Docente: Camilo Andrés Correa-Cárdenas-Rodríguez

de Agosto del 2019

GUÍA 1
ESTERILIZACIÓN, PRUEBAS DE ESTERILIDAD Y
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
1. INTRODUCCIÓN

1.1 Esterilización y pruebas de esterilidad

La esterilización es un método indispensable a la hora de desarrollar prácticas de laboratorio en

microbiología. Éste implica el control del crecimiento microbiano asegurando que podemos
destruir o eliminar toda forma de vida microscópica incluyendo virus y estructuras microbianas
resistentes como las esporas presentes en superficies, muestras, medios de cultivo, materiales de
trabajo o de manipulación de material biológico (Leahy et al., 1999). La esterilización es
indispensable en todas las áreas de aplicación de la microbiología: ambiental, industrial y clínica.
Es por esto que es muy importante que ustedes se familiaricen con esta técnica y las diferentes
pruebas que debemos hacer para probar esterilidad (ausencia de entidades vivas).

En muchas ocasiones se confunde el concepto esterilización con desinfección, por esto es

importante aclarar que la desinfección solamente es una técnica física o química para inactivar
parcialmente microorganismos potencialmente patógenos para humanos con desinfectantes o
antisépticos (estos últimos deben ser compatibles con tejidos biológicos para que no causen
ningún daño al aplicarse). La desinfección reduce la concentración microbiana pero no la
elimina en su totalidad. Algunos desinfectantes que encontraremos en el laboratorio son etanol
e hipoclorito de sodio (NaClO) (Leahy et al., 1999).

Por mencionar algunos ejemplos, en la industria alimentaria y farmacéutica es necesario

mantener la inocuidad de los alimentos y los medicamentos mediante condiciones y medidas
que incluyen técnicas de esterilización y desinfección apropiadas.

La técnica física de esterilización que es más común en microbiología se hace con Calor Húmedo
dentro de un equipo llamado Autoclave (ver figura 1). Este equipo diseñado por Chamberland
en 1884 tiene una tapa metálica y una resistencia eléctrica adentro que calienta el agua. El vapor
en el interior del autoclave se desplaza por una válvula de purga dejando que se sature el vapor
a altas presiones y a temperaturas superiores a los 100ªC sin que se produzca ebullición (Leahy et
al., 1999; Pérez-Uz et al., 2011).
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Figura 1. Ejemplo de Autoclave presente en la Universidad Central.

Tomado de: https://2.imimg.com/data2/PM/LY/MY-1229014/autoclave-cooker-type-stainless-steel-autoclave-and-sterilizers-500x500.jpg

En microbiología el autoclave lo utilizamos para esterilizar medios de cultivo autoclavables y

algunos implementos como material de vidrio (cajas de petri vacías, erlenmeyers, beakers),
material plástico autoclavable, pinzas metálicas, hisopos, rastrillos de vidrio, papel envuelto, entre
otros.

Los medios de cultivo como Agar Sangre, Agar Chocolate (sangre de cordero), Baird Parker
(yema de huevo), Agar enterococal (2,3, 5-cloruro trimetil tetrazólico), así como soluciones de
sueros o antibióticos se descomponen o denaturan a altas temperaturas (Phillips & Brock, 1991).

Aunque aquí usaremos la técnica de calor húmedo, hay que tener presente que existen otras
técnicas de esterilización como Radiaciones (luz ultravioleta), Calor Seco y Filtración.

Las pruebas de esterilidad usualmente se realizan ambientes de trabajo y materiales de trabajo

que vamos a utilizar como cajas de petri y medios de cultivo. Estas pruebas tienen una gran
importancia puesto que nos permiten verificar focos de contaminación en áreas de laboratorios
de educación, investigación, diagnóstico clínico y producción industrial ó agrícola.

En un laboratorio de microbiología es necesario que las zonas de siembra ó cámaras de flujo

laminar permanezcan estériles. Una técnica para esterilizar una cámara de flujo laminar es con la
luz ultravioleta que ésta tiene. Se debe encender la luz UV por lo menos una hora antes de trabajar
y luego apagar y esperar 15 minutos para evitar tener algún problema de salud con el operario
puesto que la luz UV (230nm) es mutagénica y por tanto altera el ADN generando deformación
de las hebras mediante la formación de dímeros de pirimidinas (Leahy et al., 1999).

Finalmente, una prueba de esterilidad es positiva cuando el material ó el ambiente está estéril y
consecuentemente no hay crecimiento microbiano.
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1.2 Preparación Medios de Cultivo

Los medios de cultivo sean agares o caldos se preparan pesando las bases o ingredientes por
separado y disolviendo en el volumen apropiado de agua. Por lo general, podemos encontrar
todos los medios de cultivo pulverizados en el comercio. Usualmente las etiquetas de los medios
dicen cuántos gramos deben disolver para preparar un litro de agua destilada. Los medios los
disolvemos por agitación constante e hirviendo en un Erlenmeyer y posteriormente lo taponamos
con algodón y gasa y lo autoclavamos si éste es autoclavable.

Aunque más adelante en la guía de Técnicas de Siembra, Tipos de Medios de Cultivo y

Ecométrico aprenderemos a clasificar los medios de cultivo y conoceremos varios de ellos. En
esta práctica es importante mencionar que existen dos medios de cultivo nutritivos que se usan
comúnmente para aislar todo tipo de bacterias y hongos (levaduras y filamentosos). Estos son
respectivamente el Agar Nutritivo (AN) y el Agar Papa Dextrosa (PDA) (Brown & Brown, 2012).

EJEMPLO DE ETIQUETA PARA PREPARAR UN MEDIO DE CULTIVO:

Agar Nutritivo: Suspender 32 gramos en 1 litro de agua destilada.

Para cada caja de petri de 9cm de diámetro se sirven 20ml de medio que corresponde a
aproximadamente ¾ de la altura de la caja de petri.
Para cada tubo inclinado se agregan de 5 a 8ml de medio, dependiendo del tamaño del tubo.
(Brown & Brown, 2012).

Un estudiante necesita preparar 10 cajas de petri de agar nutritivo. ¿Cuántos gramos debe pesar
del medio pulverizado?

Si cada caja lleva 20ml, para 10 cajas serían 200ml.

32g 1000ml
X 200ml

X = 32gx200ml
1000ml

X = 6,4g

“Este estudiante debe disolver 6,4g de Agar Nutritivo en 200ml de agua destilada.”

2. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN
- ¿El material de trabajo esterilizado bajo calor húmedo en el autoclave será positivo?
- ¿Habrá coherencia entre lo observado y esperado en las pruebas de esterilidad?

3. HIPÓTESIS
- Hay diferencias entre el material de trabajo esterilizado y el no esterilizado.
- Hay diferencias en los microorganismos observados en AN y PDA.
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4. OBJETIVOS
- Esterilizar material de trabajo en microbiología bajo la técnica de calor húmedo.
- Evaluar diferentes pruebas de esterilidad del ambiente y materiales de trabajo en el
laboratorio para bacterias, levaduras y hongos filamentosos.
- Aprender a preparar medios de cultivo autoclavables como AN y PDA para bacterias y
hongos respectivamente.

5. METODOLOGÍA PRÁCTICA

5.1 Materiales y equipos para todo el curso

- Tijeras
- Algodón
- Gasa
- Cinta de enmascarar
- Aluminio
- Cauchos
- Espátula
- Papel craft y papel de oficina reciclado
- Parafilm
Traer
- 50 palillos no estériles
- 50 pitillos cortados no estériles estudiantes:
- 6 puntas azules no estériles -Marcador
- 11 vasos de compota no estériles Sharpie delgado
- 2 planchas de calentamiento -Encendedor
- 5 agitadores magnéticos
- Baño maria a 80ªC
- 2 autoclaves
- 1 par de guantes para manipulación del autoclave
- 1 cinta indicadora del proceso de autoclavado
- 6ml de agua destilada estéril en un falcon de 15ml.
- 1 frasco de Agar Nutritivo pulverizado
- 1 frasco de PDA pulverizado
- Incubadora Hongos 25ºC e Incubadora Bacterias 37ºC
- Hipoclorito de sodio (NaClO) en envase con spray
- Alcohol al 70% en envase con spray

5.2 Materiales por grupo de trabajo

- 4 cajas de Petri vacías no estériles
- 4 cajas de Petri con AN ó PDA
- 1 Erlenmeyer de 250ml
- 1 probeta de 100ml
- 1 pinza metálica no estéril
- 1 rastrillo de vidrio no estéril
- 2 hisopos estériles
- 1 micropipeta de 100 – 1000μl
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5.3 Procedimiento

¡OJO! Cada grupo hará pruebas de esterilidad para AN ó PDA según les asigne el docente. En
consecuencia con el medio de cultivo asignado, cada grupo preparará AN ó PDA.

Antes de iniciar la práctica, todos deben desinfectar los mesones y sus guantes con alcohol e
hipoclorito de sodio. Esta actividad se debe volver una rutina en todas las prácticas de
microbiología.

5.3.1 Preparar material para autoclavado

- Agreguen agua al autoclave y enciéndalo para que se vaya calentando el agua.

Preparación de medio de cultivo sólido

- Hagan los cálculos siguiendo como modelo el ejemplo que se les da en la introducción. ¡LEAN
LAS ETIQUETAS DE LOS FRASCOS DEL MEDIO DE CULTIVO ASIGNADO!
- Usen la espátula y pesen en la balanza analítica la cantidad necesaria de AN ó PDA pulverizado
que necesitan para 4 cajas de Petri y dispóngalo en el Erlenmeyer de 250ml.
- Tomen el volumen necesario de agua destilada con la probeta y dispóngalo también en el
Erlenmeyer.
- Introduzcan un agitador magnético en el Erlenmeyer (o puede homogenizar con varilla de
vidrio) y calienten en la plancha de calentamiento a 80ªC hasta observar que se disuelve el
medio.
- Tapen el Erlenmeyer con un tapón de algodón, gasa y cinta de enmascarar (torunda de
algodón). Y autoclavar.

Preparación de medio de cultivo liquido

- Se repiten los pasos para realizar el medio de cultivo sólido.

- Una vez disuelto el medio, distribuirlo en porciones de 10 a 12 ml en los tubos de ensayo.
- Tapar con tapones de plástico esterilizables, o en su defecto con torundas de algodón

Preparación de material para autoclavado

- Envuelvan 3 de las 4 cajas vacías no estériles en papel Kraft ó reciclado.

- Envuelvan las pinzas metálicas y el rastrillo de vidrio en papel Kraft ó reciclado.
- Entre todos los grupos de trabajo van a ubicar los pitillos, palillos y puntas azules dentro de los
vasos de compota, es decir un grupo de trabajo ubicar los pitillos dentro del vaso de compota,
otro grupo toma loas palillos y los coloca en los vasos de compota y otra toma las puntas azules.
Después los tapan con aluminio y les ponen cauchos para sellarlos.
- Recuerden marcar los vasos de compota con la fecha de la esterilización.
- Pónganle 1cm2 de cinta indicadora a cada uno de los materiales que se van autoclavar.
- Esperen entre 30 – 40 minutos que tarda el proceso de autoclavado, mientras tanto pueden ir
realizando las pruebas 5.3.2, 5.3.3 y 5.3.4.

5.3.2 Prueba de esterilidad para medio ambiente

- Dejen abierta durante 15 – 30 minutos una caja de Petri con AN ó PDA “estéril”.
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- Marquen la caja por el borde del envés de forma específica (nombre de la prueba, fecha, tipo
de agar, grupo, docente).
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.

5.3.3 Prueba de esterilidad en alguna superficie del laboratorio

- Tomen uno de los dos hisopos estériles y frótenlo sobre una superficie de uso común en el
laboratorio como por ejemplo una válvula de gas, un interruptor de luz, una perilla de alguna
manija de algún equipo ó puerta del salón, el mesón, entre otros.
- Enciendan el mechero y abran la caja de Petri con AN ó PDA “estéril” cerca de éste. De esta
forma nos aseguramos que los microorganismos que allí crezcan sean los procedentes de la
superficie frotada.
- Froten el hisopo sobre toda la superficie del medio de cultivo y cierren la caja.
- Marquen la caja por el borde del envés de forma específica (como se ha indicado
anteriormente).
- Sellen con parafilm
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.

5.3.4 Prueba de esterilidad para medios de cultivo

- Sellen con parafilm los bordes de una caja de Petri con AN ó PDA “estéril”.
- Marquen la caja por el borde del envés de forma específica.
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.

UNA VEZ HAYAN SALIDO LOS MATERIALES ESTÉRILES DEL AUTOCLAVE, PODEMOS
CONTINUAR CON EL SIGUIENTE PUNTO.

5.3.5 Prueba de esterilidad para las cajas de Petri

- Marquen por el envés una caja de Petri con “Caja estéril” y otra caja con “Caja no estéril” (esta
es la caja que no se autoclavó).
- Enciendan el mechero y abran las cajas de Petri vacías.
- Adicionen 20ml del medio fundido sea AN ó PDA. El medio está listo para servir cuando el
Erlenmeyer es tolerable al tacto (45ªC aproximadamente).
- Homogenicen el medio haciendo movimientos en L ó en 8 muy suavemente, evitando que el
medio se pegue en la tapa de la caja de Petri.
- Dejen solidificar el medio (10 minutos aproximadamente).
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.

6. RESULTADOS & DISCUSIÓN

1). Construyan una tabla de resultados de las pruebas de esterilidad comparando lo observado
con lo esperado. Deben tabular los resultados de otro grupo que haya trabajado el mismo medio
de cultivo que ustedes para que puedan comparar y tener replicas experimental. Recuerden que
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una prueba de esterilidad (+) significa que dio estéril y no creció ningún microorganismo, por el
contrario un resultado (-) significa que no era estéril y crecieron microorganismos. Lo ideal sería
que tomen fotografías para el informe.

Realice las anotaciones correspondientes sobre cada medio de cultivo

MEDIO DE CULTIVO: __________________________________

CANTIDAD PREPARADA: _______________________
CANTIDAD PESADA: _____________
CÁLCULOS: _____________________

ASPECTO DEL MEDIO DE CULTIVO:

______________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
• ESTADO FÍSICO:
____Sólido _____ Líquido

• SEGÚN LA NATURALEZA DE LOS INGREDIENTES:

_____Natural o complejo ____ Complejo

• SEGÚN EL PROPÓSITO DE USO:

_______ Enriquecimiento ______ Selectivo ______ Diferencial ______ Otro

Condiciones de esterilización:
______________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________

2). Describan de forma muy general macro y microscópicamente una bacteria, levadura u hongo
filamentoso que ustedes deseen de alguna de sus pruebas de esterilidad. Lo ideal sería que tomen
fotografías para el informe.

Morfología de las colonias (en agar nutritivo)

Tamaño de la
colonia en
milímetros
Color
Forma
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
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Tamaño de la
colonia en
milímetros
Color
Forma
Superficie
Aspecto
Luz reflejada

PREGUNTAS QUE DEBEN SER RESUELTAS Y DISCUTIDAS EN EL INFORME TIPO ARTÍCULO CIENTÍFICO
CON SUS RESPECTIVAS CITAS BIBLIOGRÁFICAS.
- ¿Fueron coherentes los resultados de las pruebas de esterilidad en todos los casos?
Justifique cada resultado y compare con estudios previos.
- ¿Los medios AN y PDA inhibieron el crecimiento de hongos y bacterias respectivamente?
Justifique su resultado según las características de estos medios de cultivo.
- ¿Qué podríamos discutir de los resultados de bacterias frente a los de hongos en cada
uno de los casos?
- ¿Qué se podría afirmar con respecto a la esterilidad del ambiente y materiales de trabajo
en el laboratorio de microbiología de la Universidad Central? ¿Qué se sugiere ó se
propone en cualquier caso?

7. CONCLUSIONES

¿Se logró responder o no las preguntas de investigaciones y los objetivos de la práctica?

8. REFERENCIAS

Brown, A. E., & Brown, A. E. (2012). Benson\? s microbiological applications: laboratory manual in
general microbiology (No. QR63 B76 2012).
Leahy, T.J.; Kerry, L.R. y Christopher, M.R. 1999. Microbiology of sterilization processes. En: Validation
of pharmaceutical processes: sterile product. Carleton, F.J. y Agalloco, J.P. Ed. Pp: 353-380.
Pérez-Uz, B., de Silóniz, M. I., Torralba, B., & Vázquez, C. (2011). Metodología de esterilización en el
laboratorio microbiológico. Reduca (Biología), 3(5).
Phillips, J. A., & Brock, T. D. (1991). Laboratory manual: biology of microorganisms. Prentice Hall.