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Texto suplementario:
Materiales y métodos
El cultivo in vitro y expansión de células T CD3 alta de CD247- y CD3 γ-deficiente
pacientes
Las PBMC se purificaron por centrifugación en Ficoll-Hypaque y se cultivaron en
Medio RPMI-1640 (Lonza) suplementado con 10% de SFB, 10% de AB masculino negativo
suero humano (la primera semana, y luego con 5% de SFB, 5% de suero humano), 4 mM de L-
glutamina, 0.1 mM aminoácidos no esenciales, 1 mM piruvato sódico, 100U / ml
penicilina, 100 U / ml de estreptomicina, Hepes 10 mM, β-mercaptoetanol 50 mM (Biowest).
Las células se estimularon mediante cultivo en placas de 24 pocillos recubiertas con anti-CD3.
(5ug / ml) y mAbs anti-CD28 (10ug / ml) o en presencia de células alimentadoras irradiadas
(PBMC autólogas, líneas de células B Daudi y RPMI-8866) y PHA (0,5 μg / ml). En ambos
En los casos, los cultivos se complementaron con la adición de 50 U / ml de IL-2 recombinante
(Peprotech).
El estudio se realizó de acuerdo con los principios expresados en
Declaración de Helsinki y aprobada por la Institutional Research Ethics
Comités de los diversos hospitales involucrados. Todos los participantes, o sus tutores,
proporcionó el consentimiento informado para la recolección de muestras y análisis posteriores.
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25/10/2017 Texto complementario: Materiales y métodos Cultivo in vitro y expansión de células CD3high de pati deficientes en CD247 y CD3γ
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Líneas celulares
Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37ºC y 5% de CO2 en una incubadora humidificada
y dividir según sea necesario. Células Ma5.8 (regalo de los doctores Hisse M. van Santen y Balbino
Alarcón, CBMSO, Madrid) se mantuvieron en medio RPMI con 5% de ternero fetal
suero (FCS). La línea celular de empaquetamiento 293T se cultivó en Dulbecco's Modified
Medio Eagle (DMEM) con 10% FCS. Todos los medios fueron complementados con 2mM L-
Glutamina, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM,
Penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 U / ml, β-mercaptoetanol 50 μM.
CD247 Inmunoblotting
Las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS y se lisaron en tampón de lisis RIPA
(1% de Triton X-100, 1% de DOC, 0,1% de SDS, 50 mM de Tris HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl,
inhibidores de la fosfatasa (1 mM Navo 3 y NaF, 2 mM de EDTA) con inhibidores de la proteasa
(Pepstatina A 1 μM, leupeptina 1 μM) y yodoacetamida 0,5 mM durante 30 minutos en hielo. los
los lisados se centrifugaron durante 5 minutos a 13,000 rpm para sedimentar material insoluble y luego
la concentración de proteína se determinó mediante Bradford Assay. 30 μg de cada lisado
se separaron en electroforesis en gel de poliacrilamida reductora de SDS al 12% seguido de
transferencia a PVDF (Immovilon-P, Millipore). Las membranas se bloquearon en un 5% secado
leche desnatada (1h, 25ºC), lavada tres veces en Tween / TBS al 0.05% e incubada
(overnight, 4ºC) con conejo policlonal anti-CD247 (regalo del Prof. B Alarcon) para visualizar
CD247. Las membranas se despojaron usando Restore Western Blot Stripping
tampón (Thermo Scientific), vuelto a bloquear y desarrollado utilizando anticuerpos monoclonales de ratón
β-actina (1: 15000, Sigma) en Tween / TBS al 0,05%.
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Citometría de flujo
Las PBMC recién aisladas o cultivadas se tiñeron con etiqueta directamente
anticuerpos específicos para CD3, CD56, CD4, CD8 (todos de Biolegend) y TCRαβ (BD
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25/10/2017 Texto complementario: Materiales y métodos Cultivo in vitro y expansión de células CD3high de pati deficientes en CD247 y CD3γ
Pharmingen). Las células Ma5.8 se tiñeron con mAb marcado con PE específico para Vβ3
(Pharmingen). Para la tinción, las células se lavaron e incubaron en PBS / 0,5% (p / v)
Albúmina de suero bovino / 1% (v / v) de suero bovino fetal / 0.1% de tampón de azida sódica (PBA)
buffer) con anticuerpos específicos. Toda la tinción se realizó en hielo, y el
las células marcadas se mantuvieron en hielo hasta el análisis. Para la tinción de CD247 intracelular,
las células se tiñeron primero en hielo, si era necesario, y luego se lavaron con PBA y se fijaron
usando para-formaldehído al 2% (PFA). Después de la fijación, las células se lavaron dos veces con PBA,
y resuspendido en 0,2% de saponina / PBA (tampón de permeabilización) durante 15 minutos en hielo en
la oscuridad. Después de la permeabilización, las células se lavaron una vez en tampón de permeabilización
e incubado con anticuerpo CD247-FITC (eBiosciences) en la oscuridad durante 30 minutos en
hielo, lavado y resuspendido en PBA para su análisis. Las células se analizaron usando cualquiera
un citómetro FACSCalibur (BD Biosciences) o Gallios (Beckman Coulter). Los datos fueron
analizado con Kaluza Flow Cytometry Analysis.
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Tabla suplementaria 1: secuencias de los cebadores utilizados para la amplificación de CD247, CD3γ, CD16 y FcεRIγ, así como para la secuenciación.
CD247
GGAGATCTCCACAGTCCTCCACTTCCTG GATCGCGGCCGCATAGGAAGGCTTTAGCATGCC
cDNA
CD247
ACACCCCAAACCCTCAAACCTC AGGAGGGCAGGATTTGAAGGAG
Exon1
CD247
GGTCAGTCAGTCCTAGTGCCA CCTTGCTTTGCTCCTGGATAC
Exon2
CD247
GTTAGTTGCCAAGGAGCGGAG CCTAAACCCAAGACTCTGGCG
Exon3
CD247
CTGTCATGTTAAGGCGTGTTCTC TGGGTCTCCATCTCTTCTCTTG
Exon4
CD247
AGGTTTGGAGCCTTGATTGTG ATTTGCAGCTGGGATGAGAAG
Exon6
CD3γ
AGTCTAGCTGCTGCACAGGCT CCCCAAATTTGCTCTGATGGC
cDNA
CD16A
GGGGATCCGCCACCATGTGGCAGCTGCTCCTCCC GCGCGGCCGCTCATTTGTCTTGAGGGTCCTTTCTC
cDNA
FcεRIγ
GGGGATCCAGAACGGCCGATCTCCAG GATCGCGGCCGCGAGTCCAGTCCATGGCAGTT
cDNA
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Cebadores de secuenciación utilizados para vectores pJET1.2 y pBlueScript
pJET1.2 CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG
M13 GTAAAACGACGGCCAGT GCGGATAACAATTTCACACAGG
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Compensatorio
A> T 138 CDS No aa> Met 6/20
mutación
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Variación 29 G> A 1176 3'UTR - 1/16
Variación 30 C> G 1256 3'UTR - 4/16
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Control saludable 1
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Control saludable 2
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Variación 11 -> C 714 3'UTR - 1/10
Variación 12 G> A 827 3'UTR - 1/10
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2 10 2 401 0,49 1 Sí 1
3 7 8 263 4,34 - -
6 10 0 302 0 - -
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Tabla Suplementaria 4
Gene
Gene Sinónimo Missense 5'UTR 3'UTR 5'UTR CDS 3'UTR Dañar
ID de transcripción ID de nucleótido
Nombre variantes variantes variantes variantes longitud longitud longitud Índice - G
Phred
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Genes de control
Gene
Gene Sinónimo Missense 5'UTR 3'UTR 5'UTR CDS 3'UTR Dañar
Transcripción ID de nucleótido
Nombre variantes variantes variantes variantes longitud longitud longitud Índice - G
Phred
ADRA1A ENST00000380586 NM_033303 128 271 dieciséis 25 437 1427 440 5.12161
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MYO15A ENST00000205890 NM_016239 279 620 dieciséis 26 339 10592 945 16.09179
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25/10/2017 Texto complementario: Materiales y métodos Cultivo in vitro y expansión de células CD3high de pati deficientes en CD247 y CD3γ
NFATC1 ENST00000253506 NM_001278669 149 188 dieciséis 98 454 2831 1746 8.00523
OTUB1 ENST00000538426 NM_017670 24 25 2 46 605 815 890 2.06462
PRDX1 ENST00000262746 NM_002574 15 41 20 15 342 599 322 0.75000
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