UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID

ASIGNATURA: ANÁLISIS QUÍMICO

TÉCNICAS ÓPTICAS DE ANÁLISIS

SONIA ALONSO ROMÁN.

JAVIER CALVO GARRIDO.
ANA RIZO MARTÍ.

1
 TÉCNICAS ÓPTICAS DE ANÁLISIS

PRINCIPIOS BASICOS DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA Y

CONCEPTOS FUNDAMENTALES…………………………………………..PAG3

CLASIFICACION DE LOS MÉTODOS OPTICOS…………………………….PAG6

INSTRUMENTACION Y COMPONENTES BASICOS DE LOS

INSTRUMENTOS DE MEDIDA……………………………………………....PAG7

TÉCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN…………...PAG9

ABSORCIÓN DE RADIACIÓN Y CONCENTRACIÓN. LEY DE BEER…….PAG9

ESPECTROFOTOMETRÍA DE UV-VIS…………………………………..........PAG10

ABSORCIÓN ATÓMICA………………………………………………………..PAG13

TECNICAS BASADAS EN LA EMISION DE RADIACIÓN……………….PAG15

FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR………………………………………PAG15

ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN ATÓMICA………………………………..PAG18

TECNICAS BASADAS EN LA DISPERSION DE RADIACIÓN…………..PAG21

TURBIDIMETRIA Y NEFELOMETRIA……………………………………….PAG21

APLICACIONES AL ANÁLISIS DE ALIMENTOS DE LOS MÉTODOS

ÓPTICOS DE ANÁLISIS………………………………………………………PAG23

BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………...PAG24

TECNICAS ÓPTICAS DE ANÁLISIS:

2
Todas aquellas que implican la medida de la radiación electromagnética emitida por la
materia o que interacciona con ella.
Los métodos ópticos de análisis cubren un amplio campo de aplicaciones debido a su
rapidez, a la gran gama de instrumentación disponible y sus grandes posibilidades de
automatización.

PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA Y

CONCEPTOS FUNDAMENTALES:

La radiación electromagnética está constituida por ondas que se propagan en el espacio,

y que están constituidas por componentes eléctricos y magnéticos perpendiculares entre
sí.

Radiación electromagnética polarizada en un plano

A diferencia de otros fenómenos ondulatorios, como el sonido, la radiación

electromagnética no necesita un medio de apoyo para transmitirse y, por tanto, se
propaga fácilmente a través del vacío.
En cualquier medio material, la propagación de la radiación disminuye a causa de la
interacción entre el campo electromagnético de la radiación y los electrones enlazantes
de la materia (la longitud de onda disminuye cuando la radiación pasa del vacío a algún
otro medio).

Sin embargo, para describir cuantitativamente determinadas interacciones con la materia

(asociadas a la absorción o emisión de energía radiante), se hace necesario considerarla
como un flujo de partículas o corpúsculos, llamados fotones (dualidad onda-
corpúsculo).
La energía del fotón es proporcional a la frecuencia de la radiación (relación de
Einstein-Planck), de modo que un haz de radiación puede ser más o menos intenso en
función de la cantidad de fotones por unidad de área, pero la energía del fotón es
siempre la misma para una determinada frecuencia.

El espectro electromagnético:

El espectro electromagnético abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y de

frecuencias (y así como de energías). De hecho, el intervalo es tan grande que se
necesita una escala logarítmica.
Las zonas de separación entre regiones no están establecidas de modo rígido.

3
 Regiones del espectro electromagnético

También se denominan métodos ópticos a los métodos espectroquímicos que utilizan no

sólo la radiación visible, sino también las radiaciones ultravioleta e infrarroja, a pesar de
que el ojo humano no es sensible a ellos, debido a las similitudes que se observan en las
interacciones de estos tres tipos de radiación con la materia. a pesar de que el ojo
humano no es sensible a ellos.

Superposición de ondas: cuando dos o más ondas atraviesan la misma región del
espacio, se produce un desplazamiento igual a la suma de los desplazamientos causados
por las ondas individuales. Por tanto, una onda compleja puede descomponerse en
componentes simples por medio de una operación matemática.

Difracción de la radiación: proceso por el que un haz paralelo de radiación se curva

cuando pasa por un obstáculo puntiagudo o a través de una abertura estrecha.

4
Transmisión de la radiación: La velocidad a la que se propaga la radiación a través de
una sustancia es menor que su velocidad en el vacío y depende de los tipos y
concentraciones de átomos, iones o moléculas del medio. Sin embargo, dado que no se
observa ningún cambio en la frecuencia, la interacción no puede implicar una
transferencia permanente de energía, sino que dicha energía provoca la polarización de
las especies atómicas y moleculares que constituyen el medio (deformación transitoria
de las nubes de electrones) sólo momentáneamente, emitiéndose de nuevo sin alteración
cuando la sustancia vuelve a su estado original. Es por eso que la frecuencia de la
radiación emitida no varía, pero la velocidad de su propagación disminuye a causa del
tiempo necesario para que se produzca la retención y la emisión.

Refracción de la radiación: se trata de un cambio brusco de dirección de la radiación

cuando incide con un ángulo en la interfase entre dos medios que tienen densidades
diferentes.

Reflexión de la radiación: cuando la radiación atraviesa una interfase entre medios con
diferente índice de refracción, se produce siempre una reflexión. La fracción de
radiación reflejada es tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia entre los índices de
refracción.

Dispersión de la radiación: Fracción de la radiación momentáneamente retenida por

átomos, iones o moléculas que es reemitida en todas las direcciones cuando las
partículas vuelven a su estado inicial. La intensidad de esta radiación dispersada
aumenta con el tamaño de partícula.

Dispersión de luz por un prisma

5
Polarización de la radiación: La radiación ordinaria consiste en un haz de ondas
electromagnéticas en el que las vibraciones se distribuyen por igual entre una seria
infinita de planos centrados a lo largo de la trayectoria del haz. Un vector de cualquier
plano puede descomponerse en dos componentes perpendiculares entre sí. La
eliminación de uno de estos dos planos de vibración, origina un haz que está polarizado
en un plano. El vector eléctrico resultante de un haz polarizado en un plano ocupa, por
tanto, un solo plano del espacio.
La polarización se produce por el paso de radiación a través de medios que absorben,
reflejan o refractan de forma selectiva la radiación que vibra en un solo plano.

Sección transversal de Descomposición en dos componentes

un haz de radiación perpendiculares de un vector en el plano xy

Interacción materia-radiación electromagnética:

Cuando incide radiación electromagnética sobre una muestra material puede ser
absorbida por ella (generalmente de forma parcial), transformándose, en muchas
ocasiones, en energía térmica. Sin embargo, otras veces, parte de la radiación puede ser
dispersada o re-emitida, con o sin cambio en la longitud de onda. Incluso es posible que,
como consecuencia de la interacción, se origine simplemente un cambio en las
propiedades de la radiación, sin necesidad de producirse absorción y emisión. Por otra
parte, la muestra puede emitir radiación electromagnética si se la excita bajo
determinadas situaciones.

Cuando la materia interacciona con energía térmica o electromagnética, los átomos y

moléculas pueden pasar a un estado activado en el que permanecen durante un periodo
de tiempo muy corto, regresando su estado fundamental. En este proceso, ceden la
energía previamente absorbida a su entorno en forma de calor, o en forma de fotones, de
la misma longitud de onda o menor.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ÓPTICOS:

-MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS: aquellos en los que existe intercambio de energía

entre la radiación electromagnética y la materia. En estos métodos se miden espectros,
siendo éstos debidos a transiciones entre distintos niveles energéticos.
Técnicas basadas en la absorción de radiación:
-niveles moleculares: UV-visible, microondas
-niveles atómicos: absorción atómica, rayos x
Técnicas basadas en la emisión de radiación:
-niveles moleculares: luminiscencia (fluorescencia, fosforescencia)
-niveles atómicos: espectrometría de emisión, fotometría de llama,
fluorescencia de rayos x, fluorescencia atómica

6
-MÉTODOS NO ESPECTROSCÓPICOS: aquellos en los que no hay intercambio de
energía, sino cambios en la dirección o en las propiedades físicas de la radiación
electromagnética.
Técnicas basadas en la dispersión de radiación: turbidimetría, nefelometría
Técnicas basadas en la refracción de radiación: refractometría, interferometría
Técnicas basadas en la difracción de radiación: rayos x, electrones
Técnicas basadas en la rotación óptica: polarimetría, dicroísmo circular

INSTRUMENTACIÓN:

-Fotómetro: mide la intensidad de radiación

-Espectrofotómetro: mide la transmitancia o la absorbancia de una muestra en función

de la longitud de onda

-Colorímetro: compara, usando el ojo humano como detector, el color de la sustancia

problema con el de una disolución patrón

-Espectroscopio: detecta líneas espectrales a simple vista (líneas de color q emite un

átomo)

-Espectrógrafo: instrumento que registra líneas espectrales sobre una placa fotográfica

-Espectrómetro: instrumentos que poseen sistemas de detección eléctricos

COMPONENTES BÁSICOS DE LOS INSTRUMENTOS DE MEDIDA:

Los métodos espectroscópicos ópticos se fundamentan en seis fenómenos:

1.- Absorción
2.- Fluorescencia
3.- Fosforescencia
4.- Dispersión
5.- Emisión
6.- Quimioluminiscencia

Para medir cada fenómeno la mayoría de los componentes básicos de los instrumentos
son muy parecidos, aunque difieren algo en su configuración. Además, las propiedades
necesarias de estos componentes son las mismas independientemente de si se aplican a
la región ultravioleta, visible o infrarroja del espectro.

Los instrumentos espectroscópicos característicos incluyen cinco componentes:

1.- Una fuente estable de energía radiante
2.- Un recipiente transparente para contener la muestra
3.- Un dispositivo que aísle una región restringida del espectro para la medida
(selección de la longitud de onda)
4.- Un detector de radiación, que convierta la energía radiante en una señal utilizable (en
general eléctrica)

7
5.- Un sistema de procesamiento y lectura de la señal, que visualice la señal detectada
en una escala de medida, en una pantalla de osciloscopio, en un medidor digital o en un
registrador.

Instrumento para espectroscopia óptica de absorción:

Instrumento para espectroscopia óptica de emisión:

La espectroscopia de emisión no requiere una fuente de radiación externa, pues la

propia muestra es el emisor.
El receptáculo de la muestra es un arco, una chispa o una llama, que a la vez contiene a
la muestra y le hace emitir una radiación característica.

Instrumento para espectroscopia óptica de dispersión:

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 TÉCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN

Vamos a abordar en este apartado dos técnicas como la espectrofotometría de

UV-vis y la espectrofotometría de absorción atómica, las dos basadas para su
funcionamiento en fenómenos de absorción de radiación electromagnética.

La medida de la cantidad de radiación absorbida con la ayuda de estos métodos

nos servirá en algunos casos aplicando la ley de Lambert-Beer para establecer una
relación lineal entre la radiación absorbida y la concentración de la sustancia en el
medio.

ABSORCIÓN DE RADIACIÓN Y CONCENTRACIÓN. LEY DE BEER

INTRODUCCIÓN

La ley de Lambert-Beer nos permite establecer una conexión entre la absorción

de radiación y la concentración de la sustancia que absorbe en un medio conocido, fue
descubierta independientemente (y de distintas maneras) Pierre Bougler en 1729 en
1760 por Johann Heinrich Lambert y August Beer en 1852.

La absorción de radiación provoca una alteración en la posición de ciertos

electrones de las moléculas absorbentes llevándolos a niveles de energía superior,
aunque posteriormente lo veremos con más exactitud.

Las diferentes moléculas y de un modo más exacto y preciso los electrones que
forman parte de éstas pueden absorber radiación electromagnética a diferentes λ y
nosotros podemos llegar a medir ésta y de ese modo conociendo ciertas características
de la propia sustancia expresar su concentración.

La relación de la ley entre concentración y absorción de luz está basada en el uso

de espectroscopía para identificar sustancias, eso lo veremos más adelante.

La ley de Lambert-Beer se basa en la siguiente fórmula:

A=εcl

A representa la absorbancia.
ε representa el coeficiente de absorción de la sustancia analizada(l/mol cm). Su valor
varía dependiendo de los materiales absorbentes y la λ aplicada en cada caso y se
determina experimentalmente.
C representa la concentración de la muestra(mol/l).
L representa el espesor de la cubeta(cm).

El modo de trabajo es muy sencillo, irradiando la muestra con luz

monocromática, que situamos dentro de la cubeta, obtendremos valores de su
absorbancia a diferentes tiempo o diferentes condiciones, aplicando la fórmula
anteriormente expuesta podemos conocer que concentración existente.

9
 Existen otra serie de parámetros asociados a la absorbancia, son los siguientes:

Al incidir sobre la muestra utilizamos una radiación que denominamos Io, la radiación
que recibimos en el detector del espectrofotómetro de UV-vis por ejemplo que luego
veremos es I.

A = log (Io/I)
Conocida la T(transmitancia) podemos conocer la A(absorbancia).
T = (I/Io) 100

APLICACIONES

La ley tiende a no ser válida para concentraciones muy elevadas, especialmente

si el material dispersa mucho la luz.

La ley de Beer se cumple para una radiación monocromática que atraviesa una
disolución diluida, cuando la especie absorbente no participa en un equilibrio que
depende de su concentración, podemos pensar en cualquier ácido débil cuya forma
variará desde HA hasta su forma disociada dependiendo de una situación concentrada a
una diluida con lo cual no cumplirá la ley de Beer.

Existen muchos campos en los que es una herramienta muy usada. En el campo
de la bioquímica nos permite conocer concentración de sustancias, actividades
enzimáticas, al igual que en el de la química analítica con el estudio de otros analitos,
etc y también en la tecnología de los alimentos como luego veremos. Esta ley también
se aplica para describir la atenuación de la radiación solar al pasar a través de la
atmósfera. En este caso hay dispersión de la radiación además de absorción.

ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE

INTRODUCCIÓN

La espectrofotometría UV-Visible es una técnica de medición basada en la

absorción de radiación UV o visible por parte de las moléculas muy usada en campos
como la química analítica, bioquímica o biología molecular.

Los electrones en una molécula se establecen formando orbitales atómicos y a su

vez estos forman orbitales moleculares. La absorción de esta radiación por parte de las
moléculas provoca un fenómeno denominado transición electrónica en la cual el
electrón se mueve desde un orbital de menor nivel energético a uno de mayor
La absorción por parte de la molécula estudiada de un tipo u otra de radiación
UV o visible(la variación en la λ es causa a su vez de una variación en la energía de la
onda) provoca una transición electrónica diferente entre estos orbitales(fig.1).

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 Transición λ (nm) ξ (L mol4cm-1) Ejemplo
Σ → σ* <200 - Hidrocarburos saturados
Π → π* 200–500 ≅ 104 Alquenos, alquinos aromáticos
Η → σ* 160–260 102 – 103 H2O, CH3OH, CH3CL
Η → π* 250–600 10 – 103 Carbonilos, nitro, nitrato, carbonilo
Fig.1 Tipos de transiciones electrónicas dependiendo de la λ incidente con correspondientes ejemplos de cada una.

Aquellas moléculas con enlaces sencillos son excitadas por λ de menores y por
lo tanto de mayor energía. Estas λ se conocen con el nombre de UV de vacío. Es
necesario el trabajo en vacío ya que el O2 absorbe en estos niveles lo cual invalidaría el
experimento. Las λ mayores solamente son absorbidas por unas estructuras o grupos
funcionales denominadas cromóforos los cuales presentan electrones de absorción
energética baja. Hay también otro grupo denominado auxocromos que refuerzan a los
cromóforos.

El estado de excitación de la molécula es de alrededor de 10-9, emitiendo

entonces esta energía recibida en forma de calor o de otro tipo de radiación como puede
ser la fosforescencia o fluorescencia de las que posteriormente hablaremos; esto nos
lleva a pensar que podemos conocer más acerca de una molécula, de sus grupos
funcionales, de su estructura conociendo su espectro de absorción o de emisión
dependiendo de la técnica que utilicemos. De este modo podremos realizar el espectro
de emisión y de absorción de una sustancia, incidiendo sobre ella a diferentes λ y
viendo su emisión y absorción.

APLICACIONES

Desde el punto de vista cualitativo podemos llegar a conocer que grupo

funcional tenemos ante nosotros, o que tipo de molécula ya que una característica puede
ser única en una molécula y llevarnos a su conocimiento y aplicando la ley de Beer
anteriormente expuesta.

En estudios bioquímicos podemos conocer la cantidad de bacterias que presenta

un medio dada su absorbancia dentro de λ visibles, también ver la actuación de un
enzima sobre un compuesto inicial viendo su transformación en otro al mismo tiempo
que su desaparición, uso de colorantes como Biuret para determinar la concentración
proteica de una suspensión, etc.

Presencia de electrolitos, variación de pH, disolvente en el que trabajemos son

elementos muy importantes a la hora de establecer un método de trabajo correcto, la
presencia de un disolvente polar o apolar en la medición de una concentración proteica
puede provocar un cambio de conformación tal que aminoácidos aromáticos que
absorben en λ cercanas a 280nm cambien su posición desde el exterior al interior
molecular haciendo variar nuestros resultados; el color del disolvente es otro punto
fundamental.
La elección del tipo de material de nuestra cubeta también es importante, ya que
no queremos provocar absorción por parte de esta o que bloquee el paso de la luz, las

11
mediciones para cuantificar DNA se realizan en cubetas de cuarzo dada la λ usada
260nm y 280nm.

El espectrofotómetro de UV-vis funciona de un modo muy simple(fig.2).

Situamos la muestra en una cubeta donde va a ser excitada por un haz de luz
monocromática a una determinada λ seleccionada previamente, e incidimos sobre ésta.
El espectrofotómetro permite la medición tanto de la luz incidente como de la
transmitida y de ese modo la absorbida con los siguientes cálculos:

Fig. 2. Esquema básico de incidencia y detección de absorbancia

T = I/Io 100

A = log10(Io/I)

Conocida la absorbancia y por la ley de Beer anteriormente expuesta conocer la

concentración de una sustancia:

pH 5,5 Ph 8

0,7 0,8
0,7
0,6
0,6
ABSORBANCIA
ABSORBANCIA

0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2 0,2
0,1 0,1

0 0
0 100 200 300 0 50 100 150 200 250 300
T(SEG) T(SEG)

Fig.3. Variación de absorbancia diferencial dependiendo del pH de la disolución. Izquierda pH5.5. Derecha pH 8.

Podemos encontrarnos una sustancia que comienza a decrecer en su absorbancia,

lo cual puede suceder porque la sustancia deja de absorber o porque está desapareciendo
del medio. En este caso la acción continuada de un enzima provoca una disminución en
la cantidad de reactivo y en consecuencia de la absorbancia de la muestra. Mediante la
aplicación de la ley de Beer podríamos conocer las concentraciones de reactivo que
están siendo eliminadas en el tiempo. Además vemos como la variación de la
absorbancia es diferente en uno y otro pH(fig.3).

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ABSORCIÓN ATOMICA

INTRODUCCIÓN

La espectroscopia de absorción atómica se basa en la absorción de luz por parte

de átomos en forma gaseosa, de ese modo podemos medir su concentración, lo cual
representa una diferencia importante en cuanto a la espectroscopia UV-vis que trabaja
en fase líquida o sólida. Mediante esta técnica al igual que antes podemos conocer la
concentración de analito por la ley de Lambert-Beer conociendo la absorbancia de la
muestra, pero no permite conocer estructuras ya que las rompe. Sin embargo la
preparación de la muestra o la no-uniformidad de ésta pueden darnos valores
cambiantes lo cual nos obliga a interpolar nuestro valor de absorbancia en una curva de
calibración.

Los instrumentos de medida son mucho más complejos que en la espectroscopía

de UV-vis. Necesitamos una fuente de luz, los láseres poseen la intensidad necesaria
para generar la excitación atómica y en consecuencia el cambio hacia un orbital
molecular de mayor energía. En segundo lugar la amplia mayoría de las muestras se
encuentran en estado líquido o sólido y en esta técnica la muestra debe encontrarse en
un estado gaseoso. Para su conversión usamos un atomizador, tenemos dos tipos los
cuales explicaremos de un modo sencillo ya que su funcionamiento interno puede
resultar complicado.

FUNCIONAMIENTO DE LOS ATOMIZADORES:

Atomizador de llama: este tipo de atomizador solamente acepta soluciones analíticas

por ello la muestra debe ser tratada para formar pequeñas gotas. El atomizador de llama
consta de una serie de componentes, son los siguientes:

Fuente de radiación: este formada por un cátodo hueco fabricado con el mismo
metal a analizar junto con un ánodo que en este caso es un hilo de wolframio todo
sellado en un tubo de vidrio con un gas inerte como el argón. Al aplicar una diferencia
de potencial entre el ánodo y el cátodo se genera una ionización de los átomos del gas
inerte, estos chocan con el cátodo provocando el movimiento de diferentes átomos para
producir una nube atómica que emiten radiación.

Quemador y un nebulizador(fig.4): el nebulizador transforma la muestra en un

aerosol fino para alimentar el quemador. Este puede ser de flujo laminar si tanto
muestra como combustible y oxidante se mezclan antes de llegar a la llama o de flujo
turbulento donde muestra combustible y oxidante no llegan a la vez a la llama.

Monocromador: que selecciona la λ necesaria para cada muestra.

Atomizador de horno de grafito o atomización electrotérmica: puede aceptar

soluciones líquidas, sólidas y una mezcla de ellas, la muestra se aplica directamente
siendo calentado el horno eléctricamente. Consta de un cilindro de grafito hueco con
dos ventanas que permiten el paso de luz. Muy usado para muestras orgánicas ya que se

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requiere menos cantidad de muestra y su sensibilidad es mayor al poder controlar la
temperatura y el tiempo de una mejor manera que en el método anterior.

Podemos tener problemas en las diferentes mediciones debido a la similitud de

absorción de dos sustancias como pueden ser el V y Al, también interferencias químicas
debido al proceso de atomización de la muestra, en este caso son de dos tipos:

1. Aniones que provocan compuestos de baja volatilidad con el elemento a analizar

disminuyendo la velocidad de atomización, el problema puede ser resuelto
aumentando la temperatura.
2. Reacciones de asociación y disociación el O2.

Fig.4 Esquema básico de funcionamiento de los espectrofotómetros de absorbancia atómica.

APLICACIONES

Destacamos su gran importancia dentro de la industria alimenticia dada la

capacidad de esta técnica para detectar la presencia de elementos químicos como Pb o
Hg entre otros(fig.5).

Fig5. Elementos químicos en rosa objeto de medición en esta técnica.

14
TÉCNICAS BASADAS EN LA EMISIÓN DE RADIACIÓN

FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR

Cuando una especie química absorbe radiación pasa a un estado electrónico

excitado. Muchas sustancias disipan el exceso de energía en forma de calor. Sin
embargo, un cierto número de especies pierde sólo una parte de ese exceso de energía
en forma de calor, y emite la energía remanente en forma de radiación electromagnética
de distinta frecuencia que la absorbida, a una longitud de onda mayor, y que puede
utilizarse con fines analíticos.

X + Calor

X + hv X*

Absorción X + calor +hv´

(espectrofotometríma)
Emisión
(fotoluminiscencia)

La luminiscencia es el término aplicado a la reemisión de radiación que ha sido

previamente absorbida, mientras que la fotoluminiscencia se refiere al caso particular en
el que la excitación tenga lugar por absorción de fotones.

La fotoluminiscencia puede clasificarse en: fluorescencia y fosforescencia. Se

diferencian en que las transiciones electrónicas responsables de fluorescencia no
conllevan un cambio en el espín del electrón. Por el contrario, las emisiones de
fosforescencia van acompañadas por un cambio en el spín del electrón.

La medida de la intensidad permite la determinación cuantitativa de especies

inorgánicas y orgánicas importantes a niveles de trazas.

Estados excitados de singulete/triplete

Un estado molecular en el cual todos los espines de los electrones están

apareados se llama estado singulete. Cuando uno de los electrones de una molécula es
excitado a un nivel de energía superior, se forma un estado de triplete. En el estado de
singulete excitado, el espín del electrón promocionado continúa apareado, con signos
opuestos, con el electrón del estado fundamental, hecho que ocurre en los procesos de
fluorescencia. En cambio, en el estado de triplete los espines de los dos electrones se
han desapareado, y por tanto, están paralelos; hecho que ocurre en la fosforescencia.

El tiempo de vida de un estado de singulete de excitación es normalmente de

10-9- 10-6 s.

Cuando una molécula absorbe radiación se produce el paso desde el estado

electrónico y vibracional fundamental a un estado excitado. Este proceso tiene lugar en
unos 10-15 s cuando se trabaja con una disolución, el exceso de energía vibracional se

15
pierde rápidamente, como consecuencia de los choques de las moléculas excitadas.
Este proceso recibe el nombre de relajación vibracional. El proceso de fluorescencia
ocurre inmediatamente después de la excitación, por lo que no es posible percibir
visualmente la emisión de fluorescencia una vez eliminada la de excitación.
El proceso de transformación de un estado singulete a estado triplete se
denomina cruzamiento entre sistemas. Una vez adquirido el estado de triplete, la
molécula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos de relajación y
posteriormente emitir un fotón para retornar al estado fundamental. Esta emisión se
denomina fosforescencia.

Rendimiento cuántico
El rendimiento cuántico o eficacia cuántica, es la relación entre el número de
moléculas que emiten luminiscencia con respecto al número total de moléculas
excitadas.

Factores que afectan a la fluorescencia:

- Estructura molecular: es imprescindible que la molécula posea una estructura capaz de

absorber radiación ultravioleta/visible. Los compuestos que contienen dobles enlaces
conjugados, especialmente aquellos con un alto grado de resonancia son los que
presentan una fluorescencia más intensa y más útil. Suelen presentar fluorescencia
muchos hidrocarburos aromáticos con gran rigidez y estructuras multicíclicas.
- Influencia del disolvente y la temperatura: la eficacia cuántica de la fluorescencia
disminuye en la mayoría de las moléculas al aumentar la temperatura, lo mismo ocurre
con una disminución de la viscosidad del disolvente. La fluorescencia se reduce en
presencia de disolventes que contiene átomos pesados.
- Influencia de pH: la fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes
ácidos o básicos en el anillo, depende del pH. Tanto la longitud de onda como la
intensidad de emisión son diferentes para las formas ionizadas y no ionizadas del
compuesto.
- Oxígeno disuelto: la presencia de oxígeno reduce la intensidad de la fluorescencia.
- Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia: la intensidad, If, es
directamente proporcional a la concentración, C, de la sustancia absorbente, pero sólo a
concentraciones bajas, lo cual puede demostrarse según la ley de Beer. Para
disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia será proporcional a la
concentración.

INSTRUMENTACIÓN
Nos encontramos con dos diseños: fluorómetro y espectrofluorímetro. Los
distintos componentes de los instrumento son similares a los que se encuentran en
espectrofotómetros ultravioleta/visible.

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 Componentes de un fluorómetro o un espectroflurímetro

Componentes:
- Fuentes: se necesitan fuentes más intensas que las utilizadas en medidas de
absorción, por lo que se utiliza para los fluorométros, una lámpara de arco de
mercurio a baja presión. Y para los espectrofluorímetros una lámpara de arco de
xenón. También se utilizan láseres.
- Filtros y monocromadores. Se utilizan tanto los filtros de interferencia como los
de absorción.
- Detectores:los mas utilizados son los tubos multiplicadores.
- Cubetas.

Aplicaciones en el análisis de alimentos:

Entre los numerosos compuestos que pueden determinarse
por fluorescencia se encuentran los aminoácidos, las proteínas, las coenzimas, las
vitaminas, los ácidos nucleicos, los alcaloides, las porfirinas, los esteroides, los
flavonoides y muchos metabolitos.
Indudablemente por su alta sensibilidad y selectividad la espectroscopia de
fluorescencia es una herramienta especialmente valiosa en el análisis de alimentos,
productos farmacéuticos, muestras de laboratorio clínico y productos naturales.
Algunos de los casos concretos de determinaciones en el caso del análisis de alimentos
son:
- Generalmente aquellas especies que posean anillos aromáticos pueden presentar
fluorescencia, mientras que si la especie posee heterociclos aromáticos puede presentar
fosforescencia.
- Determinación de hidrocarburos policíclicos aromáticos, son compuestos muy tóxicos.
- Determinación de vitaminas que son fluorescentes A, C o D.

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ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN MOLECULAR

Los métodos atómicos de emisión se basan en la medida De la radiación emitida de una

muestra, previamente excitados

Muestra (X) + Energía X*

X + hv

La determinación espectroscópica de especies atómicas sólo se puede llevar

acabo dentro de un medio gaseoso, en el cual los átomos individuales están separados
unos de otros, por lo que el primer paso en todos los procedimientos espectroscópicos es
la atomización, un proceso en el cual los átomos de la muestra son excitados a estados
electrónicos superiores.

En la espectroscopia de emisión atómica una parte de la muestra se vaporiza y se

excita térmicamente hasta alcanzar la emisión atómica. La rápida relajación de las
especies excitadas va acompañada de la producción de espectros de líneas ultravioleta y
visibles que son útiles para el análisis de los elementos.

Históricamente, la espectroscopia de emisión atómica requería la atomización y

excitación mediante llama, arco eléctrico y chispa eléctrica. Sin embargo, hoy en día las
fuentes de plasma se han convertido en las más importantes y más ampliamente
utilizadas en estos procesos.

Los espectros de emisión obtenidos utilizando fuentes de plasma, arco o chispa

son muy complejos, están constituidos por cientos, e incluso, miles de líneas. Esta
cantidad de líneas, es muy ventajosa cuando se busca información cualitativa aunque
aumenta la probabilidad de interferencias espectrales en el análisis cuantitativo.

La espectroscopia atómica se emplea en la determinación cualitativa y

cuantitativa de muchos elementos. La longitud de onda a la que se efectúa la medición
de intensidad, identifica al elemento, mientras que la intensidad de la radiación emitida
cuantifica su concentración.

La anchura de las líneas de emisión atómica aumenta con el incremento de la

temperatura; las líneas son mas anchas cuando los átomos están más calientes y más
estrechas cuando los átomos están más fríos. La razón de este aumento es que los
átomos se mueven más rápidamente a temperaturas mayores.

Las técnicas espectroscópicas atómicas se pueden clasificar en función de la

fuente de atomización:

- Llama: Espectroscopia de Absorción atómica. La temperatura de atomización alcanza

los 1700-3150 ºC
- Plasma de Argón acoplado inductivamente: Espectroscopia de plasma acoplado
inductivamente (ICP). La temperatura de atomización alcanza los 6000-8000 ºC.

18
- Plasma de Argón de corriente contimua: Espectroscopia de plasma de corriente
contimua (CD). La temperatura que se alcanza es de 6000-10000 ºC.
- Arco eléctrico: Espectroscopia de emisión de fuente de arco, mide emisión a 4000-
5000 ºC.
-Chispa eléctrica: Espectroscopia de emisión de fuente de chispa, mide emisión a 40000
ºC.

INSTRUMENTACIÓN

Los componentes básicos de un espectrofotómetro son los siguientes:

- Fuente de excitación: proporciona energía a la muestra. La energía

suministrada para la excitación procede de una descarga eléctrica entre dos electrodos.
Uno de ellos, normalmente contiene la muestra, pulverizada, en forma sólida, o el
residuo procedente de una disolución.
- Monocromador: selecciona las diferentes radiaciones emitidas. Para ello, se
emplean prismas y redes.
- Sistema de detección: registran la radiación emitida por la muestra.

Espectroscopia de emisión con fuente de arco y chispa

Las espectroscopias con fuentes de arco y de chispa fueron los primeros métodos
instrumentales más utilizados en el análisis. Están basados en la obtención mediante
excitación del espectro de emisión de elementos por medio de arcos eléctricos o chispas
eléctricas. Estos espectros permiten la determinación cualitativa y cuantitativa de
elementos metálicos en varios tipos de muestras, incluyendo metales, aleaciones, suelos,
minerales y roca.

La excitación de la muestra se produce en el pequeño espacio existente entre un

par de electrodos. El paso de electricidad entre los electrodos a través de este pequeño
espacio proporciona la energía necesaria para atomizar la muestra y producir átomos o
iones en estado electrónico excitado. Las fuentes de arco y chispa requieren integrar las
señales de emisión durante al menos 20 s, y a menudo, durante un minuto o más, para
obtener datos analíticos reproducibles.
Actualmente, estos métodos se aplican principalmente al análisis de muestras
sólidas, ya que las muestras líquidas o gaseosas se manipulan mejor usando una fuente
de plasma.

Fuentes de microsonda láser

En esta fuente se utiliza el láser para vaporizar la muestra en el espacio entre dos
electrodos de grafito, que se utilizan como fuente de excitación. Cuando un impulso de
láser de elevada potencia se focaliza en una zona de 5 a 50 micrometros sobre la
superficie de la muestra, generalmente sólida, se vaporiza una pequeña cantidad de
sólido. La nube resultante está compuesta por átomos, iones y moléculas. En la
microsonda, los componentes de la nube se excitan por medio de una chispa entre un
par de pequeños electrodos situados justo por encima de una superficie de la muestra.
La radiación resultante se focaliza entonces sobre un sistema detector adecuado. Con
esta técnica ha sido posible determinar el contenido de elementos traza en células
sanguíneas aisladas y analizar materiales no conductores.

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Fuentes de emisión de llama

Actualmente, las llamas no se utilizan para obtener espectros de emisión, ya que

la modalidad de absorción proporciona resultados mejores en cuanto a exactitud,
conveniencia y límites de detección para la mayoría de determinaciones de un único
elemento. Para el análisis multielemental, las fuentes de plasma son bastantes
superiores. Por ello, la espectroscopia de emisión de llama actualmente tiene poca
utilidad, excepto en la determinación de metales alcalinos, se excitan a temperaturas
relativamente bajas para dar espectros que son notablemente sencillos y exentos de
interferencias de otras especies.

Espectroscopia de emisión con fuente de plasma

Un plasma es un gas ionizado, una mezcla gaseosa que contiene una

concentración significativa de cationes y electrones. Normalmente se utiliza argón. Para
originar el plasma es preciso un aporte externo de energía que provoque la ionización
del gas y la mantenga estacionaria. En función de cómo se aporte esta energía externa,
se han desarrollado tres tipos de fuentes de alimentación:

- Fuente de corriente continua, consistente en dos electrodos sumergidos en la corriente

del gas argón.
- Campos de microondas
- Radiofrecuencia: se utiliza en la espectroscopia de plasma acoplado inductivamente
(ICP).

Plasma acoplado inductivamente

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Aplicación al análisis de alimentos

- Tiene gran importancia para la determinación de elementos traza en diferentes

alimentos, fundamentalmente de minerales traza
- También se puede utilizar para la determinación de contaminantes ambientales en
productos vegetales
- Determinación de algunas vitaminas.

TÉCNICAS BASADAS EN LA DISPERSIÓN DE RADIACIÓN

Existen dos tipos de dispersión:

- Dispersión elástica: se genera cuando la radiación incidente tiene la misma longitud
de onda que la dispersada.

- Dispersión de partículas pequeñas o Rayleigh: se produce cuando el tamaño

máximo de las partículas que producen la dispersión es menor al 5% de la longitud de
onda de la radiación. La intensidad de la luz dispersada se distribuye de manera
simétrica.
- Dispersión de grandes partículas: la distribución de la luz dispersada
disminuye en sentido retrógrado, debido a las interferencias constructivas y
destructivas.

- Dispersión inelástica: se produce cuando el fotón emitido tiene una longitud de onda
diferente.

TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA

Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de

partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa
turbia La turbidez es la propiedad óptica de una muestra que hace que la radiación sea
dispersada y absorbida mas que transmitida en línea recta a través de la muestra. La
turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un líquido. Hay dos
métodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetría y la nefelometría. Son
dos técnicas complementarias que se utilizan para el análisis cuantitativo de
disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas.

La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la

dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en
cualquier ángulo.

En la turbidimetría se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del
que llega a la disolución. En cambio, en la nefelometría la medida de la intensidad de
luz se hace con un ángulo de 90º con respecto a la radiación incidente. El instrumento
usado en la nefelometría, el nefelómetro se asemeja al fluorómetro. En cambio en
turbidimetría se utiliza el turbidíemetro que es un fotómetro de filtro.

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Turbidimetría

Es un método en el que se mide la disminución de la potencia de la radiación

transmitida debido a la dispersión. Se mide en un espectofotómetro UV/Vis.

Para determinar la concentración del analito mediante este método aplicamos:

En donde T es la transmitancia medida,It ,es la intensidad de la fuente de radiación

transmitida, Io es la intensidad de la radiación de la fuente transmitida por un blanco.
La relación entre T y la concentración de las partículas dispersas es similar a la
proporcionada por la ley de Beer:

- logT = kbC

Siendo C la concentración de las partículas dispersantes expresada como masa por

unidad de volumen; b es la longitud del camino óptico y k es una constante que depende
de varios factores: tamaño, forma de las partículas dispersantes y la longitud de onda.

Nefelometría
Es un método para medir la intensidad de una radiación dispersa en un ángulo de 90 ºC
con respecto a la fuente. Se mide en un espectrofluorímetro.
Para determinar la concentración de analito en este método aplicamos:

IS = KSIOC

Donde KS es una constante empírica del sistema, IO es la intensidad de la fuente de

radiación incidente. El valor de KS depende de una curva de calibración preparada,
usando una serie de patrones de concentración conocida.

La elección entre turbidimetría y nefelometría viene dada por dos factores:

- Intensidad de la radiación transmitida o dispersada con la intensidad de la radiación

procedente de la fuente. Cuando la concentración de partículas dispersantes en la
disolución es pequeña, IT será muy similar a IO. Por lo que la mejor elección cuando la
muestra contiene pocas partículas dispersantes es la nefelometría. La turbidimetría es
una buena técnica para cuando las muestras contienen grandes concentraciones de
partículas dispersantes.

- Tamaño de las partículas dispersantes. En la nefelometría la intensidad de la radiación

dispersada a 90ºC es mayor si las partículas son bastante pequeñas para que se produzca
una dispersión Rayleigh. Si las partículas son mayores la intesidad de la dispersión
disminuirá a 90ºC. En turbidimetría la señal consiste en la disminución relativa de la
radiación transmitida, por lo que el tamaño de las partículas dispersantes es menos
importante.

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Aplicaciones en alimentos de la turbidimetría y nefelometría

Generalmente, nefelometría y tubidimetría se utilizan en el análisis de la calidad

química del agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de
tratamiento. También se utilizan para la determinación de iones sulfato.

APLICACIONES AL ANÁLISIS DE ALIMENTOS DE LOS MÉTODOS

ÓPTICOS DE ANÁLISIS:

La espectroscopia UV/vis sirve, sobre todo en forma de fotometría, para hacer

determinaciones cuantitativas de los componentes de los alimentos y sus aditivos. Es de
utilidad para determinar el color extraído de un alimento, para determinar la
concentración de compuestos orgánicos tales como la cafeína, la vitamina A, y el ácido
benzoico, los cuales tienen grupos cromóforos que absorben fuertemente la luz UV.
Se usa también para la determinación enzimática de azúcares y otros constituyentes de
los alimentos.
Los métodos para determinar metales traza que involucran la medición de complejos
coloridos en la región visible, han sido completamente reemplazados por la
espectrofotometría de absorción atómica, usándose los procedimientos colorimétricos
en laboratorios pequeños para algunos aniones y cationes principales solamente.

La espectroscopia infrarroja, además de caracterizar e identificar sustancias

desconocidas y analizar mezclas, se utiliza desde controles sencillos de productos y de
calidad por comparación de espectros, hasta otros objetos más complicados, como la
determinación de simetrías moleculares y el cálculo de constantes de fuerza y relaciones
de enlace.

La espectrometría de absorción atómica resulta adecuada para la determinación

rápida de distintos metales pesados (plomo, mercurio, zinc, cadmio, arsénico...) y de
alcalinotérreos (estroncio...)

La fotometría de emisión de llama se utiliza principalmente para la

determinación de sodio y potasio.

La polarimetría se aplica sobretodo a la determinación cuantitativa de

carbohidratos, como sacarosa, azúcar invertido y glucosa o almidón.

La refractometría resulta adecuada para identificar y caracterizar grasas y

aceites, para comprobar la pureza de distintos alimentos y para la determinación
cuantitativa del contenido en agua de la miel o para determinar el extracto de alimento
que esté formado principalmente por azúcar (sacarosa), como es el caso de confituras,
miel, jarabe de almidón, zumos, etc.

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BIBLIOGRAFÍA:

• L. Hernández, C. González, Introducción al Análisis Instrumental. Editorial:

Ariel Ciencia (2002)

• D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman, Principios de Análisis Instrumental 5ª

edición. Editorial: Mc Graw Hill (2000)

• R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, Análisis de los Alimentos. Editorial

Acribia. S.A.

• R.S. Kirk, R. Sawyer, H.Egan, Composición y Análisis de Alimentos de Pearson.

Editorial CECSA.

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