EFECTIVIDAD ANTIBIOTICA DE PRODUCTOS NATURISTAS CONTRA

HELICOBACTER PYLORI EN CEPAS CLINICAS

Navarro-Montes de Oca M.L.*; Poblano-Bureos M.A**; Paredes- Hernández A.**;
Rodríguez-García I.**
*Profesora horas clase e investigadora en el Centro de Bachillerato Tecnológico Dr. Alfonso
León de Garay, Tequixquiac. Fresnos Esq. Sauces s/n, Bo. San Mateo C.P. 55650,
Tequixquiac, Estado de México.
** Alumnos de tercer año de bachillerato en la carrera de Técnico Laboratorista Químico en el
CBT. Dr. Alfonso León de Garay, Tequixquiac. Fresnos Esq. Sauces s/n, Bo. San Mateo C.P.
55650, Tequixquiac, Estado de México.
Septiembre del 2018
Resumen
La gastritis es la inflamación de la mucosa gástrica. Es producida por diferentes factores
endógenos y exógenos, lo cual produce síntomas dispépticos, aunque en la mayoría de los
casos es consecuencia de la infección por la bacteria, Helicobacter pylori. Para tratar la
gastritis, los médicos han administrado antiácidos e inhibidores de la bomba de protones para
paliar los síntomas y en raras ocasiones antibióticos como la claritromicina, la amoxicilina y el
metronidazol, a los que las bacterias han desarrollado resistencia paulatinamente.
Helicobacter sp es un bacilo Gram negativo de forma helicoidal, catalasa, oxidasa y ureasa
positivo, microaerofílico, flagelado y resistente al ácido estomacal. El presente proyecto se
enfocó a comprobar la efectividad de las tinturas y los extractos de plantas como stevia,
cedrón, moringa, col blanca y brócoli así como la mezcla de estos extractos y tinturas y una
mezcla de productos de abeja y avispa (Miel, propóleo y jalea real), que ya fueron probados
en el proyecto del año anterior con la cepa ATCC 43504 de Helicobacter pylori, y que en esta
ocasión se emplearon contra cepas clínicas de Helicobacter pylori, aisladas a partir de cinco
muestras de heces en agar Campylobacter (BD BBL). Para ello, se realizaron dos pruebas
estandarizadas para antibiograma: Kirby Baüer (KB) y Microdilución en placa (MDP). Los
resultados indican que productos como la tintura o el extracto de stevia y los extractos de
cedrón, col blanca y brócoli, inhiben el desarrollo de esta bacteria cuando se emplean a
concentraciones entre el 100 y el 50%, lográndose un porcentaje de pozos inhibidos en la
prueba de MDP de entre el 4 y el18%. Asimismo, no se observan efectos inhibitorios
sinérgicos cuando los extractos o tinturas de las diferentes plantas son mezcladas.
Palabras clave
Helicobacter pylori – Gastritis - Stevia – Cedrón - Moringa, Col blanca - Brócoli - Extracto –
Tintura – Productos apícolas – Productos naturistas – Alternativas antibióticas
. aguda es provocada por el alcohol y
1. Introducción determinados medicamentos y suele durar
poco tiempo, mientras que la crónica suele
La gastritis es la inflamación del no presentar síntomas desde el principio,
revestimiento del estómago, las tres desarrollándose silenciosamente. Sus
principales causas de esta enfermedad síntomas son inflamación, dolor en el
son: La infección por la bacteria estómago, mal aliento, flatulencias y una
Helicobacter pylori, el uso de sensación de empacho. El tipo A es el
antinflamatorios y la autoinmunidad. Las menos común y se trata de un defecto
cifras presentadas en diversas inmunológico de la persona, que tiene
investigaciones arrojan que en EE. UU., y como consecuencia que los propios
otros países de occidente el 25 % de la anticuerpos ataquen a la mucosa o al
población adulta tiene dispepsia (Mena revestimiento estomacal; el tratamiento se
Rivera, 2013). basa en fármacos que moderen los efectos
Los diferentes tipos de gastritis que existen de los jugos gástricos. El tipo B es el más
son la aguda y la crónica, pero esta última común y es causado por la bacteria
se conforma de tres tipos (A, B, C). La Helicobacter pylori, aunque la mayoría de

1
las veces esta bacteria no causa daños,
puede ser que debilite las defensas del
estómago e infecte la mucosa gástrica,
trayendo consigo consecuencias como
ulceras gástricas y cáncer de estómago si
no se le trata a tiempo; el tratamiento se
basa en antibióticos que se administran
durante 1 a 2 semanas. Por último, el tipo
C suele ser causado por una inflamación
química provocada por ingerir analgésicos
(Digital Pathology Association, 2016).
Un error muy frecuente es llamar gastritis a
cualquier tipo de dispepsia, sin embargo,
tener cualquier dolor en el estómago o
ardor no es tener gastritis. En la mayoría de
las personas, la gastritis no presenta
síntomas y muchos de los pacientes solo
sienten incomodidad estomacal en una de
las comidas. Los pacientes que tiene
gastritis pueden tener una sensación de
ardor en la boca del estómago, que en
ocasiones mejora con la comida. Otros
síntomas también pueden ser acidez
estomacal y náuseas. Los síntomas
pueden empeorar en situaciones de estrés,
después de consumir bebidas alcohólicas
o gaseosas, café o por consumir alimentos
muy condimentados. Por todo lo anterior, el
diagnostico no puede ser hecho solamente
por presentar los síntomas, sino que es
necesario realizar estudios que puedan
hablar de la severidad de la gastritis
(Pinheiro, 2018).
Los tratamientos convencionales que se
practican para controlar la gastritis y la
finalidad que persiguen se describen a
continuación (@singastritisblog, 2015):
▪ Los medicamentos que ayudan a
proteger el revestimiento del estómago
disminuyen los síntomas de la gastritis,
como la sensación de indigestión,
dolor, ardor o acidez, creando una
barrera protectora o disminuyendo la
producción de ácido gástrico. Ejemplos
de ellos son los antiácidos como el
Hidróxido de aluminio, el Carbonato de
calcio o el Hidróxido de magnesio, que
aumentan el pH gástrico, aliviando las
lesiones sobre la mucosa y aumenten (Montes Valles, 2016).
disminuyendo la inflamación del
estómago.
▪ Los protectores gástricos tales como
Omeprazol, Médium, Pariet o Tecta,
crean una barrera protectora en el
estómago que disminuye la irritación de
la membrana del estómago,
especialmente en el caso de úlceras.
▪ Aquellos medicamentos que
disminuyen la cantidad de ácido como
la Ranitidina o la Cimetidina bloquean
el funcionamiento de las células del
estómago que producen ácido,
reduciendo su cantidad en el
estómago.
▪ Los bloqueadores o antagonistas de H2
se comenzaron a emplear después de
los antiácidos. Dado que no actúan
sobre la acidez presente, como lo hace
un antiácido, su efecto es más lento (de
30 a 60 minutos), pero pueden durar
hasta más de un día. Las sustancias
que son clasificadas dentro de este tipo
son: Ranitidina (Zantac), Famotidina
(Pepcid), Cimetidina (Tagamet) y
Nizatidina (Axid).
▪ Los antibióticos como la Claritromicina,
la Amoxicilina o el Metronidazol, son
usados cuando la gastritis es
provocada por la infección por
Helicobacter pylori, utilizando una
combinación de dos de éstos y
administrándose durante 1 mes.
Helicobacter pylori (H. pylori), es un bacilo
Gram negativo, curvo, móvil, flagelado y
microaerófilo, que se desarrolla en la
mucosa gástrica humana originando
diferentes patologías. Es el principal factor
causante de gastritis crónica, úlceras
gástricas y/o duodenales, linfomas tipo
MALT (Tejido Linfoide Asociado a
Mucosas) y adenocarcinomas gástricos.
Se desarrolla principalmente en adultos,
produciendo casos aislados en edad
pediátrica (países subdesarrollados). No
obstante, las tasas de afectados en países
occidentales han aumentado mucho
respecto a décadas anteriores. En los
últimos años, el desarrollo y la creciente
expansión de H. pylori han llevado a los
servicios de salud pública a desarrollar
estrategias de prevención y tratamientos
que eviten que las tasas de infección
El patólogo Robin Warren a principios de
junio de 1979, observó por primera vez a
Helicobacter pylori en una biopsia gástrica
proveniente de un paciente con gastritis
2
crónica activa. Sus observaciones en
estudios histopatológicas, continuaron por
un par de años, asociando la presencia del
microorganismo con esta patología.
Durante este tiempo, hubo muchos intentos
de aislar a la bacteria, pero sin ningún éxito
( Loughin, y otros, 2017).
Se reproduce en la mucosa gástrica del ser
humano a una temperatura óptima de 37 C,
aunque puede reproducirse desde los 35 a
los 39 C en microaerofilia. El tiempo de
incubación suele ser de por lo menos seis
días, identificándose colonias pequeñas,
transparentes y muy parecidas a
Campylobacter (En medios húmedos:
Colonias no hemolíticas, planas, bordes
irregulares, color blanco grisáceo y
superficie brillante; Medios secos: Colonias
no hemolíticas, convexas, bordes lisos
blanco grisáceas y superficie brillante). Las
colonias suelen seguir el trayecto del
estriado, llegando a confluír, mientras que
las colonias separadas se observan como
gotas de agua derramadas sobre la
superficie del agar. La identificación se
basa en las características coloniales y en
la tinción de Gram, comprobando además
una reacción de catalasa, citocromoxidasa
y motilidad positivas y demostrando la
acción de la ureasa (Morales, Castillo,
López, & Cravioto, s.f. Citado por Torres V,
García M, & Zárate O, 2008).
Debido a que el cultivo es microaerofilico,
la incubación se realiza en velobiosis, lo
cual promueve una atmósfera de entre 2 y
8% de oxígeno y de 7 a 10% de CO 2.
También se requiere de hidrógeno y
metanogénesis como fuente de energía,
así como algunos nutrientes como la
peptona, triptona, extractos de levadura,
glucosa, sales, cloruro de sodio y biosulfato
de sodio (Torres V, García M, & Zárate O,
2008).
Esta bacteria se puede cultivar en diversos
medios los cuales deben contener suero o
sangre entre el 5% y 10%, ya que estos
actúan como fuentes adicionales de
nutrientes y para protegerla de los efectos
secundarios de los ácidos grasos de
cadena larga (Alonso, 2013).
Para su crecimiento se utilizan medios
enriquecidos como Campy Bap, medio de
Brucella o de Skirrow, suplementados con
sangre de caballo o suero fetal bovino entre
otros. Cuando se cultiva en un medio solido
tiene forma de varilla y las formas espirales
son infrecuentes o ausentes, después de
un cultivo prolongado en un medio solido o
liquido las formas cocoides abundan
(Alonso, 2013).
Se han practicado diferentes métodos
alternativos naturistas para tratar la ulcera
gastroduodenal o péptica, entre las cuales
se encuentran los jugos de col blanca, el
orozuz, las semillas de papaya y el plátano
tabasco verde. Para tratar la gastritis, se
han empleado glutamina y flavonoides
(Sierra, 2013).
Esta bacteria puede colonizar únicamente
el epitelio gástrico y no se encuentra en el
duodeno normal. Es un microorganismo
excelentemente adaptado a su nicho
ecológico, descansando en la superficie de
las células epiteliales gástricas bajo la capa
de moco adherente. La forma espiral y la
motilidad, conferida por sus múltiples
flagelos, le ayudan a distribuirse a través
de la capa de moco para alcanzar la
mucosa gástrica. La metaplasia gástrica se
presenta en más del 90% de los pacientes
con úlcera duodenal y permite al H. pylori
colonizar el bulbo duodenal (Morales E,
Castillo R, López V, & Cravioto, 2014).
La infección por H. pylori produce
anomalías importantes en la secreción de
hormonas de polipéptidos
gastrointestinales por el antro gástrico.
Estas anomalías tienen consecuencias
importantes en la fisiopatología gástrica y
en las causas de la ulceración (Morales E,
Castillo R, López V, & Cravioto, 2014).
La prevalencia mundial se ha estimado
alrededor del 50% siendo esta cifra mucho
mayor en países en vías de desarrollo
superando el 80% de la población. En
nuestro país, estudios realizados al
respecto dan una cifra similar a la literatura
internacional. La prevalencia en países en
vías de desarrollo oscila entre el 50% y
70%. Es muy fácil de transmitir, aunque en
ocasiones no genera ningún tipo de
síntomas ( Pareja Cruz, Navarrete Mejía, &
Parodi García, 2017).
Si se está sufriendo de algún problema
como úlceras estomacales o gastritis a
causa de la bacteria Helicobacter pylori, se
3
suele recomendar la utilización de
remedios naturales como los siguientes:
Repollo o col blanca (Brassica oleracea
var. capitata): El jugo de col ayuda a curar
las úlceras estomacales. Además, es muy
útil para fortalecer el sistema digestivo y el
tracto intestinal. La col clasifica como un
aliado del organismo contra el cáncer. Es
también una fuente excelente de vitamina
C, fibra, potasio, entre otros (Lelyen, 2015).
Cedrón (Aloysia citrodora): Los estudios
farmacológicos se concentran en su
mayoría en el aceite esencial, habiéndose
reportado actividad antiespasmódica,
eupéptica, carminativa, antimicrobiana,
analgésica local y ligeramente sedante.
Tiene propiedades antisépticas, al mismo
tiempo que disminuye la inflamación por
sus propiedades antiinflamatorias. La
planta del cedrón está constituida por una
alta cantidad de flavonoides, los cuales
resultan ser antimicrobianos (Olguin,
2014).
Stevia (Stevia rebaudiana): Tiene
propiedades antibióticas. Las hojas de esta
planta brindan protección antibacterial
contra bacterias de la mucosa. Previene e
inhibe la reproducción de bacterias y
organismos infecciosos (Juste, 2017).
Moringa (Moringa oleífera): Es un árbol de
tamaño pequeño, el cual contiene β-
caroteno, proteína, vitamina C, calcio,
potasio y antioxidantes como flavonoides,
compuestos fenólicos, ácido ascórbico y
carotenoides. Las hojas de este árbol se
usan pala la desnutrición de los niños y
madres en lactancia haciendo una mezcla
en polvo. El extracto de las hojas en crudo
ayuda al control del colesterol. Las mezclas
de las hojas con otros compuestos pueden
ser antiulcerogénicos, previniendo la
formación de ulceras. La raíz de este árbol
es un excelente antimicrobiano y fungicida
teniendo de principal activo al
pterygospermin. La corteza posee
actividad fungicida y antibacteriano contra
Staphylococcus aureus como igual otras
partes del árbol (Benitez, Fortunato, Itati
Gómez, & Radice, 2016).
Brócoli (Brassica oleracea var. itálica):
Contiene algunas grasas e hidratos de
carbono, pero sobre todo destaca por la
riqueza de sus fotoquímicos, que lo
convierten en un alimento medicinal muy
importante. Según numerosos estudios
realizados por el Instituto Nacional del
Cáncer en Estados Unidos, el brócoli es la
hortaliza que posee mayores propiedades
para defender del cáncer Tiene
importantes propiedades
anticancerígenas, que se potencian con su
contenido de vitamina A, C y E,
aminoácidos, zinc y potasio (Botanical,
2014).
Miel de abeja: Es un remedio muy efectivo
para tratar las úlceras gástricas. La
densidad de la miel protege contra
bacterias y suciedad que entran en una
herida. La miel de abeja tiene propiedades
antibacterianas, las cuales se deben a
diversos factores como la alta
concentración de azucares, baja humedad,
acidez y presencia de peróxido de
hidrogeno. Contiene trece bacterias del
ácido láctico (BAL), que también funcionan
como antimicrobianos (Schencke,
Vásquez, Sandoval, & del Sol, 2016).
Propóleo: Es una sustancia fabricada por
las abejas a partir de las yemas y resinas
de los árboles, que mezclan en su boca con
cera y secreciones salivares obteniendo
así esta sustancia curativa. Las abejas lo
utilizan para sellar las colmenas y
defenderse frente al ataque de virus y
bacterias. El propóleo tiene una
composición química muy compleja que
incluye principios activos, entre los que
destacan los bioflavonoides, responsables
de su acción antibiótica. Antes de
descubrirse la penicilina, los pueblos
antiguos utilizaban el propóleo como
poderoso antibiótico para curar heridas y
evitar que se infectasen bajo la acción de
microorganismos (Vida Naturalia, 2015).
Jalea Real: Es un líquido segregado por las
abejas obreras, para alimentar a las larvas
durante sus tres primeros días de vida. Las
abejas reinas, gracias a ella, tienen mayor
tamaño, mayor longevidad (pueden vivir de
3 a 4 años, mientras que las obreras viven
de 40 a 45 días). Sobre el organismo
humano, actúa como estimulante y ayuda
a mejorar el metabolismo. Contiene
gammaglobulina, componente que es
capaz de frenar la senilidad y aumentar la
resistencia. Es el alimento más
concentrado de la naturaleza, por su
4
equilibrado conjunto de vitaminas,
minerales y elementos vitales
imponderables; juega un rol decisivo en los
procesos de restitución celular. No necesita
de la digestión, es totalmente asimilable y
pasa directamente a la sangre para
enriquecer los tejidos de reposición y de
crecimiento (Carrera Castillo , 2016).
El objetivo del presente proyecto fue lograr
inhibir el crecimiento in vitro de
Helicobacter pylori en cepas clínicas,
mediante el empleo de extractos (E) y
tinturas (T) de stevia (ES y TS), cedrón (EC
y TS), col blanca (ECB y TCB), moringa
(EM y TM) y brocoli (EB y TB), así como de
una mezcla de productos de abeja y avispa
(Miel, propóleo y jalea real, MPABYAV),
mismos que mostraron una eficacia
importante en el proyecto del año pasado
contra Helicobacter pylori ATCC 43504.
Para ello se emplearon dos pruebas
básicas estandarizadas para antibiograma:
Kirby Baüer y microdilución en placa.
Asimismo, se pretendió probar si al
elaborar una mezcla con los extractos y
tinturas de plantas, se lograba un efecto
sinérgico. Adicionalmente, se buscó
comparar la efectividad antibiótica de los
extractos, tinturas y mezclas, contra la
cepa de referencia y las cepas clínicas.
2. Método experimental
2.1. Elaboración del extracto en
alcohol (Riera Millan, 2002):
Paso 1: Colocar 100 gramos de
planta fresca o deshidratada en un
frasco ámbar.
Paso 2: Agregar un litro de tequila.
Paso 3: Remover, tapar y dejar
reposar durante dos días
Paso 4: Quitar la tapa y dejar
reposar durante toda una noche.
Paso 5: Filtrar con una manta de
cielo estéril exprimiendo la planta
sobre la tela.
Paso 6: Calentar a fuego lento el
extracto hasta que se reduzca a la
mitad.
Paso 7: Almacenar en frascos color
ámbar a temperatura ambiente.
2.2. Elaboración de la tintura en alcohol
(Riera Millan, 2002):
Paso 1: Medir con una probeta
graduada un litro de tequila y 120
gramos de la planta fresca o
deshidratada.
Paso 2: Colocar el tequila y la planta
en un frasco ámbar, mezclar y dejar
reposar durante una semana.
Paso 3: Filtrar con una manta de
cielo estéril.
Paso 4: Tirar los restos de la planta
y guardar el filtrado en frascos de
color ámbar con tapa a temperatura
ambiente.
2.3. Elaboración de la mezcla de
productos de abeja y avispa.
Los ingredientes adicionados a la mezcla
fueron seleccionados con base en los
mejores resultados antimicrobianos que se
han observado en trabajos de investigación
previos, realizados en este laboratorio,
contra bacterias Gram negativas:
• Miel de abeja 1. Flor de naranjo 20 %
• Miel de abeja 2. Teoloyucan 20 %
• Miel de abeja 3. Flores blancas 20 %
• Propóleo 1. Abelha 10 %
• Propóleo 2. Brilhar 10 %
• Jalea real 1. 10 %
• Jalea real 2 10 %
• Miel de avispa del mercado Medellín
20 %.
2.4. Microorganismos y
bioseguridad (Organización
Mundial de la Salud, 2005):
Se empleó bata blanca con largo
hasta la rodilla, perfectamente
abotonada y manga larga. También
cubre bocas y cofia, cuya finalidad
principal fue impedir la
contaminación de los ensayos.
Asimismo, se emplearon guantes
para evitar el contacto de los
microorganismos con posibles
lesiones en la piel.
Las cepas clínicas empleadas se
cultivaron in vitro. Los estudiantes
las emplearon elaborando
estándares bacterianos en cada
ensayo igualado al tubo 0.5 del
Nefelómetro de Mac Farland y
5
preparando con este estándar una
solución stock al 10%.
Estos microorganismos pertenecen
al nivel de riesgo 2, según el manual
de Bioseguridad de la OMS (2005),
ya que son agentes patógenos que
pueden provocar enfermedades
humanas o animales sin embargo
tienen pocas probabilidades de
entrañar un riesgo grave para el
personal de laboratorio, la
población, el ganado o el medio
ambiente. Aunque los primeros no
entrañan riesgos para la salud, la
exposición a las segundas, en el
laboratorio, puede provocar una
infección grave, para ello se
pondrán en práctica medidas
preventivas durante el manejo de
dichas cepas y el riesgo de
propagación.
El estudio se llevó a cabo en el
Laboratorio de Investigación del
Centro de Bachillerato Tecnológico
Dr. Alfonso León de Garay,
Tequixquiac. Dicho laboratorio
cuenta con un área de 3 m2,
especialmente acondicionada para
trabajar con microorganismos,
incluyendo un aislamiento elaborado
con plástico cristal. Este espacio
puede ser considerado como nivel
de Bioseguridad 2, sin embargo,
siendo estrictos y apegándose a los
lineamientos de la tercera edición
del Manual de Bioseguridad de la
OMS (2005), dicho laboratorio no
cumple con todas las
especificaciones que se manejan en
el Manual, por ejemplo: campana de
flujo laminar, sistemas de protección
contra incendios y emergencias
eléctricas, así como duchas para
casos de urgencia y medios para el
lavado de los ojos.
Se cuenta con puertas que
permanecen cerradas y que no
permiten el paso de otras personas
cuando se están realizando
procedimientos microbiológicos,
existe señalización de riesgo
biológico en las mismas, se tiene a
la disposición un extintor, para ser
usado en caso de incendio.
Los residuos potencialmente
contaminados son separados del
circuito general de residuos y son
sometidos a esterilización con
autoclave.
Después de haber utilizado el
equipo de protección personal como
son los guantes y los cubre bocas,
estos se esterilizan (121º 15lb 30”) y
se procede a desechar en la basura.
Los materiales en donde se
manipularon bacterias se
descontaminan en autoclave (121º
15lb 30”) para poder lavarlos y
esterilizarlos nuevamente. El
material desechable, ya esterilizado
se elimina en la basura.
Las placas de poliestireno se
descontaminan con solución de
cloro comercial, dejando que se
remojen durante 24 horas,
posteriormente se lavan con agua y
jabón se esterilizan en horno de
microondas para su reutilización.
En el caso de contaminación de
alguna bata de laboratorio se
esteriliza (121º 15lb 30”) y se
procede a lavar.
3. Dilución en Microplacas de
poliestireno para determinar la
Concentración Mínima
Inhibitoria (MIC). Técnica
adaptada de (Winn, y otros,
2008):
Esta técnica se empleó para probar
los efectos antimicrobianos de las
mezclas de productos de abeja y
avispa, así como de los extractos y
tinturas de stevia, cedrón, col
blanca, moringa, contra cepas
clinicas de Helicobacter pylori,
determinando el porcentaje de
pozos inhibidos y la MIC de cada
producto.
a. Preparación de soluciones stock
de cada producto a probar.
b. Preparación de 3 ml de un
estándar de bacterias (por
separado para cada
microorganismo) en un tubo de
SSF estéril, comparándolo con
el tubo 0.5 del Nefelómetro de
Mac Farland.
6
c. A partir del estándar bacteriano
anterior, elaboración de una
dilución 1:10 v/v (1 ml de
suspensión bacteriana más 9 ml
de caldo BHI estéril o SSF
estéril). Esta corresponde al
stock bacteriano.
d. Preparación de 3 matraces de
50 ml con caldo BHI y se
esterilizan.
e. Para el ensayo de cada
producto, por separado, pipeteo
de 50 µl de caldo BHI en los
pozos 1 a 12 de cinco filas de
una microplaca de poliestireno.
f. Pipeteo de 50 µl de la solución
stock del producto en el primer
pozo de cada fila de la
microplaca de poliestireno
mezclando bien, todo con ayuda
de una Micropipeta automática
previamente descontaminada
con alcohol, usando puntas
estériles.
g. Realización de diluciones
dobles seriadas a partir del pozo
1 hasta el pozo 10
(Transferencia de 50 µl en cada
ocasión), mezclando en cada
transferencia. Llegando al pozo
10 se desechan 50 µl.
h. Agregar 50 µl del stock
bacteriano del pozo 1 al pozo 11,
teniendo en cuenta que el pozo
11 corresponde al control
positivo. Este control es el
parámetro de comparación de
cómo se debe ver el pozo
cuando las bacterias no son
inhibidas con la sustancia tras
las 24 y 48 horas de incubación.
i. En el pozo 12, que corresponde
al control negativo, se agregan
50 µl de SSF estéril. Este control
es el parámetro que sirve para
saber cómo se debe ver el pozo
en el que se logra la inhibición de
las bacterias (sin crecimiento).
j. Las microplacas se incuban a
37 C por 24 a 48 hrs.
k. Se realiza la lectura mediante
un lector de aglutinación o
mediante un cuentacolonias. La
presencia de un botón de
crecimiento al fondo de cada
pozo o la presencia de turbidez,
indica el crecimiento bacteriano.
La transparencia de los pozos
indica ausencia de crecimiento.
En ambos casos es importante
comparar las observaciones con
los controles positivo y negativo.
l. Se determina, a partir de éstas
observaciones, cuál es la MIC
(Concentración mínima
inhibitoria, concentración más
pequeña del producto capaz de
inhibir el desarrollo bacteriano).
Todos los ensayos se llevan a
cabo por cuadruplicado.
4. Evaluación de la actividad
antibacteriana por la técnica de Kirby y
Bauer o difusión en agar (Técnica
adaptada de Masuda, 1976; Reimer,
Stratton, & Reller, 1981; Motyl, Dorso,
Barrett, & Giacobbe, 2005):
Esta técnica se empleó para probar
los efectos antimicrobianos de las
mezclas de productos de abeja y
avispa, así como de los extractos y
tinturas destevia, cedrón, col blanca,
moringa, contra cepas clinicas de
Helicobacter pylori.
Se emplean placas de agar Müeller
y Hinton y discos de papel filtro de 6
mm de diámetro impregnados con
cada producto, tubos con 3 ml de
SSF estéril para preparar un
estándar bacteriano y el estándar
0.5 de Mac Farland correspondiente
a 1.5x108 UFC/ml.
a. Se prepara la suspensión
bacteriana en tubos de SSF
estéril (13 x 100 mm) con 3 ml de
SSF, en condiciones estériles,
empleando un mechero de
Bunsen, para las cepas de
prueba, comparándolas con el
estándar de Mac Farland..
b. Se siembra de manera masiva
cada bacteria en cajas con agar
Müeller y Hinton de 3 a 5 mm de
espesor, con ayuda de un hisopo
estéril y se dejan reposar
durante 5 minutos para que la
7
 bacteria quede impregnada en el
agar.
c. Con ayuda de unas pinzas de
disección previamente
flameadas, se colocan sobre el
agar inoculado los discos
impregnados con tintura,
infusión y extracto en alcohol y el
control (alcohol al 70% en el
caso de la tintura y el extracto en
alcohol y SSF estéril en el caso
de la infusión). Todos los discos
deben ser impregnados 24 hrs
antes con cada producto y
secados en la estufa
bacteriológica.
d. Se debe cuidar de dar una
separación entre disco y disco
no menor a 2.5 cm y que no
queden pegados a la pared de la
caja. También se presionan los
discos ligeramente sobre el agar
para evitar que se despeguen.
e. Las placas de agar se incuban a
37 C por 24 a 48 hrs.
f. Se miden los halos de inhibición
del crecimiento, en mm, con
ayuda de una regla o Vernier.
g. Se comparan los hallazgos con los
controles positivo y negativo.
4.1. Análisis estadístico.
Con los resultados obtenidos a partir de los
ensayos de las técnicas de Kirby y Baüer y
Microdilución en placa, se llevó a cabo un
Análisis de Varianza (ANDEVA) de una vía,
considerando un intervalo de confianza del
95%. Además, se empleó la prueba de
Fisher para comparar las respuestas entre
parejas de tratamiento. Todo ello con el
apoyo del software Minitab 17.
5. Resultados y discusión
Se aislaron cinco cepas de Helicobacter
pylori a partir de muestras de heces que
con anterioridad fueron positivas en la
prueba rápida de antígenos fecales. En
todos los casos se realizó la identificación
a través de la tinción de Gram,
observándose cocobacilos Gram
negativos, sin agrupación. Las pruebas de
catalasa, oxidasa, motilidad en gota
suspendida y ureasa en agar de
Christensen fueron positivas (Figura 1).
Cabe resaltar que la motilidad de esta
bacteria es muy característica,
observándose que avanzan por tramos
cortos lenta o rápidamente, para después
realizar una voltereta, lo cual es usual en
bacterias que poseen flagelos polares,
como es el caso de Helicobacter pylori.
Al llevar a cabo la prueba de Kirby y Baüer,
a pesar de que se demarcaban halos de
inhibición de tamaños variables, en los
diferentes extractos, tinturas y mezclas, al
revisar a detalle con ayuda de una lupa, se
pudo observar que dentro de estos se
formaron colonias de bacterias. En años
anteriores se ha observado, en diversos
proyectos realizados en el laboratorio
escolar, que esta prueba resulta ser menos
sensible, que la de microdilución en placa
(MDP). Por ello, la exposición de
resultados y su discusión, se basa
principalmente en los ensayos de MDP.
En la Figura 2, se pueden observar los
resultados para todos los productos
empleados contra la cepa 1 de
Helicobacter pylori (Aislada de un paciente
masculino de 17 años). Los productos que
presentaron una mejor acción antibiótica
fueron el EB, la ME y la MPABYAV, con un
porcentaje de pozos inhibidos de 4.55 ±
4.86. El resto de los tratamientos careció
de efectividad contra dicha cepa.
Inicialmente, se pensó que los principios
activos de algunos de ellos se
desnaturalizaban debido al proceso de
esterilización y reesterilización (110 C 10 lb
10´) que se llevaba a cabo en ellos antes
de proceder a los ensayos, sin embargo,
cuando se prepararon nuevos extractos y
tinturas, se observó el mismo resultado tras
las pruebas.
8

En el caso de la cepa 2, aislada de un
paciente masculino de 17 años (Figura 3),
se apreciaron efectos inhibitorios por parte
únicamente del EB (3.41 ± 4.71) y la
MPABYAV (4.55 ± 4.86).
En la cepa 3, aislada de un paciente
femenino de 16 años, la TS y la MPABYAV,
fueron las que funcionaron mejor, con un
porcentaje de pozos inhibidos de 9.1 ± 9.73
y 9.1 ± 0.0, respectivamente. Le siguen la
TC (4.60 ± 4.92) y la TB (4.55 ± 4.86). El
resto de los productos no muestran efectos
significativos (Ver Figura 4).
En la Figura 5, se observa que para la cepa
6, proveniente de un paciente masculino de
17 años, el EB, el ECB y el EC, produjeron
los mejores porcentajes de pozos
inhibidos, igual que para la ME y la
MPABYAV (9.10 ± 0.00). El ES, por otra
parte, produjo un porcentaje menor, pero
no despreciable, de inhibición con un valor
de 6.82 ± 4.55, mientras que el resto de los
productos no mostró efectos significativos.
Finalmente, al analizar los resultados de
porcentajes de pozos inhibidos de todas las
cepas ante todos los productos (Figura 6),
se aprecia que funcionó mejor la
MPABYAV, con un 6.50 ± 4.19, siguiéndole
el EB con 4.55 ± 4.63.
Comparando los resultados obtenidos en
este trabajo empleando cepas clínicas, con
los derivados del proyecto del año pasado
utilizando una cepa de referencia, se puede
observar que los porcentajes de pozos
inhibidos se reducen aproximadamente a la
mitad comparados con las primeras. Esto
puede deberse a la variabilidad genética de
esta bacteria al encontrarse en el medio
ambiente. Diversos autores coinciden en
que no todas las cepas de H. pylori son
patógenas, y que la presencia de ciertos
factores de virulencia marca la diferencia
entre las que se consideran microbiota de
la mucosa gástrica. También existe la
evidencia de cepas altamente resistentes a
la antibioticoterapia empleada en los
esquemas terapéuticos usados en
gastroenterología. Otro factor a considerar
es la variedad de cepas que existen
9
Anteriormente, se clasificaron las cepas
como tipo I (cagA+, vacA+) y tipo II (cagA−,
vacA−), de acuerdo con la
presencia/ausencia de los genes. Las
cepas de tipo I se consideran más
virulentas que las cepas tipoII. Existe un
tercer tipo de cepa, llamada «cepa triple
positiva», con la presencia de los genes
babA+, vacA+ y cagA+. Se han asociado
las cepas «triple positiva» a EUP
(Enfermedad por úlcera péptica) y
adenocarcinoma gástrico. Teniendo esto
en cuenta se puede determinar que cada
paciente tiene una cepa distinta debido al
ambiente gástrico que tenga cada uno,
dando una amplia gama de cepas, unas
con mayor o menor resistencia (Torres V,
García M, & Zárate O, 2008; Morales-
Espinosa, Castillo-Rojas, & López-Vida,
2013; Yepes & Rodríguez, 2008).
Los antibióticos alópatas pueden mejorar la
vida del ser humano, sin embargo, un mal
uso puede conducir a una resistencia
bacteriana. Las bacterias son seres vivos
que tiene la capacidad de adaptarse, por
medio de procesos de mutación, en
circunstancias desfavorables, luchando por
sobrevivir junto con otros
microorganismos. Por ello, adquiere
relevancia el presente proyecto, pues al
emplear antibióticos naturales se puede
contribuir a impedir el avance de
resistencias bacterianas, que de no ser
atendidas ahora generarán epidemias de
alta virulencia, con consecuencias
inimaginables, como se menciona en el
libro de Harrod-Buhner (2012). Los
productos obtenidos a partir de plantas
representan una alternativa importante al
tratamiento de infecciones por Helicobacter
pylori, pues al poseer múltiples principios
activos, imposibilitan la aparición de
resistencias. Estas sustancias también
actúan en contra de hongos y virus y no
producen efectos secundarios,
fortaleciendo el sistema inmunológico.
(María & Jenny, 2012).
Sería necesario hacer algunas
modificaciones al diseño experimental, por
ejemplo, repetir los ensayos con una mayor
cantidad de cepas que se obtengan de
pacientes de diferentes grupos de edad,
explorando su contexto individual y
determinar con ello, los factores que
influyen en la variabilidad de la
sensibilidad.
Para mejorar el proyecto, se considera
importante esterilizar los extractos y
tinturas por medio de filtración, para evitar
eliminar los componentes termosensibles.
También se considera importante preparar
extractos por el método de extracción por
arrastre de vapor, pues quizá de esa forma
se obtengan productos con mayor
potencial antibiótico.
Asimismo, sería conveniente preparar
productos de plantas de diferente origen
geográfico, pues es muy probable que el
ambiente que las rodea, influya
significativamente en la cantidad y
efectividad de sus principios activos.
Podría ser importante también preparar
productos a partir de diversas partes de las
plantas, diferentes a las hojas, tales como
semillas, cortezas, raíces y tallos.
Adicionalmente podrían prepararse los
extractos y tinturas empleando como
solvente el alcohol al 100%, pues en este
trabajo se empleó tequila, el cual viene a
una concentración del 35%, lo cual puede
influir sobre la capacidad extractiva de los
principios activos.
6. Conclusiones
En este proyecto se logró la inhibición
del crecimiento de algunas cepas
clínicas de Helicobacter pylori,
empleando tinturas y extractos de
stevia, cedrón, moringa, col blanca y
brócoli, y la mezcla de productos de
abeja y avispa, sin embargo,
comparando con los resultados
obtenidos el año pasado con la cepa de
referencia, los efectos inhibitorios se
reducen a la mitad en la generalidad de
los tratamientos que resultaron
efectivos.
10
 Desafortunadamente, no se logró
potenciar el efecto antibiótico
elaborando mezclas de tinturas y
extractos de esas plantas.
Será necesario obedecer a las
modificaciones que se consideran
relevantes y se mencionaron en la
discusión.
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