Práctica 2. Fundamentos en Citometría de Flujo.

Jorge Monserrat Sanz

- ACTIVIDADES QUE DEBE DE REALIZAR EL ALUMNO A LO
LARGO DE LAS PRÁCTICAS

- OBJETIVO DE LAS ACTIVIDAD

1. Objetivos de Adquisición de fundamentos de las técnicas.

El alumno deberá:
1.1. Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la heterogeneidad
celular en líquidos biológicos y cultivos celulares.
1.2. Conocer los fundamentos que rigen el manejo de la citometría de flujo.
1.3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se realizan
mediante la citometría de flujo.

- EVALUACIÓN DE LAS PRÁCTICAS

La evaluación del curso se realizará mediante:

1. Presencia del alumno en clase, colaboración y actitud ante los protocolos
propuestos.
2. Se procederá a preguntar en el examen final la parte proporcional de las
prácticas recibidas, incluyendo siempre, al menos, un problema de citometría de
flujo.

- TÉCNICAS y PROTOCOLOS
1. ADQUISICIÓN y FAMILIARIZACIÓN Y PUESTA A PUNTO DEL CITOMETRO
DE FLUJO.
1. ADQUISICIÓN y FAMILIARIZACIÓN Y PUESTA A PUNTO DEL
CITOMETRO DE FLUJO.

A. AMPLIFICACIÓN DE LOS DETECTORES:

1. Tamaño (FSC) y Complejidad (SSC).
2. Detectores de fluorescencias.
Conceptos necesarios:
- Amplificación de las señales: no deben estar ni por debajo ni por encima de los
limites de detección del citómetro dentro de un rango lineal de detección:
1 Rango dinámico rango de intensidades que pueden ser medidas en la escala.
2 Amplificación ideal la que permite medir que tanto las células positivas como
las negativas aparezcan en la escala.
3 Amplificación insuficiente aquella en la que no aparecen las células negativas
4 Amplificación excesiva aquella en la que las células positivas se salen de
escala.
- Ajuste de la amplificación: Este ajuste se realiza con la compensación a cero.
Puede realizarse empleando células sin marcar, marcadas con anticuerpos irrelevantes
o marcadas con anticuerpos específicos con distintos fluorocromos. También, es
habitual realizar la calibración con partículas de látex sin marca y otras marcadas con
fluorocromos. Se debe ajustar a la primera década del dot plot o histograma.

B. COMPENSACIÓN DE SEÑALES FLUORESCENTES

- Fundamento Parte de la señal de emitida por un fluorocromo/color es leída por el

detector de otro fluorocromo/color.
- Definición: es la sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal
medida en otro color.
Compensación excesiva o sobrecompensada o hipercompensada: falsos negativos.
Compensación insuficiente o poco compensada o hipocompensada: falsos positivos.
- Dependencia de la amplificación: La compensación está directamente relacionada con
una correcta amplificación. Si las amplificaciones no son las correctas las
compensaciones serán excesivas o insuficientes. Para cada conjunto de amplificaciones
existe una compensación idónea.

C. SELECCIÓN DE LA INFORMACIÓN

a. Parámetros de alerta y umbrales

- El citómetro mide discontinuamente durante unos 10-40 s cuando detecta una
partícula.
Concepto parámetro que alerta al citómetro para que mida esa partícula: Umbral
Valor umbral valor del parámetro de alerta a partir del cual el citómetro decide medir
la partícula.
Utilidad El aparato no mide las señales correspondientes a partículas más pequeñas que
las que queremos estudiar. Evitamos la cuantificación del debris (restos celulares,
fragmentos celulares…)
Ejemplo: Muy usado en el detector de FSC para inmunofenotipos y otros experimentos.

b. Puertas/ventanas/Gates
Monoparámetricas: Sitúan los valores superior e inferior de un parámetro que definen
a las células de interés.
Biparámetricas: Se pueden utilizar puertas biparamétricas definidas en base a la
combinación de varios parámetros
Puertas lógicas: Pueden combinarse distintas puertas y emplearse simultáneamente
para seleccionar las células de interés.

D. ADQUISICIÓN.

Introducción de los tubos de Facs con las muestras procesadas al citómetro:

Protocolo de uso del citómetro:
a. Encender el citómetro apretando el botón on/off de encendido/apagado.
En el Facscan está en el frontal, esquina superior.
En el Facscalibur se encuentra en el lateral derecho de color verde.
b. Revisión de los tanques de fluidos: Se encuentran en un cajón que se
desliza desde el frontal del citómetro. Aquí se encuentran dos tanques de
fluidos: el primero, situado a la derecha contiene PBS limpio, y si esta vació
hay que rellenarlo, pero nunca al máximo de su capacidad, aprox 75-80%. El
segundo tanque es el que contiene PBS sucio y desechable, y si el tanque está
lleno, hay que vaciarlo.
c. Dar la presión al sistema de fluidos. Se realiza mediante una palanca
situada entre los dos tanques.
d. Encender el ordenador Macintosh que controla al citómetro.
El ordenador del Facscan se enciende desde el teclado. Tecla superior
derecha.
El ordenador del Facscalibur se enciende desde el botón central de la cpu
e. Iniciar el Cellquest-Pro: Icono que arranca el programa
Pasos básicos para poder adquirir un tubo desde el cellquest-pro:
1. Conectar al citómetro.
2. Crear o abrir plantilla de adquisición.
3. Cargar las instrument settings del citómetro.
4. Decir al cellquest donde se quieren almacenar los datos de adquisición.
5. Nombrar como se van a llamar estos datos.
6. Colocar el número de células que se quiere guardar.
f. Comenzar a adquirir las muestras resultantes de los protocolos anteriores.