Enzimas de restricción

Entre las enzimas que modifican los ácidos nucleicos se encuentran las nucleasas se denominan endonucleasas si
son capaces de cortar el enlace fosfodiéster en nucleótidos localizados dentro de la cadena del ácido nucleico, y
reciben el nombre de exonucleasas si cortan los enlaces fosfodiéster de los nucleótidos en los extremos de las
cadenas. Las enzimas de restricción que presentan actividad endonucleasa son de origen bacteriano y cortan los
enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia especifica denominada secuencia diana.
Esta herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las largas cadenas de ADN genómico para
manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños.
En 1960, Linny y Arber aislaron, en E. coli, enzimas que metilaban moléculas de ADN y que además cortaban
un enlace fosfodiéster del ADN no metilado.
Mas tarde, en 1970, se caracterizó la primera nucleasas de restricción por Daniel Nathans y Hamilton Smith,
aislada de Haemophilus influenzae, denominada Hind I.
Todas las especies de bacterias sintetizan uno o más tipos de endonucleasas capaces de hacer cortes en secuencias
específicas de nucleótidos de una doble cadena de ADN exógeno; generalmente, este ADN “extraño” es el
proveniente de los bacteriófagos, virus con capacidad de infectar a dichas bacterias.
Estas endonucleasas se denominan enzimas de restricción debido a que restringen la permanencia de un ADN
exógeno en la célula bacteriana que produce dicha enzima.

Origen
Forman parte de la maquinaria con la que cuenta la bacteria para defenderse de infecciones virales. El ADN de la
bacteria que produce la enzima de restricción no se ve afectado por su propia enzima, ya que las bacterias metilan
determinadas secuencias a su propio ADN para diferenciarlo del ADN viral por medio de una enzima
metiltransferasa en bases específicas, que generalmente son las reconocidas por sus propias enzimas de
restricción.

Nomenclatura
Se asigna según su origen bacteriano y se define basándose en las siguientes reglas:
1. Tres letras en cursiva que corresponden al nombre científico de la bacteria de donde fue atraída La primera
letra, en mayúscula, corresponde al género; las otras dos, a la especie.
2. La cepa o estirpe, si la hubiese
3. En números romanos, un numero para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie
4. Todas deberían indicar con una “R” por restricción o una “M” por metilasa, según la función de la enzima,
pero generalmente se omite. Por ejemplo:
Hind III:
H = genero Haemophilus. in = especie infl uenzae. d = cepa DSM 11121. III = tercera endonucleasa aislada en
este organismo.
Eco RI:
E = genero Escherichia. co = especie coli. R = cepa RV 13. I = primera endonucleasa aislada de esta cepa.

Clasificación por función

Tipo I Reconocen una secuencia especifica de nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en
cualquier secuencia del ADN y a una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de corte; además tienen la función
de metilar su propio genoma. Necesitan ATP para moverse a lo largo de la molécula de ADN desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio de corte.
Tipo II Reconocen secuencias específicas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en el mismo sitio de
reconocimiento. Requieren Mg2+ como cofactor y no requieren de ATP. Las secuencias de reconocimiento de
estas enzimas son palindromicas, es decir, son secuencias que se leen igual en las dos cadenas de ADN. Por
ejemplo: 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’
Tipo III Reconocen una secuencia específica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana
(aproximadamente de 25 a 27 pares de bases corriente abajo del sitio de
reconocimiento). Tienen actividad de metilasa y requieren de ATP para desplazarse a lo largo de la molécula de
ADN.

Aplicaciones
Las enzimas de restricción son una herramienta básica en clonación e ingeniería genética; se utilizan, entre otros
fines, para hacer mapas de restricción de plásmidos o genomas.
Un mapa de restricción se define como la serie de fragmentos que se generan por el corte con determinada(s)
enzima(s), específicos en tamaño (y secuencia) y que permiten emplearlos para la caracterizacion de dicho ADN.
Esta herramienta es sumamente importante para la clonación con vectores. También, en estudios de determinación
de polimorfismos, como la técnica de RFLP, según se presente o no el sitio de corte de una enzima de restricción,
se puede establecer la variante alélica, ya que el peso molecular del fragmento o fragmentos de ADN generado(s)
permitirá la caracterizacion de la secuencia. Asimismo, la construcción de moléculas de ADN recombinante
implica el obvio empleo de las enzimas de restricción para definir y delimitar las secuencias que se insertaran en
el constructo recombinante. De la misma manera, el corte de ADN genómico que suele ser, según el organismo,
del orden de millones de pb, es más manipulable cuando es digerido por estas enzimas en fragmentos más
pequeños. Esto permite un manejo adecuados sin el riesgo de degradación y manipulación para la construcción
de bibliotecas genómicas.
Tipos de cortes producidos
Los cortes cohesivos o pegajosos: la enzima corta en cada cadena de ADN entre nucleótidos localizados en
posiciones diferentes respecto al eje de simetría de la secuencia de diana.
Estos cortes generan extremos monocatenarios en un segmento de 3 a 5 bases de longitud, por lo que en esta
fracción la falta de cadena complementaria facilita su interacción con otro fragmento en mono cadena con
secuencia complementaria. Propician la unión especifica entre segmentos diferentes de ADN cortados por la
misma enzima, para la producción de ADN recombinante.
Los extremos romos se generan porque la enzima corta en ambas cadenas de ADN sobre un mismo eje, por lo

que dichos extremos son de doble cadena, y la unión entre

fragmentos de ADN con extremos romos es más inespecífica, ya que no depende de la complementariedad de
regiones mono cadena.

Isoesquizómeros
ER obtenidas de diferente especie bacteriana pero que reconocen la misma
secuencia diana de ADN y cortan entre diferentes
nucleótidos de dicha secuencia.

Familias
Está formada por aquellas que producen extremos cohesivos similares. Un
ejemplo de familia es: BamHI y BclII, que reconocen las secuencias diana
5’GGATCC3’ y 5’AGATCT3’, respectivamente, pero que generan extremos
cohesivos idénticos: 5’GATC 3’.
BamH I: 5’---G GATCC---3` Bgl II: 5’---A GATCT---3’
3’---CCTAG G---5’ 3’---TCTAG C---5’
 Esta característica favorece que dos fragmentos cortados con
estas enzimas puedan recombinarse de manera específica
gracias a la complementariedad.
Factores que afectan la actividad
Entre los factores que más afectan la actividad de las enzimas
de restricción se encuentran:
• La pureza biológica del ADN. (Contaminación con otros
ADN) • Detergentes y estabilizadores (docedil sulfato de
sodio –SDS–, acido etilendiaminotetraacético –EDTA–), que
inhiben la actividad enzimática. • Modificaciones en pH y
temperatura de incubación que inhiben enormemente la actividad de las enzimas. • El grado de metilación del
ADN, ya que algunas enzimas son inhibidas por metilación en ciertas secuencias.
Condiciones de almacenamiento y conservación
Deben conservarse a -20ºC diluidas en un volumen determinado de glicerol evitando congelamiento. Evitar
variación de temperaturas.
Selección de la ER adecuada
Cuando se pretende realizar el corte en un plásmido conocido se revisa el mapa de restricción, el cual ofrece un
listado en orden alfabético de las enzimas que son capaces de cortar dicho ADN, el sitio de corte, el tipo de corte,
así como el número y tamaño de cada fragmento generado. En el caso del ADN genómico es necesario conocer
la secuencia completa con la que se va a trabajar para conocer los sitios de corte y predecir el número y tamaño
de los fragmentos. Se realiza ingresando dicha secuencia a una base de datos especializada para estudios de
restricción y, de esta manera, se obtiene un listado de las posibles enzimas que reconocen la secuencia diana.
Eficiencia en el uso
El proveedor incluye las características y descripción de las condiciones óptimas de actividad de las enzimas de
restricción disponibles comercialmente ajustadas para el volumen de reacción a realizar, se debe tener en cuenta
la temperatura optima de acción, presentación comercial de la enzima (unidades de enzima por microlitro), tiempo
de incubación, así como los posibles requerimientos de aditivos, como albumina, ATP, etcétera.
Cantidad adecuada para un ensayo
La cantidad de enzima utilizada en una reacción dependerá de la concentración de ADN en la muestra a digerir.
Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima requerida para producir la digestión completa de un
microgramo de ADN sustrato en 60 minutos a la temperatura optima de acción de la enzima.
Preguntas
1. ¿Condiciones de almacenamiento y conservación de las enzimas de restricción?
2. ¿Cómo se determina la enzima de restricción para realizar un corte en una secuencia específica de ADN?
3. ¿Cómo se logra la mayor eficiencia en la actividad de las enzimas de restricción?
4. ¿Cómo se determina la cantidad de enzima de restricción para un ensayo?
5. ¿Aumenta la eficiencia de la actividad de restricción si se rebasa el tiempo recomendado de incubación?
6. En el siguiente esquema, determine los pares de bases de los fragmentos resultantes después del corte y

complete el mapa de restricción del plásmido.

7. El corte con las siguientes enzimas de restricción
genera fragmentos de ADN los cuales serán analizados
mediante electroforesis en gel. Indique de manera
aproximada de acuerdo a su peso molecular las bandas
que estos segmentos de ADN generarían