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Capítulo 40
MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS
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La base de los métodos inmunoquímicos es la unión del antígeno y/o hapteno con el anti-
cuerpo, es una reacción específica, de alta afinidad y reversible. Está definida por una constante
de equilibrio o de asociación intrínseca (K) que es una medida de fuerza de la interacción de la
reacción para formar complejos estables.
Los anticuerpos son proteínas relativamente estables, y sus reacciones con haptenos o
antígenos pueden ser estudiados en un amplio rango de condiciones. Las modificaciones en la
constante de asociación inciden en las fuerzas que estabilizan los complejos antígeno-anticuerpo
(Ag-Ac). La reacción es dependiente de algunos parámetros como: temperatura, pH y fuerza
iónica del medio que deben considerarse al llevar a cabo un inmunoanálisis.
Los inmunoanálisis pueden ser divididos en métodos que requieren de sistemas Ag-Ac no
marcados y marcados. La mayoría de los inmunoanálisis no marcados se basan en reacciones
inmunes secundarias (precipitación). Los inmunoanálisis marcados se basan en reacciones in-
munes primarias (inmunoanálisis fluorescentes).
En el inmunoanálisis con reactivos no marcados, la interacción de antígenos solubles
macromoleculares y anticuerpos específicos llevan a la formación de complejos, que en una
relación molar equivalente precipitan en solución (precipitación). Existe una reacción anómala
llamada floculación, en que la precipitación se observa sólo en un rango muy estrecho de la
proporción Ag/Ac. La interacción de antígenos particulados con sus anticuerpos específicos pro-
ducen aglutinación. La turbidimetría y nefelometría determina niveles de antígeno o de anti-
cuerpo en baja concentración, formando pequeños agregados que producen una turbidez que
puede ser medida por disminución y dispersión de la luz incidente, respectivamente.
Los métodos de precipitación en gel detectan la presencia y/o concentración de antígenos
y/o anticuerpos por la formación de bandas, anillos o arcos de precipitado que corresponden a
complejos antígeno-anticuerpo en la zona de equivalencia (inmunodifusión doble,
inmunodifusión radial, inmunoelectroforesis, inmunofijación, contrainmunoelectroforesis,
“rocket” inmunoelectroforesis e inmunoelectroforesis cruzada).
El inmunoanálisis con reactivos marcados se clasifica en homogéneo o heterogéneo y
puede ser de dos tipos competitivo y no competitivo. El inmunoanálisis fluorescente incluye la
microscopía inmunofluorescente que corresponde a la tradicional inmunofluorescencia (IF)
que es una técnica inmunohistoquímica o inmunocitoquímica que permite la localización de
antígenos en células ó tejidos, y la detección y titulación de anticuerpos específicos; el
inmunoanálisis de fluorescencia polarizada (FPIA) que es homogéneo y competitivo; el
inmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima (ELFIA) que es heterogéneo y puede ser
competitivo o no competitivo; y la citometría de flujo que permite medir la cantidad de anti-
cuerpo monoclonal fluorescente unido en cada célula que atraviesa un láser e identificarla según
su tamaño y granularidad de acuerdo a la forma que deflecta o dispersa la luz del láser.
El enzimainmunoanálisis (EIA) se basa en dos fenómenos biológicos: reacción
inmunológica (unión Ag-Ac) y la amplificación por reacciones químicas (enzima que actúa so-
bre el sustrato). Se dispone de EIA homogéneo representado por el “enzyme-multiplied
immunoassay technique” (EMIT) que además es competitivo y de EIA heterogéneo, como el
"enzyme-linked inmunosorbent assay" (ELISA) y el "microparticle enzyme immunoassay"
(MEIA) que además son no competitivos. La electroinmunotransferencia combina la
electroforesis en gel SDS-poliacrilaminada y el enzimainmunoanálisis. El radioinmunoanálisis
(RIA) utiliza antígeno o anticuerpo, generalmente marcados con isótopos como 125I o, eventual-
mente, 131I y este inmunoanálisis puede llevarse a cabo en fase soluble o sólida.
Finalmente existe el inmunoanálisis quimiluminiscente que utiliza la emisión de luz pro-
ducida en ciertas reacciones químicas de oxidación, como por ejemplo, la oxidación del luminol
y el inmunoanálisis bioluminiscente que se basa en un sistema natural la D-luciferina/luciferasa,
en que la luciferasa cataliza la oxidación de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg+2 a
oxiluciferina, con emisión de luz a 546 nm.
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Reacción de precipitación
En medio líquido
Precipitación en tubo
Floculación
Turbidimetría
Nefelometría
Precipitación de complejos inmunes solubles
En gel
Inmunodifusión doble
Inmunodifusión radial
Inmunoelectroforesis
Inmunofijación
Contrainmunoelectroforesis
“Rocket” inmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell
Reacción de aglutinación
Aglutinación directa
Aglutinación indirecta
Aglutinación pasiva
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Figura 40-2. Inmunodifusión doble. Reacciones de precipitación en agar que ilustran reacciones de identidad, identidad parcial
y no identidad.
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Figura 40-3. Inmunodifusión doble de una muestra de orina. Se observa un elevado nivel de albúmina y ausencia de IgG, lo
que indica un posible daño inicial del glomérulo.
Figura 40-4. Cuantificación de IgG humana por Inmunodifusión radial. Curva de referencia IgG (pocillos 1 al 4) y muestras
de suero de pacientes (pocillos 5 al 8).
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Figura 40-5. Electroforesis e inmunoelectroforesis del suero de un paciente (p) con gammapatía monoclonal IgG, g. Suero
control (c), suero anti-IgG (a), suero anti IgA humana (_), suero anti-IgM humana (µ), suero anti-kappa libre humana (g) y suero
anti-lambda libre humana (h).
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Figura 40-7. Contrainmunoelectroforesis para la determinación de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos
a: Suero de conejo anti-antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos b: Sueros humanos positivos y negativos a
antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.
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Inmunoanálisis fluorescente
Microscopía inmunofluorescente
Inmunofluorescencia directa
Inmunofluorescencia indirecta
Inmunoanálisis de fluorescencia polarizada (“FPIA”)
Inmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima (“ELFIA”)
Citometría de flujo
Enzimainmunoanálisis (EIA)
EIA homogéneo. “EMIT”
EIA heterogéneo. “ELISA”, “MEIA”
Electroinmunotransferencia o “Western blot” o “Immunoblotting”
Radioinmunoanálisis (RIA)
RIA en fase soluble
RIA en fase sólida
Detección inmunorradiométrica para antígeno
Quimiluminiscencia
Bioluminiscencia
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2.2.2. Enzimainmunoanálisis
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LECTURAS SUGERIDAS
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Capítulo 41
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA
INMUNIDAD CELULAR
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La respuesta inmune celular del hombre debe ser evaluada mediante pruebas de laborato-
rio, no sólo frente a la sospecha de estados inmunes alterados, sino también frente a tratamientos
con modificadores biológicos de la respuesta y en eventuales estudios de vacunación. Frente a
cualquiera de estas situaciones, la respuesta inmune celular puede ser evaluada tanto in vivo
como in vitro. Las respuestas in vivo, se evalúan únicamente mediante pruebas cutáneas, llama-
das reacciones de hipersensibilidad.
Por otro lado, un vasto arsenal de pruebas in vitro, están disponibles, para evaluar la res-
puesta celular y la factibilidad de su uso dependen tanto del nivel de equipamiento de cada
laboratorio como de la formación de sus recursos humanos. No obstante, de manera general
ningún ensayo aislado es suficiente para un adecuado diagnóstico; una visión adecuada del
funcionamiento de la respuesta celular puede obtenerse por la combinación e interpretación de
varios métodos y parámetros.
Especial cuidado debe tenerse en el análisis, manejo e interpretación de los resultados.
Debe considerarse que los resultados obtenidos podrían variar dependiendo de la metodología
empleada, del background genético de los diferentes individuos e incluso dentro de un mismo
individuo. Por ello resulta de especial valor que cada laboratorio determine y maneje con propie-
dad los parámetros normales para cada prueba, pudiendo así acceder a interpretaciones
laboratoriales más adecuadas.
El desarrollo de ensayos sensibles para analizar la respuesta inmune celular tanto en el
hombre como en modelos experimentales ha llevado a importantes descubrimientos tanto en
inmunología básica como clínica.
En el futuro, el empleo de métodos más sensibles y específicos, sumados a la utilización de
tecnologías emergentes como los “DNA microarrays” y el estudio de proteínas (proteomica),
permitirá mejorar el diagnóstico y el pronóstico de las diferentes enfermedades infecciosas y de
base inmunólogica
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rutinariamente utilizadas para inicialmente aislar hipodensos. Debe tenerse en mente que diferen-
células mononucleares, de las cuales entre 10-20% cias funcionales han sido observadas dependien-
corresponden a monocitos. Para aislar los tes del método utilizado en la purificación. Apa-
monocitos, se usa su capacidad de adherir al plás- rentemente, eosinófilos purificados mediante se-
tico, luego de incubación por 1 h a 37 °C. El pro- paración celular magnética son menos respon-
cedimiento de aislamiento se desarrolla en esteri- dedores a lípidos quimiotácticos que las células
lidad, a temperatura ambiente, utilizando medios obtenidas por gradiente.
y material de vidrio o plástico que estén libres de
endotoxinas, debido a que endotoxinas bacterianas 2.1.6. Aislamiento de basófilos
como el lipopolisacárido (LPS) son potentes
activadores de monocitos y macrófagos. Los basófilos son los leucocitos de menor
abundancia en sangre humana y por ende su puri-
2.1.5. Aislamiento de eosinófilos ficación es relativamente difícil. Los procedimien-
tos basados en centrifugación por gradiente per-
El bajo número de eosinófilos en sangre miten enriquecer las preparaciones de basófilos
periférica de individuos normales ha hecho relati- hasta en un 50%, pero contienen una significativa
vamente difícil obtener preparaciones en número contaminación con otros tipos celulares especial-
y pureza apropiadas para estudios funcionales. mente linfocitos. Durante cualquier procedimien-
Para ello, protocolos basados en la separación de to de enriquecimiento deberá tenerse presente en
eosinófilos de neutrófilos la principal célula con- prevenir su estimulación y degranulación.
taminante, mediante densidad han sido utilizados
por largo tiempo. Estas técnicas resultan en célu- 2.2. Separación celular inmunomagnética
las de alta viabilidad, no obstante posean bajo
rendimiento y grados de pureza variable. Más aún Recientemente han sido utilizadas técnicas
la mayoría de los eosinófilos son de alta densidad basadas en la separación inmunomagnética de
(1095-1100 g/mL), por lo que presumiblemente neutrófilos, usando perlas magnéticas recubiertas
representarían poblaciones no activadas. Recien- de anticuerpo monoclonal anti-CD16. Aunque el
temente, se ha introducido la selección negativa, marcador CD16 no es exclusivamente expresado
basada en la remoción de neutrófilos por medio por neutrófilos (también está presente en algunos
de separación celular magnética usando perlas eosinófilos y en algunas células mieloides precur-
recubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD16. soras), el aislamiento inmunomagnético a partir
Este método aumenta la recuperación y pureza de de sangre periférica permite obtener preparacio-
los eosinófilos con respecto a las técnicas que uti- nes enriquecidas de neutrófilos con más de 99%
lizan gradiente de densidad. No obstante, estas pre- de pureza (figura 41-2). De igual manera, usando
paraciones difieren de las obtenidas por gradiente, perlas sensibilizadas con anticuerpos anti-CD14
ya que contienen además los eosinófilos es posible separar monocitos humanos, mientras
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minación de las diferentes subpoblaciones de antígenos CD45 y CD3, mientras que las
linfocitos, se ha transformado en un importante subpoblaciones de LT “helper” son reconocidos
método tanto en el diagnóstico como en el pro- por los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4. Las
nóstico de varias entidades clínicas, incluyendo subpoblaciones de LT citotóxicos y supresores se
la evaluación de las inmunodeficiencias y los des- definen con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD8,
órdenes inmunológicos. mientras que los linfocitos B presentan el marca-
La citometría de flujo, permite la enumera- dor CD19. Por otro lado, las células NK, se defi-
ción de diferentes tipos de linfocitos, los cuales nen por el fenotipo CD3-, CD16+ o CD56+. No
difieren en sus propiedades funcionales, su linaje es posible identificar células NK mediante un úni-
y su estado de maduración. Entonces mediante esta co antígeno, no obstante, el fenotipo CD3-/CD56+,
técnica es posible determinar los diferentes tipos incluye la mayoría de las células NK. Por ello se
de linfocitos mediante el uso de anticuerpos requiere marcación con dos fluorocromos, siendo
monoclonales marcados con substancias que existe un porcentaje de LT que son CD3+/
fluorescentes, que reconocen sus marcadores de CD56+. En esta perspectiva, el uso de anti-CD3
superficie (figura 41-4). Desde la invención de marcado con fluoresceína y anti-CD16 y anti-
los anticuerpos monoclonales, miles de ellos han CD56 marcados con otro fluorocromo (ficoeritrina
sido generados contra determinantes de superfi- o texas red) es recomendable para determinar en
cie de células hematopoyéticas. Inicialmente, gru- definitiva el fenotipo de las células NK.
pos de estos anticuerpos que demostraron pro-
piedades semejantes en cuanto a su ligación y dis- 3.1.2. Determinación de subpoblaciones de
tribución tisular fueron designados como "clusters linfocitos mediante inmunofluorescencia
differentiation" o antígenos CD (ver capítulo 45).
La identificación de estos CD en la superfi- La determinación de subpoblaciones
cie celular de los linfocitos, mediante anticuerpos linfocitarias, es también posible mediante
monoclonales, ha sido esencial en delinear los microscopía de fluorescencia utilizando
componentes del sistema inmune. Estos anticuerpos anti-CD, marcados con compuestos
anticuerpos son ahora rutinariamente usados en fluorescentes. Para ello, luego de purificar los
la identificación, recuento y separación de dife- linfocitos, se confecciona un frotis con las células
rentes subpoblaciones de leucocitos y en la clasi- fijadas, las que se incuban con los respectivos
ficación de afecciones malignas de estos anticuerpos. Al microscopio, se cuentan a lo me-
leucocitos. nos 250 células, determinando su fenotipo, me-
Los anticuerpos monoclonales usados para diante la marcación del anticuerpo. Este método
reconocer LT totales están dirigidos contra los permite calcular el porcentaje de un determinado
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fenotipo. Mediante un procedimiento un tanto más dad para así lograr una apropiada interpretación
sofisticado, como es la microscopía confocal, es de los resultados, resulta importante evaluar estos
también posible utilizar dos o tres diferentes parámetros funcionales. La importancia del aná-
anticuerpos marcados con diferentes fluoro- lisis funcional resalta porque cada vez son más
cromos. frecuentes sus aplicaciones en el diagnóstico y
monitoreo de pacientes con síndrome de
3.2. Estudio de las funciones de inmunidad ce- inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer, en-
lular específica fermedades autoinmunes y en casos de pacientes
que requieren trasplantes de órganos. De igual
Es aceptado que las características fenotípicas manera, el uso de inmunomoduladores y MRBs
de las células del sistema inmune no proveen in- en estudios clínicos precisa de un monitoreo
formación sobre su actividad. Por ello, aunque el confiable del sistema inmune por parte del labora-
análisis funcional es algo más complejo por re- torio clínico. Entonces, hoy es posible medir un
querir experiencia y adecuados controles de cali- amplio espectro de parámetros funcionales que in-
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Figura 41-5. Estudio de la proliferación de linfocitos T, mediante la incorporación de 3H-timidina al ADN. Se miden las
cuentas por minuto (cpm) incorporadas al DNA de los linfocitos T que proliferan luego del estímulo mitogénico.
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Figura 41-7. Medición de la citotoxicidad mediada por células. Células blanco marcadas con 51 Cr, son incubadas con células
efectoras (LT, células NK) HLA idénticas; luego la lisis de las células blanco se detecta cuantificando el 51Cr liberado.
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Figura 41-8. Reacción de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Células blanco incubadas en presen-
cia de anticuerpos IgG, son reconocidas por células efectoras NK que expresan receptores del tipo FcaRII y FcaRIII. Como
resultado final, la célula recubierta de anticuerpos es lisada.
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Tabla 41-1. Secuencias de partidores para la detección de algunas citoquinas humanas mediante
reacción de polimerasa en cadena
Citoquina Partidores
IL-1B S5’-TACGAATCTCCGACCACCACTACAG-3’
A5’-TGGAGGTGGAGAGCTTTCAGTTCATATG-3’
IL-2 S5’-ACTCACCAGGATGCTCACAT-3
A5’-AGGTAATCCATCTGTTCAGA-3’
IL-4 S5’-CCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCC-3’
A5’-CCAACGTACTCTGGTTGGCTTCCTTCA-3’
IL-6 S5’-AGCTCAGCTATGAACTCCTTCTC-3’
A5’-GTCTCCTCATTGAATCCAGATTGG-3’
IL-10 S5’-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3’
A5’-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3’
IL-12p40 S5’-CCAAGAACTTGCAGCTGAAG-3’
A5’-TGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3’
IL-13 S5’-TATGCATCCGCTCCTCAATCCTC-3’
A5’-CGAAGTTTCAGTTGAACCGTCC-3’
TNF_ S5’-CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAG-3’
A5’-CACCAGCTGGTTATCTCTCAGCTC-3’
IFNa S5’-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3’
A5’-ACCGAATAATTAGTCAGCTT-3’
`-actina S5’-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3’
A5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’
P5’-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-3’
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Figura 41-9. DNA microarrays. Representación esquemática de la preparación del material genético, hibridación, captura y
análisis de imágenes.
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Figura 41-10. Flujograma de la evaluación inmunológica del paciente infectado con HIV.
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