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Quimioluminiscecnia Opcion Intensante para Deteccion Analitica de Sistemas de Flujo PDF
Quimioluminiscecnia Opcion Intensante para Deteccion Analitica de Sistemas de Flujo PDF
GARCÍA-CAMPAÑA, AM.1, BAEYENS WRG2; ZHANG X3; ALÉS F1, GÁMIZ L1.
1
University of Granada, Faculty of Sciences, Dept. of Analytical Chemistry,
Avda. Fuentenueva s/n, E-18071 Granada, Spain
2
Ghent University, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Dept. of Pharmaceutical Analysis,
Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Belgium
3
Tsinghua University, Dept. of Chemistry, Analysis Center, Tsinghua Yuan, Beijing 100084, P. R. China
RESUMEN
El estudio del tipo de interacción involucrada en la formación de dispersiones sólidas de tolbutamida con distintas
proporciones de acetamida y propianamida, ha requerido del diseño y validación de un método analítico por cromatografía
líquida de alta eficacia (CLAE) que permita cuantificar la proporción de los transportadores en mezclas físicas y en
dispersión sólida. El método resultó ser lineal, preciso y exacto en el intervalo de concentración de 100-1,56 µ g/mL
para tolbutamida y 50-0,781 µ g/mL para acetamida y propianamida.
PALABRAS CLAVE: tolbutamida, propianamida, acetamida, cromatografía líquida, CLAE.
ABSTRACT
The interest to design and validate a high performance liquid chromatography method for quantification of tolbutamide,
acetamide and propianamide in solid dispersions, was to find a relation among the amount of carriers and the active
substance in solid dispersions, in order to further investigate the drug-carrier interaction pattern responsible of solid
dispersion formation. The method was lineal, precise and accurate in the concentration range between 100.0 - 1.56 µ g/
mL for tolbutamide and 50.0 - 0.78 µ g/mL for acetamide and propianamide.
KEY WORDS: tolbutamide, propianamide, acetamide, HPLC.
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
permitiendo la resolución y cuantificación de varios been noticed in these last years; hence further
analitos en mezclas relativamente complejas [1 ]. developments are expected.
Hasta la década de los noventa, la detección The number of reactions producing CL cited
por QL no había sido acoplada a la EC, pero en in the literature is increasing annually, with analy-
estos últimos años, se han publicado importantes tical applications in chemical, biomedical, food,
desarrollos por parte de algunas compañías y environmental and toxicological disciplines. In
grupos de investigación, por lo que se esperan combination with HPLC separations, several CL
futuras contribuciones sobre el tema. reactions have been used, amongst others, pe-
El número de reacciones quimioluminiscen- roxyoxalate, firefly luciferase, lucigenin and lu-
tes citadas en bibliografía, con aplicaciones en minol, the peroxyoxalate reaction being the most
química, biomedicina, alimentación, medioam- commonly used CL-based system for post-co-
biente y toxicología, se ve incrementado anual- lumn detection in conventional and in microco-
mente. lumn LC set-ups. Continuous flow CL-based
Combinado con separaciones por cromatografía detection of several analytes has been widely
líquida de alta resolución (CLAR) , se han em- applied by several groups for the determination
pleado varias reacciones quimioluminiscentes, of diverse biological compounds and drugs.
entre otras con peroxioxalato, luciferasa, lucige- Today, analytical interest in the application of
nina y luminol, siendo la más común la reacción CL is growing considerably due to the cited advan-
con peroxioxalato en detección post-columna tages as low detection limits, wide dynamic ran-
acoplada a cromatografía líquida, tanto conven- ges, high sensitivity and the versatility of chemilu-
cional como empleando microcolumnas. Asimis- minometric methods. Recently, increasing interest
mo, se han empleado sistemas de flujo continuo was focussed on CL products for life sciences re-
con detección basada en QL, para la determina- search; in clinical diagnostics, for example, CL is
ción de varios fármacos y analitos de interés nowadays suggested as a sensitive substitute for
biológico. isotopic labelling, replacing radioisotopes. CL is
Hoy en día, el interés analítico de la QL está applied as well in the quality control of meat pro-
aumentando considerablemente debido a las ven- ducts and residues and future projects are focussed
tajas ya comentadas, como bajos límites de de- on environmental ozone measurements.
tección, rangos dinámicos amplios, alta sensibi- The sensitivity offered by CL-based reactions
lidad y la gran versatilidad de los métodos QL. is often needed, for example in the assay of illi-
Recientemente, las investigaciones se están cen- cit compounds within various matrices. Moreover,
trando especialmente en el desarrollo de produc- the interest in analytical CL for the last decade
tos quimioluminiscentes para aplicaciones de can be illustrated by the number of published
diagnóstico clínico; así, la QL es hoy en día un papers in prestigeous analytical journals (e.g.,
posible sustituto del marcado isotópico, rempla- Analytical Chemistry, The Analyst, Analytica
zando así el uso de radioisótopos. La QL se aplica Chimica Acta, Fresenius’ Zeitschrift für Analy-
también en el control de calidad de productos tische Chemie, Journal of Microcolumn Separa-
cárnicos y residuos, existiendo igualmente apli- tions, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
caciones en la medida del ozono ambiental. Analysis, to name a few) and by the existence of
Considerablemente ventajosa resulta la sensi- a dedicated specific journal, the Journal of Bio-
bilidad que ofrecen las reacciones basadas en logical and Chemical Luminescence.
QL en diversos ámbitos del análisis aplicado, It is clear that the need for improving detec-
por ejemplo en la determinación de compuestos tion technology is nowadays related to the gene-
prohibidos en diversas matrices. Así, el interés ral trend in analytical chemistry to miniaturize
de la QL en química analítica en la última déca- and thus reduce waste volumes of organic sol-
da queda demostrado por el número de artículos vents in separational set-ups, and by using more
publicados en revistas de gran prestigio (Analy- aqueous systems, studying smaller samples at
tical Chemistry, The Analyst, Analytica Chimica increasingly lower concentrations. As the CL
Acta, Fresenius’ Zeitschrift für Analytische Che- technique may provide improvement in these
mie, Journal of Microcolumn Separations, Jour- situations, the instrumentation for CL measure-
nal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, ments and the coupling with a selective physical
entre otras) y por la aparición de una revista or chemical interface to achieve selective mea-
específica: Journal of Biological and Chemical surements is likewise aimed at. In this way, di-
Luminescence. sadvantages of direct CL-based techniques (e.g.,
Siguiendo la tendencia general en química lack of selectivity, sensitivity to various physi-
analítica, la mejora en los métodos de detección co-chemical factors) are avoided. Specific deve-
está dirigida actualmente a la miniaturización y, lopments in chromatography, capillary electro-
por lo tanto, a reducir el gasto de disolventes phoresis, immunoassay and the use of enzyme
orgánicos en métodos de separación, empleando reactions are being progressively reported. Mi-
más sistemas acuosos y volúmenes de muestra crochip-sized systems are attractive from this point
menores con concentraciones inferiores. Como of view, as the problem of modest to unsatisfac-
las técnicas quimioluminiscentes pueden propor- tory detection limits characteristic for these sys-
cionar mejoras en estas situaciones, la instru- tems may be overcome.
mentación para medidas quimioluminiscentes y Moreover, the problem of waste disposal is
el desarrollo de acoplamientos con interfaces gradually forcing analytical separating systems into
selectivas físicas o químicas que permitan medi- miniaturization, e.g., narrow-bore and capillary
das selectivas están también dirigidos a conse- liquid chromatography versus high performance
guir este fin, de modo que puedan eliminarse las liquid chromatography (HPLC), miniaturized high
desventajas de las técnicas basadas en medidas performance thin layer chromatography (HPTLC),
directas de QL (como falta de selectividad o and, for recent years, capillary electrophoresis.
dependencia de factores físico-químicos). Así, se As the CL phenomenon may be applied to
están publicando progresivamente avances espe- solve the problem of detection limitations in
cíficos en cromatografía, EC, inmunoensayo y particular in narrow-bore liquid chromatographic
en el uso de reactores enzimáticos. Desde este and capillary electrophoretic set-ups, not using
punto de vista, los sistemas miniaturizados (“mi- hazardous labels, the former technique is bound
crochip”) son muy atractivos, ya que puede re- to be thoroughly explored for the coming deca-
solver el problema de los límites de detección de. As an example, it may be mentioned that in
poco satisfactorios característicos de estos siste- recent years a CL-based detection system using
mas. EMMA (electrophoretically mediated microas-
Asimismo, el problema del gasto de disol- say) of enzymes was described, allowing the
vente está potenciando gradualmente el uso de detection of enzymes at the zeptomole level in
sistemas analíticos de separación miniaturizados, both open tubular capillaries and channels in
tales como la cromatografía líquida capilar y de microfabricated devices, oxidase and catalase being
columnas de pequeño diámetro (“narrow-bore”) detected at levels of 9000 molecules employing
frente a la CLAR, cromatografía en capa fina de inexpensive instrumentation.
alta resolución miniaturizada, y recientemente EC. Without any doubt, when compared to other,
Debido a que la QL puede resolver las limitacio- conventional and powerful detection modes (fluo-
nes en la detección en estos casos, resulta previ- rescence, electrochemical), CL detection is a
sible el desarrollo de este acoplamiento en la developing technique and advances are focused
próxima década. Como ejemplo, puede mencio- on the development of new detectors that are
narse un sistema descrito recientemente, basado instrumentally simpler than existing ones and that
en detección quimioluminiscente de enzimas y offer the ability to detect various types of analytes
que emplea la técnica denominada “microensayo at trace levels.
a través de electroforesis” (EMMA, electrophore-
tically mediated microassay), que permite la de-
tección de enzimas a niveles de zeptomoles, tanto FUNDAMENTALS OF
en capilares abiertos como en canales realizados CHEMILUMINESCENCE
en microchips, detectándose la oxidasa y catalasa
a niveles de 9000 moléculas y empleando una Chemiluminescence is defined as the emis-
instrumentación relativamente económica. sion of electromagnetic radiation (usually in the
Sin ninguna duda, cuando se compara con otros visible or near infrared region) produced by a
métodos de detección convencionales y potentes chemical reaction.
(fluorescentes o electroquímicos), la detección When this emission originates from living
QL es una técnica en pleno desarrollo y sus avances organisms or from chemical systems derived from
se dirigen hacia el desarrollo de nuevos detecto- it, it is named bioluminescence (BL). Both phe-
res más simples que los ya existentes y que ofrez- nomena are luminescence processes that have been
can la posibilidad de determinar varias clases de traditionally distinguished from related emissio-
analitos a niveles traza. ns by a prefix that identifies the energy source
responsible for the initiation of emission of elec-
tromagnetic radiation. Contemporary luminescence
FUNDAMENTOS DE LA QL processes have been added to the list of lumines-
cence phenomena, as can be seen in Table 1.
La QL se define como la emisión de radia- Because the emission intensity is a function
ción electromagnética (normalmente en la región of the concentration of the chemical species in-
del visible o del infrarrojo cercano) producida volved in the CL reaction, measurement of emis-
por una reacción química. Cuando esta emisión sion intensities can be used for analytical purpo-
proviene de organismos vivos o sistemas deriva- ses. An advantage of CL techniques is that it is
dos de ellos, se denomina bioluminiscencia. Ambos possible to employ rather simplified basic ins-
fenómenos son procesos luminiscentes que se han trumentation, as the optical system requires no
identificado tradicionalmente mediante un prefijo external light source. CL is often described as a
que identifica la fuente de energía responsable del dark-field technique: the absence of strong bac-
inicio de la emisión de radiación electromagnéti- kground light levels, such as found in spectro-
ca. Actualmente, los procesos de luminiscencia se photometry and fluorimetry, reduces noise sig-
han incluido en la lista de fenómenos luminiscen- nals and leads to improved detection limits.
tes, como se indica en la Tabla 1. Instrumentation for CL measurements ranges from
Como la intensidad de emisión es función de simple to very complex, that is, allowing the use
la concentración de las especies químicas impli- of a fluorometer by turning off the excitation
cadas en la reacción QL, las medidas de la inten- source, or applying the facilities offered by more
sidad de emisión pueden emplearse con fines sophisticated systems.
analíticos. Una ventaja de las técnicas QL es que However, some limitations are to be conside-
permiten emplear una instrumentación básica red in CL analysis, such as the dependence of
bastante sencilla, ya que el sistema óptico no the CL emission on several environmental fac-
requiere fuente externa de excitación. La QL se tors that hence must be controlled, the lack of
describe a menudo como una técnica de “ campo selectivity because a CL reagent is not limited to
oscuro” : la ausencia de niveles altos de luz de just one unique analyte, and finally, like other
fondo, que sí ocurren en espectrofotometría y mass flow detection approaches, since CL emis-
fluorimetría, reduce el ruido y permite mejorar sion is not constant but varies with time (light
los límites de detección. La instrumentación para flash composed of a signal increase after reagent
medidas de QL varía desde sistemas muy sim- mixing, passing through a maximum, then decli-
ples hasta instrumentación más compleja, pudién- ning to the baseline), and this emission versus
dose usar un fluorímetro simplemente con la fuente time profile can widely vary in different CL
de excitación apagada. systems, care must be taken so as to detect the
No obstante deben considerarse algunas limi- signal in flowing streams at strictly defined pe-
taciones en el análisis por QL, como la depen- riods.
dencia de la emisión quimioluminiscente de va-
rios factores ambientales que deben ser 2.1. Mechanisms of chemiluminescence reactions
controlados, la falta de selectividad, ya que un
reactivo quimioluminiscente no se limita a un In general, a chemiluminescent reaction can
único analito, y finalmente, como ocurre en otros be generated by two basic mechanisms (Figure
sistemas de detección en flujo, la emisión qui- 1). In a direct reaction, two reagents, usually a
mioluminiscente no es constante sino que varía substrate and an oxidant in the presence of some
con el tiempo (el flash de luz está compuesto de cofactors, react to form a product or intermedia-
una señal que se produce tras la mezcla de los te, sometime in presence of a catalyst. Then
reactivos, alcanza un máximo y después cae hasta some fraction of the product or intermediate will
la línea de base), y este perfil de emisión frente be formed in an electronically excited state, which
al tiempo puede variar ampliamente en diferen- can subsequently relax to the ground state with
,E
;
+
%
'
%
F +
9 0
;
&
β
49 ,
;
&
α
/E 2
;
&
γ#G
49 0
;
*9
;
#
0E
;
- -
,E
%
;
<E 0
;
.
0E
;
,E
;
7
<E
;
0E
;
+
/E
.
;
,E <
;
%
<E H
;
3&
3
;
3
'
+
&
H
;
tes sistemas quimioluminiscentes, por lo que hay emission of a photon. The substrate is the CL
que extremar el cuidado para detectar la señal en precursor, which is converted into the electroni-
sistemas en flujo, midiendo en periodos de tiem- cally excited molecule, responsible for light
po bien definidos. emission or acting as the energy transfer donor
in indirect CL. The catalyst, enzyme or metal
2.1. Mecanismos de las reacciones QL ion, reduces the activation energy and provides
an adequate environment for producing high CL
En general, una reacción QL puede generarse efficiency of the process. Cofactors sometimes
mediante dos mecanismos básicos (Figura 1). are necessary to convert one or more of the subs-
En una reacción directa, dos reactivos, normal- trates into a form capable of reacting and inte-
mente un substrato y un oxidante en presencia racting with the catalyst, or to provide an effi-
de algunos cofactores, reaccionan para formar cient leaving group if bond cleavage is required
un producto o intermedio de la reacción, algunas to produce the excited emitter. On the contrary,
veces en presencia de un catalizador. Después, indirect or sensitised CL is based on a process of
parte del producto o intermedio pasa a un estado transfer of energy of the excited specie to a fluo-
electrónicamente excitado, que puede a continua- rophore. This process makes it possible for tho-
ción relajarse hasta el estado fundamental con se molecules that are unable to be directly invol-
emisión de un fotón. El substrato es el precursor ved in CL reactions to transfer their excess of
QL, que se convierte en la molécula excitada energy to a fluorophore that in turn is excited,
electrónicamente, responsable de la emisión de releasing to its ground state with photon emis-
luz, o bien actúa para transferir la energía en la sion. All of these paths lead to a great variety of
QL indirecta. El catalizador, enzima o ion me- practical uses of CL in solid, gas and liquid phases.
tálico, reduce la energía de activación y propor-
ciona el ambiente adecuado para la producción 2.2. Requirements for chemiluminescence emission
de una alta eficiencia QL durante el proceso.
Los cofactores son necesarios en ocasiones para For a chemical reaction to produce light, it
convertir uno o más de los substratos en una should meet some essential requirements:
forma capaz de reaccionar e interaccionar con el a) the reaction must be exothermic to produ-
catalizador, o para proporcionar un grupo “ sa- ce sufficient energy to from the electronically
liente” eficaz cuando se requiere un marcado para excited state. In this sense, for CL to occur the
producir el emisor excitado. Por el contrario, la energetic requirements can be established in ter-
QL indirecta o sensibilizada se basa en un pro- ms of ∆G (Kcal.mol-1 ):
ceso de transferencia de energía de la especie
excitada a un fluoróforo. En el caso de molécu-
hc 2.86. 10 4
las que no pueden emitir directamente QL, este - ∆G ≥ =
proceso permite transferir su exceso de energía λ ex λ ex
a un fluoróforo que a su vez es excitado, vol-
viendo a su estado fundamental con la emisión where λex is the long-wavelength limit (nano-
de un fotón. Todas estas etapas dan lugar a una meters) for excitation of the luminescent spe-
gran variedad de aplicaciones prácticas de la QL cies. Because most of the CL reactions produce
en la fase sólida, líquida y gaseosa. photons in the range 400 (violet) – 750 (red) nm,
A + B + (Cofactores)
(precursor (oxidante)
quimioluminiscente)
catalizador
(Intermediario o
P* Producto)
QUIMIOLUMINISCENCIA QUIMIOLUMINISCENCIA
DIRECTA SENSIBILIZADA O DE
TRANSFERENCIA DE ENERGÍA
F
P + hν P + F*
F + hν
c) La selectividad y la linealidad son más intensity will be directly related to the analyte
dependientes de la reacción y de las condiciones concentration.
de reacción escogidas. Como ocurre con los pro- f) CL reactions can be easily coupled as
cesos fotoluminiscentes, la absorción o emisión detection technique in chromatography, capilla-
de radiación por el analito, producto o cofacto- ry electrophoresis or immunoassay, providing
res, pueden causar pérdida de linealidad o inter- qualitative or quantitative information of a large
ferencias espectrales. variety of species in the gas and liquid phases.
d) La técnica es versátil para la determina-
ción de una amplia variedad de especies que As an empirical rule, CL behavior may be
pueden participar en el proceso quimioluminis- predicted in the case a compound or its deriva-
cente, como: substratos o precursores quimiolu- tization product show fluorescence properties. It
miniscentes responsables del estado excitado; el is possible that oxidation of such a specie may
reactivo necesario para la reacción (normalmen- produce CL, but there are many exceptions to
te un oxidante); algunas especies que afectan la this general rule.
velocidad o la eficacia de la reacción: activado-
res, como catalizadores (enzimas o iones metá-
licos), o inhibidores, como reductores que dis- MAIN LIQUID-PHASE CL REACTIONS
minuyen la emisión quimioluminiscente;
fluoróforos en el caso de QL sensibilizada; algu- 3.1. Acyl Hydrazides
nas especies que no están directamente implica-
das en la reacción QL pero que pueden reaccio- The best know example in direct reactions is
nar con otros reactivos en reacciones acopladas the oxidation of luminol (5-aminophthalylhydra-
para generar un producto que es un reactivo en zide) in alkaline medium, to produce excited 3-
la reacción QL; especies que pueden formar aminophthalate ion (Figure 2). Oxidants such as
derivados con algún precursor quimioluminiscente permanganate, hypochlorite, or iodine can be used
o fluoróforo, determinándose mediante QL di- but most useful is hydrogen peroxide. The reac-
recta o sensibilizada. tion is catalysed by metal ions (Fe(II), Cu(II),
e) Dependiendo de la naturaleza del analito y Co(II), amongst others), ferricyanide or some
de la reacción QL, el incremento o disminución metallocomplexes (hemin, haemoglobin and pe-
de la intensidad de QL estará directamente rela- roxidases). In this sense, this reaction has been
cionada con la concentración de analito. applied for the determination of catalysts such
f) Las reacciones quimioluminiscentes pue- as metal ions or enzymes (peroxidases, hematic
den acoplarse fácilmente como método de detec- compounds, etc.), certain oxidants, inhibitors or
ción en cromatografía, EC o inmunoensayo, pro- substances that are easily oxidised and are deter-
porcionando información cualitativa o cuantitativa mined indirectly measuring the decreased CL
sobre una gran variedad de especies en las fases emission. Also, luminol has been extensively used
gaseosa y líquida. in medico-legal investigations in presumptive tests
Como regla empírica, es probable que un to detect trace quantities of blood which are not
compuesto exhiba QL cuando él o su producto visible to the naked eye, e.g., areas intentionally
derivado muestren propiedades fluorescentes. Es wiped clean of blood, washed clothes, dark sur-
posible que la oxidación de tal especie produzca faces, etc. [2 ]. In fact, the application of fresh
QL, aunque hay muchas excepciones a esta regla luminol by spraying -after allowing the previous
general. applications to dry- can reactivate the lumines-
cence, and hematin can be detected in a dilution
of 1:108.
PRINCIPALES REACCIONES CL
EN FASE LÍQUIDA 3.2. Imidazoles
dihidro-1,4-ftalazinediona) en medio alcalino, para cyanoferrate (III) and O2, in aqueous alkaline
producir el ión 3-aminoftalato excitado (Figura medium, to the hydroperoxide, from which exci-
2). Pueden utilizarse varios oxidantes, tales como ted state diaroylarylamidines are formed via a
el permanganato, hipoclorito o yodo, aunque el dioxetane structure that then emits light (Figure
más usado es el peróxido de hidrógeno. La reac- 3) [3 ]. Determination of Co(II), Cr(III), Cu(II),
ción es catalizada por iones metálicos (Fe(II), Fe(CN)63-, MnO4-,ClO-, amongst others have been
Cu(II), Co(II), entre otros), ferricianuro o algu- carried out using this system. Recently, hydroxyla-
nos metalocomplejos (hemina, hemoglobina y mmonium chloride was found to enhance the CL
peroxidasas). Esta reacción ha sido aplicada en emission of the lophine-Co(II)-H2O2 system, allo-
la determinación de iones metálicos que actúan wing a very sensitive determination of Co(II)
como catalizador, enzimas (peroxidasas, compues- [4 ].
tos hemáticos, etc), ciertos oxidantes, inhibido-
res o sustancias que son fácilmente oxidables y 3.3. Acridinium esters
que son determinadas indirectamente por la dis-
minución de emisión quimioluminiscente. Tam- Lucigenin (10,10'-dimethyl-9,9'-biacridinium
bién el luminol se ha usado ampliamente en in- nitrate) is one of the more efficient CL substan-
vestigaciones criminales para detectar cantidades ces which emits an intense green emission when
trazas de sangre, que no son visibles a simple oxidised in an alkaline medium [5 ]. Other acri-
vista, tales como restos de sangre seca incluso dinium derivatives have been shown to produce
con varios años de antigüedad, en ropas lavadas, CL emission upon hydrogen peroxide oxidation
superficies intencionadamente limpiadas, super- of aqueous alkaline solutions. The main reaction
ficies oscuras, etc. [2 ]. De hecho, la aplicación product is N-methylacridone, acting as an active
de un spray con luminol sobre la superficie a intermediate in the mechanism proposed by Rauhut
investigar puede producir una luminiscencia ca- et al. [6 , 7 ] (Figure 4). Due to the reaction
paz de detectar hematina a dilución de 1:108. product being water-insoluble, the addition of a
small amount of a surfactant, such as sodium
3.2. Imidazoles dodecyl sulphate, prevents precipitation [8 ]. The
application of this reaction has permitted the
La lofina (2,4,5-trifenilimidazol) es el precursor determination of several ions, oxidants or reduc-
quimioluminiscente más representativo de estos tors, such as ascorbic acid [9 ].
O O
o2 N o2
NH
NH OH N
O NH2 O
NH2
O O
+ N2 + h
O N O ( = 425 nm)
O N O
NH 2 O O
NH2
compuestos. Cuando la lofina es oxidada, en medio 3.4. Tris (2,2’-bipyridine) ruthenium (III)
básico, por peróxido-hipoclorito o peróxido-
hexacianoferrato (III) y O2 a hidroperóxido, a Another CL system frequently applied invol-
partir del cual se forman diaroilarilamidinas en ves the use of Ru(bpy)32+ which produces an orange
estado excitado a través de una estructura de emission at 610 nm from excited state
dioxetano, que es la responsable de la emisión [Ru(bpy)32+]* that can be obtained by different
de la luz (Figura 3) [3 ]. Utilizando este sistema reactions which imply electron transfer and re-
se ha llevado a cabo determinaciones de Co(II), generation of the Ru(bpy)32+ species:
Cr(III), Cu(II), Fe(CN)63-, MnO4-, ClO-, entre otros. * By reaction of Ru(bpy)33+ and Ru(bpy)3+
Recientemente, se ha encontrado que el cloruro Ru(bpy)33+ + Ru(bpy)3+ ? [Ru(bpy)32+]*
de hidroxilamonio aumenta la emisión quimio- * By reaction of Ru(bpy)3+ with certain
luminiscente del sistema lofina-Co(II)-H2O2, per- oxidants
mitiendo una determinación muy sensible de Co(II) Ru(bpy)3+ + ox ? [Ru(bpy)32+]* + ox_
[4 ]. * By reaction du Ru(bpy)33+ with cer-
tain reductants
3.3. Ésteres de acridinio Ru(bpy)33+ + red ? [Ru(bpy)32+]* + red+
For these reactions the CL intensity is linear-
La lucigenina (nitrato de 10,10’ -dimetil-9.9’ - ly proportional to the concentration of any of the
biacridinio) es uno de los compuestos quimiolu- reagents, allowing their determination by suita-
miniscentes más eficientes, que emite una inten- ble adjustment of the remaining reagent concen-
sa luz verde cuando se oxida en medio básico trations. The solvent usually applied in CL de-
[5 ]. Otros derivados del acridinio producen terminations based on these reactions include
emisión quimioluminiscente al ser oxidados por acetonitrile-water, methanol-water and acetone-
peróxido de hidrógeno en disolución acuosa al- water [10 ]. Recently, the higher CL emission
calina. El producto final de la reacción es la N- generated by a similar complex, Ru(phen)32+ (phen
metilacridona, que actúa como intermediario activo = 1,10-phenanthroline) during oxidation of
en el mecanismo propuesto por Rauhut y col.[6 , Ru(phen)32+ by Ce(IV) in sulphuric acid medium
7 ] (Figura 4). Debido a que este producto es was investigated, allowing the establishment of
insoluble en agua, la adición de pequeñas canti- a CL method for the analysis of nucleic acids,
dades de un surfactante, tal como dodecilsulfato which enhances the CL emission [11 ].
sódico puede utilizar para evitar la precipitación
[8 ]. La aplicación de esta reacción ha permitido
H
N O2 N
N KOH H O O
N
¨
N N̈
O O O O* h
N N
( = 525 nm)
CH 3 CH3
N + N
H 2O2
O
O
NaOH
+
N N
CH 3 CH 3
CH 3 CH 3
N N
+ * h ( = 470 nm )
O O
* Por reacción de Ru(bpy)33+ y Ru(bpy)3+ phore, donating one electron to the intermediate
Ru(bpy)33+ + Ru(bpy)3+ → [Ru(bpy)32+]* [12 ]. This electron is transferred back to the
*Por reacción de Ru(bpy)3+ con ciertos oxi- fluorophore raising it to an excited state and li-
dantes berating light characteristics typical for the fluo-
Ru(bpy)3+ + ox → [Ru(bpy)32+]* + ox- rophore nature (Figure 5). Bis-(2,4,6,-
trichlorophenyl)oxalate (TCPO) and bis-
*Por reacción de Ru(bpy)33+ con ciertos re- (2,4-dinitrophenyl)oxalate (DNPO) are commonly
ductores used oxalates. The main disadvantage of this
Ru(bpy)33+ + red → Ru(bpy)33+ + red+ system resides in the insolubility of the above-
mentioned compounds in water and their insta-
Para estas reacciones la intensidad de QL es bility towards hydrolysis, which requires the use
linealmente proporcional a la concentración de of organic solvents such as acetonitrile, dioxane,
cualquiera de los reactivos, lo que permite su tert-butanol and ethyl acetate. This reaction can
determinación ajustando adecuadamente la con- be used to determine a great number of species
centración de los restantes reactivos que intervie- such as hydrogen peroxide, compounds that are
nen en ella. Los disolventes que se utilizan en las highly fluorescent (e.g. polycyclic aromatic hydro-
O O O O O O F
R O C C O R + H2O2 R O C C O OH C C
O O
O O
C C F .
+ F+ h
F* + 2 CO2
O O .- Cl NO2
R: Cl R: NO2
F: fluoróforo Cl
TCPO (pH = 5 - 9) DNPO (pH < 3.5)
rasa muestre su actividad. Un detallado esquema or if the analyte itself has a typical structure that
se muestra en la Figura 6. Considerando la es- might be fluorescent, there is a possibility that
tequiometría de la reacción, por cada molécula oxidation of the analyte will produce CL emis-
de ATP consumida se emite aproximadamente sion. Some of the first applications were the CL
un fotón. Esta propiedad, junto con la alta espe- determination of morphine [24 ], buprenorphine
cificidad de la enzima por el nucleótido, hacen hydrochloride [25 ] and the benzodiazepine lo-
que esta reacción sea un sistema analítico ideal prazolam [26 ], using a flow injection analysis
para detectar la presencia de ATP, su produc- (FIA) assembly. In these cases, the sample con-
ción o consumo, que depende de la actividad taining the drug was injected into a phosphoric
enzimática y para cuantificar substratos relacio- acid stream that was subsequently merged with
nados con el metabolismo del ATP. La detec- the oxidant stream, offering an extremely sim-
ción de ATP es una alternativa para detectar la ple, economic and effective experimental proce-
contaminación por microorganismos, residuos en dure. Since then, a wide range of such reactions
alimentos o restos de contacto humano en super- have been reported mainly in the analysis of drugs
ficies. Este sistema se emplea en el ámbito de la [27 ]. Sensitizers, micellar media or catalysts can
gestión y garantía de la calidad para aumentar la be added to these systems in order to enhance
higiene de los alimentos [15 ] y en otros campos, the CL emission. As example, penicillamine [28 ],
tales como en control de calidad ambiental [16 ], tiopronin [29 ] and cefadroxil [30 ] have been
en el seguimiento de plantas de lodos y aguas determined in presence of quinine sulphate; fo-
residuales [17 ], en la industria farmacéutica y lic acid [31 ], captopril [32 ], hydrochlorothiazi-
de cosméticos [18 , 19 ], en la calidad y vitalidad de [33 ], phenothiazines [34 ] or furosemide [35 ]
de la biomasa implicada en procesos de fermen- using rhodamines 6G or B and hydrazine in pre-
tación [20 ], en la contaminación bacteriana de sence of dichlorofluoresceine [36 ]. Quinine sul-
áreas estériles o en el deterioro de obras artísti- phate and Rhodamine 6G were simultaneously
cas por microorganismos[21 ]. Se han comercia- used for the determination of tiopronin [37 ]. Also,
lizados varios kits de reactivos, para usarlos di- in the presence of the cationic surfactant cetyl-
rectamente en el sistema adecuado mediante trimethyl ammonium bromide (CTAB), tetracycli-
instrumentos portátiles con este fin [22 ]. ne was determined with high sensitivity [38 ].
These reactions have been mainly applied to
3.7. Oxidaciones directas developed CL-based flow injection methods.
FIGURA 6.- Representación esquemática de la reacción de la luciferasa de luciérnaga. ATP, trifosfato de adenosina;
PPi, pirofosfato; AMP, monofosfato de adenosina.
FIGURE 6.- Schematic representation of the firefly luciferase reaction. ATP, adenosine triphosphate; PPi,
pyrophosphate; AMP, adenosine monophosphate.
CO2
Luciferasa Luciferasa
LIGHT
(OL)
(LH2 )
Forma oxidada de la
Forma reducida de
oxiluciferina
la D-luciferina
produzca emisión de QL. Algunas de las aplica- mentation for these measurements is named a
ciones de estos últimos sistemas han sido la luminometer. One of the most important advan-
determinación quimioluminiscente de morfina tages of CL as analytical technique is the simpli-
[24 ], hidrocloruro de buprenorfina [25 ] y la city of this instrumentation, which includes as
benzodiazepina loprazolam [26 ] mediante análi- principal components: a reaction cell, a light-
sis por inyección en flujo (FIA). En estos casos, tight housing, a device for introducing and mixing
la muestra conteniendo el fármaco se inyectaba the reagents and/or the sample, a light detector
en el canal por donde circula una disolución de and an acquisition and signal processor system
ácido fosfórico que posteriormente se mezclaba (Figure 7). In the housing a sample chamber
con el oxidante, proporcionando un procedimiento holds the reaction cell (a test tube, a microplate,
sumamente simple, económico y efectivo. Desde a flow-cell, etc.) in order to present the lumines-
entonces, un gran número de este tipo de reac- cencing sample to the detector. This chamber
ciones han sido publicadas, principalmente en el must be sealed from ambient light to minimize
análisis de fármacos[27 ]. Para aumentar la emi- potential interferences and it must be positioned
sión de QL se han añadido a estos sistemas sen- as close to the detector as possible to maximize
sibilizadores, medios micelares o catalizadores. optical efficiency. Additional mirrors, lenses,
Como ejemplos podemos citar la determinación and other devices can be used to increase the
de penicilamina [28 ], tiopronina [29 ], cefadroxil angle of collection and to obtain high optical
[30 ] en presencia de sulfato de quinina; ácido efficiency which is desirable for an optimum
fólico [31 ], captopril [32 ], hidroclorotiazida [33 ], signal-to-noise ratio, allowing rapid and precise
fenotiazinas [34 ] o furosemida [35 ] usando ro- measurements. The function of the housing is to
daminas 6G o B e hidracina en presencia de maintain the mixture of sample and CL reagents
diclorofluoresceína [36 ]. El sulfato de quinina y at an adequate temperature and in the complete
la rodamina 6G se han utilizado conjuntamente dark in order to isolate the external light from
para la determinación de tiopronina [37 ]. Tam- the detector. Usually no monochromator is re-
bién, en presencia de un surfactante catiónico, quired because the CL intensity arises from one
bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) se ha species and other substances would hardly affect
determinado tetraciclina con una alta sensibili- the spectral distribution of the light emitted.
dad [38 ]. Todas estas reacciones han sido apli- In CL techniques, after mixing of the rea-
cadas principalmente a métodos por inyección gents and the sample, the CL reaction starts and
en flujo con detección quimioluminiscente. the emission intensity is being produced, decrea-
sing once the reactants are consumed. This im-
plies a transient character of the CL emission, of
INSTRUMENTACIÓN BÁSICA which the time scale depends on the specific
reaction, and which can range from a short flash
La medida de la luz emitida por una reacción to a continuous glow. This fact is crucial for the
química o bioquímica está relacionada con la selection of the most convenient systems of re-
concentración de las especies participantes: la agent addition.
producción total de luz está directamente rela-
cionada con la cantidad de luz emitida y, conse- 4.1. Introduction of sample and reagents
cuentemente, es proporcional a la concentración
de la especie concreta. Por esta razón, la medida Depending on the configuration of the device
de luz emitida es un indicador de la cantidad de and the method for sample and reagents intro-
analito presente y al instrumento básico que es duction, it is possible to classify the systems into
capaz de realizar estas medidas se le llama lumi- static (batch or discrete sampling instrument) or
nómetro. Una de las ventajas más importantes flowing streams.
de la QL como técnica analítica es la simplici- In static systems, discrete portions of the CL
dad de la instrumentación, que incluye como reagent and the sample are mixed rapidly in the
componentes principales: una célula de reacción, reaction cell, often at a controlled temperature.
un compartimento cerrado a la luz, un dispositi- Usually the final reagent which initiates the CL
vo de inyección y mezcla de reactivos y/o de reaction is added with a syringe or using an
muestra, un detector de luz y un sistema de ad- automatic injector in order to provide a more
quisición y procesador de señal (Figura 7). En reproducible injection speed and volume and a
el compartimento cerrado se coloca la célula de synchronization of data collection in relation to
reacción (un tubo de ensayo, un microplato, una the initiation of the reaction. Mixing of sample
célula de flujo, etc.) con objeto de que toda la and reagents is provided by the force of injec-
luminiscencia sea captada por el detector. Este tion, although a magnetic stirring bar and stirrer
compartimento debe estar sellado a luz ambien- can be used. In this case, the whole CL intensity
tal para evitar posibles interferencias y se debe vs. reaction time profile is monitored. Depen-
colocar tan cerca como sea posible del detector ding on the situation, the analytical signal can be
para conseguir una máxima eficiencia óptica. taken as the maximum CL intensity (peak heig-
Espejos, lentes y otros dispositivos adicionales ht), the signal after some fixed delay time from
se pueden utilizar para aumentar el ángulo de the point of mixing, the integral of the signal
detección y conseguir una alta eficiencia óptica, over some time period, or the integral of the
al objeto de obtener una relación señal-ruido entire peak (full area). All of these are correla-
óptima; así, se obtiene un instrumento rápido y ted with the analyte concentration. This appro-
preciso. La función del compartimento es man- ach is used in selective reactions in solution phase
tener la mezcla de reactivo y muestra, a una showing high quantum yields or long time emis-
temperatura adecuada y en completa oscuridad a sion, such as bioluminescent reactions, CL im-
fin de aislar el detector de la luz externa. Nor- munoassay or nucleic acid assays.
malmente no es necesario el uso de monocroma- Continuous flow CL systems are used in gas-
dores porque la intensidad de QL que surge de phase and solution-phase reactions. The sample
una de las especies no se ve apenas afectada en and the CL reagents are continuously pumped
su distribución espectral, por la presencia de otras and mixed together using a merging zones flow-
especies. injection manifold and sent to a flow-cell or mixed
ALOJAMIENTO
SISTEMA DE INTRODUCCIÓN
DE MUESTRA Y REACTIVOS
CÉLULA DE REACCIÓN
FUENTE DE ALTO
CÁMARA DE VOLTAJE
MUESTRA
En las técnicas de QL, una vez mezclados los and the emission observed in an integral reactor-
reactivos y la muestra comienza la reacción qui- flow cell. The signal is observed when the cell
mioluminiscente y la intensidad de la emisión is totally filled with the reaction mixture, at a
que se está produciendo, disminuye una vez que fixed period after mixing. In this case, it is possible
los reactantes se han agotado. Esto supone que to obtain a constant and reproducible signal, easier
el carácter de la emisión quimioluminiscente es to measure, which represents the integrated output
transitorio, y que la escala de tiempo depende de over the residence time of the reaction mixture
la reacción en cuestión, que va de un corto flash in the cell. Optimum sensitivity is achieved by
a una emisión continua. Este hecho es crucial adjusting the flow rate, the observation cell vo-
para la selección del sistema más conveniente lume and transfer channel volumes, with the aim
para la incorporación de los reactivos. of the observed portion of emission profile oc-
curring at the maximum of the CL intensity vs.
4.1. Introducción de la muestra y los reactivos time profile. As disadvantages of this approach
are to be mentioned the high reagent consumption,
Dependiendo de la configuración del disposi- the fact that no kinetic information is obtained
tivo y del método de introducción de muestra y and that only a very small portion of the total
reactivos, los sitemas pueden clasificarse en: CL intensity is measured for slow reactions.
estáticos (introducción de cantidades discretas de In the flow injection mode, the analyte ca-
reactivos y muestra en un recipiente) o sistemas rrier stream and the reagent stream flow conti-
en flujo. nuously; the sample containing the analyte is
En los sistemas estáticos, pequeñas porciones injected and the carrier transports it into the reac-
de muestra y reactivo CL se mezclan rápidamen- tion and detection zone. The signal is acquired
te en la cubeta de reacción, frecuentemente a as a narrow peak, which corresponds to the por-
temperatura controlada. Normalmente el reacti- tion of analyte passing though the cell. Depen-
vo final que inicia la reacción CL se adiciona ding of the situation, it is possible to inject not
con una jeringa o usando un inyector automático only the sample, but also other CL reagents, e.g.,
para conseguir una velocidad y volumen de in- in the case of more expensive chemicals. This
yección más reproducibles y una mejor sincroni- methodology shows as advantage the low con-
zación de la adquisición de datos desde el inicio sumption of analyte or CL reagents and the smaller
de la reacción. La mezcla de los reactivos y la volume of the cell, so as to prevent excessive
muestra se produce por la fuerza de la inyec- dilution; the signal is highly reproducible and
ción, aunque a veces, se puede utilizar un agita- precise because it corresponds to the height of
dor magnético. En estos casos, se registra la curva the peak; moreover it is possible -in given cases-
completa de intensidad de emisión de QL en to adapt on-line chemical treatments to improve
función del tiempo de reacción. Dependiendo de selectivity (Figure 8).
la situación, la señal analítica puede ser tomada
como la intensidad máxima de QL (altura máxi- 4.2. Reaction cell
ma del pico), la señal después de un tiempo fi-
jado desde el momento de la mezcla, la integral Depending on the CL reaction that is carried
de la señal en un determinado periodo tiempo o out in the liquid, solid or gas phases it is possi-
la integral del pico completo (el área completa). ble to use different reaction cells, being the es-
En cualquiera de los casos, las medidas estarán sential requirement for their design that the
relacionadas de manera lineal con la concentra- maximum intensity must be reached while the
ción de analito. Esta técnica se usa en reacciones stream containing the analyte and the CL rea-
selectivas en disolución que muestran un alto gent is in front of the detector. It is a very
rendimiento cuántico o un largo tiempo de emi- critical variable because both in static and flow
sión, como las reacciones bioluminiscentes, el methods the magnitude of the CL intensity is
inmunoensayo quimioluminiscente o ensayos de proportional to the volume of the cell. Usually
ácidos nucleicos. it is possible to apply any material that transmits
Los sistemas de QL en flujo continuo se usan light in the visible range and that is compatible
en reacciones en disolución y en fase gaseosa. with the sample, such as glass, quartz or even
La muestra y los reactivos son continuamente acrylic or other plastics. Polystyrene is not re-
bombeados y mezclados a través de un conector, commended because it can build up static elec-
en donde se produce la mezcla, que está muy tricity which may contribute to elevated back-
próximo a la célula en donde se realiza la detec- ground levels. More transparent cell materials
ción. La señal se observa cuando la célula está allow more light to reach the detector, resulting
totalmente llena con la mezcla de reacción, a un in better detection limits.
tiempo predeterminado después de la mezcla. En In the case of flow CL measurements in the
estos casos, es posible obtener una señal cons- liquid phase, the cell design most frequently used
tante y reproducible muy fácil de medir, y que is a long spiral cell (about 1 cm) which is loca-
representa la emisión total de la mezcla de reac- ted as close to the detector as possible. The large
ción durante el tiempo que está en la célula. El volume is required due to the need to collect a
óptimo de sensibilidad se consigue ajustando la greater amount of emitted light and because the
velocidad de flujo y el volumen entre el punto thin size required (50-100 µm) minimizes band
de mezcla y el punto de observación con objeto broadening and provides a thin optical path to
de conseguir el perfil máximo de intensidad CL reduce inner filtering effects of the CL emission.
en función del tiempo. Como desventajas de esta With the purpose to minimize sample dispersion,
técnica destacan el alto consumo de reactivo, el usually the injection valve and the cell must be
hecho de que no se obtenga ninguna informa- placed as close to one another as possible.
ción cinética y que solamente una pequeña por-
ción de la intensidad de QL total es la que se 4.3. Detector
mide cuando las reacciones son lentas.
En el modo de inyección de flujo, el analito There are four basic requirements for the
se incorpora a una disolución portadora, el reac- detector, which constitutes the critical part of
tivo va por una línea aparte y fluye constante- the luminometer [2]:
mente; la muestra es inyectada en la disolución a) it must be able to detect a light signal over
portadora y a través de conectores o válvulas se several orders of magnitude of intensity (from
mezcla con el reactivo, para producir la reacción just a few photons per second to tens of millions
de QL, muy cerca de la zona de detección. En of photons per second),
estas condiciones, la señal se obtiene como un b) it must be sensitive at least over the spec-
pico estrecho que se corresponde con la alícuota tral range 400-600 nm, and ideally over the com-
de analito inyectada. Dependiendo de la situa- plete range of the visible spectrum (i.e. 380-750
ción, es posible llevar a cabo, no sólo la inyec- nm) and even into the UV and IR regions. If its
ción de muestra sino que también, en el caso de sensitivity varies with wavelength, as is usually
que los reactivos quimioluminiscentes sean ca- the case, then it must be possible to correct the
ros, incorporarlos del mismo modo que la mues- data for this,
tra, con objeto de evitar un consumo grande de c) the signal output presented by the detector
los mismos. Esta metodología tiene la ventaja de should be directly related to the light intensity
un bajo consumo, tanto de muestra como de reaching it, ideally linearly over the entire sen-
reactivos y la utilización de una célula de menor sitivity range. The signal from the detector should
volumen, evitando así una dilución excesiva; la be produced in a form which can be easily dis-
señal es muy reproducible y precisa ya que se played, recorded, and analyzed,
puede conseguir que se corresponda con la máxima d) the speed of response of the detector must
altura del pico; además, es posible - en algunos be much faster than the rate of the CL reaction,
casos- incorporar tratamientos químicos “ on line” if the signal output is not to be a distorted ver-
para alcanzar una mayor selectividad (Figura 8). sion of the true signal.
FIGURA 8.- Diagrama esquemático de un dispositivo FIA para el análisis de glucosa incorporando un reactor
enzimático con detección basada en la reacción del luminol.
FIGURE 8.- Schematic diagram for an FIA manifold for the analysis of glucose incorporating an enzymatic reactor
with detection based on the luminol reaction.
Glucosa
ml/min
Tampón 1.5
Reactor
[Fe(CN)6]3- 1.5 Enzimático D
Luminol 1.5
Detector
to-reactivo quimioluminiscente esté frente al tant. There are two different configurations for
detector. Es una variable muy crítica porque tan- PMTs depending on their position in relation to
to en los métodos estáticos como los de flujos, the reaction cell: either to the side (“ side-on”
la magnitud de la intensidad de QL es propor- configuration) or underneath the reaction cell
cional al volumen de la célula. Normalmente, es (“ end-on” configuration). Side-on PMTs are usua-
posible usar cualquier material que sea transpa- lly more economical than end-on models and their
rente a la luz en la región del visible y que sea vertical configuration takes up less space than
compatible con la muestra, tales como vidrio, the end-on versions. However, end-on PMTs have
cuarzo, plástico acrílico u otros. El poliestireno a large photocathode area and offer a greater
no es aconsejable, porque adquiere con mucha uniformity of light collection and of the respon-
facilidad electricidad estática y puede producir se [41 ].
una señal alta de fondo. Las células construidas Other detection modes in bright CL or BL
con los materiales más transparentes permiten la reactions are multichannel detectors, which pro-
llegada de una mayor cantidad de luz al detec- vide simultaneous detection of the dispersed ra-
tor, consiguiéndose con ello unos mejores lími- diation and produce a permanent image of a wide
tes de detección. area. Photographic films or plates are emulsions
En el caso de los métodos de inyección en that contain silver halide crystals in which inci-
flujo, el diseño más frecuente de la célula es en dent photons produce stable clusters of silver atoms
espiral (de aproximadamente 1 cm), colocándose within the crystals. Internal amplification is pro-
lo más cerca posible del detector. Para minimizar vided in the development process by an electron
el ensanchamiento de banda y reducir los efectos donor which reduces the remaining silver ions to
de filtro interno en la emisión de QL se necesita silver atoms within the exposed crystals. A com-
que la célula tenga un grosor pequeño (50-100 ?m plexing agent is used to remove the unexposed
) y una superficie relativamente grande ya que la silver ions. The photographic detection is an
cantidad de luz emitida es directamente propor- integrating process in that the output (density of
cional al volumen de la misma. Con objeto de silver) is a result of the cumulative effect of the
reducir la dispersión de la muestra, generalmente entire incident radiation during the exposing time.
la válvula de inyección y la célula se deben colo- The image is constituted by many thousands of
car tan cerca una de otra como sea posible. grains on each square cm of film, being neces-
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PRINCIPALES APLICACIONES
QUIMIOLUMINISCENTES
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