Técnicas de caracterización: HPLC e IR

1. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN: HPLC E IR

El constante incremento en las aplicaciones de proteínas en diversos campos como la

medicina, el medio ambiente y la industria alimentaria; va generado un interés especial en

el desarrollo de procesos para el análisis y purificación de proteínas. La cromatografía de

líquidos ha sido ampliamente explotada para llevar a cabo dichos análisis debido a su

versatilidad. [ CITATION May12 \l 9226 ].

Por otro lado, también encontramos la preocupación por la calidad y la seguridad

alimentaria que han aumentado debido a las crisis alimentarias surgidas. Los métodos

basados en la espectroscopia infrarroja por su naturaleza no destructiva, su rapidez y su no

especificidad, se presentan como una alternativa prometedora para garantizar la calidad y

seguridad de los alimentos y para detectar rápidamente cualquier alteración en la

composición de los mismos.[ CITATION Tél19 \l 9226 ]

Por estos motivos, y con el objetivo de conocer el estado del arte de las técnicas, se

seleccionan artículos de investigación recientes que engloban diferentes modalidades de

cromatografía, variedad de matrices de analitos, análisis estadísticos utilizados y

caracterizaciones utilizando la espectrometría infrarroja, además de conocer un poco más

de los fundamentos teóricos de estas dos técnicas.

Por ejemplo, Ana Belščak-Cvitanović y compañeros , evaluaron la calidad bioactiva de los

extractos de plantas medicinales mediante el uso HPLC logrando separar 24 compuestos

polifenólicos, característicos de una especie vegetal [ CITATION Ana17 \l 9226 ] , mientras que

Rongi Li e investigadores utilizaron la espectroscopia de infrarrojo cercano para la

determinación rápida y simultánea de doce componentes en frutos y semillas de A.

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oxyphylla. , modelando por medio de regresión de mínimos cuadrados parciales [ CITATION

Ron201 \l 9226 ], Téllez, demostró que al unir la técnica de infrarrojo con el tratamiento

quimiométrico de los datos espectroscópicos, estas presentaban ventajas respecto a los

métodos tradicionales [ CITATION Tél191 \l 9226 ]; Bouhzam, estimo la humedad y la actividad

de agua, realizando un análisis de regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS-R) con

validación cruzada mediante el PLS Toolbox de Matlab.[ CITATION Ibt20 \l 9226 ].

1.1 Fundamentos Teóricos del HPLC, IR

1.1.1 HPLC

Desde que fue descubierta por Mijaíl Tsvet en 1903, la cromatografía ha experimentado un

aumento paulatino en lo que a su aplicabilidad se refiere, aunque el verdadero auge de la

técnica surgió a partir de la década de 1980. La cromatografía líquida de alta resolución,

anteriormente conocida como cromatografía líquida de alta presión, es una técnica de la

química analítica que se utiliza para separar, identificar y cuantificar cada componente de

una mezcla. Se basa en bombas para hacer pasar un disolvente líquido que generalmente es

una mezcla de disolventes “fase móvil”, presurizada en la mezcla de muestra a través de

una columna llena de un material adsorbente sólido[ CITATION Che19 \l 9226 ]. Cada

componente de la muestra interactúa de forma ligeramente diferente con el material

adsorbente, provocando diferentes velocidades de flujo para los diferentes componentes y

provocando la separación de los componentes a medida que fluyen fuera de la columna. El

componente activo de la columna, el adsorbente, es típicamente un material granular hecho

de partículas sólidas, de 2 a 50 micrómetros de tamaño. Su composición y temperatura

juegan un papel importante en el proceso de separación al influir en las interacciones que

tienen lugar entre los componentes de la muestra y el adsorbente. Estas interacciones son de
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naturaleza física, tales como hidrófobas, dipolo-dipolo e iónicas, la mayoría de las veces

una combinación.

Existen varios tipos de cromatografía dentro de los que se encuentra la cromatografía de

intercambio iónico que separa las moléculas con base a su carga iónica neta, se lleva a cabo

con empaques de columna que tiene grupos funcionales cargados unidos a una matriz

polimérica. Otro tipo de cromatografía es la de gases en este caso la fase móvil es un gas

inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido o un líquido “sostenido” por un

sólido inerte, este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera

de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. Este tipo

de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de

separación. La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa uniforme

de un absorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte; la fase estacionaria

será un componente polar y el eluyente será menos polar para permitir la separación de los

analitos en la cual los más polares van a desplazarse con mayor facilidad. (Elsa Lundanes,

2013) La cromatografía de permeación en gel también conocida como de exclusión,

consiste en una columna cromatografía empacada de tal manera que las partículas de dicho

empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el fin de que las

moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su forma, tamaño y no en el

peso molecular.[ CITATION Ang19 \l 9226 ]

Teniendo claras las nociones básicas del funcionamiento y principios de la cromatografía

líquida de alto rendimiento se pueden revisar aquellos criterios indispensables para realizar

la separación de una mezcla de analitos. En Introduction to modern liquid chromatography

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(Snyder et ál., 2010), el autor propone un método para seleccionar las condiciones de

separación que provea el mejor resultado en el análisis de las muestras. Este método tiene

cinco pasos:

1. Evaluar la composición de la muestra y determinar las metas de separación

2. Pretratamiento de la muestra.

3. Selección del modo de operación y el tipo de HPLC.

4. Selección del detector.

5. Selección de las condiciones de separación.

1.1.2 Espectrometría infrarroja (IR)

La espectroscopia infrarroja es la medida de la interacción de la radiación infrarroja con la

materia por absorción, emisión o reflexión. Se utiliza para estudiar e identificar sustancias

químicas o grupos funcionales en forma sólida, líquida o gaseosa. El método o técnica de

espectroscopia infrarroja se realiza con un instrumento llamado espectrómetro infrarrojo

que produce un espectro infrarrojo. Un espectro de infrarrojos se puede visualizar en un

gráfico de absorbancia de luz infrarroja en el eje vertical frente a la frecuencia o longitud de

onda en el eje horizontal. Las unidades típicas de frecuencia utilizadas en los espectros de

infrarrojos son centímetros recíprocos, con el símbolo cm-1. Las unidades de longitud de

onda IR se dan comúnmente en micrómetros, símbolo µm, que se relacionan con los

números de onda de forma recíproca. Un instrumento de laboratorio común que utiliza esta

técnica es un espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier. También es posible el IR

bidimensional, como se explica a continuación. La porción infrarroja del espectro

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electromagnético generalmente se divide en tres regiones: el infrarrojo cercano, medio y

lejano llamado así por su relación con el espectro visible El infrarrojo cercano de mayor

energía, aproximadamente 14.000-4.000 cm-1 puede excitar modos de armónicos o

combinaciones de moléculas vibraciones. El infrarrojo medio de aproximadamente 4.000-

400 cm-1 se utiliza generalmente para estudiar las vibraciones fundamentales y las

rotaciones asociadas-estructura vibracional.