Espectrometría de Masas

Se puede usar espectrometría de masas como una técnica aislada o bien como detector acoplado
a otro tipo de técnica. El resultado que se obtiene es la huella química del analito, algo que lo hace
único. La técnica es importante porque nos permite identificar un compuesto desconocido y
confirmar que se trata de ese compuesto y no de otro. También nos permite hacer un análisis cuali
y cualitativo, tiene alta sensibilidad y provee información sobre la estructura química, el peso
molecular y las propiedades fisicoquímicas en general.

Todos los espectrómetros de masa tienen un flujo de trabajo similar.

Esto consiste en que una molécula neutra ingresa en el espectrómetro de masa, primero es
ionizado, es decir, se le entrega una energía para que se formen iones y fragmentos. Estos pasan
al analizador, que es el corazón del espectrómetro, donde son separados según su relación
masa/carga y luego llegan al detector propiamente dicho, donde se genera una señal. Finalmente
se obtiene el espectro o la huella química del compuesto.

El esquema consiste en lograr introducir la muestra, ésta pasa a la cámara de ionización donde a
partir de las moléculas neutras se forman los iones y fragmentos, luego estos llegan al analizador
ahí se ordenan en base a su relación masa carga y finalmente van al detector propiamente dicho a
partir del cual se genera la señal que nosotros vamos a poder leer.

¿Cómo vamos a introducir la muestra en el espectrómetro de masas? Podemos utilizarlo como

una técnica aislada o como una técnica acoplada a otra técnica analítica ¿De qué depende esto?
Si nosotros tenemos una muestra pura (hay un solo componente en la muestra) podemos
directamente introducirlo en el espectrómetro de masas. Esta introducción directa también va a
depender de: sí el analito que queremos evaluar es térmicamente estable, la podemos hacer por
introducción directa o calentarlo previamente e introducirlo. Ahora sí el analito térmicamente lábil
tendríamos que usar unas sondas para poder introducirlo o poner el analito en una fase
condensada y luego introducirlo en el espectrómetro de masas.

Pero bien en general, las muestras con las que trabajamos no son muestras puras sino que son
muestras que tienen una serie de compuestos o mezcla, por lo tanto, para poder utilizar el
espectro de masas para poder obtener una huella química de cada uno de los compuestos que
hay en la mezcla, esa mezcla previamente debe poder resolverse. Es acá donde nosotros
combinamos cromatografía gaseosa o cromatografía líquida de alta presión o electroforesis
capilar, con espectrometría de masas. Es decir, se utilizan las técnicas cromatográficas para
resolver los diferentes componentes de la mezcla y luego el espectrómetro de masas para
identificar y confirmar los analitos que estaban presentes en esa mezcla.

Ahora bien, logramos introducir la muestra que ingresa directamente en la cámara de ionización.
Allí lo que va a suceder es que la molécula neutra va a ser excitada, es decir, va a recibir una
determinada cantidad de energía y se van a empezar a formar iones o fragmentos. ¿Qué iones o
qué fragmentos? Depende de la cantidad de energía que le llegue a la muestra. Estos iones y
fragmentos además de depender del nivel de energía, dependen de la estructura del analito.

Obviamente existen una gran variedad de cámaras de ionización. En este esquema las cámaras
de ionización se pueden agrupar dependiendo del tipo de muestra o el nivel de energía empleado.
¿Por qué es importante la cantidad de energía? Porque de ésta va a depender el grado de
ionización y fragmentación de la muestra. Por un lado, cuanto menos energía entreguemos hay
mayor probabilidad de que se forme el ión molecular qué es el primer ión formado y es el que si
llega al detector y da la señal, cuando se grafica en el espectro nos va a dar una evidencia directa
del peso molecular (porque este ión molecular se obtiene solo por la pérdida de un electrón del
último nivel de energía). Entonces si solo quiero tener evidencia directa del peso molecular tengo
que entregar poca energía para lograr que ese ión molecular llegue al detector propiamente dicho
y en el espectro quede el pico que corresponde al ión molecular.

Si en cambio nosotros entregamos una cantidad de energía muy grande, se va a generar una
mayor cantidad de reacciones secundarias porque se va a empezar a ionizar, pero los iones que
se están formando, como hay mucha energía entregada, van a empezar a colisionar entre ellos y
se generan ionizaciones más pequeñas, fragmentaciones, transposiciones de mclafferty y todo
eso pasa al analizador y cuando se sigue al detector y se registre el espectro, en el espectro,
nosotros no vamos a encontrar el pico del ión molecular, vamos a poder calcular el peso pero
vamos a tener que primero descifrar la estructura del compuesto. Cuando los analitos tienen que
ingresar en esa cámara de ionización depende de cómo haya ingresado al equipo, es el tipo de
cámara de ionización que yo voy a elegir. Entonces si nosotros trabajamos con analitos que
entraron en fase gaseosa, lo más probable es que elija cámaras de ionización tipo el impacto de
electrones o la ionización química. Si los analitos ingresan en fases condensadas, entonces voy a
elegir como cámara de ionización los bombardeos con átomos rápidos, la espectrometría de iones
secundarios, la ionización a presión atmosférica o la desorción asistida por láser. Todas estas son
cámaras de ionización que tienen una menor energía.

Estamos en la cámara de ionización. Vimos que había diferentes tipos de cámaras de ionización.

La ionización por impacto de electrones, que recuerden era una cámara de ionización de muy alta
energía que se emplea cuando el analito ingresa en una fase gaseosa. Los espectros que se
generan, son muy reproducibles. Esto permite obtener una gran cantidad de información sobre la
estructura, pero en la mayoría de los casos, lo que no vamos a poder tener en el espectro es el
pico del ion molecular. ¿Cómo funciona? Se produce una corriente de electrones y en general esta
corriente electrones se produce con un filamento de tungsteno. Estos electrones son acelerados
por un campo eléctrico, dando un haz de electrones altamente energético. Entonces cuando la
muestra ingresa a la cámara es impactada por esos electrones, la nube electrónica de mi molécula
se empieza a distorsionar y se empiezan a perder electrones de los distintos niveles de energía, es
tan grande la energía que hay reacciones entre los iones y otros electrones entonces se producen
fragmentaciones, reagrupamientos, transposiciones. De esta manera se va ionizando y
fragmentando cada vez más la molécula que ingresó. Una vez que todo esto se formó, se regula
un campo eléctrico y todos los iones o fragmentos que tengan cargas positivas o negativas son
acelerados para que vayan hacia el analizador del espectrómetro de masas. La elevada energía
cinética genera una gran fragmentación y por lo tanto se producen un elevado número de iones
positivos, que van a tener obviamente mayor estabilidad que el ión molecular y a su vez nos van a
proveer un montón de información sobre la estructura y las energías de enlace. Tiene la desventaja
de que no puede permanecer el ion molecular. La mayor parte de las librerías que usan los
software de estos equipos fueron hechos con cámara de ionización por impacto de electrones.

Otro tipo de cámara de ionización que se usa es la ionización química. Es un poco más débil que
la ionización por impacto de electrones. Las moléculas de la muestra también están en fase
gaseosa y cuándo ingresan en la cámara de ionización se chocan o colisionan con iones que se
produjeron al bombardear un gas reactivo con electrones. Se produce una menor fragmentación
que en el impacto de electrones ¿Por qué? Porque los electrones que se producen primero
impactan sobre un gas, como puede ser el metano, isobutano o el amonio. Este gas reactivo es
ionizado recibo y los iones que resultan de este gas son los que van a chocar con el analito. Es
decir, fíjense que en la cámara ionización por impacto electrónico, el electrón producido por el
filamento de tungsteno, impactaba directamente sobre el analito de interés. Acá los electrones
producidos impactan sobre el gas reactivo y los electrones u iones que se liberan del gas reactivo
son os que impactan sobre el analito, por eso es que hay una menor cantidad de energía. Permite
obtener información sobre la masa molecular del compuesto, pero los compuestos que no son
volátiles no se pueden analizar con este método ni tampoco muchos compuestos que tienen
grupos funcionales polares. Estas son desventajas de la técnica de ionización química.

Si la muestra ingresaba al sistema en fase condensada, nosotros teníamos diferentes tipos de

cámara de ionización, una de ellas era la ionización a presión atmosférica. La muestra ingresa
disuelta en un disolvente, pasa a través de un capilar metálico que tiene en la punta una gran
diferencia de potencial. Entonces lo que pasa es que el disolvente que contiene el analito al tratar
de pasar por ese capilar, cuando llega a la punta, se genera una niebla, unas gotas como si fuera
una nebulización que tiene una alta carga. Esto va a ser que se va empiece a evaporar el solvente
y a medida que aumenta la densidad porque se me va evaporando el solvente se produce la
desorción de los iones del analito en fase gaseosa. El análisis por ejemplo por alguna de estas
técnicas y en general por electrospray, se puede provocar haciendo tanto una ionización positiva
como una negativa, de eso se realiza seleccionando la polaridad mediante el voltaje que uno le
aplica al capilar. Pero como tiene baja energía me permiten obtener datos sobre el ion molecular y
nos va a dar menos información sobre la estructura de los compuestos. En el caso de los tipos de
ionización a presión atmosférica tanto el electrospary como la ionización química, la fotoionización
y demás, son un tipo de cámara de ionización que se usan mucho cuando la muestra ingresó al
espectrómetro de masas proveniente de un cromatógrafo líquido de alta presión o un
cromatógrafo liquido de baja presión. Esto es debido a que se utiliza como una interface. En las
cromatografías líquidas en las que el analito está solubilizado en la fase móvil, para lograr reducir
la fase móvil lo que se usan son cámaras de ionización a presión atmosférica donde los solventes
de la fase móvil van siendo evaporados o se utilizan como matriz para que no ingresen al
analizador los iones de esa fase móvil. Entonces esto se utilizaría como interfaz. Es, sobre todo el
electrospray, una cámara de ionización de interface para acoplar espectrometría de masas con
técnicas de cromatografía líquida de baja presión o de alta presión.

Este es un esquema del electropray, donde nosotros vemos que el analito viene disuelto en una
disolución y al irse evaporando el solvente de esta disolución se va generando una mayor
densidad de carga y termina por eyectarse el ion del analito de interes.

Otra forma de ionizar los analitos cuando estos ingresan en fase condensada, es a través de la
desorción asistida por láser. El analito se ioniza y se volatiliza en un solo paso y la desorción es
producida por el impacto de un láser. Se utiliza una matriz, es decir, se hace una mezcla de la
muestra con una matriz y se deposita en un dispositivo porta muestra. Se evapora el solvente y se
forman unos cristales que tienen la matriz y la muestra. Esos cristales son irradiados con un haz
de láser, que tiene elevada potencia, con pulsos cortos, y a partir de eso se genera la desorción y
ionización de las moléculas de la muestra y de la matriz. Se van a mantener en fase gaseosa. A
parti de ahí, los iones de la muestra pasan directamente al analizador. Es una técnica que se
puede utilizar mucho para los analitos que son lábiles porque la matriz es capaz de absorber una
gran cantidad de energía a la longitud de onda del láser que se le hace incidir y después cuando
esa matriz sufre la relajación, le cede la energía a las moléculas de la muestra, pero se la sede en
forma controlada. Entonces permite que las moléculas de la muestra se vayan desorviendo,
quedando como iones intactos en fase gaseosa. Obviamente que se utilizan distintos tipos de
matrices dependiendo de la naturaleza del analito, por ejemplo, polímeros sintéticos, péptidos,
proteínas de alto peso molecular, que requieren de un poco más de cuidado al entregar energía.
En esta gráfica se ve que el láser apunta sobre los cristales que contienen al analito y a la matriz y
a partir de eso se van formando los iones de la molécula que son los que van a ser enfocados o
dirigidos al analizador.

En el caso de que los analitos sean compuestos polares con elevado peso molecular, otra forma
que tenemos para poder ionizarlos es el bombardeo con átomos rápidos o la espectrometría de
iones secundarios. La muestra se disuelve en un líquido inerte, polar, relativamente poco volátil,
cómo puede ser glicerol y esto actuaría como una matriz y después es bombardeada con átomos
o iones de elevada energía, es decir, pueden ser argón, xenón, cesio. Estos iones de elevada
energía son los que van a impactar sobre esa matriz o ese líquido inerte y es ese líquido inerte el
que le va a transferir la energía al analito en cuestión. Obviamente los analitos son expulsados de
la superficie de la muestra por un proceso de desorción y esto también reduce la fragmentación,
es decir, es una cámara de ionización con baja energía.

Bien, vimos que hay distintas maneras de que la muestra ingrese al espectrómetro, que hay
distintos tipos de cámaras de ionización según como ingresa la muestra o el nivel de energía que
entreguemos. Ahora los iones o fragmentos formados pasan al analizador de masas. Éste es el
corazón del espectrómetro. Su funcionamiento va a depender del diseño pero todos tienen dos
funciones importantes: separar a los iones o fragmentos según su relación masa/carga y
enfocarlos para que lleguen a un punto determinado en el detector (ordenados).

El movimiento de las partículas cargadas permite distinguir unas de otras en función de la energía
cinética de cada una de esas partículas, de la velocidad y de la trayectoria, es decir, el recorrido
que hacen esas partículas en el campo eléctrico (le da la energía cinética) o magnético (le da la
trayectoria).
Los analizadores más utilizados son el cuadrupolo, trampa de iones, tiempo de vuelo, sector
magnético. Todos trabajan de la misma manera. ¿De qué depende su elección? De la resolución
que uno quiere, el intervalo de masas que se va a separar y del tipo de barrido.

Es decir que uno va a elegir el analizador de masas dependiendo el tipo de análisis que pretende
hacer. En muchas ocasiones no es posible elegir un analizador que dé respuesta a todas las
expectativas que uno tiene. En ese caso se recurre a las nuevas tecnologías, que es usar
espectrometría de masas tándem, donde cada tándem que tenga el espectrómetro va a darnos la
posibilidad de poner en serie diferentes tipos de analizadores.

Hay analizadores de tipo continuo y por pulsos. Solamente vamos a hacer referencia a algunos de
ellos, a los más usados.

El cuadrupolo es un analizador que tiene una alta velocidad de escaneo. Es muy compacto, lo
cual hace que podamos trabajar con un equipo que ocupe muy poco espacio y eso hoy por hoy en
los laboratorios se tiene muy en cuenta. Consiste en cuatro barras paralelas, que forman un
cuadrado, a las que se les aplica un voltaje y esto hace que entre ellas se forme un campo
magnético. Entonces, si vamos alternando la fuerza de ese voltaje, podemos ir ordenando los
iones y fragmentos en base a la relación masa/carga. Es decir, las partículas con una determinada
masa/carga pasaran directamente siguiendo por el recorrido entre esas barras, y las que no tienen
esa relación masa/carga seleccionada, chocaran con alguna de estas barras y seguirán por el
sistema de vacío. Entonces, regulando de a poco el voltaje y la radiofrecuencia, vamos a ir
colectando los diferentes fragmentos o iones. Primero colectaremos unos, luego otros y asi vamos
haciendo un barrido y un escaneo hasta lograr colectar todos los iones o fragmentos que se hayan
formado y que nos interesen evidenciar en el espectro del compuesto.
El sector magnético tiene una gran resolución, un amplio rango de masas y una gran velocidad de
escaneo. Los iones o fragmentos son ordenados según su momento, es decir, estos fueron
acelerados primero por un campo magnético que les entregó una determinada energía cinética.
Esa energía cinética hace que vayan ‘volando’ por un tubo, el cual está sometido a un campo
magnético. Entonces cuando el ion ingresa en ese campo, su trayectoria se curva y yo voy
poniendo la celda del detector para que colecte los que siguen una trayectoria con un radio x.
Cambiando la posición de la celda del detector yo voy a ir colectando en diferentes momentos los
distintos iones o fragmentos que se vayan produciendo. Cuando más livianas son las partículas,
mayor es la deflexión. Entonces si nosotros siempre mantenemos la aceleración constante, lo que
tenemos que hacer es cambiar la fuerza del campo magnético o cambiar la posición de la celda
del detector. Una mejora a esto es el doble enfoque. Emplea también una combinación de campos
eléctricos y magnéticos. Los iones o fragmentos primero pasan por un campo eléctrico que les
entrega energía cinética, luego pasan a un campo magnético que desvía su trayectoria.
Finalmente pasan por otro campo eléctrico, que permite aumentar la resolución.

En el tiempo de vuelo los iones son acelerados en la entrada del analizados y viajan por un tubo
que tienen uno o dos metros de altura. Como a todos se le entrega la misma energía cinética, la
velocidad con la que vuelen depende de la relación masa/carga de cada uno. Una vez que volaron
por ese tubo, son colectados por el detector. Los iones producidos viajan de forma libre lo que
hace que no sea buena su resolución porque iones que tiene poca diferencia entre si se
diferencian solo por la energía cinética, y al tener una masa similar, la energía cinética también va
a ser similar, al igual que la velocidad de vuelo. La ventaja es que son equipos robustos y más
simples.

En la trampa de iones, a medida que los iones se van produciendo, van siendo atrapados antes de
que lleguen al detector. Van girando en círculo con un voltaje y una radio frecuencia determinada.
A medida que van girando, van siendo eyectados de esa trayectoria circular para poder ser
enfocados en el detector propiamente dicho.
 Hay diferentes tipos de detectores propiamente dichos. Proporcionan información sobre los iones
que van llegando y la abundancia de cada uno de esos iones que salen del analizador. Convierte
la señal que genera ese ion, en una señal amplificada y almacenada y mediante un software
específico se genera un registro. Su característica más importante es su elevada resolución,
sensibilidad y exactitud. Como se genera una gran cantidad de información, lo más importante es
que estén acoplados a un sistema informático que permita adquirir datos lo más rápido posible y
presentar espectros que van a ser automáticamente comparados con librerías o bibliotecas
espectrales que el mismo software tiene incorporado.

El espectrómetro colecta todos los iones o fragmentos que se fueron formando ordenados según
su relación masa/carga y va midiendo las abundancias. Lo que nos deja ver es la sumatoria de
todas las abundancias que lo grafica a modo de pico. En la pantalla vamos a ver un cromatograma
abundancia vs tiempo de retención.

 Si era una muestra pura vemos un solo pico. Para poder ver el espectro o la huella química,
hacemos un doble click en el pico.

El equipo registra estos picos que se van formando y los va sumando. Entonces una vez que tiene
el espectro, lo compara con una biblioteca espectral. En ésta están almacenados todos los
espectros de todos los compuestos. Hace una comparación y ve el porcentaje de coincidencia que
hay entre el compuesto desconocido y los espectros de librería. Nos arroja una tabla donde están
los compuestos cuyos espectros se asemejan al compuesto analizado con el porcentaje de
confianza. Esto es lo que nos permite afirmar que se trata de un compuesto y no de otro.

 Si tenemos una mezcla compleja, previamente tenemos que resolver los compuestos mediante
una técnica cromatográfica (por ejemplo). Así los compuestos van eluyendo y van ingresando de a
uno en la cámara de ionización. Vemos los picos de los distintos compuestos que se fueron
resolviendo. Al hacer doble click en los picos vemos la huella química de cada uno de ellos.
Si acoplamos cromatografía líquida, las bibliotecas espectrales van a tener que estar hechas por
uno mismo. Como el analito está solubilizado en una fase móvil y las características de esa fase
móvil varian, es muy difícil armar librerías para cada condición de corrida.

Para poder colectar datos tenemos dos modos de adquisición. El modo SCAM, donde se hacen
barridos entre dos masas y permiten tener una información total del contenido de la muestra a
analizar. Se usa para hacer análisis cualitativos para identificar todos los compuestos por
búsqueda en las librerías. En el modo SIM se hace un monitoreo de algunos iones en particular.
Es una monitorización selectiva de iones característicos. El detector es más sensible y más
selectivo.

Espectrometría de masas como técnica aislada tiene varias limitaciones. Los compuestos no
pueden ser caracterizados si no están puros porque si hay una muestra compleja, a la cámara de
ionización entran en simultáneo más de un compuesto por lo tanto, los iones y fragmentos que se
forman son de más de un compuesto. Cuando evaluemos el espectro que se obtiene con los de la
librería, no vamos a poder identificarlos. Para solucionar este problema surge la EM tándem, que
se basa en relaciones de filiación de compuestos. Nosotros vamos a tener una cámara de
ionización con muy baja energía para solamente obtener el pico del ion molecular de cada uno de
los componentes de la mezcla. Esos iones moleculares pasan al analizador y se separan según
su relación masa/carga. Luego pasan a una segunda cámara de ionización donde se le entrega
energía a cada ion molecular, que van entrando de a uno porque fueron separados en el
analizador. Ahí se forman los iones ‘hijos’. Estos iones ‘hijos’ pasan a un segundo analizador
donde se resuelven entre sí. Finalmente llegan al detector. Así se obtiene el espectro de cada uno
de los componentes. Se puede hacer EM tándem con tantos analizadores como uno quiera.

La combinación de dos técnicas genera una información única, integral y completa sobre la
composición de la muestra. Hay requisitos que se deben cumplir para poder acoplar dos técnicas.
Uno de ellos es la compatibilidad, la independencia de método, que las técnicas basen sus
separaciones en mecanismos que son muy diferentes uno de otro para que esto aporte mayor
cantidad de información, y la complementariedad para poder obtener una información más amplia
y para que la interpretación de los datos sea mucho más sencilla.
El acoplamiento de cada una de las técnicas (como cromatografía gaseosa, HPLC, electroforesis)
va a ser diferente porque, por ejemplo en cromatografía gaseosa si trabajamos con columnas
capilares este acoplamiento es mucho más sencillo, en HPLC al trabajar con alta presión vamos a
tener que hacer una reducción importante de la presión y al venir la sustancia disuelta en fase
móvil vamos a tener que utilizar cámaras de ionización que nos permitan eliminar gran parte de
esa fase móvil.

El acoplamiento ideal con cromatografía gaseosa es la utilización de columnas capilares que

tengan un pequeño flujo de gas y esto se introduce debidamente termostatizado a la cámara de
ionización. Entonces con un sistema de vacío el espectrómetro puede eliminar el gas portador y
sirve para todas las moléculas que sean pequeñas, volátiles y térmicamente estables.
Cromatografía gaseosa va a permitir separar los componentes de la muestra mientras que
espectrometría de masas nos va a permitir identificar, cuantificar y confirmar que se trata de un
analito y no de otro.
En el esquema general, la muestra sería inyectada en el cromatógrafo de gases, pasaría por una
interface e ingresaría en la cámara de iones. Luego los iones o fragmentos formados pasarían al
analizador de masas y al detector propiamente dicho.
Todo el equipo está controlado por una unidad central de control donde se establecen los
parámetros de la corrida cromatográfica y los parámetros del espectrómetro de masas, y es donde
se va a hacer el análisis de todos los datos obtenidos.
La interface permite, por ejemplo, que el gas carrier tienda a difundir más rápido que el analito y
así solo el analito ingresa a la cámara de ionización. Es importante tener en cuenta que ay un gran
sistema de vacio y que tenemos que controlar cual es el diamtro del capilar del cromatografo de
gases como para lograr que esta interface permita el mejor acoplamiento de ambas técnicas.