Tema 6: Crecimiento microbiano

Cátedra: Microbiología General y de los Alimentos

Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales

Crecimiento celular:

Es el incremento ordenado de todos los componentes de la

célula viva y conduce a un aumento del Nº de células y por lo
tanto de la masa celular.

Nutrientes Productos de desecho

Energía para
el desarrollo
Anabolismo Energía para
(biosíntesis) movto., transp.
Nutriente, etc.

Catabolismo
Componentes celulares

Fuente de energía
 Crecimiento microbiano

Modalidad
Factores del cultivo
genéticos
Condiciones
del cultivo

C. batch

C. continuo
•Temperatura.
C. fed - batch
•Comp. del medio de cultivo.

* pH
CULTIVO BATCH

Es un sistema cerrado, no hay ingreso de nutrientes ni egreso de productos.

Los microorganismos unicelulares crecen según la denominada “curva de
crecimiento microbiano”.
Esta curva describe el ciclo completo del crecimiento celular y se divide en
distintas fases:
La curva de crecimiento se divide en las siguientes fases:

1. Fase de retardo o de latencia ( fase “lag”):

Es el período de tiempo durante el cual el inóculo se adapta a las

condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado.

Si el inoculo proviene de un cultivo en crecimiento activo y en el mismo

medio, esta será despreciable.
Si el inoculo es un cultivo viejo, esta fase será larga.
Cuando se transfieren células de un medio rico a uno pobre esta fase
será larga.

2. Fase de crecimiento exponencial (fase logarítmica)

El incremento por unidad de tiempo de la masa celular, Nº de células, se

mantienen en un valor constante.

Crecimiento balanceado o equilibrado.

La velocidad de crecimiento aumenta exponencialmente y esta

influenciada por las características genéticas del microorganismo y por las
condiciones ambientales (pH, temperatura, sustrato, etc.)
El crecimiento exponencial continúa hasta que un nutriente del medio se
agota o se acumulan productos tóxicos del metabolismo.

3. Fase de desaceleración

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase de desaceleración puede

ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas
(ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los
hidratos de carbono).
 4. Fase estacionaria:

En la fase estacionaria no hay aumento del número de células. Pero aún

ocurren reacciones metabólicas (ej. metabolismo energético y algunos
proceso biosintéticos).

5. Fase de muerte exponencial: Se produce la muerte y en algunos casos lisis

celular. Se debe al agotamiento de reservas de energía.
 Velocidad de crecimiento microbiano

Se define como el cambio en el número de células o masa celular por

unidad de tiempo.

dx o dN/dt = µ . N (ec. 1)
rx = = µ .x (g/l.h)
dt

Donde:

N = número de células (nº cél./ml).

x = concentración celular o biomasa seca (g/ml).

t = tiempo de incubación (h).

µ = velocidad específica de crecimiento (h-1) (característico para cada

microorganismo en cada medio determinado).
Crecimiento en fase exponencial:

µ = µm

El microorganismo crecerá a µm máximo y constante, la ec. 1 se reduce a:

dx
rx = = µm ⋅ x (ec. 2)
dt

Integrando la ec. 2 y suponiendo que a t = 0, x =x0 se obtiene:

o Ln N = ln No + µm . t (ec. 3)
ln x – ln xo = µm. t

Si se grafica ln x frente al tiempo (ec. 3) se obtiene una línea recta cuya pendiente es µm

Si hubiera fase lag la ec. 3 queda: ln x – ln x0 = µm. (t - tlag)

 xf = xo . eµm.t (ec. 4)
La ec. 3 puede ser descrita:

Nf = No . eµm.t

X (o N) varían exponencialmente con el tiempo (crecimiento exponencial o

logarítmico).

400
XoN 3500
Pendiente en
3000
cada punto:
2500
2000
dx
1500 rx =
1000 dt
500
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo

Durante el crecimiento exponencial la velocidad de crecimiento (rx) es

inicialmente lenta pero se incrementa con el tiempo.
 En la fase exponencial el crecimiento microbiano es una progresión
geométrica de base 2.

Nº de células Nº de Generación
células
1 0
N = N 0 . 2n
2 21 1
Siendo:
4 22 2 N = nº final de células/ml.
8 23 3 No = nº inicial de células/ml.
16 24 4 n = nº de generaciones
N 2n n

400
3500 Tomando logaritmos : ln N = ln N0 + n. ln 2
3000
2500 Por lo tanto: n = (ln N - n N0) / ln 2
2000
1500
1000
Se puede calcular el número de veces que la
500 población se duplica (número de generaciones, n)
0 en el tiempo t.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Nº de generaciones a un tiempo t: n = t/ td
Tiempo de generación (tg) o de duplicación (td)

Tiempo de generación es el tiempo que transcurre para que la población se

duplique (también llamado tiempo de duplicación td).
Depende de factores nutricionales y genéticos.

Considerando x = 2 xo y reemplazando en la ec.3 se obtiene:

ln 2 x0 = ln x0 + µm . td ln 2
td =
µm

Además:

Nº de generaciones a un tiempo t: n = t/ td
Crecimiento en fase desaceleración y estacionaria

dx µ < µm
rx = = µ .x
dt
Fase Velocidad de
crecimiento
específica
Lag µ≈0

Aceleración µ<µmax

Exponencial µ≈ µmax

Declinación µ< µmax

Estacionaria µ=0

Muerte µ<0

Curva de Crecimiento en forma batch

Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de crecimiento

Monod ha propuesto una relación muy simple entre el valor de µ y la

concentración de sustrato limitante.

Sustrato limitante es aquel componente del medio de cultivo que primero se agota
(FCE, fuente de N, C, algún aminoácido etc.)

Ecuación de Monod: µm

s
µ = µm (ec. 5)
ks + s
s = ks
s
Siendo:

S: concentración de sustrato limitante (g/l).

Ks: constante de saturación (g/l), representa la concentración de sustrato
cuando µ = µm/2.
µ: velocidad específica de crecimiento (tiempo-1).
µm la velocidad específica máxima de crecimiento (tiempo-1).
 En la gráfica de la ec. de Monod se observan dos zonas:

a) Zona A-B: siendo s>> ks y µ = µm (cultivo irrestricto). Sustrato saturante

b) Zona B-C: S se va agotando y S ~ ks, µ = f (S), en esta zona juega la

ecuación completa de Monod.

C
µ = f (s ) B µ ≠ f (s ) A
µ
µm

S >> 10 kS
µ= µm = cte.
Zona sustrato saturante
S << ks Cuando s >> ks, µ = µm
µ < µm

s = ks
s
rx = µm.x

Figura 2: efecto de la concentración de sustrato limitante en la velocidad específica

de crecimiento.
En cultivo batch

S 0
µ = f (s) < µm rx = 0 Cultivo
x µ irrestricto:
Fase logarítmica
µm
S >> 10 kS

S >> 10 kS µm = cte.
µ= µm = cte.
rx = µm.x
t s = ks
s
Fase de
desaceleración

Fase de crecimiento logarítmico

En un cultivo batch al comienzo (t = 0) µ = µm hay exceso de sustrato.

No se puede controlar el crecimiento del microorganismo y µ = µm = cte.

Fase de desaceleración:

A medida que el cultivo transcurre, S disminuye hasta que llega a ser

comparable a ks.

La velocidad específica (µ) irá disminuyendo según la ecuación de

Monod.

s dx s
≠1 µ ≠ µm rx = = µm ⋅x
ks + s dt ks + s

Fase estacionaria:

Finalmente S = 0 en el cultivo: µ =0

dx dx
rx = = µ .x rx = =0
dt dt

No se acumulan más células en el reactor y se está en la fase estacionaria.

 Que tan constante es µm?

La velocidad específica máxima (µm) es constante pero depende del:

pH, temperatura, medio de cultivo.

Para un microorganismo dado, si fijo el pH, la temperatura, y el medio de

cultivo, µm será constante mientras el sustrato limitante esté en exceso.

 Efecto de la temperatura sobre la velocidad específica del crecimiento
microbiano
Los microorganismos están divididos en tres clases dependiendo de su
temperatura óptima de crecimiento:

Psicrófilos (< 20 °C), mesófilos (20 – 37 °C), termófilos (>38 °C).

Un aumento de la T, provoca un aumento de la veloc, de reacción (según ec.

de Arrhenius). Pero aumentos posteriores de T inactivan las enzimas que
catalizan las reacciones, con lo que el valor de µm disminuye.
Efecto del pH sobre la velocidad específica de crecimiento microbiano

Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de pH.

Cada microorganismo tiene un pH óptimo para el crecimiento:

Las bacterias tienen un pH óptimo cercano a 7.
Los hongos y levaduras de alrededor de 5.
Valores de µm para diferentes microorganismos:

Bacterias a 0,9 h-1

Levaduras 0,45 h-1

Hongos 0,25 h-1

CULTIVO CONTINUO

El cultivo continuo es un sistema de cultivo abierto, con volumen constante al

que se añade continuamente medio fresco y del que se retiran células y
productos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la

concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes.

El sistema está en estado estacionario µ = D

Los parámetros a tener en cuenta son:

* Fujo (F), medido en ml/h.

* Volumen de la cámara de cultivo (v, en ml).

* Densidad celular en la cámara (x).

* Factor de dilución D = F/v (en h-1).

 METODOS PARA MEDIR EL CRECIMIENTO MICROBIANO:

Determinación del peso seco:

MÉTODOS DIRECTOS: Recuento de células totales (recuento

directo):

Método del Recuento en Placa

MÉTODOS INDIRECTOS: Medida de la turbidez (ópticos):

MÉTODOS DIRECTOS:

1. Determinación del peso seco:

Suspensión celular, se separan las células por centrifugación, se lavan y secan en
estufa hasta peso constante.

2. Recuento de células totales (recuento directo):

Cámaras de recuento especiales (Neubauer, Petroff-Hauser). Son portaobjetos
excavados de volumen perfectamente conocido cuando se sella herméticamente con
cubreobjetos resistentes.

Limitaciones:
Poco sensible, se requiere una concentración
de 107 cel/ml, o más para que se pueda
observar una célula en el campo microscópico.

Se cuentan tanto células vivas como muertas

(recuento total).

Ventajas: rápido y poco material implicado.

3. Método del Recuento en Placa

Se basa en la capacidad de una célula viable de formar una colonia en un medio de

cultivo adecuado Standard (PCA). Por lo tanto se cuentan colonias, cada una proviene
de una sola célula viable.
(Célula viable: capaz de dividirse y formar células hijas.)

a) Método de extensión en placa (o en superficie):

0,1 ml de la suspensión celular se extiende sobre la superficie de la placa usando una
espátula de Drigalski. La placa se incuba y se cuentan las colonias.
b) Método de vertido en placa (en volumen). 1 ml de la suspensión en la placa y se
agrega el agar fundido a 45 ºC.
 Nº de colonias: 30 a
300 col./placa.

Ventajas:
* Elevada sensibilidad, se pueden contar muestras con pocas células.
* Determina sólo microorganismos viables.

Desventajas:
* Las colonias deben provenir de 1 sola célula (problemas con microorganismos que dan
grumos o cadenas).
* Precisa distintos medios para diferentes microorganismos.
MÉTODOS INDIRECTOS:

Medida de la turbidez (ópticos):

En una suspensión celular, las células difractan ( o dispersan) la luz

incidente en forma proporcional a su concentración.

Espectrofotómetro
(mide la luz
transmitida).

Ventajas: Precisas, dentro

de ciertos límites, rápidas
y fáciles de utilizar. Densidad óptica: OD= Log I0 / I
I0: luz incidente
I: luz transmitida (no dispersada)

Requiere la construcción de una curva de calibración.

Problemas:

1. Comenzando con 4 células bacterianas/ml en un medio rico, con un tlag

de 1 h de adaptación y un tiempo de generación de 20 min. ¿Cuántas
células habrá luego de 2 h de incubación?

2. Determine el número de generaciones que han transcurrido durante el

crecimiento exponencial de un cultivo microbiano (n) si se partió de una
población inicial (N0) de 2.107 células y se obtuvo una población final (N) de
4.107 células, luego de 6 h de cultivo.

3. Calcule el tiempo de generación en un experimento de crecimiento en el que

el medio se inoculó con 5.106 células/ml de Escherichia coli y después de 1
h de fase de adaptación, creció exponencialmente durante 5 h, siendo
entonces la población de 5.109 células/ml.

4. La velocidad específica máxima de un microorganismo desarrollado

aeróbicamente en cultivo batch es de 0,327 h-1. Suponiendo que el período
de latencia es despreciable, calcule la concentración de biomasas (x) que
se obtiene a las 12 h de proceso, partiendo de una concentración de 0,2 g/l
de células secas (x0).
5. La concentración celular en un cultivo puro de bacterias alcanza su valor
máximo de 6,67 g/l. Si la velocidad máxima de crecimiento es de 0,432 h-1 y
se parte de un inóculo de 0,2 g/l, calcule el tiempo que demandó el proceso
(suponga despreciable la fase lag).
Cuestionario

1.Represente el crecimiento microbiano de un organismo unicelular en un

cultivo batch. Describa las fases del crecimiento microbiano

2..¿Qué entiende por crecimiento balanceado o equilibro y en que fase de la

curva de crecimiento se lo obtiene?.

3. Represente la velocidad de crecimiento microbiano durante la fase de

crecimiento exponencial en su forma aritmética y semilogarítmica.

4. ¿Por que las células entran en fase estacionaria?.

5. ¿Cómo se pueden disminuir los tiempos en la fase de latencia?.

6. Defina tiempo de generación y obtenga la expresión que permita medir

el tiempo de generación

7. Qué métodos directos e indirectos utilizaría para medir el crecimiento

microbiano?. Describa uno de ellos.