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TCNICAS Y MTODOS
ERRNVPHGLFRVRUJ
Dra. Pilar Roca
Profesora Titular de Bioqumica y Biologa Molecular
Dr. Jordi Oliver
Profesor Titular de Escuela Universitaria de Bioqumica y Biologa Molecular
Dra. Ana M Rodrguez
Ayudante de Universidad
Serie
Base
BIOQUMICA. TCNICAS Y MTODOS
AUTORES:
Dra. Pilar Roca
Dr. Jordi Oliver
Dra. Ana M Rodrguez
del libro:
Editorial Hlice, 2003
de los autores, 2003
del CD:
Editorial Hlice, 2003
roolpi, 2003
EDICIN Y COORDINACIN:
Alicia Irurzun y Elena Feduchi
Editorial Hlice
C/Alberto Aguilera, 13, 4
28015 Madrid
Tel y Fax: 91 548 11 90
www.editorialhelice.com
Impreso en Espaa
ISBN: 84-921124-8-4
Depsito Legal:
Reservado todos los derechos. Ninguna parte de este libro ni del CD puede ser reprodu-
cida total ni parcialmente, ni almacenada en un sistema informtico, ni trasmitida de
cualquier forma o por cualquier medio, electrnico, mecnico, fotocopia, grabacin u
otros mtodos, sin previo aviso y expreso permiso de Editorial Hlice.
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Prlogo
Sueo de un ayer
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Prlogo
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Prlogo
7
ndice breve
9
ndice
10
ndice
11
ndice
12
ndice
13
ndice
14
ndice
15
ndice
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La Bioqumica y su estudio
INTRODUCCIN
CMO ENFOCAR UN ESTUDIO EN BIOQUMICA
NIVELES DE INVESTIGACIN EN BIOQUMICA
Estudios con un animal entero
Estudios de rganos aislados
Estudios con cultivos de tejidos y de clulas
Estudios con orgnulos celulares
Estudios moleculares
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1
INTRODUCCIN
El estudio de la Bioqumica Analtica las tcnicas y los mtodos tiene una serie
de objetivos bsicos que se irn descubriendo a lo largo de este libro. Antes de
realizar un estudio ms detallado de los objetivos de esta materia, es convenien-
te detenerse a estudiar qu es la Bioqumica y, por extensin, conocer cules son
los objetivos de la metodologa Bioqumica.
Aunque resulta difcil definir qu es la Bioqumica, se han dado diferentes
definiciones de la misma:
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Captulo 1
Composicin: molculas y elementos que forman los seres vivos. As, se estudia
la composicin qumica tanto en bioelementos (C, H, N, O, S, Fe, Ca, ...), como
en las principales biomolculas que forman los seres vivos (agua, monosacridos,
polisacridos, aminocidos, protenas, cidos grasos, triacilgliceroles, etc.).
Relaciones: las diferentes molculas que forman los seres vivos interaccionan
entre ellas formando agrupaciones supramoleculares. Algunos ejemplos son los
cromosomas (cidos nucleicos + protenas), las membranas (lpidos + prote-
nas), las lipoprotenas (lpidos + protenas), etc. Estas agrupaciones supramolecu-
lares presentan diferentes propiedades y forman las estructuras subcelulares
(mitocondrias, ribosomas, lisosomas, aparato de Golgi, etc.), que permiten a la
clula realizar las distintas funciones para mantener el fenmeno vital. Adems,
la bioqumica estudia cmo las diferentes clulas interaccionan para formar los
tejidos multicelulares, rganos, organismos, etc.
20
La Bioqumica y su estudio
das las ciencias experimentales. As pues, frente a un problema que se quiera re-
solver o sobre el que se quiera profundizar, puede plantearse una hiptesis, a
partir de una informacin previa, sobre su resolucin. En funcin de la hiptesis,
se realizar un diseo experimental que permita descartarla o bien aceptarla. El
diseo experimental se fundamentar en toda una serie de tcnicas y mtodos,
que permitirn llevar a cabo la fase experimental, a partir de la cual se obtendr
una serie de resultados. Los datos obtenidos debern ser interpretados, extrayn-
dose unas conclusiones que permitan rechazar o aceptar la hiptesis de partida,
aunque normalmente suelen conllevar nuevas cuestiones o nuevos problemas,
que debern ser investigados. Todo esto supone aumentar el conocimiento sobre
un tema determinado, pero es evidente que difcilmente se podr conocer toda
la verdad sin que se planteen nuevas preguntas, y que la aceptacin temporal de
una hiptesis va a depender, en gran medida, de la instrumentacin, las tcnicas
y los conocimientos cientficos del momento. De ah que la ciencia est en con-
tinua evolucin y que las viejas teoras se vayan descartando, cambiando o am-
pliando.
Como se puede observar, en el caso de la Bioqumica, la instrumentacin, las
tcnicas y la metodologa utilizadas para confirmar las hiptesis son cruciales,
pues se depende de la fiabilidad y la sensibilidad de stas para poder reafirmar o
rechazar las hiptesis planteadas inicialmente.
En estos momentos estamos en disposicin de decir cul es el objetivo bsico Figura 1.2. Fases del mtodo cientfico.
de este libro:
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Captulo 1
Experimentos in vivo
En los estudios in vivo, el organismo se mantiene intacto, con la menor
perturbacin posible. En contrapartida, es ms difcil identificar las varia-
bles que pueden influir sobre el sistema.
Experimentos in vitro
En los estudios in vitro, el organismo o el sistema se mantiene aislado de su
entorno, con lo que se produce una perturbacin del mismo. En contra-
partida, es ms fcil controlar las variables que pueden influir sobre el sis-
tema.
Los dos enfoques son complementarios ya que, mientras que los estudios in
vitro son ms fciles de interpretar que los estudios in vivo, las conclusiones ob-
tenidas de un estudio in vitro pueden alejarse de la realidad al haber eliminado
factores que influyen sobre el sistema (Figura 1.3). Entre un tipo de enfoque y
otro existe una gradacin con todos los tipos posibles. As, una experiencia in
situ, se encontrara en un nivel intermedio de la gradacin; por ejemplo, para
estudiar el rgano de un animal anestesiado, el rgano es canulado fuera del
animal y perfundido con diferentes compuestos.
22
La Bioqumica y su estudio
23
Captulo 1
Un ejemplo servir para ilustrar los distintos niveles de estudios que se pue-
den realizar en bioqumica: el estudio de la actividad termognica adaptativa en
roedores. La termognesis adaptativa, o produccin de calor frente a determina-
das situaciones, est regulada por diferentes vas que permiten responder a dife-
rentes factores ambientales, como la dieta y el fro.
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La Bioqumica y su estudio
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Captulo 1
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La Bioqumica y su estudio
27
Captulo 1
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La Bioqumica y su estudio
Estudios moleculares
Otro nivel de estudio en bioqumica consiste en analizar las molculas que for-
man los seres vivos y la estructura que stas presentan, as como los cambios que
se pueden producir en las mismas y que pueden ayudar a entender los fenme-
nos que tienen lugar en la clula.
Las molculas pueden aislarse utilizando tcnicas de separacin a partir de
los homogeneizados de diferentes tejidos. As, por ejemplo, se pueden estudiar
los efectos de la incubacin de la citocromo c oxidasa (Cox) con uno de sus
efectores alostricos, el citocromo c, y determinar cmo su actividad enzimtica
queda afectada (Figura 1.11), o los cambios que pueden darse en la estructura
de esta enzima, utilizando rayos X.
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Seguridad y riesgos
INTRODUCCIN
NORMAS DE SEGURIDAD
Productos qumicos
Etiquetado
Almacenamiento
Medidas de seguridad personal. Comportamiento del investigador
Fuentes de peligro en el laboratorio
Investigaciones con productos radiactivos
Investigaciones con microorganismos patgenos
NORMAS GLP: The Good Laboratory Practices
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2
INTRODUCCIN
Este captulo va a tratar de manera muy general las medidas bsicas de seguridad
que deben tomarse y respetarse cuando se trabaja en un laboratorio. Se har es-
pecial referencia al manejo de materiales biolgicos peligrosos y de material ra-
diactivo, y al desecho de productos txicos.
Hay un gran nmero de personas que trabaja en laboratorios y que maneja
materiales peligrosos de manera habitual y rutinaria. Las personas con riesgo son,
en primer lugar, los propios investigadores, pero tambin puede extenderse el
riesgo a otras personas, entre ellas, estudiantes (en el caso de laboratorios acad-
micos o universitarios), trabajadores de mantenimiento, etc.
La palabra seguridad tiene muchas connotaciones y, a la vez, es un trmino
relativo. Se dice que un acto es seguro si est libre de cualquier posibilidad de
accidente, pero, evidentemente, la probabilidad de accidente siempre existe
aunque sea baja. El acto se denomina entonces relativamente seguro. Por
ejemplo, el uso de un determinado aparato por parte de un especialista es re-
lativamente seguro si se compara con su uso por parte de alguien inexperto en
el tema. Por otra parte, el trmino seguridad siempre incluye asumir o aceptar
un cierto riesgo. En este sentido, el trmino es tambin relativo, ya que la can-
tidad de riesgo que es aceptable para una determinada persona puede no ser-
lo para otra.
Los riesgos pueden minimizarse identificando las fuentes de peligro y cono-
ciendo el riesgo de accidente inherente a estos peligros. Muchos de los peligros
con los que uno puede enfrentarse en un laboratorio son ya conocidos y los ries-
gos asociados a ellos estn ya bien definidos. Adems, se han desarrollado tcni-
cas para evitar una exposicin innecesaria a estos peligros.
Cualquier prctica de laboratorio se lleva a cabo con un cierto grado de ries-
go. Es importante determinar la cantidad de riesgo y qu efecto puede tener so-
bre el experimento y sobre el investigador. Por otra parte, la evaluacin de la
seguridad permite confeccionar un plan para reducir los riesgos y para encon-
trar mtodos alternativos que permitan alcanzar los mismos objetivos minimi-
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Captulo 2
zando los riesgos. Es evidente que la exposicin a un riesgo puede ser asumida
voluntariamente o impuesta. Determinadas personas aceptan un alto grado de
riesgo porque sienten que as obtienen un beneficio en la actividad que reali-
zan. Por ejemplo, se conoce que el tabaco es perjudicial para la salud ya que su
consumo est asociado a enfermedades neoplsicas, cardacas y pulmonares y,
a pesar de ello, sigue habiendo mucha gente que fuma. Tambin hay deportes
cuya prctica resulta muy peligrosa. Adems, hay distintos grados de riesgo; por
ejemplo, es diferente el riesgo que entraa fumar tres cigarrillos diarios que fu-
mar tres cajetillas.
Hay distintos tipos de laboratorios (industriales, clnicos, universitarios,
etc.), y cada uno de ellos tiene sus propios problemas en cuanto a seguridad.
Por ejemplo, en un laboratorio clnico el principal problema de seguridad se
plantea en los estudios mdicos en los que se utilizan muestras biolgicas pro-
cedentes de pacientes con enfermedades infecciosas; en estos casos se requie-
ren tcnicas especiales para evitar los riesgos de exposicin a tales agentes
infecciosos. Por otra parte, el trabajo con animales de laboratorio infectados
experimentalmente con agentes patgenos implica peligros adicionales. Por
ello son necesarios los programas de seguridad en los laboratorios de los hos-
pitales.
El objetivo de los programas de seguridad consiste no slo en reducir la
probabilidad de accidente, sino tambin en proteger al personal laboral y a
la propiedad. Un programa de seguridad implica ciertos beneficios adiciona-
les; entre ellos, reducir la prdida de tiempo que suponen los accidentes,
conseguir programas de produccin ms efectivos y ms predecibles, tener
seguros menos costosos y, evidentemente, motivar de forma positiva al tra-
bajador.
Es obvio que la seguridad es responsabilidad de todos. Por lo tanto, la direc-
cin de la institucin o de la empresa debe crear una atmsfera positiva y cons-
ciente. Los trabajadores del laboratorio son responsables de manejar y procesar
con seguridad los productos qumicos con los que trabajan habitualmente. En
este sentido, la direccin tiene la responsabilidad de comprobar y asegurarse de
que los trabajadores del laboratorio sigan y respeten las precauciones y las nor-
mas de seguridad. De la misma forma, la direccin debe ser consciente de las
posibles deficiencias en la construccin, en los equipos de seguridad o en las re-
glas de trabajo.
Las universidades o empresas no slo tienen una responsabilidad moral de
tener personal trabajando en condiciones ptimas de seguridad, sino que en
muchas ocasiones tienen tambin una responsabilidad legal. En este sentido, to-
das las instalaciones deben estar en perfectas condiciones. De hecho, se suelen
realizar inspecciones peridicas para asegurar el buen mantenimiento y funcio-
namiento de dichas instalaciones.
Asimismo, los trabajadores del laboratorio deben ser informados acerca de la
naturaleza de los compuestos, del equipamiento y de los procedimientos utiliza-
dos y de los peligros que entraa su manejo. Si esta informacin se desconoce o
no se tiene acceso a ella, por ejemplo, con relacin a sustancias de peligrosidad
desconocida, es recomendable que los trabajadores traten tales sustancias como
si fueran realmente muy peligrosas. Los investigadores son tambin responsables
de instruir a los tcnicos o ayudantes de laboratorio sobre los procedimientos
seguros para manejar sustancias peligrosas o llevar a cabo reacciones tambin
peligrosas.
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Seguridad y riesgos
NORMAS DE SEGURIDAD
Productos qumicos
Etiquetado
Muchos de los productos qumicos que deben manejar habitualmente los inves-
tigadores comportan un cierto riesgo. Los distribuidores de dichos productos
qumicos tienen el deber de proteger a los usuarios de aquellos daos previsibles
que pueda acarrear la utilizacin de los mismos. Ese deber se cumple indicando
las precauciones que han de tomarse en el manejo del producto en cuestin
mediante la colocacin de etiquetas de aviso adecuadamente situadas (Figura
2.1). Los usuarios de estos productos qumicos tienen, por su parte, el deber de
leer, entender y cumplir las recomendaciones de las etiquetas con el fin de pre-
venir daos no solamente a ellos mismos, sino tambin a los dems. Por otra
Figura 2.1. Etiquetas tipo de productos
parte, es tambin evidente que las etiquetas con indicaciones de precaucin de- qumicos.
ben ser fciles de entender y de leer, adems de proporcionar o indicar las me-
didas de precaucin que deben seguirse.
En las etiquetas de los productos qumicos deben aparecer las siguientes indi-
caciones:
Almacenamiento
Hay que evitar guardar productos qumicos peligrosos, como lquidos inflama-
bles, en recipientes que no sean adecuados o que estn incorrectamente marca-
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Captulo 2
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Seguridad y riesgos
Aseo personal. Tampoco debera estar permitido que uno se afeite, se lave los
dientes o se aplique cosmticos dentro del laboratorio.
Las pipetas de vidrio y otras herramientas bsicas de laboratorio pueden ser una
fuente de peligro, puesto que se utilizan para la medida volumtrica de fluidos
que frecuentemente suelen ser peligrosos, contener agentes infecciosos, ser txi-
cos, corrosivos, voltiles o radiactivos. Una pipeta puede convertirse en un uten-
silio muy peligroso si se utiliza indebidamente. Evidentemente, el principal
peligro est en succionar con la boca, lo cual est absolutamente prohibido.
Tambin es peligroso si se aspiran directamente con la boca lquidos voltiles.
Otra fuente de peligro es tocar las puntas de las pipetas, que pueden estar im-
pregnadas de lquidos txicos y corrosivos.
Las jeringas, las agujas (hipodrmicas) y las pipetas son instrumentos poten-
cialmente peligrosos. Habitualmente, en los laboratorios se dispone de recipien-
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Captulo 2
tes adecuados donde se pueden tirar las jeringas y agujas utilizadas (Figura 2.5).
Esta medida de seguridad evita pinchazos inoportunos.
Las tcnicas de centrifugacin tambin pueden acarrear algunos proble-
mas de seguridad, sobre todo en cuanto a los fallos mecnicos que puedan su-
poner la rotura de los tubos y la contaminacin de la propia centrfuga e
incluso de los alrededores de la misma. Las centrfugas ms modernas dispo-
nen de canastillas para los tubos que pueden cerrarse hermticamente, evitan-
do este problema.
Los baos termostatizados tambin pueden ser una fuente de contamina-
cin. En este sentido, deben tomarse precauciones para impedir el crecimiento
de organismos que puedan conllevar problemas de contaminacin.
Figura 2.5. Recipiente para la recogida de La utilizacin adecuada de cabinas de seguridad (Figura 2.6) y campanas
agujas. extractoras de gases (Figura 2.7), junto con buenas tcnicas y procedimientos
de laboratorio, constituye la primera barrera contra la exposicin potencial a
materiales peligrosos. El vestuario y el equipo de seguridad son importantes,
pero deben entenderse como una medida secundaria para mejorar las condicio-
nes de seguridad.
Las precauciones que hay que tomar en la utilizacin del material bsico de
cualquier laboratorio se hacen extremas cuando se habla de investigaciones rea-
lizadas con patgenos.
Existe tambin toda una serie de peligros, como son los mecnicos, elctri-
cos o de incendio a los que a veces se les resta importancia precisamente por
ser ms habituales. Algn ejemplo de peligros fsicos y mecnicos son el hecho
de cortarse con un cristal o pincharse con una aguja, o bien daarse alguna par-
te del cuerpo al mover determinados equipos. Otra fuente de peligro es el al-
macenamiento de reactivos en lugares no adecuados o no habituales o la
existencia de botellas de gases. Puede constituir un peligro la utilizacin de gas
Figura 2.6. Campana de proteccin butano o propano en el laboratorio, o de productos que al mezclarse pueden
biolgica. ser explosivos.
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Seguridad y riesgos
trando en contacto directo con las personas y el medio exterior. Las ms abun-
dantes en los laboratorios son las fuentes no encapsuladas.
La manipulacin de fuentes no encapsuladas presenta el problema adicional
de que el peligro de contaminacin es muy grande, por lo que en este caso se
requieren medidas de seguridad adicionales. En primer lugar, se deben habilitar
zonas en las que realizar este tipo de operaciones, que han de ser siempre las
mismas, con el fin de evitar la dispersin de la posible contaminacin radiactiva
(Figura 2.8). El material de laboratorio y el aparataje presente en estas zonas no
debe ser utilizado fuera de ellas, a no ser que previamente hayan sido sometidos
a un proceso de descontaminacin. Debern evitarse los mtodos de trabajo
Figura 2.8. Medidas de proteccin para
que impliquen dispersin de la sustancia radiactiva (formacin de gases, aeroso- trabajar con material radiactivo.
les, etc.), siendo siempre preferible trabajar por va hmeda antes que por va
seca. Todo el material utilizado que no pueda ser descontaminado con facilidad
(esencialmente material de laboratorio hecho de plsticos), as como el material
de radioproteccin (guantes, mascarillas, etc.) deber ser tratado como residuo
radiactivo, por lo que tendr que separarse del resto de residuos de laboratorio
hasta que pueda ser retirado por personal autorizado, que dispondr de l en la
forma que establece la legislacin vigente (Figura 2.9).
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Captulo 2
Son una serie de normas que deben cumplir todos los laboratorios que dese-
en enviar datos cientficos sobre nuevas drogas o medicamentos a agencias esta-
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Seguridad y riesgos
01. Debe existir una unidad de control de calidad, o una comisin encarga-
da del control de calidad. Dicha unidad puede estar integrada por una
sola persona.
02. Esta unidad debe estar separada y ser una entidad diferente del personal
que lleva a cabo el estudio.
03. El personal que lleva a cabo el estudio o la investigacin debe estar en-
trenado, documentado y debe tener la experiencia necesaria para reali-
zar las funciones que se le han encargado.
04. Debe existir un manual de control de calidad, aunque las normas GLP
no especifican los contenidos de dicho manual.
05. Deben estar escritos los procedimientos estndar de operacin, incluso
los mtodos analticos.
06. Todos los procedimientos de mantenimiento y calibrado deben estar es-
critos.
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Captulo 2
07. Debe existir un lugar adecuado donde almacenar las muestras antes de
ser analizadas. Debe ser un lugar separado del laboratorio que contenga
el equipamiento necesario, es decir, refrigeracin para la conservacin
de las muestras.
08. Debe haber una zona de archivo que permita el almacenamiento de to-
dos aquellos datos y documentos que sean relevantes. El acceso al archi-
vo debe ser restringido.
09. Se deben llevar a cabo inspecciones peridicas en distintas fases del es-
tudio y debe quedar constancia de tales inspecciones.
10. Los mtodos de muestreo deben estar tambin disponibles si se llevan a
cabo por el personal del laboratorio; si no, este punto es responsabilidad
de la organizacin que lleva a cabo el muestreo.
11. Todos los reactivos y soluciones deben estar adecuadamente marcados
identificando sus componentes, su concentracin, la fecha de prepara-
cin, los requerimientos de conservacin y la fecha de caducidad.
Las normas GLP fueron originalmente escritas en relacin con estudios que
evaluaban los efectos biolgicos de los materiales qumicos. Sin embargo, la EPA
est implicada con la contaminacin ambiental, los desechos peligrosos y la reti-
rada y manejo de materiales txicos. Por ello las normas GLP, en este caso, se
han ampliado para cubrir estos aspectos.
En aquellos laboratorios en los cuales el personal trabaja con microorganis-
mos o, en general, material biolgico peligroso, las normas GLP hacen referencia
a proteccin personal y normas de conducta y de higiene. Hay siete reglas bsi-
cas de bioseguridad:
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La metodologa analtica
INTRODUCCIN
FUNDAMENTO DE LOS MTODOS DE ANLISIS BIOQUMICOS
Mtodos qumicos
Mtodos fsicos
Mtodos enzimticos
Mtodos inmunolgicos
Mtodos de hibridacin
ERRORES DE LOS MTODOS ANALTICOS
Variabilidad de los datos analticos
Errores accidentales
Errores sistemticos
Valoracin de los mtodos analticos
Control de calidad de los resultados
SELECCIN DEL MTODO DE ANLISIS
PRESENTACIN DE LOS DATOS
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3
INTRODUCCIN
En los laboratorios de bioqumica es fundamental la eleccin del mtodo ade-
cuado para cada necesidad. Esta eleccin requiere que se evale una serie de
aspectos importantes, como pueden ser la finalidad del mtodo (detectar o
cuantificar), su fundamento, la disponibilidad de muestra, el tipo de muestra a
analizar (posible existencia de contaminantes e interferencias), la disponibilidad
de instrumental, la fiabilidad de la tcnica, el tiempo de procesamiento, el coste
(reactivos, instrumental, personal), etc.
As, pueden encontrarse en la bibliografa tanto mtodos que permiten iden-
tificar las biomolculas presentes en una muestra (mtodos de anlisis cualitati-
vos), como mtodos que permiten la determinacin de la cantidad presente de
un determinado compuesto (mtodos de anlisis cuantitativos), pasando por m-
todos que permiten inferir si la cantidad de muestra presente es mayor o menor
que la de un control (mtodos de anlisis semicuantitativos) (Figura 3.1).
A la hora de presentar resultados, tanto en un laboratorio de investigacin
como en un laboratorio clnico, tienen que incluirse datos para indicar la fiabili-
dad de los mismos, ya que las determinaciones en el laboratorio se encuentran
sometidas a errores de diferente ndole, por ejemplo debidas a la manipulacin
de la muestra, a problemas con los reactivos, a desajustes en los sistemas de de-
43
Captulo 3
teccin, etc. Adems, otro aspecto importante es que los resultados de un labo-
ratorio de anlisis clnico se utilizan para el diagnstico de enfermedades; en ta-
les casos se establece un valor de referencia para establecer el carcter normal o
patolgico del resultado. Aparte de los errores que pueden cometerse en el la-
boratorio, otro problema radica en la variabilidad biolgica, que, por ejemplo,
provoca que personas sanas se encuentren en lmites establecidos como patol-
gicos, mientras que algunas de las personas enfermas pueden tener valores de
determinados parmetros dentro de los lmites de normalidad. As, la identifica-
cin de las fuentes de error y la eliminacin o reduccin de stas son claves para
una correcta clasificacin de las personas dentro del grupo de las sanas o de las
enfermas.
En este captulo se introducen una serie de conceptos que ayudan a elegir el
mtodo ms adecuado a cada necesidad, as como a evaluar la calidad de los
datos de un mtodo seleccionado, al tiempo que se introducen tambin los
principios generales de los diferentes mtodos analticos que pueden utilizarse
en el laboratorio.
44
La metodologa analtica
Mtodos qumicos
45
Captulo 3
46
La metodologa analtica
Mtodos fsicos
Un problema muy comn, en el caso de los compuestos bioqumicos, es que
son muy parecidos en cuanto a sus propiedades qumicas, por lo que stas no
son lo suficientemente especficas, a veces, para poder realizar la determina-
cin de determinadas sustancias como, por ejemplo, de un aminocido en con-
creto en presencia del resto de aminocidos. Por esta circunstancia se
desarrollaron las tcnicas separativas, que se fundamentan en las propiedades
fsicas de los compuestos a determinar, como solubilidad, polaridad, punto iso-
elctrico, etc., para acudir posteriormente a un mtodo qumico para su cuanti-
ficacin (Figura 3.6). Figura 3.6. Resultado de la determinacin
de diferentes aminocidos, tras su
En muchos casos es necesario exacerbar cualquier pequea diferencia repi- separacin por tcnicas fsicas
tiendo la manipulacin de separacin muchas veces. Un ejemplo es la cromato- (cromatografa) y posterior deteccin
grafa en papel, que es un procedimiento de extraccin con disolventes en el qumica con ninhidrina.
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Captulo 3
Mtodos enzimticos
Los mtodos qumicos y fsicos no son muchas veces suficientes para determinar
todas las sustancias presentes en una muestra. As, en el caso de las protenas, las
tcnicas separativas no permiten, la mayora de las veces, determinar una prote-
na determinada en presencia de otras. Por ejemplo, la determinacin de una en-
zima en concreto es difcil por tcnicas separativas, pues las diferencias fsicas de
carga y tamao no son tan grandes que permitan, en la mayora de los casos, di-
ferenciarlas de todo el resto de protenas. La solucin a este problema analtico
est en determinar la cantidad de funcin que tiene una protena, ya que es pre-
cisamente esta funcin lo que la diferencia del resto de protenas. Las enzimas
son especficas de reaccin y sustrato, y los elementos que intervienen en la reac-
cin pueden determinarse, bien porque presentan una caracterstica que puede
medirse o bien porque pueden determinarse por mtodos qumicos (Figura 3.7).
As pues, la aparicin del producto de la reaccin catalizada por la enzima, o la
desaparicin de sustrato, permiten medir la velocidad de transformacin, que es
directamente proporcional a la cantidad de enzima presente en el medio. La acti-
vidad mxima de la enzima es funcin de su poder cataltico y de la cantidad de
enzima presente. Por lo tanto, si se estudia la funcin en condiciones saturantes
de sustrato, se puede inferir la cantidad de enzima presente en la reaccin.
As, estudiar la funcin de una determinada protena puede ser un indicador
de la cantidad de protena presente. Histricamente se ha podido comprobar
que la solucin a los problemas que no podan solucionar la qumica y la fsica,
en muchas tcnicas analticas, se encontraba en los propios conocimientos de la
Bioqumica y en el funcionamiento de las protenas.
An ms, las enzimas tambin podan utilizarse como reactivos, ya que los
reactivos qumicos nicamente reconocen un grupo funcional, mientras que las
enzimas no slo reconocen el grupo funcional, sino un sustrato concreto; as
pues, la utilizacin de las mismas como alternativa a los mtodos qumicos au-
menta la especificidad de muchas determinaciones bioqumicas.
48
La metodologa analtica
Por otra parte, las enzimas no slo pueden utilizarse como reactivos, sino
que, adems, pueden utilizarse como un sistema de marcaje alternativo a la ra-
diactividad. Esto es debido a que determinadas molculas pueden conjugarse
con una enzima, la cual podr detectarse, por ejemplo, por su capacidad de
producir un color o luminiscencia al suministrarle un sustrato adecuado, pero
con la ventaja de que una nica molcula de enzima es capaz de transformar un
gran nmero de molculas de sustrato en un compuesto que presente una ca-
racterstica mensurable, como la aparicin de color o de fluorescencia, actuando
no slo como sistema de marcaje, sino permitiendo tambin amplificar la seal.
Mtodos inmunolgicos
Histricamente, se observ que con la aparicin de las tcnicas enzimticas se
pudo estudiar un grupo importante de protenas, pero no todas las protenas tie-
nen actividad enzimtica o una funcin que pueda medirse. As, un gran nme-
ro de protenas no podan determinarse, al no poseer una funcin caracterstica
fcilmente mensurable. Sin embargo, la diferencia entre todas las protenas radi-
ca en su configuracin tridimensional (determinada por la secuencia de amino-
cidos que la forman), nica para cada protena, y, en consecuencia, la
cuantificacin de las protenas poda basarse tambin en esta caracterstica. La
solucin se encontr en el mecanismo de accin de las inmunoglobulinas o anti-
cuerpos, es decir, en las reacciones inmunoqumicas (Figura 3.8). El principio de
reconocimiento anticuerpo-antgeno constituye el principio de especificidad de
los mtodos inmunolgicos, que, al igual que el resto de mtodos, necesitan un
sistema de deteccin posterior a la reaccin inmunolgica.
Los cidos nucleicos son difciles de determinar por las tcnicas presentadas an-
teriormente. Las diferencias de tamao de las especies de ARN o de los frag-
mentos de ADN no permiten una plena identificacin de los cidos nucleicos, lo
que determin que tuvieran que desarrollarse nuevas tcnicas para poder reali-
zar una identificacin plena y correcta de los mismos. Adems de en el tamao,
los cidos nucleicos difieren, principalmente, en la secuencia de nucletidos. La
clave estaba en desarrollar una tcnica que permitiera el reconocimiento de una
secuencia determinada. La respuesta a este problema se encontr en el conoci-
miento del proceso de formacin de la doble hlice del ADN, ya que las dos he-
bras de ADN se unen por el establecimiento de puentes de hidrgeno entre las
bases nitrogenadas. La complementariedad de bases entre dos secuencias de
ADN puede permitir que se unan formando la doble hlice. Si se poda conse-
guir un fragmento de ADN con una secuencia de bases complementaria a un
segmento de un cido nucleico determinado, podra utilizarse este fragmento
(conocido con el nombre de sonda) para realizar un reconocimiento especfico
del ADN a estudiar (Figura 3.9). El proceso se conoce con el nombre de hibrida-
49
Captulo 3
Al realizar determinaciones repetidas sobre una misma muestra, los datos ob-
tenidos presentan una cierta variacin, pero se agrupan en torno a un valor cen-
tral media de tal manera que, a medida que nos alejamos de este valor
central, es menos probable que se d dicho valor. En la figura 3.10 se puede ob-
servar la forma de una distribucin normal y el significado de la media y la des-
viacin estndar.
Cuando se realiza una determinacin en laboratorio, lo que se obtiene es tan
slo una aproximacin del valor real, ms o menos cercana a la realidad depen-
diendo de la variabilidad de la determinacin, que se mide por la desviacin
estndar de los resultados.
La desviacin estndar responde a la siguiente frmula:
n
donde: x : media aritmtica
Figura 3.10. Distribucin normal y
( x x i )2 xi: datos individuales
i 1
significado de la desviacin estndar. s n: nmero de medidas individuales
Entre el valor de la media s (desviacin n
estndar) se encuentra el 68,3% de los
resultados; entre el valor de la media 2s Para el clculo de la desviacin estndar es necesario un gran nmero de re-
se encuentra el 95,4% de los resultados; y
entre el valor de la media 3s se
peticiones. Para menos de 30 repeticiones, el valor de s es slo aproximado y
~
encuentra el 99,7% de los resultados. debe utilizarse entonces la desviacin tipo s :
n
donde: x : media aritmtica
( x x i )2 x: datos individuales
~ i 1
s n: nmero de medidas individuales
n1
Los errores que pueden darse cuando se realiza una determinacin en el la-
boratorio pueden afectar tanto al valor de la media como a la variabilidad del
mtodo; entonces se habla de errores accidentales o de errores sistemticos. El
efecto de los primeros es incrementar la variabilidad en la determinacin, mien-
tras que los segundos cambian el valor de la media. Tanto un tipo de error como
el otro provocan una mala estimacin del resultado y, en el caso de una prueba
diagnstica, una mala clasificacin de la persona. As, las medidas para evitar los
errores deben de extremarse al mximo.
50
La metodologa analtica
Errores accidentales
Los errores accidentales son el resultado de una acumulacin de variaciones sim-
ples e indeterminadas que se dan durante el desarrollo del mtodo. Por ejem-
plo, se dan en la estimacin de valores comprendidos entre dos marcas de la
graduacin de cualquier escala, al pipetear muestras, al pesar muestras, al prepa-
rar los reactivos, durante la lectura de los resultados, etc. Un cmulo de este tipo
errores da lugar a que la variabilidad de los resultados sea mayor. Si se extreman
las precauciones se disminuye la variabilidad del mtodo.
El error experimental no puede eliminarse, pero s puede reducirse con una
manipulacin cuidadosa. La forma ms aceptable de expresar la variacin que
aparece entre medidas repetidas se consigue calculando la desviacin estndar
de los datos.
El conocimiento de la desviacin estndar permite evaluar de manera precisa
la distribucin de las medidas alrededor del valor medio. Si se ha realizado un
cierto nmero de repeticiones en lugar de una nica medida, se puede tener un
grado mayor de confianza en el valor medio resultante. Esta confianza se expre-
sa como el error estndar de la media (S.E.M., standard error of the mean):
s
S.E. M.
n1
Los errores accidentales aumentan la dispersin, es decir, el valor de la des- Figura 3.11. Efecto de los errores
accidentales: aumento de la dispersin.
viacin estndar (Figura 3.11).
Errores sistemticos
Como su nombre indica, son errores que se repiten siempre en el mismo senti-
do, suelen ser especficos de cada mtodo y se deben generalmente a errores de
manipulacin de la muestra, a un mal calibrado de la instrumentacin utilizada,
a la presencia de contaminantes que interfieren en la determinacin, etc. El
efecto fundamental de los errores sistemticos es el cambio en el valor de la me-
dia de un grupo de valores con respecto a la media original, no afectando a la
distribucin de los valores alrededor de la nueva media, ya que la desviacin
estndar tendr un valor similar (Figura 3.12).
51
Captulo 3
52
La metodologa analtica
53
Captulo 3
54
La metodologa analtica
La eleccin del mtodo de anlisis requiere por parte del bioqumico la eva-
luacin y consideracin de un gran nmero de factores. As, por ejemplo, mien-
tras que en un laboratorio de investigacin priman la exactitud y la precisin del
mtodo sobre el tiempo de procesamiento de las muestras, en un laboratorio de
anlisis clnicos prevalece en algunos casos la rapidez sobre la precisin, ya que
el tratamiento rpido del enfermo puede ser clave para salvarle la vida.
55
Captulo 3
56
Obtencin de muestras
INTRODUCCIN
MUESTRAS DE SANGRE
Recogida de muestras de sangre
Puncin venosa
Puncin arterial
Puncin cutnea
Anticoagulantes
Alteraciones en las muestras de sangre durante la conservacin y el procesamiento
Agentes desproteinizantes
MUESTRAS DE ORINA
Composicin de la orina
Recogida de muestras de orina
Orina de una miccin
Orina de un tiempo determinado
Deterioro de las muestras de orina. Conservantes
58
4
INTRODUCCIN
MUESTRAS DE SANGRE
La sangre puede obtenerse de las venas, de las arterias o de los capilares. De-
pendiendo del tipo de sangre que quiera extraerse, se utilizan diferentes proce-
dimientos:
59
Captulo 4
Puncin venosa
Puncin arterial
Puncin cutnea
Puncin venosa
La relativa facilidad con que se obtiene la sangre venosa hace de esta tcnica el
principal mtodo de obtencin de sangre en los laboratorios de anlisis clnicos.
La puncin venosa suele realizarse en una de las venas de la fosa cubital, por su
grosor y superficialidad (Figura 4.1).
Las muestras de sangre pueden extraerse por medio de jeringas o por tubos
Figura 4.1. Venas de extraccin de sangre; de vaco desechables, para evitar contagios. Los pasos a realizar en una extrac-
vC: vena ceflica; vCM: vena cubital cin de sangre son los siguientes (Figura 4.2):
media; y vB: vena baslica.
Se aplica un torniquete de goma, unos 1015 cm por encima del lugar de
puncin, para obstruir el retorno de la sangre venosa al corazn y para dis-
tender las venas. La vena se detecta por palpacin. En algunos casos pue-
den utilizarse venas de la parte superior de la mano, teniendo cuidado en
la extraccin, ya que pueden producirse hematomas con facilidad. La
zona donde va a realizarse la puncin debe desinfectarse con un algodn
empapado en alcohol, exceptuando aquellos casos en que deban realizar-
se pruebas de alcohol en sangre. En este ltimo caso, la limpieza con alco-
hol podra contaminar la muestra y producir una falsa elevacin de los
resultados; puede limpiarse la zona con agua y jabn, pero debe estar
seca antes de realizar la puncin.
Se procede a la puncin: jeringa y aguja deben alinearse con la vena e in-
troducirse con un ngulo de unos 15. Una vez se supera la resistencia ini-
cial de la pared de la vena, la sangre fluye fcilmente.
Si se utilizan tubos de vaco, se llenan los diferentes tipos necesarios (Figu-
ra 4.3), con el anticoagulante y el conservante adecuados.
Terminada la toma de sangre, se retira el torniquete y luego la aguja. Se-
guidamente debe sujetarse fuertemente un algodn sobre el lugar de la
puncin con el brazo extendido, para impedir la salida de la sangre.
Si se ha utilizado una jeringa, se transfiere la sangre a los tubos adecuados.
Figura 4.2. Fases en la extraccin de Los que contengan anticoagulante deben taparse y mezclarse su contenido
sangre venosa. por inversin.
60
Obtencin de muestras
Aguja estril
Soporte o dispositivo de sujecin Figura 4.3. Sistema de vaco para la
extraccin de sangre.
Tubo de vaco
Si se extrae la sangre demasiado rpido, se produce espuma Figura 4.6. Obtencin de plasma.
61
Captulo 4
Puncin arterial
La sangre arterial se utiliza para medir la presin de oxgeno y de dixido de car-
bono y para establecer el valor del pH, que es una medida del equilibrio cido-b-
sico de la sangre. Estas determinaciones son tiles para evaluar los problemas
mdicos relacionados con el sistema respiratorio. Son fundamentales en el estudio
de problemas de oxigenacin que se producen en determinadas enfermedades.
En otros tiempos, la puncin arterial se consideraba peligrosa. Realmente, las
punciones arteriales son tcnicamente ms difciles de realizar que las venosas.
La mayor presin en las arterias dificulta la interrupcin de la hemorragia y pro-
voca con mayor frecuencia la aparicin de hematomas. Hoy en da, los instru-
mentos de anlisis de gases en sangre estn automatizados, con lo cual son ms
rpidos, ms precisos y necesitan una menor cantidad de muestra. Una muestra
de sangre arterial para la determinacin de gases en sangre slo es til al mdico
si el paciente est preparado, si la muestra se recoge correctamente, si se extrae
una cantidad de muestra adecuada y si la manipulacin de la muestra es correc-
ta. Las personas que realizan las punciones arteriales tienen que estar familiariza-
das con los peligros de la tcnica y con las precauciones que hay que tomar para
evitar un perjuicio al paciente o que los resultados estn alterados.
Las muestras de sangre suelen tomarse de la arteria radial del brazo o de la
arteria femoral. La extraccin se lleva a cabo con una jeringa de vidrio heparini-
zada. No deben utilizarse jeringas de plstico normales ni tubos de vaco. La
razn es que el oxgeno difunde a travs de las paredes de las jeringas de plsti-
co en 1 2 horas. Este factor tiene cada vez menor importancia, ya que los
avances tcnicos en la instrumentacin permiten realizar un anlisis en la mues-
tra en 1 2 minutos. Los tubos de vaco no sirven para este tipo de anlisis, ya
que la presin parcial de los gases disueltos en sangre se altera notablemente
con la succin creada por el vaco del tubo.
Ya que el estado de los gases y del pH en sangre es pasajero in vivo, el pa-
ciente debe estar bien preparado. El paciente se debe encontrar en estado de
equilibrio, lo que se consigue despus de 20-30 minutos de reposo. Hay una se-
rie de factores que pueden alterar los resultados: comer, padecer un dolor, los
estados de angustia, mantener la respiracin, toser o hacer ejercicio.
La heparina sdica es el anticoagulante ms utilizado para la toma de muestras
de gases en sangre, pues tiene un efecto mnimo sobre los valores de los compo-
nentes cido-bsicos. Existe un problema de dilucin si se utiliza heparina lquida.
Recientemente se estn utilizando jeringas que contienen heparina en polvo seco.
Otra fuente de error son las burbujas de aire, que pueden alterar el valor de
la presin de oxgeno y que se producen, normalmente, por una falta de ajuste
entre la aguja y la jeringa.
62
Obtencin de muestras
Puncin cutnea
La puncin cutnea es el mtodo elegido en la extraccin de sangre en pacien-
tes peditricos, especialmente en lactantes (Figura 4.7). Es importante evitar la
produccin de daos por el volumen de muestra extrada o por el mtodo de
recogida. La puncin cutnea resulta tambin til en adultos con obesidad extre-
ma, con quemaduras graves o con tendencia trombtica. Tambin suele utilizar-
se en pacientes geritricos.
La puncin cutnea puede hacerse en el taln o en la falange distal de cual-
quier dedo. El taln del pie se pincha con una lanceta, a una profundidad no
mayor de 2,4 mm; se deja que fluya la sangre y se carga un capilar hepariniza- Figura 4.7. Zonas del taln en las que
puede realizarse una puncin cutnea.
do. Tambin puede recogerse sobre un papel, como habitualmente se hace a los
nios recin nacidos. Para aumentar la circulacin de la sangre, puede caldearse
la zona del pinchazo con un pao seco y caliente. Las punciones en los dedos
pueden realizarse en los nios a partir de los 18 meses y en los adultos.
En estos casos, la hemolisis puede producirse:
Anticoagulantes
Cuando se requiera sangre total o plasma, debe aadirse a la muestra un anticoa-
gulante durante el proceso de recogida. Existen distintas sustancias capaces de im-
pedir la coagulacin de la sangre (Figura 4.8). El anticoagulante debe elegirse de
acuerdo con las determinaciones que se vayan a realizar para que su presencia no
afecte a la medida. Por ejemplo, si se quieren medir los iones sodio o potasio, no
puede utilizarse como anticoagulante ninguna sustancia que contenga estos iones.
La heparina es el anticoagulante que menos interfiere en la mayora de las
determinaciones. Se presenta como sal sdica, potsica, de amonio o de litio y
63
Captulo 4
64
Obtencin de muestras
Agentes desproteinizantes
La desproteinizacin (eliminacin de las protenas) de las muestras de sangre,
suero o plasma es necesaria para la determinacin de diferentes metabolitos, y
conviene realizarla rpidamente despus de la recogida de cada una de las
muestras. La desproteinizacin de las muestras puede realizarse utilizando dife-
rentes agentes caotrpicos (que provocan la precipitacin de las protenas) que
pueden separarse por centrifugacin, recogindose un sobrenadante libre de
protenas. Se detallan a continuacin distintos agentes caotrpicos:
MUESTRAS DE ORINA
La orina constituye un material que permite obtener una considerable cantidad
de informacin, de forma rpida y econmica. Al igual que cualquier otro mto-
do de laboratorio, los anlisis de orina deben llevarse a cabo de forma cuidado-
sa y perfectamente controlada.
El estudio de las muestras de orina puede plantearse desde dos puntos de
vista:
Pruebas qumicas
Pruebas bacteriolgicas
Pruebas de examen microscpico
65
Captulo 4
Composicin de la orina
66
Obtencin de muestras
Una vez recogida toda la orina, se lleva al laboratorio, donde se mide el volu-
men, se mezcla bien, se separan alcuotas para las diferentes determinaciones y
lo que sobra se tira.
Dependiendo del tipo de determinaciones que vayan a realizarse, se aaden
a los recipientes de recogida diferentes estabilizadores y conservantes.
67
Captulo 4
68
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
INTRODUCCIN
ESPECTROFOTOMETRA
La luz
Distribucin de la energa en los tomos y en las molculas
Distribucin de la energa en los tomos
Distribucin de la energa en las molculas
Absorcin de la radiacin
Emisin y absorcin atmica
Absorcin molecular. Regiones ultravioleta y visible
Absorciometra molecular. Ley de Beer-Lambert
TCNICAS DE FLUORESCENCIA MOLECULAR
70
5
INTRODUCCIN
La espectroscopa permite el estudio de la absorcin y la emisin de radiacin
electromagntica por la materia. La caracterstica de la materia ms fcilmente
apreciable respecto a la absorcin de luz es el color: una sustancia presenta el
color que corresponde a la longitud de onda del espectro visible que no absor-
be; as, por ejemplo, la clorofila es verde porque absorbe todas las radiaciones
del visible excepto la correspondiente al verde (Figura 5.1).
71
Captulo 5
ESPECTROFOTOMETRA
La luz
La luz visible, y otras radiaciones del mismo tipo, consiste en ondas electro-
magnticas que viajan por el espacio a una velocidad de 3 108 m s1. La luz
consta de un campo magntico y un campo elctrico perpendiculares entre s,
que oscilan sinusoidalmente a medida que se propagan a travs del espacio (Fi-
gura 5.2).
hc
E= =hu
l
72
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
73
Captulo 5
Absorcin de la radiacin
Cuando una radiacin incide en la materia, parte de la radiacin puede ser ab-
sorbida. En el caso de los elementos, la energa se invierte en producir cambios
en el estado energtico de los electrones. En el caso de las molculas, esta
energa puede utilizarse, adems, en cambios en los estados vibratorio y rotato-
rio. Es decir, en el caso de una molcula, cuando sta absorbe radiacin, la
energa puede distribuirse en cualquiera de los tres apartados siguientes: saltos
electrnicos, vibracin de los tomos o rotacin de unos grupos de tomos res-
pecto a otros de la misma molcula.
As pues, la materia puede absorber energa en diferentes regiones de la ra-
diacin electromagntica. En la figura 5.5, se representan las diferentes regiones
del espectro electromagntico, y cmo se distribuye la energa cuando es absor-
bida por la materia. Los rayos provocan transiciones nucleares, los rayos X pro-
vocan cambios de energa en los electrones internos, las radiaciones ultravioleta
y visible provocan cambios en los electrones de valencia (electrones que inter-
vienen en los enlaces covalentes) y la radiacin infrarroja y las microondas pro-
vocan cambios debidos a vibraciones y rotaciones moleculares.
Si se representa la cantidad de energa absorbida o emitida por una molcula
o por un elemento frente a la longitud de onda, se obtiene un espectro tpico de
cada molcula (Figura 5.6). El rango de longitudes de onda en las que se absorbe
ms o menos energa es caracterstico de cada tipo de molcula y est asociado
con una regin bien definida del espectro electromagntico. Las molculas inter-
74
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
actan con las radiaciones de una amplia gama de longitudes de onda, produ-
cindose espectros en varias regiones distintas y generando los tpicos espectros
de bandas. Por el contrario, los tomos absorben energa en regiones bien deli-
mitadas del espectro, dando lugar a espectros de lneas.
75
Captulo 5
76
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
77
Captulo 5
78
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
79
Captulo 5
80
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
81
Captulo 5
Para que la sensibilidad del mtodo sea mxima, interesa que, para una con-
centracin dada, la absorbancia medida sea la mxima posible. Para ello, es pre-
ferible efectuar la medida en el mximo de absorcin de la sustancia a
determinar. En algunos casos se puede elegir otra longitud de onda para evitar
las interferencias de otros compuestos que absorban tambin a la longitud de
onda del mximo de absorcin.
Los aparatos diseados para cuantificar la absorcin de luz por una muestra
son los espectrofotmetros. Los espectrofotmetros poseen una serie de compo-
nentes bsicos, que se detallan en la figura 5.24.
82
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
Cubetas para las muestras. Son los recipientes pticamente transparentes don-
de se colocan las diluciones de muestras para las medidas de absorbancia. Pue-
den ser de vidrio, de plstico o de cuarzo. Dependiendo del material con el que
est construida la cubeta, la cantidad de luz absorbida por la propia cubeta vara
significativamente. Por ejemplo, para lecturas por debajo de 310 nm se precisan
cubetas de cuarzo, porque las de plstico absorben por debajo de esa longitud
de onda. Las cubetas ms utilizadas poseen una longitud de paso de la luz (L) de
1 cm, lo que facilita el clculo de la concentracin de la sustancia a estudiar a
partir de su absorbancia.
83
Captulo 5
84
Tcnicas espectrofotomtricas y fluorimtricas
85
Captulo 5
86
Tcnicas radioqumicas
INTRODUCCIN
TIPOS DE RADIACTIVIDAD
Partculas a
Partculas b
Positrones (b+)
Captura electrnica
Rayos g
DESINTEGRACIN RADIACTIVA
UNIDADES DE RADIACTIVIDAD
DETECCIN Y MEDICIN DE LA RADIACTIVIDAD
Contadores Geiger-Mller
Contadores de centelleo
Autorradiografa
88
6
INTRODUCCIN
La estructura del tomo se caracteriza por presentar un ncleo compacto que
contiene neutrones y protones (carga positiva) rodeado de una nube de electro-
nes (carga negativa) (Figura 6.1). El nmero de electrones de un tomo coincide
con el nmero de protones del ncleo, de manera que el tomo en su conjunto
no tiene carga neta. El nmero de protones se conoce como nmero atmico
(Z). La masa del tomo se encuentra concentrada en el ncleo, a pesar de que
ste representa slo una pequea parte del tamao total del tomo (la masa del
protn es 1.850 veces superior a la del electrn). Los neutrones son partculas
sin carga con una masa aproximadamente igual a la de los protones. La suma del
nmero de protones (Z) y neutrones (N) de un ncleo determinado se conoce
como nmero msico (A).
89
Captulo 6
TIPOS DE RADIACTIVIDAD
Partculas a
Los tomos que tienen un nmero atmico superior a 82 pueden alcanzar una
situacin ms estable expulsando neutrones y protones. Esto se realiza emitiendo
Figura 6.3. Principales istopos una partcula D, formada por dos protones y dos neutrones (es decir, un ncleo
radiactivos, partculas que emiten y de helio 42He). El resultado es un nuevo compuesto, con un nmero atmico dis-
caractersticas de la radiacin. CE: captura minuido en dos unidades y una masa atmica reducida en cuatro unidades (Fi-
electrnica; b : partculas beta; b +: gura 6.4).
positrones; g: rayos g.
Las partculas D son relativamente grandes y transportan una doble carga po-
sitiva, por lo que atraen a los electrones de los tomos del material que atravie-
san, causando efectos de ionizacin. Tienen un alcance muy pequeo (entre 15
y 40 Pm) debido al tamao que presentan; pueden ser retenidas incluso por el
226 222
88 Ra o 86 Rn 42 He aire y, por lo tanto, presentan poco riesgo de radiacin externa, aunque sus efec-
tos en las clulas o tejidos vivos pueden ser muy graves.
Figura 6.4. El radio es un elemento
radiactivo, inestable, que, por emisin de
una partcula a (un ncleo de helio), se
convierte en radn. Partculas b
90
Tcnicas radioqumicas
Positrones (b+)
Captura electrnica
Rayos g
91
Captulo 6
DESINTEGRACIN RADIACTIVA
La desintegracin radiactiva es un proceso que lleva asociada energa y que tie-
ne lugar a una velocidad caracterstica de cada istopo (Figura 6.9).
La unidad de medida de los niveles de energa asociados con la desintegra-
cin radiactiva es el electrn-voltio. As, un electrn-voltio (eV) es la energa ad-
quirida por un electrn cuando se acelera por una diferencia de potencial de 1
voltio, y equivale a 1,6 u 1019 J. En la mayora de los istopos debe utilizarse el
mltiplo MeV (mega-electrn-voltio).
La velocidad de desintegracin radiactiva es proporcional al nmero de to-
mos del istopo presentes en un momento dado, y depende de la fuente del is-
Figura 6.9. Curva de desintegracin topo. Se puede expresar mediante la siguiente ecuacin:
radiactiva.
dN
lN
dt
Nt
ln lt
N0
N0
1 0,693
ln 2 lT1/2 ln lT1/2 T1/2
N0 2 l
Los valores de vida media varan ampliamente desde unos 1019 aos, para el
204
Pb, hasta 3 u 107 aos para el 212Po (ver otros ejemplos en la figura 6.3).
92
Tcnicas radioqumicas
UNIDADES DE RADIACTIVIDAD
La unidad ms utilizada para medir la radiactividad es el curio (curie, Ci), que
equivale a la cantidad de radiactividad de 1 g de radio, es decir 3,7 u 1010 desin-
tegraciones nucleares por segundo (dps = desintegraciones u s1). As, 1 Ci equi-
vale a la cantidad de istopo que produce 3,7 u 1010 dps. Esta unidad resulta
demasiado elevada, por lo que normalmente se emplean submltiplos de la mis-
ma, como el microcurio (PCi) y el milicurio (mCi). Sin embargo, en el sistema in-
ternacional, la unidad para la radiactividad es el becquerel (Bq), que equivale a
una desintegracin nuclear por segundo. A partir de tal definicin se deduce:
93
Captulo 6
Contadores Geiger-Mller
Los contadores Geiger-Mller permiten medir los efectos ionizantes de la radiac-
tividad sobre un gas. Consisten en un cilindro hueco de metal con dos electro-
dos entre los que se establece una diferencia de potencial, de manera que los
electrones liberados durante la ionizacin del gas son atrados por el nodo, es-
tablecindose una corriente entre los dos electrodos proporcional a la cantidad
de gas ionizado. El cilindro metlico presenta una ventana por la que puede pa-
sar la radiacin y se encuentra lleno de una mezcla de gases ionizables, general-
mente nen y argn. La radiacin incidente genera un flujo de corriente entre
los electrodos que es proporcional a la cantidad de radiacin (Figura 6.10).
La ventana del tubo metlico que permite el paso de la radiactividad debe ser
lo suficientemente delgada para no absorber la radiacin, pero, an as, no sirve
para las partculas E, de baja energa, que son absorbidas por la ventana; as, por
ejemplo, los istopos 14C y 3H no pueden detectarse con tubos Geiger-Mller.
Las radiaciones J s pueden atravesar la ventana y entrar en el tubo; aunque
su capacidad para ionizar el gas es baja, son capaces de provocar la emisin de
fotoelectrones desde las paredes del metal a los electrodos. Los fotoelectrones
emitidos son capaces de ionizar el gas, por lo que pueden determinarse con este
tipo de contadores.
94
Tcnicas radioqumicas
Contadores de centelleo
Las radiaciones E, de baja energa, se absorben en parte, o incluso totalmente,
por el material de la ventana de los contadores Geiger, de manera que, como ya
se ha comentado, stos no pueden utilizarse en la determinacin de las emisio-
nes del 3H y 14C. Aunque existe un gran nmero de sustancias, denominadas
centelleantes, que responden a los efectos de ionizacin por las partculas D y E,
emitiendo destellos de luz centelleos. Este tipo de sustancias no son directa-
mente sensibles a los rayos J, aunque s lo son a sus efectos secundarios de ioni-
zacin, proporcionando por lo tanto un sistema de deteccin que puede
utilizarse tanto para la determinacin de partculas D y E, como J. Se han di-
seado diferentes tipos de instrumentacin para contabilizar el nmero de des-
tellos que pueden provocar los diferentes istopos radiactivos, que se conocen
con el nombre de contadores de centelleo.
Los compuestos que presentan tal centelleo pueden ser lquidos o slidos,
por lo que se han diseado dos tipos de contadores de centelleo, los slidos y
los lquidos, dependiendo del tipo de centelleantes utilizados.
95
Captulo 6
Los centelleadores lquidos deben de ser miscibles con la muestra. As, se uti-
lizan el tolueno y el xileno para muestras orgnicas, mientras que el dioxano es
el centelleador utilizado para muestras acuosas.
Al estar la muestra disuelta en el disolvente, las emisiones radiactivas ionizan
las molculas del propio disolvente, y estas ltimas utilizarn la energa asociada
a la radiacin para pasar a un estado excitado. El disolvente es fluorescente, por
lo que devuelve energa emitiendo a una longitud de onda mayor. El tolueno, el
xileno y el dioxano emiten a longitudes de onda muy cortas, por lo que son dif-
ciles de detectar de manera eficaz. Para subsanar este problema, lo que se hace
es aadir otro compuesto fluorescente, conocido como fluorforo primario, que
acepte la energa liberada por estos disolventes para fluorescer, emitiendo por
tanto a una longitud de onda superior, que todava es difcil de detectar por el
fotomultiplicador. Por ello se suele aadir otro compuesto fluorescente, el fluor-
foro secundario, que emite a una longitud de onda todava superior, que ya pue-
de ser detectada de manera eficaz por el fotomultiplicador. Todos son
compuestos fluorescentes, porque las mediciones se basan en esta propiedad del
disolvente, que permite aumentar la longitud de onda de los fotones emitidos
por la muestra (Figura 6.13).
Como fluorforo primario se suele utilizar el 2,5-difeniloxazol (PPO). El
fluorforo secundario puede ser el 1,3-di-[2-(5-feniloxazol)]-benceno (POPOP).
96
Tcnicas radioqumicas
Autorradiografa
La radiactividad es capaz de impresionar una placa fotogrfica, por lo que puede
emplearse esta propiedad tanto para seguir el destino de un compuesto radiacti-
vo como para cuantificar, ya que la intensidad de la impresin en la placa fo-
togrfica ser proporcional a la cantidad de radiactividad presente en la muestra
(Figura 6.14).
La muestra se coloca sobre una placa fotogrfica en un cassette protegido de
la luz, se deja el sistema el tiempo suficiente para que la placa pueda ser impre-
sionada por la radiactividad emitida por la muestra, y se revela la placa fotogrfi-
ca con los lquidos de revelado de uso normal en fotografa. Se obtiene as una Figura 6.14. Impresin sobre una placa o
placa impresionada, y la intensidad de la impresin es proporcional a la radia- un film fotogrfico de la seal emitida por
cin presente en cada muestra. compuestos marcados radiactivamente.
97
Mtodos de determinacin de bioelementos
INTRODUCCIN
TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIN DE METALES Y ELEMENTOS TRAZA
MTODOS DE DETERMINACIN DE BIOELEMENTOS
Determinacin de calcio
Determinacin de fsforo
Determinacin de sodio y potasio
Determinacin de hierro
98
7
INTRODUCCIN
99
Captulo 7
100
Mtodos de determinacin de bioelementos
presentar lneas o bandas de absorcin alejadas de las propias bandas de los ele-
mentos a analizar, para no interferir en su determinacin.
Determinacin de calcio
El calcio, adems de ser uno de los principales constituyentes del tejido seo,
participa en procesos fisiolgicos bsicos, como la coagulacin sangunea y la
contraccin muscular; acta tambin como segundo mensajero en la respuesta
hormonal, sobre la regulacin del equilibrio osmtico celular, etc.
Es habitual la determinacin del calcio en fluidos biolgicos como suero,
plasma y orina, pudiendo realizarse la determinacin tanto por mtodos espec-
trofotomtricos directos por absorcin atmica, o indirectos previa reaccin
del calcio con un compuesto con el que, al reaccionar, genere un producto colo-
reado o cromforo. Tanto en uno como en otro caso, pueden surgir problemas
de interferencias debido a otros elementos y sustancias de la muestra. En el caso
de la absorcin atmica, la presencia de Na+, K+, fosfatos o sulfatos puede pro-
vocar una determinacin errnea del calcio. Para evitar estos problemas se utili-
zan soluciones de cloruro de lantano, que reduce la interferencia de protenas y
aniones orgnicos e inorgnicos, ya que provoca la disociacin de los complejos
que el calcio forma con estos aniones. Es tambin importante evitar la presencia
de agentes quelantes, pues al secuestrar stos a los iones Ca++ pueden conducir
a la infravaloracin del mismo. As, en muestras problemticas, como las de pa-
cientes con tratamientos con agentes quelantes (como el EDTA), las muestras de-
ben sufrir un paso previo de precipitacin con oxalato y posterior resuspensin
en un medio cido.
La determinacin de calcio por espectrofotometra de absorcin atmica re-
quiere la utilizacin de un espectrofotmetro con una llama de aire/gas natural a
1.500 oC y deteccin de la absorbancia a 423 nm.
El calcio puede determinarse tambin por mtodos qumicos espectrofo-
tomtricos (indirectos), debido a que puede formar complejos coloreados con
varios reactivos que cambian de color selectivamente cuando forman quelatos
con l. Los mtodos ms utilizados son los de la o-cresolftalena y el arsenazo III
(Figura 7.2).
101
Captulo 7
EDTA o EGTA (Figura 7.3). El calcio forma un complejo fluorescente con la cal-
cena (bis[N,N-bis(carboximetil)aminometil]fluorescena) en solucin bsica, que
presenta una excitacin mxima a 490 nm y una emisin mxima a 520 nm. Al
unirse el EDTA y el EGTA al calcio con una afinidad mayor que la calcena, se re-
duce la fluorescencia del complejo. El punto final se da cuando no se observa
fluorescencia. La cantidad de EGTA o de EDTA utilizado ser, entonces, propor-
cional a la concentracin de calcio.
Otra forma eficaz de determinar calcio en una muestra biolgica es por dilu-
cin isotpica. Resulta muy adecuada ya que el calcio muchas veces est en
cantidades nfimas en los organismos vivos y forma parte de mezclas con otros
compuestos similares, por lo que los mtodos convencionales no permiten de-
terminarlo con exactitud.
Determinacin de fsforo
Al igual que el calcio, el fsforo es uno de los elementos ms abundantes en los
seres vivos, y tambin forma parte de los huesos. Adems, el fsforo se encuen-
tra combinado con un gran nmero de molculas biolgicas, desde lpidos (fos-
folpidos) e hidratos de carbono, hasta protenas y cidos nucleicos.
Los mtodos de determinacin del fsforo ms utilizados son de tipo qumi-
co-espectrofotomtrico y se basan en su capacidad de formar complejos con sa-
les de molibdato, procedindose despus a la cuantificacin del molibdato que
ha reaccionado por reduccin, dando azul de molibdeno, que posee un mximo
de absorcin a 690 nm (ver Anexo de Mtodos en el CD). Se utilizan diferentes
agentes para reducir el complejo de fosfomolibdeno; entre ellos pueden citarse
el sulfato de metil-p-aminofenol, el cido 1-amino-2-naftol-4-sulfnico (ANS), y
el cido ascrbico. Debe evitarse la presencia en las muestras de citrato, oxalato
o EDTA y de ciertos pigmentos como la bilirrubina. Las muestras de sangre de-
ben ser desproteinizadas con cido tricloroactico, debindose evitar la hemoli-
sis en este tipo de muestras. Es conveniente acidificar las muestras de orina para
evitar problemas de precipitacin a pH alcalino.
102
Mtodos de determinacin de bioelementos
Determinacin de hierro
El hierro es un elemento esencial para el hombre, ya que forma parte de los gru-
pos prostticos de muchas protenas, por ejemplo hemoprotenas como la he-
moglobina y la mioglobina, flavoprotenas, etc. Sus niveles estn regulados al
nivel de la absorcin intestinal.
Al formar parte de protenas, su determinacin requiere una desproteiniza-
cin previa de la muestra para liberarlo, siendo el cido tricloroactico el agente
desproteinizante utilizado. Su cuantificacin puede realizarse tanto por mtodos
de emisin atmica como por mtodos qumicos espectrofotomtricos, al reac-
cionar con un reactivo y producir un cromforo. Por ejemplo, la batofenantroli-
na (Figura 7.4) forma un complejo de color rojo con el hierro, por la presencia
del grupo N=CC=N, que puede cuantificarse por su absorbancia a 540 nm.
El hierro tambin forma un complejo con la ferrozina (Figura 7.4), de color ma-
genta, que puede cuantificarse a 562 nm. Ambos mtodos requieren una reduc- Figura 7.4. Estructura de la
batofenantrolina y de la ferrozina.
cin previa del Fe3+ a Fe2+.
103
Mtodos de determinacin de aminocidos
INTRODUCCIN
Estructura de los aminocidos
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS TOTALES
Mtodo de la ninhidrina
Reaccin de Sanger
Reaccin del fenilisotiocianato
Mtodo del o-ftaldehdo
Reaccin de la fluorescamina
Reaccin del cloruro de dansilo
MTODOS QUMICOS PARA LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS INDIVIDUALES
104
8
INTRODUCCIN
Los aminocidos son las molculas bsicas a partir de las cuales se construyen las
protenas. Este grupo de molculas se puede analizar, tanto cualitativa como
cuantitativamente, utilizando diferentes mtodos. La eleccin de un mtodo de-
terminado depende del objetivo del estudio.
As pues, por una parte, existen mtodos para la determinacin del conteni-
do total de aminocidos en una muestra. Los diferentes procedimientos utiliza-
dos para el aislamiento y determinacin de los aminocidos totales se
fundamentan en las propiedades qumicas y fsicas de stos que les confieren ca-
ractersticas diferenciales respecto del resto de biomolculas. Cabe comentar
que, a la hora de detectarlos y cuantificarlos, los aminocidos, en general, no
presentan una caracterstica fsica que sea fcilmente mensurable, a excepcin
de los tres aminocidos aromticos: fenilalanina, triptfano y tirosina. Por tanto,
las tcnicas para la determinacin de aminocidos totales se fundamentan en
hacerles adquirir una caracterstica mensurable. Como en otras ocasiones, pue-
den utilizarse los mtodos qumicos para desarrollar compuestos derivados de
aminocidos que absorban energa en la regin ultravioleta-visible del espectro.
Por otra parte, existen tambin mtodos que permiten la determinacin de
un aminocido concreto, as como mtodos que permiten la cuantificacin de
cada aminocido de forma individual. Estos mtodos se basan en las caractersti-
cas que diferencian los aminocidos entre s.
Por todo ello, conviene repasar la estructura y las caractersticas qumicas y f-
sicas de los aminocidos antes de explicar los mtodos que se pueden utilizar
para su determinacin.
105
Captulo 8
da una cadena lateral (grupo R) diferente para cada aminocido. Este carbono,
se denomina genricamente carbono alfa (CD). As, los aminocidos responden a
la frmula general:
106
Mtodos de determinacin de aminocidos
107
Captulo 8
el uso de compuestos que reaccionen con dicho grupo D-amino. De esta mane-
ra los aminocidos adquieren una caracterstica que puede medirse y que
adems es proporcional a la cantidad de aminocidos presentes en una muestra.
Existen varios reactivos que reaccionan con los aminocidos de manera
especfica, confirindoles caractersticas apropiadas para su deteccin. Estos re-
activos provocan la aparicin de derivados de aminocidos coloreados, fluores-
centes o radiactivos y pueden utilizarse tanto con fines cualitativos como
cuantitativos. La mayora de los reactivos que se utilizan para la determinacin
de aminocidos totales pueden provocar la aparicin de interferencias debidas a
la presencia de protenas, que tambin pueden reaccionar con ellos. As pues,
para la determinacin de aminocidos totales, las muestras suelen desproteini-
zarse previamente. Por lo tanto, la mayora de los mtodos analticos para ami-
nocidos incluyen una primera etapa de desproteinizacin, que puede
realizarse, como ya se ha comentado para el caso de las muestras de sangre (ver
captulo 4), por diferentes mtodos; por ejemplo, provocando la precipitacin
de las protenas por un aumento de la fuerza inica del medio, o bien con ci-
dos, con disolventes orgnicos, o por la accin del calor (Figura 8.5), las prote-
nas as precipitadas pueden separarse por filtracin o centrifugacin.
Mtodo de la ninhidrina
El mtodo de la ninhidrina permite la determinacin de aminocidos que pre-
sentan un grupo carboxilo y un grupo amino libres. Es una reaccin general para
todos los aminocidos, excepto para la prolina y la hidroxiprolina, que son imi-
nocidos (Figura 8.6).
108
Mtodos de determinacin de aminocidos
Reaccin de Sanger
El reactivo de Sanger, el flor2,4dinitrobenceno, reacciona en medio bsico
con el grupo amino libre de un aminocido o de un pptido para dar un dinitro-
fenil derivado (DNP) de color amarillo (Figura 8.8).
109
Captulo 8
Reaccin de la fluorescamina
Los aminocidos, al ser aminas primarias, pueden reaccionar con la fluorescami-
na en medio bsico, dando un derivado fluorescente con un mximo de excita-
cin a 390 nm y con un mximo de emisin a 475 nm (Figura 8.11). El producto
formado es inestable en disoluciones acuosas, por lo que el reactivo se prepara
en acetona. La reaccin tiene lugar rpidamente a temperatura ambiente.
110
Mtodos de determinacin de aminocidos
111
Tcnicas de separacin: cromatografa
INTRODUCCIN
PRINCIPIO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN. TCNICAS FSICAS
Polaridad
Volatilidad
Solubilidad
Adsorcin
Carga
Tamao
DISEO DE LAS TCNICAS DE SEPARACIN DE MOLCULAS
TCNICAS CROMATOGRFICAS
Tcnicas cromatogrficas basadas en la polaridad
Cromatografa lquido-slido: cromatografa de adsorcin
Cromatografa gas-lquido: GLC
Cromatografa lquido-lquido. Cromatografa lquida de alta precisin: HPLC
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de permeabilidad. Cribado molecular
112
9
INTRODUCCIN
Las tcnicas de separacin de molculas explotan las diferencias entre las carac-
tersticas fsicas de los compuestos que forman una muestra biolgica, ya que
normalmente se asemejan en sus propiedades qumicas y no pueden diferen-
ciarse por mtodos qumicos. As pues, los mtodos basados en las propiedades
qumicas, no permiten, en muchos casos, una buena diferenciacin de las mol-
culas a estudiar, ya que, en el caso de las molculas biolgicas, muchas de ellas
presentan idnticos grupos funcionales. No obstante, aunque distintas molculas
muestren unos mismos grupos funcionales, no son iguales, ya que se diferencian
en distintos aspectos fsicos, entre los que se pueden sealar el tamao (peso
molecular), la forma (por ejemplo, en las protenas, debida a su plegamiento es-
tructura tridimensional), la polaridad de una molcula (por ejemplo, las cade-
nas laterales de los aminocidos presentan diferente polaridad polar, apolar,
con carga), la carga neta que presenta una molcula a un determinado pH, etc.
De esta forma, las tcnicas fsicas son aquellas que tratan de separar las molcu-
las aprovechando las diferentes propiedades fsicas que stas presentan. Estos
mtodos normalmente se acoplan a mtodos qumicos, que permitirn la cuanti-
ficacin de cada uno de los compuestos de la muestra biolgica, una vez separa-
dos. Cabe comentar que la reaccin qumica para la deteccin de los
compuestos de inters puede realizarse con anterioridad o con posteridad a la
separacin de los compuestos de la mezcla.
Las muestras biolgicas son una compleja mezcla de biomolculas, por lo
que la determinacin cualitativa o cuantitativa de las mismas requiere el fraccio-
namiento y separacin de las diferentes clases de biomolculas presentes. Las
primeras tcnicas de anlisis para la identificacin de molculas se fundamenta-
ron en la solubilidad de las diferentes biomolculas en los distintos disolventes.
As, los lpidos se definen como aquellas sustancias biolgicas solubles en disol-
ventes orgnicos e insolubles en disolventes polares. Las protenas se pueden ais-
lar utilizando agentes caotrpicos, que provocan su precipitacin, lo que
permite separarlas por centrifugacin o filtracin del resto de biomolculas. Los
113
Captulo 9
Polaridad
La polaridad es una caracterstica de las molculas, que depende del nmero de
enlaces polarizados que presentan y de su distribucin. Un enlace est polariza-
do cuando hay una distribucin desigual de los electrones entre los dos tomos
que lo forman, consecuencia de la diferente electronegatividad (caracterstica
que mide la capacidad de un tomo para aceptar los electrones de valencia) de
los tomos que intervienen en el enlace. As, la electronegatividad de los tomos
ms abundantes en las biomolculas es:
Oxgeno 3,5
Nitrgeno 3,0
Carbono 2,5
Azufre 2,5
Fsforo 2,1
Hidrgeno 2,1
114
Tcnicas de separacin: cromatografa
Volatilidad
La volatilidad es la tendencia que tiene un compuesto a pasar al estado gaseoso.
Si la fuerza que mantiene unidas entre s a molculas iguales es pequea, la vo-
latilidad es elevada. Un ejemplo es el metano (CH4); ya que una molcula de
metano es pequea y presenta enlaces muy poco polarizados, se establecen in-
teracciones dbiles entre las molculas, por lo que a temperatura ambiente el
metano se encuentra en estado gaseoso. En cambio, la molcula de H2O, que
presenta dos enlaces polarizados, tiene la capacidad de establecer interacciones
ms fuertes con otras molculas de agua, por lo que, a diferencia del metano, el
agua se encuentra en estado lquido a temperatura ambiente.
Los puntos de ebullicin y fusin estn determinados por la polaridad de los
compuestos, de forma que sern ms altos cuanto mayor sea la fuerza de inte-
raccin entre sus molculas. Los puntos de fusin y ebullicin son muy altos en
los compuestos con enlaces inicos, disminuyendo en aquellos que contienen
enlaces covalentes. Tambin dependen de la polaridad de los tomos: cuanto
ms polarizados se encuentran los enlaces, mayores son los puntos de fusin y
de ebullicin (Figura 9.2).
Solubilidad
La solubilidad de una molcula en un disolvente depende de la polaridad de la
misma y del disolvente. Cuando los dos presentan un grado de polaridad similar,
pueden interaccionar y mezclarse; mientras que, si presentan polaridades dife-
rentes, no pueden interaccionar y se mantienen separados, ya que las molculas
115
Captulo 9
Adsorcin
Otra propiedad fsica interesante de las molculas, que tambin depende de la
polaridad, es la adsorcin, que se define como el fenmeno por el cual determi-
nadas molculas interaccionan con las molculas de un soporte slido. La inte-
raccin entre el slido (adsorbente) y la molcula es mayor cuanto ms similares
son sus polaridades.
Carga
Algunas biomolculas presentan grupos cidos y/o bsicos dbiles y, en conse-
cuencia, pueden presentar carga en funcin del pH del medio en que se en-
cuentren. Por lo tanto, la variacin del pH del medio puede utilizarse como
herramienta para forzar a que la molcula presente o no carga, y as separarla de
manera diferencial del resto de molculas que se encuentran en una misma
muestra.
Tamao
A veces la diferencia bsica entre determinadas biomolculas radica en su ta-
mao, como sucede, por ejemplo, en distintas especies de ARNm al compararlas
entre s o entre diferentes protenas que puedan ser similares en otras caracters-
ticas. As pues, la diferencia de tamao es tambin una propiedad que puede
utilizarse para la separacin de biomolculas. De esta manera, las molculas que
difieren mucho en tamao pueden separarse, por ejemplo, por ultracentrifuga-
116
Tcnicas de separacin: cromatografa
117
Captulo 9
TCNICAS CROMATOGRFICAS
concentracin en el disolvente 1
K
concentracin en el disolvente 2
118
Tcnicas de separacin: cromatografa
al 100% en un disolvente 2, al ser los dos lquidos inmiscibles, basta con separar-
los para recuperar A en el disolvente 1 y B en el disolvente 2. Este es, por ejem-
plo, el principio de la extraccin con disolventes orgnicos de los lpidos con
respecto del resto de compuestos de una muestra. Esta tcnica, utilizando nica-
mente dos disolventes de polaridad distinta, no permite separar sustancias con
polaridades similares.
A partir de esta idea, si el proceso de extraccin con disolventes se repite n
veces, puede utilizarse para separar molculas con polaridades ms similares. El
procedimiento se simplifica si uno de los dos medios en los que se realiza el re-
parto est inmvil, por ejemplo una columna rellena de un slido (adsorbente) a
travs de la cual pasa un disolvente (eluyente), que es la fase mvil. A lo largo
del recorrido de eluyente a travs de la columna, se establecen un gran nmero
de repartos; cada una de las distintas zonas donde se establece el reparto se co-
noce como plato terico (Figura 9.6). De esta manera, se puede conseguir sepa-
rar sustancias con polaridades similares (Figura 9.7).
Figura 9.6. Fundamento del reparto en
columna. La columna rellena de un slido se
ha dividido, de forma arbitraria, en 20 platos
tericos pueden llegarse a establecer 20
repartos a lo largo del recorrido del eluyente.
Se depositan 1.000 molculas de A en la
columna, con una constante de reparto de 1
(entre la fase lquida color oscuro y la slida
color claro). En un primer reparto, las 1.000
molculas se distribuyen: 500 en la fase mvil y
500 en la fase estacionaria. En la segunda
transferencia se obtiene una distribucin
250:250 en el primer plato y 250:250 en el
segundo plato. Despus de 20 transferencias,
las distribuciones mayoritarias estn en torno a
los platos 10 y 11. El reparto de las molculas
de A se indica en cursiva. Tambin se depositan
en la columna 1.000 molculas de B, con una
constante de reparto de 4 (entre la fase lquida
color claro y la slida color oscuro). En el
primer reparto de las molculas de tipo B, las
1.000 molculas se distribuyen: 800 en la fase
mvil lquido y 200 en la fase estacionaria
slido. En la segunda transferencia, se
obtiene un reparto de 160:40 en el primer
plato y 640:160 en el segundo plato. Despus
de 20 transferencias, las distribuciones
mayoritarias del compuesto B estn en torno a
los platos 16 y 17.
El trmino cromatografa engloba las tcnicas en las que las molculas de una
mezcla, disueltas en una fase mvil (que se mueve por accin de alguna fuerza,
bien sea gravitatoria o hidrodinmica), se van desplazando a travs de una fase
estacionaria (que ejerce la fuerza de retardo), establecindose distintos procesos
de reparto entre las dos fases. El trmino cromatografa fue utilizado por primera
vez por el botnico ruso M. Tswett, en 1906, para designar la tcnica de separa-
cin de pigmentos vegetales por una columna de vidrio rellena de carbonato
clcico utilizando disolventes para eluir los diferentes pigmentos, de manera que
se obtenan en el proceso una serie de bandas horizontales coloreadas.
Hay diferentes tipos de cromatografa de polaridad dependiendo de las ca- Figura 9.7. Cromatograma de elucin de las
ractersticas de las fases mvil y estacionaria que se utilizan. El estado de las di- muestras A y B del ejemplo de la figura 9.6.
119
Captulo 9
120
Tcnicas de separacin: cromatografa
121
Captulo 9
la mezcla por el eluyente (puesto que se va cambiando por disolventes con pola-
ridades distintas); y por otro lado el efecto de saturacin del eluyente sobre los
puntos de unin del adsorbente, al tener los dos una polaridad cada vez ms pa-
recida. Este tipo de elucin se conoce como elucin en gradiente.
Los diferentes componentes de la mezcla pueden recuperarse de dos mane-
ras. Una de ellas consiste en que, una vez separados los componentes en la co-
lumna, se deja secar sta; a continuacin, recortando distintas partes de la
columna, se pueden recuperar los componentes de la mezcla aislados y, poste-
riormente, pueden separarse del adsorbente utilizando el disolvente adecuado.
Otra manera es seguir aadiendo eluyente durante el proceso de la cromato-
grafa, de modo que, recogiendo de forma fraccionada el eluyente que sale al fi-
nal de la columna, se pueden ir recuperando los componentes de la mezcla por
separado.
La mayora de las veces, los elementos de la mezcla no poseen una propie-
dad que pueda ser detectada a simple vista (como el color), por lo que no pue-
de apreciarse cmo van siendo eluidos. Lo que se suele hacer es recoger de
manera fraccionada el eluyente y aadir, a cada fraccin, un reactivo que permi-
ta la identificacin de los diferentes elementos de la muestra; esta misma reac-
cin puede utilizarse para cuantificar el componente eluido.
Este tipo de cromatografa suele utilizarse para el aislamiento de diferentes
elementos de una mezcla, como un mtodo alternativo a la extraccin con disol-
ventes orgnicos. Puede utilizarse en el fraccionamiento de diferentes tipos de
molculas, como por ejemplo el fraccionamiento de las distintas clases de lpidos
(ver captulo 16).
122
Tcnicas de separacin: cromatografa
rior se sature con el vapor del disolvente por prdida de los componentes volti-
les. Tras introducir la placa, se tapa la cubeta y se deja que tenga lugar la separa-
cin de los compuestos a medida que el disolvente asciende por la placa por
capilaridad.
Puede mejorarse la resolucin de la separacin de los componentes de la
muestra efectuando una cromatografa bidireccional, de forma que distintos
componentes de la mezcla que migren exactamente hacia la misma posicin en
el primer desarrollo cromatogrfico, puedan separarse en un segundo desarrollo.
En tal caso, una vez la cromatografa se ha desarrollado en una direccin, la pla-
ca se saca de la cubeta y se deja secar; posteriormente se vuelve a desarrollar la
cromatografa en una direccin que forme ngulo recto con la del primer desa-
rrollo (Figura 9.11), pero utilizando otro sistema de disolventes (ya que, si se uti-
lizara el mismo sistema de disolventes que en el primer desarrollo
cromatogrfico, simplemente se conseguira el mismo resultado que en la prime-
ra etapa, pero dispuesto en diagonal). As, la muestra se encuentra de nuevo en
el extremo inferior de la cromatografa, pero sin estar en contacto directo con el
disolvente de la cubeta.
123
Captulo 9
124
Tcnicas de separacin: cromatografa
Gas portador. La fase mvil es un gas inerte (nitrgeno, helio o argn) cuyo flu-
jo a travs del sistema de separacin y cuantificacin, puede ser controlado.
125
Captulo 9
126
Tcnicas de separacin: cromatografa
127
Captulo 9
Cromatografa lquido-lquido.
Cromatografa lquida de alta precisin (HPLC)
En la cromatografa lquido-lquido, el principio de separacin es la solubilidad
diferencial de los componentes de una mezcla entre dos fases lquidas inmisci-
bles. Los componentes de la mezcla se distribuirn entre ambas fases en funcin
de su solubilidad en cada una de ellas; esta solubilidad diferencial depende de
la polaridad de los componentes y de cada una de las fases lquidas. As, los
componentes polares se disolvern mejor en la fase ms polar, mientras que los
apolares lo harn en la fase ms apolar.
El fundamento de la cromatografa lquido-lquido se basa en las extracciones
de molculas con disolventes orgnicos, lo que implica a dos disolventes inmisci-
bles. La cromatografa en papel es el proceso ms sencillo dentro de cromato-
grafa lquido-lquido, en la que el agua unida a la celulosa acta como fase
estacionaria polar y la fase mvil menos polar puede ser una mezcla de di-
solventes orgnicos como butanol, cloroformo, etc. Con el tiempo, la cromato-
grafa en papel ha sido reemplazada en muchas de sus aplicaciones por la
cromatografa en capa fina, debido a la mayor velocidad de separacin y la me-
jor resolucin de esta ltima.
La cromatografa lquido-lquido se ha ido sofisticando con el tiempo hasta
el desarrollo de la cromatografa lquida de alta precisin o HPLC (High Perfor-
mance Liquid Chromatography). Un sistema de HPLC es un instrumento que
permite la separacin y cuantificacin de los elementos de una mezcla biolgi-
ca mediante cromatografa lquida de alta precisin. El sistema de HPLC est di-
seado para permitir la separacin y cuantificacin de los compuestos de una
muestra (Figura 9.17).
Cada uno de los componentes del sistema cumple una funcin en el proceso
global de separacin y cuantificacin de compuestos. Hoy en da todos los com-
ponentes del sistema estn controlados por un ordenador, que controla el flujo
de la fase mvil y la seal obtenida por el detector en el tiempo; el ordenador
tambin interviene en el proceso de clculo de los resultados.
El tiempo que invierte una sustancia en recorrer la columna, como ya se ha
comentado anteriormente, es el tiempo de retencin, mientras que el volumen
de elucin es el volumen de fase mvil necesario para que se eluya un determi-
nado compuesto de una mezcla. Estos dos parmetros se utilizan con fines cuali-
tativos para identificar qu compuesto corresponde a cada uno de los picos que
se obtiene en la cromatografa lquida de alta precisin. El rea del pico se utiliza
con fines cuantitativos.
128
Tcnicas de separacin: cromatografa
Inyector. El hecho de que la fase mvil se suministre a presin hace que sea nece-
sario un sistema de inyeccin de muestra. Los primeros inyectores introducan la
muestra directamente en la corriente del disolvente. Actualmente se utilizan siste-
mas de vlvulas, que son ms precisos y permiten inyectar la muestra sin alterar las
condiciones de presin y flujo de la fase mvil. Los sistemas actuales permiten la
programacin del orden de inyeccin y de la cantidad de muestra que debe inyec-
tarse en el sistema. Algunos inyectores permiten que las muestras se encuentren
refrigeradas mientras esperan ser procesadas; lo que posibilita dejar el sistema en
funcionamiento durante horas sin requerir la intervencin de un operador.
129
Captulo 9
130
Tcnicas de separacin: cromatografa
131
Captulo 9
gativamente en la resina, los cuales atraen a las molculas con cargas positivas.
Los intercambiadores de aniones poseen grupos cargados positivamente en la re-
sina, que atraen a las molculas cargadas negativamente. Tanto las resinas ani-
nicas como las catinicas pueden ser fuertes (siempre ionizadas) o dbiles (que
estarn ionizadas en funcin del pH de los eluyentes).
As pues, una resina de intercambio inico consiste en una matriz porosa in-
soluble que tiene ligados un gran nmero de grupos inicos capaces de unir io-
nes de carga opuesta procedentes del medio (Figura 9.22). La cromatografa de
intercambio inico es esencialmente una tcnica de desplazamiento en la que
los iones de la muestra o del tampn desplazan a los iones mviles asociados ini-
cialmente a los iones fijos de la resina.
En teora, puede utilizarse cualquier grupo inico para obtener una resina de
intercambio inico pero, para que el intercambio tenga lugar, el grupo unido a la
resina debe ionizarse. Una resina de intercambio inico no puede utilizarse a un
pH en el que no se encuentre ionizada. Las resinas dbilmente inicas son ni-
camente efectivas en un rango estrecho de pH, mientras que las fuertes pueden
utilizarse en un rango de pH mucho ms amplio.
Al seleccionar una resina debe tenerse en cuenta la carga de los iones de la
muestra. Adems, hay tres factores fundamentales que determinan la unin de
los iones a la resina:
1. El valor de la carga. As, los iones divalentes tienen ms afinidad por la re-
sina que los iones monovalentes.
2. El volumen en el que est distribuida la carga, lo que determina la capaci-
dad de entrar en la resina. Por ejemplo, la fuerza de unin de cationes
monovalentes a una resina aninica disminuye en el siguiente orden:
Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH+4 > Na+ >H+ > Li+
132
Tcnicas de separacin: cromatografa
133
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales
INTRODUCCIN
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR TLC
Separacin unidimensional
Separacin bidimensional
Determinacin de aminocidos por TLC con reacciones mltiples
Separaciones de aminocidos derivatizados
Cromatografa de DNP-aminocidos
Cromatografa de dansil-aminocidos
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS POR HPLC
Ejemplo de determinacin de aminocidos individuales libres por HPLC: Pico-Tag
ANALIZADORES AUTOMTICOS DE AMINOCIDOS
134
10
INTRODUCCIN
Aunque existen diferentes mtodos para determinar un aminocido en concreto
en presencia del resto de aminocidos realizando reacciones especficas sobre
algunos de los grupos funcionales de su cadena lateral, o utilizando mtodos en-
zimticos especficos, a veces resulta ms ventajoso utilizar tcnicas separativas
(que permiten separar los diferentes aminocidos) acopladas a mtodos de
cuantificacin de aminocidos totales (por tcnicas qumicas) (Figura 10.1).
Los aminocidos se diferencian entre s por sus cadenas laterales, cuyas ca-
ractersticas les confieren distintas polaridades, o diferentes puntos isoelctricos,
etc. (Figura 10.2).
Los mtodos de separacin de molculas basados en criterios de polaridad,
como por ejemplo las tcnicas cromatogrficas (TLC, HPLC y CG), permitirn se-
parar los aminocidos entre s. Si se acopla a esta separacin un mtodo qumi-
co para la determinacin de aminocidos, no slo se podrn identificar los
aminocidos individuales presentes en una muestra, sino que tambin se podrn
cuantificar. La cromatografa de intercambio inico tambin permite separar los
diferentes aminocidos de una mezcla y, de la misma forma que ocurre en el
caso de la aplicacin de tcnicas basadas en polaridad, si se acopla al proceso
135
Captulo 10
una reaccin qumica que se produzca sobre el grupo comn a todos los ami-
nocidos, puede utilizarse tambin esta tcnica para identificar y cuantificar los
aminocidos individuales. Los analizadores automticos de aminocidos estn
basados en el principio general de acoplamiento de este tipo de tcnicas separa-
tivas y de determinacin de aminocidos totales.
La mayora de los mtodos analticos incluyen una primera etapa de despro-
teinizacin, que puede realizarse, como ya se ha visto para el caso de los ami-
nocidos totales, utilizando diferentes agentes caotrpicos o diferentes tcnicas,
por ejemplo, el uso de elevadas concentraciones de sales, cidos orgnicos o de-
terminados disolventes, por la accin del calor o por filtracin (ver captulo 8);
las protenas as precipitadas pueden separarse por filtracin o centrifugacin.
136
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales
Separacin unidimensional
137
Captulo 10
138
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales
Antes de separar los aminocidos individuales, stos pueden ser modificados con
algn reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional presente en todos
ellos. Este proceso se conoce con el nombre de derivatizacin. As, por ejemplo,
puede realizarse la cromatografa de los dinitrofenil-derivados (DNP-derivados) o
los dansil-derivados de aminocidos. Este sistema est particularmente indicado
cuando la muestra contiene otras muchas sustancias. La formacin y la extrac-
cin de los derivados son laboriosas, pero son muy convenientes para volme-
nes de muestra muy pequeos o para aminocidos presentes en muy baja
cantidad. Despus de la cromatografa no es necesario utilizar reactivos de loca-
lizacin, porque los derivados DNP son de color amarillo y los dansil-aminoci-
dos son fluorescentes.
139
Captulo 10
Cromatografa de DNP-aminocidos
Se realiza en una placa de gel de slice. El primer eluyente que se utiliza es el
acetato n-butilo:metanol:cido actico (75:25:2, V:V:V) y el segundo eluyente es
el tampn NaH2PO4/Na2HPO4 1,5M a pH = 6. Los 2,4 dinitrofenil-aminocidos
son identificados por el color amarillo que presentan y por sus Rf. (Figura 10.8).
Las cromatografas en TLC de los aminocidos derivatizados pueden utilizarse
para cuantificar los aminocidos, pero requieren la utilizacin de patrones inter-
nos y externo. El patrn interno es una sustancia con las mismas caractersticas
de los aminocidos, pero que no se encuentra en las muestras biolgicas; se
aade al principio del tratamiento de la muestra en una cantidad conocida, y su
recuperacin al final del proceso permite cuantificar las prdidas que se puedan
producir en dicho proceso. Los patrones externos permiten controlar la seal
que produce cada aminocido en el proceso de cuantificacin.
Cromatografa de dansil-aminocidos
El ejemplo representativo que se comenta a continuacin es un mtodo que
permite la cuantificacin de aminocidos en pequeas muestras de sangre o
plasma (10 PL). Este mtodo permite introducir una serie de conceptos impor-
tantes, como son el acoplamiento de tcnicas de separacin (cromatografa de
tipo TLC) y cuantificacin (tcnicas radioqumicas) de biomolculas, el concepto
de patrn interno y el de patrn externo. El protocolo completo del mtodo
puede leerse en el Anexo de Mtodos del CD que acompaa a este libro.
El mtodo se basa en la derivatizacin de los aminocidos con cloruro de
dansilo marcado con 14C y la posterior separacin de los dansil-aminocidos por
cromatografa en capa fina. Una vez se ha obtenido el cromatograma, las man-
chas correspondientes a los distintos aminocidos derivatizados (visualizados con
luz ultravioleta) se recortan y se determina la radiactividad presente en cada
mancha, que ser directamente proporcional a la concentracin de cada ami-
nocido.
140
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales
141
Captulo 10
142
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales
( Dn Fn) u Q
Fr
(D F ) u Qn
(D F ) u Qn
C u Fr u V
( Dn Fn)
143
Captulo 10
144
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales
145
Captulo 10
146
Mtodos de determinacin de aminocidos individuales
mente cuando el pH aumente hasta el punto de reducir una de las cargas positi-
vas del aminocido. La posicin relativa de los aminocidos en el cromatograma
no slo viene determinada por el pH del eluyente, sino tambin por la concen-
tracin de cationes en ste. Generalmente, se utilizan tampones de citrato sdi-
co e iones sodio positivos, que compiten con los aminocidos cargados
positivamente por la unin a las cargas negativas que la resina posee. Aunque los
aminocidos tienen una gran afinidad por la resina, los iones sodio pueden estar
presentes en mucha mayor concentracin; por tanto, los aminocidos se vern
desplazados de la resina. La molaridad del tampn eluyente influye tambin en
la elucin, de modo que, cuando la fuerza inica del eluyente aumenta, los ami-
nocidos se eluyen ms rpidamente de la columna al haber ms interacciones
de iones del tampn con los puntos de unin de la columna, provocando la li-
beracin de aminocidos retenidos.
En el orden de elucin de los aminocidos tambin intervienen las interac-
ciones no inicas de stos con el relleno de la columna, lo que provoca que se
eluyan de manera diferente aminocidos con el mismo pI. As, la polaridad de la
cadena lateral de un aminocido influye en su orden de elucin; los aminoci-
dos con cadenas laterales hidrofbicas interaccionan ms con el relleno de la co-
lumna, ya que normalmente es hidrofbico (por ejemplo, poliestireno). Otros
factores pueden influir en la separacin de aminocidos por este tipo de croma-
tografa, como la temperatura y la velocidad del flujo o el tipo de catin utilizado
en el tampn eluyente.
Al salir de la columna, los aminocidos reaccionan con ninhidrina pasando a
travs de una espiral que se encuentra situada en un bao a 100 C. Adems, se
mide continuamente la absorbancia a 570 nm y 440 nm, para detectar amino-
cidos e iminocidos respectivamente (Figura 10.15).
En algunos instrumentos de este tipo se utiliza la reaccin del o-ftaldehdo
para derivatizar los aminocidos. Este reactivo es estable y soluble en agua, por
lo que se evita el uso de disolventes orgnicos txicos y no es necesario un al-
macenamiento bajo atmsfera de nitrgeno. Adems, la reaccin puede realizar-
se a temperatura ambiente. Es tambin una reaccin ms sensible y permite
detectar los aminocidos hasta un nivel de picomoles.
Al igual que en la separacin y cuantificacin por TLC y HPLC, se utilizan pa-
trones internos y externos.
147
Mtodos de determinacin de protenas
INTRODUCCIN
Estructura de las protenas
Fuerzas determinantes de la estructura proteica
Fuerzas electrostticas
Puentes de hidrgeno
Fuerzas hidrofbicas
Fuerzas de Van der Waals
Puentes disulfuro
Desnaturalizacin de las protenas
MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS
Mtodo de Kjeldahl (determinacin del contenido en nitrgeno)
Mtodo del biuret
Mtodo de Lowry
Mtodo del BCA
Mtodo de Bradford
Nefelometra
Determinacin de albmina
Determinacin de hemoglobina
148
11
INTRODUCCIN
149
Captulo 11
150
Mtodos de determinacin de protenas
cin del enlace CN est impedida. Por este motivo, los seis tomos ms impli-
cados en el enlace peptdico (Figuras 11.4 y 11.5) se hallan en el mismo plano.
La coplanaridad del enlace peptdico determina que las nicas libertades de
giro se siten en los enlaces de los carbonos D, que as sirven de nexo de unin
entre los distintos planos que componen el esqueleto de la protena. Para cada
uno de los carbonos D (CD) se definen dos ngulos, I (phi) y \ (psi), que corres-
ponden a la rotacin de los enlaces CDiNi y CDiCi + 1 (Figura 11.5), respectiva-
mente. Si se conoce el valor de estos ngulos para cada uno de los CD, la
disposicin espacial de la cadena polipeptdica queda definida exactamente. El
bioqumico indio Ramachandran populariz la idea de que la conformacin de
una cadena polipeptdica puede ser totalmente descrita representando cada resi-
duo de aminocido en un grfico bidimensional por sus valores de I y \. Estos
grficos se conocen con el nombre de representaciones de Ramachandran.
Los ngulos I y \ no pueden tomar cualquier valor, debido a que se produ-
cen impedimentos estricos. El estudio de modelos moleculares slidos de to-
mos realizados a escala en funcin de sus radios de Van der Waals ha permitido
determinar qu valores de los ngulos estn prohibidos a causa del impedimento
estrico. Los valores permitidos son los que determinan el plegamiento de la Figura 11.4. Dimensiones y ngulos de
enlace del enlace peptdico.
protena y la estructura tridimensional.
Hay seis niveles de organizacin de la estructura de las protenas (Figura 11.6):
Aparte de los enlaces peptdicos, son tambin cruciales otras uniones en la es-
tructura de las protenas; en este sentido, se puede hablar de fuerzas no cova- Figura 11.5. Representacin de los
lentes y de puentes disulfuro. Las fuerzas no covalentes son de uno a tres ngulos de Ramanchandran.
151
Captulo 11
Fuerzas electrostticas
Puentes de hidrgeno
Fuerzas hidrofbicas
Fuerzas de Van der Waals
Fuerzas electrostticas
Estas fuerzas se dan entre grupos cargados (las cadenas laterales de algunos ami-
Figura 11.7. Interaccin electrosttica
nocidos presentan carga a pH fisiolgicos, que puede ser positiva debida a
entre el grupo amino terminal Ile 16 (con aminocidos bsicos, o negativa a aminocidos cidos). Estas interacciones se
carga positiva) y el residuo Asp 194 (con conocen con el nombre de puentes salinos. La magnitud de estas fuerzas depen-
carga negativa) de la estructura de la de de la constante dielctrica del medio, de forma que en el medio no acuoso
quimotripsina, que presenta 4 cadenas del interior de la protena, la fuerza de atraccin entre grupos es mayor que en
polipeptdicas.
su superficie (el agua tiene una constante dielctrica elevada). Los grupos carga-
dos tienden a situarse en la superficie de la protena con objeto de estabilizar la
macromolcula en el entorno acuoso, y no tienen tanta importancia en el proce-
so de plegamiento de la protena como otras interacciones (Figura 11.7).
Puentes de hidrgeno
Los puentes de hidrgeno son enlaces que se establecen entre dos tomos elec-
tronegativos a travs del hidrgeno unido covalentemente a uno de ellos. Nor-
malmente la distancia de un puente de hidrgeno en una protena es un
10-25% mayor que la que existe entre dos molculas de agua unidas por puen-
te de hidrgeno. Las limitaciones de tipo geomtrico a la hora de formar estos
enlaces entre dos grupos del esqueleto proteico impiden, por otro lado, que los
dipolos se hallen perfectamente alineados, que sera la situacin de mxima
energa de enlace (Figura 11.8).
Figura 11.8. Interaccin por puente de
hidrgeno entre los grupos amino y
Desde el punto de vista estructural, las protenas siguen la estrategia de esta-
carbonilo de la Gly 211 y la Leu 199 en la blecer el mximo nmero posible de puentes de hidrgeno intramoleculares en-
quimotripsina. tre los tomos componentes de sus enlaces peptdicos, y de mantener en su
152
Mtodos de determinacin de protenas
Fuerzas hidrofbicas
Algunos aminocidos tienen en su cadena lateral grupos hidrofbicos (todos los
aminocidos con cadena lateral apolar). Estos grupos se ordenan de tal manera
que forman un ncleo hidrofbico en el interior de la protena sin la presencia de
agua (Figura 11.9), mientras que los aminocidos cargados se sitan en el exterior
de la protena. La introduccin de aminocidos con cadenas laterales con grupos
polares en el interior hidrofbico de la protena suele compensarse con la forma-
cin favorable de puentes de hidrgeno. Se ha comprobado que un 90% de los
grupos polares internos se hallan formando enlaces de hidrgeno intramoleculares. Figura 11.9. Interaccin hidrofbica entre
la cadena lateral de la Phe 71 (apolar) y la
de la Pro 24 (apolar) de la quimotripsina.
Fuerzas de Van der Waals En la figura se representan las distancias
de los radios de Van der Waals.
En el plegamiento de las protenas, puede darse tambin la situacin de que di-
ferentes tomos se encuentren a la distancia adecuada para que se establezcan
entre ellos otras interacciones de tipo Van der Waals, encontrndose de esta ma-
nera la protena en un estado favorable desde el punto de vista termodinmico
(Figura 11.10).
Las fuerzas de Van der Waals son atracciones elctricas dbiles entre diferen-
tes tomos. Estas fuerzas se deben a que cada tomo posee una nube electrni-
ca que puede fluctuar, creando de esta manera dipolos temporales. El dipolo
transitorio en un enlace puede inducir un dipolo complementario en otro enla-
ce, provocando que dos tomos de diferentes enlaces se mantengan juntos. Estas
atracciones de Van der Waals, aunque transitorias y dbiles, son un elemento
importante en la estructura de las protenas.
153
Captulo 11
154
Mtodos de determinacin de protenas
cesario que las protenas reaccionen con algn reactivo que les permita adquirir
una caracterstica que pueda medirse (como el color), ya que, aunque la presen-
cia de los residuos de tirosina (que absorben radiacin electromagntica a
193 nm y, en menor medida, a 280 nm) y de triptfano (absorben a 219 nm y,
en menor medida, a 280 nm) provoca que las protenas absorban luz a una lon-
gitud de onda de 280 nm, esta absorcin es demasiado baja e inespecfica para
poder ser utilizada por s misma en la cuantificacin de las protenas.
Los primeros factores a considerar, como se ha venido diciendo repetida-
mente, para seleccionar un mtodo de anlisis, son la naturaleza de la muestra y
la presencia de sustancias que puedan interferir. Por ello a veces es necesaria
una etapa previa de purificacin para eliminar las sustancias que interfieren.
Existen varias posibilidades. Por ejemplo, se pueden precipitar las protenas solu-
bles, lavarlas y cuantificarlas despus por un mtodo adecuado. Si la precipita-
cin se realiza por calor o con cidos fuertes, es irreversible, por lo que es
necesario utilizar un mtodo del tipo del mtodo de Kjeldahl para la cuantifica-
cin de protenas. Si la precipitacin se produce con sales o alcohol, el precipita-
do proteico puede redisolverse en una base, con lo que despus puede utilizarse
un mtodo para la determinacin de protenas totales como el del biuret. Otra
posibilidad es eliminar las sustancias que producen la interferencia, que a menu-
do son molculas pequeas (como aminocidos), por dilisis (ver captulo 17).
Mtodo de Kjeldahl
(determinacin del contenido en nitrgeno)
El mtodo de Kjeldahl para la determinacin de protenas totales se basa en la
determinacin del nitrgeno proteico (Figura 11.13). Se trata de un mtodo que,
aunque resulta muy exacto, se emplea poco hoy en da debido a que es un m-
todo lento para la determinacin de protenas totales en clnica. Sin embargo, su
uso est bastante extendido en la determinacin de protenas en alimentos, so-
bre todo con el uso de aparatos automatizados.
El mtodo de Kjeldahl sirve para determinar la cantidad total de nitrgeno
de un compuesto, aunque puede utilizarse para calcular la cantidad de prote-
na que hay en una muestra, si se conoce la proporcin de nitrgeno en la pro-
tena que, por trmino medio, se sita en un 16%. Las determinaciones de
155
Captulo 11
156
Mtodos de determinacin de protenas
Mtodo de Lowry
El mtodo de Lowry (1951) utiliza tres sistemas para producir coloracin por la
presencia de protenas. En primer lugar, el Cu+, forma complejos de coordina-
cin con dos enlaces peptdicos consecutivos de las protenas, dando lugar a un
compuesto coloreado azul de manera similar al mtodo del biuret. En segun-
do lugar, este compuesto es capaz de reducir al reactivo de Folin-Ciocalteu (ci-
do fosfotngstico y fosfomolbdico), dando un color ms azulado. Por ltimo, el
reactivo de Folin-Ciocalteu tambin reacciona con los restos tirosinil (residuos de
tirosina) de la cadena polipeptdica, produciendo asimismo un color azul por la
reduccin del fosfomolibdato en medio bsico.
El espectro de absorcin no corresponde a una nica sustancia, por lo que
puede emplearse un amplio margen de longitudes de onda, entre 500 y
700 nm, para la lectura de la absorbancia (ver Anexo de Mtodos del CD).
El mtodo de Lowry es unas 100 veces ms sensible que el del biuret. La sen-
sibilidad es una ventaja cuando se miden concentraciones muy bajas de prote-
na. El mtodo de Lowry es muy utilizado en investigacin, sobre todo para la
determinacin cuantitativa de protenas tisulares y enzimas en preparaciones pu-
rificadas. Por otra parte, ciertos frmacos interfieren en el proceso y por ello el
mtodo no suele utilizarse en los laboratorios clnicos.
157
Captulo 11
Mtodo de Bradford
Este mtodo se fundamenta en que la unin de las protenas al colorante azul
brillante de Coomassie G-250 provoca un desplazamiento del mximo de absor-
cin de este compuesto, desde 465 nm a 595 nm (Figura 11.18). Por lo tanto las
medidas de absorbancia del complejo protena-colorante se realizarn a 595 nm
(ver Anexo de Mtodos del CD).
Nefelometra
Figura 11.18. Espectro de absorcin del Algunos mtodos para la cuantificacin de protenas se basan en la facilidad que
complejo protena-azul de Coomassie G- presentan muchas de ellas para precipitar en determinadas condiciones. Se utili-
250. A: azul de Coomassie; B: complejo zan reactivos especficos de precipitacin, generalmente cidos orgnicos, como
protena-colorante. el cido tricloroactico, y la turbidez producida se compara fotomtricamente
con la producida por una concentracin conocida de protena.
Cuando la luz choca contra una partcula en suspensin, parte de esta luz es
dispersada. La dispersin de la luz por una partcula depende de su tamao, de
su ndice de refraccin con relacin al del lquido que la rodea y de la longitud
de onda de la luz. La luz dispersada por las partculas en suspensin puede me-
dirse por dos tcnicas, que son la turbidometra y la nefelometra.
La turbidometra se basa en la medida de la disminucin de la luz transmitida
a travs de una solucin con partculas. Las medidas turbidomtricas se realizan
con espectrofotmetros.
La nefelometra se basa en la medida de la luz dispersada a diversos ngulos
por una suspensin de partculas. En la figura 11.19 se muestran esquemtica-
mente los componentes de un nefelmetro, que son los siguientes:
Fuente de luz
Filtro de excitacin
Cubeta de muestra
Filtro
Detector
Sistema de registro
158
Mtodos de determinacin de protenas
Determinacin de albmina
La albmina de las muestras de plasma se puede determinar por el cambio de
coloracin del verde de bromocresol cuando se une selectivamente a sta a pH
4,2. El cambio de coloracin se refleja en que se provoca un cambio en la ab-
sorbancia del verde de bromocresol, que tiene un mximo de absorcin a
440 nm y pasa a presentar su mximo a 630 nm. El verde de bromocresol es
amarillo, mientras que el complejo protena-colorante tiene un intenso color
azul. Este mtodo permite detectar de 50 Pg a 0,2 g de albmina (ver Anexo de
Mtodos del CD).
Determinacin de hemoglobina
Los niveles de hemoglobina en sangre pueden determinarse por un mtodo es-
pectrofotomtrico que se fundamenta en la capacidad que presentan la hemo-
globina y sus derivados (excepto la sulfohemoglobina), en medio alcalino y en
presencia de ferrocianuro potsico, de ser oxidados a metahemoglobina; esta
ltima reacciona con el cianuro potsico para producir cianohemoglobina, la
cual presenta un mximo de absorcin a 540 nm. La absorbancia es proporcio-
nal a la cantidad de hemoglobina presente en las muestras (ver Anexo de Mto-
dos del CD).
159
Tcnicas de separacin: electroforesis
INTRODUCCIN
FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS
Componentes de un sistema electrofortico
Migracin electrofortica
Naturaleza de los compuestos a separar
Campo elctrico
Tampn
Soporte
TIPOS DE ELECTROFORESIS
Electroforesis en papel de filtro
Electroforesis en membranas de acetato de celulosa
Electroforesis en geles de almidn
Electroforesis en geles de agarosa
Electroforesis en geles de poliacrilamida
VISUALIZACIN Y CUANTIFICACIN DE LOS RESULTADOS
APLICACIONES PARTICULARES DE LA ELECTROFORESIS
Isoelectroenfoque
Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: SDS-PAGE
Electroforesis en gradiente
Electroforesis bidimensional
Electroforesis capilar (CE)
160
12
INTRODUCCIN
161
Captulo 12
FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS
La electroforesis consiste en la migracin de partculas cargadas sometidas a la
influencia de un campo elctrico, de tal forma que las molculas con carga posi-
tiva migran al ctodo (electrodo con carga negativa) y las molculas con carga
negativa migran al nodo (electrodo con carga positiva). La velocidad de esta mi-
gracin se encuentra influenciada por las caractersticas de la biomolcula que
migra (la carga que transporta), la intensidad del campo elctrico y las caracters-
ticas del medio en la que tiene lugar la migracin.
La velocidad de migracin de una molcula cargada es el resultado de una
fuerza impulsora del movimiento, de tipo electrosttico:
Fimpulsora QuE
donde: Q: carga elctrica de la molcula
E: intensidad del campo elctrico
Fimpulsora = Fretardadora
QuE=6uSuruKuv
QuE
v
6uSuruK
v Q
P
E 6uSuruK
162
Tcnicas de separacin: electroforesis
163
Captulo 12
Migracin electrofortica
QuE
v
6uSuruK
Campo elctrico
El campo elctrico influye en una serie de aspectos importantes. La diferencia de
potencial que se establece entre los dos electrodos no es el nico factor a tener
164
Tcnicas de separacin: electroforesis
Tampn
El tampn utilizado en la separacin electrofortica establece el pH del medio
en el que tiene lugar la separacin; adems, tambin interviene transportando
carga entre los dos electrodos. Por lo tanto, la concentracin del tampn juega
un papel importante, ya que, al aumentar la concentracin del tampn, es ma-
yor la proporcin de carga debida al tampn transportada entre los electrodos y,
en consecuencia, disminuye la velocidad de migracin de la muestra. Disminuir
la concentracin del tampn puede mejorar la resolucin electrofortica; aun-
que si se reduce demasiado, disminuye tambin la resolucin de la electroforesis
al transportarse una parte importante de la carga con la muestra y migra sta ms
rpidamente. Por lo tanto, debe llegarse a un compromiso a la hora de elegir el
tampn apropiado y su concentracin de iones segn el tipo de separacin elec-
trofortica que se persiga.
El pH del tampn tambin es muy importante, ya que determina la magnitud
de la ionizacin y la carga neta de las molculas que se separan y, de esta forma,
define la direccin de la migracin electrofortica. El tampn presente en los re-
cipientes de la electroforesis es normalmente el mismo que se emplea para satu-
rar el medio de soporte. Sin embargo, en la electroforesis en gel, en la que el
tampn acta como parte del medio de soporte, se emplea con frecuencia un
tampn diferente del que se usa en los recipientes de electroforesis.
Soporte
El medio de soporte donde tiene lugar la separacin tambin influye en la reso-
lucin electrofortica. Se han utilizado diferentes soportes y, aunque son relati-
vamente inertes, son capaces de ejercer varios efectos sobre la resolucin de la
electroforesis. Entre los efectos que pueden producirse se pueden sealar los si-
guientes: adsorcin, electroendsmosis y cribado molecular.
Algunos soportes pueden adsorber las molculas que se separan por electro-
foresis, lo que conduce a la formacin de colas en la separacin de sustancias,
adems de reducir la velocidad de migracin de las molculas. El grado de ad-
sorcin depende del tipo de soporte que se utiliza. As, por ejemplo, el papel
presenta fenmenos de adsorcin sobre muchas molculas debido a su polari-
dad, efecto que puede reducirse utilizando acetato de celulosa como soporte en
lugar de papel.
165
Captulo 12
TIPOS DE ELECTROFORESIS
La principal diferencia entre los distintos tipos de electroforesis estriba en el
medio de soporte. El medio de soporte determina el tipo de equipamiento ne-
cesario, la resolucin que va a obtenerse (es decir, la capacidad de discrimina-
cin en la separacin de molculas), la separacin entre las distintas bandas, el
tipo de tampn y las tcnicas de visualizacin de dichas bandas. Ya que la
electroforesis, por s misma, tan slo proporciona el medio de separacin,
debe aadirse a la tcnica un sistema de visualizacin y cuantificacin de los
resultados.
Pueden utilizarse distintos medios de soporte. Entre ellos cabe mencionar:
Papel de filtro
Membranas de acetato de celulosa
Geles de almidn
Geles de agarosa
Geles de poliacrilamida
166
Tcnicas de separacin: electroforesis
167
Captulo 12
El papel (celulosa) presenta una desventaja importante para su uso como soporte
en una electroforesis debido a su capacidad de adsorber diferentes molculas, a
causa de la presencia de los grupos hidroxilo propios de la estructura del papel.
Esta adsorcin impide el movimiento de las molculas y, por tanto, reduce la re-
solucin de las separaciones. Para solucionar este problema se recurre a la esteri-
ficacin de los grupos hidroxilo con cido actico, dando lugar a lo que se
conoce como membrana de acetato de celulosa, que es un material apolar. El
uso de dicho material evita los problemas de adsorcin que provocaba el papel,
ya que dejan de existir los numerosos grupos hidroxilo que interaccionaban con
las molculas a separar, que presentan carga, y que tendrn muy poca capacidad
de adsorcin sobre materiales apolares, como el acetato de celulosa.
La resolucin de las electroforesis sobre acetato de celulosa mejora con res-
pecto a la que se consigue con electroforesis en papel, permitiendo una mayor
separacin de las molculas. Las membranas de acetato de celulosa presentan,
adems, la ventaja de que pueden volverse transparentes por la accin de dife-
rentes agentes como el metanol y el cido actico, lo que permite una mejor
lectura mediante fotodensitometra de las bandas obtenidas en la membrana por
la separacin de los distintos componentes de una muestra. Es ms, este tipo de
electroforesis permite realizar separaciones muy rpidas, de 30-60 minutos, y las
membranas pueden guardarse durante algn tiempo y ser todava analizables.
Uno de los problemas de las tiras de acetato de celulosa es que pueden pro-
vocar la aparicin del fenmeno de electroendsmosis, pudiendo dar lugar a un
cierto grado de difusin en la separacin de los compuestos.
Los geles de almidn son polmeros de glucosa con dos tipos de estructura, la
amilosa y la amilopectina. El problema ms importante de estos geles es el he-
cho de que resulta difcil preparar distintos geles con la misma concentracin y
la misma proporcin de los dos componentes, la amilosa y la amilopectina. Estas
molculas se obtienen mediante la hidrlisis parcial del almidn de la patata, de
tal forma que aumentando el grado de hidrlisis, los fragmentos de estas mol-
culas pueden ser mayores o menores; por lo tanto, los geles que se formen a
partir de ellas presentarn tamaos de poro mayores o menores respectivamen-
te. As pues, en esta tcnica puede variarse tambin el tamao de poro de los
geles para realizar un cribado molecular apropiado al tipo de molculas a sepa-
rar. Los geles de almidn se preparan disolviendo la amilosa y la amilopectina en
168
Tcnicas de separacin: electroforesis
Otro tipo de soporte en gel lo constituyen los geles de agarosa, que son utiliza-
dos con frecuencia en la separacin de protenas y cidos nucleicos. El tamao
de los poros puede ser variable en funcin de la concentracin de agarosa que
se utilice; de esta manera, puede elegirse el tamao de poro adecuado (es decir
la concentracin de agarosa adecuada para formar el gel) segn el rango de ta-
mao de las molculas a separar. Dependiendo del tamao de poro que se defi-
na, la electroforesis en geles de agarosa puede utilizarse para separar distintos
tipos de cidos nucleicos (Figura 12.5).
Los geles de agarosa tambin se utilizan en la separacin de protenas sricas,
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa (ver captulo 13), diferentes fracciones
de las lipoprotenas (ver captulo 18), etc.
El tamao de poro de estos geles es grande en comparacin con otros tipos
de geles, lo que permite la separacin por cribado molecular, aparte de por car-
ga, de biomolculas grandes (peso molecular >200 kDa), como son los cidos Figura 12.5. Concentracin de agarosa
nucleicos y las lipoprotenas. En cambio, las protenas sricas, al ser molculas recomendada para llevar a cabo una
ms pequeas, no se separan por cribado molecular en estos tipos de geles, aun- correcta separacin de cidos nucleicos
que con ellos se consiguen mejores separaciones que con el acetato de celulosa, mediante electroforesis en funcin del
rango de tamao de las molculas a
no obstante, en contrapartida, el soporte de agarosa es ms frgil.
separar. kb: kilobases.
Los geles de poliacrilamida son otro ejemplo frecuente de geles que pueden uti-
lizarse en la separacin de biomolculas. Al igual que los geles de agarosa, pue-
den prepararse con diferentes tamaos de poro pero, en este caso, los tamaos
de poro que se consiguen son ms pequeos que en el caso de la agarosa, lo
que permite la separacin, por forma y tamao, de molculas ms pequeas
que en los geles de agarosa, como es el caso de muchas protenas.
Los geles de poliacrilamida habitualmente se obtienen por la polimerizacin
de molculas de acrilamida y N,Ncmetiln-bis-acrilamida, disueltas en un
tampn adecuado. Requieren la accin de un polimerizador, que suele ser el
persulfato amnico. Al disolverse en agua, produce radicales libres, que a su vez
inducen la formacin de numerosos radicales libres en la acrilamida, permitien-
do de esta manera su polimerizacin. La gelificacin se consigue debido a la for-
macin de enlaces cruzados por la presencia de la bisacrilamida. De esta
169
Captulo 12
170
Tcnicas de separacin: electroforesis
Una vez detectadas las diferentes bandas utilizando los reactivos apropiados,
pueden utilizarse dichas bandas tanto para identificar las diferentes sustancias de
una muestra como para cuantificarlas, bien eluyndolas primero o bien por de-
teccin directa sobre el medio de soporte electrofortico (por ejemplo, por foto-
densitometra sobre el mismo soporte).
Isoelectroenfoque
El isoelectroenfoque es un sistema de separacin electrofortica que separa las
molculas en funcin de su punto isoelctrico. Un ejemplo claro de su aplica-
171
Captulo 12
172
Tcnicas de separacin: electroforesis
173
Captulo 12
Electroforesis en gradiente
En algunos casos puede interesar que el soporte vaya cambiando en sus propie-
dades a medida que se realiza la separacin. Una muestra de ello lo constituye
la electroforesis en geles de poliacrialamida en gradiente. Los gradientes se ob-
tienen variando la concentracin de acrilamida, por ejemplo del 3 al 30%. El
gradiente puede ser, por ejemplo, lineal cncavo; este gradiente de concentra-
cin provoca cambios en el tamao de poro, que disminuye a medida que au-
menta la concentracin de acrilamida. Se elige la concentracin en funcin del
tamao de las sustancias que quieren separarse. Con este tipo de geles, cada
sustancia migra hasta alcanzar una posicin en que el tamao de poro en el gel
no le permita seguir avanzando, aunque la migracin no se detiene totalmente.
La ventaja de estos tipos de geles es que, una vez que las sustancias a separar al-
canzan la zona del tamao de poro lmite, al no producirse migracin aprecia-
ble, las bandas se estrechan y se obtiene una mejor resolucin de las
biomolculas.
Electroforesis bidimensional
La resolucin electrofortica puede mejorarse realizando una separacin bidi-
mensional de la muestra. Esto se consigue llevando a cabo la separacin en
funcin de dos propiedades distintas; por ejemplo, la primera propiedad en la
que basar la separacin puede ser el fundamento de un isoelectroenfoque, y la
segunda las diferencias de masa molecular segn la tcnica de SDS-PAGE (Fi-
gura 12.16).
As, por ejemplo, puede realizarse una primera separacin por isoelectroen-
foque, que puede hacerse en placa o en columna. Una vez finalizada esta pri-
mera separacin, se corta la tira de inters (si la separacin se ha realizado en
placa), o se extrae el gel de la columna (en caso de que la primera separacin se
haya realizado en columna). Tanto en un caso como en otro se coloca el gel en-
174
Tcnicas de separacin: electroforesis
tre dos lminas de vidrio que soportan entre ellas el segundo gel, donde se reali-
za una separacin de tipo SDS-PAGE. Una vez finalizado todo el proceso, se
procede a la deteccin de las sustancias separadas en el gel con el reactivo ade-
cuado.
La visualizacin e interpretacin de los resultados es difcil en este tipo de
electroforesis, pero hoy en da existen programas de ordenador que ayudan a la
identificacin de las manchas en el gel y a la caracterizacin de las biomolculas
separadas por este tipo de electroforesis.
175
Captulo 12
176
ERRNVPHGLFRVRUJ
Tcnicas enzimticas
INTRODUCCIN
ENZIMAS
Especificidad de accin y de sustrato
Estructura de las enzimas
Cintica enzimtica
Modelo de Michaelis-Menten
Significado de las constantes cinticas del modelo Michaelis-Menten: Km y Vmx
Clasificacin de las enzimas
DISEO DE LA MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
Medio de reaccin
Medida de la velocidad de reaccin
Deteccin del sustrato o del producto de una reaccin enzimtica
LAS ENZIMAS COMO REACTIVOS
178
13
INTRODUCCIN
179
Captulo 13
ENZIMAS
180
Tcnicas enzimticas
181
Captulo 13
Cintica enzimtica
El estudio de la cintica enzimtica se basa en encontrar una relacin entre la
velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y la concentracin de sus-
trato participante. Si se representa la velocidad de reaccin en funcin de la
concentracin de sustrato, se obtiene una curva tpica de una cintica de satura-
cin (Figura 13.5).
La velocidad mxima es la velocidad que no se puede sobrepasar por mucho
que aumente la concentracin de sustrato. Cuando se alcanza la velocidad mxi-
ma, todos los centros activos de la enzima se encuentran ocupados por el sustrato.
En la curva que se obtiene al representar la velocidad de reaccin frente a la
Figura 13.5. Curva tpica que se obtiene concentracin de sustrato se pueden distinguir tres etapas, que se representan
al representar la velocidad de reaccin (v) en la figura 13.6.
frente a la concentracin de sustrato [S]
de una reaccin con cintica de
Etapa 1. En esta primera etapa, v (velocidad de reaccin) es directamente pro-
saturacin.
porcional a [S] (concentracin de sustrato), cumpliendo la frmula:
v = k [S]1, siendo k una constante. Se habla de una cintica de primer
orden.
Etapa 2. v puede depender o no de [S]. Se habla de una cintica de orden cam-
biante, tpica de las reacciones catalizadas por enzimas.
Etapa 3. v ya no depende de [S]. Se habla de una cintica de orden cero, que
responde a la frmula: v = kc [S]0.
182
Tcnicas enzimticas
Modelo de Michaelis-Menten
La velocidad global de transformacin del sustrato en producto depende de to-
dos estos procesos. Michaelis y Menten propusieron un modelo para explicar la
curva de la velocidad de una reaccin en la que intervenga una enzima en fun-
cin de la concentracin de sustrato.
El modelo aplica la teora del estado estacionario, donde la [ES] permanece
constante en el tiempo, para encontrar una ecuacin de la velocidad de reac-
cin. En la figura 13.7 se ha representado la evolucin en el tiempo de la canti-
dad de los diferentes elementos que intervienen en una reaccin enzimtica,
donde puede observarse cmo, en el estado estacionario, a partir de un mo-
mento determinado las cantidades de ES y E no se modifican con el tiempo por-
que se forma tanta cantidad de ES como la que se destruye. El estado
estacionario facilita el estudio de las cinticas enzimticas.
El modelo de Michaelis-Menten se aplica al estado estacionario y se funda-
menta en las siguientes premisas:
Figura 13.7. Evolucin en el tiempo de la
La etapa limitante de la velocidad de transformacin de sustrato (S) en cantidad de los diferentes compuestos
producto (P) es el paso de: que intervienen en una reaccin
enzimtica. A medida que transcurre el
k2 tiempo, la cantidad de sustrato disminuye
ES o EP
mientras que aumenta la cantidad de
producto formado. La enzima libre, que
Por lo tanto, la velocidad del proceso depende de la cantidad de complejo se encuentra en muy pequea cantidad,
ES en el estado estacionario ([ES]e y del poder cataltico de la enzima (k2). disminuye hasta un nivel determinado,
mientras que el complejo enzima-sustrato
v = k2 u [ES]e aumenta hasta un valor concreto; en el
momento que la cantidad de complejo
La concentracin de sustrato es muy superior a la cantidad de enzima; la enzima-sustrato alcanza este valor
mximo, la reaccin se encuentra en el
diferencia es aproximadamente de tres rdenes de magnitud. Por lo tanto estado estacionario, se produce tanto
en los primeros instantes del estado estacionario: complejo enzima-sustrato como el que se
destruye.
[S]e = [S] [ES]e = [S]
[E]e = [E] [ES]e
183
Captulo 13
d [ES]
La velocidad de formacin de ES: v fES k 1 [E]e [S]e
dt
d [ES]
v tES k 1 [ES]e k 2 [ES]e
dt
[E] [ES]e k 1 k 2
[S]
[ES]e k1
k 1 k 2
Km
k1
[E] [ES]e k 1 k 2
[S]
[ES]e k1
k 2 [E] [S]
v
Km [S]
Vmx [S]
v Ecuacin de Michaelis - Menten
Km [S]
184
Tcnicas enzimticas
Vmx [S]
Vmax
Km [S]
k 1 k 2 k 1 [E] [S]
Km Keq
k1 k1 [ES]
185
Captulo 13
na. Aunque tambin existen enzimas a las que se les ha dado un nombre que
no tiene relacin con el sustrato que catalizan; por ejemplo, la pepsina y la
tripsina son enzimas que provocan la ruptura de enlaces peptdicos. Adems,
podemos encontrarnos con el problema de que se conozca a una misma enzi-
ma con dos o ms nombres, o que a dos enzimas diferentes se les haya dado
el mismo nombre. Con el fin de evitar errores y ambigedades, la Comisin de
Enzimas (EC) de la International Union of Biochemistry (IUB) propuso adoptar
un convenio sistemtico para la designacin y la clasificacin de las enzimas,
aunque muchas enzimas se conocen todava de forma habitual por sus nom-
bres comunes.
Las enzimas se clasifican en funcin de seis clases principales de tipos de re-
acciones (Figura 13.9), cada una de las cuales presenta diferentes subclases.
186
Tcnicas enzimticas
Medio de reaccin
187
Captulo 13
d [S] d [P]
v v
dt dt
188
Tcnicas enzimticas
1 kat = 60.000.000 U
El katal es una unidad demasiado grande para las actividades que se pueden
encontrar en los homogeneizados de diferentes tejidos animales y en el suero,
as que normalmente se utilizan submltiplos de estas unidades:
189
Captulo 13
190
Tcnicas enzimticas
191
Captulo 13
El conocimiento de las enzimas abre la puerta a los mtodos enzimticos, una al-
ternativa ms especfica a los mtodos qumicos. Recordemos que la especifici-
dad de los mtodos qumicos es el resultado de la presencia de un grupo
funcional: grupo aldehdo, grupo amino, enlace peptdico, grupo alcohol, etc.
Muchas veces, las biomolculas presentan grupos funcionales muy similares, por
lo que ms de una biomolcula puede reaccionar con un mismo reactivo. Este
problema se reduce utilizando las enzimas como reactivos, ya que stas son es-
pecficas de sustrato y no de grupo funcional, es decir, reconocen una agrupa-
cin de grupos funcionales y su distribucin tridimensional, debido a que el
centro activo de la enzima es una entidad tridimensional. As, se pueden disear
mtodos en los que el reactivo responsable de la transformacin de un com-
puesto sea una enzima. Como siempre, dicha transformacin debe provocar que
un compuesto que presentaba una caracterstica mensurable la pierda, o vice-
versa. De esta manera, para disear un mtodo enzimtico, basta con conocer
las enzimas que pueden actuar sobre el compuesto a determinar y elegir la que
permita cuantificar la desaparicin de sustrato o la aparicin de producto. Al ac-
tuar la enzima como reactivo, debe aadirse en la cantidad suficiente para trans-
formar todo el sustrato en producto, es decir, en exceso. La ventaja de los
mtodos enzimticos es su elevada especificidad, por lo que permiten obviar,
muchas veces, pasos previos de purificacin.
El diseo de los mtodos enzimticos se basa en establecer un medio de re-
accin que contenga todos los componentes necesarios para que sta tenga lu-
gar: tampn, temperatura, iones, cosustratos adecuados, etc. Normalmente, en
estos casos, lo ltimo que se aade es la enzima. Adems, se requiere que el
sustrato o el producto formado presenten una caracterstica que pueda medirse,
aunque puede realizarse una reaccin qumica sobre el sustrato o el producto, o
acoplarse otra reaccin enzimtica que acte como reaccin indicadora. As
pues, las posibilidades son mltiples, acoplando y combinando los diferentes
mtodos que hemos visto. Normalmente se procede a la lectura de la caracters-
tica mensurable antes y despus de aadir la enzima como reactivo. En algunos
casos, si se utiliza un reactivo qumico una vez transcurrida la reaccin, se proce-
san dos tubos de muestra en paralelo, con la nica diferencia de que a uno no
se le aade la enzima, de manera que la diferencia de medida entre los dos tu-
bos se atribuye nicamente al efecto de la accin de la enzima, la reaccin es-
pecfica.
Como ejemplo de la determinacin de la concentracin de un sustrato utili-
zando un mtodo enzimtico, veamos la determinacin de glucosa por el mto-
do de la glucosa oxidasa, en el que tienen lugar las siguientes reacciones:
192
Tcnicas enzimticas
Glucosa oxidasa
a) Glucosa O 2 H2O
o Gluconato H2O2
b) 2H2O 2 4 - Aminofenazona Fenol Peroxidasa
o Cromgeno 4 H2O
El reactivo que se utiliza contiene las enzimas glucosa oxidasa (que se usa en
a) y peroxidasa (b), y los sustratos necesarios para que la reaccin tenga lugar en
condiciones definidas y ptimas para que el sistema funcione (ver Anexo de M-
todos en el CD).
Cuando se aade la muestra, es decir, el suero que contiene la glucosa que
se desea medir, se desencadena la reaccin. El color que aparece por formacin
de un cromforo puede medirse espectrofotomtricamente. Como patrones se
utilizan soluciones de glucosa de concentracin conocida.
El anlisis de la glucosa se puede realizar tambin por el mtodo de la hexo-
quinasa:
Hexoquinasa
a) Glucosa ATP
o Glucosa - 6 -P ADP
Glucosa-6-P DH
b) Glucosa - 6 -P NADP
o 6 -Fosfogluconato NADPH
193
Captulo 13
194
Tcnicas inmunoqumicas
INTRODUCCIN
Anticuerpos
Obtencin de anticuerpos policlonales y monoclonales
Interacciones antgeno-anticuerpo
TCNICAS ANALTICAS INMUNOQUMICAS
Reacciones de precipitacin
Inmunoprecipitacin en solucin
Inmunoprecipitacin en gel
Ensayos inmunoqumicos que utilizan marcadores
Radioinmunoensayo (RIA) y ensayo inmunorradiomtrico (IRMA)
Inmunoensayo enzimtico (EIA): marcaje con enzimas
Fluoroinmunoensayos
Western blot
196
14
INTRODUCCIN
Las tcnicas separativas, como las electroforticas y las cromatogrficas, no per-
miten separar con la suficiente resolucin todos los tipos de protenas, impidien-
do, por tanto, la determinacin y cuantificacin de ciertas protenas. Aunque las
tcnicas enzimticas son tiles para el anlisis de ciertas protenas, no todas las
protenas son enzimas, o simplemente no se puede cuantificar su actividad. Por
tanto, antes de la aparicin de los mtodos inmunolgicos, quedaba un amplio
nmero de protenas que no se podan determinar de manera sencilla y rpida.
Tena que acudirse a tediosas tcnicas de aislamiento, que consuman grandes
cantidades de muestra y tiempo, aparte de que existan protenas que difcil-
mente se podan cuantificar o determinar.
Los mtodos analticos para la determinacin de un compuesto especfico
deben basarse en sus caractersticas diferenciales en relacin con el resto de
compuestos que lo acompaan. La diferencia fundamental entre las distintas
protenas radica en su estructura tridimensional y sta depende de la estructura
primaria, es decir, de la secuencia de aminocidos. Por tanto, la cuantificacin
de protenas concretas puede basarse en su estructura primaria, que determina
la estructura terciaria. As pues, una manera de resolver el problema de la cuan-
tificacin de una protena determinada radica en descubrir qu compuestos son
capaces de reconocerla por su estructura terciaria, es decir, por la disposicin tri-
dimensional de sus grupos funcionales. La respuesta es clara: las inmunoglobuli-
nas o anticuerpos seran candidatos a poder solucionar el problema.
De esta manera, las reacciones inmunoqumicas constituyen el fundamento
de una amplia gama de ensayos sensibles y especficos para una gran variedad
de mtodos, incluidos mtodos aplicados en clnica.
Anticuerpos
Los anticuerpos son un grupo especial de protenas: las inmunoglobulinas (Ig). Los
anticuerpos son capaces de unirse de manera especfica a una amplia variedad de
197
Captulo 14
198
Tcnicas inmunoqumicas
199
Captulo 14
Una vez fusionadas las clulas del mieloma con los linfocitos, se someten a
un proceso de seleccin en un medio HAT. Las clulas hbridas (hibridomas)
pueden sobrevivir en el medio selectivo, ya que estas clulas combinan la inmor-
talidad de las clulas del mieloma y el material gentico de los linfocitos, necesa-
rio para la sntesis de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa
200
Tcnicas inmunoqumicas
(Figura 14.4). Las clulas no fusionadas se mueren en este medio, bien porque
no son inmortales (linfocitos fusionados entre ellos o simplemente no fusionados
con clulas inmortales), o bien por la carencia de la enzima (clulas inmortales
no fusionadas con linfocitos). Los hibridomas, despus de unas tres semanas de
crecimiento, son seleccionados segn el anticuerpo que producen. Para esta se-
leccin, existe una amplia variedad de tests disponibles, entre ellos, el radioin-
munoensayo o el inmunoensayo enzimtico. Las lneas celulares que secretan el
anticuerpo con la especificidad deseada son clonadas en subcultivos. De esta
manera, es posible aislar una nica lnea celular que produce un anticuerpo con
una especificidad por un nico eptopo de un inmungeno, es decir, un anti- Figura 14.4. Esquema de la fusin de una
cuerpo monoclonal (Figura 14.3). clula B y una clula cancerosa para
La utilizacin de uno u otro tipo de anticuerpos depende de la finalidad de la producir una lnea celular productora de
tcnica a utilizar. As, los anticuerpos policlonales son una mezcla heterognea anticuerpos con una determinada
de anticuerpos y es difcil obtener siempre la misma especificidad de unin especificidad.
cuando se comparan diferentes lotes de anticuerpos; de hecho, los resultados
obtenidos con anticuerpos policlonales se basan en una media de las propieda-
des de los diferentes anticuerpos formados. Por el contrario, los anticuerpos mo-
noclonales, aunque son ms difciles de obtener que los policlonales, presentan
una serie de ventajas sobre stos, ya que reconocen un nico eptopo del in-
mungeno y se pueden cultivar y subcultivar los hibridomas obtenidos, lo que
permite obtener anticuerpos con las mismas caractersticas aunque procedan de
diferentes lotes de produccin.
Interacciones antgeno-anticuerpo
La unin entre el anticuerpo y el antgeno se establece por fuerzas dbiles entre
distintos grupos funcionales de ambos; esta unin tiene lugar en un espacio tridi-
mensional. Las interacciones que se producen pueden ser hidrofbicas (entre
grupos apolares), dipolo-dipolo (entre grupos polares) o por enlaces salinos (en-
tre grupos cargados). Cuanto mayor es el nmero de interacciones que se esta-
blecen entre las dos molculas, y cuanto ms ptima sea la distancia de estas
interacciones en conjunto, mayor ser la especificidad de unin entre el antge-
no y el anticuerpo.
La reaccin entre el antgeno y el anticuerpo es una reaccin de equilibrio
que transcurre en varias fases (Figura 14.5). En la fase inicial, un antgeno multi-
valente se une a un anticuerpo bivalente; en la segunda fase se van aglutinando
ms antgenos y anticuerpos para formar un complejo mltiple (esta segunda
fase es mucho ms lenta que la primera); en la tercera fase se produce la preci-
pitacin del complejo formado despus de que ste alcance un tamao crtico.
Las interacciones que se establecen entre el antgeno y el anticuerpo se pue-
den ver afectadas por cambios de pH, temperatura, fuerza inica del medio,
presencia de polmeros lineales, etc. Estos factores pueden utilizarse para au- Figura 14.5. Representacin de las fases
mentar la especificidad de las interacciones antgeno-anticuerpo, disminuyendo de una interaccin antgeno-anticuerpo,
las interacciones no deseadas o inespecficas. donde n es el nmero de eptopos por
Un ejemplo de esto ltimo es el hecho de que la presencia de cationes inhibe molcula y a y b son el nmero de
molculas de antgeno y anticuerpo por
la unin entre el antgeno y el anticuerpo. El valor de esta inhibicin depende del
complejo respectivamente. Inicialmente se
tipo de catin que se utilice, de forma que si se ordenan diferentes cationes en unen el antgeno y el anticuerpo y, en una
funcin del grado de inhibicin que provocan se obtiene la siguiente secuencia: segunda fase, se forma una agrupacin
macromolecular entre los antgenos y los
Cs+ > Rb+ > K+ > Na+ > Li+ anticuerpos.
201
Captulo 14
202
Tcnicas inmunoqumicas
Radiactividad
Color o fluorescencia
Uso de enzimas como marcadores
Ag Ac * o Ag: Ac *
Reacciones de precipitacin
Inmunoprecipitacin en solucin
Es posible detectar y medir muchos antgenos solubles precipitndolos de mane-
ra selectiva con anticuerpos. Para ello, es necesario que los antgenos sean gran-
des y que tengan mltiples determinantes antignicos. Como las
inmunoglobulinas tambin son protenas, es posible preparar anticuerpos espec-
ficos dirigidos contra ellas mismas, que se pueden utilizar para su cuantificacin.
La precipitacin de un antgeno soluble por un anticuerpo provoca turbidez
en la solucin. El grado de turbidez es proporcional a la cantidad de antgeno
unida al anticuerpo.
Esta relacin es la base de los mtodos turbidomtricos o nefelomtricos de
cuantificacin (ver captulo 11). La reaccin se realiza en solucin acuosa, en
presencia de un exceso de anticuerpo, y la curva de calibrado se prepara utili-
zando las medidas turbidomtricas de una serie de soluciones estndar de ant-
geno (Figura 14.7).
203
Captulo 14
Inmunoprecipitacin en gel
Esta tcnica combina la electroforesis y la inmunodifusin. Permite diferenciar sus-
tancias de movilidad electrofortica similar mediante reacciones de precipitacin
especficas. La inmunoelectroforesis implica la utilizacin de anticuerpos para fijar
el antgeno en el gel y para identificarlo. La mezcla de protenas se aplica al gel de
electroforesis, se procede a realizar la electroforesis y, una vez finalizada, se cubre
el gel con un anticuerpo especfico, o bien el anticuerpo se coloca en un canal o
surco paralelo, permitiendo que difunda en el gel. El anticuerpo, en su difusin, se
encuentra con el antgeno, dando lugar a la formacin de complejos antgeno-anti-
cuerpo, lo que provoca la aparicin de arcos de precipitacin (Figura 14.8).
204
Tcnicas inmunoqumicas
Ag Ac * o Ag: Ac *
El complejo Ag-Ac* tiene que tener una caracterstica fsica que se pueda uti-
lizar para determinar en qu cantidad se encuentra presente. En dicha situacin,
hay que recordar que esta caracterstica fsica no debe presentarla el antgeno o
el anticuerpo en su forma libre, o bien las formas libres deben poder separarse
de las formas unidas.
La primera idea fue emplear el marcaje radiactivo para poder utilizar la tcni-
ca cuantitativamente, de forma que se desarrollaron las tcnicas de radioinmu-
noensayo y de ensayo inmunorradiomtrico.
205
Captulo 14
206
Tcnicas inmunoqumicas
207
Captulo 14
14.9). Est tcnica presenta la ventaja de que no se necesita tener una cantidad
de antgeno purificado, ya que el antgeno no necesita ser marcado. El marcaje
de anticuerpos, actualmente, supone menos problemas ya que los anticuerpos
son molculas relativamente estables, de manera que es ms fcil marcarlos sin
alterar su funcin como protenas. De una manera esquemtica, se puede repre-
sentar el principio bsico de la tcnica del IRMA tal y como se indica en la figu-
ra 14.13, en la que se representa un mtodo no competitivo, aunque del IRMA
tambin existe una versin competitiva. En un ensayo no competitivo, el reacti-
vo se aade en exceso.
208
Tcnicas inmunoqumicas
Este tipo de inmunoensayos consta de dos etapas: una primera etapa inmu-
nolgica, en la que tiene lugar la reaccin antgeno-anticuerpo, y una segunda
etapa en la que se determina la actividad de la enzima marcadora, una vez que
se ha aadido el sustrato de la reaccin catalizada por ella. La disminucin en la
cantidad de sustrato o el incremento en la cantidad de producto se utiliza para
detectar o cuantificar la reaccin antgeno-anticuerpo.
209
Captulo 14
de una fase slida; esto facilita la separacin de las fracciones unida y libre del
reactante marcado. Hay distintas posibilidades para realizar un ELISA.
Una opcin es hacer el mtodo de ELISA en sndwich (Figura 14.18). Se aa-
de una alcuota de la muestra que contiene el antgeno, el cual se unir al co-
rrespondiente anticuerpo, que en este caso se encuentra unido a la fase slida. A
continuacin, se aade otro anticuerpo contra el mismo antgeno, diferente del
anticuerpo unido a la fase slida, y que est marcado con una enzima. Se for-
mar un complejo tipo sndwich: fase slida-Anticuerpo-Antgeno-Anticuerpo-
Enzima. Se lava el sistema, para retirar el exceso de anticuerpo marcado no
unido, y despus se aade el sustrato de la enzima. La enzima convierte el sus-
trato en producto, que ser mensurable y cuya cantidad ser proporcional a la
cantidad de antgeno presente en la muestra.
210
Tcnicas inmunoqumicas
211
Captulo 14
212
Tcnicas inmunoqumicas
Fluoroinmunoensayos
En los fluoroinmunoensayos se utilizan compuestos fluorescentes como marca-
dores de los antgenos o de los anticuerpos (Figura 14.24). Los marcadores fluo-
rescentes deben ser estables y no deben interferir en la formacin del complejo
antgeno-anticuerpo.
Western blot
Una aplicacin especfica de los procesos inmunolgicos se da en la tcnica co-
nocida como Western blot o inmunoblot, en que se realiza una separacin pre-
via de las protenas a determinar por electroforesis de tipo SDS-poliacrilamida y,
a continuacin, se transfieren y fijan las protenas a soportes como la celulosa y
otros, para despus realizar una incubacin con el anticuerpo que detecta la
protena que se desea estudiar. Para detectar la unin antgeno-anticuerpo ha de
hacerse uso de un marcaje determinado, que puede encontrarse directamente
sobre el anticuerpo especfico contra la protena de inters o bien, tal y como
sucede muchas veces, sobre un anticuerpo secundario que detecte el anticuerpo
especfico.
En el captulo 15 se presenta un mtodo para la determinacin semicuantita-
tiva de los niveles de UCP1 por transferencia Western (Western blotting), cuyo
protocolo puede encontrarse tambin en el Anexo de Mtodos del CD.
213
Mtodos de determinacin de protenas individuales
INTRODUCCIN
TCNICAS DE SEPARACIN DE PROTENAS
Cromatografa de protenas
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de cribado molecular
Cromatografa de afinidad
Electroforesis de protenas
Electroforesis en papel de filtro
Electroforesis en acetato de celulosa
Electroforesis en geles de agarosa
Electroforesis en geles de polacrilamida
TCNICAS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS ESPECFICAS
Determinacin en clnica de enzimas plasmticas
Enzimas de baja concentracin
Transaminasas
Lactato deshidrogenasa
Determinacin de protenas por tcnicas inmunoqumicas
Determinacin de insulina por ELISA en sndwich
Determinacin de la protena UCP1 por ELISA competitivo
Determinacin de la protena UCP1 por Western blot
214
15
INTRODUCCIN
215
Captulo 15
Cromatografa de protenas
Se utilizan diferentes tcnicas cromatogrficas en la separacin de protenas,
aunque normalmente ms como tcnicas separativas que como analticas. Exis-
ten tcnicas cromatogrficas que permiten separar molculas por su carga y por
su tamao. A continuacin se comentan las ms importantes.
216
Mtodos de determinacin de protenas individuales
Cromatografa de afinidad
La presencia en las protenas de diferentes grupos funcionales (cadenas laterales
de los aminocidos y elementos que forman parte del enlace peptdico) y su dis- Figura 15.3. Representacin del volumen
posicin tridimensional, determina que puedan establecerse diferentes tipos de de elucin relativo (Ve/Vo, es decir,
interacciones con otras molculas (puentes de hidrgeno, fuerzas hidrofbicas, volumen de elucin de cada protena
partido por el volumen muerto) de
interacciones inicas, etc.). Cuanto mayor es el nmero de interacciones que
diferentes protenas frente al logaritmo
pueden establecerse, ms fuerte es la unin con otras molculas. Esta propiedad decimal de su masa molecular. Se muestra
puede utilizarse para purificar protenas a travs de la cromatografa de afinidad como ejemplo la interpolacin del peso
(Figura 15.4). Dicha tcnica se caracteriza por utilizar como relleno una matriz molecular de una protena problema (la
porosa e inerte unida covalentemente a una sustancia conocida como ligando protena UCP1).
que reconocer especficamente la protena de inters. El ligando debe tener
una afinidad elevada por la protena, de manera que se establezca un alto n-
mero de interacciones para poder inmovilizarla, aunque no debe ser tan elevada
como para no permitir su liberacin cambiando las condiciones de elucin.
Electroforesis de protenas
La principal diferencia entre los distintos tipos de electroforesis de protenas radi-
ca en el soporte elegido para la separacin electrofortica. El soporte determina
la separacin que se da entre las distintas protenas. Los soportes utilizados son:
217
Captulo 15
Papel de filtro
Membranas de acetato de celulosa
Geles de agarosa
Geles de poliacrilamida
Cada una de estas bandas no se corresponde con una nica protena, sino
que comprende varias protenas (Figura 15.6), ya que las protenas de una mis-
ma banda, a pH bsicos, presentan migraciones similares.
Figura 15.6. Principales protenas
integrantes de cada una de las bandas
que se obtienen por separacin de
protenas del suero humano y principales
funciones en las que se encuentran
implicadas.
218
Mtodos de determinacin de protenas individuales
219
Captulo 15
220
Mtodos de determinacin de protenas individuales
de poro inferiores a los que se pueden producir con agarosa. As pues, se usan
siempre y cuando no se requieran grandes tamaos de poro. El tamao de poro
de la poliacrilamida puede especificarse a partir de las concentraciones de acri-
lamida y bisacrilamida.
Con la electroforesis de protenas sricas en gel de poliacrilamida pueden se-
pararse veinte o ms fracciones proteicas (Figura 15.10). Por ello, esta tcnica es
muy utilizada en el estudio de las protenas individuales del suero, especialmen-
te en los estudios de isoenzimas.
Las protenas pueden separarse segn todas las variantes de electroforesis en
geles de poliacrilamida: SDS-PAGE, geles en gradiente, isoelectroenfoque o elec-
troforesis bidimensional. Se utiliza un tipo u otro de electroforesis en funcin de
las protenas que se pretenda separar y de la finalidad de la separacin.
En el Anexo de Mtodos del CD se presenta un mtodo para la separacin Figura 15.10. Esquema de bandas
de protenas sricas en SDS-PAGE discontinua o en disco, que se realiza en ge- producidas tras electroforesis de protenas
les de poliacrilamida y utilizando un sistema de dos tampones diferentes. Las sricas en un gel de poliacrilamida.
protenas se separan en funcin de su tamao al utilizar un detergente como el Algunas zonas contienen ms de una
SDS. Este sistema permite la separacin de las protenas por el tamao de sus ca- protena diferente.
denas polipeptdicas (las protenas se disocian en sus diferentes cadenas al tratar-
se con E-mercaptoetanol) y se obtiene una elevada resolucin al utilizar un
sistema con dos tampones.
En dicho mtodo, las protenas se desnaturalizan utilizando SDS y E-mercap-
toetanol, calentando a 100 C. Estas condiciones determinan la disociacin de
las diferentes cadenas polipeptdicas de las protenas, al tiempo que se produce
la desnaturalizacin de stas al unirse al SDS en una proporcin constante (1,4 g
de SDS por gramo de polipptido, lo que equivale aproximadamente a una
molcula de SDS por cada dos restos de aminocidos). La carga propia de las ca-
denas polipeptdicas es insignificante en comparacin con la cargas negativas
que proporciona la unin al SDS, de manera que los complejos SDS-polipptido
tienen todos aproximadamente la misma densidad de carga (carga por gramo de
complejo). El tratamiento con SDS tambin provoca que las diferentes cadenas
polipeptdicas adopten la misma forma, cilndrica. De esta forma, el principio de
este tipo de separacin electrofortica es nicamente la diferencia de tamao
entre las protenas, migrando ms rpidamente las de menor tamao.
Otro aspecto reseable de este tipo de separacin es la utilizacin de un sis-
tema con dos geles: concentrador (stacking) y separador (resolving). Mientras el
gel concentrador provoca el apilamiento de las protenas antes de que se resuel-
van, el separador permite la separacin de las diferentes protenas por su ta-
mao (resolucin).
Los dos geles presentan tamaos de poro y pH diferentes, ya que su funcin
es distinta. El gel concentrador tiene un tamao de poro grande, para permitir la
concentracin de la muestra en una banda muy estrecha, y no la separacin de
sus componentes; su pH es dos unidades inferior al del gel destinado a la sepa-
racin, para provocar que la carga se transporte ms por las protenas que por el
tampn. El gel concentrador se prepara con una concentracin de acrilamida del
orden del 3% y bisacrilamida 0,08% y a un pH de 6,8; mientras que el gel sepa-
rador se prepara con una concentracin de acrilamida del orden del 10% y bisa-
crilamida 0,27%, y a un pH = 8,8. El principio de la concentracin de la
muestra se da por la diferencia de pH establecida entre los dos geles, que deter-
mina que al pH del gel concentrador (pH = 6,8), la glicina (principal componen-
te del tampn de electroforesis) se encuentre mayoritariamente en forma de
221
Captulo 15
222
Mtodos de determinacin de protenas individuales
migrar tan rpido las protenas, llegan a alcanzar la zona de migracin de los io-
nes cloruro, por lo que se retarda su migracin debido al aumento de la concen-
tracin de los iones cloruro que tambin pueden transportar la corriente
elctrica. Como consecuencia se produce un agrupamiento de las protenas,
atrapadas entre los frentes de iones glicinato e iones cloruro, concentrndose en
franjas o discos estrechos; de ah el nombre de la tcnica.
Al alcanzar las protenas el gel separador (menor tamao de poro y diferente
pH dos unidades ms elevado), migran ms lentamente, y la velocidad de mi-
gracin de cada protena ahora s que depender de su tamao. Al migrar ms
lentamente las protenas, son alcanzadas por los iones glicinato que, al encon-
trarse ahora con un pH = 8,8, pasan a su forma cargada negativamente y ade-
lantan a las protenas en su migracin. De esta manera, se separan ms
lentamente an las protenas, ya que ahora el transporte de la carga elctrica
tambin se lleva a cabo por los iones glicinato aparte de por las protenas; hay
que tener en cuenta el continuo aporte de iones glicinato por parte del tampn
del ctodo. Esta migracin ms lenta de las protenas permite una mejor resolu-
cin de las mismas.
223
Captulo 15
224
Mtodos de determinacin de protenas individuales
Transaminasas
Segn los diferentes tipos de nomenclatura, estas enzimas se conocen como:
Lactato deshidrogenasa
La actividad de la lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, L-lactato:NAD+ oxidore-
ductasa, LDH) puede aumentar en distintos desrdenes, como son, entre otros,
225
Captulo 15
226
Mtodos de determinacin de protenas individuales
precipita sobre el gel (Figura 15.18). La cantidad de color producido puede de-
terminarse utilizando un fotodensitmetro (Figura 15.19).
227
Captulo 15
228
Mtodos de determinacin de protenas individuales
229
Mtodos generales de determinacin de lpidos
INTRODUCCIN
Clasificacin y estructura de los lpidos
Lpidos simples
Lpidos complejos
Lipoprotenas plasmticas
DETERMINACIN DE LPIDOS
Obtencin y preparacin de las muestras
Mtodos de extraccin de lpidos
Cuantificacin de lpidos totales
Determinacin de glicerol
Determinacin de triacilgliceroles
Mtodos qumicos para la determinacin de triacilgliceroles
Mtodos enzimticos para la determinacin de triacilgliceroles
Determinacin de cidos grasos libres
Determinacin de colesterol
Mtodos qumicos para la determinacin de colesterol
Mtodos enzimticos para la determinacin de colesterol
Determinacin de cuerpos cetnicos
230
16
INTRODUCCIN
231
Captulo 16
Lpidos simples
Dentro de este grupo de lpidos se encuentran los cidos grasos, las ceras, los
acilgliceroles o grasas neutras, los isoprenoides y los esteroides.
cidos grasos
Los cidos grasos son compuestos monocarboxlicos, que pueden encontrarse li-
bres, aunque normalmente suelen hallarse formando parte de otros lpidos. Los
cidos grasos responden a la frmula general RCOOH, donde R es una cadena
carbonada de estructura muy variada (lineal, ramificada o alicclica) y que puede
presentar dobles enlaces. Segn el nmero de dobles enlaces que posean, se
clasifican en cidos grasos saturados (Saturated Fatty Acids, SFA), cidos grasos
monoinsaturados (Mono-Unsaturated Fatty Acids, MUFA) y cidos grasos poliin-
saturados (Poly-Unsaturated Fatty Acids, PUFA).
La cadena carbonada de los cidos grasos puede presentar grupos hidroxilo,
ceto o epoxi, y el nmero de carbonos que la forma tambin es muy variado.
Los cidos grasos ms abundantes son los de cadena lineal con un nmero par
de tomos de carbono (entre 12 y 24 carbonos). Se nombran a partir del hidro-
carburo correspondiente con la terminacin anoico para los saturados y enoi-
co para los insaturados. En el caso de los cidos grasos insaturados se utilizan
diferentes nomenclaturas: se pueden nombrar con el smbolo ' y el exponente
correspondiente a la posicin del doble enlace; o pueden nombrase con la no-
menclatura Z y un nmero que indica el carbono junto al que se da el doble en-
lace contando desde el tomo de carbono Z (carbono metlico terminal, que se
conoce como carbono Z o carbono n). Adems, se puede utilizar una nomen-
clatura abreviada, en la que figura el nmero de tomos de carbono separado
por dos puntos del nmero de dobles enlaces y la posicin de stos en forma de
exponente. As, por ejemplo, los cidos grasos hexadecanoico, octadecanoico y
octadecenoico seran denominados 16:0, 18:0 y 18:19 respectivamente. En la fi-
gura 16.1 pueden observarse la nomenclatura y frmula de los principales cidos
grasos en los seres vivos, tanto saturados como insaturados.
El nmero de tomos de carbono, as como el nmero de enlaces dobles que
presentan, determina una serie de propiedades fsicas de los cidos grasos. Al
aumentar el tamao de la cadena carbonada de un cido graso, disminuye su
polaridad, es decir, es ms apolar. Los puntos de ebullicin y fusin aumentan a
medida que se incrementa el nmero de tomos de carbono, de manera que los
cidos grasos de cadena corta se encuentran en estado lquido a temperatura
ambiente, mientras que los de cadena larga se encuentran en estado slido. El
nmero de insaturaciones y la presencia de ramificaciones en la cadena influyen
en estas caractersticas, de forma que los cidos grasos insaturados y los ramifica-
dos tienen un punto de fusin inferior al de los saturados y los lineales respecti-
vamente con el mismo nmero de tomos de carbono.
Los dobles enlaces de los cidos grasos insaturados pueden adoptar dos
configuraciones espaciales distintas, si bien stas no son interconvertibles de
forma espontnea: son las llamadas configuraciones cis y trans. El doble enlace
en trans distorsiona slo ligeramente la estructura regular quebrada de la cade-
na del cido graso; el enlace cis, sin embargo, determina un marcado giro o
desviacin del eje longitudinal de la molcula, tal como se esquematiza en la
figura 16.2.
232
Mtodos generales de determinacin de lpidos
Ceras
Las ceras son steres de los cidos grasos con alcoholes primarios de cadena lar-
ga y responden a la formula general:
O
||
R O C Rc
233
Captulo 16
Acilgliceroles
Lpidos isoprenoides
Este grupo de lpidos se caracteriza por ser derivados del isopreno (Figura 16.4),
aunque tambin se les conoce con el nombre de lpidos de poliprenilo, y consti-
tuyen un grupo heterogneo.
Por la condensacin de varias unidades de isopreno activo (isopreno fosforila-
do) se sintetizan los diferentes lpidos isoprenoides. Cada dos unidades de isopre-
Figura 16.5. Estructura del limoneno, un no dan lugar a un terpeno, de manera que hay monoterpenos, sesquiterpenos,
monoterpeno. diterpenos, etc. segn contengan, respectivamente, dos, tres, cuatro, etc., isopre-
nos. Entre ellos tambin los hay acclicos, ramificados y cclicos, que adems pue-
den contener otras funciones orgnicas (como grupos cetona y alcohol).
Entre los monoterpenos figuran diversos compuestos voltiles con aromas ca-
ractersticos, como el limoneno del limn (Figura 16.5) y el alcanfor.
Otros ejemplos interesantes son el retinol o vitamina A1 (Figura 16.6) y el
deshidro-3-retinol o vitamina A2, que son diterpenos parcialmente ciclados,
mientras que el fitol es un diterpeno lineal.
Figura 16.6. Estructura de la vitamina A1,
un diterpeno. Son tambin terpenoides la vitamina E o D-tocoferol y derivados quinnicos,
como las ubiquinonas, la plastoquinona y las vitaminas K (Figura 16.7).
234
Mtodos generales de determinacin de lpidos
Esteroides
235
Captulo 16
Lpidos complejos
Los lpidos complejos son aquellos cuya molcula presenta dos o ms compo-
nentes claramente diferenciados, de los cuales uno de ellos, si se separa del res-
to, presenta propiedades de lpido. Dentro de este grupo se encuentran los
fosfolpidos y los glucolpidos.
Fosfolpidos
236
Mtodos generales de determinacin de lpidos
presentando, por tanto, carga negativa por el grupo fosfato y, en algunos casos,
tambin carga positiva dependiendo de la familia de fosfolpidos y del pH a que
se encuentren.
Los fosfatidilinositoles y los fosfatidilgliceroles pueden estar fosforilados en los
grupos alcohol del glicerol y de los inositoles, lo que les confiere una elevada
densidad de carga negativa.
Este grupo de lpidos presenta una solubilidad algo diferente de la del resto;
si bien son solubles en disolventes orgnicos, no lo son en acetona, propiedad
que se utiliza para su fraccionamiento. Los cidos grasos que forman los fosfoa-
cilgliceroles pueden ser muy diversos, siendo el palmtico y el esterico los ms
abundantes, aunque tambin se encuentran en ellos cidos grasos insaturados
(normalmente esterificando el carbono 2).
Las esfingiomielinas son fosfolpidos donde los cidos grasos esterifican a un
alcohol aminado, la esfingosina o esfingenina, a travs de un enlace amida, dan-
do lugar a las ceramidas (Figura 16.15).
Si el grupo hidroxilo terminal de las ceramidas se une a la fosforilcolina, for- Figura 16.15. Estructura de la esfingosina
ma la esfingomielina (Figura 16.16), presente en las membranas biolgicas. y de una ceramida.
Glucolpidos
Los sulftidos son los steres sulfricos de los cerebrsidos (un sulfato esterifi-
ca el carbono 3 de la hexosa). Los ms abundantes son los derivados de los cere-
brogalactsidos, que constituyen una parte importante de los cerebrsidos del
cerebro.
237
Captulo 16
Lipoprotenas plasmticas
Las lipoprotenas son agrupaciones de lpidos y protenas. Existen cuatro tipos
principales en el plasma, que, en densidades crecientes y tamao decreciente,
son: los quilomicrones, las VLDL (Very Low Density Lipoproteins), las LDL (Low
Density Lipoproteins), y las HDL (High Density Lipoproteins). Sus caractersticas y
composicin aparecen resumidas en la figura 16.19.
Figura 16.18. Estructura del cido
N-acetilneuramnico.
Figura 16.19. Caractersticas de las lipoprotenas plasmticas. VLDL: lipoprotenas de muy baja densidad (very low density lipoproteins); LDL:
lipoprotenas de baja densidad (low density lipoproteins); HDL: lipoprotenas de alta densidad (high density lipoproteins). TG: triacilgliceroles.
DETERMINACIN DE LPIDOS
238
Mtodos generales de determinacin de lpidos
Los lpidos de los diferentes tipos de muestras, plasma, sangre o tejidos, se pue-
den separar del resto de biomolculas realizando una extraccin, como ya se ha
indicado, con disolventes orgnicos. Si se trabaja con muestras de tejidos, en pri-
mer lugar se ha de llevar a cabo una ruptura de las clulas por medios mecni-
cos (homogeneizadores, dispersores o sonicadores). Pueden utilizarse diferentes
mtodos con disolventes orgnicos para realizar la extraccin de los lpidos de
una muestra; el ms utilizado es el mtodo de Folch, por el que se realiza una
extraccin con cloroformo:metanol (2:1, V:V). El metanol rompe los enlaces que
se dan entre los lpidos y las protenas de las membranas e inhibe la accin de
las enzimas lipasas (desnaturalizndolas), mientras que el cloroformo permite la
disolucin de los lpidos. En el Anexo de Mtodos del CD se encuentran indica-
dos los diferentes pasos del mtodo de Folch. Cabe destacar una serie de aspec-
tos de este mtodos: los lavados con NaCl permiten la eliminacin de los
materiales polares disueltos por el metanol, de manera que al aadir una disolu-
cin acuosa de NaCl al extracto de Folch y agitar vigorosamente, se forman dos
fases inmiscibles: en la fase superior acuosa se encuentran las sustancias ms po-
lares y parte del metanol, mientras que en la fase inferior se encuentra el cloro-
formo con los lpidos. Los lavados se repiten varias veces, y se elimina la fase
acuosa despus de cada lavado. Se obtiene al final una mezcla de clorofor-
mo:metanol (2:1, V:V) con los lpidos en ella, siendo ste el extracto de Folch o
extracto de lpidos purificados.
Determinacin de glicerol
239
Captulo 16
240
Mtodos generales de determinacin de lpidos
Determinacin de triacilgliceroles
Todos los mtodos empleados para la determinacin de triacilgliceroles, sean
qumicos o enzimticos, implican dos procedimientos generales:
1. Hidrlisis de los triacilgliceroles para formar glicerol y cidos grasos libres.
2. Medida del glicerol liberado, ya sea directamente o bien una vez que ste
se ha convertido en otro producto.
El principal problema que se plantea en la cuantificacin de los triacilglicero-
les es la falta de un material de referencia adecuado. Esto se explica porque los
triacilgliceroles de prcticamente cualquier muestra estn constituidos por una
mezcla compleja de distintos cidos grasos. Los estndares comerciales tratan de
reflejar esta heterogeneidad y, al mismo tiempo, controlar la cantidad de glicerol
libre que puedan contener.
241
Captulo 16
242
Mtodos generales de determinacin de lpidos
Determinacin de colesterol
La determinacin de colesterol puede llevarse a cabo, fundamentalmente, me-
diante dos tipos de mtodos: qumicos y enzimticos. Los enzimticos son ms
precisos, pero tambin ms costosos.
El colesterol, al igual que otros esteroles, se encuentra en muchos tejidos y
puede existir tanto en forma libre, como en forma esterificada con un cido gra-
so de cadena larga. Por tanto, en una muestra se puede analizar cada fraccin
independientemente o bien puede determinarse el colesterol total. Para la sepa-
racin de las fracciones libre y esterificada se puede utilizar digitonina, que es un
glucsido natural que forma con el colesterol libre un complejo insoluble en la
243
Captulo 16
244
Mtodos generales de determinacin de lpidos
245
Captulo 16
246
Tcnicas de separacin: dilisis, filtracin y centrifugacin
INTRODUCCIN
DILISIS
FILTRACIN
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN
Fundamentos de las tcnicas de centrifugacin
Diseo de la instrumentacin para tcnicas de centrifugacin
Tipos de rotores
Tipos de centrifugacin
Centrifugacin preparativa
Centrifugacin analtica
248
17
INTRODUCCIN
DILISIS
249
Captulo 17
FILTRACIN
La filtracin es otro sistema de separacin de molculas basado en el tamao
molecular de stas. Se fundamenta en separar las molculas de una disolucin a
travs de un material poroso, que slo permitir el paso de las molculas de ta-
mao inferior al de los poros (disolvente y solutos pequeos), quedando reteni-
das las molculas ms grandes (Figura 17.3).
Las primeras tcnicas de filtracin hacan uso de papel de filtro, que permita la
separacin de materiales precipitados a partir de una suspensin. Con el paso de los
aos, se ha incorporado el uso de nuevos materiales a la tcnica, tales como mem-
branas diseadas para presentar tamaos de poro determinados. Estas membranas
son de polmeros de polivinilo, steres de celulosa, acetato de celulosa, etc., y per-
miten la discriminacin de sustancias con un tamao molecular parecido.
La fuerza impulsora del movimiento en este tipo de tcnicas puede ser la
fuerza de la gravedad, o bien puede realizarse una presin, o una aspiracin re-
alizando el vaco. A esta fuerza impulsora se opone una fuerza de retardo, deter-
minada por el tamao de los poros, la superficie de filtracin, el nmero de
250
Tcnicas de separacin: dilisis, filtracin y centrifugacin
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN
251
Captulo 17
Fabajo mug rp u V u g
Farriba rf u V u g K u v u h
rp u V u g rf u V u g K u v u h
252
Tcnicas de separacin: dilisis, filtracin y centrifugacin
directamente proporcional a:
la aceleracin provocada por el campo, gravitatorio o centrfugo (G)
la diferencia de densidades entre la partcula y el medio en que se en-
cuentra (rp rf )
el volumen de la partcula (V)
inversamente proporcional a:
un factor que depende del tamao y forma de la partcula (K)
la viscosidad del medio donde tiene lugar la separacin (h)
Una vuelta del rotor se corresponde con 2S radianes, por lo que la relacin
entre las revoluciones por minuto (rpm) y la velocidad angular (radianes por se-
gundo) del rotor es:
2S u ( rpm)
Z
60
4 S 2 u ( rpm) 2 u r
Por lo que: G expresado en cm /s 2
3600
4 S 2 u ( rpm) 2 u r
CCR expresado en g
3600 u 980
253
Captulo 17
Tipos de rotores
4 S 2 u ( rpm) 2 u r
G
3600
254
Tcnicas de separacin: dilisis, filtracin y centrifugacin
Tipos de centrifugacin
Centrifugacin preparativa
Como ya se ha comentado, la finalidad de este tipo de centrifugacin es la sepa-
racin de grupos de biomolculas, aunque tambin puede utilizarse en la sepa-
racin de los diferentes componentes de la clula para su posterior anlisis. Por
ello la centrifugacin preparativa suele utilizarse para aislar clulas enteras, org-
nulos celulares, macromolculas, etc. Normalmente, en este tipo de tcnicas se
dispone de grandes cantidades de muestra.
Dentro de las tcnicas de centrifugacin preparativa, se han ido desarrollado
diferentes tipos de aplicaciones dependiendo de la finalidad del estudio. As
pues, puede hablarse de tcnicas de centrifugacin diferencial, de sedimenta-
cin en zona, isopcnicas o isopcnicas de equilibrio.
Centrifugacin diferencial
255
Captulo 17
dose una fraccin de componente relativamente pura (Figura 17.8). Debe re-
cordarse que el pellet recuperado durante la primera precipitacin por este
tipo de centrifugacin no es puro, ya que todas las partculas inicialmente se
encuentran distribuidas de forma homognea en el tubo, incluida la parte infe-
rior, por lo que siempre los componentes ms pequeos quedarn contami-
nando el pellet, pudindose purificar por la realizacin de repetidas
resuspensiones y centrifugaciones del mismo (con 2 3 procesos de lavado
suele ser suficiente).
Figura 17.8. A partir de un
homogeneizado de tejido, utilizando
diferentes etapas con campos centrfugos
Centrifugacin de sedimentacin zonal
crecientes, pueden separarse de manera
diferencial los distintos orgnulos de las
clulas. En este tipo de centrifugacin, la muestra se deposita en forma de capa en la
parte superior del medio en que se va a realizar la separacin, el cual presen-
ta un gradiente de densidad continuo. Una vez depositada la muestra, se pro-
cede a la centrifugacin de los tubos. De esta manera, los diferentes
elementos de la muestra se separan formando bandas (Figura 17.9). Se centri-
fugan las muestras hasta conseguir separar las molculas de inters. En este
caso, no debe terminar la centrifugacin hasta que las distintas partculas de
la mezcla hayan quedado sedimentadas en diferentes zonas del gradiente
segn su velocidad de sedimentacin, para poder conseguir as una buena se-
paracin.
256
Tcnicas de separacin: dilisis, filtracin y centrifugacin
257
Captulo 17
que las bandas se desplazan hacia arriba, pudindose extraer las diferentes frac-
ciones con una jeringuilla o con una pipeta. En otros casos, los tubos pueden
cortarse, recuperando las diferentes bandas. Otra posibilidad es perforar el tubo
en su base y recoger con un colector las fracciones correspondientes a las dife-
rentes bandas.
Centrifugacin analtica
La finalidad de la centrifugacin analtica es obtener informacin sobre determi-
nadas caractersticas de macromolculas o partculas: pureza, peso molecular,
forma del material, etc. Normalmente, en este tipo de tcnica se dispone de pe-
queas cantidades de muestra y suelen utilizarse elevadas velocidades de giro.
La instrumentacin que se utiliza no difiere mucho de la empleada para las se-
paraciones preparativas, pero requiere que se utilicen sistemas de deteccin y
observacin de los resultados (Figura 17.14).
258
Mtodos de determinacin de lpidos individuales
INTRODUCCIN
FRACCIONAMIENTO DE MEZCLAS DE LPIDOS
Extraccin con disolventes
Extraccin en columna
Cromatografa en capa fina
DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS
Determinacin de cidos grasos por cromatografa de gases
Determinacin simultnea de cidos grasos libres y esterificados en plasma
DETERMINACIN DE LAS LIPOPROTENAS PLASMTICAS
Separacin de lipoprotenas por ultracentrifugacin
Separacin de lipoprotenas por electroforesis
Determinacin de lipoprotenas por mtodos inmunolgicos
DETERMINACIN DE FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA
260
18
INTRODUCCIN
Como ya se ha comentado, los lpidos son mezclas complejas de un grupo muy
heterogneo de compuestos que tienen como nica caracterstica comn su solu-
bilidad en disolventes orgnicos y su insolubilidad en disolventes polares. La gran
heterogeneidad de estos compuestos provoca que la metodologa que puede apli-
carse para la separacin de mezclas de lpidos sea realmente muy extensa.
En la figura 18.1 se puede observar una lista de lpidos ordenados en funcin
de su polaridad.
Al ser los lpidos un conjunto tan heterogneo de compuestos, no existe un
mtodo que permita determinarlos todos al mismo tiempo. Lo ms normal es
hacer un fraccionamiento previo de los mismos, separando los diferentes grupos
de lpidos utilizando algn tipo de tcnica separativa (normalmente basada en la
polaridad) y, despus, una vez fraccionada la mezcla de lpidos, aplicar otra tc-
nica separativa y cuantitativa de la fraccin lipdica que quiera estudiarse.
En este captulo se muestra cmo pueden cuantificarse los diferentes cidos
grasos individuales, tanto libres como esterificados, las lipoprotenas y los fos-
folpidos.
261
Captulo 18
de forma que dos grupos de lpidos con polaridad muy diferente se pueden se-
parar con estas tcnicas. Un ejemplo lo constituye la separacin de los fosfolpi-
dos del resto de los lpidos por su precipitacin con acetona fra. Otro ejemplo
es la extraccin de los cidos grasos con ter o con heptano a pH cido, ya que,
a dicho pH, los cidos grasos estn protonados y son los ms apolares. As, la ex-
traccin con disolventes orgnicos permite la separacin de determinados gru-
pos de lpidos con propiedades de solubilidad muy diferentes.
Extraccin en columna
La cromatografa de adsorcin en columna puede utilizarse para separar los dife-
rentes lpidos. Adsorbentes como el gel de slice (adsorbente polar), el Florisil
(silicato de Mg) y el carbn activo (adsorbente apolar) son los ms utilizados y
permiten realizar separaciones diferenciales de los distintos grupos de lpidos,
eluyendo los lpidos retenidos por el adsorbente con disolventes adecuados.
262
Mtodos de determinacin de lpidos individuales
Una vez separados los diferentes grupos de lpidos por cualquiera de las tc-
nicas que hemos visto, se pueden someter a otras tcnicas separativas para de-
263
Captulo 18
264
Mtodos de determinacin de lpidos individuales
265
Captulo 18
266
Mtodos de determinacin de lpidos individuales
grasos libres se pasa una mezcla de cloroformo:metanol por la columna. Los lpi-
dos ms apolares se eluyen con cloroformo (Figura 18.10).
La fraccin de cidos grasos libres separada de esta manera se puede utilizar
para la determinacin de los diferentes cidos grasos individuales.
267
Captulo 18
268
Mtodos de determinacin de lpidos individuales
269
Mtodos de determinacin de carbohidratos
INTRODUCCIN
Estructura de los carbohidratos
Monosacridos
Disacridos
Polisacridos
MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS
Preparacin de las muestras
Mtodos qumicos para la determinacin de carbohidratos
Mtodo de reduccin del cobre
Reacciones con cidos fuertes y fenoles
Mtodos enzimticos para la determinacin de carbohidratos
SEPARACIN DE MEZCLAS DE CARBOHIDRATOS E IDENTIFICACIN
Cromatografa en papel y en capa fina
Cromatografa de gases y HPLC
270
19
INTRODUCCIN
Los carbohidratos, tambin denominados glcidos, hidratos de carbono, sacri-
dos o azcares, pueden definirse como polialcoholes que presentan, adems, un
grupo cetona o un grupo aldehdo. Cumplen funciones tanto estructurales como
de reserva energtica en el organismo.
Los carbohidratos, al igual que el resto de biomolculas, se determinan y
cuantifican por mtodos que se fundamentan en sus propiedades diferenciales
respecto del resto de biomolculas, en su caso la presencia del grupo carbonilo
(adems de ser polialcoholes). En presencia de cidos fuertes, los carbohidratos
pueden hidrolizarse; los polisacridos, por ejemplo, se descomponen en sus uni-
dades bsicas. Las pentosas y las hexosas se deshidratan produciendo un furfural
y derivados hidroximetilfurfural, que pueden condensarse con compuestos fen-
licos, dando lugar a productos coloreados que pueden utilizarse para la determi-
nacin de los carbohidratos originales.
Cuando el objetivo es el estudio de carbohidratos individuales, debe tenerse en
cuenta que el anlisis cualitativo y cuantitativo de una mezcla de carbohidratos pre-
senta considerables dificultades, debido a la similitud de la estructura y naturaleza
qumica de los diferentes glcidos. Por ello, muchos mtodos de anlisis son incapa-
ces de distinguir entre los diferentes carbohidratos. La especificidad de la determi-
nacin puede mejorarse separando previamente los componentes de la mezcla
mediante una tcnica cromatogrfica adecuada; las ms utilizadas son la cromato-
grafa de gases y la cromatografa lquida. Sin embargo, la disponibilidad de prepa-
raciones puras de muchas enzimas implicadas en el metabolismo de carbohidratos
ha dado lugar al desarrollo de mtodos enzimticos de anlisis relativamente senci-
llos, que no slo son especficos, sino que tienen altos niveles de sensibilidad.
271
Captulo 19
Monosacridos
En forma slida son de color blanco, cristalinos, muy solubles en agua e inso-
lubles en disolventes no polares. La mayora tienen sabor dulce y no pueden
ser hidrolizados en molculas ms sencillas. Son, por lo tanto, los azcares
ms sencillos, aldehdos (aldosas) o cetonas (cetosas) con dos o ms grupos
hidroxilo.
Los monosacridos pueden subdividirse en grupos segn el nmero de to-
mos de carbono que poseen:
Triosas (CH2O)3
Tetrosas (CH2O)4
Pentosas (CH2O)5
Hexosas (CH2O)6
Heptosas (CH2O)7
Octosas (CH2O)8
272
Mtodos de determinacin de carbohidratos
bien de otra molcula. En el caso de que la cadena del azcar sea lo suficiente-
mente larga (4-6 tomos de carbono), uno de los grupos hidroxilo de la misma
molcula puede reaccionar con el grupo carbonilo para formar un hemiacetal
cclico, que se halla en equilibrio con la forma de aldehdo o de cetona libre
(Figura 19.3). Los teres de hidroxilo hemiacetlico reciben el nombre de
glucsidos.
273
Captulo 19
Disacridos
Los disacridos son azcares compuestos por dos residuos de monosacridos
unidos por un enlace glucosdico (ter), con prdida de una molcula de agua
al realizarse dicha unin. El enlace glucosdico es la formacin de un acetal
entre el OH anomrico de un monosacrido y un OH de otro monosacri-
do. Es estable frente a la accin de las bases, sin embargo se hidroliza frente a
los cidos.
274
Mtodos de determinacin de carbohidratos
275
Captulo 19
Polisacridos
Los polisacridos, tambin llamados polisidos o glucanos, estn formados por
ms de 10 residuos de monosacridos. A continuacin, se resumen las carac-
tersticas ms importantes de los principales tipos de polisacridos.
276
Mtodos de determinacin de carbohidratos
277
Captulo 19
278
Mtodos de determinacin de carbohidratos
279
Captulo 19
280
Mtodos de determinacin de carbohidratos
281
Captulo 19
282
Mtodos de determinacin de carbohidratos
283
Captulo 19
para calcular las cenizas y el otro para determinar el contenido residual de pro-
tenas por el mtodo Kjeldahl (ver captulo 11). La determinacin de fibra se
corresponde con la diferencia de pesos entre la muestra original y el filtrado,
del que se descuentan el contenido de protenas residuales y de cenizas (ver
Anexo de Mtodos en el CD).
284
Mtodos de determinacin de carbohidratos
SEPARACIN DE MEZCLAS DE
CARBOHIDRATOS E IDENTIFICACIN
La separacin de mezclas de carbohidratos y la identificacin de los distintos car-
bohidratos de una muestra se puede realizar utilizando tcnicas de cromatografa.
Se sabe que las molculas ms pequeas tienen, en general, una mayor mo-
vilidad durante el proceso de cromatografa. En el caso de los oligosacridos, la
distancia recorrida depender del nmero de unidades de monosacridos que
los componen. En general, la distancia recorrida por los carbohidratos suele ser
corta y las diferencias relativas entre los distintos componentes glucdicos de una
muestra son pequeas, por lo que a veces es necesario dejar salir del soporte el
frente del solvente. Otra posibilidad para mejorar la resolucin de la tcnica es
repetir varias veces el proceso, secando la placa de cromatografa al finalizar
cada desarrollo. Cabe comentar que, cuando se determinan diferentes carbohi-
dratos utilizando estas tcnicas, la distancia recorrida por la glucosa es la que se
utiliza como referencia. Figura 19.28. Resultado de la separacin
Un ejemplo de anlisis de carbohidratos por tcnicas cromatogrficas es cromatogrfica de mono-, di-, y
la separacin de los mono-, di-, y trisacridos de una mezcla, que puede trisacridos de una mezcla en placa de gel
realizarse en placas de gel de slice, desarrollando el proceso cromatogrfico de slice, por desarrollo de la
cromatografa tres veces con
tres veces con acetonitrilo:agua (85:15), secando entre desarrollo y desarro- acetonitrilo:agua (85:15). La visualizacin
llo, y visualizando los carbohidratos con fosfato de difenilamina-anilina (Figu- se ha realizado por reaccin con fosfato
ra 19.28). de difenilamina-anilina.
285
Captulo 19
Por otra parte, los polisacridos pueden separarse en placas de gel de slice y
desarrollando la cromatografa con butanol:metanol:agua (50:25:20); los car-
bohidratos se visualizan con fosfato de difenilamina-anilina (Figura 19.29).
La glucosa y la fructosa se pueden separar con acetonitrilo:cido brico 0,5%
en agua (76:24) (Figura 19.30).
286
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos
INTRODUCCIN
Estructura de los cidos nucleicos
MTODOS DE AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS
Mtodos de aislamiento y purificacin de ADN
Mtodos de aislamiento y purificacin de ARN
MTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS
Determinacin por espectrofotometra
Mtodo de tincin con bromuro de etidio
Mtodo del cido diamino benzoico (DABA) para la determinacin de ADN
288
20
INTRODUCCIN
289
Captulo 20
290
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos
La sustitucin de 2c-desoxirribosa en el ADN por la ribosa en el ARN puede Figura 20.6. Las molculas de ARN
parecer insignificante y, sin embargo, afecta en gran medida a las propiedades monocatenario pueden contener zonas
del ARN, ya que el grupo 2c-hidroxilo: bicatenarias. En la figura se representa la
estructura molecular de una cadena de
1. Impide a las molculas de ARN la adopcin de la conformacin de tipo B ARNt formando una estructura en horquilla.
291
Captulo 20
Son estas caractersticas las que se explotan para la separacin de ambos ti-
pos de cidos nucleicos.
292
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos
293
Captulo 20
la utilizacin de detergentes,
la lisis celular utilizando tiocianato de guanidinio, que es el mtodo ms
utilizado para la extraccin de ARN de tejidos.
294
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos
295
Captulo 20
que presenta unidas cadenas de oligo(dT), las cuales podrn interaccionar con
las colas de poli(A) de los ARNm (Figura 20.9). El ARN en disolucin acuosa se
carga en la parte superior de la columna de celulosa oligo(dT) con un tampn
que posee una elevada concentracin de sal (por ejemplo un tampn Tris-
EDTA-SDS con NaCl). Los ARNm maduros son retenidos en la columna y pue-
den eluirse con un tampn adecuado (por ejemplo, mediante un tampn
Tris-EDTA).
296
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos
297
Tcnicas de hibridacin y PCR
INTRODUCCIN
PROCESO DE HIBRIDACIN
Formacin y separacin de la doble hebra de ADN
Medio de hibridacin
DISEO DE LOS MTODOS DE HIBRIDACIN
Preparacin de las sondas: produccin y marcaje
Produccin de sondas
Tipos de marcaje
Inmovilizacin de la muestra
Hibridacin y lavados
Cuantificacin
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR
Fundamento de la PCR
Diseo de las tcnicas de PCR
Medio de reaccin
Etapas de la PCR
Visualizacin de los productos
RT-PCR
298
21
INTRODUCCIN
PROCESO DE HIBRIDACIN
299
Captulo 21
300
Tcnicas de hibridacin y PCR
Medio de hibridacin
Figura 21.4. Proceso de desnaturalizacin
El proceso de hibridacin se encuentra influenciado por la composicin del me- y renaturalizacin del ADN.
dio donde tiene lugar la reaccin. El medio de hibridacin es un punto clave, ya
que determina el entorno en el que se da la reaccin fsica de interaccin entre
los cidos nucleicos a estudiar y sus sondas (Figura 21.5). La composicin del
medio y la temperatura de la hibridacin determinan el rigor (condiciones estric-
tas de apareamiento de las bases). Aunque la unin por complementariedad de
cada par de bases est termodinmicamente favorecida, pueden darse uniones
errneas entre las dos hebras durante el proceso de hibridacin. Los hbridos
con errores de apareamiento en las bases son termodinmicamente menos esta-
bles que los hbridos con un perfecto acoplamiento; por lo tanto los primeros
pueden desnaturalizarse (separarse) a ms bajas temperaturas que los segundos.
Las condiciones de la reaccin de hibridacin definen el nmero de errores
en el apareamiento de bases que pueden tolerarse en la estructura doble, es de-
cir, el rigor de la reaccin de hibridacin. Un elevado rigor permite pocos errores
de apareamiento, mientras que en condiciones de bajo rigor se permite un ma-
yor nmero de errores en el apareamiento de las bases. Las condiciones de rigor
tienen influencia en la sensibilidad del mtodo, de manera que un elevado rigor
puede provocar una disminucin de la sensibilidad. Por el contrario, condiciones
de bajo rigor aumentan la sensibilidad y disminuyen la especificidad. As pues, Figura 21.5. Tpico horno para la
un punto clave en una tcnica de hibridacin es determinar las condiciones de hibridacin de cidos nucleicos, con un
rigor que permiten buena especificidad con el mximo de sensibilidad; estas tubo de hibridacin en su interior que
condiciones se consiguen modificando la composicin del medio de hibridacin contiene una membrana con cidos
y los procesos de lavado para eliminar la sonda no unida. nucleicos fijados y una solucin de
hibridacin.
En el proceso de hibridacin hay una primera fase de nucleacin, en la que
se da la formacin de un pequeo nmero de uniones entre las bases de las dos
hebras, siendo sta la etapa limitante de la reaccin; esta fase va seguida de una
301
Captulo 21
tampones
sales
agentes desnaturalizantes del ADN y del ARN, como la formamida
polmeros de elevado peso molecular
portadores de ADN o de ARN
ingredientes mgicos diseados para reducir el ruido de fondo (back-
ground), como albmina y ficoll
302
Tcnicas de hibridacin y PCR
303
Captulo 21
Produccin de sondas
Las sondas genmicas fueron las primeras en ser utilizadas en las tcnicas de hi-
bridacin; consisten en fragmentos de cidos nucleicos extrados de organismos
y purificados. La naturaleza qumica de la sonda (ADN o ARN, de hebra doble o
simple) depende de la estructura del genoma del organismo a partir del cual se
purifica dicha sonda.
Las sondas recombinantes, en cambio, se obtienen por clonacin: se inser-
tan segmentos de ADN de secuencia conocida en un vector plasmdico, cons-
truido de forma que puede crecer y amplificarse en una bacteria. Los pequeos
ADNs plasmdicos se pueden separar fcilmente del genoma bacteriano basn-
dose en su tamao.
Existen vectores que contienen una regin promotora de ARN adyacente a la
secuencia de ADN insertada, lo que permite la generacin de transcritos de ARN
a partir del ADN insertado. En este proceso de sntesis de ARN se copia una ni-
ca hebra. Controlando la orientacin de la regin insertada en relacin con la re-
gin promotora, se permite la produccin de transcritos en sentido sense (es
decir, como el ARNm) o antisentido antisense (es decir, secuencia comple-
mentaria al ARNm).
Este tipo de sondas tiene varias ventajas. Entre ellas, se puede destacar que es
imposible la autohibridacin, debido a que no se generan dos sondas comple-
mentarias sino una nica sonda, de manera que se favorece al mximo la inte-
raccin con la secuencia diana. Otra ventaja es que la fraccin de sondas no
unidas a su diana, en caso de las sondas de ARN, puede ser eliminada a travs
de digestin con ARNasas, que degradan las hebras simples pero no las hbridas.
No obstante, son sondas ms difciles de obtener y el ARN es mucho ms lbil
que el ADN.
La reaccin en cadena de la polimerasa permite tambin obtener sondas,
diseando condiciones de amplificacin de una zona determinada del ADN del
organismo de inters (que se puede conocer utilizando las bases de datos de los
bancos genmicos). El proceso de amplificacin puede utilizarse tambin para
marcar la sonda. En este caso, se obtienen sondas de ADN doble, con las limita-
ciones que ello supone, ya que puede producirse una autohibridacin.
Los sondas cortas, segmentos cortos (14-45 bases) de desoxirribonucletidos
de ADN oligonucletidos se pueden sintetizar qumicamente con una se-
cuencia de bases determinada. La secuencia para la construccin de estas son-
das puede conocerse a partir de bases de datos de uso pblico, y de programas
informticos que permiten encontrar secuencias con un mximo de homologa
con el cido nucleico a estudiar y un mnimo de homologa con otros cidos nu-
cleicos. Estas sondas pueden ser sense o antisense. Un gran nmero de casas co-
merciales ofrece servicios para la sntesis de estos segmentos.
304
Tcnicas de hibridacin y PCR
Tipos de marcaje
Las sondas pueden marcarse por diferentes procedimientos, dependiendo del
tipo de sonda. En las figuras 21.7 y 21.8 se presentan diferentes tipos de proce-
sos por los que se puede realizar el marcaje segn el tipo de sonda (ADN, ARN u
oligonucletido).
Inmovilizacin de la muestra
Un aspecto importante de las tcnicas de hibridacin es la posibilidad de poder dis-
tinguir entre la sonda unida y la no unida. Se consigue por diferentes procedimien-
tos, y uno de los ms utilizados consiste en inmovilizar la muestra de cido nucleico
sobre una membrana de nitrato de celulosa o de niln. Estas membranas, cargadas
positivamente, presentan una importante capacidad de unin de cidos nucleicos,
al encontrarse stos cargados negativamente; adems, las uniones pueden darse co-
305
Captulo 21
Hibridacin y lavados
Cuantificacin
306
Tcnicas de hibridacin y PCR
307
Captulo 21
Fundamento de la PCR
Uno de los problemas ms serios que presenta el estudio de los cidos nucleicos
es la poca disponibilidad de muestra y la baja concentracin a la que a veces se
encuentra, lo que complica en muchos casos su estudio. Este problema ha podi-
do solventarse, como en otras ocasiones, a travs de la aplicacin en el laborato-
rio de conocimientos en bioqumica y del uso de enzimas. Para poder dividirse,
la clula necesita duplicar todo su material gentico, de forma que cada una de
las dos clulas hijas recibe una copia exacta del ADN de la clula progenitora. In
vivo, la incorporacin de nucletidos a cada una de las cadenas que forman el
ADN genmico, se cataliza por la ADN polimerasa. El conocimiento de este pro-
ceso de replicacin sirvi de punto de partida para el desarrollo de tcnicas in
vitro que han permitido sintetizar cadenas de ADN complementarias a un ADN
molde.
La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction)
es un mtodo que permite la amplificacin in vitro de fragmentos de ADN a par-
tir de una cadena de ADN molde. La PCR utiliza la capacidad de un oligonu-
cletido para hibridar con una zona especfica de ADN monocatenario, lo que
permite la posterior extensin de la cadena de oligonucletido a partir de su ex-
tremo 3c-hidroxilo, en una reaccin catalizada por una ADN polimerasa. Cuan-
do se seleccionan oligonucletidos complementarios a determinadas secuencias
de las dos hebras del ADN a estudiar, de tal forma que delimiten una regin de
inters, se puede obtener de manera exponencial una amplificacin del nmero
de copias de esa regin (Figura 21.12).
Se eligen dos primers o cebadores distintos, de forma que se siten en cada
uno de los dos extremos 3c que delimitan la regin del ADN a amplificar. Uno
308
Tcnicas de hibridacin y PCR
de los primers hibrida con una de las dos cadenas de la doble hlice de la mol-
cula de ADN, y el otro primer con la otra cadena. A partir de ah, tras la unin
de los primers, una ADN polimerasa puede ya realizar la sntesis de ADN (en di-
reccin 5c o 3c), amplificndose el nmero de copias de la regin del ADN deli-
mitada por los primers.
309
Captulo 21
310
Tcnicas de hibridacin y PCR
Medio de reaccin
En el tubo de reaccin deben encontrarse presentes todos los elementos que per-
mitan la reaccin en cadena de la polimerasa: tampn adecuado, primers, la po-
limerasa, desoxirribonucletidos, etc. El medio debe tamponarse al pH ptimo de
la enzima y normalmente contiene Mg2+, necesario para la actividad enzimtica.
311
Captulo 21
dNTPs. Los dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) deben aadirse en cantidad sufi-
ciente para que puedan darse todas las reacciones de extensin durante todos
los ciclos de amplificacin, de manera que en ningn momento estos sustratos
sean limitantes en el proceso de amplificacin.
Etapas de la PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa presenta varias etapas, que cumplen
funciones diferentes en el proceso; algunas etapas se dan una sola vez, mientras
que otras se repiten n veces, dando lugar a los ciclos de amplificacin.
312
Tcnicas de hibridacin y PCR
tener en cuenta la vida media de la polimerasa a (90-95) qC (que es, por ejem-
plo, de 40 minutos para la Taq polimerasa) y que una exposicin excesiva al ca-
lor puede provocarle daos que incrementen la incorporacin errnea de
nucletidos. Adems, un nmero excesivo de ciclos puede ocasionar que en los
ltimos ciclos falte alguno de los sustratos de la reaccin en el medio, como pri-
mers y dNTPs. En algunos casos, los productos de amplificacin pueden comen-
zar a actuar como primers en los ciclos sucesivos dando lugar a productos de
mayor peso molecular.
Los productos de la amplificacin por PCR pueden detectarse como una nica
banda, si las condiciones han sido las apropiadas, en un gel de agarosa teido
con bromuro de etidio (Figura 21.15), aunque a veces se observan tambin otras
bandas secundarias, correspondientes a amplificaciones inespecficas.
RT-PCR
313
Captulo 21
314
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos Individuales
INTRODUCCIN
SEPARACIN ELECTROFORTICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS
ESTUDIO DEL ADN
Uso de enzimas de restriccin y Fingerprinting
Southern blot
Anlisis de RFLPs
Reaccin en cadena de la ligasa (LCR, Ligase Chain Reaction)
Secuenciacin del ADN
Mtodos de fragmentacin qumica
Mtodo del terminador de cadena
ESTUDIO DEL ARN
Dot blot y Slot blot
Northern blot
RT-PCR
316
22
INTRODUCCIN
SEPARACIN ELECTROFORTICA
DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Una vez aislados los cidos nucleicos del resto de biomolculas que los acom-
paan en las muestras biolgicas, debe determinarse cada uno en particular. Al
ser molculas cargadas y con tamaos significativos pueden separarse por elec-
troforesis. En el caso de las largas molculas de ADN, es necesario realizar pre-
viamente una ruptura en fragmentos. Esta ruptura se puede realizar por mtodos
qumicos, aunque el conocimiento del funcionamiento de las enzimas de restric-
cin (nucleasas que digieren el ADN tras reconocer secuencias especficas de
nucletidos) ha provocado una sustitucin del uso de los reactivos qumicos por
el uso de estos mtodos enzimticos.
El tamao de los fragmentos de ADN y de los ARNs es grande, por lo que
normalmente se utiliza como soporte de electroforesis de cidos nucleicos la
agarosa, que permite la separacin de estas molculas por cribado molecular, ya
que mantienen una relacin carga/masa constante. Se consiguen buenas separa-
317
Captulo 22
ciones en geles de agarosa debido a que este tipo de geles presenta un rango de
tamaos de poro que permite la discriminacin de cidos nucleicos por tamao
molecular; los geles de poliacrilamida, en cambio, al tener tamaos de poro ms
pequeo no permiten una buena separacin de los fragmentos grandes, aunque
son utilizados en determinados casos para separar cidos nucleicos de pequeo
tamao, como ocurre durante los procesos de secuenciacin.
En la figura 22.1 se muestra la concentracin adecuada de agarosa a emplear
segn el rango de tamaos de los cidos nucleicos a separar.
Figura 22.1. Diferentes concentraciones Los cidos nucleicos pueden visualizarse tiendo los geles con diferentes co-
de agarosa en relacin con el rango de
tamao de cidos nucleicos para
lorantes: bromuro de etidio, Sybr Green, Sybr Gold, etc. (Figura 22.2).
conseguir una separacin ptima de stos
por electroforesis.
ESTUDIO DEL ADN
Los mtodos de estudio del ADN generalmente estn encaminados a determi-
nar diferencias en las secuencias del ADN. Muchas veces se centran en analizar
la presencia de mutaciones en un gen determinado o en estudiar las similitudes
entre el ADN de distintos individuos. Se han utilizado diferentes estrategias
para el estudio de los cidos nucleicos, de las que veremos algunas las ms des-
Figura 22.2. Gel de agarosa en el que se
ha realizado una electroforesis de ARN
tacadas.
total eucariota, visualizado por adicin de
bromuro de etidio. Las bandas ms
gruesas corresponden a los ARN Uso de enzimas de restriccin y Fingerprinting
ribosmicos 28S (arriba) y 18S (abajo). En
el carril de la izquierda se observan las
bandas correspondientes a un marcador
El ADN puede fragmentarse por la accin de productos qumicos o por la accin
de peso molecular. de las enzimas de restriccin. Estas enzimas se encuentran en una gran variedad
de especies bacterianas y se caracterizan por reconocer secuencias especficas
de nucletidos y producir cortes caractersticos en ellas (Figura 22.3).
318
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos individuales
Southern blot
La especificidad de los mtodos de hibridacin puede incrementarse procedien-
do a una separacin previa de los diferentes cidos nucleicos. En el caso del
ADN, la tcnica de Southern blot permite detectar la presencia de una secuencia
o regin especfica y, en algunos casos, la deteccin de mutaciones. La tcnica
de Sourthern blot se basa en transferir a una membrana el ADN separado por
electroforesis, para su posterior anlisis.
Estos tipos de ensayos requieren una purificacin y fragmentacin previa del Figura 22.4. Fingerprinting de ADN de
ADN. El ADN purificado por alguno de los mtodos vistos en el captulo 20 es frag- semillas de soja. Se muestra el anlisis
mentado por la accin de una o varias enzimas de restriccin, que reconocen se- realizado sobre el ADN de 5 muestras de
cuencias especficas de nucletidos (ver figura 22.3). Una vez fragmentado el ADN, la generacin F2 procedentes del cruce
los diferentes segmentos son separados por electroforesis en geles de agarosa. entre semillas de soja (A y B). Las flechas
indican polimorfismos entre dos
Los fragmentos de ADN son transferidos a membranas de nitrocelulosa o de progenitores (A y B) que se segregan a la
niln cargadas positivamente para inmovilizarlos, de manera que pueda proce- generacin F2.
derse despus a la hibridacin de las membranas con sondas especficas (Figura
22.5 y ver captulo 21). De esta forma, se consigue no slo una mayor sensibili-
dad en la tcnica, sino que adems se puede estudiar, por ejemplo, la presencia
de secuencias caractersticas de los individuos estudiados (Figura 22.6).
319
Captulo 22
320
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos individuales
321
Captulo 22
Corte por delante de dATP y dGTP. Si los residuos de purina son pre-
viamente metilados por dimetilsulfato A en N(3) y G en N(7), y en
medio cido, un tratamiento posterior con piperidina producir la rup-
tura de la hebra de ADN tanto antes de un desoxirribonucletido con A
como con G.
Corte por delante de dGTP. El tratamiento con dimetilsulfato y piperidi-
na, pero no en medio cido, provoca la ruptura de la hebra tan slo de-
lante de un residuo con G.
322
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos individuales
323
Captulo 22
324
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos individuales
325
Captulo 22
326
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos individuales
Northern blot
Del mismo modo que la tcnica de transferencia Southern blot proporciona
una herramienta til para el estudio del ADN, la tcnica de Northern blot per-
mite realizar estudios, de forma similar, sobre molculas de ARN, teniendo in-
teresantes aplicaciones en el estudio de la expresin de genes. Los ensayos de
Southern blot y de Northern blot no slo aportan informacin del peso mole-
cular de productos hibridados, sino que permiten, adems, determinar la can-
tidad de stos, al menos de forma semicuantitativa, siendo muy til su uso. La
tcnica Northern blot resulta de gran utilidad en experimentos en los que se
comparan diferencias de expresin en el nivel del ARN mensajero de un de-
terminado gen entre distintas muestras, presentando una ventaja adicional so-
bre la tcnica de Dot blot (o de Slot blot): una mayor especificidad, al
producirse una separacin previa de las diferentes molculas de ARN por su
tamao molecular antes de proceder a la hibridacin con la sonda marcada.
327
Captulo 22
As, la tcnica de Southern blot fue modificada de forma que pudiera adaptar-
se al estudio de las diferentes molculas de ARN, introduciendo la separacin
por electroforesis en geles de agarosa, y desarrollndose la tcnica denomina-
da Northern blot.
Una caracterstica diferencial importante a tener en cuenta es que el
ARN presenta estructura monocatenaria y el ADN bicatenaria. Evidente-
mente, el hecho de que el ARN sea monocatenario no quiere decir que ca-
rezca de enlaces por puentes de hidrgeno entre bases complementarias en
su estructura, ya que determinadas secuencias de una molculas de ARN
pueden hibridar con fragmentos de la misma molcula, o con otras molcu-
las de ARN (Figura 22.17). Estas asociaciones entre molculas de ARN difi-
cultaran su estudio por tcnicas de hibridacin, ya que, si hay molculas
de ARN hibridando entre s, se reducen las posibilidades de hibridacin con
las sondas marcadas. Por otro lado, estas agrupaciones interferiran en la se-
paracin de molculas de ARN en los geles de agarosa, provocando una mi-
gracin ms rpida o ms lenta, con lo que los resultados no seran
fcilmente interpretables ni comparables entre distintas muestras y experi-
mentos. As pues, al disear la tcnica del Northern blot, uno de los objeti-
vos fue eliminar estas interacciones entre las molculas de ARN, de forma
que las molculas se presentaran de forma totalmente lineal antes de reali-
Figura 22.17. Esquema representativo del
tipo de agrupaciones que pueden zar la electroforesis. Para ello, se hace uso de agentes desnaturalizantes,
producirse entre molculas de ARN: que interfieren en la formacin de enlaces por puentes de hidrgeno, evi-
intramoleculares e intermoleculares. tando las agrupaciones. Pueden utilizarse agentes como el formaldehdo y
la formamida. En estas condiciones los diferentes ARN se separan por su ta-
mao y no por su forma.
Otro problema que se manifiesta durante la realizacin de la tcnica de
Northern blot es la presencia de ARNasas, por lo que determinadas disoluciones
que se emplean durante el procesamiento de las muestras deben tratarse con
agentes inhibidores de stas, como el DEPC (dietilpirocarbonato), y adems es
conveniente mantener determinadas medidas de precaucin, tales como el uso
de material estril, guantes y pinzas.
Los ARN, una vez separados por electroforesis, deben ser inmovilizados
para proceder a realizar una hibridacin y una posterior deteccin de las espe-
cies de inters. As, el ARN se transfiere por capilaridad a membranas de niln
Figura 22.18. Imgenes obtenidas en un cargadas positivamente. Una vez realizada la transferencia, las especies de
experimento de Northern blot. Se observa ARN son fijadas sobre la membrana por la formacin de enlaces covalentes
la imagen (izquierda) del ARN total teido con sta (inducidos por calor o por radiacin UV). El proceso de hibridacin y
inespecficamente con un agente con
de deteccin es el mismo que el descrito en el ejemplo utilizado para explicar
capacidad de intercalacin en los cidos
nucleicos y fluorescente (el bromuro de la tcnica de Slot blot. En el Anexo de Mtodos del CD se presenta un mtodo
etidio). Ntese que las bandas de Northern blot para la determinacin semicuantitativa de los niveles de
mayoritarias son las constituidas por los ARNm de UCP1 (Figura 22.18).
ARN ribosmicos, 28 S y 18 S. En la
imagen derecha se observan las tpicas
bandas que aparecen tras la deteccin de
una especie de ARN concreta, el ARNm
de la UCP1 (de un peso molecular
determinado), detectada con una sonda
especfica marcada y habindose
empleado el sistema de visualizacin
correspondiente al marcaje. Tambin se
muestra la imagen de deteccin del ARNr
18S, que puede utilizarse como control
de carga y transferencia.
328
Mtodos de determinacin de cidos nucleicos individuales
RT-PCR
En algunos casos, la determinacin de un ARNm por Northern blot resulta poco
sensible, por lo que puede utilizarse el proceso de amplificacin por PCR (ver
captulo 21), realizando previamente una retrotranscripcin. La RT-PCR es una
tcnica ms sensible, que se puede convertir en una tcnica semicuantitativa e,
incluso, cuantitativa. Uno de los problemas de utilizar la RT-PCR con fines cuan-
titativos es que resulta difcil controlar las condiciones de amplificacin, por lo
que se recurre a utilizar patrones internos durante el proceso, pudindose tam-
bin utilizar patrones internos y externos en otros casos.
Hay diferentes mtodos que permiten la utilizacin de la RT-PCR con fines
cuantitativos. Se comentarn brevemente dos mtodos que permiten la cuantifi-
cacin de los niveles de ARNm de la UCP1; uno es semicuantitativo, mientras
que el otro es de tipo cuantitativo.
En la determinacin semicuantitativa de los niveles de ARNm por RT-PCR se
realiza, en primer lugar, una retrotranscripcin del ARN aislado de la muestra o
muestras de inters por accin de una enzima con actividad retrotranscriptasa
(RT). Se obtiene as el ADN complementario (ADNc), que puede utilizarse como
molde en la posterior reaccin en cadena de la polimerasa. Para controlar las di-
ferencias en el proceso de amplificacin dado entre los distintos tubos de anlisis
(que, como se ha comentado en el captulo 21, vienen determinadas por un
gran nmero de factores), se coamplifica en cada tubo otro ADNc correspon-
diente a un gen constitutivo (gen que se expresa constantemente debido a la efi-
ciencia de su promotor) que se utiliza como patrn interno del proceso. Para
este segundo gen se utilizan primers que provocan la amplificacin de un frag-
mento de este gen de una longitud diferente a la longitud del fragmento del gen
que quiere estudiarse, de manera que los productos amplificados en el mismo
tubo puedan separarse y diferenciarse posteriormente mediante electroforesis en
geles de agarosa.
En el Anexo de Mtodos del CD se presenta el procedimiento de forma deta-
llada de la determinacin semicuantitativa de los niveles de ARNm de la UCP1
por RT-PCR, utilizando actina como patrn interno. Los productos de amplifica-
cin son separados por electroforesis en geles de agarosa y visualizados con bro-
muro de etidio, observndose dos bandas por tubo de amplificacin (Figura
22.19). Los geles son analizados por un sistema de captura de imagen, y la in-
tensidad de cada banda se determina con ayuda de un programa informtico de
cuantificacin.
329
Captulo 22
330
Bibliografa por captulos
Captulo 1: WILSON, K. y WALKER, J. (1994). Principles and techniques of practical biochemistry, 4 ed. (Cambridge, Inglaterra,
Cambridge University Press)
WILSON, K. y WALKER, J., eds. (2000). Principles and techniques of practical biochemistry, 5 ed. (Cambridge, Cam-
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Captulo 2: ANDERSON, S. y COCKAYNE, S. (1993). Clinical chemistry: concepts and applications (Filadelfia, W.B. Saunders).
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336
ERRNVPHGLFRVRUJ
ndice analtico
337
ndice analtico
338
ndice analtico
bromuro de etidio, 296, 318. Fig. 3.5, celobiosa. Fig. 19.9. de variacin, 51
12.10, 20.10, 20.11, 21.15. celofn. Vase acetato de celulosa colecalciferol. Vase vitamina D
bucle, 291 clula 4-colesten-3-ona, 244
Bunsen, mechero, 46 fotoelctrica. Fig. 5.10. colesterasa. Fig. 16.26.
butanol, 128 fotovoltaica, 77. Fig. 5.11. colesterol, 235. Fig. 16.10.
celulosa, 120, 276. Fig. 19.13. determinacin, 243
centelleante, 95 enzimtica, 244. Fig. 16.26.
c
12
centrfuga, 251, 254 qumica, 244. Fig. 16.25.
C, 90 analtica. Fig. 17.14. esterificado. Vase ster de
14
C, 25, 140, 207, 306. Fig. 6.3. de mesa, 254 colesterol
cadena centrifugacin. Fig. 17.5. -oxidasa. Fig. 16.26.
lateral (grupo R), 106 analtica, 255, 258 colesterol oxidasa, 244
ligera, 198. Fig. 14.1. diferencial, 255. Fig. 17.7. colidin, 250
pesada, 198. Fig. 14.1. isopcnica, 256 colina. Fig. 16.14.
calcena, 102. Fig. 7.3. preparativa, 255 columna
calcio. Fig. 7.1. zonal, 256, 257. Fig. 17.9. de afinidad, 217. Fig. 15.4.
determinacin, 101 centro de catlisis, 181 de analizador automtico de aa.
calorimetra, 24. Fig. 1.5. cera, 233. Fig. 18.1. Fig. 10.14.
campana ceramida, 237. Fig. 16.15. de celulosa, 296
de proteccin biolgica. Fig. 2.6. cerebrogalactsido, 237 de cromatgrafo de gases, 125
extractora de gases, 34. Fig. 2.7. cerebrsido, 237. Fig. 18.1. de HPLC, 129. Fig. 9.18, 9.19.
campo ceruloplasmina. Fig. 15.6. de intercambio inico, 216. Fig.
centrfugo, 253 cesio, 103 15.1.
creciente, 255 cetohexosa, 47 de un cromatgrafo de gases. Fig.
relativo. Vase CCR 9.13.
cetosa, 272
elctrico, 161, 164 de vidrio, 119, 124
CGP-12177, 27. Fig. 1.9.
gravitatorio, 251, 253 comisin de enzimas, 186
cianohemoglobina, 159
terrestre, 253 complejo
cianuro
magntico, 72. Fig. 5.2. Ag-Ac, 201
nitroprusiato, 139
candela. Fig. 3.16. calcio-anin, 101
sdico, 111
cantidad calcio-calcena, 101
ciclo
de funcin, 48, 215 citrato-calcio, 64
de PCR, 310
de sustancia. Fig. 3.16. de coordinacin, 157
ciclopentano-perhidrofenantreno, 235.
caotrpico, 65, 136, 294. Fig. 8.5. Fig. 16.9. del Cu, 157
captura electrnica (CE), 91. Fig. 6.3, cintica dicetohidrindilideno, 109
6.7. de orden cambiante, 182 enzima-producto (EP), 182
carbazole. Fig. 3.5. de orden cero, 182 enzima-sustrato (ES), 182. Fig.
carbohidrato, 271 13.7.
de primer orden, 182
cromatografa de gases, 286. Fig. fsforo-sales de molibadto, 102
de saturacin, 182. Fig. 13.5, 13.6.
19.31. hierro-batofenantrolina, 103
enzimtica, 182
cromatografa en papel, 285 hierro-ferrozina, 103
cirrosis heptica, 226. Fig. 15.7.
derivatizacin, 286 hierro-glutamil hidroxamato. Fig.
cis, configuracin, 232. Fig. 16.2.
determinacin, 278 13.15.
cistena, 153. Fig. 3.3, 3.5, 8.1.
estructura, 271 oxalato-calcio, 64
determinacin, 111
HPLC, 286. Fig. 19.32. oxalato-fosfomolibdeno, 102
cistinuria, 138
O-trimetilsilil derivado. Vase protena-detergente, 154
citidina. Fig. 3.3
derivado de O-trimetilsilil complementariedad de bases, 299
citocromo c oxidasa, 23. Vase Cox
carbn activo, 120, 262, 266. Fig. 18.9. conejo, 25, 199
citosina, 290. Fig. 3.3, 20.5
carbonilo, 272. Fig. 11.8. de indias, 25
citrato, 64, 225. Fig. 4.5, 4.8.
carbono. Fig. 6.1. conservante. Vase anticoagulante
12
clorobenceno. Fig. 5.22.
12. Vase C orina, 68
14
cloroetano. Fig. 5.21.
14. Vase C sangre, 64
clorofila, 71. Fig. 5.1.
D, 106, 151 constante
cloroformo, 128, 239, 244. Fig. 8.5
Z, 232 de desintegracin, 92
N-clorosuccinimida, 111
carboxilo, 105, 150 de Michaelis-Menten. Vase Km
cloruro
carboximetil celulosa, 193 de dansilo, 140, 144. Fig. 3.5, 8.12, de Planck, 72
carcinomatosis. Fig. 15.7. 10.9. dielctrica, 121. Fig. 9.9.
cardiolipina. Fig. 16.14. reaccin, 111 gravitatoria terrestre, 253
carga, 116, 161 de guanidinio, 154 contador
de la molcula, 162 de lantano, 101 de centelleo lquido, 96. Fig. 6.12.
elctrica, 162 sdico, 66, 239 de centelleo slido, 95. Fig. 6.11.
naturaleza, 164 coagulacin. Fig. 4.5. Geiger-Mller, 94. Fig. 6.10.
caroteno, 80 de la sangre, 63 contaminacin bacteriana, 67
E-caroteno, 235. Fig. 5.19, 16.8 cobaya, 25 control de calidad, 53. Fig. 3.14.
carotenoide, 235 cobre. Fig. 7.1. programas, 39
cascos de proteccin auditiva, 34 coeficiente coomassie, azul de, 158. Fig. 3.5,
ctodo, 162 de extincin molar, 82, 109 11.18, 12.10, 15.9.
CCR, 253 de regresin (r), 84. Fig. 5.26. coplanaridad, 151
cebador, 308, 311. Fig. 21.16. de reparto, 118 corazn, 26
339
ndice analtico
cortisol. Fig. 16.10. derivatizacin, 137, 139. Fig. 9.16. dnodo, 77. Fig. 5.13.
Cox, 28. Fig. 1.4, 1.10, 1.11. pre-columna, 143 dinucletido de nicotinamida y adenina,
creatina quinasa. Fig. 15.13. deshidro-3-retinol. Vase vitamina A2 190
creatinina, 66 desintegracin diodo array, 130. Fig. 9.20.
cribado molecular, 133, 161, 166, 215 por minuto. Vase dpm dixido de carbono, 60
crisol, 283 por segundo. Vase dps presin de, 62
cromatografa, 119 radiactiva, 92 dipolo temporal, 153
bidimensional, 123. Fig. 9.11. velocidad de, 90 disacrido, 272, 274
en TLC, 142 desnaturalizacin no reductor, 275
de adsorcin, 120 de ADN, 300, 310, 312. Fig. 21.2, reductor, 275
en columna, 121, 262. Fig. 9.10. 21.3, 21.4. disolvente orgnico, 48, 119, 122, 238
de cribado molecular, 216 de ARN, 302, 326, 328 dispersor, 239
de gases, 124 de ARNasa, 294 distrofia muscular, 226
de cidos grasos, 264 de protenas, 153. Fig. 11.12. 2,6-di-ter-butil-p-cresolhidroxitolueno
de cidos grasos del plasma, 264 desnaturalizante, 65, 154 butilado, 2,6di-tert-butil-p-cresol.
de carbohidratos, 286. Fig. 19.31. desorden metablico, 138 Vase BHT
de intercambio inico, 131, 216. desoxirribonucletido. Vase dNTP diterpeno, 234
Fig. 9.22. desoxirribosa, 290, 291. Fig. 20.4. DNP-derivado. Fig. 10.8.
de permeabilidad, 133. Fig. 9.23. desproteinizacin, 65, 103, 136, 145, DNS, 213. Fig. 14.24.
de polaridad. Fig. 9.8. 238, 251, 278 dNTP, 297, 309
en capa fina. Vase TLC desviacin doble hlice, 299. Fig. 20.1, 20.2, 21.1,
en papel, 47, 128 estndar, 50. Fig. 3.10 21.4.
de carbohidratos, 285 tipo, 50 dodecil sulfato sdico. Vase SDS
de protenas, 167 detector, 125 dot blot, 326. Fig. 22.14.
gas-lquido, 124 de captura electrnica, 126. Fig. DPA. Fig. 16.1.
lquida alta precisin. Vase HPLC 9.15. dpm, 93
lquido-lquido, 120 de conductividad trmica, 125. Fig. dps, 93
cromatgrafo de gases, 124. Fig. 9.12. 9.13. dUTP-digoxigenina, 327. Fig. 21.10.
cromatograma, 125, 127, 131, 145, de cromatgrafo de gases. Fig.
265. Fig. 9.13,9.14, 9.15, 18.8. 9.13.
de cidos grasos. Fig. 18.8. de HPLC, 130. Fig. 9.17. e
cromforo, 84, 101 de ionizacin a la llama, 126, 264. ecuacin
cromosoma, 20 Fig. 9.14. de Michaelis-Menten, 184. Fig.
cuantificacin, 45 electroqumico, 131. Fig. 9.21. 13.8.
cuanto de luz, 72 espectrofotomtrico, 83. Fig. 5.8, Edman. Vase PITC
5.24 EDTA, 64, 101, 225, 292. Fig. 4.5, 4.8,
cubeta
espectrofotomtrico, 77 7.3.
de cromatografa, 122
fluorimtrico, 130 EGTA, 102. Fig. 7.3.
de cuarzo, 83, 296
fotomtrico, 130 Ehrlich. Vase reactivo de Ehrlich
de electroforesis, 163. Fig. 12.1.
radioqumico, 131 EIA, 208
de plstico, 83
detergente, 173
de referencia. Vase blanco elastina, 277
determinante antignico, 199. Fig.
de vidrio, 83 electroendsmosis, 166. Fig. 12.3.
14.2, 14.3.
cuerpo cetnico, 245 2 electrfilo, 127. Fig. 9.15.
deuterio. Vase H
cultivo electroforesis, 161
lmpara de, 83
de clulas, 27 bidimensional, 174. Fig. 12.16.
dextrano, 133. Fig. 9.23, 14.6.
de rganos, 27 capilar, 161, 324. Fig. 12.17.
diabetes mellitus. Fig. 15.7.
explantes primarios, 27 automatizada, 175
diaforasa, 240. Fig. 16.22.
lnea celular, 27 de cidos nucleicos, 317
dilisis, 249. Fig. 17.2.
curio (curie, Ci), 93 de alto voltaje, 173
2,7-dicloro-fluorescena. Fig. 18.5.
curva de lipoprotenas, 268. Fig. 18.12.
didesoxirribonucletido. Vase ddNTP
de calibrado, 203 de protenas, 217
dieta de cafetera, 23
de desintegracin radiactiva, 92. discontinua, 221. Fig. 15.12.
dietilaminoetil celulosa, 193
Fig. 6.9.
dietilpirocarbonato. Vase DEPC en acetato de celulosa, 168, 220
de saturacin enzimtica, 182. Fig.
1,3-di-[2-(5-feniloxazol)]-benceno. en gel
13.5, 13.6.
Vase POPOP de agarosa, 169, 317. Fig. 12.5,
patrn, 330
2,5-difeniloxazol. Vase PPO 21.15, 22.2, 22.4, 22.5, 22.27.
sigmoidea, 300
digitonina, 243 de almidn, 168
tangente en un punto, 188. Fig.
13.10. digoxigenina, 303, 306, 322 de poliacrilamida, 170, 220. Fig.
D-dihidroxiacetona, 272. Fig. 19.2. 15.10.
dilucin en papel de filtro, 167, 220. Fig.
12.4.
d en gradiente, 129
electrolisis del agua, 163
DABA, 297. Fig. 3.5, 20.12. isocrtica, 129
isotpica, de bioelementos, 99 electrn de valencia, 80
dansilacin, 111
dimetilsulfato, 322 electronegatividad, 114
ddNTP, 324. Fig. 22.11.
dinitrofenil derivado. Vase DNP- electrn-voltio (eV), 92
ddUTP-digoxigenina. Fig. 21.10.
derivado ELISA, 209
DEPC, 294 dinitrofenilfluorobenceno. Fig. 3.5. competitivo, 210. Fig. 14.19, 15.21.
derivado de O-trimetilsilil, 286. Fig. dinitrofenilhidrazina. Fig. 3.5.
19.32. en sndwich, 210, 227. Fig. 14.18,
dinitrosalicilato. Fig. 3.5. 14.20, 15.20.
340
ndice analtico
elongacin, 310. Fig. 21.13, 21.16. de emisin a la llama, 76. Fig. 5.8. en gel, 133. Fig. 15.2.
elucin en gradiente, 122 espectroscopa, 71 filtro, 251
eluyente, 119, 121 esperma de salmn, 306 fingerprinting, 318. Fig. 22.4, 22.6
EMIAT, 211. Fig. 14.22. espn. Fig. 5.5. FITC. Fig. 14.24.
endonucleasa, 320 estado fitol, 234
energa fundamental, 73. Fig. 5.4. flavoprotena. Fig. 11.2.
cintica. Fig. 17.1. transitorio, 180. Fig. 13.1. flor-2,4-dinitrofenol, 144
de activacin, 180. Fig. 13.2. ster flor-2,4-dinitrobenceno. Vase
de onda de luz, 72 colesterol hidrolasa, 244 reactivo de Sanger
libre estndar de Gibbs, 180. Fig. de cido graso, 233 fluoram, 213. Fig. 14.24.
13.1. de colesterol, 235. Fig. 16.11. fluorescamina. Fig. 8.11.
libre media, 154 de esteroide. Fig. 18.1. reaccin, 110
enlace de fosfato. Fig. 16.13, 16.14. fluorescencia, 85. Fig. 5.27, 14.21.
forma resonante, 150 sulfrico, 237 fluormetro, 85. Fig. 5.27.
fosfodister, 290, 291 esteroide, 235 fluorforo
glucosdico, 274 esterol. Fig. 18.1. primario, 96. Fig. 6.13.
peptdico, 150. Fig. 3.5, 11.1, 11.3, estradiol. Fig. 16.10. secundario, 96. Fig. 6.13.
11.4. estreptavidina. Fig. 14.23. fluoroinmunoensayo, 213
ensayo estrona. Fig. 16.10. heterogneo, 213
competitivo estructura proteica homogneo, 213
secuencial, 207 cuaternaria, 151. Fig. 11.6. fluoruro, 61, 64. Fig. 4.5.
simultneo, 207 dominio estructural, 151. Fig. 11.6. Folch
inmunorradiomtrico. Vase IRMA primaria, 150, 151, 197. Fig. 11.6. extracto de, 239, 269
enzima, 180. Fig. 13.9. secundaria, 151. Fig. 11.6. mtodo de, 239
catlisis, 181 supersecundaria, 151. Fig. 11.6. Folin-Ciocalteu. Vase reactivo de
centro activo, 181 terciaria, 151, 197. Fig. 11.6. Folin-Ciocalteu
como reactivo. Fig. 13.17. etano. Fig. 5.21. forma resonante, 150
de restriccin, 290, 318, 322. Fig. etanol. Fig. 8.5, 5.21. formador de gradientes, 257. Fig.
22.3. etanolamina. Fig. 16.14. 17.13.
ligasa. Vase ligasa eteno. Fig. 5.21. formaldehdo, 171, 328. Fig. 16.26.
plasmtica, 223 ter, 65, 262 formamida, 302, 328
enzimologa, 179 de petrleo, 244 formazn. Vase INTH
enzyme multiplied immunoassay etiolgico, 38 fosa cubital, 60
technique. Vase EMIAT fosfatasa
exactitud. Fig. 3.13
enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay. cida. Fig. 15.13.
experimento
Vase ELISA alcalina, 224, 228, 308, 327. Fig.
in situ, 22
EPA. Fig. 16.1. 14.14, 14.16, 14.17, 22.16.
in vitro, 22
EPA (U.S. Environmental Protection fosfatidilcolina. Fig. 16.14.
Agency), 38 in vivo, 22
fosfatidiletanolamina. Fig. 16.14.
eptopo, 199. Fig. 14.5. extensin
fosfatidilglicerol. Fig. 16.14.
eritrocito, 66, 67 del ADN, 312
fosfatidilinositol, 237. Fig. 16.14.
eritrosa. Fig. 19.1. fosfatidilserina. Fig. 16.14.
eritrulosa. Fig. 19.2.
error
f fosfato, 68, 236, 290
factor de respuesta (FR), 143, 265 de difenilamina anilina, 285. Fig.
accidental, 51. Fig. 3.11. 19.27, 19.28, 19.29, 19.30.
para un cido graso. Fig. 18.6.
estndar de la media. Vase S.E.M fosfoacilglicrido.Vase
fase
sistemtico, 51. Fig. 3.12. fosfoacilglicerol
esfingenina, 237 estacionaria, 117. Fig. 9.5.
fosfoacilglicerol, 236
esfingomielina, 236, 237. Fig. 16.16. mvil, 117. Fig. 9.5.
fosfolpido, 236. Fig. 16.14
esfingosina, 236, 237. Fig. 16.15. FDA (U.S. Food and Drug
determinacin, 269
Administration), 38
especificidad fosfoprotena. Fig. 11.2.
Fehling, mtodo de, 279
antignica, 198 fsforo. Fig. 7.1.
fenilalanina. Fig. 3.3, 8.1. 32
de accin, 181 P, 306, 322. Fig. 6.3.
determinacin, 111
de sustrato, 181 determinacin, 102
fenilcetonuria, 138
de unin Ag-Ac, 201 fotoctodo, 77. Fig. 5.13.
fenilisotiocianato. Vase PITC
inmunolgica, 199 fotodensitometra, 168
4-fenilspiro-(furan-2-(3H)-1-ftaln)-3,3-
espectro fotodensitmetro. Fig. 21.9.
diona. Vase Fluoram
de absorcin, 80. Fig. 5.17. fotomultiplicador, 77, 95. Fig. 5.13.
feniltiocarbamil aminocido, 110, 144.
de bandas, 75 Fig. 10.13. fotn, 72
de lneas, 75 fenol, 293. Fig. 3.5, 5.22. fototubo, 77. Fig. 5.12.
electromagntico, 74. Fig. 5.5. ferrozina, 103. Fig. 7.4. fragmento
visible, 71 fibra Fab. Fig. 14.1.
espectrofotometra determinacin, 283 Fc. Fig. 14.1.
de absorcin atmica a la llama, 78 ficoll, 302, 306. Fig. 17.12. frecuencia, 72
de emisin a la llama, 75 fiebre reumtica. Fig. 15.7. fructosa. Fig. 19.2.
espectrofotmetro, 82. Fig. 5.24. film fotogrfico, 97, 306. Fig. 6.14, determinacin, 281. Fig. 19.22.
de absorcin a la llama, 78. Fig. 15.23. fuente
5.14. filoquinona. Fig. 16.7. de energa radiante, 83. Fig. 5.24.
de doble haz, 83. Fig. 5.25. filtracin, 250. Fig. 17.3. 17.4. electrofortica, 163. Fig. 12.1.
341
ndice analtico
342
ndice analtico
343
ndice analtico
344
ndice analtico
345
ndice analtico
Sistema Internacional de unidades. ter-butil-4-hidroxianisolhidroxianisole UCP1, 28, 211, 228, 320, 327, 328.
Vase S.I. butilado, 2,3-t-butil-4-hidroxi- Fig. 9.25, 15.3, 15.21, 15.22, 15.24,
slot blot, 326. Fig. 22.14, 22.15. anisole. Vase BHA 22.7, 22.18, 22.19.
sobrenadante, 255 terminador de cadena, 324. Fig. 22.11, UCP3, 27
sobrepeso, 24 22.12, 22.13. ultracentrfuga, 254
sodio. Fig. 5.3, 7.1. termociclador, 310. Fig. 21.14. ultracentrifugacin diferencial, 267. Fig.
determinacin, 103 termognesis, 24 18.11.
solubilidad, 115 testosterona. Fig. 16.10. ultrafiltracin, 251
sonda, 289, 299, 304. Fig. 3.9, 21.6. tetrametilbenzidina. Fig. 15.20. unidad de actividad enzimtica, 188
cuantificacin, 306 tetrametilndiamina. Vase TEMED uracilo, 291. Fig. 3.3, 20.5.
de ADN. Fig. 21.7, 21.8. tetraterpeno, 235 urea, 66, 154
de ARN. Fig. 21.1.7, 21.8. tetrosa, 272 ureasa, 185
de oligonucletidos. Fig. 21.7, 21.8. Thermus aquaticus, 311 uridina. Fig. 3.3.
genmica, 304 tiempo urobilingeno, 67
libre, 303 de retencin, 128, 264 UTP-digoxigenina, 308. Fig. 21.10,
recombinante, 304 inicial de la reaccin enzimtica, 21.11.
unida, 303 187
unin inespecfica, 306 tierra de diatomeas, 125
sonicador, 239 timidina, 200. Fig. 3.3. v
timina, 290. Fig. 3.3, 20.5. vaco, 250
soporte
tiocianato de guanidinio, 294, 295 vacutainer, 61. Fig. 4.3.
de electroforesis, 165. Fig. 12.1.
tiourea. Fig. 3.5. valina. Fig. 8.1.
sorbitol. Fig. 17.12.
tirosina, 139, 155. Fig. 3.2, 3.3, 8.2 vapores de yodo, 123, 263. Fig. 18.2,
-deshidrogenasa. Fig. 15.13.
determinacin, 111 18.5.
sorbosa. Fig. 19.2.
tirosinuria, 138 vaso de precipitado, 35
Southern blot, 319. Fig. 22.5.
TLC, 122 vector, 38
SSC, 302
de aminocidos, 136. Fig. 10.3. plasmdico, 304
staking. Vase gel concentrador
bidimensional, 137. Fig. 10.5, 10.6 vrico, 38
subnivel energtico, 79. Fig. 5.16.
unidimensional, 137 velocidad
suero, 61, 199. Fig. 4.5.
de carbohidratos, 285. Fig. 19.28, angular, 253
hemolizado, 225
19.29, 19.30. de desintegracin radiactiva, 90, 92
sulftido, 237. Fig. 16.17.
de fosfolpidos, 269. Fig. 18.3. de la luz, 72
sulfato
bidimensional. Fig. 18.4. de migracin, 117, 161
clcico, 122
de lpidos, 262. Fig. 18.2. de reaccin enzimtica, 187. Fig.
de condroitina, 277. Fig. 19.15. 13.5.
Tm del ADN, 311. Fig. 21.2, 21.3, 21.4.
de dextrano, 302 inicial de reaccin enzimtica, 189.
TNBT, 226
de metil-p-aminofenol, 102 Fig. 13.10, 13.11, 13.12
D-tocoferol, 234. Fig. 16.7.
sdico. Fig. 8.5 mxima de reaccin enzimtica.
tolueno, 68. Fig. 5.22.
sulfolpido. Fig. 18.1. Vase Vmx
torniquete, 60
sustrato, 180. Fig. 13.1, 13.2, 13.11, vena
13.12. trans, configuracin, 232. Fig. 16.2.
baslica. Fig. 4.1.
activado, 180. Fig. 13.1. transaminasa, 225
cava. Fig. 1.7
transcobalamina. Fig. 15.6.
ceflica. Fig. 4.1.
transcriptasa inversa, 290, 313, 329.
Fig. 21.16. cubital media. Fig. 4.1.
transferasa. Fig. 13.9. heptica, 25. Fig. 1.7
t transferrina. Fig. 15.6. porta, 25. Fig. 1.7
tagatosa. Fig. 19.2. transicin nuclear, 74. Fig. 5.5. veneno, 33
talosa. Fig. 19.1. transmitancia (T), 82 verde de bromocresol, 159. Fig. 3.5.
tamao trauma muscular, 226 vibracin de los tomos, 74
de poro, 169, 216, 250 trealosa. Fig. 19.9. vida media (T1/2), 92
de una molcula, 116, 249 treonina. Fig. 8.2. vidrio poroso. Fig. 9.23.
tampn treosa. Fig. 19.1. virus
de citrato sdico y cloruro sdico. triacilglicerol, 234. Fig. 16.3. oncognico, 38
Vase SSC determinacin, 241. Fig. 16.23. vector, 38
de electroforesis, 163, 165 triglicrido. Vase triacilglicerol viscosidad
tartrato alcalino. Fig. 3.5. triosa, 272 del fluido, 252
Tris-EDTA, 296 tripsina. Fig. 15.13. del medio, 162
tapn, 61. Fig. 4.5. triptfano, 155. Fig. 3.3, 8.1. vitamina
Taq polimerasa, 292, 311. Fig. 21.16. espectro de absorcin. Fig. 5.18. A1, 234. Fig. 16.6.
tartrato de cobre alcalino, 111 tritio. Vase H
3 A2, 234
TCA, 65, 103, 158, 171. Fig. 8.5. trombina. Fig. 4.5, 4.8. D, 235
tejido adiposo tubos de vaco. Vase vacutainer D3, 235. Fig. 16.12.
blanco, 27 turbidez, 203 E, 234. Fig. 16.7.
marrn, 25, 26, 27, 211, 228. Fig. turbidometra, 158 K, 234. Fig. 16.7.
1.4 turbidmetro, 159 VLDL, 268. Fig. 16.19.
TEMED, 170 Vmx, 182, 185, 187. Fig. 13.8.
temperatura. Fig. 3.16. volatilidad, 115, 124, 264
de fusin. Vase Tm del ADN volumen
de hibridacin, 311 u de elucin, 128. Fig. 15.3.
teora del estado estacionario, 183 ubiquinona, 234 muerto, 125
346
ndice analtico
w xantina, 68 z
Watson y Crick, reglas de, 290. Fig. xilosa. Fig. 19.1. zinc. Fig. 7.1.
20.3. xilulosa. Fig. 19.2. zwitterin, 222
Western blot, 213, 228. Fig. 15.23.
wolframato de cobre. Fig. 8.5
wolframio, lmpara de, 83
y
yodo. Fig. 12.10.
x 125. Vase
125
I
XAD, resina, 120 vapores de, 123, 263. Fig. 18.2, 18.5.
347