Desarrollo de Un Modelo de Relación de Crecimiento Bacteriano Entre Densidad Optica Vs Recuento en Placa

Fundamentos de Microbiología Predictiva: aplicaciones
teóricas y prácticas.
Código FMP-001 v.01
Desarrollo de un modelo de relación entre D.O. vs
Recuento en Placa.
Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. Página 1 de 13
DESARROLLO DE UN MODELO DE RELACIÓN DE CRECIMIENTO

BACTERIANO ENTRE DENSIDAD OPTICA (D.O) vs RECUENTO TOTAL DE
VIABLES EN PLACA (RTVP)
En la presente guía se explica en forma sencilla cómo desarrollar un modelo matemático que
permita correlacionar dos medidas de crecimiento bacteriano: el recuento total de viables en placa vs
densidad óptica. Para el presente ejercicio se empleara como referencia a S. aureus mantenido en
caldo BHI, usando datos reales obtenidos a través de las prácticas de laboratorio del curso de
Microbiología Predictiva del programa de Microbiología de la Universidad de Pamplona. Así mismo,
se empleara como herramienta informática para la construcción del modelo el software Statgraphics
Centurion para Windows, con apoyo de Microsoft Office Excel 2007.
1.1. INTRODUCCIÓN
El Modelamiento Matemático es un proceso mediante el cual se construye, a partir de unas

observaciones del entorno, una relación matemática conveniente (ecuación) que represente lo más
sencillo e idealizado posible esa realidad, y que a través de ese modelo pueda estimarse los
cambios que sufren los componentes del entorno cuando cambian los factores más importantes de
ese entorno. En otras palabras, el proceso de Modelamiento es un proceso de abstracción –
identificación, el cual consta de una serie de etapas que son presentadas en la siguiente figura.
Figura 1. Proceso General de Modelamiento Matemático.
Fuente: Autor.
Universidad de Pamplona – Facultad de Ciencias Básicas – Departamento de Microbiología – © 2014

Recuento en Placa.
Como todo proceso, el Modelamiento matemático se desarrolla a través de las cuatro fases del ciclo
PDCA o ciclo de calidad de Deming, el cual permite lograr la mejora continua del mismo proceso y/o
modelo. Dentro de este proceso de Modelamiento PDCA, se incluyen siete fases, y de ellas, la fase
dos incluye la toma (acumulación) de datos. Mas detalles sobre el proceso de Modelamiento
matemático son abordadas en la guía: El proceso de Modelamiento.
La medida del crecimiento bacteriano es uno de los pasos importantes en el desarrollo de modelos
matemáticos predictivos, y para tal fin pueden emplearse diversos métodos de medir dicho
crecimiento. Dentro de los diversos métodos de medida de crecimiento encontramos el recuento
total de viables en placa (Método directo) y la densidad óptica (Método indirecto).
El primero cuantifica el número total de bacterias presentes en una muestra, que son capaces de
crecer originando una colonia. Parte del supuesto que cada colonia es formada por una célula viable.
Aunque este método no es preciso, se aproxima bastante bien al número real de células presentes
en el medio. El segundo método no mide directamente la cantidad de bacterias presentes en una
muestra, sino el grado de turbidez que su crecimiento o presencia origina sobre una muestra
líquida. Aunque este método es aún más inexacto que el recuento total de viables, su uso es más
práctico y bastante amplio en los casos donde no se requiere de un conocimiento muy preciso de la
población. Este método también resulta bastante aproximado a la cantidad real de bacterias,
siempre y cuando la turbidez causada por el crecimiento sea uniforme. Mas detalles sobre métodos
de recuento o medida del crecimiento bacteriano puede consultarse en libros o portales web
especializados en microbiología.
1.2. DESARROLLO DEL MODELO
Como ya se ha comentado, para el desarrollo del presente modelo de relación entre el recuento total
de viables en placa y la densidad óptica, se empleará como datos de entrada los resultados
obtenidos experimentalmente para un cultivo de S. aureus.
1.2.1. Cepa y preparación de los patrones
Una cepa de S. aureus en caldo BHI fue incubada a 35ºC por 24 horas antes de su uso, y ajustada
ópticamente a una densidad equivalente a un patrón McFarland 0,5 (1,5x108 bacterias/ml). Dicho
cultivo se rotulo como patrón 1 (P1) y a partir de este se prepararon cinco patrones consecutivos
usando un factor de dilución 1:10, los cuales fueron denominados como P2, P3, P4, P5, P6 y P7,
para obtener unas poblaciones teóricas de bacterias/ml equivalentes a 1,5x107, 1,5x106, 1,5x105,
1,5x104, 1,5x103 y 1,5x102.

Recuento en Placa.
1.2.2. Determinación de la población real.
Una vez preparados los patrones P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7, se procedió a realizar diluciones
decimales en 9 ml de agua peptona estéril hasta obtener una población final equivalente 1,5x102
bacterias/ml en cada patrón. Posteriormente se sembró 1 ml en profundidad de las diluciones
equivalentes a 1,5x103 y 1,5x102 bacterias/ml y 0,1 ml de la dilución equivalente a 1,5x102
bacterias/ml en agar BHI. Las siembras se realizaron por triplicado y las cajas fueron incubadas a
35 ± 2ºC por 24 – 48 horas. Pasado el tiempo se realizó el recuento respectivo en todas las cajas,
multiplicando cada recuento por el inverso de dilución correspondiente, y el logaritmo natural del
promedio de cada patrón fue usado para construir la curva de relación.
1.2.3. Determinación de la absorbancia.
Una vez realizadas las respectivas diluciones de los patrones P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7, se
procedió a medir por triplicado la absorbancia de cada patrón, empleando un espectrofotómetro
Genesys 20 ajustado a una longitud de onda de 600 nm para máxima absorción del cultivo y mínima
interferencia del medio. Como blanco se usó caldo BHI sin inocular. El resultado promedio de la
absorbancia para cada patrón fue usado para construir la curva de relación.
1.2.4. Resultados.
Los resultados tanto del recuento total de viables como de la absorbancia de cada patrón son
mostrados en la presente tabla:
Tabla 1. Resultados del recuento total de viables y densidad óptica para distintas concentraciones
de S. aureus crecido en caldo BHI.
Recuento Absorbancia
Patrón
Ln UFC/ml Promedio DE Promedio DE
P1 20,08 20,65 20,18 20,30 0,302 0,8173 0,7933 0,8217 0,8108 0,0153
P2 17,27 17,85 18,33 17,82 0,531 0,1453 0,1410 0,1220 0,1361 0,0124
P3 14,92 15,17 15,87 15,32 0,493 0,0247 0,0347 0,0160 0,0251 0,0094
P4 13,29 12,46 13,39 13,05 0,511 0,0147 0,0213 0,0093 0,0151 0,0060
P5 11,09 10,02 10,12 10,41 0,591 0,0123 0,0180 0,0033 0,0112 0,0074
P6 8,75 7,10 7,71 7,85 0,834 0,0147 0,0317 0,0073 0,0179 0,0125
P7 5,38 5,13 4,98 5,16 0,202 0,8173 0,7933 0,8217 0,8108 0,0153

Recuento en Placa.
1.3. CONSTRUCCIÓN DEL MODELO MATEMÁTICO
Para el desarrollo de un modelo matemático existen diversidad de software estadísticos y

matemáticos tales como MiniTab, Matlab, SPSS, Statgraphics, Excel, Prisma, etc. Algunos de estos
programas o aplicaciones se dejan programar y otros de ellos ya presentan una diversidad de curvas
que pueden usarse para ajuste de datos. En nuestro caso emplearemos el software Statgraphics
centurión para la construcción del modelo.
A través de una serie de capturas de pantalla se mostrará paso a paso como desarrollar el modelo.
PASO 1. Introducir los datos de Ln ufc/ml en la Col_1 y los datos de absorbancia en la Col_2, las
cuales nombraremos previamente. Al cargar el software nos pedirá una serie de preguntas sobre
como deseamos cargar los datos. Escogeremos introducirlos manualmente, y posteriormente nos
solicitara nombrar cada columna y el tipo de datos a cargar: numérico, carácter, etc. (Figura 2).
Figura 2. Pantalla de selección de nombres para cada columna y tipo de caracter.

Recuento en Placa.
PASO 2. Una vez cargados los datos, procedemos a realizar un análisis de relación, seleccionando
la ventana correspondiente a Relacionar, posteriormente seleccionamos Un Factor y posteriormente
seleccionamos Regresión Simple (Figura 3).
Figura 3. Selección del proceso de análisis de regresión lineal simple.
Posteriormente nos despliega una ventana donde seleccionaremos las variables a ubicar en los ejes
X y Y. Como el objetivo de este modelo es poder estimar la población en Ln UFC/ml a partir de la
medida de la absorbancia, ubicamos en el eje X la Absorbancia y en Y el Ln ufc/ml.
Figura 4. Selección de variables a relacionar.
Una vez seleccionadas las variables, damos en aceptar y se abre una nueva pantalla con el análisis
de regresión simple y el respectivo análisis de varianza.

Recuento en Placa.
Figura 5. Pantalla de resultados de ajuste de datos a regresión simple.
Para nuestro caso podemos observar que el coeficiente de correlación es 0,78807, el coeficiente de
regresión R2 = 62,1054 y el R2 ajustado es 49,4739. Así mismo, el análisis de varianza (ANOVA)
muestra que el valor-P es mayor o igual a 0,05, y que por lo tanto, no hay una relación
estadísticamente significativa entre Ln ufc/ml y Abs con un nivel de confianza del 95,0% o más.
Figura 6. Resultados de ajuste de datos a regresión simple y ANOVA

Recuento en Placa.
Como en este caso la regresión lineal simple no se ajusta al comportamiento de los datos,
escogeremos otro modelo que ajuste mejor. Para tal fin, damos click en la pestaña tablas
(seleccionada en rojo), y en el cuadro que se despliega seleccionamos la opción Comparación de
Modelos Alternativos y aceptar (figura 7).
Figura 7. Selección de Modelos Alternativos en Statgrpahics Centurión.
Finalizado el paso anterior, obtendremos una nueva pantalla (figura 8) con el análisis de los diversos
modelos presentes en Statgraphics Centurion, en este caso de los 27 modelos de ajuste solo 25
presentan algún grado de correlación. De ellos, los modelos de Raíz cuadrada de Y – Inversa de X y
Curva en S son los de mejor ajuste, ya que su coeficiente de regresión (R 2) es de 97,54. De igual
forma, el modelo de Inversa de X podría funcionar bien, ya que su R2 es aproximadamente 97.

Recuento en Placa.
Figura 8. Resultados de correlación y regresión de modelos alternativos.
El siguiente paso es seleccionar el o los modelos que mejor se ajusten al comportamiento de los
datos. Nos ubicaremos sobre el icono de Opciones de Regresión Simple (figura 9) y nos despliega
una nueva ventana donde se muestran los modelos disponibles (figura 10). Allí escogemos el de
Raíz Cuadrada de Y – Inversa de X, damos luego en aceptar y nos despliega la nueva pantalla con
el modelo nuevo y su respectivo análisis de varianza (figura 11).

Recuento en Placa.
Figura 9. Pantalla general para selección del nuevo modelo de regresión simple.
Figura 10. Pantalla opciones de Regresión Simple

Recuento en Placa.
Figura 11. Resultados de ajuste de datos al modelo de regresión Raiz cuadrada de Y – Inversa de X
y ANOVA.
De acuerdo con el nuevo análisis, podemos observar que el coeficiente de correlación es -0,987645,
el coeficiente de regresión R2 = 97,5443 y el R2 ajustado es 96,7257. Así mismo, el análisis de
varianza (ANOVA) muestra ahora que el valor-P es menor o igual a 0,05, y que por lo tanto, hay una
relación estadísticamente significativa entre Ln ufc/ml y Abs con un nivel de confianza del 95,0% o
más. El modelo generado es el siguiente:
0,0131435
𝐿𝑛𝑁 = 4,43206 −
𝐴𝑏𝑠
Los gráficos del nuevo modelo ajustado (figura 12) y de la gráfica de equivalencia entre los valores
observados y estimados (figura 13) se muestran a continuación.
En la figura 13 podemos observar que los resultados entre los valores observados y estimados se
ubican sobre la línea de equivalencia, es decir, que los resultados arrojados por el modelo son
similares a los observados y que por lo tanto, no existe una tanda hacia arriba o abajo, es decir, de
momento, el modelo no sobreestima ni subestima la respuesta esperada. En la siguiente guía sobre
validación de modelos empleando los índices de Ross (1996), abordaremos este aspecto de nuevo.

Recuento en Placa.
Figura 12. Gráfico del modelo de Raíz cuadrada de Y – Inversa de X con su respectiva ecuación de
regresión.
Figura 13. Gráfica de equivalencia entre los valores observados y los predichos por el modelo de
raíz cuadrada de Y – Inversa de X.
Vamos a realizar el mismo procedimiento anterior empleando esta vez el modelo de Curva en S o
Modelo Logístico (Sigmoidal).
De acuerdo con el análisis de la Curva en S, podemos observar que este modelo es casi igual que el
anterior en términos de relación entre Ln ufc/ml y Abs, ya que el coeficiente de correlación obtenido
es -0,987644, el coeficiente de regresión R 2 = 97,5441 y el R2 ajustado es 96,7255. Así mismo, el
análisis de varianza (ANOVA) también muestra que el valor-P es menor o igual a 0,05, y que por lo

Recuento en Placa.
tanto, hay una relación estadísticamente significativa entre Ln ufc/ml y Abs con un nivel de confianza
del 95,0% o más. El modelo generado es el siguiente:
0,00686399
2,98629−
𝐿𝑛𝑁 = 𝑒 𝐴𝑏𝑠
Los gráficos del modelo ajustado y de la comparación entre los valores estimados y observados se
muestran a continuación:
Figura 14. Gráfico del modelo sigmoidal (curva en S) con su respectiva ecuación de regresión.
Figura 13. Gráfica de equivalencia entre los valores observados y los predichos por el modelo en S.

Recuento en Placa.
Bibliografía
Datta, A.K., Sablani, S.S. (2006). Chapter 1: Mathematical Modeling Techniques in Food and
Bioprocesses: An Overview. In: Handbook of Food and Bioprocess Modeling Techniques /
Editors, Shyam S. Sablani, Mohammad S. Rahman, Ashim K. Datta and Arun S. Mujumdar.
Taylor and Francis Group, LLC. CRC Press. Boca Raton, FL, USA. Pages 1 – 11.
Gershenfeld, N. (1999). The Nature of Mathematical Modeling. Cambridge: Cambridge University
Press.
Ross, T. (1996). Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology.
Journal of Applied Bacteriology, 81: 501 – 508.
Navas, J., Esteban, F.J., Quesada, J.M. (2009). Tema 1. Modelos Matemáticos. En: Modelos
Matemáticos en Biología. Teoría. Departamento de Matemáticas, Universidad de Jaén, España.
Págs. 1 – 11. Disponible en:
http://ucua.ujaen.es/jnavas/web_modelos/pdf_mmb08_09/texto%20completo.pdf. Fecha de
acceso: 01/09/2014.

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1.2.2. Determinación de la población real.

1.2.3. Determinación de la absorbancia.

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