Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Precipitación

Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación
En la precipitación se concentra el soluto de una solución convirtiéndolo en sólido
mediante la acción de un agente precipitante.

Teóricamente la precipitación debe producir un soluto concentrado y puro, por

lo que es una operación que se utiliza al inicio de un proceso de bioseparación
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Ventajas

1. Operación que se adapta fácilmente a gran escala

1. Puede realizase en forma continua

2. El equipo que se utiliza es sencillo

3. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos éstos

son baratos
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Fundamentos
Principio Agente precipitante
Disminución de la solubilidad Sales (Sulfato de amonio)
pH (precipitación isoeléctrica)
Solventes (etanol)
Polímeros no iónicos
Desnaturalización selectiva Temperatura
pH
Solventes

Afinidad Ligandos
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación por disminución de la solubilidad

- + - - +
-+ - - - Al agregar un agente
+ - + +
+ precipitante
+ +
- Las proteínas con mayor
- +
+
- - hidrofobicidad superficial
+ + precipitan primero
- - -+
+
- + - + - +
Regiones hidrofóbicas

Precipitación de
Precipitación con sales

proteínas por
Precipitación isoeléctrica
disminución de la
Precipitación con solventes
solubilidad
Precipitación con polímeros no iónicos
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación con sales

Solubilización Insolubilización
por salado por salado

(Salting-in) (Salting-out)

[Sal]

La adición de sales elimina el agua de la proteína

Mecanismo hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en
libertad de combinarse intermolecularmente
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación por incremento de la fuerza iónica

(“Salting-out”)
100
Proteína total
Proteína de interés

80
Concentración relativa (%)

60

40

20

0
0 20 40 60 80 100
Concentración de Sal (% Saturación)
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Ecuación de la precipitación con sales

log S = A − m[Sal]
Donde:
S = Solubilidad de la proteína a un valor dado de concentración salina.

A = Constante que depende fuertemente del pH y la temperatura. Esta constante

usualmente toma un valor mínimo en el punto isoeléctrico, es característica de
cada proteína e independiente del tipo de sal.

m = Pendiente de la curva de solubilización por salado. Ésta es independiente del

pH y la temperatura, pero varía con el tipo de sal y de proteína. Las sales que
contienen aniones polivalentes tales como sulfatos y fosfatos tienen valores de m
mayores que las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio y el
magnesio disminuyen el valor de m.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Naturaleza de la sal

1. Los aniones son más efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):

citrato−3 > tartrato−2 > SO4−2 > F − > IO3− > H 2 PO4− >
CH 3COO− > Cl − > ClO3− > Br − > O3− > ClO4− > I −
2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:
H 4+ > K + > a +
3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que
requiere el método.
4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea
diferente a la de la solución para facilitar su separación.
5. Añadirla sal en forma sólida y no como solución, para minimizar la dilución.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación isoeléctrica
Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad en el punto isoeléctrico
Las proteínas por su naturaleza anfotérica presentan una carga neta negativa a
pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH
Mecanismo isoeléctrico al cual la carga neta de la proteína es cero. A este pH la molécula
es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico
+ + +
Repulsión
+ + + +
+ + + +
+ +
-
+ + - -
Efecto de las fuerzas Atracción
+ + - -
-
electrostáticas sobre la proteína +
++ - -
-

- + + -
+ Baja interacción - +
- + -
- + + en el punto
- isoelécrico - +
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación con solventes

Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad mediante la adición de un
solvente orgánico ligeramente polar
El agua se caracteriza por su alta constante dieléctrica, lo cual significa que los iones en
solución acuosa presentan interacciones más débiles que con otros medios.
La adición de un solvente orgánico (etanol o acetona) produce agregados de moléculas
proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una
Mecanismo
constante dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las
fuerzas de atracción entre cargas opuestas y una disminución en el grado de ionización
de los radicales de las proteínas, y en consecuencia una disminución en la solubilidad de
ésta.
Constantes dieléctricas de algunos líquidos a 20⁰C
Líquido D
Agua 80.0
Matanol 33.0
Etanol 24.0
Acetona 21.4
Benceno 2.3
Hexano 1.9
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Ecuación de la precipitación con solventes

K
log S = log S 0 + 2
DS
donde:
S = Solubilidad de la proteína
DS = Es la constante dieléctrica de la mezcla solvente-agua, misma que varía
dependiendo de la cantidad de solvente agregada.
K = Es una constante que toma en cuenta la constante dieléctrica original del
medio acuoso.
S0 = Es la solubilidad extrapolada

El solvente debe ser completamente miscible en agua

Selección No debe reaccionar con las proteínas
del solvente Debe ser un buen agente precipitante
Debe ser seguro (flamabilidad del solvente)
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación con polímeros no iónicos

La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros

neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes.

El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos

propuestos.

Ogston y Laurent sugieren que los polímeros excluyen a las proteínas de parte
de la solución y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su
solvatación.

Mecanismo El modelo de Ogston se basa en la teoría termodinámica y concluye que los

sistemas pueden ser explicados en términos de los coeficientes de interacción
proteína-polímero, y proteína-proteína de las especies presentes.
El modelo de Laurent se basa en un mecanismo de exclusión geométrica de
regiones hidratadas de la proteína por el polímero.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Ecuaciones de la precipitación con solventes

Modelo de Laurent: log S = log k − KC
S = Solubilidad de la proteína
C = Concentración del polímero
k = constante de proporcionalidad
3
v  rs + rp  v = Volumen parcial específico del polímero
K= rS = Radio de la molécula de proteína
2.303  rp  rP = Radio del cilindro del polímero

Modelo de Ogston: log S = X − aC

S = Solubilidad de la proteína
C = Concentración del polímero
a = coeficiente de interacción proteína-polietilen glicol

µi = Potencial químico de la proteína en presencia del polímero

µi − µ 0
µi0 = Potencial químico de la proteína en el estado estándar
X= i
RT R = Contante de los gases ideales
T = Temperatura absoluta
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación de proteínas por desnaturalización

selectiva

El objetivo de la desnaturalización selectiva es crear las condiciones en las cuales

la proteína de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínima

Si la proteína que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas

de temperatura, pH, o en solventes orgánicos, puede utilizarse esta propiedad en
las primeras etapas del proceso de purificación
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Desnaturalización por temperatura

El proceso de desnaturalización de la proteína por efecto de la temperatura puede
ser descrito como un proceso de primer orden
d [P ]
= −k [P ]
dt
[P] = Concentración de la proteína disuelta
t = tiempo
k = Velocidad específica de desnaturalización
La dependencia del proceso de desnaturalización con la temperatura está dado por:

−E
k = k0 exp 
 RT 
d [P ] −E
= −k0 exp [P ]
dt  RT 
k0 = Constante característica
E = Energía de activación de la desnaturalización
R = Constante de los gases
T = Temperatura
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Desnaturalización por pH
Debido a que ciertas proteínas son estables a pH’s extremos, se ha utilizado esta
propiedad para purificarlas mediante su precipitación por desnaturalización selectiva de
las proteínas contaminantes.

La velocidad de desnaturalización a pK’s extremos ya sea ácidos o básicos depende del

tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación.

Desnaturalización por solventes orgánicos

La estabilidad que presentan algunas proteínas en una solución con solventes orgánicos
es una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificación, mediante la
precipitación de proteínas contaminantes.

El pH y la temperatura de la solución deben definirse y manejarse cuidadosamente con

el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de la proteína de interés, y de lograr la
máxima precipitación de las proteínas contaminantes.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Precipitación por afinidad

La precipitación de proteinas por afinidad es un método de preciptación selectivo que

se basa en la capacidad que tienen las proteínas para unirse con ligandos por medio
de sus sitios activos.

En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o

un anticuerpo.

En el caso de la pseudoafinidad los ligandos utilizados son colorantes o metales.

Nota: La simple adición de ligandos a una solución proteica generalmente no es suficiente

para que ocurra la precipitación. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregación
de los complejos ligando-proteína.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Equipos de precipitación

La operación de precipitación puede llevarse en diferentes tipos de reactores entre los

que se encuentran los:

Alimentación

Alimentación Producto

Intermitentes
Tubulares Continuos tipo
Producto
tanque agitado
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Diseño de Precipitadores
En el diseño de un proceso de precipitación debe tomarse como base el comportamiento
cinético de las partículas en solución. El conocimiento de este comportamiento permite
hacer la selección adecuada de la geometría en la que se realizará el proceso.

Precipitación a gran escala

“Gran escala” significa procesos los cuales son 10 veces o más que los métodos de
laboratorio existentes. En otras palabras se está interesado en el escalamiento.

La solubilidad de un soluto particular en un proceso a gran escala no es diferente al del

proceso a pequeña escala. Lo que se puede cambiar en un proceso a gran escala es la
cinética. Se desea que ambas cinéticas sean las mismas.

Se demuestra que la precipitación se obtiene con mejor éxito a una potencia por unidad
de volumen constante (P/V).
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Se puede idealizar la precipitación como un mecanismo de 6 etapas:

1. Mezclado inicial: La alimentación conteniendo el soluto es mezclada con el

no-solvente o la sal

2. Nucleación: Aparecen pequeñas semillas e inicia la precipitación

3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por difusión

4. Crecimiento influenciado por flujo: Nuevo crecimiento es ayudado por mezclado

5. Floculación: Partículas coloides se agregan en flóculos grandes

6. Centrifugación: Los flóculos son separados por los métodos ya descritos

Alguno de estos procesos ocurrirán simultáneamente, pero se discutirán como si

ocurriesen secuencialmente
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Mezclado Inicial:

El tiempo requerido para producir homogeneidad puede ser estimado de la ecuación:

l2
t=
4D
donde: l es el tamaño promedio de los “eddies” turbulentos causados por el mezclado y
D es el coeficiente de difusión del soluto.
El tamaño de estos “eddies” puede ser estimado de la ecuación:

1
 ρν 3
 4
l =  
 P /V 

donde: ρ es la densidad de la solución, ν es la viscosidad cinemática, y P/V es la potencia

por volumen de la agitación.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Nucleación:

La nucleación es la parte del proceso donde pequeñas partículas aparecen y empiezan a

crecer:

 En sistemas inorgánicos, la nucleación puede ser lenta y la sobresaturación puede

persistir por largos periodos

 Para sistemas coloides, este proceso es efectivamente instantáneo

 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Crecimiento limitado por difusión (Crecimiento Pericinético):

Después de la nucleación, las partículas del precipitado crecen cuando el soluto disuelto
difunde hacia ellos de la solución circundante. Este crecimiento usualmente sigue un
proceso de segundo orden:
dyi
= −kyi2
dt
donde: yi es la concentración de partículas de soluto, y k es la constante de la tasa del
proceso.

La constante k es una función del coeficiente de difusión D:

k = 8πDdÑ
donde: d es el diámetro del soluto, y Ñ es el número de Avogadro.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

La ecuación de segundo orden puede ser fácilmente integrada:

1 1
= + kt
yi yi0

donde: yio es la concentración inicial de soluto.

Sin embargo, frecuentemente es más difícil medir yi que determinar el peso molecular
promedio M del precipitado. La ecuación anterior se puede escribir en términos del peso
molecular mediante un balance de masa

yi M = yi0 M 0
donde: M 0 es el peso molecular del soluto inicial.
Combinando las dos ecuaciones previas:
(
M = M 0 1 + yi0 kt )
Así las mediciones del peso molecular promedio contra el tiempo provee valores de la
constante k.
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Crecimiento influenciado por flujo (Crecimiento o agregación ortocinética):

La difusión limita el crecimiento de pequeñas partículas pero es menos importante que el

crecimiento de partículas grandes.

Para estas partículas grandes, el crecimiento usualmente involucra coalisión entre

especies las cuales son barridas junto con el mezclado.

El crecimiento en esta región obedece a una cinética de segundo orden:

dyi
= −kyi2
dt
donde la constante de la tasa está dada por:
1/ 2
2  P /V 
k = αÑd 3  
3  ρν 
donde: α es un coeficiente de pegamiento, un factor insertado para considerar el hecho
de que no todas las coaliciones producen crecimiento .
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

La integración directa de esta ecuación es complicada por el hecho de que el diámetro de

la partícula y la constante de la tasa k son función del tiempo.

Se puede resolver la complicación considerando una fracción de volumen del soluto ψ

1 
ψ =  πd 3  yi Ñ
6 
Esta fracción de volumen es independiente del tiempo. Así podemos reescribir las
ecuaciones anteriores en términos de ψ
dyi  4  P / V  
1/ 2

− = αψ   yi

dt  π  ρν   

Integrando encontramos:

yi   4  P / V 
1/ 2
 

= exp −  αψ  t 
 π ρν   
yi0
     

Ejemplo 9.3
 Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología

Floculación:

Los flujos altos para el crecimiento de partículas pequeñas puede destruir los flóculos
más grandes, así esta etapa es algunas veces llevada a cabo en tanques no agitados.

Los polielectrolitos sintéticos pueden algunas veces ayudar a la floculación, tal como
ocurre en la filtración.

Nota: Recuerde que si el precipitado es el producto deseado, el polielectrolito debe ser

removido después.