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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú. Decana de América

DIRECCIÓN GENERAL DE ESTUDIOS DE POSGRADO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

UNIDAD DE POSGRADO

Prevalencia de genes de resistencia al fluconazol y

voriconazol de cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio
Sáenz - 2018

Proyecto de tesis para optar al Grado Académico de

Magíster en Microbiología

PRESENTADO POR: Bach. Alberto Javier Ponce Medina

ASESOR : Mg. Luis Alberto Inostroza Ruiz

Lima - Perú

2018
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ÍNDICE
pág.

I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.1 Situación problemática………………………………………...……04
I.2 Formulación del problema………………………………………….06
I.2.1 Problema general……………………………….........06
I.2.2 Problemas específicos………………………………..06
I.3 Justificación de la investigación………………………………...….06
I.3.1 Justificación teórica…………………………..……….06
I.3.2 Justificación práctica…………………………....…….08
I.4 Objetivos de la investigación………………………………...……..10
I.4.1 Objetivo general……………………..………………..10
I.4.2 Objetivos específicos…………………………………10
II. MARCO TEÓRICO
II.1 Antecedentes del problema…………………………….………..…11
II.2 Bases teóricas……………………….………………………………12
II.3 Marco conceptuales…………………..…………………………….22
III. HIPÓTESIS Y VARIABLES
III.1 Hipótesis general…………………………….…………………..
….23
III.2 Hipótesis específicas……………………..…………………..…….23
III.3 Identificación de variables………………………………….………24
III.4 Operacionalización de
variables………………………………......24
III.5 Matriz de consistencia…..………………………………………….
25
IV. METODOLOGÍA
IV.1 Tipo y diseño de investigación………………..………….
……......26
IV.2 Unidad de análisis…………………………………………….
……..26
IV.3 Población de
estudio…………………………………………...... ...26
 3

IV.4 Tamaño de muestra……………………...

………………………....26
IV.5 Selección de
muestra………………………………………………..26
IV.6 Técnica de recolección de datos……………………………………
27
IV.7 Análisis e interpretación de la información……………..
………….28
V. PRESUPUESTO………………………………………………..……….
…30
VI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES…………………………….
……....31
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………….………………….….32
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I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.1 Situación problemática

Candida albicans es un patógeno fúngico humano común capaz de causar

infecciones sistémicas graves que pueden progresar hasta convertirse en
letales (Hernáez, Pla, & Nombela, 1997). Los enfoques terapéuticos actuales
tienen una efectividad limitada, especialmente una vez que se establece una
infección sistémica, en parte debido a la falta de una respuesta inmune
efectiva. Impulsar la respuesta inmune a C. albicans ha sido el objetivo de la
inmunoterapia, pero tiene que hacerse de forma selectiva para prevenir la
hiperinflamación nociva (sepsis) (Feng et al., 2017). Aunque es necesaria una
respuesta inflamatoria eficiente para combatir la infección, la respuesta típica
a C. albicans provoca daños colaterales en los tejidos, lo que agrava los
efectos patológicos de la infección. En C. albicans y otras especies de
levaduras como C. glabrata se han descrito hasta diez genes diferentes
relacionados con la producción de los transportadores ABC, llamados CDR1 -
CDR10. La resistencia a azoles se ha observado en cepas con aumento en la
expresión de los genes CDR1 y CDR2. Las bombas MFS, codificadas por los
genes MDR, emplean el gradiente de protones como fuente de energía, en
lugar del ATP y se han asociado con resistencia secundaria al fluconazol y
quizá al voriconazol (Cuenca-Estrella, 2010).

La resistencia a fluconazol entre las cepas causantes de candidiasis

sistémicas sigue siendo poco frecuente en nuestro país (< 10 %), aunque en
otros países puede alcanzar hasta un 30 %, por ello deben realizarse estudios
epidemiológicos periódicos para detectar cambios con trascendencia
terapéutica, y el incremento en la prevalencia de C. glabrata, C. krusei o de
levaduras emergentes que pueden ser resistentes a los azoles (Cuenca-
Estrella, 2010)

Las infecciones fúngicas han incrementado en frecuencia e importancia en las

últimas décadas, acompañadas de una alta mortalidad, generalmente
ocasionadas por infecciones del torrente sanguíneo; causadas por especies
del género Candida, en un 20 % a 50 % de los casos, por infecciones del
género Aspergillus en un 40 % a 80 % de los casos y por algunos hongos
 5

emergentes. La mortalidad por estas infecciones puede ir más allá de 90 %

(Zurita, 2017)

La aparición de nuevos antifúngicos en los últimos años ha modificado

profundamente el campo de la micología médica. Hasta finales del siglo XX,
no existían muchas alternativas terapéuticas para tratar una infección fúngica
sistémica. Anfotericina B deoxicolato, fluorocitosina y azoles como miconazol
y ketoconazol se empleaban en las micosis sistémicas, mostrando una
eficacia reducida ya que su toxicidad limitaba la cantidad de fármaco que
podía administrarse a los enfermos. Por ello, en las últimas dos décadas se
han desarrollado nuevos fármacos y nuevas formulaciones de antifúngicos,
más eficaces y de menor toxicidad, que han permitido mejorar el pronóstico
de los enfermos con micosis invasoras (Cuenca-Estrella, 2010)

En nuestro medio se desconoce la incidencia real de este fenómeno y por las

razones hasta aquí expuestas es necesario plantear estudios con mayor
fortaleza metodológica para encontrar asociaciones que permitan inferir
factores de riesgo de esta seria infección micótica. Es claro, además, que se
debe contar con estudios que involucren poblaciones con diferentes
condiciones médicas y fortalecer los programas de vigilancia micótica en
nuestras instituciones para permitirnos llegar a conclusiones cercanas a la
realidad

Por esta razón, la identificación de formas específicas de modulación del

sistema inmune es prometedora para el desarrollo de nuevos enfoques
terapéuticos mejorados. (Wu et al., 2018a); es por ello que resaltan la
necesidad de iniciar el tratamiento con un antifúngico de amplio espectro
(hasta que se identifique la especie de Candida) con el objeto de evitar un
tratamiento antifúngico empírico inadecuado y por tanto, el aumento de
mortalidad asociada a éste. (Zaragoza & Pemán, 2012)

I.2 Formulación del problema

I.2.1 Problema general

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I.2.1.1 ¿Cuál es la prevalencia de genes de resistencia al

fluconazol y voriconazol de cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018?

I.2.2 Problema específico

I.2.2.1 ¿Cuál es el perfil fenotípico de resistencia al fluconazol y

voriconazol de cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio
Sáenz - 2018?

I.2.2.2 ¿Qué genes de resistencia al fluconazol y voriconazol de

cepas de Candida albicans aisladas de pacientes del
Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz - 2018?

I.2.2.3 ¿ Cuál será la variabilidad genotípica de genes resistentes

resistencia al fluconazol y voriconazol de cepas de Candida
albicans aisladas de pacientes del Complejo Hospitalario
Policial Luis Nicasio Sáenz – 2018?

I.2.2.4 ¿Cuál es el secuenciamiento de los genes de resistencia al

fluconazol y voriconazol de cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018?

I.3 Justificación de la investigación

I.3.1 Justificación teórica

El incremento de la prevalencia de las infecciones fúngicas
observado en las últimas décadas ha producido un aumento en la
utilización de fármacos antifúngicos. La extensión del uso de un
antimicrobiano siempre origina, como efecto colateral, la aparición
de microorganismos resistentes y los fármacos antifúngicos no
son una excepción (Hernáez et al., 1997)
En los últimos años se han descrito resistencias a estos
compuestos si bien debe resaltarse que no son frecuentes en la
práctica clínica. La detección de resistencias a los antifúngicos se
 7

ha convertido en una técnica rutinaria en muchos laboratorios

asistenciales y los avances tecnológicos han permitido que se
realicen estudios para conocer la prevalencia de los mecanismos
moleculares por los que se producen las resistencias (Zurita,
2018).
Pocos estudios demuestran que en Perú se hace mención que la
candidemia es producida por especies sensible in vitro al
fluconazol y voriconazol, siendo el primero el antifúngico más
utilizado, por lo cual es correcto utilizarlo como tratamiento inicial
en candidemia, sin embargo, si se identifica que la cepa causante
es Candida albicans y al realizar un estudio de sensibilidad la
concentración mínima inhibitoria CMI, indica resistente de
fluconazol, se aconseja un cambio de terapia. (Zurita, 2018).

Este tipo de infecciones micoticas están aumentando en gran

número de países a nivel mundial y su tratamiento es hoy día un
problema grave debido al reducido número de antifúngicos
eficaces que actúen de forma totalmente selectiva. (Hernáez
et al., 1997)

Existen aproximadamente 163 especies pertenecientes al género

Candida y 10 de ellas son responsables de la mayoría de las
infecciones fúngicas, siendo Candida albicans la especie más
importante, considerado un microorganismo oportunista causante
de micosis sistémica en enfermos con factores predisponentes,
por lo que son difíciles de tratar independientemente de que la
cepa causante sea sensible o no a los antifúngicos, e
incrementando la tasa de mortalidad.
Además, los antifúngicos muestran un margen terapéutico corto,
al tener efectos tóxicos en células humanas e interaccionar con
varias familias farmacológicas, lo que influye sobre su dosificación
y perfil farmacocinético. (Cuenca estrella, 2010)
Otro aspecto a destacarse es que determinadas especies
fúngicas desarrollan filamentos o forman biofilms, estos pueden
influir en la respuesta, ya que algunos antifúngicos pueden tener
 8

menor actividad frente a las hifas o dificultades para penetrar en

los biofilms. Por lo mismo, la susceptibilidad de la cepa a los
antifúngicos y la presencia de mecanismos de resistencia deben
considerarse como dos variables más dentro del conjunto de
aspectos que son determinantes a la hora de predecir la
respuesta al tratamiento (Cuenca estrella, 2010)
No obstante, desde que existen métodos estandarizados para
realizar las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos, así como
técnicas para detectar los mecanismos moleculares de
resistencia, y gracias a la aparición de nuevos antifúngicos y de
nuevas presentaciones, la detección de microorganismos
resistentes in vitro y de sus mecanismos de resistencia puede
ayudar a elegir la mejor alternativa terapéutica.
Es necesario mencionar que en el Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz, existen cepas de Candida albicans
resistentes a azoles, aisladas de pacientes de los diferentes
Servicios de atención, siendo solo detectadas por fenotipificación,
a la fecha, no se ha realizado trabajo alguno para estimar la
presencia y prevalencia de los genes involucrados, constituyendo
un serio problema por la transmisibilidad de estas cepas en el
ambiente hospitalario.

I.3.2 Justificación práctica

Es importante señalar, la opinión de la mayoría de expertos que
indican, que las pruebas de sensibilidad antifúngica en la
detección de resistencia adquirida, juega un papel primordial y de
utilidad práctica, sin embargo, otros opinan que no ayuda en el
manejo de pacientes con micosis invasora, sea por problemas de
estandarización de métodos y porque las alternativas terapéuticas
son escasas para combatir la micosis invasora, por esto, las
pruebas de sensibilidad no tendría mucho sentido en la práctica
clínica. (Zurita, 2018).

En la actualidad se cuenta con dos estándares para la

determinación de resistencia antifúngica; el Clinical and
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Laboratory Standards Institute (CLSI) en EUA y el European

Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) en
Europa, que permite la detección de resistencia.(Robles, Ausejo,
& Cavero, 2007)

En el Perú el Instituto Nacional de Salud (INS) ha estandarizado el

método de referencia del CLSI utilizando la microdilución en caldo
y ha transferido a la Red Nacional de Laboratorios de Micología y
el método de difusión en disco del CLSI para fluconazol y
voriconazol. La concordancia entre estos laboratorios es
evaluada, mediante el programa de evaluación de desempeño de
la calidad. Respecto a los métodos comerciales mencionados,
estos son utilizados en algunos hospitales nacionales de alta
complejidad, ubicados en Lima. (Zurita, 2018).

El Laboratorio de Microbiología del Complejo Hospitalario Central

PNP Luis Nicasio Saenz, viene empleando el Método de Difusión
en Disco, validado según el Clinical and Laboratory Standars
Institute (CLSI M44-A2) para determinar la sensibilidad de
Candida albicans en 2 triazoles ensayados: fluconazol y
voriconazol, siendo este un método simple, desarrollado para
levaduras y disponible para fármacos solubles en agua.

En líneas generales, esta investigación busca ayudar al personal

de salud de este nosocomio a identificar los genes de resistencia
de Candida albicans ante estos antifúngicos y con ello
implementar nuevos métodos que inhiban la proliferación de esta
levadura, así como realizar una constante vigilancia
epidemiológica sobre los antifungicos prevalentes en la institución
y sus patrones de resistencia circulantes, con ello la
administración adecuada de antimicóticos o ajustar las terapias de
tratamiento, desarrollando nuevos fármacos y/o modificando los
ya existentes.

I.4 Objetivos de la investigación

 10

I.4.1 Objetivo general

Determinar la prevalencia de genes de resistencia al fluconazol y

voriconazol de cepas de Candida albicans aisladas de pacientes
del Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz - 2018
I.4.2 Objetivos específicos

I.4.2.1 Identificar el perfil fenotípico de resistencia a fluconazol y

voriconazol de cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio
Sáenz, por el método colorimétrico y turbidimetría.

I.4.2.2 Identificar los genes de resistencia a fluconazol y

voriconazol existen en las cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz, por el método de difusión de disco.

I.4.2.3 Determinar la variabilidad genotípica de genes resistentes

al fluconazol y voriconazol de cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz, por método de RFLP.
I.4.2.4 Determinar el secuenciamiento los genes de resistencia al
fluconazol y voriconazol de cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018.

II. MARCO TEÓRICO

II.1 Antecedentes del problema

Tapia & Chacha (2015) determinaron mediante la prueba del

antifungigrama la resistencia y sensibilidad de Candida al fluconazol en
muestras de secreción faríngea en pacientes con VIH/SIDA en el
Hospital “Carlos Andrade Marín”, en particular al fluconazol y
voriconazol in vitro, obteniendo 109 pacientes con VIH/SID, empleando
el sistema AS-400, mostrando así el 100% de sensibilidad,
 11

permitiéndonos observar claramente los halos de susceptibilidad que

presentaron ante estos antimicóticos.

Montoya & Suárez (2014) identificaron molecularmente y evaluaron la

susceptibilidad a fluconazol de Candida spp. colonizante de pie en
pacientes diabéticos que asisten a un programa de promoción de la
salud, analizaron 172 pacientes, concluyendo que las especies de
C. no albicans predomina como colonizantes, especialmente
C. parapsilosis, está identificación contribuye a conocer las especies de
Candida que colonizan este grupo de pacientes. No se halló cepas
resistentes a fluconazol.

Núñez (2014) determinó la resistencia al fluconazol y nistatina de

Candida albicans vaginal crónica, las pruebas de laboratorio
específicamente en el fungigrama la obtiene de la resistencia al
fluconazol en el 72 % y a la Nistatina en un 55 %. Por tanto, determino
que sí existe una alta resistencia a los antifúngicos (Fluconazol y
Nistatina) más utilizados para contrarrestar Candida albicans vaginal.

Morales (2012) identificó Candida spp. Aisladas en hemocultivos de

pacientes de retén, utilizando el medio CHROMAGAR, y susceptibilidad
a fluconazol y voriconazol, empleó el método de difusión en agar y
evidenció que el 57 % de los aislados fueron sensibles a fluconazol y
voriconazol, frente al 43 % de resistencia a estos fármacos,
concluyendo que el uso inadecuado e indiscriminado de antimicóticos
ha provocado la aparición y diseminación de mecanismos de
resistencia antifúngica, lo que justifica los diferentes cambios en el
perfil de sensibilidad y resistencia presentados por los aislados de
Candida sp.

Ríos & Rodríguez (2006) determinaron el perfil de sensibilidad in vitro,

mediante la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) frente a la
Anfotericina B, Ketoconazol y Fluconazol para especies de Candida,
emplearon el método de microdilución en caldo, indicando que las
especies aisladas de Candida fueron significativamente sensibles
frente a los azoles (fluconazol y ketoconazol) y a la anfotericina B.
 12

II.2 Bases teóricas

2.2.1 Candida albicans

Candida albicans se encuentra entre las especies de hongos más

prevalentes de la microbiota humana y coloniza asintomáticamente a
individuos sanos. Sin embargo, también es un patógeno oportunista
que puede causar infecciones graves y, a menudo, fatales en el
torrente sanguíneo.(Lohse, Gulati, Johnson, & Nobile, 2017).

El dimorfismo le permite evadir los mecanismos de defensa

relacionados con la inmunidad celular del huésped. En forma de
levadura se comporta como saprofita, conviviendo en simbiosis con el
huésped, mientras que, en forma de hongo filamentoso, se comporta
como un parásito patógeno produciendo síntomas en el huésped. El
reservorio es el hombre, forma parte de la microflora de la piel, cavidad
oral, tracto gastrointestinal y sistema genitourinario. Las colonias y las
características morfológicas microscópicas de las especies de Candida
tienen poco valor para la identificación definitiva. La mayoría de las
especies de Candida producen colonias blancas y cremosas, pero
algunas forman colonias más aplanadas y más secas. (Lohse et al.,
2017)

Las especies de Candida causan las infecciones micóticas oportunistas

que son causadas por varias especies, pero Candida albicans es el
agente etiológico más común, seguido por Candida tropicalis, Candida
parapsilosis y Candida glabrata. La frecuencia con la que se aíslan
estás levaduras varía de acuerdo con la institución. (Forbes, 2009).

Candida albicans y otras especies de Candida forman parte de la flora

microbiana endógena normal, pero se han convertido en endémicas en
la mayoría de los hospitales. Las infecciones pueden ser causadas por
levaduras endógenas o nosocomiales (Alvarado, 2018).

2.2.1.1 Patogenia de Candida

 13

Las especies de Candida causan diferentes tipos de infecciones en

pacientes sanos e inmunodeprimidos. Entre esos tipos figuran intertrigo
candidiásico (en el que están afectados los pliegues cutáneos);
paroniquia, onicomicosis, queilitis angular, vulvovaginitis candidiásica,
infección pulmonar, infección ocular, meningitis, fungemia e infección
diseminada (Olea Barrionuevo, 2007).

Estos últimos dos tipos de infección se observan con mayor frecuencia

en pacientes con enfermedades graves, inmunodepresión o ambas
cosas, mientras que los otros pueden aparecer en huéspedes sanos.
La esofagitis producida por C. albicans es muy común en pacientes con
SIDA ( Gregorí, 2005).

2.2.1.2 Cultivos de Candida

Se desarrolla con gran facilidad en medios artificiales de cultivo, a las

24 horas ya pueden aparecer colonias blancas de consistencia pastosa
o cremosa y brillante, pero el máximo desarrollo se obtiene a las 48 o
72 horas. La incubación se hace tanto a 25 °C como a 37 °C, incluso
en condiciones anaerobiosis, aunque en este caso el crecimiento es
más pobre. Los medios azucarados proporcionan buenos nutrientes
para el crecimiento de estos hongos (Negroni, 2009).

2.2.1.3 Especies de Candida

Se identifican por la producción de tubos germinales o clamidoconidios,
así como por la utilización de sustratos específicos y la fermentación o
asimilación de ciertos hidratos de carbono. Las características
morfológicas de la levadura en agar harina de mía con Tween 80 a
menudo permiten la identificación presuntiva de especies
seleccionadas y especialmente pueden detectar identificaciones
erróneas de los sistemas comerciales (Forbes, 2009).

2.2.1.4 Prueba del tubo germinal

Es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su
origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su
longitud tres o cuatro veces mayor que la célula madre, C. albicans es
capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras
 14

especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de

aspecto similar a los tubos germinales pero con una zona de
constricción característica adyacente a la célula madre, por lo que esta
prueba es útil para diferenciar C. albicans del resto de las especies de
Candida, aunque no está exenta de falsos negativos egorí, 2005).
Esta prueba es el método más aceptado y económico usado en el
laboratorio clínico para la identificación de levaduras. Cerca del 75 %
de las levaduras aisladas de muestras clínicas son C. albicans y la
prueba del tubo germinal suelen permitir una identificación de este
hongo en 3 h. (Gregorí, 2005)

2.2.2 Los azoles

Constituyeron uno de los principales avances terapéuticos de la

micología. Son moléculas sintéticas con un anillo de cinco carbonos
unido a una cadena alifática con un grupo fenilo. Existen dos familias
de azoles que se distinguen por las moléculas de nitrógeno que
contiene el anillo azolico, dos en el caso de imidazoles y tres en caso
de triazoles. La actividad antifungica de estos fármacos reside en la
capacida de unirse con el grupo hemo, que forma parte de muchas de
las enzimas implicadas en la síntesis de ergosterol, particularmente la
14 alfa demetilasa. Tal unión bloquea su síntesis acumulándose
esteroles 14 alfa metilo e inhibe la citocromo P - 450 y el crecimiento de
la célula fúngica. Los triazoles como fluconazol, itraconazol, voriconazol
y posaconazol muestran una afinidad cientos de veces superior por las
enzimas fúngicas que por las enzimas humanas, de ahí que muestren
menor toxicidad que los imidazoles, por lo que pueden administrase a
dosis más elevadas.(Cuenca-Estrella, 2010)

Aunque se hayan comercializado varios antifúngicos en los últimos

años que han modificado significativamente el tratamiento de las
micosis sistémicas, se siguen buscando nuevas moléculas que
permitan aumentar las alternativas terapéuticas (Cuenca-Estrella,
2010).
 15

Existen básicamente tres tipos de mecanismos moleculares por los

cuales un microorganismo puede adquirir resistencia a un antibiótico. El
primero, consiste en modificaciones de la enzima blanca, tanto de su
regulación (aumento o disminución de niveles) como de su capacidad
de interacción con el antibiótico, sin impedir que siga siendo capaz de
llevar a cabo su función fisiológica en la célula. El segundo mecanismo,
consiste en la incapacidad de alcanzar el antibiótico concentraciones
eficaces en el sitio de su acción, lo cual suele ser debido a la existencia
de barreras de permeabilidad o, alternativamente, a la presencia de
sistemas de bombeo activo del antibiótico al exterior celular. El tercer
mecanismo, ampliamente extendido en el mundo microbiano, es la
inactivación del antibiótico por modificación covalente del antibiótico
(Hernáez et al., 1997)

Existen pocos genes descritos en C. albicans hasta la fecha con un

papel definido en la resistencia a azoles. El primero de ellos, MDR1,
denominado inicialmente BENr, fue aislado al conferir resistencia a los
antibióticos benomilo y metotrexato en S. cerevisiae cuando se
encontraba presente en plásmidos episómicos multicopia de este
organismo. La interrupción de este gen en C. albicans ha demostrado
su implicación en la virulencia, con reducciones en el tiempo medio de
supervivencia de ratones en quienes fue ensayado. Este aspecto apoya
el hecho de que esta proteína, aunque no esencial, juega un papel
importante en procesos fisiológicos normales en la célula fúngica. Se ha
demostrado recientemente que la sobreproducción de MDR1 confiere
resistencia a fluconazol y otros azoles en S. cerevisiae (Regidor J.,
datos no publicados). Las cepas de C. albicans delecionadas en este
gen son, igualmente, más sensibles a ciertos compuestos tóxicos
aunque no a benomilo ni a azoles (Hernández ML, 2007).

Un segundo gen caracterizado es CDR1, clonado por Prasad y cols. al

complementar la hipersensibilidad a fármacos que presentaban cepas
de S. cerevisiae mutantes en el gen PDR5. CDR1 codifica una proteína
que, teniendo en cuenta su estructura primaria, pertenece a la
superfamilia de transportadores de tipo ABC (del inglés, ATP-Binding
 16

Cassette) siendo homóloga al producto de los genes PDR5 (56 %

identidad, 73 % similitud) y SNQ2 (42 % identidad, 60 % similitud) de S.
cerevisiae, también implicados en la resistencia múltiple a drogas en
este organismo. Estos transportadores, ampliamente difundidos en el
mundo microbiano, actúan acoplando el sistema de transporte del
sustrato a un proceso de hidrólisis de ATP, que interacciona con una
región definida de la proteína presente en un dominio citoplásmico. La
sobreproducción de CDR1p en S. cerevisiae confiere resistencia a
múltiples drogas como cicloheximida, cloranfenicol, miconazol,
oligomicina, nistatina y 2,4-dinitrofenol así como a fluconazol hecho
que apoya su papel como transportador multifuncional. (Hernáez 2007)

Hay varios datos que apoyan el papel que juega CDR1 en la resistencia
a fluconazol en C. albicans. En primer lugar, se ha descrito que
aislamientos clínicos obtenidos de pacientes de SIDA sometidos a
terapia con fluconazol durante periodos prolongados tienen niveles
elevados (hasta 10 veces superiores a los normales) de ARNm de
CDR1, aspecto que indica que la sobreproducción de esta bomba es un
mecanismo de relevancia clínica. Algunos de estas cepas muestran
niveles elevados del ARNm del gen MDR1, hecho que también apoya la
importancia de MDR1 en la resistencia. Por otro lado, experimentos de
interrupción génica en C. albicans han demostrado que la detección de
CDR1 genera cepas más sensibles a diversos antifúngicos, como el
fluconazol, itraconazol, ketoconazol, terbinafina, amorolfina y
cicloheximida entre otros, lo que indica que, aunque no sea esencial
para la viabilidad celular, esta proteína es capaz de transportar dichos
sustratos al exterior celular reduciendo la concentración intracelular de
droga y con ello el efecto inhibitorio deseado. Recientemente, se ha
aislado otro gen por complementación de la sensibilidad a fluconazol
que presentan cepas mutantes de S. cerevisiae PDR5. Este gen,
denominado CDR2, codifica una proteína 84 % idéntica al producto del
gen CDR1 y también pertenece a la superfamilia (Hernáez et al., 1997).

2.2.2.1 Clasificación de los azoles

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Dentro de los azoles, en los triazoles de primera generación

encontramos al fluconzaol, itraconazol y ketoconazol; entre los de
segunda generación al voriconazol, ravuconazol y posaconazol
(Gregorí, 2005).

2.2.2.1.1. Fluconazol es un triazol hidrosoluble que presenta un espectro

de actividad más amplio que el ketokonazol; tiene actividad frente a
levaduras y hongos patógenos primarios, siendo inactivo frente a
hongos filamentosos. Candida krusei muestra resistencia intrínseca
y es frecuente que aparezcan resistencias secundarias debido a
tratamiento prolongado. Tiene excelente perfil farmacocinético y su
escasa toxicidad permite su uso masivo, al parecer su difusión ha
producido el desplazamiento de cepas sensibles, que han sido
sustituidas por otras más resistentes como C. glabrata. Aun así,
sigue siendo el tratamiento de primera línea de la candidemia y de
la candidiasis diseminada en enfermos sin neutropenia (Ruiz et al
2009, Gómez et al,2008).

Las indicaciones son meningitis criptocócica, candidiasis sistémica

y mucosa en pacientes inclusive inmunodeprimidos, meningitis por
coccidioides e histoplasmosis. El fluconazol se absorbe en un
94 %; la biodisponibilidad oral no es afectada por los alimentos ni el
pH gástrico. Se excreta fundamentalmente sin modificaciones por
la orina, con una vida media de 25 - 30 horas. Alcanza
concentraciones fungicidas en las uñas, la vagina y la saliva;
penetra bien en cerebro y líquido cefalorraquídeo. Es preciso
reducir la dosis en caso de insuficiencia renal. (Tripathi, 2008).

No obstante, el tratamiento inicial de las infecciones por Candida

debe basarse en la epidemiología de cada hospital. En centros
donde la resistencia a fluconazol sea escasa (< 10 -15 %), puede
emplearse este fármaco en enfermos estables (Ruiz et al 2009,
Gómez et al, 2008).
 18

2.2.2.1.2. Voriconazol, pertenece al grupo de los triazoles, desarrollado a

partir de fluconazol con la intención de ampliar su espectro de
acción. Su actividad in vitro es parecida a la de itraconazol, con un
efecto fungicida adicional frente a la mayor parte de las cepas de
Aspergillus (Hernáez et al., 1997)
Debe indicarse que se ha observado que los organismos
resistentes a fluconazol, en especial C. glabrata, pueden
desarrollar resistencia cruzada a voriconazol (Cuenca et al, 2010).
Su utilización masiva en el tratamiento de la aspergilosis puede
haber producido un desplazamiento de especies sensibles como
Aspergillus, por otras con resistencia intrínseca a voriconazol como
los Mucorales. Varios trabajos han comunicado un aumento de
prevalencia de la mucormicosis que podría estar relacionado con la
utilización de este fármaco (Rodden et al 2005, Kontoyanis et al
2010).

2.2.3 Epidemiología de la resistencia antimicótica en C. albicans

La resistencia es un cambio de sensibilidad o susceptibilidad al
antifúngico que puede medirse in vitro por métodos de laboratorio
apropiados (Gutierrez et al, 2012). Los mecanismos de resistencia
antifúngica se clasifican en dos categorías, resistencia microbiológica y
resistencia clínica (Pfaller, 2012).
La resistencia microbiológica se define como el crecimiento del
microorganismo a dosis normales del antifúngico, sin embargo, éste
puede ser inhibido a una concentración más alta. La resistencia clínica
se define como el crecimiento del microorganismo a pesar de la
administración de un agente antifúngico lo que esto se asocia con una
alta probabilidad de falla terapéutica. El patógeno no se puede inhibir a
dosificaciones normales, pero si a concentraciones más altas las
cuales podrían ser no seguras para el paciente.
La determinación de la susceptibilidad a fármacos de la cepa de
Candida spp. es fundamental para el establecimiento del tratamiento
adecuado, porque existen cepas específicas que son intrínsecamente
resistentes a los azoles; por ello, el conocimiento de la sensibilidad a
 19

cada grupo de fármacos antifúngicos de la cepa de Candida spp puede

repercutir en la toma de decisiones con respecto al tratamiento y
pronóstico (Hernáez et al., 1997).

2.2.4 Mecanismos de resistencia antifúngica en C. albicans

La infección por C. albicans va a depender de diversos factores de
virulencia, particularmente de su capacidad de adhesión. Esta
capacidad es esencial para la patogenicidad porque favorece la
formación de un complejo denominado biopelícula que le permite
adherirse firmemente propiciando la invasión y diseminación de la
infección, actuando como un importante mecanismo de resistencia
antifúngica (Guango et al, 2008).

En cuanto a las características genómicas de C. albicans relacionadas

con resistencia, se han descrito mutaciones en los genes que codifican
para la síntesis de ergosterol de la membrana plasmática, o bien con la
sobreexpresión de genes que codifican para bombas de expulsión de
fármacos fuera del microorganismo (Dhale et al, 2014; Cowley et al
2014) o la alteración de las enzimas relacionadas en la síntesis del
ergosterol; el segundo mecanismo se debe a la formación de barreras
de permeabilidad o sistemas de bombeo del antifúngico fuera de la
célula, como la alteración en las bombas de expulsión: ATP-binding
cassette (ABC) y facilitadores mayores (MF) (Ortigoza et al, 2014).

2.2.4.1 Alteración de las enzimas relacionadas en la síntesis del

ergosterol
El análisis de los esteroles en una célula puede proporcionar gran
información relacionada con las alteraciones que se han producido en
una cepa resistente. Las modificaciones en la vía del ergosterol no solo
generan resistencia al azol al cual está expuesto, sino también a otros
fármacos con los que posteriormente pudiera entrar en contacto
(Cowen et al, 2014), en la vía metabólica de la síntesis del ergosterol,
el langosterol y sus derivados, el sustrato es la enzima 14 alfa-
lanosterol desmetilasa por lo que en la enzima dará lugar a la
acumulación de 14 alfa-metil esteroles, especialmente 14 alfa-metil
 20

facosterol y el 14α metil-diolergosta-8,24(Morshauer,2010) - dien-3b,

6alfa-diol. En células tratadas con azoles, la presencia de 14α-metil
esteroles puede modificar la función y fluidez de la membrana
plasmática, su acumulación causa la detención del crecimiento del
microorganismo, sin embargo, es tolerado por C. albicans. Estudios
recientes sugieren que la acumulación del compuesto diol también
detiene el crecimiento de C. albicans, sin embargo, sus efectos tóxicos
son eliminados gracias a una mutación en el gen erg3, que codifica
para c-5 esterol desaturasa, que es responsable de la resistencia a los
azoles y moderadamente a la anfotericina b (Gomez, 2010; Cowen et
al, 2014).

La enzima 14 alfa-lanosterol desmetilasa es producto del gen

cyp51/erg11, perteneciente a la familia del gen cyp51 el cual codifica
proteínas que catalizan la 14 alfa-desmetilación del lanosterol. En la
actualidad, se cuenta con la secuencia del gen y han sido detectadas
varias alteraciones genéticas que se asocian con el gen erg11 de C.
albicans, incluyendo mutaciones puntuales en la región de codificación,
la sobreexpresión y la amplificación (que conduce a la sobreexpresión)
así como y la conversión génica o recombinación mitótica (Mellado et
al, 2002 y Fuentes et al 2014).
Se ha identificado una mutación puntual de erg11 en aislamientos
clínicos resistentes, presentándose una sustitución de arginina por
lisina en el aminoácido 467 del gen erg11, que contribuye a la
resistencia a los azoles.16, 26 También la sobreexpresión del gen
erg11 origina resistencia a los azoles, ya que se ha demostrado un
aumento de la transcripción de este durante la exposición a los
antifúngicos azólicos, incluso en células sensibles (Mellado et al, 2002).
Este aumento se debe a la respuesta de la célula, a la disminución del
ergosterol o a la acumulación de esteroles tóxicos. Los cambios en los
niveles de expresión de cyp51 pueden ocasionar el desarrollo
progresivo de resistencia a los azoles (Pfaller, 2012) puesto que se ha
demostrado la existencia de un activador de la transcripción en el
promotor del cyp51 en cepas resistentes (Mellado et al, 2002) el
 21

número de copias de esta secuencia repetida en tándem se

correlaciona con un plásmido que presente resistencia al itroconazol y
que contiene el gen cyp51. así pues, parece claro que la resistencia a
los azoles es producida por amplificación o hiperexpresión de la diana
de los azoles (Debnath, 2014).

2.2.4.2 Alteración en las bombas de expulsión: ATP-binding cassette

(ABC) y Facilitadores Mayores (MF)
Los transportadores ATP-binding cassette (ABC) y Facilitadores
mayores (MF) son un sistema de bombeo activo mediado por ATP, se
localizan en la membrana citoplasmática y contribuye a la resistencia
de casi todos los azoles, expulsando el fármaco hacia el exterior de la
célula. Los transportadores ABC son codificados por los genes CDR
(Candida Drug Resistance) y los transportadores MF son codificados
por los genes MDR (Multidrug Resistance). La sobreexpresión de los
transportadores es la causa más frecuente de resistencia a los
antifúngicos (todos los azoles), mientras que la sobreexpresión por los
genes MDR sólo confiere resistencia al fluconazol. En una célula
susceptible, los antifúngico azólicos entran por difusión pasiva
actuando sobre la enzima lanosterol desmetilasa, que es producto del
gen ERG11, lo cual inhibe la síntesis del ergosterol. Estas células
sensibles presentan expresión de niveles bajos de los genes CDR y el
gen MDR. En una célula resistente, los azoles son menos efectivos
contra el lanosterol 14-alfa-desmetilasa por la sobreexpresión de los
genes CDR y MDR. Las células resistentes pueden tener uno o ambos
mecanismos de resistencia (Debnath, 2014, Morshauer, 2010; Cuenca
et al, 2010).

II.3 Marco conceptual o glosario

2.3.1 Agente antifúngicos: engloba cualquier sustancia capaz de

producir una alteración tal de las estructuras de una célula fúngica que
consiga inhibir su desarrollo, alterando su viabilidad o capacidad de
supervivencia, directa o indirectamente, lo que facilita el funcionamiento
 22

de los sistemas de defensa del huésped (Li, Yang, Liu, Wang, & Sun,
2016)

2.3.2 Candida albicans: es un hongo diploide asexual y saprófito, de la

familia de los Sacaromicetos. Habitualmente se encuentra en la cavidad
oral, en el tracto gastrointestinal y en la vagina. Tiene una función
relevante en la digestión de los azúcares, mediante un proceso de
fermentación (Barrionuevo, 2007)

2.3.3 Difusión en disco, es empleado para determinar la sensibilidad de

un agente microbiano frente a un antibiótico o quimioterápico. Este
método comprende lo que se denomina un antibiograma o prueba de
sensibilidad antimicrobiana frente a drogas específica (Hernáez et al.,
1997)

2.3.4 Fluconazol, agente antifúngico ampliamente usado, tiene 2 anillos

que contienen 3 átomos de nitrógeno, de peso molecular es relativamente
bajo, por ser una molécula polar y simétrica favorece su hidrosolubilidad,
su buena solubilidad en agua le hace apto para administración
endovenosa, penetrando muy bien en fluidos corporales (Gregorí, 2005)

2.3.5 Mecanismo de acción de los antifúngicos, es la acción de los

medicamentos que inhiben el crecimiento de hongos, depende del lugar
en el que actúen, lo cual está relacionado con la estructura química del
antifúngico (Rojas, 2008)

2.3.6 Resistencia fúngica, La resistencia antifúngica continúa creciendo

y evolucionando a pesar de la aparición de nuevos fármacos, haciendo
más complicado el manejo de los pacientes con infección fúngica invasora
(Tapia, 2012)

2.3.7ppppppppppppppppppppp

2.3.7 Voriconazol, es un triazol de segunda generación de amplio

espectro, derivado sintético del fluconazol, este fármaco se asocia con
sitios activos de la enzima a través de puente de hidrógeno que se forma
 23

entre el grupo C=O electronegativo de la enzima y el hidróxilo del fármaco

(Gregori, 2005).

III. HIPÓTESIS Y VARIABLES

3.1 Hipótesis general

3.1.1 Existe elevada prevalencia de genes resistentes al fluconazol y

voriconazol en cepas de Candida albicans aisladas en el
Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz - 2018.

3.2 Hipótesis específicas

3.2.1 Se identifica el perfil fenotípico de resistencia a fluconazol y

voriconazol en cepas de Candida albicans aisladas en el
Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz, 2018.

3.2.2 Se identifica los genes de resistencia a fluconazol y voriconazol

existen en las cepas de Candida albicans aisladas en el
Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz, 2018.

3.2.3 Se determina la variabilidad genotípica de genes resistentes al

fluconazol y voriconazol en cepas de Candida albicans aisladas
en el Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz, 2018.

3.2.4 Se determina el secuenciamiento los genes de resistencia al

fluconazol y voriconazol en cepas de Candida albicans aisladas
en el Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz, 2018

3.3 Identificación de variables

Variable independiente: Cepas de Candida albicans

Variable dependiente: Resistencia a fluconazol y voriconazol.

3.4 Operacionalización de variables

DEFINICIÓN DIMENSIÓN
VARIABLE INDICADOR
CONCEPTUAL OPERACIONAL
Es un hongo unicelular
Cepas de que se encuentra a nivel Desarrollo en SDA
Identificación
Candida de los genitales, tracto suplementado con
fenotípica
albicans digestivo, boca y piel, en cloranfenicol.
algunos casos, puede
 24

Observación en
examen directo con
Identificación KOH 10% y azul de
microscópica lactofenol.
Prueba de tubo
llegar a ser patógena y germinativo
causar candidiasis, que
afecta principalmente a
individuos con defensas Identificación EQUIPO
inmunitarias bajas, bioquímica MICROSCAN
aislada de muestras
clínicas como
Es la relativa
Caracterización Método de disco
Resistencia insensibilidad in vitro
fenotípica difusión modificado
a fluconazol probada de un
y microorganismo ante Secuenciamiento de
voriconazol triazoles como Caracterización
Resistencia de cepas
fluconazol y voriconazol molecular
de Candida albicans.

3.5 Matriz de consistencia.
PROBLEMA GENERAL
¿Cuál es la prevalencia de genes de
resistencia al fluconazol y voriconazol de
cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018?
PROBLEMAS ESPECÍFICOS
¿Cuál es el perfil fenotípico de resistencia al
fluconazol y voriconazol de cepas de Candida
albicans aisladas de pacientes del Complejo
Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz -
2018?
¿Qué genes de resistencia al fluconazol y
voriconazol de cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo
Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz -
2018?
¿Cuál será la variabilidad genotípica de genes
resistentes resistencia al fluconazol y
voriconazol de cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo
Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz -
2018?
¿Cuál es el secuenciamiento de los genes de
resistencia al fluconazol y voriconazol de
cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018?
OBJETIVO GENERAL
Determinar la prevalencia de genes de
resistencia al fluconazol y voriconazol de
cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar el perfil fenotípico de resistencia
a fluconazol y voriconazol de cepas de
Candida albicans aisladas de pacientes del
Complejo Hospitalario Policial Luis Nicasio
Sáenz, por el método colorimétrico y
turbidimetría.
Identificar los genes de resistencia a
fluconazol y voriconazol existen en las
cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz, por el método de disco
difusión
Determinar la variabilidad genotípica de
genes resistentes al fluconazol
voriconazol de cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo
Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz, por
método de RFLP
Determinar el secuenciamiento los genes
de resistencia al fluconazol y voriconazol de
cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018.
25
HIPÓTESIS GENERAL
Existe elevada prevalencia de los genes de
la resistencia al fluconazol y voriconazol en
cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018.
HIPÓTESIS ESPECÍFICAS
Se identifica el perfil fenotípico de
resistencia a fluconazol y voriconazol en
cepas de Candida albicans aisladas de
pacientes del Complejo Hospitalario Policial
Luis Nicasio Sáenz - 2018
Se determina la variabilidad genotípica de
genes resistentes al fluconazol y
voriconazol en cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo
Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz -
2018.
Se genotipifica por secuenciamiento los
y genes de resistencia al fluconazol y
voriconazol en cepas de Candida albicans
aisladas de pacientes del Complejo
Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz -
2018.
Se logra determinar el secuenciamiento de
los genes de resistencia al fluconazol y
voriconazol en cepas cepas de Candida
albicans aisladas de pacientes del Complejo
Hospitalario Policial Luis Nicasio Sáenz -
2018
 26

IV. METODOLOGÍA

4.1 Tipo y diseño de investigación

Observacional, descriptivo y transversal

4.2 Unidad de análisis

Cepas de Candida albicans resistente a fluconazol y voriconazol

aisladas de pacientes del Complejo Hospitalario Policial Central Luis
Nicasio Sáenz, Lima, Perú.

4.3 Población de estudio:

Esta compuesta de pacientes del Complejo Hospitalario Policial

Central Luis, Lima - 2018

4.4 Tamaño de muestra

Estará constituido por la totalidad de cepas positivos a Candida

albicans resistentes a fluconazol y voriconazol procedentes de
diversas muestras clínicas de pacientes del Complejo Hospitalario
Policial Central Luis Nicasio Sáenz, durante el año 2018.

4.5 Selección de muestra

Criterio de inclusión

Cepas de Candida albicans resistente a fluconazol y voriconazol,

procedentes de pacientes del Complejo Hospitalario Policial Central
Luis Nicasio Sáenz, durante el año 2018.

Criterio de Exclusión

Cepas repetidas o duplicadas de un mismo paciente durante un

mismo periodo.

Candida albicans sensible a fluconazol y voriconazol.

4.6 Técnica de recolección de datos

 27

4.6.1 Aislamiento e identificación de Candida albicans

Según lo establecido en el manual de procedimiento Robles,

Ausejo, & Cavero (2007), el análisis micológico se llevará a cabo
a través del aislamiento primario de especies levaduriformes
provenientes de diferentes muestras clínicas en Agar Sabouraud
(SDA), suplementado con cloranfenicol, el medio selectivo más
indicado para realizar el aislamiento primario. Se sembrara por
estrías. Con ayuda de una pipeta pasteur estéril se colocó una
cantidad considerable de muestra en el medio de cultivo SDA,
realizándose por duplicado. Los medios serán incubados en
condiciones de aerobiosis a 37 °C durante 24 horas, y el otro, a
temperatura ambiente (18 °C - 25 °C) durante 72 h.
Posteriormente, a cada uno de los tubos se le realizará un
repique en el medio de cultivo SDA, con la finalidad de verificar
la pureza de las mismas (Robles, Ausejo, & Cavero, 2007).

4.6.2 Caracterización fenotípica

A partir del aislamiento de las especies fúngicas, se procederá a
verificar las características morfológicas de las colonias: tamaño,
aspecto, forma, color, elevación de la colonia, que orientaran
hacia el grupo en estudio, C. albicans en SDA, desarrollando
colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color blanco o
ligeramente crema, lisas, convexas, de aspecto mate u opaco

4.6.3 Observación microscópica

A partir del crecimiento en el SDA, se procederá, a colocar en un
portaobjetos una cantidad considerable de la cepa,
posteriormente se agregó una gota de hidróxido de potasio
(KOH) al 10% y se cubrirá con una laminilla, facilitando la
observación, pues esta sustancia presentará un efecto
clarificador, disolviendo los distintos elementos celulares y
dejando intacta la pared celular fúngica. De igual manera, se
realizará el mismo procedimiento, con colorante el azul de
lactofenol con la finalidad de observar al microscopio la
 28

morfología celular, como la presencia de clamidoconidias

(Gregorí, 2005).

4.6.4 Prueba del tubo germinativo

Emulsionara una porción de la colonia aislada en 0,5 ml de
suero humano o de conejo. Incubar a 35 °C durante 2 h.
Depositara una gota de la emulsión sobre un portaobjetos y un
cubre-objetos. Si la prueba es positiva se visualizarán los tubos
germinales. (Guevara et al., 2007).

4.6.5 Sistema de identificación automatizado MicroScan RAPID

YEAST ID PANEL.
Se Utilizara el sistema de micro dilución para aislamientos
clínicos de levaduras, empleando paneles de identificación a
partir de 27 sustratos, usando reacciones enzimáticas; en un
tiempo de 4 horas, de fácil configuración y lectura. La
interpretación automatizada se realizará a través de LabPro
Information Manager o en línea con la herramienta de búsqueda
Biotype (GERMAIN,1991). ………………… ……………… …

4.7 Prueba de Sensibilidad Antifúngica

Se realizará según lo recomendado por MARCA (2013), donde se
utilizará la prueba de susceptibilidad antimicótica, empleando el
método de difusión en agar, y se seguirá los lineamientos
establecidos por el Instituto de Estándares de Laboratorios Clínicos
(CLSI, 2009), estandarizados y publicados en el manual M44-A2.
El procedimiento se llevará a cabo de la siguiente manera: se
tomará de 3 - 5 colonias aisladas del microorganismo, identificadas
previamente del SDA. Luego, con ayuda de un hisopo estéril, se
sembrará por diseminación sobre la superficie de la placa de agar
Mueller Hinton modificado (con la adición de 2 % glucosa y 0.5
mg/ml de azul de metileno), la cual se dejará secar de 3 - 5
minutos, Posteriormente con ayuda de una pinza estéril, se
presionará suavemente sobre la superficie del agar, se colocarán
 29

los discos de antimicóticos de elección: fluconazol (25 μg), y

voriconazol (1 μg). Después, estas placas se incubaran a 37°C
durante 24 horas en aerobiosis, al cabo de cierto tiempo se
realizara la medición de los halos de inhibición y dependiendo del
tamaño se clasificaran, según las categorías establecidas por el
CLSI (2009), en sensible (S), intermedio (I) y resistente (R).

4.8 Métodos Moleculares

Se realizará en el Laboratorio de Biología Molecular de
Enteropatogenos del Instituto Nacional de Salud (INS), Lima,
Perú.

4.8.1 Secuenciación:
Se realizará según lo recomendado por (Wu et al., 2018b), las
levaduras serán sembradas en medio de Peptona Dextrosa
Extracto de Levadura (YEPD) a 37°C con agitación, hasta
alcanzar fase exponencial y se extraerá el ADN genómico
mediante el sistema comercial High Pure PCR Template
Preparation Kit® (Roche) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante, se amplificara por reacción de polimerasa en cadena
(RPC) la región 405-488 del gen ERG11 (Gene ID: 3641571).
Cada reacción estará compuesta por tampón de RPC 1X, MgCl2
2 mM, dNTP 0,2 mM, Taq polimerasa Biolasa (Bioline®) 5 U y
partidores 0,2 μM (Tabla 2), 10 μL de ADN templado genómico y
se completará el volumen a 50 μL con agua bidestilada.

V. PRESUPUESTO TENTATIVO

Descripción Costo unitario Costo total

(S/.) (S/.)
 30

1. Remuneración. -
2500,00
Asesor de investigación
500,00
Asesor estadístico
1800,00
Investigador
2. Útiles de escritorio
Papel bond A4 (500 hojas) 15.00 30,00
Lapiceros (04) 0.50 2,00
Cuaderno de notas (02 x 100 5.50 11,00
hojas)
Plumones indelebles (02) 4,50 9,00
Dispositivos USB (02 x 8 Gb) 35,00 70,00

3. Acervo bibliográfico. -
Fotocopias 0,20 180,00
Separatas 30,00 120,00

4. Servicios. -
Movilidad local 360,00 360,00
Viáticos 480,00 480,00
Impresiones 150,00 150,00
Espiralados 2,50 2,50
Empastados 15,00 195,00
Búsqueda electrónica 50,00 150,00
5. Material de laboratorio y
reactivos. -
Reactivos e insumos químicos 8500,00
Material de vidrio 440,00

6. Muestras experimentales
Conservas de filete de bonito 320,00
Secuenciamiento de cepas 5000,00
resistentes

7. Material de limpieza. -
Detergente (bolsa x 400g) 3,00 6,00
Jabón antiséptico 3,50 7,00
Papel toalla para manos (2) 6,50 13,00
Imprevistos 550,00
Total 21 395,50

TOTAL: (ESTIMACION APROXIMADA) 21 395,50 soles

 31

VI CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

DESCRIPCIÓN DE 2018
ACTIVIDADES E F M A M J J A S O N D

1.    Recopilación de bibliografía

X X X X X X X X X X X X
e información
2.    Redacción y presentación de
      X X              
proyecto de tesis
3.    Recolección de muestras e
X   X  X X  X X  X  X  X  X X   X
identificación preliminar.

4. Caracterización fenotípica de
            X X  X  X  X  X 
la cepas de Candida albicans
5.  Identificar los genes de
              X  X X  X  X 
resistentes de Candida albicans.
6. Determinación de la
variabilidad genotípica de los                 X X   X X 
genes de resistencia
7. Determinación del
Secuenciamiento de los genes                   X  X X 
de resistencia
8. Procesamiento de los datos                   X X X 
9. Análisis e interpretación de los
                    X X 
datos
10. Redacción y presentación de
                      X
la tesis
 32

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