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Vol9 n1 4 16 PDF
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Automatización en hematología
Nilda E. Fink
TABLA 1
Algunas características de autoanalizadotes hematológicos modernos*
Los contadores de sangre automatizados, como nos, entender críticamente las evaluaciones empren-
cualquier otro instrumental de laboratorio, deben ser didas por otros usuarios. Este aspecto no será trata-
manejados de manera apropiada. Esto requiere que do en esta revisión, pero el lector puede remitirse MA
sean totalmente calibrados y que el desempeño sea Fernández Alberti y col4.
monitoreado tanto por el control de calidad interno El desarrollo automatizado del recuento y la me-
como por los PEEC. Por último, debido a que el mer- dición del tamaño de las células sanguíneas parte de
cado evoluciona muy rápido, es necesario entender técnicas de recuento simple, que fueron descriptas en
cómo se evalúan los nuevos instrumentos o, al me- la segunda mitad del siglo XIX y que fueron usadas
6 HEMATOLOGIA l Volumen 9 - Nº 1, 2005
TABLA 2
Recuento de células sanguíneas en los primeros instrumentos
Concentración de Hb
en el recuento pueden subestimarse si van a través Es él método más uniforme en todos los instru-
de la zona sensora, casi al mismo tiempo, que otra mentos y presenta dos opciones de uso común (Ta-
célula. Este problema, que se denomina coincidencia bla 3).
(Fig. 5), surge del tiempo muerto en la electrónica La primera es convertir la hemoglobina en
del instrumento y por lo general puede ser corregi- cianmetahemoglobina (HiCN) y luego medir la
do con un algoritmo matemático adecuado, cons- absorbancia alrededor de 540 nm. En la práctica, sin
truido dentro del microprocesador del contador embargo, el tiempo del ciclo de los instrumentos dis-
hematológico. ponibles en el mercado es tan corto que puede im-
Decir que las células deben contarse sólo una vez pedir que la conversión total se produzca por com-
parece igualmente excesivo, pero el problema es que pleto y que los derivados intermedios sean medidos.
en los contadores de apertura-impedancia simple sin La conversión a HiCN requiere el uso de un reactivo
TABLA 3
Fundamento de varias determinaciones hematológicas en autoanalizadores de uso frecuente.
Instrumentos
Analito Abbott Bayer Beckman Sysmex
Coulter
Hemoglobina:
- Método automatizado HiCN HiCN con Hb HiCN LSS-meta-Hb
celular directa
- Método de detección Absorción a 546 nm Absorción a 546 nm Absorción a 525 nm Absorción a 555 nm
Leucocitos totales Dispersión óptica/ Citometría de flujo Impedancia Corriente directa
fluorescencia
Leucocitos: diferencial Dispersión óptica/ Peroxidasa y Tecnología VCS de Corriente directa y
fluoresencia densidad nuclear Coulter 3-D frecuencia de radio
Leucocitos: linealidad 0-250 1-99,9 0-99,99 0-99,9
(109/L)
Plaquetas Recuento inmuno- Optico Umbral fijo de Impedancia
plaquetario de óptica/ impedancia
impedancia
Plaquetas: discriminación Recuento inmuno- Indices óptico y Exactitud de Umbrales no fijos
con eventos no plaquetarios plaquetario de óptica/ refractario que umbrales fijos en que permiten la
impedancia permiten la la detección por discriminación
discriminación parámetro único
Plaquetas: linealidad (109/L) 0-2000 0,005-3000 0-999 0-999
AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 9
tipo Drabkin, que contiene cianuro de potasio y el centro del orificio. Afortunadamente, esas células
ferrocianuro de potasio, por lo tanto el efluente resi- tienen un tiempo de pasaje más largo a través del
dual del instrumento puede no cumplir con los orificio, debido a que el flujo es más lento en el bor-
estándares ambientales en algunos países. Los méto- de. Los impulsos que ellas producen son por lo tan-
dos alternativos -libres de cianuro- para la medición to tan largos que deben y pueden ser procesados. Dos
de la Hb, que usan laurilsulfato de sodio (LSS), han células que atraviesan juntas también producen un
sido introducidos en algunos instrumentos. Los resul- pulso sobredimensionado, pero de igual modo es tan
tados parecen compararse bien con los métodos de largo, que puede ser procesado.
HiCN9. Estos métodos no cianamidas, además de ser En relación a los eritrocitos, el aspecto más serio,
más seguros, son también promisorios en cuanto a de corrección más dificultosa, es que el VCM tiende
futuras mejoras en la calibración y validación de nue- a ser subestimado cuando la concentración de Hb
vas mediciones de Hb. El método de LSS introduci- corpuscular media (CHCM) real, medida manual-
do por Sysmex, parece ser de iguales características mente, es reducida. Los fabricantes han adoptado
a las del método de referencia y es un avance signi- diferentes técnicas para obviar el problema. Estas han
ficativo para bajar la turbidez y permitir un rápido servido para reducir la magnitud del efecto aunque
análisis automatizado10. en ninguna instancia ha sido eliminado totalmente.
Debido a que los índices eritrocitarios se relacionan
entre sí de acuerdo con lo siguiente:
Eritrocitos
Por lo general, el recuento de eritrocitos se reali- HCM
za sobre diluciones de sangre entera con un umbral CHCM =
VCM
adecuado para discriminar entre grandes plaquetas
y pequeños eritrocitos (Fig. 4). Muchos sistemas no Puede observarse que un VCM subestimado cau-
tienen un umbral superior para discriminar grandes sará una CHCM sobrestimada. Por esto, con los mo-
eritrocitos de pequeños leucocitos, pero los números dernos contadores sanguíneos, rara vez se observa que
relativos de los dos tipos de células indican que esto la CHCM descienda marcadamente en la deficiencia
no suele ser un problema. de hierro severa, como sucede cuando las mediciones
de Hb y hematocrito son hechas en forma manual y
Indices eritrocitarios la CHCM se calcula usando la fórmula:
de los equipos de Bayer que llevan a la esfericidad es un indicador de recuperación medular después de,
las células con un volumen constante y luego miden por ejemplo, un transplante de médula ósea (TMO)
el volumen celular a partir de la lectura mediante un o de la administración de eritropoyetina exógena.
sistema de dispersión de luz, donde la misma incide Actualmente, se pueden hacer los recuentos sin
con dos ángulos diferentes. Después, proceden a necesidad de coloración manual, ya que están total-
transformar esas señales mediante un algoritmo es- mente automatizados. Sysmex fue el primero en in-
pecial basado en la dispersión óptica de partículas troducir un colorante fluorescente (Automune-O)
esféricas dieléctricas10. detectado por citometría de flujo, en tanto que otros
En estos casos suele aplicarse la teoría de Mie que como Beckman Coulter usan el nuevo azul de
relaciona la dispersión de luz con el volumen y el metileno. Este último método es menos preciso por-
índice de refracción interno11. El uso práctico de la que es más dificultoso estandarizar la coloración y
teoría de Mie proviene de observar la dispersión de porque los cuerpos de Howell-Jolly pueden interfe-
luz en cada célula individual, con un ángulo peque- rir. Bayer usa la oxazina-750 en el canal de luz láser
ño (2º-3º) y uno grande (5º-15º). La dispersión con un de helio-neón y esta determinación se integra con las
ángulo pequeño está afectada primariamente por el determinaciones del ancho de la distribución del vo-
volumen y la dispersión con un ángulo grande, por lumen eritrocitario (RDW) y el contenido de Hb, con
el índice de refracción interno, aunque cada uno está lo cual se obtienen los índices celulares reticulo-
afectado por ambos. Sin embargo, si ambos ángulos citarios. Estos parámetros de inmadurez reticulo-
de dispersión son ploteados uno contra el otro, la citaria, que actualmente tienen un uso limitado, pue-
posición de cualquier impulso puede ser derivada den ser usados para estimar la reducción de la vida
para medir el volumen y la concentración de Hb de media eritrocitaria y mejorar el tratamiento de una
la célula. Promediando las mediciones sobre muchas variedad de anemias, en la recuperación posquimio-
células, se pueden derivar los valores medios que terapia y en el TMO.
equivalen al VCM y la CHCM5.
Como mencionamos antes, los cambios de forma
de los eritrocios deformados anormalmente en los Plaquetas
analizadores por apertura-impedancia, afectan la es- Estas células pueden contarse sobre la misma di-
timación del VCM, la CHCM y el hematocrito. La lución de sangre entera usada para el recuento de
introducción de la focalización hidrodinámica en los eritrocitos. Hay, por lo general, un umbral superior
equipos de apertura-impedancia, tales como el para eliminar pequeños eritrocitos y un umbral infe-
Sysmex SE9500, parece reducir el efecto del cambio rior para discriminar del ruido electrónico y los res-
de forma y de deformabilidad. En ese sentido, los tos celulares (Fig. 4).
equipos de Beckman Coulter, particularmente para Estos umbrales simples son adecuados, siempre
CHCM, parecen estar afectados por no poseer esa y cuando el instrumento tenga flujo laminar, y vale
adaptación10. tanto si se usa apertura-impedancia como dispersión
de luz para su detección. Sin embargo, si no se usa
flujo laminar –opcional para los contadores de aper-
Reticulocitos tura-impedancia y obligatorio para contadores de dis-
Los recuentos de reticulocitos teñidos con varios persión de luz– hay demasiado solapamiento entre
colorantes pueden realizarse en un instrumento au- las señales de ruido o los residuos y la de los
tomatizado, diseñado para ese propósito, tal como el eritrocitos pequeños para que el recuento sea efecti-
Sysmex R3000, o en un citómetro de flujo convencio- vo, entre los umbrales inferior y superior.
nal. Recientemente otros contadores hematológicos Bajo estas circunstancias es necesario ajustar una
han incorporado una opción de recuento de reti- curva de distribución teórica al histograma de volu-
culocitos, en los que éstos deben ser coloreados de men de plaquetas y extrapolar el recuento de
modo independiente y luego son introducidos den- plaquetas a partir del área bajo la distribución teóri-
tro del contador para su análisis. ca5 (Fig. 4, C).
En el caso de mediciones hechas con colorantes Recientemente, se han ampliado los diferentes ti-
fluorescentes, de acuerdo con la intensidad de fluo- pos de métodos empleados por los distintos fabrican-
rescencia, los reticulocitos se pueden dividir en tres tes. Estos nuevos sistemas han sido importantes por-
sectores que representan estadios diferentes de ma- que se sabe que el recuento de plaquetas con un solo
duración. El estadio más joven, muy fluorescente, es parámetro tal como la impedancia, tiene una tenden-
un indicador temprano de recuperación, que apare- cia a sobreestimar el recuento verdadero de plaquetas,
ce antes de un recuento de reticulocitos total eleva- que es importante en las trombocitopatías y en el
do. Un alto recuento de elementos muy fluorescentes manejo de pacientes trombocitopénicos.
AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 11
Por otra parte, esto es importante en el caso de maria o reactivas, trombocitopenia o cambios noto-
tener que hacer recuentos elevados de plaquetas, en rios en los eritrocitos. Una forma de estimular el in-
pacientes con trombocitosis y en el control de calidad. terés y aumentar el conocimiento de los responsables
Una limitación actual es la imposibildad de distinguir en la evaluación correcta de preparaciones sanguí-
plaquetas de fragmentos celulares y restos celulares. neas y frotis de médula ósea es la discusión periódi-
Es importante también la capacidad de reconocer ca de extendidos de interés especial. Un análisis cui-
plaquetas de mayor tamaño, que suelen estar exclui- dadoso de frotis sanguíneo es una herramienta muy
das de los algoritmos de recuentos de plaquetas. Los útil para la evaluación clínica. Por otro lado, la triada
fabricantes trataron de resolver esto de diferentes for- de factores formada por la importancia, el gasto y el
mas (Tabla 3). error aleatorio llevó a los directores de laboratorios
Algunos fabricantes resuelven esto con métodos y a los ingenieros industriales a la conclusión de que
ópticos y por impedancia y si no hay concordancia la automatización del recuento diferencial proporcio-
tiene la alternativa de usar un método inmunológico naría información más exacta, además de reducir los
automatizado con un anticuerpo monoclonal contra costos y los errores.
la glicopropteína gpIIIa, que es una gp presente sólo En relación al almacenamiento de muestras de
en plaquetas (Abbott). Otros usan un método de im- sangre para hacer los frotis preparados con sangre
pedancia sin umbral fijo y los resultados correla- anticoagulada por EDTA, conservados durante no
cionan bien con el método de referencia, pero con más de 60 minutos a temperatura ambiente, mues-
menor frecuencia de alarmas con relación a otros con- tran pocos cambios comparados con los que se pre-
tadores que tienen umbrales fijos (Sysmex). paran inmediatamente después de obtener la sangre.
También se desarrolló un sistema de medida Se pueden discernir cambios tres horas después, y en-
bidimensional en el cual se mide tanto el volumen tre 6 y 8 horas posteriores a la extracción, los cam-
como el índice de refracción de cada una de las célu- bios son notorios. Los leucocitos se vacuolan y mu-
las (Bayer). Esto tiene una gran capacidad de discri- chos muestran cambios nucleares degenerativos,
minación entre plaquetas, eritrocitos y partículas con- mientras que las concentraciones de leucocitos y de
taminantes. Esta tecnología altamente novedosa es, plaquetas disminuyen. Todo esto ocurre a mayor ve-
a la vez, muy confiable. Además brinda otros pará- locidad si la temperatura ambiente es más alta y se
metros como el VPM, el ancho de la distribución del retrasa si la sangre se mantiene a 4ºC1.
volumen plaquetario (PDW), el plaquetocrito y el Para el recuento diferencial visual de leucocitos,
componente plaquetario medio (CPM), mediciones las células individuales se clasifican adecuadamente
éstas cuyo valor clínico aún está en discusión10. cuando se estudian en las etapas más maduras. Sin
embargo, es difícil medirlas adecuadamente en frotis
sanguíneos debido a la gran variación en las fraccio-
Recuento total y diferencial de glóbulos blancos nes numéricas de poblaciones celulares. Los recuen-
El examen mediante microscopía óptica de un tos diferenciales visuales se realizan de modo rutina-
frotis teñido de sangre periférica para evaluar la mor- rio en 100-200 células nucleadas. El coeficiente de
fología de eritrocitos y trombocitos (plaquetas) y la variación al contar los leucocitos más frecuentes (es
generación del recuento diferencial de leucocitos aún decir, linfocitos y neutrófilos) puede ser mayor al
hoy resultan cruciales para el diagnóstico de enfer- 25%, pero el de las células que ocurren en fracciones
medades hematológicas1. Estos procedimientos, ade- numéricas menores al 10% (es decir, eosinófilos y
más de la determinación de recuentos celulares en la monocitos) puede ser de hasta del 100%. La obten-
sangre, tradicionalmente han sido las funciones prin- ción de resultados exactos de células que se presen-
cipales de un laboratorio de Hematología. Sin embar- tan en fracciones numéricas menores al 1% (es decir,
go, el recuento diferencial visual se reconoce como eritrocitos nucleados o basófilos) es prácticamente
una de las tareas de labor más intensa en el labora- imposible ya que el total de células evaluadas es de
torio. Para lograr buena ejecución se requiere un per- 100-200 (Tabla 4).
sonal bien preparado y muy motivado. A pesar de su A pesar de estas limitaciones, el recuento diferen-
honroso papel en el diagnóstico de enfermedades cial visual constituye el estándar para comparar re-
hematológicas, estas mediciones están plagadas de sultados obtenidos con analizadores hematológicos
errores. La confiabilidad del procedimiento debe su- automatizados. El papel del examen visual de frotis
pervisarse regularmente por encargados especializa- sanguíneos sigue siendo importante en el laborato-
dos e intercambiando extendidos con otros laborato- rio clínico, ya que los analizadores hematológicos au-
rios. Siempre que sea posible se recomienda que los tomáticos pueden rechazar un alto porcentaje de
principiantes muestren a los supervisores todas las muestras consideradas como anormales que deben
anomalías importantes, tales como leucocitosis pri- evaluarse visualmente1.
12 HEMATOLOGIA l Volumen 9 - Nº 1, 2005
TABLA 4
Error de muestreo y variabilidad estadística de recuentos
porcentuales en los recuentos diferenciales proporcionales*
* Rango 95%
posición interna de los leucocitos, mediante el uso de En relación con los aspectos tecnológicos, es im-
una sonda electromagnética de alta frecuencia al mis- portante conocer qué información brindan los dife-
mo tiempo que se medía el volumen. Los sistemas de rentes sistemas y qué tecnología usan de acuerdo
dispersión de luz también pueden ser enriquecidos con los distintos métodos descriptos por los fabri-
examinando la dispersión en diferentes ángulos. Final- cantes. La capacidad y confiabilidad de los instru-
mente, ahora es posible combinar tanto la tecnología mentos para recuentos diferenciales evoluciona con-
de apertura-impedancia como la dispersión de luz, con tinuamente.
sus varios refinamientos, dentro de un canal único5. Actualmente, luego de que se ha usado el recuen-
A modo de resumen, en la Tabla 3 se indican las to diferencial por más de 25 años, la confiabilidad y
distintas características del recuento total de blancos la exactitud del instrumental automatizado ha alcan-
y distintos aspectos del diferencial leucocitario, que zado niveles muy altos. Por ello, donde se dispone
tradicionalmente fue hecho en forma manual por re- de los mismos no es conveniente reemplazarlos por
visión microscópica de extendidos. el recuento manual basado en la revisión de solo 100
Las ventajas del método automatizado son: células. Cada laboratorio debe establecer criterios
para revisar los extendidos, basado en las alarmas del
- Disminución del error aleatorio por el gran núme- instrumento, pero por lo general la revisión está más
ro de células contadas. relacionada con la observación de la morfología de
- Disminución del tiempo de retorno por la veloci- eritrocitos o de plaquetas que a un problema en el
dad con que el instrumento hace la cuantificación. recuento diferencial leucocitario.
Pero a pesar de estos avances, aún hay necesi-
Para el recuento diferencial de leucocitos automá- dad de examinar el extendido sanguíneo para deter-
tico, el análisis de imágenes tiene una aplicación muy minar la naturaleza de un recuento anormal de po-
limitada y de comercialización reducida. En principio, blaciones leucocitarias y de la morfología de
el análisis de imagen automatiza y reproduce el re- plaquetas y de eritrocitos. En 1994 se recomendó,
cuento diferencial visual. Los frotis sanguíneos se ana- luego de un estudio definitivo, no informar discri-
lizan con óptica de alta velocidad en una plataforma minadamente los neutrófilos en banda de los
controlada por computadora. Se simulan los criterios neutrófilos totales y que era aconsejable usar el nú-
del diferencial visual con algoritmos, enumerando las mero absoluto de neutrófilos para detectar una in-
subpoblaciones celulares en forma más reproducible fección. Hay dos indicaciones para la revisión de un
y cuantitativa. Varios contadores de leucocitos por aná- extendido en caso de recuentos leucocitarios norma-
lisis de imagen fueron producidos durante los años 70 les, como el caso de un neonato con fiebre y pacien-
y al principio de los 80 (Lara de Corning Medical tes con sospecha de fiebre tifoidea. La detección de
Instruments, Hematrak de Geometric Data, Dic 4 de un recuento alto de neutrófilos en banda, asociado
Coulter Electronics, ADC-500 de Abbott Diagnostics). a un recuento de neutrófilos normal, tiene un valor
Fueron desplazados del mercado por contadores más clínico significativo14.
rápidos y completos1. Una adición interesante a la artillería diagnóstica
En los sistemas comerciales disponibles actualmen- de los nuevos contadores es la inclusión del dispositi-
te, se hacen recuentos de células sanguíneas automá- vo para hacer extendidos como el incluído en el
ticos incluyendo al menos un recuento diferencial de Coulter GEN-S. El instrumento puede ser programa-
blancos de cinco subclases. Estos analizadores usan do para producir extendidos centinela automáticamente
tecnología sofisticada y constituyen un equipamiento cuando aparece cualquier alarma para eritrocitos,
de última generación que se integra a los laboratorios plaquetas y glóbulos blancos con datos identificatorios
de rutina. Las muestras sanguíneas son procesadas en incluídos15. Otro dato interesante es la graficación de
sistemas de muestreo cerrados, usan sistemas automá- eritrocitos no lisados como en los Sysmex NE 8000 que
ticos de lectura para la identificación por código de permite detectar células resistentes a la lisis como es
barras y tienen interfases con el sistema de informa- el caso de las células en diana15.
ción del laboratorio para introducir las pruebas reque- Otra consecuencia del mejoramiento continuo del
ridas, los datos identificatorios del paciente y la obten- instrumental es que se ha podido ampliar el uso de
ción de resultados. Procesan grandes cantidades de las alarmas. Por ejemplo si no hay células inmaduras
muestras (más de 100 por hora), se pueden seleccio- o blastos, no hay necesidad de revisar el extendido
nar variantes que cubren un rango amplio de opcio- para buscar anormalidades en los neutrófilos a me-
nes informatizadas como es el establecimiento de alar- nos que el porcentaje de neutrófilos exceda el 90%.
mas, acumulación de datos de control interno y pro- Así, a comienzos de los años 90 en un centro
ducción de resultados gráficos de materiales de con- asistencial de agudos se hacían 100 revisiones manua-
trol interno y de muestras de pacientes. les y esta cifra bajó a 13%14-16.
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13. Weil GJ, Chused TM. Eosinophil autofluorescence and its use 16. Rice S, Aller R. 2- & 3-part differential hematology
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