. El software especializado debe ser similar.
Tomando en cuenta la forma de la ecuación [3.1 O], se observa una similitud con la regresión lineal. Existen dos variables
independientes, x = log(z) y T. Para cada animal, existe una variable dependiente sí/no, para la que a menudo se usa el código
1 para sí o respuesta y O para no o sin respuesta. Aunque las valoraciones biológicas a menudo se diseñan con números iguales
de animales por concentración, esto no es un requisito de análisis. Utilizando los parámetros estimados por el software, los
cuales incluyen jJÜ' fi, y jJ2 y sus errores estándar, se obtiene la estimación del logaritmo natural de la potencia relativa:

Est1mac1ón del logaritmo de la potencia relativa = f! 2

ji,

Ver la sección 4 para información sobre métodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada.
Para un intervalo de confianza basado en la combinación de las estimaciones de la potencia relativa de múltiples valoraciones,
se deben usar los métodos de la. se~ción 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoración, usar el Teorema de
Fieller (sección 4.3) aplicado a /32 I /i,. El intervalo de confianza para la potencia relativa es, por lo tanto [antilog(L), antilog(U)],
donde [L, U] es el intervalo de confianza para el logaritmo de la potencia relativa.
Suposiciones-Las suposiciones para los modelos cuantales tienen dos partes. La primera se relaciona con las suposiciones
subyacentes con respecto a la probabilidad de respuesta de cada animal o unidad en la valoración biológica. Éstas son suposi-
ciones difíciles de verificar que dependen del diseño de la valoración. La segunda parte concierne a las suposiciones para el
modelo estadístico para P(z). Las más importantes de éstas son el paralelismo y la linealidad. Estas suposiciones se pueden veri-
ficar de buena manera al igual que los análisis de líneas paralelas para respuestas cuantitativas.
En la mayoría de los casos, los análisis cuantales asumen un modelo de probabilidad binómico estándar, que es una selec-
ción común para la distribución de datos dicotómicos. Las suposiciones claves del binomio se basan en que a una concentra-
ción dada, cada animal tratado a dicha concentración, tiene la misma probabilidad de responder y los resultados para cual-
quier animal son independientes de los de los otros animales. Este conjunto básico de suposiciones se puede infringir de mu-
chas maneras. La más destacada de éstas es la presencia de efectos de la camada, donde los animales de la misma camada
tienden a presentar una respuesta más parecida entre ellos que los animales de diferentes camadas. Los efectos de la jaula, en
los que las condiciones ambientales o el cuidado dado a cualquier jaula específica hace que los animales de dicha jaula sean
más o menos propensos a responder al tratamiento experimental, violan las suposiciones de idéntica probabilidad y de inde-
pendencia. Estas violaciones de las suposiciones y otras similares (que podrían ser una selección deliberada del diseño) no impi-
den el uso de modelos logit o de probitas. No obstante, son indicaciones de que podría requerirse una metodología más com-
pleja para el análisis que la presentada en este capítulo (ver el capítulo (1032)).
Verificación de las Suposiciones-El modelo estadístico para P(z) asume linealidad y paralelismo. Para evaluar el paralelismo,
se puede modificar la ecuación [3.1 O] de la manera siguiente:

logl ~J =/30 +/31 log(z) +/32 T +/33 T * log(z)

\ 1- p

En este caso, ji, es la diferencia de pendientes entre la Prueba y el Estándar y debe ser lo suficientemente pequeña. [El término
T*log(z) se conoce como un término de interacción en la terminología estadística.] La medición de falta de paralelismo también
USP 37 Información General/ (1034> Análisis de Valoraciones Biológicas 761

se puede expresar en términos del cociente de las pendientes, (111 + /11)//11 • Para intervalos de confianza basados en modelos
para estas mediciones de falta de paralelismo, se recomiendan los métodos de remuestreo o de probabilidad del perfil. Dichos
métodos no se presentan en este capítulo general.
Para evaluar la linealidad, resulta una buena práctica comenzar con un examen gráfico. De acuerdo con la ecuación [3.1 O],
ésta sería una gráfica de log[(y + 0,5)/(n - y+ 0,5)] en función del log(concentración), donde y es el número total de respues-
tas en la concentración y n es el número de animales en dicha concentración. (Las correcciones 0,5 mejoran las propiedades
de este cálculo como una estimación de log[P/(l - P)].) Las líneas para el Estándar y la Prueba deben ser líneas rectas paralelas,
al igual que en el modelo lineal en valoraciones cuantitativas. Si la relación es monotónica pero no parece ser lineal, entonces
el modelo de [3.1 O] se puede expandir con otros términos. Por ejemplo, se puede agregar un término cuadrático en log(con-
centración): [log(concentración)]2. Si fuera necesario transformar la concentración en algo distinto del logaritmo de la concen-
tración, entonces el análogo del modelo cuantal de las valoraciones de cociente de pendientes es una opción. Esto último es
posible; sin embargo, debido a que no se usa con frecuencia, no se analizará en mayor profundidad en el presente capítulo
general.
Valores Aberrantes-La evaluación de valores aberrantes es más difícil en las valoraciones cuantales que en las valoraciones
cuantitativas. Debido a que la respuesta de la valoración sólo puede ser sí o no, ninguna respuesta individual puede ser inusual.
Lo que parece caer dentro de la categoría de valor aberrante es una sola respuesta a una concentración baja o una sola falta de
respuesta a una concentración alta. Asumiendo que no se ha encontrado ninguna causa (p.ej., incapacidad de administrar
adecuadamente el fármaco al animal), no existe fundamento estadístico para distinguir un valor aberrante de un evento extra-
ño.
Métodos Alternativos-Se pueden aceptar alternativas a los análisis cuantales simples aquí descritos, dependiendo de la natu-
raleza del desafío analítico. Uno de esos desafíos es la falta de independencia entre unidades experimentales, según se puede
apreciar en los efectos de la camada en valoraciones con animales. Algunas de las metodologías que se pueden emplear son
las Ecuaciones de Estimación Generalizadas (GEE, por sus siglas en inglés), los modelos lineales generalizados y los modelos de
efectos mixtos lineales generalizados. Un Análisis con Ecuaciones de Estimación Generalizadas producirá errores estándar e in-
tervalos de confianza cuya validez no dependerá del cumplimiento de la suposición de independencia.
Además, existen métodos que no realizan ninguna elección particular de la ecuación del modelo para la curva sigmoidea.
Un ejemplo que se aprecia comúnmente es el método Spearman-Karber.

4. INTERVALOS DE CONFIANZA

El informe del resultado de una valoración debe incluir una medición de la incertidumbre de dicho resultado. Esto es, a me-
nudo, un error estándar o un intervalo de confianza. Un intervalo (e, d), en el que e es el límite de confianza inferior y des el
límite de confianza superior, es un intervalo de confianza de 95% para un parámetro (p.ej., la potencia relativa) si el 95% de
tales intervalos al repetir el experimento incluyeron el valor real del parámetro. Un intervalo de confianza se puede interpretar
como valores indicativos del parámetro que son uniformes con respecto a los datos. Esta interpretación de un intervalo de con-
fianza requiere satisfacer diversas suposiciones. Las suposiciones también deben cumplirse cuando en una monografía se utiliza
el ancho o el ancho medio [(d-c)/2] como una medida para determinar si existe la precisión adecuada para informar una po-
tencia. El ancho del intervalo en ocasiones se emplea como un criterio de aptitud sin la interpretación de confianza. En tales
casos, no es necesario cumplir con las suposiciones.
Los intervalos de confianza pueden ser basados en modelos o basados en muestras. Un intervalo basado en modelos se basa
en los errores estándar para cada una o más de las estimaciones del logaritmo de la potencia relativa que provienen del análisis
de un modelo estadístico particular. Los intervalos basados en modelos no deberán usarse cuando sea posible utilizar intervalos
basados en muestras. Los intervalos basados en modelos requieren que el modelo estadístico incorpore correctamente todos
los efectos y correlaciones que influencian la estimación de precisión del modelo. Éstos incluyen, pero no se limitan a dilucio-
nes en serie y efectos de placa. La sección 4.3 Métodos Basados en Modelos describe el Teorema de Fieller, un intervalo basado
en modelo de uso común.
Los métodos basados en muestras combinan estimaciones independientes del logaritmo de la potencia relativa. Pueden sur-
gir múltiples valoraciones debido a que la necesidad de dicho método se determinó durante el desarrollo y la validación, o
debido a que el procedimiento de valoración fija un ancho máximo aceptable del intervalo de confianza y podrían ser necesa-
rias dos o más valoraciones independientes para cumplir con el requisito de ancho específico. Algunos métodos basados en
muestras no requieren que el modelo estadístico incorpore correctamente todos los efectos y correlaciones. No obstante, esto
no debe interpretarse como un descarte del valor de tratar las correlaciones y demás factores que influencian la precisión den-
tro de la valoración. La precisión dentro de la valoración se emplea en la evaluación de la similitud y es una porción de la
variabilidad, la cual es el fundamento para los intervalos basados en muestras. Por lo tanto, es importante minimizar la variabi-
lidad dentro de la valoración hasta donde resulte práctico. Los intervalos basados en muestras se discuten en la sección 4.2
Combinación de Va/oraciones Independientes (Métodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras).

4.1 Combinación de Resultados de Múltiples Valoraciones

A fin de mitigar los efectos de la variabilidad, resulta adecuado llevar a cabo determinaciones repetidas de valoraciones bio-
lógicas independientes y combinar sus resultados para obtener un valor de informe único. Posteriormente, dicho valor de in-
 •
762 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas / Información General USP 37

forme único (y no los resultados individuales de la valoración) se compara con cualquier criterio de aceptación aplicable. Du-
rante el desarrollo y validación de la valoración, los analistas deben evaluar si sería útil combinar los resultados de dichas valo-
raciones y, en caso afirmativo, la forma en que se va a proceder.
Existen dos preguntas principales que se deben tratar cuando se considera la forma de combinar los resultados de múltiples
valoraciones:
¿Son mutuamente independientes las va/oraciones?
Un conjunto de valoraciones se puede considerar mutuamente independiente cuando las respuestas de alguna de éstas
no depende en ninguna forma de la distribución de las respuestas de las valoraciones restantes. Esto implica que los erro-
res aleatorios en todos los factores esenciales que influencian el resultado (por ejemplo, diluciones del estándar y de la
preparación que se va a examinar o la sensibilidad del indicador biológico) en una valoración debe ser independiente de
los errores aleatorios correspondientes de las otras valoraciones. Por consiguiente, las valoraciones en días sucesivos que
emplean las diluciones originales y reservadas del Estándar no son valoraciones independientes. De manera similar, si las
respuestas, en particular la potencia, dependen de otros reactivos compartidos por las valoraciones (p.ej., preparaciones
celulares), las valoraciones podrían no ser independientes.
Las valoraciones no necesitan ser independientes para que los analistas combinen los resultados. Sin embargo, los méto-
dos para valoraciones independientes son mucho más simples. Asimismo, combinar resultados de valoraciones depen-
dientes puede requerir suposiciones sobre la forma de la correlación entre los resultados de las valoraciones que, en el
mejor de los casos, podrían ser difíciles de verificar. Existen métodos estadísticos disponibles para valoraciones dependien-
tes, aunque no se presentan en este capítulo general.
¿Son homogéneos los resultados de las valoraciones?
Los resultados homogéneos sólo presentan diferencias debidas a errores aleatorios dentro de las valoraciones. Cualquier
contribución de factores asociados con la precisión intermedia impide la homogeneidad de los resultados. Los factores de
precisión intermedia son aquéllos que varían entre las valoraciones dentro de un laboratorio y pueden incluir analistas,
equipo y condiciones ambientales. Existen pruebas estadísticas para heterogeneidad, pero la falta de heterogeneidad esta-
dísticamente significativa no se toma como una garantía de homogeneidad, por lo que no se recomienda prueba alguna.
Si los analistas emplean un método que supone la homogeneidad, ésta debe ser evaluada durante el desarrollo, docu-
mentada durante la validación y monitoreada durante el uso continuo de la valoración.
Además, antes de que se puedan combinar los resultados de las valoraciones, los analistas deben considerar la escala en la
que se llevará a cabo dicha combinación. En general, la combinación se debe realizar usando la escala en la que las estimacio-
nes de parámetros se distribuyen aproximadamente de manera normal. Así, para las potencias relativas basadas en un método
de líneas paralelas, de curvas paralelas o cuantal, las potencias relativas se combinan en la escala logarítmica.

4.2 Combinación de Valoraciones Independientes (Métodos para Intervalos de Confianza Basados

en Muestras)

Los analistas pueden usar diversos métodos para combinar los resultados de valoraciones independientes. Un método simple
descrito a continuación (Método 1) asume una distribución común de las potencias relativas en todas las valoraciones, por lo
que es un método recomendable. Asimismo, se proporciona un segundo procedimiento que puede ser útil si se puede docu-
mentar la homogeneidad de la potencia relativa en todas las valoraciones. Se ofrece una tercera alternativa que puede ser útil
si no se cumplen las suposiciones para los Métodos 1 y 2. La alternativa de analizar todas las valoraciones juntas usando un
modelo de efectos mixtos lineal o no lineal no se discute en este capítulo general.
Método 7-Resultados de Valoraciones Independientes a partir de una Distribución de Valoraciones Común-El siguiente es un
método simple que asume la independencia de las valoraciones. Se asume que los resultados de la valoración individual (loga-
ritmos de las potencias relativas) se derivan de una distribución normal común con algo de varianza diferente a cero. Esta su-
posición de distribución común requiere que todas las valoraciones que se van a combinar hayan usado el mismo diseño y
procedimientos de laboratorio. Queda implícito que las potencias relativas pueden diferir entre las valoraciones. Por lo tanto,
este método captura la variabilidad entre valoraciones con respecto a la potencia relativa. Se debe tomar en cuenta que las
potencias relativas individuales no deben redondearse antes de combinar los resultados.
Suponiendo que R; es el logaritmo de la potencia relativa de la ima valoración de N resultados de valoraciones que se van a
combinar. Para combinar los N resultados, la media, la desviación estándar y el error estándar de la R, se calculan de la manera
usual:
N

Media R ·~ L R/N
1=1

Desviación Estándar S - { 1 -f(~,-~R/

~ N-1 ,c1

Error Estándar SE= SI JN

Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 - u)% como

USP 37 Información General/ (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas 763

donde tN _1 ,, 12 es el punto porcentual superior u/2 de una distribución t con N - 1 grados de libertad. La cantidad
tN 1,,, 12 SE es la incertidumbre expandida de R. El número, N, de valoraciones que se van a combinar es, por lo general, peque-
ño, y, por consiguiente, el valor de tes a menudo grande.
Puesto que los resultados se combinan en la escala logarítmica, el resultado combinado se puede informar en la escala sin
transformar como un intervalo de confianza para la potencia media geométrica, estimada mediante antilog(R),

antilog(R- tN- 1,,,12 SE ), antilog (R ± tN 1,,, 12 SE)

Método 2-Resultados de Valoraciones Independientes y Suposición de Homogeneidad-Este método se puede usar siempre
que se cumplan las siguientes condiciones:
(1) Las estimaciones de potencia individual forman un conjunto homogéneo con respecto a la potencia que se está estiman-
do. Se debe tomar en cuenta que esto significa documentar (a menudo durante el desarrollo y la validación) que los fac-
tores de precisión intermedia no contribuyen a la variabilidad entre valoraciones. Los resultados individuales deben pare-
cer uniformes con respecto a la homogeneidad. En particular, las diferencias entre éstos debe ser uniforme con respecto a
sus errores estándar.
(2) Las estimaciones de potencia se derivan de valoraciones independientes.
(3) El número de grados de libertad de los errores residuales individuales no es pequeño. Esto es necesario para determinar
de manera adecuada todas las ponderaciones.
Cuando no se cumplen estas condiciones, no es posible aplicar este método, por lo que deberá usarse el Método 1, el Méto-
do 3 o algún otro método . .Además, se debe tomar en cuenta que el Método 2 (debido a que asume la ausencia de variabili-
dad entre valoraciones) a menudo resulta en intervalos de confianza más estrechos que el Método 1, pero esto no es justifica-
ción suficiente para usar el Método 2 ante la falta de cumplimiento de las condiciones citadas anteriormente.
Cálculo de Coeficientes de Ponderación-Se asume que los resultados de cada una de las N valoraciones han sido analizados
para proporcionar N estimaciones del logaritmo de potencia con límites de confianza asociados. Para cada valoración, i, el in-
tervalo logarítmico de confianza para el logaritmo de potencia o el logaritmo de la potencia relativa y un valor L; se obtienen
restando el límite de confianza inferior del límite de confianza superior. (Esta fórmula, usando el L;, acomoda intervalos de con-
fianza asimétricos tales como el Teorema de Fieller, sección 4.3 Métodos Basados en Modelos). Un peso W; para cada valor del
logaritmo de la potencia relativa, R;, se calcula de la manera siguiente, donde t; tiene el mismo valor que el usado en el cálculo
de los límites de confianza en la im• valoración:

w = 4t~ [4.1]
1 ~

Cálculo de la Medía Ponderada y de los Límites de Confianza-Los productos W;R; se forman para cada valoración y su suma se
divide por el peso total para todas las valoraciones para proporcionar el logaritmo de la potencia relativa media ponderada y
su error estándar de la manera siguiente:
N N
Media R= ¿w;R; 1¿w,
i-1 i=1

Error Estándar SE = 1/ ~t W;
Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 - a)% en la escala logarítmica como
[4.2]
donde tk,., 12 es el punto porcentual superior a/2 de una distribución t con grados de libertad, k, igual a la suma del número de
grados de libertad para el error de cuadrados medios en las valoraciones individuales. Posteriormente, este intervalo de con-
fianza puede transformarse nuevamente a la escala original, al igual que en el Método 1 .
Método 3-Resultados de Valoraciones Independientes Sin la Suposición de una Distribución de Valoraciones Común-El Método
3 es un método aproximado que se puede considerar cuando no se cumplen las condiciones del Método 1 (distribución de
valoraciones común) o el Método 2 (homogeneidad).
La variación observada tiene entonces dos componentes:
• la variación intravaloración para la valoración i:

5~=1/W,
• la variación entre valoraciones:

Posteriormente, se calcula un coeficiente de ponderación para cada valoración como

764 (1034) Análisis de Valoraciones Biológicas/ Información General USP 37

1
W,'
52
1
+ 52B

el cual reemplaza W, en la ecuación [4.1] y donde ten la ecuación [4.2] a menudo se aproxima mediante el valor 2.

4.3 Métodos Basados en Modelos

Muchos intervalos de confianza son del tipo:
Intervalo de confianza =valor± k veces el error estándar de dicho valor.
Para tales casos, siempre que se pueda determinar fácilmente el multiplicador k (p.ej., a partir de una tabla de distribución
t), informar el error estándar e informar el intervalo de confianza serán altamente equivalentes, puesto que se podrá determi-
nar fácilmente el intervalo de confianza a partir del error estándar. No obstante, los logaritmos de las potencias relativas para
modelos de líneas paralelas y algunas parametrizaciones de modelos no lineales, así como las potencias relativas de los mode-
los de cocientes de pendientes, son cocientes. En tales casos, los intervalos de confianza no son simétricos alrededor del loga-
ritmo de la potencia relativa o de la potencia estimadas, por lo que se requiere el Teorema de Fieller. Para estos casos asimétri-
cos, se debe informar el intervalo de confianza, puesto que el error estándar por sí mismo, no captura la asimetría.
El Teorema de Fieller es la fórmula para el intervalo de confianza para un cociente. Suponiendo que R = a/b es el cociente
para el que se requiere un intervalo de confianza. Para las estimaciones de a y b, se cuenta con sus respectivos errores están-
dar, SE. y SEb, y con una covarianza entre ellos, denominada Cov. (La covarianza es una medición del grado de relación de las
estimaciones de a y b, y es proporcional a la correlación entre las estimaciones de a y b.) La covarianza puede ser O, al igual
que para algunas parametrizaciones de análisis de líneas paralelas estándares, aunque no es un requisito. Posteriormente, el
intervalo de confianza para Res según se indica a continuación:

{ R- gCov ± ~ k:(1-) SE'+ R2SE2 -2RCov + gCov 2 }

SE: bV g a b SE:
(R,,Ru)=~----------------~
1-g

en donde

y tes el valor desviado apropiado de t que dependerá del tamaño de la muestra y del nivel de confianza seleccionado (por lo
general 95%). Si g > 1, esto significa que el denominador, 6, no presenta una diferencia estadísticamente significativa a O y el
uso del cociente no es sensible para dichos datos.
Para aquellos casos en los que las estimaciones de a y b no guardan una correlación estadística (Cov =O), la fórmula del
intervalo de confianza se simplifica a

[4.3]

5. FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIÓN

Se pueden usar una variedad de métodos estadísticos para analizar los datos de las valoraciones biológicas. Este capítulo pre-
senta diversos métodos, pero también se pueden emplear muchos otros métodos similares. Es posible encontrar información
adicional, así como procedimientos alternativos en las referencias citadas a continuación y en otras fuentes.
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(1035) INDICADORES BIOLÓGICOS PARA ESTERILIZACIÓN

En términos generales, un indicador biológico se define como una preparación caracterizada de microorganismos específicos
resistentes a un proceso específico de esterilización. Los microorganismos ampliamente reconocidos como indicadores biológi-
cos adecuados son las bacterias formadoras de esporas, debido a que estos microorganismos son mucho más resistentes que la
microflora normal frente a la mayoría de los procesos de esterilización, excepto los que emplean radiaciones ionizantes. Un
indicador biológico se puede utilizar en la calificación del desempeño de un equipo de esterilización, y en el desarrollo y esta-
blecimiento de un proceso de esterilización validado para un artículo específico. Los indicadores biológicos se emplean en pro-
cesos que dan como resultado un producto estéril en su empaque o envase final, al igual que en la esterilización de equipos,
materiales y componentes de envases que se utilizan en procesos asépticos. También se pueden utilizar indicadores biológicos
para controlar ciclos de esterilización establecidos y en revalidaciones periódicas de procesos de esterilización. Además, se pue-
den usar indicadores biológicos para evaluar la capacidad de procesos empleados para descontaminar aisladores o ambientes
asépticos de cuartos limpios.
Los principios y requisitos de estas aplicaciones se describen en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopei-
cos (1211 ).

TIPOS DE INDICADORES BIOLÓGICOS

Hay al menos tres tipos de indicadores biológicos. Cada tipo de indicador incorpora una especie conocida de un microorga-
nismo con resistencia conocida a una forma específica de esterilización. Algunos indicadores biológicos también pueden conte-
ner dos especies diferentes de microorganismos en concentraciones distintas.
Una forma de indicador biológico consiste en esporas que se disponen sobre un transportador (un disco o tira de papel de
filtro, vidrio, plástico u otro material) y se envasa de manera que se mantenga la integridad y viabilidad del transportador ino-
culado.
Los transportadores y los envases primarios no deben tener ningún tipo de contaminación (física, química ni microbiana)
que afecte de manera adversa el desempeño ni las características de estabilidad del indicador biológico. El proceso específico
de esterilización no debe degradar al transportador ni al envase primario, pero se debe usar de manera que afecte el desarrollo
del indicador biológico. El transportador debe resistir el transporte en el envase primario y secundario y la manipulación en el
lugar de uso. El diseño del transportador y del envase primario debe reducir al mínimo la pérdida del inóculo original durante
el transporte, la manipulación y la vida útil durante el almacenamiento.
Otra forma de indicador biológico es una suspensión de esporas que se inocula a unidades representativas del producto que
se va a esterilizar. Esto constituye un producto inoculado; aunque también se puede inocular un producto simulado si no resul-
ta práctico inocular el producto real. Un producto simulado es una preparación que difiere en uno o varios aspectos del pro-
ducto real, pero que se comporta como el producto real en condiciones de prueba o durante el proceso real de esterilización
del producto. Se deben usar suspensiones de esporas con un valor D conocido para inocular el producto real o simulado. Si se
usa un producto simulado, se debe demostrar que dicho producto no disminuirá la resistencia a la esterilización del indicador
biológico. El diseño físico del producto real o simulado puede tener influencia sobre la resistencia de las suspensiones de espo-
ras inoculadas. En el caso de productos líquidos inoculados, con frecuencia es conveniente determinar el valor D y el valor z del
microorganismo indicador específico en el producto líquido específico. Se debe determinar la población, el valor D, el valor z
cuando corresponda, y el tiempo de muerte final del producto real o simulado.
Una tercera forma de indicador biológico es un indicador autocontenido. Un indicador autocontenido está diseñado para
incubar el envase primario luego del proceso de esterilización, y contiene el medio de crecimiento para la recuperación de los
microorganismos expuestos al proceso. Esta forma de indicador biológico, junto con el medio de cultivo autocontenido, se
pueden considerar un sistema. En el caso de indicadores biológicos autocontenidos, todo el sistema ofrece resistencia al proce-
so de esterilización.
Si el indicador biológico es una tira de papel o un disco en un envase autocontenido que incluye un medio de cultivo, el
envase debe estar diseñado para ser fácilmente penetrable por el agente esterilizante. Para considerar la demora del agente
esterilizante en llegar a los microorganismos contenidos en el sistema, se debe caracterizar el valor D, el tiempo de muerte final
766 (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización/ Información General USP 37

del proceso y el tiempo de supervivencia para todo el sistema y no solamente para la tira de papel en la unidad autocontenida.
Después del tratamiento de esterilización, se manipula el sistema para sumergir la tira o disco de papel con las esporas en el
medio de cultivo autocontenido y lograr el contacto entre ambos.
Los indicadores biológicos autocontenidos además pueden constar de una suspensión de esporas en su propio medio y con
frecuencia también contienen un colorante para indicar si hubo crecimiento positivo o negativo después de la incubación. La
resistencia del sistema autocontenido depende de la penetración del agente esterilizante en el envase. El fabricante puede re-
gular la penetración variando los diseños y la composición del envase, ampolla o recipiente del indicador biológico autoconte-
nido. Los indicadores biológicos autocontenidos en ampollas se pueden incubar directamente después de haberse expuesto al
proceso de esterilización. Después se incuba todo el sistema en las condiciones especificadas. El crecimiento o la ausencia de
crecimiento de las esporas tratadas se determina visualmente (ya sea mediante un cambio de color específico de un indicador
incorporado al medio o por turbidez) o mediante el examen microscópico del medio inoculado.
Las características de resistencia del sistema autocontenido también deben cumplir con lo establecido en la etiqueta del sis-
tema autocontenido y en la monografía referente al indicador biológico pertinente. El sistema de indicador biológico autocon-
tenido debe soportar el transporte en el envase secundario y la manipulación en el lugar de uso sin romperse. El sistema auto-
contenido se debe diseñar para disminuir al mínimo la pérdida del inóculo original de microorganisn1os durante el transporte y
la manipulación. Durante o después del proceso de esterilización, los materiales utilizados en el sistema autocontenido no de-
ben retener ni liberar ninguna sustancia que pueda inhibir el crecimiento de un bajo número de microorganismos indicadores
supervivientes en el cultivo. Se deben tomar las medidas adecuadas para demostrar que el medio de recuperación ha conser-
vado las características que sustentan el crecimiento después de la exposición al proceso de esterilización.

Preparación

Todas las operaciones vinculadas a la preparación de indicadores biológicos se controlan mediante un sistema de calidad
documentado. Se mantiene la rastreabilidad de todos los materiales y componentes incorporados o que entran en contacto
directo con la suspensión de microorganismos, el transportador inoculado o el indicador biológico.
La preparación de suspensiones madre de esporas de los microorganismos seleccionados que se emplean como indicadores
biológicos requiere el desarrollo de procedimientos adecuados, entre los que se incluyen cultivos en masa, recolección, purifi-
cación y conservación de las suspensiones de esporas. La suspensión madre debe contener principalmente esporas latentes (no
germinativas) que se mantienen en un líquido no nutritivo.
El producto terminado (suspensión microbiana, transportadores inoculados o indicadores biológicos) suministrado por los
fabricantes para uso comercial no debe tener otros microorganismos diferentes a los microorganismos de prueba, en un nú-
mero tal que afecte al producto de manera adversa. Se debe validar, monitorear y registrar el sistema usado para reducir al
mínimo la presencia en el producto de microorganismos distintos de los que constituyen el indicador biológico.

Selección de Indicadores para Procesos de Esterilización Específicos

La selección de un indicador biológico requiere el conocimiento de la resistencia del sistema indicador biológico con respec-
to al proceso de esterilización específico. Se debe establecer que el sistema indicador biológico ofrece una mayor resistencia al
proceso de esterilización que la correspondiente a la carga microbiana natural presente en el producto.
El uso eficaz de indicadores biológicos en el ciclo de desarrollo, proceso y validación del producto y en el control de la pro-
ducción de rutina de un proceso de esterilización requiere un profundo conocimiento del producto que se va a esterilizar y de
sus componentes (materiales y envase). En el desarrollo o la validación de un proceso de esterilización sólo se deben usar los
indicadores biológicos ampliamente reconocidos en la monografía del indicador biológico específico. Esto garantizará que el
indicador biológico seleccionado represente un desafío mayor para el proceso de esterilización que la biocarga presente en el
producto. Es posible que algunos usuarios necesiten indicadores biológicos con características que difieran de las que poseen
los que están disponibles comercialmente. En dichos casos, los usuarios pueden desarrollar sus propios cultivos de esporas con
el propósito expreso de preparar indicadores biológicos para su uso interno específico. En dicho caso, se aconsejará al usuario
que utilice microorganismos ya descritos en publicaciones científicas como microorganismos indicadores y el usuario debe te-
ner la capacidad de determinar los valores D y z de los indicadores biológicos de uso interno. Cuando los indicadores biológi-
cos se preparan internamente, los usuarios deben confirmar la población, la pureza y la vida útil del indicador biológico para
asegurar la validez de cualquier prueba que se lleve a cabo con el indicador interno. Cuando se emplea un diseño de un proce-
so de esterilización basado en la biocarga, son esenciales los datos que comparan la resistencia del indicador biológico con la
resistencia de la biocarga. Además, se requiere el recuento del contenido de la biocarga de los artículos que se esterilizan. El
proceso puede dar como resultado una letalidad verificada desde el punto de vista biológico suficiente para lograr que la pro-
babilidad de obtener una unidad no estéril sea menos de una en un millón.
Como alternativa, se puede usar el método de sobremuerte en el diseño de un proceso de esterilización. En este caso, se
hacen presunciones específicas con respecto a la resistencia presupuesta al establecer los requisitos de letalidad del proceso de
esterilización. En general, todos los procesos de sobremuerte se elaboran basándose en la suposición de que la biocarga es
igual a un millón de microorganismos y que los microorganismos son muy resistentes. En consecuencia, para lograr la probabi-
lidad requerida de una unidad no estéril menor de uno en un millón, se necesita como mínimo un proceso 12 D. Un proceso
1 2 D se define como un proceso lo suficientemente letal como para provocar una reducción de 12 unidades logarítmicas, lo
USP 37 Información General/ (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización 767

que equivale a 12 veces un valor D para microorganismos con una resistencia suficientemente más alta que la resistencia me-
dia de la biocarga. Puesto que se da por sentado que la biocarga es un millón, en la práctica real, un proceso de sobremuerte
dará como resultado una probabilidad de no esterilidad mucho menor de 10 6 • El diseno y la evaluación del proceso de sobre-
muerte pueden diferir según el proceso de esterilización en análisis. El uso de un diseno de sobremuerte y un enfoque de vali-
dación pueden minimizar o evitar la necesidad del recuento e identificación de la biocarga.
Calor Húmedo-En procesos de esterilización por calor húmedo, con frecuencia se utilizan esporas de cepas adecuadas de
Bacil/us stearothermophilus que están disponibles comercialmente como indicadores biológicos. También se han utilizado otros
microorganismos formadores de esporas, resistentes al calor, como Clostridium sporogenes, Bacil/us subtilis y Bacil/us coagulans
en el desarrollo y validación de procesos de esterilización por calor húmedo.
Calor Seco-En la esterilización por calor seco, algunas veces se emplean esporas de Bacillus subtilis spp. para validar el
proceso. Durante la validación de los procesos de esterilización por calor seco, frecuentemente se llevan a cabo estudios de
despirogenación de endotoxinas en lugar de estudios de inactivación microbiana durante el establecimiento de ciclos de este-
rilización, debido a que la inactivación de las endotoxinas es más difícil que la velocidad de inactivación de las esporas de
Bacillus subtilis. En la práctica, una reducción del título de endotoxinas en tres o más unidades logarítmicas dará como resulta-
do un proceso que logra una probabilidad de no esterilidad mucho menor de 10- 6 •
Radiación Ionizante-Las esporas de Bacillus pumilus se han usado para controlar los procesos de esterilización que em-
plean radiación ionizante; sin embargo, esta práctica se está abandonando. Para establecer procesos de radiación se han utili-
zado ampliamente métodos de ajuste de dosis de radiación que no usan indicadores biológicos. Además, ciertos microorganis-
mos de la biocarga pueden presentar mayor resistencia a la radiación que Bacillus pumilus.
Óxido de Etileno-En 1<1 esterilización por óxido de etileno, habitualmente se emplean esporas de una subespecie de Baci-
1/us subtilis (Bacil/us subtilis var. niger). Generalmente se emplean los mismos sistemas indicadores biológicos para la esteriliza-
ción por óxido de etileno al 1 00% y para sistemas de óxido de etileno con un gas transportador.
Peróxido de Hidrógeno en Fase de Vapor (VPHP, por sus siglas en inglés)-Este proceso ha demostrado ser eficaz para
esterilizar o descontaminar superficies. El VPHP puede lograr la esterilización (probabilidad de no esterilidad menor de uno en
un millón) cuando las condiciones del proceso así lo requieran y si el objeto de la esterilización está adecuadamente configura-
do. Sin embargo, el VPHP también se emplea habitualmente como agente descontaminante de superficies en el tratamiento
de pruebas de esterilidad, contención química y biológica, fabricación de aisladores y cuartos limpios.
La descontaminación de superficies es un proceso distinto de la esterilización de materiales que entran en contacto con el
producto, sistemas de envase-cierre o producto. Es un proceso ideado para dejar un entorno libre de microorganismos detec-
tables o recuperables. Los indicadores biológicos se utilizan frecuentemente para verificar la eficacia del proceso de desconta-
minación. Sin embargo, en el caso de la descontaminación, un valor de tres a cuatro unidades de reducción logarítmica de
esporas es adecuado, porque el objetivo es la descontaminación más que la esterilización.
Bacil/us stearothermophilus es el indicador biológico más utilizado para validar el proceso VPHP. Otros microorganismos que
pueden resultar útiles como indicadores biológicos en procesos VPHP son las esporas de Bacillus subtilis y Clostridium sporoge-
nes. Se pueden considerar otros microorganismos si sus reacciones al VPHP son similares a las de los microorganismos citados
anteriormente.
Estas esporas se pueden inocular en la superficie de varios sistemas transportadores impermeables a los gases cuyas superfi-
cies sean de vidrio, metal o plástico. Las superficies muy absorbentes, como por ejemplo los sustratos fibrosos o cualquier otro
sustrato que absorba fácilmente VPHP o humedad, pueden influir de manera adversa sobre la concentración de VPHP disponi-
ble para inactivar los microorganismos inoculados. No se usan sustratos de papel porque el VPHP degrada los materiales que
contienen celulosa.
Para conocer las características representativas de indicadores biológicos disponibles comercialmente, ver la Tabla 7.
Tabla 1. Características Típicas de Sistemas de Indicadores Biológicos Suministrados Comercialmente

Intervalo de valores D para Límites de Resistencia Adecuada (depen-

Seleccionar un Indicador diendo del valor D específico [minutos])
Modo de Ejemplo de valor D Tí- Biológico Adecuado Tiempo de Tiempo de
Esterlllzaclón pico (minutos) (minutos) Supervivencia Muerte
Calor secoª 1,9 Mín. 1,0 Mín. 4,0 10,0
160º Máx. 3,0 Máx. 14,0 32,0
Óxido de etilenob
600 mg por L 3,5 Mín. 2,5 Mín. 10,0 25,0
54º Máx. 5,8 Máx. 27,0 68,0
60% de humedad relativa

¡ ---· ---------,¡
Calor húmedo' 1,9 Mín. 4,5 13,5
121º Máx. 14:-o-- - 32,0
·---~------------~-----

d Para 1,0 x 1 0 6 a 5,0 x 1 0 6 esporas por transportador.

b Para 1,0 x 1 Qó a 5,0 x 1 0 7 esporas por transportador.
' Para 1,0 x 1os a 5,0 x 10 6 esporas por transportador.
768 (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización/ Información General USP 37

El indicador biológico también puede estar envasado individualmente en un envase primario envuelto adecuadamente para
que no afecte de manera adversa el resultado del indicador y sea penetrable por VPHP. Se ha demostrado que los materiales
de poliolefina hilados son adecuados para envolver indicadores biológicos destinados a la evaluación de procesos VPHP. El ma-
terial de envoltura puede facilitar la manipulación de los indicadores biológicos en el laboratorio después de la exposición a
VPHP. Además, se debe evaluar cuidadosamente el material de envoltura, para asegurar que no queden residuos de peróxido
de hidrógeno en el material del envase después de la exposición a VPHP, lo que posiblemente induciría una bacteriostasis du-
rante los pasos de recuperación. Los valores D microbiológicos se verán influidos en cuanto a la velocidad de inactivación por
la presencia del material de envoltura del indicador biológico y la posible presencia de residuos de VPHP. En los casos en que
se empleen indicadores biológicos (transportadores inoculados) sin el envase primario, se requiere el estricto cumplimiento de
las técnicas asépticas.

EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO

Responsabilidad del Fabricante

La responsabilidad inicial de determinar y proporcionar a los usuarios las características de desempeño de un lote de indica-
dores biológicos 1 recae sobre el fabricante del indicador. El fabricante debe suministrar un certificado de análisis con cada lote
de indicadores biológicos, el cual debe confirmar la validez de las aseveraciones sobre el desempeño del indicador biológico
que se indican en la etiqueta del mismo o en la información adjunta al envase. El fabricante debe definir el proceso de esterili-
zación para el cual se destina el indicador biológico. El fabricante del indicador biológico debe realizar la caracterización inicial
que establece las bases de las declaraciones de la etiqueta de cada indicador biológico mediante el uso de aparatos especializa-
dos y estandarizados en condiciones definidas y precisas. 1 El fabricante además debe proporcionar información sobre el valor
D, el método por el cual se determinó el valor D, y el recuento microbiológico y la estabilidad de la resistencia del indicador
biológico durante toda la vida útil del indicador declarada en la etiqueta. El fabricante debe proveer condiciones óptimas de
almacenamiento, incluidas la temperatura, la humedad relativa y cualquier otro requisito para almacenamiento controlado. Los
datos obtenidos de las diversas valoraciones de desempeño requeridas se deben citar en el prospecto adjunto o en la etiqueta
del envase del indicador biológico. El fabricante debe proporcionar instrucciones de uso, entre las que se incluyen el medio y
las condiciones que se deben emplear para la recuperación de los microorganismos después de la exposición al proceso de
esterilización. Además, el fabricante debe suministrar las instrucciones de eliminación del indicador biológico.

Responsabilidad del Usuario

Producto Comercial-Cuando se adquieran indicadores biológicos de una fuente comercial, se debe establecer su aptitud
para el uso en un proceso de esterilización específico mediante la realización de estudios de esterilización a menos que se dis-
ponga de datos que respalden su uso en el proceso. El usuario debe establecer normas internas de aceptación para los lotes de
indicadores biológicos y considerar su rechazo cuando el lote no cumpla con los estándares de desempeño establecidos. Se
debe obtener un Certificado de Desempeño de cada lote de indicadores y el usuario debe llevar a cabo periódicamente inspec-
ciones de los procesos y las instalaciones del fabricante. Sí no se obtienen certificados ni se realizan inspecciones, o si los indi-
cadores biológicos se van a usar sin tener en cuenta las declaraciones establecidas en la etiqueta del fabricante, es necesaria la
verificación y documentación del desempeño en las condiciones de uso.
Cuando el usuario recibe por primera vez el indicador biológico de un proveedor comercial, debe verificar la pureza y la
morfología de los microorganismos del indicador biológico adquirido. Es conveniente que por lo menos se verifique el género.
Además se debe realizar un recuento microbiano para determinar el recuento promedio por unidad de indicador biológico. Se
deben observar y tomar nota de los comentarios del fabricante respecto del intervalo del valor D, las condiciones de almacena-
miento, la fecha de caducidad y la estabilidad del indicador biológico. El usuario tiene la opción de llevar a cabo evaluaciones
para verificar el valor D antes de aceptar el lote. Los laboratorios que tengan la capacidad de realizar determinaciones del valor
D pueden realizarlas mediante uno de los tres métodos citados en el capítulo de pruebas generales Indicadores Biológicos-
Pruebas de Resistencia (55) y en las monografías pertinentes de la USP sobre indicadores biológicos. Es de particular importan-
cia la verificación del valor D y la estabilidad del recuento del sistema de indicador biológico si se emplea el almacenamiento a
largo plazo.
En el caso de que el cultivo de esporas se mantenga durante más de 12 meses en condiciones de almacenamiento docu-
mentadas, se debe llevar a cabo tanto un recuento de esporas como un análisis de la resistencia, salvo que el desempeño del
cultivo madre original se haya validado durante un período de almacenamiento más prolongado. Los resultados de ambas va-
loraciones deben estar dentro del intervalo de aceptabilidad establecido en la aceptación inicial de la partida del cultivo de
esporas.
Producto No Comercial-Un usuario de sistemas de indicadores biológicos puede optar por cultivar microorganismos para
desarrollar indicadores biológicos de uso interno con el propósito de establecer o validar procesos de esterilización. En el caso
de que un usuario se convierta en "fabricante" de indicadores biológicos, se debe cumplir con ciertos requisitos de desempeño

1 Ver Aparatos en Indicadores 810!09icos---Prueha~ de Re-,1:ilencio 55 blch dpdl dtos hJr1 sido d1::.cnados pard proporc iondr condiciones tí sic a\ uniformes aplicable':i a
la caracteri1ación de indicadores biológicos. También ">C indicdn las caractcri-.tic dS de dcsemperio requerida).
USP 37 Información General/ (1035) Indicadores Biológicos para Esterilización 769

para indicadores biológicos. Si el sistema indicador biológico se emplea para desarrollar nuevos procesos de esterilización o
para la validación de los ya existentes, se deben seguir los mismos criterios de desempeño descritos para los fabricantes comer-
ciales de indicadores biológicos.

Preparación del Cultivo de Esporas

Debido a que la mayoría de los indicadores biológicos emplean esporas microbianas, los productores de indicadores biológi-
cos, comerciales o no comerciales, deben mantener registros precisos de la identificación del cultivo de esporas. Estos registros
deben incluir anotaciones referentes a la fuente del cultivo inicial, identificación, rastreabilidad del cultivo madre de esporas,
frecuencia de subcultivos, medios utilizados para la esporulación, cambios en la preparación de los medios y cualquier observa-
ción sobre contaminación de cultivos y datos previos y posteriores al choque térmico. Se deben mantener registros respecto al
uso del cultivo de esporas y su resistencia a la esterilización (concretamente, los valores D y z cuando corresponda).

Instrumentación

La instrumentación que se usa para evaluar la resistencia a la esterilización de los cultivos de esporas debe cumplir los están-
dares2 que se refieren a la evaluación del desempeño de los sistemas de indicadores biológicos.
El equipo para la determinación de los valores D de microorganismos expuestos a VPHP debe poder ejercer un control estric-
to sobre los parámetros de operación del equipo como se describe para otros sistemas de indicadores biológicos en Indicadores
Biológicos-Pruebas de Resistencia (55). Es de particular importancia asegurar una concentración de VPHP reproducible, entre-
gada dentro de un período definido y mantenida dentro de un intervalo específico de concentración o de presión de VPHP
durante incrementos de tiempo definidos. La introducción de indicadores biológicos en condiciones de una concentración es-
tabilizada de VPHP se debe efectuar mediante un sistema que permita introducir y retirar rápidamente las unidades de prueba
de la cámara. Además, el diseño de la cámara de prueba debe ser tal que se pueda alcanzar el estado estacionario de concen-
traciones y presiones de VPHP, o se pueda usar una cantidad definida de pies cúbicos de VPHP fluyendo libremente a presión y
temperatura normalizadas. Actualmente, el uso de dispositivos que determinan la concentración de VPHP no está muy difundi-
do. Por lo tanto, puede ser necesario basar las condiciones de exposición en el mantenimiento de las presiones de VPHP en
estado estacionario o en las velocidades de flujo resultantes de un peso inicial de peróxido de hidrógeno conocido que entra
en la cámara en una unidad de tiempo definida. Esta información, junto con el volumen fijo conocido del entorno de la cáma-
ra, permite calcular la concentración aproximada de VPHP. Si las condiciones se mantienen constantes a lo largo de cada corri-
da de evaluación del valor D, se pueden determinar fácilmente comparaciones de resistencia relativa entre diferentes lotes de
indicadores biológicos.

USO PARA VALIDACIÓN DURANTE EL PROCESO

Independientemente del modo de esterilización, el número de microorganismos de la población inicial, su resistencia a la

esterilización, y el sitio de inoculación dentro o sobre el producto pueden influir en la velocidad de inactivación del indicador
biológico.
Durante las exposiciones del producto a los microorganismos, se deben inocular varios lugares del producto con indicadores
biológicos. Si, por ejemplo, se esteriliza un envase con su sistema de cierre, se debe exponer tanto la solución del producto
como el sistema de cierre para asegurar que se logre la esterilización equivalente a un nivel de garantía de esterilización (SAL,
por sus siglas en inglés) de 10-6 (una probabilidad en un millón de que haya una unidad no estéril) en la solución y el cierre.
Puede ser necesario determinar mediante estudios de laboratorio si los componentes del producto son más difíciles de esteri-
lizar por separado que, por ejemplo, una solución o un fármaco contenidos dentro del producto. Dependiendo de la localiza-
ción de los componentes del producto más difíciles de esterilizar, pueden intervenir diferentes parámetros del proceso para
garantizar la inactivación microbiana hasta un nivel SAL de 10-6 • Durante la fase de calificación de desempeño del producto se
deben identificar los parámetros del proceso con mayor influencia en la inactivación de microorganismos en los sitios más difí-
ciles de esterilizar. En la validación durante el proceso del producto, los parámetros fundamentales previamente determinados
se deben ajustar por debajo de las condiciones establecidas en las especificaciones del proceso. La supervivencia del indicador
biológico se puede predecir basándose en su resistencia y la población. Por lo tanto, no siempre se requiere una población de
106 de un indicador biológico para demostrar un SAL de 10-6 • Es adecuado usar indicadores biológicos para confirmar que los
parámetros del proceso desarrollado den como resultado el SAL deseado. En la esterilización por calor húmedo, el indicador
biológico se emplea para verificar biológicamente la letalidad determinada físicamente. Indicadores biológicos con altos valo-
res D y poblaciones significativamente menores de 106 son adecuados para validar muchos procesos de esterilización y descon-
taminación. Es importante que los usuarios puedan justificar científicamente su selección de un indicador biológico.

2 Vigentes para Recipientes de Vapor/BIER, Estándares Nacionales de los Estados Unidos (American National Standards), ANSl/AAMI ST45:1992.
770 (1 041 > Productos Biológicos / Información General USP 37

<1041) PRODUCTOS BIOLÓGICOS

Algunos productos como por ejemplo antitoxinas, antivenenos, sangre, hemoderivados, antisueros, elementos auxiliares pa-
ra el diagnóstico inmunológico, toxoides, vacunas y artículos relacionados que se producen bajo licencia en conformidad con
los términos de la Ley federal de Servicios de Salud Pública (Estat. 58 682) aprobada el 1 de julio de 1944 como enmienda, se
han conocido durante mucho tiempo como "productos biológicos". Sin embargo, en la Tabla 111, Parte F de la Ley, el término
"productos biológicos" se aplica al grupo de productos autorizados en conjunto. A los efectos de esta Farmacopea, el término
"productos biológicos" hace referencia a aquellos productos que deben estar autorizados según la Ley y cumplir con el Regla-
mento sobre Alimentos y Medicamentos-Código de Reglamentos Federales, Título 21, Partes 600-680, relativas al control fe-
deral de estos productos (excepto ciertos elementos de diagnóstico), según la administración del Centro de Investigación y
Evaluación de Productos Biológicos (Center for Biologics Evaluation and Research) o, en el caso de los elementos auxiliares de
diagnóstico pertinentes, del Centro de Dispositivos y Radiología (Center for Devices and Radiological Health) de la Administra-
ción Federal de Alimentos y Medicamentos.
Cada lote de un producto biológico autorizado está aprobado para su distribución cuando se ha determinado que el lote
cumple con los requisitos de control específicos para dicho producto según establezca la Administración. El otorgamiento de
licencias incluye la aprobación de una serie específica de pasos de producción y de pruebas de control durante el proceso, así
como especificaciones sobre el producto final que deben cumplirse lote por lote. Estos pasos sólo pueden alterarse después de
la aprobación del Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos y con el apoyo de la información apropiada
que demuestre que el cambio generará un producto final con una seguridad, pureza, potencia y eficacia iguales o superiores.
Ningún lote de un producto biológico autorizado será distribuido por el fabricante antes de completar las pruebas especifica-
das. Las disposiciones generalmente aplicables a los productos biológicos incluyen pruebas de potencia, seguridad general, es-
terilidad, pureza, agua (humedad residual), pirógenos, identidad y materiales constituyentes (Artículos 610.1Oa610.15 y ver
Pruebas de Seguridad-Productos Biológicos en Pruebas de Reactividad Biológica In Vivo (88), Pruebas de Esterilidad (71 ), Determi-
nación de Agua (921 ), Prueba de Pirógenos (151) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)). Los materiales constituyentes inclu-
yen ingredientes, conservantes, diluyentes y adyuvantes (los cuales generalmente deben cumplir con las normas farmacopei-
cas), vacunas producidas en cultivos celulares de proteína extraña (la cual se excluye si no origina suero) y antibióticos diferen-
tes de la penicilina agregados al sustrato de producción de vacunas virales (para las cuales hay disponibles monografías oficia-
les sobre antibióticos y sustancias antibióticas). También es necesario realizar pruebas de seguridad adicionales específicas en
vacunas vivas y algunos otros elementos. Cuando el Centro de Investigación y Evaluación de Productos Biológicos (Apartado
610.20) pone a disposición las preparaciones estándar, dichas preparaciones se especifican para la comparación de potencia o
pruebas de virulencia. El Estándar de Opacidad de los EE.UU. se utiliza para calcular la concentración bacteriana de ciertas va-
cunas bacterianas y para evaluar cultivos de desafío en las pruebas realizadas a dichas sustancias. (Ver también Unidades de
Potencia en las Advertencias Generales.)
Las Monografías Farmacopeicas cumplen la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos al cubrir los aspectos de iden-
tidad, calidad, pureza, potencia, envasado y almacenamiento, que resultan de particular interés para los farmacéuticos y médi-
cos responsables de la compra, el almacenamiento y el uso de productos biológicos. Las revisiones de los requisitos federales
que afectan a las monografías de la USP serán los temas centrales de los Suplementos de la USP tan pronto como sea factible.
Vehículos y Sustancias Agregadas-Los vehículos y las sustancias agregadas adecuados para productos biológicos son los
que se enumeran en la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos.
Envases para Inyecciones-Los envases para productos biológicos que deban ser administrados por vía inyectable cum-
plen con los requisitos de Envases para Inyecciones en Inyectables (l ).
Volumen en Envase-Los volúmenes de los envases de productos biológicos que deban ser administrados por vía inyecta-
ble cumplen con los requisitos de Contenido del Envase en Inyectables (1 ).
Etiquetado-Los productos biológicos que deban ser administrados por vía inyectable cumplen con los requisitos de Eti-
quetado en Inyectables (l ). Además, la etiqueta del envase final para cada producto biológico indica lo siguiente: el título o
nombre propio (el nombre con el cual el producto fue autorizado según la Ley de Servicios de Salud Pública), el nombre, la
dirección y el número de licencia del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad y la dosis individual recomendada
para envases multidosis. La etiqueta del envase incluye todo lo mencionado anteriormente, con la siguiente adición: el conser-
vante utilizado y la cantidad; el número de envases, si hubiera más de uno; la cantidad de producto contenida en el envase; la
temperatura de almacenamiento recomendada; una leyenda, si fuera necesario, que indique que debe evitarse la congelación;
y cualquier otra información semejante requerida por la Reglamentación sobre Alimentos y Medicamentos.
Envasado y Almacenamiento-El etiquetado indica la temperatura de almacenamiento recomendada (ver Advertencias Ge-
nerales). Cuando los productos cuya etiqueta indica que deben almacenarse a una temperatura entre 2º y 8º están almacena-
dos en un refrigerador, se deben tomar precauciones para asegurarse de que no se congelen. Los diluyentes envasados con
productos biológicos no deben congelarse. Algunos productos (como se define en el Apartado 600.15) deben mantenerse a
temperaturas especificadas durante el transporte.
Fecha de Caducidad-Para los artículos farmacopeicos, la fecha de caducidad identifica el tiempo durante el cual se puede
esperar que el artículo cumpla con los requisitos de la monografía Farmacopeica, siempre que se almacene en las condiciones
de almacenamiento prescritas. Esta fecha limita el tiempo durante el cual el producto puede ser dispensado o utilizado (ver
USP 37 Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 771

Advertencias Generales, página 1 ). Sin embargo, para los productos biológicos, la fecha indicada en cada lote determina el pe-
ríodo de vigencia, que comienza en la fecha de fabricación (Apartado 61 O.SO) y más allá de la cual existen dudas razonables
de que el producto pueda generar los resultados específicos y conserve la seguridad, pureza y potencia requeridas (Apartado
300.3 (1) y (m)). Dicho periodo de vigencia puede comprender un periodo de almacenamiento en fábrica durante el cual se
mantiene en las condiciones prescritas en el almacenamiento del fabricante, seguido de un periodo tras ser retirado de allí. Las
monografías individuales suelen indicar este último período y también (entre paréntesis) el período de almacenamiento en fá-
brica permisible. Si el producto se conserva en el almacenamiento del fabricante durante un periodo superior al indicado (en-
tre paréntesis), la fecha de caducidad se determina reduciendo en la proporción correspondiente el periodo de vigencia des-
pués de la salida del almacenamiento del fabricante.

(1043) MATERIALES AUXILIARES PARA PRODUCTOS CELULARES,

GÉNICOS Y DE INGENIERÍA TISULAR

INTRODUCCIÓN

La fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular requiere de una amplia variedad de reactivos y materia-
les, muchos de los cuales son únicos o complejos. Estos materiales incluyen productos provenientes del plasma o del suero,
extractos biológicos, antibióticos, citocinas, medios de cultivo, anticuerpos, matrices poliméricas, dispositivos de separación,
medios de gradiente de densidad, toxinas, medios condicionados suministrados por "capas de células de alimentación", sus-
tancias químicas puras, enzimas y soluciones amortiguadoras de procesamiento. Muchos de estos artículos se usan para asegu-
rar la supervivencia y favorecer la proliferación de determinadas poblaciones celulares, aunque su mecanismo de acción puede
no estar completamente elucidado. Algunos ejemplos son el suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés) y diversos suple-
mentos de medios. Otros artículos, como la toxina del cólera altamente purificada, se introducen en el flujo de procesamiento
durante la fabricación para ejercer un efecto bioquímico específico y se eliminan por lavado inmediatamente en pasos subsi-
guientes del procesamiento para evitar la toxicidad posterior no deseada. Los productos biológicos terminados elaborados en
estos procesos a menudo son mezclas complejas que, en algunos casos, no se pueden caracterizar totalmente. Es necesario
examinar cuidadosamente los materiales utilizados en la elaboración, para evitar la introducción de agentes adventicios o im-
purezas tóxicas, y para garantizar la máxima seguridad, eficacia y uniformidad del producto final.
En la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, a estos reactivos y materiales se los conoce colectiva-
mente como materiales auxiliares (AM, por sus siglas en inglés). Los AM también se conocen como productos auxiliares, reacti-
vos auxiliares, coadyuvantes del proceso ("processing aids") y reactivos de procesos. Los AM se trataron por primera vez bajo el
sinónimo de productos colaterales en la Notificación de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Uni-
dos, "Application of Current Statutory Authorities to Human Somatic Cell Therapy Products and Gene Therapy Products" (Re-
glamentación Vigente para Productos de Terapia Celular Somática Humana y Productos de Terapia Génica) (Diario Oficial
58(197), 14 de octubre de 1993 ((Federal Register 58(197), Oct. 14, 1993) páginas 53248-53251 ). Este documento estable-
ció la autoridad de la FDA para reglamentar productos de terapia celular somática humana y productos de terapia génica. AM
también es sinónimo de "materiales de proceso" que fueron definidos en 21 CFR Parte 1271, "Current Good Tissue Practice
for Manufacturers of Human Cellular and Tissue-based Products; lnspection and Enforcement; Proposed Rule (Buenas Prácticas
Vigentes para Fabricantes de Productos Tisulares y de Células Humanas; Inspección y Ejecución; Norma Propuesta" (Diario Ofi-
cial 66(5), 8 de enero de 2001 ((Federal Register 66(5), january 8, 2001) páginas 1508-1559). Los AM pueden ser análogos a
"componentes", y en algunos casos, "envases" según se describe en las reglamentaciones sobre las buenas prácticas de fabri-
cación vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés) para productos farmacéuticos terminados según se define en 21 CFR 211.80 a
211.94 y 211.lOl(b) y (c).
La propiedad que define a los AM es que no están destinados a estar presentes en el producto final. Son materiales que se
usan como ayuda en el procesamiento y la purificación o agentes que ejercen su efecto sobre la sustancia terapéutica. Los ma-
teriales o componentes destinados a estar en la forma farmacéutica del producto final (por ejemplo, materiales genéticos, so-
portes biopoliméricos, soluciones amortiguadoras fisiológicas) no son AM. Los bancos de células y los bancos de virus tampoco
se consideran AM; hay una serie de guías que describen los requisitos para su certificación. Sin embargo, los virus "auxiliares" y
plásmidos "auxiliares" se pueden considerar AM cuando no están destinados a formar parte del producto final.
La calidad de un AM puede afectar la estabilidad, seguridad, potencia y pureza de un producto celular, génico o de ingenie-
ría tisular. Por ejemplo, se puede desconocer el mecanismo mediante el cual un AM ejerce su efecto y puede no comprenderse
el impacto que tiene la variación normal de un AM sobre la calidad y seguridad del producto terapéutico. Otra posibilidad es
que los AM de origen humano o animal podrían presentar un riesgo de transmisión de una enfermedad infecciosa. Otros AM,
si se administran a seres humanos, pueden provocar una reacción inmunitaria. Finalmente, un AM con propiedades tóxicas
que se introduzca en un proceso de fabricación y no se elimine de manera satisfactoria en pasos subsiguientes del proceso,
expondrá al paciente a una sustancia tóxica y puede alterar la eficacia de la entidad terapéutica. Estos riesgos que afectan la
calidad y seguridad del producto terapéutico frecuentemente aumentan en el caso de productos celulares, génicos y de inge-
772 (1043) Materiales Auxiliares/ Información General USP 37

niería tisular, como consecuencia de la capacidad limitada de llevar a cabo pruebas exhaustivas en proceso y de liberación. Por
ejemplo, la falta de pasos de retención en proceso o vida útil limitada pueden crear la necesidad de administrar los productos
celulares, génicos o de ingeniería tisular antes de obtener los resultados de las pruebas en proceso o de liberación finales. En
otros casos, la escasez de tejido donante adecuado o la compleja logística en el transporte de materiales biológicos puede limi-
tar la cantidad de material disponible para efectuar pruebas. Para minimizar estos riesgos, cuando sea posible hay que imple-
mentar rigurosos procedimientos de calificación de los materiales y aplicar con prudencia controles del proceso de fabricación.
Con frecuencia, estos nuevos productos terapéuticos se crean utilizando procesos biológicos complicados. Los AM emplea-
dos en estos procedimientos se pueden seleccionar principalmente por sus contribuciones funcionales o efectos biológicos es-
peciales. Cuando sea posible, es preferible que los AM sean productos terapéuticos aprobados o autorizados porque están bien
caracterizados, poseen un perfil toxicológico establecido y están fabricados según procedimientos controlados y documenta-
dos. Por otra parte, el AM puede estar destinado al "uso en investigación" y por lo tanto puede carecer del nivel de calificación
necesario para su uso en la producción de un producto terapéutico. En cada caso, el fabricante del producto celular, génico o
de ingeniería tisular debe elaborar protocolos de calificación amplios y científicamente válidos para garantizar la rastreabilidad,
consistencia, aptitud, pureza y seguridad del AM. En los casos en que los AM sean productos aprobados para su uso con fines
terapéuticos, el nivel de calificación probablemente sea menos amplio que el de un material destinado a fines de investigación.
No obstante, aún es necesario determinar su aptitud en el proceso de fabricación cuando el AM se utiliza de forma distinta al
uso previsto o a lo indicado en el etiquetado. El propósito de este capítulo es ofrecer una guía para elaborar programas de
calificación apropiados para AM que se empleen en la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular.

CALIFICACIÓN DE MATERIALES AUXILIARES

La calificación es el proceso de obtener y evaluar datos para establecer el origen, la identidad, la pureza, la seguridad bioló-
gica y la aptitud general de un AM especifico. La responsabilidad de la calificación del AM recae en quien desarrolla o fabrica el
producto celular, génico o de ingeniería tisular. Esta sección resume a grandes rasgos las bases para que un fabricante pueda
establecer programas razonables y científicamente válidos para calificar los AM, aunque la amplia naturaleza de los productos
celulares, génicos y de ingeniería tisular, al igual que la de los AM empleados para producir estos productos hacen difícil reco-
mendar pruebas o protocolos específicos para un programa de calificación. La documentación completa y rigurosa es la piedra
angular de cualquier programa de calificación.
Un programa de calificación bien diseñado se torna más amplio a medida que progresa el desarrollo del producto. En las
primeras etapas de desarrollo del producto, el enfoque principal es respecto a la seguridad. En las etapas posteriores, se deben
desarrollar actividades de producción y calificación del AM en forma amplia para respaldar la consiguiente concesión de la li-
cencia del producto celular, génico o de ingeniería tisular. En algunas ocasiones, es posible que no hayan proveedores de sus-
tancias complejas o únicas que han demostrado ser esenciales para el control del proceso o la producción y que las producen
de conformidad con las cGMP. En estas situaciones, el fabricante debe elaborar una estrategia científicamente válida para la
calificación. Un programa de calificación para los AM que se utilicen en la fabricación de productos celulares, génicos y de
ingeniería tisular debe cubrir los siguientes aspectos: (1) identificación, (2) selección y aptitud para usarlos en la fabricación, (3)
caracterización, (4) calificación del proveedor y (5) control y garantía de calidad.

1dentificación
El primer paso de cualquier programa de calificación es listar todos los AM que se emplean en la fabricación de un producto
determinado e indicar en qué parte del proceso de fabricación se van a utilizar. Se debe establecer el origen y el uso previsto
de cada material y se debe determinar la cantidad o concentración necesaria de cada material. Además se deben identificar
fuentes alternativas de cada material.

Selección y Aptitud para el Uso

Quienes desarrollan productos celulares, génicos y de ingeniería tisular deben establecer y documentar los criterios de selec-
ción de AM y los criterios de calificación para cada proveedor al principio de la fase de diseño del desarrollo del producto. Los
criterios de selección deben incluir evaluaciones de pureza microbiológica y química, identidad y actividad biológica pertinen-
tes al proceso de fabricación específico. Es importante abordar estos temas al principio del desarrollo del producto porque la
calificación de ciertos AM, que inicialmente pueden ser considerados necesarios, puede ser imposible o demasiado costosa,
justificando de este modo la investigación de productos alternativos o sustitutos. Entre los ejemplos se encuentran algunos ma-
teriales de origen animal o humano que en algunos casos tienen fuentes alternativas (como por ejemplo, de origen vegetal o
por síntesis química).
Los AM de origen animal o humano se deben seleccionar cuidadosamente debido a los posibles riesgos de enfermedades
infecciosas o zoonóticas asociadas a estos materiales. Hay que seleccionar proveedores que puedan proporcionar documenta-
ción sobre el país de donde provienen los AM de origen animal para responder a las inquietudes respecto a la encefalopatía
espongiforme bovina y otras enfermedades de interés agrícola, como tuberculosis y brucelosis. En muchos casos, se debe do-
cumentar la cadena de custodia de los AM de origen animal (es decir, matadero~ centro de procesamiento intermedio~
USP 37 Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 773

centro de procesamiento final). Los proveedores de AM de origen humano deben poder proporcionar documentación respec-
to a la rastreabilidad del material. Por ejemplo, los AM obtenidos de plasma humano deben provenir de establecimientos auto-
rizados que controlen el conjunto de donantes y examinen a los donantes individuales para verificar que no padezcan enfer-
medades infecciosas humanas importantes. En algunos casos, los proveedores de AM de origen animal y humano suministran
diferentes categorías de materiales, siendo algunas más adecuadas para usar en la fabricación de productos celulares, génicos y
de ingeniería tisular que otras categorías. Por ejemplo, se puede obtener FBS que haya sido procesado para reducir el riesgo de
contaminación viral bovina sometiéndolo a procesos validados de irradiación y nanofiltración. Además, muchos componentes
obtenidos de animales y de plasma humano se someten a tratamientos químicos (tratamiento con detergentes o disolventes) o
físicos (exposición al calor durante períodos prolongados) que, mediante exhaustivos estudios de validación, han demostrado
reducir significativamente el riesgo de contaminación microbiana o viral adventicia asociada a los AM iniciales. Se prefiere utili-
zar dichos AM en procesos de fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular porque reducen significativa-
mente los riesgos asociados al material original.
Se puede reducir la complejidad de la evaluación del riesgo mediante el empleo de uno de varios métodos cuantitativos o
semicuantitativos, como el análisis de los efectos en modo de falla (FMEA, por sus siglas en inglés), el despliegue de la función
de calidad (QFD, por sus siglas en inglés), o el análisis de riesgos y punto crítico de control (HACCP, por sus siglas en inglés).
Estos programas generalmente asignan un valor puntual a cada parámetro de riesgo de un AM, que da como resultado punta-
jes acumulativos que facilitan darle prioridad al esfuerzo y los recursos para disminuir los riesgos asociados a los AM. Por ejem-
plo, un AM que tenga un fuerte perfil de seguridad y se utilice en cantidades mínimas en los pasos iniciales del proceso de
fabricación y se lave minuciosamente para eliminarlo del sistema acumula un puntaje bajo. Por el contrario, un AM que se sepa
que es tóxico y se emplee en las etapas finales del proceso presenta más posibilidades de aparecer como residuo en el produc-
to final y se le debe asignar un puntaje más alto. También se pueden asignar puntos según la clasificación del riesgo (ver
Clasificación del Riesgo).

Caracterización

Es necesario desarrollar o adoptar e implementar pruebas específicas de caracterización de control de calidad para cada AM.
El conjunto de pruebas para cada AM debe evaluar diversos atributos de calidad, entre los que se incluyen la identidad, pure-
za, funcionalidad y ausencia de contaminación microbiana o viral. El nivel de prueba apropiado para cada AM proviene de su
perfil de evaluación de riesgos y del conocimiento obtenido durante el desarrollo. Se deben establecer especificaciones de
prueba para cada AM, para asegurar la uniformidad y el funcionamiento del proceso de fabricación. Los criterios de aceptación
se deben establecer y justificar sobre la base de datos obtenidos a partir de lotes utilizados en estudios preclínicos y estudios
clínicos iniciales, de lotes empleados para demostrar la uniformidad de la fabricación y de datos pertinentes del desarrollo, co-
mo los que surgen del desarrollo de procedimientos analíticos y estudios de estabilidad.
Algunos AM de naturaleza biológica pueden ser difíciles de caracterizar totalmente. Como estos materiales ejercen su in-
fluencia a través de acciones biológicas complejas y las pruebas bioquímicas pueden no predecir el desempeño de los AM en el
proceso, puede ser necesario realizar pruebas funcionales o de desempeño. La variabilidad en el desempeño de dichos mate-
riales puede tener un efecto perjudicial sobre la potencia y la uniformidad del producto terapéutico final. Algunos ejemplos de
pruebas complejas de funcionalidad de los AM son las pruebas de promoción del crecimiento de lotes individuales de FBS en la
línea celular utilizada en la fabricación, pruebas de desempeño de preparaciones de enzimas digestivas y valoraciones in vitro
de citotoxicidad en cultivo de tejidos (ver aspectos de Pruebas de Desempeño).

Calificación del Proveedor

Se debe calificar a los proveedores de AM lo antes posible. Una auditoría temprana de las instalaciones de fabricación del
proveedor, incluyendo sus GMP y su programa de prueba de AM, son elementos básicos de un programa de calificación de un
proveedor. Para poder considerar confiable a un proveedor es esencial revisar los procedimientos de procesamiento y del pro-
grama de documentación del proveedor. Además, los proveedores certificados por medio de un programa de inspección ISO
o auditados por otros organismos gubernamentales suelen contar con sistemas de calidad robustos. Los informes de auditorías
anteriores de proveedores de EE.UU. obtenidos a través de la Ley de Libertad de Información (FOI, por sus siglas en inglés)
pueden mejorar el proceso de calificación.
Es importante establecer una buena relación de trabajo con un proveedor. En algunos casos, el proveedor puede ofrecer
normas de fabricación más exigentes, servicios de formulación de acuerdo a las especificaciones del cliente o sustitución de
componentes de calidad inferior previa solicitud, con o sin costos adicionales. Una buena relación es esencial si se justifica una
investigación más extensa de proveedores de AM. Además es crítico asegurar que el proveedor tome las medidas correspon-
dientes para evitar la contaminación cruzada entre sus productos durante la fabricación. Los proveedores deben estar familiari-
zados con los principios de validación, especialmente la validación de limpieza, al igual que la validación de inactivación viral y
la validación de esterilización. Finalmente, se deben establecer sistemas para que los proveedores suministren a los clientes cer-
tificación por escrito de cambios de procesamiento o de origen, mucho antes de la puesta en práctica de los cambios, de mo-
do que los clientes puedan evaluar sus consecuencias posibles.
774 (1043) Materiales Auxiliares/ Información General USP 37

Control de Calidad y Garantía de Calidad

Como los componentes del programa de calificación tienen varios aspectos y deben cumplir con las cGMP, deben ser con-
trolados por una unidad de garantía de calidad y control de calidad (QAU, por sus siglas en inglés). Las acciones típicas de
QAU comprenden los siguientes sistemas o programas: (1) recepción de entrada, separación, inspección y liberación de mate-
riales antes de su uso en la fabricación, (2) auditoría y certificación del proveedor, (3) pruebas de verificación del certificado de
análisis, (4) políticas y procedimientos formales para materiales que no cumplen con las especificaciones, (5) prueba de estabi-
lidad y (6) almacenamiento de muestras de archivo.

CLASIFICACIÓN DEL RIESGO

Se debe crear un programa de calificación racional y científicamente válido para cada AM, que tome en cuenta su origen y
los procesos empleados en su fabricación. Cuando estén disponibles, se prefieren los AM que sean productos terapéuticos
aprobados o autorizados porque están bien caracterizados con un perfil toxicológico probado y están fabricados según proce-
dimientos controlados y documentados. Los productos biológicos autorizados, fármacos aprobados y dispositivos médicos o
materiales implantables aprobados o autorizados que han sido incorporados en procesos de fabricación de productos celula-
res, génicos o de ingeniería tisular presentan un perfil de seguridad conocido o más favorable para el paciente que las versio-
nes no aprobadas o no autorizadas. Los programas de calificación para estos AM deben reflejar la inspección amplia y minucio-
sa de estos artículos durante su desarrollo y fabricación. En consecuencia, se debe poner mayor énfasis en la investigación del
impacto de la variabilidad inherente de estos AM sobre la función del producto final. Por ejemplo, un fabricante puede utilizar
seroalbúmina humana, destinada a ser administrada a seres humanos, como suplemento para un medio de cultivo celular para
un producto celular. Debido a que el producto celular se comercializa como un producto biológico autorizado, no es necesario
repetir todas las pruebas realizadas por el proveedor como parte de la calificación del material. Por otra parte, el efecto de la
variabilidad de un lote a otro sobre la velocidad de crecimiento celular o el mantenimiento de una propiedad celular diferen-
ciada puede ser una área de investigación aconsejable. Como alternativa, la estabilidad de este material a la concentración em-
pleada en el procesamiento o su potencial de interacción con otros componentes del proceso, también pueden ser áreas que
vale la pena investigar. En consecuencia, estos criterios respecto a la calificación de AM se concentran en los AM como una
fuente potencial de variabilidad que puede influir en la potencia y seguridad del producto final. Los programas de calificación
para estos AM deben ser amplios para minimizar el riesgo al consumidor y garantizar la detección de lotes inaceptables o adul-
terados.
El programa de calificación también debe tener en cuenta la cantidad de AM empleado en la fabricación, al igual que su
punto de introducción en el proceso de fabricación. Un ejemplo pertinente es el uso de FBS como suplemento de un medio de
cultivo de tejidos empleado para aumentar una población de células madre de un tejido específico para su eventual adminis-
tración a un paciente (ver Perspectiva General de la Fabricación en Productos de Terapia Génica y Celular (1046)). Un programa
de calificación para tal AM debe incluir (a) la garantía de que el suero proviene de un país o región que esté libre de encefalo-
patía espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en inglés); (b) la garantía de que el ganado de origen se controla y que los
resultados de las pruebas de detección de enfermedades importantes en el correspondiente entorno agrícola son negativos
(por ejemplo, tuberculosis, brucelosis, fiebre aftosa); (c) el análisis del suero para verificar su esterilidad, detectar micoplasma,
contenido de endotoxinas y virus adventicios bovinos vinculados a este material; 1 (d) la revisión y archivo del certificado de
análisis del fabricante; (e) la evaluación entre lotes de la aptitud del suero para aumentar de manera uniforme una población
celular representativa utilizando una valoración de control de calidad estandarizada para el cultivo de células; y (f) la auditoría
del proveedor en su establecimiento para asegurar que la proveniencia y el procesamiento del material sean aceptables según
una unidad QA responsable.
Para ayudar a los fabricantes y a aquellos que desarrollan el producto en el diseño de sus programas de calificación para una
variedad de AM, en las Tablas 1-4 se presentan niveles de categorías de riesgo de muestra, que se proporcionan como una
guía. El riesgo también depende de la cantidad y la etapa en la que se usa el AM en el proceso de fabricación. Las Tablas 1-4
no consideran el efecto de la cantidad ni la etapa de uso.
Nivel 1-Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales altamente calificados muy adecuados para usar en la fabrica-
ción. El AM es un producto biológico, un fármaco aprobado, un dispositivo médico aprobado o autorizado o está destinado al
uso como material biológico implantable. En general, estos componentes o materiales se obtienen como un sistema de enva-
sado estéril o forma farmacéutica para el uso que se indica en su etiqueta, pero en vez de esto se emplean para un uso "no
indicado en la etiqueta" en el proceso de fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular.
Nivel 2-Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales bien caracterizados y muy adecuados para usar en la fabrica-
ción. Están destinados para usarse en la fabricación de fármacos, productos biológicos o dispositivos médicos, incluyendo los
productos celulares, génicos y de ingeniería tisular como AM, y se producen con las cGMP pertinentes. La mayoría de materia-
les de origen animal están excluidos de esta categoría.

1 La mayoría de los proveedores realizan pruebas para detectar agentes adventicios de conformidad con 9 CFR 113, establecido por el Centro de Productos Bioló·
gicos Veterinarios, Servicio de Inspección Sanitaria Animal y Vegetal (Center far Veterinary Biologics, Animal and Plan! Health lnspection Service) del Departamento
de Agricultura de Estados Unidos. Estas pruebas pueden diferir de las utililadas para analizar productos desarrollados para uso humano (por ejemplo, micoplasma).
USP 37 Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 775

Nivel 3-Estos AM son materiales que presentan un riesgo moderado y que requieren un nivel más alto de calificación que
los anteriores. Frecuentemente, se producen para uso diagnóstico in vitro y no están destinados a la producción de productos
celulares, génicos o de ingeniería tisular. En algunos casos, puede ser necesario mejorar los procesos de fabricación del AM
para emplearlo en la fabricación de estos productos (por ejemplo, modificación del proceso de producción de un anticuerpo
monoclonal de grado diagnóstico para incluir pasos robustos de eliminación de virus en la purificación).
Nivel 4-Este es el mayor nivel de riesgo de AM. Es necesario efectuar una exhaustiva calificación antes de emplearlos en la
fabricación. El material no se produce de conformidad con las cGMP. Los AM no están destinados para la producción de pro-
ductos celulares, génicos o de ingeniería tisular. Este nivel de riesgo comprende sustancias tóxicas con mecanismos biológicos
de acción conocida y también incluye materiales líquidos más complejos, de origen animal, que no se someten a procedimien-
tos de eliminación o inactivación de virus adventicios. Estos materiales pueden requerir (a) un mejoramiento de los procesos de
fabricación del AM; (b) tratamiento del AM para inactivar o eliminar agentes adventicios, sustancias causantes de enfermeda-
des o contaminantes específicos (por ejemplo, priones, virus animales); (c) análisis de cada lote de material para asegurar la
ausencia de agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes específicos; (d) validación del proceso
de fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación de una sustan-
cia tóxica conocida o pruebas de liberación de lote capaces de demostrar niveles de reducción seguros; o (e) validación del
proceso de fabricación del producto celular, génico o de ingeniería tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación o inac-
tivación de agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes específicos asociados al material. Los
encargados de desarrollar el producto deben evaluar en las etapas iniciales de desarrollo la necesidad de estos materiales e
investigar sustancias o fuentes alternativas.
Tabla 1. Riesgo del AM Nivel 1
Materiales de Riesgo Bajo, Altamente Calificados, Destinados a Usarse como Fármaco Terapéutico o Producto Biológico,
Dispositivo Médico o Material lmplantable
Uso Común en la Fabricación de
Productos Celulares, Génicos Acciones de
Ejemplo y de Ingeniería Tisular Calificación o Reducción del Riesgo
Insulina recombinante para inyección Aditivo para medio de cultivo de células Referencia cruzada del DMF (cuando sea
posible o práctico)
Líquido conservador de órganos Líquido biológico de proceso empleado en el
Certificado de análisis
transporte o procesamiento de tejidos
Seroalbúmina humana para inyección Medio de cultivo de células Evaluar el efecto de un lote a otro sobre el
funcionamiento del proceso 1
Líquidos estériles para inyección Líquido biológico de proceso empleado en trans-
porte de tejidos, procesamiento de células, purifi- Evaluar la eliminación en el producto final
cación
Materiales biológicos implantables (estructuras de Armazones, matrices para cultivo de células inmo-
Evaluar la estabilidad del AM mientras se al-
colágeno formado, silicona, poliuretano destina- vil izadas
macena antes de usar en la fabricación 2
das a implantación quirúrgica)
Desoxirribonucleasa recombinante para inhalación Enzima de proceso empleada en la fabricación de
o inyección vectores virales, procesamiento de células madre
Antibióticos para inyección 3 Aditivo de líquido de transporte de medio de culti-
vo celular y biopsia para reducir el riesgo de con-
taminación bacteriana
Anticuerpos monoclonales inyectables Acción inmunológica dirigida a poblaciones celula-
res específicas para su selección o eliminación
Citocinas inyectables Medio de cultivo de células
Vitaminas para inyección; nutrientes, sustancias Aditivo de medio de cultivo de células empleado
químicas o excipientes definidos para inyección en la expansión de células, la diferenciación celu-
lar controlada y pasos de activación o fabricación
de un vector viral
Bolsas IV, tuberías y equipos de transferencia, bol- Sistemas de cierre de recipientes de almacena-
sas para crioconservación, jeringas, agujas miento, sistemas cerrados de transferencia asépti-
ca
1 Ver Pruebas de Desempeño.
2 A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferen-
tes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación de la actividad del AM en las
condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación.
3 No se deben usar antibióticos beta lactámicos como AM, debido al riesgo de hipersensibilidad del paciente.
 r
776 (1043) Materiales Auxiliares/ Información General USP 37

Tabla 2. Riesgo del AM Nivel 2

Materiales de Riesgo Bajo, Bien Caracterizados, Destinados a Usarse como AM, Producidos de Conformidad con las GMP
Uso Típico en la Fabricación
de Producto Celular, Génico Acciones de Calificación o
Ejemplo o de Ingeniería Tisular Reducción del Riesgo
Factores de crecimiento recombinantes, citocinas 1 Aditivo de medio de cultivo de células Referencia cruzada del DMF (cuando sea
posible o práctico)
Perlas inmunomagnéticas Separación inmunomagnética de células Certificado de análisis
Suero humano AB Aditivo de medio de cultivo de células Evaluación del efecto de un lote a otro so-
bre el funcionamiento del proceso 2
Progesterona, estrógeno, vitaminas, sustancias quí- Aditivos de medio de cultivo de células, agentes de
Evaluación de la eliminación en el producto
micas purificadas (grado USP) inducción, componentes de soluciones amorti-
final
guadoras
Soluciones amortiguadoras para procesos estériles Líquido biológico de proceso empleado en el Evaluación de la estabilidad del AM mien-
transporte de tejidos, procesamiento de células, tras se almacena antes de usarse en la fa-
purificación bricación 3
Polímeros, armazones e hidrogeles biocompatibles Armazones, matrices para cultivo de células inmo- Cuando sea pertinente, confirmar los resul-
vil izadas tados de la prueba del certificado de análi-
sis que sean esenciales para el producto
(podría incluir la valoración funcional)
Enzimas proteolíticas Enzima de proceso Auditoría al proveedor
Medios de cultivo de tejidos Aditivo de medio de cultivo de células
Anticuerpos monoclonales Acción inmunológica dirigida a poblaciones celula-
res específicas para su selección o eliminación
Medios de gradiente de densidad Separación de células por centrifugación
1 Estos AM se deben producir a partir de fuentes recombinantes, que no sean de mamíferos (es decir, desarrollados microbiológicamente en ausencia de com-
ponentes de origen animal en los medios de cultivo).
2 Ver Pruebas de Desempeña.
3 A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferen-
tes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación o actividad del AM bajo las
condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación.

Tabla 3. Riesgo del AM Nivel 3

Materiales de Riesgo Moderado, No Destinados a Usarse como AM
(frecuentemente producidos para su uso en diagnóstico In vltro o materiales grado reactivo)
Uso Típico en la Fabricación
de Productos Celulares, Génicos o de
Ejemplo Ingeniería Tisular
Factores de crecimiento recombinantes, citocinas Aditivo de medio de cultivo de células
Medios de cultivo de tejidos Aditivo de medio de cultivo de células
Anticuerpos monoclonales (de grado diagnóstico Acción inmunológica dirigida a poblaciones celula-
producidos en cultivo de células) res específicas para su selección o eliminación
Soluciones amortiguadoras de proceso Líquido biológico de proceso empleado en el
transporte de tejidos, procesamiento celular, puri-
ficación
Nuevos polímeros, armazones, hidrogeles Armazones, matrices para cultivo de células inmo-
vil izadas
1 Ver Pruebas de Desempeño.
2 A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferen-
tes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación o actividad del AM bajo las
condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación.
Acciones de Calificación o
Reducción del Riesgo
Referencia cruzada del DMF (cuando sea
posible o práctico)
Certificado de análisis
Evaluación del efecto de un lote a otro so-
bre el funcionamiento del proceso 1
Evaluación de la eliminación en el producto
final
Evaluación de la estabilidad del AM mien-
tras se almacena antes de usarse en la fa-
bricación 2
Cuando sea pertinente, confirmar los resul-
tados del certificado de análisis que sean
esenciales para el producto (podría incluir
la valoración funcional)
Auditoría al proveedor
Mejorar el proceso de fabricación del mate-
rial según las GMP
Elaborar especificaciones internas estrictas
Determinar si son necesarias las pruebas de
biocompatibilidad, citotoxicidad o detec-
ción de agentes adventicios, de un lote a
otro
USP 37 Información General/ (1043) Materiales Auxiliares 777

Tabla 3. Riesgo del AM Nivel 3

Materiales de Riesgo Moderado, No Destinados a Usarse como AM
(frecuentemente producidos para su uso en diagnóstico in vitro o materiales grado reactivo) (Continuación)
Uso Típico en la Fabricación
de Productos Celulares, Génicos o de Acciones de Calificación o
Ejemplo Ingeniería Tisular Reducción del Riesgo
Enzimas proteolíticas Enzima de proceso
Sustancias químicas purificadas (grado reactivo) Aditivos de medio de cultivo, agentes de induc-
ción, componentes de soluciones amortiguadoras
1 Ver Pruebas de Desempeño.
2 A menudo los AM se conservan en alícuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferen-
tes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservación o actividad del AM bajo las
condiciones que sean específicas a su uso en la fabricación.

Tabla 4. Riesgo del AM Nivel 4

Materiales de Alto Riesgo
Uso Típico en un Producto Celular, Génico,
Ejemplo o de Ingeniería Tisular
FBS Aditivo de medio de cultivo de células
Extractos de origen animal (incluyendo humano) Aditivo de medio de cultivo de células
Polímeros, armazones e hidrogeles de origen ani- Armazones, matrices para cultivo de células inmo-
mal vil izadas
Enzimas purificadas Enzima de proceso
Anticuerpos o proteínas derivados de ascitis Acción inmunológica dirigida a poblaciones celula-
res específicas para su selección o eliminación
Células humanas o animales utilizadas como capas Sustrato de cultivo de células o fuente de campo-
de alimentación nentes de medios
Acciones de Calificación o
Reducción del Riesgo
Igual que en Tabla 3, más
Verificar la rastreabilidad al país de origen
Asegurar que el país de origen esté califica-
do como seguro con respecto a enferme-
dades animales pertinentes a la fuente, in-
cluida TSE (por sus siglas en inglés)

Entidades químicas con toxicidad conocida (p.ej. Agentes de selección utilizados en cultivo de célu-
metotrexato, toxina de cólera, hemolisina forma- las para mejorar o mantener la expresión transgé- Pruebas de detección de agentes adventi-
dora de poros de Staphylococcus aureus; enteroto- nica, aumentar la proliferación celular, mejorar la cios para detectar virus pertinentes a la
xinas A y B de Staphylococcus, toxina del síndrome supervivencia celular durante la crioconservación, fuente de origen animal
de shock tóxico) superantígenos para la activación de linfocitos T

PRUEBA DE DESEMPEÑO

En los casos en que los AM se eligen por su capacidad para proporcionar una cierta función biológica en la elaboración del
producto terapéutico, la prueba de desempeño se torna un componente fundamental de su calificación general. Esto es parti-
cularmente cierto cuando el AM desempeña un papel crítico en la modulación de un efecto bioquímico complejo y ejerce un
gran impacto sobre el rendimiento de la fabricación del producto, su pureza o la potencia del producto final. Estos AM tienden
a ser sustancias o mezclas complejas, frecuentemente de origen biológico y pueden presentar gran variabilidad entre lotes.
Como resultado, estos AM en general no tienen una prueba de identidad simple, ni pueden ser fácilmente caracterizados por
pruebas físicas o químicas. El desarrollo de valoraciones de desempeño bien definidas para AM complejos no sólo asegura la
reproducibilidad del proceso y la calidad del producto final, sino que en muchos casos también cumple con los criterios de
pruebas de identidad conforme a 21 CFR 211.84(d).
En algunos casos, la calificación inicial de un AM para usarse en la fabricación debe ser la investigación del efecto que tiene
la cantidad del AM sobre la respuesta deseada (aumento del rendimiento, pureza o potencia del producto terapéutico). La
cantidad de AM empleada en la fabricación debe ser seleccionada para que produzca el efecto deseado de manera uniforme, a
la vez que minimice los problemas mediante la eliminación del AM en los pasos subsiguientes del procesamiento. Dicha prue-
ba a menudo evalúa el atributo funcional importante que se espera del AM en un proceso de fabricación a escala reducida o
simulado. A continuación se indican algunos ejemplos:
• Si un AM se agrega a los medios de cultivo porque favorece la proliferación celular o la secreción de un agente terapéuti-
co esencial, la valoración podría demostrar que cada lote de AM produce la velocidad o cantidad esperada de prolifera-
ción celular o el nivel esperado de agente terapéutico segregado.
• Si se usa un anticuerpo monoclonal para purificar un cierto tipo de célula, se podría demostrar que el nuevo lote de anti-
cuerpo monoclonal purifica la población celular con la recuperación y pureza esperada para el tipo de célula deseado.
• Si se usa una desoxirribonucleasa para descomponer el ADN celular, se podrían analizar los nuevos lotes para verificar la
capacidad de la desoxirribonucleasa para descomponer el ADN.
• Si se usa un tipo especial de gradiente de densidad para purificar un vector o célula, se podría demostrar que los nuevos
lotes del material utilizado para obtener el gradiente pueden purificar el vector o célula hasta un grado satisfactorio.
• Si se usa un plásmido o vector viral en la producción de un vector de terapia génica (por ejemplo, función auxiliar), se
podría demostrar que los nuevos lotes del vector auxiliar producen las cantidades esperadas del vector de terapia génica.
• Si se produce terapia celular en un biorreactor de fibra hueca, se podría demostrar que los nuevos lotes del biorreactor
producen la cantidad prevista de producto celular.
778 (1043) Materiales Auxiliares / Información General USP 37

La valoración usada podría evolucionar a medida que el proceso de fabricación se desarrolla y las relaciones críticas entre el
AM y el producto final se comprendan mejor.
Debido a que la mayoría de las pruebas de desempeño producen resultados relativos, a menudo resulta útil valorar un lote
nuevo de AM conjuntamente con un lote aprobado de AM o un estándar de referencia oficial, si se dispone de alguno. La
comparación simultánea ayuda a reducir la variabilidad debida a diferentes lotes de células o vectores y ayuda a distinguir la
variabilidad asociada a los diferentes lotes de AM. Si la prueba de desempeño implica valoraciones para demostrar que el nue-
vo lote de AM no afecta el perfil de impurezas del producto terapéutico final, ya sea generando nuevas impurezas o aumentan-
do el nivel de impurezas existentes, es útil valorar ambos respecto al nivel de impurezas totales, al igual que buscar la presencia
de nuevas impurezas. Un análisis de inmunodetección en general puede evaluar solamente el nivel de impurezas totales. Por
ejemplo, un Western blot del producto de terapia génica que se investiga tanto con anticuerpos del producto como con anti-
cuerpos de proteínas de células anfitrionas, es útil para detectar nuevas especies de proteínas y aumentos significativos de los
niveles de impurezas de las células anfitrionas. Esta calificación inicial se incrementa por medio de una valoración de desempe-
ño que tiene una lectura cuantitativa con un cambio marcado en la señal cuando se introduce en la valoración un cambio
importante en la cantidad de AM (por ejemplo, respuesta de dosis). Una respuesta tipo umbral (es decir, hay dos niveles de
respuesta para el AM y la respuesta no cambia ni con cambios grandes en el AM por debajo de una dosis determinada ni por
encima de una dosis determinada) puede hacer más difícil seleccionar una concentración de AM que dé como resultado el
efecto deseado de manera uniforme y minimice los niveles residuales del AM en el producto terapéutico final.

EVALUACIÓN V ELIMINACIÓN DEL NIVEL RESIDUAL DE MATERIALES AUXILIARES

Los AM no están destinados a estar presentes en la forma farmacéutica final en los productos celulares, génicos y de ingenie-
ría tisular. Su presencia en el producto final podría provocar efectos indeseables en la persona que los reciba o tener un efecto
perjudicial en la potencia del producto. Los efectos indeseables en seres humanos consisten en la toxicidad directa del AM o en
una respuesta inmunogénica no deseada. Algunos ejemplos incluyen lo siguiente:
•Al generar una vacuna contra un tumor utilizando una biopsia de tumor de un paciente como material inicial, se introdu-
ce una entidad química para desnaturalizar las proteínas de la superficie celular y los antígenos del tumor para aumentar
su antigenicidad. Se sabe que la entidad química es muy tóxica.
• Se pueden agregar antibióticos a una solución de transporte para células humanas para contrarrestar la contaminación
microbiana asociada con el procedimiento de obtención. Los niveles residuales del antibiótico pueden afectar la capaci-
dad de proliferación del producto celular final producido por bioingeniería. Los antibióticos residuales también pueden
provocar una respuesta anafiláctica en algunos individuos.
• El FBS, empleado en el cultivo de un injerto de piel humana realizado mediante bioingeniería, puede provocar una res-
puesta de anticuerpos humorales contra las proteínas bovinas.
• Las inmunoglobulinas aglomeradas de ratón, una traza de impureza en una preparación purificada de anticuerpo mono-
clonal de ratón dirigido contra una población celular para inmunoselección, pueden ser inmunógenas.
• Una citocina empleada como inmunomodulador en la creación de una vacuna autóloga contra tumores producida por
modificación génica, puede provocar una reacción grave en el receptor.
• La toxina del cólera, empleada como parte de un medio de cultivo celular para un producto de terapia celular destinado a
la administración intravenosa, resultará sumamente tóxica para el receptor si no se elimina durante el procesamiento.
Estos riesgos se pueden mitigar si se diseñan procesos que incluyen pasos de eliminación satisfactoria del AM, mediante dilu-
ción, separación o inactivación, y se desarrollan valoraciones de detección analítica para evaluar los niveles de AM durante el
procesamiento y en el producto terapéutico final. Las estrategias de evaluación y eliminación de AM residuales se deben consi-
derar en las fases iniciales del desarrollo del proceso. Hay dos métodos diferentes para evaluar los niveles de AM residual en el
producto terapéutico final: (1) Los estudios de validación pueden demostrar que el proceso es capaz de eliminar más del AM
de lo que estaría presente en el peor caso hipotético. (2) Los niveles residuales de un AM se pueden medir en cada lote en un
paso apropiado durante el proceso de fabricación.
La validación de un AM con frecuencia se realiza mejor agregando al producto impuro con el "peor caso" o niveles superio-
res de AM y demostrando que el proceso de purificación es capaz de eliminar el AM hasta "niveles no detectables". De este
modo se pueden generar factores de depuración para cada paso de purificación de manera análoga a la realizada en estudios
de depuración viral. Al diseñar los estudios de validación se deben incluir los tres factores siguientes: (1) La valoración debe ser
capaz de cuantificar con exactitud el AM en cada matriz de muestra. (2) Si la validación se lleva a cabo a una escala menor que
la utilizada en la producción de lotes de rutina, es necesario demostrar la comparabilidad entre este proceso en pequeña escala
y el proceso completo. En general esto significa que el proceso en pequeña escala se realiza con los mismos parámetros críticos
que el proceso completo y que el producto generado en cada paso tiene una pureza y rendimiento similares. (3) Igual que con
cualquier tipo de estudio con muestras adicionadas, se debe demostrar que el nivel adicional más alto de AM no ha afectado el
proceso de purificación. Si se emplea el segundo método de medición de niveles residuales de AM en cada lote, la especifica-
ción de la cantidad máxima de AM en el producto terapéutico final se basa en la cantidad de AM en los lotes utilizados en
estudios toxicológicos o clínicos o en datos toxicológicos conocidos.
El desarrollo de valoraciones analíticas sensibles y reproducibles para AM es otro componente importante de un método de
reducción del riesgo. Dos tipos de valoraciones son útiles en la evaluación de los niveles de impurezas residuales de AM: una
prueba límite y una prueba cuantitativa. Ambas pruebas deben ser exactas, precisas, robustas y tener un límite de detección
USP 37 Información General/ (1043> Materiales Auxiliares 779

bajo. Se pueden llevar a cabo valoraciones para detectar AM residuales en el producto antes de formularlo (por ejemplo, en el
fármaco) para evitar cualquier tipo de interferencia de los componentes empleados en la formulación con la valoración de AM
residuales o en el producto farmacéutico final. En dichas valoraciones a menudo se incluyen controles de recuperación de can-
tidades agregadas conocidas para demostrar que la matriz de muestra no inhibe la detección del AM. Preferentemente, las
valoraciones se deben diseñar para que detecten todas las formas de AM, entre las que se incluyen aglomerados, fragmentos o
conjugados. Se ha demostrado que las proteínas aglomeradas son especialmente inmunógenas.
Las valoraciones inmunológicas como ELISA son las más comúnmente usadas para evaluar niveles residuales de AM. Se ha
empleado un ELISA para seroalbúmina bovina (BSA) para evaluar niveles residuales de FBS. La tecnología de reacción en cade-
na de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), se ha utilizado para evaluar los niveles residuales de ADN de células anfitrio-
nas. El marcado de células con 3 H timidina o la ejecución de PCR para una secuencia génica específica de células de soporte
son dos maneras de evaluar los niveles residuales de células de soporte. Si el "lavado" del AM se logra mediante una minuciosa
dilución asociada a otras acciones de procesamiento, puede resultar útil calcular el factor de dilución para el AM durante este
proceso. En algunos casos, es suficiente asegurar que el AM se redujo a niveles seguros para el desarrollo clínico inicial. Duran-
te el desarrollo clínico posterior se deben obtener datos que permitan confirmar la eliminación por lavado del AM en los pasos
esperados. Este método es particularmente útil cuando ya se conocen los niveles terapéuticos y la toxicidad del AM. En otros
casos, se debe obtener información sobre la seguridad y tolerancia del AM (en estudios preclínicos de toxicología o posterior-
mente con estudios clínicos en seres humanos) para determinar los niveles seguros o no tóxicos que se deben lograr. Estos
datos pueden ser necesarios incluso para un AM que esté aprobado para usar con fines terapéuticos si se va a utilizar de una
forma diferente a la que establece su uso indicado o su etiquetado o si la vía de administración o nivel de dosificación del AM
puede presentar riesgos que previamente no se han encontrado o considerado.

CONCLUSIÓN

Si bien se emplean muchos tipos de AM durante la fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular, se les
ha dado menos importancia que a los productos finales. Sin embargo, no se puede exagerar la importancia de la calidad del
AM para la calidad del producto final. Las diferentes partidas de AM de buena calidad deben cumplir uniformemente con las
características de desempeño indicadas, si se seleccionan cuidadosamente y se usan como corresponde. Los AM de calidad
insuficiente afectan la calidad y la eficacia del producto final y ponen en peligro la salud de los pacientes. En consecuencia, la
implementación de un programa de calificación de AM que considere los riesgos asociados al AM, la etapa de fabricación en la
que se use y la cantidad de AM utilizado durante la fabricación, asegurará la seguridad y eficacia del producto final.

APÉNDICE

Los AM utilizados en productos celulares, génicos y de ingeniería tisular se regularán en el contexto del proceso de fabrica-
ción de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular. Algunos AM pueden ya estar aprobados para usos diferentes a la
fabricación de productos celulares, génicos y de ingeniería tisular. Se prefiere obtener AM que sean productos terapéuticos
aprobados cuando estén disponibles porque están bien caracterizados con un perfil toxicológico establecido y fabricados se-
gún procedimientos controlados y documentados. La siguiente lista de documentos ofrece una guía normativa pertinente y
una descripción de las mejores prácticas en el desarrollo de productos y procesos, fabricación, control de calidad y garantía de
calidad:
• Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87)
• Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88)
•Artículos Obtenidos por Biotecnología (1045)
• Productos de Terapia Génica y Celular (1 046)
• Artículos Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1 052)
• Electroforesis Capilar (1053)
•Artículos Obtenidos por Biotecnología-/soelectroenfoque (1054)
• Artículos Obtenidos por Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055)
• Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1 056)
•Artículos Obtenidos por Biotecnología-Va/oración de Proteínas Totales (1057)
•21 CFR211 SubparteE,211.80a211.94y211.101
• 21 CFR 312
•21CFR314
•21 CFR801.109(b)(l)
• 21 CFR 807.81 a 21 CFR 807.97
• 21 CFR 812
•21 CFR814
• Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA (CBER) "Draft Guidance for Monoclonal Antibodies Used as Rea-
gents in Drug Manufacturing" (1999)
• Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA (CBER) "Points to Consider in the Characterization of Cell Lines
Used to Produce Biologicals" (1993)
780 (l 043) Materiales Auxiliares / Información General USP 37

• Center for Devices and Radiological Health de la FDA (CDRH) "Class 11 Special Controls Guidance Document: Tissue Cultu-
re Media for Human ex vivo Tissue and Cell Culture Processing Applications; Final Guidance for lndustry and FDA Revie-
wers" (16 de mayo de 2001)
• CDRH Blue Book Memorandum G95- l
• ISO 10993-1: 1997 Evaluación Biológica de Dispositivos Médicos-Parte 1: Evaluación y Análisis "Biological Evaluation of
Medical Devices-Part 1: Evaluation and Testing"
• Conferencia Internacional de Armonización (ICH, por sus siglas en inglés) QSA "Guidance for Viral Safety Evaluation of
Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human and Animal Origin"
•Conferencia Internacional de Armonización (ICH) QSD "Guidance on Quality of Biotechnological/Biological Products: De-
rivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products"
• Public Health Service Guideline on lnfectious Diseases lssues in Xenotransplantation (18 de octubre de 2000)

(1045) ARTÍCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA

Las sustancias macromoleculares se pueden obtener mediante varios métodos, entre ellos la extracción desde fuentes natu-
rales, la modificación de proteínas de origen natural, el cultivo in vitro o in vivo de células de mamíferos, la producción me-
diante microorganismos y la síntesis química. Desde el punto de vista de la Farmacopea, los artículos constituidos por macro-
moléculas que se obtienen a partir de procesos biotecnológicos-o más específicamente a partir de la tecnología de ADN re-
combinante (ADNr), la tecnología de hibridomas y líneas celulares continuas transformadas-son artículos que tienen nombres
oficiales y normas públicas oficiales para establecer su identidad, contenido (potencia), calidad y pureza. Los avances logrados
en genética y en las aplicaciones de la ingeniería genética han permitido que la producción de artículos macromoleculares
existentes y nuevos sea tecnológica y económicamente factible.
Se han documentado ampliamente las tecnologías utilizadas para producir una proteína mediante procesos biotecnológicos
y el gobierno federal ha establecido pautas generales. Los productos biotecnológicos pueden reglamentarse como fármacos,
productos biológicos o de diagnóstico, según su origen, su composición y el uso al que estén destinados. La biotecnología
permite nuevos enfoques que pueden dificultar la aplicación de las definiciones clásicas de estas categorías; por consiguiente,
la FDA ha aconsejado a los fabricantes que soliciten aclaraciones en las primeras etapas de desarrollo, para determinar cómo se
reglamentará un producto cuando no es obvia su clasificación. 1 El esquema regulatorio general para los productos obtenidos
mediante biotecnología es el mismo que para los productos de la misma categoría producidos por métodos de fabricación
tradicionales, con la adición de requisitos específicos adecuados para los productos obtenidos por biotecnología. Los requisitos
generales se describen principalmente en las partes correspondientes del Código de Reglamentaciones Federales, Título 21.
Los Institutos Nacionales de la Salud (National lnstitutes of Health o NIH) han publicado pautas relativas a la investigación de
ADNr que son obligatorias para cualquier investigación, tanto de carácter público como privado, subvencionada por los NIH.
Estas pautas tienen amplia aceptación y es frecuente que instituciones y empresas que no se encuentran específicamente bajo
su jurisdicción las cumplan voluntariamente. 2 Las prácticas de seguridad para laboratorios, en particular la protección contra
materiales potencialmente infecciosos, son un motivo de preocupación. 3 La producción de artículos macromoleculares me-
diante procesos biotecnológicos consiste inicialmente en la clonación de un gen específico en el laboratorio, o en la construc-
ción de un gen sintético, con su posterior inserción en una célula anfitriona y su subclonación en un microorganismo o cultivo
celular; luego, se lleva a cabo un desarrollo de proceso a escala piloto para optimizar su rendimiento y calidad y, finalmente,
tienen lugar la fermentación o los procesos de cultivo celular a gran escala. El paso siguiente, que es el más importante en el
desarrollo de las monografías farmacopeicas, es la purificación de las proteínas macromoleculares. Luego siguen pruebas en
animales, pruebas clínicas, la aprobación reglamentaria y la comercialización del producto.
Por lo general, el desarrollo de normas públicas adecuadas para estos artículos macromoleculares está estrechamente vincu-
lado a la tecnología de procesamiento empleada y a las características fisicoquímicas y biológicas de un fármaco específico. En
las caracterizaciones de estos artículos para asegurar su seguridad, pureza y actividad se deben incorporar técnicas clásicas así
como métodos específicos a esa tecnología. Existe siempre la posibilidad de que estos artículos puedan causar efectos secunda-
rios en los pacientes que los emplean debido a una sensibilización inmunológica como resultado de una única (o múltiple)
modificación molecular. Esta posibilidad requiere una caracterización precisa de estas sustancias. Aunque teóricamente es posi-
ble elaborar normas públicas para un artículo macromolecular, no es posible desarrollar normas específicas que contemplen
todos los métodos de producción. La perspectiva de la Farmacopea es elaborar normas públicas que puedan aplicarse a un

1 Existe una serie de documentos titulados Points to Consider (Puntos a Tener en Cuenta) que pueden solicitarse al Director de la FDA a la siguiente dirección:
Director, FDA Center for Biologics Evaluation and Research, HFB-1, 8800 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892.
2 Estas pautas se publicaron originalmente en el Diario Oficial (Federal Register), Cuidelines far Reseorch lnvolving Recombinan/ ONA Molecules (Pautas para la Inves-
tigación de Moléculas de ADN Recombinante) 1986; 51 (88): 16957-16985. Se pueden obtener copias en: Office of Recombinant DNA Activities, 12441 Parklawn
Orive, Suite 58, Rockville, MD 20852.
3 Existen unas pautas integrales, Biosafety in Microbiologicol and Biomediw/ Loboratories (Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biornédicos), que pueden
solicitarse a: Superintendent of Documents, U.S. Government Pri11ting Office, Washington, DC 20402, N 107-040-000508-3.
USP 37 Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 781

producto final y que aseguren el mantenimiento de su seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza aun cuando no exista
un conocimiento total de los detalles de su producción.
Las pruebas de identidad, pureza y actividad normalmente requieren el uso de Estándares de Referencia USP. Es necesario
tener en cuenta qué Estándares de Referencia USP podrían requerirse y cuál podría ser su pertinencia con respecto al método
de producción y su relación con las características de un producto final. Estas decisiones deben tomarse en forma individual
según cada producto. Se considera deseable el uso de Estándares de Referencia USP representativos de los productos específi-
cos que se han evaluado mediante pruebas clínicas y que están plenamente caracterizados.
Aunque la temprana incorporación de métodos generales de análisis de fármacos macromoleculares en la USP podría con-
ducir a una rápida estandarización de los métodos, la tecnología y los procedimientos analíticos están evolucionando muy rá-
pidamente. Los procedimientos analíticos-químicos, físicos, microbiológicos e inmunológicos-se incluyen en las monografías
específicas de cada producto.

EL ALCANCE DE LA BIOTECNOLOGÍA EN EL DESARROLLO DE ARTÍCULOS FARMACOPEICOS

Definición de Biotecnología-Perspectiva Histórica

En su definición más amplia, la biotecnología se refiere al uso de organismos vivos, incluyendo células aisladas de mamíferos,
para la elaboración de productos beneficiosos. Esta definición colocaría al alcohol, la producción de antibióticos y el procesa-
miento de lácteos, por ejemplo, dentro del espectro de la biotecnología. Sin embargo, el interés generado en la actualidad por
la biotecnología es fundamentalmente el resultado de dos importantes avances. El primero fue el desarrollo de la tecnología de
ADNr, que permite trasplantar genes de una especie a otra. De esta manera, el gen que codifica la expresión de una proteína
deseada (generalmente humana) podría insertarse en una célula anfitriona procariótica o eucariótica de manera que la célula
anfitriona exprese posteriormente cantidades utilizables de la proteína deseada. El segundo gran avance fue el desarrollo de
técnicas para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (es decir, anticuerpos provenientes de un solo linfoci-
to).
La biotecnología dentro de la industria farmacéutica se refiere, en general, a la elaboración de productos proteicos emplean-
do técnicas de ADNr o a la producción de anticuerpos monoclonales. Otras tecnologías, como por ejemplo los animales y las
plantas transgénicos, la terapia génica y el ADN con una secuencia en dirección antiparalela (de antisentido), podrían tener
consecuencias para la industria farmacéutica en el futuro pero no están dentro del alcance de este capítulo.

Tecnología ADNr

En esta sección se describen los pasos principales para la aplicación de la tecnología ADNr a la producción de una proteína
deseada. El primer paso crítico es la identificación de la proteína que se desea producir y, luego, el aislamiento del gen corres-
pondiente (es decir, la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada). Una vez aislado y caracterizado totalmente, este
gen se inserta en un vector apropiado, como por ejemplo un plásmido, que es un segmento extracromosómico de ADN que
suele encontrarse en determinadas bacterias. A continuación, se inserta el plásmido en la célula anfitriona. Se aíslan los clones
de la línea celular anfitriona transformada y aquellos que producen la proteína de interés en las cantidades deseadas se conser-
van como un banco de células bajo condiciones apropiadas. A medida que las necesidades de fabricación aumentan, se puede
aumentar la cantidad de células clonadas mediante un proceso de fermentación o de cultivo celular para obtener el producto
proteico.
Aunque el proceso de ADNr se describe más detalladamente en otra parte de este capítulo, se debe prestar atención a los
siguientes puntos clave. El vector (plásmido) contiene, en general, un marcador que se puede emplear para identificar las célu-
las que contienen este gen. Este se incluye además del gen codificador de la proteína de interés y las secuencias de nucleótidos
regulatorias necesarias para la replicación del plásmido y la transcripción del ARN mensajero (ARNm) (el primer paso en la sín-
tesis de proteínas). La selección de las células deseadas se simplifica dado que sólo las células correctamente transformadas que
contienen el gen marcador seleccionable sobrevivirán bajo las condiciones de cultivo usadas para identificar y reproducir las
células transformadas. Por lo general, los marcadores bacterianos y eucarióticos seleccionables pueden incluir la resistencia a
antibióticos y genes que complementan una mutación auxotrófica de la célula anfitriona. Hay numerosos ejemplos de ambos
tipos de marcadores en cada sistema.
Existen diferencias significativas entre las células procarióticas y eucarióticas en el proceso de producción de ADNr. En gene-
ral, las células bacterianas expresan una mayor concentración de producto proteico y requieren medios relativamente sencillos.
Sin embargo, las células procarióticas no realizan muchas modificaciones importantes posteriores a la traducción, como por
ejemplo la glicosilación e, históricamente, no ha sido posible expresar proteínas grandes en E. coli. Estas limitaciones requieren,
en muchos casos, el uso de células eucarióticas. Las diferencias de producción entre las células anfitrionas eucarióticas y proca-
rióticas tienen repercusiones importantes que se reflejan en los requisitos para la validación de procesos, la purificación y la
metodología analítica. Estos requisitos se tratan más adelante en este capítulo.
 ,.
782 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ Información General USP 37

Anticuerpos Monoclonales

Los anticuerpos son proteínas producidas por linfocitos B diferenciados. Cada linfocito produce un anticuerpo de especifici-
dad definida (es decir, la molécula de anticuerpo reconoce un sitio específico o epítopo en el antígeno). Los anticuerpos que se
producen en animales inmunizados se forman a partir de muchos clones diferentes de linfocitos B, de donde deriva el término
anticuerpos policlonales. Dado que al tomar sangre de estos animales se obtienen, por definición, mezclas de anticuerpos poli-
clonales, los antisueros tienen sitios de reconocimiento de epítopos múltiples con una amplia variedad de constantes de unión
(avidez) y, en consecuencia, varían de un lote a otro. Los anticuerpos que se producen a partir de líneas de células inmortaliza-
das (hibridomas) provenientes de una única célula B se denominan anticuerpos monoclonales. La cosecha de estos cultivos
conduce a un anticuerpo de reconocimiento específico de un epítopo con una constante de unión homogénea.
Los linfocitos B tienen una vida finita en cultivo y es necesario inmortalizarlos para permitir la producción continua de anti-
cuerpos monoclonales. En la actualidad, el procedimiento más común es mediante la fusión químicamente provocada de una
célula esplénica de ratón con una célula de mieloma de ratón. La célula hibridoma ratón-ratón resultante hereda de la célula
del mieloma la capacidad de replicarse continuamente en cultivo y de la célula esplénica, la capacidad de producir el anticuer-
po monoclonal deseado. Los bancos de células de la línea de células hibridoma pueden emplearse para producir un suministro
continuo del anticuerpo monoclonal, ya sea in vivo (es decir, mediante la inyección en ratones seguida de la recolección del
líquido ascítico) o in vitro (es decir, mediante técnicas de cultivo celular convencionales). Cabe mencionar que los recientes
avances en genética molecular han llevado al desarrollo de transfectomas y esquemas de producción basados en E. coli y bac-
teriófagos que pueden ofrecer ventajas en la producción futura de anticuerpos monoclonales.
La validación de procesos, la purificación y las observaciones analíticas para anticuerpos monoclonales son conceptualmente
similares a las empleadas en los productos de ADNr. Esto se debe a que ambos tipos de productos son proteínas y, en conse-
cuencia, requieren un manejo y un procedimiento de valoración similares. Como los anticuerpos monoclonales son el produc-
to de líneas de células inmortalizadas, es importante excluir o desactivar eficazmente los posibles contaminantes del ácido nu-
cleico viral durante los procesos de fabricación, como en el caso de los productos recombinantes de líneas celulares continuas.
Las aplicaciones comerciales de anticuerpos monoclonales incluyen el uso terapéutico y de diagnóstico. En algunos casos, el
anticuerpo monoclonal se acopla a otra sustancia (por ejemplo, un agente oncolítico, un radionucleido o una toxina), resultan-
do un anticuerpo conjugado que es el producto final de interés. En este caso, tanto el anticuerpo intermedio como el producto
final requieren un extenso desarrollo de procesos y caracterización analítica.
En este capítulo, el alcance de la biotecnología se limitará a los productos farmacéuticos de anticuerpos monoclonales y
ADNr.

PROCESOS DE PRODUCCIÓN CARACTERÍSTICOS

La principal diferencia entre los productos obtenidos por biotecnología y otros productos farmacéuticos consiste en los me-
dios de producción para generar el producto. La biotecnología emplea organismos vivos genéticamente modificados para pro-
ducir proteínas o productos peptídicos. Esta afirmación es válida tanto para productos derivados de ADNr como para produc-
tos derivados de anticuerpos monoclonales. En consecuencia, los productos obtenidos por biotecnología se diferencian fácil-
mente de las proteínas o los péptidos que se han obtenido por aislamiento de materiales de origen natural, como por ejemplo
plasma, suero o tejido, o por síntesis química.
Los productos obtenidos por biotecnología no son significativamente diferentes de otros fármacos proteicos después del
proceso de purificación de proteínas. Por lo tanto, los requisitos básicos para la validación de procesos, el control ambiental, la
fabricación aséptica y los sistemas de control de calidad y garantía de calidad son fundamentalmente los mismos para todos
los productos farmacéuticos. Sin embargo, la complejidad de estos sistemas suele ser mayor para los productos obtenidos por
biotecnología ya que su producción requiere, por lo general, procesos de propagación de células altamente desarrollados, mé-
todos de purificación complicados y un control analítico para asegurar su homogeneidad, uniformidad entre lotes y seguridad.
Esta sección describe con cierto detalle sólo aquellos factores significativos característicos del procesamiento de productos
obtenidos por biotecnología. Entre ellos se encuentran las descripciones de los distintos sistemas de producción biológicos uti-
lizados actualmente y un análisis de los problemas relacionados con la purificación.

Producción de ADNr

En la actualidad, los productos de ADNr se generan en sistemas procarióticos (bacterias) o eucarióticos (por ejemplo, levadu-
ras o cultivo de células de mamíferos). Por lo general, la elección del organismo de producción depende directamente de la
complejidad molecular de la proteína que se va a producir, así como de la economía y eficiencia de la fermentación o el cultivo
celular. Los primeros productos obtenidos por biotecnología se produjeron en E. coli debido a la amplia comprensión de su
biología molecular. En los últimos años, sin embargo, el uso del cultivo de células eucarióticas a gran escala se ha vuelto relati-
vamente común.
USP 37 Información General/ \1045; Artículos Obtenidos por Biotecnología 783

PRODUCCIÓN EN CÉLULAS PROCARIÓTICAS (BACTERIAS)

La producción bacteriana de productos obtenidos por biotecnología ofrece varias ventajas características, así como ciertas
desventajas. Como se ha señalado antes, se ha estudiado y documentado ampliamente la biología bacteriana y el uso seguro y
eficaz de E. coli como organismo anfitrión en la producción. Por lo tanto, la expresión de una proteína nueva en E. coli, cuando
es posible, suele ser más fácil que en otros sistemas de expresión teóricamente más apropiados. Esta ventaja puede verse ate-
nuada, sin embargo, por el hecho de que E. coli produce proteínas generalmente en un estado químicamente reducido. Para
plegarse adecuadamente, tales proteínas requieren la producción de uniones disulfuro intramoleculares por oxidación. Una se-
gunda desventaja es que todas las proteínas de E. coli empiezan su secuencia con un residuo de N-formil-metionina que no
siempre puede eliminarse con los sistemas proteolíticos de E. coli, por lo cual posiblemente se produzca un derivado metionilo
de la proteína natural deseada. Una tercera desventaja de la expresión en E. coli es la posibilidad de que el producto se deterio-
re debido a trazas de impurezas de proteasa. Una cuarta desventaja es el requisito de eliminación de endotoxinas durante la
purificación. A pesar de estas limitaciones, la facilidad de uso de E. coli y sus rendimientos de expresión generalmente altos
para la mayoría de las proteínas han propiciado el uso preferencial continuado de esta bacteria siempre que sea posible.
Como se describió anteriormente, el elemento clave en la tecnología de ADN recombinante es el plásmido recombinante,
que contiene el gen que codifica la proteína de interés. Los plásmidos son segmentos extracromosómicos circulares, sencillos y
pequeños de ADN bacteriano que se aíslan de una bacteria y que se autorreplican. La tecnología básica emplea el corte enzi-
mático específico de un plásmido mediante el empleo de endonucleasas, seguido de la inserción de una nueva pieza de ADN
que contiene el gen de interés. El plásmido recombinante resultante se considera la materia prima clave de la tecnología de
ADNr. El plásmido recombinante se introduce en el organismo anfitrión mediante un proceso llamado transformación, por el
cual transmite su nueva información genética y genera el producto proteico. El crecimiento a gran escala de organismos re-
combinantes puede realizarse en fermentadores comerciales de más de 100 000 L, lo que hace que estos tipos de sistemas de
producción sean sumamente económicos. Existen, sin embargo, una serie de problemas que complican el uso de los sistemas
de fermentación de E. co/i. En algunos casos, el producto proteínico expresado puede causar toxicidad celular y/o ser suma-
mente difícil de recuperar o purificar ya que puede quedar atrapado en cuerpos de inclusión bacteriana como grandes aglo-
merados semisolubles. Los recientes avances en la biología molecular de E. coli han permitido expresar proteínas en el espacio
periplásmico, facilitando la eliminación de grupos metionina N-terminales no deseados y la obtención de proteínas más fáciles
de purificar.

PRODUCCIÓN EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS (CÉLULAS DE MAMÍFEROS Y LEVADURAS)

El uso del cultivo de células eucarióticas para la producción de vacunas se ha establecido hace tiempo en la industria farma-
céutica y se ha desarrollado una extensa base de datos para asegurar la aptitud del uso de tales productos proteicos en seres
humanos. La extensión de esta tecnología a los productos de ADNr fue principalmente una respuesta a las limitaciones en el
uso de E. coli. En particular, en lo que se refiere a proteínas o glicoproteínas grandes, la expresión de células eucarióticas es una
alternativa atractiva a un sistema bacteriano, ya que las células eucarióticas pueden secretar proteínas que se pliegan adecua-
damente y cuya estructura primaria, secundaria y terciaria es idéntica a la de la proteína humana natural. La preocupación por
los aspectos económicos de este sistema de producción obstaculizó en un principio su desarrollo. Sin embargo, los recientes
avances en la obtención de mejores niveles de expresión, en el cultivo celular a gran escala mediante el empleo de células de
Ovario de Hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) y en la formulación de medios de crecimiento más definidos han
mejorado mucho la factibilidad económica de los sustratos de células eucarióticas. El número de pasajes celulares requeridos
para la clonación, selección, amplificación y la creación de bancos celulares antes de la producción requiere, en general, el uso
de líneas de células inmortales, ya que las cepas no inmortalizadas (es decir, los cultivos diploides) no pueden propagarse sufi-
cientemente como para proporcionar tiempos económicamente convenientes en la etapa de producción. Las dudas iniciales
en lo referente a la seguridad de estas líneas de células inmortales reflejaban una preocupación por la presencia de posibles
oncogenes y una posible contaminación viral y retroviral. Estas preocupaciones se han disipado considerablemente gracias al
análisis y caracterización exhaustivos de bancos de células maestras para determinar agentes adventicios (introducidos acci-
dentalmente), mediante estudios eficaces de la validación de procesos y datos de seguridad obtenidos hasta la fecha para pro-
ductos elaborados con este método. El banco de células maestras resultante y completamente caracterizado se emplea para la
producción a gran escala. Otras líneas de células eucarióticas, como por ejemplo las provenientes de células de insectos, pue-
den ser útiles para lograr muchas de las ventajas de conformación y postraduccionales que se han descrito para el cultivo de
células de mamíferos.
Se ha explorado ampliamente el uso de cepas de levaduras, como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, para la producción.
La producción de proteínas en levaduras ofrece muchas más ventajas teóricas con respecto al uso de E. coli, aunque plantea
nuevas preocupaciones. Al igual que E. coli, las levaduras pueden mantener plásmidos estables en forma extracromosómica; sin
embargo, d diferencia de E. coli, las levaduras tienen la capacidad de producir glicoproteínas.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse de dos maneras principales, dependiendo de si son de origen humano o
murino (ratón). En el caso de los anticuerpos de origen murino, los linfocitos apropiados se seleccionan de los bazos de ratones
784 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ Información General USP 37

o ratas previamente inoculados. La célula se fusiona luego con una línea celular transformada, como por ejemplo una línea de
células de mieloma, lo cual produce una célula hibridoma. A continuación, se seleccionan las células hibridomas por clonación
y se emplean para generar productos de anticuerpos monoclonales. En el caso de los anticuerpos de origen humano, los linfo-
citos B humanos pueden seleccionarse por clonación según la especificidad de unión entre el hapteno y los anticuerpos resul-
tantes; estas células seleccionadas luego pueden inmortalizarse mediante la infección con un virus. La célula resultante fusiona-
da o transformada puede proliferar indefinidamente en un entorno de cultivo celular o en un biorreactor o bien puede inyec-
tarse en ratones de cuyo líquido ascítico puede extraerse la proteína. El anticuerpo se produce según lo indica la información
cromosómica que reside en la célula o que se adquirió durante la fusión y se secreta en el medio, a partir del cual puede purifi-
carse fácilmente. Las células hibridoma se deben analizar y caracterizar exhaustivamente de la misma manera que un banco de
células ADNr. El banco de células resultantes se emplea para la elaboración del producto por cultivo celular a gran escala o
mediante la recolección de líquido ascítico de ratones inoculados con células transformadas.

Control de los Procesos de Fermentación y Cultivo de Células

Como el proceso de producción a través de un sistema vivo es la base fundamental de la biotecnología, es necesario consi-
derar los problemas que implica el control de los procesos biotecnológicos. Las principales preocupaciones para la producción
de proteínas en bacterias, por ejemplo, involucran el desarrollo de sistemas que permitan asegurar la estabilidad genética, un
rendimiento uniforme del producto y la evidencia de que no existe contaminación por microorganismos adventicios. Estas
mismas preocupaciones valen para el cultivo de células eucarióticas a gran escala, donde, como se ha indicado anteriormente,
también existen problemas importantes relacionados con el uso de líneas celulares inmortalizadas, como por ejemplo la pre-
sencia putativa de ADN y ARN oncogénico e impurezas de proteínas de los medios.

FERMENTACIONES (BACTERIAS Y LEVADURAS)

Se han acumulado muchos conocimientos sobre la producción de proteínas recombinantes en bacterias y levaduras; en con-
secuencia, los principales problemas del proceso de fermentación suelen resolverse mediante la demostración de que existe
uniformidad en las condiciones de fermentación. Las fermentaciones con bacterias y levaduras se realizan generalmente duran-
te períodos breves y bien definidos para vigilar y controlar la velocidad de crecimiento y las condiciones de expresión del pro-
ducto. Se puede detectar la presencia de organismos contaminantes extraños por sus efectos sobre la velocidad del crecimien-
to, la pureza del cultivo, el perfil de ácidos grasos, etc.; esta presencia es razón suficiente para terminar la fermentación. La
estabilidad genética del plásmido producido por bacterias puede controlarse mediante el aislamiento y el análisis de la secuen-
cia de nucleótidos o mediante el mapeo del ADN con enzimas de restricción. Estos resultados pueden verificarse por mapeo de
péptidos de la proteína expresada en cada lote del producto elaborado. Es muy importante optimizar las condiciones de fer-
mentación para limitar o evitar el procesamiento proteolítico de la proteína objetivo. El procesamiento proteolítico suele ser un
problema en las fermentaciones de E. colí y puede producir dificultades en la recuperación y un bajo rendimiento del produc-
to. Finalmente, el proceso de fermentación debe contemplar la conformación de la proteína y sus posibles efectos sobre la
potencia.

CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS

Las técnicas de cultivo celular a gran escala para la elaboración de productos obtenidos por biotecnología se remontan a la
producción de vacunas. Ciertos avances, como el cultivo de células en suspensión a gran escala usando organismos recombi-
nantes que secretan la proteína deseada hacia el medio de cultivo, han tenido una importante repercusión en la biotecnología.
En la actualidad, pueden producirse grandes proteínas glicosiladas en cantidades suficientes para el mercado. Sin embargo, el
uso de cultivos de células eucarióticas se complica por aspectos tales como la estabilidad genética, el plegado de proteínas y
las condiciones del cultivo, incluyendo la viabilidad de las células y su velocidad de crecimiento. La estabilidad genética de los
cultivos celulares, por ejemplo, no puede controlarse tan fácilmente como en el caso de las fermentaciones de E. co/í con técni-
cas como el análisis de las secuencias del plásmido, ya que el gen que codifica el producto se incorpora al genoma de las célu-
las y no se recupera fácilmente. Una alternativa es el mapeo de péptidos de la proteína expresada, que requiere una suficiente
resolución y sensibilidad para detectar mutaciones sutiles.
La ausencia de organismos adventicios en cultivos celulares es crítica. Además de demostrar que no hay bacterias, levaduras
ni hongos presentes en los cultivos de células, el fabricante debe proporcionar evidencia, para cada cultivo, de que no hay
micoplasmas ni virus adventicios. Es importante tener en cuenta que algunos hibridomas usados para la producción de anti-
cuerpos monoclonales pueden contener retrovirus endógenos. Sin embargo, debe demostrarse que cualquier virus presente en
el cultivo es eliminado del producto final. Esto exige el desarrollo de técnicas analíticas apropiadas que aseguren la ausencia de
contaminación por micoplasmas o virus adventicios humanos y animales.
El grado y tipo de glicosilación pueden ser importantes para el diseño de las condiciones de cultivo celular necesarias para la
producción de proteínas glicosiladas. El grado de glicosilación puede afectar la vida media del producto in vivo así como su
potencia y antigenicidad. Aunque el estado de glicosilación de un producto de cultivo celular es difícil de determinar, puede
comprobarse su uniformidad si las condiciones de cultivo son altamente reproducibles.
USP 37 Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 785

Proceso de Recuperación y Purificación

Por lo general, la recuperación de productos proteicos obtenidos a partir de fermentación o cultivo celular se basa en técni-
cas eficientes de separación proteica, como las listadas en la Tabla 7. El proceso de recuperación comienza con el aislamiento
de la proteína deseada del medio de fermentación o de cultivo celular, a menudo en una forma muy impura. La ventaja del
cultivo celular y de los productos obtenidos a partir de levaduras es que muchas de estas proteínas se secretan directamente
hacia el medio y, por lo tanto, sólo requieren la separación de las células para obtener una purificación significativa. En el caso
de productos obtenidos a partir de f. coli, suele requerirse la lisis de las bacterias para recuperar la proteína deseada. Es impor-
tante en cada caso lograr una rápida purificación de la proteína deseada ya que las proteasas liberadas por los organismos
lisados pueden escindir el producto deseado. Estas trazas de proteasas adquieren especial importancia durante la purificación
de productos obtenidos mediante biotecnología, ya que pueden ser muy difíciles de eliminar, pueden complicar el proceso de
recuperación y pueden afectar considerablemente la estabilidad del producto final.
Tabla 1. Métodos de Purificación Cromatográflcos Empleados para Productos Obtenidos por Biotecnología
Cromatografía focalizada
Cromatografía en fase reversa
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatografía por transferencia de carga
Cromatografía de exclusión por tamaño (tamizado molecular)
Cromatografía de intercambio iónico
Aniónico
Catiónico
Cromatografía de afinidad
Química
Anticuerpos monoclonales
Receptores celulares
Colorante/Ligando
Quelatos metálicos

Por lo general, el proceso de recuperación está diseñado para una elevada purificación del producto final. El requisito de
pureza para un producto depende de muchos factores, aunque puede exigirse que los productos de uso continuo tengan una
pureza mucho mayor que aquellos concebidos para un solo uso. Los productos biotecnológicos contienen ciertas impurezas
que los procesos de recuperación están específicamente diseñados para eliminar o reducir al mínimo. Estas impurezas incluyen
cantidades detectables de ADN, factores de crecimiento, proteínas residuales del anfitrión, endotoxinas y proteínas celulares
residuales provenientes de los medios. Las impurezas más comunes de interés y los métodos de valoración apropiados para
detectarlas se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Posibles Impurezas y Contaminantes en Productos Obtenidos por Biotecnología
Impurezas o Contaminantes Método de Detección
Impurezas
Endotoxinas Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), Prueba de Pirógenos (151)
Proteínas de células anfitrionas SDS-PAGP, Valoraciones inmunológicas
Otras impurezas proteicas (medios) SDS-PAGE, HPLCb, Valoraciones inmunológicas
ADN Hibridación de ADN, Espectrofotometría UV, Unión a proteínas
Proteínas mutantes Mapeo de péptidos, HPLC, IEF<, MSd
Formil-metionina Mapeo de péptidos, HPLC, MS
Metioninas oxidadas Mapeo de péptidos, análisis de aminoácidos, HPLC, análisis de degradación de Edman, MS
Escisión proteolítica IEF, SDS-PAGE (reducido), HPLC, análisis de degradación de Edman
Proteínas aglomeradas SDS-PAGE, HPSECe
Desamidación IEF, HPLC, MS, análisis de degradación de Edman
Anticuerpos monoclonales SDS-PAGE, valoraciones inmunológicas
ª Electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio.
b Cromatografía líquida de alta resolución.
e lsoelectroenfoque.
d Espectrometría de masas.
e Cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño.
f Borradores de lineamientos relativos al Código de Reglamentaciones Federales, Título 21.
g Fluorocromo de unión con ADN.
h Efecto citopático.
i Hemoadsorción.
i Producción de anticuerpos murinos.
 ,.
786 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología/ Información General USP 37

-
Tabla 2. Posibles Impurezas y Contaminantes en Productos Obtenidos por Biotecnología (Continuacion)
----------------------~-·------·-···-----

Impurezas o Contaminantes Método de Detección

Sustituciones de aminoácidos Análisis de aminoácidos, mapeo de péptidos, MS, análisis de degradación de Edman
Contaminantes
Pruebas de Recuento Microbiano '.61 ), Pruebas de Microorganismos Específicos , 62 ', Pruebas de Esterilidad
Microbianos (bacterias, levaduras, hongos) 1,71 ), pruebas microbiológicas
Micoplasmas Método del 21 CFR Modificado 1, DNAF9
Virus (endógenos y adventicios) CPE 11 y HAd' (virus exógenos exclusivamente), actividad de transcriptasa reversa, MAPi
d Electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfoto de sodio.
b Cromatografía líquida de alta resolución.
' lsoelectroenfoque.
d Espectrometría de masas.
e Cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño.
1 Borradores de lineamientos relativos al Código de Reglamentaciones Federales, Título 21.
g Fluorocromo de unión con ADN.
h Efecto citopático.
1 Hemoadsorción.

1 Producción de anticuerpos murinos.

La cromatografía focalizada y la cromatografía en fase reversa son métodos de purificación que emplean productos quími-
cos, ya sea en la fase estacionaria (unida) o en la fase móvil, que pueden convertirse en impurezas en el producto final. Como
sucede con cualquier tecnología nueva, la responsabilidad de la validación (es decir, de demostrar la supresión de productos
químicos potencialmente nocivos) recae en el fabricante. La validación es necesaria cuando se están aislando los anticuerpos
monoclonales del producto final o empleando una técnica que contiene una etapa de purificación de anticuerpos monoclona-
les. El proceso debe probar que se han eliminado los fragmentos de anticuerpos o anticuerpos lixiviados. Es necesario asegurar
la ausencia de agentes adventicios, como por ejemplo virus y micoplasmas, en la línea celular de origen de los anticuerpos
monoclonales. La principal preocupación es la posibilidad de contaminación del producto con una sustancia antigénica que
podría ser perjudicial para los pacientes. Es necesario un continuo control del proceso para evitar o limitar tal contaminación.
El problema de la antigenicidad relacionada con las proteínas activas y con las proteínas anfitrionas es característico de los pro-
ductos obtenidos por biotecnología, en contraste con los fármacos tradicionales. Los métodos de fabricación que emplean
ciertos disolventes deben controlarse si son capaces de provocar reordenamientos químicos que alterarían el perfil antigénico
del ingrediente activo. El fabricante también está obligado a comprobar la uniformidad en el funcionamiento de las nuevas
columnas cromatográficas. Las consideraciones para los productos de un solo uso, como por ejemplo las vacunas, pueden dife-
rir ya que no se administran continuamente y su antigenicidad es deseable. Por otro lado, es necesario validar la eliminación de
la contaminación con proteínas extrañas o ligandos. A diferencia de los fármacos de origen natural, los fabricantes de produc-
tos obtenidos mediante biotecnología deben validar la eliminación de los ácidos nucleicos durante la purificación. Como ya se
ha señalado, las vacunas pueden diferir en este aspecto debido a los antecedentes clínicos acumulados sobre estos productos.

CONTROL DE CALIDAD

En general, los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnología son muy similares a los utilizados
rutinariamente en productos farmacéuticos tradicionales en áreas tales como pruebas y liberación de materias primas, docu-
mentación de control de proceso y fabricación, y procesamiento aséptico. Los sistemas de control de calidad de productos
obtenidos por biotecnología incorporan algunas de las mismas filosofías aplicadas al análisis de productos farmacéuticos de
bajo peso molecular, como el uso de estándares de referencia químicos y métodos validados, para evaluar un amplio espectro
de impurezas del producto conocidas y/o potenciales, así como posibles productos de descomposición. Los sistemas de con-
trol de calidad para productos obtenidos mediante biotecnología suelen ser análogos a los establecidos para productos bioló-
gicos tradicionales en lo que se refiere a la determinación de la esterilidad del producto, la seguridad del producto para anima-
les de experimentación y la potencia del producto. Consultar por ejemplo, Inyectables (1 ), pH (791 ), Particulas en Inyectables
(788), Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) e Impurezas en Artículos Oficiales (1 086).
La diferencia fundamental entre los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnología y productos
farmacéuticos tradicionales reside en el tipo de métodos que se emplean para determinar la identidad del producto, su unifor-
midad, su pureza y el perfil de las impurezas. Además, en el control de calidad biotecnológico, frecuentemente es necesario
combinar pruebas para el producto final y pruebas durante el proceso validadas, y la validación del proceso para asegurar la
eliminación de impurezas no deseadas reales o posibles, hasta alcanzar los niveles sugeridos por los organismos reguladores.
Por lo general, los productos obtenidos por biotecnología requieren una caracterización detallada del organismo de produc-
ción (célula), una evaluación completa de los medios de crecimiento y propagación de las células y un análisis explícito del
proceso de recuperac1on del producto final.
La complejidad de los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnología se relaciona con el tamaño
y con las características estructurales del producto y el proceso de fabricación. En general, los sistemas de control de calidad
requeridos por los productos elaborados en células procarióticas son menos complejos que los sistemas requeridos para los
elaborados en células eucarióticas. Entre los sistemas de control de calidad para los organismos de producción procarióticos
generalmente se encuentran la documentación del origen de la cepa productora y las pruebas tradicionales para la detección
USP 37 Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 787

de organismos adventicios, cariología, caracterización del fenotipo y resistencia a los antibióticos. Además, pueden ser útiles
otras técnicas nuevas, como el mapeo por restricción de ADN, el análisis de secuencias de ADN y el control de rutina, que
puede incluir la medición de concentraciones de ADN de plásmido o ARNm. El control de calidad del banco de células maes-
tras y el banco de células de trabajo para organismos eucarióticos de producción incluye, por lo general, pruebas para detec-
ción de organismos adventicios, cariología, identidad y el control de la estabilidad. Todas las líneas de células eucarióticas (ex-
cepto las levaduras) suelen analizarse para detectar la presencia de retrovirus, marcadores de actividad retroviral y tumorigeni-
cidad, aunque muchas de estas pruebas pueden tener un valor limitado.

FORMULACIÓN DE PRODUCTOS

Los productos biotecnológicos son proteínas y péptidos que son moléculas relativamente inestables comparadas con la ma-
yoría de las sustancias farmacéuticas orgánicas. En la mayoría de los procesos biotecnológicos hay una transferencia de proteí-
nas desde un amortiguador de pH estabilizante o solubilizante a otro durante la purificación. En último término, la proteína se
transfiere a una solución en su forma farmacéutica final, donde se logra su estabilidad a largo plazo. Además, estos productos
requieren a menudo la liofilización para lograr una estabilidad a largo plazo, debido a su tendencia a degradarse mediante una
variedad de mecanismos, entre ellos, la desamidación, aglomeración, oxidación y posible proteólisis causada por trazas de pro-
teasas de las células anfitrionas. Por lo general, la forma farmacéutica final de la proteína contiene compuestos estabilizantes
que proporcionan el pH óptimo y las condiciones de solución necesarias para la estabilidad a largo plazo del producto y/o las
propiedades deseadas para su administración (tonicidad). Entre estos compuestos se encuentran las proteínas, alcoholes polihí-
dricos, aminoácidos, carbohidratos, agentes de volumen, sales inorgánicas y agentes tensoactivos no iónicos. Además, estos
excipientes pueden ser necesarios para la obtención de un liofilizado estable. Existen requisitos especiales para los productos
liofilizados, como por ejemplo el control de la humedad, que, en general, se definen en la monografía USP de cada producto y
que pueden ser importantes para su estabilidad. Vale notar que la evaluación de la estabilidad proteica suele exigir múltiples
métodos analíticos, cada uno de los cuales puede emplearse para evaluar una modalidad específica de degradación proteica.
Muchas de estas valoraciones se describen en la siguiente sección. El uso de estudios de estabilidad acelerada para predecir la
vida útil de formulaciones proteicas a veces se complica por los efectos de la temperatura sobre la conformación de las proteí-
nas, produciéndose un comportamiento que no se ajusta a la teoría de Arrhenius. Por lo tanto, suelen requerirse con frecuen-
cia estudios de estabilidad en las condiciones de almacenamiento recomendadas en tiempo real para establecer la fecha de
caducidad de los productos obtenidos mediante biotecnología.

METODOLOGÍA ANALÍTICA
El análisis de los productos obtenidos mediante biotecnología depende en gran medida de métodos analíticos sofisticados
para demostrar la identidad estructural y la homogeneidad de las proteínas y para evaluar su vida útil o estabilidad. Esta sec-
ción trata sobre la exactitud, la precisión, el contenido informativo y la aplicabilidad general de los métodos más comúnmente
utilizados. Algunos métodos, como por ejemplo la valoración de impurezas de la célula anfitriona y los procedimientos para
ADN residual, pueden ser muy específicos para el producto y para el proceso en particular; por lo tanto, deben incluirse en
cada monografía.

Consideraciones sobre Estándares de Referencia

El uso de estándares y materiales de referencia apropiados es sumamente importante para el análisis de los productos obte-
nidos por biotecnología. Estos estándares pueden ser materiales naturales o proteínas producidas por ingeniería genética. Mu-
chos productos obtenidos por biotecnología requieren estándares de referencia exactamente caracterizados disponibles de
fuentes internacionalmente reconocidas, como por ejemplo la USP (ver Estándares de Referencia USP (11 )), OMS, NIH y FDA.
Actualmente, los estándares de referencia de algunos productos biológicos con unidades de actividad definidas se obtienen en
dichas organizaciones. Los fabricantes emplean estos estándares para probar o calibrar estándares secundarios aplicando mu-
chas de las valoraciones descritas en esta sección. El valor de potencia del estándar de referencia se obtiene por estudios cola-
borativos que, cuando se evalúan estadísticamente, permiten determinar el valor de potencia máxima asignado al estándar de
referencia. El estándar secundario puede emplearse para determinar la cantidad declarada del fármaco o la potencia definida
en la etiqueta del producto. Por lo tanto, la USP aprueba y proporciona los estándares o materiales de referencia para produc-
tos obtenidos mediante biotecnología utilizados con los fines analíticos descritos en las monografías USP correspondientes. En
una situación ideal, estos estándares de referencia deberían utilizarse mundialmente y siempre deberían estar calibrados en
comparación con el estándar de los EE.UU. que el fabricante entrega a la FDA para productos autorizados por la FDA. Esto
asegura la determinación exacta y uniforme de la actividad, contenido y pureza de estos productos. Debido a diversas caracte-
rísticas especiales de los productos obtenidos por biotecnología, como por ejemplo la especificidad del proceso y del produc-
to, es posible que otros productos similares necesiten estándares de referencia diferentes. Además, la USP realiza el desarrollo
minucioso y la recalibración de los estándares de referencia para reemplazar estándares agotados o caducos a fin de asegurar
que no cambien las indicaciones en las etiquetas de los productos farmacéuticos. Un punto que se debe considerar en la asig-
nación de la potencia al estándar primario mediante estudios colaborativos es que las unidades de actividad definidas sólo son
788 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / Información General USP 37

significativas cuando se comparan en una sola valoración exacta y bien descrita. Si se intenta comparar actividades obtenidas
con valoraciones que son ligeramente diferentes, es probable que se obtengan resultados marcadamente distintos.

Metodología Característica

Existen varios métodos analíticos específicos para productos obtenidos mediante biotecnología. Muchas de las valoraciones
y pruebas descritas pueden realizarse de diferentes maneras y, como algunas pueden ser también específicas para un determi-
nado producto, se necesitan normas claras sobre la aplicación de métodos específicos en cada situación en particular. Ver los
capítulos Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111) y Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) para información
general sobre la metodología.

CONTENIDO PROTEICO

Las valoraciones de contenido proteico se emplean para determinar cuantitativamente la cantidad de proteínas en un pro-
ducto dado obtenido por biotecnología. La determinación del contenido proteico suele ser una de las mediciones más difíciles
y frecuentemente requiere una verificación independiente mediante métodos alternativos. Siempre que sea pertinente, pueden
emplearse métodos tales como la espectrofotometría UV con una absortividad válida y el análisis de nitrógeno por Kjeldahl
para determinar las cantidades absolutas de proteína independientemente de los estándares de referencia. Sin embargo, otros
métodos, como Lowry, Biuret y el análisis cuantitativo de aminoácidos, que requieren el uso de sustancias de referencia, tam-
bién permiten obtener valores exactos. Las valoraciones de contenido proteico se encuentran entre los métodos más importan-
tes para estos productos ya que los resultados de otros tipos de valoraciones, como por ejemplo la potencia, también depen-
den de ellos.
Existen varios métodos comunes de valoración para determinar el contenido proteico. Estos métodos de valoración pueden
emplearse en distintos puntos del proceso de elaboración de un determinado producto obtenido por biotecnología. En el caso
de proteínas de alta pureza, el método más sencillo para evaluar el contenido proteico se basa en la determinación espectrofo-
tométrica de la absorbancia en el UV de una solución de proteínas. La absorbancia se determina al máximo de absorción y se
calcula la concentración proteica empleando una absortividad determinada empíricamente. Esta técnica se aplica a proteínas
que contienen los residuos aromáticos triptofano, tirosina, y/o fenilalanina. A menudo, la longitud de onda de absorción em-
pleada es de 280 nm. El coeficiente de extinción, o absortividad molar, debe determinarse en el mismo disolvente usado para
la muestra que se va a medir. Si fuera necesario, el producto puede diluirse antes de analizarlo para obtener soluciones con
valores de absorbancia en el intervalo lineal de detección. Los aglomerados y partículas de mayor peso molecular pueden dis-
persar la luz, que artificialmente aumenta la absorbancia. Los excipientes que tienen absorbancia significativa a 280 nm tam-
bién interfieren. La espectrofotometría UV es única entre los métodos de valoración de contenido proteico, ya que es una me-
dida absoluta de concentración de una proteína específica que no requiere calibración con estándares.
Un método general comúnmente utilizado para medir el contenido proteico es la valoración de Lowry. Este método se basa
en la reacción de Biuret de proteínas con cobre (11) en una solución básica y la reducción del ácido fosfomolíbdico-fosfotúngsti-
co de Folin-Ciocalteu a azul de heteropolimolibdeno mediante la oxidación catalizada por cobre de los aminoácidos aromáti-
cos tirosina, triptofano y fenilalanina en la proteína. Los productos de reacción son azules y se cuantifican en forma espectrofo-
tométrica en la región visible entre 540 y 560 nm. Esta reacción es lineal para microgramos de proteína. La valoración, sin
embargo, es susceptible de interferencias de varias sustancias, como por ejemplo alcoholes, azúcares y detergentes. En algunos
casos, sustancias de interferencia o el producto pueden extraerse antes del análisis, por ejemplo mediante su precipitación.
Además, la preparación de controles que contienen sustancias interferentes presentes en el producto farmacéutico puede per-
mitir la corrección. Aunque históricamente se ha empleado la albúmina sérica bovina para preparar la curva estándar, se sabe
que cada proteína puede reaccionar con una intensidad diferente y por lo tanto se debe emplear un material de referencia del
mismo producto para la calibración. La valoración del ácido bicinconínico (BCA) es una alternativa útil a la valoración de
Lowry, ya que es menos sensible a sustancias interferentes. El reactivo de trabajo es una solución de BCA-cobre (11). El complejo
de cobre (11) se reduce a cobre (1) en presencia de proteínas y el color morado puede cuantificarse por espectrofotometría a
aproximadamente 560 nm.
También pueden emplearse otras valoraciones calorimétricas. El método de Bradford, por ejemplo, emplea la unión delco-
lorante Azul de Coomassie Brillante a la proteína en un medio ácido. La concentración de la proteína en la solución se determi-
na mediante la comparación de la absorbancia a 595 nm con una curva estándar de un material de referencia.
Los métodos de fluorescencia empleados se basan normalmente en fluorescamina o en o-ftaldialdehído (OPA). La principal
ventaja de estas valoraciones es su mayor sensibilidad. Otra ventaja es su uso con proteínas hidrófobas. La fluorescamina y el
OPA reaccionan con aminas primarias en el extremo N-terminal del polipéptido y en las cadenas laterales de aminoácidos tales
como la lisina.
El método de Kjeldahl para nitrógeno, Determinación de Nitrógeno (461 ), es una determinación exacta y precisa de la con-
centración proteica y suele emplearse en la determinación de absortividades UV de proteínas. La valoración se realiza en dos
etapas. En primer lugar, la muestra se descompone con ácido sulfúrico produciéndose sulfato de amonio, dióxido de carbono
y agua. La descomposición se realiza al punto de ebullición del ácido sulfúrico en matraces de cuello largo con forma de pera.
Estos matraces sirven para condensar el vapor de agua e impedir la pérdida de material. Según la eficiencia de la descomposi-
ción, se pueden agregar diversas sales, como por ejemplo sulfato de potasio, para aumentar el punto de ebullición de la solu-
USP 37 Información Grneral / (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 789

ción de ácido sulfúrico. También se han empleado agentes oxidantes, como por ejemplo ácido perclórico o permanganato de
potasio, para mejorar la descomposición. La segunda etapa de la valoración incluye la determi11ac1on directa del amoníaco. En
la mayoría de las macrodeterminaciones, el amoníaco se destila por corriente de vapor a partir de la mezcla después de la
alcalinización con hidróxido de sodio. Por lo general, el amoníaco destila cuantitativamente de la mezcla en 5 a 20 minutos y
se absorbe cuantitativamente en una solución ácida estandarizada, de volumen y r1ormalidad conocidas. El exceso de ácido se
retrovalora volumétricamente con una base estandarizada. Para las determinaciones de proteína bruta, el valor del amoníaco
(y, por lo tanto, del contenido de nitrógeno) se multiplica por un factor de 6,25 mg de proteína por mg de nitrógeno, que
corresponde a un contenido de nitrógeno de 16%. El valor proteico obtenido de esta forma es generalmente válido para la
mayoría de las proteínas. Si se requiere un valor más exacto, como en una medición de absortividad, entonces el factor de
conversión debe calcularse para el contenido de nitrógeno de cada proteína pura a partir de su composición aminoacídica. En
el caso de las glicoproteínas que contienen aminoazúcares, el valor calculado produce un valor atificialrnente alto a menos que
se aplique una corrección.
El análisis de aminoácidos se emplea en la determinación de la absortividad apropiada de la proteína y también puede em-
plearse cuantitativamente para la determinación del contenido proteico. Este procedimiento, aunque es más complicado que
los descritos anteriormente, también produce resultados exactos.

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS

El análisis de aminoácidos es un método químico clásico para determinar la composición de aminoácidos en proteínas y
péptidos. El método consiste en la hidrólisis completa de una proteína o péptido hasta sus aminoácidos componentes, que
luego se separan por cromatografía y se cuantifican. Por consiguiente, el análisis de aminoácidos puede emplearse para deter-
minar la composición de un producto (es decir, la identidad) y la cantidad de proteínas totales presente. El método tiene algu-
nas dificultades inherentes (como por ejemplo la destrucción total o parcial de algunos aminoácidos) que pueden evitarse em-
pleando la metodología analítica apropiada. El aminoácido triptofano se destruye por hidrólisis con ácido clorhídrico 6 N y, por
lo tanto, requiere otras condiciones de hidrólisis. Los aminoácidos serina y treonina pueden destruirse parcialmente, mientras
que las uniones peptídicas entre residuos hidrófobos voluminosos tales como la valina y la isoleucina pueden ser más resisten-
tes a la hidrólisis, proporcionando en ambos casos valores inferiores a los reales. En consecuencia, se puede emplear el análisis
de muestras a lo largo de la hidrólisis para compensar estos factores. La cisteína y la metionina pueden requerir la oxidación
previa a ácido cisteico y metionina sulfona, respectivamente, para su cuantificación exacta. Cada proteína específica puede re-
querir un procedimiento de hidrólisis en condiciones optimizadas para el análisis de sus aminoácidos a fin de obtener buenos
resultados.
El análisis de aminoácidos se realiza en dos etapas. La primera etapa es la hidrólisis de la proteína que genera sus aminoáci-
dos componentes. Esta hidrólisis se realiza normalmente con ácido clorhídrico 6 N a aproximadamente 11 Oº durante 24 horas.
Algunas proteínas pueden requerir condiciones de hidrólisis más largas o más enérgicas. La segunda etapa es la separación y
cuantificación de los aminoácidos individuales mediante alguna forma de cromatografía que se pueda realizar por derivatiza-
ción anterior o posterior al paso por la columna. Se dispone de varios procedimientos de derivatización anteriores al paso por
la columna, como por ejemplo con OPA, fenilisotiocianato (PITC) y fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC). Estos derivados se sepa-
ran luego mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa (FR) y se cuantifican por detección en el UV
o por fluorescencia. Dentro de los métodos de derivatización posteriores al paso por la columna se encuentran la separación
en componentes aminoacídicos por cromatografía de alta resolución de intercambio iónico (HPIEC), seguida por una reacción
postcolumna con un cromóforo tal como la ninhidrina, y la cuantificación mediante la detección en la región UV/visible. Todos
estos métodos son apropiados para análisis de aminoácidos y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Los derivados
de OPA son muy fáciles de preparar y sensibles y sólo requieren una pequeña cantidad de muestra, pero son inestables y tie-
nen que pasar a la cromatografía de inmediato una vez preparados. Por otro lado, los derivados del feniltiocarbamilo (PTC)
son relativamente más estables. La derivatización con ninhidrina postcolumna a menudo se realiza a baja presión y tiene la
ventaja de la estabilidad del hidrolizado. Sus desventajas son la necesidad de detección dual a 440 y 570 nm y el equipo nece-
sario para la derivatización postcolumna.

SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

La secuenciación de proteínas es útil para el control de calidad de productos biológicos proteicos ya que puede proporcionar
información sobre su estructura primaria, es decir, la estructura amino-terminal y carboxi-terminal. En el caso de productos
biológicos provenientes del ADNr, esta metodología también sirve para confirmar la secuencia aminoacídica predicha por el
ADN complementario (ADNc), la homogeneidad de la proteína y el número potencial de cortes proteolíticos. En cuanto a los
anticuerpos monoclonales, esta técnica se emplea para determinar su homogeneidad proteica. La secuenciación de proteínas
se divide en aplicaciones y procedimientos de secuenciación amino-terminal y carboxi-terminal.
Secuenciación Amino-Terminal-El análisis de la secuencia amino-terminal es una técnica química clásica que proporciona
información importante sobre la estructura primaria (secuencia), la homogeneidad y la presencia de escisiones conocidas o
desconocidas en el polipéptido. El análisis de las secuencias N-terminales se realiza con varios secuenciadores de péptidos auto-
máticos comercialmente disponibles. El método se basa en la reacción de acoplamiento del residuo amino-terminal de una
proteína o de un péptido con PITC. El derivado aminoácido-PTC resultante se separa de la proteína con un ácido orgánico
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perfluorado (por lo general ácido trifluoroacético o heptafluorobutírico), que expone el aminoácido adyacente. Este aminoáci-
do adyacente sirve como un nuevo N-terminal y se derivatiza en el siguiente ciclo de acoplamiento y escisión. Este proceso se
repite hasta extraer un número apropiado, normalmente de 8 a 1 O aminoácidos. Por lo general, el residuo aminoácido modifi-
cado resultante del ciclo de escisión (anilinotiazolinona [ATZ]) se convierte en un feniltiohidantoín-aminoácido (PTH-AA) en
presencia de ácido y calor. Luego, el PTH-AA puede determinarse mediante un análisis por RP-HPLC. Cualquier escisión dentro
de la cadena, así como la heterogeneidad de los terminales N (por ejemplo, metionina N-terminal) en el polipéptido, también
se secuencian simultáneamente. Esto da lugar a picos más pequeños en el cromatograma y permite la cuantificación relativa
de los terminales N y la identificación del lugar de escisión en el polipéptido. Este procedimiento para la secuenciación de pro-
teínas también puede realizarse manualmente. Las limitaciones del método de secuenciación con PITC son que es solamente
semicuantitativo (es decir, la cantidad de terminales N sólo puede estimarse) y que los derivados PTH de la serina y la treonina
se pueden degradar mucho, lo cual dificulta su determinación. Para determinar los residuos de cisteína es necesario modificar-
los, por ejemplo mediante alquilación. Además, los aminoácidos glicina y prolina se reordenan lentamente, lo que presenta un
pequeño problema para su determinación.
Secuenciación Carboxi-Terminal-La secuenciación de proteínas a partir del extremo carboxi-terminal también proporcio-
na valiosa información sobre la estructura primaria así como posibles escisiones de C-terminales. La degradación secuencial de
una proteína desde el extremo C-terminal puede realizarse mediante métodos químicos o enzimáticos. Se puede usar la reac-
ción de hidrazina, tiocianato de amonio o bromuro de cianógeno con una proteína para degradar secuencialmente la proteína
en el extremo C-terminal o en sus proximidades. Se ha extendido el uso de la reacción de tiocianato de amonio para proteínas
acopladas a soportes sólidos. Los aminoácidos C-terminales pueden escindirse secuencialmente en forma enzimática usando
exopeptidasas tales como las carboxipeptidasas. Las limitaciones de las carboxipeptidasas son la posible contaminación con
endopeptidasas, su inherente dificultad y la naturaleza impredecible de la secuenciación. La espectrometría de masas puede
emplearse ya sea directamente en digeridos de proteínas o junto con el mapeo de péptidos por HPLC para identificar el extre-
mo C-terminal de la proteína. Sin embargo, estos métodos son solamente semicuantitativos.

MAPEO DE PÉPTIDOS POR HPLC

El mapeo de péptidos cumple dos propósitos principales en relación con las proteínas de uso farmacéutico: es un método de
identidad altamente específico y, en el caso de los productos obtenidos mediante biotecnología, puede servir como una con-
firmación de la estabilidad genética. Este método se emplea para comparar la estructura proteica de un lote específico de ma-
terial con la de un material o estándar de referencia apropiado o con la estructura de lotes anteriores para verificar si la estruc-
tura primaria es correcta y comprobar la uniformidad de la estructura primaria en cada lote (dentro de los límites de esta técni-
ca). Por lo general, los grupos amino-terminales y carboxi-terminales de los péptidos, y de los péptidos que contienen carbohi-
dratos se pueden separar e identificar. Estos últimos son valiosos en los mapeos de los péptidos de proteínas glicosiladas tales
como los anticuerpos monoclonales. Los mapas de péptidos pueden emplearse para determinar la presencia de aminoácidos
incorrectos simples o múltiples como resultado de una mutación puntual o errores en la traducción de la secuencia de ADNc.
El procedimiento implica la fragmentación selectiva de la proteína, formándose péptidos diferenciados que se separan por
alguna técnica cromatográfica. La fragmentación se logra con endoproteasas tales como la tripsina, quimotripsina, termolisina,
proteasa V8, o mediante la degradación química selectiva con bromuro de cianógeno, que divide la molécula en sitios específi-
cos. La selección de la endoproteasa apropiada depende de la secuencia primaria de la proteína. La tripsina escinde los resi-
duos básicos de lisina y arginina en su extremo e-terminal; la quimotripsina escinde después de los residuos aromáticos a feni-
lalanina, tirosina y triptofano; la termolisina escinde después de los residuos hidrófobos a leucina, isoleucina y valina; la protea-
sa V8 escinde después los residuos de ácido glutámico y ácido aspártico; y, finalmente, el bromuro de cianógeno escinde los
residuos metionilo. También se pueden emplear otras enzimas, como por ejemplo clostripaína (arginina) y endoproteinasa lis-
C (lisina) y métodos químicos tales como el ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico (cisteína). Cada uno de estos métodos tiene sus
propias ventajas y desventajas. Una desventaja común a todas estas técnicas es que, en cierta medida, se producen escisiones
no específicas. Es importante que los péptidos generados por la digestión sean lo suficientemente grandes para proporcionar
información estructural sobre la proteína y a la vez lo suficientemente pequeños para permitir su análisis y separación mediante
una técnica del tipo RP-HPLC. Por este motivo y como la escisión con esta enzima es casi cuantitativa, la tripsina es la enzima
de aplicación general para la mayoría de las proteínas. En el caso de proteínas grandes de más de 60 000 daltons (aproximada-
mente 520 aminoácidos), la escisión con tripsina podría producir demasiados fragmentos y, por lo tanto, puede elegirse otra
endoproteasa. Normalmente, se emplea la tripsina tratada con L-TPCK (tosil-L-fenilalanina clorometil cetona), ya que el TPCK
inhibe la acción de la quimotripsina, un contaminante presente en muchas preparaciones de tripsina. Aunque la reacción con
bromuro de cianógeno escinde en los residuos de metionilo, las proteínas no contienen muchos de estos residuos. Por lo tan-
to, se obtienen relativamente pocos péptidos y es posible que sean demasiado grandes o excesivamente hidrófobos para la
separación por HPLC.
Una vez terminada ia d1gest1ón, los pépt1dos suelen separarse por KP-HPLC y HPIEC La selección de la columna apropiada es
empírica y depende del tipo de proteínas. Para el RP-HPLC, funcionan bien los soportes que tienen un tamaño de poro de 100
Ay 300 A y la selección del soporte de sílice puede ser un criterio importante para una separación óptima. Para los péptidos
más pequeños generados por estas digestiones, se ha comprobado que las fases estacionarias C8 y Cl 8 son en general más
eficientes que los soportes C4. Los disolventes más comunes empleados para separaciones en fase reversa son agua y acetoni-
trilo con una cantidad constante (~O, 1 'Yo) de ácido trifluoroacético. Las fases móviles amortiguadas que contienen fosfato tam-
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bién ofrecen una excele11te selectividad según su pH. Al examinar el efecto del pH entre 3,0 y 5,0 se produce un desplaza-
miento en los péptidos que contienen los residuos ácido glutámico y ácido aspártico. Hay menos información disponible para
las separaciones de intercambio iónico. pero son útiles los soportes de sílice, así como los poliméricos con soporte estacionario
de intercambio iónico débil y fuerte. Como muchos péptidos son ligeramente hidrófobos, puede requerirse la adición de pe-
queñas cantidades de disolventes orgánicos en la fase móvil, por ejemplo 5% a 10% de metanol o acetonitrilo. Una posible
desventaja del análisis HPIEC para mezclas de péptidos es que, a veces existe la posibilidad de no retener en la columna los
péptidos neutros o los que tienen la misma carga que el soporte y, por lo tanto, este método quizás no permita separarlos o
identificarlos.

VALORACIONES INMUNOLÓGICAS

Las valoraciones inmunológicas se emplean para identificar y cuantificar la proteína de interés en ingredientes farmacéuticos
activos o para detectar y cuantificar las impurezas proteicas conocidas provenientes de la célula anfitriona. Dado que estas im-
purezas proteicas pueden representar un gran número de trazas de impurezas posibles en lugar de una sola impureza, las valo-
raciones inmunológicas deben ser sensibles y selectivas para detectar la mayor cantidad posible de estas impurezas. Se han
desarrollado valoraciones inmunológicas capaces de medir estas impurezas en concentraciones muy bajas en las proteínas de
E. coli (ECP) y CHO. Además, las valoraciones inmunológicas pueden servir como valoraciones de la potencia para anticuerpos
monoclonales con el empleo de un antígeno apropiado.
Las valoraciones inmunológicas incluyen un gran grupo de valoraciones basadas en interacciones específicas anticuerpo: an-
tígeno de alta afinidad del complejo, tales como los radioinmunoanálisis (análisis RIA) y las pruebas de inmunoabsorción enzi-
mática (prueba ELISA). Los análisis RIA se realizan en fase líquida o sólida con un anticuerpo no marcado dirigido contra la
proteína radiomarcada de interés. Este análisis consiste en comparar la inhibición de la unión de un antígeno marcado a un
anticuerpo no marcado con la inhibición mediante estándares conocidos, lo cual permite la cuantificación de la proteína de
interés.
Las valoraciones inmunorradiométricas (IRMA) o los análisis RIA de fase doble utilizan dos preparaciones de anticuerpos en-
tre las que se coloca la proteína de interés. El primer anticuerpo no está marcado y está dirigido contra la proteína; el segundo
anticuerpo está radiomarcado y puede estar dirigido contra la proteína o el primer anticuerpo. El complejo anticuerpo:antíge-
no se aísla en su totalidad y se determina la radioactividad y, en consecuencia, la proteína de interés. El desarrollo de un análi-
sis RIA o una valoración IRMA para un producto obtenido por biotecnología requiere una cuidadosa atención a la producción
de los antisueros, a la preparación del trazador marcado, a la preparación de un estándar de referencia apropiado y a los méto-
dos para la separación del antígeno libre a partir del antígeno unido.
El formato de prueba ELISA para el análisis de trazas de impurezas más utilizado es la prueba ELISA de fase doble, que em-
plea dos preparaciones de anticuerpos en forma similar a las valoraciones IRMA, pero sin marca radioactiva. El primer anticuer-
po no está marcado y al segundo anticuerpo se le ha agregado una enzima, como por ejemplo peroxidasa de rábano (HRP) o
fosfatasa alcalina. A grandes rasgos, la prueba ELISA consiste en aplicar una capa de anticuerpos purificados a las proteínas de
las células anfitrionas sobre placas de microtitulación, seguida del producto proteico. Se agrega el conjugado anticuerpo:enzi-
ma y se deja que se una a las proteínas de las células anfitrionas unidas al anticuerpo. Se agrega un substrato apropiado para
que se desarrolle un color, que se analiza con un lector de placas por espectrofotometría. Un ELISA multiantígeno de tales ca-
racterísticas requiere una preparación de estándares de referencia apropiados representativos de las impurezas proteicas de las
células anfitrionas, para así servir como el inmunógeno en la preparación de los anticuerpos que se emplean en la valoración.
Estos estándares de referencia generalmente se preparan mediante un proceso de fabricación que proporciona todas las proteí-
nas esperadas de las células anfitrionas excepto la proteína producto. Es necesaria la ausencia total de la proteína producto en
esta preparación para evitar la producción de anticuerpos contra el propio producto cuando el estándar de referencia se em-
plea como inmunógeno. Debido a la diversa afinidad de los anticuerpos policlonales con las preparaciones multiantigénicas,
no se puede garantizar la exactitud absoluta de los métodos multiantígeno ni la capacidad de detectar todos los antígenos
posibles.

ELECTROFORESIS

Los métodos electroforéticos se encuentran entre las valoraciones más comunes y potentes empleadas para la evaluación de
la pureza y homogeneidad proteica. Son valiosas no sólo para la evaluación inicial y la separación de productos obtenidos me-
diante biotecnología sino también como métodos indicadores de estabilidad para detectar cambios moleculares o químicos en
la molécula, debidos a la desnaturalización, aglomeración, oxidación, desamidación, etc. Se facilita el uso de estos métodos
dada su sencillez y el hecho de que sólo requieren microgramos de muestra. Los dos tipos de valoraciones electroforéticas más
frecuentemene usadas para productos obtenidos por biotecnología son la electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato
de sodio (SDS-PAGE) y el isoelectroenfoque (IEF).
El método SDS-PAGE separa proteínas principalmente según su peso molecular ya que, en presencia del detergente aniónico
Dodecil Sulfato de Sodio, se forma un complejo proteína-Dodecil Sulfato de Sodio con carga neta negativa. En primer lugar, se
desnaturaliza la muestra en el detergente, que rompe las uniones no covalentes intra e intermoleculares que le dan estructura
a las proteínas y a continuación se somete a electroforesis en un soporte de gel de poliacrilamida. La migración de las proteí-
nas a través del gel es proporcional a su tamano; las proteínas más pequeñas migran más rápido que las grandes a través del
792 (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología / lnformacion General USP 37

gel. Con frecuencia, las muestras se separan electroforeticamente bajo condiciones reducidas y no reducidas para determinar
la existencia de impurezas con el mismo peso molecular o escisiones proteolíticas intramoleculares de la proteína de interés.
Aunque la SDS-PAGE no reductora se emplea normalmente para estimar el estado de aglomeración o de oligomerización de la
proteína de interés, este método sólo permite observar aglomerados u oligómeros estables en presencia del Dodecil Sulfato de
Sodio y en las condiciones usadas para la preparación y electroforesis de la muestra. Las proteínas que constan de cadenas
múltiples unidas por uniones disulfuro se descomponen y se dividen en cadenas polipeptídicas individuales. La detección de la
muestra después de la electroforesis puede ser cuantitativa mediante un análisis densitométrico de tinción con Azul Brillante
Coomassie o cualitativa, pero con mayor sensibilidad cuando la muestra está presente en cantidades de nanogramos si se reali-
za la tinción con plata. El SDS-PAGE con tinción con plata también puede llevarse a cabo cuantitativamente bajo condiciones
apropiadas. Con una validación adecuada, se puede usar la tinción con Azul Coomassie Brillante y la densitometría para obte-
ner una determinación cuantitativa de nanogramos de polipéptidos. El SDS-PAGE junto con la tinción con Azul de Coomassie
Brillante se emplean para determinar cuantitativamente la pureza de la muestra con respecto a dímeros y aglomerados y frag-
mentos peptídicos covalentes más grandes. Cuando el método se combina con la técnica de tinción con plata, se puede hacer
una evaluación de niveles bajos o de trazas de una nueva impureza al comparar directamente la muestra sometida a electrofo-
resis con el material o el estándar de referencia sometido a electroforesis en condiciones reducidas y no reducidas. En general,
la tinción con plata se emplea cualitativamente porque podría haber una variación importante en la unión con plata entre una
proteína y otra debido a una tinción de fondo heterogénea en ensayos de rutina. Se puede estimar la cantidad de una impure-
za mediante la electroforesis de una cantidad conocida de un estándar interno, como por ejemplo la albúmina sérica bovina, o
mediante diluciones menores de la proteína de interés en otros carriles del mismo gel. La separación SDS-PAGE de una proteí-
na puede combinarse con un método inmunológico, como por ejemplo la inmunotransferencia (immunoblotting). La transfe-
rencia Western (Western blot) resultante se emplea para identificar las bandas electroforéticas (es decir, la impureza relaciona-
da con el producto o con las proteínas de las células anfitrionas). Después de la electroforesis, se transfieren las proteínas sepa-
radas a una membrana de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y se hacen reaccionar con el anticuerpo de
interés. La visualización del complejo se realiza con un anticuerpo marcado enzimáticamente o radiomarcado.
El método IEF separa proteínas según su carga en un campo eléctrico. Las cargas en una proteína provienen de distintos
sitios en la cadena de aminoácidos, tales como grupos amino protonados, grupos carboxilo no protonados, grupos sulfhidrilo
no pro tonados, residuos de tirosina no protonados, residuos de cisteína oxidados y residuos desamidados. Sin embargo, existe
un pH para cada proteína en el cual la proteína es isoeléctrica y estas cargas se anulan mutuamente, siendo la carga neta efec-
tivamente cero. El IEF se realiza con proteínas nativas en un soporte de poliacrilamida de poros grandes o de gel de agarosa
con anfolitos (iones anfóteros de bajo peso molecular) que establecen un gradiente de pH debido a su migración dentro de la
matriz del soporte cuando se aplica un campo eléctrico. Simultáneamente, en presencia del campo eléctrico, las proteínas con
carga positiva migran hacia el cátodo y las proteínas con carga negativa migran hacia el ánodo. La migración finaliza cuando
cada proteína alcanza el valor de pH en el gradiente del soporte, donde su carga neta es cero. Este es el punto pi o isoeléctrico
aparente de la proteína. Como la migración de una proteína depende de su composición de aminoácidos, las formas alteradas
de la proteína y otras proteínas migrarán a diferentes puntos en el soporte. Los geles IEF pueden teñirse para visualizar las pro-
teínas con colorante Azul Brillante Coomassie o plata. El IEF se emplea para identificación o para asegurar la homogeneidad de
una proteína (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales) como se demuestra mediante el patrón de bandas en el intervalo de
pi correcto. También se puede emplear el método para evaluar la estabilidad de un producto biológico. La desamidación pro-
teica (es decir, la desamidación de la glutamina o de la asparagina), con el tiempo, produce nuevos ácidos carboxílicos que
generan moléculas con un pi más ácido. El IEF puede proporcionar información sobre el estado de glicosilación de glicoproteí-
nas tales como anticuerpos monoclonales, que pueden aparecer como muchas bandas debido a cambios en la carga aparente
de la molécula proteica como resultado de los grupos de ácido siálico. La interpretación de los resultados del gel de IEF suele
ser más difícil que los de SDS-PAGE y pueden exigir muchas suposiciones o juicios subjetivos.
Se está investigando exhaustivamente la electroforesis capilar de alta resolución (HPCE), debido a recientes avances en la
tecnología, ya que ofrece las ventajas potenciales de una alta resolución de las proteínas.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Durante mucho tiempo, se han empleado métodos cromatográficos para determinar la pureza de moléculas orgánicas y
proteínas pequeñas, tales come la insulina (ver Cromatografía (621 )) y para determinar la concentración de ingredientes acti-
vos y/o excipientes de productos farmacéuticos. Los métodos cromatográficos también son muy eficaces para la determina-
ción de la pureza de productos farmacéuticos obtenidos por la técnica de recombinación. Sin embargo, la cromatografía de
proteínas es mucho más difícil debido a las múltiples modalidades de interacción con el soporte cromatográfico producidas
por el tamaño y la forma, la carga y la hidrofobicidad de las proteínas. Los métodos cromatográficos comúnmente empleados
para aislar y caracterizar proteínas recombinantes son el RP-HPLC, HPIEC, cromatografía de exclusión por tamaño (HPSEC) y
cromatografía de interacción hidrofobica (HIL). Estos metodos incluyen la separación de proteínas y se emplean para determi-
nar la pureza de los ingredientes farmacéuticos activos, así como los niveles de impurezas o productos de degradación conoci-
dos. Una complicación en todos los métodos cromatográficos por columna es la determinación del equilibrio de masas entre la
carga de la columna y el eluato. Sin embargo, las técnicas de HPLC son valiosas cuando es necesario determinar la pureza y la
potencia de los productos farmacéuticos proteicos.
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Los análisis RP-HPLC más comunes se llevan a cabo en columnas que contienen una fase estacionaria C4 o C8 sobre un so-
porte de sílice o un soporte polimérico. También se utilizan tases estacionarias C 18, pero rna'> frecuentemente con péptidos
más pequeños en aplicaciones como el mapeo de péptidos. Se prefieren soportes con poros de un tamaño de al menos 300 A
para proteínas con un peso molecular mayor de 1O000. En la mayoría de los análisis RP-HfJLC, las proteínas se eluyen con
gradientes de acetonitrilo acuoso y se mantiene constante el ácido trifluoroacético en O, 1%. También se emplean otros amorti-
guadores del pH, como por ejemplo fosfato o Tris [tris(hidroximetil)aminometanol, donde el pH puede ajustarse para aumen-
tar la selectividad y lograr separaciones óptimas.
El HPIEC es un método importante para la determinación de la pureza. Estas separaciones se basan en cambios en la carga
de la molécula y son útiles para identificar y cuantificar impurezas comunes en proteínas de uso farmacéutico, tales corno for-
mas oxidadas (principalmente metionina oxidada) y desamidadas (glutamina y la asparagina) y formas fragmentadas o trunca-
das. Pueden emplearse fases estacionarias de intercambio iónico fuertes o débiles en soportes de sílice o poliméricos. La croma-
tografía de intercambio catiónico puede realizarse en resinas de tipo sulfopropilo y se usa para productos de oxidación y desa-
midación. Por lo general, las proteínas se cargan sobre una columna equilibrada con agua o una solución amortiguadora débil
y se eluyen con una gradiente salina, tal como cloruro de sodio de O a 1 M.
El HPSEC es una técnica que puede proporcionar información sobre la cantidad de aglomeración y fragmentación de las
proteínas de uso farmacéutico. Según la información que se necesite, la fase móvil puede mantener la proteína nativa y conte-
ner un amortiguador de pH acuoso tal como fosfato 100 mM, pH 7, o bien puede desnaturalizar la proteína con concentracio-
nes bajas de un agente caotrópico o detergente tal corno Dodecil Sulfato de Sodio al O, 1%. Los análisis se realizan isocrática-
mente, con una lectura característica entre 21 O y 220 nm según el amortiguador de pH usado. También puede emplearse la
detección a 280 nm pero es menos sensible. La cromatografía de exclusión por tamaño clásica se lleva a cabo en soportes
poliméricos blandos tales como dextranos, poliacrilamida o agarosa entrecruzados. Estos, sin embargo, son más adecuados pa-
ra aplicaciones a baja presión. Corno resultado, se han desarrollado varios soportes de mayor resistencia mecánica. Actualmen-
te, es común el uso de soportes basados en sílice y agarosa, entrecruzados disponibles en el mercado. También se utiliza el
HPSEC para la determinación de fragmentos de proteínas. Las cadenas fragmentada'> suelen permanecer unidas a través de
uniones disulfuro de residuos de cisteína. El tratamiento de la muestra con un agente reductor tal corno ditiotreitol o mercap-
toetanol rompe la unión disulfuro y separa las cadenas. Por consiguiente, las cadenas fragmentadas pueden separarse de for-
mas no fragmentadas mediante el HPSEC.
El HIC separa proteínas en base a diferencias en su hidrofobicidad bajo condiciones de adsorción y elución moderadas que
impiden en general la desnaturalización y posterior pérdida de actividad biológica. Una fase estacionaria moderadamente hi-
drófoba se emplea con una fase móvil acuosa de amortiguador de pH y una concentración inicial de sal alta para adsorber la
proteína, la cual luego se eluye selectivamente empleando una gradiente salina decreciente. Se producen interacciones entre
los residuos aminoacídicos no polares expuestos en la superficie de la proteína y los grupos hidrófobos presentes en la matriz
cromatográfica. Para su uso en el HIC se han desarrollado varios soportes polirnéricos y de sílice combinados con ligandos lige-
ramente hidrófobos tales corno poliéteres, éteres de fenilo o cadenas alquílicas cortas. Esta técnica puede emplearse en el aná-
lisis, purificación y caracterización de proteínas hidrófobas más lábiles. Se puede modificar la selectividad y la retención de la
proteína mediante el control de variables tales como el tipo y la concentración de sal, el pH y efectos selectivos de iones, tem-
peratura y diseño degradiente, así como mediante una cuidadosa selección de la fase estacionaria.

VALORACIONES CUANTITATIVAS

Las valoraciones biorniméticas (valoraciones que imitan el efecto biológico del producto) son de suma importancia en la
consideración de las valoraciones para productos obtenidos mediante biotecnología. Estas valoraciones miden la actividad del
producto y aseguran su eficacia. A grandes rasgos, existen tres tipos principales de valoraciones cuantitativas: las valoraciones
en modelos animales, valoraciones basadas en cultivos de células y los ensayos in vitro (fisicoquímicos). Cada una de estas va-
loraciones tiene una aplicación en el control de productos biológicos. Independientemente del tipo de valoración cuantitativa
empleada, es deseable y a veces necesario emplear una valoración biomirnética.
Valoraciones en Modelos Animales-Las valoraciones biomiméticas en modelos animales se han desarrollado para su uso
rutinario. Aunque el uso de estas valoraciones tiene una historia relativamente larga, presentan varias desventajas importantes
tales como la necesidad de un gran número de animales, instalaciones apropiadas y personal idóneo para el manejo de los
animales, el alto costo del análisis, su larga duración (de varios días a semanas) y la mala reproducibilidad de los resultados. A
pesar de todo, se utilizan principalmente porque no se ha desarrollado una valoración en cultivo de células o in vitro o no se
ha demostrado que estas técnicas sean de igual o mayor valor. Un ejemplo de tal valoración es la empleada para determinar la
actividad de la hormona humana del crecimiento (somatrem y somatropina). La potencia de la hormona humana del creci-
miento se determina mediante un ensayo biológico que mide el aumento de peso en ratas. Se controla el aumento de peso de
varias ratas hembras hipofisectomizadas durante 11 días, después de una serie de inyecciones diarias de hormona humana del
crecimiento. La potencia relativa de la muestra de prueba se obtiene por comparación estadística de la actividad de la muestra
con la de un material o estándar de referencia. Los modelos animales se pueden emplear como pruebas de identidad biológica
en caso de que se desarrollen valoraciones biológicas in vitro o fisicoquímicas para medir la potencia de los productos.
Valoraciones Biológicas Basadas en Cultivo de Células-Este grupo de valoraciones es comparativamente más fácil de
llevar a cabo, permite obtener resultados con más rapidez (1 a 3 días), es mucho menos costoso y utdi1a más eficientemente
los recursos que las valoraciones en modelos animales. Las valoraciones biológica'> ba-,ada'> en cultivo de células proporcionan
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información sobre el efecto del producto biológico en un sistema vivo, pero son imprecisas debido a las variaciones propias de
las células vivas, aunque no tanto como las valoraciones en modelos animales. Sin embargo, pueden automatizarse y en conse-
cuencia pueden repetirse con suficiente frecuencia para proporcionar resultados relativamente reproducibles y exactos. Un
ejemplo de este tipo de valoración es la medición de la actividad antiviral de o.-interferón humano en una línea de células di-
ploides de prepucio humano o en una línea de células de carcinoma de pulmón humano (A549). Esta valoración se realiza en
placas de microtitulación por incubación de células con o.-interferón seguida de la exposición al virus de la encefalomiocarditis.
Las células que sobreviven se detectan por unión a un colorante y se calcula la dilución de (1-interferón en la cual se produce la
protección en un 50% de la monocapa.
Valoraciones in Vitro (Fisicoquímicas)-Este grupo de valoraciones no depende de un modelo vivo, sino que se basa ge-
neralmente en la acción química de un producto biológico. Estos métodos son bastante sencillos, rápidos, precisos y exactos.
La actividad del activador plasminógeno tipo tisular (alteplasa), por ejemplo, puede determinarse con una valoración in vitro
de lisis del coágulo que puede automatizarse y proporcionar los resultados requeridos en cuestión de horas. Se forma un coá-
gulo de fibrina sintética en presencia del plasminógeno como resultado de la acción de la enzima trombina sobre el fibrinóge-
no. Cuando se agrega alteplasa, el plasminógeno se convierte en la enzima activa plasmina, que luego lisa el coágulo sintético.
El punto final de la valoración se sigue en forma espectrofotométrica o visualmente mediante la observación de la liberación de
burbujas de aire atrapadas. Otra ventaja de este tipo de valoración, debido a su precisión y exactitud, es que puede emplearse
para proporcionar estimaciones confiables de la estabilidad del producto. También se han desarrollado ejemplos de valoracio-
nes biológicas in vitro basadas en las interacciones anticuerpo:antígeno y proteína:ligando (receptor) para aplicaciones especí-
ficas. La aplicación de estos tipos de valoraciones ofrece muchas ventajas para determinar la potencia de los anticuerpos mo-
noclonales u otras proteínas muy específicas para un ligando cuya reactividad incluye un paso de enlace.

DETERMINACIÓN DE ADN

El ADN residual de las células anfitrionas es una posible impureza específica del proceso en un producto obtenido mediante
biotecnología. El ADN residual es diferente en cada producto ya que depende del organismo anfitrión y del procedimiento de
recuperación utilizado para elaborar el producto. Aunque no se han detectado efectos perjudiciales para la salud en productos
biológicos debido a su contenido de ADN, las agencias reglamentarias han pedido a los fabricantes que se aseguren un nivel
de reducido a bajo de ADN en productos obtenidos por biotecnología.
La técnica de hibridación de ADN (análisis de transferencia de punto, o dot blot) es la valoración de ADN más sensible y
rutinaria disponible para determinar el contenido de ADN en los productos. Sirve para valorar el proceso de purificación para
demostrar que se ha logrado un nivel bajo de ADN en la etapa inicial de la fabricación. El método se basa en la hibridación del
ADN celular de la muestra con sondas de ADN específicamente marcadas con 32 P o químicamente modificadas obtenidas del
ADN de la célula anfitriona. Primero se aisla el ADN residual en la muestra mediante un procedimiento que puede incluir la
hidrólisis de la proteína, cromatografía, extracciones orgánicas y precipitación en alcohol. Luego, se desnaturaliza el ADN aisla-
do y se aplica a una membrana de nitrocelulosa o nailon junto con un grupo de estándares diluidos progresivamente de ADN
anfitrión. A continuación, se aplican controles de ADN positivos y negativos y la membrana se introduce en un horno aproxi-
madamente a 80º o se la coloca bajo luz UV para así completar la unión del ADN a la membrana. Luego, se prepara una sonda
de ADN mediante desplazamiento de mella (nick translation), síntesis de iniciador aleatoria o por modificación química de un
extracto de ADN de la célula anfitriona. Se purifica la sonda de ADN y se desnaturaliza térmicamente a 95º. Luego se agrega a
la membrana tratada en el horno o con UV y se deja que se hibride con el ADN de las muestras aproximadamente a 42º en
presencia de formamida o a temperaturas mayores sin formamida durante 24 a 48 horas. A continuación se coloca la membra-
na entre dos placas radiográficas y se expone para producir una autorradiografía o se desarrolla por medios inmunoquímicos
empleando un sistema conjugado enzimático/sustrato similar a la prueba ELISA y/o al método de Western blot. Se estima el
ADN de la muestra por comparación visual de la intensidad del punto de la muestra con los estándares de ADN diluidos. Tam-
bién se puede explorar el autorradiograma por densitometría óptica. Se determina la sensibilidad de la valoración, es decir de
1 O a 250 pg, por el límite de detección visual por encima del fondo producido por estándares de ADN diluidos en serie.
Se han desarrollado otros métodos para determinar ADN por tecnología de sensores biológicos, o biosensores. En la actuali-
dad, esta metodología determina las impurezas totales de ADN y ácido nucleico más que el ADN específico de las células anfi-
trionas. Esta tecnología podría ser muy valiosa en el futuro, especialmente cuando se desarrollen métodos de unión a ADN más
específicos. Finalmente, la tecnología de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) recientemente desarrollada, que consiste
en la amplificación del ADN, puede resultar útil para detectar e identificar el ADN contaminante. Sin embargo, el uso cuantita-
tivo de esta tecnología aún debe perfeccionarse.

DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Una de las posibles modificaciones posteriores a la traducción que aparecen en las proteínas es la unión covalente de cade-
nas de oligosacáridos. La glicosilación es una característica de proteínas recombinantes expresadas en líneas celulares eucarióti-
cas. Aunque la cadena polipeptídica de una glicoproteína se sintetiza bajo el control directo del código genético, los oligosacá-
ridos no son productos primarios de los genes, sino que son sintetizados por enzimas conocidas como glicosiltransferasas. Esta
síntesis da lugar a la microheterogeneidad de las cadenas de carbohidratos. Además, la glicosilación depende de las líneas ce-
lulares, por lo que las glicoproteínas con cadenas polipeptídicas idénticas sintetizadas en distintas líneas celulares pueden tener
USP 37 Información General/ (1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología 795

estructuras de carbohidratos considerablemente diferentes. Los azúcares más comunes en las glicoproteínas incluyen los azúca-
res neutros (o-galactosa, o-manosa y L-fucosa), los aminoazúcares (N-acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina) y el azúcar
acídico conocido como ácido siálico.
Se pueden aplicar dos enfoques principales para determinar los azúcares covalentemente unidos a la glicoproteína. Ambos
aceptan que la microheterogeneidad es un fenómeno común entre las glicoproteínas y que la información obtenida representa
la composición promedio o la estructura representativa.
El primer enfoque es la determinación de la composición de azúcares en una glicoproteína, que puede realizarse mediante
varios métodos. Se pueden determinar los azúcares neutros y el ácido siálico por pruebas calorimétricas sencillas. El total de
azúcares neutros puede determinarse mediante la reacción con fenal y ácido sulfúrico y midiendo la absorbancia de la solución
a 490 nm, comparada con una curva estándar. Luego de una hidrólisis ligeramente ácida y la oxidación con peryodato, se
puede determinar el contenido de ácido siálico libre, utilizando ácido tiobarbitúrico y la absorbancia de la solución aproxima-
damente a 550 nm comparada con una curva estándar. Los azúcares neutros individuales pueden determinarse después de la
hidrólisis ácida, por varios métodos. Si no están derivatizados, se pueden separar mediante HPIEC a un pH alto y se pueden
cuantificar por detección amperométrica de pulsos. También se pueden convertir en peracetatos de alditol usando anhídrido
acético o en acetatos de aldononitrilo utilizando clorhidrato de hidroxilamina y piridina antes de la peracetilación, y los com-
puestos derivatizados se pueden separar por cromatografía de gases.
El segundo enfoque para determinar la composición de carbohidratos consiste en liberar y separar las estructuras de oligosa-
cáridos individuales unidas covalentemente a la glicoproteína. Esto requiere el conocimiento de los tipos de estructuras unidas.
La unión de azúcares a las proteínas puede ocurrir principalmente de dos maneras: mediante una unión 0-glicosídica que in-
cluye el grupo hidroxilo de la serina, treonina o aminoácidos modificados tales como la hidroxilisina o la hidroxiprolina, o me-
diante la unión N-glicosídica de la asparagina. Los oligosacáridos unidos en O pueden liberarse de la proteína por eliminación
beta en condiciones alcalinas y la reducción de los azúcares terminales reductores con borohidruro de sodio. Los oligosacáridos
unidos en N pueden liberarse químicamente por la hidrazinólisis o enzimáticamente usando una variedad de glicosidasas espe-
cíficas tales como endo H, endo F, o péptido-N-glicanasa. Los oligosacáridos se pueden separar por HPIEC a un pH alto y se
pueden cuantificar mediante una detección amperométrica por pulsos. Esto produce un mapa de oligosacáridos o carbohidra-
tos análogo al mapa de péptidos para la proteína.

DETECCIÓN DE AGENTES ADVENTICIOS Y ENDÓGENOS

Las valoraciones específicas de la biotecnología se centran en la detección de bacterias, hongos, micoplasmas y virus. Éstos
son ejemplos de los posibles contaminantes que pueden aparecer en la fermentación bacteriana y en el cultivo de células de
mamíferos. Se ejerce control de varias maneras, incluyendo la caracterización del banco de siembra maestro y los bancos de
células de trabajo para asegurar la ausencia de estos contaminantes, la evaluación de materias primas, el diseño y funciona-
miento de sistemas de fabricación cerrados, el análisis de lotes de producción y la validación de procesos de fabricación especí-
ficos para asegurar la inactivación o la eliminación de posibles contaminantes.
La ausencia de bacterias y hongos en las formas farmacéuticas estériles finales se evalúa por lo general mediante pruebas de
esterilidad según se describe en Pruebas de Esterilidad (71 ). Las valoraciones de micoplasmas se realizan mediante métodos de
cultivo estándar, empleando la incubación aeróbica y anaeróbica en medios sólidos en placas y caldos semisólidos en tubos de
ensayo y deben cumplir con el Código de Reglamentaciones Federales (21 CFR 610.12). Además, los micoplasmas no cultiva-
bles se detectan microscópicamente por el método de tinción con bisbenzimida de Hoechst.
Entre los diversos métodos empleados para detectar la contaminación por virus adventicios en líneas celulares se encuentran
la inoculación de líneas celulares indicadoras seleccionadas porque permiten la reproducción de una amplia gama de virus y su
control para detectar indicadores de infección viral tales como la citopatología, hemoadsorción, hemoaglutinación e inmuno-
fluorescencia; la inoculación de animales no infectados y el seguimiento de la patología y muerte; la inoculación de animales y,
después de cuatro semanas, la recolección y evaluación del suero para detectar anticuerpos contra virus específicos de impor-
tancia; y valoraciones inmunológicas específicas o sondas genéticas para detectar algunos virus importantes que no se pueden
detectar mediante los otros métodos indicados.
La expresión de genes de retrovirus endógenos es muy variable en diferentes células y líneas celulares de mamíferos. La na-
turaleza impredecible de su manifestación y la diversidad de sus propiedades bioquímicas y biológicas hacen imposible el uso
de una sola prueba y exigen una estrategia de pruebas combinadas. Los métodos de prueba generalmente empleados inclu-
yen la microscopía electrónica de transmisión de las células del banco de siembra maestro y de sedimentos obtenidos por ul-
tracentrifugación de medios de cultivos post-cosecha y exentos de células, diversas valoraciones de retrovirus infecciosos que
emplean líneas de células indicadoras susceptibles a retrovirus; la actividad de transcriptasa reversa; y la inducción de retrovirus
en las células del banco de células maestras usando sustancias químicas que inducen los retrovirus. Además de los métodos
virológicos clásicos, también se están comenzando a emplear otras técnicas más novedosas tales como la hibridación de son-
das moleculares.
796 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información Genero/ USP 37

(1046) PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS Y TEJIDOS

INTRODUCCIÓN

Este capítulo general proporciona una visión cabal sobre los aspectos a considerar para el desarrollo de productos derivados
de células y tejidos. El Glosario de Términos y Definiciones proporciona una lista de términos comúnmente usados en este cam-
po. Las terapias celulares y tisulares emplean productos médicos que contienen células humanas o animales que se administra-
rán en humanos para reparar, reemplazar, regenerar o aumentar una célula, tejido u órganos enfermos, lesionados o disfuncio-
nales de un receptor. Las células o tejidos pueden ser recolectados para su uso sin manipulación o se pueden propagar, expan-
dir, tratar farmacológicamente o alterar de otra manera sus características biológicas ex vivo antes de la administración. La di-
versidad de indicaciones clínicas y tipos de productos derivados de células y tejidos se presentan en la Tabla 7.

·-------·---------
Tabla l. Ejemplos de Productos de Terapia Celular
-------- -
Indicación
- - - · - · - - - - - - - - - - - - - - - - - - ----- -- ~ Pmdu~
Células madre y progenitoras hematopoyéticas que se han recolectado, propa-
Transplante de células madre hematopoyéticas después de la gado, seleccionado y/o tratado para eliminar células contaminantes mediante
terapia de ablación dispositivos y/o reactivos
·-------
Células T, células asesinas naturales (o Células NK, por sus siglas en inglés), cé-
lulas dendríticas o macrófagos expuestos a péptidos específicos del cáncer pa-
ra producir una respuesta anticancerígena; células cancerosas autólogas o ala-
génicas modificadas genética o bioquímicamente e irradiadas para producir
Cáncer una respuesta anticancerígena
Diabetes Células jJ de los islotes pancreáticos encapsuladas
Células madre/progenitoras autólogas o alogénicas; miocitos del músculo es-
Infarto de miocardio quelético; células madre cardiacas
·-----
Enfermedad del injerto contra el anfitrión Células madre mesenquimales alogénicas
----------------
Queratinocitos autólogos o fibroblaslos dérmicos alogénicos en un andamiaje
Cicatrización de heridas biocompatible
-
Defectos focales en el cartílago de la rodilla Condrocitos autólogos o alogénicos con o sin andamiaje biocompatible
Reparación ósea --------------
Células madre mesenquimales en un andamiaje biocompatible
--
Células progenitoras neuronales derivadas de tejidos embrionarios, fetales o
adultos; células modificadas genéticamente para secretar factores neurotrófi-
Enfermedades neurodegenerativas cos, con o sin encapsulación
Enfermedad infecciosa
--------------
Células T activadas
Enfermedad autoinmune Células T reguladoras (T,"°)
-·
Lesión de la médula espinal Células progenitoras neuronales
Células autólogas o alogénicas en biomateriales biocompatibles (geles) o es-
Reparación o regeneración de órganos 1 true.tura de andamiaje en 3 dimensiones

Los productos de terapia celular se pueden modificar mediante tratamiento con materiales genéticos de integración o no
integrados (ADN, ARN, ARN pequeño de interferencia, etc.) con el objetivo de cambiar el patrón de expresión genética. Por lo
general, se extraen células de un paciente, se modifican fuera de su cuerpo y luego se retornan al paciente. Las agencias regla-
mentarias consideran al producto celular modificado genéticamente ex vivo como un producto de terapia génica. Una gran
parte de la información de este capítulo general es pertinente al procesamiento, caracterización, fabricación y administración
de células modificadas genéticamente. Sin embargo, la información detallada acerca del uso de varios sistemas de transferen-
cia de genes, consideraciones para el monitoreo del paciente, análisis genético y demás consideraciones pertinentes a produc-
tos de terapia génica, se tratan en el capítulo general Productos de Terapia Génica (1047).
Este capítulo general describe aspectos relacionados con la fabricación, la obtención de componentes y la caracterización de
productos derivados de células y tejidos para asegurar su seguridad y eficacia. El Apéndice presenta una lista de guías y docu-
mentos reglamentarios relevantes. Los fabricantes de productos derivados de células y tejidos deben considerar y aplicar los
controles y procedimientos descritos en este capítulo para asegurar el uso seguro de los productos en humanos. Se están desa-
rrollando y validando continuamente nuevas metodologías, las cuales serán incluidas en la Farmacopea de los Estados Unidos
( USP) a medida que se encuentren disponibles. Las monografías de USP para productos tisulares específicos y derivados de teji-
dos describen las especificaciones de prueba con las que debe cumplir el producto durante toda su vida en el mercado. El
término producto re/u/ar SP refiPre a rélula<; o tPjirlo<; rl0 hurnvnos o animales vivos que han sido manipulados o que se usan de
modo tal que se reglamentan como terapias celulares somáticas, conforme a lo definido por la US Food and Drug Administra-
tion (Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. o FDA). El término producto derivado de tejidos se refiere a tejidos
humanos que se reglamentan de conformidad con las buenas prácticas para tejidos (GTP, por sus siglas en inglés). El término
productos de combinación se refiere a células combinadas con dispositivos médicos, tales como un andamiaje natural o sintéti-
co.
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 797

Consideraciones para la Incorporación de Conceptos del Sistema de Calidad en las Etapas

Tempranas del Desarrollo de Productos Derivados de Células y Tejidos

Los requisitos reglamentarios vigentes y futuros continuarán presentando desafíos a los que desarrollan productos derivados
de células y tejidos en lo que respecta a incorporar atributos robustos de calidad en etapas tempranas de la fase de diseño para
asegurar el énfasis en la seguridad del paciente mediante un alto grado de entendimiento del proceso. Los sistemas de calidad
modernos que armonizan las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes (BPFv) con otros sistemas reglamentarios farmacéuticos
generados fuera de EE.UU. [tales como la lnternational Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armo-
nización o ICH) y la lnternational Organization for Standardization (Organización Internacional para la Estandarización o ISO)]
y el sistema de calidad para dispositivos médicos de la FDA se reconocen como las nuevas normas mundiales. Estas nuevas
normas incluyen conceptos para desarrollo de producto tales como Calidad por Diseño (QbD, por sus siglas en inglés) y Tec-
nología Analítica de Procesos (PAT, por sus siglas en inglés). Asimismo, estos sistemas de calidad integran métodos para el me-
joramiento continuo y la gestión de riesgos que promueven la adopción de los avances científicos más recientes y de tecnolo-
gías innovadoras de fabricación.
El uso de los principios de Gestión de Riesgo de Calidad (QRM, por sus siglas en inglés) en etapas tempranas del desarrollo
del producto puede ser útil para la identificación de áreas de riesgo que pueden mitigarse antes de que sean incorporadas al
proceso de fabricación y afecten la seguridad y eficacia del producto. Los que desarrollan productos derivados de células y
tejidos deben emplear técnicas de gestión y evaluación de riesgos como componentes claves de sus sistemas de calidad. La
gestión de riesgos se define como un proceso sistemático para la identificación, evaluación y control de riesgos a favor de la
calidad del producto derivado de células o tejidos durante todo el ciclo de vida del producto. El uso de técnicas de QRM pue-
de ayudar a conseguir productos seguros y eficaces mediante la evaluación de riesgos para el paciente, la determinación de
límites en el espacio de diseño o el ranking de atributos de calidad. La QRM también ayuda a establecer y mantener un estado
de control mediante el uso de gestión de riesgos para conducir el control del proceso. Por último, la QRM se puede usar para
facilitar el mejoramiento continuo dando prioridad a las oportunidades de mejoramiento. El nivel de esfuerzo, formalidad y
documentación del proceso de gestión de riesgos debe ser acorde al nivel de riesgo, debe basarse en conocimientos científicos
y, finalmente, debe estar vinculado con la protección del paciente.
Los elementos de gestión de riesgo se han convertido en un paradigma aceptado y se pueden encontrar fácilmente en do-
cumentos guía reglamentarios de la FDA e internacionales, especialmente el documento ICH Q9. Para facilitar esta evaluación,
se han desarrollado diversas herramientas, las cuales proporcionan medios cuantificables para priorizar riesgos de manera que
se puedan identificar y corregir los elementos de más alto riesgo de un proceso.
Dependiendo del objetivo del programa de gestión de riesgo, los análisis de riesgo pueden presentar un grado mayor o me-
nor de formalidad. De manera preliminar, los análisis de riesgo menos formales entran en acción cuando es necesario acelerar
una evaluación de riesgos, por ejemplo para la resolución de un incumplimiento de fabricación. Resulta necesario un sistema
de evaluación de riesgos más formal para el desarrollo de procesos o productos, lo cual es especialmente importante cuando
se deben priorizar recursos limitados. Los sistemas formalizados se integran en herramientas bien establecidas que pueden
cuantificar riesgos en cada fase o etapa de la fabricación. Estos sistemas también se pueden usar para la evaluación de opcio-
nes de materias primas, establecimiento de prioridades de validación, alteraciones en las instalaciones, cambios de equipo y
deliberaciones sobre servicios.
Las herramientas formales de análisis de riesgos incluyen el mapeo del proceso, el análisis preliminar de riesgos, el Análisis de
Riesgo y Puntos Críticos de Control (HACCP, por sus siglas en inglés), el Análisis de Riesgo y Operabilidad (HAZOP, por sus
siglas en inglés), el Análisis por Árbol de Fallas (FTA, por sus siglas en inglés), el Análisis de Modo y Efecto de Fallas (FMEA, por
sus siglas en inglés) y el Análisis de Modo, Efecto y Criticidad de Fallas (FMECA, por sus siglas en inglés).
En lo que respecta a productos derivados de células y tejidos, el FMEA se ha usado comúnmente para identificar, cuantificar
y priorizar riesgos. El FMEA puede asignar una clasificación numérica en una de tres categorías:
• Severidad, que es la consecuencia de una falla;
• Ocurrencia, que es la probabilidad de que ocurra la falla basándose en experiencias o incumplimientos anteriores; y
• Detección, que se basa la capacidad para detectar la falla.
Se asigna una clasificación numérica a cada categoría (por lo regular del 1 al 5 o del 1 al 1O) que corresponde a la severidad de
la variación con respecto al intervalo del parámetro operativo, la probabilidad de una variación y la posibilidad de detectar una
variación antes de que afecte el producto. Los números menores denotan una probabilidad remota de detección, mientras que
los números más altos denotan la posibilidad de una falla o efecto de riesgo. El producto de los valores de severidad, ocurren-
cia y detección representa un Número de Prioridad de Riesgo (RPN, por sus siglas en inglés). Durante el proceso de evaluación
de riesgos se priorizan los RPN y se puede dirigir la solución más inmediata a las áreas de riesgo más elevado.

COMPONENTES USADOS EN LA FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS V

TEJIDOS

Introducción

Los fabricantes de productos derivados de células y tejidos deben asegurarse de que todos los componentes usados en la
fabricación sean adecuadamente calificados. Los ejemplos de componentes usados en la fabricación de productos de terapia
798 (1046> Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

celular o tisular incluyen células y tejidos de origen; biomateriales naturales o sintéticos; materiales auxiliares requeridos duran-
te la fabricación pero que no están destinados a aparecer en el producto terapéutico final; y excipientes usados en la formula-
ción de productos de terapia celular o tisular.
La calificación es el proceso de adquisición y evaluación de datos para establecer el origen, identidad, pureza, seguridad bio-
lógica y aptitud general de un componente específico para garantizar la calidad. La diversidad de productos de terapia celular
y tisular y de los materiales usados para producirlos dificulta recomendar pruebas o protocolos específicos para un programa
de calificación. Por lo tanto, se deben desarrollar programas racionales y científicamente sólidos para cada componente.
Las actividades de calificación de materiales cambiarán a medida que los productos pasen de la etapa de estudios clínicos a
la de obtención de autorizaciones y comercialización. Un programa de calificación bien diseñado se hace más exhaustivo a
medida que progresa el desarrollo del producto. Durante las etapas tempranas del desarrollo del producto, las cuestiones de
seguridad deben ser el foco principal de un plan de calificación de materiales. En las etapas posteriores, las actividades de califi-
cación de materiales deben desarrollarse completamente y cumplir con las BPFv.

Calificación de las Fuentes de Células y Tejidos

Diversas células y tejidos derivados de humanos y animales sirven como material de origen para productos derivados de cé-
lulas y tejidos. Las células de donantes que se pueden utilizar en los productos de terapia celular provienen de diferentes fuen-
tes:
1. Las células propias del paciente (productos celulares autólogos)
2. Las células de otro ser humano (productos celulares alogénicos)
3. Las células derivadas de animales (productos celulares xenogénicos)
El origen de las células usadas para una terapia celular o tisular determinada depende en gran medida de la compatibilidad,
pureza y disponibilidad. El uso de células autólogas presenta la ventaja de un mínimo nivel de inquietudes con respecto al re-
chazo inmunológico. No obstante, no siempre se cuenta con una fuente autóloga o o ésta no siempre es apropiada cuando el
tipo de célula es disfuncional, maligna, difícil de obtener o si está contaminada.
La alternativa es una fuente de células alogénicas compatibles que esté fácilmente disponible. La incompatibilidad inmunoló-
gica representa la principal preocupación con respecto al uso de fuentes de células alogénicas pues puede llevar al rechazo de
la terapia celular o tisular administrada. En receptores inmunocomprometidos, las células de donante pueden reaccionar con
las células del paciente, lo que puede resultar en la enfermedad del injerto contra el anfitrión, poniendo en riesgo la vida del
paciente. A pesar de las potenciales complicaciones del uso de células o tejidos de donantes alogénicos y ante la ausencia de
otras alternativas, la relación riesgo-beneficio es a menudo favorable. Existen diversas metodologías que sortean con éxito las
barreras inmunológicas para el uso de fuentes alogénicas. Los fármacos inmunosupresores desarrollados para el transplante de
órganos sólidos, así como los avances en la inducción de tolerancia inmune se aplican cada vez más al transplante de células.
Algunas células alogénicas desencadenan reacciones inmunológicas mínimas, incluso en receptores HLA incompatibles. Los
ejemplos incluyen células madre mesenquimales, algunas células dérmicas y epidérmicas y fibroblastos.
Pese a los avances en la derivación de nuevos tipos de células terapéuticas, particularmente células madre (células de adulto,
fetales, embrionarias y de pluripotencia inducida), la capacidad de generar ciertos tipos de células o tejidos aún está muy lejos
de ser alcanzada. Por consiguiente, los procesos actuales usan células y tejidos xenogénicos para tratar diversas enfermedades
o condiciones en los seres humanos. El uso de células xenogénicas debe atender inquietudes relacionadas con el rechazo in-
munológico y la transmisión de virus animales a los seres humanos (ver Fuentes Animales de Células y Tejidos, más adelante).
Algunos principios generales para la obtención de tejidos incluyen lo siguiente: (1) los sistemas deben permitir la rastreabili-
dad retrospectiva del material hasta el donante, mientras se cumple la legislación sobre privacidad; (2) deben tomarse medidas
para prevenir la transmisión de enfermedades infecciosas del donante al receptor; y (3) la obtención y el procesamiento asépti-
cos deben garantizar la seguridad del producto final, debido a que no es posible la esterilización terminal de productos que
contienen células y tejidos vivos. La FDA ha promulgado un conjunto de reglamentos específicos, referidos como Buenas Prác-
ticas para Tejidos (GTP), que tratan específicamente la necesidad de obtener y procesar tejidos de una manera tal que evite la
transmisión de una enfermedad transmisible. Se deben seguir las GTP y/o BPF para productos de terapia celular o tisular, de-
pendiendo del origen de la célula y de su lugar en el ciclo de vida del producto.

ELEGIBILIDAD DEL DONANTE

La FDA ha promulgado un conjunto integral de reglamentos que rigen el uso de tejidos y células humanos destinados para
implantes, transplantes, infusión o transferencia a un receptor humano. Se hace referencia a estos materiales como células y
tejidos o productos derivados de células y tejidos humanos (HCT/P, por sus siglas en inglés). El cumplimiento con los requisitos
de elegibilidad de donantes es de suma importancia para la obtención de HCT/P para uso médico, debido a que estos instru-
yen que es obligatorio revisar los registros médicos pertinentes de un donante para evaluar los factores de riesgo y la evidencia
clínica de agentes infecciosos transmisibles. Esto incluye la obtención de un historial médico y la realización de un examen
físico al donante para detectar enfermedades transmisibles. Asimismo, los donantes deben someterse a análisis de laboratorio
adecuados usando kits de prueba autorizados o aprobados por la FDA para enfermedades y agentes de enfermedades específi-
cos relevantes (RCDAD, por sus siglas en inglés). El examen de detección de enfermedades requerido será cada vez más amplio
a medida que se identifiquen nuevos RCDAD y se encuentren disponibles kits de prueba aprobados o autorizados por la FDA.
USP 37 Información General! (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 799

Dos fuentes de información sobre el examen de detección de enfermedades transmisibles son: la Guidance on Eligibility Deter-
mination far Donors of Human Ce/Is, Tissues, and Cel/ular and Tissue-Based Products (Guia sobre la Determinación de Elegibilidad de
Donantes de Células y Tejidos y Productos Derivados de Células y Tejidos Humanos) de la FDA y la Circular of lnformation (Circular
Informativa) de la AABB (http://www.aabb.org/Content/AbouCBlood/Circularsof lnformation/aabb coi.htm). No se requiere
determinar la elegibilidad de donante para HCT/P autólogos.

CÉLULAS Y TEJIDOS O PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS O TEJIDOS HUMANOS

Los HCT/P se pueden obtener de donantes comunes sanos, donantes cadavéricos o pacientes enfermos, por ejemplo, de
cáncer. Se debe evaluar la aptitud del tejido obtenido de pacientes con cáncer y otras enfermedades antes de la recolección
para asegurar la seguridad y el funcionamiento adecuados del producto de terapia celular final. Asimismo, la reglamentación
del Título 45 del CFR Parte 46 se aplica a todas las investigaciones en humanos financiadas por el gobierno federal. Esta regla-
mentación requiere que el uso de cualquier tejido extraído de donantes humanos sea examinado y aprobado por una Junta de
Revisión Institucional. Asimismo, esta reglamentación incluye consideraciones especiales para la investigación en presos, niños,
mujeres embarazadas o tejidos gestacionales. En todos los casos, se debe obtener el consentimiento adecuado, por escrito, del
donante o del pariente más cercano, que incluya una descripción del tejido a extraer y del uso previsto.
Se debe minimizar el riesgo de transmisión de enfermedades al operador de la fabricación mediante capacitación adecuada
sobre la manipulación de materiales potencialmente infecciosos y mediante el uso de equipo y vestimenta de protección. Los
tejidos deben obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperación aséptica con un alto grado
de seguridad.
Las células progenitoras hematopoyéticas (HPC, por sus siglas en inglés) son uno de los tipos de célula más utilizados para el
transplante humano. Estas células se pueden obtener de la médula ósea, de la sangre periférica o de la sangre del cordón um-
bilical. El origen de las células depende del paciente, la enfermedad y el protocolo clínico. Los métodos de procesamiento de
las células son similares, independientemente de su origen. Las HPC se pueden obtener de donantes saludables o pacientes
con trastornos hematológicos. Además de las reglamentaciones sobre HCT/P de la FDA, la American Association of Blood
Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre o MBB), la Foundation for the Accreditation of Hematopoietic Cell
Therapy (Fundación Para la Acreditación de la Terapia de Células Hematopoyéticas) y el National Marrow Donor Program (Pro-
grama Nacional de Donantes de Médula o NMDP) han publicado guías y normas aplicables a la recolección y el procesamien-
to de estos materiales.
Para fuentes de células o tejidos obtenidos de muestras quirúrgicas o de donantes cadavéricos, se aplican las prácticas co-
rrientes de salas de operación de hospitales. La calidad del aire en una sala de operación con acceso limitado típica es adecua-
da para dichos procedimientos. El personal de recolección debe tener la capacitación adecuada en todos los aspectos relativos
a la recuperación de tejidos: lavado quirúrgico, vestimenta, comportamiento dentro de la sala de operación, anatomía, prepa-
ración del sitio de intervención y técnica aséptica. Se requiere especial cuidado cuando la obtención de tejidos u órganos re-
quiera la manipulación prolongada del intestino, lo cual conlleva el riesgo de que se produzca una punción involuntaria del
intestino. Si el tejido contiene flora microbiana (p.ej., la piel), puede ser desinfectado adecuadamente en el momento de la
extracción con agentes antimicrobianos o bactericidas y un lavado minucioso.

FUENTES ANIMALES DE CÉLULAS Y TEJIDOS

Resultaría ideal que los productos de terapia celular constaran de células humanas fabricadas con una mínima exposición a
materiales derivados de animales. Sin embargo, en la actualidad, importantes necesidades médicas no satisfechas pueden ser
potencialmente tratadas mediante productos de terapia celular de células o tejidos animales, tales como los islotes pancreáti-
cos destinados al tratamiento de la diabetes. Las fuentes humanas de islotes pancreáticos están disponibles únicamente de
páncreas donados al momento de la muerte. La calidad de los islotes del donante de órganos es variable y el suministro dispo-
nible es inadecuado para satisfacer la potencial demanda. Un método consiste en obtener islotes pancreáticos de fuentes ani-
males apropiadamente calificadas para su uso subsiguiente en humanos (xenotransplante).
Los desarrolladores que pretenden usar células o tejidos animales en un producto de terapia celular deben tratar adecuada-
mente las cuestiones de salud pública y deben desarrollar metodologías para reducir el riesgo potencial de introducción y pro-
pagación de agentes infecciosos zoonóticos en la población general humana. La PHS Guideline on lnfectious Disease lssues in
Xenotransplantation (Guía sobre Cuestiones Relacionadas con Enfermedades Infecciosas en Xenotransplantes del Servicio de Sa-
lud Pública de EE.UU.) (enero de 2001) describe riesgos potenciales. La guía de la FDA Source Animal, Product, Preclinical, and
Clínica/ lssues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans (Aspectos sobre Fuentes Animales, Productos, Pre-
clínicos y Clínicos Relacionados con el Uso de Productos de Xenotransplante en Humanos) (abril 2003) presenta métodos y
expectativas actuales para minimizar los riesgos de los productos celulares xenogénicos.
El uso de tejido animal en la fabricación de productos de terapia celular requiere que el tejido se obtenga de una manera
controlada y documentada y que provenga de animales libres de patógenos designados, que hayan sido criados en cautiverio
en países o regiones geográficas con sistemas adecuados de prevención y control de enfermedades. Asimismo, el cuidado y
uso de animales debe ser aprobado por una comisión institucional acreditada para el cuidado y uso de animales. Los animales
donantes deben tener un linaje documentado, provenir de manadas o colonias cerradas y estar en programas de manteni-
miento y control de salud. Las instalaciones para albergar a estos animales deben estar certificadas por el USDA (Departamento
800 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

de Agricultura de los Estados Unidos) (para animales vertebrados grandes) o por la Association for Assessment and Accredita-
tion of Laboratory Animal Care lnternational (Asociación para la Evaluación y la Acreditación del Cuidado de Animales de Labo-
ratorio; AAALAC, por sus siglas en inglés) (para animales vertebrados pequenos) y deben cumplir con las recomendaciones es-
tablecidas por la Cuide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996) (Guía para el Cuidado y la
Utilización de Animales de Laboratorio del Consejo de Investigación Nacional, 1996), que se puede obtener a través de la AAA-
LAC (www.aaalac.org). Estas instalaciones deben contar con veterinarios y demás personal capacitado que garantice la salud
de los animales y la prevención de enfermedades. Los procedimientos empleados en las instalaciones deben estar documenta-
dos y se deben guardar registros. Los programas de mantenimiento y control de salud deben basarse en la atención veterinaria
estándar para cada especie, incluyendo exámenes físicos, monitoreo, pruebas de diagnóstico de laboratorio y vacunaciones.
Un método de partidas sucesivas o de ingresos y egresos totales (all-in-all-out) para trasladar a los animales en las instalaciones
puede minimizar el potencial de transmisión de agentes infecciosos.
Los componentes alimenticios deben estar documentados y excluir material reciclado o procesado a fin de reducir el riesgo
de enfermedades priónicas.
Para garantizar al máximo la seguridad del producto, tanto los donantes animales como sus tejidos deben ser examinados
en varias etapas del proceso para descartar la presencia de agentes microbianos. Estas pruebas de control deben emplear ensa-
yos que sean lo suficientemente sensibles y específicos para detectar bacterias, micoplasma, hongos o virus de interés. Los ani-
males donantes deben someterse a estudios de detección de enfermedades pertinentes antes de la extracción del tejido. Las
necropsias posteriores a la recuperación de tejidos, los programas de animales centinela y el archivo de órganos, tejidos, san-
gre y otras muestras de donantes también garantizan la seguridad del tejido animal para aplicaciones de terapia celular.
En general, se aplican condiciones de extracción aséptica similares en la obtención de tejido animal y humano. El tejido debe
obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperación aséptica con un alto grado de seguridad.
Se deben utilizar instalaciones especialmente disenadas para la extracción de tejidos, por lo general, en estrecha relación con la
instalación que alberga a los animales. Las características y atributos recomendados para las instalaciones de extracción de teji-
do animal deben incluir lo siguiente: (1) organización de etapas tales como afeitado, sedación y preparación para la sala de
operaciones en salas diferentes con controles ambientales apropiados; (2) filtración de partículas del aire de alta eficiencia (HE-
PA, por sus siglas en inglés); (3) instalaciones contiguas pero separadas para continuar con el procesamiento de tejidos; y (4)
áreas destinadas al retiro de cadáveres. Todo lo relacionado a la capacitación del personal, la manipulación y la punción del
intestino, y la desinfección se aplican a la extracción quirúrgica tanto de tejidos humanos como animales (ver la sección Células
y Tejidos o Productos Derivados de Células y Tejidos Humanos anterior). Cuando los investigadores establecen líneas celulares ani-
males para su uso como capa de células alimentadoras, es necesario crear, analizar y caracterizar bancos de células, según se
indica en la siguiente sección.

SISTEMA DE BANCOS DE CÉLULAS

Un banco de células es un conjunto de células obtenidas de células combinadas o derivadas de un único clan celular o tejido
de donante que se almacena en bolsas o viales en condiciones definidas que mantienen la estabilidad genotípica y fenotípica.
El sistema de bancos de células por lo general se compone de un banco maestro de células (MCB, por sus siglas en inglés) y un
banco de células de trabajo (WCB, por sus siglas en inglés), aunque es posible emplear otras metodologías. El MCB se produce
de acuerdo con las BPFv y, preferentemente, se obtiene de una fuente calificada (exenta de agentes adventicios) con antece-
dentes conocidos y documentados. Las células y tejidos humanos se deben obtener mediante un contratista autorizado para
adquisición de tejidos con un programa de calificación de donante que cumpla con el Título 21 del CFR 1271. El WCB se ob-
tiene o produce mediante la expansión de uno o más viales del MCB. El WCB, o el MCB en los ensayos iniciales, se convierte
en la fuente de células para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos de células contribuyen en gran
medida a la uniformidad en la producción de partidas debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. No obstan-
te, no siempre es posible o factible crear un banco de células, de modo que se pueden usar células primarias apropiadamente
analizadas y calificadas en lugar de crear bancos de células. Como mínimo, el MCB y el WCB deben analizarse para determinar
su identidad, esterilidad, pureza, viabilidad y la presencia de virus y micoplasma.

CALIFICACIÓN DE BANCOS DE CÉLULAS

El análisis de seguridad y la caracterización de bancos de células son etapas importantes para obtener un producto final uni-
forme que mantenga una uniformidad de lote a lote y que se mantenga exento de agentes adventicios. La norma ICH Q5A,
Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin (Evaluación de Seguridad
Viral de Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal) proporciona recomendaciones
específicas para el análisis de bancos de células para agentes virales. Aunque esta guía no está específicamente destinada para
los productos derivados de células o tejidos, por lo general se pueden aplicar las mismas pruebas. Pueden ser necesarios análi-
sis de virus adicionales dependiendo del predominio de enfermedades virales endémicas en la población donante. Los análisis
para calificar los MCB se realizan una sola vez y se pueden hacer con una alícuota del material del banco o con cultivos de
células derivados del banco de células. Se deben establecer especificaciones de manera prospectiva para la calificación del
MCB. Es importante documentar los antecedentes del MCB, los métodos y reactivos empleados para crear el banco y las con-
diciones de almacenamiento. Todos los materiales auxiliares requeridos para la producción de los bancos, tales como medios,
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 801

sueros, citoquinas, factores de crecimiento y enzimas también deben ser calificados, documentados y analizados de manera
apropiada.

ANÁLISIS DE SEGURIDAD DE LOS MCB Y WCB

Banco Maestro de Células (MCB)-EI análisis de seguridad para calificar el MCB incluye análisis para demostrar la ausencia
de agentes adventicios y virus endógenos. Los análisis de agentes adventicios deben incluir pruebas de detección de bacterias,
hongos, micoplasma y virus. La ausencia de virus adventicios debe comprobarse utilizando sistemas de prueba tanto in vitro
como in vivo y pruebas adecuadas específicas para la especie.
Banco de Células de Trabajo (WCB)-EI análisis de seguridad para el WCB es menos extenso y por lo general se enfoca en
el potencial de introducción de virus adventicios o en la activación de virus latentes durante el cultivo adicional requerido para
crear el WCB. Asimismo, se debe llevar a cabo el análisis de seguridad del final de la producción (EOP, por sus siglas en inglés)
para asegurar que las células se puedan expandir en un número máximo conocido de generaciones, a la vez que continúen
generando un producto aceptable. Para información acerca de los tipos de análisis de virus adventicios que deben realizarse a
las células del MCB, del WCB y EOP, consulte el capítulo Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos
de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal (1050).

CARACTERIZACIÓN DE LOS MCB Y WCB

La caracterización de los MCB y WCB incluye el análisis de identidad para establecer el origen de las especies, p. ej., análisis
de isoenzimas para confirmar el origen humano de las células. No obstante, la caracterización de los bancos de células debe
incluir evaluaciones adicionales como las que se mencionan a continuación:
• Cinética de crecimiento y tiempo de duplicación de la población
• Evaluación morfológica
• Porcentaje de confluencia en el pasaje
• Conteos de células
• Viabilidad (pre y poscrioconservación)
• Expresión fenotípica de tipos celulares deseados e indeseados (pre y poscrioconservación)
• Monitoreo de marcadores bioquímicos únicos (pre y poscrioconservación)
• Evaluaciones de actividad funcional (pre y poscrioconservación)
• Análisis de expresión génica y proteica (pre y poscrioconservación)
• Expresión de antígenos de histocompatibilidad inmunologica (HLA/MHC)
• Identificación genética molecular
• Estabilidad cromosómica

Materiales para Andamiajes Biocompatibles

La mayoría de los materiales para andamiajes naturales o sintéticos se reglamentan como dispositivos médicos, aunque los
andamiajes derivados de tejidos humanos, tales como la dermis se reglamentan como HCT/Ps. Siempre que sea posible, se
deben usar andamiajes que hayan sido previamente aprobados para otros usos clínicos, pues dichos materiales deberían haber
sido sometidos previamente a análisis exhaustivos de seguridad y calidad. Para aplicaciones en productos derivados de células
o tejidos, el material de andamiaje debe permitir la unión, proliferación y migración de células, y por lo regular resulta desea-
ble una alta porosidad para facilitar la siembra de células dentro del material. El andamiaje debe proveer una difusión adecua-
da de nutrientes para la salud de las células y la liberación de productos excretados por las células. El material debe contar con
una resistencia mecánica adecuada y debe ser susceptible a la manipulación, modificación química y fabricación. El material
del andamiaje debe ser biocompatible, relativamente inerte e inmunológicamente benigno.
Por lo general, los andamiajes se pueden clasificar como duros o blandos. Los andamiajes duros se usan en aplicaciones que
requieren una forma específica, tales como la formación de un vaso sanguíneo o una vejiga. Los andamiajes blandos se usan
en aplicaciones en las que es necesario que el producto se amolde flexiblemente con una forma existente del cuerpo.
Los materiales del andamiaje pueden ser polímeros sintéticos o naturales, biodegradables o permanentes. La biodegradación
permite la reabsorción o eliminación del andamiaje por parte del cuerpo sin manipulación. La velocidad de degradación del
andamiaje debe coincidir con la velocidad de formación o regeneración del tejido. La estructura del andamiaje natural debe
reemplazar al andamiaje que se degrada de tal manera que mantenga la integridad estructural del tejido u órgano que se está
regenerando. Por ejemplo, un vaso sanguíneo recientemente formado debe tolerar tanto la presión sanguínea interna como
las fuerzas mecánicas externas.
El polímero biodegradable sintético que se usa de manera más común es el ácido poliglicólico (PGA, por sus siglas en in-
glés). El ácido Poliláctico (PLA, por sus siglas en inglés) también se usa ampliamente, en ocasiones en combinación con el PGA.
Estos polímeros se degradan dentro del cuerpo, se eliminan fácilmente antes de la degradación y tienen un extenso historial de
uso en materiales de sutura. La policaprolactama (PCL), que presenta una velocidad de degradación menor a la del PLA o el
PGA, se usa en aplicaciones que requieren de una larga presencia en el cuerpo.
802 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

La matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) y sus derivados son materiales naturales que se usan para andamiajes
en la fabricación de productos de combinación de células y biomateriales. Las proteínas tales como el colágeno o la fibrina y
los polisacáridos como el quitosano o los glicosaminoglicanos (GAG) también han sido usados en el crecimiento de células
para fabricar productos de combinación. El colágeno es por mucho el sustrato más popular para células y ha sido moldeado en
andamiajes para una variedad de productos, principalmente en aplicaciones para la piel de ingeniería tisular. Los agentes de
entrecruzamiento tales como el glutaraldehído y las carbodiimidas solubles en agua se han usado para mejorar la fuerza de los
andamiajes naturales. Dependiendo del origen del material, los andamiajes naturales pueden ser inmunogénicos.
Cuando las células deben proliferar después de la siembra, el andamiaje y el sistema de cultivo de apoyo debe permitir el
intercambio de nutrientes y productos de desecho. Una matriz gruesa e impermeable conducirá a zonas de tejido necrótico.
Muchos dispositivos de tejido están diseñados de tal manera que puedan ser eventualmente retirados del paciente.
Se debe establecer la seguridad y biocompatibilidad del andamiaje y de los materiales que entran en contacto con el pro-
ducto. Se debe llevar a cabo una batería completa de las pruebas recomendadas por los capítulos Pruebas de Reactividad Bioló-
gica, In Vitro (87), Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88), y los documentos ISO 10993 o el FDA Blue Book (Libro Azul de
la FDA) G95-1. Los residuos del proceso y los productos de degradación derivados de la preparación del andamiaje deben
cuantificarse y se deben establecer límites. Es necesario establecer condiciones de estabilidad y almacenamiento de los materia-
les del andamiaje.

Calificación de Materiales Auxiliares

Los productos auxiliares incluyen una amplia variedad de materias primas y componentes usados en la fabricación. Pueden
incluir materiales relativamente simples o sustancias complejas como medios de cultivo, amortiguadores, factores de creci-
miento, citoquinas, componentes de cultivo y procesamiento, anticuerpos monoclonales y dispositivos de separación de célu-
las.
Los materiales auxiliares no están destinados a estar presentes en el producto terapéutico final. Por lo general, las formula-
ciones de medios definidos incluyen componentes como la albúmina y la transferrina, purificadas a partir de fuentes humanas
o animales. La purificación, el procesamiento y el análisis exhaustivo de estos componentes minimizan aún más el riesgo de
contaminación viral o microbiana, si bien no lo eliminan. Las cantidades residuales de materiales auxiliares usados en el proce-
so de fabricación, incluyendo proteínas recombinantes u otros componentes de medios definidos, pueden ser potencialmente
antigénicos por lo que se debe evaluar su eliminación del producto final y se deben establecer límites apropiados cuando sea
necesario.
Los riesgos conocidos se asocian con el uso de materiales auxiliares en la producción de productos de terapia celular. La
calidad de los materiales auxiliares utilizados en la elaboración de un producto de terapia celular puede influir en la seguridad,
potencia y pureza del producto. Idealmente, cada uno de los materiales auxiliares empleados en la fabricación de un producto
de terapia celular o tisular debe elaborarse en condiciones que cumplan con las BPFv. No obstante, las sustancias complejas o
únicas que resultan esenciales para el control de procesos o la producción pueden no estar disponibles a través de proveedores
que las producen de acuerdo con las BPFv. En este caso, el fabricante de productos de terapia celular o tisular debe desarrollar
una estrategia científicamente sólida para calificar la materia prima. Un programa de calificación de materiales auxiliares utiliza-
dos en la fabricación de productos de terapia celular y tisular debe incluir los siguientes puntos: (1) identificación y selección,
(2) aptitud para uso en la fabricación, (3) caracterización y criterios de aceptación, (4) calificación del proveedor y (5) garantía
de calidad. Se deben generar archivos históricos de los lotes para cada material auxiliar.
El cumplimiento con las especificaciones establecidas se debe comparar con los datos provistos en el Certificado de Análisis.
La rastreabilidad es esencial y se deben anotar los números de lote para cada material auxiliar en los registros de producción
del producto derivado de células. Se debe consultar el capítulo de información general de USP Materiales Auxiliares para Pro-
ductos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular (1043) para información específica sobre la implementación de un programa de
calificación apropiado para estos materiales. Otros capítulos de USP tratan aspectos que se deben considerar con respecto a la
calificación de materiales auxiliares específicos (p.ej., Suero Bovino (1024), Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de
Funcionalidad (90) y Factores de Crecimiento y Citoquinas Usados en la Fabricación de Productos de Terapia Celular (92)).

Calificación de Excipientes

Durante las etapas finales del proceso de fabricación, es posible incluir excipientes o sustancias que incrementan la estabili-
dad de las células terapéuticas. Los ejemplos de excipientes incluyen medios de cultivo, solución salina USP u otras soluciones
de electrolitos aprobadas para inyección, proteínas exógenas tales como albúmina sérica humana o crioprotectores tales como
dimetil sulfóxido (DMSO). Los excipientes no están destinados a ejercer un efecto terapéutico directo sobre el paciente, sino
que están destinados a contribuir con el mantenimiento de los atributos de calidad del producto celular final. Debido a que los
excipientes se administrarán al paciente junto con las células, se debe poner especial atención a su calificación. En general,
siempre que sea posible, deben usarse excipientes que ya hayan sido aprobados por la FDA para uso humano. Si se usan exci-
pientes no aprobados, debe realizarse una evaluación de la seguridad completa. Para los excipientes novedosos, tales como
soluciones para crioconservación, pueden ser necesarios estudios de seguridad preclínicos apropiadamente diseñados.
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 803

FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS O TEJIDOS

Introducción

La fabricación de productos derivados de células o tejidos requiere de diversas de operaciones y manipulaciones por parte de
individuos bien capacitados en técnicas de procesamiento aséptico. La competencia técnica del personal es fundamental para
la seguridad y eficacia del producto. Los productos autólogos presentan más retos para el procesamiento celular y tisular pues-
to que deben desarrollarse procedimientos para segregación de lotes, autorización de línea y procesos operativos a fin de redu-
cir las posibilidades de confundir lotes para pacientes específicos (ver Consideraciones sobre el Diseño y la Operación de Instala-
ciones a continuación).

Aislamiento y Selección de Células

Los principios generales para el procesamiento de tejidos humanos o animales después de su extracción aséptica son inde-
pendientes del origen de la célula o tejido. La fabricación de productos celulares puede llevarse a cabo en una instalación de
fabricación ubicada en las inmediaciones del sitio clínico o en una instalación de fabricación de productos celulares central dis-
tante. El material celular o tisular de origen debe ser envasado en envases estériles a prueba de fugas y transportado desde el
área de extracción al lugar de procesamiento en condiciones controladas que mantengan la viabilidad de las células. El medio
líquido en el cual se sumergen las muestras durante el transporte debe ser óptimo para mantener la viabilidad de células y
tejidos. Este medio de transporte puede complementarse con antibióticos. Los niveles de antibiótico en los amortiguadores del
proceso deben disminuirse y, finalmente, eliminarse durante las etapas subsiguientes del procesamiento, de modo que los anti-
bióticos no estén presentes en el producto celular final. En el caso de productos sanguíneos o de tejidos con gran cantidad de
sangre, el medio de transporte o solución amortiguada de electrolitos debe contener un anticoagulante.

AISLAMIENTO

Por lo general, se realiza una disección de órganos o tejidos sólidos para dejar expuesta la región deseada. Este material se
puede usar tal como está para transplante o se puede someter a procesamiento adicional. Si se desean organoides multicelula-
res (por ejemplo, los islotes de Langerhans) o suspensiones de célula única, el tejido se puede someter a disgregación mecáni-
ca o enzimática. La disgregación física se puede lograr con instrumentos que homogeneizan el material impartiendo grandes
fuerzas de corte o dividiendo el tejido en partes más pequeñas. Alternativamente, el material se puede comprimir o pasar a
través de tamices con tamaños de malla determinados.
La digestión enzimática de tejido conectivo extracelular es otro método común para disociar el tejido sólido, en la cual se
usan diversas enzimas, incluyendo colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, hialuronidasa, papaína y quimotripsina. Se pueden
agregar enzimas con actividad nucleasa, como la desoxirribonucleasa, para contribuir en la digestión de los ácidos nucleicos
liberados de las células dañadas y evitar la aglomeración excesiva de las células. Al final de la incubación, la suspensión de célu-
las puede ser sometida a una acción de bombeo leve para dividir aún más los cúmulos multicelulares hasta lograr el tamaño o
la composición deseados. Habitualmente, los métodos de disgregación enzimática y física se combinan para lograr el resultado
deseado.
Debido a que las células sanguíneas o de médula ósea son intrínsecamente suspensiones, la manipulación mecánica por lo
general se limita a la extracción de plasma y agregados, lo cual se consigue mediante centrifugación y filtración.
Las actividades de aislamiento de células y tejidos que implican etapas abiertas de manipulación deben llevarse a cabo en
una cabina de seguridad biológica ISO 5 (clase 100). El entorno de la cabina de seguridad biológica debe ser adecuado para
mantener operaciones de procesamiento aséptico. Para HCT/P que sufren una manipulación mínima en sistemas cerrados, es-
tos entornos pueden estar controlados pero sin clasificación. No obstante, para productos de terapia celular y tisular que se
manipulan y fabrican de conformidad con las BPFv, el entorno de la cabina de seguridad biológica debe estar controlado y
clasificado, por lo general como un cuarto limpio ISO 7 (clase 1O 000). Se deben tomar precauciones para segregar los aisla-
dos tisulares y celulares específicos del paciente.

SELECCIÓN

Por lo general, las suspensiones de células son una mezcla de tipos celulares que pueden requerir procesamiento adicional, a
fin de aislar una población celular de interés y para reducir el nivel de tipos celulares no deseados, tales como células tumorales
potencialmente contaminantes. Diversas técnicas de aislamiento y separación de células proporcionan un alto rendimiento de
poblaciones celulares puras.
Las poblaciones celulares se pueden enriquecer selectivamente variando la fuerza y la duración del centrifugado. La separa-
ción también se puede lograr mediante centrifugación isopícnica, donde la suspensión de células se centrifuga en un medio de
gradiente que abarca todas las densidades de las células de la muestra. Las centrífugas de elutriación de flujo continuo espe-
cialmente diseñadas separan poblaciones celulares sometiendo una suspensión de células a fuerzas centrífugas y de corriente
líquida opuestas en una cámara especial dentro del mecanismo del rotor. Las poblaciones celulares se separan dentro del rotor
804 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

según sus tamaños y densidades y se eluyen selectivamente fuera de la cámara del rotor al aumentar la fuerza de corriente
líquida. Finalmente, otros métodos implican la adición de agentes de alta densidad como el almidón hidroxietílico a la suspen-
sión celular. Los procedimientos de concentración y separación como estos con frecuencia ocasionan la pérdida de células de-
bido a la aglomeración y agregación.
La separación celular también se puede lograr aplicando técnicas que toman ventaja de las características citológicas o bio-
químicas únicas de distintas poblaciones celulares. La aglutinina de soja agrega células que contienen un grupo particular de
carbohidratos que se expresa en células maduras de la sangre pero no en células madre, permitiendo el enriquecimiento de las
células madre. Los linfocitos poseen el antígeno CD2 que actúa como receptor de eritrocitos ovinos. Al agregar eritrocitos ovi-
nos a la mezcla de células, los linfocitos forman rosetas alrededor de los eritrocitos ovinos y posteriormente se separan median-
te centrifugación diferencial. Algunas aplicaciones aprovechan la capacidad de ciertas poblaciones de células de adherirse a la
superficie de sustratos sólidos específicos, como el plástico para cultivo de tejidos, materiales revestidos de colágeno y losan-
damiajes de polímeros naturales y sintéticos. El tipo celular unido específicamente se recupera selectivamente en la superficie y
se retira de la suspensión de células inicial.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas específicas de superficie de células se pueden usar tanto para la se-
lección positiva como para la selección negativa de células. Por ejemplo, una población celular unida con anticuerpos mono-
clonales puede ser retirada de la suspensión celular después de su exposición a partículas magnéticas recubiertas con anticuer-
pos antimonoclonales. Las partículas magnéticas y sus células unidas se retiran de la suspensión celular magnéticamente. Las
suspensiones de células no marcadas se pueden verter o incubar sobre superficies, como matraces de plástico o microesferas
recubiertas de anticuerpos monoclonales para aislar poblaciones celulares particulares. Además, se pueden separar diferentes
tipos de células, utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), mediante la
unión de anticuerpos con marcadores fluorescentes a un tipo de célula particular.
Otras técnicas enriquecen poblaciones de células destruyendo células no deseadas. Por ejemplo, algunos anticuerpos mono-
clonales unidos a células son capaces de fijar y activar el complemento que se agrega exogénicamente, provocando lisis celu-
lar. Algunos procedimientos utilizan agentes citotóxicos o inhibidores mitóticos para destruir selectivamente células no desea-
das. Estos métodos por lo regular se dirigen a subpoblaciones celulares con altas tasas de crecimiento, tales como las células
tumorales. Finalmente, un anticuerpo se puede conjugar con un grupo tóxico, como la ricina, y permitir que el agente citotó-
xico alcance la población celular deseada. La mayoría de estos procedimientos requieren varias etapas de lavado para garanti-
zar la eliminación de las células muertas, fragmentos de células y agentes citotóxicos del producto celular final.

Expansión y Diferenciación de Células Ex Vivo

EXPANSIÓN EX VIVO

Un aspecto fundamental para los fabricantes de productos celulares y tisulares es la capacidad de producir y administrar al
paciente una dosis terapéuticamente relevante de la población celular requerida. Según la aplicación de que se trate, el pro-
ducto puede ser de un tipo celular puro y homogéneo, o una mezcla de diferentes tipos celulares funcionales. Hay muchas
poblaciones de células blanco presentes en bajos niveles o baja pureza en los tejidos complejos de fuentes primarias. En estos
casos, la producción de una dosis terapéutica se puede lograr sólo mediante el enriquecimiento y la expansión ex vivo específi-
cos de las células requeridas.
La expansión ex vivo de células se puede presentar en cultivos en suspensión (p.ej., células T o células madre hematopoyéti-
cas y progenitoras), cultivos adherentes (p.ej., células madre mesenquimales, células madre embrionarias, células madre pluri-
potentes inducidas, células madre neuronales o fibroblastos dérmicos) o una mezcla de ambos (p.ej., expansión del estroma
medular). Existen numerosas tecnologías para el cultivo de células. Las células se pueden propagar en matraces de cultivo de
tejidos (matraces T), frascos tipo rodantes, andamiajes poliméricos o bolsas flexibles, permeables a gases, por lo general, den-
tro de incubadoras con control de temperatura, humedad y composición gaseosa. Los sistemas para cultivo de células multica-
pa de alta capacidad compuestos por sistemas de bolsas múltiples de plástico para cultivo de tejidos y biorreactores que em-
plean microportadores permiten llevar a cabo la expansión, recolección y formulación en un sistema cerrado. Las unidades de
fermentación de pequeña escala tradicionales se pueden usar para la expansión de células en cultivos en suspensión. Asimis-
mo, es posible expandir células adherentes en esas unidades ya sea proporcionado una superficie de adherencia (microporta-
dores, perlas recubiertas o discos) o adaptando las células para propagarlas en un cultivo en suspensión. Algunos sistemas de
cultivo se diseñan específicamente para la propagación de células para aplicaciones terapéuticas. Estos por lo general, son sis-
temas cerrados que usan cartuchos desechables para el biorreactor en unidades de procesamiento automático con control di-
recto de temperatura, composición gaseosa y velocidad de perfusión de medios. En algunas ocasiones el software automatiza-
do permite el rastreo de paciente-donante, así como documentar las condiciones de cultivo y las manipulaciones. Estas carac-
terísticas son útiles en el diseño e implementación de los programas de Control de Calidad (QC) de liberación de producto y
para la documentación de Garantía de Calidad (QA) de corridas de procesamiento.
En cultivos adherentes, las células por lo general se recolectan de la superficie en la que se han expandido. Los métodos de
liberación incluyen la agitación física, la ruptura enzimática, la quelación de iones metálicos y la inhibición competitiva de mo-
léculas de adhesión o de matriz. Como se describió anteriormente, debe tenerse en cuenta la fuente, la seguridad, la toxicolo-
gía y el análisis de residuos para cualquier reactivo utilizado para liberar células adherentes durante la fabricación. Algunos sis-
temas específicos para ciertos productos no requieren la liberación de células adherentes. Las células se expanden en un anda-
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 805

miaje sintético o natural biocompatible que luego se aplica en forma tópica (por ejemplo, sustitutos de piel modificados por
ingeniería) o las células se cultivan dentro o fuera de fibras para perfusión ex vivo (por ejemplo, hepatocitos en dispositivos de
fibra hueca para tratar hepatopatías).
En todos los casos, se deben optimizar los parámetros estándar de cultivo de células para maximizar la eficiencia del proceso.
Tales parámetros incluyen la composición del material celular de origen, la densidad de siembra inicial, la composición de los
medios, la velocidad de recambio de los medios, la temperatura, la composición gaseosa, el pH y la velocidad de entrega. Se-
gún la naturaleza del producto, es necesario definir el efecto potencial de los parámetros del proceso sobre la potencia y la
función de las células blanco.
Biorreactores-Se requieren biorreactores y dispositivos especializados para la fabricación de productos de combinación tri-
dimensionales. Estos biorreactores sostienen los andamiajes/matrices biocompatibles para la fabricación de la construcción.
Aunque el biorreactor puede proporcionar un sistema cerrado para la fabricación de construcciones, éste genera el reto de
acceder al andamiaje para la siembra de células y durante la obtención de muestras para el análisis de liberación de producto
mientras se mantiene la esterilidad. Los biorreactores son, por lo general, dispositivos de un solo uso, con lo cual se evita la
contaminación cruzada entre productos. De preferencia, el producto no será reenvasado para su transporte y entrega. Por
ejemplo, los biorreactores también pueden servir como envase final para el transporte del producto.
La prueba de envase-cierre se debe llevar a cabo en todos los sistemas de envase-cierre finales. Se debe verificar la compati-
bilidad para la esterilización del biorreactor y del andamiaje y el proceso de esterilización debe ser validado para cada configu-
ración de producto. Los productos lixiviables y extraíbles de los materiales en contacto con el producto tales como biorreacto-
res y componentes de envasado deben cuantificarse y se deben establecer límites.
En los sistemas cerrados de biorreactores puede ser difícil observar o muestrear células. La medición de parámetros metabóli-
cos puede servir de método sustituto susceptible de validación con el que se puede evaluar la tasa de proliferación y predecir el
momento de la recolección del producto celular. Debe definirse bien la relación entre tales parámetros y la viabilidad, la poten-
cia y la función del producto celular. Puede ser necesaria la purificación y el enriquecimiento de las células blanco después de
la expansión mediante métodos como los descritos anteriormente.

DIFERENCIACIÓN

Algunos productos de terapia celular requieren diferenciación de linaje o funcional de las células de origen. Por ejemplo, a
través de los procesos de expansión de células madre hematopoyéticas, normalmente se generan productos que contienen
una mezcla de células madre multipotentes, células progenitoras comprometidas hacia un linaje y células diferenciadas hacia
un linaje. La composición de estos productos se puede manipular mediante diversas combinaciones de factores de crecimiento
y citoquinas durante el proceso de expansión. Lo opuesto se aplica a los procesos en los que las células maduras son desdiferen-
ciadas para permitir que luego vuelvan a comprometerse hacia un linaje determinado (por ejemplo, los condrocitos en la repa-
ración de cartílago). Algunos ejemplos específicos de la manipulación ex vivo son la producción de células T específicas para
antígenos destinados a tratar determinadas enfermedades o la obtención de tipos de células terapéuticas a partir de células
madre embrionarias. Antes de su liberación para uso clínico, las células blanco diferenciadas resultantes deben ser completa-
mente caracterizadas. Puede ser necesario evaluar el potencial de desdiferenciación de células multipotentes que hayan sido
sometidas a diferenciación para garantizar la seguridad del producto. Cuando las células hayan sido expandidas y subsiguien-
temente diferenciadas, se puede llevar a cabo el análisis de cariotipo o ensayos de transformación in vitro para demostrar que
las células son aceptables para uso clínico.

MANIPULACIÓN GENÉTICA EX VIVO

La modificación genética de células ex vivo es un procedimiento común de procesamiento que se usa para alterar el patrón
de expresión génica en una población definida. La introducción de materiales genéticos integrantes o no integrantes (ADN,
ARN, ARN pequeño de interferencia) se lleva a cabo a fin de inducir la expresión de nuevos genes y productos o para inhibir la
expresión génica endógena. La modificación genética ex vivo en entornos de transplante autólogo implica la manipulación de
una población de células recolectada o expandida de un paciente y la readministración subsiguiente de las células al donante.
En un entorno de transplante alogénico común, una población de células estable y modificada genéticamente que ha sido
caracterizada y de la cual se ha generado un banco, se administra a una amplia población de pacientes. Con el propósito de
controlar la enfermedad del injerto contra el anfitrión en transplantes alogénicos de médula ósea, las células T de donantes
seleccionadas han sido tratadas con genes letales, como el de la timidina quinasa, que hacen que las células sean susceptibles
al tratamiento con ganciclovir después del transplante. Entre los ejemplos de productos de terapia celular autólogos genética-
mente modificados se incluye la transducción de células tumorales con citoquina u otros genes inmunomoduladores, linfocitos
transducidos con receptores para antígenos tumorales y la introducción en linfocitos recolectados de un vector de ribozima
antiviral como una estrategia para tratar la infección por virus de inmunodeficiencia humana. Entre los ejemplos de productos
alogénicos de terapia celular se incluyen líneas de células tumorales genéticamente modificadas e irradiadas que se usan como
vacunas contra tumores y células encapsuladas transfectadas con un gen para expresar un factor neurotrófico para una admi-
nistración localizada de proteína terapéutica en el sistema nervioso central.
Las células genéticamente modificadas ex vivo se consideran productos de terapia génica. Las cuestiones relacionadas con
los productos de terapia génica se tratan en detalle en el capítulo general Productos de Terapia Génica (1047), en especial lo
 ,.
806 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

referente a la producción del vector o material genético usado para conseguir la transferencia génica, las estrategias de prue-
bas analíticas, la seguridad del paciente y el monitoreo. La fabricación, procesamiento de células y las metodologías de control
de procesos tratadas con anterioridad se pueden aplicar a los procedimientos usados para manipulación genética. Con fre-
cuencia, las poblaciones celulares genéticamente modificadas se aíslan y expanden o seleccionan antes de la introducción del
material genético. Se cuenta con equipo y procesos especializados para la introducción de material genético el cual debe ser
validado y monitoreado. Las cuestiones relacionadas con la generación de bancos de células y estabilidad aplican a líneas de
células usadas en productos alogénicos de terapia celular que se establecen y crioconservan en MCB y WCB. Por último, las
cuestiones relacionadas con el análisis y la administración de la población de células genéticamente modificadas se analizan
más adelante en este capítulo.

Formulación de Productos Derivados de Células y Tejidos

Las metodologías para formular productos derivados de células y tejidos dependen en gran medida del tiempo de almacena-
miento planeado para las células antes de la administración al paciente. Para algunos productos derivados de células, el tiempo
entre el fin de la fabricación y la administración al receptor previsto puede medirse en el orden de horas a días. Otros produc-
tos derivados de células pueden crioconservarse para extender su vida útil. Una metodología distinta para formular productos
derivados de células y tejidos puede implicar la adición de un andamiaje natural o sintético que pueda facilitar el manejo, la
protección de las células de la respuesta inmune y la creación de una forma específica que contribuya con el efecto terapéuti-
co. Las consideraciones para formular cada uno de estos tipos de productos derivados de células y tejidos se analizan a conti-
nuación.

PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS Y TEJIDOS NO CRIOCONSERVADOS

Los productos que constan de suspensiones de células para administración en pacientes dentro de las horas posteriores a su
fabricación con frecuencia se formulan en soluciones amortiguadas estériles, adecuadas para administración directa. Para otros
productos derivados de células y tejidos no crioconservados, es posible extender la vida útil de horas a días, usando soluciones
que contengan nutrientes y antioxidantes apropiados. En la mayoría de los casos, estos excipientes no están destinados para su
administración directa a pacientes. Por consiguiente, puede ser necesario eliminar los excipientes antes de la administración al
paciente (ver Preparación y Administración del Sitio Clínico). Cuando se va a administrar un amortiguador para formulación no
aprobado a pacientes, se debe llevar a cabo un análisis toxicológico preclínico.

PRODUCTOS DERIVADOS DE CÉLULAS Y TEJIDOS CRIOCONSERVADOS

La mayoría de las formulaciones de medios de crioconservación de células se suplementan con DMSO del 5% al 10% con o
sin almidón hidroxietílico (por lo general al 6%) y una proteína plasmática como albúmina sérica humana del 4% al 10% en
una solución salina balanceada. El DMSO previene la deshidratación al alterar la concentración aumentada de soluciones extra-
celulares no penetrantes durante la formación de hielo. La solución polimérica de hidroxietilo de alto peso molecular protege a
las células de la deshidratación puesto que el agua se incorpora en cristales de hielo extracelulares. El uso de proteínas, a me-
nudo, determina una recuperación y viabilidad máximas de células después de descongelar. En ocasiones se usa suero (de 5%
a 90%) en lugar de proteínas específicas. Algunas formulaciones para crioconservación están completemente exentas de pro-
teína.
La concentración óptima de células para crioconservación depende del tipo de célula y debe determinarse empíricamente,
pero por lo general oscila entre 10 6 y 10 7 células por mL. La homogeneidad y viabilidad de la población de células que se
crioconservan también puede diferir después de la descongelación y se debe evaluar cuidadosamente. En los casos en los que
el producto final derivado de células o tejidos está destinado para descongelación y administración inmediata, la presencia de
DMSO en el amortiguador de la formulación somete al paciente a un nivel incrementado de toxicidad relacionada con la infu-
sión, aunque esto se relaciona con el volumen administrado y con la concentración final del crioconservante. Referirse a la sec-
ción Preparación y Administración del Sitio Clínico para consideraciones adicionales.

CÉLULAS COMBINADAS CON ANDAMIAJES BIOCOMPATIBLES

Muchos productos de terapia celular y tisular se administran en conjunto con un andamiaje biocompatible. Por ejemplo, los
productos para cicatrización de heridas o sustitutos de piel contienen células sembradas en un andamiaje. La estructura bioquí-
mica y física del andamiaje y el método para combinar células con el andamiaje son específicos para cada producto.
Las células se pueden cargar en un dispositivo de membrana semipermeable para administración. Por lo regular, el tamaño
de poro de la membrana es lo suficientemente grande para permitir que los factores terapéuticos secretados por las células
pasen, pero es lo suficientemente pequeño para evitar que las inmunoglobulinas y las células anfitrionas entren en contacto,
destruyan o monten una respuesta inmune con las células terapéuticas. El dispositivo puede ser una fibra hueca o una cápsula
semipermeable con células en el interior que secretan compuestos terapéuticos o bien puede formar parte de un sistema más
grande de bombas y filtros, como módulos de fibra hueca con hepatocitos para tratar hepatopatías.
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 807

Las células se pueden sembrar en un andamiaje tridimiensional y se les permite propagarse y formar una estructura parecida
al tejido. En el producto resultante, las células se orientan de una manera única, que es importante para el uso previsto del
producto (p.ej., substitutos de piel).
Las células se pueden encapsular en un gel o solución de polímero entrecruzable y la estructura implantable resultante pue-
de funcionar como vaso de cultivo, como un medio para proteger a las células del sistema inmune del anfitrión, o como una
manera de moldear las células en una forma definida. Algunos de los polímeros utilizados son alginato, ácido hialurónico, colá-
geno, quitina o polímeros sintéticos. Se han implantado células j3 de los islotes pancreáticos encapsuladas en pacientes para
tratar la diabetes. Para tratar la incontinencia urinaria, se han mezclado condrocitos con alginato a fin de formar una estructura
al inyectarlos.
Las células se pueden adherir a andamiajes con formas definidas que posteriormente se implantan. Algunos ejemplos inclu-
yen células precursoras osteogénicas en andamiajes de hueso humano cadavérico desmineralizado, cerámica de hidroxiapatita,
cerámica de hidroxiapatita-fosfato tricálcico o vidrio biodegradable, que se pueden usar en la reparación de defectos óseos.

MÉTODOS ANALÍTICOS

Consideraciones Generales

La complejidad y el alcance de las terapias celulares se reflejan en la amplia variedad de métodos analíticos que se usan para
establecer controles durante el proceso y criterios de liberación del producto final. Se deben seleccionar especificaciones de
calidad para productos celulares y tisulares para confirmar la calidad, seguridad y potencia del producto. Las pruebas seleccio-
nadas deben ser específicas para cada producto y deben contar con criterios de aceptación adecuados a fin de garantizar pará-
metros de calidad uniformes y dentro de los límites aceptables de variación biológica, pérdida de actividad, cambios fisicoquí-
micos o degradación durante la vida útil del producto. El desarrollo y el establecimiento de especificaciones para productos
celulares y tisulares deben respetar los principios descritos en el documento de la ICH Q6B Specifications: Test Procedures and
Acceptance Criterio far Biotechnological/Biological Products (Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación
para Productos Biotecnológicos/Biológicos).
Las especificaciones se establecen a partir de una caracterización minuciosa del producto durante la fase de desarrollo y un
entendimiento del proceso y su capacidad. La caracterización debe incluir mediciones de las propiedades fisicoquímicas, la se-
guridad, la pureza, las impurezas derivadas del proceso y del producto, la potencia, la viabilidad, la esterilidad y la cantidad.
Los fabricantes deben desarrollar especificaciones para cada producto desarrollado a partir de esta información mediante la
aplicación de métodos estadísticos apropiados. Los datos deben incluir lotes usados en los estudios preclínicos y clínicos, y de-
ben incluir además datos de validación de ensayo y proceso que pueden estar correlacionados con la evaluación de estabili-
dad, seguridad y eficacia.
Los controles durante el proceso y las especificaciones para el producto deben estar sustentadas usando un estándar de refe-
rencia apropiado. Un producto autólogo puede basarse en un estándar de referencia generado a partir de células o tejidos de
procesamiento de un donante saludable o de una fuente que proporciona células y tejidos a instituciones de investigación. El
estándar de referencia garantiza que el proceso, según se mide en los ensayos de liberación, no cambie de manera importante
con el tiempo y que verifique que una prueba produzca resultados aceptables, es decir, que se cumplen los requisitos de apti-
tud del sistema. El estándar de referencia se fabrica a partir de un lote producido en condiciones controladas y cumple con
todas las pruebas de proceso y de liberación final. Además, este estándar de referencia está sujeto a un nivel adicional de ca-
racterización, que incluye pruebas que no se suelen realizar para la liberación de productos. No es necesario que el estándar de
referencia esté almacenado en la misma dosis, formulación o temperatura que el producto final. Sin embargo, se debe deter-
minar la estabilidad del estándar de referencia.
Alternativamente, se puede usar un estándar de trabajo. En ese caso, debe comportarse en la prueba de forma similar al
estándar de referencia. El cambio a un nuevo estándar de referencia debe incluir muchas pruebas y todas ellas se deben reali-
zar paralelamente al estándar de referencia existente. Se debe evaluar, con sumo cuidado, el impacto de cualquier cambio en
las propiedades del nuevo estándar de referencia antes de adoptarlo. Una opción de estándar de referencia para un producto
celular con una vida útil corta, o para una aplicación autóloga o específica para un paciente, puede ser un banco de células
donantes normales del tipo celular apropiado. Este banco de células se puede utilizar para asegurar que el proceso de fabrica-
ción es capaz de generar un producto uniforme.

Controles durante el Proceso

Los procesos de fabricación deben contar con criterios bien definidos para decidir si se avanza o no se avanza, en etapas
clave durante el proceso. Los controles durante el proceso son valoraciones o pruebas realizadas para garantizar que la calidad
y la cantidad del producto en proceso sean suficientes para fabricar un producto final aceptable. Entre los ejemplos de contro-
les durante el proceso se incluyen:
• Enumeración y viabilidad
• Microbiológicos (esterilidad, endotoxinas, micoplasma)
• Expresión de marcadores fenotípicos o genotípicos
• Verificación de morfología contra estándares de referencia visuales
 ,.
808 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

• Producción de una sustancia bioactiva deseada

• Determinación de duplicaciones de población, número de pasaje, edad del cultivo
• Valoraciones de impurezas potenciales del proceso
• Monitoreo de parámetros del sistema de cultivo (% C0 2, humedad relativa %, pH, glucosa, lactato, etc.)
• Pruebas funcionales tales como unidades formadoras de colonias (UFC) y expresión de proteínas específicas de las células.
La razón principal para establecer pruebas de control durante el proceso es garantizar que se obtenga el producto correcto
con calidad y desempeño específicos. La razón secundaria para la realización de pruebas durante el proceso consiste en reco-
lectar datos de caracterización del proceso y del producto útiles en la evaluación del impacto de los cambios o desviaciones en
el proceso. El material intermedio en proceso que no cumple con los criterios de control durante el proceso no debe usarse
para la fabricación adicional. Este material se puede reprocesar cuando se cuenta con procedimientos para tales actividades. El
material reprocesado debe cumplir con las especificaciones originales durante el proceso y se debe definir el efecto del repro-
cesamiento sobre otros atributos de calidad, tales como la estabilidad, antes de que el material pueda someterse a fabricación
adicional. Cuando se van a combinar varios sublotes (p.ej., células recolectadas de diversos vasos de cultivo) para procesamien-
to adicional, los sublotes que no cumplen con los criterios especificados no deben incluirse en la combinación, incluso si la
combinación que contenga estos sublotes no aprobados cumpliese con los criterios de valoración en proceso.
Durante el desarrollo del proceso clínico, los ensayos para calidad y desempeño del producto deben realizarse después de la
mayoría de las etapas de procesamiento para determinar los pasos críticos así como los ensayos más sensibles a las desviacio-
nes en el proceso. Se deben usar controles de proceso estadísticos y parámetros críticos para establecer límites para validacio-
nes de proceso e investigaciones de fabricación. Se deben usar herramientas de muestreo estadístico para asegurar un tamaño
de muestra válido. Los controles durante el proceso deben llevarse a cabo para procesos totalmente validados para asegurar
que estos continúen bajo control. Los resultados de estos ensayos deben someterse a un análisis de tendencia y se deben to-
mar medidas para corregir los problemas cuando éstos surjan.

Especificaciones de Liberación de Producto Final

Las terapias celulares reglamentadas como productos biológicos deben cumplir con las secciones aplicables del Título 21 del
CFR 211 y del Título 21 del CFR 61 O para garantizar que cumplan con su identidad, pureza, potencia, seguridad microbiológi-
ca y demás atributos esenciales, tales como la viabilidad.
Debido a que no es posible emplear la esterilización terminal de un producto celular vivo, esencialmente se requiere que
todos los productos derivados de células cumplan con los criterios de aceptación para pruebas de producto tales como esterili-
dad, micoplasma y endotoxina-por lo general, un resultado negativo o la falta de crecimiento demuestran la esterilidad y la
ausencia de micoplasma; asimismo, los productos deben demostrar <5 unidades de endotoxina (UE) por kilogramo de peso
corporal del paciente. En el caso de las inyecciones intratecales, el límite de endotoxina especificado es más estricto ::o;0,2 UE
por kilogramo de peso corporal del paciente. El análisis de virus adventicios se realiza en contadas ocasiones en el producto de
terapia celular final debido a que las células o bancos de células de origen y los materiales auxiliares de origen biológico ya han
sido sometidos a análisis para detectar agentes virales de interés antes de la fabricación.
Para casi todos los demás criterios de liberación de producto final, tales como aquellos para identidad, pureza y potencia, los
procedimientos analíticos con métodos y criterios de aceptación son específicos para el producto derivado de células indivi-
dual. La Tabla 2 ofrece una visión general de las pruebas de liberación de producto final previstas para productos de terapia
celular y lista ejemplos de metodologías que se usan para cumplir con los requisitos de las pruebas.
Tabla 2. Visión General de Análisis de Liberación de Producto Final
Prueba de Liberación Ejemplos Criterios
Esterilidad USP (71) Negativo
Micoplasma Método de cultivo directo e indirecto (FDA Points to Consider[Puntos a Negativo; no detectado
Considerar])
Endotoxina USP (85) <5 UE/kg (s:0,2 UE/kg intratecal)
• Determinación de marcador de superficie
• Análisis de isoenzimas
• Identificación genética
• Morfología
• Bioensayo
Identidad • Marcador bioquímico Específico del producto
• Porcentaje de células viables
• Porcentaje de marcadores específicos de expresión de células
• Límites para tipos no deseados de células
Pureza • Límites para contaminantes del proceso (p.ej., suero) Específico del producto
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 809

Tabla 2. Visión General de Análisis de Liberación de Producto Final (Continuación)

Prueba de Liberación Ejemplos Criterios
• Número de células viables
• Ensayo de formación de colonias
• Cambio en la expresión de genes específicos
• Secreción de macromoléculas deseadas
• Inducción de efecto secundario (p.ej., antígenos leucocitarias
humanos (HLA))
• Evidencia de actividad metabólica
Potencia • Evidencia de función celular Específico el producto
• Número de células viables
• Enumeración de población de células específicas
• ADN total
Dosis • Proteína total Específico del producto
• Apariencia
• Morfología
Otros •Tamaño Específico del Producto

ESTERILIDAD

Los productos derivados de células deben cumplir con los requisitos de las pruebas de liberación del producto final, inclu-
yendo la esterilidad. Asimismo, las pruebas de esterilidad con frecuencia se llevan a cabo durante el proceso para establecer la
pureza microbiana de las células que requieren de mayor tiempo de cultivo. Las pruebas de esterilidad adecuadas incluyen la
prueba descrita en el Título 21 del CFR 610.12 y en el Capítulo de pruebas generales de USP Pruebas de Esterilidad (71 ). Estos
métodos de prueba basados en cultivos requieren de 14 días y, por consiguiente, únicamente son adecuados para productos
de terapia celular con vidas útiles prolongadas (p.ej., después de la crioconservación). Muchos productos de terapia celular
tienen vidas útiles cortas y deben administrarse a los pacientes antes de que los resultados de la prueba de 14 días estén dispo-
nibles. En tales casos, la FDA ha identificado una metodología que permitirá la administración de productos derivados de célu-
las a pacientes en dicha situación [ver Guidance far FOA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufactu-
ring, and Control (CMC) lnformation far Human Somatic Ce// Therapy lnvestigational New Drug Applications (IN Os)] (Guía para
Revisores y Auspiciadores de la FDA: Contenido y Revisión de Información Química, de Fabricación y Control (CMC) para Nue-
vas Aplicaciones Farmacológicas lnvestigativas (IND) de Terapia Celular Somática en Humanos):
• Prueba de esterilidad durante el proceso de una muestra tomada de 48 a 72 horas antes de la recolección final o después
de la última adición de medio a los cultivos.
• Una prueba rápida de detección microbiana, como por ejemplo, tinción de Gram u otro procedimiento en el producto
final formulado.
• Prueba de esterilidad que cumpla con el Título 21 del CFR 610.12 en el producto final formulado.
Cuando se usa esta metodología alternativa, los criterios de liberación para esterilidad se basan en un resultado negativo de
la tinción de Gram y en resultados que demuestren la ausencia de crecimiento en la prueba de esterilidad durante el proceso
de 48 a 72 horas. En caso de que la prueba de esterilidad de 14 días arroje resultados positivos después de que el producto
haya sido administrado al sujeto, el fabricante deberá informar sobre la falla en la esterilidad, los resultados de la investigación
de la causa, así como cualquier acción correctiva a manera de enmienda a la IND dentro de los 30 días hábiles posteriores a la
recepción inicial del resultado de prueba de cultivo positivo.
Debido a las inquietudes relacionadas con la sensibilidad de una tinción de Gram y a la incapacidad para obtener resultados
completos de esterilidad durante 14 días después de la administración al paciente, existe un extenso interés en el uso de méto-
dos microbiológicos rápidos como alternativa al método de cultivo de 14 días. Esto se analiza en Métodologías de Prueba Alter-
nativas.

MICOPLASMA

El Micoplasma y el ureaplasma son los microorganismos libres vivientes más pequeños. El micoplasma carece de pared celu-
lar rígida y su tamaño oscila entre 0,2 y 0,3 µm. Se puede observar el micoplasma con una forma redonda o filamentosa en un
cultivo de células usando un microscopio de campo oscuro o de contraste de fases. En agar sólido, el diámetro de las colonias
de micoplasma puede variar de aproximadamente 15 a 300 µm, mientras que las colonias más grandes se distinguen por una
típica apariencia de "huevo frito".
El micoplasma es ubicuo y se puede aislar de prácticamente cualquier mamífero. El micoplasma ha representado histórica-
mente uno de los principales problemas de contaminación de cultivos de tejidos, debido a que tiende a ser difícil de controlar
y requiere de ácidos nucleicos preformados provistos por componentes de los medios. Estos componentes pueden encontrarse
fácilmente en los materiales de cultivo de células que se usan durante la fabricación. El micoplasma puede surgir de compo-
nentes de cultivo bovinos o de otros animales, de materiales de células o tejidos de pacientes asintomáticos, o posiblemente
de operadores que lo liberan durante la fabricación.
81 O (l 046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

Se recomienda llevar a cabo el análisis de micoplasma para todas las materias primas de origen humano o animal y es indis-
pensable como ensayo de liberación de lote para productos derivados de células. La FDA ha publicado un documento (Poínts
to Consíder in the Characterizatíon of Ce// Lines Used to Produce Biologica/s [Puntos a Considerar durante la Caracterización de
Líneas Celulares Usadas para Producir Productos Biológicos) que describe en detalle los métodos aceptados para el cultivo y
aislamiento de micoplasma. Los métodos para la detección de micoplasma también se describen en el capítulo de pruebas
generales de USP Pruebas para Mícoplasma (63). Debido a que los ensayos clásicos requieren un mes de análisis para su culmi-
nación, se están desarrollando y validando métodos alternativos para la detección rápida de micoplasma. Esto se analiza en
Métodologías de Prueba Alternativas.

ENDOTOXINAS

Las endotoxinas ejercen diversos efectos biológicos en la membrana celular de los mamíferos y pueden afectar la secreción y
producción de citoquinas, pueden provocar fiebre en los receptores o pueden servir como mitógenos poderosos. Debido a la
posibilidad de los ampliamente variados efectos biológicos de las endotoxinas sobre los cultivos de células y tejidos, se deben
evaluar las materias primas y los componentes usados para la fabricación de productos derivados de células para determinar la
presencia de endotoxinas como parte del proceso de calificación de materias primas. El control de endotoxinas en Ja fabrica-
ción de productos de terapia celular es un elemento esencial de cualquier programa de control de calidad.
La presencia de endotoxinas en productos administrados a pacientes representa una preocupación de seguridad importante.
El capítulo de pruebas generales de USP Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) describe una variedad de métodos para la me-
dición de endotoxinas que se basan en el ensayo de lisado de amebocitos de Limu/us. Este ensayo se puede validar para una
amplia gama de productos biofarmacéuticos. Una característica importante de la valoración con respecto a los productos de
terapia celular es la capacidad de realizar el ensayo antes de la liberación de productos con vidas útiles cortas.

IDENTIDAD

El análisis de liberación de lote para productos celulares debe incluir una prueba de identidad. Esta prueba se emplea clara-
mente para identificar al producto. Su complejidad depende de la naturaleza del producto específico y de la gama de produc-
tos que se fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo análisis más extensos y rigurosos para un producto de terapia celu-
lar autólogo en una instalación de fabricación en la que se preparan múltiples productos para pacientes, comparando con un
producto de terapia celular alogénico que es el único producto fabricado en una instalación.
Las pruebas de identidad para productos derivados de células deben ser pertinentes al tipo de célula y a las manipulaciones
realizadas durante el procesamiento. Con frecuencia, se usan marcadores de superficie diferenciales para determinar la identi-
dad del producto. Los inmunoensayos por citometría de flujo son los métodos más comunes para detectar y cuantificar estos
marcadores. La identificación y cuantificación de subgrupos individuales de células se realiza mediante análisis multiparamétri-
co, por lo general, según el tamaño y la granularidad, y de uno o más marcadores de identidad. Otros ejemplos de pruebas de
identidad incluyen análisis isoenzimáticos para confirmar las especies de origen, los cuales serían preferibles si el producto
constara de células xenogénicas. Se puede emplear la morfología celular para distinguir tipos de células específicas. Existe una
creciente tendencia al uso de tecnologías de identificación genética tales como repeticiones cortas en tándem para establecer
la identidad de líneas celulares (p.ej., células madre embrionarias humanas usadas para derivar tipos de células terapéuticas).

PUREZA

Los métodos de pureza cuantifican específicamente los componentes activos deseados del producto. Las impurezas son con-
taminantes residuales relacionados con el producto o el proceso que se pueden detectar en el producto final. El requisito de
analizar una impureza particular para la liberación de un lote dependerá de: (1) la capacidad demostrada del proceso de fabri-
cación y purificación para eliminar o inactivar la impureza mediante la validación del proceso y (2) el potencial de toxicidad o
el impacto funcional sobre el producto asociado con la impureza.
Entre los ejemplos de impurezas relacionadas con el proceso asociadas con productos de terapia celular se incluyen los com-
ponentes residuales del medio de producción (p.ej., suero, antibióticos o citoquinas exógenas), materiales auxiliares usados en
el procesamiento subsiguiente (downstream processing) (p.ej., nucleasas o proteasas) y lixiviables (p.ej., plastificantes de tube-
rías o plásticos para cultivo). Las impurezas pueden ser bioactivas (p.ej., citoquinas u hormonas) o inmunogénicas (p.ej., agre-
gados, productos de degradación o proteínas derivadas de animales). Las impurezas pueden tener otros efectos perjudiciales,
dependiendo de la dosis del producto.
Las impurezas relacionadas con el producto son específicas a cada tipo de producto. Los ejemplos incluyen restos celulares,
presencia de células no diferenciadas en un producto derivado de células que debe contener tipos específicos de células tera-
péuticas diferenciadas; niveles inaceptables de células no viables; células competentes para la replicación en un producto celu-
lar que debe contener células mitóticamente inactivadas; o cambios en la composición de células funcionales posteriores a la
crioconservación y descongelación. Las metodologías analíticas para evaluar la pureza requieren la cuantificación de las impu-
rezas o su separación física del producto. Se debe hacer hincapié en demostrar la uniformidad del perfil de impurezas del pro-
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 811

dueto. Puede ser posible valorar el proceso de fabricación al grado que se pueda limitar el análisis de liberación de lote especí-
fico para impurezas.
El análisis de impurezas es a menudo extenso durante la caracterización del producto y la validación del proceso cuando se
está demostrando la uniformidad de la fabricación y del proceso de purificación. El análisis de impurezas como parte del análi-
sis de liberación del lote debe reflejar los riesgos de seguridad asociados con la impureza y la capacidad del proceso para elimi-
nar sistemáticamente tal impureza.

POTENCIA

La potencia se define, de conformidad con el Título 21 del CFR 600. 3(s), como "la capacidad específica del producto, con-
forme a lo indicado por pruebas de laboratorio apropiadas o por datos clínicos adecuadamente controlados obtenidos me-
diante la administración del producto en la forma prevista, para generar un resultado determinado." Junto con la dosis, la po-
tencia define la actividad biológica de cada lote (ver Ensayos para Determinación de Dosis, a continuación). La relación entre las
mediciones de potencia del producto durante el desarrollo y la fabricación con la seguridad y eficacia clínicas es clave para su
uso en la liberación de partidas. La potencia se puede evaluar mediante valoraciones biológicas in vitro o in vivo o una combi-
nación de éstas. Es común que estas valoraciones tengan coeficientes de variación entre 30% y 50%. Estas valoraciones requie-
ren un material de referencia representativo, bien definido, que se pueda utilizar como control positivo para la valoración. El
control positivo sirve para calificar el rendimiento de una valoración individual. El desarrollo de las valoraciones de potencia
debe centrarse en la caracterización y control de la variabilidad. Las valoraciones de alta precisión son herramientas eficaces
para controlar la calidad del producto. La información relacionada con la variabilidad de la valoración de potencia se debe in-
corporar en el diseño de estudios de estabilidad y la metodología estadística propuesta para asignar la fecha de caducidad (ver
Estabilidad más adelante).
Los tipos de valoraciones que se pueden emplear para establecer la potencia de un producto derivado de células son muy
variados y dependen de las características únicas y la vida útil del producto. Para algunos productos derivados de células tales
como células progenitoras hematopoyéticas, las valoraciones de potencia del producto han sido correlacionadas con la eficacia
clínica. En este caso, el ensayo tradicional por formación de colonias que cuantifica células progenitoras tales como las unida-
des formadoras de colonias-granulocito-macrófago (UFC-GM) ha sido relacionado con los resultados clínicos de injerto en al-
gunos estudios. Para otros productos derivados de células, se han usado los modelos de enfermedades de animales in vivo
para establecer la potencia del producto. Si el producto derivado de células libera una macromolécula bioactiva, la valoración
de potencia se puede basar en unidades de actividad liberada. Por ejemplo, la producción de insulina como respuesta a los
cambios en los niveles de glucosa puede ser la base de un ensayo de potencia para células destinadas para el tratamiento de
diabetes.
Los productos específicos para pacientes tales como las inmunoterapias autólogas presentan retos relacionados con la de-
mostración de la actividad terapéutica en un sistema de ensayo in vitro o in vivo. Las metodologías novedosas para medir la
potencia, como la correlación de la evolución clínica con otras pruebas de caracterización, como las pruebas de identidad,
pueden ser apropiadas y deben ser analizadas con las autoridades reglamentadoras en las primeras etapas del desarrollo. Por
ejemplo, la capacidad de determinar marcadores específicos de identidad de superficie celular empleando técnicas de citome-
tría de flujo o tinciones vitales puede ser una medición aceptable de la potencia, si está validada adecuadamente y se correla-
ciona con el resultado clínico. La FDA ha emitido pautas que analizan la posibilidad de uso de una matriz de ensayos biológi-
cos y no biológicos, incluyendo tanto ensayos cualitativos como cuantitativos, para establecer la potencia del producto. La in-
formación contenida en estas pautas es particularmente importante para productos derivados de células con una vida útil cor-
ta o mecanismos de acción complejos o actividades biológicas múltiples (ver Guidance for lndustry: Potency Tests for Cel/ular and
Gene Therapy Products [Guía para la Industria: Pruebas de Potencia para Productos de Terapia Celular y Génica).
Por lo general, se requiere de una valoración de potencia validada antes de la aprobación reglamentaria. Durante los estu-
dios clínicos investigativos, las autoridades reglamentarias por lo general requieren que, antes de iniciar los ensayos clínicos
claves, se cuente con una valoración o valoraciones bien definidas destinadas a establecer la potencia del producto. Se reco-
mienda ampliamente la implementación temprana de una o más valoraciones candidatas destinadas a establecer la potencia
del producto. Los datos de estas valoraciones candidatas de potencia o funcionales pueden ser particularmente importantes al
evaluar cambios propuestos en la fabricación, durante la transferencia de tecnología y para determinar la estabilidad del pro-
ducto.

ENSAYOS DE DETERMINACIÓN DE DOSIS

El ensayo que mide, con precisión, la cantidad de producto se denomina ensayo de determinación de dosis y se selecciona
basándose en su exactitud y precisión. Un ensayo que mide la actividad terapéutica de un producto recibe el nombre devalo-
ración de potencia y se diseña para medir la función del producto. Este tipo de valoración es diferente al ensayo de determina-
ción de dosis. El diseño del ensayo depende del tipo de producto. En el caso de medicamentos, las valoraciones que miden la
cantidad de fármaco (dosis) se llaman valoraciones de contenido. Para estos medicamentos, las dosis de producto se pueden
definir como la concentración o cantidad del producto final administrado al paciente y por lo general se mide como masa de
producto. Para productos derivados de células, los atributos tales como el número viable de células terapéuticas a menudo se
usan para definir la dosis del producto.
812 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

Los productos de terapia celular se pueden dosificar con base en la enumeración de una o más poblaciones de células.
Cuando el producto se encuentra en una suspensión homogénea de célula única, el ensayo más utilizado es el número de
células viables. Estos ensayos pueden incluir la enumeración de todas las células, células nucleadas totales u otro subgrupo ce-
lular. Los ensayos de viabilidad por lo general se basan en la capacidad de las células de excluir un colorante supravital, como
el azul de tripán. Los resultados se expresan como el número de células que excluyen el colorante y, por lo tanto, se conside-
ran viables. Los compuestos fluorescentes que se unen a las proteínas nucleares y que son excluidos por las células viables pue-
den incorporarse a métodos de citometría de flujo para la determinación simultánea de viabilidad y marcadores de identidad
de las células.
El conteo de células se puede llevar a cabo rápidamente por métodos manuales o automatizados. El recuento manual por
enumeración visual de células en una cámara hematocitométrica es una técnica de fácil acceso, de exactitud aceptable, pero
de menor precisión que la mayoría de los métodos automatizados. Los instrumentos habituales para el recuento celular auto-
mático proporcionan una enumeración reproducible de células no nucleadas (eritrocitos y plaquetas) y de células nucleadas y
un recuento diferencial de células anteriormente nucleadas en poblaciones de leucocitos mononucleares y polimorfonucleares.
Una discriminación mayor de poblaciones celulares específicas, por lo general, requiere el análisis de fenotipos de superficie
celular por citometría de flujo u otros métodos (ver la sección Identidad anterior). La proporción de una subpoblación celular
específica puede determinarse por FACS o por citometría de flujo. Un ejemplo de ensayo de enumeración de células es la enu-
meración de células progenitoras hematopoyéticas CD34 positivas (CD34+).
Para productos que contienen células en una suspensión no homogénea, tales como células que se combinan con un bio-
material (p.ej., un andamiaje), se han usado medidas alternativas para la enumeración de células, incluyendo el área total de
una capa de células, el peso húmedo, las proteínas totales y el ADN total. Si se emplean estas medidas para determinar la dosis
del producto, se deben llevar a cabo pruebas complementarias para establecer la importancia.

Consideraciones para el Análisis de Liberación de Construcciones de Células y Biomateriales

Para algunos productos derivados de células tales como células combinadas con biomateriales para formar productos de
combinación, puede no ser factible analizar directamente la construcción de células y biomateriales. Con frecuencia se da este
caso cuando están implicadas células autólogas y la construcción de células y biomateriales consta de una sola unidad y no es
factible el muestreo de la construcción. En tales casos, los componentes individuales se analizan antes de ser combinados y la
construcción final no se somete a análisis directo. Las medidas indirectas tales como el muestreo del medio de cultivo se pue-
den emplear para tratar los requisitos reglamentarios. Se debe establecer la calidad y estabilidad de la construcción de células y
biomateriales formulada, así como la importancia de las medidas indirectas mediante estudios de validación durante el desa-
rrollo del producto.

Consideraciones sobre el Muestreo

Conforme a lo requerido por las BPF, se deben conservar muestras de producto después de haber completado el análisis de
liberación. Cuando se emplean estrategias de liberación rápida, es posible que los fabricantes deban conservar muestras adicio-
nales de manera que pueda reevaluarse la calidad del producto mediante metodologías de prueba alternativas o tradicionales,
si fuera necesario.
El muestreo para el análisis de liberación de lote debe basarse en la distribución potencial del parámetro analizado. Ver Desa-
rrollo del Protocolo de Estabilidad (más adelante) para consideraciones adicionales. Se deben conservar muestras de cada lote
ante la posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un lote. Aunque la vida útil del producto sea muy
breve, se pueden utilizar estas muestras retenidas para detectar impurezas y otras sustancias. La necesidad de un diseño ade-
cuado del plan de muestreo requiere de consideración especial. En estos casos, la validación del proceso ayudará a determinar
el diseño apropiado de muestreo estadísticamente fundamentado.

Métodos de Prueba Alternativos

Conforme a lo indicado en Especificaciones para la Liberación de Producto Final (anteriormente), los productos de terapia celu-
lar deben someterse a pruebas de esterilidad, micoplasma y endotoxina. Antes del uso clínico, se deben cumplir criterios de
aceptación adicionales para el análisis relacionado con la identidad, pureza, potencia, dosis y demás características pertinentes.
Excepto por la esterilidad, micoplasma y endotoxinas, la mayoría de los procedimientos de prueba y sus métodos centrales
usados para garantizar que el producto final cumple con los criterios de aceptación para liberación son únicos para el producto
y se pueden adaptar para cumplir con las características y aplicaciones específicas del producto derivado de células. En general,
se deben desarrollar métodos de prueba basándose en los mejores criterios científicos disponibles y deben ser adecuados para
su uso en un ambiente de fabricación que cumpla con las BPM. Las valoraciones deben ser robustas, confiables y susceptibles
de validación y deben proporcionar resultados antes de la liberación para uso clínico. El capítulo Validación de Procedimientos
Farmacopeicos (1225) proporciona consideraciones básicas para la validación de métodos.
Para algunos productos de terapia celular, el tamaño de la muestra y el volumen de material requerido para el análisis, o el
tiempo necesario para obtener resultados de prueba puede consumir cantidades significativas del producto final o el tiempo
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 813

requerido para obtener resultados puede exceder la vida útil del producto o ambos. Esto crea problemas con el suministro
disponible de producto para tratar pacientes y en otras situaciones, descarta la posibilidad de obtener resultados antes de su
administración en pacientes, lo cual es un problema particular para la prueba de esterilidad farmacopeica así como para el
método de cultivo en caldo-agar para micoplasma, recomendado por la FDA. Por consiguiente, tanto la industria como las
autoridades reglamentarias han mostrado un interés considerable en facilitar el desarrollo de métodos de prueba alternativos
para estabilidad y micoplasma.
Las reglamentaciones de la FDA para productos biológicos tratan específicamente el uso de métodos equivalentes siempre
que garanticen que la seguridad, pureza, potencia y eficacia del producto biológico sean iguales o mayores a las garantías pro-
vistas por el método específico (Título 21 del CFR 610.9). A continuación se describen algunos de los métodos de prueba alter-
nativos disponibles para esterilidad y micoplasma.
Existe una amplia variedad de tecnologías disponibles que continúa en desarrollo por parte de diseñadores de ensayos para
su uso en la industria de las terapias celulares. Los atributos que deben incluirse en cualquier revisión de tecnología propuesta
incluyen la exactitud para el propósito destinado, la velocidad de productividad, los costos, la aceptabilidad por parte de la
comunidad científica y las agencias reglamentarias, la simplicidad de la operación, los requisitos de capacitación y reactivos, la
reputación del proveedor, los servicios técnicos provistos por el vendedor y, finalmente, los requisitos de servicios y espacio.
La validación de estos métodos de prueba y la demostración de equivalencia, según se describen en el Título 21 del CFR
610.9, son obligatorias al momento de solicitar la autorización para productos biológicos (BLA, por sus siglas en inglés) o una
aprobación previa a la comercialización (PMA, por sus siglas en inglés).

ESTERILIDAD

Las plataformas de detección para métodos microbiológicos alternativos por lo general se han basado en el crecimiento, via-
bilidad, artefactos o ácidos nucleicos. Las tecnologías basadas en el crecimiento emplean medidas bioquímicas o fisiológicas
que reflejan el crecimiento de microorganismos. Las muestras de prueba se transfieren a formulaciones de medio tradicionales
o mejoradas que estimulan la proliferación microbiana, y el crecimiento microbiano se detecta química o espectrométricamen-
te. La ventaja primaria de estos sistemas es la naturaleza automatizada de los resultados de prueba y la recuperación de micro-
organismos para investigaciones de fallas y otras metodologías de caracterización microbiana. La FDA ha publicado pautas pa-
ra validación de métodos microbiológicos rápidos basados en crecimiento (Guidance far lndustry: Validation of Growth-Based
Rapid Microbiologica/ Methods far Sterility Testing of Ce/fufar and Gene Therapy Products, CBER, 2008 [Guía para la Industria: Vali-
dación de Métodos Microbiológicos Rápidos Basados en Crecimiento para Pruebas de Esterilidad de Productos de Terapia Ce-
lular y Génica). Los principios de validación de métodos microbiológicos alternativos también se describen en el capítulo de
USP Validación de Métodos Microbiológicos Alternativos (1223).
Las tecnologías basadas en la viabilidad no requieren de crecimiento celular. Estas tecnologías se basan en detectar la pre-
sencia de contaminantes vivos individuales mediante colorantes vitales, tintes o marcadores de superficie celular. Las células
marcadas con un sustrato metabólico de fluorocromo específico se recolectan en una membrana de detección.
Las tecnologías basadas en artefactos analizan componentes celulares o sondas moleculares que se designan específicamente
para una especie microbiana particular. Por ejemplo, las especies individuales se pueden caracterizar mediante patrones únicos
de composición de ácidos grasos después de que se han saponificado muestras de células enteras para inducir la formación de
ésteres metílicos. Otras tecnologías emplean espectrometría de masas por tiempo de vuelo.
Las tecnologías de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) se basan en la amplificación de ADN mediante reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), tipificación de ARNr l 6s ó 23s y secuenciación génica. Algunas tecnologías identifican mi-
croorganismos mediante la secuenciación de una porción del cromosoma de un organismo desconocido y comparando la se-
cuencia de ARNr l 6s con una base de datos. Esta tecnología es capaz de identificar hongos, micoplasma y bacterias, incluyen-
do elementos de lento crecimiento y no fermentadores. Para más detalles sobre los métodos basados en PCR, ver el capítulo
de USP Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127).

MICOPLASMAS

Las metodologías de análisis farmacopeico para micoplasma se desarrollan basándose en cultivos en agar y caldo y requieren
por lo menos 28 días para controlar adecuadamente la presencia de contaminación por micoplasma. Debido a esta limitante,
se han desarrollado una variedad de tecnologías de análisis rápido de micoplasma basadas en técnicas de amplificación de áci-
dos nucleicos tales como PCR, así como ensayos de hibridación de ácidos nucleicos no amplificados, ELISA y ensayos basados
en enzimas.

SISTEMAS DE CALIDAD
Los sistemas de calidad entrelazan los diversos aspectos de la fabricación. Los programas de control de calidad (QC) y de
garantía de calidad (QA) deben ejercer control sobre las instalaciones y los procesos de fabricación, los procesos de validación
y las pruebas de las materias primas, los materiales en proceso, los productos a granel y el producto formulado final. Los pro-
gramas de capacitación y certificación representan el núcleo para contar con personal de fabricación técnicamente competen-
 ,.
814 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

te. Se debe implementar un programa de documentación para sustentar todas las operaciones de fabricación, capacitación,
validación y calidad. Los cambios en los procesos y procedimientos deben seguir un programa formal basado en principios
bien establecidos de control de cambios.
Cuando se usan células o tejidos humanos alogénicos como material de origen para la fabricación de productos derivados
de células o tejidos, los donantes de células o tejidos deben ser sometidos a análisis de detección y pruebas adecuadas (ver la
sección Eligibilidad de Donantes anterior). En todos los casos, las células y tejidos humanos de origen deben manipularse de
conformidad con las Buenas Prácticas para Tejidos (GTP) según se describe en el Título 21 del CFR 1271.
Además de las GTP, se aplican las BPFv conforme a lo descrito por la FDA en el Título 21 del CFR 21 O, 211, 600s (en especial
en el Título 21 del CFR 61 O) y 820 a la fabricación de productos derivados de células y tejidos que están sujetos a la aproba-
ción previa a su comercialización. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricación, al igual que las materias primas, siste-
mas de calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv. Las BPFv se aplican al proceso
y a la planta de fabricación a lo largo de todo el desarrollo clínico. El grado de control se incrementa a medida que progresa el
desarrollo clínico y se espera el cumplimiento cabal con las BPFv al momento de iniciar los ensayos clínicos Fase 111.
Es indispensable monitorear los datos obtenidos del análisis durante el proceso y de liberación del producto final. Los resulta-
dos fuera de especificación (OOS, por sus siglas en inglés), o incluso aquellos que están fuera de la tendencia, se deben investi-
gar antes de desechar el material. La Guidance far lndustry: lnvestigating Out of Specification (005) Test Results far Pharmaceuti-
cal Production (octubre de 2006) [Guía para la Industria: Investigación de Resultados de Pruebas Fuera de Especificación en la
Producción Farmacéutica] de la FDA ofrece un enfoque sistemático para llevar a cabo una investigación. El resultado de un
ensayo puede rechazarse cuando se confirma que se ha presentado un error, tal como un error del analista, de cálculo o fallo
del equipo. Si la investigación determina que los resultados de las pruebas del producto no cumplen con los criterios de acep-
tación especificados, el lote debe ser rechazado. En algunas situaciones, especialmente con productos autólogos o alogénicos
específicos del paciente, puede ser necesario administrar un producto que no cumpla con todas las especificaciones o que pre-
senta únicamente resultados de prueba incompletos como medida para salvar la vida de un paciente. Sin embargo, se debe
contar con procedimientos que rijan la comunicación de resultados 005 al médico o a la persona responsable de tomar la
decisión del uso del producto y para proporcionar instrucciones para todas las pruebas de seguimiento, monitoreo del pacien-
te y comunicación de dichos resultados a todas las partes, incluyendo autoridades reglamentarias.
Conforme a lo descrito con anterioridad, un enfoque de gestión de riesgos efectivo en las etapas tempranas de desarrollo
del producto puede asegurar la más alta calidad de un producto derivado de células al proveer una medida proactiva para
identificar y mitigar problemas potenciales de calidad. La probabilidad de falla en los productos de terapia celular puede surgir
de una variedad de fuentes, incluyendo errores del personal, fallas en el procesamiento aséptico, fallas de los equipos, fallas de
las instalaciones y servicios, limpieza, desinfección y fallas en los componentes y materias primas. Un entendimiento proactivo
del riesgo puede ayudar a tomar mejores decisiones al momento de presentarse un problema de calidad. La gestión efectiva
de riesgos puede facilitar la toma de decisiones más informadas y adecuadas y puede ofrecer a las autoridades reglamentarias
una mayor garantía de la capacidad de un desarrollador para tratar riesgos potenciales. Dicha garantía puede afectar el grado
y nivel de supervisión reglamentaria directa. La gestión de riesgos de calidad se puede integrar en partes claves del sistema de
calidad tales como la gestión de cambios, la Acción Correctiva y Preventiva (CAPA, por sus siglas en inglés), las BPFv, la valida-
ción, entre otras, y se puede usar para establecer especificaciones coherentes y Parámetros Críticos del Proceso (CPP, por sus
siglas en inglés) para asegurar el cumplimiento de los atributos de calidad.
El análisis de riesgos es de naturaleza cualitativa. Se puede lograr usando experiencia y conocimientos sobre el proceso para
definir las categorías para la evaluación de riesgo que pueden formar la base de un sistema de evaluación y mitigación de ries-
gos después de identificar errores de fabricación. Por ejemplo, resulta una práctica común desarrollar categorías de riesgo de
incumplimento o desviaciones que puedan incorporarse a un procedimiento de investigación de incumplimiento o fallas. Las
categorías son particularmente útiles cuando es necesario acelerar la evaluación de riesgos para facilitar una CAPA. A continua-
ción se definen, a manera de ejemplo, los Niveles de Riesgo 1 a 4 los cuales se pueden adoptar como un medio para llevar a
cabo una evaluación preliminar de riesgos:
Nivel de riesgo 1: Aspectos Técnicos-No presenta ningún riesgo para el paciente y no impacta la seguridad y efectividad
del producto. Ejemplo: Falta de una firma en el registro de partida.
Nivel de riesgo 2: Alerta-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o puede tener un impacto potencial
en la seguridad y eficacia del producto. Se debe volver a establecer el cumplimiento mediante justificación apropiada para
proceder después de su entrega a QA para su revisión y aprobación. Ejemplo: El tiempo de digestión de procesamiento de
biopsia está fuera del intervalo definido.
Nivel de riesgo 3: No enviar/rechazar el lote-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o afectar la efica-
cia del producto incluso después de tomar acciones correctivas. No se permite su envío. Ejemplo: Los cultivos no demues-
tran un crecimiento celular adecuado.
Nivel de riesgo 4: Evento posterior a la distribución-Puede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o un impac-
to potencial en la seguridad, potencia o pureza del producto. La señal de seguridad se identifica después de la distribu-
ción del producto. Ejemplo: La prueba de esterilidad fallida se conoce después de la distribución del producto.
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 815

DISEÑO DE LAS INSTALACIONES Y CONSIDERACIONES OPERATIVAS

Las instalaciones de fabricación para productos de terapia celular y tisular deben ser cuidadosamente diseñadas para mante-
ner las operaciones de procesamiento aséptico de acuerdo con las BPF, al tiempo que abarca aspectos únicos del producto. Las
células o tejidos recibidos pueden tener biocarga u otros contaminantes por lo que puede ser necesario recibirlas y procesarlas
en un área segregada en cuarentena para evitar comprometer a la instalación principal. Asimismo, el procesamiento de tejido
para obtener células de interés puede requerir de equipo y procesos especializados que deben considerarse durante el diseño y
las operaciones subsiguientes de la instalación. Para fabricar productos de combinación que implican andamiajes biocompati-
bles, puede ser necesario que la instalación sea capaz de manejar operaciones que impliquen procesamientos, manipulaciones
y eliminaciones químicas. Esto puede presentar restricciones en el diseño de la instalación, especialmente para los sistemas de
manejo de aire en ambientes de cuartos limpios.
Aunque el principal hincapié en la fabricación de un producto derivado de células o tejidos se relaciona con la protección del
producto de contaminación involuntaria, es necesario evaluar y reducir los riesgos para el operador de fabricación mediante
capacitación adecuada en el manejo de patógenos transmitidos por la sangre y en el uso de equipo/vestimenta de protección.
La protección del operador y el procesamiento aséptico son complementarios e incluyen el uso de cabinas de seguridad bioló-
gica certificadas y de vestimenta de protección aséptica que consta de batas, guantes, mangas, máscaras quirúrgicas, protec-
ción para los ojos y cubiertas para la cabeza. El tejido humano debe obtenerse en condiciones y controles ambientales que
proporcionen un alto grado de garantía de recuperación aséptica.
El grado de control requerido para operaciones de procesamiento de células y tejidos depende de una variedad de factores,
incluyendo la complejidad de los procesos de fabricación aséptica, el sitio primario de fabricación y la vida útil del producto
final. Los procesos de fabricación que implican la manipulación abierta de células, incluso en una cabina de seguridad biológi-
ca, tienen mayor riesgo de contaminación que los procesos que se llevan a cabo en biorreactores cerrados o sistemas de bol-
sas, que utilizan dispositivos estériles de conexión y de sellado de tubos. Por lo regular, los cuartos limpios ISO 7 (clase 1O 000)
y las cabinas de seguridad biológica ISO 5 (clase 100) son componentes esenciales para procesos de fabricación de productos
de terapia celular, especialmente aquellos que implican manipulaciones abiertas.
El ambiente controlado de un cuarto limpio, cuidadosamente diseñado, construido, validado y mantenido puede minimizar
los riesgos de contaminación ambiental durante el procesamiento aséptico y reducirá la posibilidad de contaminación cruzada
de productos específicos para un solo paciente. Las presiones diferenciales entre la fabricación clasificada deben cumplir con el
documento guía de septiembre de 2004, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing
Practice (Medicamentos Estériles Producidos Mediante Procesamiento Aséptico-Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes). Se
debe monitorear la calidad del aire en las instalaciones y las áreas de procesamiento de manera tal que se provea un alto nivel
de condiciones asépticas durante el procesamiento. Para pautas relacionadas con este tema, ver el capítulo Control Microbioló-
gico y Monitoreo de Ambientes para Procesamiento Aséptico (1116).
La limpieza de las instalaciones, la segregación de componentes y productos, así como los procedimientos de desinfección,
deben llevarse a cabo para evitar contaminación microbiana y contaminación cruzada entre lotes producidos en las instalacio-
nes.
Los productos celulares o tisulares basados en células autólogas representan un nivel de complejidad adicional para el diseño
y la operación de las instalaciones de fabricación. Para productos autólogos, se fabrica un lote de producto para cada persona
y se requiere de segregación completa durante la fabricación. A diferencia de los diseños de instalaciones para productos alo-
génicos, los cuales se basan en volumen en gran escala para lograr la máxima eficiencia de fabricación, las instalaciones para
productos autólogos requieren de una unidad de ampliación (a escala), lo cual debe considerarse durante el diseño y la opera-
ción de las instalaciones. La automatización puede emplearse de manera efectiva para gestionar la manipulación manual repe-
titiva de células. Es posible que la escala inicial de operación no justifique una inversión de capital inicial para automatización,
pero se debería considerar a medida que aumenta el tamaño de las operaciones de fabricación.
La segregación del producto en las instalaciones es otro punto clave a tomar en cuenta durante el diseño y la operación. La
supervisión del etiquetado y de QA se usan generalmente para el rastreo y la segregación. Técnicas tales como los códigos de
barra y las etiquetas de frecuencia radial (FR) pueden usarse para el rastreo y la segregación del producto. Para obtener pautas
sobre este tema, ver el Título 21 del CFR 211.42, 211.113, 1271 y la Guidance for lndustry: Sterile Drug Products Produced by
Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice (Guía para la Industria: Medicamentos Estériles Producidos Mediante
Procesamiento Aséptico-Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes) de la FDA, septiembre 2004.
El equipo de fabricación debe ser robusto, proveer productos uniformes y permitir la calibración periódica y el mantenimien-
to preventivo. La calificación es necesaria para el equipo del cual se derivan parámetros o mediciones críticas del proceso. En la
mayoría de los casos, esto incluye el software que controla las operaciones del equipo o sistemas. Los equipos críticos, como
las incubadoras o los congeladores, deben contar con sistemas de alarma capaces de emitir señales de falla de manera remota.
Asimismo, el equipo crítico debe estar conectado a un generador de respaldo para emergencias, el cual debe probarse periódi-
camente para verificar su estado operativo.

CONSIDERACIONES SOBRE LA VALIDACIÓN Y CALIFICACIÓN

Los principios de validación recomendados por los documentos guía de la FDA y de la ICH, así como los capítulos de USP
(1225) y Validación de Recuperación Microbiana de Artículos Farmacopeicos (1227) aplican a los productos derivados de células y
816 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

tejidos. La variación biológica en las células y tejidos de origen usados para fabricar la mayoría de los productos de terapia
celular o tisular pueden afectar los esfuerzos de la validación.
Las actividades de validación deben incluir la evaluación de riesgos, la capacitación y calificación del personal, la calificación
del equipo e instalaciones, la validación de métodos analíticos, el procesamiento aséptico, el proceso de fabricación y la limpie-
za.
La validación del proceso debe tomar en cuenta la seguridad, la uniformidad (rendimiento del proceso y por etapas, elimina-
ción de impurezas), la robustez (operador a operador, día a día) y la calidad del producto final (identidad, pureza, potencia).
Es necesario evaluar o calificar de manera apropiada los métodos analíticos usados para evaluar el proceso.
La validación de procesos para productos específicos del paciente como los productos autólogos celulares y tisulares presen-
ta problemas excepcionales. Primero, los materiales de partida para productos específicos del paciente por lo general se obtie-
nen de materiales del paciente o de un donante que corresponda, tales como material de biopsia, productos obtenidos por
aféresis, tejidos de desecho de procedimientos quirúrgicos y órganos de cadáveres que no califican para transplate. El proceso
puede requerir que los fabricantes acepten cierto intervalo en lo que respecta a la calidad y la cantidad del material de partida,
al tiempo que deben seguir produciendo un producto final que satisfaga los análisis de liberación. En segundo lugar, el proce-
samiento manual de células y tejidos presenta un grado de variabilidad inherente. Se deben desarrollar etapas de procesamien-
to que resulten de manera exitosa y uniforme en componentes de proceso y productos finales apropiados, incluso si el proceso
se basa en materiales tisulares no estándares o variables. La validación del proceso debe tomar en cuenta dicha variabilidad y
debe garantizar que los puntos finales y críticos de la fabricación y del análisis cumplan en todo momento con las especifica-
ciones.
Las validaciones de procesos asépticos se deben llevar a cabo usando medios microbiológicos que demuestren que el perso-
nal de fabricación puede realizar los procedimientos y producir un producto libre de contaminación microbiana. Los procedi-
mientos destinados a mantener la segregación durante la fabricación se deben someter a desafío para verificar que la probabi-
lidad de contaminación cruzada o confusión entre lotes de producto para diferentes pacientes sea mínima.
Dependiendo de la variabilidad de las células o tejidos de origen y de la complejidad del proceso de fabricación, puede ser
necesario fabricar más de tres lotes de calificación para verificar la uniformidad y la robustez del proceso de fabricación. No
todos los esfuerzos de fabricación serán exitosos para productos de terapia autólogos y específicos del paciente. Sin embargo,
se debe establecer la tasa de éxito y realizar un seguimiento que permita a los fabricantes detectar cualquier reducción en di-
cha tasa y, en tal caso, tomar las medidas necesarias para corregir el problema. Las células primarias bien caracterizadas de un
banco de células se pueden utilizar en la validación del proceso si el perfil de los donantes se encuentra dentro del intervalo
deseado para la población de pacientes. También puede ser apropiado un análisis de tendencia de un número de administra-
ciones de producto estadísticamente aceptable.
Deben realizarse validaciones sobre la limpieza del equipo y las instalaciones a fin de demostrar la eficacia de los agentes de
limpieza sobre contaminantes estándar microbianos y fúngicos, así como contaminantes aislados de la planta de fabricación.
La medición de los residuos de los agentes de limpieza debe tratarse en las validaciones de limpieza del equipo. Deberá eva-
luarse el equipo, las instalaciones y los sistemas electrónicos de monitoreo y control, tales como los sistemas de monitoreo de
edificios y de control de inventarios.
El equipo y los métodos analíticos y de fabricación deben ser validados siguiendo los procedimientos descritos en el capítulo
(1225), además de los documentos guía emitidos por la !CH (ver Q2 Rl ). Se deben establecer planes de capacitación y se
deben llevar a cabo calificaciones del personal. Se deben realizar validaciones para el transporte de tejidos y el envío de pro-
ductos.

PREPARACIÓN V ADMINISTRACIÓN DEL SITIO CLÍNICO

Consideraciones Generales

Antes de llevar a cabo la administración de algunos productos derivados de células o tejidos, puede ser necesario realizar
modificaciones al producto o etapas de preparación. Estas modificaciones o etapas a menudo se realizan cerca del momento
de la administración y, por lo tanto, quedan fuera del control de fabricante original. La naturaleza de estas modificaciones de-
pende, en gran medida, de las características del producto.
Las etapas de preparación incluyen la descongelación, el lavado o filtrado para eliminar células o sustancias acumuladas du-
rante el almacenamiento, la transferencia a una solución infusible o la formulación con un vehículo o material estructural tal
como un andamiaje. Asimismo, las consideraciones sobre el paciente, tales como la necesidad de preparar dosis o modificar el
producto de acuerdo con la estructura anatómica, peso o volumen sanguíneo del paciente, pueden afectar dichas etapas.
Se deben establecer en el sitio clínico procedimientos adicionales y controles de proceso para todos los intervalos de almace-
namiento de producto, etapas de transporte y modificaciones, comenzando con una definición clara de puntos de control crí-
ticos. Los requisitos operativos incluyen la designación de un espacio físico adecuado para la manipulación aséptica, como por
ejemplo una cabina de seguridad biológica ISO 5 (clase 100), personal capacitado, procedimientos operativos estándar detalla-
dos y supervisión de la calidad. La naturaleza única e irremplazable de muchos productos derivados de células o tejidos incre-
menta la necesidad de contar con procedimientos bien establecidos para preparación y administración en el sitio clínico.
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 817

Manipulación del Producto

Antes de administrar productos médicos que contienen células, la preparación en el sitio puede implicar una o más manipu-
laciones. Las manipulaciones típicas incluyen lo siguiente:
Cambio en el Envase Final-El producto fabricado puede haber sido almacenado o transportado en un envase y es posi-
ble que necesite ser transferido a un envase diferente para su administración.
Cambio del Estado Físico o Temperatura-Puede ser necesario descongelar o entibiar el producto.
Cambio en Solución o Suspensión-Puede ser necesario disolver, diluir o suspender un producto en un líquido.
Combinación con un Material Biológico-Puede ser necesario combinar las células terapéuticas con un material de an-
damiaje tal como hojas de matriz extracelular descelularizadas, geles, tapones, cápsulas, esponjas, partículas o gránulos.
En otros casos, puede ser necesario agregar las células a un dispositivo médico existente tal como una unidad de filtración
de fibras huecas antes de su uso.
Mezclado o Preparación Magistral-Para algunos productos celulares, puede ser necesario el mezclado o la preparación
magistral en el sitio clínico.
Filtración o Lavado-La presencia de materiales no deseados en el producto fabricado, tales como partículas, desechos
celulares, metabolitos o compuestos remanentes de manipulaciones previas, puede requerir de etapas de lavado o filtra-
ción.
Muestreo-Puede ser necesario llevar a cabo un muestreo del producto final antes de su administración para probar la
formulación final.

Consideraciones sobre las Instalaciones del Sitio Clínico

Los requisitos de las instalaciones para llevar a cabo las etapas de preparación en el sitio o la administración de productos de
terapia celular dependen de los productos y de las manipulaciones requeridas. El principal determinante de las características
de las instalaciones es el grado de riesgo de contaminación microbiana relacionado con cada paso. Ver Preparación Magistral-
Preparaciones Estériles (797) para obtener pautas relacionadas con el tipo de manipulación y los niveles de control ambiental
requeridos para garantizar el manejo aséptico.

Descongelación de Productos Derivados de Células

La descongelación se lleva a cabo rápidamente. Si se va a reinfundir o trasplantar una pequeña cantidad de células, no es
necesario extraer el DMSO de la suspensión, porque la mayoría de las preparaciones celulares pueden ser concentradas ade-
cuadamente para mantener la concentración de DMSO dentro de límites tolerables. El uso de DMSO ejerce dos efectos sobre
las células después de la descongelación: Se pueden agrupar si están dañadas y el DMSO reduce la viabilidad celular en minu-
tos. Si se debe extraer el DMSO o concentrar las células para la administración, por lo general, se diluye la suspensión de célu-
las descongelada de forma seriada (para evitar el choque osmótico) y se la vuelve a suspender en un medio con proteínas. La
viabilidad y potencia de las células se puede monitorear después de la descongelación, pero a menudo, la información es sólo
para propósitos de recolección de datos y no una especificación que se debe cumplir para el uso clínico del producto celular.
Algunos productos de terapia celular necesitan ser transportados frescos (es decir, sin congelar). En algunas situaciones, los
componentes celulares se almacenan congelados pero se descongelan y aplican a los andamiajes en el sitio de fabricación a
temperatura ambiente o de refrigeración, justo antes de ser transportados. Es posible que los productos de combinación com-
puestos por células en un andamiaje requieran ser transportados a temperaturas superiores a las temperaturas de refrigeración
(es decir, temperatura ambiente) para evitar que las células se desprendan del andamiaje. Debido a que el producto preparado
recientemente (fresco) es metabólicamente activo, el envase para transporte debe estar diseñado y validado para mantener la
actividad metabólica del producto, además de cumplir con las pruebas de validación estándar de transporte. El metabolismo
puede lentificarse disminuyendo la temperatura de transporte, pero esto requiere de un control de temperatura confiable du-
rante el transporte. Debido a que los envases para transporte dependen en cierta medida de la temperatura exterior, estos
deben ser validados para mantener un estricto control de la temperatura en cualquier condición climática.

Pruebas Adicionales de Liberación de Productos Celulares Manipulados en el Sitio Clínico

Los productos de terapia celular que se someten a etapas de preparación o a manipulaciones en los sitios clínicos deben
someterse a controles o pruebas apropiadas que garanticen el cumplimiento de todas las especificaciones de calidad antes de
la liberación para su administración en pacientes. La naturaleza y el grado de las manipulaciones determina la necesidad de
aplicar requisitos de liberación o especificaciones críticas adicionales a las requeridas inmediatamente después de la fabricación
inicial.
Por lo general, las pruebas previas a la liberación incluyen lo siguiente:
• Inspección física del producto, incluyendo apariencia del producto (color, turbidez, partículas o materia extraña), integri-
dad del envase, temperatura y exactitud y conveniencia del etiquetado
• Revisión de los registros de proceso y/o certificado de análisis
818 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

• Para productos específicos del paciente, verificación del etiquetado del producto y de los registros relacionados con la
identidad del receptor
Los productos de alto riesgo (definidos en el capítulo (797)) deben someterse a pruebas adicionales. Para todos los produc-
tos de alto riesgo, se debe evaluar la necesidad de valoraciones de calidad adicionales de identidad, potencia y pureza de los
ingredientes activos y llevarlas a cabo cuando sea apropiado. Para productos de alto riesgo en la Categoría 11, llevar a cabo
pruebas de esterilidad y de endotoxinas.

Administración a Pacientes

Es posible que, dependiendo de la aplicación específica de la terapia celular o tisular, el personal para el cuidado del pacien-
te requiera llevar a cabo algunas etapas para preparar al paciente. Estas etapas ayudan a asegurar que el producto emitirá los
resultados terapéuticos esperados y ayudan a minimizar el riesgo de efectos adversos.
La determinación de la aptitud del paciente para la terapia, incluyendo la evaluación de histocompatibilidad, por lo general
ocurre antes de la preparación del producto. El estado clínico de un paciente puede cambiar después de la recolección de teji-
dos (debido a fiebre, infección, recurrencia o diseminación de tumores, o mal funcionamiento de órganos), por lo que se de-
ben revisar la condición general del paciente y su aptitud para la terapia antes de la administración del producto. Esta evalua-
ción puede incluir la historia clínica del paciente, una exploración física y estudios de laboratorio tales como hemogramas y
análisis químicos. Asimismo, se pueden llevar a cabo mediciones funcionales y físicas basales, análisis de laboratorio o estudios
de diagnóstico por imágenes pertinentes.
Puede ser necesario preparar al paciente antes del tratamiento, dependiendo de la ruta de administración. Para terapias ce-
lulares que requieren de administración intravenosa, puede ser necesario colocar un catéter venoso central a pacientes con cir-
culación periférica deficiente. Cuando se implantan en el paciente células o tejidos combinados con materiales estructurales, es
necesaria la preparación del sitio, para lo cual puede ser necesario establecer un acceso quirúrgico al sitio, eliminando tejido
degenerado o dañado, cortando el tejido adyacente para acomodar el implante y eliminando el tejido de un sitio secundario
para sujetar o sostener el implante. Por ejemplo, si se implantan productos celulares para la cicatrización de heridas, el sitio
para el injerto debe estar libre de infecciones y el lecho de la herida debe estar bien preparado. Para células de reparación de
defectos en cartílagos, es necesario preparar el sitio dañado. Antes de realizar la administración terapéutica en un sistema de
órganos (p.ej., el sistema broncoalveolar) o en una red vascular (p.ej., las arterias coronarias), puede ser necesario generar un
acceso en el paciente para el catéter mediante cirugía, endoscopía o dirigido por radiografías.
Para todos los casos, se debe evaluar cuidadosamente la necesidad la anestesia y medicación previa adecuadas. Por ejemplo,
cuando el DMSO se va a conservar en un producto celular crioconservado descongelado, puede ser necesario administrar un
antihistamínico al paciente antes de la administración. El examen previo a la administración también debe evaluar los trata-
mientos concomitantes que puedan interactuar con el producto de terapia celular o tisular y modificar sus efectos. Algunos
tratamientos pueden ser auxiliares de la terapia celular o tisular, tales como las citoquinas que promueven la proliferación o la
diferenciación del tejido infundido o implantado. Se deben evaluar los posibles efectos de otros fármacos usados comúnmente,
tales como antibióticos, antineoplásicos, anticoagulantes y agentes antiinflamatorios.

ADMINISTRACIÓN DE TERAPIAS CELULARES A PACIENTES

Algunos productos de terapia celular o tisular son específicos del paciente debido a que se fabrican a partir de células, tejidos
o fuentes de tejido autólogos o alogénicos. Ciertos productos específicos del paciente tienen un potencial definido para el be-
neficio o daño por inmunorreactividad. Se deben establecer sistemas para impedir la administración de un producto de este
tipo al paciente equivocado. Los sistemas recomendados incluyen procedimientos similares a aquellos usados en la administra-
ción de hemoderivados humanos por lo que al menos dos personas deben verificar la identidad del paciente y del producto
específico del paciente inmediatemente antes de la administración.
Los productos de terapia celular y tisular se pueden administrar a través de una variedad de rutas que incluyen las rutas pa-
renterales comunes (intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraarterial) y el tracto respiratorio o gastrointestinal. Otras posi-
bilidades son su aplicación directa en la vasculatura regional, órganos, tejidos o cavidades corporales mediante agujas o catéte-
res o bien después de la exposición quirúrgica del tejido. Aunque la administración parenteral se puede llevar a cabo en insta-
laciones habituales para pacientes ambulatorios o internados, las otras vías pueden exigir lugares especializados, como una sala
de operaciones o sala de endoscopia asépticas. Con frecuencia se emplea una variedad de sistemas de administración tales
como catéteres, jeringas y líneas IV para administrar las células a los pacientes. Antes del uso clínico, los fabricantes deben ase-
gurarse que los componentes de estos dispositivos médicos sean compatibles con las células y con las soluciones de la formula-
ción. En todos los casos, deben existir procedimientos operativos estándar y un programa de calidad para garantizar que el
producto se administre de la manera prevista.

MONITOREO POSTERIOR A LA ADMINISTRACIÓN

Se debe contar con políticas y procedimientos escritos para monitorear los resultados del paciente, así como para informar y
gestionar los eventos adversos. Los exámenes de evolución del paciente deben incluir indicadores capaces de detectar errores
USP 37 Información Cenera// (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 819

o problemas relacionados con todo el proceso de fabricación, y se debe poner especial atención a las manipulaciones, al alma-
cenamiento o al transporte después de la fabricación. La gestión de las reacciones adversas debe incorporar procedimientos
para asegurar el examen médico rápido y el tratamiento de pacientes, además de un sistema para informar y evaluar los efec-
tos adversos que puedan identificar posibles defectos en el producto. Los informes incluirán información requerida por los pro-
gramas de monitoreo de eventos adversos federales o estatales.

ESTABILIDAD

Consideraciones Generales

La estabilidad de los productos celulares o tisulares y de los componentes usados para su fabricación variará dependiendo de
la naturaleza del producto, de su uso clínico previsto, de sus atributos específicos y de las condiciones de almacenamiento,
envasado y transporte. Por esta razón, generalmente no es posible generar pautas integrales que abarquen una amplia gama
de productos. De cualquier modo, el estudio de estabilidad siempre debe diseñarse basándose en principios científicamente
sólidos, así como en un conocimiento cabal del producto terapéutico final y su uso previsto. Los fabricantes también deben
evaluar la estabilidad de las etapas de retención durante el proceso, bancos de células, materias primas críticas y estándares de
referencia. Un programa de estabilidad bien diseñado y ejecutado ofrece un alto grado de garantía de que el producto será
estable durante su vida útil especificada.
Cuando sea factible, se deben llevar a cabo análisis de estabilidad, de conformidad con los principios descritos en las pautas
ICH QSC, presentadas en el capítulo Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biotecnológicos o
Biológicos (1049). Asimismo, se deben recolectar datos de estabilidad para materiales a granel y en proceso que se almacenan
antes del procesamiento y llenado final.
Dependiendo de la formulación usada y de las condiciones de almacenamiento, la vida útil puede variar de horas a años.
Para los casos en los que el producto tiene una vida útil corta o cuando se debe eliminar el estabilizador del producto, puede
ser necesario preparar la formulación final en el sitio clínico, justo antes de su administración. A menudo, la inestabilidad se
observa en forma de agregación en productos celulares y como falta de uniformidad estructural en productos tisulares. Se de-
be establecer la estabilidad del producto celular o tisular final mediante estudios de validación durante el desarrollo.
Para algunos productos celulares o tisulares, tales como productos celulares autólogos o específicos del paciente, los lotes
finales tienden a constar de volúmenes pequeños con una vida útil de apenas unas pocas horas o días. En dichos casos, los
protocolos de estabilidad deben basarse en materiales de donantes múltiples. En los estudios de estabilidad para validar el al-
macenamiento, transporte y fecha de caducidad, y debido a que a menudo resulta difícil obtener suficientes células o tejidos
de productos autólogos o específicos del paciente, se pueden usar células o tejidos de diversas fuentes tales como donantes
normales, repositorios tisulares para investigación, fuentes cadavéricas o células primarias de bancos bien caracterizados. No
obstante, los resultados obtenidos con tales células o tejidos "sustitutos" deben interpretarse con cuidado y de manera conser-
vadora hasta que los datos confirmen que las células autólogas o específicas del paciente en cuestión presentan perfiles de
estabilidad similares a los de las células o tejidos sustitutos.
Para productos de combinación que incluyen células y biomateriales, se debe considerar la estabilidad de ambos componen-
tes. Cuando se encuentran presentes materiales de andamiaje biodegradables, se debe tomar en cuenta la degradación del
andamiaje para determinar la estabilidad y la vida útil del producto de combinación.

Desarrollo del Protocolo de Estabilidad

Los estudios formales de estabilidad para respaldar la obtención de la autorización y la recopilación de información de esta-
bilidad del producto en etapas tempranas deben detallarse en un plan por escrito que describa la forma en que se deben reco-
lectar y analizar los datos sobre la estabilidad para sustentar la fecha de caducidad. Los protocolos deben seguir el formato
recomendado en las pautas reglamentarias existentes y deben incluir el alcance, las condiciones de almacenamiento y el nú-
mero de lotes a analizar, el programa de análisis, los ensayos, el análisis de datos y las especificaciones del producto. Todo
ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la autorización debe ser validado antes de comenzar el
estudio. El diseño específico del estudio debe tomar en cuenta los desafíos razonablemente previstos que pueden surgir para el
producto. Por ejemplo, si la formulación del producto final se realiza en el sitio clínico, se deben realizar estudios de estabilidad
en esta formulación final para determinar el intervalo de tiempo y las condiciones de su conservación. Para células o tejidos
crioconservados, la estabilidad debe establecerse después de la crioconservación del producto final, de productos intermedios
del proceso o de cualquier etapa de retención.
Los estudios de estabilidad deben verificar que las condiciones de almacenamiento mantengan los atributos de calidad del
producto de manera que éste último cumpla con las especificaciones de estabilidad. Estas especificaciones pueden diferir de las
especificaciones de liberación, pero deben tratar la potencia del producto. Medir y calcular el deterioro de la actividad del pro-
ducto empleando metodologías estadísticas puede requerir de muestreos frecuentes durante un periodo prolongado, además
del análisis de múltiples lotes de producción para compensar la variabilidad de las valoraciones o productos.
Se deben llevar a cabo estudios iniciales para establecer una fecha de caducidad provisional antes de la administración al
primer paciente. Estos estudios también son útiles para determinar qué valoraciones son indicadoras de estabilidad, es decir,
los indicadores óptimos de degradación del producto. Debido a que los métodos farmacopeicos existentes no tratan las carac-
820 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

terísticas únicas de todos los productos celulares y tisulares, los fabricantes deben desarrollar valoraciones que abarquen estas
características únicas.
Las validaciones de transporte representan un tipo especial de estudio de estabilidad con protocolos predeterminados, requi-
sitos de prueba y criterios de aceptación. Por lo regular, el producto se envasa y transporta en condiciones normales y extre-
mas, y el material se analiza antes y después del transporte para garantizar que aún cumple con los requisitos de liberación de
producto. Conforme a lo descrito en Almacenamiento y Transporte (a continuación), se debe poner especial atención a las con-
diciones específicas de estrés térmico, mecánico y radiológico que podrían afectar a los productos.

Condiciones de Desafío de la Estabilidad

El perfil indicador de la estabilidad de un producto celular o tisular puede variar con el tiempo por la influencia de una am-
plia variedad de condiciones ambientales, incluyendo temperatura, estrés mecánico y luz. En el desarrollo de un programa que
investigue los efectos de estos parámetros sobre la estabilidad de los productos, se deben considerar vías de degradación mul-
tifactoriales. Los estudios, basándose en la evaluación de riesgos, deben incluir condiciones que superen los intervalos de alma-
cenamiento especificados, es decir, condiciones de desafío como las encontradas durante períodos de almacenamiento, trans-
porte o manipulación anormales. Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras durante un breve periodo, fa-
llas de la incubadora o del almacenamiento en frío, períodos de fluctuaciones térmicas extremas ocasionadas por el transporte
hacia climas calurosos o fríos, condiciones hipobáricas en el sector de carga de una aerolínea comercial o temperaturas previsi-
bles en la sala de cirugía.
Una exposición breve a una condición ambiental muy alejada de un límite establecido y una exposición prolongada a un
ambiente que apenas exceda el límite establecido pueden ser igualmente dañinas. Si se aplican condiciones de almacenamien-
to diferentes, la velocidad lenta y constante de degradación del producto a una temperatura específica puede aumentar. Si
existe una justificación científica, se debe investigar el efecto de la luz sobre el perfil indicador de estabilidad. Se debe prestar
especial atención a los productos almacenados en fluidos que contienen componentes sensibles o que reaccionan con la luz
los cuales pueden dar origen a subproductos citotóxicos.
Los estudios análogos a los de envejecimiento acelerado habitualmente usados en programas de monitoreo de estabilidad
farmacéutica también son útiles para caracterizar la manera en que el producto se degrada y los ensayos que son indicadores
de la estabilidad. Por ejemplo, si un producto derivado de células se va a conservar en refrigeración (4º-6º) hasta su uso, en-
tonces los estudios realizados durante la etapa de retención del producto durante periodos prolongados a temperatura am-
biente (25º) pueden ofrecer información útil sobre la integridad del producto así como de los métodos analíticos usados. Estos
tipos de estudios deben llevarse a cabo antes de los estudios formales de estabilidad, de manera que los estudios formales in-
corporen en el protocolo los ensayos indicadores de estabilidad validados.

ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE

Consideraciones Generales

Las condiciones de almacenamiento se seleccionan para preservar la pureza y la potencia a fin de que se mantengan las es-
pecificaciones del producto durante el almacenamiento, transporte y manipulaciones en el sitio clínico. Antes del uso en ensa-
yos clínicos, deben realizarse estudios iniciales para determinar si las condiciones de almacenamiento, transporte y manipula-
ción son aceptables. Se deben especificar las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad del producto. No es
necesario que las condiciones de almacenamiento y transporte sean las mismas que aquellas previstas para el producto comer-
cial, pero deben garantizar que se mantengan las especificaciones del producto más allá de la fecha de caducidad inicialmente
propuesta. Una vez que se hayan desarrollado los métodos indicadores de estabilidad y que se hayan seleccionado las condi-
ciones del cierre del envase final, almacenamiento y transporte, dichas condiciones deben ser valoradas, conforme a lo tratado
en la sección Estabilidad (anterior).
Para productos con vidas útiles cortas, se deben tomar en cuenta las condiciones de almacenamiento y transporte en con-
junto-incluso dentro de un solo sitio clínico- debido a que el transporte constituye la mayor parte del tiempo de almacena-
miento después de la fabricación. El producto debe ser colocado en un envase a prueba de fugas y resistente a la luz, con un
soporte físico adecuado, que garantice la estabilidad y la prevención de fugas durante las condiciones normales de transporte.
Se debe poner especial atención a la capacidad de los gases para penetrar el envase de transporte, especialmente si el produc-
to de terapia celular se almacena o transporta usando hielo seco o nitrógeno líquido.

Almacenamiento

Para cada tipo de producto de terapia celular, el fabricante debe establecer especificaciones de almacenamiento del produc-
to y condiciones de almacenamiento aceptables que incluyan el intervalo de temperatura o el nivel de nitrógeno líquido. Las
unidades de almacenamiento requieren de un sistema que monitoree y registre continuamente la temperatura y/o los niveles
de nitrógeno líquido. Esto incluye un sistema de alarma para notificar inmediatamente al personal del laboratorio sobre candi-
USP 37 Información General/ (1046\ Producto<; Derivados de Células y Tejidm 821

ciones de almacenamiento inaceptables. La estabilidad del producto durante el almacenamiento de rutina debe rnonitoreai-se
mediante un programa de estabilidad (ver la sección Estabilidad anterior).
La crioconservación es el principal modo de almacenamiento a largo plazo para células. Los productos celulares se criocon-
servan usando procedimientos de congelación a velocidad controlada o equivalentes que mantengan la viabilidad. Se debe
monitorear y documentar la temperatura de los productos durante la congelación y el alrmJCenamiento de conformidad con
las políticas de la instalación. Asimismo, se debe valorar la estabilidad del producto en condiciones de retencion tanto en la
instalación de fabricación como en el sitio clínico.
La velocidad de enfriamiento para soluciones celulares durante la crioconservación es importante debido a las lesiones mecá-
nicas y por deshidratación que resultan de la formación y crecimiento de cristales de hielo. Las temperaturas ideales dependen
del tipo de células y de la concentración del crioconservante. La velocidad de enfriamiento óptima para la mayoría de las célu-
las está entre 1 ºy 3º por minuto. Los congeladores con velocidad controlada que pueden duplicar de manera reproducible
esta velocidad de enfriamiento óptima son fundamentales cuando se congela un gran número de viales o grandes volúmenes
de células en bolsas. Una vez enfriadas por debajo del punto de congelación, las células deben almacenarse a temperaturas por
debajo de -130º. Esto se puede conseguir mediante congeladores eléctricos o con nitrógeno liquido.
El almacenamiento de células en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido reduce el riesgo de contaminación
cruzada con otros materiales en el congelador. Se debe validar el equipo congelador y se debe mapear la temperatura de mo-
do que las células no estén sujetas a temperaturas por encima de -1 30º a medida que el nitrógeno líquido se evapora o duran-
te la apertura del congelador. Algunas células se pueden almacenar a -80º si se pretende usarlas dentro de unas pocas sema-
nas. Asimismo, es posible prevenir la contaminación cruzada usando envoltorios sellados para cubrir las criobolsas.
Una gran cantidad de productos derivados de células no pueden ser crioconservados. Debido a que las células mantienen su
metabolismo durante el almacenamiento, su período de caducidad es corto~en el orden de horas o días. La fecha de caduci-
dad se puede extender si se aumenta el volumen del medio de almacenamiento, si se ajusta la temperatura de almacenamien-
to o si se conecta una serie de bolsas o compartimientos que permitan cambiar el medio sin violar la esterilidad del sistema.
Además, se deben definir y monitorear las condiciones de almacenamiento en el sitio clínico. Aunque los centros de procesa-
miento de células o los centros médicos implicados en el transplante de médula ósea por lo general cuentan con congeladores
de nitrógeno líquido, la mayoría de las farmacias clínicas no cuentan con estos equipos. Las temperaturas y características de
almacenamiento deben definirse para cada producto. Es posible que el sitio clínico deba retener el producto en el envase para
transporte hasta que éste pueda administrarse al paciente. Cuando el descongelamiento y la administración del producto deri-
vado de células se llevan a cabo en el centro médico, el laboratorio que almacena o transporta las células debe colaborar estre-
chamente con el sitio clínico debido a que las células en una suspensión concentrada sólo pueden sobrevivir durante unas po-
cas horas.

Transporte

Los envases para transporte y los procedimientos de transporte deben asegurar que las temperaturas se mantengan dentro
de los intervalos aceptables de duración del transporte y en condiciones de uso real. Estas condiciones incluyen temperaturas
dentro del envase para transporte, extremos de temperaturas en el exterior del envase para transporte (como las temperaturas
en la pista caliente de un aeropuerto o en el frío sector de carga de un avión) y demás desafíos de transporte (tales como rayos
x o vibración mecánica). Durante el desarrollo del producto, se deben realizar estudios de transporte para identificar las condi-
ciones adversas que podrían afectar a los productos. De manera subsiguiente, se deben seleccionar y validar los materiales de
refuerzo y aislamiento para armar un sistema de embalaje que proteja contra temperaturas extremas y condiciones mecánicas
adversas.
La mayoría de los productos se transportan mediante transportadores o sistemas de correo comerciales. En ocasiones, los
productos críticos son transportados a mano en aviones comerciales. Los transportistas comerciales deben obtener permisos
especiales para evitar las revisiones con equipo de rayos x en los aeropuertos. Se debe poner especial atención a las etiquetas
del envase para transporte ya que puede ser necesario mostrar información sobre riesgo biológico y específica del paciente en
áreas específicas del embalaje. Las validaciones de transporte deben llevarse a cabo usando protocolos definidos con criterios
de aceptación predeterminados para asegurar que el producto cumpla con las especificaciones de calidad (incluyendo la po-
tencia) una vez que alcance su destino final.
Los productos derivados de células crioconservados por lo regular se envían a sitios clínicos usando hielo seco o en transpor-
tadores secos de nitrógeno líquido. Se prefieren estos últimos, porque resulta más fácil mantener y monitorear la temperatura,
y permiten el monitoreo continuo de la temperatura del transportador, la cual puede ser recabada y registrada hasta 14 días.
El hielo seco y el nitrógeno líquido son materiales considerados peligrosos durante el transporte por lo que se deben etiquetar
adecuadamente.

ETIQUETADO

El etiquetado de productos de terapia celular está regulado por la FDA de conformidad con el Título 21 del CFR 201, 601,
61Oy1271. En lo que respecta a productos biológicos, el Título 21 del CFR 61 O Subparte G describe lm requisitos de etiqueta-
do de envase y embalaje. Siempre que sea posible, se debe adjuntar una etiqueta completa al envase del producto. Ésta inclu-
ye el nombre propio del producto obtenido del US Adopted Names (USAN) Council (Consejo de Nombres Adoptados en los
822 <1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

EE.UU.); el nombre, dirección y número de autorización del fabricante; el número de lote; la fecha de caducidad; para envases
multidosis, la dosis individual recomendada; la leyenda "Solamente Rx" para productos de venta bajo receta; instrucciones pa-
ra el dispensador para que proporcione, cuando se requiera, una Guía de Medicación a cada paciente; y si el envase no está
contenido en un empaque, todos los puntos requeridos para una etiqueta del empaque. Si la etiqueta es demasiado pequeña
para incluir toda esta información, se puede usar una etiqueta parcial, pero la siguiente información debe aparecer en dicha
etiqueta: el nombre expresado como nombre propio o nombre USAN; el número de lote y el nombre del fabricante; y para
envases multidosis, la dosis individual recomendada. Cuando se usan etiquetas parciales, el envase debe colocarse en un em-
paque que tenga una etiqueta que incluya todos los puntos requeridos para la etiqueta del empaque. Para los envases que no
pueden incluir ninguna etiqueta, el envase debe colocarse en un empaque que incluya toda la información requerida para una
etiqueta del empaque. Además, cuando la etiqueta se coloca en el envase, ésta no debe impedir la inspección del contenido.
Para productos con vidas útiles muy cortas, la fecha de caducidad debe ajustarse y corregirse a los husos horarios para propor-
cionar al usuario una evaluación exacta de la vida útil.
La etiqueta del empaque debe contener el nombre propio o USAN del producto, el nombre, dirección y número de autori-
zación del fabricante, el número de lote, la fecha de caducidad, el conservante usado y su concentración, o las palabras "Sin
conservante" si fuera apropiado, el número de envases, si contiene más de uno, la cantidad de producto en el envase, la tem-
peratura de almacenamiento recomendada, las palabras "Agitar Bien", "No Congelar" u otras instrucciones según se indique,
la dosis individual recomendada para envases multidosis, la vía de administración, las sustancias sensibilizantes conocidas, el
tipo y la cantidad de antibióticos agregados durante la fabricación, los ingredientes inactivos si representan un factor para la
seguridad, el coadyuvante, el origen del producto cuando represente un factor para la administración segura, la potencia míni-
ma expresada en términos del estándar oficial de potencia o la declaración "No Existe un Estándar de Potencia de EE.UU." y,
finalmente, la declaración "Solamente Rx" para productos de venta bajo receta. Los reglamentos del Título 21 del CFR 610.62
tratan la posición y prominencia del nombre propio o USAN con respecto a un nombre comercial.
Los requisitos adicionales de etiquetado son aplicables puesto que el Título 21 del CFR 1271.90 considera a los productos de
terapia celular como HCT/P. Para productos de terapia celular autólogos, el fabricante está exento de los requisitos para deter-
minar la elegibilidad del donante. No obstante, si no se realiza el análisis recomendado para contaminantes patógenos o mi-
crobianos antes de la liberación, la etiqueta debe contener la leyenda "SÓLO PARA USO AUTÓLOGO" o "NO EVALUADO PA-
RA SUSTANCIAS INFECCIOSAS". La etiqueta debe contener la leyenda para Peligro Biológico (Biohazard) mostrada en el Título
21 del CFR l 271.3(h) con la leyenda "ADVERTENCIA: Explicar a los pacientes los riesgos de enfermedades transmisibles." Para
productos específicos del paciente, el nombre completo del paciente, sus iniciales o una combinación de los mismos debe apa-
recer en el etiquetado para garantizar que el producto se administre al paciente apropiado.
Asimismo, los reglamentos rigen el contenido y formato del etiquetado para productos farmacéuticos para prescripción en
humanos (incluyendo productos biológicos), también conocido como prospecto del empaque. Estos reglamentos, que aplican
a productos terapéuticos aprobados, entraron en vigor el 30 de junio de 2006. Los detalles sobre el contenido y el formato se
pueden encontrar en el Título 21 del CFR 201.56 y 201.57. Estos cambios fueron diseñados para mejorar la capacidad de los
profesionales de la salud para acceder, leer y usar el etiquetado de medicamentos bajo receta. El principal cambio es la adición
de una sección de media página de información más relevante. La mayoría de los demás cambios implican la reorganización
de las secciones para trasladar al frente la información más crítica para la prescripción.
Además de los requisitos reglamentarios específicos de la FDA, diversos grupos han diseñado la ISBT 128, una norma para
uniformar el etiquetado de productos de terapia celular, en la que ISBT son las siglas de la lnternational Society of Blood Trans-
fusion (Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea) y el 128 refleja la selección de la simbología de código de barras
conocida como Código 128. La ISBT 128 define las estructuras de los datos y la colocación de códigos de barras y su texto
correspondiente, legible a la vista, que aparece debajo del código de barras. Asimismo, la norma proporciona clasificaciones
para diferentes tipos de productos celulares, texto modificador para procesamiento de células, texto de manipulación para la
forma en que se fabrican las células, texto crioprotector para productos celulares congelados, así como otros textos diversos
que deben incluirse en las etiquetas. Aunque esta norma voluntaria cumple con los requisitos de diferentes organizaciones para
el etiquetado de productos celulares, actualmente no cumple con los requisitos reglamentarios de la FDA. Por consiguiente, las
etiquetas que cumplen con la ISBT 128 deben complementarse con información adicional requerida por la FDA.

CONSIDERACIONES PARA LA TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍA

La transferencia de habilidades, conocimiento, tecnologías y métodos de fabricación necesarios para crear un producto deri-
vado de células o tejidos son esenciales para garantizar que los desarrollos científicos y tecnológicos sean accesibles a usuarios
que puedan desarrollarlos aún más y convertir la tecnología en nuevos productos, procesos, aplicaciones, materiales o servi-
cios. A continuación se resumen algunas consideraciones generales para las actividades de transferencia de tecnología.
El proceso para desarrollar un producto de terapia celular o tisular es complejo y a menudo implica varias rondas de transfe-
rencia de tecnología durante el ciclo de vida del producto. Algunos ejemplos de actividades de transferencia de tecnología
incluyen: desde la investigación de campo hasta la investigación traslacional; transferencia desde la investigación y el desarrollo
hasta la fabricación que cumpla con las BPF; y cambio en la instalación de fabricación (por ejemplo, de la fabricación interna al
fabricante contratista).
Los fabricantes deben anticipar la necesidad de transferir tecnología durante la etapa de investigación y desarrollo de un
proceso de terapia celular o tisular. Lo anterior debe resultar en buenas prácticas de documentación para investigación y desa-
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 823

rrollo del producto, incluyendo procedimientos de análisis. Los datos y resultados deben conservarse en forma de informes de
desarrollo o informes técnicos para proporcionar información histórica que pueda usarse como referencia y para solicitudes
reglamentarias. Asimismo, las materias, procedimientos y equipos críticos deben identificarse durante la transferencia de tec-
nología. El progreso de desarrollo del producto y del proceso debe monitorearse en función de hitos establecidos como parte
de la evaluación de riesgos y la identificación de brechas en el plan de transferencia de tecnología. La Tabla 3 proporciona una
visión general de las etapas relacionadas con la transferencia de tecnología.
Tabla 3: Transferencia de Tecnología-Etapas Fundamentales
• Definir el alcance, la estrategia y los riesgos asociados con el proyecto que será transferido
• Identificar brechas generales y la capacidad de transferencia del proceso
• Evaluar la disponibilidad de documentación tal como los procedimientos de fabricación y análisis, pla-
nes de muestreo, datos y especificaciones del producto en proceso y final, especificaciones de material
(incluyendo el origen, requisitos de análisis y cantidades requeridas para un procedimiento de fabricación
o de prueba), especificaciones de equipo, requisitos de capacitación especializados, requisitos de la insta-
lación y requisitos de infraestructura
•Establecer un órgano de administración formado por líderes, expertos y mentores por parte del que
transfiere y del que recibe la tecnología; determinar responsabilidades para cada grupo e individuo
• Definir canales de comunicación e información
Preparación • Identificar mediciones de desempeño, hitos y secuencias
• Establecer un plan de gestión de riesgos
• Establecer un plan maestro de transferencia de tecnología
• Desarrollar un plan de capacitación
• Establecer documentos en el centro receptor (especificaciones, SOP, registros de partidas y métodos de
prueba estándar)
• Operaciones de capacitación, calidad y apoyo del personal para la sostenibilidad
• Calificar materiales y proveedores
• Establecer y ejecutar protocolos de comparabilidad/aptitud del equipo
• Calibrar el equipo en el centro receptor
• Calificar al personal, al equipo y las instalaciones en el centro receptor (incluye la ejecución de validacio-
nes de procesamiento aséptico, llenado de medios estériles y validaciones de limpieza)
• Establecer y ejecutar calificaciones de métodos/valoraciones
• Establecer un programa de estabilidad de producto
• Realizar pruebas de ingeniería y uniformidad/calificación
Desarrollo e • Evaluar la necesidad de establecer la comparabilidad y preparar solicitudes reglamentarias
Implementación • Establecer y ejecutar calificaciones de transporte
• Recolectar y establecer tendencias de datos de procesos/producto
• Monitorear la estabilidad del producto
• Gestionar el control de cambios
• Capacitar y volver a calificar al personal
• Recalibrar y volver a calificar el equipo
Mantenimiento • Actualizar las solicitudes reglamentarias

El objetivo final de la transferencia de tecnología se centra en que el receptor reproduzca un proceso de manera uniforme
para producir productos comparables que cumplan con los reglamentos. Es común que los fabricantes desarrollen e imple-
menten mejoras en el proceso durante las etapas tempranas de transferencia de tecnología para respaldar la ampliación y la
fabricación para los ensayos clínicos de las Fases 1/11. Sin embargo, durante la transferencia de tecnología para estudios de la
Fase 111, ensayos claves o fabricación comercial, se deben evitar cambios en el proceso o productos debido a que pueden re-
querir de estudios clínicos adicionales y afectar negativamente el tiempo hasta su comercialización.

REGLAMENTACIONES V ESTÁNDARES

La Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos o Ley FD&C) y la Public
Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Pública o Ley PHS) ofrecen el marco legal para la reglamentación de la FDA para
productos biológicos, incluyendo productos de terapia celular. La Tabla 4 presenta una lista de términos de uso frecuente en la
reglamentación de productos de terapia celular. En 1993, la FDA notificó que tenía la intención de reglamentar los productos
de terapia celular y génica como productos biológicos (Registro Federal l 993;58:53248-53251 ). La FDA definió productos de
terapia celular somáticos como células autólogas (es decir, obtenidas del mismo sujeto), alogénicas (es decir, intraespecies) o
xenogénicas (es decir, interespecies) que han sido propagadas, expandidas, seleccionadas, tratadas farmacológicamente o al-
teradas de otro modo ex vivo para su administración en humanos para la prevención, tratamiento, cura, diagnóstico o mitiga-
ción de enfermedades o lesiones. Para otros productos y medicamentos biológicos, se deben realizar ensayos clínicos que im-
pliquen productos de terapia celular somáticos con base en una solicitud para nuevo medicamento en investigación (IND).
Después de que el patrocinador presente evidencia suficiente sobre la seguridad del producto y de la eficacia clínica, se puede
obtener la aprobación de la FDA para la comercialización a través de una solicitud de autorización para Productos biológicos
(BLA) o PMA.
Conforme a lo definido por la FDA, los productos de terapia celular se consideran medicamentos y productos biológicos,
pero también HCT/P reglamentados con base en la Sección 351 y/o Sección 361 de la Ley PHS. Esto significa que los produc-
tos de terapia celular están sujetos a las BPFv (Título 21 del CFR 21 O y 211 ), a los reglamentos para Productos Biológicos (Títu-
824 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

lo 21 del CFR 61 O) y a los reglamentos para productos elaborados con células o tejidos humanos (Título 21 del CFR 1271)
incluyendo las Buenas Prácticas para Tejidos vigentes.
En anos recientes, la FDA ha emitido diversas reglamentaciones y documentos guía para productos celulares y tisulares hu-
manos (HCT/P) (ver el Apéndice y www.fda.gov/cber/). Las reglamentaciones del Título 21 del CFR 1271 son de particular im-
portancia pues establecen un enfoque gradual basado en el riesgo de productos elaborados con células o tejidos humanos
(HCT /P). Dentro de este marco reglamentario, una gran cantidad de células o tejidos humanos convencionales no están suje-
tos a la aprobación previa a la comercialización y únicamente tienen que cumplir con las Buenas Prácticas para Tejidos vigen-
tes, incluyendo los requisitos de elegibilidad del donante. Este nivel más bajo de supervisión reglamentaria tiene como propósi-
to prevenir la introducción, transmisión o diseminación de enfermedades transmisibles. Cuando las células o tejidos humanos
son el material de partida para la creación de un producto derivado de células novedoso, se aplican requisitos reglamentarios
adicionales. Este nivel más alto de supervisión reglamentaria incluye el cumplimiento con las BPFv, las normas para productos
biológicos y la aprobación previa a la comercialización (ver el Título 21 del CFR 1271.1 O). Para casi todas las instancias, los
productos derivados de células descritos en este capítulo general deben cumplir con el nivel más alto de supervisión reglamen-
taria.
Además de las reglamentaciones y pautas específicas de terapia celular, resultan importantes y aplicables una gran cantidad
de pautas tales como aquellas relacionadas con el procesamiento aséptico, las expectativas de las BPF durante el desarrollo y la
validación del proceso, entre otras (ver www.fda.gov). Asimismo, la ICH ha emitido documentos guía para la calificación de
productos derivados de células y tejidos (ver el Apéndice y www.ich.org). Algunas de las pautas y conceptos en estos documen-
tos se reproducen en los compendios USP~NF.
La vía reglamentaria para productos de terapia celular es paralela a la de los productos farmacéuticos y, a medida que el
producto se traslada de la investigación temprana a los ensayos clínicos claves y finalmente hasta su aprobación para comercia-
lización, el grado de control de fabricación aumenta en rigurosidad. Lo anterior tiene implicaciones para la unidad de fabrica-
ción y puede requerir que el sitio sea trasladado. Las organizaciones para el establecimiento de normas fomentan el uso de una
unidad de calidad plenamente funcional para supervisar el progreso de la fabricación. La información se encuentra disponible
en el sitio Web de la FDA, junto con referencias a los grupos a cargo de guiar a la comunidad médica y a la unidad de fabrica-
ción durante el desarrollo.
Además de los capítulos generales y monografías de USP para productos de terapia celular y tisular, diversas organizaciones
profesionales para el establecimiento de normas (ver la Tabla 5 y el Apéndice) han trabajado estrechamente con las autoridades
reglamentarias para desarrollar normas y prácticas. Estas organizaciones garantizan que las normas se mantengan actualizadas
y que cumplan con las reglamentaciones gubernamentales. Estas normas representan una fuente complementaria de conoci-
miento en relación con la identificación de donantes, la selección y el análisis de donantes, las recolecciones de productos, el
procesamiento de productos celulares, la administración, el informe de eventos adversos y el seguimiento posterior al trata-
miento. El AATB ha elaborado pautas para obtener tejido alogénico. Con el paso de los anos, diversas organizaciones han in-
tentado armonizar normas, así como el desarrollo de circulares comunes que puedan compararse con los prospectos del em-
paque. Sin embargo, en la actualidad, cumplir con las normas de una organización no garantiza el cumplimiento con las nor-
mas de otras organizaciones.
Los programas de normas voluntarias generan una gran cantidad de beneficios para las instalaciones de fabricación que par-
ticipan de estos programas. Las organizaciones profesionales para el establecimiento de normas participan en talleres educati-
vos y diseminan información sobre asuntos operativos. Asimismo, mantienen una vigilancia estrecha sobre las actividades de la
FDA y la capacitación de inspectores. Además, la FDA confía en la acreditación mediante el programa de normas voluntarias;
asimismo, las inspecciones no anunciadas de la FDA han llevado al aumento en el nivel de cumplimiento por parte de las insta-
laciones de laboratorio y clínicas, lo que sin lugar a dudas ha incrementado la seguridad del paciente. Los terceros responsa-
bles de los pagos y los servicios de clasificación de hospitales han comenzado a usar informes de acreditación en su evaluación
de programas de calidad.
Tabla 4. Términos de Uso Frecuente en la Reglamentación de Productos de Terapia Celular
TÉRMINO DEFINICIÓN
351 productos Regulados con base en la Sección 351 de la Ley PHS
Regulados con base en el Título 21 del CFR 1271, Células, Tejidos y Productos Derivados
~productos de Células y Tejidos Humanos
BLA Solicitud de Autorización para Productos Biológicos
CBER Centro para la Evaluación e Investigación de Productm Biológicos
CDRH Centro para Dispositivos y Salud Radiológica
BPF Buenas Prácticas de Fabricación
Buenas Prácticas para Tejidos, Título 221 del CFR 1271, Células, Tejidos y Productos Derivados

~>c,
1
N e Lelulas y 1e11dos Humanos
ención de Investigación de Dispositivos.
Una exención de investigación de dispositivos (IDE, por sus siglas en inglés) permite el uso del dispositi-
1 vo bajo investigación en un estudio clínico a fin de recolectar datm de seguridad y eficacia requeridos
1 .
para respaldar la solicitud de Aprobación Previa a la Comercialización (PA) o la entrega de una Notifica-
E 1
ción Previa a Id C.Clíl1~rciali1<1ción [51 O(k)] a la FDA
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 825

Tabla 4. Términos de Uso Frecuente en la Reglamentación de Productos de Terapia

-----
Celular (Co11tinuución)
-----~------

TÉRMINO DEFINICIÓN
Nuevo Fármaco en Investigación (IND, por sus siglas en inglés).
Un IND es una solicitud de autorización presentada ante la FDA para adminis liar un medicamento en
investigación a humanos. Las reglamentaciones para IND se pueden encontriir en el Título 21 del CFR
IND 312.
---- ·----·--
PMA Aprobación Previa a la Comercialización
---- ----------~

Tabla 5. Organizaciones para el Establecimiento de Normas para Productos de Terapia Celular

La AABB, anteriormente conocida como la American Association of Blood Banks (Aso-
ciación Estadounidense de Bancos de Sangre), es una asociación internacional que re-
presenta a individuos e instituciones implicadas en actividades relacionadas con la
AABB transfusión y las terapias celulares, incluyendo medicamentos de transplante. http://www.aabb.org/
--
La American Association of Tissue Banks (Asociación Estadounidense de Bancos de Teji-
dos) es una organización educativa y científica, exenta de impuestos, que facilita el
abastecimiento de tejidos transplantables de alta calidad para satisfacer las necesida-
des de la nación. La AATB publica normas para asegurar que las actividades de los
bancos de tejidos cumplan con las normas aceptables de desempeño técnico y ético.
La AATB lleva a cabo un programa de acreditación para establecimientos que recolec-
tan, procesan, almacenan o distribuyen tejido humano para transplante. El personal
del banco de tejidos se somete a un programa de certificación para asegurar que las
actividades de bancos de tejidos se lleven a cabo de manera profesional, cumpliendo
AATB constantemente con las normas de la asociación. http://www.aalb:org/
La ASTM lnternational (ASTM), conocida originalmente como la American Society far
Testing and Materials (Asociación Estadounidense para Análsis y Materiales), es una
de las organizaciones voluntarias para el desarrollo de estándares más grandes del
mundo y proporciona normas técnicas para materiales, productos, sistemas y servi-
cios. Las normas de la ASTM lnternational se usan en la infraestructura de informa-
ASTM ción que guía el diseño, la fabricación y la comercialización en la economía global. http://www.astm.org/
------
La Foundation far the Accreditation of Cellular Therapy (Fundación para la Acredita-
ción de Terapias Celulares) es una organización sin fines de lucro fundada conjunta-
mente por la lnternational Society far Cellular Therapy (Sociedad Internacional para
Terapias Celulares o ISCT) y la American Society of Blood and Marrow Transplanta-
tion (Sociedad Estadounidense de Transplante De Médula y Sanguíneo o ASBMT) pa-
FACT ra la inspección y acreditación voluntaria en el campo de la terapia celular. http://www.factwebsite.org/
El National Marrow Donar Program (Programa Nacional de Donantes de Médula) es
una organización sin fines de lucro que opera el registro de donantes de células he-
matopoyéticas y de unidades sanguíneas de cordón umbilical, auspiciado por el go-
NMDP bierno federal, en los Estados Unidos. http://www.nmdp.org/
El lnternational Council far Commonality in Blood Banking Automation (Consejo lnter-
nacional sobre Aspectos Comunes de Automatización de Bancos de Sangre) se esta-
bleció con el objetivo de implementar y gestionar la norma ISBT 128, un sistema de
identificación, etiquetado y procesamiento de sangre, tejido y productos de terapia
ICCBBA celular humanos que emplean un sistema internacionalmente normalizado. _12!tp://www.iccbba.org/

APÉNDICE:

Las terapias celulares y los componentes de las terapias celulares están reglamentados por la FDA como productos biológi-
cos. Los requisitos generales se listan en la legislación nacional y en las guías internacionales. En los Estados Unidos, los requisi-
tos nacionales se codifican en diferentes secciones del Título 21 del CFR, mientras que los documentos guía de la FDA propor-
cionan recomendaciones adicionales. Los documentos guía internacionales se encuentran disponibles en la ICH, en la Euro-
pean Agency of Medicines (Agencia Europea de Medicamentos o EMA) y en la Organización Mundial de la Salud (OMS). Aun-
que el presente capítulo general hace una buena referencia a los documentos guía de la ICH, no ocurre lo mismo con los do-
cumentos de la OMS y de la EMEA, por lo que se recomienda a los fabricantes de productos derivados de células y tejidos
destinados a mercados fuera de los Estados Unidos referirse a las pautas pertinentes de las naciones correspondientes. De ma-
nera complementaria a los capítulos de USP referidos en este capítulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios y
las mejores prácticas de desarrollo de productos y procesos, fabricación, control de calidad y garantía de calidad:
Código de Reglamentos Federales (CFR)
•Título 21 del CFR 201.56-57
• Título 21 del 21 O
•Título 21 del CFR 211
•Título 21 del CFR 600.3
•Título 21 del CFR 601
•Título 21 del CFR 61 O
•Título 21 del CFR 820
•Título 21 del CFR 1271
826 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

• Título 21 del CFR 46

Documentos Guía de la FDA
• Draft Guidance far FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) lnforma-
tion far Human Somatic Ce// Therapy lnvestigational New Drug Applications (INDs)
• Draft Guidance far Jndustry: Potency Tests far Ce/fular and Gene Therapy Products
• Draft Guidance far Jndustry: Current Good Tissue Practice (cGTP) and Additional Requirements far Manufacturers of Human
Ce/Is, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/Ps)
• Guidance far lndustry: Eligibility Determination far Donors of Human Ce/Is, Tissues, and Ce/fular and Tissue-Based Products
(HCT/Ps), February 200 7. http://www.fda.gov/Biolog icsBloodVaccines/G uidanceComplianceRegulatoryl nformation/
Guidances/Tissue/ucm073964.htm
• Guidance far lndustry: Source Animal, Product, Preclinical, and Clinical lssues Conceming the Use of Xenotransplantation Pro-
ducts in Humans, April 2003. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/
Gu idances/Xenotra nspla ntation/ucmO 74 354. htm
• PHS Guideline on lnfectious Disease lssues in Xenotransplantation, january 2001. http://www.fda.gov/BiologicsBlood
Vaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/Xenotransplantation/ucm074727.htm
• Guidance far lndustry: lnvestigating Out-of-Specification (005) Test Results far Pharmaceutical Production, October 2006.
www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/UCM070287.pdf
• Guidance far lndustry: Validation of Growth-Based Rapid Microbio!ogical Methods far Sterility Testing of Ce/fular and Gene-
Therapy Products, CBER, 2008. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/
Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072612.htm
• FDA Blue Book G95-l, http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/
ucm080735.htm
Documentos Reglamentarios Nacionales e Internacionales
• The United States Consensus Standard for the Uniform Labeling of Cellular Therapy Products using ISBT 128, disponible
en: http://www.iccbba.org/usconsensusstandard_cell ulartherapy .pdf
• ISO 10993-1 :2003, Biological evaluation of medical devices-Part 1: Evaluation and testing, disponible en: http://
www.iso.org
• ICH Q2(Rl ): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, disponible en: http://www.ich.org
• ICH Q5C: Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products, disponible en:
http://www.ich.org
• ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, disponible en:
http://www.ich.org
• ICH Q9: Quality Risk Management, disponible en: http://www.ich.org
• Naming Scheme for Cell Therapies by the United States Adopted Names (USAN) Council, available at: http://www.ama-
assn.org/
• Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996), disponible en: http://
www.nap.edu/

GLOSARIO DE TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Aféresis-Procedimiento de extracción de sangre de un donante, retirando componentes seleccionados (p.ej., plaquetas o leu-
cocitos) y retransfusión del remanente al donante.
Agente Adventicio-Agente extraño que se introduce inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la contamina-
ción microbiana, química o bioquímica de una sustancia purificada).
Alogénico-De un integrante no emparentado de la misma especie pero con un genotipo diferente.
Anticuerpos Monoclonales-Anticuerpos derivados de un único clon celular.
Antígenos Leucocitarios Humanos (HLA, por sus siglas en inglés)-Proteínas controladas por el complejo principal de histo-
compatibilidad. Estas proteínas tienen un papel preponderante en la determinación de la compatibilidad para trasplantes.
Autólogo-Que se obtiene del organismo propio.
Bioensayo-Medición de la efectividad de un compuesto por su efecto en animales o células en comparación con una prepa-
ración estándar. (Ver también Potencia.)
Biotecnología-Toda técnica que utilice organismos vivos (o partes de estos) para producir o modificar productos, mejorar
plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos específicos. La definición más nueva se refiere al uso industrial y
farmacéutico del ADN recombinante, fusión celular, nuevas técnicas de bioprocesamiento y terapia génica.
BPFv-Abreviatura para Buenas Prácticas de Fabricación vigentes.
CD34--Cúmulo del marcador 34 de la superficie celular. El CD34 es una proteína que distingue a las células madre y progeni-
toras de células sanguíneas más maduras.
Célula Dendrítica-Célula que sensibiliza las células Ta los antígenos.
Célula Madre-Célula inmortal capaz de proliferar y diferenciarse en distintos tipos de células especializadas. Se supone que
cada sistema de tejidos importante tiene su propia célula madre.
USP 37 Información General/ (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos 827

Célula Progenitora-Célula madre o ancestral generalmente ya comprometida a diferenciarse en un tipo o linaje celular espe-
cífico.
Células Alimentadoras-Células usadas en cocultivo para mantener células madre pluripotentes. Para hESC, las capas alimen-
tadoras típicas incluyen fibroblastos embrionarios de ratón o humanos tratados para evitar su división.
Células Asesinas Naturales (Células NK)-Linfocitos citotóxicos que constituyen un componente principal del sistema inmu-
ne innato.
Células de la Médula Ósea-Una variedad de células indiferenciadas (células madre) y diferenciadas (linfocitos, granulocitos,
eritrocitos y plaquetas) que se encuentran en las cavidades internas de los huesos o la médula ósea.
Células de los Islotes-Células de los islotes j3 del páncreas que secretan insulina.
Células Endoteliales-Células epiteliales de origen mesodérmico que recubren las cavidades internas del cuerpo como el cora-
zón y los vasos sanguíneos y linfáticos.
Células Epiteliales-Células del revestimiento de distintos órganos. Ejemplos: células epiteliales respiratorias, intestinales o vas-
culares.
Células Madre de Sangre del Cordón Umbilical-Células madre obtenidas de la sangre que se conserva en la placenta y en
el cordón umbilical que se mantienen unidos después del alumbramiento.
Célula Madre Embrionaria Humana (hESC, por sus siglas en inglés)-Célula madre derivada de la masa celular interna del
blastocisto.
Células Madre Hematopoyéticas-Células madre que dan origen a todos los leucocitos, eritrocitos y plaquetas.
Células Madre Mesenquimales-Células madre multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de células.
Células Madre Neuronales-Células madre encontradas en el tejido neuronal que pueden dar origen a neuronas y células
gliales.
Células No Diferenciadas-Células que no se han desarrollado en un tipo de célula o tejido especializado.
Células Osteogénicas-Provenientes del hueso o que participan en el crecimiento o reparación ósea.
Células Somáticas-Células que no son células germinales.
Células T-Linfocitos que adquieren su repertorio de funciones y su capacidad de discriminación autóloga en el timo, y son
responsables de la inmunidad mediada por células. Hay varios subgrupos de células T (células T colaboradoras, células T supre-
soras y células T citotóxicas).
Citoquina-Todo factor que actúa sobre las células; por lo general, una proteína que favorece el crecimiento.
Citoplasma-Material celular contenido entre la membrana celular y el núcleo.
Citotóxico-Capaz de causar la muerte celular.
Clasificador de Células Activado por Fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés)-Equipo que clasifica células basándose
en marcadores fluorescentes unidos a las células.
Clonal-Genes, células u organismos enteros derivados de y genéticamente idénticos a un único gen, célula u organismo an-
cestral común.
Colorante Supravital-Colorante que tiñe células vivas solamente.
Condrocitos-Células que producen los componentes del cartílago.
Cultivo en Suspensión-Células capaces de crecer en suspensión sin la necesidad de adherirse a un sustrato (soporte) para
generar la división celular.
Diferenciación-Proceso de cambios bioquímicos y estructurales mediante el cual las células adquieren forma y función espe-
cializadas.
ELISA-Enzimoinmunoensayo. lnmunoensayo que utiliza un antígeno o anticuerpo marcado con una enzima para detectar la
unión de una molécula a una matriz sólida.
Enfermedad del Injerto Contra ei Anfitrión-Rechazo del tejido transplantado por parte del anfitrión. Es la causa principal de
muerte del paciente cuando se utiliza un tejido alogénico mal compatibilizado con el receptor.
Ensayo Clonogénico-Procedimiento basado en la capacidad de producir un don de células.
Epidérmico-Perteneciente a la capa más externa y avascular de la piel, derivada del ectoderma embrionario.
Ex Vivo-Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Se refiere al procedimiento médico en el que un
órgano, células o tejido se toman de un cuerpo vivo para un tratamiento o procedimiento y posteriormente se devuelven al
cuerpo vivo.
Exento de suero-Se refiere al medio de crecimiento celular que carece de componentes séricos.
Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM CSF, por sus siglas en inglés)-Hormona natural que
estimula la producción de leucocitos, especialmente granulocitos y monocitos.
Factores de Crecimiento-Factores responsables de regular la proliferación, función y diferenciación celular.
Fibroblastos-Células de tejido conectivo capaces de producir colágeno.
Formulado-Preparado de acuerdo con condiciones o métodos prescritos.
Granulocito-Uno de los tres tipos de leucocitos. Estas células digieren bacterias y otros parásitos.
Hemacitómetro-Dispositivo usado para el recuento manual de células.
Hematopoyético-Perteneciente o con influencia sobre la formación de células sanguíneas.
Hepatocitos-Células predominantes del hígado, que cumplen una función importante en el metabolismo y son productoras
de proteínas séricas. Por lo general, estas células no están en división pero si se dañan, se pueden dividir y regenerar hasta
reponer las células dañadas.
828 (1046) Productos Derivados de Células y Tejidos/ Información General USP 37

In Vitro-En el laboratorio (fuera del organismo). Lo contrario de in vivo (en el organismo).

In Vivo-Procedimiento que se lleva a cabo dentro de un organismo vivo.
Injerto-Proceso mediante el cual se implantan o trasplantan células, tejidos u órganos en otro organismo. Se refiere tanto a
los procesos mecánicos como biológicos necesarios para obtener un injerto plenamente funcional.
lnmunoensayo-Técnica para identificar sustancias basándose en el uso de anticuerpos.
lnmunofluorescencia-Técnica que combina una estrategia de detección de anticuerpos con un marcador fluorescente para
visualización que por lo general se usa en combinación con la clasificación de células por microscopía o activación por fluores-
cencia.
lnmunogénico-Sustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria; una forma de antígeno que induce una respuesta in-
munitaria, contrario a un tolerógeno, que induce tolerancia.
Linaje (Células Progenitoras Comprometidas, Células Diferenciadas)-Vía específica de diferenciación celular que se puede
rastrear hasta una célula única de origen.
Líneas Celulares-Células que derivan de cultivos primarios de embriones, tejido u órganos. Estas líneas celulares pueden te-
ner una vida finita o pueden inmortalizarse (modificadas para replicarlas indefinidamente).
Linfocitos B (Células B)-Una clase de linfocitos provenientes de la médula ósea que producen anticuerpos.
Macrófago-Cualquiera de las diversas formas de fagocitos mononucleares que se encuentran en los tejidos y que surgen de
las células madre hematopoyéticas en la médula ósea.
Materiales auxiliares-Componentes usados durante la fabricación que no deben estar presentes en el producto final. Ejem-
plos: factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos monoclonales, dispositivos de separación de células y componentes de
medios.
Medicina Regenerativa-Campo interdisciplinario de investigación y aplicaciones clínicas emergente que se centra en la repa-
ración, reemplazo o regeneración de células, tejidos u órganos para restaurar funciones deficientes usando una combinación
de métodologías que incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, el uso de moléculas solubles, terapia génica, transpla-
te de células madre, ingeniería tisular y reprogramación de tipos de células y tejidos.
Medio de Cultivo-Líquido que cubre las células en un vaso de cultivo y que contiene ingredientes para nutrir y sustentar las
células. El medio de cultivo también puede incluir factores de crecimiento que se agregan para producir cambios deseados en
las células.
Miocitos-Células fundamentales del tejido muscular. Células blanco para la inserción de genes que codifican proteínas secre-
toras.
Pasaje-Proceso en el que las células son desasociadas, lavadas y sembradas en nuevos cultivos después de una ronda de cre-
cimiento y proliferación celular. El número de pasajes es una buena indicación de la edad de los cultivos y de la estabilidad
esperada.
Potencia-Medición cuantitativa de la actividad biológica basada en el atributo del producto vinculado a las propiedades bio-
lógicas relevantes.
Producto Biológico-Cualquier virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina o producto análogo aplicable a la prevención, tra-
tamiento o cura de enfermedades o lesiones en humanos. (El término producto análogo indica que incluye esencialmente pro-
ductos obtenidos por biotecnología y procedimientos que incluyen terapia génica, productos transgénicos y terapia celular so-
mática.)
Productos de Combinación-Productos terapéuticos que combinan fármacos, dispositivos y/o productos biológicos.
Queratinocitos-Células epidérmicas diferenciadas que constituyen la capa superior de las células de la piel.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés)-Técnica para amplificar una secuencia específica de
nucleótidos de ADN o ARN mediante ciclos de copiado que utilizan polimerasa, dando como resultado incrementos geométri-
cos en el número de copias.
Terapia Celular-Terapia que utiliza células completas para tratar una enfermedad, afección o lesión.
Transplante de Médula Ósea-Transplante de células de la médula ósea capaces de mantener las funciones hematológicas
indefinidamente. Técnica empleada en el tratamiento de trastornos inmunitarios (deficiencias inmunitarias combinadas graves,
tales como la deficiencia de ADA), trastornos hematológicos (anemia), metabólicos (enfermedad de Gaucher) y enfermedades
malignas (leucemia, linfoma o tumor sólido).
Validación del Proceso-Método para suministrar documentación probatoria de que el proceso de fabricación está controla-
do, es reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que cumple con especificaciones predeterminadas.
Xenogénico-De una especie diferente.
Xenotransplante-Transplante de órganos de una especie a otra (por ejemplo, de cerdos a seres humanos).
USP 37 Información General/ (1047) Productos de Terapia Génica 829

<1047) PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA

INTRODUCCIÓN

Los productos de terapia génica permiten la administración de ácidos nucleicos para modificar el material genético de las
células. Los productos de terapia génica son ampliamente clasificables con base en la metodología de adlllinistración e inclu-
yen lo siguiente: (1) vectores virales [virus que transportan los genes de interés pero, generalmente, sin el mecanismo de auto-
rreplicación in vivo]; (2) ácidos nucleicos en una formulación simple (ADN desnudo); y (3) ácidos nucleicos formulados con
agentes tales como los liposomas, que mejoran su capacidad para penetrar en la célula. Cuando la introducción del ácido nu-
cleico se lleva a cabo ex vivo, la población de células que se administra se convierte en el producto de terapia génica. Las pau-
tas específicas para la fabricación, el procesamiento, la caracterización y la administración de productos derivados de células se
proporcionan en el capítulo Productos Derivados de Células y Tejidos (1046).
La toma de decisiones con respecto a un vector génico puede ser compleja (ver Consideraciones de Diseño para Vectores Géni-
cos en Fabricación de Productos de Terapia Génica). Los virus más comúnmente utilizados incluyen retrovirus murinos, adenovi-
rus humanos y virus humanos asociados a adenovirus (V AA). La definición de terapia génica de este capítulo considera inhe-
rentemente que la administración de ácidos nucleicos mediante transducción se expresa como ARN y posteriormente como
proteína. En la Tabla 7 se incluyen ejemplos de productos de terapia génica.
Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Génica
Categorías o Estrategias Indicación: Producto Administrado ·~---~

Reemplazo de genes Enfermedad cardiovascular: vector de factor de crecimiento en un andamiaje biocompatible·'

Corto plazo Fibrosis quística: vector para la regulación de la conductancia transmembrana
Largo plazo Hemofilia: vector para el factor VIII ó IX
Destrucción directa de células Cáncer: virus oncolíticos recombinantes
Cáncer: células tumorales autólogas, transducidas con genes para citoquinas u otros genes inmuno-
moduladores; linfocitos transducidos con receptores para antígenos tumorales
Inmunoterapia Artritis: linfocitos autólogos modificados genéticamente
Cáncer (tumor sólido): vector que inserta el gen de timidina quinasa (TK) o citosina desaminasa
(CD) en las células tumorales
Enfermedad del injerto contra el anfitrión (GVHD, por sus siglas en inglés): Vector que transduce el
Genes condicionalmente letalesb gen de TK o CD en las células T de donantes
"---·---------
Cáncer: vector con antioncogen
Alteración del gen mediante ARN antisentidos, Retinitis por citomegalovirus: vector antiviral
ribozimas y ARN inhibitorios expresados me- Virus de inmunodeficiencia humana (VIH): linfocitos autólogos transducidos con vector con ribozi-
diante un vector ma antiviral
Cáncer o VIH: vector que codifica anticuerpo monocatenario contra una proteína tumoral o viral,
lntracuerpos respectivamente
ªEste producto favorece la formación de nuevos vasos sanguíneos.
b Las células con genes condicionalmente letales, así como sus células vecinas, se destruyen después de la administración de un segundo fármaco in vivo. Para la
timidina quinasa (TK, por sus siglas en inglés), el fármaco es ganciclovir. Para la citosina desaminasa (CD, por sus siglas en inglés), el fármaco es 5-fluorocitosina.

Propósito y Organización del Capítulo

Los usos clínicos de los productos de terapia génica, sus procesos de fabricación y los esquemas analíticos para determinar la
identidad, dosis, potencia, pureza y seguridad están evolucionando a gran velocidad y son tan diversos como los productos
mismos. Este capítulo sintetiza las mejores prácticas vigentes y cuestiones inherentes a la fabricación, pruebas y administración
de productos de terapia génica. Por lo general, los capítulos de USP se concentran en los materiales disponibles comercialmen-
te. Sin embargo, este capítulo no solamente analiza productos con aplicaciones comerciales, sino que también está dirigido a
la producción de materiales para ensayos clínicos. Cuando usan diferentes enfoques para el material utilizado en ensayos clíni-
cos, en comparación con aquellos utilizados en productos comerciales, así se indica.
Cuando resulte apropiado, se hace referencia a las pautas aplicables incluyendo las pautas de calidad de la lnternational
Conference on Harmonization (Conferencia Internacional de Armonización, ICH) debido a que los principios aplican incluso si
los productos de terapia génica estuvieran fuera del alcance oficial. El Apéndice presenta una lista de documentos reglamenta-
rios y guías aplicables a la terapia génica, a la par de una lista de términos de uso común en el campo de la terapia génica. La
perspectiva farmacopeica tradicional es desarrollar normas públicas que puedan aplicarse a un producto final en particular sin
proporcionar detalles de la producción. Este capítulo tiene como propósito identificar ias situ¡¡cione~ en las c¡ut: se pueden
adaptar las metodologías o normas tradicionales.
La amplitud de este capítulo se deriva de la diversidad de los productos y de las consideraciones especiales que requieren. La
fabricación se ha dividido en dos secciones: la primera analiza los aspectos generales de la fabricación y del desarrollo del pro-
ceso, mientras que la segunda analiza el diseño de vectores y temas sobre clases específicas. La Preparación y Administración In
Situ aparece después de las secciones sobre fabricación, ya que el manejo de estos productos en la clínica requiere una infraes-
 ,.
¡

830 (1047) Productos de Terapia Génica/ Información General USP 37

tructura y experiencia profesional que no se encuentran comúnmente en un hospital convencional. Las otras secciones relacio-
nadas con la fabricación incluyen: Métodos Analíticos; Estabilidad; Almacenamiento y Transporte; y Etiquetado. La sección Regla-
mentaciones y Normas resume las pautas existentes y resalta la necesidad de desarrollar y validar nuevas metodologías para
evaluar la calidad del producto. El Glosario de Términos presenta y define los términos y abreviaturas usados en este capítulo y
aquellos usados comúnmente en este campo.

ASPECTOS GENERALES DE LA FABRICACIÓN

Introducción

La fabricación de productos de terapia génica se ha dividido en dos secciones. Esta sección, Aspectos Generales de la Fabrica-
ción, analiza cinco temas que se aplican a la fabricación de todos los productos de terapia génica: (1) materias primas, (2) ca-
racterización de materiales de bancos, (3) controles durante el proceso, (4) especificaciones y (5) validación. La segunda sec-
ción, Fabricación de Productos de Terapia Génica, trata la fabricación de vectores de terapia génica, tanto virales como no vira-
les, y analiza en detalle el diseño de vectores génicos.
Todos los principios generales de las buenas prácticas de fabricación vigentes (BPFv) establecidas por la FDA en el Título 21
del CFR 21 O, 211, 600s (en especial el Título 21 del CFR 61 O) y 820, y en otros capítulos de USP aplican a la fabricación de
productos de terapia génica. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricación, al igual que las materias primas, sistemas de
calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv. Las BPFv aplican durante todo el desa-
rrollo clínico. Por lo regular, el nivel de control aumenta a medida que avanza el desarrollo clínico y, para el momento de ini-
ciar la fabricación como respaldo de la Fase 111 de los ensayos clínicos, se espera un cumplimiento total de las BPFv. Las instala-
ciones y el equipo deben diseñarse, edificarse y validarse cuidadosamente para sustentar el proceso de fabricación y para man-
tener la segregación requerida del producto/instalación. El mantenimiento preventivo y la calibración se deben llevar a cabo
de manera rutinaria en el equipo crítico. Las incubadoras, biorreactores y congeladores deben contar con sistemas de alarma
capaces de emitir señales de falla de manera remota. Se deben establecer sistemas de calidad para garantizar que la fabrica-
ción sea uniforme y controlada. Los sistemas incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, lo siguiente: control de cam-
bios, control de documentos, monitoreo del medio ambiente, capacitación, planes maestros de validación, análisis y liberación
de materias primas, aprobación de proveedores, análisis y liberación de productos, pruebas de estabilidad y acción correctiva/
preventiva (CAPA, por sus siglas en inglés).

Materiales Auxiliares

Se puede utilizar una amplia variedad de materias primas, incluyendo materiales auxiliares, en la fabricación de los produc-
tos. Las materias primas pueden incluir sustancias complejas tales como células, tejidos, fluidos biológicos, factores de creci-
miento y anticuerpos monoclonales. Algunos de estos materiales pueden mantenerse en el producto terapéutico final como
sustancias activas, crioconservantes o excipientes. Un material auxiliar tiene un efecto sobre el material terapéutico (por ejem-
plo, una citoquina puede activar una población de células) pero no está destinado a estar presente en el producto terapéutico
final. La calidad de las materias primas usadas en la elaboración de un producto de terapia génica puede influir en la seguri-
dad, potencia y pureza del producto. Por lo tanto, es necesario calificar este tipo de materiales para garantizar la uniformidad y
la calidad de todos los productos de terapia génica. Las actividades relacionadas con la calificación de materias primas cambia-
rán a medida que los productos avancen por las diferentes etapas de desarrollo clínico hacia la obtención de la autorización y
su comercialización. La amplitud de un programa de calificación bien diseñado se extiende a medida que progresa el desarro-
llo del producto. Un programa de calificación de materias primas utilizadas en la fabricación de productos de terapia génica
debe tratar cada una de las siguientes áreas: (1) identificación y selección, (2) aptitud para uso, (3) caracterización, (4) compo-
nentes derivados de animales y (5) garantía de calidad. Se debe considerar para todas las materias primas el momento y la
etapa en la que se usa cada una dentro del proceso de fabricación debido a que puede ser útil para definir criterios de selec-
ción. Se debe consultar el capítulo de USP, Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Génicos y de Ingeniería Tisular (1043),
para información específica sobre la implementación de un programa de calificación apropiado para estos materiales. Otros
capítulos de USP proveen información que se debe tomar en cuenta con respecto a la calificación y normas de materiales auxi-
liares específicos (p.ej., Suero Bovino (1024), Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) y Factores
de Crecimiento y Citoquinas Usados en la Fabricación de Productos de Terapia Celular(92)).

Caracterización de Bancos de Células y de Virus

BANCOS DE CÉLULAS

Un banco de células es un conjunto de viales que contienen células almacenadas en condiciones definidas, con una compo-
sición uniforme y obtenidas a partir de células combinadas derivadas de un único clon celular. El sistema de bancos de células,
por lo general, se compone de un banco maestro de células (MCB, por sus siglas en inglés) y un banco de células de trabajo
(WCB, por sus siglas en inglés), aunque existen otras categorizaciones posibles. El MCB se produce de acuerdo con las BPFv y,
USP 37 Información General/ <1047) Productos de Terapia Génica 831

preferentemente, se obtiene de una fuente repositoria calificada (exenta de agentes adventicios) con antecedentes conocidos y
documentados. El WCB se obtiene o produce mediante la expansión de uno o más viales del MCB. El WCB, o el MCB en los
ensayos iniciales, se transforma en la fuente de células para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos
de células contribuyen en gran medida a la uniformidad en la elaboración de partidas de productos clínicos o autorizados,
debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. Los bancos de células usados para la preparación de bancos de
virus o del producto clínico se deben caracterizar adecuadamente antes de su uso. Los aspectos relacionados con la elabora-
ción de bancos de células y su validación se analizan en los capítulos Productos Derivados de Células y Tejidos (1046), Calidad de
Productos Biotecnológicos: Análisis de la Construcci