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Informe 1. Juan Esteban, Anderson y Kevin - Final
Informe 1. Juan Esteban, Anderson y Kevin - Final
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría UV-visible es una técnica que permite determinar la concentración de un
compuesto en solución. Se basa en que las moléculas que absorben las radiaciones
electromagnéticas y a su vez que la calidad de luz absorbida dependen de forma lineal de la
concentración. Además es usada para identificar compuestos por su espectro de absorción y
conocer la concentración de un material o sustancia, esto último permite, seguir el curso de
reacciones químicas y enzimáticas así como determinar enzimas y proteínas incluso ácidos
nucleicos. Mediante esta práctica se pretende calcular las concentraciones de dos muestras
problema utilizando la absorbancia mediante la curva de calibración y la ecuación de Beer-
Lambert.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
● Reactivo de Biuret.
● Solución patrón de gelatina (8 mg/mL)
● Solución salina (0.9%)
● Solución de gelatina sin sabor (1mg/mL)-Solución problema 1
● Solución de albúmina (1mg/mL)-Solución problema 2
Se preparan dos tubos de ensayo: el tubo 1 con la solución problema 1 y reactivo de Biuret (1:2)
y el tubo 2: Solución problema 2 y reactivo de Biuret (1:2). Se miden las absorbancias a longitud
de onda de 420 nm a cada tubo aumentando de 20 nm en 20 nm hasta 660 nm.
Flujogramas concerniente a la curva de calibración y curva de absorbancia
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 1. Variación de absorbancia de la solución contenida en el tubo 1 y tubo 2 respecto a la
variación de la longitud de onda, inmediatamente después de preparar la solución y 15 minutos
después de preparar.
De las gráficas se puede observar que la mayor longitud de onda para el tubo 1 sin reposar y
luego de los 15 minutos de reposo fue de 580nm.
Figura 3. Absorbancia vs. Longitud de onda Figura 4. Absorbancia vs. Longitud de onda
de la medición del tubo 2 inmediatamente de la medición del tubo 2 15 minutos después
después de su preparación. de su preparación.
CONCLUSIONES
- Fue posible determinar las longitudes de onda donde las muestras problema absorbían la
mayor cantidad de luz (540 y 580nm) y de esa manera a partir de ellas tomar las
absorbancias para determinar las concentraciones de las muestras problema.
- Se determinó la concentración de las muestras problema tanto por el método grafico como
por la ecuación de Beer-Lambert, ambos métodos fueron exitosos ya que permitieron
obtener valores muy cercanos para las concentraciones de las muestras.
- El Reactivo de Biuret es un buen indicador de la presencia de proteínas, péptidos cortos y
otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición
desconocida, por lo cual fue útil su implementación en la práctica.
Cuantificación de Proteínas
Los aminoácidos (aa) son los monómeros que componen las proteínas. Una proteína
está compuesta de una o más cadenas lineales de aminoácidos, cada una de la
cuales se denomina polipéptido. En un extremo, el polipéptido tiene un grupo amino
libre, llamado amino terminal (o extremo N-terminal). El otro extremo, que tiene un grupo
carboxilo libre, seconoce como carboxilo terminal, o extremo C-terminal (OpenStax College,
2013).
La estructura básica de los aa consiste en un átomo central de carbono, también
llamado carbono alfa (α), unido a un grupoamino (NH2), un grupo carboxilo (COOH). A
pH fisiológico (7.2 -7.4), el grupo amino generalmente se encuentra protonado y tiene una carga
positiva, mientras que el grupo carboxilo está desprotonado y tiene una carga
negativa (OpenStax College,2013).
Las proteínas son un constituyente muy importante de las células y los tejidos del cuerpo
humano. Las proteínas totales séricas se pueden separar en dos grandes grupos la
Albúmina y las Globulinas. La albúmina es la proteína de más concentración en la sangre.
Transporta muchas moléculas pequeñas y mantiene la presión sanguínea. Las
globulinas se pueden dividir en alfa-1, alfa2, beta y gamma globulinas. La albúmina
representa el 60% de las proteínas que contiene el suero, el resto son las globulinas. La
determinación de proteínas totales se realiza para evaluar la posiblepresencia de enfermedades
nutricionales, enfermedades del riñón o del hígado. (García, 2010)
Solución 1.0
salina
Cálculos:
a) Dilución del patrón
C 1∗V 1=C 2∗V 2
Preguntas
1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albúmina, con los reportados
como normales para el suero. ¿Existen diferencias? ¿Por qué?
Los porcentajes de estas proteínas pueden variar y salirse del rango normal debido a diferentes
factores tales como el sexo, la edad, problemas de salud y características especiales en cada
persona.
Niveles bajos de globulina pueden indicar una posible enfermedad celíaca, mala absorción de
proteínas, mal funcionamiento del hígado o una enfermedad intestinal. En algunos casos la
anemia aguda contribuye a tener bajos esos niveles, así como las enfermedades renales.
(Zumalacárregui, 2017).
Los altos niveles de globulina pueden indicar una enfermedad grave como tuberculosis o sífilis,
trastorno de la médula ósea (mieloma múltiple), leucemia o el lupus sistémico. La ictericia y la
cirrosis biliar pueden provocar también altos niveles de globulina. La artritis, colitis ulcerosa, una
enfermedad renal o infecciones provocadas por diferentes bacterias y virus pueden causar un
aumento de globulinas.
Los valores de albúmina bajos pueden estar relacionados con: Problemas en el hígado que es
donde se sintetiza mayoritariamente la albúmina. En este caso cuantos más bajos sean los valores
indican mayor gravedad del daño hepático (por cirrosis o hepatitis), problemas en los riñones que
están excretando demasiada albúmina, problemas de malnutrición o de mala absorción.
Los niveles elevados de albúmina en sangre (suero) no suelen tener una significación clínica y
por tanto no suelen ser preocupantes. Normalmente se debe a deshidratación por pérdida de agua
debido al calor o al ejercicio. También se observa si existe una ingesta limitada de líquidos,
particularmente agua, en la dieta.
Los niveles de albumina altos son poco frecuentes ya que no existe una causa natural para la
elevación de la albumina. Puede deberse principalmente a tres razones: Deshidratación, Consumo
muy alto de proteína, Torniquete aplicado por un largo periodo. (Zumalacárregui, 2017)
2. Consulte la función de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el
procedimiento de separación de globulinas.
La mayoría de las globulinas animales se precipitan con sulfato de amonio al 50% de saturación;
Las albuminas se precipitan con soluciones de sulfato de amonio al 100% de saturación lo que
hace que se disminuya el grado de hidratación y se reduce el número de cargas de las proteínas.
(Fiorentino, 1994).
Esto nos da la oportunidad de separar las albuminas de las globulinas y la manera de evidenciar la
separación de estas globulinas es por cuantificación de las proteínas del suero total y luego las de
su precipitado. (Herrera, 2003).
La función del sulfato de amonio es disminuir la solubilidad de las globulinas en el suero
sanguíneo, produciendo la precipitación de estas; mientras que el cloruro de sodio tiene como
función diluir las globulinas que fueron separadas del suero sanguíneo.
Análisis:
Durante la sección experimental se buscó mediante una serie de mediciones realizadas en el
espectrofotómetro hallar las concentraciones correspondientes a las proteínas totales, globulinas y
albúmina, con ayuda de las absorbancias encontradas previamente de cada uno de estas proteínas
y la concentración final de la solución patrón (gelatina).
El suero sanguíneo está compuesto principalmente por dos proteínas: albúmina y globulinas,
(Cardona, 2018) para encontrar las concentraciones de dichas proteínas inicialmente se tuvo que
efectuar una separación de las globulinas del suero sanguíneo, la cual se hizo agregando solución
saturada de sulfato de amonio, y luego de centrifugar y separar las globulinas, éstas fueron
diluidas en solución salina.
El uso de las soluciones de sulfato de amonio y salina se debe a que a una fuerza iónica lo
suficientemente elevada, una proteína puede ser casi completamente precipitada de su disolución;
efecto llamado insolubilización por salado, que es el resultado de la competencia por moléculas
de solvatación entre los iones salinos agregados y los otros solutos disueltos. Uno de los factores
que explican este efecto es que la concentración elevada de la sal puede eliminar el agua de
hidratación de las moléculas de proteína, reduciendo entonces su solubilidad. 101 (Voet, 2007) La
solubilización e insolubilización por salado son procedimientos importantes para la separación de
mezclas de proteínas, ya que las diferentes proteínas varían en su respuesta frente a la
concentración de sales neutras. Las proteínas precipitadas por salado retienen su conformación
nativa y pueden disolverse de nuevo, normalmente sin experimentar desnaturalización. El sulfato
de amonio es el preferido para precipitar las proteínas por salado, debido a su gran solubilidad en
agua, lo que permite alcanzar fuerzas iónicas muy elevadas. (Voet, 2004)
Las absorbancias de las proteínas fueron halladas a una longitud de onda λ = 580 nm, se usó esta
longitud de onda debido a que en solución alcalina y en presencia de iones Cu2+ (reactivo de
Biuret) los cuales reaccionan formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces
peptídicos de las proteínas y éstas, desarrollan un complejo coloreado de gran estabilidad que se
detecta fotometricamente a 580 nm. (Ruiz, 1995) Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color
azul claro.
Según lo encontrado en la literatura, la albúmina es la principal proteína del plasma humano y
comprende cerca el 60% de la proteína plasmática total, (Zumalacárregui, 2017) el resto
corresponde a las globulinas, es decir, el 40 %; por lo que se puede deducir que existe una mayor
cantidad de albúmina y una deficiencia de globulinas. (Murray, 1996)
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Celia E.Coto. “Las curvas de calibración” Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
UBA. Recuperado de:
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm
Fiorentino, S. (1994). La Inmunología en el Diagnóstico clínico. Santafé de Bogotá:
Centro Editorial Javeriano, CEJA. 70-73