Guía Práctica PDF

Universidad de Carabobo
Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología

Departamento de Biología
Unidad Académica de Biología Celular y Biotecnología
Guía de
Prácticas de
Laboratorio
de Biología
Celular
Elaborada por: Luis Ramírez, Eucandis Fuentes,

Doménico Pavone y Renny Pacheco.
Modificada por: Eucandis Fuentes, Luís Ramírez, José Núñez, Leandro

Núñez, Claudio Granado, Gabriel Díaz, Betzabeth Pereira,
Wilmary Mora y Delimar Rodríguez, Daniela López.
Guía de Prácticas de Laboratorio de Biología Celular Ramírez, Fuentes, Pavone y Pacheco (2017)
Índice de Contenido
Normas Generales............................................................................................................. 1
Práctica 1. Morfología Celular ......................................................................................... 2
Práctica 2. Fraccionamiento Celular............................................................................... 13
Práctica 3. Plamólisis...................................................................................................... 18
Práctica 4. Conteo y Viabilidad Celular ......................................................................... 23
Práctica 5. Fragilidad Globular ....................................................................................... 29
Práctica 6. Acción de los Neurotransmisores en Ceriodaphnia sp................................. 34
Práctica 7. Cascada de Señalización en la Coagulación Sanguínea ............................... 38
Práctica 8. Reacciones Inmunitarias. .............................................................................. 44
Práctica 9. Cáncer. .......................................................................................................... 48
Índice de Tablas
Tabla I. Valores porcentuales normales en los diferentes grupos de leucocitos. ............ 5
Tabla II. Proporciones para la preparación de muestra de sangre periférica. ................. 26
Índice de Figuras
Figura 1. Tipos de células sanguíneas (NCI, 2008). ........................................................ 3

Figura 2. Cambios producidos en una célula vegetal por contacto con medios
hipertónico, isotónico o hipotónico. ............................................................................... 18
Figura 3. Cambios producidos en las células de Allium sp. al ser colocadas en un medio
isotónico (A) y los cambios que se van produciendo cuando son colocadas en un medio
hipertónico (B y C). Fuente: modificado de Ehrig (2002).............................................. 19
Figura 4. Esquematización de una Cámara de Neubauer vista desde dos perspectivas.
A: vista frontal; B: vista lateral ...................................................................................... 23
Figura 5. Retículo mostrando sus dimensiones y las áreas utilizadas para el recuento
celular. L: cuadrados de las esquinas; E: cuadrado central. ........................................... 24
Figura 6. Descripción del retículo de Neubauer. a: cuadrado de las esquinas (L); b:
cuadrado mediano del cuadrado de las esquinas; c: cuadrado central (E); d: cuadrado
mediano del cuadrado central; e: cuadrado pequeño del cuadrado central .................... 24
Figura 7. Cambios morfológicos producidos en los eritrocitos, según las condiciones
osmóticas del medio en el que se encuentren. A: glóbulos rojos crenados; B: glóbulos
rojos normales; C: glóbulos rojos en lisis ....................................................................... 30
Figura 8. Esquema general de Ceriodaphnia sp hembra (vista lateral) (Filion & Morin,
2006) ............................................................................................................................... 36
Departamento de Biología- FACYT-UC. ii

Normas Generales
Para el mejor aprovechamiento del tiempo y los recursos, y la realización del trabajo
práctico en un ambiente seguro, es muy importante que el estudiante conozca y aplique
de forma rigurosa la siguiente normativa:
1. El uso de la bata de protección, y de guantes de látex según sea el caso, es

OBLIGATORIO. Aquella persona que no traiga la bata podrá realizar la evaluación
corta, pero no la práctica, por lo que perderá la nota del informe.
2. No se permite comer, beber ni fumar dentro de las instalaciones del Laboratorio.
3. La manipulación del material del laboratorio (vidriería y reactivos) debe realizarse

siguiendo las normas de higiene y seguridad correspondientes. Si no sabe como
manipular algún material o equipo, consulte al profesor. Cada equipo será el único
responsable del material asignado, el cual debe ser devuelto al personal de apoyo
limpio y en perfectas condiciones al finalizar la práctica.
4. Se recomienda utilizar un cuaderno de laboratorio durante la práctica. Puede

estructurarlo de la siguiente forma: identificando el número y nombre de la práctica,
actividades previas reflejadas en la guía, metodología esquematizada (citada
bibliográficamente), riesgos biológicos, cálculos previos, fórmulas, y referencias
bibliográficas.
Departamento de Biología- FACYT-UC. 1

Práctica 1. Morfología Celular
Las células son las unidades estructurales y funcionales básicas de todo ser vivo, de
modo que existen organismos formados por una única célula (unicelulares) o formados
por miles de millones de ellas (multicelulares). Dependiendo principalmente de la
organización del material genético las células pueden clasificarse en procariotas, cuyo
material genético está disperso en el citoplasma, sin que exista la presencia de una
envoltura nuclear; o eucariotas, cuyo material genético se encuentra aislado del
citoplasma mediante una envoltura nuclear. En general, los organismos procariotas son
unicelulares, mientras que los organismos eucariotas pueden ser unicelulares o
multicelulares. Los eucariotas unicelulares son generalmente organismos de tamaño
microscópico (microorganismos), mientras que los multicelulares son organismos
complejos que pueden alcanzar grandes tamaños. Existen tres tipos de células
eucariotas: las fúngicas, las vegetales y las animales. Las principales diferencias entre
ellas se basan en la presencia y composición de la pared celular, que en los hongos está
compuesta principalmente por quitina y en los vegetales por celulosa; la presencia de
centríolos en las células animales, y de plasmodesmos y plastos en las células vegetales.
Los organismos multicelulares presentan una gran variedad morfológica en cuanto a los
diferentes tipos de células que los constituyen, ya que esas diferencias son el resultado
de un proceso de diferenciación que les permite especializarse para realizar una
determinada función. Así podemos encontrar células que forman tejidos, células que se
mantienen dispersas, células excitables, entre otras. Las células que se especializan en
una función determinada presentan un patrón morfológico característico, lo cual ha
permitido el estudio de patologías asociadas. El citodiagnóstico es un conjunto de
técnicas de estudio citológico que permiten diagnosticar patologías, basándose en
alteraciones morfológicas de los caracteres microscópicos de las células y los
componentes extracelulares. Estos estudios se realizan en células que se han
desprendido de los órganos espontáneamente o que se han obtenido por procedimientos
que, en general, son menos invasivos que la biopsia. Los diferentes tipos de muestras
utilizadas para el citodiagnóstico dependen de su procedencia, de modo que se pueden
obtener de las siguientes fuentes:
Líquidos fisiológicos como: sangre; orina; líquido cefalorraquídeo; líquido pleural;
líquido prostático; etc.
Líquidos y fluidos patológicos, líquidos de derrames, pleural, peritoneal, contenido
de quistes, punción de medula ósea, punción hepática, etc.
Frotis legrados como el vaginal y el cepillado bronquial.
Piezas operatorias.
Los líquidos fisiológicos son las muestras de más fácil obtención para su estudio, y las
características de algunos de estos líquidos se presentan a continuación:
Liquido Cefalorraquídeo (LCR)

Aproximadamente el 70% se forma en los plexos corocoideos ventriculares a través de
un proceso combinado de transporte activo y ultrafiltración. El 30% restante se forma en
otros lugares que incluyen el revestimiento del epéndimo de los ventrículos y el espacio
subaracnoideo. Es reabsorbido en los senos durales de las vellosidades aracnoideas. El

volumen total de LCR en un ser humano adulto es de unos 150 mL; de los cuales cerca
de 20 mL están en los ventrículos; unos 60 mL en las cisternas subaracnoideas y unos
70 mL en el conducto raquídeo.
Funciones: constituye un medio nutritivo y vía de excreción de productos
metabólicos. Ejerce una función mecánica de amortiguación y regulación del
contenido intracraneal.
Obtención: se extrae por punción lumbar, cisternal o ventricular. Se deposita en un
tubo de ensayo con anticoagulante (oxalato de potasio) para prevenir su coagulación.
Características físicas: es límpido e incoloro con una viscosidad comparable a la del
agua. Las alteraciones patológicas pueden provocar cambios en los caracteres
organolépticos. Estos cambios pueden consistir en: aparición de coloración, turbidez,
existencia de una red fibrinosa o presencia de coágulos. El color rojizo se debe a la
presencia de sangre o sus derivados.
Estudio citológico: en la primera etapa del estudio se debe evaluar la presencia de
elementos celulares y sus características morfológicas, puesto que células como el
neutrófilo tienen un período de vida muy corto y en el espacio de pocas horas
desaparecen.
Sangre
Desde el punto de vista físico es un sistema heterogéneo bifásico, constituido por una
fase líquida (el plasma) y una fase celular que contiene en suspensión los elementos
figurados: eritrocitos (glóbulos rojos, hematíes), leucocitos (glóbulos blancos) y
plaquetas. El estudio citológico permite evaluar los diferentes elementos celulares, así
como parásitos presentes en la sangre. Los elementos celulares que componen la sangre
se muestran a continuación en la Figura 1.
Figura 1. Tipos de células sanguíneas (NCI, 2008).
Las principales características que se evalúan en cada uno de los elementos celulares
que componen la sangre, se describen a continuación:
Eritrocitos
Tamaño: microcitosis, macrocitosis, normocitosis o anisocitosis. Los eritrocitos
normales tienen aproximadamente 7 micras de diámetro.
Forma: esferocitosis, ovalocitos, células diana, poiquilocitosis, entre otros.

Intensidad de color: proporciona una idea de su contenido en hemoglobina.

Variaciones de color: basofilia difusa, plolicromatofilia, etc.
Presencia de estructuras coloreables internas: Anillos de Cabot, Corpúsculos de
Wowell Joly, Núcleos (normoblastos y eritoblastos, los cuales son eritrocitos
inmaduros nucleados).
Leucocitos
Para la identificación de los distintos tipos de leucocitos es necesario examinar
cuidadosamente cada célula, observando las siguientes características:
Tamaño de las células en comparación con el de otras células observadas con el
mismo frotis.
Examinar el núcleo observando lo siguiente:
- Posición dentro de la célula: central o excéntrico.
- Forma: redondo, arriñonado, cayado, segmentado; números de segmentos.
- Color.
- Estructura de la cromatina: malla fina, laxa, medianamente gruesa o gruesa.
- Presencia de nucleolo.
Examinar el citoplasma observando las siguientes características:
- Cantidad relativa en comparación al tamaño celular y al tamaño del núcleo (escaso,
moderado o abundante).
- Coloración (azul, rosa, etc.).
- Presencia de una zona clara perinuclear.
- Presencia de granulaciones, número aproximado, color y distribución.
Existen diferentes grupos de leucocitos, los llamados polimorfonucleares (neutrófilos,
eosinófilos y basófilos) y los mononucleares (linfocitos y monocitos). Los neutrófilos
son los más numerosos y porcentualmente los más significativos que se encuentran. Su
función es la fagocitosis que se entiende como si fuera una absorción y digestión de
sustancias extrañas (bacterias, cuerpos extraños, tejidos, etc.). Las formas inmaduras
que aparecen cuando hay un estímulo intenso medular para su producción se llaman
cayados, los cuales poseen un núcleo en forma de bastón y su presencia suele indicar la
existencia de actividad intensa de las defensas contra infecciones por bacterias. Los
eosinófilos se llaman así por el color rojo en el que aparecen al microscopio por una
tinción con eosina. Suelen estar elevados en ciertas enfermedades causadas por alergia o
por infecciones parasitarias. Los basófilos suelen tener un comportamiento similar. Los
linfocitos y monocitos tienen un único núcleo celular de tamaño reducido. Su función
es la de combatir infecciones virales y bacterianas crónicas.
La modificación del porcentaje de leucocitos puede orientar al diagnóstico de

enfermedades infecciosas, inflamatorias, y otros procesos. Cuando en la medición de
leucocitos se observa la presencia de cayados, y hay aumento del porcentaje de
polimorfonucleares se ha producido una "desviación a la izquierda", lo que sugiere
infecciones bacterianas agudas. La "desviación a la derecha" se produce cuando el
porcentaje de linfocitos y monocitos se encuentra aumentado con respecto al de los
polimorfonucleares, y se asocia, en general, a enfermedades víricas. La eosinofília, que
es el aumento del porcentaje o del número total de eosinófilos, sugiere un cuadro
alérgico o una infección parasitaria.

Tabla I. Valores porcentuales normales en los diferentes grupos de leucocitos.

Grupo de leucocitos % Valor absoluto (*103/mm3)
Neutrófilos 55 a 70 2.500 a 8.000
Linfocitos 20 a 40 1.000 a 4.000
Monocitos 2a8 100 a 700
Eosinófilos 1a4 50 a 500
Basófilos 0a1 25 a 100
Plaquetas
Normalmente son corpúsculos de 2-3 micras de diámetro, con una parte granular
central de color púrpura y un citoplasma hialino rosa en la periferia. Estas células están
involucradas en los procesos de hemostasia.
Estudio citológico: se comprueba su presencia, se realiza una apreciación aproximada
de su número y luego se observan su morfología y tamaño.
Orina
La orina es un líquido acuoso transparente y amarillento, de olor característico,
secretado por los riñones y eliminado al exterior por el aparato urinario. Se forma
mediante la filtración del plasma sanguíneo en los riñones, con su posterior
transformación y eliminación a través del sistema urinario. Su estudio permite evaluar
de manera no invasiva enfermedades del sistema urinario. Los estudios citológicos de la
orina ayudan al reconocimiento temprano de condiciones infecciosas, inflamatorias y
neoplásicas que afectan al sistema urinario. En un sedimento urinario se pueden
conseguir:
Hematíes: su presencia en la orina se denomina hematuria.
Leucocitos: su presencia sugiere una inflamación intra renal o a lo largo de las vías
urinarias. Los núcleos polinucleares no se ven con toda perfección debido a que los
gránulos citoplasmáticos ocultan al núcleo.
Bacterias: por lo general no se ven y se reportan como escasas, moderadas o
abundantes.
Levaduras: son ovoides, frecuentemente tienen yemas y bordes muy retractiles, y su
tamaño es variable.
Células: las células epiteliales planas o escamosas son las más grandes presentes en la
orina y tienen un citoplasma abundante y aplanado con núcleo pequeño.
Cilindros: un cilindro es una pequeña masa de mucoproteína de Tamm-Horsfall
coagulada que ha moldeado la luz del túbulo renal en el que se ha formado. También
se forman cuando aumenta la concentración de sales y cuando disminuye el pH
urinario. Son de longitud y grosor variable, y su número, forma y composición son
indicios de enfermedades intrínsecas del parénquima renal.
Cristales: generalmente no están presentes en muestras recién emitidas, pero pueden
aparecer como consecuencia de la saturación o alteración en la solubilidad de algunos
componentes químicos cuando se mantiene a temperaturas bajas. La mayoría de los
cristales desaparecen cuando se coloca la orina a 37 °C y los que no solubilizan
podrían tener significados clínicos.

Células Epiteliales
Son células yuxtapuestas que recubren todas las superficies libres del organismo, y
constituyen el recubrimiento interno de las cavidades, órganos huecos, conductos del
cuerpo y la piel. También forman las mucosas, las glándulas y el parénquima de muchos
órganos, como el hígado. Estas células provienen de tres hojas germinativas:
Del ectodermo la mayor parte de la piel y cavidades naturales (ano, boca, fosas
nasales).
Del endodermo el epitelio de casi todo el tubo digestivo y el árbol respiratorio,
también el hígado y páncreas.
Del mesodermo todo el epitelio restante como en el riñón y órganos reproductores.
Las células epiteliales conforman un conjunto de capas epiteliales que pueden ser:
Epitelio simple o monoestratificado.
Epitelio compuesto o estratificado.
Epitelio pseudoestratificado.
Semen o Plasma Seminal

Es una suspensión de elementos celulares, los espermatozoides y una mezcla de
secreciones que penetran en la uretra a partir de los órganos accesorios y en los cuales
están los espermatozoides que son formados en los testículos.
Para su estudio citológico se evalúan las siguientes características:
Motilidad: los espermatozoides deben tener una motilidad activa para que penetren
en el moco cervical y a continuación emigren para fertilizar el óvulo en las trompas
de Falopio. Al observar el frotis se registra el porcentaje de espermatozoides que
muestren una auténtica motilidad progresiva (tipo a), los que se mueven lentamente
pero atraviesan el campo (tipo b), los que se mueven en su propio eje (tipo c) y los
que no se mueven (tipo d).
Recuento de espermatozoides: después de la licuefacción del semen, los
espermatozoides pueden contarse en la cámara hematimétrica.
Elementos agregados: se realiza con una simple observación microscópica del
material al fresco. Dentro de los elementos a investigar destacan: hematíes y células
epiteliales, leucocitos y/o piocitos. Con el tiempo pueden aparecer cristales de
fosfatos de espermita en forma de aguja como resultado de la reacción de la espermita
con el ácido fosfórico.
Morfología: se valora mediante recuentos diferenciales de los tipos de
espermatozoides morfológicamente normales y anormales en las extensiones teñidas
con el método de Papmart o Giemsa. Las anomalías en los espermatozoides se
denominan:
- Mégalos: cabeza más de 5 µ.
- Microcéfalos: cabezas de 2 µ.
- Taperinos: cabeza alargada.
- Amorfos: anomalías de tamaño.
- Bicéfalos: más de 1 cabeza.
- Piriformes: cabeza en forma de pera.
- Anomalías de pieza intermedia.
- Anomalías de cola: enrollada, corta, doble o ausente. (Valores normales: ≥ 45 %
formas normales).

Para realizar el citodiagnóstico se requiere realizar frotis con las muestras, lo cual
consiste en la extensión de la misma de manera uniforme sobre un portaobjetos. De esta
forma es posible determinar con mayor facilidad la composición celular, realizar
recuentos diferenciales y evaluar características morfológicas. La elaboración de un
frotis en un portaobjeto se realiza utilizando dos láminas portaobjetos, en una de las
cuales se colocará una gota de la muestra y con la otra se realiza la extensión de dicha
muestra mediante deslizamiento en forma horizontal. Luego de hacer el frotis es
necesario fijar la muestra para conservar el detalle morfológico de las células en el
estado más parecido posible a las células en el tejido vivo. Esto se consigue con
fijadores que deshidratan las células, inactivan las enzimas autolíticas, coagulan las
proteínas y penetran en la membrana celular.
La fijación debe realizarse inmediatamente después de realizado el frotis, cuando la
preparación aún este húmeda. Los fijadores más comúnmente utilizados son: etanol
96%, Metanol Puro, Propanol e isopropanol 90%, Líquido de Carnoy y Citospray. El
Citospray es un fijador en forma de aerosol que contiene una mezcla de alcohol
isopropílico y polietilenglicol (funciona como una capa protectora de la desecación), y
debe aplicarse a una distancia de 25-30 cm de distancia de la muestra.
Posterior a la fijación debe realizarse un proceso de coloración. Esto es necesario debido
a que las células carecen de componentes que absorben luz, por lo que son invisibles en
el microscopio óptico. Para poder visualizarlas se les añaden colorantes que permiten
diferenciar las estructuras celulares mediante el establecimiento de contrastes, basados
en procesos de electroabsorción que se dan por cargas eléctricas de polaridades opuestas
(+ y -), y, si tenemos en cuenta el carácter anfolito de las proteínas, se entiende la
importancia que tiene el pH en ese proceso, en relación al punto isoeléctrico de las
estructuras a teñir. También existe un mecanismo por tensión superficial que se da por
la adherencia de las sustancias a la superficie. Los diversos mecanismos de ese
fenómeno, pueden darse por la intervención de fuerzas electroestáticas. Esta capacidad
de absorción varía de una sustancia a otra, puesto que la tensión superficial de las
diferentes estructuras también varía. Los tipos de coloraciones se clasifican en:
coloración química, que se da por la reacción entre el colorante y el sustrato según un
proceso químico bien definido; y la coloración física, que ocurre por la disolución del
colorante sobre las estructuras celulares (coloración por impregnación). Entre los tipos
de colorantes tenemos los naturales, que son extraídos de animales (Carmín) o vegetales
(Azafrán), y los artificiales o sintéticos, que son derivados de la hulla y se conocen con
el nombre de anilinas. Estos colorantes se clasifican a su vez en:
Colorantes Básicos: son sales que tienen muy bien las estructuras ácidas
(Hematoxilina; verde de metilo).
Colorantes Ácidos: son colorantes que tienen estructuras básicas (Eosina; Eritrosina).
Colorantes Neutros: son sales con componentes ácidos y básicos capaces de actuar
en estructuras celulares (eosinato de azul de metileno).
Colorantes Indiferentes: estos no forman sales pero tienen capacidad de disolución en
los alcoholes y las grasas (rojo escarlata).

Colorantes Metacrómicos: se caracterizan por teñir de diferente color que el

colorante utilizado (azul de toluidina).
Los colorantes actuarán dependiendo del método de coloración utilizado:
Coloración Directa: existe una clara afinidad entre el colorante y la sustancia a teñir.
Coloración Indirecta: se requiere la intervención de sustancias fijadoras (mordientes)
para que la coloración se adhiera a la estructura alumbre fenol cromo.
Coloración Progresiva: el colorante actúa hasta que se obtiene el color deseado.
Coloración Regresiva: hay que hacer una sobre coloración para luego eliminar el
exceso con diferenciadores: agua acidulada en la coloración de papmart.
Coloración Simple: se realiza sólo cuando interesa resaltar algunos aspectos del
preparado: grasa, glicógeno; etc.
Coloración Combinada: se emplea colorantes ácidos y básicos sucesivamente para
reforzar el contrasté por la doble acción: hematoxilina-eosina.
Coloración Panóptica: coloración combinada y realizada sucesivamente por
colorantes neutros: May Grünwald Giemsa.
Coloración Pancrómica: es un solo recipiente de colorante actúan todos colorantes
neutros que se necesitan: Papernheim
Objetivos
Diferenciar morfológicamente las células procariotas de las eucariotas.
Comparar los diferentes tipos de células eucariotas en organismos unicelulares y
multicelulares.
Reconocer las características y composición de los líquidos biológicos y las
patologías asociadas a los mismos.
Establecer las diferencias morfológicas presentes entre distintos tipos de células
presentes en el cuerpo humano.
Comprender los fundamentos citoquímicos e inmunocitoquímicos de los colorantes
presentes en las tinciones más comúnmente utilizadas para visualizar estructuras
celulares.
Actividades previas que debe realizar el estudiante

Elabore cuadros comparativos entre las características de las células procariotas y
eucariotas, los tipos de células eucariotas, los tipos de células animales, las
características citológicas y patologías asociadas a las muestras provenientes de líquidos
fisiológicos, las características de diferentes tipos de tinciones (incluyendo las de los
colorantes empleados en cada una de ellas), y los tipos de microscopios.
Material disponible en el laboratorio

Láminas micropreparadas para la
Eosina acuosa.
observación de morfología celular.
Etanol 70% v/v.
Láminas portaobjetos y cubreobjetos.
Giemsa.
Microscopio óptico.
Goteros.
Muestras de líquido cefalorraquídeo.
Hematoxilina de Mayer.
Paleta de madera.
Pipetas Pasteur.

Tubos de centrífuga de 15 mL de Centrífuga.

poliestireno y fondo cónico.
Material que debe traer el estudiante

Cámara fotográfica (opcional, se puede emplear para sustituir la esquematización de
las observaciones).
1 Jeringa de 5 mL por equipo.
Muestras frescas de:
- Sangre (que le serán tomadas en el laboratorio a los voluntarios).
- Semen.
- Orina.
No debe haber pasado más de una hora desde la toma de las muestras.
Metodología
Comparación morfológica de células procariotas y eucariotas, organismos
unicelulares y multicelulares
Observe las láminas preparadas utilizando el microscopio óptico y elabore un cuadro
comparativo con las características morfológicas visualizadas.
Líquido Cefalorraquídeo (LCR)

Coloque una gota de LCR en un portaobjeto, resguárdela con el cubre objetos y observe
en el microscopio óptico. Cuantifique el número de hematíes, células epiteliales y
leucocitos. Indique si observa la presencia de levaduras y bacterias en abundancia, así
como cualquier otro elemento. Esquematice sus observaciones.
Nº de células Promedio
observadas por campo ± Error
1 2 3 4 estándar
Levaduras
Bacterias
Eritrocitos
Células epiteliales
Leucocitos
Otros
Observaciones:
Sangre (Tinción Giemsa)

Realice un frotis sanguíneo y deje secar. Añada 2 gotas de etanol y deje secar
nuevamente. Coloque 8 gotas del colorante de Giemsa por 1 minuto. Escurra y lave con
agua hasta obtener un color azul claro grisáceo. Deje secar y observe al microscopio.

Cuantifique el número leucocitos, según su tipo. Indique si observa la presencia de

eritrocitos y plaquetas en abundancia, así como cualquier otro elemento. Esquematice
sus observaciones.
1 2 3 4 estándar
Eosinófilos
Neutrófilos
Basófilos
Monocitos
Linfocitos
Otros
Observaciones:
Semen
Para evaluar motilidad coloque una gota de semen bien mezclado en un portaobjeto y
cúbralo con un cubreobjeto. Observe mediante el microscopio óptico y cuantifique el
número de espermatozoides que presentan motilidad de tipo a, de tipo b, de tipo c y de
tipo d.
observadas por campo ± Error %
1 2 3 4 estándar
Motilidad a
Motilidad b
Motilidad c
Motilidad d
TOTAL
Observaciones:
Para observar la morfología realice un frotis y déjelo secar, fíjelo con etanol 75%,
coloree con 2 gotas de Eosina acuosa y déjelo secar. Observe en el microscopio óptico,
con objetivo de 100X, la morfología de cada uno de los espermatozoides presentes en
cuatro campos distintos. Cuantifique el número de espermatozoides con morfología

normal y con morfología anormal. Reporte esa cuantificación de manera porcentual e

indique cuáles fueron las formas observadas.
observadas por campo ± Error %
1 2 3 4 estándar
Morfología normal
Morfología anormal
TOTAL
Observaciones:
Orina
Centrifugue 5 mL de orina durante 20 minutos a 2000 rpm, descarte el sobrenadante y
realice un frotis con el sedimento. Observe en el microscopio óptico con objetivo de
100X y poca luz, en cuatro campos distintos. Indique si observa la presencia de
levaduras y bacterias en abundancia, así como cualquier otro elemento. Esquematice sus
observaciones.
1 2 3 4 estándar
Eritrocitos
Células epiteliales
Leucocitos
Otros
Observaciones:
Células Epiteliales (Tinción Hematoxilina – Eosina)

Con la ayuda de una paleta frote fuertemente el lado interno de la mejilla y con esta
muestra realice un frotis. Añada 2-3 gotas de Hematoxilina de Mayer (suficiente para
que cubra la muestra), y deje actuar el colorante durante 20 minutos. Descarte el exceso
de colorante realizando tres lavados con agua destilada y coloque 2-3 gotas de Eosina
Ácida (suficiente para que cubra la muestra) en la región donde se observa el frotis.
Deje actuar el colorante durante 5 minutos. Retire el exceso de colorante realizando tres
lavados con etanol 70% y deje secar. Observe y esquematice su muestra, reporte la
morfología celular, e indique a qué tipo de epitelio pertenecen esas células.

Observaciones:
Células Procariotas y Fúngicas

Observe y esquematice las láminas micropreparadas correspondientes a células
procariotas y fúngicas. Describa detalladamente la morfología celular y las diferencias
entre ellas.
Puntos a discutir en el informe

Emplee los cuadros comparativos que elaboró, como actividad previa a la práctica, para
establecer las diferencias más importantes entre los grupos comparados e indicar su
importancia (ESTE PUNTO ES EL MÁS IMPORTANTE DEL TRABAJO). Enfóquese
discutir las diferencias morfológicas encontradas en cada una de las experiencias.
Además, para las diferentes muestras de líquidos biológicos y de tejidos animales
observados, indique si presentan alguna patología. Sustente esta información con lo
reportado en la literatura y mencione la importancia de este tipo de estudios.
Bibliografía
 Alberts A., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & P. Walter (2006).
Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Garland Science. USA.
 Lodish H., A Berk, P. Matsudaira, C. Kaiser, M. Krieger, M. Scott, S. Zipursky & J.
Darnell (2005). Molecular Cell Biology. 5 th ed. W. H. Freeman & Co. USA.
 National Cancer Institute (2008). Hematopoietic Tree-Basic. Disponible:
http://visualsonline.cancer.gov/details.cfm?imageid=7164.
 Stansfield W., J. Colomé, & R. Cano (2003). Molecular and Cell Biology. McGraw-
Hill. USA.

Práctica 2. Fraccionamiento Celular
La célula eucariota es un sistema altamente organizado con organelas que cumplen

funciones específicas. Para poder estudiar cada una de sus partes, es necesario separar
los componentes celulares, y en ello se utiliza la técnica de fraccionamiento subcelular,
que consiste en: i) romper la célula y ii) separar cada componente según criterios como
tamaño, masa y densidad, aplicando técnicas de centrifugación. Para la ruptura celular
se debe utilizar una solución con pH y contenido de sales apropiado, que mantengan el
sistema tan intacto como sea posible. Existen varios métodos de ruptura, entre los que
se encuentran la sonicación y la homogeneización. La ruptura de las células produce la
mezcla de los componentes, lo cual se denomina homogeneizado. Seguidamente se
procede a centrifugar diferencialmente el homogeneizado con el objeto de separar sus
partes. También es posible realizar gradientes de densidad para separar componentes
celulares, en el mismo tubo.
La separación por centrifugación se basa en las diferencias de tamaño y densidad. La

fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa (RCF) en
unidades de gravedad (g). La RCF es una función de velocidad de centrifugación en
revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación.
Conociendo esta distancia (X) y el (rpm), se puede determinar el RCF a partir de la
ecuación:
RCF = (1.19*10-5)*(rpm)*(2X)
Donde X se toma como la distancia (en cm), desde el eje de rotación hasta el margen de
afuera del tubo de centrífuga.
En la centrifugación diferencial, el homogeneizado es centrifugado repetidas veces a

altas velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. La primera
centrifugación es a 600 g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este
“pellet” o sedimento contiene el núcleo, células intactas y tejido. La siguiente
separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el
precipitado o “pellet” nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centrífuga
centrifugándose a 10000 g por 30 minutos en una centrífuga refrigerada. El material
sedimentado se conoce como fracción mitocondrial; este último contiene mitocondrias y
microcuerpos.
Objetivo
Entrenar al estudiante en técnicas de ruptura y separación celular con el objeto de
obtener partes celulares aisladas para su posterior estudio.

Preparar los siguientes conceptos: sonicación, homogeneizador (funcionamiento y
aplicaciones), homogeneizado (características), centrifugación (principios, tipos y
aplicaciones), calidad del fraccionamiento (¿De qué depende?), citometría de flujo
(aplicaciones), colorante 2,6-diclorofenol indofenol (DCFIF) (aplicaciones), Buffer TES
y Tris-HCl (composición).


2,6-diclorofenol indofenol (DCFIF) Pipetas de vidrio.
al 0.01% (p/v). SDS al 10% v/v.
Agua destilada a 4ºC. Solución de NaCl al 0.9% p/v.
Buffer TES. Solución tampón de maceración
Espectrofotómetro. (buffer Tris-HCl 40 mM).
Centrífugadoras. Soluciones de sacarosa a las
Cilindro graduado de 100 mL. siguientes concentraciones (p/v):
Émbolo. 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% y
H2SO4 al 30%. 20%.
Hígado de Mus musculus. Tijeras.
Licuadora. Tubos de centrífuga de 15 mL, de
Mortero con mazo. poliestireno y fondo cónico.
Perhidrol. Tubos de centrífuga de 2 mL fondo
Molibdato de amonio 2,5% p/v. cónico.

las observaciones).
Gasa.
Muestras frescas de espinacas o albahaca (compradas la noche anterior a la práctica).
Metodología
Obtención de los homogenatos

Material animal
Pese 4 gramos de hígado, corte y macere con el mazo del mortero hasta formar una
papilla. Trasvase a un homogenizador de tejidos y recoja los restos en el mortero con
solución tampón (buffer) TES. Efectúe 8-10 pases con el émbolo. Filtre a través de una
gasa y complete a 15 mL con el buffer TES. Reserve a 4ºC hasta su uso.
Material vegetal
Pese 24 gramos de hojas de espinacas o albahaca, colóquelos en la licuadora (usada
como homogenizador de tejidos), y agregue 45 mL de buffer Tris-HCl 40 mM (solución
tampón de maceración, BM). Filtre a través de una gasa y complete a 50 mL con el
buffer BM. Reserve a 4ºC hasta su uso.
Gradiente discontinuo de densidad

Tome seis tubos de centrífuga de 15 mL, previamente identificados para la muestra
animal (3 de ellos), y para la muestra vegetal (los otros 3), y añádale a cada uno 1 mL
de solución de sacarosa de cada una de las siguientes concentraciones (p/v), en el
mismo orden: 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% y 20%.
Para que el gradiente sea adecuado a los propósitos de la práctica, hay que trabajar con
las soluciones muy frías, depositar cada capa lentamente sobre la anterior, para evitar
que se mezclen, y utilizar una pipeta de vidrio distinta para cada solución. Sobre la

última capa se depositará la muestra biológica, que consiste en 1 mL del

homogeneizado de hojas de espinaca o albahaca, o de hígado de rata, preparados
previamente. Cuando los tubos estén listos y balanceados, realice lo siguiente:
a. Una pareja de tubos con muestra animal y con muestra vegetal, se dejará por 24 h a
4ºC.
b. Otra pareja de tubos con muestra animal y con muestra vegetal, se centrifugará con
rotor de ángulo fijo a 10000 rpm por 30 minutos.
c. La última pareja de tubos, se centrifugará con rotor basculante a 14000 rpm por 45
minutos.
Al finalizar la centrifugación observe y compare la disposición del homogeneizado en

todos los tubos.
Centrifugación diferencial
Tome 2 mL del homogenato de la muestra animal y centrifugue a 5000 rpm durante
5 min. Separe el sobrenadante del precipitado y marque el precipitado como P1. Vuelva
a centrifugar el sobrenadante obtenido a 10000 rpm durante 10 min. Separe nuevamente
el sobrenadante del precipitado y marque el precipitado como P2. Centrifugue el
sobrenadante obtenido de la centrifugación anterior a 14000 rpm durante 15 min. Separe
el sobrenadante del precipitado y marque el precipitado como P3. Disuelva los
precipitados P1, P2, y P3 con NaCl 0.9% p/v hasta 1.5 mL.
Realice el mismo procedimiento para la muestra de tejido vegetal, pero identificando los
precipitados como E1, E2, y E3. Compare los tubos y anote sus observaciones.
En ambos casos (vegetal y animal) realice las siguientes pruebas para evaluar la
calidad del fraccionamiento:
1. Determinación de la cantidad de ADN: tome 100 μL de las soluciones de P1, P2,

P3, E1, E2 y E3, y coloque cada una en tubos de 2 mL, previamente identificados.
Agregue a cada tubo 50 μL de SDS 10% v/v y agite. Añada 650 μL de NaCl 0.9% p/v
y resuspenda. Mida la absorbancia del sobrenadante de las soluciones a una longitud
de onda de 260 nm.

Homogenato Homogenato
Absorbancia (260 nm) Absorbancia (260 nm)
Animal Vegetal
P1 E1
P2 E2
P3 E3
Observaciones:
2. Determinación de fosfato: una vez determinada la absorbancia a 260 nm a los

sobrenadantes de las soluciones P1, P2, P3, E1, E2 y E3, trasvase 0,5 mL de cada una
de esas soluciones a tubos de ensayo. Agregue 0,5 mL de H2SO4 30% v/v. Caliente
vigorosamente sobre un mechero. Observe el oscurecimiento de la solución y
adicione de 1 a 2 gotas de perhidrol. Continúe calentando hasta que la solución se
torne incolora. Adicione de 1 a 2 gotas de molibdato de amonio 2,5% p/v. Observe si
el volumen en los tubos es uniforme y la coloración amarilla que se produce
(fosfomolibdato de amonio). Anote la intensidad de color en cada tubo.
Homogenato Homogenato
Observaciones Observaciones
Animal Vegetal
P1 E1
P2 E2
P3 E3
Adicionalmente, determine la presencia de transporte de electrones en las fracciones

vegetales, agregando el colorante 2,6 dicloro fenol indo fenol (DCFIF). Tome 500 μL
de las soluciones E1, E2 y E3, coloque en tubos, y anote la coloración inicial. Luego
agregue 50 μL de colorante DCFIF. Nuevamente, anote la coloración obtenida al añadir
el DCFIF. Deje actuar el colorante durante 24 horas y observe la coloración final en los
tubos.

Coloración
Antes de añadir el Luego de añadir el Luego de añadir el
DCFIF DCFIF (0 horas) DCFIF (24 horas)
E1
E2
E3

Señale la importancia de la composición de las soluciones de taponamiento empleadas y
por qué se diferencian entre los tipos de tejido utilizados. Compare los métodos de
centrifugación realizados. Compare las técnicas de ruptura y separación con otros
métodos diferentes a los empleados. Basados en los resultados de las pruebas de
identificación, indique el grado de pureza de las fracciones obtenidas y si se
corresponden con los valores teóricos esperados.
Bibliografía
 Karp, G. (2005). Biología Celular y Molecular. 4ª ed. Editorial McGraw-Hill
Interamericana. España.

Práctica 3. Plasmólisis
Generalmente a la célula vegetal se le considera como un sistema osmótico perfecto. La

pared celular no forma parte del sistema, ya que es completamente permeable a
cualquier disolución o sustancia; solamente la membrana plasmática es semipermeable.
El protoplasma encierra la(s) vacuola(s), cuya composición es líquida con sales, ácidos
orgánicos, azúcares, entre otros, las cuales son todas sustancias osmóticamente activas.
El protoplasma puede ser bastante permeable a ciertas sustancias, lo que explica la
absorción de iones por células absorbentes de las raíces y su transporte de célula a
célula en los tejidos. Otras sustancias como la sacarosa, no son fácilmente absorbidas y
en este caso la célula se comporta como un sistema osmóticamente casi perfecto.
Tal como se observa en la Figura 2, colocando una célula vegetal en agua pura o en una
disolución muy diluida, de menor concentración que el jugo celular (disolución
hipotónica), habrá difusión neta del agua a través del protoplasma hacia la región de
mayor concentración del soluto, es decir, hacia la vacuola (endósmosis). Esta aumenta
de volumen y presiona la capa protoplasmática contra la pared celular. El proceso
continúa hasta que la pared celular no cede más, debido a la rigidez característica de la
misma, y por lo tanto ejerce una presión sobre el contenido celular llamada presión de
turgencia o turgor. En este punto, la célula se encuentra saturada de agua hasta su
capacidad máxima, es decir, completamente turgente. De forma contraria, si se coloca
una célula en una disolución de mayor concentración que la del jugo celular (disolución
hipertónica), la difusión será en sentido inverso, es decir, el jugo celular pierde agua a la
disolución rodeante (exósmosis). Al reducirse el volumen vacuolar por pérdida de agua,
disminuye al mismo tiempo la presión de turgencia hasta que desaparece del todo. El
protoplasma se contrae alrededor de la vacuola y empieza a separarse de la pared
celular, fenómeno al que se le llama plasmólisis (gr. plasma, forma, + lysis, separar). Al
momento justo en el que empieza la separación del protoplasma de la pared, se le
denomina plasmólisis incipiente. Este proceso continúa hasta que el jugo celular llega a
equilibrar su concentración, por pérdida de agua, con la disolución en la que fue
colocada. Una vez que se ha establecido este equilibrio se dice que el citosol y la
disolución alrededor de las células son isotónicas.
Figura 2. Cambios producidos en una célula vegetal por contacto con medios hipertónico, isotónico o
hipotónico.
Ejemplos representativos para la observación de plasmólisis en células vegetales son

Elodea sp. y Allium sp. En la Figura 3 se pueden observar células de Allium sp. que han

sido sometidas a cambios osmóticos según el medio en que se encuentran (isotónico en

la Figura 2A e hipertónico en las Figuras 2By 2C).
A B C
Figura 3. Cambios producidos en las células de Allium sp. al ser colocadas en un medio isotónico (A) y
los cambios que se van produciendo cuando son colocadas en un medio hipertónico (B y C). Fuente:
modificado de Ehrig (2002).
Objetivo
Estudiar los cambios de estado en el sistema osmótico que presentan las células
vegetales mediante el tratamiento con soluciones de sacarosa a diferentes
concentraciones.

- Preparar los siguientes conceptos: propiedades coligativas, medio isotónico, medio
hipertónico, medio hipotónico, ósmosis, presión osmótica, plasmólisis,
deplasmólisis, plasmólisis incipiente, presión de turgencia, potencial hídrico.
- Realice una revisión bibliográfica acerca de la composición de la célula vegetal,
destacando la función de cada uno de sus constituyentes, la importancia de la pared
celular en el proceso de mantenimiento de la estructura celular vegetal, el transporte
activo y pasivo incluyendo los tipos de proteínas asociadas a cada uno.
- Investigar los principios, aplicaciones e importancia de la plasmólisis y del potencial
hídrico.

Agua destilada. Pinzas de relojero.
Alcohol isopropílico al 70% v/v. Placas de poliestireno.
Cilindro graduado de 50 mL. Plancha con agitación.
Cilindros graduados de 10 mL. Sacarosa de grado reactivo.
Láminas cubreobjetos. Recipientes para soluciones de sacarosa.
Láminas portaobjetos. Rosa de Bengala 1% m/v.
Magneto. Glicerina.

1 Cebolla fresca por equipo. Cámara fotográfica (opcional, se puede
Sacarosa de consumo común. emplear para sustituir la
Bisturí con hojillas pequeñas (en su esquematización de las observaciones).
defecto hojillas de repuesto de Cronómetro o dispositivos que los
afeitadoras reusables). contengan (reloj, celulares, entre otros).

Metodología
Preparación de la solución madre de sacarosa (1 por sección de laboratorio)
Calcule la cantidad de sacarosa necesaria para preparar 300 mL de solución de sacarosa
1 M. Pese en la balanza la cantidad de sacarosa anteriormente calculada. Añada el
volumen de agua indicado a un recipiente, introduzca el magneto en el mismo y
colóquelo en una plancha con agitación a 200 rpm y 60ºC de temperatura. Finalice el
proceso una vez disuelta la sacarosa.
Preparación de las soluciones de trabajo

Calcule la cantidad necesaria de solución madre (solución de sacarosa 1M), para
preparar 50 mL de soluciones de sacarosa a 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 y
1.0 M con agua destilada, y anote sus resultados en la tabla que se encuentra a
continuación. Rotule 11 cápsulas de placas indicando la concentración de cada una de
las soluciones de trabajo preparadas. Coloque en cada placa 10 mL de la solución
indicada en su rótulo.
Volumen de solución Volumen de agua

[Sacarosa] (M) madre (mL) destilada (mL)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Preparación de los sistemas osmóticos

Tome un catáfilo de cebolla y, por el envés, realice incisiones cuadriculares. Desprenda
con pinzas esta capa delgada de células y coloque una cuadrícula en cada una de las
placas, asegurándose que todo el tejido este en contacto con la solución. Deje en reposo
por 20 minutos.
Transfiera las cuadrículas a láminas portaobjetos, proceda a fijarlas con etanol 70% p/v
y deje actuar por 1 minuto. Luego lave cuidadosamente con agua, sujetando suavemente
con pinzas el tejido. Agregue 1 gota del colorante rosa de bengala en cada cuadrícula,
deje actuar por 1 minuto, y aclare con agua destilada. Después, añada una gota de
glicerina y coloque encima del tejido una lámina cubreobjetos. Finalmente, observe la
lámina en el microscopio; cuente el número de células plasmolizadas y células con
ruptura de membrana en cuatro campos distintos, empleando el objetivo de 10X; anote
sus resultados en la tabla que se encuentra a continuación; detalle y esquematice las
observaciones para cada muestra.

N° de células N° de células con lisis de

plasmolizadas membrana
[Sacarosa] (M) Total de células Total de células
Campo Campo
1 2 3 4 1 2 3 4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
[Sacarosa] (M) Observaciones

0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0


Calcule el porcentaje de plasmólisis y lisis de membrana por campo. Promedie los
valores obtenidos y grafíquelos (% Plasmólisis vs Concentración de sacarosa).
Interprete sus resultados, analizando los fenómenos observados y su importancia para la
célula.
Bibliografía
 Ehrig D. (2002). Pictures of Plasmolysis. Disponible en: http://www.ehrig-
privat.de/ueg/pictures_of_plasmolysis.htm. Fecha de consulta: 02/05/2011.
 Gunning, B. & M. Steer (1996). Plant cell biology: Structure and function. Jones &
Bartlett Learning. USA.
 Prescott D. (1966). Evaluation of turgidity plasmolysis and deplasmolysis of plants
cells. In: Methods in cell biology. Academic Press. USA.
 Sutcliffe, J. (1968). Plants and water. Studies in Biology N° 14. Edward Arnold
Publications. Great Britain.
 Ting, I. (1982). Plant Physiology. Addison-Wesley Publications and Company.
USA.
 Turner, N. (1981). Techniques and experimental approaches for the measurement of
plant water status. Plant and Soil, 5:339-366.

Práctica 4. Conteo y Viabilidad Celular
La determinación de los patrones de viabilidad celular, proporciona valiosa información

sobre la proporción de células vivas funcionales y existentes en una población celular
determinada. Son varios los métodos que se pueden utilizar en el laboratorio para
estudiar la viabilidad y funcionalidad celular, ensayos funcionales, ensayos de
viabilidad a través de biosensores de fluorescencia, morfológicos, microanálisis por
energía dispersiva de rayos X, y técnicas de la expresión genética mediante microarrays.
Si una célula está muerta o en vías de morir, la función y estructura de la membrana
celular se encontará alterada, esta alteración permitirá la incorporación al medio
intracelular de moléculas que hasta el momento no permitidas, o bien, el rechazo de
moléculas que previamente se incorporaban a la célula. De acuerdo con estas
propiedades, se han desarrollado diferentes test con el objetivo de evaluar, la integridad
de membrana plasmática. Se distinguen tres tipos de ensayos: los métodos que emplean
sustancias colorantes o fluorescentes, los métodos basados en tinción catiónicas y los
basados en la liberación de determinadas sustancias al medio extracelular.
El conteo de células es una técnica ampliamente utilizada para estimar el número de

células en un medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, líquido
cefalorraquídeo, líquido sinovial, entre otros. Para determinar la cantidad de células se
emplean diferentes técnicas, desde la simple cámara de conteo celular (cámara de
Neubauer), hasta equipos automáticos de conteo celular como el Coulter counter y el
citómetro de flujo. La cámara de Neubauer, consiste en una placa de vidrio especial,
grueso, atravesado por unos surcos longitudinales que delimitan tres superficies
rectangulares: una central (b) y dos laterales (a y c). El rectángulo central está dividido
en dos secciones, y en cada una de ellas se encuentra grabado el retículo (R), tal como
se observa en la Figura 2A. Este rectángulo central es un poco más bajo que los dos
laterales, sirviendo estos como apoyo al cubreobjeto. Cuando el cubreobjeto se apoya
sobre las superficies rectangulares laterales, queda un espacio entre la cara superior del
rectángulo central, donde está grabado el retículo y la cara inferior de la laminilla
citométrica, tal como se observa en la Figura 2B; esto determina la altura de la cámara
que es de 0,1 mm.
Figura 4. Esquematización de una Cámara de Neubauer vista desde dos perspectivas. A: vista frontal; B:
vista lateral.

El retículo de la cámara de Neubauer, tiene una superficie total de 9 mm 2, ya que está

dividido en 9 cuadrados de 1 mm2 de superficie cada uno. Como se observa en la
Figura 4 Los cuatro cuadrados de las esquinas (L), están subdivididos en 16 cuadrados
medianos, cada uno de los cuales mide 0,25 mm de lado. El cuadrado central (E), está
dividido en 25 cuadrados medianos, cada uno de los cuales mide 0,2 mm de lado. A su
vez, cada uno de estos 25 cuadrados está dividido en 16 cuadros más pequeños cuyos
lados miden 0,05 mm (Figuras 5 y 6)
Figura 5. Retículo mostrando sus dimensiones y las áreas utilizadas para el recuento celular.
L: cuadrados de las esquinas; E: cuadrado central.
Figura 6. Descripción del retículo de Neubauer. a: cuadrado de las esquinas (L); b: cuadrado mediano
del cuadrado de las esquinas; c: cuadrado central (E); d: cuadrado mediano del cuadrado central;
e: cuadrado pequeño del cuadrado central.

Cabe destacar que al momento de contar células, es necesario diferenciar las que son
viables de las que no. De forma contraria, se sobrestimaría el número de células que
realmente van a funcionar en el ensayo que se quiera realizar, más aún si este requiere
que las células estén vivas. Una forma de evaluar la viabilidad celular es mediante el
uso de colorantes, que sólo pueden penetrar en la célula si la membrana plasmática ha
sufrido algún daño. De esta forma, se puede considerar que una célula que presente
coloración, debido a que la tinción ha penetrado en su interior, es una célula no viable;
este tipo de coloración a menudo se conoce como tinción de células muertas. También
existen sustancias que penetran en la célula y son retenidas dentro de la misma, sí y sólo
si la célula es viable; por lo tanto, en este caso se considera que la célula que ha retenido
la coloración es una célula viable, y a ese tipo de coloración se le conoce como tinción
de células vivas.
Las tinciones y colorantes empleados para evaluar viabilidad celular varían según el tipo
celular y los requerimientos del ensayo. Entre estos tenemos sustancias como el Ioduro
de Propidio, el colorante Azul de Tripano, 7-aminoactinomicina D (7-AAD) y la eosina
Y, las cuales son empleadas en procesos de tinción de células muertas. Otras sustancias,
como el líquido de Turk, son coloraciones empleadas en el conteo de leucocitos en
muestras de sangre, que facilitan el proceso debido a que excluyen la presencia de
eritrocitos maduros en la muestra por lisis de estos últimos.
Objetivo
Determinar la concentración de células viables en una muestra mediante técnicas de
evaluación de viabilidad celular y de conteo con Cámara de Neubauer.

Investigue cómo se evalúa la viabilidad celular de una muestra de células eucariotas,
cuál es su importancia, que técnicas de evaluación de viabilidad se emplean para
glóbulos blancos y para células epiteliales, y en qué consisten.

Azul de Tripano. Solución tampón de fosfato (PBS 1X).
Cámara de Neubauer. Tubos de centrífuga de 2 mL de fondo
Líquido de Turk. cónico.
Pipetas automáticas de 2-20 μL. Sacarosa al 40%.
Puntas para pipetas automáticas de 2-20 μL.

Cámara fotográfica (opcional, se puede
emplear para sustituir la esquematización
de las observaciones).
Gasa.
1 Tubo vacutainer tapa morada por
equipo.
Muestra fresca de sangre (se tomará
durante la realización de la práctica).

Metodología
Preparación de las diluciones
Obtención de Glóbulos blancos
Extraer 5 mL de sangre periférica y diluir la muestra con PBS 1X en una proporción

1:1, de acuerdo a lo reportado en la Tabla II, mezclar bien.
Tabla II. Proporciones para la preparación de muestra de sangre periférica.
Sangre (mL) PBS1X Sacarosa al 40%

(mL) (mL)
1 1 1,5
2 2 3
3 3 3
4 4 4
5 5 10
10 10 15
Tomar el volumen requerido de sacarosa y agregarlo a un tubo limpio.

Colocar la dilución de sangre en PBS 1X sobre el tubo con sacarosa, lentamente
por las paredes.
Centrifugar por 30 minutos a 800 G o 1.800 rpm.
Transcurrido el tiempo extraer el tubo del rotor procurando no mezclar las capas
formadas: la inferior de color rojizo, la intermedia de menor tamaño que
contiene las células mononucleres y la superior conteniendo plasma con la
solución de fosfatos.
Trasvasar la fase intermedia a un tubo de 1,5 mL estéril y preservar.
Tomar 20 μL del anillo de glóbulos blancos y añadirlo a un tubo de 1,5 mL, con
0,38 mL de líquido de Turk (enjuague varias veces). Realice el mismo
procedimiento con la fase obtenida al fondo del tubo.
Llenado de la Cámara de Neubauer

Es importante tener presente que en el momento justo antes de llenar la cámara, la
dilución debe mezclarse muy bien. Asegúrese de que la cámara y la lámina cubreobjeto
estén bien limpias. Tome la lámina por los bordes y colóquela sobre la cámara de
manera que quede superpuesta sobre las plataformas laterales del retículo. Para llenar
ambos retículos de la cámara con la muestra diluída utilizando la pipeta automática,
coloque la punta con la muestra diluída en el espacio entre la superficie del retículo y el
cubreobjeto, suelte lentamente la muestra ya que el llenado debe ocurrir por capilaridad.
Evite que el líquido se rebose o que queden burbujas, ya que si esto ocurre los
resultados no serán adecuados por lo que deberá llenar la cámara nuevamente. La
cámara una vez llena, no debe inclinarse, por lo que tendrá que llevarla al microscopio
lo más horizontalmente posible. Antes de contar las células, deje reposar la cámara
aproximadamente 2 minutos para que estas se sedimenten. No se debe dejar pasar
mucho tiempo para evitar la evaporación del líquido en la cámara, ya que esto
traerá como consecuencia un conteo erróneo.

Conteo celular
Luego de dejar reposar la muestra, debe observar la distribución de las células en cada
retículo. Una distribución desigual bien sea por la presencia de agrupaciones o
conglomerados de células o ausencia de células en algunos cuadrados, puede ser debido
a una mezcla inadecuada de la dilución. Si la distribución es aparentemente uniforme, se
procede a contar las células.
Con la cámara ya cargada y trasladada al microscopio, se inicia el conteo utilizando el
objetivo de 10X. Para poder distinguir las células animales de levaduras, cristales u
otras partículas, es necesario mover el tornillo micrométrico durante la realización del
conteo.
Las células de la línea celular y los glóbulos blancos se observarán redondeados y se les
apreciará su núcleo. Se contarán las células que se observan en cada cuadrado mediano
que constituye cada cuadrado grande L (Figura 4, b y a respectivamente). Cuando se
tienen células en los bordes, se contabilizan en un cuadrado mediano sólo las que tocan
los bordes superior e izquierdo, las que toquen los bordes inferior y derecho no deben
ser contabilizadas porque podrían estar contándose doblemente y esto altera la
concentración real de células en la dilución.
En la tabla que se muestra a continuación, reporte el número de células viables y el
número total de células que contabilice en cada uno de los cuadrados grandes L, para
cada muestra, y determine los valores que en dicha tabla se indican.
Nº de células viables Promedio ±

Muestra L arriba L arriba L abajo L abajo Desviación
izquierdo derecho izquierdo derecho Estándar
Glóbulos
blancos
Nº de células viables Promedio ± Porcentaje

Muestra Desviación de
Nº de células no viables Estándar viabilidad
Células
disgregadas
Cálculos
Para realizar los cálculos se debe tomar en cuenta lo siguiente:
La dilución utilizada.
La altura de la cámara.
La superficie contada para calcular el volumen.

Dilución utilizada
Ej. Glóbulos blancos
Se tomaron 0,38 mL de líquido de Turk y se agregaron 20 μL (0,02 mL) de sangre, el
volumen total será la suma de ambos (0,40 mL):
Si hay 0,02 mL de sangre ----------------------- en 0,40 mL de volumen final
1,00 mL de sangre ----------------------- estará presente en W
W = 20 (representa el factor de dilución, número de veces que fue diluida la muestra)
Cálculo del volumen

Si se cuentan 4 cuadrados de 1 mm2 de superficie, la superficie total es la suma de los
cuatro (4 mm2). La altura de la cámara es de 0,1 mm, por lo tanto el volumen total
contado es:
4 mm2 x 0,1 mm = 0,4 mm3
Determinación de la concentración
Para calcular la cifra total de células, se procede así:
Si se cuentan 4 cuadrados y la dilución utilizada fue 1:20 (ejemplo glóbulos blancos), se
tiene que:
Si en 0,4 mm3 ------------------------ hay X = Cantidad total de células viables
En 1,0 mm3 ---------------------- habrá Y
Y representa la cantidad de células viables por mm 3 en la muestra diluída.
Si se considera el factor de dilución se tiene que:
Z = Y*W (20 en el ejemplo, caso de los glóbulos blancos)
Z representa la cantidad de células viables por mm3 en la muestra sin diluir.
Para reportar células por mL o por L, se multiplica por 103 y 106 respectivamente, según
sea el caso.
Valores de referencia:
Adultos: 4000 a 10000 glóbulos blancos/mm3
Recién nacidos: 10000 a 25000 glóbulos blancos/mm3
Niños de 1 año: 6000 a 18000 glóbulos blancos/mm3
(Consultar referencias para conocer valores a diferentes edades y condiciones).

Bibliografía
 Cañedo V. & T. Ames (2004). Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos
Entomopatógenos. Centro Internacional de la Papa (CIP). Perú.
 Cátedra de Hematología (2003). Guía de Trabajos Prácticos. Parte I. Escuela de
Bioanálisis. Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad de Carabobo. Venezuela.
 Cuéllar, F. & F. Falabella (2004). Hematología. 6ª ed. Corporación para
Investigaciones Biológicas. Colombia.
 Martín. M. (2014). Evaluación de los perfiles de viabilidad celular de células madre
de la pulpa dental de la gelatina de Wharton como control de calidad para su uso en
ingeniería tisular. Tesis Doctoral. Facultad de Medicina. Departamento de
Histología. Universidad de Granada. Granada, España.
 Lodish H., A Berk, P. Matsudaira, C. Kaiser, M. Krieger, M. Scott, S. Zipursky &
J. Darnell (2005). Molecular Cell Biology. 5th ed. W. H. Freeman & Co. USA.

Práctica 5. Fragilidad Globular
Las características semipermeables de la membrana del glóbulo rojo normal y su forma

de disco bicóncavo, que le proporciona un área de superficie de 60-70% en exceso del
mínimo necesario para acomodar su contenido, le permiten cambiar de volumen y sufrir
deformaciones transitorias, al variar la presión osmótica del medio que le rodea
(Figura 7). La cubierta de los hematíes actúa como una membrana semipermeable que
deja pasar con facilidad el agua, pero no la mayoría de las sales disueltas. Cuando
colocamos glóbulos rojos, en una solución hipertónica (Figura 7A) estos pierden agua,
para diluir la solución y establecer el equilibrio osmótico; por lo tanto, el glóbulo se
deshidrata, se hace pequeño y se arruga, tomando una forma característica llamada
glóbulos rojos crenados. Cuando colocamos glóbulos rojos en una solución hipotónica
(Figura 7C), se presenta el fenómeno contrario al explicado anteriormente. El agua
penetra al glóbulo rojo para tratar de diluir su contenido de sales y así equilibrar su
presión osmótica, por lo tanto el glóbulo rojo se embebe de agua, aumenta su tamaño,
pierde la forma de lente bicóncava, aumenta de espesor y adquiere el perfil de un lente
biconvexa o hasta la forma de esfera; en esta etapa no pude resistir la tensión por
imbibición y en consecuencia, se rompe la membrana, se libera la hemoglobina y así
tiene lugar la hemólisis.
A B C
Figura 7. Cambios morfológicos producidos en los eritrocitos, según las condiciones osmóticas del
medio en el que se encuentren. A: glóbulos rojos crenados; B: glóbulos rojos normales; C: glóbulos rojos
en lisis.
El glóbulo rojo normal conserva su forma cuando está suspendido en el plasma o en una
solución salina fisiológica (0.85 - 0.90% m/v de NaCl) debido a un intercambio iónico
balanceado entre la célula y el fluido que lo rodea (Figura 7B). Si se coloca al glóbulo
rojo en agua destilada sufre una transformación rápida de disco bicóncavo y se rompe.
Esto se debe a que la célula toma agua, debido a la menor concentración osmótica en su
interior, y cuando llega al límite de la relación área superficie/volumen, ocurre la
ruptura de la célula y la hemoglobina es liberada en el medio. Si colocamos glóbulos
rojos en soluciones hipotónicas de concentraciones intermedias entre estos dos puntos

extremos (solución de NaCl al 0.9% m/v y agua destilada), sufrirán lisis de acuerdo a la
concentración de la sal y al tiempo a que han sido expuestos a un medio ambiente
iónico anormal. Si fijamos un tiempo, el cual debe ser corto para obviar movimientos
significativos de cationes a través de la membrana, podemos medir la resistencia de los
glóbulos rojos a ser lisados frente a soluciones salinas hipotónicas. Esta es la base en
que se fundamentan las pruebas de fragilidad globular osmótica.
Las pruebas que se emplean para evaluar la fragilidad osmótica miden la resistencia de
los glóbulos rojos a la hemólisis por estrés osmótico. A su vez, esta resistencia depende,
en mayor parte, de la forma del glóbulo rojo y su relación entre el área de superficie y el
volumen. Una fragilidad globular aumentada (o resistencia globular disminuida), se
observa en:
Condiciones asociadas con esferocitosis. Esto se debe a que los esferocitos tienen un
área de superficie reducida en relación a su volumen, por lo que, necesitan absorber
muy poca cantidad de líquido para llegar al punto en el cual la membrana no resiste el
estiramiento y se rompe. Por lo tanto, hay aumento de la fragilidad globular en la
esferocitosis hereditaria, donde la hemólisis puede iniciarse a concentraciones tan
altas como la 0.60% m/v de NaCl y se completa a 0.40% m/v de NaCl.
Anemias hemolíticas autoinmunes con presencia de esferocitos.
Estados de hipercolesterolemia.
Una fragilidad globular disminuida (o resistencia globular aumentada) es

característica de:
Talasemias. En ellas se explica por la presencia de células en diana (leptocitos) que
tiene un área de superficie aumentada en relación a su volumen. En esta enfermedad
esta tan marcada dicha resistencia, que se pueden encontrar glóbulos rojos intactos en
concentraciones tan bajas como 0.30% de NaCl y aún en agua destilada.
Drepanocitosis y otros desórdenes donde existan leptocitos, tal es el caso, de
enfermedades del hígado, después de la esplenectomía, enfermedades por Hb C.
Casos de hipocromía, ya que los glóbulos rojos hipocrómicos debido a su menor
contenido de hemoglobina, tienen capacidad para absorber mayor cantidad de agua
que los normales.
Se observa después de hemorragias, debido al paso a la sangre de células jóvenes.
Los hematíes, como todas las células animales, son susceptibles al trauma mecánico y
pueden hemolizarse incluso in vitro, agitándolos con perlas de vidrio. La prueba de
fragilidad mecánica estudia la cantidad de lisis de la sangre en presencia de soluciones
de distinta composición, y se compara con la cantidad de lisis de la sangre que ha sido
sometida a trauma mecánico, en presencia de las mismas soluciones. Esta prueba
permite evaluar el papel de la membrana plasmática en la regulación de las condiciones
internas de las células.
Objetivo
Evaluar el estado de la fragilidad de los glóbulos rojos frente a condiciones osmolares y
mecánicas.

Actividades previas que debe realizar el estudiante:

El estudiante debe familiarizarse con los siguientes tópicos: resistencia globular
osmótica, resistencia globular mínima, resistencia globular máxima, prueba de
fragilidad globular de parpart, hemólisis total, hemólisis inicial, fragilidad globular
media, composición de la membrana eritrocitaria y acuaporinas.

Bulbos para pipetas Pasteur. Pipetas Pasteur.
Centrífuga. Puntas para pipetas automáticas de 2-
Espectrofotómetro. 20, 20-200 y 100-1000 µL.
Gradillas para tubos. Tubos de centrífuga de 15 mL, de
Pipetas automáticas de 2-20, 20-200 poliestireno y fondo cónico.
y 100-1000 µL. Tubos de colorimetría.
Muestras frescas de sangre. Tubos de ensayo.
Papel Parafilm. NaCl 0,9% p/v.
Pipetas de 5 mL. Agua amoniacal.

las observaciones).
Muestra fresca de sangre (que le será tomada en el laboratorio a los voluntarios).
Metodología
Fragilidad Globular Osmótica
- Mida 5 mL de cada una de las soluciones de trabajo de NaCl 0.90, 0.80, 0.70, 0.60,
0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.20 y 0.10% p/v, y coloque cada una en un tubo de
centrífuga de 15 mL perfectamente limpios, secos y debidamente rotulados.
- Agregue 20 μL de sangre a cada una de las soluciones medidas anteriormente,
enjuagando la pipeta 3 veces en la solución. Esta operación debe realizarse siempre
igual en cada uno de los tubos.
- Selle el tubo con papel parafilm y mézclelo por inversión varias veces. Deje en
reposo a temperatura ambiente por 30 minutos.
- Al culminar el tiempo, mezcle de nuevo los tubos y centrifúguelos de 3000 a 3500
rpm durante 5 minutos, a fin de sedimentar las células no lisadas.
- Tome el sobrenadante de cada tubo y colóquelo en tubos de colorimetría, teniendo la
precaución de no resuspender el fondo de hematíes. El sobrenadante del tubo que
contiene la solución de NaCl al 0,10% m/v debe mostrar completa hemólisis; el
sedimento debe ser muy escaso y de color blanco o ligeramente rosado. Si se
observan en él glóbulos rojos intactos, debe resuspenderse el contenido del tubo para
lograr la lisis completa de los glóbulos rojos y luego centrifugarlos nuevamente. Este
tubo representa el 100% de hemólisis.
- Utilizando una longitud de onda de 540 nm (filtro verde), ajuste el cero de densidad
óptica o el 100% de transmitancia, utilizando como blanco el sobrenadante del tubo
que contiene la solución de NaCl al 0,90% m/v, ya que en él no debería haber

hemólisis. Luego proceda a la lectura de cada uno de los sobrenadantes de los otros
tubos.
- El porcentaje de hemólisis en cada uno de los tubos se deduce comparándolo con el
que representa el 100% de hemólisis.
Absorbancia
[NaCL] (% m/v)
(540 nm)
0.90
0.80
0.70
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.20
0.10
Fragilidad Globular Mecánica

- Coloque 1 mL de sangre en un homogenizador y se le aplican 20 toques. Transvase el
homogenizado a un tubo de ensayo.
- Haga diluciones 1:100 (para un volumen total de 2 mL), de la sangre homogeneizada
con solución salina (NaCl 0,9 % p/v) y con agua amoniacal (NH4OH N/150). Repita
el mismo procedimiento pero empleando sangre sin homogeneizar.
- Centrifugue los tubos y mida la absorbancia del sobrenadante a 540 nm. Emplee
como blancos la solución salina y el agua amoniacal, según sea el caso.
Absorbancia (540 nm)

Compuesto
Homogeneizado Sin homogeneizar
NaCl 0,9% p/v
Agua amoniacal

Calcule el % de hemólisis en cada uno de los tubos de la siguiente forma:
% HEMÓLISISX = [(DOX)/(DO0,1)]*100%
Donde, X = concentración en % m/v de NaCl del sobrenadante del tubo y
DO (Densidad Óptica) =Absorbancia medida a 540 nm
Grafique el % de hemólisis a medida que disminuye la concentración de NaCl.

Con ayuda del gráfico determine lo siguiente:

La Hemólisis Inicial (Resistencia Globular Mínima): es la más alta concentración
de solución salina donde comienza a observarse la hemólisis (valores normales: 0.45
- 0.50 % m/v NaCl).
La Hemólisis Total (Resistencia Globular Máxima): es la concentración más alta
de solución salina en la cual aparece hemólisis completa (valores normales: 0 - 30
% m/v NaCl).
Fragilidad Globular Media (FGM): la concentración de solución salina que
produce el 50% de lisis.
Evalúe los resultados obtenidos para la prueba de fragilidad globular mecánica,
comparando el comportamiento de la sangre homogeneizada y no homogeneizada en
cada una de las soluciones, y los resultados obtenidos para los dos tipos de soluciones
(las cuales constituyen dos tipos de medio al que están siendo sometidos los eritrocitos).
Bibliografía
 Rodak, B. (2005). Hematología, Fundamentos y Aplicaciones Clínicas. Editorial
Médica Panamericana. España.

Práctica 6. Acción de los Neurotransmisores en Ceriodaphnia sp.
Los neurotransmisores son señales químicas liberadas por las terminaciones nerviosas
que intervienen en la producción de impulsos nerviosos en las uniones sinápticas entre
neuronas o entre neuronas y el órgano que inervan. Una vez liberada la acetilcolina de la
neurona presináptica al espacio intersináptico es captada por un receptor de membrana
de la fibra muscular, que estimula la apertura de canales sodio en la membrana
postsináptica (membrana de la fibra muscular) e induce a la despolarización de la
membrana de la fibra muscular, lo que conlleva a la contracción muscular. Los
neurotransmisores característicos de los nervios periféricos son la acetilcolina y
adrenalina. La acetilcolina es liberada por el sistema nervioso parasimpático en las
terminaciones preganglionares y postganglionares y por las terminaciones simpáticas
preganglionares, mientras que la adrenalina es liberada por las terminaciones nerviosas
simpáticas postganglionares. Existen otros neurotransmisores además de la acetilcolina
y la adrenalina como la dopamina, la serotonina, el ácido γ- aminobutírico (GABA), la
glicina, el ácido aspártico, el glutamato, las endorfinas y el óxido nitroso, entre otros.
Acetilcolina
Es un neurotransmisor que genera impulsos eléctricos entre las células nerviosas a
través de la sinapsis y desde las células nerviosas hasta los músculos lo que origina la
contracción. Además de ser el neurotransmisor de las uniones neuromusculares, la
acetilcolina puede actuar en algunas vías de dolor y quimiosensitivas. Cuando la
acetilcolina es liberada por las terminaciones presinápticas o botones terminales de las
neuronas hacia la hendidura sináptica, es captada por un receptor nicotínico o
muscarínico de la membrana postsináptica (de una neurona o fibra muscular), lo que
induce a la apertura de los canales de sodio, y la consiguiente despolarización de la
membrana postsinápticas. Una vez que ha ejercido su acción es degradada por acción
hidrolítica de la acetilcolinesterasa. Tiene diversas acciones: dependiendo de los
órganos en los que actúa, y presenta funciones sensoriales y motoras. Dentro de las
sensoriales están las acciones visual, muscular, auditiva y de dolor. Las funciones
motoras comprenden el tono muscular, la conciencia y la memoria.
Adrenalina
Es una sustancia neurotransmisora tipo catecolamina, que se secreta en el hipotálamo,
tálamo, sustancia gris periacueductal, médula espinal y en la médula de la glándula
suprarrenal de los mamíferos. También se le denomina Epinefrina y produce diversas
reacciones en el organismo preparándolo para una respuesta rápida, aumentando la
frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria, se produce broncodilatación, aumenta el
flujo sanguíneo hacia el cerebro y los músculos, y se estimula la utilización de glucosa
en el cuerpo.
Dopamina
Al igual que adrenalina, es un neurotransmisor tipo catecolamina del sistema nervioso
central, que se produce principalmente en la sustancia negra y es liberada por el
hipotálamo. Su función principal es la inhibición de la prolactina del lóbulo anterior de
la hipófisis, y actúa como simpaticomimético mediante la promoción del incremento en

la frecuencia cardíaca y la presión arterial, y la producción de efectos deletéreos como

la hipertensión arterial. Participa en la regulación de la conducta motora, y actúa como
psicoestimulante. La degeneración de las neuronas dopaminérgicas es una de las
consecuencias de la enfermedad de Parkinson (trastorno debilitante del movimiento), y
la disfunción de la vía de señalización por receptores dopaminérgicos puede contribuir a
la esquizofrenia.
Ceriodaphnia sp.
Pertenece a la clase Branchiopoda, suborden Cladocera. Es un crustáceo de pocos
milímetros de longitud cuyo cuerpo es transparente, lo que facilita la observación de sus
órganos internos (Figura 8). Vive en agua dulce, presenta un caparazón bivalbo y un
reducido número de apéndices torácicos. Es un organismo filtrador y los bordes de sus
apéndices presentan cerdas finas para realizar esta función. El alimento pasa al interior
de una cámara sencilla por medio de una corriente de agua que es aspirada al interior.
Su dieta principalmente es a base de plancton o detritos; pero se alimenta también de
bacterias. El intestino anterior forma un esófago corto y el intestino medio forma un
estómago el cual, por ser tubular, no se diferencia de las otras partes del sistema
digestivo. Presenta un vaso sanguíneo corto que conduce sangre desde el corazón a la
parte anterior, el cual no se ramifica y la sangre pasa a través de los senos y no de venas.
En los branquiópodos se ha encontrado hemoglobina en la sangre, en músculos, tejido
nervioso y huevos.
Figura 8. Esquema general de Ceriodaphnia sp hembra (vista lateral) (Filion & Morin, 2006).
Las ceriodaphnias que se encuentran en aguas estancadas presentan un color rosado

debido a la hemoglobina, mientras que las que se encuentran en aguas aireadas son de
color claro. El ritmo y la regularidad de contracción del músculo cardíaco varía en las
distintas especies del los invertebrados y vertebrados. La velocidad de contracción del
corazón puede alterarse por condiciones que afectan a todo el animal como temperatura,
actividad hormonal y efecto de neurotransmisores. La frecuencia cardíaca normal a
20°C es de 240 a 250 latidos por minuto, la cual puede disminuir o aumentar de este

intervalo por el efecto de los neurotransmisores como la acetilcolina, adrenalina y

dopamina.
Objetivos
Analizar la acción de los neurotransmisores acetilcolina, adrenalina y dopamina en la
contracción del corazón, motilidad intestinal y cambio en la forma y coloración del
ojo de Ceriodaphnia sp.

El estudiante debe familiarizarse con los siguientes tópicos: tipos de neurotransmisores
y sus receptores, acción neurotransmisora en distintas regiones del cuerpo de
invertebrados y vertebrados, tipos de hormonas, neuronas y otras células excitables, y
tipos de sinapsis.

Láminas porta y cubre objetos. Puntas para pipetas automáticas de
Pipetas automáticas de 2-20, 20-200 y 2-20, 20-200 y 100-1000 µL.
100-1000 µL. Soluciones de acetilcolina, adrenalina y
Pipetas Pasteur. dopamina 1x10-3 M.
Placas de poliestireno.

las observaciones).
Bulbo para pipetas Pasteur.
Especímenes de Ceriodaphnia sp.
Metodología
Estado basal (sin efecto del neurotransmisor)
Para evaluar el estado basal de un ejemplar, tómelo del recipiente en el que se encuentra
con una pipeta Pasteur y colóquelo en una lámina portaobjetos, en una gota del medio
acuoso en el que se encuentra. Observe al microscopio en objetivo de 10X y diferencie
los órganos de acuerdo a la Figura 8. Identifique la forma y coloración del ojo
compuesto del ejemplar. También identifique el intestino y observe su movimiento en
estado. Ubique el corazón y cuente los latidos cardíacos durante 20 segundos (repita dos
veces más esta operación).
Efecto del neurotransmisor

Coloque una gota de adrenalina sobre el ejemplar, y cuente los latidos cardíacos durante
20 segundos (repita dos veces más esta operación). Observe la forma y la coloración del
ojo, y determine si hay cambios en éste con respecto al estado basal. También observe si
hay cambios en el movimiento intestinal, respecto al estado basal.
Repita el procedimiento anterior para acetilcolina y para dopamina, utilizando cada vez
un nuevo ejemplar. Anote sus resultados en la siguiente tabla:

NEUROTRANSMISOR
Adrenalina Acetilcolina Dopamina
(latidos) compuesto
Forma
Ojo
Color
BASAL
1
Corazón
2
3
Movimiento intestinal
(Rápido, moderado, lento)
(latidos) compuesto
Forma
Ojo
TRATAMIENTO
Color
1
Corazón
2
3
Movimiento intestinal
(Rápido, moderado, lento)

Compare los cambios ejercidos en Ceriodaphnia sp. en presencia de cada uno de los
transmisores en la forma y coloración del ojo, y en el movimiento intestinal. Calcule el
promedio de latidos contabilizados, y en base a ello, determine el promedio de latidos
por minuto para el estado basal y luego de la aplicación de cada uno de los
neurotransmisores: compare sus resultados. Establezca los mecanismos mediante los
cuales cada uno de los neurotransmisores empleados actúa para ejercer su efecto en
cada uno de los tejidos evaluados en Ceriodaphnia sp.
Bibliografía
 Espíndola, C. (2004). Prácticas de biología de organismos multicelulares. Editorial
Pontificia Universidad Javeriana. Chile.
 Kandel, E., J. Schwartz, & T. Jessell (2001). Principios de Neurociencia. 4 a ed.
McGraw-Hill Interamericana. España.
 Randall, D., W. Burggren & K. French (1999). Fisiología Animal: Mecanismos y
Adaptaciones. 4ª ed. W. H. Freeman & Company. USA.
 Ruppert, E. & E. Barnes (1996). Zoología de los Invertebrados. 6ª ed. Mc Graw-Hill
Interamericana. España.
 Filion A. & A. Morin (1996). Trace Metal Contamination of Benthic
Macroinvertebrates and Sediments in the St. Lawrence River, at Cornwall, Ontario.
6th Annual Meeting of the Group for Interuniversity Research in Limnology and
Aquatic Environment, Ontario, Canada.

Práctica 7. Cascada de Señalización en la Coagulación Sanguínea
El sistema de coagulación está constituido, fundamentalmente, por proteínas

plasmáticas con actividad de proteasas, que circulan en forma inactiva (proenzima o
zimógeno) y que en determinadas circunstancias pueden ser activadas, originándose una
cascada de reacciones que amplifican la reacción enzimática, y que llevan, finalmente, a
la formación de la fibrina. Algunos factores de coagulación no son enzimas, sino
cofactores enzimáticos cuya función es favorecer la formación e interacción del
complejo enzima-sustrato, a través de las modificaciones que provocan en las
estructuras moleculares terciarias de los componentes del complejo, lo que aumenta y
acelera marcadamente la reacción enzimática (Kordich et al., 1990). Hasta el año 2004
se habían reconocido 12 proteínas plasmáticas como factores de coagulación,
subdividiéndose en las siguientes categorías:
a. Factores dependientes de vitamina K.
b. Factores V y VII.
c. Factores de activación por contacto.
d. Fibrinógeno y factor XIII (Cuéllar y Falabella, 2004).
Una lesión endotelial por diversos mecanismos, al provocar la denudación del

colágeno subendotelial o por pérdida de sus propiedades fisiológicas, inicia el proceso
de la adhesividad y agregación plaquetaria, a la vez que puede activar la coagulación
por acción sobre las vías intrínseca o extrínseca. La vía intrínseca se inicia cuando la
sangre se pone en contacto con superficies de carga negativa (colágeno, plaquetas
activadas, ciertos ácidos grasos, entre otros), formando el factor de contacto. Ello
provoca la fijación a la superficie de una proteína plasmática que induce un cambio en
su conformación molecular y una probable autoactivación, y/o facilita su posterior
proteólisis y activación por enzimas que se forman o liberan en sus cercanías. La vía
extrínseca se inicia con el contacto de la sangre o plasma con sustancias titulares,
formando el factor tisular. Este factor es una glicoproteína presente en la mayoría de los
tejidos, especialmente a nivel de las membranas celulares, cuya actividad aumenta
marcadamente cuando se asocia con determinados fosfolípidos. Ambas vías, intrínseca
y extrínseca, convergen en la conversión del factor X en Xa, y en este punto se inicia la
vía común. En esta etapa intervienen varios factores de coagulación, cuya síntesis es
dependiente de vitamina K, y culmina con la conversión de fibrinógeno en fibrina
(Kordich et al., 1990).
Existen pruebas de laboratorio que permiten evaluar deficiencias de los factores de

contacto o defectos en las vías de coagulación, las cuales son parte de un conjunto de
métodos de selección realizadas como pruebas de entrada para estudios de coagulación
en individuos con alteraciones hemostáticas o que serán sometidos a intervenciones
quirúrgicas. Entre estas pruebas mencionaremos a continuación las que serán realizadas
en esta práctica:
Tiempo de Tromboplastina Parcial activado (TTPa): esta prueba evalúa el sistema

intrínseco, midiendo el tiempo de coagulación del plasma pobre en plaquetas y
descalcificado, en presencia de una sustancia que sustituye al factor plaquetario 3, de
un activador de la fase de contacto y del calcio. La prueba es más sensible a las
deficiencias de los factores VIII, XI y XII.

Tiempo de Protrombina (TP) en una Etapa o Tiempo de Quick: esta prueba evalúa
el sistema extrínseco, midiendo el tiempo de formación del coágulo plasmático en
presencia de exceso de extractos tisulares (factor III). La prueba es más sensible a la
deficiencia del factor II.
Tiempo de Trombina (TT): esta prueba mide el tiempo durante el cual el fibrinógeno,
presente en el plasma, se transforma en fibrina por la adición de una cantidad
estandarizada de trombina.
Técnica para el Factor XIII: esta prueba evalúa la estabilidad del coágulo de fibrina,
en ausencia del factor XIII, cuando se suspende en una solución concentrada de úrea
5M o una solución de ácido monocloroacético (Gaudens, 1984).
Objetivo
Evaluar los sistemas intrínseco y extrínseco de la coagulación mediante la
determinación de los tiempos de tromboplastina parcial y de protrombina,
respectivamente.
Examinar la última fase de la coagulación mediante la determinación del tiempo de
trombina y del factor XIII.

Investigar el proceso bioquímico implicado en la activación de la cascada de
coagulación.
Elaborar un cuadro comparativo con los factores de coagulación indicando si se trata
de una enzima o un cofactor enzimático y su función.
Realizar un esquema que represente los eventos bioquímicos implicados en la cascada
clásica de la coagulación.
Estudiar los mecanismos de regulación de la cascada de coagulación.
Indicar cuáles factores de coagulación causan las más graves manifestaciones
hemorrágicas.

Baño de maría a 37°C. Pipetas de 5 mL.
Cefalina con activador. Plasma Control (PC).
Cloruro de calcio 0,025 M. Puntas para pipetas automáticas de
Gradillas para tubos de ensayo. 2-20, 20-200 y 100-1000 µL.
Envases con hielo picado. Tromboplastina - Calcio.
Pipetas automáticas de 2-20, 20-200 Tubos de ensayo.
y 100-1000 µL. Úrea 5 M.
Papel Parafilm.
Materiales que debe traer el estudiante
2 cronómetros.
1 Jeringas de 5 mL.
1 Bulbo para pipetas Pasteur.
las observaciones).
Muestra fresca de sangre (que le será tomada en el laboratorio a los voluntarios).

Metodología
Centrifugue las muestras de sangre obtenidas, a 2000 rpm durante 10 minutos. Separe
el plasma de los glóbulos rojos. El plasma debe colocarse en otro tubo de ensayo de
plástico debidamente identificado.
Medición del TTPa
Rotule tubos de ensayo, por duplicado, para el plasma control (PC) y para cada una de
las muestras (PM1, PM2,…). Diferencie el duplicado de cada tubo agregando una
tilde al rótulo.
Coloque los tubos en una gradilla en baño de hielo y añada a cada uno 0,1 mL de
cefalina con activador.
Procese los tubos en el siguiente orden: PC, PM1, PM2,…, PM2’, PM1’ y PC’ y de la
siguiente forma:
 Coloque el tubo en una gradilla en baño de maría a 37°C.
 Añádale 0,1 mL del plasma correspondiente (PM, PC o la mezcla PM-PC). Accione
el primer cronómetro en forma simultánea a la adición del Plasma.
 Mezcle el contenido del tubo y déjelo en incubación durante 3 minutos exactos.
 Al cabo de este tiempo, añada al tubo 0,1 mL de cloruro de calcio 0,025 M a 37°C,
y en forma simultánea a la adición, accione el segundo cronómetro.
 Mezcle el contenido del tubo y déjelo en incubación durante 20 segundos exactos.
 Al cabo de este tiempo, saque el tubo y observe la reacción hasta el momento
preciso de formación del coágulo de fibrina. Detenga el segundo cronómetro justo
en este punto.
 Anote los tiempos de coagulación registrados y calcule la diferencia de tiempo entre
el PM y el PC (M-C) y entre la mezcla PM-PC y el PC (MC-C).
Valores normales
PC: 30-50 segundos.
Diferencia M-C: hasta ± 10 segundos.
Valores de referencia
PC: 38 segundos.
PM: 48 segundos.
Diferencia M-C: 10 segundos.
Valores inferiores al rango son indicadores de hipercoagulabilidad, mientras que valores
superiores son indicadores de deficiencias en la coagulación plasmática.
Cuando se prolonga el tiempo de la prueba, respecto a los valores normales, esto puede
deberse a la presencia de inhibidores de la coagulación (anticoagulantes, inhibidores de
un determinado factor, o presencia de productos de degradación del fibrinógeno o de la
fibrina). Si la extensión de tiempo se debe a la presencia de inhibidores la diferencia
MC-C será nula, pero si se debe a la deficiencia de factores la diferencia MC-C se le
resta a la diferencia M-C para corregir la alteración inicial. Esta corrección sólo se
puede realizar si el TTPa para PM-PC es menor que el TTPa para PM.
Medición del TP
Rotule tubos de ensayo, por duplicado, para el plasma control (PC) y para cada una de
las muestras (PM1, PM2,…). Diferencie el duplicado de cada tubo agregando una
tilde al rótulo.

Procese los tubos en el siguiente orden: PC, PM1, PM2,…, PM2’, PM1’ y PC’ y de la
siguiente forma:
 Coloque 0,1 mL del plasma correspondiente en el tubo.
 Incube durante 1-3 minutos en una gradilla en baño de maría a 37°C.
 Añada 0,2 mL de Tromboplastina-Calcio, precalentada durante al menos 5 minutos
a 37°C (No deje precalentar la Tromboplastina-Calcio por más de 30 minutos).
Accione el cronómetro en forma simultánea a la adición.
 Detenga el cronómetro al formarse el coágulo.
 Anote los tiempos de formación del coágulo, y calcule las diferencias de tiempo M-
C y MC-C, y la razón.
Razón = TP del PM/ TP del PC.
Valores normales
PC: 11-17 segundos. Depende de la procedencia de la tromboplastina empleada.
Diferencia M-C: hasta ± 4,0 segundos.
Razón: 0,8-1,2.
Valores de referencia
PC: 12,5 segundos.
PM: 13,1 segundos.
Diferencia M-C: 0,6 segundos.
Razón: 1,1 segundos.
El TP se prolonga en las deficiencias únicas o combinadas de los factores I, II, V, VII y
X, y en presencia de un inhibidor de los factores de coagulación, inhibidores tipo
heparina y de productos de degradación del fibrinógeno y/o fibrina. Por tanto, la
prolongación del Tiempo de Protrombina está asociado a Hipoprotrombinemias, terapia
con cumarínicos, síndrome de coagulación intravascular y afibrinogenemias.
Al igual que en la prueba TTPa, cuando se prolonga el tiempo de la prueba, respecto a
los valores normales, se evalúa si la extensión de tiempo se debe a la presencia de
inhibidores (diferencia MC-C nula) o a la deficiencia de factores, en cuyo caso la
diferencia MC-C se le resta a la diferencia M-C para corregir la alteración inicial. Esta
corrección sólo se puede realizar si el TP para PM-PC es menor que el TP para PM.
TTPa TP
Muestra Tiempo (seg) Muestra Tiempo (seg)
PC PC
PC’ PC’
PM PM
PM’ PM’
M-C M-C
Razón
Técnica para el Factor XIII

Rotule tubos de ensayo, para el plasma control (PC) y para cada una de las muestras
(PM1, PM2,…). Diferencie el duplicado de cada tubo agregando una tilde al rótulo.

Procese los tubos en el siguiente orden: PC, PM1 y PM2 de la siguiente forma:
 Añada al tubo 0,2 mL del plasma correspondiente (PM, PC o la mezcla PM-PC) y
0,2 mL de cloruro de calcio, y colóquelo en una gradilla en baño de maría a 37°C.
Deje coagular por 30 minutos.
 Al cabo de este tiempo, añada 3 mL de úrea 5 M, agite para desprender el coágulo y
déjelo en la gradilla en baño de maría a 37°C.
 Observe a las 2 y a las 24 horas.
En ausencia del Factor XIIIa, al pasar el coágulo de un medio hidrofílico a un medio
hidrofóbico se produce la disociación del polímero.
Factor XII Observaciones

2 horas
24 horas

Estudie la normalidad de los tiempos obtenidos y observaciones realizadas para cada
prueba, y con ello evalúe si existen deficiencias de los factores de contacto o defectos en
las vías de coagulación.
Bibliografía
 Gaudens, L. (1984). Manual de Hemostasia y Coagulación Sanguínea. Universidad
Central de Venezuela. Ediciones de la Biblioteca. Venezuela.
 Kordich, L., J. Sánchez, H. Vidal, & C. De Campos (1990). Manual de Hemostasia
y Trombosis. 2a ed. Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y
Trombosis. Argentina.
 Cuéllar, F. & F. Falabella (2004). Hematología. 6 a ed. Corporación para
Investigaciones Biológicas. Colombia.

Práctica 8. Reacciones Inmunitarias.
El sistema inmune de los vertebrados, consiste en varios órganos y diferentes tipos de

células, que le permiten al organismo discernir entre agentes propios y extraños con su
consecuente eliminación. Las células del sistema inmune incluyen linfocitos y
diferentes células fagocíticas, organizadas en los tejidos linfoides. Las células del
sistema inmune derivan de células pluripotentes de la médula ósea, órgano en que
ocurre la hematopoyesis. El concepto de inmunología ha madurado rápidamente con el
redescubrimiento y progreso de la genética, y especialmente el descubrimiento en el
suero de las inmunoglobulinas, el desarrollo de la teoría química de los receptores y la
demostración de la inmunogenicidad de substancias químicas artificiales que, ligadas a
proteínas naturales, reaccionan específicamente a las inmunoglobulinas de los animales
inyectados. En tal sentido, la patogenicidad se convirtió en “requisito” de la
inmunogenicidad, mediante el uso de cepas bacterianas atenuadas, o, microorganismos
con reacción cruzada para inducir una protección efectiva, siendo el caso más notable el
desarrollo de la vacuna para la viruela. Desde entonces, la utilización de vacunas para el
control de las enfermedades infecciosas ha tenido un gran éxito en modificar los
patrones de incidencia y mortalidad de cientos de enfermedades
Una vacuna viva consiste de un microorganismo que se puede replicar por sí mismo en
el individuo o que puede infectar células y actúa como un inmunógeno sin causar la
enfermedad natural. Las vacunas vivas usualmente producen tanto inmunidad humoral
como celular. Algunas vacunas vivas se acercan al concepto de una vacuna ideal, por
cuanto pueden producir una protección duradera con pocos efectos secundarios usando
una o dos dosis. La vacuna viva es atenuada, lo cual significa que su capacidad de
causar enfermedad ha sido virtualmente eliminada en aquellos individuos
inmunocompentes para quienes la vacuna ha sido diseñada. Un aspecto importante a
considerar es que los microoganismos atenuados pueden ser transmitidos a otros
individuos no vacunados e incluso a individuos con algún tipo de compromiso
inmunológico, en quienes eventualmente pueden causar enfermedad. Aunque estas
propiedades de las vacunas vivas hacen parecer deseable que todas las vacunas sean de
este tipo, esto no es técnicamente posible para la mayoría de las vacunas que se
desarrollan actualmente. Particularmente, existen dos problemas fundamentales en la
atenuación de microorganismos. La primera dificultad radica en el mecanismo de
atenuación del microorganismo, es decir, como hacerle perder su patogenicidad, sin que
pierda las capacidades de multiplicarse en el hospedero y de producir una respuesta
inmune apropiada. La segunda dificultad consiste en cómo lograr la estabilidad de la
atenuación, debido a que los microorganismos mantienen su capacidad de
multiplicación y pueden eventualmente revertir a la forma virulenta.
Las vacunas vivas atenuadas son teóricamente las ideales, ya que dan lugar a una
infección similar a la natural (los virus atenuados se replican en el organismo humano
igual que los virus salvajes) con una reactogenicidad mínima. La respuesta inmunitaria
es también similar a la de la infección natural (anticuerpos y linfocitos Tc), aunque de
menor intensidad. Las variantes atenuadas se consiguen mediante diferentes
procedimientos. El más clásico es la utilización de patógenos de otras especies que
presenten inmunidad cruzada. La inmunogenicidad de cualquier candidato vacunal debe
ser evaluada en modelos animales antes de estudiar estos candidatos en voluntarios
humanos, el modelo más usado para evaluar la capacidad inmunogénica de
formulaciones vacunales ha sido la inoculación oral, intramuscular o intraduodenal en
conejos adultos.

Las técnicas clásicas de atenuación son aquellas que no utilizan la metodología del
ADN recombinante. Existen cuatro técnicas de atenuación de agentes virales. La
primera técnica consiste en la atenuación mediante pasajes seriados en cultivos de
células para seleccionar las variantes menos virulentas. Aunque no se conocen con
exactitud los mecanismos por los cuales se introducen las mutaciones durante la
replicación viral, empíricamente se ha logrado obtener una serie de vacunas virales
atenuadas con demostrada eficacia, incluyendo las vacunas para polio, paperas,
sarampión, rubeóla y varicela (2, 10, 31, 38, 42). Una segunda técnica consiste en
utilizar virus homólogos causantes de enfermedades veterinarias similares a las
observadas en seres humanos. Se asume que el virus animal estará naturalmente
atenuado para el ser humano pero estará inmunológicamente relacionado, de manera
suficiente, con el virus humano de forma que producirá una respuesta inmunológica
apropiada. La tercera técnica consiste en generar virus con un genoma reordenado
derivado de una coinfección de dos virus diferentes en un cultivo celular. El virus
resultante contiene en su genoma segmentos de los dos virus paternales. La cuarta
técnica consiste en obtener mutantes virales que son incapaces de crecer a temperaturas
superiores a 37°C (temperature-sensitive, ts) o que pueden crecer a temperaturas más
bajas (p. ej. 25°C) (cold-adapted, ca). Se asume que los virus “ts” o “ca” son menos
vigorosos en su crecimiento y, por lo tanto, atenuados.
Objetivos
Dominar las técnicas clásicas para el desarrollo de Vacunas.
Determinar el nivel de anticuerpos ante Salmonella spp. a los 0, 14, 28 y 42 días.
Entender la respuesta del sistema inmune mediante la titulación de antígenos.

Desarrolle los siguientes conceptos: anticuerpo, antígeno, reacciones de aglutinación,
titulación del antígeno, avidez, afinidad, grado de aglutinación.

Conejo adulto New zeland. PBS 1X.
Cultivo de Salmonella spp. Puntas de 100 μL.
NaCl 0,9 M. Portaobjetos.
Kit para tinción de Gram.
Baño de maría.
Fenol.

Jeringa de 10 mL. Alcohol.
Tubos Vacutainer tapa Guantes.
roja.
Algodón.

Metodología
Inactivación de cepas microbianas
Añada a 10mL de NaCl una colonia de un cultivo de Salmonella spp
previamente crecido.
Mida el porcentaje de tramitancia a 580nm de un patrón McFarland 0,5
previamente preparado.
Mida el porcentaje de tramitancia a 580nm del inóculo. Si el valor de tramitancia
es menor al del patrón diluir con NaCl 0,9 M, si es mayor inocular otra colonia.
Realizar una tinción y verificar que las características morfológicas coincida con
la especie (Bacilos Gram-).
Coloque la dilución en una baño de agua hirviendo por 2 1/2h.
Añada como preservativo fenol a una concentración final de 0,5%.
Preserve a -20 ºC hasta su uso.
Obtención de anticuerpos.
A intervalos de 7 días, inyectar vía intramuscular un conejo adulto, con 0,5-1-2 y 2

mL de antígeno inactivado.
En tubos vacutainer, obtener 5 mL de sangre el día 7, 14, 21 y 28, colocar la
muestra en tubo estéril y dejar que coagule para centrifugar la muestra de sangre a
2500 rpm durante 10 minutos y obtener posteriormente el suero bajo condiciones
de esterilidad.
Distribuirlo en alícuotas en tubos estériles con la identificación de la fecha
correspondiente.
Congelar las muestras a -20 °C.
En un portaobjetos limpio colocar 20 μL de PBS 1X y 20 μL del suero problema
homogeneizar.
Realizar 3 diluciones dobles seriadas del suero en PBS 1X homogeneizar.
Agregar 10 μL del antígeno.
Homogeniza la suspensión con palillo de madera.
Dejar reposar durante dos minutos para observar la aglutinación.
Realice el mismo procedimiento con los anticuerpos obtenidos en la práctica 4.
La dilución que muestre la aglutinación se expresa como el título recíproco de la
dilución mayor.
Discuta la presencia de aglutinación que puede presentarse de leve a intensa expresada

como 1+, 2+, 3+ y 4+ en los primeros dos a tres minutos, como esto, esta relacionado a
la respuesta inmune del animal, por otra parte, discuta sobre como puede desaparecer en
la forma alterna de dilución del suero en la dilución mayor debido a una respuesta
intensa (fenómeno de zona).

Bibliografía
 .García. F. (1999). Mecanismos moleculares para el desarrollo de vacunas. Acta pediátr.
costarric. (13):2. Ledón, T.; B. Ferrán., J. Vichi., E. Suzarte., R. Oliva., R. Fando.
(2010). Evaluación en modelos animales de cepas vivas atenuadas de vibrio cholerae
O139. Rev. CENIC. Ciencias Biológicas, (41): 1-12 pp.
 Lodish, H., A. Berk, P. Matsudaira, C. Kaiser, M. Krieger, M., Scott, S. Zipursky &
 Salleras. L. (2002). Tecnologías de producción de vacunas I: vacunas vivas
atenuadas.Vacunas (3): 29-33pp
 Stansfield, W., J. Colomé & R. Cano (2003). Molecular and Cell Biology. McGraw-
Hill. USA.
 Palomo. I., A. Ferreira., C. Sepúlveda., M. Rosemblatt & U. Vergara.(2009).
Fundamentos de inmunología básica y clínica. Editorial Universidad de Talca. Talca-
Chile.

Práctica 9. Cáncer.
El ciclo celular de una célula somática constituye una serie ordenada de eventos
macromoleculares que culminan con la división de la célula madre en dos células hijas,
cada una de las cuales contiene una carga cromosómica idéntica a la de la célula madre.
En los organismos multicelulares puede ocurrir que muchas células diferenciadas salgan
del ciclo celular y entren en un estado de latencia en el que pueden sobrevivir por días,
semanas, o incluso en algunos casos nunca volver a dividirse durante el resto del tiempo
de vida del organismo. La división celular es la culminación de una serie de eventos que
ocurren desde la última vez que la célula se ha dividido. El período entre dos divisiones
mitóticas define el ciclo de una célula somática.
El cáncer se produce por la generación de fallas en la adquisición de nutrientes, en los

mecanismos de reparación del ADN, y de control del ciclo, división y muerte celular,
debido a factores externos (ambientales) o genéticos. Por ello se ha definido como una
aberración del comportamiento celular. La mayoría de los tipos celulares del organismo
pueden dar origen a células cancerígenas, que se pueden multiplicar en ausencia de
factores de crecimiento y no experimentan apoptosis. Las células cancerígenas invaden
los tejidos circundantes, después de atravesar las láminas basales que definen los límites
de los tejidos y de diseminarse por todo el organismo, para establecer zonas de
crecimiento secundarias (metástasis). Los tumores metastásicos secretan proteasas que
degradan la matriz extracelular circundante. Por su parte, los tumores primarios y
secundarios requieren de la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), para
crecer y formar una masa grande.
Las características principales que definen a las células cancerígenas son las siguientes:
Autosuficiencia en cuanto a señales de crecimiento.
Insensibilidad a las señales de inhibición del crecimiento.
Evasión de la apoptosis.
Potencial replicativo ilimitado.
Invasión del tejido y metástasis.
Angiogénesis.
Existen diferentes tipos de cultivos celulares, los cuales pueden diferenciarse entre sí
principalmente por su capacidad para dividirse, su tipo de crecimiento y su
proveniencia. Así tenemos que los cultivos primarios son células aisladas directamente
del tejido a estudiar que pueden ser propagadas y subcultivadas in vitro, presentando un
crecimiento en monocapa. Estas células requieren del suministro de aminoácidos
esenciales y factores de crecimiento para su subsistencia. Con cada subcultivo sucesivo,
las células con una lenta velocidad de división o con menor resistencia a las
manipulaciones o tratamientos de disgregado se perderán, y el cultivo será cada vez más
homogéneo y estable. Los cultivos primarios pueden ser propagados de forma inalterada
por un número limitado de generaciones, luego de lo cual entran en período de
senescencia final. La alteración de estos cultivos puede dar origen a las líneas celulares
por transformación in vitro, lo que puede ocurrir de forma espontánea o inducida
mediante agentes químicos o virus. Sin embargo, la inmensa mayoría de los cultivos
primarios no dan origen a líneas celulares continuas espontáneamente. Las líneas
celulares se caracterizan por presentar una morfología homogénea, por su capacidad
para dividirse ilimitadamente, por presentar crecimiento en monocapa y por su

incapacidad para sobrevivir por largos períodos de tiempo en ausencia de aminoácidos

esenciales y factores de crecimiento. Por su parte, los cultivos de células cancerígenas
se caracterizan por tener un ciclo celular alterado (sin regulación), lo que les permite
replicar su genoma varias veces en una sola vuelta del ciclo celular, dividirse en forma
descontrolada e ilimitada, crecer en múltiples capas formando cúmulos de células y
producir sus propios factores de crecimiento y elementos necesario para su
supervivencia en medios en los que éstos están ausentes. Algunas células en cultivo in
vitro, que son transfectadas con ADN de células tumorales también se transforman y
comparten muchas de las propiedades de las células tumorales. El requerimiento de
múltiples mutaciones en la inducción del cáncer concuerda con el incremento observado
en la edad avanzada. Cabe destacar que la mayoría de estas mutaciones son somáticas y
no están contenidas en el ADN de la línea germinativa.
Objetivos
Caracterizar morfológicamente muestras de diferentes tipos de tejido normal y de
tejido cancerígeno.
Reconocer las principales diferencias entre cultivos primarios, líneas celulares y
células cancerígenas.

Elabore un cuadro comparativo con las características morfológicas que presentan los
cultivos primarios, líneas celulares y células cancerígenas.

Agua destilada. Láminas micropreparadas para la
Eosina ácida. observación de morfología celular en
Etanol 70% p/v. tejido normal y cancerígeno.
Giemsa. Láminas portaobjetos y cubreobjetos.
Goteros. May Grünwald.
Hematoxilina de Mayer. Microscopio óptico.

Cámara fotográfica (opcional, se puede emplear para sustituir la esquematización de las
observaciones).
Metodología
Tinción Hematoxilina-Eosina
Tome el portaobjetos con la muestra de cultivo celular que le fue asignada y colóquelo
en una Cápsula de Petri limpia. Añada 300 μL de solución de Hematoxilina de Mayer
en la región donde se observa el cultivo y deje actuar durante 20 minutos. Descarte el
exceso de colorante realizando tres lavados con agua destilada hasta que la muestra
tome una coloración azul y deje secar. Coloque 300 μL de solución de eosina ácida en
la región donde se observa el cultivo y deje actuar durante 5 minutos. Retire el exceso
de colorante realizando tres lavados con etanol al 70% y deje secar. Observe su muestra
y la de sus compañeros, y esquematice o capture digitalmente las imágenes.

Tinción May Grünwald-Giemsa

Tome el portaobjetos con la muestra de cultivo que le fue asignada y colóquelo en una
Cápsula de Petri limpia. Añada 300 μL de solución de May Grünwald en la región
donde se observa el cultivo y deje actuar durante 15 minutos. Descarte el exceso de
colorante realizando tres lavados con agua destilada y deje secar. Coloque 300 μL de
solución de Giemsa en la región donde se observa el cultivo y deje actuar durante 15
minutos. Retire el exceso de colorante realizando tres lavados con agua destilada y deje
secar. Observe su muestra y la de sus compañeros, y esquematice o capture digitalmente
las imágenes.
Diferenciación de tejidos normales y cancerígenos

Observe en el microscopio óptico las láminas micropreparadas con diferentes muestras
de tejidos normales y cancerígenos y esquematice o capture digitalmente la imagen.

Establezca las principales diferencias morfológicas y arquitectónicas entre las muestras
de cultivos celulares y de tejidos observadas.
Bibliografía
 Frank, S. (2007). Dynamics of Cancer: Incidence, Inheritance, and Evolution.
Princeton University Press. USA.
 Lewin, B. (2004). Genes VIII. Pearson Prentice Hall. USA.
 Lodish, H., A. Berk, P. Matsudaira, C. Kaiser, M. Krieger, M., Scott, S. Zipursky &
 Stansfield, W., J. Colomé & R. Cano (2003). Molecular and Cell Biology. McGraw-
Hill. USA.

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Universidad de Carabobo

Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología

Elaborada por: Luis Ramírez, Eucandis Fuentes,

Modificada por: Eucandis Fuentes, Luís Ramírez, José Núñez, Leandro

Tabla I. Valores porcentuales normales en los diferentes grupos de leucocitos. ............ 5

Tabla II. Proporciones para la preparación de muestra de sangre periférica. ................. 26

Figura 1. Tipos de células sanguíneas (NCI, 2008). ........................................................ 3

Departamento de Biología- FACYT-UC. ii

1. El uso de la bata de protección, y de guantes de látex según sea el caso, es

2. No se permite comer, beber ni fumar dentro de las instalaciones del Laboratorio.

3. La manipulación del material del laboratorio (vidriería y reactivos) debe realizarse

4. Se recomienda utilizar un cuaderno de laboratorio durante la práctica. Puede

Departamento de Biología- FACYT-UC. 1

Práctica 1. Morfología Celular

Liquido Cefalorraquídeo (LCR)

Departamento de Biología- FACYT-UC. 2

Figura 1. Tipos de células sanguíneas (NCI, 2008).

Departamento de Biología- FACYT-UC. 3

Intensidad de color: proporciona una idea de su contenido en hemoglobina.

La modificación del porcentaje de leucocitos puede orientar al diagnóstico de

Departamento de Biología- FACYT-UC. 4

Tabla I. Valores porcentuales normales en los diferentes grupos de leucocitos.

Departamento de Biología- FACYT-UC. 5

Semen o Plasma Seminal

Departamento de Biología- FACYT-UC. 6

Departamento de Biología- FACYT-UC. 7

Colorantes Metacrómicos: se caracterizan por teñir de diferente color que el

Actividades previas que debe realizar el estudiante

Material disponible en el laboratorio

Departamento de Biología- FACYT-UC. 8

Tubos de centrífuga de 15 mL de Centrífuga.

Material que debe traer el estudiante

Líquido Cefalorraquídeo (LCR)

Sangre (Tinción Giemsa)

Departamento de Biología- FACYT-UC. 9

Cuantifique el número leucocitos, según su tipo. Indique si observa la presencia de

Departamento de Biología- FACYT-UC. 10

normal y con morfología anormal. Reporte esa cuantificación de manera porcentual e

Células Epiteliales (Tinción Hematoxilina – Eosina)

Departamento de Biología- FACYT-UC. 11

Células Procariotas y Fúngicas

Puntos a discutir en el informe

Departamento de Biología- FACYT-UC. 12

Práctica 2. Fraccionamiento Celular

La célula eucariota es un sistema altamente organizado con organelas que cumplen

La separación por centrifugación se basa en las diferencias de tamaño y densidad. La

En la centrifugación diferencial, el homogeneizado es centrifugado repetidas veces a

Actividades previas que debe realizar el estudiante

Departamento de Biología- FACYT-UC. 13

Material disponible en el laboratorio

Material que debe traer el estudiante

Obtención de los homogenatos

Gradiente discontinuo de densidad

Departamento de Biología- FACYT-UC. 14

última capa se depositará la muestra biológica, que consiste en 1 mL del

Al finalizar la centrifugación observe y compare la disposición del homogeneizado en

1. Determinación de la cantidad de ADN: tome 100 μL de las soluciones de P1, P2,

Departamento de Biología- FACYT-UC. 15

2. Determinación de fosfato: una vez determinada la absorbancia a 260 nm a los

Adicionalmente, determine la presencia de transporte de electrones en las fracciones

Departamento de Biología- FACYT-UC. 16

Puntos a discutir en el informe

Departamento de Biología- FACYT-UC. 17