UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

PRÁCTICA 5 CROMATOGRÍA EN PAPEL

Practice 5 Paper Chromatography

,
30/06/2011

El uso de la Cromatografía como técnica de separación, permite el análisis de mezclas complejas

de compuestos muy estrechamente relacionados químicamente (aminoácidos). Además de
identificar mediante una muestra conocida una muestra problema. Es de suma importancia para el
manejo de aislamiento de proteínas.
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INTRODUCCIÓN:

La palabra cromatografía proviene de kromatos, color y graphos, escrito. Los primeros

registros acerca de la Cromatografía son de 1939 por Brown, que fue el primero que usó la
cromatografía circular en papel. Después en 1944 Consden, Gordon, y Martin, describieron la
cromatografía de partición en papel. En 1906, el botánico ruso Mikhail Tswett (1872-1919)
formalizó el uso de la cromatografía en estudios científicos, aplicándola a la separación de los
pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas).
Además le dio ese nombre a la técnica. Tswett empacó una columna de vidrio vertical (de unos
cuantos centímetros de diámetro) con material adsorbente. Luego, por la columna vertical virtió una
solución que contenía la mezcla de pigmentos provenientes de las hojas molidas de una planta.
Pasados unos minutos, el material empacado en la columna había adquirido una coloración
diferente por segmentos. Es decir, había logrado la separación de los pigmentos naturales de la
planta. En cada segmento de color definido había un pigmento diferente.

La cromatografía en papel es la técnica de separación e identificación de sustancias

químicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel de filtro. Se toma una
pieza de papel de filtro y cerca de uno de sus extremos se deposita una gota de la solución que
contiene la mezcla de las sustancias que se quieren separas. Se deja secar la gota y quedara la
mancha de las sustancias mezcladas. El extremo del papel mas próximo a la mancha se introduce en
un disolvente apropiado, pero sin que la mancha llegue a introducirse en él. Existen muchos tipos de
cromatografía sobre papel, una primera división de las variadas clases podría ser:

1- Cromatografía ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del recipiente que sostiene al

papel y va subiendo a través de el por capilaridad.
2- Cromatografía descendente: el disolvente esta en un recipiente esta en un recipiente del que
cuelga el papel, fluye por él hacia abajo por una combinación de capilaridad y gravedad.

Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción
con la fase estacionaria al último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las
propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes
(picos) se separan cuando el pico que sale después es retardado lo suficiente para impedir la
sobreposición con el pico que emergió antes.

Una amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite
separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un sentido
amplio, la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las
moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que
presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas
pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o
pueden deberse a fuerzas de dispersión de tipo London.

La resultante de las fuerzas: Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las
sustancias, comienzan a actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que
retardan. Las fuerzas propulsoras actúan apartando las sustancias de su punto de origen y
desplazándolas en dirección del flujo de origen. Las fuerzas retardantes tratan de impedir el
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movimiento de las sustancias, llevándolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrás en el papel.
La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es la resultante de
estas dos clases de fuerzas.

Fuerzas propulsoras: Cuando se realiza un cromatograma en papel, las fuerzas propulsoras

más importantes son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le disolvente.

Flujo del disolvente: Si la sustancia cromatografiada fuera completa e instantáneamente soluble en

el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azúcar, y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia
ascenderá desde el origen hasta donde llega el diluyente. En cambio si la sustancia fuera
completamente insoluble en el disolvente en movimiento no se movería del origen. La corriente del
disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha, así pues, si el disolvente fuese capaz
de disolver instantánea y completamente todas las sustancias, estas avanzarían juntas hasta el final
de la trayectoria del disolvente y terminaríamos donde empezamos con todas las sustancias juntas.

Fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las sustancias que ofrecen la misma
solubilidad en cualquier disolvente. La particular solubilidad de una sustancia en la corriente del
disolvente es una fuerza propulsora que tiende a desplazarla, manteniéndola en movimiento a lo
largo del papel.

Fuerzas retardantes: Hay también dos fuerzas retardantes principales: la adsorción y el

reparto.

Adsorción: La celulosa de la que esta hecho el papel de filtro, posee propiedades adsorbentes. Las
sustancias depositadas en el papel, en cromatografía, pueden ser más o menos adsorbidas en el
papel. La adsorción es otra de las fuerzas diferenciales esto significa que unas sustancias son
adsorbidas más que otras y, por consiguiente, la liberación de las sustancias de las manchas variará
de una sustancia a otra. Esto contribuye de nuevo a la separación. Mientras que se va realizando el
cromatograma, las sustancias mas fuertemente adsorbidas se van quedando atrás, mientras que las
adsorbidas con menos fuerza avanzan hacia el frente.

Reparto: La cromatografía se basa, en una medida considerable, en la presencia de dos fases

liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente circulando por el papel de
filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel de filtro. Una hoja de papel de filtro
aparentemente seca contiene entre un 6 y 12% de agua firmemente adherida a la celulosa. Aquí es
donde entra en función el reparto. Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no
mezclados es expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartirá entre ellos. La cantidad que se
encuentre en cada disolvente dependerá de la relativa solubilidad del soluto en cada uno. El grado
de reparto, una vez conseguido el equilibrio, se llama coeficiente de reparto o razón de distribución.

Constante Rf: El último punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina frente
del disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias relativas
recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El símbolo utilizado para designar esta
distancia relativa es Rf y se define mediante: distancia recorrida por el compuesto desde el origen
Rf = Distancia del origen al frente del disolvente Como el denominador es siempre mayor que el
numerador en Rf debería ser un decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un
porcentaje. Así un Rf de 50 indicaría que el compuesto avanzo la mitad de la distancia del frente del
disolvente.

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OBJETIVO GENERAL:

 Determinar la presencia de un edulcolorante artificial en una muestra problema, mediante

su (Rf), y ver sus propiedades de solubilización comparándolo con los Rf de los
aminoácidos que lo componen.

OBJETIVOS PARTÍCULARES:

 Separa aminoácidos y péptidos mediante el uso de la cromatografía en papel.

 Determinar el corrimiento cromatográfico de un aminoácido polar y uno no polar;
comparando el Rf de cada uno de ellos.
 Separar e identificar, por medio de la técnica de cromatografía en papel, el aspartame en un
refresco dietético, comparando su Rf con el del Canderel.

HIPÓTESIS:

 Si el aminoácido “x” presenta un mayor corrimiento en el cromatograma;

entonces decimos que presenta una polaridad compartida con el eluyente.
 Si la mancha de un aminoácido corre cierta distancia y la muestra problema
también la presenta; entonces estaremos hablando del mismo tipo de
aminoácido.

MATERIALES

1 Hoja de Papel Whatman No2 para cromatografía

7 Capilares de Vidrio
1 Cámara para Cromatografía en papel
1 Placa de Calentamiento
1 Probeta de 100 mL

REACTIVOS
Ácido Aspártico
Fenilalanina
Ninhidrina
Butanol
Acido Acético
Isopropanol
Acetona

MATERIAL PROPORCIONADO POR EL ALUMNO

1 Atomizador de Vidrio de 50 o 100 mL

1 Pliego de Cartulina
1 Tijeras
1 Regla de 30 cm
1 Par de guantes desechables

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1 Secadora de Cabello
1 Sobre de Canderel o de Nutrasweet
1 Lata con refresco normal sin colorante
1 Lata con refresco de Dieta sin colorante

Soluciones
• Solución de isopropanol al 10% (v/v)
• Solución de ácido aspártico 0.002M (0.026 en 100 mL de isopropanol al 10%)
• Solución de fenilalanina 0.002M (0.033g en 100 mL de isopropanol al 10%)
• Solución de Ninhidrina al 0.2% (0.2g en 100 mL de acetona).
• Solución de butanol: acido acético: agua, en proporción 12:3:5 (v/v)
• Canderel al 1% (1g en 100 mL de agua)

METODO

1. Colocar un volumen de la mezcla butanol: acido acético: agua en la cámara para

cromatografía, tal que no sobrepase el nivel de 1 cm y taparla para que se sature a
temperatura ambiente (25ºC). Si la temperatura ambiente es baja, se debe colocar
la cámara cerca de una placa de calentamiento dentro de la campana de
extracción de vapores.
2. Usar guantes para cortar un fragmento de 20 x 9 centímetros de una hoja de
papel Whatman, el cual debe colocarse sobre la superficie de una cartulina nueva.
Marcar el fragmento de papel con una flecha que indique el sentido en que
correrán las muestras, el cual viene señalado en la caja de papel Whatman.
3. En el lado más angosto del papel Whatman, y considerando el sentido en que
correrán las muestras, trazar con lápiz una línea a un centímetro del borde. Sobre
ésta línea marcar cinco puntos equidistantes, dejando un margen de 0.5cm en
cada extremo (ver figura).
4. Tomar una alicota de fenilalanina, utilizando un capilar de punta adelgazada, y
ponerla sobre uno de los puntos marcados en el papel. Secar la aplicación con la
secadora de cabello. Realizar cinco aplicaciones secando en cada ocasión. Hacer
lo mismo con el ácido aspártico, Canderel o Nutrasweet, refresco normal y de
dieta.
5. Cuando se hayan aplicado las alícuotas de las cinco muestras, hacer dos
perforaciones en la parte superior de la hoja y colocar dos hilos de
aproximadamente 30cm de largo.
6. Colocar la hoja de papel dentro de la cámara de cromatografía, sosteniéndola
mediante los hilos en una posición tal que sea humedecida en forma homogénea
por la mezcla butanol: acido acético: agua, pero si que las manchas de las
sustancias a separar sean cubiertas por la mezcla. El papel debe mantenerse en
esta posición vertical durante todo el procedimiento. Para ello se deben sujetar los
hilos a las paredes externas de la cámara cromatográfica con un trozo de cinta
adhesiva. Cerrar la cámara y colocarla dentro de la campana de extracción del
laboratorio.

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7. Dejar correr la cromatografía durante dos horas aproximadamente. Sacar el papel

de la cámara, marcar con un lápiz la posición donde llego el disolvente después
del tiempo y dejar secar al aire.
8. Para revelar la posición de las sustancias que se corrieron en la cromatográfica,
se rociará el papel con una solución de ninhidrina contenida en el atomizador. El
rociado se realiza en forma homogénea y a una distancia de unos 10 cm. Secar el
papel en una estufa a 100ºC por diez minutos.
9. Una vez seco el papel. Marcar con un lápiz los límites de las manchas que
aparecen y tomar la distancia entre el centro de la mancha y el punto de
aplicación. A partir de estos datos y distancia a la que llego el solvente, determinar
el Rf de cada uno de los compuestos que se aplicaron en el papel, mediante la
formula siguiente:

RESULTADOS

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ANALISIS DE RESULTADOS

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué son la fase estacionaria y la fase móvil de un sistema de cromatografía?

La fase móvil o eluyente es el fluido (líquido o gas) en que están las sustancias a
separar, y que provoca el arrastre de las mismas por la fase estacionaria mientras se
filtra a través de ella en una dirección definida. Dependiendo del tipo de
cromatografía, la fase móvil puede tener una composición fija o variable.

La fase estacionaria es la que no se mueve y que retiene a los solutos a separar que
interaccionan con ella. Un concepto relacionado, y a veces coincidente, es el de
soporte o matriz, que es el sólido que constituye, retiene o mantiene fija la fase
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estacionaria. Los requisitos generales que debe tener un soporte son: carácter
hidrofíÍico y ausencia de carga para evitar adsorciones inespecíficas, estabilidad
mecánica y química, inerte, gran superficie, y tamaño del grano y porosidad
controlables.

2.- ¿Cómo puede modificar la fase móvil en un sistema cromatográfico?

Dependiendo del eluyente que se utilice en la cromatografía, la fase móvil debe elegirse de
forma que se eluyan todos los componentes de la muestra y no se produzca una
acumulación en la base de la cromatografía.

3.- ¿Qué es el Rf de una sustancia?

Es el último punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina frente del

disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias relativas
recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El símbolo utilizado para
designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante: distancia recorrida por el
compuesto desde el origen Rf = Distancia del origen al frente del disolvente Como el
denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debería ser un decimal. Por razones
de conveniencia se suele expresar como un porcentaje. Así un Rf de 50 indicaría que el
compuesto avanzo la mitad de la distancia del frente del disolvente.

Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la concentración
del ambiente de la cámara y la temperatura.

4.-Investigue las características de los aminoácidos utilizados en la práctica, y como se

clasifican.

No esenciales Esenciales

Alanina Arginina*

Asparagina Histidina

Aspartato Isoleucina

Cisteina Leucina

Glutamato Lisina

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Aminoácidos Esenciales vs. No Esenciales

Los aminoácidos arginina, metionina y fenilalanina se consideran esenciales por

razones no directamente relacionadas por la falta de síntesis. La arginina es sintetizada
por las células de mamíferos pero en un rango que es insuficiente para resolver las
necesidades de crecimiento del cuerpo y la mayoría que es sintetizada es procesada para
formar urea. La metionina es requerida en grandes cantidades para producir cisteina, si
el último aminoácido no es provisto adecuadamente en la dieta. Igualmente, la
fenilalanina se necesita en grandes cantidades para formar tirosina, si este último
aminoácido no es adecuadamente provisto en la dieta.

La fenilalanina: Es un aminoácido esencial aromático (junto con el triptófano y la

tirosina) cuyo grupo R contiene un anillo bencénico (Ruta 2). Uno de los aspectos más
relevantes de su biosíntesis es el mecanismo a través del cual los anillos aromáticos se
forman a partir de precursores alifáticos. También se le clasifica, junto con el triptófano,
como un aminoácido hidrofóbico con estructura cíclica. Según los últimos estudios
sobre los aminoácidos esenciales parece que en la fenilalanina, la estructura carbonada
sería su parte considerada esencial ya que esta estructura es transaminada con rapidez
por el organismo.

La mayor parte de este compuesto se transforma, por medio de hidroxilación, en

tirosina que es otro aminoácido, en este caso considerado como semiesencial.

Además la fenilalanina es el precursor de las catecolaminas en nuestro cuerpo, si bien

acortamos el mecanismo en la síntesis de catecolaminas utilizando la tirosina como
precursor (ver Ruta 3). También es un constituyente importante de los neuropéptidos
cerebrales, como la somatostatina, vasopresina, melanotropina, encefalina, ACTH,
angiotensina, sustancia P y colecistoquinina. Muchas drogas de las que conocemos
como psicotrópicas, contienen fenilalanina.

La fuente más importante de fenilalanina son los alimentos ricos en proteínas, como es
la carne y los productos lácteos. La fenilalanina tiene utilidades en la industria de la
alimentación, por ejemplo, en la elaboración de edulcorantes artificiales.

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Acido aspártico: Aminoácido glucogénico (puede convertirse en glucosa y glucógeno)

cuyo grupo R posee carga negativa a pH 7,0. Se trata de un compuesto muy hidrofílico,
y como tal se encuentra casi siempre en la superficie externa de las proteínas
globulares. Es un compuesto metabólicamente activo debido a su interconversión con
los ácidos dicarboxílicos tetracarbonados del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, después
de sufrir una transaminación. Es el precursor de la asparagina. También interviene en
otras reacciones como dador de aminos en la síntesis de urea y de purinas, y como
precursor de los anillos pirimidínicos a través de la formación de carbamoilaspartato en
el citosol. Es, junto con el glutámico, el principal neurotransmisor excitatorio de la
corteza cerebral.

5.-Investigar los Rf reportados en la literatura para los aminoácidos aquí utilizados,

anote el sistema de fase móvil y fase estacionaria utilizado para obtenerlo. Rf de los
aminoácidos de referencia

Aminoácido
Rf

Lisina 0.24
Ácido glutámico 0.47
Glicina 0.49
Cisteina 0.12
Serina 0.31
Metionina 0.59
Fenilalanina 0.66
Arginina 0.28
Valina 0.59
Triptófano 0.60
Histidina 0.29
Treonina 0.39

http://www.doschivos.com/display.asp?ID=625&f=13547

6.-Hacer una investigación sobre el uso de actual del aspartame . Anote posibles beneficios
y perjuicios del uso de tal producto.

El ASPARTAME

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Se sintetiza a partir del ácido aspártico y del éster metílico de fenilalanina para
formar un endulzante blanco, cristalino altamente estable. Es un endulzante de bajas
calorías usado en alimentos y bebidas. Es aproximadamente 130 a 200 veces más
dulce que el azúcar.

VENTAJAS DE USO

 Se utiliza para reemplazar el azúcar.

 Reduce sustancialmente las calorías en los alimentos o incluso las elimina por
completo.
 Aprobado por la FDA de los Estados Unidos.

APLICACIONES

* Bebidas refrescantes

*Helados

*Néctares de fruta

*Postres, gelatinas

*Concentrados de bebidas

*Conservas de fruta, gelatinas

*Edulcorantes de mesa

*Mermeladas, confituras

*Productos lácteos

*Productos hechos al horno

*Goma de mascar

*Repostería

Beneficios y perjuicios del uso del Aspartame en nuestra salud.

Abril, 2011. La Autoridad Europea para la Seguridad Alimentaria, AESA, afirma que no
hay evidencia científica para apoyar una relación causal entre el consumo del edulcorante
aspartame, utilizado para la fabricación de bebidas y alimentos, con el parto prematuro en
mujeres embarazadas, o con el desarrollo de tumores cancerígenos.

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La AESA, en una publicación de febrero del presente año, desmintió científicamente los
resultados de dos estudios realizados en el 2010 sobre los posibles riesgos para las personas
consumidoras de aspartame.

El primero asociaba la exposición de ratones suizos al aspartame con el desarrollo de

tumores cancerígenos, mientras que en el segundo mostraba una supuesta asociación entre el
consumo de refrescos endulzados artificialmente y el parto prematuro en una muestra de 59,334
mujeres embarazadas.

En ambos casos, el organismo, con sede en Parma, Italia, concluyó que la información
disponible en ambos estudios “no da razón para reconsiderar las evaluaciones ya realizados sobre
el aspartame o aditivos artificiales ya autorizados en la Unión Europea”.

La AESA recomienda que se continúen estudiando otros factores relacionados con la dieta
que podrían influir en la aparición de tumores cancerígenos. Además, señala que diferentes tipos
de edulcorantes se utilizan solos o combinados con las bebidas, y que no hay justificación para
concentrarse en un edulcorante específico.

Dulce y Seguro

Si bien existe un debate sobre la seguridad en el uso de aspartame, el edulcorante está

aprobado en más de 105 países y grupos independientes del área de salud también le han dado su
visto bueno.

De acuerdo con un artículo de la Revista del Consumidor de la Administración de Drogas y

Alimentos de los Estados Unidos (FDA), “No existen pruebas científicas que apoyen una relación
entre el aspartame y cualquier tipo de cáncer”.

Un estudio del Instituto Nacional del Cáncer del año 2006 indica que “el aumento en el
consumo de bebidas con contenidos de aspartame no se relaciona con el desarrollo de linfomas,
leucemia o cáncer cerebral”.

 Es 200 veces más dulce que el azúcar, pero con la ventaja que puede utilizarse en cantidades tan

pequeñas que da dulzura a los alimentos que lo contienen sin aportar calorías al cuerpo. Es

posible encontrarlo en cereales, bebidas gaseosas y goma de mascar.

 El aspartame está en la lista de los cinco edulcorantes artificiales aprobados por la

Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), junto con la sacarina, el

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acesulfame potásico, el neotame y la sucralosa, así mismo está aprobado por el Codex

Alimentarius, referencia regulatoria de la mayoría de los países del orbe.

 “La FDA evalúa la composición y propiedades de los edulcorantes, las cantidades que se pueden

consumir, así como otros estudios en cuanto a su seguridad” concluye la nutricionista Pardo.

La especialista señala que “debido a que el aspartame se descompone en fenilalanina, los

organismos internacionales exigen que los productos que lo contengan, lo adviertan en su
etiqueta para aquellas personas que sufren fenilcetonuria. Este defecto congénito causa una
alteración del metabolismo en el que el organismo no puede metabolizar fenilalanina en el
hígado”.

Por su parte, la nutricionista colombiana y docente universitaria, Consuelo Pardo explica

que es improbable que se pueda exceder la ingesta diaria admisible (IDA) de aspartame, ni
siquiera por niños o personas diabéticas. El nivel recomendable por día es de entre 40mg/kg de
peso corporal y 50 mg/kg de peso corporal, lo que equivaldría a consumir 15 refrescos gaseosos
endulzados con aspartame al día.

La regulación requiere que se coloque una leyenda en las etiquetas de los productos con
contenidos de aspartame, especialmente para alertar a los fenilcetonúricos de la presencia de
fenilalanina en el producto.

“Los fenilcetonúricos son una parte muy pequeña de la población que no puede consumir
ningún producto con fenilanalina, como la leche, y el aspartame. Generalmente la enfermedad se
detecta pocos días después de nacer, mediante la prueba de tamizaje, que es standard en todos
los países”, agrega la nutricionista Pardo.

Bibliografía:

Lehninger, A. L. 1991.Bioquímica “Las bases moleculares de la estructura y function cellular”.

Ed. Omega. España, Barcelona, 56-78 p.

Harris, D. C. 2003. Análisis químico cuantitativo. Ed. Reverté. España, Barcelona. 62-63 p.

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Willard, H. H. 1988. Instrumental Methods of Analysis. Wadsworth, Inc., U.S.A. 654-665p.

http://gc.discussing.info/gs/b_theory/index.html

http://www.pinolerosports.com/blogs/8-blogs/973-desvinculan-consumo-de-aspartame-con-riesgos-
en-la-salud.html

http://www.corporativotae.com.mx/aditivos_quimicos/ASPARTAME.pdf

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