Mesa #4 Laboratorio de Tópicos de Bacteriología Cínica

Conservación de cepas: Glicerol

Objetivo
 Disminuir al mínimo la actividad del microorganismo a largo plazo mediante la
criopreservación.

Introducción
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Método ideal de conservación

 Cultivos puros, sin contaminación.
 Sobrevida del 70-80% del inóculo.
 Genéticamente estables.

Fundamento
 Congelamiento y descongelamiento rápido.
 Glicerol. Agente crioprotector no iónico (neutraliza el efecto de las sales).
 La congelación disminuye la actividad metabólica drásticamente de una célula por la
disminución de agua disponible hasta el caso de prácticamente anularlo con nitrógeno
líquido (-196°C).
 Compuesto químico no tóxico, atraviesa con facilidad la membrana celular y se acumula
intracelularmente. Reduce al mínimo los efectos perjudiciales del aumento de la
concentración de solutos y la formación de cristales de hielo  lisis celular.
 Temperatura:
En aquellos congeladores que sólo alcanzan temperaturas entre –20° C y –40° C, no son
aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentración de solutos que existen en
la suspensión celular, su punto de congelación baja. El daño que se produce en las células es
debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se
añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que
se produce y se evita el aumento de la concentración iónica.

La congelación debe ser lenta a la par con una descongelación rápida. Condiciones:
 Un °C por minuto hasta -20°C y luego un rápido descenso en la temperatura.
 Temperatura de conservación más baja recomendada es -70°C (esto evita la
recristalización intracelular).

Microorganismos
 Hongos y bacterias.
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Procedimiento
Los microorganismos pueden ser preservados de -5 a -20° C por 1-2 años por congelación en
cultivo en caldo o en suspensiones celulares en viales. Para los procesos de profunda
congelación requieren crioprotectores como el glicerol o DMSO, cuando son almacenadas a -70°C
o en nitrógeno líquido de -156 a -196°C. Con cultivos en caldo se toman de la mitad o pasada la
fase logarítmica del crecimiento y mezclado con un volumen igual de 10 a 20% (v/v) de glicerol o
de 5 a 10% (v/v) de DMSO. Alternativamente, se puede preparar una suspensión de glicerol al
10% v/v de crecimiento del microorganismo desde las cajas petri. En este caso la suspensión es
pipeteada a viales criogénicos o ampolletas, se congela y se almacenan.
 Solución de glicerol (alcohol) 10-25 %.
 Temperatura: -70° C
Preparación pre-congelado:
Periodo de equilibrio.
 Se inocula en el medio líquido, se incuba hasta la fase estacionaria, centrifugar, se retira el
pellet y se resuspende en 2‐5 mL caldo, añadir el crioprotector (glicerol).
 Tiempo: 30 minutos a temperatura ambiente. El agente crioprotector puede ser
tóxico para las células si el tiempo de equilibrio es demasiado largo.
 Fraccionamiento en viales.

Reconstitución (deshielo).
 Descongelación rápida: baño María (37° C)
 Crioviales:
 Criotolerancia, tapa a rosca y o‐ring. Máxima capacidad de almacenamiento y
facilidad de manejo.
 Colocar 0,5-1,0 mL de la suspensión de celular, no llenar.
Recuperación post-congelado.
 Una vez recuperadas, nunca utilizar los microorganismos inmediatamente en pruebas
fisiológicas, realizar de 1-2 pasajes previos (estrés celular).
 Transferir a medios adecuados (caldos o medios agarizados).
 Tiempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento.

Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las cepas

 Temperatura de almacenamiento:
 Nitrógeno líquido: -196° C (forma gaseosa -140° C).
Se utiliza para la conservación de bacterias, virus y líneas celulares. Existen varios problemas
prácticos: el nitrógeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se
deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estén bien cerrados para
evitar la entrada del nitrógeno.
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 Ultrafreezer: hasta -96° C.
 Congelador: -20 a -40° C.
 Alta densidad celular:
 Usar entre 107-104 células/mL: lisis de parte del inóculo.
 Edad de las células:
 Velocidad de crecimiento promedio (18 horas, 1 semana, 20 días).
 Lo ideal es la preservación en la fase log tardía o al inicio de su fase estacionaria
(mayor resistencia a la congelación y descongelación).
 Si se trata de cepas que cuentan con un estado de esporulación, se debe realizar en
ese momento.
 Nucleación cristalina:
 Velocidad de congelación: 1-10° C/minuto  minimiza el efecto de la concentración
de los solutos durante la nucleación.
 La congelación paulatina evita la lisis celular.

Ventajas
 Viabilidad 7-10 años. Glicerol 20% garantiza viabilidad por 3 años.
 No se han reportado cambios a nivel genético.
 Apto para gran variedad de microorganismos.
 Sencillo, pre-tratamiento mínimo.

Desventajas
 Requiere equipo especial, aumenta el costo.
 Suministro constante de energía.
 Especio físico refrigerado.
 No apto para el envío de cepas
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Bibliografía
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Pseudomonas aeruginosa. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 45, No. 1, pp. 51-56, 2014.
2. Arencibia DF, Rosario LA, Gámez R. Métodos Generales de Conservación de Microorganismos.research Gate
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3. Morales GY, Duque E, Rodríguez AO, De la Torre J, Martínez CR, Pérez TR, Muñoz RJ. Bacterias preservadas, una
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