Estudio de las propiedades de biointegración y resistencia elástica de un nuevo biomaterial

basado en xenopericardio para cirugía cardiovascular reconstructiva

introduccion

Analizamos la biocompatibilidad, las propiedades de resistencia elástica y el potencial de

biointegración de un nuevo biomaterial hecho de xenopericardio para la cirugía cardiovascular
reconstructiva. El biomaterial fabricado por la tecnología propuesta demostró un alto potencial de
biocompatibilidad y biointegración y sus propiedades de resistencia elástica de 2 a 4 veces
superaron a las del pericardio nativo. Los resultados obtenidos atestiguaron buenas perspectivas de
utilizar la tecnología propuesta para preparar biomateriales para cirugía reconstructiva
cardiovascular.

Durante muchas décadas, los materiales basados en el pericardio del donante se han utilizado
ampliamente en intervenciones reconstructivas en el corazón y los vasos sanguíneos. La experiencia
del uso del pericardio biológico cardíaco y Las prótesis fijadas por agentes de reticulación indican
que las matrices extracelulares libres de células alogénicas y xenogénicas puede proporcionar una
vida prolongada del biomaterial y no induce la respuesta inmune del receptor. En el Al mismo
tiempo, la principal limitación del uso generalizado de materiales xenopericárdicos es el riesgo de
calcificación patológica y degeneración estructural en plazos retrasados. después de la cirugía,
especialmente en pacientes jóvenes. Esta el hecho se explica, primero, por la supresión de la
repoblación de biomateriales fijada por agentes de reticulación y, en consecuencia, la imposibilidad
de biointegración y posterior remodelación del material implantado junto con el desarrollo de
calcificación aséptica de la matriz extracelular estructuralmente dañada del biomaterial.
Considerando el hecho de que los biomateriales utilizados en la cirugía cardiovascular
reconstructiva no solo debe ser biocompatible y duradero, sino también tienen propiedades
mecánicas cercanas a las de los reemplazados tejidos (válvulas, septos cardíacos, etc.), la creación
de un material duradero basado en una matriz extracelular descelularizada.

Materiales y métodos

Se utilizó el pericardio de terneros maduros sanos de animales con certificados veterinarios

apropiados en el estudio. Se Utilizo la parte anterior del pericardio desde el sitio de su unión a los
vasos principales hasta el ligamento diafragmático-pericárdico. El material fue entregado al
laboratorio a más tardar el en 4 h después del sacrificio a 4C en medio RPMI-1640 que contiene 400
μg / ml de gentamicina y 50 μg / ml de fluconazol y tratado de acuerdo con [2]. El tratamiento en
varias etapas del material donante incluyó incubación de 2 h con EDTA 2 mM seguido de tratamiento
en monohidrato de desoxicolato de sodio al 0,5% (SDM, D5670, Sigma-Aldrich) (pH 8.0) a 37 ° C, y
lavado repetido de SDM en solución de NaCl 150 mM (pH 7. que contiene etanol al 20%; El ciclo
completo de descelularización tomó 10 días.
Las muestras pericárdicas y el biomaterial pericárdico resultante (BM) antes y después de la
implantación en animales de laboratorio se fijaron de forma rutinaria (NBF, 24 h, 20-22C) y se
prepararon secciones histológicas (9 μ) por criotomía (Shandon E620, Thermo Fisher Scientific) .
Para el análisis histoquímico de BM antes y después de la implantación, utilizamos la tinción
diferencial de Weigert y Van Gieson (para componentes de elastina), de Lillie
tinción de tricromo (para componentes de colágeno), Sudán III y hematoxilina de Mayer (para
componentes de lípidos), tinción de von Kossa (para depósitos de calcio), azul alciano y reacción PAS
(detección de glicosaminoglicanos y mastocitos), y tinción de estudio estándar con hematoxilina y
eosina para la detección de núcleos celulares restantes y el grado y naturaleza de la repoblación de
materiales en el cuerpo. Para evaluar el posible efecto tóxico de la BM, se estudió la citotoxicidad in
vitro en cultivos de fibroblastos de piel humana (pasajes 1-4 después del aislamiento). Las celdas se
sembraron en la superficie serosa del BM y se cultivaron en medio αMEM (Sigma-Aldrich)
suplementado con Suero de ternera fetal al 10% (Gibco) y 40 μg / ml de sulfato de gentamicina
(Sigma-Aldrich) a 37C y 5% de CO2 en una incubadora Las células vivas y muertas se contaron en 24
y 96 h después de la inoculación después de la tinción con fluorescentes. tintes calceína AM y PI
(ambos de Sigma-Aldrich).Las células se separaron del sustrato con ac-cóctel cutase (Sigma-Aldrich)
y teñido en L-15 medio con suero de ternera fetal al 1% que contiene 1 μg / ml calceína AM y 2 μg /
ml de yoduro de propidio durante 25 minutos
a 37C. Se realizó el análisis de células vivas y muertas. utilizando un citómetro de flujo Accuri C6 (BD
Bioscience). El grado de calcificación de las muestras de BM (μg Ca / mg peso de muestra seca) antes
y después de la implantación se evaluó mediante espectroscopía de absorción utilizando
kit de ensayo de calcio estándar (Calcio AS FS Arsenazo III, DiaSys) y un espectro de microplacas
Infinite F200 Fluorometro (tecan)

El análisis histológico de los fragmentos de BM antes de la implantación confirmó la eliminación

eficiente de las células donantes, la ausencia de componentes lipídicos y la estructura conservada y
la arquitectura de la matriz extracelular después del tratamiento con xenopericardio y mostró que
la BM se presentaba principalmente por células extracelulares colágenas. matriz. La BM estudiada
no produjo ningún efecto citotóxico en las células. Las células se adhirieron al material, se
extendieron y crecieron en BM. El número de células en el control (plástico de cultivo) en 96 h
después de la siembra aumentó de 5000 a 35,000 por 1 cm2. El crecimiento celular en BM superó
el control en un 95 ± 5%. El porcentaje de células vivas en BM y en cultivos de control fue el mismo:
96 ± 2%. Los resultados obtenidos atestiguan la alta biocompatibilidad de la biomaterial fabricado.
La comparación de las características de resistencia elástica de BM y pericardio nativo mostró que
BM podría soportar cargas 2 veces mayores que el pericardio nativo. En dirección transversal, el
pericardio nativo tiene resistencia a la tracción máxima (promedio, σB) de 3.77 ± 0.95 MPa con un
alargamiento promedio de 35.84 ± 6.15%; para BM los parámetros correspondientes fueron 12.2 ±
1.84 MPa a 76,5 ± 10,49%. En la dirección longitudinal, estas características fueron 11.16 ± 2.08 MPa
a 24.35 ± 5.73% para el pericardio nativo y 34.29 ± 3.78 MPa a 51.99 ± 9.37% para BM. Estos
resultados muestran que el método propuesto para fabricar BM a partir de xenopericardio
proporciona propiedades de resistencia elástica 2-4 veces mayores en comparación con el material
nativo. El análisis histológico de las muestras no reveló signos de respuesta inmune al implante en
el receptor en todos los términos después de la implantación (Fig. 2). Intensivo La repoblación de la
matriz BM por las células receptoras se observó en 4 semanas después de la implantación. Todas
las muestras conservaron integridad estructural y no se reabsorbieron durante todo el experimento.
La tinción selectiva para fosfatos de calcio no reveló mineralización. calcio en las muestras en todos
los términos después de la implantación. La ausencia de la reacción inflamatoria. y signos de
calcificación aséptica atestiguada de alta biocompatibilidad de BM.

En la semana 13, observamos una remodelación significativa de la matriz con la formación de

elastina de novo fibras y glucosoaminoglicanos y migración activa de basófilos de tejidos a las
muestras de tejidos de contacto del espacio subcutáneo. Estos hallazgos indican una biointegración
activa de las muestras en los tejidos circundantes. El análisis cuantitativo de calcio mineralizado
mostró que su contenido en el pericardio nativo y la BM antes de la implantación era de 0.09 ± 0.03
μg / mg de tejido seco. El análisis de las muestras de BM en la semana 13 después de la implantación
mostró que el contenido de calcio mineralizado el calcio fue de 0.14 ± 0.10 μg / mg de tejido seco,
lo que atestigua la supresión de la calcificación de la muestra en el receptor cuerpo. Sobre la base
de este complejo estudio.

conclusion

podemos concluir que el método de descelularización / delipiización de tejidos biológicos propuesto

por nosotros garantiza destrucción completa y eliminación de células donantes y componentes
lipídicos y conserva la estructura y arquitectura de la matriz extracelular. Los biomateriales
experimentales producidos por la tecnología propuesta nique se caracterizan por una alta
biocompatibilidad tanto in vitro como in vivo, son activamente repobladas por las células receptoras
tan pronto como a las 4 semanas después de la implantación, no inducen mineralización ni siquiera
en plazos retrasados después de la implantación, y someterse a una remodelación activa de la matriz
extracelular, que indica un potencial significativo para la biointegración de estos materiales en el
cuerpo receptor Estas propiedades junto con las características de alta resistencia elástica del BM
examinado abre buenas perspectivas de su uso en reconstructivos cirugía Cardiovascular.

El estudio se llevó a cabo utilizando los recursos materiales y técnicos del Centro de Uso Común
"Centro de Pruebas In Vitro", el Instituto de Teoría y biofísica experimental, y fue apoyado por El
Programa del Presidium de la Academia Rusa de Ciencias "Investigación básica para el desarrollo de
tecnologías biomédicas" y por la Promoción de la Innovación Fondo de acción.

Las pruebas mecánicas de BM se realizaron en un Instrumento Zwick / Roell Z0.5. Pericárdico y BM

Las muestras (10 × 50 mm; n = 20) fueron sometidas a tensión uniaxial hasta la ruptura completa
(carga inicial 0.05 N y velocidad 50 mm / min) para determinar la tensión y resistencia al desgarro
(MPa) en el alargamiento relativo en la ruptura (%) y módulo elástico (módulo de Young, N / mm2)
en la longitud (en relación con las fibras pericárdicas) y dirección transversal. La biocompatibilidad
y el grado de biointegración de las muestras de xenopericardio estudiadas fueron evaluado en un
modelo de heterotópico (subcutáneo) implantación en ratas Wistar machos que pesan 180-200 g
bajo xilazina y anestesia de Zoletil. Fragmentos de BM (1 × 1 cm; n = 96 por grupo de prueba) fueron
implantados bajo condiciones de contacto intersticial completo. En 4, 8 y 13 semanas, los implantes
se retiraron junto con tejidos circundantes y analizados en comparación con xenopericardio (nativo)
no tratado que se sabe que causa rechazo en el modelo de implantación heterotópica. Todas las
manipulaciones se llevaron a cabo de acuerdo con los requisitos de GOST R ISO 10993-2-2009. El
análisis histológico de las criosecciones de BM teñidas fue llevado a cabo utilizando una estación de
fluorescencia microscópica Nikon Eclipse Ti-E; Se obtuvieron histotopogramas de encuesta en todos
los casos utilizando un software NIS Elements (Nikon) Se realizó el procesamiento estadístico de los
resultados. usando la prueba U de Mann-Whitney. Las diferencias fueron significativas a p <0.05.
Todos los experimentos se llevaron a cabo. en al menos tres repeticiones