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ABRIR CAPÍTULO 3.
-
4.- CINETICA DE LAS REACCIONES
DE HIDRÓLISIS CON LAS ENZIMAS
INMOVILIZADAS
4.1.- INTRODUCCIÓN
En este capítulo se estudian las reacciones de hidrólisis de lactosa y de ONPG con

las 9-galactosidasas de K. fragilis y de E. cali, cuando estas se encuentran inmovilizadas
sobre una sílice-alúmina industrial (KA-3, de Síldehemie). Se analizan primero algunos
aspectos relativos a la inmovilización y posteriormente se discrirnina el modelo cinético
de cada una de las reacciones para las dos enzimas empleadas.
• En el proceso de inmovilización se han estudiado los efectos de algunas de las

variables de inmovilización en la actividad y la estabilidad del inmovilizado, para
elegir las condiciones idóneas de la inmovilización de las enzimas por enlace
covalente (por formación de bases de SchifQ.
• Se han determinado las condiciones de agitación y carga enzimática en el soporte que
no introducen resistencias significativas debidas a la transferencia de materia en la
película externa (difusión externa) y en los poros (difusión interna), de tal forma que
sea la reacción quimica el fenómeno que controla la velocidad global del proceso.
• Se han estudiado las condiciones de pH, concentración de sales y temperatura que

son las más adecuadas para que la actividad de cada enzima sea máxima y perdure el
tiempo suficiente para llevar a cabo los experimentos cinéticos sin que la enzima
pierda actividad.
Seleccionado el método de inmovilización y las condiciones de inmovilización y

de reacción, se llevan a cabo varios experimentos cinéticos similares a los que se hicieron
251
Capítulo 4. Cinética de las reacciones de hidrólisis con las enzimas inníovilizadas
con las enzimas en disolución, modificando las variables consideradas en cada modelo
cinético en los intervalos que se utilizaron en el capítulo 3 para cada reacción, utilizando
para ello reactores discontinuos isotermos. Los modelos cinéticos considerados son los
presentados en las Tablas 3.2, 3.3 y 3.4.
Debido a las conclusiones alcanzadas en el estudio cinético con las enzimas en

disolución, se ha optado por analizar los datos cinéticos obtenidos con las enzimas
inmovilizadas por el método integral y con la temperatura como variable.
En este apartado se analizan los métodos de inmovilización de enzimas,

particularizando posteriormente este análisis para las 3-galactosidasas.
4.1.1.- Inmovilización de enzimas
La inmovilización es un proceso por el cual el movimiento de la enzima en el

espacio se ve restringido total o parcialmente (Wiseman, 1985). Las enzimas
inmovilizadas pueden estar unidas entre sí, unidas a un soporte o libres, pero confinadas
en un espacio determinado. De hecho, algunas enzimas de las utilizadas en diversas
aplicaciones se encuentran ligadas a paredes celularcs o situadas dentro dc la célula,
estando así naturalmente inmovilizadas, pues la célula evita su pérdida por encapsulación
o inmovilización en membranas.
El empleo de la inmovilización de enzimas se conoce desde 1916, ai~o en el que

Nelson y Griffin observaron que la invertasa de levadura se adsorbía sobre carbón activo
y era capaz de catalizar la hidrólisis de sacarosa. En aflos posteriores se publicaron varios
artículos sobre la inmovilización de enzimas activas inmovilizadas covalentemente a
varios soportes. Sin embargo, la aplicación práctica de las enzimas inmovilizadas se sitúa
en 1953, cuando Grubhofer y Shleith inmovilizaron varias enzimas, como
carboxipeptidasa, diastasa, pepsina y ribonucleasa, en resma de poliestireno diazotada,
mediante enlace covalente. En 1956, Mitz informó sobre el enlace iónico de catalasa a
DEAE-celulosa. En 1963, Bernfeld y Wan lograron la inmovilización por atrapamiento de
tripsina en gel dc poliacrilamida y Quiocho y Richards inmovilizaron por
entrecruzamiento con glutaraldebido la carboxipeptidasa A. Chang, en 1964, consiguió la
252
Capitulo 4. Cinética de las reacciones de hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
inmovilización por encapsulación de anhidrasa carbónica. En 1971, Gregoriadis preparó

liposomas que contenían amiloglucosidasa. El estudio teórico de la inmovilización de
enzimas durante este periodo inicial fue encabezado por Katchalski-Katzir y
colaboradores (Wiseman, 1985).
La primera aplicación industrial de las enzimas inmovilizadas fue introducida en

Japón por Chibata y sus colaboradores de Tanabe Seiyaku Co., en 1969. Inmovilizaron
aminoacilasa fúngica por enlace iónico sobre DEAE-sefarosa y la aplicaron en la
hidrólisis estereoselectiva de N-acil-D,L-aminoácidos para obtener L-aminoácidos y N-
acil-D-aminoácidos. La primera aplicación industrial de células inmovilizadas también
fue llevada a cabo por estos autores: inmovilizaron células de E. ccli con alta actividad de
aspartasa por atrapamiento en gel de acrilamida para producir L-aspartato de fumarato
amónico. Desde entonces, varios procesos han sido industrializados, tanto de enzimas
como de células inmovilizadas.
Por ejemplo, las enzimas inmovilizadas se utilizan en química sintética, en los

electrodos enzimáticos, en los termistores y en dispositivos analíticos y son muy útiles en
terapéutica en forma de puentes extracorporales. También se usan en la industria
alimentaria y en la industria farmacéutica. Ciertas enzimas, como la penicilin-acilasa,
permiten la producción de antibioticos semisintéticos en gran escala. Las enzimas que
hidrolizan el almidón y sus productos para obtener jarabes edulcorantes como los HFCS
mueven un mercado de miles de millones de dólares al aflo en USA, ya que, en ese país,
estos productos son competidores directos del azúcar de remolacha y caña. Algunos
ejemplos de los usos industriales de las enzimas inmovilizadas se muestran en la Tabla
4.1 (Lalonde, 1997).
En la Tabla 4.2 se muestran las ventajas y desventajas que presenta el empleo de

las enzimas inmovilizadas. La ventaja más importante es la posibilidad de reutilización de
la enzima, lo que permite el empleo de procesos en continuo, de mayor productividad y
mejor control que los discontinuos, y supone una disminución de gastos tanto en el
biocatalizador como en la purificación de los productos, que se separan de la enzima.
Como principal desventaja cabe citar la pérdida de actividad debida tanto al propio
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proceso de inmovilización como a la posible presencia de limitaciones difusionales, que

ralentizan el proceso de transformación (Finochiaro y col., 1980).
Hasta el momento se han desarrollado varios métodos de inmovilización de

enzimas, como se muestra en la Figura 4.1 (Wiseman, 1985). Una primera clasificación
distingue entre métodos en los que la enzima queda ligada a un soporte y métodos en los
que la enzima queda atrapada en un soporte o en un sistema. En el primer caso se suele
obtener una enzima cuyas propiedades son diferentes a las de la enzima libre, hecho que
no sucede en el segundo método, en el que la enzima actúa en un microentorno pero no sc
ha modificado esencialmente y, por tanto, su comportamiento no sufre variación
apreciable respecto de la enzima en disolución. Este es el caso de emplear la enzima en
disolución pero evitando su salida del proceso mediante una unidad de ultrafiltración que
se sitúa a la salida del reactor en el que se lleva a cabo la reacción homogénea. Esta
modalidad de inmovilización práctica (en el sentido de que la enzima es reutilizable) tiene
la ventaja de no necesitar soporte alguno ni otro sistema de atrapamiento más allá de la
unidad de ultrafiltración y de no reducir la actividad de la enzima intrínsecamente. Sin
embargo, su operación a gran escala puede ser problemática por fenómenos de
polarización y adsorción de las proteínas en la membrana, que afectarán al mantenimiento
de la actividad en el reactor, ya que la enzima queda fijada a la membrana y la ocluye.
Además, el método de inmovilización no estabijiza la cnzima. Los deníús métodos, que se
muestran en la Figura 4.1, exigen la presencia de un soporte, que puede estar unido a la
enzima o ser una red que la atrape. A continuación, se desarrollan brevemente algunos de
los métodos de inmovilización más utilizados.
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Capítulo 4. Cinética de las reacciones de hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
Tabla 4.1.- Usos industriales de algunas enzimas y células inmovilizadas.

[Producto ] Enzima J Reacción
Acrilamida Nitril hidratasa fijada en Hidrólisis de acrilonitrilo a
células acrílamida
Aspartamo Termolisina Unión estercoespecífica de pépti
(soluble o inmovilizada) dos en agua
Jarabe de fructosa Amilasas solubles en tanque Hidrólisis de almidón a glucosa y
(HFCS) agitado y xilosa isomerasas en posterlor isomerización de esta a
reactores de lecho fijo fructosa
6-APA Penicilina acilasa inmovilizada Hidrólisis quimioselectiva de
en paniculas de polímero ácido fenilacético en penicilina G
L-tert-leucina Leucina dehidrogenasa soluble Aminación reductora enantioes
junto con formato dehidroge- pecífica de ácido alfa-ceto con
nasa en un reactor con formato amónico
membrana de ultrafiltración
L-aminoáeidos Acilasa inmovilizada en Hidrólisis L-especifica de N
reactores de lecho fijo acetil amida
D-hidroxifenil- Hidantoinasa en células Hidrólisis de hidantoin of D
glicina amino acid con racemízación in
situ del L-isómero
L- o D- Amídasa en celulas Hidrólisis específica de carboxa
aminoácidos mida de aminoácidos
Tabla 4.2.- Ventajas y desventajas de las enzimas inmovilizadas.
Ventajas de las enzimas inmovilizadas

Reutilización de la enzima.
Posible uso en continuo.
Pureza del producto (reducción de los costes de purificación).
Control más preciso de las especificaciones del producto.
Menor inhibición por producto.
Aumento de la estabilidad de la enzima -
Mayor flexibilidad en el diseño del reactor.
Posibilidad de emplear sistemas multienzimáticos.
Desventajas de las enzimas inmovilizadas
Menor actividad especifica (25-80 % de la libre, generalmente).
Coste del soporte y del proceso de inmovilizacxon.
Modificación de la estructura espacial o química de la enzima.
Posible contaminación bacteriana, siendo necesaria la prefiltración o estenlízacion del sustrato.
Ibimitaciones difusionales (interna o externa).
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Figura 4.1.- Métodos de inmovilización de enzimas.
4.1.1.1.- Métodos de atrapamiento
Los métodos de atrapamiento se clasifican a su vez en: atrapamiento en gel,

atrapamiento en fibras y microencapsulación. Se basan en la localización de una enzima
en una red espacial, que puede ser una matriz polimérica o una membrana. Son métodos
generales que no necesitan de ninguna propiedad química de la enzima, por lo que son de
aplicabilidad general, extendiéndose su uso a células y a orgánulos.
1. Atranamiento en ~el
La red está formada por geles poliméricos insolubles en agua. El atrapamiento

puede llevarse a cabo con polimeros naturales y sintéticos. En un primer momento, se
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utilizaron polímeros sintéticos, aunque luego también se estudió la posibilidad de

aprovechar materiales poliméricos naturales para atrapar enzínns.
Inicialmente se utilizaron geles de poliacrilamida, obtenidos por entrecruzamiento

de acrilamida con N,N-metilenobis(acrilamida) en una solución acuosa de la enzima y
utilizando como iniciador persulfato potásico (K2S205) y como catalizador 4-
dimetilamino-propionitrilo o N,N,N’ ,N’-tetrametilenetilendiamina. El gel resultante se

rompe en partículas del diámetro elegido; como el gel tiene una amplia distribución de
diámetros de poros, una parte de la enzima se va perdiendo después de periodos largos de
utilización del inmovilizado. Si se forman radicales durante la polimerización, la enzima
se puede desactivar parcialmente, pues reacciona con los radicales formados.
Posteriormente, se han utilizado otros geles; algunos de los más habituales son la
gelatina, cl K-carragenano, el alginato y el agar (Iborra y col., 1997; Fraser y Bickerstaff,
1997). Se pueden formar los geles por enfriamiento de una solución, todavía líquida, a 30-
0C, momento en el que se le añade la enzima. En el caso del K-carragenano, la solución
40
se enfría en presencia de cloruro cálcico, desplazando el calcio al sodio progresivamente
(el alginato sódico es soluble en agua, el cálcico no). La presencia tanto de disolventes
orgánicos como de elevadas concentraciones de sales durante el proceso de gelificación
puede ocasionar la desnaturalización de la enzima.
De los materiales que se utilizan en la formación de geles, los materiales naturales

presentan propiedades notables como su precio y su disponibilidad, pero tienen
desventajas como la baja resistencia mecánica y térmica y su escasa resistencia al ataque
microbiano. El uso dc materiales sintéticos como la poliacrilamida y el poli (2-hidroxietil)

metacrilato, que presentan las ventajas de los anteriores y superan sus inconvenientes,
parece más plausible desde el punto de vista industrial (Cantarella y col, 1997),
destacando hidrofilicidad (son muy polares) y su biocompatibilidad. En el caso del poli
(2-hidroxietil) metacrilato se obtiene un gel de porosidad controlada que permite el
mantenimiento de la mayoría de la actividad de la enzima y evita la penetración de
microorganismos, lo que elimina la actividad de la enzima. El soporte tiene posibilidades
de aplicación en CSTR y en reactores de lecho fluidizado.
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JI. Atronamiento en fibras
Los primeros investigadores que utilizaron esta técnica fue Dinelli (1972). La
técnica permite el atrapamiento de enzimas en la red formada por fibras según estas se
van formando por el procedimiento de hilado en húmedo, con aparatos similares a los de
la industria textil. Se extrusiona el polímero solubilizado en un disolvente orgánico que
está formando emulsión con la disolución acuosa de enzima sobre otro disolvente
orgánico, como tolueno o éter de petróleo, donde el polímero precipita, atrapando
microgotas de la solución enzimática en sus cavidades. Este método mejora el
atrapamiento en gel, pues el área de contacto red-enzima es mucho mayor y las
propiedades de las fibras son mejores que las de los geles: mayor resistencia a ácidos y
bases débiles, a disolventes orgánicos y a fuerzas iónicas altas. Se pueden inmovilizar
varias enzimas (inmovilización multienzimática), aunque sc requiere, como en el caso
anterior, que el sustrato o sustratos no tengan peso molecular alto. El polímero más usado
por su biocompatibilidad y bajo costo es el acetato dc celulosa. La retención de actividad

es alta, posiblemente porque la enzima está en un entorno acuoso y el tiempo de contacto
con los disolventes orgánicos es corto. Por ejemplo, para la invertasa, se consiguen
actividades dcl 65% de la actividad de la enzima libre y los inmovilizados son muy
estables durante la hidrólisis de sacarosa a 250C en un bulfer fosfato a pH 4,5.
Existen, además, reactores enzimáticos que se han desarrollado a partir de esta

técnica, aunque admiten enzimas inmovilizadas por otras técnicas. Son los llamados
reactores de fibra hueca. La enzima en estudio y otra proteína, que suele ser albúmina
bovina y que actúa de estabilizador, se disuelven en tampón y se mezclan con polisulfona
disuelta en N,N-dimetilformamida. La mezcla se precipUa luego en moldes usando agua
como precipitante o se lila en fibras huecas, que se pueden utilizar en reactores
microtubulares, que suelen consistir en un ovillo de fibras en un cilindro metálico.
III. Microencansulación
En este método, la enzima queda atrapada en una membrana polimérica esférica

de diámetro comprendido entre 1 y 100 m, a través de la cual difunden sustratos y
productos, lo que permite la coinmovilización de varias enzimas. Estas técnicas no sc
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disefiaron en principio para la inmovilización de enzimas, sino que ya se empleaban para

tintes, medicamentos de dosificación controlada y otros compuestos quimicos.
La microencapsulación presenta como ventajas la coinmovilización fácil y la

existencia de una gran superficie de contacto enzima-sustrato en un volumen pequeño,
pero tiene, sin embargo, los inconvenientes de la pérdida de actividad durante el proceso
de microencapsulado, la restricción de uso para sustratos y productos macromoleculares,
la alta concentración de enzima requerida, la posible fijación de la enzima en la pared y la
pérdida de enzima durante la utilización del biocatalizador. Existen varios métodos para
realizar la microencapsulación: separación de fase, polimerización interfacial, membrana
surfactante líquida y secado de líquidos (Wiseman, 1985).
4.1.1.2.-Métodos de unión a un soporte
En estos métodos, la enzima queda unida al soporte bien por interacciones fisicas
(fuerzas de Van der Waals, puentes de H y enlaces iónicos), bien por enlaces químicos
(covalentes). La enzima interacciona con la superficie de un soporte, generalmente
poroso. Estas interacciones modifican la estructura espacial de la enzima e, incluso,
pueden alterar su estructura química, lo que provoca variaciones de su comportamiento
como catalizador: actividad, estabilidad, afinidad por sus sustratos, etc. La influencia de
estas variaciones en las propiedades de la enzima dependen del método utilizado, siendo
menores cuanto menos enérgicas sean las interacciones enzima-sustrato. Ordenando los
diversos métodos de inmovilización de mayor a menor fuerza de unión soporte-enzima se
obtiene:
enlace covalente > enlace iónico > enlace metálico > adsorción fisica
En todos los casos, el soporte tiene una capacidad limitada de inmovilizar enzima,
existiendo una concentración de enzima a la que se satura. La concentración de saturación
depende tanto del número de posibles centros de unión en la superficie del soporte como
del tamaño molecular de la enzima. A continuación se analizan, brevemente, los métodos
de unión a un soporte.
259
1. Adscr ion
Es un método simple en el que se pone en contacto la solución acuosa de la

enzima con un soporte cuya superficie atrae algunos residuos polares de la enzima
(Bódalo y col., 1985; Montero y col., 1993). Se pueden usar diversas técnicas de contacto:
procedimiento estático, electrodeposición, proceso en reactor y bafio con agitación. La
más usada en el laboratorio es la última, en la que la solución enzimática es puesta en
contacto con el sólido en un tanque termostatizado y agitado por vibración, vaivén o
movimiento orbital, con lo que se logra una deposición unifonne de enzima. La
inmovilización se suele llevar a cabo comercialmente en reactor, que puede ser un lecho
fijo o fluidizado o un tanque agitado por hélice, paleta o turbina, al qtíe la solución
enzimática se recircula o en el que se agita dicha solución, respectivamente. En el
procedimiento de adsorción por electrodeposición, el soporte se coloca cerca de un
electrodo y la enzima migra hacia él debido a la atracción eléctrica. El procedimiento
estático es el más lento y origina una deposición no uniforme, ya que no hay agitación.
En la adsorción fisica no hay una interacción ftíerte enzima-soporte (se generan

fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrógeno, puentes hidrofóbicos), por lo que la
unión enzima-soporte puede alterarse fácilmente debido al pH del medio, a la fuerza
jónica del tampón, a la temperatura, a la naturaleza del solvente utilizado, o simplemente
se debilita con el tiempo. La enzima puede, entonces, separarse del soporte y
solubilizarse, lo que es una ventaja cuando la enzima se desactiva y una desventaja
cuando aún tiene actividad. Las temperaturas altas o las concentraciones elevadas de sales
favorecen la desorción. Para evitar la pérdida de enzima se pueden usar agentes de
entrecruzamiento, como el glutaraldehido u otros agentes bifuncionales, que unen los
radicales de aminoácidos de distintas moléculas de enzima o de la misma enzima (enlaces
inter- e intramoleculares). Esta técnica supone la introducción de enlaces químicos en el
sistema, con la posibilidad de desactivar total o parcialmente la enzima y de modificar su
comportamiento con respecto a la enzima adsorbida, con lo que resulta tina técnica de
inmovilización mixta entre adsorción y enlace covalente.
260
II. Enlace iónicp
En este caso se usan resinas intercambiadoras de iones, que tienen grupos

superficiales que pueden sustituir su unión iónica a un cation o anión por uniones
similares a radicales polares de la enzima (Heng y Glatz, 1994). Esta unión es más fuerte
que la mera adsorción, aunque no tanto como el enlace covalente. La unión iónica no
excluye la posibilidad de adsorción enzima-soporte. Los procedimientos de contacto son
iguales a los utilizados en adsorción. La presencia de grupos que sean atraidos por la
resma puede desplazar a la enzima, por lo que el enlace es, a menudo, reversible.
También las concentraciones elevadas de sustrato pueden liberar la enzima, al igual que si
hay cambios de pH. Como en la técnica de adsorción, hay pocos cambios en la estructura
espacial de la enzima, lo que preserva las características que tenía la enzima en
disolución. Los intercambiadores aniónicos más usados son derivados de DEAE , TEAE
y ECTEOLA, siendo los intercambiadores de CM (carboximetil-) los intercambiadores
catiónicos más empleados. Los soportes de estos intercambiadores suelen ser
polisacáridos como dextrano y celulosa, o polímeros sintéticos, como poliestireno.
El principal problema asociado a este método de inmovilización es conseguir que

la enzima se una al soporte con suficiente fuerza para que la pérdida de enzima por lavado
durante la operación del reactor que contenga la enzima inmovilizada sea mínima. Con
este objeto se modifican químicamente los aminoácidos superficiales de las enzimas
(Tyagi y Gupta, 1993) o se modifican por Ingeniería Genética (Heng y Glatz,1994),
añadiéndoles grupos peptídicos muy cargados.
Enlace metálico
[II.
Quedan comprendidas en este apartado aquellas técnicas de inmovilización que

utilizan la formación de quelatos entre metales de transicción y enzimas, Los metales de
transicción empleados con más frecuencia son el titanio (IV) y el zirconio (IV), ya que
sus óxidos no son tóxicos. De hecho, los cloruros de estos metales, así como los de
vanadio (III), hierro (III) y estaño (IV), forman hidróxidos en medio ácido, que precipitan
como geles, por lo que pueden ser usados como soportes para la inmovilización de
enzimas. Sin embargo, el empleo de soportes porosos es más adecuado por sus
261
propiedades mecánicas y, en este caso, la técnica consiste en depositar una capa de

hidróxido del metal sobre la superficie de los poros.
El titanio, muy usado por su estabilidad, es conocido como un metal de transición

con mucha tendencia a formar complejos. El titanio en su valencia IV tiene como
números de coordinación 4 y 6, foi-mándose complejos de estructura tetraédrica y
octaédrica. El zirconio en su valencia IV tiene como número de coordinación 8 (es decir,
puede estar unido a 8 ligandos a la vez). Las proteinas tienen gi-upos polares que pueden
actuar como ligantes y desplazan durante la inmovilización a otros ligantes del metal que
se unen más débilmente a éste; estos grupos de las enzimas útiles para el enlace metálico
son el carbóxilo y el amino terminal y los radicales fenélicos, hidroxi y sulfidrilo de los
residuos dc los aminoácidos. La elección de titanio o zirconio depende del pH al que se
utilice el inmovilizado: si el pH es neutro o básico se usan sales de Zr, siendo de Ti para
las aplicaciones a pH ácido.
Existen varias versiones del método original (Cabral y col., 1983; Kennedy y col.,
1997) tanto para soportes orgánicos, para los que fue primero diseñado esta técnica, como
para soportes inorgánicos. En los soportes inorgánicos, lo fundamental es eliminar el agua
que haya quedado en el preparado tras el tratamiento con el cloruro del metal de
transicción que se emplee, asegurando una buena interacción de este metal con los grupos
silanol presentes en la superficie del soporte y favoreciendo, por tanto, la estabilidad del
inmovilizado.
IV. Enlace por afinidad
Este método de inmovilización sc basa en que las enzimas, al igual que los
anticuerpos y otras proteínas, tienden a fijarse a determinados moléculas orgánicas por las
que tienen afinidad, formando complejos estables y reversibles con estas moléculas. Esta
propiedad ha sido utilizada en los últimos años para la inmovilización de enzimas a
soportes poliméricos. Su inmovilización en soportes inorgánicos sería similar, aunque con
algunas modificaciones en la activación del soporte. Cuando la enzima o proteína no
presente afinidad por detemÁnados grupos funcionales de soportes comerciales, se
pueden añadir a la proteína dominios proteicos con afinidad por tales grupos utilizando
262
técnicas de Ingeniería Genética (Vian y col., 1998). Este hecho permite obtener enzimas
con una amplia variedad de actividades que se unan a soportes comerciales.
Una de las técnicas de activación típicas es la que utiliza bromuro de cianógeno

para unir al soporte por enlace covalente diferentes ligandos que interaccionan con la
proteína. Ligandos de tipo general para proteínas son los dextranos tipo dextran blue y
polímeros colorantes tipo cibacron bIne y, evidentemente, hay ligandos específicos para
muchas enzimas que se unen a los grupos alostéricos de las mismas.
Por ejemplo, una nueva técnica de inmovilización por afinidad permite la

posibilidad de unir biotina a la enzima y avidina (una proteína tetramérica que une como
grupos prostéticos cuatro moléculas de biotina) al soporte al que se ha unido
covalentemente biotina (Swaisgood y col., 1997). La fuerte afinidad de la avidina por la
biotina hace que la enzima biotinilada y el soporte activado con avidina queden unidos.
La interacción de la avidina con la biotina es más fuerte que el enlace iónico pero no tanto
como el covalente, pues une la biotina con una constante de disociación de ío’5 M. La
unión es reversible usando agentes caotrópicos, como, por ejemplo, cloruro de guanidinio
6M en agua.
y. Enlace covalente
La unión de las enzimas a los soportes mediante enlaces covalentes es,

probablemente, el método general de inmovilización más conocido y desarrollado,
dado el auge de la síntesis orgánica, y es el más utilizado hasta el momento, a escala
industrial y en laboratorio (Wiseman, 1985) para la fijación de enzimas a soportes.
En este método, se produce una reacción química que origina un enlace irreversible o
reversible sólo en condiciones muy específicas entre la enzima y los grupos reactivos
del soporte. A este tipo de enlace se añaden siempre Iterzas electrostáticas que
consolidan la fijación.
La reacción quimica de formación del enlace covalente debe ser poco

desnaturalizante para la macromolécula biológica; para ello, es necesario proceder a
263
una activación previa de los grupos del soporte susceptibles de reaccionar con la
enzima. Algunos de los grupos funcionales de las enzimas que pueden estar
involucrados en la formación del enlace covalente se muestran en la Tabla 4.3.
Los métodos propuestos para activar los diversos soportes son muy numerosos
y están ampliamente descritos en trabajos de tipo general (N4osbaeh, 1976; Wisernan,
1985; Rapatz y col., 1988; Weetall, 1993) en la Figura 4.2 se presentan algunos de
los métodos más empleados. De todos ellos, el método covalente con glutaraldehido
(reactivo multiflmncional) es uno de los más utilizados (Weetall y col., 1974; Lee y
col., 1976; Cho y Baley, 1979; Wassermann y col., 1980; Hossain y Do, 1985;
Manjón y col., 1985; Rapatz y col., 1988; Dekker, 1989; Bódalo y col., 1991; Bakken
y col., 1992; Sears y Clark, 1993; Lartillot, 1993; Papayannalcos y col., 1993). Este
método se basa en la formación de puentes entre los grupos amino del soporte y los
de la enzima por intermedio de] ligando bifuncional glutaraldehido, permitiendo así
una cierta separación entre la enzima y el soporte sólido, lo que mejora la accesibili-
dad del sustrato al centro activo dc la enzima.
La unión imina que se produce entre la enzima y el soporte está estabilizada

por resonancia con un enlace etilénico, obteniendo un complejo que resiste, como
método standard, a la hidrólisis con HCI 6 N a 1 lOt durante 24 horas. El
glutaraldehido es un agente aceptado en la industria alimentaria y además posee
propiedades desinfectantes (Seriban, 1985). La química del glutaraldebido no está
clara, aunque parece que dentro de una solución acuosa de glutaraldehido coexisten
vanos compuestos quimicos, pudiendo todos ellos formar enlace con la enzima (Walt
y Agayn, 1994). El glutaraldehido forma aductos de Miehael (especies poliméricas
compuestas de ciclos de seis carbonos que proceden dc la condensación dc tres
moléculas de glutaraldehido), de tal forma que la especie ligada al sólido puede ser
polimérica o monomérica (Guerra, 1997). Por tanto, la inmovilización vía
glutaraldehido parece ser una inmovilización mixta y no un proceso que sólo
implique la formación de bases de Schiff, especialmente si se inmoviliza en medios
264
ácidos (Richards y Knowles, 1968). Se observa que no existe una pérdida enzimática
importante incluso aunque no se proceda a la reducción de los teóricos enlaces imína,
lo cual es lógico si se considera que el enlace imina queda estabilizado por
resonancia con enlaces dobles C=C presentes en los aductos de Michael.
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Activación del soporte por ghiitartldcliido
—ÑU2 + OHC—(CI-12>=—CHO N -— CH--—<CHP)2——CHo
N CH—(CH2)2—cHo + NH2 ENZIMA
—N <~CH—(CH2>2——CHN —ENZIMA
Figura 4.2.- Algunos métodos covalentes frecuentemente utilizados.
265
4.1.1.3.- Entrecruzamiento
El entrecruzamiento es un procedimiento de inmovilización de enzimas que tiene

como característica principal que no necesita soporte, sino que la propia enzima se
insolubiliza al formar una red dc proteínas, ella sola o con albúmina bovina u otra
proteína estabilizante y con muchos grupos reactivos en superficie (Wong y Wong, 1992).
El entrecruzamiento se produce uniendo las proteínas por enlace covalente aprovechando
los grupos amino, hidróxilo, tiol, carboxilo, imidazol y tiocter de las mismas (grupos
nuelcófilos), aunque se pueden usar otros. Las enzimas se unen entre si mediante agentes
de entrecruzamiento.
Los agentes de entrecruzamiento pueden no quedar atrapados en la red formada

por las proteínas, lo que se consigue si se usan agentes de entrecruzamiento que induzcan
la interacción de radicales presentes en las proteínas de fornía directa, sin quedar ellos
implicados. Estos agentes de entrecruzamiento se denominan agentes de longitud cero.
Los demás agentes dc entrecruzamiento interaccionan con las proteínas, actuando de
puentes entre los grupos nucléofilos de estas, ya que sus extremos son grupos electrófilos,
de esta forma van creando enlaces covalentes que unen las proteínas entre s¡. Estos
agentes suelen ser bifuncionales y pueden tener un solo grupo funcional o dos (homo- y
heterobífuncionales).
Aunque el agente entrecruzante más usado es el glutaraldeliido, también se usan

dextranos de peso molecular medio y alto, poliaminas y otros polímeros. Estos polímeros
tienen más de dos grupos funcionales útiles para el entrecruzamiento, por lo que se llaman
agentes multifuncionales. Con ellos se obtiene un entrecruzamiento múltiple tanto en la
superficie de la enzima como de enzima a enzima. Este entrecruzamiento suele ser más
flexible y desactiva menos la enzima que el entrecruzamiento logrado con glutaraldehido,
pero puede bloquear o dificultar el paso de los sustratos al centro activo, por el hecho de
crear una red polimérica sobre la superficie enzimatica. Aún así, el método logra
estabilizar la enzima frente a agentes desactivantes como la temperatura, los agentes
caotrópicos o el pH (Guisán y col., 1997).
266
El entrecruzamiento es un método versátil que se ha utilizado, con enzimas en

disolución o cristalizadas (lo que lleva a inmovilizados muy estables) o junto con técnicas
de inmovilización por unión de la enzima a un soporte, para favorecer la creación de
redes proteicas sobre la superficie del soporte y aumentar la estabilidad operacional,
térmica y química del preparado. Este aumento de estabilidad se logra al reforzar de la
estructura activa, aumentando la diferencia de energía libre de Gibbs con otras posibles
conformaciones no activas de la enzima, lo que provoca que el paso de la estructura
activa a otras inactivas sea más dificultoso termodinámicamente. Otra ventaja de este
método, compartida con el enlace covalente a soportes, es su versatilidad, que procede del
gran desarrollo de la síntesis orgánica. Así, a cada enzima se le puede aplicar un agente de
entrecruzamiento que dé lugar al inmovilizado más estable y activo de todos los posibles.
4.1.1.4. Soportes utilizados para la inmovilización de enzimas y otros biocatalizadores
Los soportes utilizados en la inmovilización de enzimas son muy variados;

atendiendo a su composición química se pueden dividir en orgánicos e inorgánicos. Los
soportes orgánicos han sido tradicionalmente los más usados y sobre ellos se han probado
más enzimas y más métodos que sobre los inorgánicos. Esto es debido a que hay una
afinidad natural de estos soportes, generalmente poliméricos, por las enzimas, dada la
relativa similitud química entre ellos.
Los soportes orgánicos admiten mayor carga enzimática, son más fáciles de
modificar químicamente para la inmovilización de enzimas, presentan una porosidad
adecuada para este fin y suelen ser baratos. Por contra, cabe destacar su tendencia a
cambiar de tamaño -lo que modifica su porosidad y, por tanto, el comportamiento del
biocatalizador en el reactor- su compresibilidad -lo que hace inadecuado el empleo de
lechos fijos- y su tendencia a ser fuente de carbono de microorganismos invasores, como
ocurre al utilizar polimeros naturales como la agarosa, la sefarosa, el agar, la celulosa, la
quitina, etc.
Los soportes inorgánicos o cerámicos presentan una menor afinidad por las
enzimas y por los compuestos orgánicos en general y necesitan activar su superficie
mediante reacciones con diferentes agentes organofilizadores (como los silanos) o con
267
sustancias químicas de otra clase que introduzcan funciones orgánicas en dicha superficie,
con las que puedan reaccionar las enzimas o alguna molécula orgánica que haga de
puente. Por ello, generalmente, admiten menor carga de enzima. Como ventajas, se puede
citar que son poco atacables por microorganismos, presentan tina estructura porosa rígida
y definida, no son compresibles, tienen una vida útil larga, son fáciles de manejar, son
resistentes a los disolventes orgánicos y se pueden regenerar mediante pirólisis. Además,
suelen ser baratos (al menos, los que tienen posibilidad de uso industrial).
En cualquier caso, se elija un soporte orgánico o inorgánico, éste ha de cumplir

algunos requisitos mínimos para su utilización (Bickerstaff, 1997):
a) Físicos: resistencia mecánica, incompresibilidad en el rango de variables de

proceso utilizado, superficie intema adecuada, forma geométrica que facilite su
manejo y empaquetamiento, permeabilidad al sustrato, densidad mayor que el
líquido, pérdida aceptable de carga en el reactor.
b) Químicos: Hidrofilicidad (alta polaridad de la superficie), no reactividad con la
enzima, grupos funcionales en superficie suficientemente reactivos o fáciles de
activar.
e) De estabilidad: mecánica y de almacenamiento.
d) Resistencias: al ataque por bacterias y hongos, al pH, a la temperatui-a, a la fuerza
iónica, a los disolventes orgánicos.
e) De seguridad: biocompatibilidad, no toxicidad.
O Economicos: Disponibilidad elevada y coste bajo, simplicidad del equipo que
necesita para su modificación y dc la habilidad técnica requerida para su manejo,
posibilidad de cambio de escala y uso en procesos en continuo, periodos elevados
de utilidad y posibilidad de reutilización.
g) De reacción: escasas limitaciones a la transferencia de materia.
4.1.2.- Inmovilización de ~-gaIactos¡dasas
Dado que las j3-galactosidasas tienen un precio relativamente alto, comparadas con
enzimas de amplia utilización industrial, como glucosa isomerasa o amilasas (por el hecho
de que su mercado mueve 500 veces menos dinero que estas enzimas) su utilización depende
268
mucho de que se pueda recuperar el catalizador después de cada ciclo (si se trabaja en
discontinuo) o de que mantenga su actividad durante periodos largos de tiempo, si se trabaja
en continuo. Cuando el volumen de material a tratar es elevado, un proceso de
transformación en continuo sería lo más adecuado, en función de las tendencias del mercado.
Para la inmovilización de estas enzimas se han probado métodos muy diversos y se

han estudiado las propiedades de los inmovilizados. A principios de los años 70 se produjo
un auge en el estudio de p-galactosidasas con fines industriales y fue cuando comenzo
realmente la investigación sobre inmovilización de las mismas. Weetall (1974 a y b) y
Wondolowsky (1974) fueron pioneros en inmovilizar este tipo de enzimas. Weetall utilizó
en su primer trabajo ~-galactosidasas de hongo (lactasa-M) y de levaduras (lactasa-Y) y
vidrio de poro controlado (CPG) tratado con óxido de zirconio como soporte. En el segundo
usó una enzima de hongo más estable (lactasa-M) y un soporte de vidrio poroso cuya
superficie se había tratado con óxido de titanio. En ambos casos, se utilizó para la
imiiovilización de la enzima un método covalente en el que se empleaban silano y
del soporte. La vida media de los dos inmovilizados
glutaraldehido para activar la superficie
de hongo fue ligeramente favorable a la lactasa-M operando en lecho fijo a 400C (39 frente a
35 días a 40<t) cuando se introduce como alimento soluciones de lactosa, disminuyendo a
25 días cuando se introduce suero dulce. Wondolowski empleó la enzima de E. coli ATCC-
26, purificada e inmovilizada sobre vidrio de poro controlado por tres métodos de enlace
covalente (silanizado en acetona en todos ellos): glutaraldehido, método diazo y formación
de enlace peptidico con carbodiimina. El inmovilizado más estable con la temperatura fue el
que se obtuvo tras activar el soporte con glutaraldehido. El autor estudió la actividad y la
estabilidad con el pH de los inmovilizados y de la enzima en solución, concluyendo que la
enzima libre es más estable a los valores extremos de pH. El estudio cinético empleando
como sustratos lactosa, ONPG y PNPG con los inmovilizados lleva a la conclusión de que
existe inhibición competitiva por galactosa. En el caso de la hidrólisis de PNTPG, también la
glucosa actúa como inhibidor, pero no competitivo.
4.1.3.1.- Métodos de atrapamiento
Los métodos de atrapamiento de 3-galactosidasas en fibras o en membranas se han

utilizado con profusión. Se han empleado con las enzimas de K. fragilis (Kolars y col.,
269
Capitulo 4. Cinética de las reacciones dc hidrólisis con las cnzimas inmovilizadas
1984), de K. lactis (Jancsik y col., 1982; Pastore y col., 1976a y 1976b; Dinelli, 1972), de
A. niger (Kolars y col., 1984, Broome y col., 1983) y de L. bulgaricus (Mahoney y
Adamchuk, 1980). Con la enzima de K. lactis se han logrado conversiones de 0,8 a 1 en 200
minutos utilizando como sustrato leche entera. Con la enzima de K. Jíagilis se han tratado
soluciones de lactosa, consiguiendo conversiones dc 0,39 con cargas de enzima de Sí Ul.
Recientemente, Portaccio y col. (1998) proponen un reactor no isotermo tipo membrana
donde la enzima de A. oryzae está inmovilizada en soportes de nylon y de quitosano. En el
caso dcl quitosano se hace un entrecruzamiento posterior con glutaraldehido. Estos autores
establecen que la reacción de hidrólisis de lactosa con el inmovilizado está inhibida por
galactosa de forma competitiva.
Un método curioso de atrapamiento que se ha desarrollado en los últimos ai~os hace

uso de polímeros que se denominan sensibles a la temperatura. Así, se inmovilizó la [3-
galactosidasa de E. coli con un polímero entrecruzado de N-isopropilacrilamida (Park y
Hoffman, 1993). Este hidrogel responde a la temperatura de tal forma que, por debajo dc un
cierto valor (el valor crítico de solución), el gel pierde gran parte del líquido que contiene y,
al volver a temperaturas superiores, lo reabsorbe. De esta manera, el inmovilizado puede
actuar como una bomba, absorbiendo sustrato a alta temperaturas y expulsando productos a
bajas. Tales inmovilizados sc han probado en tanques agitados continuos y en lechos fijos,
operando en ciclos térmicos. En el caso de lecho fijo se ha mejorado la conversión final
obtenida frente a la obtenida en operación isoterma. La ventaja fundamental de este método
de operación es la operación no isoterma, que crea un bombeo, el cual elimina el control
difusional al crear un transporte por convección forzada en los poros, más rápido que la
difusión molecular. Esta última ventaja es importante, ya que permite que la enzima se
inmovílice en mayor cantidad, aumentando la concentración final de enzima atrapada en el
sólido, y, por tanto, aumentando la velocidad global del proceso.
4.1.3.2.- Métodos de unión a soporte
El método de adsorción, generalmente combinado con un entrecruzamiento

superficial con glutaraldehido, ha sido usado en numerosas ocasiones y sobre diversos
soportes. La enzima de A. niger se ha fijado por este método sobre alúmina porosa y se ha
probado en una planta piloto para el tratamiento de soluciones de lactosa al 5% y de suero
270
ácido caído (Coughlin y col., 1980). El inmovilizado mantenía el 50% de la actividad de la

enzima en disolución y se consiguieron grados de hidrólisis entre el 70 y el 85%. Se han
conseguido inmovilizados con una vida media en el tratamiento de sueros de 120 días y
cargas enzimáticas hasta 250 mg de enzima por g de soporte. Otras enzimas inmovilizadas
por este método han sido las de L. bulgaricus (Macris y Markakis, 1981), B. circulans
(Nakaniski y col., 1983), E. cdi (Kaul y col., 1984) y Scopulariopsis (Park y Pastore, 1981).
La inmovilización en resinas de intercambio iónico se ha logrado tras introducir en la

secuencia de aminoácidos de la enzima de E. coli péptidos cargados (Heng y Glatz, 1994).
Estos péptidos contenían 1, 5, 11 y 16 residuos aspartato, los cuales no interferían con las
propiedades hidroliticas de la enzima nativa, excepto el que contenía 16 aspartatos, que
reducía a la mitad la constante de velocidad. Cuando se producía la inmovilización sobre
membranas de intercambio iónico con grupos amino en superficie, se perdía un 50% de
actividad. La introducción de la cola de 11 aspartatos permitió una interacción de la enzima
con el soporte que aguantaba concentraciones salinas de 0,3 M sin pérdida de enzima al
eluyente durante 5 horas y que servía para purificar la enzima hasta un 83% simplemente
cargando en la columna cromatográfica con la resma el usado diluido de células de E. Coli,
eluyendo primero las impurezas y proteínas extrañas con un tampón 0,3 M en cloruro sódico
y luego la enzima de interés con un tampón 3 M en la misma sal. Estos autores observaron
una inhibición competitiva por galactosa en todos los preparados, pero la constante de
inhibición tiene un valor de un orden de magnitud superior a la constante de Michaelis (35
mM frente a 3,5 mM) cuando se empleaba ONIPG como sustrato.
Los métodos reversibles y controlables son interesantes para reactivar el soporte.

Aunque hay métodos covalentes reversibles, los métodos de inmovilización por afinidad son
interesantes porque fijan la enzima al soporte con gran fuerza en las condiciones de
operación usuales, pero permiten una recuperación de la enzima unida en condiciones suaves
de pH y temperatura. Para la j3-galactosidasa se propone su ligamiento a soportes tratados
con biotina y posteriormente con avidina (Swaisgood, 1997). Este método implica la
biotinilación de la enzima como paso previo a su inmovilización. La interacción es muy
fuerte, pero el simple lavado con cloruro de guanidinio desorbe la enzima, cargándose
posteriorn-iente enzima fresca.
271
También se ha empleado la Ingeniería Genética para inmovilizar por afinidad y

purificar estas enzimas. Al unir el dominio C- terminal de la enzima autolitica amidasa
LYTA de Pneumococcus pneurnoniae al extremo amino de la [3-galaetosidasa
de E. ccli, se
consigue una quimera que mantiene la actividad catalítica de la enzima de E. ccli y que
permite su purificación por afinidad o su inmovilización directa a geles de DEAE-celulosa o
a otros soportes con funcionalidad DEAE en superficie (Sánchez-Puelles y col., 1992). De
esta forma, en un solo paso, se consigue un catalizador heterogéneo adecuado para la
hidrólisis de lactosa.
Otro método muy utilizado con las 9-galactosidasas ha sido la unión covalente a
superficies tratadas con glutaraldehido, que, en el caso de ser inorgánicas, habían sido
tratadas anteriormente con silano para dejar grupos amino en superficie que reaccionaran
con el glutaraldehido. Por ejemplo, la enzima de A. niger ha sido tratada de tal forma para
inmovilizarla en sílice (Pastore y col., 1976 a) y en partículas no porosas de ferrita con Mn y
Zn (Halling y Dunhilí, 1979 a y 1979 b). La carga de enzima con sílice como soporte no fue
elevada, 17 mg/g, y la vida media del inmovilizado dependía del sustrato tratado: 125 días
con soluciones de lactosa, 50 días con ultrafiltrados de suero y 38 dfas con suero entero. La
enzima de A. oryzae se ha inmovilizado de forma similar sobre una resma de intercambio
iduico (Hirohara y col., 1982). En este caso se ha tratado leche desnatada, suero ácido y
ultrafiltrados de suero, consiguiéndose una conversión de 0,8 con un inmovilizado que
contenía una actividad de 1000 U.I./g con tiempos de residencia de 6 a 40 minutos. La vida
media dependía del sustrato: 33 días para sueros ácidos y 48 días para leche. La
productividad oscilaba entre 35 y 90 L de solución dc sustrato por ml de inmovilizado. La
enzima de A.oryzae se ha inmovilizado en otro trabajo (Dekker, 1989) sobre partículas de

magnetita tratada con polietilenimina, la cual es posteriormente activada con glutaraldehido.
Se han estudiado los efectos de las concentraciones de PEI y de glutaraldehido en las
características de los inmovilizados (actividad enzimática y carga proteica). El estudio
fisicoquímico del inmovilizado indica una vida media superior a 14 días a 55”C en las
condiciones de operación, y se observó inhibición competitiva por galactosa y activación por
glucosa. También por este método ha sido inmovilizada la enzima de K. j=agilis(Beddows y
col., 1980; Torrey, 1983) utilizando como soportes celulosa y polímeros orgánicos, con
cargas enzimáticas que llegaban a las 500 U.l./g. Esta enzima fue inmovilizada de esta forma
sobre restos de maíz (Siso y col., 1993). También por este método se han inmovilizado
272
células enteras de Bacillus stearothermophilus (Griffiths y Muir, 1980), con las que se ha
tratado leche desnatada, soluciones de lactosa y suero ácido. El inmovilizado contenía de 2 a
4 mg de actividad enzimática por g de soporte y la conversión para lactosa en solución y
suero llegó a 0,8. Su vidamedia fue de 15 dias. Bakkenycol. (1991)proponen el empleo de
un reactor de flujo axial consistente en una lámina de PVC enrollada que contiene partículas
de sílice derivatizadas con PEI y glutaraldehido donde se inmovilizan enzimas de A. oyzae
y B. circulans (1989) para el tratamiento de leche desnatada, alcanzándose vidas medias del
inmovilizado de 26 h a 640C.
El método covalente de inmovilización con grupos oxirano se ha utilizado en las

enzimas de E. coli (Hannibal-Friedrich y col., 1980), de K. fragilis (Greenberg y Mahoney,
1981) y de K. lactis (Greenberg y Mahoney, 1981). En todos estos casos se consiguieron
cargas enzimáticas de 109 mg/g en celulosa y de 40 mg/g en poliacrilamida con una
actividad del 11 al 23% de la actividad de la enzima en disolución (para las enzimas de
levaduras).
El método basado en la formación de un enlace diazo a partir de una sal de diazonio

también es un método habitual en la inmovilización de estas enzimas. Se ha utilizado con la
enzima de K. fragilis (Beddows y col., 1980) y con la de K. lactis (Torrey, 1983). El método
de formación de enlaces peptídicos por condensación con ayuda de carbodiimidas se ha
empleado para la enzima de E. coli (Beddows y col., 1981); se obtuvieron inmovilizados
poco estables.
Otro método utilizado para la inmovilización de la enzima de K. lactis ha sido la
fijación a soportes de agarosa activados para tener en superficie grupos
tiosulfinato(tiosulfonato (Ovsejivi y col., 1998). Este método también ha sido probado
previamente con la enzima de E. coli (Ovsejivi y col., 1995). Se trata de un método
covalente pero reversible, ya que se puede recuperar hasta el 80% de la enzima lavando el
inmovilizado con un agente reductor, como DTT. Se consigue inmovilizar hasta un 95% dc
la enzima en disolución, manteniendo hasta un 900 u de la actividad de la enzima en
disolución. Los inmovilizados tienen una estabilidad alta, manteniendo su actividad en lecho
fijo inalterada durante 12 días con soluciones de lactosa y 5 días con leche entera.
273
Recientemente, se han desarrollado algunas técnicas de estabilización por

inmovilización multipuntual covalente a la superficie de geles de agarosa (Penzol, 1996). El
uso de pH básico y de temperaturas bajas o medias pemuite la inmovilización de [3-
galactosidasas como la de E. coli o la de K. lactis por los grupos amino de las lisinas
superficiales. Para ello, el soporte debe tener una densidad alta de grupos aldehido en
superficie, lo que se suele lograr por derivatización de la agarosa con glicidilpropanol
seguido de una oxidación con peryodato de sodio. En este mismo trabajo se propone una
estabilización posterior de la enzima ya inmovilizada utilizando entrecruzamiento
multipuntual con poliaminas o polialdehidos (que proceden de las anteriores). El aumento de
estabilidad se logra generalmente a costa de una pérdida de actividad, pero se evita cualquier
pérdida de proteína al eluyente, lo que es importante cuando se trata de enzimas
multiméricas que pueden quedar ligadas al soporte sólo por una subunidad.
Algunos autores (Manjón y col., 1985; Bódalo y col., 1991) han comparado varios
métodos de inmovilización de j3-galactosidasas. Manjón y col. (1985) inmovilizan la enzima
dc E. coli sobre un vidrio de poro controlado tratado con silanos para tener grupos epóxido
en superficie. A partir de este soporte se consigue otro con grupos aldehido en superficie por
oxidación con peryodato sódico de los grupos diol formados de los grupos epóxido, o se
trata el soporte para inmovilizar la enzima por el método diazo, por tioles o por enlace
peptidico con ayuda de carbodiimidas. El método diazo es el que mejor conserva la actividad
de la enzima, incluso la actividad de la enzima inmovilizada es un 190 u superior a la de la
enzima en disolución. Con el método tiol se obtienen inmovilizados muy poco estables y
poco activos (sólo se conserva un 34% de la actividad de la enzima libre). El método por
formación de bases de Schiff (aldehido) rinde un inmovilizado con un 5Q0 de la actividad
de la enzima libre. Con el método por formación de enlace peptídico se consigue una
retención de actividad del 80-85% respecto a la de la enzima libre. La baja estabilidad y
actividad del derivado con puente disulfuro lleva a pensar en la importancia de alguna
cisteina o bien para la unión del sustrato a la enzima o bien para la catálisis o bien para la
estabilización de la conformación activa dc la enzima. Considerando la estabilidad en
operación, el derivado por enlace peptídico con una carbodiimida como agente de
condensación fue el más estable, con una pérdida del 35% de la actividad tras 20 dias de
operación a 45<’C con una solución de lactosa al 4% como alimento. De este estudio, se
deduce que el mejor inmovilizado es el que se logró por formación de enlaces peptídicos.
274
Bódalo y col. (1991) utilizan cinco métodos de inmovilización con la enzima de E.

cotí: adsorción sobre Cromosorb-W, enlace covalente por formación de bases de Schiff con
glutaraldehido sobre CPU, enlace covalente por arilación sobre CPU y atrapamiento en dos
tipos de geles: K-carragenano y alginato cálcico. Con los métodos de atrapamiento se
obtenían inmovilizados poco activos, con una retención de actividad respecto a la enzima
libre para alginato y carragenano de 6 y 15%, respectivamente. Al aplicar el método de
adsorción se conseguían inmovilizados con una retención de actividad del 36% respecto a la
actividad de la enzima libre. Los métodos covalentes resultaron ser los mejores si se tiene en
cuenta la conservación de la actividad respecto a la enzima libre, con un 70% de actividad
conservada en el inmovilizado arilico y un 80% en el derivado aldehido.
275
4.2.- MODELOS CINÉTICOS DE LAS REACCIONES DE HIDRÓLISIS CON ¡3-

GALACTOSIDASA DE Kluyveromycesfragilis INMOVILIZADA
En este apartado se estudian las reacciones de hidrólisis de ONPG y lactosa con la

enzima de K. fragilis, del preparado comercial Lactozym, inmovilizada sobre sílice-
alúmina. El método de inmovilización seleccionado es uno de los más utilizados en la
literatura, el enlace covalente por formación de bases de Schiff en el que se activa el
soporte con un silano y con glutaraldehido; se ha estudiado la influencia de algunas
variables de Ja inmovilización sobre las propiedades de los inmovilizados,
Posteriormente, se determinaron las condiciones en las que la transferencia de materia es
suficientemente rápida y es la etapa química la que controla la velocidad del proceso. Se
ha analizado luego el efecto del pH, de ciertos iones y de la temperatura sobre la actividad
y estabilidad dc la enzima, para establecer las condiciones de reacción en las que se
asegure la actividad de la enzima durante el tiempo que duran los experimentos cinéticos.
Una vez se han seleccionado las condiciones de reacción adecuadas y los valores de las
variables del método de inmovilización, se ha llevado a cabo el estudio cinético de las
reacciones de hidrólisis de lactosa y de ONPG con la enzima inmovilizada, discriminando
el mejor modelo cinético de entre los propuestos y determinando los parámetros que
aparecen en dicho modelo.
4.2.1.- Selección de las condiciones de inmovilización
El soporte elegido para inmovilizar la enzima de K. fragilis es una sílice-alúmina

industrial, KA-3 de Sudehemie y se utilizó el método de inmovilización por enlace
covalente por formación de bases de Schiff con glutaraldehido, que es un procedimiento
de inmovilización de enzimas muy común, tanto en soportes orgánicos como en soportes
inorgánicos (Weetall, 1974; Wondolowsky, 1974; Cho y Bailey, 1979; Hossain y Do,
1985; Manjón y col., 1985; Rapatz y col., 1988; Dekker, 1989; Bódalo y col., 1991;
Bakken y col., 1992; Lartillot, 1993; Papayannakos y col., ¡993; Benzol, 1996). El
procedimiento de inmovilización y las reacciones que este procedimiento comprende se
han descrito en el apartado 2.3.4.
276
A continuación se estudia el efecto de algunas variables de la inmovilización sobre

la actividad y la estabilidad de la enzima inmovilizada. En todos los experimentos de
inmovilización que se han llevado a cabo se han seguido los siguientes protocolos:
• La proteína en el sobrenadante se mide por el método de Bradford descrito en el

apartado 2.3.3.
• La actividad remanente en el sobrenadante durante la inmovilización se mide según el

protocolo del apartado 2.2.3, en las condiciones estándar (T=250C, CONPG=O,5 gIL).
• La actividad inicial de los inmovilizados y la actividad residual del inmovilizado
durante el estudio de la desactivación se determina de acuerdo al protocolo del
apartado 2.2.4.
• La estabilidad de cada inmovilizado se mide como actividad residual, sometiéndolo a

desaetivación térmica a 450C en BP, como se describe en el apartado 2.2.4.
En todos los experimentos realizados en este punto, el diámetro de partícula

utilizado fue de 0,1-0,2 mm y la concentración inicial de enzima en la fase de
inmovilización de 35 mg/L. La inmovilización se llevó a cabo en el tampón BP
seleccionado en el punto 3.2.1. y cuya composición está recogida en la Tabla 2.4. Las
variables estudiadas en este punto son: el tiempo de tratamiento del soporte con silano, la
concentración de silano durante ese tratamiento, el tiempo de activación del soporte
silanizado con glutaraldehido, la concentración de glutaraldehido durante esa activación,
el pH del medio durante la etapa de inmovilización de la enzima, el efecto protector de la
lactosa frente al pH de ese medio y el tipo de agente reductor y su concentración durante
la etapa de estabilización del inmovilizado.
Influencia del tiempo de activación con silano
En la superficie de la sílice-alúmina hay grupos silanol, que son poco reactivos

para inmovilizar enzimas, por lo que hay que activar la superficie del soporte. Para que
dicha activación se lleve a cabo con compuestos orgánicos, como el glutaraldehido, hay
que organofilizar la superficie de la sílice-alúmina, lo que se suele realizar tratándola con
silanos. Para que pueda reaccionar con el glutaraldehido, la sílice-alúmina se trata con un
277
silano aminado: y-aminopropiltrietoxisilano (y-APTES); por cada gramo de soporte, se

utilizan 20 mL de la solución de silano.
Se han llevado a cabo dos experimentos de inmovilización en los que el tiempo de

tratamiento con silano fue de 2 y de 3,5 horas. La concentración de silano en la disolución
es del 10% en los dos experimentos. Luego, se han tratado los sólidos con glutaraldehido
2,5% durante 2 horas. La inmovilización de la enzima se llevó a cabo en BP pl-! 7,0; para
la reducción final, se empleó NaBH4 1 mg/mL; la concentración de enzima por gramo de
soporte obtenida es de 0,35 mg/g y la concentración de proteína por gramo de soporte es

1,65 mg/g.
La medida dc la actividad de los dos inmovilizados se realizó mediante un

experimento estándar de hidrólisis de ONPG (T25<’C; CQNP<tO,S gIL) del apartado 2.2.3.
En la Figura 4.3a se muestra la evolución de la conversión de ONPG con el producto tCE
para los dos inmovilizados. Como se puede observar, los resultados son similares en
ambos casos, lo que significa que la actividad en los dos inmovilizados es prácticamente
la misma. Por lo tanto, esta variable no afecta a la actividad del inmovilizado al menos en
el intervalo estudiado.
El análisis de la estabilidad de los inmovilizados con la temperatura se llevó a

0C en BP y los resultados se muestran en la Figura 4.3b. Se observa que la
cabo a 45
pérdida de actividad es muy similar en los dos casos, por lo que la estabilidad térmica de
los dos inmovilizados es parecida. Por tanto, el tiempo de silanización tampoco influye
sobre la estabilidad de la enzima inmovilizada. De acuerdo con los resultados obtenidos
se ha seleccionado un tiempo de silanización dc 3,5 horas para el resto de los estudios
llevados a cabo con enzima inmovilizada.
Influencia de la concentración de silano
Para analizar la influencia de esta variable se han llevado a cabo tres experimentos
de inmovilización en los que se varió la concentración de silano entre cl 1 y cl 20%. El
tiempo de silanización fue de 3,5 horas. Se trataron los soportes silanizados con
glutaraldehido al 2,5% durante 2 horas. Se puso en contacto el soporte activado y la
278
disolución de la enzima en BP a pH 7,0. Una vez inmovilizada la enzima, se estabilizaron

los inmovilizados por reducción con NaBI-14 1 mg/mL. Se obtuvieron inmovilizados con
una carga de enzima de 0,35 mg/g y una carga de proteína de 1,65 mg/g. Las medidas de
actividad y estabilidad de cada inmovilizado se realizaron como en el punto anterior.
En la Figura 4.4a se muestra la variación de la conversión de ONPU con el

producto tC~. Se observa que las curvas coinciden, por lo que la actividad de los
inmovilizados es similar. La concentración de silano no afecta a la actividad de la enzima
inmovilizada.
La Figura 4.4b muestra como pierden la actividad los inmovilizados cuando se

0C en BP. Se puede apreciar que la estabilidad de la enzima es similar en
someten a 45
todos los casos, ya que las curvas de desactivación son muy parecidas. Para el resto de los
estudios con la enzima inmovilizada se ha elegido una concentración de silano del 10%.
279
1,0
1
0 1 2 3 4 5 6
tq(ninnÚL) (rin)
Figura 4.3.- Influencia del tiempo de silanización en la actividad (a) y estabilidad (b) de
la enzima inmovilizada.
~1
25 O 50 l(~ 150 an 250 3(U
(rin)
Figura 4.4.- Influencia de la concentración de silano en la actividad (a) y estabilidad (b)

de la enzima inmovilizada.
280
Influencia del tiempo de activación con glutaraldehido
El glutaraldehido es un agente bifuncional que se suele utilizar en el

entrecruzamiento de proteínas o para el enlace covalente de proteínas a soportes. Sus
grupos aldehido forman bases de Schiff con los grupos amino de las proteinas o del
soporte silanizado, por lo que actúa de molécula-puente entre el soporte silanizado y la
enzima. En realidad, la química de la reacción del grupo amino y del grupo aldehido es
más compleja, pues el enlace imida queda estabilizado por resonancia a pH neutro, de
modo que el enlace del glutaraldehido con la enzima es más estable de lo que se supone
en un enlace imifia.
Se han llevado a cabo dos experimentos de inmovilización en los que se ha tratado

el soporte silanizado con glutaraldehido durante 2 y 3 horas, respectivamente. La
concentración de glutaraldehido ha sido de 2,5%. Se añaden 15 mL de solución de
glutaraldehido en HP por cada gramo de soporte silanizado. Los soportes se silanizaron
durante 3,5 h con una solución al 10% de silano; cuando se terminó de activar el soporte
silanizado con glutaraldehido y, tras un lavado intenso, se añadió la enzima disuelta en
BP pH 7,0. La reducción final se llevó a cabo con NaBH4 1 mg/ni. La concentración de
enzima inmovilizada en el soporte (C~~~) fue de 0,35 mg/g y la de proteína (C~~) de 1,65
mg/g. Las medidas de actividad y de estabilidad se realizaron por los mismos
procedimientos empleados en los experimentos de inmovilización del punto primero de
este apartado.
La Figura 4.5a muestra la variación de la conversión de ONPG con el producto

t~C>~. Se puede observar que las curvas de actividad de los distintos inmovilizados son
muy próximas, por lo que se deduce que el tiempo de activación con glutaraldehido no
influye en la actividad del inmovilizado.
En la Figura 4.5b se presenta la desactivación térmica de los inmovilizados con

distinto tiempo de activación con glutaraldehido. Se observa como las curvas de
desactiva-ción prácticamente coinciden, por lo que esta variable, al menos en el intervalo
estudiado, no influye tampoco en la estabilidad de la enzima inmovilizada.
281
Influencia de la concentración de alutaraldehido
Para analizar la influencia de esta variable se han realizado experimentos de

inmovilización en los que se varió la concentración de glutaraldehido entre 0,5 y 5%. El
soporte silanizado se mezcla con la solución de glutaraldehido en BP en una proporción
15 ml/g de soporte. La silanización del sólido se llevó a cabo durante 3,5 h con una
solución al 10% de silano. El soporte activado con glutaraldehido se añadió a la enzima
disuelta en HP a pH 7,0. Se utilizó NaBH4 1 mg/ni como agente reductor en la
estabilización de los enlaces imina. Se obtuvo una concentración de enzima (C1;J de 0,35
mg/g y una concentración de proteína (C~~) de 1,65 mg/g en todos los inmovilizados. Las
medidas de actividad y de estabilidad se llevaron a cabo del mismo modo que en los
experimentos dc inmovilización dcl primer punto de este apartado.
En la Figura 4.áa se muestra la variación de la conversión de ONPG con el

producto tC[%. Se observa que las curvas de actividad de los distintos inmovilizados son
muy parecidas, por lo tanto, se deduce que la concentración dc glutaraldehido no influye
en la actividad del inmovilizado.
0C.
La Figura 4db muestra la pérdida de actividad de los inmovilizados en BP a 45
Las curvas de desactivación están muy próximas cuando la concentración de
glutaraldehido es superior a 1,25%; de lo que se deduce que la concentración de
glutaraldehido no afecta a las propiedades de la enzima inmovilizada en concentraciones
iguales o mayores al 1,25%. Para concentraciones menores de glutaraldehido, la enzima
inmovilizada parece que es menos estable. En consecuencia, para el resto de
experinientos con la enzima inmovilizada, se ha seleccionado una concentración de
glutaraldehido dcl 2,5%.
282
1.0 10)
80
70
o
60
1 50
40
30
20
10
O
0 1 2 3 4 5 6 O 10) 20) 30) 40) 50)
t4(ninn4L) (rrín)
~rcubaoÓ~
Figura 4.5.- Influencia del tiempo de activación con glutaraldehido en la actividad (a) y
estabilidad (b) de la enzima inmovilizada.
1.0 100
80
10
o
6, 60
50
40
30
20
10
o
0 2 4 6 8 10 12 14
tct(ninngL)
Figura 4.6.- Influencia de la concentración de glutaraldehido en la actividad (a) y

283
Capítulo 4. Cinética de las reacciones de hidrólisis con las cnzimas inmovilizadas
Influencia del pH de inmovilización
Con el objeto de estudiar la influencia del pH de la solución enzimática en la etapa

de inmovilización, sobre la actividad y la estabilidad de la [3-galactosidasa
dc K. f=agilis
inmovilizada, se han llevado a cabo varios experimentos con distinto pH en la mezcla
sólido activado-solución enzimática, en ausencia y en presencia de lactosa (50g/L). Estos
experimentos se recogen en la Tabla 4.3. En todos los casos, los sólidos se trataron con
silano al 10% durante 3,5 h, con glutaraldehido al 2,5% durante 3 Ii y se utilizó como
agente reductor NaBH4 en una concentración de 1 mg/mL. En todos los casos se
obtuvieron inmovilizados con una concentración de enzima en el sólido, ~ de 0,35

mg/g y una concentración dc proteína, C~, de 1,65 mg/g.
En la Figura 4.7a se muestra la variación de la conversión de ONPG con el

producto t•C17 para los experimentos realizados en ausencia dc lactosa a diversos valores
de pH. Se observa que, para un mismo valor de tC}; , la conversión disminuye al
aumentar el pH. Al ser mayor la interacción soporte-enzuna, la deformación
tridimensional que sufre la enzima respecto a la enzima en disolución es mayor cuanto
mayor es el pH. Este hecho explica que la actividad disminuya al aumentar el pH.
La estabilidad de los inmovilizados con el tiempo para diferentes valores de pH en

ausencia de lactosa se muestra en la Figura 4.7b. Se puede observar que la velocidad de
desactivación es más lenta cuanto mayor es el pH. Este hecho implica que el enlace de la
enzima con el soporte es diferente según el pl-!; a pR básico se obtienen derivados
multipuntuales, donde la enzima está ligada al soporte por más de un enlace.
Hay que considerar que, en cualquiera de los inmovilizados obtenidos hasta ahora,
se ha utilizado una cantidad elevada tanto de silano como de glutaraldehido, por lo que el
soporte siempre ha sido un soporte muy activado, con una densidad superficial de grupos
aldehido alta. Por tanto, el número de enlaces que se establecen entre la enzima y el
soporte depende solamente de cuantos grupos amino de la enzima que estén activos al pH
de la inmovilización. Esta cantidad es tanto mayor cuanto mayor es el pH. A pH elevado,
los grupos amino de las ¿-lisinas pueden formar enlaces con los grupos aldehido del
soporte (Penzol, 1996; Guerra, 1997; Guisán y col., 1997). Se sabe que, en esta enzima,
284
Capitulo 4. Cinética de tas reacciones de hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
un 7,64% de los aminoácidos son s-hsinas y que hay dos subunidades y, por tanto, dos
cadenas polipeptídicas (Mahoney, 1978). Por tanto, a pH neutro la enzima puede
establecer uno o dos enlaces con el soporte, probablemente uno, pues sólo si los grupos
amino terminales de las cadenas polipeptidicas tienen la misma orientación espacial se
pueden establecer los dos enlaces posibles entre la enzima y el soporte. A pH básico, hay
108 s-lisinas en las dos subunidades (Mahoney, 1978) que pueden reaccionar con el
soporte. Aún teniendo en cuenta que estos aminoácidos deben estar próximos entre si y
estar situados en la superficie de la enzima para poder reaccionar conjuntamente, se puede
considerar que se formarán varios enlaces enzima-soporte si el estado iónico de estos

grupos amino es el adecuado. Cuanto más enlaces se formen entre la enzima y el soporte,
más estabilizada quedará la estructura espacial de la enzima inmovilizada y más actividad
se podrá perder como consecuencia de la alteración de la conformación nativa de la
enzima. Como se ve, si se quiere una mayor estabilidad, se obtiene a costa de perder
actividad.
Los resultados de actividad y estabilidad obtenidos con los distintos inmovilizados

a distintos valores de pH se resumen en la Tabla 4.3. La actividad enzimática conservada
(a) es el tanto por ciento de actividad conservada en el inmovilizado respecto a la de la

enzima en disolución y se calada según la ecuación [4.1]. La vida media es el tiempo al
cual la actividad remanente en el inmovilizado es el 50% dc la actividad inicial del
mí sino.
y
XC [4.1]
(r~ $Xc &jioo
Para observar el efecto de la presencia de lactosa en el medio de inmovilización,
se han realizado algunos experimentos a los valores de pl-! antes probados en los que se
ha añadido lactosa a la solución de enzima en una concentración de 50 gIL. La actividad
de los inmovilizados se muestra en la Figura 4.8a como conversión de ONPG Vs. el
producto t.Cj. Al aumentar el pH, se observa una pérdida de actividad sólo cuando el pH
285
es mayor de 9,0. La actividad se conserva mejor en presencia de lactosa que en su

ausencia; a pH 9,0 se pierde un 60% de actividad frente al 82% que se pierde en ausencia
de lactosa. La utilización de sustratos y de inhibidores competitivos es muy conocida
como medio para estabilizar a la enzima contra la desactivación por pH (Guisán, 1992).
En Ja Figura 4.8b se muestra como se desactivan los distintos inmovilizados en HP

a 450C. Se observa que la pérdida de actividad es similar a pl-! 7,0 y a pH 9,0 en presencia
de lactosa. Por tanto, si hay lactosa en el medio de inmovilización, la actividad y la
estabilidad de los inmovilizados a pH 7,0 y a pH 9,0 es similar. A pH 9,5 se puede
apreciar que la estabilidad es mayor, con una vida media dcl inmovilizado que puede
superar los 500 minutos frente a los 100 conseguidos a pH 7,0. Los resultados también se
resumen en la Tabla 4.3.
Comparando los resultados obtenidos en presencia y en ausencia de lactosa en el

medio de inmovilización, sc deduce que la lactosa tiene un efecto estabilizador
importante, al fijar la conformación del centro activo y protegerle de reacciones
desactivantes. Seguramente, varios aminoácidos que sirven para la inmovilización a pH
básico se encuentran cerca del centro activo y no reaccionan a estos valores de pl-l cuando
hay lactosa en el medio, pero lo hacen en su ausencia, lo que explica la mayor estabilidad
y menor actividad de los inmovilizados obtenidos en ausencia de lactosa.
Los inmovilizados obtenidos a pH 7,0, con o sin lactosa, son los más activos,
aunque son los menos estables. Sin embargo, tienen una estabilidad similar a la de la
enzima en disolución, como se verá más adelante, por lo que son adecuados para
utilizarlos en el estudio de la cinética de la enzima de K. fragilis inmovilizada. Se escogen
como condiciones de inmovilización, por tanto, pH 7,0 y ausencia de lactosa.
286
1.0
10)
exp
90
• 7,0 ILZ17
0.8 • 9,0 ILZiS 50
k 9,5 LZi9
70
6,
0.6 a 60
U,
a
6,
E 50
U,
-D
0.4 - 6, 40
.5
50
0.2 - 20
lo
0.0
o
o 2 4 6 8 lO 12 14 16 18 20 22 0 50 10) 150 20) 250 30)
t C5 (mm mg/L) t¡rflj5adtl (mm)
Figura 4.7.- Influencia del pH de la solución enzimática en la actividad (a) y en la

1.0
100•
o
a
6,
a
6,
-c
6,
.5
t4
0 5 10 15 20 25
t CE (mm mg/L) (mio)
Figura 4.8.- Influencia de la presencia de lactosa a diversos valores del pH de

inmovilización sobre la actividad (a) y la estabilidad (b) de la enzima inmovilizada.
287
Tabla 4.3.- Inmovilizados: Influencia del pH de inmovilización y de la presencia de

lactosa.
Experimento ILZ14 ILZJS ILZI6 ILZI7 ILZIS ILZI9

ph 7,0 9,0 9,5 7,0 9,0 9,5
Lactosa 50 gIL no no no si sí
Actividad enzimútica 34 18 5 37 40 19
conservada (0/o)
Vida media a 450C en BP (mm) 100 298 460 80 105 450
Influencia del agente reductor
La enzima inmovilizada por el método silano-glutaraldehido está unida al sólido

por un enlace imina, que es relativamente débil. Para estabilizar este enlace hay que
reducir el doble enlace de la imina a un enlace simple, una amina. Esta reducción se
puede llevar a cabo con varios reductores relativamente suaves: borohidruro sódico,
cianoborohidruro sódico y otros compuestos similares. El NaBH
4 es un reductor más
potente que el NaCNBH4 que reduce, además de los enlaces imina, los grupos aldehido
libres en la superficie del soporte activado. Estas reacciones de reducción se muestran en
el apartado 2.3.4.
Se han realizado cuatro experimentos en los que se han utilizado estos dos agentes
reductores, utilizando dos concentraciones: 1 y 10 mg/mL. Los experimentos realizados
se recogen en la Tabla 4.4; se han dejado reaccionar con el inmovilizado durante una hora
en todos los casos; los sólidos se han activado por silanización con y-APTES al 10%
durante 3,5 horas seguida de una reacción con glutaraideliido al 2,5<0 durante 3 horas; se
inmovilizó la enzima a pH 7,0, sin lactosa, en el medio de inmovilización. Los

inmovilizados obtenidos tenían una carga de enzima de 0,35 mg/g y una carga de proteína
de 1,65 mg/g.
La conversión de ONPG obtenida frente al producto tCr- se muestra en la Figura

4.9a. Se puede observar que se obtiene una actividad similar en todos los casos, excepto
cuando el NaBH4 se utiliza en una concentración de lO mg/nl. Entonces, la actividad se

reduce mucho, lo que puede deberse a que este reactivo también afecta a algunos
aminoácidos de la enzima.
288
1.0
0.8
cl)
0.6 —
0.4
0.2
0.0
10 15
1 CE (mm mgIL) ~ (mm)
Figura 4.9.- Influencia del agente reductor en la actividad (a) y en la estabilidad (b) de la
enzima inmovilizada.
En la Figura 4.9b se muestra la desactivación de distintos inmovilizados a 45<’C en

BP. Se observa que la pérdida de actividad es similar en todos los casos, excepto en el
experimento con la concentración más alta de NaBH4, caso en el que se obtiene una
mayor estabilidad (300 horas de vida media frente a las 60-100 obtenidas en los demás
inmovilizados). Sin embargo, la mayor estabilidad obtenida con 10 mg/mL de NaBH4 no
compensa la menor actividad del inmovilizado obtenido en estas condiciones. En la Tabla
4.4 se resumen los resultados obtenidos de actividad y de estabilidad.
Para el resto de los estudios con la enzima inmovilizada se ha seleccionado como

agente reductor NaBH4 en una concentración de 1 mg/mL. Este es un valor muy habitual
en los estudios realizados en la literatura (Bódalo, 1991; Lartillot, 1993).
289
Tabla 4.4.- Influencia del tipo y concentración de agente reductor sobre la actividad y la
estabilidad de la enzima inmovilizada.
[Experimento ILZI3 1__ILZ?14__] ILZI5 ILZI6

Agente reductor >~ NaBI-b NaBH4 NaCNBH3 NaCNBB3
concentración (mg/mL) 1 10 10
Actividad enzimática
0/o) 37 18 46 48
conservada (
Vida media a 450C en RP 63 106 51 48
(mm)
Por tanto, teniendo en cuenta la influencia de las variables analizadas en el

proceso de inmovilización, las condiciones seleccionadas para llevar a cabo la
inmovilización son:
• Tiempo de silanización:
3,5 horas
• Concentración dey-APTES:
1000
• Tiempo de activación con glutaraldehido:
3 horas
• Concentración de glutaraldehido.
2,5 ~
• pH de inmovilización:
7,0
• Lactosa 50 gIL:
No
• Agente reductor y concentración: NaBH
4 1 mg/ml
Se han utilizado en todos los casos un diámetro de partícula pequeño, la fracción

comprendida entre 0,1 y 0,2 mm de diámetro de panícula, y una carga baja de enzima en
el sólido, Ci;w=0,35 mg/g.
Se han realizado varios experimentos de inmovilización en las condiciones

escogidas en los que la única vanable que se ha modificado ha sido la concentración de
enzima en el medio de inmovilización y, por tanto, la carga de enzima en el soporte. Sc

obtuvieron inmovilizados con una carga enzimática, ~ entre 0,07 y 5,6 mg/g.
En las Figuras 4.lOa y 4.lOb se muestra la variación de las concentraciones

relativas de enzima y de proteína en el sólido durante las inmovilizaciones. Como se
puede apreciar, la enzima sc inmoviliza a la misma velocidad que la proteina total en
290
todos los casos. Considerando que la enzima es, más o menos, un 20% de la proteína total
y que tiene un peso molecular alto comparado con la mayoría de las proteínas habituales
(201 KDa frente a 50-100 KDa que suelen tener otras proteínas), se puede deducir que
habrá muchas proteínas en el medio con un coeficiente de difusión molecular en agua que
será incluso de un orden de magnitud superior al de la enzima de interés. Por tanto, para
que las curvas de carga de proteína y de carga de enzima coincidan, la transferencia de
materia en la capa externa o difusión extema no puede controlar la velocidad del proceso
de inmovilización.
Teniendo en cuenta la forma de las curvas, parece que hay un limite de

concentración de proteína en el sólido a partir del cual disminuye la velocidad del proceso
de inmovilización. Este límite, en términos de concentración de enzima en el sólido o
se encuentra en tono a 1,40 mg/g. Este descenso en la velocidad de inmovilización
se puede explicar si se supone que, al principio de la inmovilización, se crea una
monocapa de proteína sobre el soporte y el resto de la proteína se une a la ya fijada por
adsorción. Si se tiene en cuenta que Mahoney y col. (1978) observaron al microscopio
electrónico que la enzima de K. fragilis formaba agregaciones de 10 subunidades, es
decir, de 5 moléculas de enzima, se puede deducir que la enzima tiende a unirse a otras
moléculas de enzima. Podría darse, por tanto, una inmovilización mixta por enlace
covalente y adsorción o, incluso, afinidad.
291
Capítulo 4. Cinética de las reacciones dc hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
100 loo
80 so
o
o 60 2 eo
oII o
II
40 40
o LV
E-)
20 20
o o 8
0 2 4 6 8 0 2 4 6
t¡nnniI¡zad&~ (h)
Figura 4.10.- Evolución de las concentraciones relativas de enzima (a) y de proteína (b)
en el liquido sobrenadante en experimentos con distintas cargas de enzima.
4.2.2.- Experimentos previos
Se estudia en este apartado el efecto de ciertas variables dcl medio sobre la

actividad y estabilidad de la enzima. Es importante conocer en qué condiciones la enzima
es activa y cuánto tiempo mantiene dicha actividad; también hay que determinar en que
condiciones la reacción ocurre bajo control dc la etapa química.
Influencia del pH y de algunos iones en la actividad de la enzima
Para analizar el efecto dcl pH sobre la actividad de la enzima, se han realizado

experimentos a distintos pH comprendidos entre 5 y 9. En la Figura 4.11 se muestra la
velocidad inicial de la reacción, frente al pH del medio de reacción utilizando ONPG como
sustrato y HP como tampón. En la Figura 4.12 se muestran los resultados obtenidos con
lactosa como sustrato y BM como tampón.
292
Capítulo 4. Cinéticade las reacciones de hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
Para llevar a cabo los experimentos con ONPG y, teniendo en cuenta los resultados
de la Figura 4.10, se ha seleccionado un pH de 7, al cual se observa una mayor actividad
para Lactozym. Para la reacción con lactosa se ha elegido el pH 6,5, pues es el pH de la
leche. Este pH óptimo está cercano a 7, lo que es natural en enzimas procedentes de
levaduras y bacterias que crecen en medios neutros.
Igual que se hizo con las enzimas en disolución, se han realizado varios
experimentos para analizar el efecto de algunos cationes metálicos sobre la actividad de los
inmovilizados. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4.13. Se puede observar
que seis de los nueve cationes utilizados inhiben la actividad enzimática, siendo el más
inhibidor el ión Cir2t que provoca una pérdida de actividad del 95%. Si se añaden los iones
Ni 2+, Al3~, Ee2~ y Zn2~, la actividad de la enzima disminuye hasta el 50-60% de la obtenida
en HP.
Influencia del pH en la estabilidad de la enzíma~
Se ha estudiado también, como se hizo con las enzimas en disolución, el efecto

desestabilizador del pH. Para ello se ha seguido un procedimiento muy similar al empleado
con la enzima libre (apartado 3.2.1). A cada valor del pH en el intervalo experimental
seleccionado (entre 5 y 9) se mide la actividad remanente en muestras de sólido tomadas a
distintos tiempos de incubación. La actividad remanente (a) se calcula como:
[4.2]
•100
donde t se refiere al tiempo de incubación al pH ensayado. Los resultados se muestran en la

Figura 4.14, en la que se puede observar que la enzima es poco estable a pH alcalino,
teniendo su máxima estabilidad con pH 7,0. El aumento de actividad a 1 h que se aprecia a
pH 6 y 7 se puede deber a un desplegamiento de la enzima a una forma más activa pero
menos estable, que posteriormente evoluciona a una forma inactiva de la enzima.
293
Influencia de la temperatura en la estabilidad de la enzima
Para observar la termoestabilidad de la enzima inmovilizada, se han realizado

experimentos siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 2.2.4. Se ha trabajado a tres
temperaturas 6, 40 y 45 0C, y se han tomado medidas de actividad a diferentes tiempos según
el protocolo del apartado 2.2.4. El medio en el que se han llevado a cabo las incubaciones ha
sido BP. Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 4.15 y 4.16 como actividad
residual o remanente (calculada según la ecuación [4.2]) frente a tiempo de incubación.
• En la Figura 4.15 se observa que hay una pérdida de actividad en el inmovilizado a una
temperatura de 60C en HP, es decir, en condiciones de almacenamiento. Esta
desactivación se puede explicar si existe desorción de la enzima, lo que implica que parte
de la enzima no se ha inmovilizado por enlace covalente, sino por adsorción y ésta
enzima es la que, con el paso del tiempo, se desorbe. Otra posibilidad es la existencia de
reacciones enzima-soporte posteriores a la inmovilización que provoquen una
modificación estructural de la enzima y, por tanto, una pérdidade actividad.
• El comportamierño de la enzima de K. fragilis inmovilizada frente a la desactivación
térmica se muestra en la Figura 4.16. A 400C se observa una muy leve desactivación,
siendo ésta mayor cuando se aumenta la temperatura a 450C. Por tanto, la mayor
temperatura a la cual se puede trabajar es de 40”C, porque a una temperatura mayor
se observa una desactivación que puede influir en el curso de hipotéticos
experimentos cinéticos que se hicieran a esa temperatura.
294
0.25- ‘u
0.20-
0.15 u
010- u
E
a
1— u
0.05-
u
0.00
4 5 6 7 8 9 10
pH
Figura 4.11.-influencia del pH sobre Ja actividad de la enzima de K fragilis inmovilizada

(en HP y con ONPG). T=250C; CoNp(;o~z0,5 gIL; C~~0,7 mg/L
u-.
-~ ¡
0.15
u
0 10 - ---‘u
1~.r0 05
000-
u- —J
5 8 7 8 9
pH
Figura 4.12.- Influencia del pH sobre la actividad dc la enzima de K. fragilis inmovilizada

(en BM y con lactosa). T=400C; C
1~0=50 gIL; CEL =~7 mg/L
295
100
80
cl
0) 60
5
-D
40
4—
E->
20
O
Blanco Fe Co Ni Cu Al Zn Or Mn
lón presente en el medio
Figura 4.13.- Influencia de algunos iones metálicos sobre la acti vidad de la enzima de
K.fragilis inmovilizada (en HP).
140
1202
e
o
100 5 u m u
6)
4-- y. e
a)
a 80 y. •~
t¡empo(h
1~ 60- ,1’ U O
-o
ca 4. e 1,0
40 3,0
? 7,0
20 ~&- 24,0
¡ ¡
4 5 8 7 8 9 10 11 12
pH
Figura 4.14.- Estabilidad al pH de la enzima de K.f-ugi/is inmovilizada (en BP).

Medida de actividad estándar: T=250C; CQÑPG <=0,5 g/L; C111 ~0,7 mg/L
296
)
100! a
E..
80 -
.9
a
a) 50-
a
1.-
~0 40 -
ca
-o
20 -
o ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
0 50 100 150 200 250 300 350 400

t (días)
Figura 4.15.- Estabilidad de la enzima de K.fragilis inmovilizada almacenada a 40C.

Medida de actividad estándar: T=250C; CONI’u o~0,S gIL; C~
11~ ~0,7 mg/L
E.
100’
u
u
o
so-
.9
a
a)
a 50-
1- e
-o 40-
El)
~0 e
Terroeratura
20 - u 4000
• 4500
o ¡ ¡ 1 ¡ ¡
0 50 100 150 200 250 300
t(min)
Figura 4.16.- Estabilidad térmica incubada en BP de la enzima CEL ~0,7inmovilizada.

0,5 gIL;K.fragilis mgIL
Medida de actividad estándar: T~=25’~C; CONPG o~
297
Influencia de la velocidad de aaitación en la velocidad de la hidrólisis de ONFG
Se ha estudiado como influye la velocidad de agitación en la velocidad de reacción

obtenida con la enzima de K.. Jíagilis inmovilizada, para seleccionar las condiciones de los
experimentos cinéticos en los que se pueda eliminar el control de la difusión externa. Para
ello se ha elegido:
-Un tamaño de partícula suficientemente pequeño (O,l<d~K0,2 mm) con el que cabe
esperar la ausencia de limitaciones por difusión interna, aunque esta hipótesis se
revisará más tarde.
-La reacción de hidrólisis de ONPG, ya que es una reacción más rápida que la
hidrólisis de lactosa y. por tanto, puede favorecer el control de los procesos de
difusión.
Se ha seguido el protocolo del apartado 2.2.4 y se han realizado experimentos en

matraces Erlenmeyer agitados y termostatizados en un intervalo de velocidades de agitación
de la hélice de 100 a ¶400 r.p.m., así como un experimento que se llevó a cabo con agitación
de vaivén a 100 r.p.m. Los diferentes experimentos realizados se presentan en la Tabla 4.5.
En la Figura 4.17 se representa la conversión frente al producto tC1>, a varias
velocidades de giro de la hélice que actúa como agitador, así como los resultados obtenidos
en el experimento realizado en baño de agitación con agitación de vaiven. Si controla la
etapa química, la conversión debería ser la misma para un mismo valor de t-C~. A] emplear
la agitación de vaivén dc 100 r.p.m. la difusión externa controla claramente la velocidad del
proceso. Lo mismo sucede cuando se utiliza agitación con hélice a velocidades menores de
300 r.p.m.: la difusión externa es la etapa controlante. Entre 300 y 500 r.p.m. coinciden las
curvas X vs. t * Ch: y se alcanza la máxima velocidad de reacción, lo cual indica que en estos
experimentos la difusión externa no controla. Si la velocidad de agitación es de 1400 r.p.m.,
se observa que la velocidad de reacción es algo inferior a la obtenida a 800 r.p.nv, lo que se
podría explicar si hay desactivación mecánica de la enzima (Man ón, 1985). Por tanto, para
el estudio cinético se ha seleccionado como equipo de experimentación matraces Erlenmeyer
con 50 mL de medio de reacción agitado por una hélice que gira a una velocidad entre 300 y
800 r.p.m.
298
Capitulo 4. Cinética dc las reacciones de hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
Influencia de la concentración de enzima inmovilizada en el sólido en la velocidad de la

hidrólisis de ONPG
La difusión en poros es la etapa que controle la velocidad del proceso cuando es la

etapa más lenta del mismo. Al disminuir el tamaño de partícula o la carga de enzima
(reduciendo asi la velocidad de la etapa química) se elimina el control por la difusión interna.
Se ha elegido un soporte cuyo diámetro de partícula está entre 0,1 y 0,2 mm, pues es el más
pequeño que resulta aceptable dados los requerimientos dc pérdida de carga que se dan en
reactores de lecho fijo. La velocidad de la etapa quimica es proporcional a la concentración
de enzima inmovilizada.
El estudio cinético debe realizar en condiciones en las que los fenómenos de

transferencia de materia no controlen la velocidad global del proceso. Para seleccionar el
intervalo de concentraciones de enzima inmovilizada en cl que hay que llevar a cabo el
estudio cinético se han realizado experimentos de hidrólisis de ONPG (que es más rápida
que la hidrólisis de lactosa) según el protocolo del apartado 2.2.4. Sc ha variado la carga de
enzima entre 0,07 y 5,6 mg de enzima por g de soporte. En la Figura 4.18 y en la Tabla 4.6,
se muestra la conversión frente al producto del tiempo por la concentración teórica de
enzima referida a la fase líquida.
Se observa que las curvas conversión de ONPG frente al producto tC~ coinciden
para los inmovilizados con concentraciones entre 0,07 y 1,40 mg/g, lo cual indica que la
conversión es una función lineal de concentración de enzima inmovilizada, lo que permite
asegurar que controla la etapa química para estas cargas de enzima. Para el estudio cinético
de la hidrólisis de ONPG y de la de lactosa se ha elegido una concentración relativamente
baja de entre las probadas (0,35 mg~/L), para asegurar que la difusión interna no afecte a la
velocidad del proceso. Los inmovilizados que se utilizarán en el estudio de los modelos
cinéticos tendrán un diámetro de partícula entre 0,1 y 0,2 mm y una carga de enzima de 0,35
mg/L.
299
Tabla 4.5.- Experimentos para comprobar la influencia de la difusión externa en la

velocidad global del proceso.T=250C; CONIR; ívo,5 gIL; VR=50 mL.
(r.p.m.) (mm)
EXP y agil. t inc. 3 1 10 20 40 60
PIDE-l 100 Cfl 0,630 1,050 2,100 4,200 8,400 12,600
X 0,033 0,049 0,130 0,290 0,340 0,430
PDE-2 300 CE*t 0,660 1,100 2,200 4,400 8,800 13,200
X 0,061 0,097 0,253 0,414 0,686 0,810
PDE-3 800 Ql 0,630 1,050 2,100 4,200 8,400 12,600
X 0,068 0,113 0,252 0,463 0,663 0,777
PDE-4 1400 CE*t 0,675 1,125 2,250 4,500 9,000 13,500
X 0,082 0,151 0,250 0,390 0,590 0,640
PDE-5 1001 Ql 0,675 1,125 2,250 4,500 9.000 13,500
X 0,016 0,024 0,041 0,074 0,125 0,200
~4otas: Agitación de vaivén en baño termostático. Los demás: agitación con hélice.
2 La concentración de enzima en el líquido (Ci. o C~
1.) se calcula como:
c =c .W~V~ W = peso de sólido [4.3]
Fabla 4.6.- Experimentos para comprobar la 0C; influencia de lag/L;

CONRG ~—0,5 difusión
VR=50interna en la
mL; co=500
velocidad
r.p.m. global del proceso. T=25
EXP Inmovi- CEW C

1-~ T 1 3 6 12 20
lizado (ingElg) (mgEIL) (mm)
1>1)1-1 1LZ24 0,07 0,504 X 0,13 0,21 0.38 0,48
PDI-2 ILZ2S 0,18 0,598 0,12 0,19 0,43 0,52
PD[-3 1LZ26 0,35 0,544 0,14 0,21 0,43 0,51
PDI-4 1L727 0,70 0,543 0,12 0,21 0,34 0,50
PDI-5 1LZ28 1,40 0,739 0,15 0,27 0,52 0,66
PDI-6 1LZ29 2,80 0,829 0,12 0,22 0,43 0,57
PDI-7 ILZ3O 5,60 0,902 0,06 0,13 0,26 0,37
300
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
t CE (mm mg/L)
Figura 4.17.- Efecto de la agitación sobre la conversión con enzima de K.fragilis

inmovilizada.
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
t C~ (mm mgIL)
Figura 4.18.- Efecto de la carga enzimática sobre la conversión con enzima de K.fragilis
inmovilizada.
301
Capitulo 4. Cinética de Las reacciones de hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
4.2.3.- Modelo cinético de la reacción de hidrólisis de lactosa
Conocidas las condiciones en las que la enzima es más activa y estable, al menos
durante un tiempo superior al de experimentación, y en las condiciones a las cuales los
fenómenos de difusión no afectan a la velocidad del proceso, se han realizado varios
experimentos para discriminar el modelo cinético que reproduzca mejor los datos
experimentales obtenidos en la reacción de hidrólisis de lactosa con el inmovilizado de la
enzima de K. fragilis.
4.2.3.1.- Resultados experimentales
El estudio cinético de la hidrólisis de lactosa con la enzima contenida en Lactozym

inmovilizada se ha llevado a cabo en BM a pH 6,5, que es el pH de la leche, y a
temperaturas inferiores a 40<’C, para evitar la desactivación térmica de la enzima
inmovilizada durante el tiempo de experimentación. Se utilizaron para los experimentos
matraces Erlenmeyer termostatizados con agitación de hélice a tina velocidad dc 500
r.p.m. Se hicieron experimentos a temperaturas entre 5 y 40”C, con concentraciones de
lactosa entre 25 y 75 gIL y con concentraciones de galactosa y glucosa entre O y 15 g/L.

La carga de enzima en el sólido (CÑV) fue de 0,35 mg/g en todos los experimentos. La
concentración de enzima en el liquido (Cí;í o CÚ fue de lO mg/L, aproximadamente,
aunque se hizo algún experimento a la mitad de esa concentración. Los resultados de
dicha experimentación se muestran en las Tablas 4.7 a 4.11 y en las Figuras 4.23 a 4.28.
302
Tabla 4.7.- Resultados de la hidrólisis de lactosa a 5t>C con enzima de K.fragilis

inmovilizada.
EX? ILL-1 ILL-2 EXP ILL-3

Cta. (gIL) 50 50 Ci
2. (gIL) 25
Cgai (gIL) 0 15 Cgai (gIL) O
C~i. (gIL) 0 0 C~i. (gIL) O
CE,. (mg/L) 10,50 10,50 CEL (mg/L) 9,45
tiempo (mm) X¡a. tiempo (mill) X1~.
0 0 O 0 0
30 0,03 0,028 15 0,151
60 0,10 0,06 30 0,317
120 0,17 0,07 60 0,444
300 0,42 0,29 120 0,670
420 0,52 0,40 180 0,735
1320 0,91 0,89
Tabla 4.8.- Resultados de la hidrólisis de lactosa a 25<’G con enzima de K.frag¿lis

inmovilizada.
EX? ILL-4 EXP ILL-5 111-6

Ciac (gIL) 50 Ci~,, (gIL) 50 50
Cga¡ (g/L) O Cga¡ (g/L) 0 15
Cgiu (gIL) O C21~, (g/L) O O
QL (mg/L) 9,45 Q, (mg/L) 10,50 10,50
tiempo (mm) X¡a, tiempo (mía)
O O O O O
15 0,086 15 0,11 0,07
30 0,178 30 0,18 0,08
60 0,338 60 0,38 0,20
120 0,593 90 0,54 0,39
180 0,772 120 0,67 0,44
240 0,912 180 0,86 0,76
303
Capítulo 4. Cinética de las reacciones de hidrólisis con las enzimas inmovijizadas
Tabla 4.9.- Resultados de la hidrólisis de lactosa a 400C con enzima de K fragilis

inmovilizada.
£XP ILL-7 ILL-8 EXP ILL—9 ILL-10
C
1~~ (gIL) 50 50 C13. (g/L) 50 50
Cgai (gIL) 0 15 Cgaj (gIL) O O
C~.. (gIL) O O Cgiu (gIL) 0 15
CEL (niglL) 9,45 9,45 Q1 (mg/L) 4,71 9,45
tiempo(ndn) tiempo(min)
O o o o o o
15 0,139 0,11 5 0,046 0,023
30 0,377 0,25 15 0,109 0,139
60 0,665 0,46 30 0,247 0,377
120 0,898 0,75 60 0,365 0,655
180 0,929 0,85 120 0,538 0,898
Tabla 4.10.- Resultados de 0C con enzima de K. fragilis

inmovilizada. la hidrólisis de lactosa a 40
EXP ILL-11 ILL-12 ILL-13 EXP ILL-14

Qic (gIL) 50 50 50 Clac (g/L) 25
Cgai (g/L) 0 15 0 Cga (g/L) O
Cgi. (g/L) 0 0 15 Cgii, (g/L) 0
QL (mg/L) 10,50 10,50 10,50 CFI (mgIL) 10,50
tiempo(min) tic¡npo(min) Xiac
O o o o o o
5 0,15 0,06 0,12 5 0,153
20 0,33 0,28 0,38 15 0,414

30 0,46 0,39 0,49 30 0,795
60 0,71 0,71 0,76 60 0,908

90 0,85 0,77 0,83 -
180 0,97 0,96 0,87 - -
304
Tabla 4.11.- Resultados de la hidrólisis de lactosa a 15 y 300C con enzima de K. fragilis

inmovilizada.
TEMPERATURA 300C TEMPERATURA 15”C

EXP ILL-15 EM> ILL-16
Ciac (g/L) 50 C
1~. (gIL) 50
Cgai (gIL) O Cgai (g/L) O
Cgiu (g/L) O Cgiii (gIL) O
C~1. (mg/L) 9,45 C~i (nigfL) 9,45
tiempo (mm) tiempo (mili)
O O O o
15 0,083 30 0,109
30 0,238 60 0,281
60 0,504 120 0,564
120 0,854 180 0,738
180 0,925 240 0,822
240 0,976 300 0,919
305
4.2.3.2.- Análisis de las velocidades iniciales
Analizando la influencia de las concentraciones de sustrato y productos en la

velocidad inicial de reacción se puede realizar una discriminación cualitativa del tipo de
modelo cinético que debe considerarse.
En la Figura 4.19 se muestra la variación de la velocidad inicial de reacción con la

concentración inicial de lactosa para los experimentos de las Tablas 4.7 a 4.11. Se observa
que, al aumentar la concentración inicial dc sustrato, aumenta la velocidad inicial de
reacción, aunque no linealmente, por lo que la cinética de la reacción debe tener un orden
entre cero y uno, aunque más cercano a cero, con las concentraciones iniciales de lactosa
utilizadas.
En la Figura 4.20 se muestra cómo afecta la concentración inicial de galactosa a la

velocidad inicial de reacción. Se observa que hay una importante inhibición por este
producto, ya que disminuye la velocidad inicial de reacción cuando aumenta la
concentración inicial de galactosa. Las rectas que unen los puntos con diferente
concentración inicial de galactosa a cada temperatura son casi paralelas, por lo que parece
que la inhibición por galactosa no aumenta ni disminuye con cl cambio de temperatura.
Esto supone que la temperatura afecta poco a la constante de inhibición.
La Figura 4.21 muestra el efecto que tiene la concentración inicial de glucosa

sobre la velocidad inicial de reacción, observándose que un aumento de la concentración
inicial de glucosa en el medio no provoca variación apreciable en la velocidad inicial de
reacción, por lo que este producto no actúa como inhibidor.
306
0.40
0.35
0.30
g,a 0 25
E 0.20
?E 015
~, 0.10
0.05
0.00
0.00 0.18
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16
q~ (mol/L)
Figura 4.19.- Hidrólisis de lactosa con enzima de K.Jtagilis: r0 vs Cíaco a varias temperaturas.
Cgai ~=0 g/L; Cgiu 0=0 gIL.
1.2
1 .0
oII
o
c
oo
..~0.5
o
A0
0.4
a
oo
0.2
0.0
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
C~1 (mol/L)
Figura 4.20.- Hidrólisis de lactosa con enzima de K.Jkagilis: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin galactosa inicial vs Cgaí o a varias temperaturas. C1,. 50 gIL; Cgiti ~= O g/L.
307
1.2
u
u Tenyeratura
1.0- u 4~YC
II
u a
E)
oA
(5>0.4-
‘ 0.2-
0.0 ¡ ¡
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12

C~ (rrul/L)
Figura 4.21.- Hidrólisis de lactosa con enzima de Kfragilis: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin glucosa inicial vs Cgiu ~a varias temperaturas.C1~. ~= 50 gIL; ~ = O gIL.
4.2.3.3.- Discriminación del modelo cinético
Para la discriminación del modelo cinético se ha utilizado el metodo integral y el

análisis de los datos con la temperatura como variable, como ya se justificó en el apartado
3.2.2.5.
El análisis de las velocidades iniciales sugiere que el modelo cinético que ajuste
los datos experimentales debe tener en cuenta la inhibición por galactosa. La inhibición
por glucosa podría en principio descartarse. Sobre la inhibición por el sustrato no se
puede establecer una hipótesis definitiva. Los modelos cinéticos que se van a considerar
son los modelos cinéticos propuestos en la Tabla 3.2.
Mediante regresión no lineal acoplada a una integración numérica por Runge-

Kutta, se han ajustado los datos de las Tablas 4.7 a 4.11 a los modelos cinéticos
propuestos. Los parámetros cinéticos de estos modelos, junto con sus intervalos de
308
confianza, el valor de F y el residuo generado por el ajuste a cada modelo se recogen en

las Tablas 4.12 y 4.13. Los parámetros que no pasan los criterios estadísticos y fisicos del
apartado 3.1.3.2 se destacan en sombreado. En la Tabla 4.14 se resume el grado de
cumplimiento de los criterios estadísticos y flsicos por parte de los parámetros de los
distintos modelos cinéticos analizados.
En la Tabla 4.14 se observa que pasan los criterios estadísticos los modelos 1,2,3,
4, 6, 8 y 9. Los criterios fisicos los pasan todos los modelos excepto los modelos 5, 7 y
11, donde la energía de activación de la constante de inhibición tiene un valor
excesivamente alto.
Entre los modelos que pasan los criterios estadísticos y fisicos, el modelo que
genera menor residuo, pasando los criterios estadísticos y fisicos, es el modelo 8
(SQR=0,46). El modelo 9 tiene un residuo próximo (SQR=0,50), pero los intervalos de
confianza de los parámetros del modelo 8 son más estrechos que los del modelo 9. Los
modelos que tienen en cuenta la inhibición por glucosa tienen un residuo similar al del
modelo de Michaelis-Menten simple, aunque tienen un parámetro más, lo que confirma
que la glucosa no inhibe, como se observó en el análisis de las velocidades iniciales. Lo
mismo sucede con el modelo 3, que considera la inhibición por lactosa formando un
complejo ternario.
Por tanto, con los resultados obtenidos se puede seleccionar como modelo cinético
de la hidrólisis de lactosa con g—galactosidasa de K. Jtagilis inmovilizada el modelo 8:
k2 CE. CIaS
(cÁ [4.5 a]
KM ~+jCicic
donde los valores de los parámetros son:
ex48>73±2,96—5298±890~
K~ exP(1684+7 24— 6688± [4.5b]
309
( 830l±2626~
= ex$22,85±8 88— T )
En la Figura 4.22 se muestran los residuos calculados con los datos experimentales
de conversión y con las conversiones obtenidas aplicando el modclo 8. Se puede observar
que las diferencias entre los valores experimentales y calculados suelen ser menores del
10%, aunque hay casos en los que alcanzan hasta el 30%. Estas diferencias no presentan
tendencias con el tiempo de reacción, por lo que el error cometido es aleatorio. Con el
modelo seleccionado (ecuaciones [4.5 a] y [4.5 b]) se han reproducido los resultados
experimentales de las Tablas 4.11 a 4.15. Los valores calculados se muestran con línea
continua en las Figuras 4.23 a 4.28.
Figura 4.22.- Análisis de residuos calculados con los datos experimentales y con los
0.3
0.2
0.
0.0
-0.1
-0.2
-o.
5030 7500 15000
t CE (mm mg(L)
valores de conversión obtenidos de la aplicación del modelo 8.
310
Tabla 4.12.- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de lactosa con enzima de K. fragilis

inmovilizada. (Método integrat regresión no lineal, T como variable)
MODELO Orden 1 Michaelis-Menten M¡chael¡s-Menten

(1) simple (2) con inhibición por
lactosa (3)
Lnk0 10,72+180 17,70+450 1441+572
EJR 5327±552 7953±1260 6978±1540
LnKMO - 19,15+920 1893±090
E2M/R - 6568±2840 6623±2140
Lii K,0 - -
E2 1/R -
SQR 1,19 0,87 0,80

F 1094 1094 707
MODELO Michaelis-Menten Michaelis-Menten

con inhibición con inhibición
competitiva por acompetitiva por
glucosa (4) glucosa (5)
Lnk0 10,70+508 1059+412
E3/R 5913±1440 5892±1196
LnKMO 17,93+160 1828±086
EfiM/R 6325±1589 6243 ±2253
Ln K10 32,01 + 13 62
10474±4054 v~4i:~o? t tQI1 o?
SQR 0,80 0,74
F 693 764

con inhibición no con inhibición
competitiva por mixta por glucosa
glucosa (6) (7)
Lnk6 10,64+513 641+656
E2/R 5962±1264 4647±1902
Lii KMO 19,02+145 ~2,37*~Z66
E2M/R 6435 ±1698 ~p6~Z
J~4>Ó
Ln Ko 40,28 + 11 45 -6 81±!61,24
11256±4198 -~¡l35~48842
LnK’10 - iS6~4 >5O4~
- $2900 t*ot’W
SQR 0,79 0,63
E 699 534
311
Tabla 4.13.- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de lactosa con enzima de K. fragilis

inmovilizada. (Método integral, regresión no lineal, T como variable)

con inhibición con inhibición
competitiva por aconipetitiva por
galactosa (8) galactosa (9)
Lnk0 873+296 ~102+77G
E2/R 5298±890 8910±2140
LnKNIo 1684+724 1980+542
E2M/R 6688±1589 6368±1698
LnK10 2285+888 -¡348+10,80
E21/R 8301 ±2626 -3107 ±2880
SQR 0,46 0,50
F 1177 1112

con inhibición no con inhibición
competitiva por mixta por galactosa
galactosa (10) (II)
Lnk0 1070+254 848+305
E2/R 5913±751 5253±904
Ln KNW 1877±542 72,91 ¿8080
E2M/R 6424±1698 7fl5t~,51O~
Lii K10 -0>$39~t4Q 13,27±81.20
477~fr2146 sl46±s,&lOb
Lii K’10 3171422844
E’ a¡/R 8893Ót 6340
SQR 0,47 0,36
F 1170 921
312
Tabla 4.14.- Discriminación de modelos: Hidrólisis de lactosa con enzima de K.fragilis.
MODELO PARA- CRITERIOS CRITERIOS OBSERVACIONES

METRO ESTADÍSTICOS FISICOS
Orden 1(1) Lnk0 + Pasa 0)
Michaelis-Menten E3/Rk
Ln + >0(+) SQR=1,19(11
0 + Pasa.
simple (2) EaJR + >0 (±) SQR=O,87 (1O~)
LnKM +
E2MIR + >0
Michaelis-Menten La l4~ + Pasa.
con inhibición por EaIR + > o (+) SQR=0,80 (90)
lactosa (3)
>0
> O (valor alto)

Michaelis-Menten Ln k0 + Pasa.
con inhibición E2/R + > O (1-)v SQR>O,80 (~0)
competitiva por Ln KM +
glucosa (4) >0
>0
con inhibición E2IR + > O (±) SQRO,74 (60)
acompetitiva por Ln KM +
glucosa (5)
Michaelis-Menten Ln k0 +
con inhibición no Ea/R + > O (±) SQR=O,79 (70)
competitiva por Lo KM O
glucosa (6)
Michaelis-Menten Ln k<, + No pasa.

con inhibición Ea/R + >0 (±) SQR=0,63 (50)
mixta por glucosa Ln KM O
(7)
Clave: Criterios físicos: <O Parámetro negativo

> O Parámetro positivo
+ pasa
Criterios estadísticos: O incluye el cero en el intervalo de confianza
+ pasa 0 de orden de mejor a peor ajuste, entre paréntesis.
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n
313
Tabla 4.14.(cont4- Discriminación de modelos: Hidrólisis de lactosa con enzima de K.

fragilis.
MODELO PA~ CRITERIOS CRITERIOS OBSERVACIONES

METRO ESTADÍSTICOS
Michaelis-Menten Ln k11
con inhibición Ea/R
competitiva por Ln KM
galactosa (8) IEM/R
LnK1 +
Ea«R + >0
Miebaelis-Menten Ln k0 +
con inhibición Ea/R + >0 QQ SQR=O,50 (4<’)
acompetiliva por Ln KM +
galactosa (9) E3MIR + > O
LnK1 +
E~1IR +
con inhibición no BaIR + > 0 (-4-) SQR=0,4’7 (3’)
galactosa (10) WMIR +
LnK1 O
EaiIR
Michaelis-Menten Ln k0 No pasa.
con inhibición Ea/R >0(Ú) SQR=O,36 (1<’>
mixta por galactosa Ln KM O
(It) EaM/R
Ln K1
E<1IR
E’aj/R 0 >0
Clave: Critcrios físicos: <O Parámetro negativo

+ pasa
Criterios estadisticos: O incluye el cero en cl intervalo de confianza
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n<’ de orden dc mejor a peor ajuste, entre paréntesis.
314
4.2.4.- Modelo cinético de la reacción de hidrólisis de ONPG
Con los experimentos previos se determinaron las condiciones en las que la

enzima es activa y estable durante un tiempo mayor que el de experimentación, y las
condiciones a las cuales la velocidad del proceso es controlada por la velocidad de la
etapa química. En estas condiciones, se han llevado a cabo varios experimentos con el
objeto de discriminar el modelo cinético que ajuste mejor los datos experimentales
obtenidos en la reacción de hidrólisis de ONPC con la enzima de K. fragilis inmovilizada.
4.2.4.1.-Resultados experimentales
Se han realizado varios experimentos en los que se ha variado la temperatura de
reacción entre 5 y 40<’C, la concentración de ONPG entre 0,25 y 1 gIL, la concentración

de ONP entre O y 0,25 gIL y la de galactosa entre O y 15 gIL. Estos experimentos se
realizaron en BP, en Erlenmeyer termostatizados y agitados con hélices a 300 r.p.m. y con
una concentración de enzima inmovilizada en el liquido (GEL) entre 0,5 y 2,0 mg/L. La
concentración de enzima en el sólido (C~w) ha sido de 0,35 mglg en todos los casos.
Los experimentos realizados y los resultados obtenidos, como conversión de
ONPG frente al producto t~CE, se muestran en las Tablas 4.15 a 4.18. Las Figuras 4.33 a
4.43 muestran los datos experimentales de conversión frente a t’Cu.
319
Tabla 4.15.- Resultados de la hidrólisis de ONPG a 50C con enzima de K. fragilís

inmovilizada.
EM> TLO-1 ILO-2 ILO-3 ILO-4 ILO-5 ILO-6 EM’ ILO-7 ILO-8
CONPG 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 1 Cosp(; 0,5 0,5
(gIL)
CONP 0 0,25 0 0,25 0 0 CONP O O

(gIL)
0 0 0 0 0,15 0 C~
(gIL) 1 0 15
(gIL)
0,613 0,640 0,788 0,758 0,875 0,818 CFI, 0,583 0,543

(mg/14) (¡ng/L)
tiempo XONPC tiempo XoNp(;

(nuin) (ruin)
O O O O O 0 0 0 0 0
5 - - - - . - 6 0 0,027
10 0,12 0,14 0,14 0,10 0,15 0,03 16 0,13 0,063
20 0,21 0,24 0,22 0,24 0,23 0,06 25 0,18 0,07

40 0,42 0,48 0,38 0,42 0,44 0,10 60 0,39 0,15
60 0,58 0,62 0,52 - 0,58 0,16 120 0,64 0,26

90 0,72 - 0,68 - 0,7 0,24 - -
320
Tabla 4.16.- Resultados de la hidrólisis de ONPG a l5~C con enzima de K. fragilis

inmovilizada.
EM’ ILO-9 ILO-lo ILO-il ILO-12 1L0-13 1L0-14 ILO-iS

CONPC 0,25 0,5 0,5 0,5 1 1 1
(gIL)
CONP (gIL) 0 0 0 0,25 0 0 0,25
Cgai(g/L) 0 0 15 0 0 15 0
QL (mgIL) 1,500 2,053 1,500 1,983 1,230 1,155 1,155
tiempo XONPG
(mill)
O O O O O O O O
3 0,24 0,18 0,052 0,040 0,072 0,028 0,035
6 0,34 0,22 0,084 0,161 0,113 0,049 0,110
12 0,67 0,47 0,180 0,350 0,203 0,095 0,235
30 0,95 0,78 0,399 0,629 0,375 0,168 0,373
45 0,99 0,97 0,585 0,776 0,600 0,291 0,6004
Tabla 4.17.- Resultados de la hidrólisis de ONPG a 25<’C con enzima de K. fragilis

inmovilizada.
EM’ ILO-16 ILO-17 ILO-18 1LO-19 ILO-20 ILO-21 ILO-22

CONPC 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1
(g/L)
CoNP(gIL) 0 0 0 0,25 0 0 0
Cgai (g/L) 0 0 0,15 0 15 0 0,6
CEI. (mg/L) 0,845 0,613 0,613 0,700 0,758 0,640 0,905
tiempo XON ~
(miii)
O O O O O O O O
5 0,22 0,16 0,09 0,14 0,09 0,11 0,11
10 0,44 0,28 0,34 0,26 0,14 0,16 0,16
20 0,71 0,51 0,51 0,51 0,26 0,40 0,40
40 1,0 0,76 0,78 0,77 0,38 0,68 0,68
60 - 0,84 0,83 0,86 0,42 - -
321
Tabla 4.18.- Resultados de la hidrólisis de ONPG a 40<’C con enzima de K. fragilis

inmovilizada.
EXP ILO-23 ILO-24 ILO-25 ILO-26 ILO-27

CONPU, (gIL) 0,25 0,25 0,5 1
CoNp (gIL) O O O O O
C221 (g/L) 0 0,3 0 0 0,6
QL (mgIL) 0,640 0,788 0,670 0,622 1,168
tiempo XON ~.c
(miii)
o o o o o o
5 0,29 0,29 0,19 0,12 -
10 0,59 0,59 0,29 0,21 0,36
20 0,81 0,81 0,52 0,43 0,48
40 . - 0,79 0,59 0,72
60 . - 0,85 0,74 -
322
4.2.4.2. Análisis de las velocidades iniciales
El análisis de las velocidades iniciales permite establecer las variables que

influyen en el modelo cinético de una determinada reacción y de que manera influyen.
Este análisis es una ayuda en la propuesta dc los modelos cinéticos entre los que se
discrimina. Los valores de las velocidades iniciales para los experimentos de las Tablas
4.15 a 4.18 se calculan según el procedimiento explicado en el apartado 3.2.2.2.
En la Figura 4.29 se puede apreciar corno influye la concentración del sustrato en

la velocidad de inicial de reacción, r0, a distintas temperaturas. Al aumentar la
concentración de ONPG, aumenta la velocidad de reacción, aunque no

proporcionalmente. A temperatura baja la velocidad aumenta muy poco con el
incremento de la concentración inicial de sustrato, lo que corresponde a un orden neto
respecto al sustrato próximo a cero. Al aumentar la temperatura, el aumento de la
velocidad inicial con la temperatura es más pronunciado, hasta hacerse casi lineal, por lo
que el orden neto respecto al sustrato se acerca a uno. Esto implica que la constante de
Michaelis (KM) aumenta al aumentar la temperatura, por lo que la afinidad de la enzima
por el sustrato decrece en ese mismo sentido.
En la Figura 4.30 sc muestra el efecto de la concentración inicial de galactosa

sobre la velocidad inicial de reacción. Se puede observar que hay inhibición sólo cuando
la concentración de galactosa es mucho mayor que la de ONPG, por lo que la enzima
muestra mucha más afinidad por el ONPG. La inhibición disminuye al aumentar la
temperatura, por lo que K~ aumenta en el mismo sentido.
En la Figura 4.31 se puede observar cual es el efecto de la concentración inicial de

QN? sobre la velocidad inicial de reacción. En algunas temperaturas (40 y 5<’C), parece
haber una ligera inhibición por el producto, en otras (25 y 1 5”C), una ligera activación. Si
se observan los resultados de X vs t C~ de las Figuras 4.34 a 4.37, se puede deducir que, a
las concentraciones utilizadas, el ONTP no inhibe o lo hace muy levemente.
Del análisis realizado se podría proponer un modelo cinético tipo Michaelis-

Menten (orden neto respecto al ONPG entre cero y uno) con inhibición por galactosa. La
323
inhibición por ONP no parece ser importante aunque no se puede descartar

definitivamente.
0.55
0.50
0.45
0.4C
0.35
c 0.30
-5- 0.25
£
L.-
o
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.0 SOxiO.4 1.0x103 1.5x10~3 2.0x10 3 2.5x10 3 3.0x103 3.SxlO>
C
0~pQ (nuI/L)
Figura 4.29.- Hidrólisis de ONPG con enzima de K.j=agi/i.s:re vs CONR(; a varias temperaturas.
324
1.2
o
A
1
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08
C~ (rrullL)
Figura 4.30.- Hidrólisis de ONPG con enzima de K. fragilis: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin galactosa inicial vs C5~¡ o a varias temperaturas. CONF6 0 0,5 gIL; CONP o O gIL.
1.2
1 o.a
,o 0.6
0.4
o
a
0.2
0.0 4 1.OxlOt 1.5x103 2.OxlO 2.5x10~

0.0 5.OxlO
~ (mol/L)
Figura 4.31.- Hidrólisis de ONPG con enzima de K.Jkagilis: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin ONP inicial vs CONF O a varias temperaturas. CONP(}&~ 0,5 gIL; Cgaío= O gIL.
325
Para discriminar el modelo cinético se han analizado los datos de las Tablas 4.15 a
4.18 por el método integral. El ajuste de los datos experimentales se ha llevado a cabo por
regresión no lineal a la que se ha acoplado una integración numérica por Runge-Kutta.
Los modelos cinéticos entre los que se discrimina son los modelos de la Tabla 3.2, que
consideran que no existe inhibición o que ésta se debe sólo al sustrato o a un producto.
Mediante el ajuste de los datos experimentales a cada uno dc los modelos cinéticos
propuestos se han calculado los correspondientes parámetros cinéticos, que se recogen,
junto con sus intervalos de confianza, el valor de F y el residuo obtenido para cada
modelo en las Tablas 4.19 y 4.20. Los parámetros que no pasan los criterios estadísticos y
fisicos del punto 3.1.3.2. están sombreados. En la Tabla 4.21 sc puede apreciar cl grado
de cumplimiento de estos criterios por los parámetros calculados en todos los modelos
cinéticos considerados.
De los resultados de las Tablas 4.19 y 4.20 se deduce que sólo pasan los criterios
estadísticos los modelos 1 y 8; mientras que los criterios fisicos los pasan todos los
modelos. De los modelos que cumplen los criterios estadísticos y fisicos, el quc menos
residuo genera es el modelo 8 (1,26 frente 3,56 del modelo 1). Este modelo considera la
inhibición competitiva por galactosa y no la inhibición por ONP, por lo que está de
acuerdo con las conclusiones a las que se llegó en el análisis dc las velocidades iniciales.
4.2.4.4.- Discusión
Los parámetros obtenidos para los modelos con inhibición por o-nitrofenol
muestran intervalos de confianza que incluyen el cero, tanto en la constante de Michaelis
como en la constante de inhibición. Por tanto, parece que la inhibición es sólo debida a
galactosa. Además, los parámetros calculados en el modelo 8 cumplen las tendencias de
KM y K~ con la temperatura observadas en el análisis de las velocidades iniciales. Por
tanto, el modelo seleccionado para la reacción de hidrólisis de ONPG por enzima de K.
fragilis inmovilizada viene dado por:
326
k2 CE~
j
CONP& [4.6 a]
KM (ji + ~j~ai+ CON/’G
donde los valores de los parámetros son:
k2zzexpI¿l416+446~2952 ±1270
( 6229+ 2242
K~ =exPyl42O+7 16— 1) [4.6b1
K,5<’1 =exPÉl6~50±9~72—5930±2946
La Figura 4.32 muestra los residuos que se obtienen de los datos experimentales y
de los valores de conversión calculados con el modelo 8. Se puede apreciar en dicha
Figura que las diferencias entre las conversiones experimentales y las calculadas no es
superior en la mayor parte de los casos al 10% del valor experimental, aunque el modelo
tiende a subestimar ligeramente (menos de un 5%) la conversión obtenida. En las Figuras
4.33 a 4.43, donde se representa la conversión de ONPG frente al producto t•CE, se
muestra en línea continua la reproducción de los datos experimentales con el modelo
cinético seleccionado de las ecuaciones [4.6
al y [4.6
b].
327
0.3
0.2
0,1
0.0
-0.1
~02
-0.3 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

-2000
~
0E (mm mg/L)
328
Tabla 4.19- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de ONPG con enzima de K. fragilis

inmovilizada. (Método integral, regresion no lineal, 1’ como variable)
MODELO Orden 1 Michaelis- Michaelis-Menten con

(1) Menten simple inhibición por ONPG
(2) (3)
Lnko 13,28+485 848+8,06 15,36+1056
E~/R 6226 ±2986 5206±2250 7254±3036
Ln KMO - ~ 9 41J~f4~,4
FaMIR - 1 O ~
LnK¡o - Mi$ ~
Eai/R 4~$9L~44ú 4~
SQR 3,56 2,57 2,33
F 645 534 389
MODELO Michaelis-Menten Michaelis-Menten con

con inhibición com- unhibicién acompetitiva
petitiva por ONP (4) por ONP (5)
Lnk0 842+9,40 877±1058
Ea/R 5171±2740 5236±2584
2;89 Á44~
£aM/R ,, ,
Ln K¡0 ~j, ~4IW&3429
Eai/R <.~ ,,4j 9 25561
SQR 2,56
F 367 319
MODELO Michaelis-Menten con Michaelis-Menten con

inhibición no com- inhibición mixta por
petitiva por ONP (6) ONP (7)
Lnke 845±10,01 848±1056
Ea/R 5293 ±4524 5426±4289
Ln KMO
EaM/R
LnK¡0 :~, a~,r4M~ ~69~±1O1 ~
LatiR 419 7*2 4~
Ln K’10 - -3«$9~ t3~~
E’ai/R
SQR 2,45 2,31
E 351 252
329
Tabla 4.20- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de ONPG con enzima de K. fragilis

inmovilizada. (Método integral, regresi¿n no lineal, Teomo variable)

inhibición competitiva inhibición acompetitiva
por galactosa (8) por galactosa (9)
Lnk0 14,16±4,46 1498+5,40
EJR 6952±1270 7180±1533
Ln ‘(MO 14,20±7,16 13,83 1 7,90
6229 ±2242 6055 ±2302
Lii ‘(yo 16,50 + 9 72 -234 ±t);40
Eai/R 5930±2946 403±3018
SQR 1,26 1,42
F 729 648

inhibición no competitiva inhibición mixta por
por galactosa (10) galactosa (¡1)
Lnk0 14,00+500 14,12+462
EaIR 6884±1406 6686±1316
LnKMO 12,13+750 12,39+764
EaM/R 5560±2198 5704±2256
Ln Kío 1549±12,24
E~1IR 2935 ±2533 5651 ±3676
Lii K’10 41,18±607
4967±V70&
SQR 1,33 1,27
E 693 536
330
Tabla 4.21.- Discriminación de modelos: Hidrólisis de ONPG con enzima de K.fragilis.
MODELO CRITERIOS CRITERIOS OBSERVACIONES

METRO ESTADÍSTICOS FíSICOS
Orden 1 (1) Ln k0 + Pasa
E,/R + >0 (±) SQR=3,56 (11<’)
Michaelis-Menten Ln k0 + No pasa.
simple (2) EJIR + >0 (+) SQR2,57 (10<’)
LnKM O
EaM/R 0 >0
con inhibición por E~/R + > O (±) SQR=2,33 (6<’)
lactosa (3) Ln KM O
EaM/R 0 >0
LnK1 O
0 <0
con inhibición Ea/R + >0 (+)v SQR”2,41 (7<’)
competitiva por Ln KM O
ONP (4) EaM/R O >O
LnK1 O
0 <0
con inhibición E,/R + >0 (+) SQR=2,56 (90)
acompetitiva por Ln KM O
ONP (5) EaM¡R O > O
LnK1 O
Eaj/R 0 <0
Michaelis-Menten Ln lc~ + No pasa.
con inhibición no Ea/R + > O (+) SQR~2,45 (8<’)
ONP (6) EaM/R O >O
LnK1 O
0 <0
con inhibición E]R + >0 (±) SQR=2,31 (5<’)
mixta por ONP (7) Ln KM o
EaM/R 0 >0
LnK1 O
0 <0
LnK’~ O
E’ai/R 0 <0
Clave: Criterios físicos: <O Parámetro negativo

+ pasa
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el u<’ de orden de mejor a peor ajuste, entre paréntesis.
331
Tabla 4.21.(cont.).- Discriminación de modelos: Hidrólisis de ONPG con enzima de

K.fragilís.

Michaelis-Menten La k0 + Pasa.
con inhibición Ea/R + >0 (+) SQR= 1,26 (1~)
galactosa (8) EUM/R + > 0
Ln K1 +
EM/R + >0
Michaelis-Menten Ln k<1 + No pasa.
con inhibición Ea/R + > 0 (1) SQR 1,42 (4<’)
galactosa (9) EJM/R + > O
Ln K1 O
Eai/R 0 >0
con inhibición no Ea/R + >0 (~> SQR=l,33 (3<’)
galactosa (10) E~M/R + >0
LnK1 O
E,1/R + >0
con inhibición E,/R + >0 (+) SQRl,27 (2<’)
mixta por galactosa Ln KM +
(11) E<’M/R + >0
LnK¡ +
+ > O
LnK’1 O
1’, ~fl fl
U
Clave: Criterios fisicos: <O Parámetro negativo

O Parámetro positivo
>
+ pasa
+ pasa
Observaciones: al valor dc SQR le sigue el n<’ de orden de mejor a peor ajuste, entre paréntesis.
332
4.2.5.- Comparación de la enzima de K. fragilis en disolución e inmovilizada
Para comparar el comportamiento de la enzima de K. fragilis en disolución y de la

enzima de K. fragilis inmovilizada, se va a analizar primero como varía la actividad y la
estabilidad de las enzimas con algunas propiedades del medio de reacción: composición
iónica, pH y temperatura; En segundo lugar, se van a comparar los modelos cinéticos
obtenidos con la enzima libre e inmovilizada en las reacciones de hidrólisis de lactosa y
de ONPG.
4.2.5.1.- Actividad y estabilidad de la enzima libre e inmovilizada
Los tampones utilizados con la enzima libre e inmovilizada fueron los elegidos
para la enzima libre: tampón BP para los experimentos de hidrólisis de ONPG y tampón
BM para los experimentos de hidrólisis de lactosa.
El efecto de los iones metálicos añadidos al tampón BP sobre la actividad de la

enzima libre e inmovilizada se puede observar en las Figuras 3.5 y 4.13. Hay cationes,
como el Cu2~ o el Ni2~, que son levemente activadores en la enzima libre y que inhiben
fuertemente la acción enzimática en la enzima inmovilizada. El manganeso es un
activador en la enzima libre y un inhibidor de la enzima inmovilizada. La inmovilización
cambia el comportamiento electrostático de la superficie de la enzima, de tal forma que la
relación con la mayoría de los iones probados cambia considerablemente, siendo la
enzima desestabilizada por muchos iones cuando está inmovilizada.
Cuando se hidroliza lactosa en tampón BM, el pH óptimo para la enzima libre es

de 6,5 (Figura 3.6) y para la inmovilizada de 7,1 (Figura 4.11). La enzima libre tiene un
pH óptimo en BP y con ONPG como sustrato de 6,7 (Figura 3.7) frente a 7,0 de la enzima
inmovilizada en las mismas condiciones (Figura 4.12). Por tanto, la enzima inmovilizada
podría presentar un pH óptimo algo mayor al de la enzima en disolución, lo que se
manifiesta algo más claro con la lactosa. En cualquier caso, parece que la inmovilización
cambia poco el valor del pH óptimo de la enzima de K. fragilis, lo que significa que la
superficie del soporte está poco cargada o que la enzima es capaz de contrarrestar la carga
339
superficial y evita que afecte a los centros activos y, por tanto, a la actividad de los
mismos.
La estabilidad de la enzima en disolución y de la enzima inmovilizada con el pH

también varía. Si se comparan las Figuras 3.8 y 4.14, la enzima inmovilizada tiene menos
estabilidad que la libre a pH básico y más estabilidad a pH ácido. A pH alcalino es
posible que haya grupos amino de algunos residuos s-lisina con un pK. lo suficientemente
bajo (en tomo a 7,5-9,0) para reaccionar con grupos aldeliido no reducidos que haya en la
superficie del soporte. Este fenómeno provoca tina distorsión estructural de la enzima que
conlíeva una pérdida de actividad mayor, que es lo que sucede cuando se inmoviliza la
enzima a pH alcalino. Cuando cl pH es ácido, la enzima queda muy estabilizada por la
inmovilización, de tal forma que, a pH 5, la vida media de la enzima (el tiempo de
incubación a dicho pH que es necesario para que la enzima pierda el 50% de su actividad)
pasa de 1,5 h a 24 lv Esta estabilización se produce incluso a pesar deque el entorno de la
enzima es un micro-entorno ácido, por los átomos de Al incluidos en la cstruetura de la
sílice-alúmina, que actúan como ácidos de Lewis. Es decir, cuando el pH del medio en el
que se incuba la enzima inmovilizada es 5, en realidad el pH al que está sometida la
enzima es algo menor.
Respecto a la estabilidad de la enzima con la temperatura, la inmovilización

apenas mejora esta característica. Utilizando como medio de incubación tampón BP y una
temperatura de incubación de 45<’C, la vida media de la enzima libre es de 70-100 minutos
(Figura 3.9), frente a 60-105 minutos de la enzima inmovilizada (Figura 4.15). Este hecho
es lógico si se considera que la enzima está unida al soporte por uno o dos enlaces, los
que se pueden formar entre los grupos aldehido del soporte y los grupos amino terminales
de las cadenas polipeptídicas. La enzima inmovilizada no ha ganado suficiente rigidez
estructural que la pueda estabilizar frente a la temperatura.
340
4.2.5.2.- Comparación del modelo cinético de la hidrólisis de lactosa
El modelo cinético seleccionado para las reacciones de hidrólisis de lactosa

utilizando la enzima en disolución y la enzima inmovilizada es el mismo: el que
corresponde a un mecanismo de Michaelis-Menten con inhibición competitiva por
galactosa. Las ecuaciones [3.79]
y [4.5]
son las ecuaciones de los modelos cinéticos para
la enzima libre y para la enzima inmovilizada, respectivamente. En ellas se encuentran
expresados los parámetros en función de la temperatura.
Comparando los valores de los parámetros de los modelos cinéticos obtenidos con
la enzima libre y la inmovilizada, la constante cinética k2 tiene una energía de activación
similar, pero el término preexponencial de esta constante considerablemente menor en el

caso de la enzima inmovilizada. De aquí se deduce que la inmovilización ha supuesto una
pérdida de actividad aunque la variación de la constante cinética con la temperatura es la
misma. Como la enzima parece que tiene dos centros activos, pudiera ser que uno de ellos
haya quedado bloqueado por estar próximo a la superficie del soporte.
La constante de Michaelis sufre con la inmovilización un cambio notable, tanto en

el término preexponencial como en la energía de activación, puesto que ambos
disminuyen respecto a los obtenidos en el caso de la enzima en disolución. El cambio en
el término preexponencial implica un aumento de la afinidad de la enzima por el sustrato.
El cambio en la energía de activación, que dicha afinidad está menos influenciada por la
temperatura en la enzima inmovilizada, quizás porque haya nuevos aminoácidos
implicados en la unión sustrato-enzima y la interacción de éstos con el sustrato se vea
menos afectada por la temperatura.
La constante de inhibición es el parámetro que menos modificaciones sufre con la

inmovilización, bajando levemente la energía de activación y el término preexponencial.
Se podría suponer entonces que la inmovilización apenas afecta a la unión de la galactosa
con la enzima. Considerando este hecho y que la inmovilización afecta de forma
importante a la unión de la lactosa con la enzima, se puede deducir que la mayor afinidad
de la enzima inmovilizada por la lactosa es debida a interacciones de la enzima con la
glucosa de la lactosa.
341
En la Tabla 4.22 se comparan los valores de los parámetros de los modelos

cinéticos obtenidos con la enzima en disolución e inmovilizada a 40, 25 y 5<’C; también se
han calculado el cociente de k2/KM para esas tres temperaturas. Esta relación es la
constante de “pseudoprimer orden” o la constante de velocidad aplicable en condiciones

en las que la enzima no está saturada de sustrato, válida cuando la concentración de
lactosa es mucho menor que el valor de KM. En estas condiciones, la velocidad de
reacción depende de la afinidad de la enzima por el sustrato. Como se puede observar, la
relación k2/KM es mayor a menor temperatura en los dos casos. La enzima libre tiene
mayor especificidad por el sustrato que la enzima inmovilizada a bajas temperaturas,
disminuyendo rápidamente dicha especificidad con cl aumento de la temperatura. Para la
enzima inmovilizada, la disminución de k2/KM con el aumento de la temperatura es más
suave, ya que su constante de Michaelis varia menos con la temperatura que la obtenida
en el caso de la enzima libre. A 40<’C no se observa diferencia entre la enzima libre y la
inmovilizada en esta relación; comparando los valores de la constante de inhibición, la
galactosa inhibe menos en el caso de la enzima inmovilizada, ya que su es más alta,
especialmente a temperaturas bajas.
Respecto a las velocidades de reaccion por unidad de concentración de enzima

obtenidas a una concentración de lactosa de SO gIL y a concentraciones iniciales de
productos de O g/L, el orden de magnitud es similar para las enzimas libre e inmovilizada.
Con estas velocidades, se obtiene la actividad conservada en la enzima inmovilizada
respecto a la actividad de la enzima libre. Como se puede observar en la Tabla 4.22, la
actividad conservada varía entre cl 50 y el 60% de la actividad de la enzima libre a
medida que la temperatura desciende de 40 a 5”C. Una cierta rigidez estructural, debida a
la inmovilización, puede suponer que la actividad catalítica de la enzima inmovilizada no
aumente tanto con la temperatura como la de la enzima libre.
342
Tabla 4.22.- Comparación de parámetros de la hidrólisis de lactosa con Lactozym en

disolución e inmovilizada.
T(<’C) k2 KM K1 KM k2/ KM kj KM
(libre) (libre) (libre) (mmv.) (mmv.) (mmv.) (libre) (mmv.)
1~ TiTW~~~ lYTW~
40 S?WTW~~~ 2IT~ TTW’ TTW ¶W~TW~~ 11W
25 2,3 lo-4 4,7 ío-3 3,7 ío-3 1,2 ío4 3,8 ío-3 6,8 ío3 4,9 l0~ 3,1 i0~
5 5,5 lo-5 4,1 lo-4 4,2 ío4 3,3 í0~ 7,6 íOA 9,2 lo-4 1,4 ío 4,4 io~
k
2 [mol/(mg mm)]; KM [MI; Kj [M]
TQC) roL/CFi, rOW/CEW Actividad conservada

(C~0 M) (Cv’0 M) ((roW/CEW)/(roí,/CF[j 100)
40 TWTW 1WTW~ 52,3

25 2,2 lOA 1,2 10A 52,5
5 ~ ío-5 59,9
s s,s íw
rOL/QL y ro~/CEW [mol/(mg mm)] calculadas con Cia. 0=50 g¡L
4.2.5.3.- Comparación del modelo cinético de hidrólisis de ONPG
En el caso de la reacción de hidrólisis de ONPG, los modelos cinéticos

seleccionados para la enzima libre (ecuación [3.80]) y para la inmovilizada (ecuación
[4.6]) son diferentes. En el caso de la enzima libre se obtuvo inhibición acompetitiva por
o-nitrofenol, lo que no se observa para la enzima inmovilizada. Con la enzima libre, el
ONP se une al complejo enzima-sustrato, es decir, se une a un centro alostérico de la
enzima. Este centro puede ser bloqueado en el proceso de inmovilización por quedar
próximo a la superficie del soporte. Entonces, el producto ya no se une al complejo ES de
la enzima inmovilizada, por lo que no inhibe. Se observa en los dos casos una leve
inhibición competitiva por galactosa. Este producto se une al centro activo de la enzima
de forma más débil que el ONPG.
En la Tabla 4.23 se muestran los valores de los parámetros de los modelos

aplicables a la hidrólisis de ONPG con la enzima libre y con la enzima inmovilizada, así
como la relación k
2/KM, las velocidades de reacción por unidad de concentración de
343
enzima y la actividad conservada en la enzima inmovilizada respecto a la de la enzima

libre.
Comparando la constante catalítica k2 de los modelos cinéticos correspondientes a
la enzima en disolución y a la inmovilizada, el parámetro de la enzima en disolución tiene

una energía de activación y un término previo que casi doblan los del parámetro de la
enzima inmovilizada. Por tanto, hay desactivación debida a la inmovilización. Esta
desactivación, como se aprecia en la Tabla 4.23, es más notable cuando se trabaja a
temperatura alta. A 40<’C, la capacidad catalítica enzima libre es 11,3 veces mayor que la
de la enzima inmovilizada. A 5<’C, la capacidad catalítica de la enzima libre es un 55%
mayor que la de la enzima inmovilizada. Hay que considerar que esta capacidad catalítica
corresponde a la velocidad de la transformación del sustrato, una vez este está unido al
centro activo.
La constante de Michaelis de la enzima libre tiene la misma relación con la misma

constante de la enzima inmovilizada que en el caso de k2, aunque la diferencia entre
energías de activación es menor. De nuevo, la afinidad de la enzima inmovilizada por el
sustrato varía menos que la de la enzima libre. La enzima inmovilizada tiene mayor
rigidez que la enzima libre.
La energia de activación de la constante de inhibición de la galactosa en el caso de

la enzima inmovilizada es mayor que en el caso de la enzima libre. Además, el término
preexponencial también es mayor, lo que lleva a un valor de K1 mayor para la enzima
inmovilizada. La galactosa inhibe menos la reacción de hidrólisis de ONPC con la enzima
inmovilizada.
En la Tabla 4.23 se comparan los valores numéricos de los parámetros de la

enzima libre y la inmovilizada para esta reacción a 40, 25 y 5<’C. La relación k2/ KM o
constante de “pseudoprimer orden” es parecida en los dos casos, pero varía más
rápidamente con la temperatura en el caso dc la enzima en disolución. A temperatura
baja, la especificidad de la enzima inmovilizada es mayor que la de la enzima libre.
344
La inhibición por galactosa es similar en los dos casos también, pero K1 varia más
rápidamente con la temperatura en el caso de la enzima inmovilizada, de tal forma, que a

40<’C la reacción catalizada por la enzima inmovilizada es menos inhibida que la de la
enzima libre.
También se puede observar que la inhibición por ONP con la enzima libre es de 10
a 1000 veces mayor que la inhibición por galactosa, según se pasa de ST a 40<’C. Una
posible hipótesis para explicar esta situación es que la unión del sustrato a la enzima
depende del grupo o-nitrofenol del ONPG, ya que se observa inhibición con
concentraciones de ONP similares a las de ONPG. Sin embargo, esta hipótesis implicaría
que el o-nitrofenol debería ser un inhibidor competitivo, uniéndose al centro activo y no a
un centro alostérico, que es lo que sucede. Además, comparando la constante de
inhibición de este producto y la constante de Michaelis, se observa que la enzima tiene
una afinidad por el o-nitrofenol de 10 a 100 veces mayor que la que tiene por el ONPG. Si
la inhibición fuese competitiva, el ONPG se vería totalmente desplazado del centro activo
y la reacción apenas tendría lugar. Sin embargo, la constante de inhibición de la galactosa
es considerablemente menor que la constante de Michaelis, de lo que se deduce que la
interacción de los aminoácidos del centro activo con el sustrato implica no sólo al residuo
galactosa del ONPG, sino que debe implicar también al enlace y, quizás, al ONP.
Por otro lado, el orden de magnitud de las velocidades de reacción es similar con
la enzima libre y la inmovilizada. La actividad conservada respecto a la enzima libre
depende mucho de la temperatura, siendo mucho mayor a temperaturas bajas. El aumento
dc temperatura provoca un aumento mucho mayor de la actividad de la enzima en
disolución que el que provoca en la enzima inmovilizada, lo que se podría explicar
considerando la mayor rigidez de la enzima inmovilizada. Es curioso que en el caso de la
lactosa apenas hay variación en la actividad conservada cuando se aumenta la
temperatura. Este hecho se explica observando que la capacidad catalítica de la enzima en
0C, k
disolución respecto al ONPG aumenta mucho con la temperatura (de 5 a 40 2 se
multiplica por 100), mientras que no es asi cuando la enzima hidroliza lactosa, en cuyo
caso la constante catalítica k2 se multiplica por 10 cuando la temperatura pasa de 5 a
40<’C.
345
Tabla 4.23.- Comparación de parámetros de la hidrólisis de ONPC con Lactozym en

disolución e inmovilizada.
T(”C) k2 KM K1 gal K1 QN!> KM K1 gal k2/ KM k2/ KM

(libre) (libre) (libre) (libre) (mmv.) (mmv.) (mmv.) (libre) (mmv.)
1,4 1W 5,6 10’ 7,8 1W 3,2 1W 3,4 1W 8,8 10’ 2,7 10’ 9,4 1W
40 3,7 lO’
4 2,9 lo-3 3,0 1W2 3,0 lOA 1,1 ío~4 1,2 ío’~ 3,4 10< 1,9 l0~’ 9,2 10<
25 5,5 ío
3,1 ío5 2,8 iO~ 1,1 102 2,2 í03 2,0 10~ 2,8 lo-4 8,1 10< 1,1 10< 7,0 10<
5
k
2 [mol/(mg mm)]; KM [M]; K1 [M]
T(<’C) roí./CEL ro~/CFW Actividad conservada

(C~=0 M) (C~~0 M) ((ro~V/CEW)/(roí/CpL). 100)
TIb~ 25,6
40 TiW~
4 6,4 íO< 32,0
25 2,0 lo’
2,6 ío’~ 1,7 1W5 65,4
5
roL/CFI y ro~v/Císw [mol¡(mg mm)] calculadas con CQNPC o—0,5 g/L
346
4.3.- MODELOS CINÉTICOS DE LAS REACCIONES DE HIDRÓLISIS CON j3-

GALACTOSIDASA DE Eseherichia coli INMOVILIZADA
Conocido el comportamiento cinético de la enzima de K. fragilis, se inmovilizó

por el mismo método la enzima de E. cotí, en las condiciones fijadas en el apartado 4.2.1.
Con estas condiciones del método de inmovilización, la enzima de E. coli queda fijada
por los grupos amino terminal de las cadenas polipeptidicas. Aún considerando que la
enzima es tetramérica, la enzima queda unida al soporte por tino o por dos enlaces, por Jo
que se puede considerar que se obtiene un derivado unipuntual y la distorsión de la
estructura tridimensional de la enzima debida a la inmovilización es mínima.
En el apanado 4.2.2, se escogieron las condiciones de agitación y de carga de

enzima en el inmovilizado que, en el caso de Lactozym, aseguraban una difusión de
reactivos y de productos suficientemente rápida tanto en la capa externa como en los
poros, siendo la etapa quimica la reacción más rápida de las estudiadas, en este caso la
hidrólisis de ONPG. Se aseguraba así que la etapa controlante de la velocidad del proceso
fuese la etapa química. Las mismas condiciones se han utilizado con esta otra enzima, lo
que está justificado si se tiene en cuenta que la hidrólisis de ONT’C con la enzima de E.
cotí en disolución transcurre a velocidades similares a la reacción catalizada por la enzima
de K. fragilis. La reacción de hidrólisis de lactosa con la enzima de E. coli es aún más
lenta que la misma reacción catalizada con la enzima de K.fragilis.
Estos experimentos se llevaron a cabo para conocer la actividad y la estabilidad de

la enzima a distintos valores del pH y de temperaturas altas. Asimismo, al igual que en el
apanado anterior, se estudió como afectaban ciertos cationes a la actividad de la enzima.
347
Influencia del pH y de algunos iones en la actividad de la enzima
Se llevaron a cabo experimentos estándar de hidrólisis de ONPG y de lactosa a pH

entre 5 y 9, con una concentración de enzima de 0,7 y 7 mg/L, respectivamente. En la
Figura 4.44 se muestra la variación de la velocidad inicial de la reacción frente al pH del
medio de reacción con ONPG como sustrato y tampón BP como medio de reacción. En la
Figura 4.45 se muestra lo mismo con lactosa como sustrato y BM como tampón.
La actividad frente a ONPG es máxima a un valor de pH de 8, algo alcalino, pero

la actividad frente a lactosa presenta un máximo a pH 6. La razón de esta diferencia se
puede deber al tampón, pero también al sustrato y a su relación con el sólido y con la
enzima. En consecuencia, se utilizará un pH de 7 para la experimentación sobre la
hidrólisis de ONIPG, que es el que tiene el tampón BP. Para la reacción con lactosa se
selecciona el pH de 6,5, pues es el pH de la leche.
Se realizaron experimentos estándar de hidrólisis de ONPG para observar cual era el

efecto de ciertos cationes metálicos sobre la actividad de la enzima inmovilizada. Cada
catión se añadió al medio de reacción para alcanzar una concentración final dc 0,1 mM. Los
resultados se presentan en la Figura 4.46. Se puede observar que los cationes añadidos al BP
apenas afectan a la actividad enzimática; lo más destacable es que el ión cobalto hace que la
actividad disminuya en un 20%.
Influencia del pH en la estabilidad de la enzima
Se estudió también, como con las enzimas cn disolución, el efecto desestabilizador

del pH. Para ello se sigue un procedimiento muy similar al usado con la enzima libre,
excepto que de cada inmovilizado se toman vanas muestras por cada pH estudiado, entre 5 y
9. Después se toma una muestra a cada tiempo de incubación y sc mide la actividad
remanente utilizando el experimento estándar de hidrólisis de ONPG en BP. Los resultados
se aprecian en la Figura 4.47. Se puede observar que la enzima de E. coli tiene una menor
estabilidad que la enzima contenida en Lactozym, sobre todo a pH alcalino. A valores altos
348
de pH se puede esperar que haya reacciones con grupos aldehido de la superficie del soporte
que no hayan reaccionado durante la inmovilización y que se hayan reducido.
Influencia de la temperatura en la estabilidad de la enzima
Se han realizado experimentos siguiendo el procedimiento comentado

anteriormente, para la hidrólisis de ONPG. Se ha trabajado a tres temperaturas: 40, 45 y
550C, y se han realizado medidas de actividad a diferentes tiempos para seguir el
comportamiento de la enzima, utilizándose tampón BP para esta experimentación. En el
caso de la enzima de E. cali, se observa que es muy estable a 400C, mientras que a 450C y
a 550C se observa una desestabilización creciente, con un periodo de mantenimiento de la
actividad que sugiere que la enzima nativa se conviene en otra relativamente estable de
menor actividad, la cual luego se desactiva según continúa la incubación. La Figura 4.48
muestra las desactivaciones térmicas de los inmovilizados de E. coli.
349
0.12 -
0.10 -u-
u-
a 0.08- u
u-
~0.06-
E orn-
L..
o
u
0.02-
0.00
4 5 6 7 8 9 10
pH
Figura 4.44.- Influencia del pH sobre la actividad enzimática (en E? y con ONPG).
Tr25ÓC; CoNpooÉ=0,5 g/L; C~1,=0,7 mg/L.
0.10
0.08 -
u.
a 0.06-
u.. . u- -
~0.04-
E u
1-
o
0.02
0.00
4 5 6 7 8 9 10
pH
Figura 4.45.- Influencia del pH sobre la actividad enzimática (en BM y con lactosa).
0C; Ciaco5O gIL; CpíA mg/L.
T=40
350
100
80
a,
1...
60
-D
r
40
-U
20
o Blanco Fe Co Ni Cu Al Zn Cr Mn
lón presente en el medio
Figura 4.46.- Influencia de algunos cationes divalentes sobre la actividad enzimática (en
100- u u u u u
e-.’.
e
80- e.
sc
a, ;I’’ •,Y. , tiempo (h
E 80-
y . . .. u.. O
40 - e ,•,
3,0
ci: ~y~- 7,0
20 -
24,0
o ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ — —
4 5 6 7 8 9 10 12
pH
BP).
Figura 4.47.- Estabilidad al PH de la enzima de E. coli inmovilizada (en BP).
Medida de actividad estándar: T=250C; CONPG o#t5 g/L; CFIxO,7 mg/L.
351
)
100 J I u-... u...

-.5...
o 80 - ‘e-.
e
e)
a
a)
a 80
e
~0
cl, 40 -
‘0 A
A
Termeratura
U 40~C
20 - 0C
-.á e 45
Á~ 55~C
o ¡ ,.......—¡ • ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
400
0 50 100 150 200 250 300 350
t (mm)
Figura 4.48.- Estabilidad térmica en HP de la e-gal de E. ccli inmovilizada. Medida de

~ 4 .1 m,,1 Con. fl
*Z.~ .1.,— u — - fl fl ir
aytiviuau eStaundE i—i~ U; UONPGO~O,J g/L ULL—U,/ mg/U.
352
4.3.2.- Modelo cinético de la hidrólisis de lactosa
Determinadas las condiciones de reacción en las que la enzima es activa y estable

durante un tiempo lo suficientemente largo, se llevó a cabo la experimentación para
determinar el modelo cinético de la hidrólisis de lactosa con ~-galactosidasa de E. cotí
inmovilizada.
4.3.2.1 -- Resultados experimentales
La cinética de la reacción de hidrólisis de lactosa con ¡3-galactosidasa de E. coli se

estudió realizando experimentos en BM en los que se cambió la temperatura entre 5 y
400C, la concentración de lactosa entre 25 y 75 g/L y las concentraciones de galactosa y
glucosa entre O y 15 g/L. La concentración de enzima varió entre 12 y 18 mg/L,
aproximadamente.
En las Tablas 4.24 a 4.26 se muestran los resultados de dichos experimentos y en

las Figuras 4.53 a 4.59, la representación gráfica de la X con el t-C~ para los mismos.
353
Tabla 4.24.- Resultados de la hidrólisis de lactosa a 50C con enzima de E. cotí

inmovilizada.
EX? LEL 1
IEL2 LEL3 IEL4 LELS 1 ¡ELÚ IEL71
C
1~ (gIL) 25 25 25 —, 50 f 50 50 100
C~1(g/L) 0 15 0 0 15 0 0
Q~(g/L) 0 0 15 0 0 15 0
CEI(mg/L) 18,16 15,64 16,19 16,48 16,21 14,27 16,33
½
tiempo (mm)
O O O (1 0 0 0
720 . 0,27 0,30 - 0,15 0,13 0,11 0,05
1440 0,50 0,46 0,30 0,17 0,23 1022 0,07
2160 0,57 0,56 042 1 0,30 ¡ 0,26 ¡ 0,26 0,15
2880 0,68 0,83 ~i~_0,52 { - 0,32 0,37 0,39 0,15
3600 - 0,85 - 0,43 0,42 0,40 0,21
4440 - - - 0,48 0,44 0,48 , 0,27
0C con enzima de E. cotí

Tabla 4.25.- inmovilizada.
Resultados de la hidrólisis de lactosa a 25
EX? IEL8 IEL9 [ELIO JELil IELI2 , 1EL13 IELI4

C
1 (gIL) 25 25 25 so so ¡ 50 100
C~1(g/L) 0 15 of 15 o o
C~~(gIL) O O 15~ 0 0 15 ¡ 0
1~~”” ————4
CE¡ (mg/L) 18,37 18,20 17,95_[_1823 18,44 ¡ 17,99 f18~30
tiempo (miii)
o o o fo 1 o , o
90 0,36_— 0,20 0,24 0,2 0,16 0,l6~ 0,08
120 0,44 0,27 0,36 0,22 0,24 0,19 0,08
180 0,50 0,38 0,51 0,25 0,25 0,22 0,14
——
240 0,64 0,52 0,58 0,29 0,31 0,26 0,21
300 0,71 0,60 0,67 0,37 0,41 0,33 0,22
360 0,79 0,79 0,78 0,46 0,45 0,35 -

1—....
480 0,87 0,84 - 0,55 0,50 0,45 0,26
660 0,83 0,87 0,92 0,64 0,63 0,55 0,32
354
Tabla 4.26.- Resultados de la hidrólisis de lactosa de 400C con enzima de E. coti

inmovilizada.
EXP IELíS 11116 11117 11118 IELI9} 11120 11121

Ciac (g/L) 25 25 25 50 so~ Áo fíoo
Cgai (gIL) 0 15 0 0 15 0 0
Cgiu (g/L) 0 0 15 0 0
CE¡ (mg/L) 12,95 11,90 11,90 12,25 12,60
tiempo (mm)
o o o o o o 0 0
30 0,19 0,15 0,10 0,1 0,10 0,10 0,03

60 0,36 0,35 0,32 0,52 0,18 0,22 0,05
120 0,65 0,58 0,64 0,66 0,37 0,29 0,16

180 0,92 0,84 0,84 0,77 0,59 0,46 0,23
240 0,97 - 0,87 0,67 ¡ 0,60 0,31
300 - - - 0,94 0,83 0,71 0,37

.—.——,——.——.—
360 - - - - 0,88 0,81 0,46

420 - - - - 0,94 0,87 0,49
355
Como en ocasiones anteriores, este análisis tiene por objeto proponer modelos
cinéticos que tengan en cuenta el efecto el efecto de las concentraciones de lactosa,
glucosa y galactosa sobre la velocidad inicial de reacción. Los valores de las velocidades
iniciales se calculan, en cada experimento, ajustando los datos experimentales C vs. t a
una función, la velocidad inicial es la derivada de dicha función a tiempo cero.
En la Figura 4.49 se muestra el efecto de la concentración inicial de lactosa sobre

la velocidad inicial de reacción, r0. Se puede observar como, al aumentar la concentración
de lactosa, la velocidad de reacción aumenta, de forma proporcional a la concentración de

sustrato para concentraciones de lactosa bajas, para luego disminuir a las
concentraciones de lactosa más altas. Este hecho apoyaría un modelo en el que hubiera
inhibición por sustrato. También la inhibición por sustrato parece aumentar con el
aumento de temperatura, con lo que la constante K1 deberá disminuir con la temperatura.
La Figura 4.50 indica el efecto de la concentración inicial de galactosa añadida

sobre la velocidad inicial de reacción; se observa que la galactosa no inhibe
prácticamente la reaccion.
En la Figura 4.51 se muestra la influencia de la glucosa en la velocidad de

reacción: al aumentar la concentración de glucosa disminuye r, con lo que la glucosa
inhibe la reacción de hidrólisis; parece inhibiría más al aumentar la temperatura, lo que
significa que la constante K1 debe disminuir con la misma.
Del análisis realizado se deduce que el modelo cinético que reproduzca los
resultados experimentales obtenidos deberá estar entre orden uno y cero y considerar que
existe inhibición por glucosa y, posiblemente, por lactosa. En principio, la inhibición por
galactosa se puede eliminar.
356
005
0.04
?E 0Á32
a
3—
0.01
0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.00
C~ (mol/L>
Figura 4.49.- Hidrólisis de lactosa con enzima de E. ccii: r0 vs C13, a varias temperaturas.
1.2 A
Te ratijra
U 40%?
0C
. •
A 25
5~C
u----
e
=0.8~
o
A a
0.4
0.2-
a
1-.
0.0 ¡ ¡ 1 ¡ ¡ ¡
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12

Cgai (rrnl/L)
Figura 4.50.- Hidrólisis de lactosa con enzima de E. cotí: cociente entre las velocidades iniciales
con y sin galactosa inicial vs Cgaí a a varias temperaturas.Cjaú 50 gIL; C&Uo O gIL. ~= =
357
1.2
4
.—.. 1.0-
o
II
a
caos -
A
e e
8 6-
jO.
o
Aa
o
e
a
0.0 ¡
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
Figura 4.51.- Hidrólisis de lactosa con enzima de E. ca/i: cociente entre las velocidades iniciales
con y sin galactosa inicial vs Cgaio a varias temperaturas. ~ 50 g/L; C~~<ft O g/L.
Los datos experimentales se han ajustado empleando los modelos cinéticos de las
Tablas 3.2 y 3.4 mediante el método integral. La técnica que se ha utilizado para el ajuste
ha sido, de nuevo, una regresión no lineal con la temperatura como variable. Por tanto, los
parámetros se expresan en función de la temperatura según la ecuación de Arrhenius en la
ecuación cinética de cada modelo, luego se ajustan todos los datos de todas las
temperaturas.
Las Tablas 4.27 y 4.28 presentan los resultados dcl ajuste con la temperatura
como variable. En este caso se han añadido tres modelos más, que combinan la inhibición
por glucosa y la inhibición por lactosa. Los parámetros que no pasan criterios estadísticos
y fisicos están sombreados en la Tabla 4.28. En la Tabla 4.29 se resume el grado de
cumplimiento de los criterios estadísticos y fisicos del punto 3.1.3.2 por parte de los
parámetros cinéticos de cada modelo.
358
Los criterios estadísticos los pasan los modelos 1, 3, 8, 21 y 22. Los criterios
fisicos los pasan los modelos 1, 3,6, 7, 9, 10, 11, 21, 22 y 23. Los modelos que generan
menor residuo (SQR= 0,37 en los tres modelos probados: modelos 21, 22 y 23) tienen en
cuenta la inhibición por lactosa, que siempre es acompetitiva. En este punto no se puede
discriminar entre los modelos 21 y 22.
El modelo 22 tiene un valor de F levemente inferior al del modelo 21; por otra
parte, si se compara con los resultados obtenidos al aplicar los distintos modelos cinéticos
a la enzima en disolución, se observa que el modelo que implica inhibición competitiva
tiene, en aquel caso, cuatro parámetros que incluyen el cero en el intervalo de confianza.
Además, si se consideran, en el caso de la enzima inmovilizada, los modelos que sólo
implican inhibición por glucosa (modelos 4, 5 y 6) se observa que el modelo 4 también
(como en el caso de la enzima libre) tiene cuatro parámetros sin significación estadistica.
Con estas dos razones, parece que la inhibición competitiva por glucosa no debería ser la
elegida, por lo que el modelo adecuado en el presente caso sería el modelo 22: inhibición
acompetitiva por glucosa y acompetitiva por lactosa. La ecuación del modelo elegido es
la siguiente:
k2 C5~ ~ [4.7 a]
Id Clac [jí + ~lac %rI ~
lar ¡
¡glu
donde:
k2z~exp~j22,82+414~ 10090±1I40~
KM exp~32 77±2226—
11220±736fl
359
Kigiu :zexP~j 35 77±264 + 11760±8260 [4.7b]
El análisis de los residuos calculados con los datos experimentales y con los
valores de conversión que se obtienen al aplicar el modelo seleccionado se muestra en la
Figura 4.52. Se puede apreciar en dicha Figura que la diferencia máxima que hay entre la
conversión experimental y la calculada es inferior al 15% del valor de la primera, siendo
en la mayoría de los casos inferior al 5% dicha diferencia. El modelo tiende a pronosticar
valores de la conversión ligeramente superiores a los experimentales, aunque con un error
inferior al 5%.
En las Figuras 4.53 a 4.59 se muestra como línea continua la reproducción de los
datos experimentales X vs t CE con las ecuaciones [4.7a]
y [4.7b],
que corresponden al
modelo cinético elegido.
0.15
0.10
0.05
0.00
2
-0.05
-0.10
-0.15
O 20000 40000 60000 80000

t Q (mm mg/L)
360
)
Tabla 4.27.- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de lactosa con ¡3-galactosidasa de E.

cotí inmovilizada. (Método integral, regresión no linea¿ T corno variable)

(1) Menten simple inhibición por lactosa
(2) (3)
Ln k0 2096 + 2,48 18,67±0,88 2421 + 3,33
Ea/R 9015 ±752 9042 ±262 10560 ±904
Ln KMO - 20 82±7,88
EaM/R - i~=24~=i±L 7432 ±2600
LnK1o - -1900+8,01
5338±2540
SQR 4,50 0,66 0,54
F 457 1686 1367
MODELO Michaelis- Michaelis- Michaelis- Michaelis

Menten con Menten con Menten con Menten con
inhibición inhibición inhibición no inhibición
competitiva por acompetitiva por competitiva por mixta por
glucosa (4) glucosa (5) glucosa (6) glucosa (7)
Lnko 1470+1,80 1921+0,60 1852+8,00 1707+172
Ea/R 7835±570 9149±154 8950±236 8950±4957
LnKMO nl Q 4 6235+28,40 5993±838
EaM/R 5 J 20868±9200 20130±2880
LnK10 3,4~kQ~ Á~-~i~I

Eai/R 135~tV45Q $4@~
Ln K’10 - 1
E’0 1/R
SQR 0,57 0,50 0,50
E 1299 1484 1500 1006
361
Tabla 4.28.- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de lactosa con j3-galactosidasa de E.

cotí inmovilizada. (Método integraL regresión no lineal, T corno variable)

galactosa (8) galactosa (9) galactosa (10) galactosa (11)
Lnk0 1876+102 1920+140 1866+002 1851+089
Ea/R 9067±302 9193±296 9021+1402 9125±144,3
Ln KMO 133 1+26,40 52,96±7,20 52 96 + 720 53 58 + 1947
EaNI/R 4~~Ztit~< ~ 17430±2896 17980±2120 18256±14565
Ln K10 101,6±37,40 ~ -5054 + 16,42 -4824 + 4201
~Í~ds44~tÓ 455É :16234
1
LnK’¡o - - 459~12±7$,29
E’ai/R 21378 4
SQR 0,64 0,63 0,68 ±7,21
0,70io
E 1141 1174 1098 821
MODELO Michaelis-Menten Michaelis-Menten Michaelis-Menten con

con inhibición con inhibición inhibición acompetitiva
acompetitiva por acompetitiva por por lactosa y no
lactosa y competitiva lactosa y acompetitiva competitiva por
por glucosa (21) por glucosa (22) glucosa (23)
Lnko 29,49+640 2282±414 26,09+370
Ea/R 11930±1698 10090±1140 11000±1024
LIIKMO 20,73+050 3277+2226 18,20+506
E
0M/R 7074±1506 11220±7360 6487±1566
Lii Kigiuo -10,31+960 35 77+264 0S7& ~.6O
Eaigiu/R -2431±2250 11760±8260 589±2234
Lii Kiiaco -21,20+606 -1259+844 -18,78+602
Eai iaJR 5703± 1754 -3284±2540 5088±1850
SQR 0,37 0,37 0,37
F 1464 1472 1444
362
Tabla 4.29.- Discriminación de modelos: Hidrólisis de lactosa con la enzima de E. cotí.

Método integral: regresión no lineal de datos a temperatura variable.

Orden 1(1) Lnk0 + Pasa
Ea/R + >0 SQR~4,50 (140)
Michaelis-Menten Ln kQ + No pasa.
simple (2) Ea/R + >0 SQR#2,66 (110)
LnKM O
E,M/R 0 >0
con inhibición por E3/R + > O SQR=0,54 (70)
lactosa (3) Ln KM +
EaM¡R + >0
Ln K~ O
O > O (valor alto)
con inhibición Ea¡R + > O SQR~0,57 (50)
glucosa (4) EaM/R O > O (valor alto)
LnK[ O
Ea>/R O > O (valor alto)
con inhibición Ea/R + > o SQR=0,5O (40)
glucosa(S) EaM/R 0 >0
LnK1 O
Eaj/R 0 <0
con inhibición no Ea/R + > O SQR=0,5O (50)
glucosa (6) FaM/R + > O
LnK1 O
E,1/R 0 >0
Michaelís-Menten Ln k0 + No pasa.
con inhibición Ea/R + > O SQR=0,54 (6~)
mixta por glucosa Ln KM +
(7) E.M/R + > 0
LnKj O
Ea¡/R 0 >0
LnK’¡ O
E’ai/R 0 >0

+ pasa 0 de orden de mejor a peor ajuste, entre paréntesis.
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n
363
Tabla 4.29.(cont.).- Discriminación de modelos: Hidrólisis de lactosa con la enzima de E.

cotí. Método integral: regresión no lineal de datos a temperatura
variable.
MODELO PÁ~ CRITERIOS CRITERIOS OBSERVACIONES

con inhibición VR + >0 SQR=O,64 (10>)
galactosa (8) E>M/R
Michaelis-Meriten Ln k0 No pasa.
con inhibición Ea/R > O SQR%,63 (90)
acompetitiva por Ln KM
galactosa (9) EaM/R >0
<0
Michaelis-Menten Lii k0 No pasa.
con inhibición no E~/R >0 SQR=O,68 (12’>)
competitiva por Ln KM
galactosa (10) E.M¡R >0
0 <0
Michaclis-Menten Ln k~ + No pasa.
con inhibición E>/R + >0 SQRO,70 (13”)
mixta por galactosa Ln KM +
EaM/R + >0
LnK~ +
0 <0
LnK’~ O
E’w’R 0 <0
con inhibición E/R + >0 SQR~0,37 (1’>)
glucosa y E.M/R + > O
acompetitiva por Ln K1 ~. +
lactosa (21) Ea¡ 5~~/R + <0
LnKí¡a. +
Eajiac/R + <0
Clave: Criterios fisicos: <0 Parámetro negativo

Criterios estadisticos: O incluye el cero en el intervalo de confianza
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n” de orden de mejor a peor ajuste, entre paréntesis.
364
Tabla 4.294cont).- Discriminación de modelos: Hidrólisis de lactosa con la enzima de E.

cotí. Método integral: regresión no lineal de datos a temperatura
variable.

con inhibición E~/R + > O SQR=0,37 (2”)
glucosa y EaM/R + >0
acompetitíva por Ln K1 gí. +
lactosa (22) Fai g¡u/R + > O
LnK¡iac +
Eai¡ac/R + <0
con inhibición no E,/R + > O SQR=O,37 (3”)
glucosa y FaM/R + >0
acompetitiva por Ln K1 g¡. O
lactosa (23) Eai 5i0/R O > O
LnK~~~ +
Ea¡¡acIR + >0

Criterios estadisticos: O incluye el cero en el intervalo de confianza
+ pasa
365
4.3.3.- Modelo cinético de la hidrólisis de ONPG
Conocidas ya las condiciones del medio de reacción que aseguran que la actividad
de la enzima es estable durante el tiempo que dura un experimento de hidrólisis, se realizó
el estudio cinético de la reacción de hidrólisis de ONPG con ~-galactosidasa dc E. cotí
inmovilizada.
4.3.3.1.- Resultados experimentales
Se llevaron a cabo diversos experimentos en los que se varió la temperatura de

reacción entre 5 y 400C, la concentración de ONPG entre 0,25 y 1 gIL, la concentración
de ONP entre O y 0,25 g/L y la de galactosa entre O y 15 g/L. El tampón utilizado fue BP,
se fijó la agitación por hélice en 300 r.p.m., y se utilizó una concentración de enzima
aproximada de 0,7 mg/E.
Los experimentos se muestran en las Tablas 4.30 a 4.32. En las Figuras 4.64 a
4.72 se observa la variación de la conversión con tC~ en dichos experimentos.
370
Tabla 4.30.- Resultados de la hidrólisis de ONPG a 5”C con la enzima de E. cotí

inmovilizada.
EXP IEO-1 IEO-2 IEO-3 IEO-4 IEO-5 IEO-6 IEO-7 IEO-8
CoN~ 0,10 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 1 1

(gIL)
CONP 0 0 0,25 0 0,25 0 0 0
(WL)
Cgaj O 0 0 0 0 15 0 15
(g/L)
0,673 0,855 0,995 1,093 1,584 0,998 0,937 1,718
(mg/L)
tiempo XONPG
(miii)
o o o o o o o o o
6 0,18 0,15 0,16 0,11 0,09 0,05 0,07 o,os
12 0,29 0,22 0,30 0,17 0,17 008 0 10 0,12
18 0,42 0,35 0,45 0,24 0,34 0,14 0,17 0,15
24 0,53 0,40 0,50 0,30 0,38 0,18 0,18 0,20
40 0,76 0,57 0,79 0,47 0,56 0,28 0,31 0,32
60 0,90 0,80 - 0,65 0,86 0,41 0,44 0,45
80 . - - 0,77 - 0,51 0,54 0,59
105 - - - 0,79 - 67 0,72 0,74
120 - - - 0,85 - 0,68 0,77 0,79
371
Tabla 4.31.- Resultados de la hidrólisis de ONPG a 25”C con la enzima de E. cok

inmovilizada.
372
Tabla 4.32.- Resultados de la hidrólisis de ONPG a 400C con la enzima de E. cotí

inmovilizada.
EXLP lEO- lEO- lEO- ¡FO- fEO- lEO- 1 lEO-

19 20 21 22 23 1 24
CONPC 0,10 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 1 1
(g/L)
CONP 0 0 0,25 0 0,25 0 0 0

(g/L)
0 0 0 0 0 15 0 15
(g/L)
0,757 0,669 0,907 0,594 1,092 0,518 0,574 0,463
(mg/L)
tiempo XoNPG
(mili)
o o o o o o o l
lo
0,13 0,10
2 0,53 0,35 0,32 0,20 0,18 0,14
4 0,75 0,50 0,60 028 027 0,17 0,16 0,13
6 0,82 0,60 0,72 0,36 0,38 0,23 0,23 0,17
8 0,90 0,73 0,87 0,40 0,54 0,27 0,28__1__0,20
10 - 0,80 - 0,41 0,65 0,34 0,28 0,26
12 - - - 0,52 0,58 0,38 0,39 i 0,30
16 . - - 0,57 0,66 0,47 0,47 0,42
24 - - - 0,70 0,78 0,60 0,68 1__0,62

30 - - - 0,82 0,87 0,67 . 0,82 0,70
40 - - - - -~ - 0,85 0,80
373
Con el análisis de las velocidades iniciales se obtienen elementos cualitativos que

permiten determinar en general los modelos cinéticos que pueden ajustar los datos
experimentales. Esta discriminación cualitativa tiene en cuenta las figuras que presentan
cl electo de las concentraciones de sustrato y de productos sobre la velocidad inicial de
reacción. Como en ocasiones anteriores, la velocidad inicial de reacción se ha calculado
por ajuste de los datos integrales obtenidos en la experimentación a una fúnción y
posterior derivación de ésta a tiempo cero de reaccion.
La Figura 4.60 muestra la influencia de la concentración inicial de sustrato en la

velocidad inicial de reacción, r0. Al aumentar la concentración de sustrato, aumenta la
velocidad inicial de reacción; a concentraciones bajas este aumento es proporcional (el
orden neto respecto al sustrato es aproximadamente 1), pero a concentraciones altas de
sustrato, el aumento de la velocidad inicial de reacción es mucho menor que el aumento
de la concentración de sustrato que lo provoca (el orden neto respecto al sustrato se acerca
a orden cero). Al aumentar la temperatura parece que el orden neto respecto al sustrato
pasa de orden aproximadamente cero a orden aproximadamente uno. La constante de
Michaelis parece aumentar con la temperatura, por lo que la afinidad de la enzima por el
sustrato disminuye con el aumento de la dicha variable.
La Figura 4.61 indica el efecto la concentración inicial de galactosa a la velocidad

inicial de reacción. Hay inhibición sólo cuando la concentración de galactosa es mucho
mayor que la de ONPG, con lo que la enzima se une al sustrato con mayor afinidad que a
la galactosa. La inhibición parece disminuir con el aumento de la temperatura, por lo que
la constante de inhibición aumenta con la temperatura.
En la Figura 4.62 se observa el efecto de la concentración de ONP a tiempo cero

sobre la velocidad inicial de reacción. Se puede observar una clara inhibición a
concentraciones muy similares a las de sustrato, por lo que se puede deducir que el ONP y
el ONPG se unen a la enzima con constantes de adsorción muy similares. La inhibición
374
disminuye con la temperatura, por lo que la constante de inhibicián de este producto

aumenta en ese sentido.
Del análisis de las Figuras 4.60 a 4.62 se deduce que el modelo cinético que ajuste
los datos experimentales ha de ser uno cuyo orden neto respecto del sustrato esté entre O y
1, como en el caso de un modelo basado en el mecanismo de Michaelis-Menten; por otra
parte, deberá incluir inhibiciones por los dos productos de la hidrólisis: galactosa y ONP.
0.28
0.24
~ 0.20
.9 0.16
E
-~ 0.12
-5
jD 0.08
0.04
0.00
4 1.0x103 1.5x104 2.0x103 2.5x103 3.0x10~3 3.5x103
0.0 5.0x10
C~ (rmIIL)
Figura 4.60.- Hidrólisis de ONPG con enzima de E. coti: r

0 vs CONIN; a varias temperaturas.
375
1.2
lemueratura
u 4tYC
1t
• 25
~0~~ St
s..II o í.o~ A
u—
A
~ 0.6- -. A
e..
o
Ao
~ 0.4 -
o
0.2 -
L..
o
¡ 1 ¡ ~ — ¡ 1 ¡
0.0 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
Figura 4.61.- Hidrólisis de ONFO con enzima de E. cotí: cociente entre las velocidades iniciales
con y sin galactosa inicial vs CONPC a varias temperaturas. CONPG 0,5 g/L; CONI’ o O g/L.
1.2
Te eratura
• 40”C
1.04 • 2Sf
oII
o
t~ 0.6-
o e
A0
y~ 04-
0.2 -
L.. o
0.0 0.0 5.0x104 1.0x103 1.5x103 2.OxlO3

2.5x1 o~
CONP (mol/L>
Figura 4.62.- Hidrólisis de ONPG con enzima de E. ccli: cociente entre las velocidades iniciales
con y sin ONP inicial vs CONPO a varias temperaturas. CONIO 0,5 gIL; C~
1 O gIL.
376
La discriminación del modelo cinético se llevó a cabo por el método integral. Se

empleó como técnica matemática para el ajuste de los datos experimentales a los modelos
cinéticos de las Tablas 3.2 y 3.3 una regresión no lineal con una integración numérica
acoplada. Se ajustaron todos los datos conseguidos a todas las temperaturas ensayadas,
considerando la temperatura como una variable. Esta variable aparece en el desarrollo de
los parámetros cinéticos de cada modelo según la ecuación de Arrhenius.
Los parámetros cinéticos de cada modelo que se han obtenido mediante el método
integral se muestran en las Tablas 4.33, 4.34 y 4.35, junto con sus intervalos de confianza
y el residuo generado por cada modelo. Los parámetros que no cumplen los criterios
estadisticos y fisicos del apartado 3.1.3.2 se muestran sombreados. En la Tabla 4.36 se
resume el cumplimiento de dichos criterios por cada parámetro cinético de los modelos
probados.
Los criterios estadísticos los pasan los modelos 1, 12 y 20. Los criterios fisicos los
pasan todos los modelos cinéticos probados. De los modelos cinéticos que cumplen
criterios, el que menos residuo genera es el 12 (SQRO,46), seguido por el 20
(SQR=0,75). Teniendo en cuenta que el modelo 12 ajusta los datos claramente mejor que
el 20 y que los parámetros cinéticos del modelo 12 tienen unos intervalos de confianza
más estrechos, en esta etapa se elige el modelo 12.
Del análisis de las velocidades iniciales se deduce que conviene proponer un

modelo cinético que incluya la inhibición por o-nitrofenol y por galactosa. Además, se
observa en este análisis que la constante de Michaelis y las constantes de inhibición
aumentan con la temperatura, por lo que sus energías de activación deberían ser positivas.
La discriminación por el método integral, con la temperatura como variable, lleva

a dos modelos cinéticos que ajustan razonablemente los datos y que cumplen con lo dicho
377
anteriormente: los modelos 12 y 20. El primero implica inhibición competitiva por los dos
productos, el segundo propone inhibición no competitiva por ONP y competitiva por
galactosa. El modelo 12 ajusta mejor los datos y sus parámetros tienen una mayor
significación estadística. Además, la constante de Michaelis del modelo 12 es la única que
cumple con la tendencia con la temperatura marcada por el análisis de las velocidades
iniciales para dicho parámetro. Se elige, por tanto, este modelo. La ecuación
representativa del mismo es la siguiente:
k2 ~>~1 CONI>G [4.8 a]
donde:
1 + + I¿i2 j + CONPG
43 = exl{1 1,25±1,80—6063±534j
( 3521±1120
KA, exnl4,O2±3,76—
( 3482±1098
Kig¡ = e%8~24±3~72-. T [4.8b]
( 3372 ±246
exp~4~36+O25— T
La Figura 4.63 muestra los residuos que se han calculado utilizando los valores
experimentales de las conversiones y los valores calculados de la mismas con el modelo
12. Como se puede apreciar, la diferencia máxima entre los valores experimentales y
calculados de la conversión es de un 18% del valor experimental, pero esta diferencia es
inferior al 5% en la gran mayoría de los casos. Además, el error se distribuye
aleatoriamente alrededor del cero, por lo que no hay tendencia significativa y el modelo
reproduce correctamente las conversiones experimentales obtenidas.
378
Capitulo 4. Cinética de las reacciones dc hidrólisis con las enzimas inmovilizadas
En las figuras donde se representa la conversión de ONPG vs. el producto tCE

(Figuras 4.64 a 4.72), se muestra en línea continua la reproducción de los datos
experimentales con el modelo elegido (ecuaciones [4.8 a] y [4.8 b]).
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
14 -0.05
-0.10
-0.15
0 50 100 150 200

tC~(minmg/L)
379
Tabla 4.33.- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de ONPG con ~-galactosidasa de E.

cotí inmovilizada. (Método integrat, regresí¿n no lineal, T como variable)

(1) Menten simple inhibición por ONPG
(2) (3)
Lnko 1359+3,69 1120+1,60 12,64±937
Ea/R 7347±659 6181±490 7006±2687
Ln KMO - ~=2$
t945
E0M/R 3684±1874 3754±2498
LnKrn - 49 £2$7
Eai/R 3597±2497
SQR 4,06 - - Á,60 - 1,48 -
F 1095 1271 957

competitiva por acompetitiva competitiva por mixta por ONP
ONP (4) por ONP (5) ONP (6) (7)
Lnko 894±180 821+212 549+248 5,49±1,24
E8/R 5442±532 5230±624 4413 ±736
Ln KMO ~3~41x¿Es;4e -9 28 + 6 08 -9 20 + 5 42
EaM/R 1689±1480 1É1It4~O4 -474±.¡800
LnKio 791±572 952+774 1555+920
E01/R 3198±1660 3217±2220 4917±2600 5.9$i±5ZQ4
Ln K’10 - - I6,84.~ 0$ 90
E’ai/R - 427fl48400
SQR 0,98 1,14 1,63 1,16
F 1382 1117 833 824
380
Tabla 4.34.- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de ONPG con ~3-galactosidasade E.

cotí inmovilizada. (Método íntegrat regresión no lineal, Tcomo variable)

galactosa (8) galactosa (9) galactosa (10) galactosa (11)
Lnk0 11,59±1,80 14,92+266 11,59+188 11,51±332
Ea/R 6242±550 7176±754 6242±550 6251 +9604
Ln KMO ~1~-~’ 4 -1~25t~ 1P
EaM/R 2120±2116 3886±1560 2119±2114 2Z
~ -‘~‘4 4
E01/R - -4549 ±2600 .~591Y2900 -4Q~ POS
Ln K’jo - 94
E’ai/R - -36 9
+4
SQR 0,98 1,23 0,98 1,25

E 1340 1083 1339 681
MODELO Michaelis-Menten Michaelis-Menten Michaelis-Menten

con inhibición con inhibición con inhibición
competitiva por competitiva por competitiva por
ONP y competitiva ONP y acompetitiva ONP y no
por galactosa (12) por galactosa (13) competitiva por
galactosa (14)
Lnk0 1125+1,80 15,87+164 050±298
Ea/R 6063 ±534 3046 ±494 2645 ±900
LIIKMO 402+376 -15,92+340 -1474+480
E2M/R 3521±1120 -2666± 1012 -2322±1440
LnK¡ga¡o 436+025 4,42±085 441+061
Eaigai/R 3372±246 3452±249 3398±208
Ln K1 ONPO 8 24±372 O1~94UE4jO VttI4 hA
EaIONP/R 3482±1098 fl40t4200 1517±1232

SQR 0,46 0,63 0,68
F 2875 2117 1919
381
Tabla 4.35.- Parámetros cinéticos de la hidrólisis de ONPG con 9-galaetosidasa de E.

colí inmovilizada. (Método integrat regresión no lineal, T como variable)

con inhibición con inhibición con inhibición
acompetitiva por acompetitiva por acompetitiva por
ONP y competitiva ONP y acompetitiva ONU y no
galactosa (17)
Ln k0 10,98 + 2 26 O&~4 1,80 4j&t3~éÚ
E0/R 5975 ±666 2&~. 1S4J40 2123 ±1100
LnKMO -1679+542 -1671 +5,42
EaM/R 3365±1328 -2948±1164 -2948±1634
LnK¡gaio 428+0,95 4,29+016 431+0,69
Eaigai/R 3478±459 3298±579 3589±759
LnKIONPO 057’t444 1414±534 1367±6,18
Eai ONP/R 720&1.592 4904±1550 4897±1936
SQR 0,61 0,83 0,84
E 2153 1601 1555

con inhibición no con inhibición no con inhibición no
competitiva por competitiva por competitiva por
ONU y competitiva ONU y acompetitiva ONU y no
galactosa (20)
Ln k0 12,03±210 U -35,06±3,20
Ea¡R 6272±614 2920±532 2367±964
LnKMO 525+4,00 -1607±354 -1542±4,48
EaM/R 3845±1180 -2739±1550 -2567±1462
LnK¡gaio 441 +0,28 4,43+037 429+0,56
Eaigai/R 3372±348 3372±452 3372±568
Ln K1 ONPO O;~4d~4~24 8,46±416 8 45 ±4,32
EaIONP/R 697i2’248 3086±1209 3206±1262
SQR 0,55 0,72 0,75
1? 2385 1843 1734
382
Tabla 4.36.- Discriminación de modelos: Hidrólisis de ONPG con ~-galactosidasa de

E cotí. Método integral: regresión no lineal de datos a temperatura variable.

METRO ESTADÍSTICOS FISICOS
Orden 1(1) Lnk0 + Pasa.
Ea/R + > 0 SQR’4,06 (20”)
simple (2) E~/R + >0 SQR1,60 (18”)
LnKM O
EaM/R + >0
con inhibiciónpor E3/R + >0 SQR=l,48 (17”)
ONPG (3) Ln KM o
EaM/R + >0
Ln K~ O
Faz/It + >0
Michaelis-Menten En k0 + No pasa.
con inhibición Ea/It + >0 SQRO,98 (12”)
competitiva por Ln KM 0
ONP(4) EaM/R + >0
LnK1 +
Ea¡/It + >0
Michaelis-Menten Ln ka * No pasa.
con inhibición Ea/R + >0 SQR=l,14 (13”)
acompetitiva por En KM O
ONP (5) EaM/It O > O
LnK, +
Ea¡/R + >0
con inhibición no Ea/It + >0 SQR=l,63 (19”)
competitiva por En KM +
ONP (6) EaM/R 0 <0
LnK1 +
Ea¡/R + >0
Michaelis-Menten En k0 + No pasa.
con inhibición Ea/R 0 >0 SQRI,16 (14”)
mixta por ONP Ln KM +
(7) EaM/R 0 <0
LnK1 O
Eai/R 0 >0
LnK~ O
Eai/R 0 >0

>0 Parámetro positivo
+ pasa
383
Capitulo 4. Cinética de las reacciones de bidrólisis con las enzimas inmovilizadas
Tabla 4.36 (cont.).- Discriminación de modelos: Hidrólisis de ONPG con ~-galactosidasa

de E. colÉ Método integral: regresión no lineal de datos a temperatura
variable.
MODELO PARA CRITERIOS CRITERIOS OBSERVACIONES

con inhibición Ea/It + >0 SQR=O,98 (11”)
galactosa (8) EaM/R + > O
La K1 O
EM/R O <O
con inhibición Ea/R + >0 SQR=l,23 (15”)
acompetitiva por Ln KM
galactosa (9) EaM/It + >O
LnK~ O
Eai/R + <0
con inhibición no E,IR + >0 SQR=0,98 (10”)
competitiva por Ln KM o
galactosa (10) WJVI/R + >0
LnK~ O
E~/R 0 <0
Michaelis-Menten Ln k<1 + No pasa.
con inhibición Ea/It + >0 SQIt1,25 (16”)
mixta por galactosa Ln KM O
(11) EaM/R 0 >0
LnK~ O
Eai/R 0 <0
LnK¡ O
E11/It O <O
Miebaelis-Menten Ln k, + Pasa.
con inhibición VR + >0 SQRO,46 (1”)
ONP y competitiva EaM/R + > O
por galactosa (12) Lo K1 gal +

Ea¡ ga¡/It + > O
Ln K1 ONP +
Ea¡ ONPIR + >O
Clave: Criterios fisicos: <0 Parámetro negativo

Criterios estadisticos: o incluye el cero en el intervalo de confianza
+ pasa
384
Tabla 4.36 (cont.).- Discriminación de modelos: Hidrólisis de ONPG con 3-galactosidasa

de E. colí. Método integral: regresión no lineal de datos a temperatura
variable.
MODELO PARA CRITERIOS CRITERIOS OBSERVACIONES

METRO ESTADISTICOS FíSICOS
Míchaelis-Menten Ln k0 + No pasa.
con inhibición Ea/It + >O SQIt0,63 (4”)
ONE y acompetitiva EaM/It + <0
por galactosa (13) Ln K1 gal +
Ea¡gai/It + >0
LnKIONP O
E,¡oNp/R 0 >0
Michaelis- Menten Ln k0 + No pasa.
con inhibición E,/R + >0 SQR0,68 (5”)
ONPyno EaM/It + <0
competitiva por Ln K1 gal +
galactosa (14) Eai gaí/It + >O
LnKIONP O
EaiONP/It + >0
-con inhibición Ea/It + >0 SQR=0,61 (3”)
ONP y competitiva E,M/It + >O
por galactosa (15) Ln K~ gal +
Ea¡ gaí/R + >O
LnKIONP O
Eai ONP/It 0 >0
Michaelis-Menten Ln k0 O No pasa.
con inhibición Ea/It 0 >0 SQR=0,83 (8”)
acompetitiva por LnKM +
ONP y acompetitiva EaM/R + <0
por galactosa (16) LnKzga¡ +
Fa¡ ga¡~’R + > o
LnK[ONP +
Ea¡ ONP/It + >0

> ti Parámetro positivo
+ pasa
385
Tabla 4.36 (cont.).- Discriminación de modelos: Hidrólisis de ONPG con f3-galactosidasa

de E. cotí. Método integral: regresión no lineal de datos a temperatura
variable.

con inhibición a- E,/It + >O SQR=O,84 (9”)
ONPy no EaM/It + <O
competitiva por Ln K1 gal +
galactosa (17) E11 gaí/R 1- >0
Ln K~ ONP +
E11 <)NPIR + > O
Michaelis-Menten Ln k~ + No pasa.
con inhibición no E1/It + >0 SQRO,55 (2”)
ONP y competitiva EaM/R + >O
por galactosa (18) Ln K, gal +
E,1 ~11/It + > O
LnKzONP O
EIIoNP/R 0 >0
con inhibición no Ea/It + > 0 SQIt=O,72 (6”)
ONP y acompetitiva EIM/R -f <O
por galactosa (19) Ln Kz gal +
Ea¡ gav’R + >O
LnKIONP +
E1¡oNp/It + >0
con inhibición no Ea/It + > o SQR=O,75 (7”)
competitiva por Ln K,, +
ONPyno Em,,/R + <O
competitiva por Ln K~1 +
galactosa (20) E1~1/It + >0
-4-
a-Al fl.¡,
E1~2/It + > O
Clave: Criterios físicos: <0 Parámetro negativo


+ pasa
386
4.3.4.- Comparación de la enzima de E. ccli en disolución e inmovilizada
En este punto se comparan los resultados obtenidos con la enzima de E. colí libre
y los obtenidos con la enzima de E. coil inmovilizada. Primero se comparan los efectos de
determinadas propiedades intrínsecas del medio de reacción: composición iónica, pH y
temperatura, sobre la actividad y la estabilidad de las enzimas. Luego, se comparan los
modelos cinéticos seleccionados para reproducir el comportamiento de las dos enzimas en
las reacciones de hidrólisis de lactosa y ONIPG.
4.3.4.1.- Actividad y estabilidad de la enzima libre e inmoviliza&
Los tampones utilizados en los experimentos de hidrólisis de lactosa y ONPG

fueron, respectivamente, BM y BP, igual que con la enzima libre y con la enzima de K.
fragilís.
Para estudiar el efecto de determinados cationes metálicos en la actividad de la

enzima en disolución y de la enzima inmovilizada, se llevaron a cabo varios experimentos
estándar de hidrólisis de ONPG en BP al que se le había añadido una concentración
pequeña de dichos cationes. En el caso de la enzima libre (Figura 3.36), la mayoría de los
cationes probados aumentan poco (3-5%) la actividad de la enzima, excepto e] Mn2<, que
la aumenta en un 10%. La actividad de la enzima inmovilizada disminuye en presencia de
ciertos iones: Fe2~, Co2~ y Cu2~, mientras que no varía con otros: Ni2~, Cr2~ y Mn2~, y es
activada suavemente por el AI3~ y por el Zn2~ (Figura 4.46). Estos dos últimos iones son
los que conservan su relación con la enzima a pesar de la inmovilización, pero este
proceso supone que la mayoría de los iones pasan de activar suavemente a inhibir
suavemente, en general. Este efecto está mucho más marcado en Lactozym, pero va en el
mismo sentido. Queda claro que el punto de unión de cada ión a las enzimas es diferente
al de otro ión y que el proceso de inmovilización genera una enzima más inestable cuando
se pone en contacto con iones.
La enzima de E. colí tiene un pH óptimo en tampón BP y con ONPG de 7,5

(Figura 3.38). Al inmovilizar, el pH óptimo pasa a ser de 8 (Figura 4.44). Cuando el
392
tampón es BM y el sustrato lactosa, el pH óptimo pasa de 6,5 a 6 (Figuras 3.37 y 4.45).

En el caso de Lactozym, según se comentó en el apartado 4.2.4.1, el pH óptimo para
ambos sustratos pasa, aproximadamente, de 6,5 a 7, por lo que la inmovilización ejerce el
mismo efecto sobre el pH óptimo para los dos sustratos. En el caso de la enzima de Ecolí,
la inmovilización provoca que los valores de pH óptimo para las hidrólisis de cada
sustrato varien en sentidos opuestos, haciéndose mayor la diferencia entre los valores de
pH óptimo para las dos reacciones de hidrólisis. La inmovilización produce una
modificación en la distribución de la densidad electrónica en la superficie o en el centro
activo de la enzima que es diferente a la provocada en la enzima contenida en Lactozym.
El centro activo se ha modificado de tal forma que moléculas que forman dipolos
permanentes, como el ONPG, interaccionan mejor con la enzima en medios con una
concentración elevada de cargas negativas.
La estabilidad de la enzima frente al pH sufre un cambio debido a la

inmovilización sólo cuando el pH es alcalino (Figuras 3.39 y 4.47). A pH ácido, el
comportamiento de enzima libre e inmovilizada es el mismo. Por tanto, la inmovilización
no supone estabilización alguna en la estructura de la enzima a pH ácido. A pH alcalino,
la enzima inmovilizada es más inestable; a estos valores de pH todavía podría haber
reacciones en superficie de unión entre la enzima y el sustrato que supondrían un aumento
de rigidez de la estructura nativa de la enzima, con pérdida de actividad asociada, lo
mismo que sucedía con la enzima contenida en Lactozym.
La estabilidad de la enzima con la temperatura no varia con la inmovilización a 40

y 45<’C (Figuras 3.40 y 4.48). Sin embargo, a 55”C se observa cierta estabilizaciów,
manteniéndose la actividad de la enzima inmovilizada en un nivel del 20-25% hasta, por
lo menos, 300 minutos, cuando la enzima libre ya ha perdido la actividad totalmente. Se
deduce que la inmovilización favorece la formación de una estructura enzimática más
estable pero menos activa que la enzima nativa.
393
4.3.4.2.- Comparación del modelo cinético de la hidrólisis de lactosa
En el caso de la enzima libre se elige un modelo tipo Michaelis-Menten con

inhibición acompetitiva por glucosa, pero esa elección no es clara, ya que el modelo con
inhibición no competitiva por glucosa da resultados muy similares. En el caso de la
enzima inmovilizada se selecciona un modelo que supone inhibición acompetitiva por
glucosa. Los modelos que suponen inhibición competitiva por glucosa tienen varios
parámetros que incluyen el cero en su intervalo de confianza, lo que también sucede en el
modelo que implica inhibición no competitiva por glucosa y acompetitiva por lactosa
(modelo 23), en el caso de la enzima inmovilizada. Se puede considerar entonces que el
modelo para la enzima libre que más se adecua a la realidad es cl que presenta inhibición
acompetitiva por glucosa (modelo 5 y ecuación [4.7]),
puesto que es la única opción que
es aceptable tanto en la enzima libre como en la inmovilizada, eligiéndose para la enzima
inmovilizada el modelo 22: inhibición acompetitiva por lactosa y por glucosa (ecuación
[3.8 14
El modelo cinético seleccionado para la enzima inmovilizada postula también la

inhibición por el sustrato, lo que no se considera en el modelo elegido para la enzima
libre. De hecho, en expenmentos no mostrados llevados a cabo a 40”C en los que se
aplicó el método de velocidades iniciales (se calculó la velocidad inicial a varias
concentraciones iniciales de lactosa, de 10 a 300 gIL) sólo sc observó una saturación de la
enzima a concentraciones bajas de sustrato, por lo que se alcanza un orden similar a cero
a concentraciones de sustrato de 25-SO g/L, pero no se observó un descenso dc la
velocidad inicial a concentraciones altas de lactosa. Este hecho supone que, tras la
inmovilización, la enzima tiene un centro alostérico donde se une el sustrato al complejo
enzíma-sustrato, llevando a un complejo ESS inactivo en equilibrio con las especies que
lo forman.
La constante cinética k2 tiene una energía de activación (E~/R) en el caso de la
enzima libre de 7239 W frente a 10090 K.! en el caso de la enzima inmovilizada. Por
,
tanto, la actividad de la enzima inmovilizada es más afectada por la temperatura que la de

la enzima libre. La misma tendencia se observa en el caso de la constante de Michaelis y
394
de la constante de inhibición por glucosa, siendo este último caso notable, ya que se pasa
de una energía de activación propia de un proceso fisico en el caso de la enzima libre
(1007 K ) a otra muy superior (11760K’).
La inmovilización, por tanto, afecta de forma importante a los parámetros

cinéticos obtenidos y no se puede decir que la estructura de la enzima inmovilizada sea
más rígida que la de la enzima en disolución, es decir, que la inmovilización lleve a una
menor variación de los parámetros con la temperatura. De hecho, parece que la
inmovilización es un proceso que modifica la estructura de la enzima, probablemente
desplegando su estructura terciaria en parte, haciéndola más susceptible a la influencia de
la temperatura.
En la Tabla 4.37 se comparan los parámetros de la hidrólisis de lactosa con la

enzima libre y la inmovilizada. Se observa que los valores de k2 en los dos casos son muy
similares a 25”C. Sin embargo, a 5”C, la constante cinética para la enzima libre es 3 veces
superior a la obtenida para la enzima inmovilizada; mientras que a 40”C, la constante
cinética para la enzima inmovilizada es un algo mayor que la de la enzima libre. Se
deduce que la inmovilización no ha provocado una disminución de la velocidad de la
etapa catalítica, es decir, la etapa que transcurre una vez el sustrato está unido a la enzima,
aunque ha modificado su comportamiento con la temperatura, haciéndola más susceptible
a los cambios en esta variable.
La proximidad del sólido a la enzima inmovilizada afecta a los demás parámetros,

aumentando la afinidad de la enzima por el sustrato a temperaturas bajas. Se observa que
la inhibición es menor a temperaturas altas y bastante mayor a temperaturas bajas cuando
la enzima está inmovilizada. La glucosa es un inhibidor débil en ambos casos, pues la K,
es de un orden de magnitud superior a la KM. La relación k2/KM sólo tiene sentido aquí
para la enzima libre, pues hay que tener en cuenta la acción inhibidora de la lactosa en el
caso de la enzima inmovilizada. En la enzima libre se observa que la velocidad de la etapa
catalítica, representada por k2, aumenta más rápidamente que la constante de Michaelis,
KM. por lo que, aunque la enzima pierde afinidad por el sustrato al aumentar la
temperatura, la actividad global de la misma aumenta en ese sentido.
395
La eficiencia catalítica en el caso de la enzima dc E. colí libre aumenta con la

temperatura, no como en el caso de la enzima de K. fragílís, que disminuye
marcadamente con el aumento de esa variable. La enzima de E. colí actúa a temperaturas
mayores que la dc Lactozym, como lo demuestra su mayor termoestabilidad respecto a la
enzima de K. fragilís.
Para comparar las actividades de la enzima libre y la enzima inmovilizada, se ha

calculado la actividad conservada tras la inmovilización. Se puede apreciar que la enzima
inmovilizada es mucho menos activa que la enzima libre: su actividad es
aproximadamente el 14% de la de la enzima libre, manteniéndose este porcentaje con la
temperatura. El cálculo, se ha realizado, como en los demás casos, para una concentración
de lactosa inicial de 50 gIL (la que contiene la leche de vaca). Esta concentración afecta
muy apreciablemente a la actividad de la enzima inmovilizada, reduciéndola unas diez
veces a 40<’C frente a la que se obtendría en ausencia de esta inhibicion.
Tabla 4.37.- Comparación de parámetros de la hidrólisis de lactosa con 3-galactosidasa

de E. cotí libre e inmovilizada.
1(C) KM grn KM gI k2/ KM k2/ KM

(libre) (libre) (libre) (mmv.) (mmv.) (mmv.) (mmv.) (libre) (mmv.)
T21W KTTW~ Áy¿i-bv~ T77ilV~ 1,2 10 S3~iiP ~17BV~~
40 7VTÚ~ TTTWV
1 1,3 10’ 1,6 í05 7,6 í& 2,5 102 2,1 10’ 4,1 í03 2,1 ío-~
25 2,5 í& 6,1 í0
1,9 ío~ 1,010.1 1,410.6 5,1í04 1,5 ío-3 4,6 10 2,1 i0~ 1,8 i03
5 4,4 106
k
2 [mol/(mg mm)]; KM [MI; K1 [M]
T(”C) r01/C,~, roW/CFW Actividad conservada

(Cp O M) (Cp O M) ((roW/Cu~)/( roL/CEL). 100)
13,58
40 7,1 l0~’
14,04
25 2,4 1W 3,3 iW
7 14,92
5 4,3 1W 6,5 íO>
rol/CEL y ro~~/Cu~ [mol/(mg mm)] calculadas con Ciac o= 50 g/L
396
4.3.4.3. Comparación del modelo cinético de la hidrólisis de ONPG
El modelo elegido para la hidrólisis de ONPG con las enzimas libre e

inmovilizada es el mismo: Michaelis-Menten con inhibición competitiva tanto por
galactosa como por ONP (ecuaciones [3.82]
y [4.8]).
Las energías de activación de la constante catalítica son similares en ambos casos,

por lo que se mantiene la tendencia de este parámetro con la temperatura después de
inmovilizar la enzima. El término preexponencial de este parámetro es considerablemente
mayor en la enzima libre que en la enzima inmovilizada, lo que implica una desactivación
de la enzima debida a la inmovilización.
La energía de activación de la constante de Michaelis es considerablemente mayor

para la enzima libre, por lo KM varia mucho más con la temperatura en el caso de la
enzima libre. Sucede lo contrario que en el caso de la hidrólisis de lactosa con estas
enzimas; Puede ser que el mecanismo de una reacción y el de otra sean distintos. La
constante de inhibición de la galactosa es muy similar en los dos casos, pero la constante
de inhibición por ONP tiene una energía de activación más baja en el caso de la enzima
inmovilizada
La menor variación de los parámetros cinéticos con la temperatura podría sugerir

que la estructura de la enzima ha aumentado su rigidez. El resultado es el opuesto al
obtenido con lactosa en todos los parámetros.
La Tabla 4.38 muestra los valores de los distintos parámetros para esta reacción
con enzima libre e inmovilizada. Cuando se cotejan los valores de las relaciones k2/KM, se
observa que la tendencia con la temperatura cambia al inmovilizar la enzima: la enzima

inmovilizada es más eficiente a mayor temperatura, al revés que la enzima libre.
Si se comparan los valores de k2, se observa que la enzima libre es más activa que
la enzima inmovilizada: 3 veces más a 40”C, algo más del doble a 25”C y un 50% más a
5”C. La galactosa inhibe más la reacción catalizada por la enzima inmovilizada, al
397
contrario que el o-nitrofenol. La interacción con ONP parece mucho más débil con la
enzima inmovilizada. En la enzima contenida en Lactozym, esta interacción llega a ser
despreciable, pero la inmovilización afecta al efecto del ONP sobre la reacción de
hidrólisis de ONPG en el mismo sentido con las 3-galactosidasas de E. cotí y de K.
fragilís.
Es interesante observar que a una temperatura de 5”C la enzima libre tiene un

valor de la constante KM muy bajo, es decir, tiene una gran afinidad por el sustrato y lo
mismo sucede con el o-nitrofenol. De hecho, son muy parecidos los valores de KM y K,
ONP tanto en la enzima libre como en la inmovilizada. Se podría deducir que la unión del
sustrato a la enzima se lleva a cabo por el ONP en esencia; esto explicaria la inhibición
competitiva por parte del ONP.
El orden de magnitud de las velocidades de reacción por unidad de concentración

de enzimas es similar. La actividad conservada en la enzima inmovilizada respecto a la
enzima libre es menor a la conservada en la reacción de hidrólisis de lactosa. Sin
embargo, la actividad conservada es mayor a mayor temperatura, como en el caso de la
hidrólisis de lactosa. Podría explicarse debido a que la inmovilización favorece un
desplegamiento de la enzima con la temperatura que favorece su actividad.
398
Tabla 4.38.- Comparación de parámetros de la hidrólisis de ONPG con 3-galactosidasa

de E. colí libre e inmovilizada.
T k2 KM K, gal K, ONP KM gal ONP k2/ KM k2/ KNI

(“C) (libre) (libre) (libre) (libre) (mmv.) (mmv.) (mmv.) (mmv.) (libre) (mmv.)
40 W Wft’ ~-- Tñr ~ W T~ W W
4 3,3 iW 5,2 10.2 2,7 io-~ 1,1 IO~ 4,1 IO’~ 3,3 i0~ 9,6 itt 8,1 1W’ 2,7 10~
25 2,7 io
5 4,0 ítt 9,5 Itt 2,1 10.2 7,0 ío~ 2,6 1W 1,8 ío~ 1,4 ítt ~ íU 4,2 ío~ 1,5 í0
k
2 [mol/(mg
mm)]; KM [M]; K, [M]
rO~V/CEW Actividad conservada

TQC) rOL/CFI
(C~0 M) ((roW/CE~V)/(roL/CEL). 100)
(CEO M)
40 TETWC’ 69,8
T~7Ú’~
25 4 8,8 íO’5 39,2
2,0 í~Y
5 4,0 í& 2,3 lo’5 58,9
rol/CEL y ro~/C,
mm)] calculadas con CONI’(-I o0,5 g/L
3~~ [mol/(mg
399
4.4.- COMPARÁCIÓN DE LAS DOS ENZIMAS INMOVILIZADAS
4.4.1.- Actividad y estabilidad
Para la inmovilización de las dos enzimas se ha utilizado el mismo método,

aunque las condiciones de inmovilización sólo se han elegido con Lactozym. Las
condiciones de velocidad de agitación y de carga enzimática del inmovilizado, así como
el tamaño de partícula, han sido iguales para las dos enzimas, asegurándose en ambos
casos que la velocidad del proceso coincidía con la velocidad de la reacción química.
El efecto del pH sobre la actividad de las enzimas se puede observar en la Figura

4.73. En experimentos estándar de hidrólisis de ONPG empleando como tampón BP se
observa que el pH afecta mucho más a la actividad de la enzima de K. Jtagílis, que tiene
una campana de actividad mucho más estrecha que la enzima de E. ccli. El valor del pH
óptimo es algo mayor para esta última enzima que para la enzima contenida en Lactozym
(8 frente a 7). En experimentos estándar de hidrólisis de lactosa en tampón BM, la enzima
de K.fragílís presenta el mismo valor de pH óptimo que para la hidrólisis de ONPG, pero
la enzima de E. cok tiene un pH óptimo mucho más bajo, 6 frente a 8. Mientras que en la
enzima contenida en Lactozym se puede pensar que la interacción enzima-lactosa es
similar a la interacción enzima-ONPG, no sucede lo mismo para la enzima de E. ccli.
Parece que la inmovilización aumenta la carga positiva cii el centro activo de esta enzima,
pues se necesita una concentración relativamente alta de cargas positivas en el medio para
neutralizar dicha carga positiva y permitir la unión enzima-ONPG.
En las Figuras 4.9 y 4.46 se muestra el efecto de añadir ciertos cationes metálicos
al tampón BP sobre la actividad de las enzimas. Se puede observar que dichos iones
afectan poco a la actividad de la enzima de E. ccli mientras que la actividad de Lactozym
disminuye mucho en presencia de Ni y casi se desactiva en presencia de ión cúprico. El
zinc, el hierro ferroso y el aluminio disminuyen también de forma notable la actividad de
esta enzima. Este diferente comportamiento puede deberse a que estos iones podrían
sustituir al magnesio en la enzima de K. fragilis y no en la de E. colí.
400
En la Figura 4.74 se puede observar el efecto del pH sobre la estabilidad de las

enzimas. En ambos casos, un valor de pH de 6-7 es el más adecuado para la estabilidad de
la enzima, ya que valores más ácidos o más básicos provocan una pérdida de actividad
importante en ambos casos. La enzima de E. cotí se ve muy afectada por valores de pH
básicos, lo cual se puede deber a que todavía haya grupos reactivos en superficie o a que
se pierden subunidades de esta enzima a dichos valores de pH. En el caso de Lactozym se

debería más bien a la primera causa, ya que experimentos de desorción variando la
temperatura, el pH de elución o la fuerza salina (añadiendo NaCí hasta 3M) no
provocaron la pérdida de proteína del sólido, y, como se ha podido ver en el apartado
4.2.1, un pH alto de inmovilización implica pérdidas de actividad porque supone una
intensa interacción enzima-soporte que modifica la estructura de la enzima.
La pérdida de actividad durante el almacenamiento del inmovilizado a 6”C y a pH

7,0 (BP) se puede explicar por la presencia de reacciones posteriores enzima-sólido, más
que por desorción, ya que tampoco se apreció proteína en el liquido de almacenamiento.
Lactozym es bastante menos estable con el aumento de temperatura que la enzima

de E. cotí estando las dos enzimas en disolución. Lo mismo sucede a las enzimas
inmovilizadas, como se aprecia en la Figura 4.75. La enzima de E. cotí presenta una
bajada brusca de actividad inicial seguida de una fase en la que se mantiene la actividad,
después ya disminuye rápidamente; esto implica que haya alguna forma intermedia de la
enzima más estable que la nativa. En la enzima contenida en Lactozym la pérdida es
progresiva, así que no se puede sacar la misma conclusión.
401
k Ira
b .! .
a 0.25-
0.20 u
0.20-
0.15
E u
u
015
~Z30.10
o-
‘1
L2 0.05-
e-.
o
0.10
u-
-e. 1
- -e-
e. . , e. -
u e 0.05-
u
o.oo4 •. Kfragllis
& .e. E.coli
¡ ,——— 1 ¡ 0.00
5 6 7 8 9 5 6 7 8 9
pH pH
Figura 4.73.- Efecto del pH en las reacciones de hidrólisis de lactosa (a) y ONPG (b) por
3-galactosidasas de K. fragítís y de E. cotí.
Lactosa: T=400C; C~acor5O gIL; C,=mg/L
ONPG: T=250C; CoNPGo=SO g/L; Cit~0,7 mg/L
402
100-
u u
90-
80 -
.~ 70- e
c
o, $
E 60-
E 50-
0
(t
~ 40-
~
30i
u- tienv~
20 -
•. tienuo24 h (1< fingí/ls)
10 -
* tienvo=24h(Eco/i>
o
5 6 7. 8 9
pH
Figura 4.74.- Estabilidad de las enzimas frente al pH. Actividad residual vs tiempo de
incubación.
0C; CONPCJO=O,5 g/L; CE=0,7 mg/L
Medida de actividad estándar: T~25
110
loo
{ E
Li -, e
90- -u
-u
80 -
a, •c-.
E 70 - O
a, e’
E 60- e
50-
1.-
-D 40 - e - —
-D
30 - u PC fragilís 4~C *
20 - e 1< fragilís 4500
U E.celi4OMC
10- O E. colí4500
o ¡ ¡ ¡ ¡
0 50 100 150 200 250 300

t (mm)
Figura 4.75.- Estabilidad de las enzimas frente a la temperatura. Actividad residual vs

tiempo de incubación.
Medida de actividad estándar: T=250C; CONPG o=0,5 g/L; CF=0,7 mg/L
403
4.4.2.- Modelo cinético de la hidrólisis de lactosa
En la Tabla 4.39 se muestran los modelos cinéticos elegidos para cada enzima con
lactosa como sustrato. Al compararlos, se observa que la enzima de E. cotí es inhibida por
el sustrato y por glucosa y no por galactosa, como ocurre en el caso dc la enzima de
Lactozyín.
En el caso de la 9-galactosidasa de E. cotí, la energia de activación de la constante

cinética k2 es el más del doble que en el caso de Lactozym, pero, como se observa en la
Figura 4.68 a, la actividad de la enzima de Lactozym sobre lactosa es muy superior a la de

la enzima de E. cotí. Hay que tener en cuenta que la enzima de E. colí tiene 4 centros
activos (Jacobson, 1 994), por 2 centros activos de la enzima de K. fragilís (Mahoney,

1978).
Tanto el factor preexponencial como la energía de activación de la constante de

Michaelis de la enzima de E. cotí son el doble que los mismos parámetros de la enzima de
K. fragílís, por lo que parece que su unión con la lactosa puede ser también similar, si se
considera la diferencia en número de centros activos entre una enzima y otra.
Entre las energías de activación de las constantes de inhibición de los productos

hay una gran diferencia. La interacción de la glucosa con la enzima de E’. coti no parece
que sea muy afectada por cambios en la temperatura, lo que no sucede con la interacción
entre la galactosa y la enzima de K. fragítís, que tiene tina energía de activación casi
cuatro veces superior a la de la K, de la glucosa. Se observa, en el caso de la enzima de
Lactozym, una disminución importante de la inhibición según se llega a temperaturas
altas, donde la acción de las enzimas es óptima. La inhibición por glucosa en la hidrólisis
de lactosa por enzima de E. colí varía en ese mismo sentido con la temperatura. En la
enzima de E. coli, la inhibición por sustrato aumenta en el mismo sentido que disminuye
la afinidad de la enzima por el mismo, según aumenta la temperatura. Esta inhibición es
importante porque se hace patente en un intervalo de concentraciones en el que se
encuentra la lactosa de la leche de diferentes especies y la de los sueros ácidos y dulces,
entre 50 y 100 g/L.
404
Tabla 4.39.- Resumen de modelos cinéticos para la reacción de hidrólisis de lactosa con
g-galactosidasas inmovilizadas de K. fragilis y de E. coIl.
Fuente de Modelo Parámetros del modelo

la enzima
K.fragítis Modelo 8 (Tabla 3.2) 5298±890
k, CE~ C~. *2 = 873+2 96—— T
exp
KM Md =exp¿684±724—6688±1589)
Kjgqj = exk22,85±8,88— 8301±2626)

E. cotí Modelo 21 (Tabla 3.4) 122 82+4l4~íO090í 140)
~2 =ex T )
*2 CP~~ C,~.
w v-l-r C + Cgiu - 11220 +7360>
=exi{3277+2226—
~Nf’—I’w K11,~ K,gj¡,
11760 ±8260
Kjgj¡
4 exp¿ 3577+264±-
7,
=ex Py~
(~1259+844+3284±2540)
7, )
4.4.3.- Modelo cinético de la hidrólisis de ONPC
Cuando se comparan los modelos cinéticos que reproducen los datos de las
hidrólisis de ONPG realizadas con cada una de las enzimas, lo primero que llama la
atención es que el ONP no inhibe en el caso de la enzima de Lactozym, mientras que la
enzima de E. colí es inhibida por este producto. En la tabla 4.40 se muestran los modelos
cinéticos seleccionados para las dos enzimas estudiadas. Se observa que, mientras que la
constante catalítica es muy similar tanto en cl término preexponencial como en la energía
de activación en las dos enzimas, la constante de Michaelis y las de inhibición tienen una
energía de activación mucho más baja en el caso de la enzima de E. coil, del orden de la
mitad. Por tanto, en la enzima de E. colí, la temperatura afectará menos a la afinidad de la
enzima por ONPG y la inhibición disminuirá más lentamente con la temperatura. En las
dos enzimas, la galactosa inhibe poco, puesto que las enzimas tienen mucha más afinidad
por el sustrato, que está en competencia con la galactosa. En la enzima de E. cotí, el o-
nitrofenol inhibe de forma competitiva y su inhibición es más potente que la de la
405
galactosa, como se deduce cuando se observa que el término preexponencial es mucho

menor en la constante de inhibición del ONP.
Tabla 4.40.- Resumen de modelos cinéticos para la reacción de hidrólisis de ONPG con
fl-galactosidasas inmovilizadas de K. fragitís y de E. colí.
Fuente de Modelo Parámetros del modelo

la enzima
- K.fragitis Modelo 8 (Tabla 3.2) ( 6952±l270>~
k2 CE~ CONPC *2 expyl5~04±446—------ )
T
m =e61420+716—9229±2242Á
K~1 1+ + CONPG KM 7, )
1< KIgrj)
( 5930±2946
K,~>2 =ex116,50~9 72——- )
63j 534)
E. cotí Modelo 12 (Tabla 3.3) exkl1,25+180~ÉO
k2 Ct4 Coypc
kIí+. + +(%~<, K A!
KM! exl{8
76—--3521±
1 24*372— 1120>
3482±1098>
—______
( 36+025—------------
3372±246))
= exPlk4
7,
406
5.- REACCIÓN-DIFUSIÓN CON
ENZIMA INMOVILIZADA
5.1.- INTRODUCCIÓN
Son muchos los procesos de interés industrial que tienen lugar en sistemas
heterogéneos fluido-sólido, donde el sólido tiene una actividad catalítica. El empleo de
enzimas inmovilizadas se incluye entre estos procesos. En ellos, la reacción química tiene
lugar en la superficie interna del sólido, por lo que, para describir la velocidad global del
proceso, deben analizarse las velocidades a las que ocurren los fenómenos que se suceden en
dicho sistema para que tenga lugar la transformación química. Estos fenómenos son de
carácter fisico: transferencia de materia en la capa estancada cercana al sólido (difusión
externa) y transferencia de materia en los espacios interiores del catalizador (difusión
interna), y de carácter químico: unión del o de los sustratos al centro activo de la enzima
inmovilizada y posterior reacción química que genera los productos, que siguen el camino
contrario hasta llegar al fluido, repitiéndose los fenómenos de transferencia antes citados.
Por una parte, como se verá más adelante, la introducción de un soporte sólido en el
medio y la unión de la enzima a este soporte puede originar efectos de partición y cambios
conformacionales en la enzima que afectan a su cinética intrínseca. El estudio cinético con la
3-galactosidasa de K. fragílís fue abordado y descrito anteriormente en el punto 4 de esta
Memoria. Por otra parte, además del cambio en la cinética intrínseca, la inmovilización en
soportes porosos introduce otros fenómenos de tipo fisico, como son la difusión del sustrato
desde el seno del fluido a la superficie externa del sólido y desde la superficie externa a la
superficie interna del soporte, que es donde se encuentra la gran mayoría de la enzima
inmovilizada y donde se lleva a cabo la conversión del sustrato a los productos. El efecto de
407
Capitulo 5. Reacción-difusión con enzima inmovilizada
la difusión interna puede ser muy importante en la eficacia del proceso y su estudio es el
objeto de este capítulo.
La influencia de la resistencia en la difusión interna del sustrato se debe a que las

enzimas se suelen inmovilizar sobre soportes con una superficie interna mucho mayor que la
externa. Las limitaciones al transporte interno surgen cuando la resistencia que se opone a la
difusión del sustrato dentro de la matriz del soporte es importante. A medida que el sustrato
se difunde hacia el interior del soporte va reaccionando, siendo catalizada la reacción por la
enzima inmovilizada. Si la velocidad de difusión es lenta respecto a la reacción química, la
concentración del sustrato disminuye hacia el interior de la partícula, apareciendo gradientes
internos de reactivo que provocan una disminución de la velocidad global respecto a la que
se obtendría en condiciones de superficie (Swanson y col., 1978; Chen y col., 1980; Guisán
y col., 1981; Tomás y col., 1988; Bódalo y col., 1989).
El soporte que se emplea para inmovilizar la enzima suele ser un sólido poroso con
una compleja estructura interna. Para realizar una descripción rigurosa del mismo, se deberia
descender a nivel microscópico (Mohanty y col., 1982). Resolver el problema supondría un
gran esfuerzo de modelización y de tiempo de cálculo y exigiria disponer de técnicas de
caracterización muy evolucionadas, no siempre disponibles. Por ello, se acepta una
simplificación del problema, que consiste en pasar de tratar el soporte con la enzima
inmovilizada como un medio heterogéneo a considerar el biocatalizador como un medio
pseudo-homogéneo mediante el coeficiente de difusión efectivo del sustrato (Da). Así,
conocidas las propiedades macroscópicas (concentraciones y temperaturas en la fase líquida)
se puede describir el transporte del sustrato y de los productos mediante la ley de Fick, en la
que el flujo del componente i a través de una sección se expresa como el producto de una
fuerza impulsora (gradiente de concentración) por este coeficiente de difusión efectivo, de
acuerdo a:
dc.
[5.11
La evaluación del coeficiente de difusión efectivo se realiza considerando el soporte

como una estructura formada por zonas sólidas y huecas; la transferencia de materia se
408
produce en las zonas huecas. Existen varios mecanismos por los que se produce la difusión
en estas zonas, resultando un coeficiente de transporte local global en la fase hueca, D. El
problema consiste en combinar de forma adecuada las zonas huecas con las regiones sólidas,
para describir la partícula como un conjunto global, a través de D0. Con objeto de
solucionarlo, se han propuesto varios modelos de sólido de distinta complejidad que

introducen un factor de corrección ..f el cual depende tanto del parámetro estructural
característico del modelo como de alguna propiedad macroscópica fácilmente medible,
como la porosidad. Conocidofy estimado el coeficiente local de transporte en la fase hueca,
se calcula el coeficiente de difusión efectivo como:
D~=D.f [5.2]
Se han llevado a cabo numerosos estudios con el objeto de estimar a priori el valor
del parámetro estructural del que depende el valor def (Maxwell, 1892; Bruggemann, 1935;
Meredith y Tobias, 1961; Wakao y Smith, 1962; Schwartz y Weisz, 1962; Masamune y
Smith, 1962; Neale y Nader, 1973; Jeffrey, 1973 y Abbasi y col., 1983). Pero se han
observado diferencias entre los valores de D~ experimentales y estimados de varios órdenes
de magnitud (Brown y col., 1965; Satterfield y Cadle, 1968). En consecuencia, para obtener
un valor fiable, se considera necesario estimar el coeficiente de difusión efectivo y calcularf
a partir del mismo. Una vez conocido f~ se puede calcular el parámetro estructural del
modelo elegido para representar al soporte.
Por otra parte, en los soportes donde se ha inmovilizado la enzima aparece como
característica propia una distribución no uniforme de enzima, fenómeno que se da más
raramente en otro tipo de sólidos inorgánicos con actividad catalítica y que, por tanto, está
poco descrito en la bibliografla. Hay pocos trabajos que desarrollen modelos capaces de
explicar los resultados experimentales y la mayoría de los trabajos publicados son de tipo
teórico (Do y Bailey, 1981; Do y col., 1982; Hossain y Do, 1986, 1988 y 1989; Sharer y col.,
1992). La distribución de la enzima en el soporte es el resultado de las condiciones de
impregnación y de la activación previa del soporte, pero es la naturaleza macromolecular
de las enzimas la razón última de la distribución heterogénea en anillo que se presenta en
los inmovilizados obtenidos habitualmente, con una gran cantidad de enzima cerca de la
superficie (Borchert y Buchholz, 1979). La enzima tiene una sección molecular grande, lo
409
Capítulo 5. Reacción-difusión con enzima inmovilizada
que suele provocar que la difusión de la misma en el soporte, previa a su inmovilización,

esté limitada por el efecto de las paredes del capilar, es decir, hay una difusión
restringida. Sólo con soportes que tengan macroporosidad y controlando las condiciones
de inmovilización se podría obtener una distribución homogénea de enzima con distintas
condiciones experimentales.
Para conocer experimentalmente la distribución de enzima en el soporte se han

utilizado diversas técnicas, como la microscopia óptica con tinción de la proteína con
cromóforos y corte del soporte (Carleysmith y col., 1980; Ampon, 1992), microscopia de
fluorescencia (Lasch y col., 1972, Sernetz y Puchinger, 1976; Lasch y Ktihnau, 1986;
Mullon y col., 1988), microscopia electrónica (Lasch y col., 1975), marcaje con isótopos
de yodo (David y col., 1974) y microscopia de fluorescencia confocal (Pinto y Macias,
1995). Incluso se han desarrollado modelos fisicos que simulan la estructura de un poro
para estudiar el proceso de inmovilización y conocer así la distribución de enzima
empíricamente (Sharer y col., 1992). En pocos estudios se han obtenido distribuciones
cuantitativas de la enzima en el soporte (Lasch y Kfihnau, 1986; Mullon y col., 1988;
Pinto y Macias, 1995).
La velocidad global de la reacción con enzima inmovilizada supone el acople de los

fenómenos de difusión y reacción. Para modelar la difusión es necesario determinar primero
el coeficiente de difusión efectivo del sustrato en el soporte utilizado (en este estudio, sílice-
alúmina KA-3), lo que se realizará utilizando la técnica de cromatografia en lecho fijo,
método empleado también por otros autores (Ching y Chu, 1989; Netrabukkana y col.,
1996). Como el coeficiente de difusión efectivo se obtiene en condiciones diferentes a
aquellas en las que se lleva a cabo la reacción con la enzima inmovilizada, es conveniente
calcular el factor estructural f, lo que, de acuerdo con la ecuación [5.2], supone estimar
primero el coeficiente de difusión local en la zona hueca D, para lo que se analizarán los
mecanismos de difusión de líquidos a través de capilares.
En la reacción química hay que conocer la cinética intrínseca (determinada en el

punto 4 de esta Memoria) y la distribución de la enzima en el soporte, que se determinará
por diversas técnicas instrumentales, como se comenta posteriormente. Finalmente, sc
construirá un modelo matemático que acople los fenómenos anteriores y que sea capaz de
410
Capitulo 5. Reacción-difrsión con enzima inmovilizada
explicar los resultados observados en presencia de reacción química, empleando los

parámetros cinéticos y la distribución de la enzima observados experimentalmente.
5.2.- FENOMENOLOGÍA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

INMOVILIZADAS
Como se comentó en el apartado anterior, una reacción que se lleva a cabo con una
enzima inmovilizada es un proceso complejo, pues existen varios fenómenos que se dan a la
vez y que, por tanto, se acoplan entre sí. La enzima inmovilizada está influenciada por el
microentorno de la superficie del soporte y por su interacción con el medio sólido (efectos de
partición), además de estar su estructura modificada respecto a la de la enzima nativa
(efectos conformacionales). El sustrato ha de difundir hasta la enzima, tanto desde el líquido
hasta la superficie de la partícula (difusión externa), como desde ésta a la superficie interna
de los poros (difusión interna). A continuación, en los próximos apartados, se describirán
estos fenómenos en mayor detalle.
5.2.1.- Efectos de partición y conforinacionales
Estos efectos están relacionados con la naturaleza química del soporte, que puede dar
lugar a la presencia de cargas superficiales o de grupos hidrofóbicos. Se crea entonces una
capa superficial de influencia de dichas cargas o compuestos en la que tanto el pH como la
concentración de iones o de compuestos cargados se ven modificados respecto a los
reinantes en el seno del fluido. Esta capa no es gruesa y su espesor equivale a unos cuantos
diámetros moleculares (10 nm, aproximadamente). Los efectos de partición pueden
aumentar o disminuir la velocidad observada de reacción. Las diferencias en la
concentración del compuesto i entre la superficie (C¡SUP) y el seno del fluido (Ct) se describe
mediante el coeficiente de partición F~:
ci [5.3]
Una consecuencia importante de estos efectos de partición es un posible cambio en

el pH óptimo, con un desplazamiento de la curva pH-actividad hacia un pH más alcalino o
411
más ácido, para soportes con carga negativa o positiva respectivamente. Otra posible
consecuencia es una mayor o menor concentración de producto o sustrato si éstos tienen la
misma carga que la superficie o son hidrofóbicos o hidrofilicos como los grupos que hay en
la superficie. Este último hecho puede modificar el valor aparente de KM, haciéndolo mayor
si hay rechazo o menor si hay atracción del soluto por la superficie (Chaplin y Bucke, 1992).
Los efectos conformacionales se deben a que la inmovilización puede causar

perturbaciones en algún nivel de la estructura de la proteína, reduciendo la eficacia catalítica
de la enzima. Además, la inmovilización puede limitar el acceso del reactivo al centro activo
de la enzima, reduciendo nuevamente la actividad. Esto se traduce en un cambio en las
constantes k1, k.1 y k2 del mecanismo de Michaelis-Menten, de lo que resulta una
modificación en la ecuación cinética con la enzima inmovilizada respecto a la que se obtenía

con la enzima libre (Okos y Harper, 1974; Dekker, 1989; Papayannakos y col., 1993). Los
cambios conforuncionales son más dificiles de valorar y vahan con el tipo de enzima, el
método de inmovilización y el soporte utilizado.
5.2.2.- Limitaciones difusionales externas
Los fenómenos de transferencia de materia son importantes dentro de la catálisis

heterogénea, ya que existen resistencias a la difusión del sustrato desde el seno del fluido
hasta la enzima y a la difusión de los productos de reacción desde la posición de dicha
enzima hasta la disolución que pueden limitar la velocidad global del proceso.
Las limitaciones a dicha transferencia se presentan cuando se forma una capa de

fluido, en la que existe una pequeña mezcla, alrededor de la partícula, originando un
transporte en régimen laminar desde el seno del fluido a la superficie de la panícula,
pudiendo aparecer un gradiente de concentración de reactivos y productos entre la superficie
externa del biocatalizador y el seno del fluido. La importancia relativa de esta resistencia, y,
por tanto, la brusquedad del gradiente, aumenta si la velocidad de la difusión en la película
es menor que la de la reacción catalítica, pudiendo, en este caso, la difusión externa llegar a
ser la etapa controlante (Lee y col., 1979; Chen y col., 1980; Ooshima y Harano, 1983; Park
y col., 1984).
412
El flujo del sustrato desde el seno del fluido a la superficie puede expresarse de
acuerdo a un modelo de gradiente máximo:
NjkKC1~-C) [5.4]
donde el coeficiente de transporte, k5, es función de las propiedades del fluido (viscosidad,
densidad, difusividad), de la geometría y tamaño del soporte, y de la velocidad del fluido

(lineal o de agitación). En el estado estacionario, las velocidades de difusión y reacción
deben ser iguales:
k2c [5.5]
KM~C
Para predecir el control relativo de la etapa de difusión se emplea uno de los

números adimensionales de Damkdhler, que se define como:
Da= [5.6]
k, C
El número de Damkóhler es la relación que hay entre la velocidad máxima de

reacción y la velocidad máxima de transferencia de materia en la película externa. Si Da a
1, se asume que no existen limitaciones difúsionales externas apreciables. Por el contrario,
si Da » 1, entonces existen limitaciones a la difusión externa, más o menos importantes
según el valor de Da (Robinson, 1988).
La difusión en el interior de los poros, por ser un fenómeno frecuentemente más

importante dada su influencia en la velocidad global del proceso, se tratará por separado en
próximos apartados.
413
Capítulos. Reacción-difusión con enzima inmovilizada
5.3. MECANISMOS DE DIFUSIÓN DE LÍQUIDOS A TRAVÉS DE CAPILARES
La zona de huecos del soporte puede asimilarse a una red de capilares de distintos
tamaños y orientación. A continuación se desarrollan, de forma resumida, los mecanismos
por los que una molécula de sustrato en una mezcla líquida se difunde a través de esta red y
las ecuaciones que permiten estimar el coeficiente de difusión local que caracteriza este
mecanismo.
El mecanismo por el que un sustrato se difunde en un capilar lleno de una fase

líquida es habitualmente la difusión molecular. En este tipo de difusión, las diferentes
especies de la mezcla se mueven bajo la influencia de gradientes de composición, siendo
superior el número de choques entre las propias moléculas de la fase fluida que el de
choques de estas con la pared del sólido. Ocurre con sólidos cuyos poros son grandes o en el
caso de que el fluido sea denso, como es el caso de los líquidos. Para una mezcla binada este
mecanismo está caracterizado por el coeficiente de difusión ordinaria ~ cuya estimación
varia según se trate de gases o de líquidos. En gases, el número de correlaciones es elevado
(Reid y col., 1987; Bueno y col., 1979 y 1981). En líquidos hay menos información
disponible: las expresiones propuestas por Stokes-Einstein, Hirschfelder (1954), Witke y
Chang (1955), Hayduck y Minhas (1982). La ecuación siguiente muestra la correlación de
Wilke y Chang (1955):
15T [5.7]
DAR =7,4 10 -s (0M
YBVA
11Y
donde 4) es el factor de asociación del disolvente B (2,6 para el agua), M

3 es el peso
molecular del disolvente, T es la temperatura absoluta (K), I-’n la viscosidad del disolvente y
VA es el volumen molar del trazador. Este volumen molar se calcula por métodos de
contribución de grupos como el de Le Has. La difusividad molecular de varios compuestos
se encuentra tabulada (Perry y Green, 1997; Reid y col., 1987).
En ciertos casos, cuando el diámetro del capilar es similar o algo superior (hasta
diez veces mayor) al diámetro de la molécula que difunde aparecen los denominados
414
efectos restrictivos. Estos efectos se tienen en cuenta en la bibliografia multiplicando el

coeficiente D de la ecuación [5.7] por un factor de corrección F. Este factor tiene un valor
menor que 1 cuando las moléculas son de un radio similar al del propio capilar. El flujo
queda, entonces, definido por:
N. =FD.L vc. [5.8]

¡¡
Conocido el valor del coeficiente de difusión molecular de i en la disolución

(estimándolo, por ejemplo, con la correlación de Wilke y Chang —ecuación [5.7]-), falta
determinar el valor de F. Para ello, se han propuesto correlaciones empíricas y desarrollos
semiempíncos.
Las correlaciones empíricas se han obtenido ajustando datos experimentales, que

proceden en general de experimentos de craqueo de fracciones pesadas de crudo en catali-
zadores de hidrocraqueo (Satterfield, 1970; Baltus y Anderson, 1985; Seo y Massoth, 1985)
en ecuaciones del tipo:
F=F(2)— e(11Á) [5.9]
donde rm es el radio molecular del compuesto i, r~ es el radio de poro y B es un parámetro

que depende del sistema estudiado, con valores en torno a 4,5 en el intervalo 0,1<h<0,4
(Changtong y Massoth, 1983). Otras correlaciones han sido propuestas por Prasher y Ma
(1977), Brenner y Gaydor (1977), Mavrovouniotis y Brenner (1986).
En el desarrollo semiempírico propuesto por Teman (1987) se consideran por

separado los factores que pueden modificar 11$, introduciendo un factor estérico CF1, que
considera la relación entre la sección de la molécula y la del poro, y un factor CF2, que
considera la posible modificación de la viscosidad del líquido debida a la proximidad de la
pared del capilar.
— r» >2
[5.10]
415
g Mm _ 1 [5.11]
Pm+AMw l+PR
1—
Teman (1987) comparó las predicciones de la ecuación [5.12] con los datos
experimentales de varios autores: difusión de compuestos de peso molecular entre 58 y 1143
disueltos en disolventes orgánicos difundiendo en catalizadores de sílice-alúmina
(Satterfield, 1973); difusión de moléculas orgánicas pesadas en ciclohexano y y-alúmina
(Changtong y Massoth, 1983) y difusión de fracciones pesadas de asfaltenos a través de
membranas de mica con tetrahidrofurano como disolvente (Baltus y Anderson, 1983). Los
valores de P para cada caso fueron 16,26, 11,04 y 2,07, respectivamente.
Renkin (1978, 1985) propone para sistemas biológicos una correlación semiem-
pírica que no presenta parámetros ajustables:
F = fl (CF), = [(í fi — 2,1052 + 2,0872~ — 1,7072~ ~0,7262Ó [5.13]

1—0,758»
Este mismo autor, Renkin (1954), propuso anteriormente una correlación más
sencilla, pero de las mismas características, aplicable a soportes porosos:
F = fl(cF)1 =1 — 2,1042 + 2,09» —0,95» [5.14]
Los efectos restrictivos son muy comunes en casos en los que hay reactivos o
productos poliméricos. Este es el caso de algunas enzimas que degradan proteínas
(proteasas) y polisacáridos (amilasas, celulasas, ligninasas) y algunas sintetasas
(polimerasas).
No hay muchos estudios sobre la difusión restringida de sustratos en soportes.

Algunos autores se han centrado en la difusión de monosacáridos y polisacáridos en soportes
cerámicos (Ching y Chu, 1989; Netrabukkana y col., 1996). Otros, como Boyer y Hsu
(1992) han estudiado la difusión restringida de proteínas. Uddin y col. (1990) han estudiado
416
»
la difusión de aminoácidos en gel de sílice, en condiciones en las que los efectos restrictivos
eran importantes. Sobre este tema existe una importante revisión debida a Deen (1987), que
también incluye los estudios, más numerosos, realizados sobre la difusión restringida de
polímeros.
Netrabukkana y col. (1996) han estudiado la difusión de la glucosa y el glucitol en

varios soportes cuyo diámetro de poro oscila entre los 116 y los 7,4 A. En este mismo
sentido, el valor de k (el cociente entre el radio del soluto y el radio del poro) varió entre
0,15 y 1 para la glucosa. Estos autores han aplicado el modelo de Teman (1987) para obtener
el factor de corrección F. El factor de corrección calculado para un valor de 2. de 0,08 y
glucosa como soluto fue de 0,3; para este mismo soluto y un valor de 2. de 1, F tuvo un valor
de 4.101 En la Figura 5.1 se muestran sus resultados experimentales junto con la predicción
según la ecuación de Teman (1987) y según la ecuación de Renkin (1954). En el soporte de
menor diámetro de poro, la difusión ya no está controlada por la difusión molecular, porque
el número de choques de la molécula con la pared es tan o más alto que el número de
choques con las moléculas de fluido portador, en este caso agua. El mecanismo que controla
la difusión en este caso se llama difusión configuracional.
Cuando se inmoviliza enzima en el soporte, si éste tiene microporos muy pequeños,

puede suceder que la enzima bloquee los microporos o los obstruya parcialmente,
dificultando la difusión del sustrato en los mismos.
417
0.1
0.01
LL
1E-3
1 E-4
1 E-5
0.0 0.2 0.4 0.8 0.8 1.0
2. (d5Id~)
Figura 5.1.- Factor de corrección frente a la relación de diámetros: resultados

de Netrabukkana y col. (1996).
5.4. DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DEL COEFICIENTE DE DIFUSIÓN

EFECTIVO
Una primera clasificación de los métodos de determinación de este coeficiente

distingue entre métodos de medida de D~ en ausencia de reacción química (condiciones
inertes) y en presencia de reacción química. En el caso de gases, que es donde mayor
número de estudios se ha realizado, parece que hay controversia respecto a los valores de D~
obtenidos por estos dos métodos (Park y Kim, 1984 a y b; García-Ochoa y Santos, 1994 y
1995).
5.4.1. Determinación de O, en condiciones inertes
Las técnicas utilizadas en ausencia de reacción química, o métodos fisicos de

medida, se clasifican, a su vez, en métodos estáticos y métodos dinámicos. En los primeros,
418
la medida se realiza en condiciones estacionarias, en los segundos, en estado no estacionario.

Los métodos más utilizados son, dentro de los primeros, la célula de Wicke-Kallenbach
según la desarrollaron sus autores en 1941 (Figura 5.2), y, dentro de los segundos, la
cromatografla en columna y la célula de Wicke-Kallenbach en régimen no estacionario. En
el caso de que el portador sea una fase líquida, además del método cromatográfico (Ching y
Chu, 1989; Boyer y Hsu, 1992; Netrabukkana y col, 1996), se ha utilizado otra técnica no
estacionaria que consiste en la aplicación de técnicas de estímulo-respuesta en escalón en un
reactor tanque agitado tipo cesta, determinando la evolución de la concentración de trazador
en la disolución hasta alcanzar el equilibrio (Hossain y Do, 1987; Oyaas y col., 1995).
La medida en estado estacionario con la célula de Wicke-Kallenbach esquematizada

en la Figura 5.2 fue la primera técnica de medida de D~ que se utilizó, aunque se ha aplicado
sólo a catalizadores inorgánicos y en fase gas. Esta célula consiste en dos cámaras separadas
por el sólido poroso a estudiar. En cada cámara se introduce un gas, difundiendo éste hacia
la otra cámara. Las dos cámaras están a la misma presión y temperatura. Al alcanzarse el
estado estacionario, se determinan las concentraciones de los gases A y B en las corrientes
de salida. Se utilizan comúnmente detectores de conductividad térmica. A partir de la
ecuación integrada de flujo a través de la partícula, propuesta en el método (Wakao y Smith,
1962) se calcula el coeficiente de difusión efectivo.
Este método da lugar a valores de D~ para moléculas gaseosas que algunos autores
consideran elevados (McGreavy y Siddiqui, 1980), sobre todo en el caso de soportes
bimodales (Burghardt y col., 1988), porque no se tiene en cuenta el transporte en los
microporos, que se comportan como zonas de flujo estancado. Comparando los valores de
D~ de varios autores (Santos, 1992) se observa que el cociente De dinÉntico ¡De estÉtico es casi
siempre menor que 1, llegando a ser tan bajo como 0,15. Esta técnica ha sido poco utilizada
en los últimos años. En cualquier caso, no existen estudios con solutos en fase líquida.
419
Figura 5.2.- Esquema de la célula de Wicke-Kallenbach (1941)
En las medidas por métodos fisicos en estado no estacionario o dinámicos, se

emplean técnicas de estímulo-respuesta. Se introduce un trazador en la corriente fluida que
contacta con el sólido problema y se analiza la concentración del componente en la corriente
de salida. En los últimos veinte afios se ha incrementado el uso del método de cromato~zrafia
en columna (Figura 2.9), dado que el procedimiento experimental es sencillo y los resultados
obtenidos fiables. El método de interpretación de los datos experimentales obtenidos por esta
técnica se analiza a continuación.
El flujo en la columna debe ser isobaro e isotermo, en el caso de gases, e isotermo en

el caso de líquidos y se utiliza el modelo de Kubin (1965) y Kucera (1965) para describir el
transporte de materia en el interior de la partículay a través del lecho.
Este modelo considera los fenómenos de adsorción, difusión interna y externa en la

partícula y dispersión axial en el lecho. Estos fenómenos están caracterizados por los
coeficientes Ka, D~, k1 y Dax, respectivamente, suponiendo que la adsorción sigue una
cinética de primer orden.
420
Al aplicar la transformada de Laplace a las ecuaciones diferenciales del modelo de

Kubin y Kucera se obtienen las expresiones de los momentos de la curva de concentración
de trazador a la salida de la colunma, Cg(t), en función de los coeficientes anteriores y de
otras variables: porosidad del lecho, porosidad de la partícula, radio de la partícula y longitud
de la columna. Las expresiones para los momentos primero y segundo (le la curva C(t),
asumiendo equilibrio en los procesos de adsorción y de desorción, son:
ftc(odt L
oJC(t)dt u.
2 _ 0
cr -
fCOidt (5.16]
2~D L 2 ‘•R L 5>

; •(í-~-s0) 2
±—.
(l—L).e
8L ~u .Ó±K){-i—± ¡
u, 15 1 yD0 k1R,,)
donde L es la longitud de la columna, u~ la velocidad intersticial y 5<) una función de la

porosidad de lecho, de la constante de adsorción y de la porosidad de partícula de acuerdo a
la siguiente expresión:
El término tm de la ecuación [5.15] corresponde al tiempo muerto que pueda

deberse a los espacios vacíos que haya en el sistema antes de la columna. Como el
trazador se introduce en impulso, también se ha de considerar el tiempo de retraso o
tiempo que dura la inyección del impulso. Este tiempo de retraso suele ser de uno o dos
segundos. El tiempo muerto prácticamente es nulo en la mayoría de los sistemas de
cromatografia modernos. La altura equivalente de plato teórico se puede escribir como:
421
HEPT- cr2L [5.18]

‘u,
por lo que, a] sustituir en esta ecuación los dos momentos calculados con las ecuaciones
[5.15] y [5.16], resulta la siguiente ecuación:
2 ~L
1-IEPT = 2D
u,
+
15 ( í
+
kf R
5
Y [5.19]
L ~Y 1,
La dispersión axial suele definirsecomo (Wakao y Kaguei, 1 982):
=b1 +b2u [5.20]
Con lo que la relación entre la altura equivalente de plato teórico HEPT y la

velocidad intersticial u~ puede expresarse por una ecuación del tipo Van Deemter (Van
Deemter y col., 1956):
HEPT = + 8±Gu. [5.21]

u.
donde el coeficiente G de la ecuación [5.21] corresponde a:
2 ~L R
5
+ [5.22]
kfR,,
En el caso de líquidos, el primer sumando de la ecuación [5.21] es despreciable y el

segundo sumando depende de la dispersión axial en el lecho.
En el cálculo de D~ por la técnica cromatográfica hay vados trabajos que se

distinguen porque en unos se utiliza la ecuación del segundo momento y en otros la de la
curva HEPT vs LI,. También difieren en el número de fenómenos que consideran (llorta,
422
1990). Al parecer, los valores más fiables del coeficiente de difusión efectivo se obtienen en
aquellas condiciones donde la difusión interna es la etapa limitante (Horta, 1990; Santos,
1992). Estas condiciones corresponden a:
- Tamaños de partícula grandes, que aumentan al máximo la resistencia debida a la

difusión interna y hacen más fiable la determinación del coeficiente de difusión efectivo.
- Elevados valores de la velocidad intersticial, donde la curva HEPT es lineal con la
velocidad intersticial. En esta región, la dispersión axial es pequeña y no tiene mucha
importancia. El fenómeno controlante es la difusión interna.
Con el valor de la pendiente G, obtenido del tramo lineal de HEPT vs. u~, se puede
calcular De. Para ello, hay que estimar primero el coeficiente de transporte en la capa de
fluido estancado que rodea al sólido, kf. Existen varias correlaciones para estimarlo:
- Wakao y col. (1958) propusieron:
2k1R~ 33 si Re~’<l 00 [5.23]

2,00 + 1,45 Re fi Sc’
- Wilson y Geankoplis (1966), para lechos fijos a valores muy bajos del número de Reynolds
(de O a 5), lo que suele suceder con líquidos, proponen:
1 09u (tAj
=‘ I~Re,,Sc)’3 [5.24]
e
fi
Cuando no es posible obtener G sólo con el tramo lineal de HEPT vs. u~, hay que
estimar también el coeficiente de dispersión axial (Dax). Este coeficiente se puede estimar
por la correlación de Wen y Fan (1975):
ULdP _ 0,20 0.011

Pe= — + Re ~ [5.25]
CL
En el caso de líquidos, el número de Peclet es independiente de la velocidad

intersticial cuando sus valores son bajos, debido a que el número de Reynolds es bajo y el
423
segundo término de la correlación de Wen y Fan es mucho menor que el primero. La curva
HEPT vs u1 toma una forma lineal con ordenada en el origen 4R~/Pe, es decir, 1 ORpEL,y
pendiente G.
5.4.2. Determinación de D0 en presencia de reacción química
La determinación del coeficiente de difusión efectivo en presencia de reacción

química se realiza, normalmente, a partir del factor de efectividad, t~ (García-Ochoa y
Santos, 1995). Este factor fue propuesto por primera vez por Thiele (1939) y definido
como cl cociente entre la velocidad de reacción observada y la velocidad de reacción que
se obtendría en las condiciones de concentración y temperatura de la superficie externa
del catalizador. Cuanto mayor sea la resistencia a la difusión interna, el gradiente de
concentración de sustrato en el interior del soporte será más pronunciado y mayores serán las
diferencias entre la velocidad observada (promedio de las velocidades en el interior de la
partícula) y la esperada en condiciones de superficie, lo que redundará en un valor menor del
factor de efectividad.
El valor del factor de efectividad (~) puede obtenerse de modo experimental si se

conoce la velocidad observada y la cinética intrínseca o formal. También puede predecirse sí
se conoce la cinética intrínseca y el perfil de sustrato en el interior de la partícula. La
determinación de este perfil supone resolver la ecuación de conservación del sustrato en el
interior del soporte, que puede escribirse igualando los términos de difusión y reacción, de
acuerdo a la siguiente expresíon:
d’C’
2 a-¡dC
r dr
D~1 dr - + S]=rwepp [5.26]
siendo: a = 1, 2, 3 para geometría de placa, cilindro o esfera, respectivamente, r la

coordenada característica de esa geometría, r~ la velocidad de reacción referida a la masa de
soporte y Pp la densidad de partícula del soporte. Las condiciones límites dc la ecuación
[5.26] son:
424
r=O.. dc~0
dr
[5.27]
r=R,.t CcC
Si no existe gradiente de concentraciones en la capa de líquido alrededor de la

partícula, es decir, si la difusión externa es rápida respecto a los procesos que existen dentro
de la particula, entonces:
r= .x c~ = cf [5.28]
La solución analítica de la ecuación [5.26] sólo es posible cuando la ecuación

cinética de la velocidad sigue un modelo potencial de orden uno o cero. Por lo tanto, en el
caso general, los perfiles C,’(x) se obtienen resolviendo numéricamente la ecuación [5.26],
normalmente porincrementos finitos o por colocación ortogonal.
Suponiendo que r~ puede representarse mediante la ecuación de Michaelis-Menten

con inhibición competitiva por un producto, donde aparece la concentración de enzima
inmovilizada ~ y que la geometría es esférica, la ecuación [5.26] puede escribirse en
forma adimensional de la siguiente forma:
23 2d8 _ R 2
d r~P~k
2CL~ JE
[5.29]
C
d~’ xdx KMD~
1± .8,, +
siendo las condiciones de contorno, en ausencia de control por parte de la difusión externa:
e
x=O ..
dx
[5.30]
x1.t Jj~l
425
donde las variables adimensionales se han definido como:
J-c~ [5.31]
.s. ~
3’, [5.32]
E
Cs
[5.33]
E
r [5.34]
y la relación entre 3p y 6~ es la siguiente:
Ds (l—J~) [5.35]
c~ D,,
siendo Des y ~ los coeficientes de difusión efectivos del sustrato y del producto y C 1 y
5
CF> las concentraciones de sustrato y producto en el seno de la disolución. El módulo de
Thiele, h, puede definirse en este caso como:
k, CEWPP
KMD, [5.36]
Entonces, sustituyendo h en la ecuación [5.29],resulta:

3 .3
d23~ ~2d 8ski £

[5.37]
d~2 xdx
Cí±?7 .3~+~j’ .CSjj
El módulo de Thiele representa la resistencia relativa de la etapa de difusión interna

y la reacción química, aumentando el control de la difusión cuanto mayor sea el valor de h y
viceversa.
426
La velocidad de reacción observada es el promedio de las velocidades de reacción en

el interior de la partícula, por tanto, es una función de la difusividad efectiva del sustrato, de
la concentración de reactivo y productos en el fluido y de la ecuación cinética de la reacción
catalizada por la enzima inmovilizada. El factor de efectividad,1l, es el cociente entre la
velocidad de reacción observada y la que se obtendría en condiciones de superficie, por lo
que puede expresarse como:
3. f ~E .~
CF ~ x2dx
II
+ cÁÚF.ój)
siendo 6p función de 6s según la ecuación [5.35].
La determinación de De en presencia de reacción química se realizó mediante las

siguientes etapas:
• Se llevaron a cabo experimentos a varios tamaños de partícula y se deternúnó la velo-

cidad de reacción observada en unas ciertas condiciones de concentración y
temperatura en la disolución. Se utilizó una velocidad de agitación tal que la difusión
externa fuera rápida y no controlara la velocidad del proceso.
• Conocida la velocidad observada de la reacción se calcula la velocidad esperada en las

condiciones de concentración y temperatura de superficie que, en este caso, coinciden
con las de la disolución. En este cálculo se considera el modelo cinético que sea
aplicable de los obtenidos en el punto 4 de esta Memoria.
• Se calculan dos factores de efectividad experimentales: flcxpl y tlcxp2. El primer factor

de efectividad experimental (flexpl) es el cociente entre la velocidad observada
utilizando partículas de un determinado tamaño y la observada empleando paniculas

del tamaño menor, en las que se considera que no afecta la difusión interna a la
427
velocidad de transformación del sustrato (según se demostró en el punto 4.2.2.5). El

segundo factor de efectividad experimental (flexp2) es el cociente entre la velocidad
observada con cualquier tamaño de partícula y la velocidad calculada en condiciones

de superficie aplicando el modelo cinético seleccionado para la hidrólisis de lactosa o
de ONPG, según el caso, con la enzima de K. fragilis inmovilizada.
• Para varios valores de h, conocidas la distribución de enzima y la cinética intrínseca,

junto con los valores de las concentraciones de sustrato y productos en la disolución y
la temperatura de la misma, se calcula el factor de efectividad mediante la ecuación
una vez que se han calculado los perfiles resolviendo el balance de la ecuación
[5.38],
[5.37] con las correspondientes condiciones de contorno. Si se representan los valores
de ~ calculados frente a valores del módulo de Thiele, se obtienen gráficas como la
representada en la Figura 5.3.
En la Figura 5.3 también se representan los valores experimentales del factor de

efectividad obtenido a cada diámetro de partícula. Para la distribución de enzima
correspondiente a un diámetro de partícula, se lee, a cada ~ experimental, el valor del
módulo de Thiele que le corresponde. El coeficiente D0 se calcula teniendo en cuenta la
ecuación [5.36] como:
2,, k
De = R 2 CEwPP
KM [5.39]
Por otra parte, si se introduce el O. obtenido en las medidas en condiciones

inertes, se puede situar un punto ~ h) en la gráfica de la Figura 5.3 y analizar si este
punto corresponde a la distribución de enzima observada a ese diámetro de partícula.
428
SM.
)b ~3 y
y
clave Factor de efectividad <~í ‘~ 2
• experimental (1> y \
• experimental (2> 1 ~
~.~
9edil 1 calculado
0.1 — —perfil 2 calculado
• . . . perfil 3 calculado
— . —~er1il 4 calculado
1 10 100
h
Figura 5.3.- Variación del factor de efectividad con el módulo de Thiele.
5.5. REPRESENTACIÓN DE LA ESTRUCTURA POROSA
La compleja estructura de huecos y sólido que constituye el soporte se describe

idealmente asimilándola a un modelo, que intenta representarla y que permite describir el
transporte en su interior mediante un parametro estructural que caracteriza el sólido poroso.
Los modelos de sólido poroso se pueden clasificar, por orden de complejidad, en tres
grupos: modelos basados en capilares, modelos de grano y modelos de desorden estadístico.
1. Modelos basados en capilares
De los modelos basados en capilares, el más sencillo es el modelo de poros paralelos

propuesto por Wheeler (1951, 1955). Este modelo considera que los poros son cilindros
ideales, de tamaño uniforme, sin intersecciones entre ellos, formando con la superficie
externa un ángulo de 45O~ Los parámetros necesarios para caracterizar el sólido son: la
429
superficie específica, 5g. el volumen de poros, V~, y la porosidad de la partícula, sr,. El factor
estructuralf necesario para determinar el coeficiente de difusión efectivo, se calcula como:
e
[5.40]
y
En este modelo, el parámetro estructural es r, la tortuosidad. Representa el factor de
corrección por el que hay que multiplicar la longitud teórica de poro para tener en cuenta la
no idealidad de la estructura del sólido. El valor de t varía, en fase gaseosa, entre 1,41 y 14
y, en fase líquida, se han obtenidos valores entre 2 y 4 para monosacáridos y polisacáridos
en agua (Ching y Chu, 1989), entre 5 y 6 para ciclohexano en benceno (Lee y Ruthven,
1977). Estos valores de la tortuosidad para soportes en líquidos se han obtenido con soportes
con mesoporos y microporos, pues apenas existen valores de este parámetro estructural para
soportes con macroporos.
Otro modelo basado en capilares muy utilizado es el modelo de poros aleatorios

propuesto por Scott y Dullien (1962) y desarrollado por Johnson y Stewart (1965). La
principal diferencia con el anterior es que se introduce una distribución de radio de poros, en
lugar de un radio promedio. Se calcula el factor de corrección según la ecuación [5.40],y la
tortuosidad es el parámetro estructural. Este modelo, junto con el anterior, se esquematiza
en la Figura 5.4.
II. Modelos de grano
Los modelos de grano se basan en considerar el sólido como un conglomerado de

granos, con microporosidad o sin ella; en el caso de un catalizador unimodal, se consideran
granos no porosos. Hay numerosas correlaciones propuestas en la literatura para determinar
el valor def en función de la porosidad de la partícula (Silveston y Gianetto, 1986). Estos
modelos se aplican fundamentalmente en reacciones sólido-fluido donde el sólido es un
reactivo.
430
Capítulos. Reacción-difusión con enzima inmovilizada
111. Modelos de desorden estadístico
En estos modelos, la matriz porosa se considera como un ensamblado estadístico de

zonas huecas y sólidas, a las que se les aplican los conceptos de percolación (Broadbent,
1957). Si el desorden del sólido es muy elevado, puede utilizarse un tipo de red denominado
estructura de Bethe, introducida por Domb (1960), mediante la cual se han descrito
numerosos procesos de interés que transcurren en sistemas constituidos por varias fases y
que presentan alto grado de desorden (Mohanty y col., 1982). En la Figura 5.4 se aprecia la
disposición de los poros en una red tipo Bethe.
Los modelos de grano y desorden estadístico se emplean más cuando la estructura

del sólido poroso cambia con el tiempo de reacción (reacciones gas-sólido no catalíticas,
desactivación del catalizador por deposición, etc).
En el caso de enzimas inmovilizadas parece suficiente emplear modelos de poros, ya

que no se consideran modificaciones de la estructura porosa del soporte con el tiempo. El
parámetro de ajuste es, por tanto, la tortuosidad, que, en principio, dependerá sólo del
soporte utilizado y no de las condiciones de reacción.
El parámetro f, que se calcula como cociente entre D (estimado) y De (obtenido

experimentalmente en unas determinadas condiciones) permite determinar t y predecir D~ en
otras condiciones, una vez estimado el coeficiente de difusión local que corresponda a esas
nuevas condiciones.
431
POROS PARALELOS POROS ALEATORIOS
Figura 5.4.- Modelos basados en capilares
5.6. DETERMINACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DE ENZIMA EN EL SOPORTE
Como ya se ha indicado, la distribución de enzima en el soporte suele ser no

uniforme y esta distribución afecta al factor de efectividad, como se deduce de la
ecuación [5.38]. Una distribución no uniforme de enzima o de otro catalizador, si es en
“coraza”, implica que el trayecto medio a recorrer por reactivos y productos es menor,
con lo que la influencia de la difusión en la velocidad global disminuye (Corbett y Luss,
1974; Borchert y Buchholz, 1984).
En los primeros estudios de distribución de enzimas en los soportes, las enzimas

que se estudiaban se inmovilizaban en partículas de gel y luego se teñían y se cortaban,
estudiando su distribución cualitativa (Lasch y col., 1975). Posteriormente, se utilizaron
datos recogidos por métodos microfluorimétricos tratados matemáticamente (Lasch y col.,
1986; Mullon y col., 1988). Los datos que se obtienen corresponden a la señal integrada
emitida por la enzima inmovilizada en secciones circulares o en secciones tubulares de la
panícula. Estos datos son tratados matemáticamente para calcular densidades de enzima
432
locales. Se considera la señal recogida f(x) como una función integral de la señal emitida
en un punto de radio r:
f(x) SSP(P)ds [5.41]
donde ds es el área del segmento esférico del que se recoge la señal. Haciendo un cambio
de variable a coordenadas polares:
f(x) = 2rfp(r) rdr [5.42]
Derivando esta integral paramétrica respecto al radio y se llega a:
f(x)—2np(x)x [5.43]
por lo que, considerando la simetría radial, se puede despejar la señal a radio r como:
1 7(x
p(x) = — — [5.44]
En esta última ecuación, f(x) es la intensidad de la fluorescencia emitida por la

proteína marcada. Si se aproxima dicha intensidad como un cociente entre la variación de
fluorescencia y la variación del radio y se consideran incrementos pequeños del radio, la
ecuación [5.44]se transforma en:
¡Nf [5.45]
2,rAx x
En esta última ecuación, Af puede ser sustituido como la diferencia de señales AS.
Esta ecuación indica que la densidad enzimática es proporcional a la señal de
fluorescencia recogida.
433
)
Mullon y col. (1988) utilizan una aproximación más sencilla que Lasch y col.
(1975), pues cortan las partículas de gel antes de tomar las micrografias con un
microscopio de fluorescencia. En este estudio, las partículas de gel con proteína BSA
marcada con el fluoróforo isotiocianato de fluoresceina (FITC) se embebieron en moldes
de gelatina, se congelaron dichos moldes y se prepararon por criomícrotomía varias
muestras de 12 im de espesor.
Las imágenes obtenidas con un microscopio dotado de cámara de vídeo eran

digitalizadas para su tratamiento por un programa de ordenador. La luminosidad de cada
bit de una imagen tenía un valor determinado de luminosidad, directamente proporcional
a la intensidad de luz emitida por el FJTC excitado. En los programas de tratamiento de
imágenes, la luminosidad se mide en una escala de O a 256, de menos a más luminosidad.
Cada imagen fue tratada para determinar la concentración de fluoróforo a cada

valor del radio. Para ello, determinado el centro de la partícula, se trazan radios a varios
valores del ángulo O y se marcan en cada radio varios puntos equidistantes. De esta
forma, se adquieren valores de luminosidad en varios puntos para que el muestreo sea
representativo del gradiente de luminosidad que hay en la partícula.
Una vez se tienen suficientes valores de luminosidad en puntos localizados de la

partícula se procede a determinar la concentración de FITC en esos puntos. Para ello, se
considera que la luminosidad y la intensidad de fluorescencia son lo mismo. La relación
entre la intensidad de fluorescencia y la concentración de FITC es:
11. río ~ (i — e23<í3¿zd) [5.46]
donde Ip es la intensidad de fluorescencia, 1o es la energía de excitación, 4 es la constante

de eficiencia cuántica, e es la concentración molar de FITC, s es el coeficiente de
extinción molar [L/(mol cm)] y d es el espesor de medio que contiene el fluoróforo [cm].
Al ser las muestras de un espesor muy pequeño (1W cm), la ecuación [5.46] se puede
simplificar a:
434
1,. =2,30310q5ccd [5.47]
Esta última ecuación predice que, para muestras de espesor muy pequeño, la
intensidad de fluorescencia emitida es directamente proporcional a la concentración de
fluoróforo. Estos autores demuestran, midiendo la señal obtenida en varios inmovilizados
con concentraciones conocidas de FITC-BSA, que se cumple lo predicho por la ecuación
[5.41], al menos hasta concentraciones de 45 mg/g del complejo FITC-BSA.
Pinto y Macias (1995) introducen una nueva técnica para determinar la

distribución de enzima. Estos autores han utilizado un microscopio confocal para obtener
imágenes de geles de poliacrilamida en los que se ha inmovilizado lipooxigenasa marcada
con FITC. La microscopia confocal permite medir la intensidad de fluorescencia que
emiten las moléculas de fluoróforo que hay en un plano perpendicular al rayo láser de
excitación, es decir, realiza un corte óptico de la muestra, eliminando la fluorescencia
emitida por cualquier zona de la muestra que no sea el plano enfocado. Por tanto, se evita
la manipulación de la muestra, pero la técnica exige que la muestra sea transparente, lo
que cumplen la mayoría de los geles y algunos soportes inorgánicos.
Las imágenes obtenidas pueden ser tratadas de forma muy similar a como las
trataron Mullon y col.(1988) Existen, aparte del programa de tratamiento de imágenes del
microscopio confocal, otros programas en el mercado que son adecuados para tratar las
imágenes, por ejemplo, el Photoshop de Adobe. Evidentemente, el espesor del corte
óptico realizado por el microscopio se reduce a muy pocos micrómetros y, por tanto, es
aplicable la ecuación [5.42], es decir, que la intensidad de fluorescencia o la luminosidad
son directamente proporcionales a la concentración local de enzima marcada. El método
experimental para la obtención de los perfiles de enzima se comenta en el apartado 2.3.3.
435
5.7. RESULTADOS EXPERIMENTALES
En este apartado se determina, en primer lugar, la distribución de la proteína

inmovilizada sobre partículas de sílice-alúmina KA-3 de distintos tamaños, obteniéndose
una ecuación que liga la concentración de enzima con el radio adimensional,
describiendo, por tanto, la distribución presente en cada uno de los tamaños de partícula.
Posteriormente, se ha calculado el coeficiente de difusión efectivo en la sílice-

alúmina en ausencia de reacción química empleando el método cromatográfico. Se han
utilizado los dos sustratos usados como sustratos de las [3-galactosidadas: lactosa y
ONPG, como trazadores y utilizando columnas con distinto tamaño de partícula. Se ha
calculado D~, el factor de corrección, f, y la tortuosidad, u, para cada caso.
Por otra parte, se han llevado a cabo varios experimentos de hidrólisis de ONPG y
de lactosa con inmovilizados de distinto tamaño de partícula. Los valores experimentales
del factor de efectividad para cada tamaño de partícula se han calculado como el cociente
entre la velocidad de reacción obtenida para cada tamaño de partícula y la velocidad de
reacción observada en el experimento realizado las partículas de menor tamaño o bien,
con la velocidad predicha por los modelos cinéticos obtenidos para cada reacción de
hidrólisis en el apartado 4.2.3. Introduciendo en el balance de la ecuación [5.37] las
ecuaciones que se han obtenido para cada distribución de enzima, y resolviendo esta
ecuación por colocación ortogonal, se obtienen valores del factor de efectividad calculado
para cada distribución de enzima y para cada tamaño de partícula a través de la ecuación
[5.38].
Finalmente, se han comparado los valores de u calculados con los valores

experimentales de este parámetro obtenidos con los experimentos de hidrólisis, así como
los valores del coeficiente de difusión efectiva obtenidos en ausencia y en presencia de
reacción química, analizando la influencia de la distribución de enzima.
436
5.7.1. Distribución de la enzima
Para medir la distribución de la enzima, se ha utilizado la técnica descrita en el

apartado 2.3.3. La enzima, disuelta en tampón BP, se ha marcado con isotiocianato de
fluoresceina (FITC); después, se ha eliminado por cromatografia en gel el FITC no
reaccionado. La enzima marcada se ha inmovilizado en el soporte elegido utilizando el
método descrito en el apartado 2.3.4.
Para la observación de la distribución de enzima por microscopia confocal el

soporte ha de ser transparente o hay que seccionarlo para observar la superficie del corte.
Con objeto de determinar la distribución de enzima en partículas pequeñas, de diámetro
de partícula entre 0,1 y 0,2 mm, se ha utilizado un soporte similar a la sílice-alúmina KA-
3, como es el vidrio de poro controlado (CPG). Este soporte es transparente, por lo que
permite los cortes ópticos realizados por el láser de excitación del microscopio y se evita
tener que hacer una preparación laboriosa, o imposible, de la muestra (dado el pequeño
tamaño de la partícula). Como la enzima se inmoviliza, por su tamaño, en los macroporos
del soporte KA-3, no penetrando en los microporos, el vidrio utilizado presenta
macroporosidad exclusivamente, con diámetro de poro medio de 2000 A. Para
inmovilizar la enzima en el CPG se ha utilizado el mismo procedi-miento que con la
sílice-alúmina. La distribución de enzima en partículas de KA-3 de mayor tamaño se ha
determinado cortando ecuatorialmente las partículas de KA-3 con enzima inmovilizada
que había sido previamente marcada con FITC y observando al microscopio confocal la
distribución de fluorescencia en la sección obtenida.
En el caso de la partícula de 5 mm de diámetro se ha observado con ayuda de una

lupa, que no se activa toda la partícula cuando se hacen reaccionar los grupos amino
introducidos en el soporte por silanización con glutaraldehido. Esta reacción hace que
cambie de color el soporte, de blanco a pardo (en el caso del KA-3) o a magenta (en el
caso del CPG). Al cortar una partícula de KA-3 de Smm, se observa que sólo una corteza
superficial presenta coloración, mientras que el interior permanece blanco. La
observación por lupa permite establecer que el espesor de penetración del glutaraldehido,
que no es uniforme, alcanza un máximo de 0,4 mm. Esta activación en capa se produce
aunque se varíe el tiempo de limpieza del soporte, la concentración de silano utilizada, el
437
tiempo de silanización, la concentración de glutaraldehido o el tiempo de activación con

dicho agente. En la Figura 5.5 se presenta una fotografia del corte ecuatorial de una
partícula de KA-3 de 5 mm de diámetro.
En las Figuras 5.6 a 5.8 se presentan micrografias obtenidas por microscopia

confocal. Se puede observar la fluorescencia verde emitida por el FITC fijado a las
proteínas inmovilizadas. Es interesante darse cuenta de que la distribución de enzima no
es uniforme ni homogénea en la partícula, tan sólo la enzima tiende a acumularse cerca de
la superficie del soporte al aumentar el tamaño de la partícula estudiada, lo que indica que
la difusión interna de la enzima determina la velocidad de inmovilización en las partículas
de mayor tamaño.
Para cuantificar el perfil de enzima dentro de la partícula se necesita un programa

de tratamiento de imágenes, bien el que se implementa en el ordenador de control del
microscopio confocal, bien otro cualquiera de los presentes en el mercado informático. En
este trabajo se ha hecho uso del programa Photoshop 5.0, de Adobe, para el tratamiento
de imágenes. Para dicho tratamiento, se puede seguir el procedimiento de Mullon y col.
(1988), pero tal procedimiento exige el muestreo individual de la fluorescencia de gran
cantidad de puntos a lo largo de distintos radios para que la medida sea representativa.
Otro procedimiento posible, que es el utilizado en este trabajo, se basa en el análisis del
histograma correspondiente a la imagen estudiada.
Como la fluorescencia emitida por el FITC es verde, la imagen se estudia en el

modo de color RVA (Rojo-Verde-Azul), haciendo uso del histograma correspondiente al
color verde. El nivel de verde de cada uno de los bits en los que se divide la imagen está
en uno de los 256 canales de verde de los que dispone el programa, o sea, el verde se
mide en una escala del O al 256. La intensidad de fluorescencia es igual al nivel de verde.
El histograma se analiza considerando que los niveles mayores de verde corresponden a
zonas en o cerca de la superficie del soporte y que los niveles menores están en o cerca
del centro de la partícula. En el histograma se representa el número de bits por cada nivel
de verde que hay en la imagen seleccionada, por tanto, es tina distribución estadística del
nivel de verde entre los bits de la imagen y su análisis evita cualquier tendencia errónea
en el muestreo. Se divide la escala de verde en suficientes intervalos regulares y se asigna
438
Capítulo 5. Reacción-difusión con enzima inmovi1i~ada
el valor medio de verde de dicho intervalo a los bits que estén incluidós en el mismo. El
número total de bits es proporcional a la superficie estudiada, sea esta la correspondiente
a un corte total de la partícula o una zona de conocido espesor de la misma, y se puede
determinar, por tanto, la superficie de cada bit. Suponiendo que la sección es circular y
que el radio de la panícula corresponde al radio medio de la fracción se asigna la zona
,
más cercana a la superficie del soporte a los bits correspondientes al intervalo de mayor
nivel medio de verde. Se calcula el espesor de esta primera capa haciendo uso de la
fórmula aplicable a la superficie de una corona circular, tomando como radio mayor el
radio de la partícula. El radio medio es el de la partícula menos la mitad del espesor
calculado. Para la siguiente capa, el radio mayor es el de la partícula menos el espesor de
la capa anterior y la superficie asignada, la correspondiente a los bits del segundo
intervalo de nivel de verde en orden decreciente. Así se calcula progresivamente el
espesor de cada capa, asignándole un radio medio.
Cuando se quiere determinar cuantitativamente la distribución de enzima, se

considera que x es el radio adimensional, cociente entre el valor del radio medio y el radio
de la partícula, y se asigna a cada valor de x una concentración de enzima que se obtiene
de aplicar a cada valor medio de nivel de verde el calibrado de la Figura 2.18. Ajustando
los puntos conseguidos a funciones conocidas, se consiguen los perfiles de enzima
presentados en las Figuras 5.9 a 5.11. En los casos estudiados se ha ajustado la
concentración de enzima en el sólido, CEW(i), a (l-x), mediante funciones exponenciales
decrecientes. Las ecuaciones obtenidas para cada caso (ecuaciones [5.50], [5.51] y [5.52])
se muestran posteriormente.
La distribución de enzima CEW(x) debe cumplir, en el soporte esférico conside-

rado, que:
3SQ~x2dx=cs~
o
[5.48]
439
2.0
CE =1,1 2*edlxí/OOOSl+O,668*e11x>¡O261
1 .5
O) 1.0
O, q
E
0.5 1~
3%
a E -t
u-
0.0
¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

x
Figura 5.10.- Distribución de enzima en una partícula de KA-3 de d~ medio= 2,75mm.
CE =1
4 a
u
q
u
O, u
O, 2 u
E u
u.?
o
u
0
¡ ¡ ¡ ¡ ¡
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Figura 5.11.- Distribución de enzima en una partícula de CPG de d~ medio= 5 mm.
443
Capítulo 5. Reacción-difúsión con enzima inmovilizada
(l—x) (I—x)
CE =—O,288+O,163e 0,0082 +O,70’7e 2,144 [5.50]
(1—y) (1— )
CE =1,12e 0,0031 +O,668e 0,261 [5.51]
(I—x) (1—y)
CE =í,617e <~‘0029-i-2,’777e 0,0404 [5.52]
Como se puede observar en las Figuras 5.6 a 5.11, la distribución de enzima es

menos uniforme cuanto mayor es el diámetro de la partícula. Este hecho es lógico, dado
que la enzima y las proteínas que la acompañan son macromoléculas y su difusión en el
interior de los poros es lenta. Por otra parte, se han utilizado concentraciones de silano y
de glutaraldehido saturantes, por lo que la superficie tiene una elevada densidad de grupos
aldehido, lo que aumenta la velocidad de reacción superficial entre la proteína que se
inmoviliza y el soporte. A pesar de que los macroporos tienen un radio grande, la
presencia de gradiente de enzima en las partículas de diámetro menor (CPG de 0,150 mm
de diámetro medio de partícula) indica que la difusión de la enzima es controlante desde
tamaños de partícula muy pequeños.
Por último, se puede observar la diferencia de textura entre el CPG y la sílice-

alúmina. El vidrio de poro controlado es un soporte homogéneo, como lo demuestra la
textura del corte óptico, aunque la distribución de enzima no sea del todo homogénea. En
la sílice-alúmina industrial, KA-3, se aprecian zonas huecas grandes y una distribución de
enzima que sugiere que determinados caminos de penetración de la proteína son más
favorables que otros, pues a lo largo de ellos hay más proteína.
444
Capítulo 5. Reacción.diffisión con enzima inmovilizada
5.7.2. Difusión interna en ausencia de reacción química.
Para obtener el valor del coeficiente de difusión efectivo de la lactosa y del ONPG
en el catalizador KA-3 (descrito en el apartado 2.3.2.1) se ha utilizado un equipo de
HPLC modificado, según representa la Figura 2.9. Se siguió el procedimiento
experimental descrito en el apartado 2.3.4.6. El valor de D~ se obtuvo experimentando en
una columna construida con el soporte KA-3. Las características de la columna se
detallan en la Tabla 5.2. Empleando esta columna, se han llevado a cabo experimentos a
una temperatura constante de 250C, utilizando dos trazadores: ONPG y lactosa, que son
los dos sustratos de la enzima. Como portador se utiliza como eluyente agua Milli-Q.
Para la preparación de la columna, se ha medido el volumen de la misma pesando

el agua necesaria para rellenarla y, conocida su longitud, se ha calculado el diámetro
interno. Posteriormente, se ha introducido el soporte en pequeñas fracciones, sometiendo
a la columna a una vibración constante para evitar zonas huecas. El lecho resulta así lo
más compacto posible. Como el sólido se pesó antes de empezar a introducirlo, se pesa el
restante y la diferencia es el peso de sólido en el lecho. Con la densidad de partícula, se ha
calculado el volumen de sólido y la porosidad del lecho.
Los experimentos se han llevado a cabo a velocidades intersticiales que están

comprendidas en el intervalo entre 0,86 y 69,56 cm/mm, lo que corresponde a caudales de
portador que varían entre 0,1 y 6,0 cm3/min. Se inyecta un volumen de solución de
lactosa o de ONPG de 20 gí. Las inyecciones se pueden considerar instantáneas, ya que
se llevan a cabo en menos de un segundo. De esta forma, el tiempo de retraso se puede
considerar despreciable. En principio, todo HPLC tiene un sistema de tubos y conexiones
que minimizan el volumen muerto previo y posterior a la columna. Para conocer el
volumen muerto, se realizan pinchazos de lactosa sin columna, sustituyendo esta por una
conexión de volumen muerto mínimo. Los resultados se observan en la Figura 5.12.
Ajustando el tiempo muerto de la ecuación [5.15] al caudal se obtiene la siguiente
ecuación:
= 0,131
cm3 ¡mm + 0,013m/n [5.53]
445
El detector de dispersión de luz tiene un nebulizador a la entrada. No es un

detector de célula continuo, sino que tiene un pequeño volumen muerto. En este volumen
se da una cierta mezcla y, como el tiempo de mezcla depende de la corriente de aire del
nebulizador y ésta tiene un caudal constante y alto, hay siempre un tiempo muerto fijo,
aunque pequeño, calculado en 8 s, que se obtiene al ajustar los datos del primer momento
frente a caudal a una exponencial decreciente de primer orden con ordenada en el origen,
como se muestra en la Figura 5.12.
El error que se comete en el valor del primer momento, si no se tiene en cuenta el

tiempo muerto de la instalación, oscila entre un 3,8 y 4,9% cuando el caudal varía entre
0,1 y 4,5 cm3/min. Por tanto, se considerará el tiempo muerto para corregir el primer
momento experimental, de acuerdo a la ecuación [5.15].
En cada experimento, la señal de trazador a la salida corresponde a un pico cuyo

tiempo del máximo y cuya amplitud varian con el caudal empleado. La señal de salida se
toma como una curva: tensión V(t) en mV frente al tiempo de elución. Esta señal es
proporcional a la concentración de trazador, por lo que se puede aplicar directamente con
ella el cálculo de momentos. Por ello, el cálculo de gí y ~2 de las ecuaciones [5.15] y
[5.16] se puede hacer directamente a partir de la curva tensión-tiempo de elución.
JtV(t)dt
— = JtE(t)dt [5.54]
I V(t)dt
o
2 _ 0 = E(t)dt [5.55]
a— J(t~p¡)2
5 V(t)dt
o
O
Los resultados obtenidos para las dos concentraciones de trazador en la inyección

se han recogido en las Tablas 5.3 a 5.6.
446
Considerando el modelo propuesto por Kubin y Kucera, al representar el primer

momento frente al cociente entre la longitud del lecho y la velocidad intersticial (L/uD, se
debería obtener una recta de pendiente (1+a0), de acuerdo a la ecuación [5.15].
En las
Figuras 5.15, 5.17, 5.19 y 5.21 se puede observar que se cumple esta relación lineal en
todos los experimentos realizados. Con los valores de (l+8~) se calcula la constante de
equilibrio de adsorción, mediante la ecuación [5.17].
Por otra parte, al representar HEPT frente a la velocidad instersticial (Figuras

5.16, 5.18, 5.20 y 5.22), se observa que, en las condiciones de velocidad utilizadas, sólo
aparece el tramo lineal de la ecuación [5.21], por lo que puede eliminarse la influencia de
la dispersión axial y G es la pendiente de la recta HEPT vs. u~. De acuerdo a la ecuación
[5.22], D~ se obtiene a partir de G una vez conocidos So y estimado un valor medio de kf

en el intervalo de caudales utilizado, de acuerdo con la correlación de Wilson y
Giankoplis (1966) (ecuación [5.24]). En la Figura 5.23 se ha representado la variación de
kf con la velocidad intersticial, que se recoge en la Tabla 5.7. A bajas velocidades de paso
del fluido portador por el lecho, los valores del coeficiente de transporte en la película
externa son muy bajos. Al aumentar la velocidad de paso, aumenta de forma hiperbólica
kñ hasta llegar a una zona donde el aumento de kf parece ser lineal con la velocidad
intersticial, lo que sucede porque k~ es directamente proporcional a la raíz cúbica de u~,
según la correlación de Wilson y Giankoplis (1966). A menor tamaño de partícula, menor
es el espesor de la capa de fluido estancado en torno al sólido, con lo que se favorece la
difusión del trazador a la superficie externa de la partícula. Por tanto, kf aumenta a
igualdad de la velocidad intersticial al disminuir el tamaño de la partícula.
En las Figuras 5.13 y 5.14 se representan las curvas E(t) obtenidas con lactosa y
ONPG. Se observa que los picos salen antes al aumentar el caudal y, además, existe una
modificación en la forma del pico, que es casi simétrica para caudales bajos y se vuelve
más asimétrica en los experimentos a caudal alto.
447
Tabla 5.2.- Características de la columna construida usando KA-3 como soporte.
R~ (cm) f~p (M+js) 6p (M) Ej L (cm) d~ colu¡nna (cm)

0,021 0,535 0,219 0,346 25 0,46
Tabla 5.3.- Resultados experimentales. Trazador: 20 gí de lactosa 5 g/L. Columna 2.

(KA3L1)
Q (cm3/min) u~ (cm/mm) ¡‘í (mm) a2 (mm’) L/u

1 (mm) HEPT (cm)
0,1 1,74 33,35 16,33 14,30 0,37
0,3 5,22 11,36 2,16 4,77 0,42
0,4 6,96 8,41 1,91 3,58 0,68
0,5 8,70 6,29 2,13 2,87 1,34
0,5 8,70 6,93 1,55 2,86 0,81
1,0 17,39 3,48 1,02 1,43 2,08
1,0 17,39 3,51 0,86 1,43 1,75
1,0 17,39 3,51 0,75 1,43 1,52
1,5 26,09 2,43 0,65 0,96 2,64
1,5 26,09 2,48 0,73 0,96 2,97
2,0 34,78 1,99 0,54 0,72 3,45
2,0 34,78 2,01 0,64 0,72 3,96
2,5 43,47 1,59 0,47 0,57 4,65
3,0 52,17 1,60 0,44 0,48 4,29
4,0 69,56 1,15 0,25 0,36 5,29
448
Tabla 5.4.- Resultados experimentales. Trazador: 20 ~.flde lactosa 70 g/L. Columna 2.

(KA3L2)
Q (cm’/min) u~ (cm/mm) k~í (mm) a’ ~min’) L/u1 (mm) HEPT (cm)

0,1 1,74 33,97
0,3 5,22 16,81
0,4 6,96 8,13
0,5 8,70 6,58
0,5
0,5
0,5
1,0
1,0
1,0
1,0 17,39 3,43
1,0 17,39 3,63
1,5 26,09 2,32
1,5 26,09 2,36
1,5 26,09 2,55
1,5 26,09 2,55
2,0 34,78 1,57
2,0 34,78 1,73
2,0 34,78 2,01
2,0 34,78 1,96
2,5 43,48 1,50
2,5 43,48 1,54 5,58
3.0 52,17 1,32 3,77
3,0 52,17 1,65 0,68 0,48 6,24
3,0 52,17 1,34 4,72
3,0 52,17 1,70 6,23
3,5 60,87 1,57
3,5 60,87 1,18 0,18 0,49
3,5 60,87 1,48 0,76 0,41
Tabla 5.5.- Resultados experimentales. Trazador: 20 ~.tlde ONPG 2 g/L. Columna 2.

(KA3O1)
2) L/u~ (mm) HEPT (cm)
Q (cm~/min)
0,5 u, (cm/mm) pi (mm) a’ (mm 1,23
1,0 2,34
1,5 3,24
2,0 34,78 2,47 } 1,03 0,72 4,22
3,0 6,07
449
Tabla 5.6.- Resultados experimentales. 1 razador: 20 gí de ONPG 5 gIL. Columna 2.

(KA3 02)
Q (cm’/min) u~ (cmlmin) ~ (mm) a’ (mm’) L/u1 (mm) HEPT (cm)

0,2 3,48 24,13 16,32 7,18 0,70
• 0,3 5,22 15,70 9,41 4,79 0,95
0,4 6,96 11,74 6,46 3,59 1,17
0,5 8,69 9,77 4,99 2,88 1,30
0,5 8,70 9,77 4,99 2,87 1,31
0,6 10,43 7,86 4,11 2,40 1,66
1,0 17,39 4,88 2,24 1,44 2,35
1,0 17,39 4,73 2,11 1,43 2,36
1,0 17,39 4,88 2,24 1,43 2,35
3,00 0,94 0,96 2,61
2,56 1,27 0,72 4,84

2,41 0,97 0,72 4,17
1,93 0,74 0,60 4,97
1,61 0,62 0,48 5,98
3,0 52,17 1,69 0,62 0,48 5,43
1 .4 J
Modelo: reciproca cor~ origen
chiÁ2 = 0.000 18
1.2- Pl 0.1313 ±0.00138
P2 0.01313 ±0.00468
1.0-
-? 0.8-
E
~ 0.6-
0.4 -
1
h
0.2 - 5
a-..
— — .5... — .5-. — .5 — — E —
0.0
o 1 2 3 4 5
Q25,0(cm/min)
Figura 5.12.- Variación del tiempo muerto con el caudal de líquido eluyente.
450
35
30
25
a 20
E
15
10
o
0 2 4 6 6 10 12 14 16
L/u~ (mm)
Figura 5.15.- gí versus L/u~. Trazador: 20 lil de lactosaS g/L. (KA3L1)
ci 3
1-
o-
uJ
2: 2
o
0 10 20 30 40 50 60 70
u~ (cm/mm)
Figura 5.16.- HETP versus u~. Trazador: 20 gí de lactosa 5 g/L. (KA3LI)
452
35
30
25
a 20
15
ji
10
o
0 2 4 6 8 10 12 14 16
L/u~ (mm)
Figura 5.17.- jí versus L/u~. Trazador: 20 jil de lactosa 70 g/L. (KA3L2)
ci 4
1—
o-
w 3
r
2
~1
o
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Figura 5.18.- HETP versus u~. Trazador: 20 k1 de lactosa 70 g/L. (KA3L2)
453
12
10
a
6
E
4
o
0 1 2 3 4
L/u (mm)
Figura 5.19.- ytí versus L/u,. Trazador: 20 yA de ONPG 2 g/L. (KA3OI)
7-. Y =0,35+0,11 X
R2=0,99
6—
5-
o 4.
o-
uJ 3-
o r.....—-.—.....—-¡........—. —1———~— ¡ - ¡ , ¡ ¡ ¡
0 10 20 30 40 50 60 70 80
u, (cm/mm)
Figura 5.20.- HETP versus u~. Trazador: 20 11 de ONPG 2 gIL. (KA3O1)
454
30
25
20
15
E 10
o
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
L/u~ (mm)
Figura 5.21.- 1-ti versus L/u~. Trazador: 20 yA de ONPG 5 g/L. (KA302)
(5 4
H
o-
w
1
2
o
0 10 20 30 40 50 60
u (cm/mm)
Figura 5.22.- HETP versus u1. Trazador: 20 1.11 de ONTPG 5 g/L. (KA302)
455
Tabla 5.7.- Valores de kf estimados según la correlación de Wilson y Giankoplis (1966).
Caudal Columna 2
(cm3/min) u~ íac kFcjjNp(~
(cm/mio) 1 . lO~
(cm/s) (cm/s)
0,1 1,74 1,30 1,41

0,3 5,22 1,87 2,03
0,5 8,70 2,22 2,41
1,0 17,39 2,79 3,03
2,0 34,78 3,52 3,82
3,0 52,17 4,03 4,37
4,0 69,56 4,44 4,81
5,0 86,95 4,78 5,19
6,0 104,34 5,08 5,51
ci
Co
o
2-
o ¡ ¡
o
¡ ¡
20 40 60 80 100 120
u~ (cm/mm)
Figura 5.23.- kf (para la lactosa)frente a la velocidad intersticial u

1.
456
Los valores de 8o, KA, 6, k1 medio y D~ calculados en los experimientos
realizados con lactosa como trazador se recogen en la Tabla 5.8, y con ONPG como
trazador se recogen en la Tabla 5.9.
Una vez determinado el valor del coeficiente de difusión fisico, se puede calcular
el parámetro estructural, t. En los modelos de poros descritos en el punto 5.5 la
tortuosidad se calcula como:
Dc~ c~
= [5.56]
D, 1
Para ello hay que estimar primero el coeficiente de difusión molecular D del
sustrato en las condiciones en las que se ha medido D~. Se estima utilizando la ecuación
dc Wilke-Chang (ecuación [5.7]).
Para el cálculo de la tortuosidad se ha considerado la
porosidad total de la partícula, suma de la porosidad de macroporos y la de microporos,
ya que el trazador difunde en ambas zonas. Los resultados obtenidos se muestran en la
Tabla 5.10.
Se puede observar en las Tablas 5.8 y 5.9 que la concentración de trazador no

afecta apreciablemente al valor del coeficiente de difusión efectivo, tanto para la lactosa
como para el ONPG.
La constante de equilibrio para la lactosa es 0,31. El valor es bajo, por lo que la

lactosa no tiende a adsorberse sobre el sólido, aunque debe haber interacciones tipo
puente de hidrógeno entre los grupos —OH de la lactosa y los grupos silanol de la
superficie del soporte.
El valor de Ka obtenido con ONPG como trazador indica que este compuesto se
adsorbe mucho más que la lactosa. El tipo de interacción responsable ha de ser diferente a
los puentes de hidrógeno, pues puede establecer menos enlaces de este tipo que la lactosa,
por lo que ha de estar implicado el anillo aromático (más que el grupo nitro, que está algo
impedido estéricamente para cualquier interacción). Como el anillo aromático acepta
densidad electrónica del grupo galactósido, el ONPG es una molécula que forma un
457
dipolo, cuyo poío negativo es el grupo aromático. La lactosa es una molécula neutra, con
una distribución de densidad electrónica simétrica. Como el soporte tiene cargas positivas
en superficie, los átomos de Al, atrae a los dipolos permanentes por su poío negativo. Este
hecho podría explicar la mayor interacción KA3-ONPG.
Teniendo en cuenta los resultados recogidos en la Tabla 10, se observa que la

tortuosidad es baja, en tomo a 1. Este hecho implica que la difusión interna de los
sustratos, lactosa y ONPG, apenas se ve afectada por la presencia del sólido. Dado que el
diámetro de la lactosa o del ONPG es aproximadamente de 5 Á y el diámetro medio de

microporos es de 90 A, se comprende que no haya mucha diferencia entre el coeficiente
de difusión efectivo y el coeficiente de difusión molecular. De aquí se deduce que la
velocidad de transferencia de materia en el interior de los poros es similar a la velocidad
de transferencia de materia en una solución estancada del sustrato en agua.
La tortuosidad es algo mayor en el caso de utilizar lactosa como trazador que si se

utiliza ONPG. Esto se debe a que el ONPG tiene un D~ mayor que el de la lactosa. Como
el ONPG es una molécula algo menor que la lactosa, es lógico que su coeficiente de
difusión efectivo sea mayor. Además, hay que considerar que la lactosa es más hidrófila
que el ONPG, por lo que su esfera de solvatación es mayor. Cuando difunde una molécula
de trazador, su esfera de solvatación difunde con ella.
458
Tabla 5.8.- Resultados obtenidos con el soporte KA3 con lactosa como trazador.
Tabla 5.9.- Resultados obtenidos con el soporte KA3 con ONPG como trazador.
Tabla 5.10.- Valores de la tortuosidad t y del factor de corrección f calculados con

lactosa y ONPG.
Trazador Ctrazado¡. 577T VA D AB •10 f t
(g/L) (cm/s) (cm3/mol) (cm/s)

Inyección
Lactosa 5 1,43 318,2 4,96 0,29 1,84
Lactosa 70 1,77 318,2 4,96 0,36 1,49
ONPG 2 2,65 252,3 5,56 0,48 1,11
ONPG 5 2,35 252,3 5,56 0,42 1,27
Nota: A es el trazador y 13 es el disolvente (agua)
459
5.7.3. Difusión interna en presencia de reacción química
En este apartado se estudia el efecto de la resistencia a la difusión interna en la
velocidad de reacción observada a través del valor del factor de efectividad. Este factor de
efectividad se obtiene llevando a cabo varios experimentos de hidrólisis de los sustratos
con enzima inmovilizada en partículas de distinto tamaño, calculando la velocidad a
tiempo cero para cada experimento (por ajuste de los datos de concentración de producto
frente a tiempo de reacción a una función y derivación de la misma) y dividiéndola por la
velocidad de reacción obtenida con la partícula de menor tamaño o por la velocidad de
reacción calculada con el modelo cinético adecuado, según el sustrato que se hidrolice.
Los factores de efectividad experimentales quedan definidos por las siguientes
ecuaciones:
{[jro~ ~‘E ibservada
¡ (r0 CE iJD,vO.O¡5 . [5.57]
1/ exp 2 —
— r0,,, c’E )akerea~a
¡“odelocj¡,e [5.58]
Los experimentos se han llevado a cabo según los protocolos descritos en el

apartado 2.3.4. Se han empleado los dos sustratos utilizados en este trabajo para 3-
galactosidasas: lactosa y ONPG. Se utilizaron varios tamaños de partícula y varias
temperaturas. A cada tamaño de partícula Je corresponde tina distribución de enzima,
según se comprobó en el punto 5.7.1. En la Tabla 5.11 sc resumen las condiciones
empleadas en cada experimento.
En las Figuras 5.24 a 5.26 se muestra la evolución de la conversión con el tiempo

de reacción para los experimentos realizados, tanto con lactosa como con ONPG como
sustratos. Los datos integrales (C, t) se han ajustado a una función exponencial que se ha
derivado para calcular la función que liga la velocidad de reacción con el tiempo. Con
460
dicha función se ha calculado la velocidad de reacción por mg de enzima a conversiones

fijadas: 0, 0,3 y 0,6. Luego, aplicando las ecuaciones [5.57] y [5.58], se han calculado los
factores de efectividad experimentales. Para obtener el factor de efectividad referido a la
velocidad calculada según el modelo cinético, hace falta calcularla a partir de la ecuación
cinética correspondiente. En la Tabla 5.12 se recogen la ecuación necesaria para el
cálculo de la velocidad y los parámetros cinéticos aplicables a la hidrólisis de cada
sustrato; en ambos casos la inhibición por producto es competitiva. En las Tablas 5.13 a
5.15 se muestran los valores de las velocidades de reacción y de los factores de
efectividad experimentales.
Posteriormente, utilizando la ecuación [5.36],

se ha calculado el valor del módulo
de Thiele, h, para cada tamaño de partícula, considerando la constante catalítica aplicable
a cada reacción y el coeficiente de difusión efectivo del sustrato correspondiente obtenido
en ausencia de reacción química (Tabla 5.10)
Tabla 5.11.- Condiciones de los experimentos a varios tamaños de partícula.
4 (mm) T (0C) Cia. CONPC CE,, Distribución Figuras

(gIL) (gIL) media (ecuación)
0,15 40 50 - 0,35 [5.501 5.6 y 5.9

0,65
1,30
2,75 [5.511 S.7yS.lO
3,5
5,0 0,29 [5.521 5.8 y 5.11
0,15 40 - 0,5 0,35 [5.501 5.6 y 5.9
0,41
0,65
1,30
2,75 [5.511 5.7 y 5.10
0,15 25 - 0,5 0,35 [5.501 5.6 y 5.9
0,41
0,65
1,30
2,75 [5.511 5.7 y 5.10
461
1.0 ¡ ¡ ¡
e. .4
e’ .1
e
— y.
0.8+ 1
a.
A
0.6 -
jis
— y d~(rmi)
$ ‘ -
-Y, ~‘
• 0,15
x ‘e
FM Y, • 0,65
0.4 - Bbc <- 1,30
e, y 2,75
• 3,5
•1. Y 5,0
0.2- • si .4 r
,45
‘‘1<
00~~
o
¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Figura 5.24.- Conversión vs. t~C8: hidrólisis de lactosa a 400C a varios diámetros de
partícula
1.0 ¡ r ¡ •
• .6
0.8 -
0.6
u.
* - .7 d~(rrrn)
0.4- e.. • 0,15

•0 - e Q41
4 A 0,65
e. -7 ~ y
0.2 - e - 4 275
- -4
y
‘y
e. ~. -
0.0 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
O 10 20 30 40 50 60 70 80
t*Q (mm mg/L)
Figura 5.25.- Conversión vs. t~C~: hidrólisis de ONPG a 400C a varios diámetros de
partícula.
462
1.0
e
0.8 u
u
0.6 -
.7. __________
e d~(mm)
0.4 1
• 0,15
A e 041
e 4 0,65
0.2 u
T y 1,3
A • 2,75
0.0 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
t Q (mm mgIL)
Figura 5.26.- Conversión vs. tC~: hidrólisis de ONPG a 25<’C a varios diámetros de
partícula.
Tabla 5.12.- Modelos cinéticos aplicados para el cálculo de la velocidad inicial en

ausencia de control por parte de la difusión interna.
Sustrato Velocidad modelo cinético Parámetros del modelo

Lactosa ex (8 73 5298 ±890
k2 Py~ ±2,96— T )
=exp~l6,84±7,24~~6688±1589)
k,C,
FO
(1—X)
K ¡gal =exn¡zzñD
~ +8 ~ 8301±2626
¡
flXTflfl
ui~ru Q (1— fl) + KM¿li <x) 1<, =exP¿14~16±4¡46—6952 ±1270)
exP¿4~20±7~16—6229±2242)
( 6,50±9,72—5930±
K ¡ga/ exPyl T 2946 )
463
Conocidos los valores del factor de efectividad experimental para lactosa y

ONPG, se pueden comparar con los valores de ~icalculados a partir de los modelos
cinéticos de las reacciones de hidrólisis, de las distribuciones de enzima que se han
obtenido por microscopia confocal (ecuaciones [5.50]
a [5.52]) y de los valores de los
coeficientes de difusión efectivos calculados por métodos cromatográficos (Tabla 5.12).
Estos valores calculados del factor de efectividad se han obtenido resolviendo
numéricamente, por colocación ortogonal, el balance de materia planteado en la ecuación
[5.37] para nueve puntos interiores de la partícula, además de los puntos central y de
superficie, donde se aplican las condiciones limite. Una vez resuelto dicho balance, se
obtiene un perfil de concentraciones de sustrato en el interior de la partícula y se puede
calcular el valor del factor de efectividad mediante la ecuación [5.38]. El perfil de
concentraciones de sustrato depende del perfil de concentración de enzima y del valor del
coeficiente de difusión efectivo del sustrato, que se introducen en el balance de materia
antes de resolverlo.
En las Tablas 5.13 a 5.15 se recogen los valores experimentales y calculados del
factor de efectividad para la reacción de hidrólisis de lactosa a 40”C y para la reacción de
hidrólisis de ONPG a 25 y 400C, con las distribuciones de enzima determinadas
experimentalmente y con una distribución uniforme de enzima. En las Figuras 5.27 a
5.35 se comparan los valores experimentales y calculados de ~ para distintos tamaños de
partícula. En la Figura 5.36 se presenta la misma comparación, pero en este caso se ha
variado la concentración de enzima en el sólido. Para hacer esta comparación se han
utilizado los inmovilizados del apartado 4.2.1 (1LZ24 a ILZ3O), en los que se varió la
carga de enzima entre 0,07 y 5,60 mg de enzima por g de soporte. La comparación se
hace utilizando como reacción test la hidrólisis de ONPG a 250C, según cl protocolo del
apanado 2.4.3.
464
d~ (cm)
0.01 0.1
Save 3
——2 rC%f¡¡mflnncPGrtI~o
• • • .3 ~ffl e¡Ñm KA-3d 2 75rTr ‘~ 2
—. —4 pcd¡¡ e¡dnnK43d,. Onr
1
fada~ de efedi,~ annstá~
•
O Ver
2
0.1
10
h
Figura 5.27.- Comparación de los valores experimental, teórico y calculado del factor de
efectividad. Hidrólisis de lactosa a 40”C. X’~0.
d9 (cm)
0.1 1
1—
Qave Fadp de ef~l¡v~d ~adat

——2
• . • -3
—4
—.
paf¡l anam Kk3 d~=2.75 ¡ras 2
¡n5l Sane KA.3 d d.O nr
ladoes de efect~idad e<~innt¡¡es 1

U
o ~
0.1
10
h
0C. X=tO,3.
efectividad. Hidrólisis de lactosa a 40
465
Capitulo 5. Reacción.difusión con enzima inmovilizada
d~ (cm)
10
Oavs Fact, de 64Co5v~
—1 ~fffl eúnn ~o,r~é~eo

--2 fi¡eneCPG~o
3 paf¡i ai~nn K&3 1 275 nr
- -4 ~f 1 mnn~ KA~3 ~S.O tras
f,,jses de ~edi~dad egDeÑ,rr/aIps

• u
O
0.1
1 10
h
efectividad. Hidrólisis de lactosa a 400C. X=~0,6.
d~ (cm)
0.01 0.1
u
O
u •1
O
u
O u
O
Case Fad~ de e<ecú4dad cáco¡ado
mw~ harcgéneo
2 palji en~me cpo r~vo
0.1 3 pe’fi¡ ená~n K.A-3 cl =2.75 VTO :3
4 ¡rIO enzrrn KA.3 d,’5.O smi 2
fact~es de eledÑdad earedrrenlales 1
u
O
0,01 ¡ ¡
0.1 lo 100
h
efectividad. Hidrólisis de ONPG a 400C. X=0.
466
d~ (cm)
0.01 0.1
C¡ave FacioLde efectivLdad calcolado
—1 perfil enzima homogéneo
r 0.1 — — 2 parid enzima cpo polvo

- . . .3 perf¡l enzima KA.3 d
5—2.75 mm
——4 perfil enzima KA-3d =5.0 mm
____________
factores de efeclividad exoerimenlales Ii
• 0.5 lrd/r~.,.,,,.,>
o tr (nr
0.01
0.1 10 100
h
efectividad. Hidrólisis de ONPG a 40”C. X0,3.
d0 (cm)
0.01 0.1
Clave Factor de eteprividad calculado
perfil enzima homogéneo

0.1 - — 2 — perfil enzima CPG polvo
- - . 3 perfil enzima KA-3d =2.75 mm
—-—4 perfil enzima KA-3d, =5. Omm
factores de efectividad exoenimenlales 1

• ¡5~,, ~
O tr...¡ «5.ín,.~.5,.,1
0.01
0.1 10 100
h
0C. X=0,6.
efectividad. Hidrólisis de ONPG a 40
467
d~ (cm)
0.01 0.1
Clave Factor de efectividad calculado
perfil enzima homogéneo

0.1 ——2 perf¡l enzima CPG polvo
perfil enzima KA-3 cl 2.15 mm
—4 perfil er,dma KA.3 d
5=5.0 mm
fac¡ores de efectividad exnerimer¡ta¡es
• l•,,
O
0.01
0.1 lo 100
h
0C. X~0.
d~ (cm)
0.01 0.1
1
o. —•
1
Clave Factor de efectividad calcL¡¡ado
—1 perfil enzima homogéneo

r 0.1 — — 2 perfil enzima CPG polvo
• • --3 perfil enzima KA-3d =275 mm
— • —4 perfil enzima KA-2 cl =5.0 mrO
•1
factores de efectividad exnehmenta¡es
• fl.,, (r
5~,.,1,.
O n «/r
0.01
0.1 100
1 10
0C. X0,3.
468
d~ (cm)
0.01 0.1
clave Factor de efectividad calculado
—1 perfil enzima homogéneo 4

0.1 - — — 2 perfil enzima CPG polvo 3
• • .3 perfil enzima KA.3 d 2.75 mm 2
— • —4 perfil enzima KA-3 djb.O mm
factores de efectividad exaecimentales
• ~ 1 (r
5/r,1
O ¡t,vx (~d<erd•S=¡¡,fl=~
0.01
• ,.,l ,
1 10
0.1 100
h
efectividad. Hidrólisis de ONPG a 250C. X=0,6.
5c. XO.
Hidrólisis de ONPG 25
c E: Q,35; 0,70; 1,4; 2,8 y 5,6 rag
5/g,,.50~
.5
0.1 clave Fado, de e¡edivida±ca¡os¡~
st enz¡na CPC alas

fle~ arzi¡re 1
S ¡e ilene¡maKA-3d2.7flmai
— —4 peda escara KAS d 5 O asas
¡adores de efectladad exaerln,eata¡aa
0.01
0.1 1 10 100
h
efectividad. Hidrólisis de ONPG a 25”C. X~0. Diversos valores de la carga
de enzima C~W.
469
e
ej VS CN..—
ex — — — r== flC~r.=CV
ej •.‘~4~<~.- ,~,.
co0o
~- 000 0000
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CapituLo 5. Reacción-difusión con enzima inmovilizada
5.8. DISCUSIÓN
En las Figuras 5.27 a 5.35 se puede observar que, al aumentar el diámetro de la

partícula de soporte que contiene la enzima inmovilizada, disminuye el factor de
efectividad. Según la distribución de enzima es menos unifonne, al mismo valor de
diámetro de particula, aumenta el factor de efectividad. En las Figuras 5.37 y 5.38 se han
representado los perfiles adimensionales de concentración de lactosa y de ONPG para
distintos diámetros de partícula y distribuciones de enzima a conversián cero. Al
aumentar el tamaño de partícula se observa una disminución mayor de la concentración
de sustrato desde la superficie de la partícula al centro de la misma. Este hecho provoca
que haya una disminución cada vez mayor de la velocidad de reacción y, por tanto, una
disminución del factor de efectividad calculado. Cuando la distribución de enzima es
menos uniforme, al mismo diámetro de partícula, la disminución de la concentración de
sustrato es menor. El factor de efectividad es mayor cuando la distribución de enzima es
de tipo coraza que cuando es uniforme, debido a que el sustrato recorre un camino más
corto hasta la enzima donde se transforma.
Al aumentar el tamaño de partícula, la distribución de enzima es menos uniforme.

En el caso de la hidrólisis de lactosa se observa claramente esta tendencia, pues a tamaños
de partícula pequeños el valor del factor de efectividad experimental coincide con el
calculado para una distribución uniforme o poco heterogénea, y, al aumentar el tamaño de
la partícula, el valor del factor de efectividad experimental coincide con el calculado para
distribuciones de enzima menos uniformes. Lo mismo sucede en la hidrólisis de ONPG,
especialmente a 250C.
En la partícula de 5 mm de diámetro, el valor del factor de efectividad es 3 veces

menor que el valor del r~ calculado para la distribución de enzima que le corresponde.
Este hecho se puede deber a que la tortuosidad sea menor, es decir, el coeficiente de
difusión efectivo es mayor que el obtenido en ausencia de reacción química, o bien
porque hay una pérdida de actividad respecto a la esperada. La distribución de enzima que
hay en la partícula de 5 mm de diámetro (ecuación [5.52] y Figuras 5.8 y 5.11) es muy
heterogénea, tipo coraza, estando la mayoría de la enzima en la zona superficial de la
partícula. En esta distribución la proteína alcanza concentraciones muy elevadas en la
473
Capitulo 5. Reacción-diffisión con enzima inmovilizada
zona más cercana a la superficie, del orden de 4 mglg. Por otra parte, en el apartado 4.2.1,
se apuntó que la enzima se inmoviliza según dos mecanismos diferentes, pues, hasta una
concentración de enzima aproximada de 1 ,4 mg/g la enzima se inmoviliza muy rápido,
pero a concentraciones mayores de enzima en el soporte la inmovilización se ralentiza
mucho. Parece que la inmovilización es bifásica, según la carga máxima de enzima que se
alcanza en el soporte. Teniendo en cuenta que la distribución que hay en el CPG, que
tiene el mismo diámetro de partícula que la sílice-alúmina utilizada en los experimentos
del apartado 4.2.1, es casi uniforme con una concentración de enzima de 0,35 mg/g, es
posible pensar que la proteína se inmoviliza desde un primer momento sobre toda la
partícula formando una monocapa. Una vez esta monocapa está formada, la proteína que
se inmoviliza después se une a la proteína ya inmovilizada, formando otra capa. Como la
~-galactosidasa de K. fragilis tiende a aglomerar (Mahoney, 1978), es razonable que las
proteínas se unan a otras ya inmovilizadas. La mayor lentitud de esta segunda fase de la
inmovilización se puede deber a que la tendencia a la unión proteina-proteina es menor
que la tendencia de la proteína a reaccionar con la superficie del soporte. La enzima
inmovilizada en una segunda capa puede bloquear centros activos de la enzima ya
inmovilizada, lo que supone un descenso en la actividad respecto a la esperada. Además,
una concentración local de proteínas alta favorece la agregación de las mismas. La
agregación es un mecanismo de desactivación muy conocido y esta desactivación es
irreversible si se forman enlaces covalentes entre las enzimas (Lencki y col., 1992 b). En
las partículas de menor diámetro de enzima se observa que hay concentración de enzima
en la zona superficial, pero la concentración máxima en la distribución de la partícula de
2,75 mm de diámetro apenas sobrepasa los 1,4 mg/g y la mayor parte de la enzima está en
zonas del soporte con una concentración de 1 mg/g o menor, por lo que estaría
inmovilizada en monocapa. En la partícula de 5 mm, un 50% de la enzima,
aproximadamente, se encuentra en zonas del soporte con una concentración de enzima
superior a 1,4 mglg y, por tanto, puede estar bloqueada por otra proteína que se
inmovilice o formar parte de agregados inactivos. El resultado es una velocidad de
reacción observada menor a la esperada y, por tanto, un factor de efectividad
experimental que es menor que el calculado.
En la Figura 5.36 se puede observar que, al aumentar la concentración de enzima

inmovilizada en el sólido (CE~Ñ) en una partícula del tamaño menor, el factor de
474
efectividad disminuye a partir de un valor de CE~ de 1,4 mg/g. El aumento de la carga

enzimática supone un aumento proporcional de la velocidad de la etapa química. Este
aumento provoca que, a partir de una determinada carga de enzima, la etapa controlante
ya no sea la reacción química, sino que pase a ser la difusión en los poros. Este hecho
provoca una disminución del factor de efectividad. Además, a partir de concentraciones
de 2,8 mg de enzima por g de soporte, gran parte de la enzima podría quedar inmovilizada
sobre otras proteínas ya fijadas al soporte, con lo que el fenómeno de la agregación puede
provocar desactivación y una disminución del factor de efectividad mayor de la esperada.
Considerando que el tamaño de la partícula es similar al del CPG en polvo del que se
conoce la distribución de enzima y que, al aumentar la carga de enzima, se van saturando
las partículas en enzima, el aumento de la carga enzimática en las partículas conduce a
perfiles de enzima más homogéneos, partiendo del ya conocido para el CPG en polvo,
que es el adecuado para una carga de enzima de 0,35 mg/g.
Para comparar los valores del coeficiente de difusión efectivo obtenido en

ausencia de reacción química y en presencia de la misma, se han calculado los valores de
a partir de la definición del módulo de Thiele dada en la ecuación [5.36]. Conocido el
valor medio del factor de efectividad experimental, el módulo de Thiele se ha obtenido
utilizando la curva que relaciona el factor de efectividad con este parámetro, dada en las
Figuras 5.28 a 5.30 para varias distribuciones de enzima en el soporte. Para cada partícula
se ha utilizado la curva ~-h que corresponde a su distribución de enzima. Por tanto, para
calcular h se utilizan los experimentos con partículas de las que se conoce cuál es su
distribución de enzima: 0,15; 2,75 y 5 mm de diámetro. Además, con las partículas de
menor tamaño no es factible el cálculo, ya que el factor de efectividad es 1 o muy cercano
y con las partículas de 5 mm se ha observado una posible desactivación, lo que llevaría a
un cálculo erróneo del valor de D0 químico. Por tanto, se utilizarán los experimentos
realizados con partículas de 2,75 mm y la curva que corresponde a la distribución de

enzima que hay en esas partículas. En la Tabla 5.16 se comparan los valores del De fisico
y quimico. Se puede observar que el D. químico es algo menor, pero parecido, al obtenido
por el método cromatográfico, tanto si se emplea lactosa como sustrato como si se emplea
ONPG. Se puede considerar que la difusión del sustrato no debe verse afectada por la
reacción química, pues son dos fenómenos distintos. El valor de D0 variaría si cambiara la
interacción fluido-compuesto-sólido; por ejemplo, por el bloqueo paulatino de los poros
475
del sólido por deposición de polímeros o por polimerización en el interior de los mismos.
También puede haber un cambio de viscosidad en el liquido que llena los poros si se dan
reacciones de polimerización en él.
Tabla 5.16.- Valores de los coeficientes efectivos de difusión fisico y químico.
Sustrato X ( D~ fisico hgráncó D, qufmico fís¡ca tquírnica
(0C) medio .106 medio .106
(cm2ls) (cm2/s)
Lactosa 0 40 1,60 24 1,58 1,65 1,66

Lactosa 0,3 40 30
Lactosa 0,6 40 31
ONPG 0 40 2,50 50 1,87 1,19 1,48
ONPG 0,3 40 52
ONPG 0 25 47 1,91 1,19 1,45
ONPG 0,3 25 41
476
6.- ESTABILIDAD DE LA
ENZIMA DE K.ftagilis
INMOVILIZADA
6.1.- INTRODUCCIÓN
La estabilidad en operación de los catalizadores, sean de la naturaleza que sean, es

uno de los requisitos más importantes a la hora de utilizarlos en los procesos industriales
para los que son diseñados. Una vez se han seleccionado los catalizadores activos y con
una alta selectividad para un determinado proceso qulmico, se escogen entre ellos
aquellos que presenten una mayor estabilidad, siempre considerando su coste. Un
catalizador estable permite operar en condiciones de operación más productivas (por
ejemplo, aumentando la temperatura) y no exige reemplazarlo con frecuencia.
En un proceso enzimático, la enzima puede ir perdiendo actividad con el tiempo

de operación. La actividad remanente de la enzima en cada tiempo se define como:
a C~t OYJ.ioo [6.1]
Es decir, la actividad se obtiene como cociente de la velocidad a un cierto tiempo

de operación y la velocidad que se obtendría a tiempo cero de operación, en las mismas
condiciones de temperatura y de concentraciones de sustrato y de productos. Esta última
velocidad de reacción se calcula mediante el uso del modelo cinético discriminado para la
enzima libre y la inmovilizada en los apanados 3.2.2 y 4.2.3, respectivamente. La
velocidad ~ es la velocidad inicial de hidrólisis de ONPG en un experimento estándar de
medida de actividad con ONPG, que se lleva a cabo en discontinuo con cada muestra que
479
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragilis inmovilizada
se toma de enzima desactivada a tiempo dc operación t del reactor donde se produce la

desactivacion.
La disminución de actividad que experimenta la enzima hace que la conversión y,

por tanto, la producción disminuyan con el tiempo. Para predecir como cambia la
conversión de sustrato debida a la pérdida de actividad en el reactor es necesario
introducir en el balance de materia la velocidad (r<>(t)) como producto de la velocidad
(ro(O)) por la actividad a ese tiempo, lo que supone conocer la ecuación de desactivación
que permite calcular la actividad en función del tiempo de operación.
Los reactores que se utilizan en reacciones catalizadas por enzimas se pueden

clasificar en función de que la enzima actúe en la misma fase cii la que están sustratos y
productos (catálisis homogénea), en cuyo caso la enzima actúa en disolución o libre, o
bien que la enzima esté inmovilizada, formando parte de una fase sólida, distinta de la
fase líquida en la que se encuentran sustratos y productos, caso en el cual la enzima es un
catalizador heterogéneo. Cuando se utilizan enzimas en disolución, el reactor suele ser
discontinuo, agitado por hélice, turbina o por chorros de aire (reactor tipo airlift). Si se
pretende trabajar en continuo, evitando la pérdida de enzima, se debe colocar a la salida
del reactor un ultrafiltro, para separar la enzima de la corriente de productos y poder
recircularla al reactor. Otra opción es separar la enzima de la solución de sustratos y
productos reteniéndola en una bolsa de diálisis sumergida en el tanque donde están los
sustratos y los productos (Atkinson, 1986). En este caso, los sustratos pueden traspasar la
membrana y reaccionar, generando los productos, que difunden fuera de la membrana y
luego dejan el tanque por la corriente de salida.
Las enzimas inmovilizadas pueden utilizarse como catalizadores en reactores de

lecho fijo (Sanromán y col., 1991; Iborra y col., 1993; Blanes y col., 1998), en reactores
tipo tanque agitado en con el soporte activado en suspensión (CSTR) o dentro de una
cesta (BSTR) (Lin y Wei, 1979; Bódalo y col., 1993), y cn lechos fluidizados (Vos y col.,
1990 a,b y c; Kiesser y col., 1990 a y b). A partir de estos reactores básicos se han
diseñado algunos otros más complicados, pero similares a los anteriores en su
comportamiento: reactores tipo fibra hueca (Engasser y col., 1980), capilares (Peterson y
col., 1989) o monolíticos (Papayannakos y col., 1993). Los dos tipos de reactores más
480
utilizados han sido de tipo lecho fijo y tipo tanque con cesta o con la enzima en
suspensión. Varias configuraciones de reactores enzimáticos se muestran en los libros de
Wiseman (1985) y Atkinson (1986).
En reactores discontinuos, por su forma de operar, no se alcanza el estado

estacionario y la desactivación de la enzima supondría alcanzar conversiones menores de
las esperadas con el tiempo de reacción (que, en este caso, coincide con el de operación).
La puesta en marcha de un proceso enzimático en reactores continuos supone que

dentro del reactor cambia la concentración de los sustratos y de los productos con el
tiempo basta que se alcanza el estado estacionario. Este estado estacionado se observará
si la desactivación es suficientemente lenta. A partir de un cierto tiempo desde que se
alcanza el estado estacionario, en su caso, se puede observar que la conversión disminuye
con el tiempo de operación debido a la desactivación de la enzima.
Para modelizar el comportamiento del reactor hay que plantear el balance de

materia del sustrato en el reactor considerando los términos de:
• Acumulación (en reactores continuos es cero cuando se alcanza el estado estacionario)

• Entrada al reactor
• Salida del reactor (ambos nulos en discontinuo)
• Generación (debida a la reacción química)
De forma general:
Entrada + Generación Salida + Acumulación [6.2]
La generación incluye el término de velocidad de reacción, que puede expresarse

como:
r = r0 (t) a~ [6.3]
481
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de Kb fragilis inmovilizada
donde a es la actividad de la enzima y ~ es el factor de efectividad, que tiene en cuenta la

disminución en la velocidad del proceso debida a los fenómenos de transferencia de
materia en la capa de líquido estancado que rodea la partícula de soporte y dentro de los
poros, lo que puede generar gradientes de concentración de sustrato fuera y dentro de la
partícula del biocatalizador. Esta magnitud, como ya se ha indicado, varía entre O y 1.
Evidentemente, en el caso de enzima en disolución no se dan fenómenos de transporte y i~
vale 1.
Para los principales reactores antes citados se han aplicado los balances de materia
de la ecuación [6.2]. El resultado se muestra en la Tabla 6.1.
Tabla 6.1.- Ecuaciones de conservación de materia para varios tipos de reactores.
Reactor Balance de materia (ecuación [6.2])

Entrada Generación Salida Acumulación
Reactor discontinuo O — . O dC5
1 d(C
Reactor tipo tanque Q~ C5ent — (,u)~ . Q. c; 5 . V1)
continuo:
CSTR
* O (en estado
BSTR
Reactor con membrana de estacionario)
diálisis reactor con
ultrafiltro a la salida
Reactor tipo lecho fijo Q. C5 — . dv, Q . (c~ + dc) d(C5 . dV1)
df
O (en estado
estacionario)
Nota: en reactores que utilizan enzimas inmovilizadas se cumple que:
[6.4]
482
6.1.1.- Mecanismos de desactivacián de enzimas
Las fuerzas de unión que permiten la conformación nativa de la enzima son

débiles. Por ello, es natural que, con poca energía que se le aporte, pierda dicha
conformación y, por tanto, su actividad. Además, el gran número y diversidad química de
los aminoácidos que constituyen la enzima permite varias reacciones químicas cuyo
resultado final es una inactivación total o parcial de la enzima (Klibanov, 1979). La
enzima puede perder su actividad de forma reversible, por eliminación temporal de algún
ión o molécula orgánica que es fundamental para la actividad enzimática, o de forma
irreversible. En ciertas condiciones, algunos de los enlaces que obligan a la enzima a
tener su conformación activa se rompen, y la enzima se despliega, siendo este proceso
reversible. Sin embargo, la enzima desplegada es más susceptible de reaccionar
químicamente y, posteriormente, la enzima puede plegarse en una conformación inactiva,
que suele ser irreversible.
Los procesos de inactivación irreversible que se dan en las enzimas pueden ser
inter o intramoleculares (Klibanov, 1986; Guerra, 1997). Entre los primeros se encuentran
la agregación y la autolisis, mientras que los segundos se provocan por agentes externos,
tales como la temperatura, los cambios de pH, los detergentes, los agentes
desnaturalizantes, los metales pesados, las fuerzas mecánicas, los agentes oxidantes, el
enfriamiento, la congelación, las radiaciones, etc. A continuación se comentan
brevemente algunos de estos mecanismos.
1.-Procesos intermoleculares de desactivación
Agregación
Cuando las moléculas sufren desactivación reversible, los residuos hidrófobos que
contienen quedan más expuestos al exterior que en su conformación nativa. Para
minimizar este estado desfavorable, las moléculas se asocian entre sí mediante
interacciones intermoleculares de tipo hidrofóbico, formando agregados que precipitan
cuando alcanzan un determinado tamaño. Posteriormente, si la enzima tiene cisteinas en
la interfase con otras enzimas, se pueden formar puentes disulfuro.
483
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragilis inmovilizada
La agregación también puede ser el paso final de otros procesos de inactivación

debidos a factores extemos como el calor, la agitación, la presencia de disolventes orgá-
nicos, etc. Sin embargo, este mecanismo de inactivación puede ser reversible, siempre y
cuando no se hayan producido modificaciones químicas, mediante el uso de agentes
desnaturalizantes que eliminen las fuerzas hidrofóbicas, nO covalentes, que mantienen
unidos los agregados (por ejemplo, agentes caotrópicos como la urea o el cloruro de
guanidinio).
Auto/isis
Cuando la enzima es una proteasa puede producirse un proceso de autodigestión,

ya que estas enzimas rompen enlaces peptídicos localizados y pueden ser a la vez
catalizadores y sustratos. El aumento de la concentración de péptidos y restos proteicos de
bajo peso molecular en ciertas condiciones en las preparaciones de proteasas es debido a
este fenómeno (Schokker y Van Boekel, 1998).
II.- Procesos intermoleculares
Desactivación térmica
La inactivación térmica es probablemente el mecanismo más frecuente de inacti-

vación enzimática y ha sido, por ello, el más estudiado (Klibanov, 1978;Gianfreda y col.,
1991; Nohara y col., 1994; Tomazic y Klibanov, 1988; Erarsían y Kocer, 1992; Illanes y
col., 1996; Nath, 1996; Schokker, 1998). Desde un punto de vista industrial, un aumento
de la temperatura de operación aumenta la velocidad de reacción y elimina contaminación
microbiana. Sin embargo, puede afectar negativamente al rendimiento de la reacción, sí
ésta es reversible, y también afecta a la actividad de la enzima, produciendo una
disminución rápida de dicha actividad.
La inactivación térmica, como la mayoría dc los mecanismos de inactivación

irreversible, comienza con la etapa intermedia dc desactivación reversible comentada
anteriormente. Después puede darse la agregación de las moléculas de enzima, al quedar
484
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de Al. fragilis inmovilizada
los grupos hidrófobos más expuestos al exterior, o bien puede generarse una enzima cuya
conformación no es activa y, aunque la conformación original es más estable, al disminuir
la temperatura, la enzima permanece en la conformación inactiva porque existen
impedimentos cinéticos para que la enzima recupere la conformación nativa y activa.
Variación depil
Cuando el PH dc la disolución enzimática varía levemente, la actividad de la

enzima se ve modificada, ya que se protonan o desprotononan ciertos aminoácidos del
centro activo. Un cambio leve en el pH siempre es reversible, al cambiar el pH del medio
de nuevo al pH óptimo. Este hecho explica que, en general, el intervalo de PH en el que la
actividad en las enzimas es máxima es más pequeño que el intervalo de pH en el que la
estabilidad es máxima y está comprendido dentro del primero.
Los cambios importantes en el pH del medio respecto al punto isoeléctrico de la

enzima pueden originar agregación irreversible o iniciar reacciones químicas que
modifiquen de forma irreversible la estructura de las proteínas (Kheirolomoom y col.,
1998).
Presencia de disolventes orgánicos
El mecanismo de inactivación enzimática es diferente dependiendo de que los

disolventes sean miscibles o inmiscibles con agua.
Cuando se añade a la disolución enzimática un disolvente miscible, puede

enlazarse directamente con la enzima mediante interacciones hidrofóbicas o bien alterar la
constante dieléctrica del medio. Esto afecta al balance de fuerzas que mantienen la
estructura nativa de la enzima aumentando la solubilidad de los aminoácidos hidrofóbi-
cos y disminuyendo la de los más hidrofilicos. Se produce así una reorganización de la
estructura de la enzima en el nuevo medio que lleva a otra conformación, estable en este
medio, pero inactiva.
485
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de 1< fragilis inmovilizada
Si el disolvente que se añade es inmiscible en agua, la enzima permanece en la

fase acuosa, por no ser soluble en el nuevo disolvente. La formación de una emulsión
entre ambas fases aumenta enormemente la superficie de la interfase, favoreciendo que la
enzima entre en contacto con dicha interfase, en la que las interacciones hidrofóbicas
existentes producen una reorganización estructural de la enzima en la que los
aminoácidos hidrofóbicos interaccionan más con el medio externo que en la
conformación nativa de la enzima. Este efecto supone la desactivación de la enzima, un
fenómeno que se debe considerar cuando la enzima se utiliza como catalizador en medios
en los que una de las fases es un disolvente orgánico, como en la síntesis de péptidos
(Romero, 1997; Guerra, 1997; Nakanishi y col., 1986) o en reacciones de
transesterificación (Corréa de Sampaio y col., 1996; Griebenow y Klibanov, 1997;
Nagayama y col., 1998).
Acción de fuerzas mecánicas
Todas las proteínas pueden desactivarse por la acción de fuerzas mecánicas

normales o rasantes, por lo que, en ocasiones, aumentos de presión o de velocidad de
agitación pueden originar pérdidas de actividad (Manjon, 1985; Maa y Hsu, 1996 y
1997).
En algunos casos, una agitación muy fuerte puede originar una elevada velocidad
de inactivación debido al aumento de la interfase entre el agua y el aire. Como el aire es
muy hidrófobo, provocará una reordenación estructural inactivante en la enzima, pues
tiende a interaccionar con los aminoácidos hidrofihicos.
Acción de agentes oxidantes
La presencia de ciertos agentes oxidantes en el medio de reacción: oxígeno

molecular, peróxido de hidrógeno y radicales libres en general, puede provocar la
oxidación de ciertos aminoácidos como los que poseen la cadena lateral aromática, la
nietionina, la cisteina y la cistina que forman dos cisteinas (Hu y col., 1993). Como estos
residuos son de naturaleza hidrofóbica suelen encontrarse en el interior de la proteína, por
486
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de Al. fragilis inmovilizada
lo que, para que se dé esta desactivación, se debe provocar antes el desplegamiento

reversible de la enzima.
Acción de detergentes y tensoactivos
Los detergentes causan la desactivación de todas las enzimas ya que interaccio-

nan muy fuertemente con ellas, incluso a concentraciones muy bajas (Maa y Hsu, 1997;
Katakam y col., 1995). Este tipo de inactivación suele ser irreversible porque no es
posible eliminar todas las moléculas de detergente que se han unido a la enzima.
La mayoria de los detergentes están formados por una larga cadena

hidrocarbonada de carácter hidrófobo y una “cabeza” de tipo hidrofilico. Cuando se
añaden detergentes a una disolución acuosa, se disuelven por su parte hidrofihica y
tienden a formar micelas enfrentando a sus grupos hidrofóbicos. Cuando hay una enzima
en el medio, las micelas se forman alrededor de ella y se produce un cambio
conformacional en la misma, ya que sus aminoácidos hidrofóbicos tienden a mostrarse al
exterior, ahora de carácter hidrófobo. La enzima queda desactivada irreversiblemente.
Acción de agentes quelantes
Los reactivos quelantes de metales, como el EDTA, inactivan las metaloenzimas y

aquellas que requieren iones metálicos para su actividad, al formar complejos con dichos
iones. Esta desaetivación puede ser reversible o irreversible, dependiendo de que la
pérdidad del cofactor metálico provoque cambios conformacionales leves o profundos.
Acción de sales disueltas
Las sales disueltas a elevadas concentraciones pueden afectar a la enzima,

aumentando o disminuyendo su estabilidad. De forma general, pueden ordenarse los iones
según su carácter estabilizante sobre las proteínas de la siguiente forma:
(CH3)4N~> NH4~> K~,Na~> Mg2~> Ca2~> Ba2~

S042> Cf> BI>NOY>CIO$>SCN
487
Los iones situados más a la izquierda estabilizan las proteínas debido a que
reducen la solubilidad de los residuos hidrofóbicos, al aumentar la fuerza iónica de la
disolución. Además, favorecen la hidratación de las proteínas provocando un descenso en
la energía libre del sistema. Este efecto, denominado “sahing-out”, proporciona moléculas
de proteína más compactas y estables. Por el contrario, los iones situados a la
derecha se enlazan a los aminoácidos cargados o incluso a los dipolos, disminuyendo el
número de moléculas de agua de hidratación. Entonces, la molécula de proteína puede
desplegarse y desnaturalizarse, es el llamado efecto de “salting-in”.
Las enzimas no escapan de las exigencias técnicas a las que son sometidos los
catalizadores en general. Las enzimas son catalizadores muy activos y con una
selectividad alta. En la naturaleza, las enzimas funcionan en condiciones ambientales muy
controladas, lo que permite su estabilidad. Tales condiciones no son comunes en los
procesos industriales para los que se pretende utilizar las enzimas. Es cierto que la
utilización de enzimas supone una suavización de las condiciones de operación, pero no
lleva a recrear las condiciones ambientales a las que la enzima está habituada. Por tanto,
hay que modificar la enzima para estabilizarla o bien obtener enzimas estables por sí
mismas. La estabilización de las enzimas es, pues, uno de los aspectos más importantes
para alcanzar una utilización óptima de las mismas en diversos procesos industriales.
Estabilizar una enzima es una tarea complicada, dada la gran cantidad de mecanismos por
los que se puede desactivar debido a su compleja naturaleza polimérica. Para entender la
estabilidad de una enzima se ha de pensar que depende de que la enzima esté en una
conformación activa, normalmente la nativa.
En función del mecanismo de inactivación expuesto anteriormente, pueden

considerarse dos grupos de métodos de estabilización. En uno de ellos se previene la
inactivación reversible mediante procedimientos que consigan hacer más rígida la
estructura nativa de la enzima, desplazando el equilibrio que existe entre esta estructura y
la estructura desplegada hacia la forma nativa. El otro grupo de métodos de estabilización
se basa en evitar la desactivación irreversible actuando sobre los mecanismos que
provocan el paso de la forma desplegada a la forma plegada inactiva. Entre los primeros
métodos de estabilización destacan la reticulación y la inmovilización covalente de la
enzima.
488
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de Kifragilis inmovilizada
La inmovilización de la enzima puede estabilizar la actividad enzimática por

varias razones (Blanch y Clark, 1995):
La imposibilidad de que las proteínas fijadas se pueden mover libremente impide

cualquier mecanismo de desactivación basado en interacciones intermoleculares, ya
que estos mecanismos exigen plena libertad de movimientos de las proteínas que
interaccionan. Estos mecanismos son la autolisis intermolecular y la agregación. En
enzimas multiméricas, la inmovilización no excluye la posibilidad de que las
subunidades se disocien y se vuelvan a asociar en otra forma que no sea activa, por
tanto, la agregación intramolecular no se evita por inmovilización.
• La unión de la enzima al soporte por varios enlaces (inmovilización multipuntual)

reduce la movilidad interna de la enzima y crea nuevos enlaces que estabilizan la
configuración en la que queda finalmente la enzima al inmovilizarse. La modificación
de esta estructura requiere un mayor aporte energético y, por tanto, condiciones más
drásticas de desactivación que la enzima libre para perder el mismo porcentaje de
actividad.
• Las enzimas multiméricas (con más de una subunidad) ven reducida su desactivación
por disociación, siempre que el método de inmovilización permita que todas las
subunidades queden fijadas al soporte. Siendo así, se puede producir la disociación,
pero la cercanía de las subunidades separadas permite que se puedan volver a unir y se
recupere la actividad según desaparezca el agente desnaturalizante.
• El soporte puede evitar que ciertos agentes desnaturalizantes cargados puedan entrar
en contacto con la enzima, siempre que tenga una carga del mismo signo. Además, el
mismo soporte puede descomponer agentes desnaturalizantes según estos se
produzcan; por ejemplo, la formación de agua oxigenada en ciertas reacciones
enzimáticas puede contrarrestarse utilizando carbón activo como soporte, porque el
carbón activo descompone el agua oxigenada.
489
• La utilización de soportes cargados permite utilizar la enzima inmovilizada con

medios cuyo pH desnaturalizaría la enzima libre. El soporte neutraliza el pH de tal
forma que cerca de la enzima el pH es el adecuado para la acción estable de la misma.
• El soporte puede evitar que proteasas del medio entren en contacto con la enzima.
Esto sólo sucede cuando la enzima se inmoviliza creando una red polimérica durante
la inmovilización, pues en este caso la propia enzima no puede salir del entramado.
Por tanto, esta estabilización es válida cuando se utiliza entrecruzamiento o
atrapamiento, preferiblemente en este último tipo de técnicas de inmovilízacion.
6.1.2.- Modelizacián de la desactivacián de enzimas
La desactivación enziniática es la pérdida de la actividad por un uso prolongado de

la enzima en el reactor, lo cual indica que tiene una vida útil limitada, que influye en las
apreciaciones económicas en el momento de diseñar un bio-reactor. Desde un punto de
vista bioquímico, esta pérdida de estabilidad procede de una alteración de la estructura
que incide en la función de la proteína. En primer lugar, se trata de predecir la vida útil
dcl biocatalizador mediante modelos cinéticos obtenidos a partir dc datos experimentales
de actividad en función del tiempo de operación del reactor, pues estos modelos son los
que permitirán diseñar la operación del reactor cii condiciones de desactivación
enzimática. Estos modelos cinéticos se deben relacionar con los fenómenos químicos que
originan la desactivación de la enzima. De hecho, Lencki y col. (1992 ay b) han deducido
modelos cinéticos a partir de mecanismos de desactivación basados en reacciones reales
de desactivación de las enzimas.
La enzima presente en el reactor pierde su actividad principalmente por envene-

namiento y desnaturalización y, en algunos casos, por ataques microbianos (Wang y col.,
1980). Los efectos de pérdida de actividad por contaminación microbiana pueden
minimizarse utilizando una temperatura de trabajo próxima a 450C y valores de pH lejos
de la neutralidad. Cuando estas condiciones no pueden alcanzarse o no son adecuadas, la
alimentación puede prefiltrarse o tratarse con tolueno o formaldehido (Bailey y Ollis,
1986). Otra posibilidad es introducir limpiadores en pulso de tipo básico o ácido o utilizar
lisozima coinmovilizada con la enzima de interés.
490
La desactivación puede ser total o parcial. En el primer caso, la enzima evoluciona

hacia una forma totalmente inactiva. En el segundo caso, queda una forma de la enzima
que es más estable que la inicial, pero menos activa.
El desarrollo teórico de la desactivación enzimática considera dos posibilidades en

los mecanismos de desactivación, que sea lineal y afectada por la formación de una
especie intermedia o no lineal, considerando un grupo de sustancias intermedias. La
desactivación lineal de las enzimas puede representarse por reacciones simples de orden 1
o por reacciones complejas, cada paso de los cuales también puede ser de orden 1. Dentro
de estas últimas, se distingue entre desactivaciones en serie y en paralelo.
1-Mecanismos lineales de desactivación
Estos mecanismos consideran que una conformación de la enzima se transforma

en otra siguiendo una reacción de orden uno, irreversible o reversible, lo cual es válido
para muchas enzimas. Estos mecanismos incluyen fenómenos como la disociación de
subunidades, la desnaturalización, la descomposición química, la agregación y la
coagulación. De todos ellos, sólo la coagulación o agregación en la que se forman enlaces
covalentes entre las unidades de enzima da lugar a enzimas irreversiblemente inactivas.
Desactivación debida a una reacción simple
Muchas enzimas se desactivan siguiendo una reacción irreversible de orden uno.

El mecanismo más general, ya comentado, se basa en el paso de la conformación nativa a
la forma desplegada en una reacción reversible de orden 1 en ambos sentidos.
Posteriormente, la forma desplegada evoluciona hacia una configuración inactiva de la
enzima, que ya no puede volver a la forma inicial de la enzima, ya sea por impedimentos
cinéticos o termodinámicos. En cualquier caso, en las condiciones drásticas en las que se
inactiva la enzima, el paso irreversible es rápido y se puede considerar estado
pseudoestacionario para la forma desplegada de la enzima, y así deducir la velocidad de
formación de la forma inactiva irreversible. Si se tiene en cuenta esta simplificación, se
obtiene una cinética de orden 1.
491
Capítuio 6. Estabilidad de la enzima de Al. fragilis inmovilizada
ET7E, k2~D
[6.5]
d
Br, k1 CE
= ______ =
- 1<4 C1~~ - *2 C5,, O [6.6]
1<, E [6.7]
Sustituyendo la concentración de la especie desplegada en la velocidad de

formación de la configuración desactivada, D:
dcD
k~ 1< CE = k~ (Y [6.8]
1<1±1<,
Se suelen considerar sólo las formas plegadas y una constante de desactivación de

orden 1, k~í. Si se integra la ecuación, y se considera la definición de actividad, se llega a
la siguiente ecuación que liga la actividad con el tiempo:
C~(t) ti
[6.9]
CEO
En algunos casos (Henley y Sadana, 1986), la conformación de la enzima a la que

se llega mantiene una cierta actividad. Entonces el mecanismo que se propone y la
ecuación cinética que se deriva de él son:
E k., ~Et [6.10]
a(1~fl)ekí +/P [6.11]
donde ~3es la relación entre la actividad de la conformación final, E1, y la de la forma

nativa, E. Se considera, por tanto, que 3 es la relación entre velocidades iniciales de
reacción de la forma enzimática E1 y la forma enzimática inicial E, suponiendo que el
492
modelo cinético de la reacción catalizada por ambas formas enzimáticas es el mismo y

sólo varia la constante catalítica (k2) entre las das formas enzimáticas.
Otro mecanismo más complejo postula la existencia de un equilibrio químico entre

la forma nativa y la forma semidesactivada de la enzima (Sadana, 1988). En tal caso, si
las constantes cinéticas de las reacciones directa e inversa son similares, el
comportamiento cinético a tiempos cercanos a cero se asemeja a una reacción irrever-
sible de orden uno, cuya constante aparente viene dada por la ecuación [6.13]. El
mecanismo se presenta en la ecuación [6.12] y la ecuación integrada de la actividad en la
ecuación [6.14].
E ~iizÉi
E [6.12]
1<ob, =(1—/J)k [6.13]
a = (1— fi’ )(K

3 (1— e k,(I4K~.+Cp(t=C)) + fi’ [6.14]
2.- Desactivación en serie
En este caso se considera que la enzima evoluciona a sucesivas formas menos

activas y cada una de estas reacciones transcurre según un modelo cinético de primer
orden.
Algunos investigadores han destacado la existencia de algunas etapas que no

destruyen la actividad de la enzima, pero que son precursoras de otras que sí lo hacen.
Estudios experimentales acerca del plegamiento y desplegamiento de enzimas han
indicado que el proceso de desactivación es complejo, ya que las enzimas pasan de forma
continua de un estado estable a otro inestable, lo que afecta al grado de actividad de dicha
enzima (Alvarez y Meraz, 1993).
En función de las características de la enzima, ésta puede presentar uno o más

estados en el proceso de desactivación, de manera general dichos estados se pueden
esquematizar como:
493
Las relaciones de actividad de las sucesivas enzimas con la actividad de la enzima

nativa son, respectivamente, 1, Pi, P2,...P~, O. Por tanto, existe una forma nativa E, una
forma desactivada totalmente D y varias especies E, intermedias. Los coeficientes ¡3~
pueden ser inferiores a uno, en cuyo caso la forma enzimática i estaria desactivada
respecto a la inicial, o superior a uno, en cuyo caso se produciría una activación al pasar
de la forma inicial a la forma i de la enzima.
Por todo lo anterior, se puede considerar que los mecanismos de desactivación

involucran más de una etapa intermedia, por lo que la actividad dc la enzima con respecto
al tiempo puede definirse como:
a1+fi’1C1±fi’2C,±...+fi’nC,, z1+ Zfi’ C, [6.16]

¿=1
Considerando la actividad en función del tiempo de desactivación, se puede

demostrar que la actividad es función de las constantes cinéticas de cada etapa, según la
ecuación siguiente:
aEA¡ekl [6.17]
¡=
donde los coeficientes A~ son función de los coeficientes de actividad ¡3, y de las
constantes cinéticas. En el caso más sencillo (n=2) la actividad se calcula como:
______ ,JC’ 1<-—e

k,—k (6.18]
Un mecanismo también muy utilizado supone tres etapas de desactivación. Al

final de las mismas se obtiene una enzima que no es completamente inactiva (Henley y
494
Sadana, 1985, 1986 y 1987). El mecanismo y la ecuación integrada que liga la actividad
con el tiempo se muestra en las siguientes ecuaciones:
k, [6.19]
ajl±fi
1<,
1<21<1
_ fi’? 1<t1<~e-ki~
21) ~(fi’, ~ 1<, ¿*2/ ±fi’2 [6.20]
3.- Desaetivación en paralelo
La forma nativa de la enzima puede evolucionar en paralelo a varias formas

enzimáticas menos activas. Este mecanismo también es común cuando se utiliza una
mezcla de isoenzimas que se desactivan simultáneamente. En el caso de tres isoenzimas
que se desactivan simultáneamente al mismo tiempo, siguiendo reacciones elementales de
orden uno, el mecanismo es:
[6.21]
E, k2vD
£3 k3~D
La ecuación integrada de la actividad que se deriva de este mecanismo es:
+ ,fl, Al, ek21 + fi2 Al2 e

t±fi,M,±fi2M2 [6.22]
donde Pi y (32 son los cocientes entre la actividad dc las enzimas E2 y E1 y de las enzimas
E3 y E1, respectivamente, M1 y M2 son los cocientes entre las concentraciones iniciales de
las enzimas E2 y Ei y de las enzimas E3 y E,, respectivamente. Si, en vea de las tres
isoenzímas, hay una sola enzima que se desactiva por tres reacciones en paralelo, con
distintas constantes de desactivación, entonces la desactivación sigue una cinética de
primer orden sencilla cuya constante global de desactivación es la suma de las tres
constantes cinéticas del mecanismo propuesto.
495
En general, en un mecanismo que se representa por varias etapas elementales de

orden 1, tanto en serie como en paralelo (dado en la ecuación [6.23]), se puede modelizar
la actividad como una suma de exponenciales decrecientes, como sc muestra en la
ecuación [6.24].
* —~-> *
E«~Eí ~ E2 ... E
¡ 2 <3 [6.23]
Vi =l,n—l
a=~C~e~ ‘ [6.24]
¿=1
donde L¡ es una función de las constantes cinéticas de las reacciones directas, inversas y
de desactivación , siendo C, las constantes de integración (Henley y Sadana, 1986).
II. Desactivación no lineal
La desactivación de las enzimas encierra mecanismos complejos que pueden

suponer modificaciones en las que una o varias formas de enzima se combinan entre sí
para dar una o varias formas enzimáticas de mayor o menor actividad. Las posibilidades
bioquímicas son numerosas, sólo hay que considerar la variedad y número de los enlaces
químicos y de las interacciones fisicas que se dan en una enzima. Los comportamientos
no lineales en desactivación se explican desde esta variedad de posibles interacciones.
Cuando la velocidad de desactivación por un cierto mecanismo es mucho más

rápida que por los otros posibles mecanismos de desactivación, la desactivación suele ser
lineal. Sin embargo, cuando la desactivación se produce por varios fenómenos
simultáneamente suele ser no lineal (Lencki y col., 1992 b).
Los mecanismos de desactivación en serie pueden representar este fenómeno de

manera conceptual y resolver problemas asociados con la interacción enzima-sustrato, y
con las propiedades fisicoquímicas y regulatorias de las enzimas (Bailey y Ollis, 1986).
La principal desventaja de estos mecanismos es la dificultad que existe en la
496
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K.frugi/is inmovilizada
determinación experimental de los parámetros: los cocientes de actividad j3~ y las

constantes cinéticas k~.
En la desactivación no lineal, una o varias etapas de la serie de reacciones puede

ser no lineal. En este caso, los estudios experimentales consideran una actividad global de
la enzima, suma de las actividades de las distintas especies presentes en el medio, como
una función del tiempo. Los datos obtenidos se ajustan a una curva, comúnmente una
función de tipo polinómico, lo que permite que la desactivación no lineal pueda
expresarse como (Alvárez y Meraz, 1993):
da f(a,t)=K~a”f(C) [6.25]
En la ecuación [6.25] se relaciona la velocidad de desactivación con la actividad a

cada tiempo y con una función que depende de la concentración de sustrato; esta función
se introduce en la velocidad de desactivación cuando el sustrato provoca la desactivación
de la enzima o ésta está provocada por productos procedentes de dicho sustrato. Los
citados autores encontraron que, cuando se representan dos o más etapas de desactivación
en los mecanismos en serie, quedan agrupadas en una sola, de tal manera que la expresión
de la velocidad de desactivación está dada por la siguiente funcion:
dCE A
— dt = — K. (E~ — a)tm [6.26]
donde a es una constante que indica la actividad de las etapas que no están agrupadas.
Cuando las etapas están agrupadas en una sola, la velocidad de desactivación es la
siguiente:
[6.27]
siendo a~ la actividad residual y m el orden de la función que representa la desactivación.
497
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de Al.fragil~ inmovilizada
En enzimas multiméricas no es extraño observar una desactivación no lineal. Se

han descrito dos comportamientos diferentes: desactivación bifásica (Gianfreda y col.,
1985; Sadana y Henley, 1987; Lencki y col., 1992 b) y desactivación con un periodo
inicial que se podría considerar de latencia, en el cual la enzima apenas pierde actividad,
seguido de otro periodo de desactivación más rápida. Ejemplos de enzimas que se
desactivan por el primer mecanismo son las de la enzima dimérica luciferasa y la
fostatasa ácida (Chase, 1950; Gianfreda y col., 1984), desaetivaciones que transcurren de
acuerdo al segundo caso son las de la enzima hexamérica ureasa y la galactosil-
transferasa (Belon y Luisot, 1974; Tirrelí, 1978).
El mecanismo que se propone para la desactivación de la luciferasa es el

mostrado en la ecuación [6.24]. A partir de este mecanismo, aplicando la aproximación el
estado pseudoestacionario, suponiendo que la única forma activa de la enzima es la
dimérica, que los procesos de agregación y coagulación son muy lentos y que las especies
intermedias están en equilibrio, se deriva la cinética de desactivación dada en la ecuación
[6.29] (Lencki y col., 1992 b).
kj ¼
P _____ PP 2P — disociación—
2 ¡ ¡
<2
+ Pi —~---> Pt1 agregación — [6.28]

+ P~, ~“ P’~ —coagulación —
da 2 [6.29]
—~2X—(Y+4X)a±2Xa
dt
donde:
1< 1<2 2C
y Y~k. [6.30]
Por integración numérica de la ecuación [6.29] se puede obtener la relación de la

actividad con el tiempo.
Un mecanismo muy similar explica la desactivación con un periodo inicial estable

seguido de una desactivación rápida (ecuación [6.31]) (Lencki y col., 1992 b).
498
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de Al. fra gilís inmovilizada
P ¡1
_____ PP
3 3
4171311 2P — disociación —
P <PPP>3P [6.31]
1 ¡
3 —4
*3 >P’,•~ — agregación —
f~ ±P~«.A=L.4P*., —coagulación—
En este capitulo se estudia la desactivación de la enzima de K. fragilis,

empleándola tanto en disolución como inmovilizada. La actividad es función de la
concentración de enzima activa que queda en el medio de reacción a cada tiempo. Con el
objeto de determinar el modelo cinético de la desactivación de la enzima libre y de la
enzima inmovilizada se han propuestos varios mecanismos cinéticos: simples, en serie, en
paralelo a partir de una enzima activa inicial, en paralelo a partir de varias formas activas
de la enzima en equilibrio entre si. Los modelos propuestos suponen una o varias
reacciones elementales de orden uno. En el caso de que haya más de una reacción, se han
probado modelos en serie o en paralelo. Cuando las reacciones de desactivación
transcurren en paralelo, pueden afectar a una o a más especies de enzima activas,
existentes inicialmente en el medio de reacción. Estos mecanismos, junto con las
ecuaciones cinéticas que derivan de ellos, se muestran en las Tablas 6.2 a 6.5. Al ser
función sólo de la temperatura y del tiempo, cuando el proceso es isotermo se pueden
obtener ecuaciones integradas de la actividad en función del tiempo. Sólo en un caso de
los considerados, el modelo planteado para la desactivación de luciferasa por Lencky y
col. (1992 b) —modelo 14-, hay una ecuación diferencial que no puede integrarse
analiticamente para obtener la actividad a cada tiempo.
Para enzimas multiméricas se utilizan varios modelos, pudiendo aplicarse los

propuestos para enzimas en general (Lencky y col., 1992 a) y otros que se proponen
específicamente para estas enzimas y que incluyen el fenómeno de la disociación:
modelos como los propuestos para la luciferasa y para la ureasa por Lencky y col. (1992
b). De estos últimos y en el caso de la (3-galactosidasa de K. fragilis se propone el modelo
aplicable a luciferasa y otros dos modelos en los que existen dos especies enzimáticas a
499
tiempo cero en un equilibrio tal que las reacciones directa e inversa son rápidas
comparadas con las reacciones irreversibles de las que las dos especies enzimáticas son
los reactivos. Una o las dos especies enzimáticas pueden ser activas. Los dos últimos
modelos propuestos se basan en que hay varias formas enzimáticas de la ¡3-galactosidasa
de K. lacús en el preparado comercial (Nombre comercial: Maxilact; fabricante: Gist-
Brocades), así como en caldos procedentes de fermentación, correspondientes al
tetrámero, al trímero, al dímero y al monómero de la enzima (Surve y Mahoney, 1994;
Becerra y col., 1998). De estas especies enzimáticas (cuya existencia se ha determinado)
la más activa, o la más abundante, es el dímero. El tetrámero tiene alguna actividad
enzimática, no es seguro que el trímero tenga actividad alguna pero es evidente que el
monómero es inactivo. Los resultados de las electroforesis no parecen concluyentes sobre
la existencia del trimero, en particular los realizados en condiciones no desnaturalizantes
por Becerra y col. (1998). En estos modelos, el tetrámero y el dímero están en equilibrio,
disociándose este último en dos monómeros, que pueden agregar o desactivarse más
!entamente. Este conjunto de reacciones se describe con un modelo de orden 1. Además, a
partir de estos modelos cinéticos, se han propuestos otros modelos en los que la especie
dimérica evoluciona hacia más de una forma enzímática, tanto activa como inactiva.
Estos modelos se proponen en la Tabla 6.5.
En los modelos propuestos en las Tablas 6.2 a 6.5 para reproducir los datos
experimentales en los que existe más de una configuración activa de la enzima, la
constante o constantes (3 relacionan la actividad de las especies enzimáticas activas. Se
considera como 1 el valor de esta constante para la enzima existente a tiempo cero, pues
todas las actividades se refieren a la actividad de la enzima a tiempo cero.
En los modelos cinéticos en los que existe más de una configuración activa de la
enzima, la constante o constantes ¡3 relacionan la actividad de las especies enzimáticas
activas. En el modelo 3 las constantes (3 se incluyen en los términos preexponenciales. En
todos los modelos de las Tablas 6.2 a 6.5 que contienen estas constantes, estas pueden
variar o no con la temperatura. Por tanto, todos los modelos menos los modelos 1 y 7 dan
lugar a dos ecuaciones cinéticas diferentes según se considere o no que las relaciones de
actividad son constantes o variables con la temperatura. En el caso de que varíen con la
temperatura, se ha considerado que varían siguiendo la ecuación de Arrbenius, ya que son
500
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fiagilis inmovilizada
relaciones de actividades y, por tanto, de velocidades de reacción. En los términos

preexponenciales de los modelos de la Tabla 6.5, además de las relaciones de actividad
entre las formas enzimáticas (¡3), hay grupos de constantes cinéticas. Cuando estos grupos
son constantes de equilibrio puede que los términos preexponenciales apenas varíen con
la temperatura, ya que el intervalo de temperaturas de desactivación utilizado es
relativamente estrecho. Todos los modelos propuestos son aplicables tanto a la enzima en
disolución como a la enzima inmovilizada.
Una vez seleccionado los modelos cinéticos de las desactivaciones de la ¡3-

galactosidasa libre y de la inmovilizada, se han analizado los resultados obtenidos en un
reactor en continuo tipo BSTR con la enzima inmovilizada. Para ello, se han comparado
los valores de conversión experimentales con los calculados a partir del balance del
sustrato en este reactor, una vez introducida la cinética de la reacción enzimática y la
cinética de la desactivación.
501
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Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragihs inmovilizada
6.2.- MODELO CINÉTICO DE LA DESACTIVACIÓN DE j3-GALACTOSIDASA

DE 1<. fragilis EN DISOLUCIÓN
En este apartado se estudia la pérdida de actividad de la enzima de K. fragilis. Para

ello, la enzima se ha mantenido a una cierta temperatura en una disolución de lactosa de
50 gIL en tampón BM. A diversos tiempos de almacenamiento y para cada temperatura se
ha determinado la actividad de la enzima. Estos datos se han ajustado a los modelos
cinéticos propuestos en las Tablas 6.2 a 6.5, discriminando entre ellos y seleccionando el
modelo cinético que reproduce mejor y con mayor fiabilidad los datos experimentales de
partida. Posteriormente, La pérdida de actividad que predice el modelo seleccionado se ha
introducido en el modelo cinético de la hidrólisis de lactosa con la enzima de K. fragilis
en disolución, simulando la operación en un reactor discontinuo. Finalmente, se ha
simulado el comportamiento de un reactor tanque en continuo, en el que se retiene la
enzima con una membrana de diálisis o se recircula la enzima tras separarla de la
corriente de salida por ultrafiltracion.
6.2.1.- Discriminación del modelo cinético de desactivación
Las temperaturas estudiadas han sido 25, 40, 45 y 50”C. Se han tomando muestras
del matraz que contiene la enzima en la disolución de lactosa en tampón BM a varios
tiempos y se ha medido la actividad de dichas muestras. La medida de la actividad
remanente se ha llevado a cabo en todos los casos utilizando ONPG como sustrato según
el procedimiento del apartado 2.2.4. La evolución de la actividad con el tiempo de
incubación, para las temperaturas estudiadas, se muestra en la Tabla 6.6 y en la Figura
6.1.
Los datos experimentales de actividad frente a tiempo a varias temperaturas se han

ajustado por regresión no lineal utilizando el algoritmo de Marquardt (1963). Cuando el
modelo cinético de la desactivación no puede integrarse (modelo 14, por ejemplo) para
obtener un relación de la actividad frente al tiempo, al algoritmo de Marquardt se le
acopla una subrutina de integración numérica. Se han ajustado los datos con la
temperatura como variable porque, según se mostró en el capitulo 3, es el mejor método
desde el punto de vista estadístico y obliga a que las constantes cinéticas sigan una
507
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K.fragilis inmovilizada
tendencia lógica con la temperatura. Cuando se utiliza una regresión no lineal, se deben
conocer valores iniciales de los parámetros o conocer el intervalo adecuado para cada
parámetro. En el caso de (3, toma valores entre O y 1 habitualmente. En algunos casos,
puede ser superior a 1, pero nunca negativo; de esta forma, surgen varias combinaciones
de parámetros iniciales razonables. En algunos casos, el algoritmo de Marquardt no
converge, a pesar de haber partido de múltiples combinaciones de parámetros iniciales
que variaban en un amplio intervalo de valores. Esto ocurre con los modelos 3, 5, 11 y 19,
por lo que estos fueron descartados. Los parámetros a los que se llega con el resto de los
modelos propuestos en las Tablas 6.2 a 6.5 se recogen, junto con el valor del residuo final
y el de F, en la Tabla 6.7. Los parámetros que no cumplen alguno de los criterios
estadísticos o fisicos ya citados en los apanados 3 y 4 están sombreados.
Analizando la Tabla 6.7 se observa que los modelos 1, 2, 8, 15 y 17 pasan los

criterios estadísticos y fisicos. Estos modelos se ordenan de mayor a menor residuo
(SQR) de acuerdo a la siguiente secuencia: 1, 2, 15, 8 y 17. Los modelos cinéticos 1 y 2
suponen una sola forma enzimática que se desactiva o bien a una enzima inactiva o a otra
enzima menos activa. En cualquiera de los dos casos el residuo obtenido es muy alto, por
lo que se pueden descartar estos dos modelos, ya que reproducen nial los resultados
experimentales. El mal resultado de los modelos basados en mecanismos en serie no
parece apoyar esta vía de desactivación para la enzima. Los modelos con los que se
obtiene menor residuo son el 8 y el 17. El modelo 8 es el más sencillo y supone que la
enzima activa se desactiva por dos vías en paralelo, una rinde una enzima desactivada
mientras que la otra lleva a una enzima semiactiva. En el modelo 1.7 se considera otra
forma enzimática inactiva en equilibrio con la enzima activa inicial, que podría ser el
tetrámero. Según el estudio de Becerra y col. (1998) sobre la purificación de la enzima de
K. lactis, existen varias enzimas multiméricas en equilibrio, siendo la más activa el
dímero. El tetrámero puede estar en equilibrio con el dímero, el cual puede disociarse a un
monómero y también evolucionar a otro dímero más estable pero menos activo. Teniendo
en cuenta los resultados del ajuste no se puede elegir entre el modelo 8 (SQR=O,12) y el
17 (SQR=tO,115), pero parece que el modelo 17 es más adecuado según los estudios de
otros autores (Mahoney, 1978; Lencky, 1992 b y Becerra, 1998). Por tanto, el modelo
seleccionado para describir la desactivación de la enzima en disolución viene dado por las
ecuaciones [6.32 a] a [6.32 c]. En la Figura 6.1 se representan en forma de líneas
508
continuas la reproducción de los datos de actividad frente a tiempo de incubación (o

almacenamiento a la temperatura escogida) realizada con el modelo cinético 17 junto con
los datos experimentales de los mismos.
da _ dC~11~~,.0 + ,¿~ * dCv

[6.32 a]
dt dt dt
a=A, ek=t
[(1—/3* )e~k~í + [6.32 b]
k2 =exp(4O~77±19~2í—14768±5954
k3 =exP~jl24~2±l8~48—41418±5926 [6.32 e]
fi*j ~0,7O+011
A1 =1,05+015
Tabla 6.6.- Evolución de la actividad residual de la enzima en disolución con el tiempo

de desactivación en tampón BM con 50 gIL de lactosa.
0C 45”C 500C
Tiempo
0 (mm) 25”C
1 401 1
30 - . - 0,39
60 - 0,93 0,58 0,22
90 - - - 0,15
120 0,99 0,89 0,50 0,11
180 - - 0,47 0,06
240 0,98 0,81 0,40
300 - - 0,38 0,04
360 0,97 0,74 0,35
720 - 0,68 -
1080 - 0,50 0,16
1230 0,83 - -
1380 0,81 - -
1440 0,76 - 0,11

1980 . 0,27 -
2880 0,72 - -
3360 0,67 - -
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4502
Co
0.0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
tdesacthvaoión (mi n)
Figura 6.1.- Desactivación de (3-galactosidasa de K.fragilis en disolución.

tampón BM; C100 050g/L; Cgai oC~iu (J~0 g/L
510
Tabla 6.7.-Parámetros cinéticos obtenidos a partir de los datos de desaetivación de la

enzima de K. fragilis en disolución para los distintos modelos de
desactivación propuestos en las Tablas 6.2 a 6.5.
MODELO 1 2 (¡3tf(T)) 2 ([3=f(T))

Lnk0 1090+19,10 114,30±2261 10969+4164
E2/R 36390±6075 38026±7158 36542±13302
4
Ln(3 0 - 3*=ofl+0n¡ ~2i~-~73jI~7
Ea *IR - - ~$~i1I3±~~ Pa~
SQR 0,44 0,38 0,37

F 418 303 221
MODELO 4 ((34(T)) 6 ([34(T))

Ln k1 o 175,44±5668 24,70 + 2022
Eai/R 57984±18242 10532±5820
Lnk2o 212,68±9752 26,93+1943
Ea2IR 68817±30890 9082±6236
[
3¡ 4t4~4 42
(3* - —tii±4~64
SQR 0,33 0,13

F 195 295
8 ([3!=f(T)) 9 ((34(T))
¡. * 43,07±2036
14942±6254 ~“< t~ ¼
Lnk2o 1170±28,42 125,1+1862 1202+2762
Ea2IR 39016±9122 41706±6298 39905±8822
[3*~ 0,74±0,12 0,59±0,36
¡3 0 12+006
SQR 0,33 0,12 0,08
E 195 427 511
MODELO 8 ([34(T)) 9 (f3=f(T))

Ln k1 o 50,01 ±4772 84,56±17,70
EaiIR 17070±14500 28370±4722
Lnk20 122,9+16 86 t14x04~tt»’~70
E221R 40969 ±5422
Lii Vio -~K’R~~.g -65,29+12 06
Eaj<iIR ~j~4j~~j9 20449±3800
Lii (3*20 -
Ea ¿IR - -7832
SQR 0,11 0,044
E 368 651
511
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K. ¡tagilis inmovilizada
Tabla 6.7 (coit.).-Parámetros cinéticos obtenidos a partir de los datos de desactivación

de la enzima de K. fragilis en disolución para los distintos modelos de
MODELO 10 (f34(T)) 12 ((3!=f(T)) 13 (134(T))

170+11,96 1193+4,96
E211R 34493±8828 2117±3768 39590±1594
~&~dr~t’2AÚt0~ 01-1 ±t,19
Lnk20 66,02+3870 2427+11,12 4,51tii5~4
Ea2IR 22408±12450 9438±3533 S93B+4~É~Ul&
Lii k3 o 19,43 + 10 52 89 57 + 22,94 422±44t7.
Ea3IR 8488±3182 30540±7274 3840*14=310?
[3* 072±0084 2~$6af34o6
[3* t2U± -$
SQR 0,08 0,048 0,08

F 407 595 297
MODELO 1 5([3!=f(T)) 1 5([3zi(T)) 16(134(T))

Lnkío 116,4±1654 1163+1684 U57±t18220
Eai/R 38855±5288 38831 ±5394 38936*3,75 130v
A1 0,86+0054 Uh=A½0O27~t272 085+0058
Ln k20 - ii~, $~4~JtiSUi,8 115’6*1$1~4
Ea2/R - 3 St79Li SU3011
SQR 0,21 0,21 0,21
F 447 323 248
MODELO 17~33!=f(T)) 18([3!=f(T))

Lnk¡o 4277+1921 1228+2826
Eai/R 14768±5954 40755 ±9200
A1 070+011 0,11+0063
Lnk20 1242+1848 jZQ~6~±U6Z8
EazIR 41418±5926 t43< t~4S72
[3* 105±015 036t2 16
[3*2 - 0,95±0,059
SQR 0,115 0,075
F 358 450
512
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragilís inmovilizada
Tabla 6.7 (cont.).-Parámetros cinéticos obtenidos a partir de los datos de desactivación

de la enzima de K. fragilis en disolución para los distintos modelos de
MODELO 19(134(T)) 19(f3=zf(T)) 20(134(T))

1809+62,28 1294+1850
Eai/R 59764±20632 43248±5762
Lnk2o 1204+34,28 190,9+7358 6371+2250
Ea2IR 39993±8076 61899±23145 2,04l0~ ±71610~
Lnk30 - - 2432+916
Eas/R - 9580 ±2826
—~ 9~Y
Aí 9~4té~’ ~
A2 064+0,53 4 ~ 045+012
SQR 0,17 0,04

E 247 211 689
MODELO 21(jB!=f(T)) 22(134(T))

Lnk¡o 151,1+1524 1055+1148
EaiIR 50214±4836 35364±3640
Lnk20 23,18+476 1,73+1034
E~2IR 9527 ±1408
Lnk30 ~--¡* -1888+6001
E231R - -, t¡~ - - 4%7$~i$hd$~p8
Aí 0,56±0064 0,61 +0074
A2 0,42 ±0068 9043 ±S~P54
(3*i W0~$&~-~ ~0,027Jt~
th4I3
(3* - 8?89±~1O42
SQR 0,017 0,013
E 1401 1588
513
6.2.2.- Simulación de reactores tanque en discontinuo y continuo con desactivación
Una vez seleccionado el modelo cinético 17, que recoge la ecuación [6.42], se
pueden permite predecir los datos experimentales de actividad frente a tiempo y teniendo
en cuenta el modelo cinético de la reacción de hidrólisis de lactosa con enzima de K.
fragilis en disolución seleccionado en el capítulo 3 (apartado 3.2.2, ecuación [3.79]), se
pueden resolver los balances de materia para reactores tanque discontinuo y continuo y
simular el comportamiento de estos reactores. En el caso del reactor discontinuo, en la
simulación se han escogido las condiciones de algunos experimentos de hidrólisis de
lactosa llevados a cabo a 400C y a 250C (a 40’JC se eligen los experimentos LL51, LLS7 y
LL6I, de la Tabla 3.13; a 250C, los experimentos LL25, LL3O y LL36, de la Tabla 3.10)
para poder comparar los valores calculados con los datos experimentales y con la
reproducción en ausencia de desactivación, como se muestra en las Figura 6.3. En los
experimentos seleccionados, la concentración inicial de lactosa es 50 g/L y las de glucosa
y galactosa de O g/L; las concentraciones de enzima varían entre 2,33 y 7 mg/L. Como se
puede observar las simulaciones que se obtienen considerando o no la desactivación son
muy similares . Esto es así ya que los tiempos de reacción son lo suficientemente bajos
como para que la enzima apenas se desactive.
En la Figura 6.3 se muestra la simulación obtenida para reactores tipo tanque en

los que la enzima en disolución se retiene, bien mediante membrana de diálisis, bien
separando la enzima de la corriente de salida por ultrafiltración y recirculándola al
reactor. La simulación se ha realizado a varias temperaturas con el modelo cinético de
hidrólisis de lactosa y el de desactivación de la enzima en disolución. En esta simulación
se ha considerado que la enzima retenida en la membrana de diálisis actúa como si
estuviera libre en el medio de reacción, es decir, se supone que la difusión a través de la
membrana es suficientemente rápida como para que la concentración de sustrato dentro
de la membrana coincida con la concentración del mismo fuera de ella. También se
supone que la enzima se recircula completamente al reactor, evitándosc retenciones de la
misma en la membrana del ultrafiltro con la consiguiente disminución de la concentración
de enzima en el reactor. Como se puede observar en la Figura 6.4, la desactivación no es
importante hasta temperaturas superiores a 250C para el intervalo dc ticmpo considerado.
514
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K.fra gilís inmovilizada
1.0
1.0
A
A- -
e 0.8
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• 50 2.3> LL3O
-
• 50 4,66 LL3O 0.2
0.2
A 50 7 [1.25
— S*mu¡ación modelo h¡dróIis¡s
— — Simulación modelos hidrólisis4-desaclivación
0.0 400 600 600 100012001400160018002000 0.0

0 200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400
t. C2 (min.mg II) t. CE ( min.mg II)
Figura 6.2.- Comparación de datos experimentales de hidrólisis de lactosa con enzima de K

fragilis en disolución con datos simulados utilizando sólo el modelo cinético representativo de la
reacción de hidrólisis o datos simulados con el acople de dicho modelo y el modelo de
desactivación de la enzima elegido.
1.0
0.9
0.6
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Figura 6.3.- Simulación de un reactor tanque continuo de membrana o con ultrafiltro a la

salida.
515
6.3.- MODELO CINÉTICO DE LA DESACTIVACIÓN DE LA (3-GALACTOSI-

DASA DE K. fragilis INMOVILIZADA
Para medir la estabilidad de la enzima inmovilizada, se han llevado a cabo varios

experimentos en un reactor continuo tipo BSTR (reactor tanque agitado con cesta) y en
reactor discontinuo. En ambos tipos de reactor, la enzima inmovilizada se ha mantenido
en tampón BM con una concentración inicial de lactosa de 50 gIL. En discontinuo se ha
estudiado la desactivación a 25, 40 y 450C, mientras que en continuo se ha estudiado
dicho fenómeno a 6, 15, 25 y 400C. En ambos casos, se han tomando muestras de sólido a
determinados tiempos de contacto con la disolución de lactosa a la temperatura en estudio
y se ha medido su actividad remanente con ONIPG como sustrato, siguiendo el protocolo
descrito en el apanado 2.3.4. Los datos de la actividad remanente frente al tiempo de
desactivación se muestran en la Tabla 6.8. Como se observa, a las temperaturas en las que
se ha experimentado en continuo y en discontinuo los datos han sido muy similares y en
la Tabla 6.8 se muestran las medias a cada tiempo.
Como se hizo con la enzima libre se han considerado los modelos cinéticos de las
Tablas 6.2 a 6.5 para ajustar los datos de actividad remanente frente a tiempo y se ha
considerado la temperatura como variable en la regresión no lineal utilizada en el ajuste.
Los parámetros obtenidos para los citados modelos y sus intervalos de confianza, junto
con el valor del residuo y de E, se muestran en la Tabla 6.9. Los parámetros que no
cumplen algún criterio estadístico o fisico están sombreados.
De nuevo, algunos de los modelos cinéticos de los considerados no convergen, por

lo que se descartan; son los modelos 5, 10, 11 y 14. Los modelos cinéticos de los
propuestos que cumplen con los criterios estadísticos y tísicos (aplicados en los capítulos
3 y 4), ordenados de mayor a menor residuo, son los modelos 1,2, 15, 7, 16, 8, 17, 24, 9,
18, 20 y 19 con las constantes A en función de la temperatura. Los modelos 1, 2, y 15
tienen un residuo que es un orden de magnitud superior al de los demás modelos, lo que
implica que pueden descartarse porque reproducen mal los resultados experimentales.
También se observa que, como ocurría con la enzima en disolución, los modelos basados
en mecanismos de desactivación en serie dan parámetros que no pasan los criterios
estadísticos y fisicos o no convergen, por lo que esta forma de desactivación parece que
516
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de 1<. fi-a gilís inmovilizada
se puede desartar para esta enzima. Los modelos 16, 17, 19, 18, 20 y 19 con las
constantes preexponenciales (A1, A2 —ecuación [43 b]) en función de la temperatura se
basan en mecanismos en los que existen dos fases de desactivación o dos formas
enzimáticas en equilibrio. Los modelos 7,8 y 9 se basan en mecanismos en los que una
enzima se desaetiva por dos reacciones diferentes, dando enzimas semiactivas o inactivas.
En principio, ninguno de los dos mecanismos se puede eliminar, puesto que no está bien
definida la existencia de varias formas de asociación de monómeros para la enzima de K.
fragilis, como lo está para la de K. lactis (Becerra, 1998). Lo que si se observa en el
estudio de Mahoney y col. (1978) es que la enzima tiende a agregar, formando incluso
asociaciones de diez subunidades, lo que apoyaría los mecanismos que incluyen la
disociación de subunidades. No obstante, al observar las energías de activación de las
constantes de desactivación de estos modelos cinéticos se ve que se diferencian en un
orden de magnitud, lo que apoyada que hubiera dos mecanismos de desactivación, uno
que predomina a temperaturas bajas (el de menor energía de activación) y otro a
temperaturas altas, A las temperaturas más altas, la desactivación podría ser debida a
reacciones de la enzima con la superficie del soporte, si todavía tiene grupos reactivos que
no hayan sido anulados por la acción del borohidruro sódico que se añade para detener la
inmovilización.
Por tanto, no se puede seleccionar definitivamente ninguno de los modelos

basados en disociación o en reacciones en paralelo a partir de una sola enzima. Aún así,
se ha elegido el modelo cinético con menor residuo de todos (SQR= 0,023), el modelo 19
con las constantes preexponenciales A como funciones de la temperatura. Los parámetros
cinéticos de dicho modelo tienen unos intervalos de confianza más estrechos que los de
otros modelos propuestos entre los que se discrimina, lo que también apoya esta elección.
El modelo 19 se basa en un mecanismo que predice la existencia de dos especies
enzimáticas activas en equilibrio que evolucionan, por separado, a especies enzimáticas
inactivas; las especies enzimáticas activas pueden ser el tetrámero y el dímero. En la
ecuación [6.33] se muestran las ecuaciones diferencial e integrada del modelo cinético
seleccionado, junto con las expresiones de sus parámetros en función de la temperatura
La reproducción de los datos experimentales con el modelo cinético 19, junto con estos,
se muestra en la Figura 6.4.
517
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K.fragilis inmovilizada
dad/CEI
+ dC82 [6.33 a]
dt dt pi
dt
a A1 [6.33 b]
~-k,t + A2 kv
k 6520±986,2Á
2 14,60+338
T )
159,3+32 44~5l935±l0246) [6.33 c]
A zzexp~ —4,84+272 + 1278±782~6
A, exli¿ 5,65+404±1966±1226)
Tabla 68.- Evolución de la actividad residual de la enzima inmovilizada con el tiempo de

desactivación en tampón BM con 50 g/L de lactosa.
0C 150C 250C 400C 450C

tiempo 6
(mm)
0 1 1 1 1 1
30 - - - 0,73
60 - - - 0,93 (0,95-0,91) 0,55
120 - - - 0,89 (0,96-0,82) 0,38
1 80 - - 0,93 (0,97-0,89)
240 - - - 0,81 (0,84-0,28) 0,24
300 - - - 0,18
360 - - 0,85 (0,90-0,80) 0,74 (0,72-0,26) -
510 - - - 0,40 (0,45-0,35) -

540 - - 0,78 (0,84-0,72) - -
600 - 0,78 (0,70-0,86) - - -
690 - -
800 0,97 -
1380 - - 0,65 (0,63-0,67) 0,27 (0,33-0,21) -
1440 0 0,68 (0,65-0,71) - - -

1680 0,85 - 0,57 (0,49-0,65)
1980 - - - 0,08 (0,10-0,06) -
2880 0,74 0,57 (0,59-0,55) 0,40 (0,43-0,37) - -
3360 - -
4100 0,61 0,48 (0,50-0,46) - - -

5400 0,57 0,43 (0,40-0,46) - - -
7100 0,53 0,40 (0,42-0,38) - - -
Nota: En las temperaturas a las que se han llevado a cabo experimentos de desactívación en
continuo y en discontinuo se indica entre paréntesis el valor de la actividad remanente tanto para
el experimento en continuo como para el discontinuo y por ese orden.
518
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de I’C. fragilis inmovilizada
1.0
0.8
0 0.6
o,
1.-
Co 0.4
(-3
cC 0.2
0.0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
tdesactjvaciÓn (mi n)
Figura 6.4.- Desactivación de [3-galactosidasade K. fragilis inmovilizada.

tampón BM; Ciac o 50g/L; Cga¡ oCg¡sí ~=0g/L
519
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K.fragilis inmovilizada
Tabla 6.9.-Parámetros cinéticos obtenidos a partir de los datos de desactivación de la

enzima de K. fragilis inmovilizada para los distintos modelos de
MODELO 1 2 ([34(T)) 2 ([3=f(T)) 3 (¡34(T))

Lii k0 30,01 + 5 06 32,37 + 6 36 22,93 + 11 42 131Ó94t
E~IR 11289±1534 11853±1870 8839±3428 S$~flt
- 020+0,19 E 0,50+018
E~gE3~Ib6&v 3176
Lii K00 - - -
EaK/R - 9544 ~894

SQR 0,55 0,51 0,36 1,21
F 338,6 226 191 84
MODELO 4 (¡3!=f(T)) 4 (134(T)) 6 ([34(T))

Lnk10 15,22+324 23,03+246 399+242
E~i/R 6864+9642 8878±7582 4011±393,4
Lii k20 -87,82+6071 823,4+62001 401 + 1 56
EazIR I0a~j:I1~$$ ~ 4008+ 10 44
[3*~ $~Z1~4 Ln [3o7 75 + 5 12 —Ú,744Z34
EapIR 2533±1526
[3*
SQR 0,098 0,05 1 0,35
F 559 850 149
MODELO 7 8 ([34(T)) 9 ([34(T))

Lnk10 9,61±400 1061+390 1034+3,42
5257±1144 5358±1124 5374±982,5
Lnk20 120,8+2608 124,7±23,12 1403±25,10
E221R 40026±8274 41263±7358 4605±794,7
[3*~ - 0,32+0105 031±0096
[3 023+011
SQR 0,074 0,048 0,034
F 988 1135 1247
520
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K.fra gilís inmovilizada

de la enzima de K. fragilis inmovilizada para los distintos modelos de
MODELO 8 (f34(T)) 9 ([3=f(T))

Lnkí0 3,48+1064 3,37+1166
EaiIR 3275±3156 3241±2678
Lnk20 119,2+2667 157,9+6998
Ea2IR 39550±8392 51646±21789
~9$&7.*i#t;.g
Ea g*iIR t24t~ t~2~43
Lii [3*20 -
Ea *IR - 1,8, ~4Oi« A~.I0~.40/
SQR 0,044 0,025

F 981 1159
MODELO 12 ([34(T)) 13 (¡3!=f(T))

Lnki0 28,90+364 4,00±198
Eai/R 11057±1114 4000±1080
[31 15,18+8843
Lii k20 72,32 +_1548 4,00±234
Ea2IR 22882±4490 4000±2014
Lnk30 525,54±1498 14171+3625
[3*2 ~4.
~4LL-.~
46480±11760
9,53±86,58
¡33 - 0,24±0,13
SQR 0,019 0,030
F 1528 837
MODELO 1 5(f34(T)) 1 5Q3=f(T)) 16(134(T))

Lnk10 2598+5,04 26,28+719 9,73±3,98
Eai/R 10104±1532 10193±2174 5334±1146
A1 085+0,09 6 0,93±004
Lnk20 - 6~Z 1188+2388
EaiIR - - 39413±7562
SQR 0,35 0,35 0,053
F 265 191 1004
521
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragílís inmovilizada

de la enzima de K. fragilis inmovilizada para los distintos modelos de
MODELO 17fl3!=f(T)) 1 S(¡34(T))

Lnk10 139,1±26,58 1391±2658
E211R 45680±8400 45680±8400
Aí 023+012 0,23+012
Lnk2q 1060+360 1060+360
Ea2IR 5379±1014 5379±1014
[3*1 030+012 0,30±012
[3*2 - 0,99±0 052
SQR 0,045 0,034
F 948 1024
MODELO 1 9Q34(T)) 1 9fl34(T)) 20Q3!=f(T))

Lnk10 13,71+254 14,60+338 1036+7,26
EaiIR 6148±784,2 6520+9862 5163±2172
Lnk20 211,12+3986 1593+3244 1739±40,04
E221R 68341±12556 51935±10246 56626±12604
Lii It10 1246+12,31
E011R 6387±3560
A1 0,61 +0061 LnA1=-484±2,72 044±0,18
EaAi/R = 4278±782,6
A2 0,41±0049 LnA2=565+404 057+0,16
EaAZIR 1966±1226
SQR 0,036 0,023 0,025
F 1193 1259 1181
MODELO 21(134(T)) 22([34(T))

Lnk10 1040+896 1933±18,08
EaiIR 5163±2600 62729±5688
Lnk20 Wií.Á$ 44 11 44±2,36
Ea2/R 6642±3446 5583 ±621,6
Lii k30 177 64 + 62 02 ZZ3$$ t. 1092
Eaí/R 57789±19543 t8035~ t 1,6$21O~

A1 0,45±0,32 048+014
A2 0,55±0,28 053+016
[3*~ 9~+~t36 it
[3* - i4~o7it0
SQR 0,025 0,072
1007 324
522
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragílis inmovilizada
6.4.- COMPARACIÓN DE LOS MODELOS DE DESACTIVACIÓN DE LA

ENZIMA LIBRE Y DE LA INMOVILIZADA
Comparando los resultados de actividad frente a tiempo de las Figuras 6.1 y 6.4 se
deduce que la enzima libre es más estable en el tampón BM en presencia de lactosa que la
enzima inmovilizada. En este caso, la inmovilización desestabiliza la enzima. Este hecho
puede deberse a:
• pérdida de la enzima por lavado,

• reacción de la enzima con la superficie,
• presencia de estabilizantes en la enzima libre.
En el primer caso, el enlace de la enzima con el soporte se rompe y ésta se difunde

hacia el seno del líquido, abandonando el reactor en la corriente de salida. Sin embargo,
se comprobó que el enlace de la enzima al soporte es fuerte rellenando una columna de
cromatografia con inmovilizado y lavando dicho inmovilizado con soluciones acuosas de
NaCí a varias temperaturas y con agua a distintos valores de pH. Por absorbancia en el
ultravioleta y por colorimetría, se observó que no había proteína en el eluyente que salía
de la columna. Además, con varios meses de almacenamiento de los inmovilizados en
nevera a 4”C tampoco se observó presencia de proteína en el tampón BP utilizado para el
almacenamiento de los inmovilizados.
Respecto a la segunda causa, puede deberse a que la superficie del soporte puede
quedar activa a pesar del tratamiento con borohidruro sódico, ya que este no asegura la
reducción de todos los grupos aldehido superficiales que no hayan reaccionado con la
enzima.
En el tercer caso, la ausencia de estabilizantes, puede deberse a que la enzima libre

en solución comercial (Lactozym) se ha estabilizado en glicerina al 50%. La enzima en
disolución que se añade al tampón BM con lactosa para estudiar su desactivación tiene
tales estabilizantes, posiblemente muy ligados a la misma enzima. La enzima
inmovilizada carece de ellos. La inmovilización elimina tales estabilizantes por lavado.
523
Si se comparan los modelos cinéticos seleccionados para la enzima libre (ecuación

[6.42]) y para la enzima en disolución (ecuación [6.43]), se observa la existencia de dos
reacciones de desactivación, cada una de ellas predominante en un rango de temperaturas:
la reacción con la energía de activación mayor es la dominante a temperaturas más altas,
mientras que la de energía de activación baja es la que predomina a temperaturas bajas.
Además, mientras que en la enzima en disolución parece que existe sólo una forma activa
inicial, el modelo elegido para la enzima inmovilizada sugiere que hay dos formas activas
iniciales en equilibrio entre sí. Este resultado supone que en la solución comercial parece
que existe una forma activa, probablemente el dímero, aunque en la enzima de K. ladis se
ha observado dos formas activas (Becerra, 1998). La inmovilización parece que genera
dos formas enzimáticas en equilibrio entre si que no existen en disolución, lo que apunta a
que el equilibrio entre el tetrámero y el dímero que se podría postular según los resultados
de purificación de Becerra y col. (1998) no existe. Estas dos configuraciones enzimáticas
se podrían diferenciar en sus interacciones con la superficie del soporte, apoyando la
hipótesis de que la actividad química de esta superficie no se ha eliminado completamente
con el borohidruro sódico. Estas interacciones tendrían un carácter reversible,
permitiendo la interconversión de una configuración enzimática en la otra y viceversa.
Otro hecho que diferencia los modelos de la enzima libre e inmovilizada es que la
enzima en disolución puede evolucionar hacia una configuración activa, siendo ésta la
desactivación predominante a temperaturas altas (por encima de 40”C), mientras que las
formas inmovilizadas evolucionan hacia especies inactivas. La inmovilización supone una
pérdida de actividad respecto a la enzima en disolución, lo que implica que la enzima
inmovilizada es termodinámicamente más inestable que la libre. Esta inestabilidad la hace
más propensa a sufrir desactivaciones irreversibles, mientras que la enzima libre puede
desplegarse a formas que conservan gran parte de la estructura tridimensional del centro
activo y, por consiguiente, de su funcionalidad.
524
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragílis inmovilizada
Tabla 6.10.- Resumen de los modelos cinéticos de desactivación elegidos para la enzima
libre y para la inmovilizada.
Enzima Modelo Parámetros cinéticos

En disolución 17
a A1 Ck2t [(1 — ,L3*úek3É + /3*1 ]
¾= exP?4o~77+í9 21— 14768±

4lS±5926j
k3=exp(¿l24~2±1848— zll
fi*~ ~070+O,1l
A = 1,05 ±
0,15
Inmovilizada 19
a A
1 ¿k21 + A2 ~k3í
¾= exp~l4,6O+3 38— 6s2O±986~2j~
¾=exp~l59~3±32~ 51935 ±10246)
A = exP¿—4~84±272±
1278±782~6)
A2exPI¿5~65+404±1966 ±1226)
6.5.- REACCIONES DE HIDRÓLISIS DE LACTOSA EN UN RSTR CON [3-

GALACTOSIDASA DE K.fragilis INMOVILIZADA EN CONDICIONES DE
DESACTIVACIÓN Y SU SIMULACIÓN
Con el objeto de comprobar si el modelo cinético determinado para la reacción de

hidrólisis de lactosa por [3-galactosidasa de K. fragilis inmovilizada y el modelo de
desactivación de la enzima son capaces de describir operaciones en continuo se llevaron a
cabo varios experimentos cinéticos en un reactor de mezcla completa tipo cesta descrito
0C, introduciendo
en el apartado 2.3.1. Se estudiaron las temperaturas de 6, 15, 25 y 40
como alimentación al reactor una solución de lactosa de 50 g/L en tampón BM.
525
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragílís inmovilizada
Como el volumen de reacción en el tanque es unas diez veces mayor que el

utilizado en los experimentos dc hidrólisis de lactosa en discontinuo, se han realizado
unos experimentos previos para asegurar que no hay zona muerta y que la agitación del
medio de reacción es suficiente para evitar el control de la velocidad del proceso por la
difusión extema.
Determinación de la inexistencia de zona muerta en el BST.R
Para determinar el comportamiento fluidodinámico de un reactor real se utilizan

técnicas de estímulo-respuesta, introduciendo en el reactor una señal en impulso o en
escalón de un determinado trazador y determinando la concentración del mismo a la
salida. Para que un reactor real, tipo BSTR en este caso, se acerque en su comportamiento
fluidodinámico a uno de tipo ideal, no deben existir zonas muertas, donde se estanque el
fluido, ni cortocircuitos que favorezcan la salida de los reactivos sin que estos se mezclen
con el resto del medio de reacción.
- -.
En el equipo utilizado para la experimenuacion en continuu se

~ .1.~
evitauu ‘Ob
cortocircuitos alejando la entrada y la salida del reactor, puesto que la solución de lactosa
en BM entra por la parte superior del reactor y la salida del medio de reacción se lleva a
cabo por el fondo del reactor. Además, el líquido que entra cae directamente sobre una
turbina para favorecer su mezcla con el medio de reacción.
Para determinar posibles zonas muertas, se han llevado a cabo experimentos de

estimulo-respuesta tipo escalón inverso a varias velocidades de agitación: 800 y 1600
r.p.m. y a varios caudales de entrada de la alimentación. Para ello, sc ha realizado un
escalón inverso, llenando el reactor con una solución de KCI 0,1M e introduciendo a
tiempo cero como alimentación del reactor agua destilada. Se van tomando muestras a la
salida del reactor y se mide su conductividad, comparándola con la de la disolución
inicial. Esta conductividad es proporcional a la concentración de sal en la corriente de
salida.
526
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragílís inmovilizada
Se define la curva 1-F como el cociente entre la concentración de trazador a cada

tiempo de muestreo y la concentración inicial de trazador (ecuación [6.35]).
Al ser un
cociente, la concentración puede sustituirse por cualquier propiedad del medio
proporcional a ella, como la conductividad (ecuación [6.34]). La integral de dicha curva
respecto al tiempo es el tiempo medio de residencia de una molécula de trazador en el
reactor. Si se define el tiempo adimensional O como el cociente entre el tiempo real y el
tiempo de residencia (ecuación [6.36]),
la integral de la curva 1 -F frente a O debe ser 1 si
no hay zonas muertas. Si es menor que 1 hay zonas en las que el medio de reacción está
algo estancado porque no le llegan las líneas de corriente con la suficiente fuerza para
provocar la mezcla. En este caso, el volumen útil del reactor sería inferior al volumen
total de medio de reacción. Los resultados se muestran en la Figura 6.5. Como se observa
en dicha Figura, los valores del área de 1-F frente a O en los dos experimentos realizados
son aproximadamente la unidad, por lo que no existe zona muerta. Como los
experimentos se han llevado a cabo con los caudales mínimo y máximo que se han
utilizado después en los experimentos de hidrólisis, se asegura que, con una velocidad de
agitación de 1400 r.p.m. no hay zonas muertas a caudales iguales o inferiores a 0,5 L/h, y
que, aunque se emplee una velocidad de agitación de 800 r.p.m., si el caudal de
alimentación es menor o igual a 0,1 L/h, tampoco existen dichas zonas en el reactor.
Concentración(M) = 84,4- conductividad(pS) [6.34]
Co
9=: [6.36]
trid ch,
527
1.0
0.8
0.6
LL
0.4
0.2
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
o
‘u’
1.0
Expednunta2
m Q=0,025 LJh, vel.agit.=1400 r.p.m.
0.8 - t,~0=25h
te,i&rna=24 h
t~=65 h
0.8~- Pjea=1 06
u-
r
0.4 ‘ua
u
0.2-
u
u
U.U
u
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
o
Figura 6.5.- Experimentos de estimulo-respuesta en escalón inverso para determinar la

zona muerta en el reactor BSTR.
528
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de 1<. fragilís inmovilizada
Influencia de la velocidad de a2itación sobre la velocidad de reacción en el BSTR
Con el objeto de determinar la velocidad de agitación mínima que elimina

probables resistencias difusionales en la película externa, se han llevado a cabo
experimentos similares a los realizados con los reactores en discontinuo con el mismo fin,
en el apartado 4.2.2. Estos experimentos se han realizado en discontinuo en el reactor
BSTR que se ha utilizado posteriormente en los experimentos de hidrólisis en continuo.
Los experimentos se han realizado en tampón BP, empleando ONPC como sustrato en
una concentración de 0,5 gIL, una temperatura de 250C y un inmovilizado cuyo diámetro
de partícula era de 0,65 mm y cuya concentración de enzima era de 0,35 mg/g de soporte.
Con este inmovilizado se asegura que la difusión en los poros es rápida y no controla la
velocidad del proceso, como se demostró en el apanado 4.2.2. Se ha variado la velocidad
de agitación entre 300 y 1400 r.p.m., utilizando el protocolo descrito en el apartado 2.2.4.
Se ha empleado ONPG como sustrato, ya que su hidrólisis es más rápida que la de
lactosa, por lo que, si en esta reacción controla la etapa química, se asegura que sucede lo
mismo con la de hidrólisis de lactosa, que es una reacción más lenta.
En la Tabla 6.11 se resumen las condiciones de los experimentos realizados y los

resultados de los mismos. También se han representado en la Figura 6.6, donde se observa
que la velocidad de agitación no afecta a la velocidad del proceso a partir de 600 r.p.m.
Por tanto, con las condiciones de agitación elegidas para evitar las zonas muertas se
asegura también que la difusión extema no afecte a la velocidad del proceso. Los
experimentos de hidrólisis se han llevado a cabo con una velocidad de agitación de 1400
r.p.m.
529
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K fragilís inmovilizada
Tabla 6.11.- Experimentos realizados para analizar la influencia de la difusión externa en el

BSTR. T=250C; CONPGO=O,5 gIL; VR50 mL.
(miii)
EX? Vagil. t ¡nc. 6 12 20 30

PDE-1 300 CE*t 0,85 1,69 3,38 5,64 8,46
X 0,020 0,050 0,092 0,130 0,196
PDE-2 600 CE*t 0,85 1,69 3,38 5,64 8,46
X 0,060 0,130 0,366 0,444 0,670
PDE-3 800 CE*t 0,85 1,69 3,38 5,64 8,46
X 0,072 0,128 0,347 0,435 0,680
PDE-4 1400 CE*t 0,85 1,69 3,38 5,64 8,46
0,068 0,140 0,354 0,432 0,656
1.0
Velocidad de agitación (r.p.m.)
0.8 - • 300
o eoo
& 800
0.6 ~ 1400
0.4 -
0.2 - u-
----3-
0.0 -u- ¡ ,
o 2 4 8 8 10
t % (mm mgIL)
Figura 6.6.- Influencia de la velocidad de agitación en la hidrólisis de ONPG con enzima

de K. fragilis inmovilizada empleando el reactor BSTR en discontinuo.
530
Capítulo 6. Estabilidad de la enzima de K.fiagilís inmovilizada
6.5.2.- Hidrólisis de lactosa eii contuiiuo
Se ha seleccionado la velocidad de agitación y el intervalo de caudal en que el

BSTR se comporta como un reactor de mezcla completa y en cl que la resistencia a la
difusión externa es despreciable. Se ha elegido un inmovilizado con una concentración de
enzima de 0,35 mg/L y un diámetro de partícula de 0,65 mm. En estas condiciones, la
velocidad del proceso debe estar controlada por la reacción química. La desactivación que
se produce a lo largo del tiempo de reacción en cada experimento en continuo sólo
disminuye la velocidad de dicha reacción química, por lo que siempre controla la
velocidad del proceso.
Se han llevado a cabo 4 experimentos en continuo, siguiendo el protocolo descrito

en el apartado 2.3.4. y variando la temperatura de reacción entre 6 y 400C. Se utilizó una
concentración de lactosa a la entrada de 50 g/L, mientras que no se añadieron ninguno de
los productos de la hidrólisis a tiempo cero. El tanque se llenó inicialmente con una
disolución de 50 gIL de lactosa en BM. La velocidad de agitación utilizada fue de 1400
r.p.m. y el caudal de entrada se varió entre 0,03 y 1,2 L/h. Las condiciones de cada
experimento se recogen en la Tabla 6.12, mientras que la evolución de la conversión de
lactosa con el tiempo de operación se muestra en la Tabla 6.13.
Las conversiones experimentales se compararon con las obtenidas mediante

simulación a las condiciones de cada experimento, sustituyendo en la ecuación de
conservación del sustrato los modelos cinéticos elegidos para la hidrólisis de lactosa con
la enzima de K. fragilis inmovilizada y para la desactivación de dicha enzima (ecuaciones
[4.5] y [6.33]) resumidos en la Tabla 6.14. El método numérico empleado fue la
integración de las ecuaciones diferenciales mediante la técnica de Runge-Kutta. Los datos
experimentales obtenidos junto con los resultados de las simulaciones se muestran en la
Figura 6.7. También se han representado en dicha figura simulaciones realizadas que
describen el comportamiento de un reactor tanque agitado en continuo con la enzima libre
retenida en el reactor (por membranas) en las mismas condiciones de los experimentos
realizados con la enzima inmovilizada: en estas simulaciones se utiliza el modelo cinético
elegido para la hidrólisis de lactosa (ecuación [3.79] y el modelo de desactivación de la
enzima de K. fragilis libre (ecuación [6.32]).
531
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K. fragilís inmovilizada
Tabla 6.12.- Condiciones de los experimentos de hidrólisis de lactosa en continuo en el

BSTR.
Tabla 6.13.- Evolución de la conversión de lactosa a la salida del BSTR con el tiempo de
operacion.
Exper¡meiito 6 1 2 4
Temperatura 60C 150C 25<’C 400C

tiempo Xiac tiempo Xiac tiempo X¡a. tiempo
(fi) (ji) (h) (It)
0 0 0 0 0 0 0 0
13 0,56 1,5 0,18 1 0,12 0,5 0,18
14 0,54 3 0,39 2 0,22 1 0,34
16 0,54 4,5 0,39 6 0,50 2 0,47
18 0,58 6 0,44 16,5 0,60 3 0,52
20 0,54 12,5 0,48 21,5 0,55 4 0,61
22 0,56 26 0,51 23 0,51 5 0,48
24 0,54 46 0,41 25 0,43 6 0,56
37 0,49 71 0,21 27 0,40 7 0,51
41 0,48 79 0,16 44 0,04 8 0,51
44 0,43 93 0,08 48 0 9 0,53
47 0,45 102 0,10 - - 11,5 0,41
65 0,42 118 0,03 - - 20 0,26
68 0,41 - - - - - -
75 0,37 - - - - - -
92 0,32 - - - - - -
111 0,22 - - - - - -
532
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K.J¡-a gilís inmovilizada
1,0 1.1’
U u ~í~a~comtl~
— d,TiAajÉUBSTR sadortintio en ~a0k~ió, Ñntad¿n BSTR scfnccn¡Lr¡uO nr dmadl~soó9
— — ernj¡~ó, BSRr soni~¡¡in¡noy¡ c~aclid~ó1 — — enjíadón B~T seolcodireo~ ~adiv~h,,
¡ . . dnsj¡~óiro~nÚane<ednrdrn) - . s¡n~eoán lasa de mernwsa (mdmo ¡¡dv
0.8 - 0C
T=40”C 0.5- T=25
u
0.6 -
u
-U-...
.3
.5 u
0.4 u
0.4 -
•1
u
0.2-
0.2 -
u
0.0 nn
50
0 5 10 15 20 25 30 o 10 20 30 40
tdq~i~dÉn (h)
tdee~jva~Éfl <h)
1.0 1.0
u WÚeeqme,nwdise U rdkm niondeles
— dr¡Úadói BSTR ssdwl¡nio en c~ad¡v~¡M sirnilasde SSTR seoucast¡rn, br d~xt~~ió~
— . — em.jlajÉn BSRT Sse1¡~¡LI~fl an ~d¡v~ó, - drnjjat¡4r E¡SRT smicai¡irt¡o o,, c~adivadói
--:rredadó, ¡asede nn’~’a (mzinn ¡¡be
rab¡~nrÚ~n sezionSibe)
0.8— 0.8 -
0.6- 0.6 -
1•~~-
0.4 - 0.4 - ‘u -
u
u
u
0.2- 0.2 -
u
U
u
u
0.0 0.0 1~~~~ ¡ r
¡ ¡ ¡ ¡ r ¡ —. ¡
o 20 40 60 80 100 120 140
o 20 40 60 80 100 120 140
tdesactj~ad&, (h) tmora~o
4l (h)
Figura 6.7.- Resultados de los experimentos de hidrólisis de lactosa en continuo y de las

simulaciones para cada experimento.
533
)
Capitulo 6. Estabilidad de la enzima de K. f-agílí.s inmovilizada
Tabla 6.14.- Resumen de modelos cinéticos de la reacción de hidrólisis de lactosa con [3-
galactosidasa inmovilizada de K. fragilis y de la velocidad de desactivación.
Reaceióii Modelo cinético Parámetros del modelo
Hidrólisis de *2 PL CEw Ch
1~ *2 = exPI¿8~73±296—--—--
5298±89
lactosa K T
K~;, ) + Ch~< K zrexl{l684+724~6688±l589j
Kig{ú =exPk228s+888— 8301±2626)
6S2Ot98
Desactivactoti a — 4 e~ + A2 ek3¿ ¼ cxPLl4~60±338~ T 6,2~
da dCc, dC
k exn(ls9~3±3244—É193~10246>
di ~ de deL2
A expQ
4,s4+2i2±§ZS~782~6j
A2 exPK5~65±4~04±
1966±1226)
Comparando los resultados de las simulaciones con los datos experimentales de

conversión frente al tiempo de operación (Figura 6.7) se observa que la desactivación
experimental es aparentemente más rápida que la que predice el modelo cinético de la
0C. A 40”C se observa que
ecuación [6.43], especialmente en los experimentos de 15 y 25
los resultados experimentales y los que predice el modelo de desactivación son bastante
próximos. A 60C la disminución de la conversión de lactosa con el tiempo por
desactivación de la enzima es levemente superior a la que era de esperar con los modelos
de hidrólisis de lactosa y de desactivación de la enzima inmovilizada aplicados.
Durante los experimentos a 15 y a 250C se observó el crecimiento de bacterias

(muchas del género Lactococcus) en el BSTR tras unas 1 5 horas de operación. Este
problema es muy dificil de evitar porque, aunque se aseguran condiciones de asepsia
iniciales, no se puede esterilizar todo el reactor con la enzima incluida y no se pueden
mantener condiciones de esterilidad más allá de filtrar la corriente de entrada al reactor y
la solución de lactosa antes de introducirla en el depósito de alimentación con un filtro de
0,2 j.tm de luz. Esta contaminación microbiana es muy importante a 25’t, que es el
534
experimento donde se observa más diferencia entre lo pronosticado con el modelo

cinético elegido y los datos experimentales. A 150C también se observó un aumento de la
turbidez del medio con el tiempo de operación, turbidez que está asociada al crecimiento
de microorganismos.
Esta contaminación microbiana se debe a que el medio es rico en fuente de

carbono y su pH es neutro, la agitación asegura una oxigenación adecuada para el
crecimiento de microorganismos y la proteína que hay sobre la superficie del catalizador
puede ser utilizada por los microorganismos como fuente de nitrógeno. Por otra parte, el
soporte no permite que las bacterias entren en sus poros, pues tienen un diámetro máximo
de poro de 0,6 ~¿m,mientras que las bacterias suelen tener dimensiones superiores a iktm.
Sin embargo, las bacterias y otros microorganismos tienden a fijarse sobre superficies
durante el crectmiento, aún cuando la fermentación sea en medio liquido, formándose
peliculas o “biofilms” que contienen bacterias de varios géneros. El lavado simple puede
eliminar estas películas si la fijación de las mismas al soporte es débil. La película no se
fija sobre las superficies más expuestas a la acción de las líneas de corriente en el BSTR,
pero en el interior del lecho que forma el sólido retenido en la cesta, estas corrientes son
mucho más débiles y la película se podría formar. Este problema es bien conocido en
reactores de lecho fijo con enzimas inmovilizadas y se han propuesto varios métodos para
limpiar el reactor durante la operación con sustancias químicas o enzimas
coinmovilizadas que actúan sobre los microorganismos, impidiendo o retrasando su
crecimiento (Baret, 1987). Esta operación es relativamente sencilla cuando se trabaja en
lecho fijo, pero no tan simple cuando hay que reemplazar todo el liquido que contiene un
BSTR. Por tanto, en la elección de un tipo u otro de reactor hay que tener en cuenta si las
condiciones del medio de reacción favorecen o no el crecimiento de microorganismos y,
en consecuencia, las condiciones de asepsia que se necesiten en el proceso.
Otro efecto debido al crecimiento de microorganismos a tener en cuenta es el

consumo de glucosa que le acompaña. Las bacterias consumen los monosacáridos antes
que el disacárido y este hecho supone que la conversión aparente a la salida puede ser
más baja que la prevista por simulación.
535
En el experimento a 400C coinciden los datos experimentales y los simulados, por

lo que la desactivación está más asociada con fenómenos de desactivación térmica, no
con la acción de los microorganismos. A 60C vuelven a coincidir casi los datos
experimentales y simulados, lo que parece conoborar la hipótesis de la contaminación
microbiana en la superficie de la partícula. Tanto a 40 como a 60C el crecimiento de
microorganismos se encuentra muy limitado.
En todos los casos, los datos del arranque del reactor son reproducidos con
bastante exactitud por las simulaciones, lo que corroboraría el modelo cinético de
hidrólisis de lactosa elegido para esta enzima. El modelo cinético de la desactivación
explica la caída de conversión a 4OdC y a 60C, temperaturas a las que no crecen
microorganismos, lo que parece validar dicho modelo cinético. Para representar el
comportamiento del BSTR a las temperaturas intermedias habría que estudiar la
evolución de la biomasa con el tiempo de operación y elegir un modelo de crecimiento
para poder aplicarlo luego, en una simulación, junto con un modelo de bloqueo de poros
asociado a la formación de un “biofilm” y los modelos cinéticos ya elegidos para la
desactivación de la enzima inmovilizada y para la hidrólisis de lactosa por dicha enzima.
Finalmente, de la comparación del comportamiento del BSTR con la enzima

inmovilizada y el de un reactor tanque continuo con la enzima libre retenida en el mismo,
se observa que el comportamiento es similar a temperaturas altas y que la disminución de
la conversión es mayor en la enzima inmovilizada a temperaturas bajas, probablemente
debido a que la enzima reacciona con la superficie del soporte a bajas temperaturas y se
desactiva, por tanto, más rápidamente que la enzima libre.
536
7.- RESUMEN Y CONCLUSIONES
7.1.- RESUMEN
En esta Memoria se realiza un estudio fenomenológico de reacciones enzimáticas, es

decir, cuando se emplean como catalizadores enzimas en disolución y enzimas
inmovilizadas, Estos fenómenos son la reacción química, los fenómenos de transferencia de
sustrato y productos (cuando la enzima está inmovilizada) y la desactivación de la enzima
durante el transcurso de la reacción, fenómeno que es importante cuando se emplean
reactores en continuo. Para estudiar estos fenómenos se han utilizado dos sistemas
reacuonantes: las reacciones de hidrólisis de dos sustratos por enzimas con actividad ¡3-
galactosidasa: lactosa, e] sustrato natural, y ONPG (o-nitrofenol-[3-D-galactósido) un
sustrato sintético empleado para detectar dicha actividad. Estos dos sustratos han sido
hidrolizados empleando dos [3—galactosidasas,una comercial suministrada por Novo
Nordisk Ltd., procedente de la levadura Kluyveromyces fragilis, cuyo nombre comercial es
Lactozym, y otra enzima procedente de una cepa de Esehericha coli, que es la
[3—galactosidasamás estudiada en la literatura. Las dos enzimas se han utilizado en
disolución, como catalizadores homogéneos, e inmovilizadas, como catalizadores
heterogéneos.
Para determinar las condiciones óptimas para la actividad y la estabilidad de las

enzimas se han realizado varios experimentos previos al estudio de los fenómenos citados.
Las reacciones de hidrólisis de lactosa se realizaron empleando como medio de reacción
tampón BM, un tampón con una composición salina idéntica a la de la leche de vaca. Para
las reacciones de hidrólisis de ONPC, se ha utilizado un tampón fosfato 50 mM de pH 7,0 al
que se le han añadido Mg» y mercaptoetanol, pues se ha demostrado que su ausencia
537
Capítulo 7. Resumen y Conclusiones
implica la pérdida de la actividad enzimática. Este tampón BP ha sido optimizado variando

las concentraciones de sus componentes y observando su efecto sobre la actividad de la
enzima de K. fragilis y sobre la estabilidad de las disoluciones de esta enzima preparadas
con los distintos tampones. Se han probado un total de 12 tampones fosfato variando la
composición de potasio entre 75 y 200 mM, la de magnesio entre 1 y 10 mM y la de
mercaptoetanol entre O y 10 mM. Se ha seleccionado un tampón fosfato 50 mM con una
concentración 1 mM de ~ y una concentración de mercaptoetanol de 5 mM.
Se ha estudiado el efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de las dos enzimas

citadas, tanto en disolución como inmovilizadas. El pH del medio de reacción original se ha
modificado utilizando NaOH o H2S04, realizándose posteriormente las reacciones de
hidrólisis de ONPG y lactosa con la enzima estudiada a varios valores del pH (de cuatro a
nueve), o almacenando la enzima en tampones con distinto pH y midiendo la actividad de
muestras de enzima tomadas a diversos tiempos.
También se ha determinado la temperatura máxima de utilización de las enzimas, en

disolución e inmovilizadas, llevando a cabo reacciones de desactivación de las mismas en
0C) y midiendo
tampón BP a varias temperaturas (de tres a cinco temperaturas, entre 20 y 55
la actividad de las mismas a distintos tiempos de almacenamiento a cada temperatura..
Las reacciones de hidrólisis con las enzimas en disolución se han llevado a cabo
utilizando Erlenmeyers como reactores en discontinuo, dispuestos en un baño termostático
dotado de una plataforma con agitación de vaivén, tanto en los experimentos previos antes
comentados como en los experimentos realizados para el estudio de la cinética de cada
reacción de hidrólisis. En todos los casos, se han determinado los efectos de la temperatura y
de las concentraciones de enzima, de sustrato y de productos sobre la velocidad de reacción,
cuantificando estos efectos en una ecuación cinética.
Para el estudio de la reacción de hidrólisis de lactosa con /3—galactosidasa de Al

fragilis se llevaron a cabo sesenta y seis experimentos, estudiando los siguientes niveles de
las variables:
538
Capitulo 7. Resumen y Conclusiones
• Temperatura: 5, 15, 25, 30y400C.

• Concentración de lactosa: 25, 50 y 75 gIL.
• Concentraciones de glucosa y de galactosa: 0; 7,5 y 15 gIL
• Concentración de enzima: 2,33; 4,66; 7 y 11,65 mg/L.
Para el estudio de las reacciones de hidrólisis se han propuesto veintitrés modelos

cinéticos entre los que discriminar. Entre estos modelos, el más simple es el de orden 1; en
los demás, se tienen en cuenta fenómenos de inhibición por sustrato o por productos. En
todos los sistemas reaccionantes se ha determinado el efecto de las variables estudiadas
sobre la velocidad inicial de la reacción. Este análisis de velocidades iniciales ha sido
empleado para una primera selección cualitativa de los posibles modelos cinéticos más
adecuados en cada sistema de reacción.
En el caso de la hidrólisis de lactosa con 9—galactosidasa de K. fiagilis, se han

comparado distintos métodos y técnicas para discriminar el modelo cinético y determinar sus
parámetros. Se han empleado el método diferencial y el integral. En el primer caso, se han
calculado los datos de velocidad de reacción frente a concentración de sustrato (datos
diferenciales) a partir de los datos experimentales, que son datos de conversión de lactosa
frente a tiempo de reacción (datos integrales), por derivación numérica.
Cuando se utiliza el método diferencial es posible emplear regresión lineal o no

lineal para ajustar los datos diferenciales. En primer lugar, se han examinado los parámetros
cinéticos obtenidos por regresión lineal. Para poder aplicar esta técnica se han de linealizar
las ecuaciones cinéticas de cada modelo propuesto. Las linealizaciones que se han probado
son las de Lineweaber-Burk, Hanes y Eadie y se linealizaron los modelos en los que no
había inhibición o ésta era debida sólo a un producto de los implicados en la reacción
(modelos de la Tabla 3.2). Al ajustar los datos experimentales de la hidrólisis de lactosa con
la enzima de Lactozym (sistema en el que había el mayor número de datos) a los modelos
linealizados se observó que se obtenían parámetros negativos en muchos casos, con valores
muy bajos de la F de Fischer y del coeficiente de correlación, R2, que indicaban un mal
ajuste de los datos a los modelos cinéticos linealizados y, por tanto, poca fiabilidad de los
parámetros cinéticos obenidos. En consecuencia, la regresión lineal de los datos a los
539
modelos cinéticos linealizados es una estrategia que se descartó en la discriminación del

modelo cinéticos para los demás sistemas reaccionantes.
Posteriormente, y siguiendo con el método diferencial, se han ajustado los datos de

velocidad vs. concentración mediante regresión no lineal, utilizando el algoritmo de
Marquardt. Primero se han ajustado los datos a cada temperatura (ajuste con la temperatura
como constante) y posteriormente los datos de todas las temperaturas (ajuste con la
temperatura como variable). Cuando se han ajustado los datos temperatura a temperatura se
observó una variación un tanto aleatoria de los parámetros con dicha variable, debido a que
los parámetros del numerador y denominador de la ecuación cinética se acoplaban, siendo
estos valores de los parámetros a cada temperatura el resultado matemático del ajuste mejor,
pero carentes de sentido fisico. Mejor resultado se obtuvo al ajustar todos los datos de todas
las temperaturas a la vez (ajuste con la temperatura como variable).
Al aplicar el método integral, se han ajustado los datos experimentales conversión

Vs. tiempo directamente. Para ello, a la técnica de regresión no lineal se acopló una
integración numérica de la ecuación cinética. Los datos se han ajustado primero temperatura
a temperatura y posteriormente con la temperatura como variable. En el primer caso, se han
repetido los fenómenos de acople entre los parámetros cinéticos descritos en el método
diferencial. En el segundo, se pudo discriminar un modelo cinético que ajustaba de forma
bastante aceptable los resultados de la reacción de hidrólisis dc lactosa con 9—galactosidasa
de K. fragilis. El modelo seleccionado fue de tipo Michaelis-Menten con inhibición
competitiva por galactosa. Con dicho modelo, se han reproducido razonablemente los datos
experimentales obtenidos para esta reacción.
Finalmente, se ha realizado una comparación de los residuos obtenidos con el

método diferencial y el integral, encontrando menores residuos con el método integral. Con
los resultados obtenidos en la reacción de hidrólisis de lactosa con ¡3—galactosidasa de K.
fragilis, se decidió aplicar el método integral en la discriminación del modelo cinético de los
demás sistemas reaccionantes.
En segundo lugar, se ha estudiado la reacción de hidrólisis de ONPG con

/3—galactosidasa de Al fragilis en disolución. Se llevaron a cabo veintisiete experimentos. En
540
este sistema no se varió la concentración de enzima, pues en la hidrólisis de lactosa se

encontró que afectaba linealmente a la velocidad de la reacción. Las variables y los niveles
seleccionados para las mismas han sido:
• Temperatura: 5, 25, 30 y 40 0C.

• Concentración de ONPG: 0,25; 0,5 y 1 gIL.
• Concentraciones de o-nitrofenol (ONP): O y 0,25 gIL.
• Concentraciones de galactosa: 0; 0,15; 0,3; 0,6 y 15 g/L.
Al igual que en la hidrólisis de lactosa se ha realizado un análisis de velocidades

inicialespara determinar cualitativamente el tipo de modelo cinético más adecuado.
En este sistema reaccionante, y por los motivos antes citados, se ha utilizado el

método integral, aplicando la técnica de regresión no lineal con integración numérica
acoplada para ajustar los datos experimentales (conversión de GNPG frente a tiempo de
reacción) a los modelos cinéticos considerados. Se han ajustado los datos con la temperatura
como constante y con la temperatura como variable a los modelos cinéticos propuestos en
las Tablas 3.2 y 3.3. Como en los casos anteriores, el ajuste con la temperatura como
constante llevó, para varios de los modelos cinéticos propuestos, a valores ilógicos de los
parámetros cinéticos ya que se acoplaban los valores de los parámetros del numerador y
denominador. Por ello, en la discriminación del modelo cinético en los restantes sistemas de
reacción se ha seleccionado el método integral, ajustando los datos experimentales mediante
regresión no lineal con la temperatura como variable.
Con los resultados de la variación de la velocidad inicial de reacción con las

variables estudiadas y con el ajuste de los datos experimentales a los modelos considerados
(veinte modelos propuestos en las Tablas 3.2 y 3.3), se discriminó que el modelo cinético de
la reacción de hidrólisis de ONPG con la enzima de K. fragilis en disolución era un modelo
tipo Michaelis-Menten con inhibición competitiva por galactosa e inhibición acompetitiva
por ONP.
Conocido el comportamiento en disolución de la enzima de K. fragilis, se ha

estudiado la cinética de las reacciones de hidrólisis de lactosa y de ONPG con una enzima
541
procedente de E. coiL En el estudio cinético de la hidrólisis de lactosa con esta enzima se

han realizado diecisiete experimentos, variando la temperatura y las concentraciones de
glucosa, galactosa y lactosa, además de la concentración de enzima, en los siguientes
intervalos:
• Temperatura: 5, 25 y 40 0C.
• Concentración de lactosa: 25, 50 y 75 gIL.
• Concentraciones de glucosa y de galactosa: O y 15 g/L
• Concentración de enzima: 3,5 y 7 mg/L.
Los datos experimentales de conversión de lactosa frente a tiempo de reacción

obtenidos se han ajustado a los modelos cinéticos propuestos. Una primera discriminación
cualitativa se realizó teniendo en cuenta el efecto de las variables estudiadas sobre la
velocidad de reacción inicial. En este caso se han probado II modelos cinéticos de la Tabla
3.2. El ajuste se ha realizado por regresión no lineal de los datos experimentales con la
temperatura como variable. Se ha seleccionado un modelo con inhibición acompetitiva por
lactosa.
En la reacción de hidrólisis de ONPG con la enzima procedente de E. coli se

llevaron a cabo veintinueve experimentos. Las variables estudiadas y los niveles de dichas
variables han sido las mismas que para la enzima de K. fragilis en disolución. En el análisis
dc la influencia de estas variables sobre la velocidad de reacción inicial también se ha
observado que el modelo cinético debe ser del tipo Michaelis-Menten y que la reacción es
inhibida por ambos productos. Por tanto, se ha discriminado el modelo cinético considerando
los modelos de las Tablas 3.2. y 3.3. La discriminación se ha realizado por ajuste de los
datos experimentales por regresión no lineal y con la temperatura como variable. Se ha
elegido un modelo cinético tipo Micliaelis-Menten con inhibición competitiva por ONP y
por galactosa.
Para estudiar la cinética de las reacciones de hidrólisis con las enzimas

inmovilizadas se ha elegido como soporte para la inmovilización una sílice-alimina
comercial (KA-3 de StidChemie) y se han ~midolas enzimas a este soporte por un método
covalente de inmovilización. En este método se activa la superficie del soporte con 3-
542
aminopropiltrietoxisilano (y-APTES) y glutaraldehido. En primer lugar, se han seleccionado

ciertas condiciones de inmovilización utilizando la enzima de K. fragilis. Las variables y los
niveles que se han estudiado han sido:
• Tiempo de silanización: 2 y 3,5 h.

• Concentración de silano: 1, 10 y 20 %.
• Tiempo de activación con glutaraldehido: 2 y 3 Ii.
• Concentración de glutaraldehido: 0,5; 1,25; 2,5; 3,75 y 5%.
• pH al que se ha inmovilizado la enzima: 7,0; 9,0 y 9,5.
• Concentración de lactosa durante la inmovilización: O y 50 g/L.
• Agente reductor: NaBH4 y NaCNBH4.
• Concentración de agente reductor: 1 y 10 mg/mL.
Se han realizado un total de dieciséis experimentos de inmovilización, siguiendo el

proceso de la inmovilización en cada caso por medida de la proteína y de la actividad
remanente en el sobrenadante. Se han comparado los inmovilizados obtenidos midiendo la
0C.
actividad enzimática de los mismos y su estabilidad en tampón HP a 45
Elegidas las condiciones de inmovilización para la enzima de K. fragilis, se han

utilizado las mismas para la de E. coil. Posteriormente, como con las enzimas en disolución,
se ha estudiado el efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de las enzimas
inmovilizadas y el efecto de temperaturas elevadas sobre su estabilidad, determinando las
condiciones en las que las enzimas inmovilizadas son más activas y estables. Los niveles
de pH y temperatura utilizados han sido los mismos que los empleados con las enzimas en
disolución.
Antes de estudiar la cinética de las reacciones de hidrólisis con las enzimas

inmovilizadas, se han realizado varios experimentos previos para seleccionar la velocidad de
agitación y la concentración de enzima en el inmovilizado que aseguran que la etapa de
reacción química sea la que controla la velocidad del proceso. Para ello, se han llevado a
cabo cinco experimentos de hidrólisis de ONPG con enzima de K. fragilis inmovilizada en
los que se ha modificado la agitación del medio (mediante plataforma con movimiento de
543
vaivén y mediante hélice), y la velocidad de rotación de la hélice (entre 100 y 1400 r.p.m.).
Posteriormente, se han realizado siete experimentos de hidrólisis de ONPG con la misma
enzima inmovilizada en el tamaño menor de partícula (0,2 mm>d~>0, 1 mm), variando la
carga de enzima entre 0,07 y 5,6 mg/g. Conocidas las condiciones en las que la actividad y la
estabilidad de las enzimas es máxima y la reacción química es la que controla la velocidad
del proceso, se ha procedido al estudio cinético de las reacciones de hidrólisis con las
enzimas inmovilizadas. En estos estudios, se han empleado como reactores discontinuos
Erlenmeyers con agitación por hélice.
Para el estudio de la cinética de la reacción de hidrólisis de lactosa con /3-

galactosidasa de Al fragilis inmovilizada se han realizado dieciséis experimentos,
modificando la temperatura y las concentraciones de enzima, lactosa y productos en los
siguientes niveles:
• Temperatura: 5, 15,25,30 y 40 0C.

• Concentración de lactosa: 25 y 50 gIL.
• Concentraciones de glucosa y de galactosa: O y 15 gIL
• Concentración de enzima: 4,66; 9,45 y 10,5 mg/L.
En el estudio de la cinética de la reacción de hidrólisis de ONPG con /3-

galactosidasa de K. fragiis se llevaron a cabo veintisiete experimentos en discontinuo. Las
variables y los niveles elegidos para las mismas han sido:
• Temperatura: 5, 15,25 y 40 0C.

• Concentración de ONPG: 0,25; 0,5 y 1 gIL.
• Concentraciones de galactosa: 0; 0,15 y 15 g/L.
• Concentración de enzima: entre 0,5 y 2 mg/L.
Para estudiar la cinética de la reacción de hidrólisis de lactosa con la enzima de E.

coli inmovilizada se han realizado veintiún experimentos, en las siguientes condiciones:
544
• Concentración de lactosa: 25, SOy 100 g/L.
• Concentraciones de glucosa y de galactosa: O y 15 gIL
• Concentración de enzima: entre 14 y 18 mg/L.
En el estudio cinético de la reacción de hidrólisis de ONPG con la enzima de ¡3. coli

se realizaron veinticuatro experimentos en discontinuo, en los que se han variado la
temperatura y las concentraciones de enzima, sustrato y productos en los siguientes niveles:
• Concentración de ONPG: 0,25; 0,5 y 1 g/L.
• Concentraciones de galactosa: 0; 0,15 y 15 gIL.
• Concentración de enzima: entre 0,5 y 1,5 mgt.
Para cada reacción y enzima se ha analizado la influencia de las variables estudiadas

sobre la velocidad inicial de reacción, lo que permite una discriminación cualitativa del tipo
de modelo cinéticos que sigue la reacción. Los datos experimentales, en todos los casos, se
han ajustado a los modelos cinéticos propuestos en las Tablas 3.2 a 3.4 utilizando una
técnica de regresión no lineal con la temperatura como variable. De esta forma se ha podido
discriminar un modelo cinético para cada caso, como se muestra en la Tabla 7.1, junto con
los modelos elegidos para las reacciones con enzimas en disolución.
Con los modelos seleccionados para las enzimas en disolución e inmovilizadas se

han podido realizar una comparación entre el comportamiento cinético de ambas enzimas y
conocer el efecto de la inmovilización.
545
Tabla 7.L- Modelos cinéticos seleccionados para las reacciones de hidrólisis con las
enzimas inmovilizadas.
Fuente de la enzima Reacción Modelo seleccionado

K fragi/L~ en disoJución ]-Iidrólisis de lactosa Michaelis-Menten con inhibición
competitiva por galactosa
K.fragilis en disolución Hidrólisis de ONPG Michaelis-Menten con inhibición competitiva
por galactosa y acompetitiva por ONP
E. cali en disolución Hidrólisis de lactosa Michaelis-Menten con inhibición acompetitiva
P~ glucosa
E. cali en disolución Hidrólisis de ONPG Michaclis-Menten con inhibición competitiva
por galactosa y por ONP
K. fragilis inmovilizada Hidrólisis de lactosa Michaelis-Menten con inhibición
K. fragilis inmovilizada Hidrólisis de ONPG Michaelis-Menten con inhibición
E. ccli inmovilizada Hidrólisis de lactosa Michaelis-Menten con inhibición acompetitiva
por glucosa y por lactosa
E. coli inmovilizada Hidrólisis de ONPG Michaelis-Menten con inhibición competitiva
por galactosa y por ONP
El siguiente fenómeno que se ha estudiado ha sido la difusión del sustrato en los

poros del soporte con la enzima inmovilizada. Este fenómeno puede determinar la
velocidad global del proceso cuando la concentración de enzima inmovilizada es alta o
cuando las partículas de soporte tienen un diámetro grande, ya que en estos casos la
velocidad de la etapa de reacción química puede ser mayor que la difusión en poros. En usos
industriales es habitual que las partículas tengan un diámetro igual o superior a 0,5 mm y se
tiende a aumentar la concentración de fase activa (o enzima, en este caso) en el soporte, para
aumentar la velocidad de la transformación, por lo que este fenómeno puede adquirir una
importancia considerable y conviene estudiar cómo la difusión de los sustratos dentro del
soporte puede afectar a dicha velocidad. Se ha considerado que la difusión en el interior del
catalizador puede describirse mediante la ley de Fick, empleando para ello un coeficiente de
difusión efectivo, D~. Este coeficiente De se ha determinado experimentalmente mediante
medidas en condiciones inertes y se ha comprobado este valor en presencia de reacción
química.
546
La medida Jísica del coeficiente de difusión efectivo se ha realizado utlizando el

método dinámico, es decir en condiciones no estacionanas. Se han llevado a cabo sesenta y
cinco experimentos: cuarenta y cuatro con lactosa como trazador y veintiuno con ONPG
como trazador. Los experimentos se han realizado a 30’t, utilizando la técnica de estimulo-
respuesta en columna de cromatografía, es decir, en lecho fijo. Se ha estudiado la influencia
de la concentración de trazador, utilizando concentraciones de lactosa de 5 y 70 gIL, y de
ONPG de 2 y 5 gIL. También se ha estudiado la velocidad intersticial entrel,74 y 104,34
cm/mm.
Para comprobar si el valor de De obtenido en condiciones inertes explica los

resultados en presencia de reacción química (de las reacciones de hidrólisis de lactosa y de
ONPG) se ha inmovilizado la enzima de K. fragilis sobre partículas de sílice-alúmina de
distinto tamaño. En la hidrólisis de ONPG se han realizado diez experimentos en discontinuo
(cinco a 250C y cinco a 400C), con una concentración de sustrato de 0,5 gIL y en ausencia
inicial de productos. En la hidrólisis de lactosa se han llevado a cabo seis experimentos a
400C con una concentración de sustrato de 50 g/L y sin añadir productos a tiempo cero. Se
ha determinado en cada experimento el valor del factor de efectividad experimental, para lo
que se ha utilizado el valor de la velocidad observada en experimentos con partículas de
varios tamaños y la velocidad en ausencia de limitaciones difusionales; esta última puede ser
o bien la velocidad observada en experimentos realizados con partículas del tamaño inferior
(para las que se supone un factor de efectividad 1) o bien, la velocidad calculada según los
modelos cinéticos de hidrólisis de lactosa y de ONPG seleccionados para la enzima de K.
fragilis inmovilizada.
El factor de efectividad experimental se ha comparado con el que se predice al

resolver el balance de materia del sustrato en la partícula de biocatalizador. Para ello, es
necesario introducir las ecuaciones cinéticas de los modelos seleccionados y conocer cuál es
la distribución de la enzima en el interior del soporte. Esta distribución se ha determinado
marcando las proteínas con isotiocianato de fluoresceina (FITC) antes de inmovilizarías en
partículas de 0,15; 2,75 y 5 mm de diámetro. Las partículas de menor tamaño frieron de
vidrio de poro controlado para poder llevar a cabo las observaciones oportunas.
Posteriormente, tras cortar las partículas de sílice-alúmina, se ha empleado un microscopio
de fluorescencia confocal para determinar la distribución de fluorescencia en las distintas
547
partículas, obteniendo para todas ellas una distribución fluorescencia-radio, y, por tanto, una
distribución de concentración de enzima con el radio de la partícula. El balance de sustrato
en el interior de la partícula se ha resuelto, para cada reacción y para cuatro posibles
distribuciones de enzima, por colocación ortogonal, determinando un perfil de velocidades
de reacción en el interior de la partícula. Para la resolución de este balance se ha utilizado el
valor de D~ de los sustratos obtenido en condiciones de ausencia de reacción y se han
analizado los resultados obtenidos al comparar los factores de efectividad experimentales y
calculados.
El valor de D~ en presencia de reacción química se obtiene calculando el módulo de

Thiele que rinde el factor de efectividad determinado experimentalmente. Para describir el
sólido se han utilizado modelos de poros y se ha calculado su parámetro estructural, la
tortuosidad, en ausencia y en presencia de reacción química.
Finalmente, se ha abordado el estudio de la desactivación térmica de la enzima de K.

fragilis, tanto en disolución como inmovilizada. Para ello, se han llevado a cabo cuatro
experimentos de desactivación, a 25, 40, 45 y 50”C con la enzima en disolución y en
discontinuo y ocho experimentos de desactivación, a 6, 15, 25, 40 y 45 0C, con la enzima
inmovilizada ( se han realizado cuatro experimentos en continuo —a 6, 1 5, 25 y 40 0C- y
cuatro en discontinuo —a 15, 25,40 y 45 0C-) utilizando como medio tampón BM con lactosa
en una concentración de 50 gIL. Durante la desactivación se han tomado muestras de la
enzima en el medio de almacenamiento y se ha medido su actividad mediante experimentos
de hidrólisis de ONPG a 250C. Los experimentos en continuo con la enzima inmovilizada se
llevaron a cabo en un tanque cesta continuo (BSTR), extrayendo de la cesta muestras de
sólido de las que se ha medido la actividad. Estos experimentos se han realizado en
condiciones en las que la difusión externa no controle (para lo que se hicieron cuatro nuevos
experimentos variando la velocidad de giro de las turbinas) y la difusión en los poros
tampoco (para lo que se utilizaron inmovilizados con la mínima carga de enzima y el
mínimo tamaño de partícula de los utilizados en la inmovilización); también se comprobó
que con los valores empleados de caudales y agitación no existían ni zonas muertas ni
cortocircuitos en el BSTR.
548
Los datos experimentales de actividad frente a tiempo obtenidos en discontinuo se

han ajustado por regresión no lineal con la temperatura como variable a los veintidós
modelos cinéticos de desactivación propuestos. En el caso de la enzima libre, se ha
seleccionado un modelo según el cual la enzima, al desactivarse, evoluciona siguiendo una
cinética de primer orden hacia dos formas, una con cierta actividad residual y otra totalmente
inactiva, estando la forma activa original en equilibrio con otra forma inactiva. El modelo
seleccionado con la enzima predice un equilibrio entre dos formas enzimáticas presentes
inicialmente en el medio que evolucionan por separado hacia formas enzimáticas inactivas,
siguiendo cinéticas de orden uno en ambos casos.
Con el modelo seleccionado para la enzima en disolución se han reproducido datos

obtenidos en discontinuo a 25 y a 40”C, en experimentos que se habían realizado
previamente en el estudio de la cinética de hidrólisis de lactosa con la enzima de K. fragilís
en disolución. Además, se ha simulado el comportamiento de un reactor tanque continuo con
la enzima en disolución, acoplando los modelos seleccionados para describir la reacción de
hidrólisis de lactosa y la desactivación de la enzima libre.
Con el modelo seleccionado para describir la desactivación de la enzima

inmovilizada y con el modelo elegido en el estudio de la cinética de la hidrólisis de lactosa
con dicha enzima, se ha simulado el comportamiento de un reactor continuo BSTR. Por otro
lado, los experimentos en continuo que se han realizado en el BSTR han servido para
comparar los valores experimentales de conversión de lactosa con el tiempo con los que
predice el modelo cinético de desactivación seleccionado.
7.2.- CONCLUSIONES
Como resultado de la investigación realizada se ha llegado a las siguientes

conclusiones:
1.- Respecto a la enzima de K. fragilis en disolución:
a) La enzima tiene su máxima actividad en tomo a un pH de 6,5 tanto en la reacción de

hidrólisis de lactosa como en la de hidrólisis de ONPG. La enzima es estable a valores
549
de pH entre 7 y 9, siendo muy inestable a pH inferior a 5,5. Además, la enzima es

estable a temperaturas iguales o inferiores a 400C. La enzima es activada por ciertos
cationes metálicos: Mn2~, Co2~ yZn2~.
b) En el estudio de la cinética de la reacción de hidrólisis dc lactosa con esta enzima, los

datos experimentales obtenidos (conversión de sustrato frente a tiempo de reacción) se
han ajustado a varios modelos cinéticos por distintos procedimientos: método
diferencial con regresión lineal, método diferencial con regresión no lineal y datos a
temperatura constante, método diferencial con regresión no lineal con la temperatura
como variable, método integral con regresión no lineal y temperatura como constante
y el mismo método con la temperatura como variable. De todos ellos, se ha elegido el
método integral con regresión no lineal y temperatura como variable como cl mejor
método para discriminar el modelo cinético y calcular los parámetros del mismo.
e) Una vez interpretados los datos experimentales utilizando el método de ajuste

seleccionado y tras aplicar los criterios estadísticos y fisicos de discriminación a los
modelos cinéticos probados, se ha seleccionado el siguiente para la reacción de
hidrólisis de lactosa con la enzima de K fragi1t~ en disolución:
k
2 CE C10.
( ~
¡ gal
KM
Lí±K ¡+ Lja<
¡ gal )
5870±4411
¼
(
expyll3O+155— ~ )
KM = expl¿2854+1223— 1011t6200j1
( 9001 ±6230Á
gal = expy24,58 ±13,96—
Este modelo se corresponde a un mecanismo tipo Michaelis-Menten en el que la

galactosa actúa como inhibidor competitivo, uniéndose al centro activo junto con la
lactosa.
550
Al analizar la reproducción de los datos experimentales, se observa que el modelo

predice dichos datos con un error máximo del 15% y con un error medio aproximado
del 5%.
d) De igual forma, el modelo seleccionado para la reacción de hidrólisis de ONPG con

enzima de K. fragilis en disolución es:
k2 CE CONPG
( ~ ( c
KM Y1+K 1~ c’í ONP
OJVPGy+ K1 Q~ )
( 12 160±4203~~
= ex$34,00±13,20— T )
8 141±37001
KM = ex12234 1352— T
_ ( 629+6l4~ 2883±1704>1
T
— exP~
= exp(—3586±14,23+8085±3982
Que corresponde a un mecanismo tipo Michaelis-Menten en el que la galactosa es un

inhibidor competitivo y el o-nitrofenol actúa como inhibidor acompetitivo, uniéndose
a la enzima en un centro alostérico de la misma. Además, el QN? inhibe la reacción en
concentraciones similares a las del sustrato (ONPG), mientras que la inhibición por
galactosa sólo se aprecia si ésta se añade al principio de la reacción en una
concentración muy supenor.
El análisis de los residuos permite apreciar que el error máximo cometido al reproducir
los datos experimentales con el modelo seleccionado es de un 20%, estando el error
medio por debajo del 10%.
551
)
2.- Respecto a la enzima de E. coil en disolución:
a) La enzima tiene su máxima actividad en tomo a un pH de 6,5 en la reacción de

hidrólisis de lactosa, tanto si se utiliza el tampón BM como medio de reacción como sí
se utiliza el tampón BP. Sin embargo, en la hidrólisis de ONPG influye el tampón
utilizado, estando el pH óptimo en tomo a 7 si se utiliza en tampón BM y en tomo a
7,6-7,7 si se emplea el tampón BP. La enzima es estable a valores de pH entre 7 y 9,
siendo inestable a pH inferior a 5,5, pero menos que la enzima de K. fragilis. Además,
la enzima es estable a temperaturas iguales o inferiores a 400C, siendo más estable que
la enzima de la levadura a temperaturas superiores a 40”C. Los cationes metálicos
probados no influyen en la actividad de la enzima; sólo el Mn parece aumentar su
actividad ligeramente.
b) Al igual que con la enzima de K fragilis, se discriminó el modelo cinético aplicable a

la reacción de hidrólisis de lactosa con enzima de E. ¿xli en disolución. El modelo
seleccionado es:
k, C
5 Ch,~
KAÍ + + KCg¡,¿
fglu
exPIl3~7l+060~ 7239±180
U
K ~ex
1ll32+594—
Py~ T )
4894±1840Á
1007±596>1
K ¡g¡u =exP(Jt32±í28—
_
:r )
Este modelo implica un mecanismo tipo Michaelis-Menten en cl que la glucosa es un

inhibidor acompetitivo, uniéndose a un centro alostérico de la enzima.
Analizando la reproducción de los datos experimentales con el modelo seleccionado,

se observa que éste predice dichos datos con un error máximo del 17% y con un error
medio en tomo al 5%.
552
e) De acuerdo al mismo procedimiento, en el caso de la reacción de hidrólisis de ONPG

con enzima de E. cok en disolución, el modelo cinético seleccionado es:
k2 CE COÑPG
( Cga¡ C >1
O/VP + LO/VP0
K~ ¼ ¡gal J
( 7878±1236
k2 exPl\l8~20±4~28— T )
KM = 4150+12
ex~, 1476 1±
T 4100)
( 3799±1894
Kigm e~%978+604— T )
=exP(¿42 72+1450~15197±4580)
Modelo que corresponde a un mecanismo tipo Michaelis-Menten en el que tanto la

galactosa como el o-nitrofenol son inhibidores competitivos de la reacción, uniéndose
a la enzima en el cento activo junto con el sustrato. Igual que con la enzima de K.
fragilis, el ON? inhibe la reacción en concentraciones similares a las del sustrato
(ONTPG), mientras que la inhibición por galactosa sólo se aprecia en experimentos en
los que se añade al principio de la reacción en una concentración treinta veces superior
a la de sustrato.
El análisis de los residuos permite apreciar que el error máximo cometido al reproducir
los datos experimentales, con el modelo seleccionado, es de un 20%, siendo el error
medio inferior al 10%.
3.- Respecto a la influencia de algunas variables de la técnica de inmovilización sobre la

actividad y estabilidad de las enzimas inmovilizadas obtenidas, se concluye que el
tiempo de silanización, la concentración de silano, el tiempo de activación con
glutaraldehido y la concentración de glutaraldehido durante la activación del soporte no
afectan a la actividad y estabilidad de los inmovilizados, al menos en los intervalos
estudiados de estas variables. El pH al que se efectúa la inmovilización afecta tanto a la
553
actividad como a la estabilidad de los inmovilizados conseguidos: un pH básico

disminuye la actividad y aumenta la estabilidad de forma apreciable frente a un pH
neutro. La presencia de lactosa en el medio de inmovilización lleva a obtener
inmovilizados menos estables y más activos que los fabricados en ausencia del sustrato.
Cuando se hidroliza lactosa, la actividad que tiene la enzima inmovilizada respecto a la

libre está en tomo al 50% de esta última, variando del 60% al 52% cuando la
temperatura de reacción sube de 5 a 400C. Al hidrolizar ONPG, la actividad conservada
en la enzima inmovilizada respecto a la libre varia considerablemente con la temperatura
de reacción: a 5”C se conserva un 65% de actividad, mientras que a 400C sólo se
conserva un 25%.
4.-. Respecto a la enzima de K.fragilis inmovilizada:
a) La enzima tiene su máxima actividad en tomo a un pH de 7,0, utilizando ONPG y

lactosa como sustratos. La enzima es estable a valores de pH en tomo a 7, siendo
inestable a pH ácido y básico. A pH ácido es más estable que la enzima en
disolución, mientras que a pH básico es menos estable. Además, la enzima es
estable a temperaturas iguales o inferiores a 40~’C cuando, como en otros casos, se
ineuba en tampón BP. Se pierde un 30% de actividad al almacenar la enzima a 60C
en tampón BP al cabo de seis meses, aunque no se observa proteína en el
sobrenadante al tratar de eluir la enzima unida al soporte con agua o con tampones
con alta fuerza iónica, tanto a pH neutro como ácido o básico, o cambiando la
temperatura durante la elución. La actividad de la enzima es inhibida por varios
cationes metálicos que no inhiben la acción de la enzima libre: 2+, Ni2~, Cu2t, Al3~ y
Zn2+
b) Respecto a los experimentos realizados para determinar las condiciones dc agitación,

tamaño de partícula y concentración de enzima en el soporte que aseguren el control
de la velocidad del proceso por parte de la reacción química, estos experimentos se
han llevado a cabo con a hidrólisis de ONPG (la reacción de hidrólisis más rápida de
las estudiadas) que han permitido llegar a las siguientes conclusiones:
554
Con este sistema, la agitación de vaivén no es adecuada para eliminar la resistencia

debida a la difusión externa en las condiciones en las que se llevan a cabo los
experimentos (V¡{É= 50 mL con Erlenmeyer de 100 mL de capacidad). La agitación
por hélice parece adecuada para eliminar dicha resistencia si la velocidad de
agitación es igual o superior a 300 r.p.m.Una velocidad de agitación superior a 1400
r.p.m. podría generar problemas debido a la presencia de una desactivación
mecánica de la enzima.
Con e] tamaño menor de partícula (0,2 mm>d~>0, lmm), e] empleo de concentraciones

de enzima en el soporte iguales o menores a 0,7 mg/g evita que exista resistencia
debida a la difusión en los poros.
e) Actuando de igual manera que cuando se han discriminado modelos para las
reacciones con enzimas en disolución, en el caso de la reacción de hidrólisis de lactosa
con enzima de K.fragilis inmovilizada el modelo cinético seleccionado es:
1<2 CE,,. CO/VPG

r=
4,,
KM
1<2 =exp~14~16±4~46—6952±1270
KM = exP~j14~20+7 16— 6229±2242
Kiga exp~16~50-+9 72— 5930; 2946
Modelo que es coherente con un mecanismo tipo Michaelis-Menten con inhibición

competitiva por galactosa. Comparando con el modelo seleccionado para la enzima en
disolución, se observa que no hay inhibición por ONP. Probablemente, la
inmovilización bloquea el centro alostérico al que se une el ONP. De hecho, esto es
una prueba más de que la inhibición debida al ONP en la reacción con la enzima libre
es acompetitiva.
555
)
)
Al analizar la reproducción de los datos experimentales con el modelo seleccionado se

llega a la conclusión de que el modelo elegido predice estos datos con un error
máximo del 30% y con un error medio inferior al 10%, no observándose, al igual que
en los casos antenores, tendencia alguna en los residuos, que se disponen
aleatoriamente en tomo al cero.
d) Respecto a la reacción de hidrólisis de ONPC con la misma enzima inmovilizada, el

modelo cinético elegido es:
/<2 CE Ciar
w
KM kl±E’I1)±Ciac
expl¿8.73+2 96— 5298±890
K~ ~texp({16,84+724~Éó88±í5j) y
( 8301±2626>1
Kjgqj = expy22,85±8,88—
Este modelo corresponde a un mecanismo tipo Michaelis-Menten en el que la

galactosa es un inhibidor competitivo de la reacción de hidrólisis de lactosa.
El análisis de la reproducción de los datos experimentales lleva a la conclusión de que

el modelo elegido predice dichos datos con un error máximo del 25% y con un error
medio en tomo al 5%.
5.- Respecto a la enzima de E. cal/inmovilizada:
a) La enzima tiene su máxima actividad en tomo a un pH de 8,0, utilizando ONPG como

sustrato y tampón BP como medio de reacción. Sin embargo, su pH óptimo es de 6,0
cuando se hidroliza lactosa en tampón BM. La inmovilización acentúa la diferencia
entre los valores de pH óptimo con los dos sustratos. La enzima es estable a valores de
pH entre 6 y 7, siendo inestable a pH más ácido y básico. A pH ácido es igual de
556
)
estable que la enzima en disolución, pero a pH básico es mucho menos estable. Por
otro lado, la enzima es estable a temperaturas iguales o inferiores a 400C al incubarse
en tampón BP. Su estabilidad térmica es similar a la de la enzima en disolución. La
enzima es levemente inhibida por algunos cationes metálicos que no inhiben la acción
de la enzinia libre Fe2~, Ni2~y Co2~.
b) Si se utiliza la hidrólisis de lactosa para comparar la actividad de la enzima libre

respecto a la inmovilizada, la primera es, aproximadamente, un 14% de la segunda,
vanando del 15% al 13,5% al aumentar la temperatura de reacción de 5 a 400C. Se
aprecia que gran parte de esta pérdida de actividad se debe a la aparición de la
inhibición por lactosa en la enzima inmovilizada. Si la reacción estudiada es la
hidrólisis de ONI’G, la actividad que se conserva en la enzima inmovilizada respecto a
la libre es, de forma aproximada, de un 50-60% y no varia tanto con la temperatura
como en el caso de la enzima de K. fragilis.
c) Aplicando el mismo procedimiento de discriminación de modelos que e] utilizado para

las enzimas en disolución, el modelo cinético seleccionado para la reacción de
hidrólisis de lactosa con enzima de E. coli inmovilizada es
k
2 CE~ Ciar
r=
KM+ Mí
lar y
Clar
K01,~
+
Kjgj¡, 1
1<2 exPL22~82 ±4,14—10090;1140
KM exp~32~77 ±2226~ll220±7360j
Kig¡u = exp~35,77+2 64+ 11760±8260
K,>,,~ ex~fj—l2~59+844+ 3284±2540
Que supone un mecanismo tipo Michaelis-Menten en el que la glucosa y la lactosa son

inhibidores acompetitivos que se unen a un centro alostérico de la enzima.
557
Cuando se analiza la reproducción de los datos experimentales con el modelo elegido,

se aprecia que éste rinde unos valores de conversión de sustrato que tienen un error
máximo del 14% y con un error medio inferior al 5%.
d) En el caso de la reacción de hidrólisis de ONPG con enzima de E. co//inmovilizada,

el modelo cinético seleccionado es:
= k2 ~ Conpc
11-1-
K + CO/VRO
Vga/
( 6063±534>1
1< 2 exnlll2S+180— T 2¡
KA., expl¿402±376—3521±1120
= exk8,24±3,72—3482 ±1098
K¡ON,,. = exp(4,36±0,25— 3372±246
Modelo que corresponde a un mecanismo tipo Michaelis-Menten en el que la

galactosa y el o-nitrofenol actúan como inhibidores competitivos de la reacción, al
unirse a la enzima en el centro activo. Igual que en casos anteriores, el ONP inhibe la
reacción en concentraciones similares a las del sustrato (ONPG), mientras que la
inhibición por galactosa se observa cuando se añade al principio de la reacción en una
concentración muy superior.
En el análisis de residuos se aprecia que el error máximo cometido al reproducir los

0/o y el error medio es,
datos experimentales con el modelo seleccionado es de un 17
aproximadamente, un 5%.
558
6.- Respecto al estudio de la diffisión de los sustratos en los poros del soporte, llevados a
cabo con enzima de K fragilis inmovilizada, se pueden establecer las siguientes
conclusiones:
a) La distribución de enzima dentro del soporte es no uniforme, incluso dentro de las

partículas de menor tamaño, con la carga de enzima utilizada (0,35 mg de enzima por
g de soporte). Además, la distribución de enzima no es idéntica con la posición radial
de la partícula, debido a la complejidad de la distribución de poros en el soporte (sea
éste la sílice-alúmina comercial o el vidrio de poro controlado).
A] aumentar el tamaño de la particula, la concentración de enzima cerca de la

superficie de dicha partícula tiende a ser superior, acentuándose el gradiente de
concentraciones a lo largo del radio de la partícula. Las ecuaciones que relacionan la
concentración de enzima con el radio adimensional, x, para diámetros de la misma de
0,15; 2,75 y 5 mm, respectivamente, son:
(i—r) (l—x)
Cfi =—O,288+O,163e 0,0082 ±O,707e 2,144 (d~=0,15 mm)
(I—x} (1—x)
= 1,12 e 0003 ‘+0,668e 026? (4=2,75 mm)
(I—x) (I—x)
Cfi= 1,617e 0,0029 +2,777e 0,0404 (4=5 mm)
b) Al calcular el coeficiente de difusión efectivo en ausencia de reacción química, se

obtiene un valor del mismo cercano al valor de la difusión molecular multiplicada por
la porosidad de partícula, con lo que se obtienen valores de la tortuosidad próximos a
la unidad, tanto si se utiliza lactosa como si se utiliza ONPG como trazador e
independientemente de la concentración de los mismos, como se observa en la Tabla
7.2.
e) En los experimentos de hidrólisis de lactosa y ONPG llevados a cabo a distintos

tamaños de partícula, se aprecia que el factor de efectividad experimental obtenido
a tamaños grandes de la partícula coincide con valores de este parámetro calculados
559
para los perfiles más pronunciados que se determinaron para la distribución de

enzima dentro del soporte. Además, en el caso de la hidrólisis de lactosa, los valores
del factor de efectividad experimental obtenido con partículas de 2,75 mm de
diámetro y los calculados con el perfil de enzima determinado a ese tamaño
coinciden. En el caso de la hidrólisis de ONPG, y para la partícula de 2,75 mm de
diámetro, los valores experimentales del factor de efectividad son mayores que los
calculados con la distribución de la enzima en partículas de ese diámetro. Este hecho
supone que el D. para lactosa en presencia de reacción química coincide con el valor
de dicho parámetro obtenido en ausencia de reacción química, mientras que el valor
¡Lico de D~ para ONPG es algo mayor que el obtenido en presencia de reacción
química (Tabla 7.2).
Tabla 7Z- Valores de los coeficientes efectivos de difusión físico y químico.
d) Cuando se comparan los valores experimentales del factor de efectividad obtenidos en

experimentos de hidrólisis de lactosa con partículas de 5 mm de diámetro y el factor de
efectividad calculado para dicho tamaño y reacción, se observa que el valor
experimental del factor de efectividad es mucho menor que el calculado, lo que
significa que la velocidad de reacción observada experimentalmente es mucho menor
que la que deberia obtenerse con el perfil de enzima correspondiente a partículas de
ese tamaño. Este hecho sólo es explicable si la enzima está desactivada. Teniendo en
cuenta la concentración de esta enzima cerca de la superficie de estas partículas, dicha
desactivación debe ser por agregacion.
7.- Respecto al estudio de la desactivación de la enzima de K. fragilis en disolución e

inmovilizada y su aplicación a un reactor tanque-cesta en continuo:
560
a) En la desactivación de la enzima en disolución se discriminó entre varios modelos
cinéticos utilizando el método integral y la regresión no lineal para seleccionar

finalmente un modelo cinético de desactivación. Este modelo supone que existe
inícialmente una enzima dimérica activa en equilibrio con otra inactiva, tetramérica; al
transcurrir la desactivación la forma activa de la enzima evoluciona según reacciones
irreversibles de orden uno a otra forma enzímática de menor actividad y una segunda
forma inactiva. El mecanismo y la ecuación cinética que de él se deriva son:
aA1 ek2¡ [(1—/3* )e~k3t + ,6*i
( 14768±5954
2 exn14077+1921-
uy, T )1
( 41418 ±5926
3 exn11242+1848—
ry~ T )1
>8=0,70±0,11
A =105+0,15
b) Respecto al modelo de desactivación seleccionado para la enzima inmovilizada, se ha

discriminado entre los mismos modelos que se han propuesto para la enzima libre.
Mediante dicha discriminación se ha elegido un modelo cinético de desactivación

según el cual la enzima inmovilizada existe a tiempo cero de reacción en dos formas
activas en equilibrio entre sí con diferente estabilidad, observándose que las dos
evolucionan hacia formas enzimáticas inactivas siguiendo reacciones irreversibles

cuya cinética es de orden uno. El mecanismo y la ecuación cinética que de él se deriva
son:
561
>
a 4 ¿*2> +A
2 ¿k~
1<2 exP(l4~60±3~38—6520±98=)
¼ ~ÉexPI1593±3244.~..Sl93S±lO246j~j
A¡=exp(j484+272± 1278 ;782~6
A 1966±í2kjj
2 zzexP(5 65±404+
e) Comparando los datos de desactivación de la enzima libre con los de la inmovilizada,

se observa que la desactivación de la enzima inmovilizada es más rápida que la de la
enzima libre cuando esta desactivación se lleva a cabo en tampón BM y en presencia

de lactosa, mientras que la estabilidad de la enzima libre y de la inmovilizada son
iguales cuando se incuban en tampón BP. Como este tampón, a diferencia del BM,
tiene en su composición un agente reductor, el mercaptoetanol, se concluye que la

oxidación es un mecanismo importante de desactivación de la enzima y que la
inmovilización favorece dicho mecanismo porque expone más a la enzima.
d) Finalmente, cuando se comparan los datos experimentales de desactivación de la

enzima inmovilizada obtenidos en el BSTR con datos calculados con los modelos
seleccionados para describir la hidrólisis de lactosa y la desactivación de la misma
enzima:
• A temperaturas de operación de 6 y 400C, las conversiones de lactosa calculadas
son levemente superiores a las obtenidas experimentalmente, pero muy similares.
562
)
• A temperaturas de operación de 15 y 25’t, las conversiones calculadas son
claramente mayores a las obtenidas experimentalmente. En los experimentos

realizados a dichas temperaturas, se observó crecimiento de microorganismos tras
las primeras 15-20 h de operación, así que esta parece ser la causa de la falta de
coincidencia entreconversiones calculadas y experimentales.
563
8.- NOMENCLATURA
a Constante geométrica en las ecuaciones [1.2]
y [5.26].
Actividad remanente durante la desactivación de la enzima.

a
Actividad conservada tras la inmovilización (ecuación [4.1]).

a
Actividad remanente a tiempo de desactivación elevado.

«:0
Relación superficie/volumen en las partículas de catalizador.
BM Tampón de composición salina similar a la leche.

Tampón fosfato 0,1 M, 1 mM CI2Mg, 10 mM 2-mercaptoetanol.
BP
C Concentración (mL de enzima/L, mol/L)

Concentración de disacáridos, ecuaciones [3.65]
a [3.70].
CE Concentración de enzima en el medio de reacción (ml enzimalL).

CíE?. Concentración dc enzima inmovilizada referida a volumen de reactor
(mg enzima/L).
Concentración inicial de enzima en el medio (mg enzima/L).
CES Concentración del complejo enzima-sustrato, definida en la ecuación [3.3].

C El Concentración de la enzima no unida a sustrato, presente en la ecuación [3.3].
CE~ Concentración de enzima inmovilizada (mg de enzima/g de soporte).
Cgai Concentración de galactosa (g/L, mol/L).
Concentración del anómero a de la galactosa (gIL, mol/L).
564
Capítulo 8. Nomenclatura
C~tgai Concentración del anómero fi de la galactosa (g/L, mol/L).
Cgiii Concentración de glucosa (gIL, mol/L).
Cia. Concentración de lactosa (g/L, mol/L).
CONI’ Concentración de ONP (gIL, mol/L).
CONFG Concentración de ONPG -o-nitrofenol-fl-D-galactósido - (g/L, mol/L).
Cp~~ Concentración de proteína inmovilizada en el sólido (mgIL).
Concentración de producto
Ql Concentración de sustrato en el interior de la partícula, definida en la

ecuación [1.9].
Ctri Concentración de trisacáridos, ecuaciones [3.65] a [3.70]
CF! Factor estérico de Teman, definido en la ecuación [5.10].

CF2 Factor de viscosidad de Teman, definido en la ecuación [5.12].
Da Número adimensional de Damkóhler, definido en la ec. [5.6].

2¡s).
Coeficiente de difusión efectivo (cm
D, D, Formas inactivas de la enzima en el capítulo 6.
D, DL Coeficiente de difusión local (cm2/s).
DAB0 Coeficiente de difusión molecular, definido en la ecuación [5.7] (cm2/s).

Dax Coeficiente de dispersión axial, definido en la ecuación [5.20] (cm%s).
Diámetro de partícula (mm, cm).
E Enzima (mg/L).
E. Energía de activación (dividida por R) de la constante cinética k

2 (K).
E»M Energía de activación (dividida por R) de la constante de Michaelis (K).
Eaí Energía de activación (dividida por R) de la primera constante de inhibición

(K).
Fai Energía de activación (dividida por R) de la segunda constante de inhibición

(K).
Formas activas de la enzima a tiempo cero de reacción (isoenzimas).
&, E* Forma(s) activa(s) de la enzima que se genera(n) durante la desactivación,

(mg/L).
565
Capitulo 8. Nomenclatura
1 Factor estructural definido en la ecuación [5.40].

1’ Intensidad de fluorescencia global recogida, definida en la ecuación [5.41].
F Parámetro estadístico de Fischer (marca la fiabilidad del modelo cinético
propuesto).
E Factor de corrección aplicado al flujo de un soluto en un poro
(ecuación [5.8]).
U 1 ]), definido en la
Coeficiente de la ecuación de van Deemter (ecuación [5.2
ecuación [5.22].
h Módulo de Ihiele, definido en la ce. [5.36]
HEPT Altura equivalente de plato teórico (cm).
IP Intensidad de fluorescencia, definida según la ecuación [5.46].
lo Intensidad de excitación.
Ka Constante de adsorción del soluto.
KA, K13, K’A Constantes de equilibrio en reacciones enzimáticas con más de un sustrato.
Coeficiente de transporte de materia en la película externa (crn/s, cm/h).

Constantes de desactivación en el capítulo 6 (min’).
Constante de inhibición general, (mol inhibidor/L).

nl~ Constante de inhibición del compuesto idi, (mol inhibidor/L);
inh= glu (glucosa); gal (galactosa); ONP (o-nitrofenol); lac (lactosa);
a- gal (a-galactosa); ~- gal (j3-galactosa)
KM Constante de Michaelis-Menten (mol sustrato/L).

KMI, KM2 Constantes tipo Michaelis-Menten de la ecuación [3.14].
kmut Constante cinética de mutarrotación de la galactosa (min’).
Kmtit Constante de equilibrio de la mutarrotación de galactosa.
kq Constante cinética general referida al peso de soporte.
Constante del equilibrio de formación del complejo enzima-sustrato, definida
en la ecuación [3.49].
Término preexponencial de la constante cinética k2.
566
Constante cinética de la velocidad de formación de complejo enzima-sustrato

(L/mol mm).
Constante cinética de la velocidad de formación de producto (mm’).

Constante cinética de formación del segundo complejo enzima-sustrato en un
mecanismo tipo ping-pong (ecuación [3.31]).
Constante cinética de formación del segundo producto en un mecanismo tipo

ping-pong (ecuación [3.31]).
L Longitud de la columna cromatográfica, en el apartado 5.4.
Relación de concentraciones iniciales entre distintas fornias enzimáticas.
Flujo de sustrato desde el seno del fluido a la superficie (mol/cm2 s).

p Intensidad de fluorescencia en un determinado punto de la partícula,
ecuación [5.44].
Coeficiente de partición, definido en la ce. [5.3].
Proteína multimérica (capítulo 6).
P producto
Pc Número de Peclet.
Q Caudal volumétrico de entrada y salida de fluido en un reactor continuo

(L/min).
r Velocidad referida a volumen de reactor (mo) S/Lmin).
r coordenada característica de la geometria o radio de poro (cm, A).
Velocidad de formación del complejo enzíma-sustrato, definida en la
ecuación [3.2].
Velocidad de reacción observada (mol sustrato/Is).
Radio de partícula (cm, mm).

Velocidad referida a peso de soporte (mol S/g soportemin).
rx Velocidad de obtención del producto X en un mecanismo tipo ping-pong.

ry Velocidad de obtención del producto Y en un mecanismo tipo ping-pong.
Velocidad inicial en un experimento en discontinuo
(mol S/(L mm) o mol S/(g soporte mm) o mmol/(min mg enzima)).
567
r Velocidad inicial en un experimento en discontinuo llevado a cabo como

0 (t)
medida de actividad de una muestra de enzima extraida de un reactor en
continuo a tiempo de operación t (mol S/Lmin o mol S/g soportemin).
Re~ Número de Reynolds referido a la partícula de soporte.
5 sustrato
Superficie específica (m2/g).
Número de Schmidt.
Sc
Residuo obtenido con cada modelo cinético aplicado.
SQR
Tiempo (h, ruin, s).
t
Temperatura (K, 0C).
T
Tiempo al que termina un experimento en escalón inverso en el apartado
tliflai
6.5.1.
Tiempo muerto en un sistema cromatográfico, presente en la ecuación [5.15].

tm
Tiempo medio de residencia de un eleniento de fluido en un reactor continuo
tflyyJ~(j
(h, mi s).
Tiempo de residencia de un elemento de fluido en un reactor continuo

tresidencia
(h,min,s).
Velocidad intersticial de paso de fluido en la columna cromatográfica
(cm/mm, cm/s).
Volumen de reactor (L, mL).
Volumen de poros (cm3/g).

Peso de soporte (g).
w
Coordenada radial adimensional, definida en la ecuación [5.34].
x
Conversión calculada con un modelo cinético.
xc
Conversión experimental.
xc
Conversión de ONPG.
XQNEG
Conversión de lactosa.
Xiac
568
Letras Griegas
a Constante que indica la actividad de etapas no agrupadas en la ecuación
[6.26]
13, 1~ Relación(es) de actividad(es) entre varias formas de la enzima presentes al

comienzo de la desactivación. En el capitulo 3, ecuación [3.48],
es un
parámetro que indica si la inhibición es parcial o total.
13* 13* Relación(es) de actividad(es) entre varias foni3as de la enzima que se generan
durante la desactivación de la misma con la forma enzimática existente
inícialmente.
Ns Concentración adimensional de enzima inmovilizada, definida en la ecuación

[5.33].
62 Concentración adimensional de producto, definida en la ecuación [5.3

2].
Concentración adimensional de sustrato, definida en la ecuación [5.31].
60 Término que incluye la adsorción en el modelo de Kubin y Kucera

(ecuación [517]).
L Porosidad del lecho.

Porosidad de la partícula de soporte.
Factor de efectividad en la panícula.
tlca\c Factor de efectividad calculado para los distintos perfiles de concentración de
enzima en el interior de la partícula de soporte, definido por la ecuación

[5.38].
flexp Factor de efectividad definido en la ecuación [5.57].
~lc~p2 Factor de efectividad definido en la ecuación [5.58].

Relación entre el radio molecular del soluto y el radio del poro.
jlrnax Velocidad máxima englobando C~, definida en la ec. [3.8]
(mol sustrato/lmin).
569
Primer momento de la curva E(t) del trazador, definido por la ecuación
[5.15].
112 Segundo momento de la curva E(t) del trazador, que aparece y está definido
en la ecuación [5.16].
O Tiempo adimensional, definido en la ecuación [6.46].
Densidad de partícula (g/cm3, gIL).

Pi. Densidad del soporte en el volumen de reacción, (g de soporte/L de reactor).
a2 Varianza del trazador, definida en la ecuación [5.16].
t Tortuosidad, parámetro estructural del sólido en el modelo de poros paralelos.
Subíndices
E Relativo a la enzima.
Relativo al compuesto i (sustratos, productos o formas enzimáticas). También
indica el número de subunidades en una enzima multimérica.

L Relativo al liquido.
M Relativo a los macroporos.

p Relativo a la partícula de soporte.
Relativo al tiempo t.
w Relativo al soporte o a la enzima inmovilizada.

O Relativo al tiempo inicial.
11 Relativo a los microporos.
Superíndices
cnt/sal Relativo a las corrientes de entrada o salida de un reactor continuo.

fluido,f, F Relativo al seno del fluido.
Relativo al interior de la partícula de soporte.
sup Relativo a la superficie externa del soporte.
570
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ABRIR CAPÍTULO 3.

En este capítulo se estudian las reacciones de hidrólisis de lactosa y de ONPG con

• En el proceso de inmovilización se han estudiado los efectos de algunas de las

• Se han estudiado las condiciones de pH, concentración de sales y temperatura que

Seleccionado el método de inmovilización y las condiciones de inmovilización y

Debido a las conclusiones alcanzadas en el estudio cinético con las enzimas en

En este apartado se analizan los métodos de inmovilización de enzimas,

4.1.1.- Inmovilización de enzimas

La inmovilización es un proceso por el cual el movimiento de la enzima en el

El empleo de la inmovilización de enzimas se conoce desde 1916, ai~o en el que

inmovilización por encapsulación de anhidrasa carbónica. En 1971, Gregoriadis preparó

La primera aplicación industrial de las enzimas inmovilizadas fue introducida en

Por ejemplo, las enzimas inmovilizadas se utilizan en química sintética, en los

En la Tabla 4.2 se muestran las ventajas y desventajas que presenta el empleo de

proceso de inmovilización como a la posible presencia de limitaciones difusionales, que

Hasta el momento se han desarrollado varios métodos de inmovilización de

Tabla 4.1.- Usos industriales de algunas enzimas y células inmovilizadas.

Tabla 4.2.- Ventajas y desventajas de las enzimas inmovilizadas.

Ventajas de las enzimas inmovilizadas

Figura 4.1.- Métodos de inmovilización de enzimas.

4.1.1.1.- Métodos de atrapamiento

Los métodos de atrapamiento se clasifican a su vez en: atrapamiento en gel,

La red está formada por geles poliméricos insolubles en agua. El atrapamiento

utilizaron polímeros sintéticos, aunque luego también se estudió la posibilidad de

Inicialmente se utilizaron geles de poliacrilamida, obtenidos por entrecruzamiento

dimetilamino-propionitrilo o N,N,N’ ,N’-tetrametilenetilendiamina. El gel resultante se

De los materiales que se utilizan en la formación de geles, los materiales naturales

microbiano. El uso dc materiales sintéticos como la poliacrilamida y el poli (2-hidroxietil)

JI. Atronamiento en fibras

por su biocompatibilidad y bajo costo es el acetato dc celulosa. La retención de actividad

Existen, además, reactores enzimáticos que se han desarrollado a partir de esta

En este método, la enzima queda atrapada en una membrana polimérica esférica

disefiaron en principio para la inmovilización de enzimas, sino que ya se empleaban para

La microencapsulación presenta como ventajas la coinmovilización fácil y la

4.1.1.2.-Métodos de unión a un soporte

Es un método simple en el que se pone en contacto la solución acuosa de la

En la adsorción fisica no hay una interacción ftíerte enzima-soporte (se generan

II. Enlace iónicp

En este caso se usan resinas intercambiadoras de iones, que tienen grupos

El principal problema asociado a este método de inmovilización es conseguir que

Quedan comprendidas en este apartado aquellas técnicas de inmovilización que

propiedades mecánicas y, en este caso, la técnica consiste en depositar una capa de

El titanio, muy usado por su estabilidad, es conocido como un metal de transición

IV. Enlace por afinidad

Una de las técnicas de activación típicas es la que utiliza bromuro de cianógeno

Por ejemplo, una nueva técnica de inmovilización por afinidad permite la

La unión de las enzimas a los soportes mediante enlaces covalentes es,

La reacción quimica de formación del enlace covalente debe ser poco

La unión imina que se produce entre la enzima y el soporte está estabilizada

iiWiflOáCidO N - taro In el,

Activación del soporte por ghiitartldcliido

—ÑU2 + OHC—(CI-12>=—CHO N -— CH--—<CHP)2——CHo

N CH—(CH2)2—cHo + NH2 ENZIMA

Figura 4.2.- Algunos métodos covalentes frecuentemente utilizados.

El entrecruzamiento es un procedimiento de inmovilización de enzimas que tiene

Los agentes de entrecruzamiento pueden no quedar atrapados en la red formada

Aunque el agente entrecruzante más usado es el glutaraldeliido, también se usan

El entrecruzamiento es un método versátil que se ha utilizado, con enzimas en

4.1.1.4. Soportes utilizados para la inmovilización de enzimas y otros biocatalizadores

Los soportes utilizados en la inmovilización de enzimas son muy variados;

En cualquier caso, se elija un soporte orgánico o inorgánico, éste ha de cumplir

a) Físicos: resistencia mecánica, incompresibilidad en el rango de variables de

4.1.2.- Inmovilización de ~-gaIactos¡dasas