FECHA 23/5/12

GRUPO 9
SUBGRUPO ɛ

PRACTICA G: CROMATOGRAFÍA DE GASES.

OBJETIVOS:
Determinar el contenido porcentual de limoneno en una muestra
Parte A:
Evaluar la Influencia de la temperatura en la separación de una mezcla de sustancias.
Parte B:
Determinar el contenido porcentual de limoneno en una muestra, utilizando los métodos de
patrón interno y calibración directa.
Comparar los resultados obtenidos por ambos métodos.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL:

Materiales y equipos:

 Pipeta automática de volumen variable

 Tips para pipeta de 100 µL
 Microjeringa para GC de 10 µL (con topes)
 Matraces aforados de 10.00 mL

 Patrón: aceite esencial de naranja 100% puro (limoneno: 95% (v/v))

 Patrón interno: anisol (“purum” ≥99.0%)
 Alcohol etílico para análisis (99.5%(v/v))
 Etanol comercial para el lavado del material
 Muestra: Aceite esencial de limón

 Cromatógrafo: Hewlett Packard 4890D

Condiciones de trabajo:

 Detector: Ionización de llama (FID)

 Gas portador: Nitrógeno
 Atenuación en el cromatógrafo: OFF
 Range: 9
 Temperatura del inyector: 150ºC
 Temperatura del detector: 250ºC
 Columna:
o Fase estacionaria: HP-5 (5%fenil- 95%dimetilpolisiloxano)
o Largo 15m
o Diámetro Interno 0.53mm
o Temperatura máxima: 320ºC
o No polar
Procedimiento experimental:

Las disoluciones que se inyectaron se prepararon de la siguiente manera:

Disolución Patrón Aceite esencial de Estándar Interno (µL) Disolvente (Alcohol

naranja (µL) etílico)
0 0 100 Completar 10 mL
1 25 100 Completar 10 mL
2 50 100 Completar 10 mL
3 100 100 Completar 10 mL
Muestra 100 100 Completar 10 mL

RESULTADOS:

Concentración de limoneno %(v/v) en la muestra

R1 R2 R3 R4 R5 𝑥̅ CV
Calibración 60.6023 79.5015 80.1961 75.3228 59.4723 71,0190 14.3687 %
directa
Patrón 55.5648 54.7002 55.7425 56.2300 56.7128 55.7900 1.3550 %
interno

DISCUSIÓN:

La cromatografía de gases presenta gran aplicación en la determinación cuantitativa de

compuestos volátiles y su principal ventaja frente a otras técnicas es la posible determinación
de varios analitos en forma simultánea. El registro obtenido se denomina cromatograma y el
mismo representa Señal analítica vs. Tiempo.

En primera instancia se evaluó la influencia de la temperatura en la cromatografía de gases.

Para ello se obtuvieron tres cromatogramas a diferentes temperaturas (60, 90 y 130ºC) y se
pudo observar lo siguiente: Con la disminución de la temperatura aumentan los tiempos de
retención de los analitos en estudio y se produce un ensanchamiento de los picos.
En el cromatograma a 130ºC los picos presentan tiempos de retención muy pequeños y
próximos entre sí, solapándose y no obteniéndose una resolución para el posterior estudio. Las
temperaturas de 60ºC y 90ºC pueden ser utilizadas para la obtención de cromatogramas de
buena resolución, prefiriéndose el de 90ºC por tener tiempos de retención más adecuados a
la práctica y picos más estrechos.
Una vez elegida la temperatura de trabajo para el horno donde se encuentra la columna
cromatográfica, se procede a la obtención de las medidas. Para la determinación de limoneno
en la muestra se utilizan dos métodos cuantitativos a fin de compararlos y determinar cual
presenta los mejores resultados. En el método de calibración directa se realiza la curva de
calibración graficando directamente Área del pico vs. Concentración del patrón.
Posteriormente se inyecta la muestra y se determina su concentración por interpolación. A fin
de obtener la curva de calibración de mejor ajuste se realiza inspección visual de los gráficos
obtenidos, evaluación de R2 y determinación de los residuos. En este caso se opta por el
modelo cuadrático con ordenada en el origen como el de mejor ajuste, debido principalmente
a la distribución aleatoria obtenida en el gráfico de residuales realizado. El segundo método
utilizado para la determinación de limoneno en la muestra se denomina método del patrón
interno. Para su realización se adiciona a cada uno de los patrones y a la muestra una
concentración conocida de una sustancia denominada patrón interno, que debe cumplir
determinadas condiciones para su utilización: se debe resolver completamente en el
cromatograma, debe eluirse cerca del analito en estudio y no debe estar presente en la
muestra. En este caso se utiliza Anisol como patrón interno. Para la obtención de la curva de
calibración se grafica área del pico de Limoneno/área del pico de Anisol vs. Concentración de
Limoneno/concentración de Anisol. El grafico de mejor ajuste elegido para este caso es la
representación lineal sin ordenada ya que presenta un valor de R2 aceptable y la inspección
visual se corresponde con el modelo. Aunque no es el que presenta la mejor distribución
aleatoria de residuales es el modelo más sencillo, y la sumatoria de los residuos presenta un
valor aceptable. A fin de comparar ambos métodos cuantitativos se calcula el coeficiente de
variación (CV) para cada uno de ellos, obteniéndose el menor valor para el método de patrón
interno, siendo este el más preciso y por tanto el que arroja los resultados más confiables. Esto
se explica porque la cromatografía de gases se encuentra muy afectada por pequeños cambios
que puedan ocurrir en las condiciones de operación para cada una de las corridas. En el
método de patrón interno, estas fluctuaciones se encuentran compensadas ya que todo factor
que afecte la respuesta para el analito también afecta la respuesta obtenida para el patrón
interno en forma proporcional.

CONCLUSIONES:
 La temperatura afecta la separación de una mezcla de sustancias. Para elegir la
temperatura de trabajo debe existir un compromiso entre la resolución obtenida y el
tiempo para la obtención del cromatograma.
 En cromatografía de gases el método de patrón interno arroja mejores resultados que
el método de calibración directa.
INTEGRANTES DEL EQUIPO:

Firma Firma Firma Firma Firma

Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre

 ANEXO
Concentraciones
Se consideran para todos los cálculos la concentración de patrón de limoneno 95% (v/v) y
concentración de Anisol del 100% (v/v).
C1 x V1 = C2 x V2

Disoluciones Concentración de Concentración de

Patrón Analito % (v/v) Patrón interno % (v/v)
0 0.0000 1.000
1 0.2375 1.000
2 0.4750 1.000
3 0.9500 1.000
Muestra ? 1.000

Áreas

Estándares Repeticiones (áreas)

R1 R2 R3
Blanco Analito ..... ..... .....
Estándar Interno 190.9972 149.8910 154.6489
Disolución 1 Analito 40.9734 40.6637 41.7590
Estándar Interno 169.1716 183.4969 177.0176
Disolución 2 Analito 79.4936 71.9387 93.0752
Estándar Interno 166.4494 149.8362 200.2690
Disolución 3 Analito 186.9296 181.4151 171.1636
Estándar Interno 203.8202 196.6938 187.1404

MÉTODO DE CALIBRACIÓN DIRECTA

Estándares Promedio de Áreas del Analito Concentración de Analito % (v/v)

Blanco 0 0
Disolución 1 41.13203333 0.2375
Disolución2 81.50250000 0.4750
Disolución 3 179.8361000 0.9500
Modelo Lineal sin ordenada:

200
180 y = 185,159185x
160 R² = 0,996341
140
120
Área 100
80
60
40
20
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Concentración %(v/v)

Aexperimental Aregresión Residuales (Reciduales)2

(Aexperimental – Aregresión)
0 0 0 0
41,13203333 43,9753064 -2,843273108 8,08420196
81,5025 87,9506129 -6,448112875 41,5781596
179,8361 175,901226 3,93487425 15,4832354
∑ = 65,145597

Representación de Residuales:

0
1 2 3 4
-2

-4

-6

-8
Modelo lineal con ordenada:

200
y = 189.669931x - 3.213907
R² = 0.997308
150

100
Área

50

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

-50
Concentración %(v/V)

Aexperimental Aregresión Residuales (Reciduales)2

(Aexperimental – Aregresión)
0 -3,213907 3,213907 10,3291982
41,13203333 41,8327016 -0,700668282 0,49093604
81,5025 86,8793102 -5,376810225 28,9100882
179,8361 176,972527 2,86357255 8,20004775
∑ = 47,9302702

4
3
2
1
0
-1 1 2 3 4
-2
-3
-4
-5
-6
Modelo cuadrático sin ordenada:

200
180 y = 33,294331x2 + 159,046358x
160
R² = 0,999780
140
120
Área
100
80
60
40
20
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Concentración %(v/V)

Aexperimental Aregresión Residuales (Reciduales)2

(Aexperimental – Aregresión)
0 0 0 0
41,13203333 39,6515184 1,48051495 2,19192451
81,5025 83,0590535 -1,55655348 2,42285874
179,8361 181,142174 -1,30607383 1,70582884
∑ = 6,32061209

1.5

0.5

0
1 2 3 4
-0.5

-1

-1.5

-2
Modelo cuadrático con ordenada:

200
y = 33.294331x2 + 156.910688x + 0.542110
180 R² = 0.999798
160
140
120
Área
100
80
60
40
20
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Concentración %(v/V)

Aexperimental Aregresión Residuales (Reciduales)2

(Aexperimental – Aregresión)
0 0,54211 -0,54211 0,29388325
41,13203333 39,6864068 1,445626572 2,08983619
81,5025 82,5867202 -1,084220232 1,17553351
179,8361 179,655397 0,180702673 0,03265346
∑ = 3,5919064

1.5

0.5

0
1 2 3 4
-0.5

-1

-1.5
 R2 Signo de residuales
Lineal sin ordenada 0.996 - - +
Lineal con ordenada 0.997 + - - +
Cuadrática sin ordenada 0.999 + - -
Cuadrática con ordenada 0.999 - + - +

Dado el estudio para cada modelo, de los residuales, los R2 y la inspección visual, se toma el
modelo cuadrático con ordenada en el origen como el modelo que mejor ajusta a los datos
obtenidos particularmente por lo observado en los residuales donde existe mayor aleatoriedad
de los mismos. Por lo tanto se usará este modelo para la realización de los cálculos posteriores.

Área de las Muestras

R1 R2 R3 R4 R5
107.8614 146.3322 147.7914 138.3344 105.6366
Concentraciones calculadas interpolando en curva de calibración % (v/v)
0.606023027 0.795015458 0.801961352 0.753228417 0.594723213
Concentraciones en la muestra %(v/v)
60.6023027 79.5015458 80.1961352 75.3228417 59.4723213

s 10,20453109
CV = x̅ = 71,01902934
x 100% = 14.3687279 %

MÉTODO DE PATRÓN INTERNO:

Área de analito / área de patrón interno

Estándares Repeticiones
R1 R2 R3
Blanco 0 0 0
Disolución 1 0.242200227 0.221604288 0.235903096
Disolución2 0.477584178 0.480115619 0.46475091
Disolución 3 0.917129901 0.922322411 0.914626665

Promedios
Estándares Área de analito/ Concentración de analito/
área de patrón interno concentración de patrón interno
Blanco 0 0
Disolución 1 0.23323587 0.2375
Disolución2 0.474150235 0.4750
Disolución 3 0.918026325 0.9500
Modelo lineal sin ordenada:

1
0.9 y = 0.973161x

Área analito/Área patrón interno

0.8 R² = 0.999593

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Conc analito/Conc patrón interno

yexperimental yregresión Residuales (Residuales)2

(yexperimental – yregresión)
0 0 0 0
0,23323587 0,23112574 0,00211013 4,4527E-06
0,47415024 0,46225148 0,01189876 0,00014158
0,91802633 0,92450295 -0,00647663 4,1947E-05
∑ = 0,00018798

0.015

0.01

0.005

0
1 2 3 4

-0.005

-0.01
Modelo lineal con ordenada:

1
0.9 y = 0.966819x + 0.004519

Área analito/Área patrón interno

0.8 R² = 0.999666

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Conc analito/Conc patrón interno

yexperimental yregresión Residuales (Residuales)2

(yexperimental – yregresión)
0 0,004519 -0,004519 2,04214E-05
0,23323587 0,23413851 -0,00090264 8,14763E-07
0,47415024 0,46375803 0,01039221 0,000107998
0,91802633 0,92299705 -0,00497072 2,47081E-05
∑ = 0,000153942

0.012

0.01

0.008

0.006

0.004

0.002

0
1 2 3 4
-0.002

-0.004

-0.006
Modelo cuadrático sin ordenada:

1
0.9 y = -0,054803x2 + 1,014188x

Área analito/Área patrón interno

0.8 R² = 0,999920

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Conc analito/Conc patrón interno

yexperimental yregresión Residuales (Residuales)2

(yexperimental – yregresión)
0 0 0 0
0,23323587 0,23777842 -0,00454255 2,06347E-05
0,47415024 0,46937437 0,00477586 2,28089E-05
0,91802633 0,91401889 0,00400743 1,60595E-05
∑ = 5,95031E-05

0.006

0.004

0.002

0
1 2 3 4
-0.002

-0.004

-0.006
Modelo cuadrático con ordenada:

1
y = -0.054803x2 + 1.020741x - 0.001663
0.8 R² = 0.999927

Área analito/Área patrón interno

0.6

0.4

0.2

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-0.2
Conc analito/Conc patrón interno

yexperimental yregresión Residuales (Residuales)2

(yexperimental – yregresión)
0 -0,001663 0,001663 2,76557E-06
0,23323587 0,23767176 -0,00443589 1,96771E-05
0,47415024 0,47082405 0,00332619 1,10635E-05
0,91802633 0,91858124 -0,00055492 3,07933E-07
∑ = 3,38141E-05

0.004
0.003
0.002
0.001
0
1 2 3 4
-0.001
-0.002
-0.003
-0.004
-0.005
 R2 Signo de residuales
Lineal sin ordenada 0.99959 + + -
Lineal con ordenada 0.99967 - - + -
Cuadrática sin ordenada 0.99992 - + +
Cuadrática con ordenada 0.99993 + - + -

Realizando la inspección visual de los gráficos obtenidos para cada uno de los modelos
propuestos y teniendo en cuenta los valores de R2, es posible utilizar el modelo lineal sin
ordenada para la realización de los cálculos ya que es una muy buena aproximación de los
datos obtenidos. De todas maneras, el modelo que mejor ajusta es el cuadrático con
ordenada, debido a la distribución aleatoria de los residuos y la menor sumatoria de los
mismos.

R1 R2 R3 R4 R5
Área limoneno 107.8614 146.3322 147.7914 138.3344 105.6366
Área anisol 199.4718 274.8948 272.4448 252.8004 191.4031
Área 0.540735081 0,532320727 0.542463647 0.547207994 0.551906421
limoneno/area
anisol
Conc 0.55564812 0.547001705 0.557424559 0.562299551 0.567127557
limoneno/conc
analisol
Conc limoneno 55.564812 54.7001705 55.7424559 56.2299551 56.7127557
en la muestra
%(v/v)

s 0,755932695
CV = = x 100% = 1.354960191 %
x̅ 55.79002984