B-GLUCOSIDASA

Principio del metodo

Se basa en la determinación colorimétrica del p-nitrofenol liberado por las B-glucosidasa del suelo,
cuando el suelo es incubado con una solución tamponada de p-nitrofenil-B-D-glucósido Sustrato:
p-nitrofenil-B-D-glucósido (PNG) Producto: p-nitrofenol Coloración: amarillo

Nota: El suelo debe ser tamizado usando tamiz de 4 mm y se debe retirar con pinzas todos los
trozos de raíces, tejidos de plantas y otros materiales orgánicos gruesos que puedan interferir en la
determinación del análisis.

Procedimiento

1. Pese a 0.50 g ± 0.005 g de suelo (libre de residuos orgánicos) y colocar en un frasco

Erlenmeyer de 50 ml.

2. Añadir 2 ml de MUB pH 6

3. Añada 0.5 ml de PNG 0,025M a todos los frascos menos los controles (testigo, blanco).

4. Incube por una hora a 37 ° C con tapones de goma (para evitar la evaporación).

5. Añadir 0.5 ml de 0.5M CaCl2

6. Añadir 2 ml de THAM pH 12

7. Agregar 0.5 ml de PNG en los controles

8. Filtrar a través de un papel de filtro Whatman # 2

9. Haga la lectura de la coloración amarilla en un espectrofotómetro a 420 nm.

10. Si es necesario, diluir las muestras en agua destilada.

Soluciones:

a) HCL al 10%

Medir 900 ml de agua destilada y añadir lentamente 100 ml de HCl usando la cabina de extracción.

b) PNG (0.025 M)

Disuelva 0.1885 g de p-nitrophenyl-B-D-glucósido (Sigma N-7006) en 15 ml de MUB pH 6.0

Ajuste el volumen a 25 ml con MUB pH 6

Nota: Prepare esta solución antes de realizar el ensayo. Se tarda más o menos 30 minutos en
disolverse.

c) CaCl2 (0.5M)

Disuelva 73.5g de CaCl2.2H2O en 700 ml de H2O 12Completa el volumen para 1L con H2O
destilada
d) THAM- Solución extractora de hidróxido de sodio (0.1M THAM pH 12)

Disolver 6.1 g de THAM (Tris-Hydroxymethyl-Amino-Metano) en 350 ml de H2O destilada Ajuste

el pH a 12, añadiendo NaOH 0.5M (aproximadamente 7.5 ml) Completar para 500 ml con H2O
destilada y guardar en la nevera.

e) Solución STOCK MUB

mezclar: 6.05 g de THAM

5.8 g de ácido maleico

7 g de ácido cítrico

3.15 g de ácido bórico

244 ml de NaOH 1M

Completar para 500 ml con H2O destilada Mantenga la solución en la nevera.

f) MUB pH 6.0

Utilice 100 ml de la solución de inventario de MUB Ajuste el pH a 6.0 usando HCl 0.1M
(aproximadamente 250 ml) Completa el volumen a 500 ml utilizando H2O destilada.

Soluciones para la curva

a) Solución STOCK de P-Nitrofenol

Disolver 0.1 g de p-nitrofenol (Sigma 104-8) en 50 ml de H2O destilada, completar el volumen para
100 ml y guarde en la nevera.

NOTA: Cuando vaya a preparar su curva, diluya 1 ml de este patrón en 100 ml de agua destilada en
un matraz aforado. (= "Solución estándar diluida") Pipetear alícuotas de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la
"solución estándar diluida" en Erlenmeyer de 50 ml, completar a 5 ml y proceder como si fuera una
muestra de suelo (es decir a añadir 1 ml de CaCl2 0.5M; 4ml de NaOH, mezclar y filtrar). Estas
alícuotas representarán 0, 10, 20, 30 40 y 50 ug de p-nitrofenol. Explicando mejor la preparación
de la curva.
Comentarios

La solución de PNG es estable durante varios días si se almacena en la nevera a 4°C.

El THAM es quien confiere la coloración amarilla a la solución, o sea el color amarillo sólo se forma
después de su adición (es él que m libera el p-nitrofenol formado).

Es necesario añadir CaCl2 para prevenir la dispersión de la arcilla y la extracción de materia

orgánica del suelo, al agregar el tampón THAM a la liberación de la p-nitrofenol liberada.

Valores de actividad de B-glucosidasa descritos en la literatura:

Muestra húmeda: 38 a 720, media 148 mg p-nitrofenol. kg-1 suelo.h-1
Muestra seca: 48 a 169, media 112 mg p-nitrofenol. kg-1 suelo.h-1

Nota importante: Si sus muestras superan el punto de la curva estándar de 50 ppm (ug / l), las
muestras deben diluirse preferentemente con THAM 0.1 M, pH = 10 o con agua destilada, hasta
que la lectura caiga dentro de los límites de la curva de calibración.