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domesticus) VENEZOLANA.
domesticus) VENEZOLANA.
Autores:
Br. Casadiego Soleydimar
Br. Garcia Enderlys
Tutor Externo: Dr. Catarí Edgar
Tutor Académico: M.Sc. Mayantino Garaboto
Casadiego Soleydimar.
iv
DEDICATORIA
García Enderlys.
v
AGRADECIMIENTOS COMPARTIDOS
A nuestro tutor, M.Sc. Angel Garaboto, por sus orientaciones y consejos durante la
realización de este trabajo, por trasmitirnos sus conocimientos y brindarnos la oportunidad
de adquirir nuevas experiencias como estudiantes de Ing. Química.
Al Dr. Edgar Catarí, y al cuerpo técnico del Laboratorio de Polímeros del Instituto
Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), por abrirnos las puertas de esta casa de
estudio, proporcionarnos toda su ayuda en el desarrollo de la investigación y permitirnos
realizar los experimentos de éste trabajo en sus instalaciones.
A la Lic. Liz Cubillán, por su amable atención al realizar las pruebas de IR de las muestras
de nuestra investigación, así como sus consejos y enseñanzas durante nuestra permanencia
en el IVIC.
Al Lic. Álvaro Mendoza, por darnos la oportunidad de participar en este proyecto, por su
entusiasmo y disposición para hacer que esta investigación se desarrollara de la mejor
manera brindándonos la mejor experiencia de nuestra carrera, muchas gracias.
vi
A la Ing. Karelys Vargas, quien siempre estuvo al pendiente durante nuestro trabajo en las
instalaciones de Agroindustrias D’EFRAIN dispuesta a ayudarnos en cualquier situación,
por brindarnos su apoyo incondicional y en especial por su amistad.
Al Ing. Carlos Mascia, por su colaboración para la adquisición del patrón de Hialuronato de
Sodio.
vii
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por iluminar mi camino, por darme la fuerza y perseverancia para seguir adelante y
permitirme alcanzar esta meta.
A mi padre Luis Casadiego, que desde el cielo estás como un ángel guiando mis pasos y sé
que estarías muy orgulloso de mí por este logro que hoy estoy cumpliendo.
A mis hermanas Mariany Casadiego y Ana Casadiego, por confiar siempre en mí, por
brindarme su amor incondicional, por ser mi fuente de alegría y ser mi motivación durante
todos estos años.
A mi Familia, por estar siempre pendientes de mí, por sus consejos, su cariño y apoyo
incondicional.
A Oscar Ortiz, por su cariño y apoyo incondicional, por siempre creer en mí y hacerme reír
en todo momento.
Casadiego Soleydimar.
viii
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por brindarme la oportunidad de cumplir mis sueños y por darme la
determinación para culminar mis estudios.
Agradezco a mi madre, Euris Alvarado, pilar fundamental en mi vida, gracias por el amor
incondicional, gracias por guiarme y cuidarme, gracias por tu paciencia y comprensión, no
ha sido fácil pero lo logramos.
Agradezco a mi abuela, Juana Alvarado, por siempre creer y confiar en mí, gracias por el
amor más dulce que puedo recibir.
Agradezco a mi familia, especialmente a mis tías, Lesbia, Aury y Angie, sin olvidar a mi
tía Sailuma que nos cuida desde el cielo. A mis tíos, Ovidio, Félix, Arcadio y Carlos.
Gracias por el apoyo y disposición para siempre ayudarme cuando lo necesito.
Agradezco a mi compañera de tesis, Soleydimar Casadiego, no fue fácil pero fue divertido,
gracias por tu paciencia en esta aventura.
García Enderlys.
ix
ÍNDICE GENERAL
x
Funcionamiento del molino de bolas ............................................................................ 46
Definición del tamiz ...................................................................................................... 46
Funcionamiento del tamizador ...................................................................................... 46
PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN.......................................................................... 47
ETAPA I: SEPARACIÓN FÍSICA DE LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA ......... 47
ETAPA II: EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE LA
MEMBRANA PULVERIZADA SECA ....................................................................... 49
ETAPA III: PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO OBTENIDO .............. 52
CAPÍTULO IV .................................................................................................................................. 56
PRESENTACIÓN Y DISCUSION DE RESULTADOS ............................................................. 56
ETAPA I: SEPARACIÓN FÍSICA DE LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA ......................... 56
Análisis granulométrico de cáscaras secas .................................................................... 58
ETAPA II: EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE LA MEMBRANA
SECA............................................................................................................................................. 60
Perfil de pH ................................................................................................................... 60
ETAPA III: PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO OBTENIDO .............................. 61
ETAPA IV: CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO FINAL ................................................. 62
Espectrometría Infrarroja por la Transformada de Fourier ........................................... 65
Comparación de los resultados respecto al solvente utilizado para realizar la extracción
....................................................................................................................................... 70
Comparación de los espectros IR del ácido hialurónico obtenido relacionando los
porcentajes de acetato de sodio y cloruro de sodio utilizado. ....................................... 71
Análisis Termogravimétrico (TGA) .............................................................................. 72
CAPÍTULO V ................................................................................................................................... 81
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................................ 81
Conclusiones ................................................................................................................. 81
Recomendaciones .......................................................................................................... 82
REFERENCIAS ................................................................................................................................ 83
APÉNDICE ....................................................................................................................................... 89
ANEXOS .......................................................................................................................................... 93
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 4. Materiales, reactivos y equipos utilizados durante todo el proceso de obtención del
AH. ....................................................................................................................................... 43
xii
INDICE DE FIGURA
xiii
Figura 20. Espectros IR por ATR de la muestra 33AI, 32AI, 31AI, hialuronato de sodio
comercial y acetato de sodio................................................................................................. 71
Figura 21. Espectros IR por ATR de la muestra 33SE, 32SE, 31SE, hialuronato de sodio
comercial y cloruro de sodio. ............................................................................................... 72
Figura 22. Termogramas para el HS comercial, AS y Cloruro de Sodio. ........................... 73
Figura 23. Pérdida de masa en función de la temperatura de las muestras tratadas con
acetato de sodio. ................................................................................................................... 75
Figura 24. Termogravimetría Derivada (DTG) de las muestras obtenidas a través de la
primera derivada de la curva de peso en función de la temperatura..................................... 78
Figura 25. Pérdida de masa en función de la temperatura de las muestras tratadas con
cloruro de sodio. ................................................................................................................... 79
xiv
ABREVIATURA
AG Ácido glucuróico
AH Ácido hialuróico
AS Acetato de sodio
Da Dalton
"Differential scanning calorimetry" (Calorimetría de barrido
DSC
diferencial)
DTG "derived thermogravimetry" (Termogravimetría derivada)
HS Hialuronato de sodio
“High Performance Liquid Chromatographic” (Cromatografía
HPLC
líquida de alta eficacia).
IR Infrarrojo
xv
UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL POLITÉCNICA
“ANTONIO JOSÉ DE SUCRE”
VICERRECTORADO BARQUISIMETO
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
EVALUACIÓN, DISEÑO Y SIMULACIÓN DE PROCESOS
INDUSTRIALES
RESUMEN
El presente trabajo permitió evaluar la obtención del Ácido Hialurónico a partir de la membrana
de la cáscara del huevo de gallina (Gallus gallus domesticus) venezolana. Primeramente se
estableció un método físico que permitió la separación de las membranas de las cáscaras con un
rendimiento del 51,0 %. Luego de lograr la separación se llevó a cabo la extracción, para esto se
realizaron ensayos experimentales a nivel de laboratorio, desarrollados en el Laboratorio de
Polímeros del Centro de Química del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).
Las membranas fueron tratadas bajo las siguientes condiciones de operación: control de pH desde
3,5 a 3,9 manteniendo constante la temperatura de 9 °C durante 3 días de extracción. Se
emplearon dos solventes, isopropanol y etanol en proporción 1:1 respecto al volumen de muestra
obtenida, resultando ser más eficiente el isopropanol. Dentro del proceso se utilizaron dos sales
como agentes precipitantes, acetato de sodio y cloruro de sodio, ambas al 3, 2 y 1% en diferentes
ensayos. Se caracterizó parcialmente el producto obtenido empleando la técnica de FTIR con el
accesorio ATR, resultando que para las muestras tratadas con 1% de acetato de sodio mostraron
bandas más definidas asociadas al hialuronato de sodio comercial, sin embargo, se encontró que
dichas muestras contenían un exceso de acetato de sodio. De igual manera, se practicaron análisis
de TGA que permitieron deducir que el exceso de acetato de sodio y cloruro de sodio
estabilizaban térmicamente las muestras elevando su temperatura de descomposición en
comparación a la del hialuronato de sodio puro.
En 1934, Karl Meyer y John Palmer aislaron un nuevo polisacárido del humor
vítreo de bovinos, compuesto por un ácido urónico y un aminoazúcar. Lo llamaron ácido
hialurónico (Peñuelas, 2016). El Ácido Hialurónico (AH) es un polímero de origen natural
que resulta de la polimerización alterna del Ácido Glucurónico (AG) y N-
Acetilglucosamina, esta molécula puede llegar a alcanzar una longitud de cadena del orden
de 102 a 104 unidades manométricas, obteniéndose así un rango de peso molecular de entre
104 a varios millones de Dalton. El AH se encuentra localizado en la matriz extracelular,
articulaciones, cartílago, piel actuando como esponja absorbiendo el agua. Por tanto, el AH
es el responsable principal de la hidratación de la piel. A nivel comercial, el AH se produce
a partir de crestas de gallo y por fermentación del Streptococcus pertenecientes al grupo C,
el cual el grupo C tiene una alta productividad de AH y no son patógenos humanos
(Peñuelas, 2016). Este trabajo consistió en evaluar la obtención de AH usando la membrana
de la cáscara del huevo de gallina como materia prima alternativa para extracción.
La finalidad de este trabajo tiene como objetivo evaluar el método físico y químico
para la obtención del Ácido Hialurónico a partir de la membrana de la cáscara del huevo de
Gallina (Gallus gallus domesticus) Venezolana, usando como solvente de extracción
isopropanol y etanol y como agentes precipitantes acetato de sodio y cloruro de sodio a
diferentes concentraciones.
1
membrana de la cáscara. Etapa II: Extracción del ácido hialurónico a partir de la membrana.
Etapa III: Purificación del ácido hialurónico obtenido. Etapa V: Caracterización del
producto final.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
3
tecnologías producen AH de alto peso molecular para aplicaciones biomédicas y
cosméticas. El primer proceso, que se aplicó a escala industrial, fue la extracción de AH a
partir de desechos animales, un inconveniente en el proceso de extracción es la inevitable
degradación del AH, causada por (a) la actividad hialuronidasa endógena en tejidos
animales, rompiendo la cadena del polímero a través de la hidrólisis enzimática, y (b) las
duras condiciones de extracción (Boeriu, 2013).
Además de las fuentes antes mencionadas, existen otros sustratos alternativos que
pueden ser útiles para extraer AH, como por ejemplo la membrana de la cáscara del huevo
de gallina, como se indica en la investigación descrita por Khanmohammadi (2014). No
obstante, se ha determinado que el contenido de AH presente en las membranas de las
cáscaras de huevo es menor en comparación a otras fuentes, como los cordones umbilicales
y las crestas de gallo, sin embargo las membranas de las cáscaras de huevo resultan ser una
fuente alternativa de AH con un gran potencial para ser usado en el campo industrial y
medicinal (Khanmohammadi, 2014).
4
Bajo el patrocinio de la empresa Agroindustrias D’EFRAIN C.A., y con el apoyo y
soporte técnico del Laboratorio de Polímeros del Instituto Venezolano de investigaciones
científicas (IVIC), se investigó la manera de obtener AH a partir de las cáscaras de huevo
residuales. Este AH representaría un producto secundario de gran valor comercial con el
cual se obtendría una excelente oportunidad de negocios para la empresa Agroindustrias
D’EFRAIN C.A., al mismo tiempo se reduce el impacto ambiental que se deriva de la
deposición de estos desechos industriales al entorno, a pesar de que son productos que no
contienen compuestos de alto riesgo medioambiental, la acumulación de estas cáscaras en
grandes volúmenes pueden plantear problemas de gestión.
La cáscara de huevo de gallina representa del 9 al 12% del peso total del huevo, la
misma está compuesta en un 96-98% de carbonato calcio (CaCO3), mientras que el 2-4%
restante constituye una matriz orgánica que se localiza dentro y entre los cristales de
carbonato de calcio, esta matriz orgánica, adherida internamente en la cáscara de huevo,
está compuesta por dos membranas llamadas membrana testácea interna y externa, la
principal función de esta matriz orgánica es la de proporcionar protección contra la
penetración bacteriana (Fernández, Arias, 2010). De acuerdo a estudios realizados en el
Laboratorio de Biología Celular del departamento de Ciencias Biológicas Animales de la
universidad de Chile, la membrana de la cáscara de huevo seca, está constituida en un 3%
de lípidos, 2% de polisacáridos y 95% de proteínas (Fernández, Arias, 2010). El
polisacárido al cual se refiere el estudio anteriormente mencionado, es el AH.
5
De lo antes expuesto, surgen siguientes interrogantes que el trabajo experimental
buscara responder:
En aras de dar respuestas a estas interrogantes antes planteadas, se procede a formular los
objetivos del presente trabajo.
6
OBJETIVOS DEL TRABAJO
Objetivo General
Evaluar la obtención del Ácido Hialurónico a partir de la membrana de la cáscara del huevo
de Gallina (Gallus gallus domesticus) Venezolana.
Objetivos Específicos
7
JUSTIFICACIÓN
8
La empresa Agroindustria D’EFRAIN C.A. es una empresa dedicada a la
transformación y producción de los derivados industriales del huevo (ovoproductos) que
pueden destinarse al consumo humano directo, o para el uso en otras industrias para obtener
otros productos. La producción de estos ovoproductos genera grandes cantidades de
desechos sólidos, alrededor de unos 108.000 huevos por día durante el proceso de
quebrado, actualmente este pasivo ambiental no es aprovechado de ninguna manera,
además representa una fuente de contaminación generando las condiciones adecuadas de
procreación de insectos y otros entes patógenos. Por lo tanto, el presente trabajo utilizara
estos desechos como materia prima para la obtención del AH, lo cual aportará un valor
agregado a las cascaras de huevo desechadas, y se minimizará el impacto ambiental.
9
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
ANTECEDENTES
Estudios anteriores relacionados con la obtención del AH, han servido de base y
sustento en este trabajo de grado; algunos de gran importancia, se citan a continuación.
10
esta forma se han elaborado a partir del mismo un jabón, gel y loción evaluadas para el
tratamiento antiacné, así como un gel cicatrizante propuesto en el tratamiento de ulceras y
una loción para después de afeitar, ya comercializada. En dicho estudio se determinó el
contenido de AH mediante el empleo de cromatografía líquida de intercambio iónico (HPIC
en sus siglas en inglés), se determinó la masa molar del ácido hialurónico por cromatografía
de exclusión molecular (SEC en sus siglas en inglés), se realizó un análisis mediante el
empleo de la espectrofotometría infrarroja por la transformada de Fourier (FTIR) para la
detección de los principales grupos funcionales presentes en el ácido hialurónico purificado
y en el tomado como estándar de referencia, de igual manera se aplicaron otros análisis para
su caracterización. La información aportada por esta tesis proporcionó algunas de las bases
teóricas necesarias para complementar esta investigación, además aportó información
referente al método de análisis y caracterización que fueron aplicados al producto obtenido
y al AH comercial.
11
la industria y la medicina. La metodología de extracción de AH descrita en el trabajo por
Khanmohammadi, sirvió como base metodológica para el presente trabajo de grado, para
ello se tomaron en cuenta las siguientes variables: pH, temperatura y tiempo de extracción.
Además sirvió como referencia en cuanto al uso de la técnica de análisis, FTIR para
detectar la presencia de los diferentes grupos amino, carboxilo e hidroxilo característicos
del AH.
12
acuerdo al procedimiento descrito por Pires y Santana (2010). De igual manera, en este
trabajo se caracterizó el AH obtenido mediante la técnica de Espectrometría de Infrarrojo
por Transformada de Fourier (FTIR) y resonancia magnética nuclear de protón (1H-NMR)
con el objetivo de verificar la pureza y existencia de los grupos funcionales característicos
del AH. Además, se determinó el peso molecular y el índice de polidispersidad, que son
parámetros importantes de calidad, mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Lo significativo de este trabajo fue el uso de la técnica de infrarrojo utilizada para
caracterizar el AH obtenido, el cual permite su correcta identificación. Dicho método será
adaptado a las condiciones de trabajo en las que se desarrolle esta investigación.
13
BASES TEÓRICAS
14
Figura 1. Unidad de repetición de ácido hialurónico que comprende ácido D-glucurónico y
N-acetilglucosamina unidos alternativamente por los enlaces glicosídicos β -(1–3) y β –
(1–4).
Características estructurales
15
de base para las funciones tisulares. Estas redes poliméricas, tienen la posibilidad de
retener agua en su interior como si fuera una esponja molecular. En el caso de la piel, es
responsable de su capacidad hidratante. Se ha demostrado que cuando se aísla de fuentes
biológicas o se obtiene por vía biosintética, la capacidad de hidratación del mismo, permite
formar soluciones con características viscoelásticas, de interés en oftalmología. Según
algunos investigadores esta propiedad es única de esta estructura (Lago, 2007).
Especificaciones
16
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas del Ácido Hialurónico
Pureza >93 – 95 %
Degradación
El AH, tanto a nivel de tejido como cuando se encuentra libre puede ser
degradado por diferentes vías: enzimáticas, por acción de agentes químicos, radiaciones
ionizantes y por efecto de la temperatura.
En 2007, Lago expresa que el ácido hialurónico se puede degradar también por
agentes oxidantes y radiaciones UV y gamma, produciéndose radicales libres en la
17
molécula de AH, que le permite inhibir algunas sustancias proinflamatorias como son
interleucinas (IL-1β) y el factor de necrosis tumoral (TNF−α), esta inhibición puede
explicar, el efecto antiinflamatorio y analgésico del mismo.
Función
El AH tiene una estructura que exhibe una amplia gama de efectos biológicos, dada
por su capacidad hidratante, acción antiinflamatoria, cicatrizante etc. Durante la última
década se ha demostrado que participa en un grupo de eventos que contribuyen en el
comportamiento y fisiología de las células tales como: movimiento, crecimiento, división y
diferenciación, remodelación del tejido, inflamación y tumorogénesis. Como se explicó con
anterioridad, el AH no forma enlace covalente con las proteínas sin embargo, las células
responden directamente al AH por medio de proteínas de la superficie de la membrana, que
se unen al mismo mediante interacciones no covalentes, éstas son: las hiadhelerinas, el
receptor CD-44, el receptor para la motilidad mediada por hialuronato (RMMAH), el cual
juega un papel importante en la motilidad de las células malignas, así como la molécula de
adhesión intercelular (MAC-1). De los anteriores, el receptor CD-44 de gran especificidad
hacia el AH, es una proteína integral de la membrana la cual está implicada, con la
regulación del desarrollo de tumores y con el potencial metastático (Tufvesson y
Westergren, 2000; Karvinen y col, 2003; Gao y col, 2004).
18
trombina. Aunque el nivel de AH es bajo en sangre, el mecanismo explica el significado
funcional y estructural de este polisacárido durante la cicatrización (Weigel y col, 1988).
Usos
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MATERIA PRIMA: MEMBRANA DE LA CÁSCARA DEL HUEVO DE GALLINA
Composición química
Organización estructural
20
Cutícula
La cutícula se deposita sobre la superficie de la cáscara durante la fase final de
formación del huevo, se distribuye de manera desigual y su espesor varía desde 0,5 hasta
12,8 µm. en ella se encuentra en gran mayoría los pigmentos (moléculas de porfirinas)
responsables de la coloración de la cáscara (Fernández y Arias, 2010).
Capa en empanizada
Capa mamilar
La capa mamilar tiene un grosor aproximado de 100 µm. Está formada por las
mamilas, que constituyen pequeñas masas de material orgánico distribuidas de manera
discreta en toda la capa y que se hallan unidas a la superficie externa de la membrana
externa. Es a partir de las mamilas que se inicia la mineralización por el depósito de
cristales de calcita, constituyéndose de esta manera la base de las columnas cristalinas de la
capa en empanizada.
Las cáscaras del huevo de gallina y sus membranas son materiales de desecho
baratos y abundantes, cuyos usos tradicionales son como alimento para animales, como cal
sustituta o como fertilizante. Sin embargo, la separación de este residuo en sus
constituyentes minerales (cáscara) y proteicos (membranas), permite el desarrollo de
21
diferentes aplicaciones para cada material, dando lugar a productos de mayor valor
agregado (Urbano, 2015).
Las compañías de ovoproductos (derivados del huevo de gallina), durante más de 10
años, han invertido en la investigación y desarrollo de procesos que permitan la extracción
de productos con potencial aplicación comercial a partir de sus residuos. El alcance de estos
estudios ha dado lugar a un sinnúmero de usos tanto para las membranas intersticiales como
para la cascara limpia (Urbano, 2015).
Muchos de ellos han desarrollado de manera exitosa y rentable, de tal forma que
actualmente se encuentran como aplicaciones patentadas. A su vez las investigaciones
realizadas han marcado precedentes importantes para futuros e innovadores usos de estos
residuos.
Caracterización y función
22
Figura 2. Esquema de la ubicación y estructura de las membranas del huevo de gallina.
Las membranas testáceas representan en promedio el 3,00 % del total del peso de la
cáscara, lo que indica que, de cada 100 g de residuos de cáscara de huevo de gallina, 3 g
corresponden a las membranas intersticiales (Barroeta, 2002).
Composición química
La parte orgánica de las membranas de la cáscara, en base seca, está constituida por
3,00 % de lípidos, 2,00 % de polisacáridos y 95,00 % de proteínas, de acuerdo con lo que
establecen estudios realizados en el laboratorio de Biología Celular del Departamento de
Ciencias Biológicas Animales de la Universidad de Chile (Fernández y Arias, 2000).
La fracción proteica de las membranas testáceas contiene colágeno, glicoproteínas y
proteoglicanos. En un corte transversal se observa que cada fibra está compuesta por un
núcleo rico en colágeno, el cual se encuentra rodeado por un manto rico en glicoproteínas y
proteoglicanos. El manto de proteoglicanos y glicoproteínas es importante en la
determinación de las propiedades viscoelásticas de las membranas ya que contienen la
capacidad de adoptar la consistencia de un gel solido con buena resistencia a las fuerzas de
comprensión. Los proteoglicanos presentes en el manto de las fibras de las membranas
testáceas consisten en unidades hechas de 95,00 % de glicosaminoglicanos, o
23
mucopolisacáridos y 5,00 % de proteína. La molécula central organizadora del
proteoglicano es el AH; a partir de esta cadena central se proyectan las largas proteínas del
proteoglicano, las mismas que sirven de punto de anclaje de numerosas cadenas del
polisacárido condroitina (Hernández y Sastre, 1999).
La figura 3 indica la configuración de los componentes de los proteoglicanos.
24
Descripción y usos de los principales constituyentes de la membrana de la cáscara de
huevo de gallina
Espectrometría Infrarroja
La espectrometría del infrarrojo es sumamente útil para determinaciones cualitativas
de compuestos orgánicos y para deducir estructuras moleculares a partir de sus grupos
funcionales tanto de compuestos orgánicos como inorgánicos. En el análisis cualitativo la
25
espectroscopia de infrarrojo puede usarse para la identificación de sustancias puras o para
la absorción, localización e identificación de impurezas. Para localizar una impureza en una
sustancia se hace una comparación en el espectro de las sustancias que se estudia y una
muestra de la sustancia pura. Las impurezas causan bandas de absorción adicionales que
aparecen en el espectro (Skoog et al, 1998).
Los espectros IR contiene los números de onda de 4000 a 600 o 400 𝑐𝑚−1. Los
espectrómetros IR con transformada de Fourier (FTIR) ofrecen numerosas ventajas sobre
los antiguos espectrómetros IR. Dado que l0os datos se obtienen y almacenan en forma
digitalizada en la computadora, es posible manejarlos, transportarlos y presentarlos en una
pantalla con facilidad. Los instrumentos FTIR son muy rápidos, sensibles y precisos
comparados con los espectrómetros más antiguos (Shriner y Hermann, 2013).
La figura 5 muestra un esquema de un espectrómetro FTIR. La energía infrarroja
del láser pasa a través de una abertura que controla la cantidad de energía infrarroja
emitida. El haz infrarrojo se divide en dos haces ópticos mediante el separador de haces del
interferómetro. El separador de haces puede ser un espejo parcialmente recubierto que
puede manipularse para que deje de pasar en forma alterna la radiación, ya sea hacia el
espejo fijo o hacia el movible. Este último se ajusta con cuidado en forma creciente de
manera que la longitud de la trayectoria varíe regularmente. Las señales se recombinan en
26
el separador de haces. La diferencia entre las longitudes de la trayectoria da como resultado
una diferencia entre las dos longitudes de onda de energía. Dichas diferencias producen un
interferograma. Este interferograma posee información acerca de cada señal infrarroja que
proviene de la fuente y, de esta manera, todas las frecuencias se miden de manera
simultánea. Cuando la diferencia entre las dos longitudes de onda es un múltiplo entero par
de la longitud de onda del haz invariante, se produce una interferencia constructiva. Si la
diferencia entre ambas longitudes de onda es un múltiplo entero impar de un cuarto de la
longitud de onda del haz invariante, se genera interferencia destructiva. El interferograma
pasa entonces a través de la muestra y luego al detector. La señal de este no puede
interpretarse directamente, sino que se somete a una transformación de Fourier, un
procedimiento matemático muy complejo. La señal resultante se imprime como un espectro
infrarrojo (Shriner y Hermann, 2013).
27
Figura 5. Diversos tipos de modo de vibración.
Fuente: Shriner y Hermann, (2013).
28
absorben radiación, de modo que se utilizan espejos de vidrio con un recubrimiento de oro
o aluminio. El sistema óptico va equipado con un compartimento para la muestra, en el que
ésta se sitúa en el camino de la radiación, bien mediante celdas u otros accesorios que
permitan realizar medidas diferentes a la transmisión. (Ej. Attenuated Total Reflectance
ATR) El detector se emplea para convertir la señal óptica en una señal eléctrica fácilmente
medible, como el voltaje. Esto se consigue con la ayuda de equipos electrónicos para
amplificar y digitalizar las señales. Mientras que los primeros espectros se registraban de
forma analógica sobre papel, hoy en día el ordenador es un componente esencial con
múltiples posibilidades para procesar y almacenar los espectros. Los aparatos basados en el
método de transformada de Fourier ofrecen una relación señal/ruido mucho mejor y mayor
rapidez en la obtención de espectros, por lo que se imponen en el mercado (Serrano, 2017).
Electrofotómetros FTIR
Los espectrofotómetros dispersivos son los primeros que se utilizaron, aunque muy
pocos quedan activos en la actualidad para medidas de rutina en el IR-medio. Emplean un
dispositivo para restringir la longitud de onda que se mide de forma sucesiva, frente a la
medida simultánea de todas las longitudes de onda que realizan los aparatos basados en la
transformada de Fourier. En éstos últimos el componente más importante es el
interferómetro que se muestra en la figura 6 (Serrano, 2017).
30
Figura 7. Espectros (izquierda) y sus respectivos interferogramas. Radiación
monocromática(a) y radiación continua de una fuente térmica (d)
Preparación de muestras
31
de 1 a 10 minutos, dependiendo de la resolución y el número de barridos requerido
(Serrano, 2017).
𝐼
De acuerdo con la ley de Beer 𝐼 = 𝐼0 𝑒 −𝑎𝑏𝑐 la trasmitancia 𝑇 = 𝐼 es función de la
0
32
dispersiones del sólido en una matriz líquida o sólida. Generalmente, en estas técnicas la
muestra sólida se debe pulverizar hasta que el tamaño de sus partículas sea menor que la
longitud de onda de la radiación (<2 μm) para evitar los efectos de la dispersión de la
misma (Serrano, 2017).
Pastillas
Después del prensado es importante realizar una limpieza cuidadosa de todos los
accesorios, puesto que los residuos de KBr pulverizado son higroscópicos y muy corrosivos
una vez húmedos. En relación con esto conviene resaltar la elevada polaridad de los haluros
alcalinos que pueden incluso interactuar física o químicamente con la muestra, de tal modo
33
que el espectro registrado por este método puede diferir si lo medimos empelando alguno
de los métodos que se comentan a continuación. Algunos cambios son la hidratación de la
muestra, saponificación de esteres, sustitución de grupos funcionales por haluro o
descomposición del producto. Si se observan anomalías en la identificación de la muestra
es recomendable probar otra técnica de preparación (Serrano, 2017).
Suspensiones
Se pueden obtener, con ayuda de un par de placas calientes y una prensa, láminas
delgadas de polímeros con un espesor altamente reproducible, desde 15 hasta 500 μm.
Respecto a la cantidad de muestra necesaria, para hacer un disco de 20 mm de diámetro
basta con 10 mg de polímero si se quiere hacer una lámina de 15 μm de espesor. Esta
lámina se analizará por transmisión.
34
Después de forma similar se añade nitrógeno para conseguir la presión total deseada, puesto
que hay una importante dependencia de la absortividad con esta magnitud que hay que
considerar en los ensayos cuantitativos. Así, es muy importante utilizar la misma presión
total en las medidas de la muestra y en la correspondiente calibración (Serrano, 2017).
35
del cristal con una o más reflexiones. Tanto el número de reflexiones como la profundidad
de la penetración decrecen con el incremento del ángulo de incidencia. Para un ángulo
dado, las mayores relaciones longitud/espesor dan un mayor número de reflexiones. Existe
una variedad de tipos de accesorios de ATR, como los verticales de ángulo variable, de 25 º
a 75º, los cristales horizontales o las cubetas cilíndricas de reflectancia interna para
evaluación de líquidos.
Análisis Termogravimétrico
36
Las mediciones se llevan a cabo bajo reflujo programado de un gas apropiado. El
contenido porcentual de pérdida, G, se calcula por la formula siguiente:
𝛥𝑚
𝐺(% 𝑑𝑒 𝑝é𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎) = 100
𝑚𝑜
En la cual:
𝛥𝑚 es la pérdida de masa.
𝑚𝑜 es el peso inicial de la muestra
37
Figura 8. Ejemplo de la curva de tipo TGA y DTG
Fuente: Rivas, (2007).
Instrumentación
Balanza
Las condiciones requeridas para la balanza son exactitud, sensibilidad y
reproducibilidad, siendo también necesarias una capacidad razonable, elevada estabilidad y
rapidez de respuesta. Los dos sistemas de balanza más comunes son las de punto nulo y las
de desviación. A medida que el peso varía y el brazo de la balanza comienza a desviarse de
su posición normal, un sensor detecta la desviación y provoca la fuerza que devuelve al
brazo de la balanza a su posición de cero o punto nulo. La fuerza aplicada es directamente
proporcional al cambio de peso. Se suele utilizar una microbalanza electrónica, de
capacidad máxima 1.0 g incluido el peso del portamuestra, que permite acomodar hasta 500
mg de muestra aproximadamente (Rivas, 2007).
38
Horno
El horno se puede considerar como el corazón de la termobalanza; tiene que
acomodar el portamuestra y asegurar velocidades de calentamiento lineal en un amplio
intervalo de temperatura, así como trabajar en régimen isotérmico. Estos requisitos se
pueden conseguir utilizando un horno con un rebobinado no inductivo, provisto de algún
sistema de refrigeración. El horno conecta directamente al programador. Es muy importante
que el horno posea una zona caliente uniforme, lo cual es fácil de conseguir en un horno de
masa apreciable. Sin embargo, estos se enfrían muy lentamente y también necesitan mucho
más tiempo para alcanzar una determinada temperatura. Por estas razones, el diseño de los
hornos comerciales varía considerablemente de unos fabricantes a otros. Además, si ha de
ir provisto de sistemas de circulación de gases para trabajar en atmosfera controlada, se
dificulta aún más el diseño del horno (Rivas, 2007).
Programador
El programador está conectado directamente al horno y lo controla a lo largo de
todo el proceso. Debe existir un sensor de temperatura en contacto directo con el horno, que
envíe información al programador para controlar la potencia eléctrica que se envía al horno.
El desarrollo de dispositivos de estado sólido permite disponer actualmente de
programadores que pueden ejecutar complicados programas de calentamiento, isotérmico y
enfriamiento. El objetivo es poder disponer de un registro continuo del peso de la muestra
en función de la temperatura, generalmente a través de un sistema informatizado de
adquisición de datos, así como para el procesado de los mismos (Rivas, 2007).
39
una atmósfera oxidante (ver Figura 10). Pérdida de masa puede ser categorizado como
componentes volátiles, tales como la humedad absorbida, disolventes residuales, productos
de reacción, tales como agua y formaldehído a partir de la cura de fenólicos y amino
resinas, que generalmente se forman entre 100 ° C y 250 ° C; y la generación de productos
de degradación volátiles que resultan de la escisión de cadena que generalmente requieren
temperaturas superiores a 200 ° C pero no más de 800 ° C. Todos estos procesos de pérdida
de masa se puede caracterizar mediante TGA para producir información tales como la
composición, grado de curado, y estabilidad térmica (Menczel y Prime, 2009).
40
CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
NATURALEZA DE LA INVESTIGACIÓN
41
Etapa II: En esta etapa se realizó la extracción del AH a partir de la membrana
pulverizada seca.
Etapa III: Consistió en purificar el producto obtenido.
Etapa IV: En esta última etapa se caracterizó parcialmente el producto final
obtenido.
VARIABLES DE ESTUDIO
Fuente: Propia.
42
SUJETO DE ESTUDIO
RECURSOS Y MATERIALES
Tabla 4. Materiales, reactivos y equipos utilizados durante todo el proceso de obtención del
AH.
43
Homogenizador, marca
Mortero de porcelana. Cloruro de sodio al 97 %.
HEIDOLPH.
Continuación de tabla 4
Campana de extracción, marca
Piceta. Agua destilada.
MOBILABCA.
Envases de plástico para
Horno con sistema al vacío,
almacenar.
marca NATIONAL.
Envases de vidrio para
Rotavapor, marca HEIDOLPH.
almacenar.
Balones aforados de 25, Batidor industrial, marca
100, 250 y 1000 mL. G.PANIZ
Balones de fondo redondo
Tamices series Tyler.
de 250 y 500 mL.
Beaker de 100, 300, 600, Centrifuga, marca
900, 1400 y 3000 mL. EPPENDORF.
Cilindros graduados de 10,
Liofilizador, marca VirTis.
250 y 500 mL.
Espectrómetro FTIR, marca
Kitasato de 1000 mL.
Thermo SCIENTIFIC
TGA, marca METTLER
Embudo de vidrio para
TOLEDO, modelo
filtrado.
TGA/SDTA851e.
Tubos de centrífuga de 50
mL.
Reactor con camisa de
vidrio de 100 y 500 mL.
Pinzas de metal.
Jeringa de vidrio.
Colador de aluminio.
Tobos de plástico de 16 L.
Bandejas de aluminio.
Fuente: Propia.
44
INGENIERÍA DE PROCESOS: EQUIPOS UTILIZADOS
Definición de trituración
Fraccionamiento de la muestra
Definición de molienda
45
Funcionamiento del molino de bolas
La materia prima que fue colocada dentro del molino de bolas fue golpeado por un
conjunto de bolas cilíndricas de cerámica de alúmina de igual tamaño, girando a una
velocidad media simulando la rotación de un tambor, se produjo la pulverización de las
membranas gracias a la fricción que se ejerció entre las bolas a medida que giraban dentro
del molino. Este proceso se llevó a cabo durante un tiempo aproximado de 12 horas.
Un tamiz es una malla metálica constituida por barras tejidas y que dejan un espacio
entre sí por donde se hace pasar el sólido previamente triturado. Las aberturas que deja el
tejido y, que en conjunto constituyen la superficie de tamizado, pueden ser de forma
distinta, según la clase de tejido (Vian y Ocón, 1952).
46
PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN
47
Figura 10. Diagrama del proceso de limpieza y separación física de las membranas y
cáscaras a partir de residuos de cáscara de huevo de gallina.
Fuente: Propia.
48
de membrana y cáscaras se separaran casi en su totalidad. Dado que las partículas de
membranas son muy livianas, tienden a permanecer atrapadas en la parte superior del
líquido, para retirar las membranas suspendidas en el agua, se usó un colador de malla
metálica. Estas membranas fueron lavadas con suficiente agua destilada y depositadas en
un recipiente adecuado donde fueron secadas a temperatura ambiente, para eliminar la
mayor humedad se sometió a un proceso de secado al vacío a temperatura ambiente por 24
horas, una vez ya secas fueron pulverizadas usando un molino de bolas ubicado en el
Laboratorio de Polímeros en el Centro de Química del Instituto Venezolano de
Investigaciones Científicas (IVIC). Finalmente, las membranas pulverizadas fueron
almacenadas en un recipiente de vidrio.
Por otro lado, las partículas de cáscaras de huevo limpias se depositaron en el fondo
del mezclador donde fueron recogidas, secadas a temperatura ambiente y almacenadas para
luego realizar su cuantificación.
Se llevaron a cabo dos tipos de tratamientos diferentes, con el fin de trabajar con
dos métodos distintos y comparar el rendimiento del ácido hialurónico obtenido.
49
dado que el trabajo desarrollado por Khanmohammadi, utilizan como fuente de extracción
las cáscaras de huevo molidas junto con las membranas lo que añade una gran cantidad de
carbonato de calcio y otros compuestos a la matriz del proceso generando interferencias en
la extracción del ácido hialurónico. Y en la presente investigación se tiene como fuente de
extracción las membranas secas pulverizadas eliminando las interferencias que pueda
causar el carbonato de calcio por lo que se requirió menos tiempo para la extracción. A
continuación se explica el procedimiento llevado a cabo para la extracción del AH usando
como solvente alcohol isopropílico.
Procedimiento experimental
1. Se preparó en la campana extractora una solución de ácido acético de
concentración 0,006 mol/L y una de concentración 4 mol/L.
2. Se instaló el sistema de extracción como se muestra en la figura 12, se dio inicio
al sistema y se esperó a que se estabilizara la temperatura de 9 ºC en el circulador
de fluidos.
3. Se pesaron 3 g de muestra en la balanza analítica.
4. La muestra se agregó al reactor tipo batch el cual se encuentra acoplado al
sistema de enfriamiento instalado, manteniendo contante la temperatura.
5. Se midieron 110 mL de solución de ácido acético de concentración 0,006 mol/L
y se agregaron al reactor para llevar a cabo la reacción.
6. Se midió el pH al inicio de la reacción con el pHmetro y se desarrolló una curva
de pH en función del tiempo (s) usando para su control y registró el programa
RS232 Software Ver 2.1.
7. Para neutralizar la reacción, se agregaron 22 mL de solución de ácido acético de
concentración 4 mol/L.
8. Se realizó la extracción del ácido hialurónico durante 3, 2 y 1 día.
9. Al completar el tiempo de extracción, se agregó alcohol isopropílico en
proporción 1:1 respecto al volumen de muestra obtenida.
10. Se agito durante 0,5 h hasta obtener una mezcla homogénea y se mantuvo en
reposo durante 24 h.
50
11. Se centrifugo en frio a 4 ºC, a una velocidad de 4000 rpm durante un tiempo de
operación de 40 minutos.
12. Se preparó 200 mL de una solución de acetato de sodio al 3%, 2% y 1%.
13. El precipitado obtenido, se lavó con una solución de acetato de sodio
correspondiente a 3%, 2% o 1%.
14. Se homogenizo la solución a temperatura ambiente, manteniendo una velocidad
de agitación de 7 rpm durante un tiempo de 10 minutos.
15. Se agregó en agitación durante 2 h sílica gel y carbón activado a la solución
luego de la homogenización, ambos al 2% en peso respecto al volumen de
solución a tratar.
16. Al pasar las 48 h, se filtró la solución al vacío.
17. La solución liquida se liofilizo durante 48 h.
18. El sólido blanco obtenido luego de la liofilización fue pesado.
19. Finalmente el sólido purificado es analizado mediante FTIR – ATR y TGA.
Figura 11. Montaje del sistema utilizado para la extracción del ácido hialurónico.
Fuente: Casadiego y García, 2018.
51
Descripción del funcionamiento del sistema
El sistema que se utilizó está comprendido por: un circulador de fluidos que permite
el mantenimiento de temperaturas constante, un reactor tipo batch con agitador mecánico,
este sistema contiene aberturas que permitió la medición periódica del pH.
Para la extracción del AH usando como solvente alcohol etílico, se realizó el mismo
procedimiento experimental desarrollado anteriormente, diferenciándose en que para este
caso se usa alcohol etílico en vez de alcohol isopropílico y soluciones al (3, 2 y 1) % de
cloruro de sodio con una pureza del 96% en vez de acetato de sodio. A excepción de una
muestra donde se usó acetato de sodio al 3%.
52
La solución de sal del ácido hialurónico fue separada de la sílica gel y carbón
activado por medio de una filtración al vacío a través una membrana con una
capacidad de retención media de 4 – 12 µm.
Finalmente se liofilizó la solución para obtener el producto en su forma sólida y
libre de impurezas.
El equipo utilizado para esta técnica fue un espectrómetro FTIR marca THERMO
SCIENTIFIC, modelo Nicolet iS10. Las muestras fueron analizadas empleando el accesorio
de Reflectancia Total Atenuada, en sus siglas en inglés (ATR) debido a la versatilidad del
equipo. Para el estudio de esta técnica se colocaron las muestras obtenidas así como la del
AH estándar de referencia, en contacto íntimo con un cristal denso y altamente refractivo
de ZnSe, el accesorio usado para la técnica de ATR fue el smart iTR. El espectro se
realizó mediante un barrido desde 4000 a 400 𝑐𝑚−1 con una apertura=80, velocidad
óptica=0.4747 y con una ganancia = 8 y resolución= 4. En la figura 12 se puede observar
el equipo utilizado para los análisis realizados de FTIR – ATR.
53
Figura 12. Espectrómetro FTIR con accesorio RTA.
Fuente: Propia.
Análisis Termogravimétrico
54
Figura 13. Equipo para análisis termogravimétrico.
Fuente: Propia.
55
CAPÍTULO IV
56
Tabla 5. Pesos de las cáscaras y membranas empleadas en el proceso
57
Análisis granulométrico de cáscaras secas
3 6.68 0
58
Continuación de tabla 7
30
0.597 0.4 ± 0.2
(n=3)
El equipo utilizado para realizar la reducción del tamaño de las cáscaras fue una
batidora industrial con la que contaba la empresa, dicho equipo no es adecuado para hacer
dicha operación por lo tanto no se logró el tamaño de partícula recomendado, sin embargo,
se alcanzó separar el 50 % de las membranas. Para futuras investigaciones en las que se
pueda profundizar en el proceso de separación por diferencia de densidades para residuos
de cáscara de huevo de gallina se plantea realizar diseño óptimo de esta etapa.
59
ETAPA II: EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO HIALURÓNICO A PARTIR DE LA
MEMBRANA SECA
El desarrollo de esta segunda etapa se apoyó en la investigación de
Khanmohammad, (2014), manteniendo las condiciones de tiempo, temperatura y pH que
garantizan una mayor extracción del ácido hialuónico.
Perfil de pH
60
8
6
pH
3
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
Tiempo (s)
La purificación fue realizada con sílica gel y carbón activado, ambos al 2% en peso
respecto al volumen de solución a tratar. La mezcla se dejó en reposo por 48 horas para que
así el carbón activado junto al sílica gel lograra adsorber las proteínas y demás impurezas
permitiendo la separación de la solución de hialuronato de sodio mediante un proceso de
filtración al vacío a temperatura ambiente.
61
Luego de obtener la solución de hialuronato de sodio purificada se llevó a un
liofilizador, el cual permite la extracción de agua a bajas temperaturas sin alterar las
propiedades del compuesto, se utilizó este equipo puesto que el ácido hialurónico se
degrada a altas temperaturas. Debido a las condiciones y capacidades del equipo el proceso
tardó 48 horas para 200 mL de solución, obteniéndose al final un sólido blanco que
posteriormente fue analizado y parcialmente caracterizado.
62
Isopropanol
63
NaCl al 3% e Etanol
64
liofilización
20 A CH3COONa puro
21 S NaCl puro
23 M Membrana pulverizada
65
100
AH comercial
80
2911
%Transmitancia
60
3282
40
1405
1605
20
1147
1078
1038
0
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
-1
Numero de onda (cm )
Figura 3. Espectro IR por ATR del patrón de referencia de hialuronato de sodio. Este
espectro fue obtenido en un equipo modelo Nicolet iS10.
Por su parte, Lago (2007) aporta tres bandas más características en el espectro de
HS, a 2907 𝑐𝑚−1 característica de estrechamientos C-H en el plano de grupos metilo y a
1084 𝑐𝑚−1 y 1147 𝑐𝑚−1 aparecen bandas que pueden estar asociadas a C-N alifático.
66
El acetato de sodio (CH3COONa) contiene un grupo hidroxilo (O-H), un grupo
carbonilo (C-O) y grupos metilos (C-H), por lo que estos grupos funcionales generan
señales a longitudes de ondas específicas en su espectro de IR, dichos grupos también se
encuentran presente en el HS por tanto existen bandas que coinciden para ambos
compuestos. Por otro lado, en el espectro correspondiente al NaCl (ver figura 17) presenta
una banda de gran amplitud cerca de los 3500 cm-1 que puede estar asociada a enlaces O-H
aportados por la humedad en la sal.
Ac. de sodio
HS comercial
% Transmitancia
NaCl
67
HS comercial
31AI
% Transmitancia
Acetato
de sodio
Las muestras tratadas con cloruro de sodio para la obtención de la sal del ácido
hialurónico presentaron espectros similares al mostrado en la figura 19. En este espectro se
puede observar la coincidencia de las bandas en la zona de huella dactilar, particularmente
se muestran las bandas asociadas a los enlaces N-H a los 1144 y 1111 𝑐𝑚−1, y a 1031
𝑐𝑚−1 aparece una banda de baja amplitud correspondiente a los enlaces C-O-C. La banda
que identifica al grupo O-H puede encontrarse desplazada por el exceso de NaCl presente
en la matriz de la muestra y por esto no coincide con el espectro del hialuronato de sodio
comercial.
68
HS comercial
31SE
% Transmitancia
NaCl
69
Comparación de los resultados respecto al solvente utilizado para realizar la
extracción
33AI
33AE
%Transmitacia
33AIE
HS comercial
Ac. de sodio
Figura 7. Espectros IR por ATR de la muestra 33AI, 33AE, 33AIE, hialuronato de sodio
comercial y acetato de sodio.
70
Comparación de los espectros IR del ácido hialurónico obtenido relacionando los
porcentajes de acetato de sodio y cloruro de sodio utilizado.
33AI
32AI
%Transmitacia
31AI
HS comercial
Ac. de sodio
Figura 8. Espectros IR por ATR de la muestra 33AI, 32AI, 31AI, hialuronato de sodio
comercial y acetato de sodio.
71
sodio. Para la muestra 32SE la banda asociada a la presencia del grupo –OH es más visible
y de igual manera los picos en la zona de huella dactilar corresponden a los del espectro del
patrón de referencia.
33SE
32SE
%Transmitacia
31SE
HS comercial
NaCl
Figura 9. Espectros IR por ATR de la muestra 33SE, 32SE, 31SE, hialuronato de sodio
comercial y cloruro de sodio.
72
encuentran relacionados y a partir de allí estimar su contenido en función de la pérdida de
masa relacionada con dicho evento.
En la figura 23, se muestran los termogramas obtenidos vía TGA para los distintos
patrones y materiales puros utilizados en el presente trabajo, los cuales permiten observar
las pérdidas de masa en función de la temperatura de la muestra debido a la degradación del
material, pérdidas de agua y liberación de gases productos de la reacción.
100
Porcentaje de perdida de masa (%)
90
80
70
60
50
40
HS comercial
Cloruro de Sodio
30 Ac. de Sodio
73
se asocia a perdida de agua atrapada debido a que este material, al igual que el HS, también
es higroscópico. La segunda pérdida de masa observada en el termograma para este
material ocurre en temperaturas comprendidas entre 500 y 550ºC, las cuales se
corresponden con la descomposición del AS, en donde se desprenden trazas de CO2 y
acetona como productos volátiles, dejando a su vez carbonato de sodio como residuo
sólido.
74
100
80
70
60
50
40
33AI
32AI
30 31AI
Figura 11. Pérdida de masa en función de la temperatura de las muestras tratadas con
acetato de sodio.
75
Con base a lo expresado en la tabla 9, se puede concluir que no existe una tendencia
clara entre el porcentaje de absorción de agua en los materiales considerados y el tiempo de
tratamiento con acetato de sodio. Por otro lado, estos resultados demuestran heterogeneidad
en las muestras estudiadas, lo cual puede ser consecuencia errores en las distintas variables
involucradas durante el proceso de mezclado, la forma en que se depositaron las distintas
sales en el envase posteriormente al proceso de liofilización, o incluso al tamaño, forma y
densidad de los cristales de ambas sales presentes en el material, las cuales podrían haber
actuado como barrera evitando la total absorción de humedad por parte de estos materiales,
es de destacar que este último fenómeno ya ha sido reportado para otras estructuras.
76
pudieron cristalizar en conjunto formando una fase cuya estabilidad térmica se
asemeja a la del AS.
Cabe resaltar que en un sistema de esta naturaleza pueden existir distintas
fases de cristales (Lowry, 1994), en donde pueden coexistir en conjunto tanto
cristales de AS puro, como del hibrido, lo cual explicaría el comportamiento por
etapas observado para los materiales 32AI y 33AI.
Por otro lado, en lo referente a los resultados vía DTA, presentados en la figura 25,
se tiene que existe una transición cercana a 250 °C, coincidiendo con la temperatura de
descomposición del HS, por lo que se puede suponer que dicho material puede sufrir una
transición, la cual es estabilizada por la presencia del AS.
77
8
6
Diferencia de temperatura (°C)
4
-2
-4 33AI
32AI
31AI
-6 HS comercial
Ac. de sodio
-8
Es importante resaltar que los ensayos y análisis realizados durante el desarrollo del
presente trabajo de grado no son suficientes para demostrar la validez de las suposiciones
descritas anteriormente con el objetivo de explicar los fenómenos que ocurren entre 400 y
550ºC de los materiales tratados con acetato de sodio. Esto deja abierta la posibilidad de
que físicamente pueda estar ocurriendo uno de estos a la vez, así como también cualquier
otro evento aun no considerado.
De igual manera se debe resaltar que debido a las posibles interacciones existentes
entre los distintos elementos en las muestras tratados con AS, así como la heterogeneidad
de las muestras limitan la estimación de la concentración del HS dentro de las distintas
composiciones obtenidas para la extracción de dicha sal.
Por otro lado, las curvas de TGA de las muestras tratadas con cloruro de sodio y
etanol se pueden visualizar en la figura 26, donde son comparadas con la sal de ácido
hialurónico y la sal utilizada en el proceso.
78
100
80
70
60
50
40 32SE
31SE
HS comercial
30 NaCl
Figura 13. Pérdida de masa en función de la temperatura de las muestras tratadas con
cloruro de sodio.
79
De la tabla 10, se puede estimar que la concentración de HS dentro de estos
materiales fue cercana al 2% considerando los errores asociados a la heterogeneidad de las
muestras estudiadas. Se resalta que estos resultados se presentan asumiendo que la pérdida
de masa obtenida a 400ºC se corresponden con el HS presente en los materiales estudiados.
80
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
81
Las muestras tratadas con cloruro de sodio al 2% presenta bandas más definidas que
las muestras que contienen 1 y 3% de NaCl.
Recomendaciones
Efectuar diferentes rutas de purificación del producto con el fin de realizar una
eficaz eliminación de restos de los reactivos utilizados durante el proceso que
afecten la estabilidad térmica de la sal de ácido hialurónico extraído.
82
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2855633 [consulta: 13/12/18]
88
APÉNDICE
89
Apéndice A: Cálculos típicos
1. Cálculo del volumen de ácido acético con una pureza de 100 % y una densidad de
1,05 g/mL para preparar 500 mL de una disolución de concentración 4 mol/L.
𝑉𝑐 = 115 𝑚𝐿
10−3 𝛼 2
𝐾𝑎 = = 1,8 × 10−5
1−𝑥
Sea la reacción de disociación del ácido acético:
Cinicial (mol/L) 4
𝑋2
1,8 × 10−5 =
4−𝑋
Resolviendo,
𝑋 = 0,008476
Determinando el pH
90
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[𝐻3 𝑂+ ]
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[0,008476]
𝑝𝐻 = 2,071
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[𝐻3 𝑂+ ] = 3,5
10𝑙𝑜𝑔𝑋 = 10−3,5
𝑋 = 0,00031
−5
(0,00031)2
1,8 × 10 =
𝑋 − 0,00031
Resolviendo,
𝑋 = 0,005648
𝑉𝑐 = 0,34 𝑚𝐿
91
6. Análisis granulométrico: cálculo del porcentaje de masa retenida.
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑧 (𝐾𝑔)
% 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑧 = ∗ 100
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (1 𝐾𝑔)
92
ANEXOS
93
Anexo A. Tabla de registro del peso de las partículas de cáscaras secas.
Tamiz Abertura Peso retenido (Kg) (1) Peso retenido (Kg) (2) Peso retenido (Kg) (3)
3 6.680 0.000 0.000 0.000
3 1/2 5.600 0.002 0.001 0.001
4 4.750 0.025 0.011 0.013
5 4.000 0.062 0.042 0.055
6 3.350 0.205 0.153 0.160
7 2.800 0.354 0.600 0.560
8 2.360 0.038 0.018 0.017
10 2.000 0.063 0.038 0.023
12 1.397 0.038 0.025 0.027
16 0.991 0.155 0.080 0.092
20 0.850 0.041 0.020 0.030
25 0.710 0.004 0.003 0.005
30 0.597 0.006 0.002 0.004
35 0.500 0.003 0.001 0.002
40 0.425 0.001 0.002 0.001
Resto 0.001 0.001 0.001
94
8
-2
-4 33AI
32AI
31AI
-6 AH comercial
Ac. de sodio
-8
4
Diferencia de temperatura (°C)
-2
33SE
32SE
-4 31SE
AH comercial
NaCl
-6
100 200 300 400 500 600
Temperatura de la muestra (°C)
95
Anexo C: Registro fotográfico del proceso de separación física de la membrana de la
cáscara de huevo de gallina.
Membranas separadas
Secado de membranas
Membranas
pulverizadas
96
Anexo D: Registro fotográfico del equipo empleado para la molienda de la membrana seca.
Molino de bolas
Anexo E: Registro fotográfico de lavado del sólido precipitado con soluciones de acetato
de sodio.
97
Anexo F: Equipo empleado para la centrifugación de la solución en frio.
Liofilizador con
muestra incorporada
98
Anexo H: Sistema de secado al vacío, tiene incorporado una bomba, una trampa de vacío y
un horno.
99