PRÁCTICA: DETERMINACIÓN DE LA TASA ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO

DE UN CULTIVO PURO DE Bacillus subtilis. EN CALDO ALMIDON

EXTRACTO DE LEVADURA

I. INTRODUCCIÓN:
El crecimiento es definido como un incremento ordenado de todos los
constituyentes y estructura celular. En muchos microorganismos, este
incremento continuo hasta que la célula se divide en dos nuevas
células por fisión binaria. El crecimiento microbiano conlleva
usualmente a un incremento en el número de células y es importante
distinguir entre el crecimiento individual de células y el crecimiento de
poblaciones de células: crecimiento individual, es el incremento en el
tamaño y peso, y es usualmente un preludio a la división celular,
mientras que el crecimiento poblacional, es el incremento en el número
de células como una consecuencia del crecimiento y división celular.1

La velocidad específica de crecimiento, se define como el cambio del

número de células o masa por unidad de tiempo, mientras que la
generación, como el intervalo para la formación de dos células
provenientes de una. En tanto que, el tiempo de generación es el
tiempo que tarda una población en duplicarse o también se puede
definir como la cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo
de división.1

Las bacterias de género Bacillus son aislados del suelo, que participa
conjuntamente con otras bacterias en las primeras etapas de
descomposición de la biomasa vegetal y que mediante el uso de
carbohidratos extracelulares degrada varios polisacáridos presentes
en estos materiales. Este género microbiano tiene capacidad de
utilizar el almidón como fuente carbonada para su crecimiento,
desarrollo y reproducción, en forma paralela se sabe que las bacterias
excretan amilasas con el afán de hidrolizarlos y que constituyen
comercialmente los extractos enzimáticos que pueden ser utilizadas
en la industria a gran escala.2
II. OBJETIVO:
Determinar la tasa específica de crecimiento de un cultivo puro de
Bacillus subtilis En caldo Almidón Extracto de levadura (CAEL)

III. MATERIAL:

3.1. Material Biológico:

 Cultivo puro de 72 hr de Bacillus subtilis.
3.2. Medios de cultivo:
 Caldo almidón Extracto de levadura (CAEL) o diferentes
concentraciones de almidón (0.25x0.5x0.75x1.00)
 Agar Nutritivo
 Agar para recuento en placas
3.3. Reactivos:
 Set de Gram
 Aceite de cedro
3.4. Equipos:
 01 microscopio de luz compuesto
 01 incubadora calibrada a 35ºC
 01 Contadora de Colonias
 01 Cocina eléctrica
3.5. OTROS:
 Algodón
 Papel de molde
 Plumón de tinta indeleble
 Pabilo

IV. PROCEDIMIENTO:
4.1. Del desarrollo del cultivo puro de Bacillus sp en agar
nutritivo de 72 h. hacer una suspensión turbia igual al tubo
Nº3 de Mc Farland. Comprobar pureza dde la suspensión
 bacteriana (col. De Gram y hacer la observación a mayor
aumento)
4.2. De la suspensión anterior hacer una dilución 10-3 e inocular
5 ml en cada uno de los cuatro matraces conteniendo 45 ml
de CAEL con diferente concentración de almidón (0.25, 0.5,
0.75 y 1.0 %)
4.3. Llevara a incubar a 35ºC y hacer las tomas de muestra a
las 0, 4, 8, 12, 24 horas. Hacer diluciones, según cuadro, y
hacer los recuentos microbianos por el método del recuento
en placa por incorporación.
4.4. Después de incubar por 48 horas hacer los recuentos de
colonias e informar del número de Unidades Formadas de
Colonias (UFC/ml).
4.5. Hacer un ploteo del número de UFC/ml versus tiempo y
obtener las tasas específicas de crecimiento en cada una
de las concentraciones de almidón.

V. DIAGRAMA DE FLUJO:

SUSPENSIÓN BACTERIANA

(Cultivo de 72 h Bacillus sp)

INOCULACIÓN DE CALDOS CAEL

(Diferentes % de Almidón)

RECUENTOS MICROBIANOS

(0, 4, 8, 12 y 24 horas)

OBTENCIÓN DE 𝜇

A diferentes concentraciones de S

OBTENCIÓN DE PARÁMETROS

CINÉTICOS
 TIEMPO DILUCIONES
0 10-4 y 10-5
4 10-6 y 10-7
8 10-7 y 10-8
12 10-9 y 10-10
24 10-11 y 10-12

Fórmulas para obtener m y b para corrección de datos

𝑌 = 𝑚𝑥 + 𝑏

𝑛(∑ 𝑥𝑙𝑜𝑔𝑦) − ∑ 𝑥 (∑ 𝑙𝑜𝑔𝑦)

𝑚= 2
𝑛(∑ 𝑥 ) − (∑ 𝑥)2

2
(∑ 𝑙𝑜𝑔𝑦)(∑ 𝑥 ) − ∑ 𝑥 (∑ 𝑥𝑙𝑜𝑔𝑦)
𝑏= 2
𝑛(∑ 𝑥 ) − (∑ 𝑥)2

µ = m (2.303)

VI. RESULTADOS:

Tabla 01. Recuento de Bacillus subtilis (UFC/ml) en 24 horas y a diferentes

concentraciones de almidón.

Concentración de almidón (%)

Tiempo (h) 0.25 0.50 0.75 1.0
0 5.85 x 106 5.85 x 106 5.85 x 106 5.85 x 106
4 1.00 x 106 9.00 x 106 1.00 x 106 1.45 x 107
8 2.15 x 1010 2.50 x 109 5.75 x 1010 1.04 x 1010
12 2.45 x 1011 4.25 x 1010 1.85 x 1010 2.16 x 1011
24 6.50 x 1011 2.40 x 1011 7.50 x 1011 3.70 x 1011
Tabla 02. Corrección de datos del recuento de Bacillus subtilis (UFC/ml) en la
concentración 1.0%, aplicando la fórmula de mínimos cuadrados.

TIEMPO(x) RECUENTO(y) Log y x log y X2

1 4 1.45 x 107 7.14 28.56 16
2 8 1.04 x 1010 10.01 80.08 64
3 12 2.16 x 1011 11.33 135.96 144
∑ 24 28.48 234.6 224

Tabla 03. Datos corregidos del recuento de Bacillus subtilis a la concentración

1.0% de almidón, para realizar la gráfica.

TIEMPO Yc Antilog
Yc
1 4 8.64 4.4x 108
2 8 9.48 3x 109
3 12 10.32 2x 1010

Yc = mx + b  Y = 0.214x + 7.80

Con los datos obtenidos se realizó la pendiente que representa el crecimiento

del cultivo de Bacillus subtilis en fase logarítmica, teniendo de sustrato almidón
a concentración 1% (grafica 1).

Tabla 04. Tasa especifica de crecimiento (µ) en las diferentes concentraciones.

Concentración de Valor “m” Tasa especifica de

almidón (%) pendiente crecimiento (h-1)
0.25 0.243 0.456
0.50 0.203 0.470
0.75 0.219 0.505
1.0 0.214 0.493
VII. COMENTARIO

Determinar la tasa especifica de crecimiento, también llamada

velocidad especifica de crecimiento, es importante para conocer la
cinética de crecimiento del cultivo evaluado, en este caso Bacillus
subtilis, necesaria para predecir el crecimiento, como una bacteria
consume el sustrato y acumula los productos de su metabolismo.

Bacillus subtilis tiene como hábitat natural el suelo y se encuentra

ampliamente distribuido en la naturaleza, entre sus principales
características se encuentra su capacidad de crecer en un intervalo
amplio de temperaturas desde 15 hasta 55 °C, presentar motilidad,
aerotaxis y velocidades de crecimiento altas, sobrevivir en
concentraciones salinas (hasta el 7% de NaCl), y producir una amplia
variedad de antibióticos y enzimas hidrolíticas extracelulares.2

El crecimiento Bacillus subtilis y la expresión enzimática están

fuertemente influenciados por la composición del medio de cultivo,
principalmente por la fuente de carbono y nitrógeno. El almidón como
sustrato induce la producción de amilasas.

Las amilasas son enzimas extracelulares que catalizan la hidrólisis de

enlaces glucosídicos α-(1-4) con retención de la configuración del
carbono anomérico, a partir de polímeros de glucosa, como el almidón
y glucógeno. Tienen aplicaciones en diversos sectores: textil, papel,
panificación, fermentación, producción de energéticos, preparación de
ayudantes digestivos y farmacéuticos. Su principal aplicación es la
producción de jarabes de glucosa, maltosa, maltotriosa, dextrina y/o
fructosa. Biotecnológicamente, son las enzimas más importantes ya
que representan cerca del 30% del mercado mundial de enzimas.2

VIII. CONCLUSIONES
Se determinó la tasa específica de crecimiento de un cultivo puro de
Bacillus subtilis en Caldo Almidón Extracto de levadura (CAEL) con
diferentes concentraciones de almidón.
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. Madigan M, Martinko J, Parker J. Biología de los
microorganismos. 10ma ed. Edit. Pearson Prentice Hall S.A.
Madrid. España 2006
2. Avalos Zavaleta R, LLenque-Díaz L, Segura-Vega R. Aislamiento
y selección de cultivos nativos de Bacillus sp. Productor de
amilasas a partir de residuos amiláceos del mercado Hermelinda,
Trujillo, Perú. REBIOL, 2016;36(2): 16-26.

X. ANEXOS

Determinación de la “pendiente” (m) y “b” a la concentración de

1.0%

(3)(234.6)−(24)(28.48)
𝑚= = 0.21
(3)(224)−(24)²

(28.48)(224)−(24)(234.6)
𝑏= = 7.80
(3)(224)−(24)²

Y = mx + b  Y = 0.21x + 7.80

Determinación de la tasa especifica de crecimiento (µ) en las

diferentes concentraciones

µ = m (2.303)

µ0.25= (m0.25) (2.303)  µ0.25= (0.243) (2.303) = 0.456 h-1

µ0.50= (m0.50) (2.303)  µ0.50= (0.203) (2.303) = 0.470 h-1

µ0.75= (m0.75) (2.303)  µ0.75= (0.219) (2.303) = 0.505 h-1

µ1.0= (m1.0) (2.303)  µ1.0= (0.2142) (2.303) = 0.493 h-1