PRÁCTICA 7: ESTUDIOS IN VIVO DE ANALGÉSICOS Y ANTICONVULSIVANTES

Los estudios de gran cantidad de fármaco, incluyendo éstos, se realizan en modelos animales.
Estos modelos tienen carácter predictivo de eficacia, potencia y toxicidad en humanos; sin
embargo, su uso en animales y humanos es diferente.

Los animales más usados en docencia son los ratones; mientras que en experimentación son
las ratas. Son animales especialmente preparados para ello, con cruces endogámicos entre
animales de la misma camada, de modo que se ha seleccionado características específicas de
ellos que resultan convenientes en investigación.

Abbie Lathrop (1868-1918) fue una de las primeras personas que comenzó a aplicar los cuidados
que se les daba a los animales mascota para, en este caso, obtener animales de
experimentación. Observó que estos animales eran menos agresivos, todos ellos homogéneos
y, además, por los cruces endogámicos estos animales tenían grandes probabilidades de
desarrollar cáncer. Así pues, fueron los primeros estudios de oncología relacionada con la
genética.

Tras la muerte de Abbie Lathrop se obtuvo la cepa C57-BL (a partir de una de las hembras de
rata) que ha sido muy utilizada en el estudio de farmacodependencia, docencia… Esta cepa fue
elegida por su pureza genética y la rapidez de su reproducción, por no ser agresivos y por
su utilidad en los estudios antes dichos. Además, también eran prometedores en estudios sobre
la adicción porque gustan del alcohol y otras drogas (esto hay que matizarlo, no van a ingerirlo
voluntariamente porque tienen muy buen olfato y van a rechazar el olor, la única forma de que lo
ingieran es retirarles el agua y ponerles drogas hasta que después de varias dosis se vuelven
adictos y ya no quieren agua normal). Actualmente también se utilizan otros modelos animales
como gatos, cerdos, monos… En farmacología se utilizan sobre todo ratones y ratas.

Esta cepa, de carácter albino (ojos rojos y pelaje blanco), tenía la característica de que, al
ponerla sobre una superficie blanca (como un papel, que contrastara con la superficie que había
debajo) se mantiene sólo en esa superficie y no sale de ahí, no salen corriendo. Es un
comportamiento que ha sido seleccionado genéticamente, pues un ratón de campo o una rata
en primer lugar huirían y se esconderían y, en segundo lugar, morderían para defenderse.

La cepa que nosotros usaremos en el laboratorio es la BALB/c, que tienen el pelo completamente
blanco, así como su cola, y sus ojos son naranjas. Son los más usados en todos los experimentos
en docencia dada su docilidad.

Vamos a administrar el fármaco vía peritoneal (también podría hacerse vía oral pero la
biodisponibilidad del fármaco sería mucho menor) con una aguja. La vía peritoneal es más rápida
(alcanza su concentración máxima antes) debido a su gran superficie de absorción y su gran
irrigación (hay muchos capilares sanguíneos y muy accesibles); por ello, es equivalente a la vía
IV en humanos (en humanos esta forma de administración tendría un riesgo muy grande de
producir una peritonitis).

La jeringa usada es del tipo de la de la insulina, es decir, subcutánea. Como norma general
daremos 0’2 mL de las sustancias. La técnica de administración consiste en:

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 1) Inmovilizar al animal con la mano izquierda; para ello le cogeremos del cuello. Al coger
al animal de la piel del cuello se queda inmovilizado y en una posición que nos permite
inyectarle el fármaco.
2) Le damos la vuelta e inyectamos el fármaco con la jeringa el fármaco, mientras con el
dedo meñique sostenemos la cola, usando la mano derecha. Lo haremos situando la
jeringa en un ángulo de unos 30 grados con respecto al cuerpo del animal, en la zona
inferior del abdomen, en la zona izquierda, para evitar dañar el hígado (los expertos en al
laboratorio lo hacen en cualquier parte).

Ejercicio nº1: Test de la placa caliente (evaluación analgésicos acción central):

Se evalúa la potencia de los analgésicos opioides principalmente. Son válidos para el dolor
profundo o visceral. La eficacia analgésica de todos los opioides es igual, así que se mide la
potencia analgésica (la morfina tiene potencia 1, mientras que la potencia del fentanilo es 100;
hablamos en estos términos en la escala de equianalgesia). Como la placa está caliente, el
animal se va a colocar en sus patas traseras y se va a lamer las delanteras porque no aguantan
el dolor y finalmente van a saltar para irse.

Emplearemos clorhidrato de morfina [HCL+ morfina] a 10 mg/mL. Pasamos el preparado a un

matraz Erlen-Meyer y lo pasamos a una jeringa subcutánea. Inyectamos la morfina según lo
indicado anteriormente. Vamos a comprobar que la morfina, y todos los opioides, producen la
Reacción de Straub, que es inmediata porque la inyección es intraperitoneal. Esta reacción
consiste en una contracción sostenida de toda la zona perianal, produciendo una elevación o
erección de la cola del animal.

Al animal control [otro ratón de la misma camada, sexo, peso similar, y al que se inyecta 0’2 mL
suero salino o agua destilada (preferentemente suero salino para no cambiar la homeostasis
interna) para que se encuentren ambos en el mismo estado de estrés hormonal de
catecolaminas, cortisol, endorfinas… debido a sus pinchazos] le colocamos en una placa caliente
a 60ºC.

Tendremos que medir 2 parámetros:

1) Tiempo (en s) que tarda el ratón en lamerse las patas delanteras.
2) Tiempo (en s) que tarda en saltar al quemarse para salir del estímulo estresor.

Habría que medirlo en más ratones porque, aunque sean cepas endogámicas sigue habiendo
variabilidad biológica; después habría que hacer una media de los tiempos. En el vídeo vemos
que en el ratón al que le hemos administrado suero tarda 17s en lamerse las patas y 23s en
intentar saltar, mientras que el ratón al que le hemos administrado morfina no se lame las patas
pasado un minuto (le retiramos de la placa para que no se queme las patas).Con estos test, p.
ej., se puede medir si un fármaco de neo-síntesis tiene efecto opioide: a mayor alargamiento de
ambos parámetros, mayor es la potencia analgésica. Se ha comprobado de forma empírica que
la analgesia en ratones es similar que en humanos, a pesar de que el dolor que lo provocamos
al ratón no sea el mismo que el dolor visceral humano.

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Ejercicio nº2: Test de retorcimiento (evaluación de analgésicos antitérmicos como los
AINE): Estos fármacos son empleados en el dolor osteo-músculo-articular. Comparamos la
aspirina con un placebo.

El test de retorcimiento por ácido acético predice la eficacia analgésica de los AINE. Lo primero
es disolver la aspirina en NaCl al 9% y echamos también HCO3-. Además, machacaremos la
pastilla. Se remueve continuamente la aspirina para que no precipite. A continuación, usamos
ácido acético al 1%. A cada ratón le daremos 2 pinchazos:
1) A uno le damos 0’2 mL de suero salino y el ácido acético al 1%.
2) Al otro le damos 0’2 mL de aspirina y 0’2 mL de ácido.

Con esto conseguimos producir una peritonitis química, de modo que el ratón se moverá menos
(le dolerá al moverse) y, al quedarse quieto, dejará atrás una pata y flexionará la otra. Esta
posición asimétrica es el retorcimiento del ratón, a veces no es sencillo verlo. Mediremos el
tiempo para que se produzca con un cronómetro de mano. Hay que medir: el tiempo que tarda
en aparecer el primer retorcimiento y el número de retorcimientos por minuto.

La aspirina alcanza enseguida una concentración plasmática máxima muy rápida, pero debemos
dejar un tiempo hasta el próximo pinchazo para permitir su absorción antes de inyectar acético.
Los ratones a los que se les administra la aspirina tienen un menor número de retorcimientos por
minuto. En este modelo ocurre lo mismo que en el anterior, al ratón no le provocamos un dolor
osteo-músculo-articular, pero el modelo sí es predictor de la analgesia de este tipo de dolor en
humanos.

Ejercicio nº3: Modelo animal de epilepsia:

El principal problema es que los ratones con cepas endogámicas no tienen epilepsia salvo que
sean ratones escogidos específicamente con ello genéticamente, por ello, son los investigadores
los que provocan las convulsiones en los ratones mediante electroshock o una sustancia
química. Tendremos un modelo de epilepsia para el estudio de las epilepsias tipo Gran mal y
tipo petit mal. **En humanos, el electroshock solamente se emplea para casos excepcionales de
depresión severa con tendencia al suicidio en los que no tenga éxito ningún otro tratamiento y
además, se aplica con anestesia general.

- Tipo gran Mal: se coloca un electrodo diferente en cada ojo del ratón y se aplica una
descarga eléctrica. Previamente se ha debido aplicar una solución con electrolitos para
no quemar al ratón. Hay que medir la duración de la crisis epiléptica en el ratón. Se
mide porque al finalizar ésta, el ratón es capaz de incorporarse ante un estímulo auditivo
producido por nuestro dedo al golpear la mesa de trabajo, al que se pondrá a perseguir.
También deberemos tener en cuenta la potencia de la descarga y el nº de crisis hasta
la curación.
- Tipo petit mal: se consigue producir la crisis epiléptica con la aplicación de Cardiazol
(sustancia que provoca arritmias e hipersalivación, puede morir algún ratón), aplicado al
10%. Este fármaco tiene una toxicidad cardiovascular muy elevada, se generan
convulsiones mayores que con el electroshock.

En ambos casos se hará una comparación entre un ratón al que se le aplicará DIAZEPAM vía
IV, que es anticonvulsivante y antiepiléptico, y otro al que no (control).

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Cogeremos 0’2 mL de diacepam o diacepam disuelto con agua y se lo inyectaremos al ratón
caso. Al otro se le dan 0’2 mL de suero salino. Luego se esperan 10-15 min (para permitir la
absorción) y se da Cardiazol. La mitad de los ratones pueden morir por fibrilación auricular o
ventricular.

Antes de darle al ratón protegido el Cardiazol, practicaremos un 4º test, que es el test del plano
inclinado, para comprobar los efectos de las benzodiacepinas. Cuando no hay benzodiacepina
el ratón, si está en la parte alta del plano, se agarra para no caerse, mientras que si está en la
parte baja del plano trepa hasta arriba. Una vez aplicada la benzodiacepina, el ratón no es capaz
de trepar ni de agarrarse, porque sufre una descoordinación motora (este efecto es importante a
tener en cuenta en las personas ya que puede afectar a las actividades profesionales, no se
puede conducir ni manejar maquinas bajo su efecto). **Un efecto adverso de las benzodiacepinas
es la rotura de cadera en las personas mayores.

Una vez demos el Cardiazol (que es muy pro-convulsivante), vemos que el diazepam le protege
completamente de la crisis anticonvulsivante.