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Manualdemtodosgeneralesparadeterminacindecarbohidratos 141106162652 Conversion Gate02 PDF
Manualdemtodosgeneralesparadeterminacindecarbohidratos 141106162652 Conversion Gate02 PDF
GENERALES PARA
DETERMINACIÓN DE
CARBOHIDRATOS
UPTC
2014
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1. INTRODUCCION
Los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son
carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y
numerosas gomas. Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan
especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se
encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que
conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Dada la
importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su
determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero
todos ellos se basan en el mismo principio:
Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como
azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos
en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente
en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución
alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los
azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la
que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una
substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma es conocida
como Espectrofotometría
Dentro de la bromatologia un apartado escencial son las pruebas analiticas las cuales no
son otra cosa que la identificacion y cuantificacion de los diversos carbohidratos
presentes en un alimento, pudiendo aprovechar un carbohidrato con fienes industriales o
para aseguarar la composicion que un producto alimentario pueda tener; la analitica
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permite entre otras cosas el control del estado de las materias primas o los productos
durante todo el proceso de transporte almacenamiento o transformacion.
INDICE
1. INTRODUCCION 2
2. METODOS CUANTITATIVOS 5
2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR 5
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)
2.2 DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR 7
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS)
2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO OPTICO DE 10
POLARIMETRIA
2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA, SACAROSA Y FRUCTUOSA) 12
POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION)
2.5 DETERMINACION DE AZUCARES POR ESPECTROSCOPIA POR 17
INFRARROJO CERCANO
2.6 ANALISIS DE POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA) 20
3. METODOS CUALITATIVOS 22
3.1 PRUEBA DE MOLISCH 22
3.2 PRUEBA DE BENEDICTO 23
3.3 PRUEBA DE LUGOL 24
3.4 PRUEBA DE BIAL 24
3.5 PRUEBA DE SELIWANOFF 26
3.6 PRUEBA DE BARFOED 27
3.7 PRUEBA DE FEHLING 28
3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA CARBOHIDRATOS 28
4. BIBLIOGRAFIA 29
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2. METODOS CUANTITATIVOS
2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)
INTRODUCION
El metodo por espectrofotometria UV hace referencia al uso de la luz para medir las
concentraciones de ciertas sustancias quimicas. Para que este fenomeno pueda llegar a medirse
se debe tener presente la concentracion de las especies abosorbentes dado a que esta es
proporcional a la absorbancia según la ley de lamber-bee donde:
A=e×b×c
FUNDAMENTO
Reaccion:
METODOLOGIA
Preparacion de la muestra
concentrado rápidamente a la mezcla. Luego los tubos de ensayo se dejan en reposo durante 10
min, se agitan durante 30 segundos y se colocan durante 20 min en un baño de agua a
temperatura ambiente para el desarrollo de color. El blanco y la solución patrón se preparan
conforme al procedimiento anteriormente descrito, utilizando el carbohidrato de interés.
Finalmente se lleva a una celda donde se deposita en el espectrofotómetro para programar la
longitud de onda a 490 nm y se procede a leer la absorbancia (M. DuBois, K. Gilles, J. Hamilton, P.
Rebers y F. Smith, 1956).
Se procede a determinar las diferentes concentraciones del carbohidrato partiendo de 0.01 % que
indica 0.1 gramos en 1000 ml de agua. Posteriormente se toman alícuotas de 0.1; 0.2; 0.3 y se
completa a volumen para 1.0 ml con agua destilada. Por último se añade el fenol y el ácido
sulfúrico siguiendo la metodología anterior, para ser leídas en el espectrofotómetro (R. Matissek,
F.M. Schnepel y G. Steiner, 1992).
Tabla 1: Preparacion de las soluciones patrones para elaborar una curva patron.
patrón del
N° de azúcar (0.1 g/ agua fenol 5% H2SO4 Concentración
tubos 1000 ml) (ml) (ml) (ml) µ/ml Absorbancia
1 0.1 0.9 1.0 5.0 10 µ/ml -
2 0.2 0.8 1.0 5.0 - -
3 0.3 0.7 1.0 5.0 - -
4 0.4 0.6 1.0 5.0 - -
5 0.5 0.5 1.0 5.0 - -
6 0.6 0.4 1.0 5.0 - -
7 0.7 0.3 1.0 5.0 - -
8 0.8 0.2 1.0 5.0 - -
blanco 0.9 0.1 1.0 5.0 - -
Fuente: Análisis de alimentos. 2da edición, Editorial Acriba S.A Zaragoza España.
0.1 ml X
X = 10ug/ml (así determinamos para cada una de las concentraciones del azúcar)
RESULTADOS
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Para leer los resultados de la muestra a analizar, es necesario contruir una curva de calibracion o
curva patron a diferentes concentraciones con el carbohidrato de interes (disacaridos y
monosacaridos) para determinar la absorbancia. Para calibrar el espectrofotometro se procede a
ubicar el blanco que se tiene provisto en la celda, ajustandolo al 100% de transmitancia y 0,000 de
absorbancia. Una vez obtenida la absorvancia de cada concentracion, se grafica sobre excel o una
hoja de papel milimetrado absorvancia vs concentracion de cada solucion preparada. La ecuacion
de linealidad que arroje la grafica de la curva patron se tomara como referencia para hallar
matematicamente la concentracion del azucar presente en la muestra.
Entonces:
teniendo en cuenta los datos de la ecuacion lineal despejamos X (lo tomamos como
concentracion del analito). Como obtenemos la concentracion diluida en ppm se realizan los
calculos necesarios para determinar la concentracion en gramos de la muestra analizada en
determinado alimento. O de igual manera la absorbancia que obtenemos cuando medimos la
muestra se interpola o extrapola en la grafica según el valor arrojado.
INTRODUCCION
Los azucares reductores poseen poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal
que le confiere la caracteristica de poder reaccionar con otros compuestos. El metodo de miller o
DNS (acido dinitrosalicilico como reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores
mostrando un comportamiento diferencial hacia mono y disacaridos, dando resultados
colorimetricos que se puede medir con una longitud de onda de 575 nm.
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FUNDAMENTO
METODOLOGIA
Se implementa el mismo metodo para realizar la curva patron, como se describio en el metodo
fenol-sulfurico. Emplendo una solucion patron de glucosa con una concentracion de 1.0 g/L, para
la cual se disuelve 0.1 gramos de glucosa en 90 ml de agua y se lleva a volumen a 100 ml. Esta
solucion patron se prepara a difentes concentraciones adicionando a cada tubo 1 ml del reactivo
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de DNS con agitacion constante. Posteriormente se lleva a baño maria durante 15 minutos se deja
enfriar y se añade agua destilada hasta completar el volumen respectivo. Se determina la
absorbancia de cada tubo a 575 nm en el espectrofotometro UV.
Preparacion de la muestra
Se toma 1 ml de la solucion acuosa de la muestra, enseguida se adiciona 1ml del reactivo de DNS
y se calienta por 15 minutos en baño maria. Se deja enfriar y se diluyen con 10 ml de agua
destilada. Se procede a leer la absorbancia junto con el blanco a la misma longitud de onda que
las muestras para la curva patron.
RESULTADOS
para realizar la curva patron se grafica concentracion en ppm de la glucosa vs absorbancia de las
muestras diluidas a diferentes concentraciones.
INTRODUCCION
FUNDAMENTO
Se coloca un tubo de muestra que contiene un liquido en solucion, entre dos elementos
polarizantes. El primer elemento (polarizador) polariza la luz antes de que esta pase a traves de la
muestra. El segundo elemento (analizador) puede girarse para contrarrestar cualquier rotacion
por la muestra y por tanto, localiza la posicion angular resultante del plano de la luz, y por tanto la
cantidad de rotacion causada por la muestra, donde se expresa en grados angulares. En la
industria del azucar la rotacion se expresa sobre una escala diferente que se denota como °Z. A
continuacion un esquema de polarizacion de una muestra de azucar en solucion.
Fuente: https://es.scribd.com/doc/89862717/Analisis-polarimetrico.
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Cada sustancia opticamente activa tiene su rotacion especifica, determinada por la siguiente
ecuacion:
Donde:
c= concentracion
t= temperatura
λ=longitud de onda
1 - Entrada de luz de Na
2 - Lente de iluminación
3 - Filtro de luz
4 - Polarizador
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5 - Placa
7 - Analizador
10 - Lupa
11 - Panel de lectura
METODOLOGIA
RESULTADOS
Se determina la concentracion del azucar según la ecuacion y el angulo de rotacion, junto con la
temperatura al momento de la lectura con el equipo:
INTRODUCCION
La HPLC o cromatografia liquida de alta resolucion es una tecnica cromatografica usada para
separar componentes de una muestra que se fraccionan entre una fase movil liquida y una fase
estacionaria solida compuesta por particulas muy finas contenidas en una columna, y donde se
utiliza una presion muy elevada para forzar el paso del disolvente a traves de ella, consiguiendo
asi separaciones de gran resolucion, permitiendo su identificacion y cuantificacion. La
cromatografía líquida de alta resolución tiene ventajas en el análisis de los azúcares debido a su
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FUNDAMENTO
Para la separacion de carbohidratos como sacarosa, glucosa y fructosa se utiliza una columna de
separacion rellena de una resina de intercambio cationico con base calcica, que exhiben
propiedades como intercambio de ligandos y exclusion por tamaños.
MATERIALES Y EQUIPOS
Reactivos
METODOLOGIA
Se preparan 1000 ml de solución de EDTA (Sal Cálcica) de 50 ppm, se filtra por membrana de
0.45 µm y se desgasifica.
Preparacion de la muestra
Tres parametros instrumentales que afectan la sensibilidad son: la temperatura del detector,
presion del gas de nebulizacion y la ganancia. La temperatura del detector se estudia a un
intervalo de 40-60 °C. una temperatura de 45 es suficiente para permitir la evaporacion completa
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del disolvente y por lo tanto dando un ruido insignificante. Una velocidad de flujo (presión) del
sistema del aire a 3 bar y una ganancia de 5 proporcionaron una buena sensibilidad y una
adecuada relación señal-ruido (Luciana C. Nogueira 2005).
Cálculos
Donde:
Area = Dada por el integrador para el estándar de Calibración de Sacarosa
Concentración = Gramos exactos de Sacarosa Pesados
Para hallar el % de sacarosa:
% sacarosa= Area de la muestra a 7. 53 min x 100%
FR x concentracion muestra
Cálculo del porcentaje de Glucosa en la muestra
Se procede igual que para el cálculo de la Sacarosa, teniendo en cuenta que el tiempo de elución
de la glucosa es en aproximadamente 9.52 min. Se toma el área de la Glucosa correspondiente a
un tiempo de elución de aproximadamente 9.52 minutos y se calcula el Factor de Respuesta (FR).
Donde:
Area = Dada por el integrador para el estándar de Calibración de Glucosa
Concentración = Gramos exactos de Glucosa Pesados
Para hallar el % de glucosa:
% glucosa = Area de la muestra a 9.52 min x 100%
FR x concentracion muestra
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Donde:
Imagen 5. Muestra un cromatograma típico para la separación de los cinco hidratos de carbono
utilizados en el proceso de optimización.
Fuente: Journal of Chromatography A, Volume 1065, Issue 2, 2005, 207 – 210. (1) La fructosa
(t R 8,76 min), (2) la glucosa (t R 9,71 min), (3) la maltosa (t R 15,45 min), (4) maltotriosa (t R 22,21
min), (5) maltotetraosa (t R 29,41 min). La concentración de los estándares en la mezcla fue de 2 g
/L
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La figura anterior representa el método estándar externo que se usa generalmente para calibrar el
sistema cromatográfico para la cuantificación de hidratos de carbono. Para ello, las soluciones
estándar azúcares con diferentes concentraciones (0,05-5,0 g / L para la fructosa, 0,05-5,0 g / L
para la glucosa, 0,05 a 15,0 g / l de maltosa, 0,05 a 10,0 g / L para maltotriosa, y 0.05- Se utilizaron
5,0 g / L para la maltotetraosa), de acuerdo a la concentración de la muestra en el alimento Y.
(Wei, MI Ding J. Chromatogr. A, 904 (2000))
INTRODUCCION
FUNDAMENTO
Pueden distinguirse dos categorías básicas de vibraciones: de tensión y de flexión. Las vibraciones
de tensión son cambios en la distancia interatómica a lo largo del eje del enlace entre dos átomos.
Las vibraciones de flexión están originadas por cambios en el ángulo que forman dos enlaces. En
principio, cada molécula presenta un espectro IR característico (huella dactilar), debido a que
todas las moléculas (excepto las especies diatómicas homonucleares como O2 y Br2) tienen
algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorción de una determinada longitud de onda
en la zona del espectro electromagnético correspondiente al infrarrojo.
En la zona del espectro electromagnético IR con longitudes de onda del infrarrojo medio (entre
4000 y 1300 cm-1) se suelen observar una serie de bandas de absorción provocadas por las
vibraciones entre únicamente dos átomos de la molécula. Estas vibraciones derivan de grupos
que contienen hidrógeno o de grupos con dobles o triples enlaces aislados. (Nakamoto K., 1997).
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METODOLOGIA
Generalmente las muestras sólidas se debe pulverizar hasta que el tamaño de sus partículas
sea menor que la longitud de onda de la radiación (<2 µm) para evitar los efectos de la
dispersión de la misma.
Una de las técnicas más populares es la formación de pastillas de KBr (también se han usado
otros haluros de metales alcalinos). Las sales de haluros tienen la propiedad de flujo en frío
(cold flow), por lo que, cuando se somete a la presión adecuada este material finamente
pulverizado, sinteriza y forma una tableta transparente que se asemeja a un cristal. Al usar
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Análisis cuantitativo
A = -log (I/Io) = a · b · c
RESULTADOS
Para los compuestos carbonilicos, como aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos y sus derivados, el
grupo funcional principal en los carbohidratos es el que absorbe con una alta intensidad en la
región del infrarrojo en la zona de 1850- 1650 cm-1. Estas vibraciones generalmente por
alargamiento de este grupo específicamente.
Fuente: Mc.Murry J. Química Orgánica, quinta edición .Thomson Editores México 2000).
Los picos que identifican cada banda en el espectro se relaciona a la longitud de onda entre los
enlaces de la molécula. Así tenemos enlace C-C, C-H etc.
La fibra dietética se define como los polisacáridos y lignina que no son digeridos por enzimas
humanas (Lee y Prosky, 1995). Los métodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se
fundamentan en aislar la fracción de interés con la precipitación selectiva y después determinar su
peso. Una muestra gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere enzimáticamente con
alfa-amilasa, amiloglucosida y proteasa para hidrolizar el almidón y la proteína. El contenido total
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de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la solución para precipitar toda
la fibra. La solución entonces se filtra, se recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta como
fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985)
FUNDAMENTO
METODOLOGIA
Pesar por 1g de muestra (exactitud de 0.1g) en matraces de 500 mL. El peso de las muestras no
debe diferir en más de 20 mg. Adicionar 50 mL de buffer de fosfatos 0.08M pH 6 0, Medir pH y
ajustar a pH 6± 0.2 si es necesario.
Adicionar 0.1 mL de la solución de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el matraz
en un baño a ebullición durante 15 min. Agitar suavemente cada 5 minutos. Verificar con
termómetro que los matraces mantengan 95-100°C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura
ambiente Ajustar a pH 7.5± 0.2 adicionando 10 mL de NaOH 0.275N, agregar 5 mg de proteasa
(disolver 50 mg de proteasa en 1mL de buffer de fosfatos. Adicionar 0.1mL de la solución a cada
matraz). Cubrir el matraz con papel aluminio y colocarlos en un baño a 60°C por 30 minutos con
agitación continua.
Restar el peso del crisol con la celita para conocer el peso del residuo
RESULTADOS
Donde:
- m1 = masa del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado
(mg).
Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra original considerando que ha sido
desgrasada en el caso de contener más de 10 % de grasa.
3. METODOS CUALITATIVOS
3.1 PRUEBA DE MOLISCH
Método: se colocan 1-2 mililitros (ml) de una solución “muestra” en un tubo de ensayo, se añaden
dos gotas de reactivo de Molisch (una solución de α-napthol en etanol al 95%). se vierte luego
lentamente por la pared del tubo (Quesada, 2007) 1-2 ml de ácido sulfúrico concentrado de
(Harpercollege, n.d.).
Cuando un carbohidrato posee en su estructura un grupo carbonilo libre (C=O) esta reducirá el
reactivo de Benedicto por oxidación con los iones cobre en una solución de pH alcalino y la acción
del calor (Punto de ebullición); y formara acido carboxílico; al reaccionar se puede denominar
como azúcar reductor (Sakuta, n.d.).
Resultados: la reacción positiva es una coloración que va desde verde, amarillo, naranja y rojizo, el
grado de coloración y el tono radica en la concentración de cobre oxidado (Cu2O); esta reacción
indica que es un azúcar reducido.
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La interacción del yodo o yodo potásico con el almidón forma coloraciones azules oscuras, debido
a la ocupación de los espacios libres del glúcido, este es un glúcido alterado, al cual, sus
propiedades físicas son modificadas, como la no absorción lumínica
Esta prueba detecta las pentosas. El reactivo deshidrata las pentosas formando furfural
(derivados de las pentosas). Estos derivados de las pentosas además reaccionan con orcinol y los
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iones de hierro presentes en el test reactivo, generan productos de color azul (HARPER COLLEGE,
n.d.).
Método: tomar dos ml o 1-2 gotas (Mahesh, Murugesh y Mohana, 2006) de una muestra de
solución y colocarla en un tubo. Tomar dos ml del reactivo de Bial (solución de orcinol, HCl y
cloruro férrico) y adicionarlo en el tubo. Entonces calentar la solución lentamente con un
mechero Bunsen o en baño de María (HARPER COLLEGE, n.d.). Se debe calentar a 60 º C durante
10 minutos (Díaz, Jorrín y Bárcena).
Resultados: es positivo si se observa un derivado azulado. Otros colores indican negativo (ver
imagen 13). Las hexosas generalmente producen un resultado de color verde, rojo o café
(HARPER COLLEGE, n.d.).
Esta prueba detecta cetosas (hexosas). En el test se provoca una reacción de deshidratación de
cetohexosas para formar 5 hidroximetilfurfural. La formar 5 hidroximetilfurfural además
reacciona con el resorcinol presente en el test (HARPER COLLEGE, n.d.).
Metodo. Tomar 1 ml de la solución y colocarla en un tubo. adicionar 1-3 ml del reactivo de Barfoed
(Danmalam, Et. Al., 2009) (solución de acetato cúprico y ácido acético) y adicionarla. Calentar la
solucion al baño de maria durante tres minutos (HARPER COLLEGE, n.d.).
Resultados: la formacion de precipitaciones rojizas dentro de los tres minutos indican un
resultado positivo (HARPER COLLEGE, n.d.).
La prueba hace reduce el cobre (Cu++) por oxidacion con los todos los azucares reductores,
siempre que este en medio alcalino con una presencia de tartrato de sodio y potasio para permitir
la estabilizacion del cobre (De, Dey y Ghosh, 2010); (ver imagen 9).
Metodo: se llevan las dos fracciones del reactivo a un tubo de enzayo; la fraccion A es el sulfato de
cobre 7% disuelto en agua y la fraccion B es el Tartrato de potacio 35% y hidroxido de sodio 10%
diluidos en agua, una vez completado el reactivo (A:1-2ml+B:1-2ml) (UNIVERSIDAD DE LA
LAGUNA, n.d.) se mescla bien y se adicionan 1-5 ml del la muestra al tubo de enzayo y se lleva al
baño de maria por 5 minutos (Danmalam, Et. Al., 2009)
Resultado: la reaccion positiva forma un presipitado de color rojo ladrillo por la oxidacion del
cobre (reduccion).
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