PRACTICA N° 11: AISLAMIENTO DEL ADN

INTRODUCCION

ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico. Constituye el material genético de los

organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que
los genes están formados. La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas.
En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para
poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana
nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que
puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.

En este informe de laboratorio mostramos, conceptos básicos del ADN: Definición,

composición, estructura, su extracción en células vegetales y/o animales y otros
conocimientos relacionados a esta práctica; también contiene el proceso de la práctica
realizada en el laboratorio, los resultados que obtuvimos en los dos tipos de células,
algunas conclusiones a las que llegamos y un cuestionario donde hemos resuelto algunas
de nuestras dudas.

MARCO TEORICO

El ADN (Ácido Desoxirribonucleico), conocido también como la molécula de la vida o la

molécula de la herencia, es la molécula que contiene toda la información (genes)
necesaria para que se desarrolle un ser vivo y para que funcione como tal. Pero el ADN
no es un mero almacén de información, sino que también, y gracias al proceso de
replicación, es capaz de transmitirla de una generación a la siguiente en el proceso de la
división celular.
Fue aislado por primera vez en el invierno de 1869 por Johann Friedrich Miescher, médico
suizo que estudiaba la composición química de los glóbulos blancos que obtenía del pus
de vendajes quirúrgicos.
En uno de sus experimentos, al utilizar los núcleos aislados de los leucocitos, aisló un
precipitado con propiedades que no correspondían a sustancias lipídicas y que no era
destruido por proteasas (enzimas que degradan las proteínas). Esto le indujo a pensar
que se trataba de otro tipo de sustancia, de composición desconocida hasta la fecha, y la
llamó nucleína. Posteriormente, demostró que la nucleína tenía carácter ácido y aisló la
misma sustancia en otras células y en esperma de salmón. Esta nucleína aislada
corresponde al
ADN y a las proteínas histónicas sobre las que se enrolla.
Fueron necesarios 70 años más para que se dilucidara la composición química exacta y la
estructura del ADN.

¿Dónde se encuentra el ADN en los seres vivos?

El ADN se encuentra en las células. En el caso de las células procariotas, como las
bacterias, está en el citoplasma en forma de molécula circular. En las células eucariotas
podemos diferenciar dos tipos de ADN según su localización: el ADN del núcleo formado
por varias moléculas lineales (dependiendo de la especie), y el ADN mitocondrial, formado
por algunos miles de copias de ADN circular.
Composición química

Desde el punto de vista químico, el ADN es un polinucleótido, es decir, un polímero de

unidades llamadas nucleótidos que se unen las unas a las otras mediante un enlace
químico fosfodiéster llamado enlace nucleotídico. Cada nucleótido está formado por una
molécula de ácido fosfórico, una base nitrogenada (A, T, C y G) y la pentosa
desoxirribosa. Las siguientes imágenes muestran los cuatro nucleótidos que componen el
ADN.
Los grupos fosfatos en disolución, que es como se encuentran en la célula, presentan
carga negativa, por lo que el ADN es una molécula con carga negativa.

Estructura

La estructura secundaria del ADN fue propuesta en 1952 por Watson y Crick basándose
en estudios previos realizados por otros científicos como Erwin Chargaff, Maurice Wilkins
y Rosalind Franklin. El modelo propuesto recibe el nombre de doble hélice de ADN. Lo
forman dos cadenas de polinucleótidos antiparalelas y complementarias. Las bases
nitrogenadas están situadas hacia el interior de la doble hélice, enfrentadas y unidas por
puentes de hidrógeno y con los grupos fosfatos hacia el exterior, lo que confiere a la
molécula carga negativa. La doble hélice tiene un diámetro de 2nm.

El ADN presenta dos niveles de plegamiento que dan lugar a:

Estructura primaria:

Los polinucleótidos se forman entre las bases nitrogenadas de adenina, guanina , citosina
y timina por enlaces covalentes de tipo fosfodiéster. Así se forma un esqueleto de
polidesoxiribosa-fosfato, de forma que queda un extremo con -OH 3´ libre y un extremo 5´
con un grupo fosfato libre.
Estructura secundaria

Tiene un empaquetamiento espacial pero no se altera.

Dentro de la estructura secundaria hay 3 modelos:

.El modelo de la estructura secundaria del ADN en forma de doble hélice dextrógira
(forma B). Las dos hebras son antiparalelas es decir si una presenta la dirección 5´->3´,
la otra posee la dirección 3´->5´.

El conjunto se pliega sobre sí mismo obligado por los puentes de hidrógeno entre
diferentes regiones de la molécula, hasta adoptar la conformación más estable, que es la
de doble hélice. Este enrollamiento entre las 2 hebras de la doble hélice es dextrógiro es
decir gira a derechas y de tipo plectonémico, como si estuvieran trenzadas.

Las secuencias de bases son complementarias, pues hay una correspondencia entre las
bases de ambas cadenas .La adenina sólo puede estar frente a la timina y la guanina
frente a la citosina. Así las bases púricas están enfrentadas a las bases pirimidínicas y la
unión se realiza por puentes de hidrógeno en los pares A=T y tres en los pares G-C

La correspondencia entre las bases es la causa de que las dos cadenas de la doble hélice
de ADN posean secuencias complementarias.

Además los pares de bases están horizontales y el eje los atraviesa por el centro.

Modelo hélice A: En este modelo los pares de bases nitrogenadas están inclinados hacia
el exterior pero la hélice al igual que la del ADN B es dextrógiro

Modelo hélice z: En este modelo las cadenas de ADN no se enrollan en forma de doble
hélice sino en forma de zig-zag.

Extracción del ADN

El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material inicial,

ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El método utilizado para romper la
célula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor daño posible al
ADN. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo
seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar la degradación enzimática de la pared
celular (si está presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares. Seguido al
rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una desproteinización, lo cual se
lleva a cabo con un solvente orgánico, seguido de una precipitación con isopropanol o
etanol y posterior solubilización con agua o tampón.
Existen diferentes técnicas para la extracción del ADN, aunque todas conservan el uso de
los mismos principios y fundamentos.

Para obtener ADN a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre periférica), células
en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa generalmente una
técnica de cuatro pasos secuenciales:

 El primer paso consiste en la lisis de las células y los núcleos.

  Luego, la separación del ADN a partir de sangre total involucra la lisis de
eritrocitos, seguida por una lisis de leucocitos y de sus núcleos.
 Las proteínas celulares son entonces removidas por un paso de precipitación
salina, y
 Finalmente el ADN genómico es concentrado por precipitación con isopropanol.

El ADN purificado por medio de este proceso, está listo para ser utilizado en diferentes
aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestión con endonucleasas
de restricción, Southern blot y Dot blot.
Existen otras técnicas que permiten la obtención de ADN genómico a partir de muestras
sólidas y líquidas, que permiten la separación simple, rápida, segura y eficiente del ADN.
Esta separación se basa en la utilización del isotiocianato de guanidina, como solución de
lisis celular, lo cual permite una precipitación selectiva del ADN con etanol y solubilización
en agua o en 8 mM de NaOH. Este procedimiento se puede realizar en 30 minutos,
recobrando un 70% a un 100% del ADN.

Extracción del ADN en las plantas

El ADN genómico de las plantas es más difícil de extraer a causa de la pared celular de la
planta, que se elimina por homogeneización o mediante la adición de celulasa para
degradar la celulosa que forma la pared celular. Además, los metabolitos presentes en la
célula vegetal pueden interferir con la extracción de ADN genómico por la contaminación
de la muestra de ADN durante el proceso de precipitación.

Extracción de ADN animal

Los leucocitos de sangre periféricos son una fuente principal de ADN genómico en
animales, pero la recogida de muestras es difícil ya que la sangre debe ser retirada del
animal. La sangre contiene una serie de compuestos como proteínas, lípidos, glóbulos
blancos, glóbulos rojos, plaquetas y plasma, que pueden contaminar la muestra de ADN.
El contaminante principal del ADN de animal extraído por muestras de sangre es hemo, el
componente no proteíco de la hemoglobina.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Silvia Quesada Mora. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para

bioquímica. Costa Rica. Editorial Universidad Nacional A Distancia.

 Ghislain, M., Zhang, D.P., Herrera, M.R. 1998. Protocolos de Laboratorio de

Biología Molecular: Tipificación genética. Perú. Centro Internacional de la Papa
(CIP).

 Dora Fonseca Mendoza, Heidi Mateus Arbeláez, Nora Contreras Bravo. 2010.
Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular: Su Aplicación en Genética Básica.
Colombia. Editorial Universidad Del Rosario.