ENZIMOLOGA I

MARA CRISTINA LUNA LPEZ (1541236)

DIANA YURLEY BRAVO LPEZ (1543171)
LUISA FERNANDA RIVERA FORERO (1543556)
ANGLICA MARA ROJAS MAYOR (1543378)

PRESENTADO A:
NGELA MARA ESCUDERO R. MD.

FACULTAD DE SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLGICAS

PROGRAMA DE BACTERIOLOGA Y LABORATORIO CLNICO

METABOLISMO

SANTIAGO DE CALI, VALLE.

MAYO 19 DE 2016
 Resumen. En esta prctica realizamos procedimientos experimentales para la determinacin del efecto sobre la actividad
enzimtica en la variacin del pH y la temperatura en la enzima fosfatasa, utilizando el sustrato p-nitro-fenilfosfato (PNFP),
obteniendo la mayor absorbancia para una temperatura de 37 C y pH de 9.6.Adems se utiliz la ley de Beer-Lambert para
establecer la concentracin de una muestra realizando una curva de calibracin con un resultado de 0.11 mM en la muestra
problema.

Palabras clave: Enzimas, fosfatasas, pH, temperatura, tiempo.

INTRODUCCIN Determinar el efecto sobre la actividad

Las fosfatasas son un conjunto de enzimas capaces de
hidrolizar los esteres fosfato de diversos fosfolpidos. Si
son activadas a un nivel de pH inferior a 7 se denominan
fosfatasas cidas mientras que si son activadas a un pH
superior a 7 se denominan fosfatasas alcalinas. Son
enzimas con actividad fosfomonoesterasa que se
encuentra en las membranas celulares de diferentes
rganos, entre ellos, en el hueso, placenta, intestino,
leucocitos y otros [1]. En el proceso de clasificacin de las
fosfatasas se han sealado cuatro diferentes tipos de esta
enzima:
Fosfomonoesterasas: catalizan la hidrlisis de
monoesteres de cido fosfrico.
Fosfoesterasas: que tienen accin sobre disteres del
mismo cido.
Pirofosfatasas: las cuales hidrolizan esteres de cido
pirofosfotico
Metafosfatasas: quienes hidrolizan esteres de cido
metafosfrico y (HPO3)n [2]
enzimtica de la variacin del tiempo, pH,
temperatura, en la enzima fosfatasa, utilizando el
sustrato sinttico p-nitro-fenilfosfato.
Observar el comportamiento de la enzima
fosfatasa que es tan abundante en animales,
vegetales y microorganismos.
Identificar cual es la temperatura y PH ptimo
para la fosfatasa alcalina.
PROCEDIMIENTO
1. Curva de calibracin de p-nitrofenol
Con una longitud de onda de 405 se determin la
relacin entre absorbancia y concentracin y
entre transmitancia y concentracin.
En cinco tubos de ensayo se realizaron las
siguientes soluciones y se obtuvieron los
resultados contenidos en la Tabla 1.

Existen diferentes factores que influyen en la Solucin TUBO (mL)

determinacin de la actividad enzimtica entre ellos blanco 1 2 3 4 5
encontramos: Agua 1.5 1.47 1.44 1.41 1.35
Buffer 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
pH 9.6 Soluc
La Temperatura: que en general aumenta la velocidad Barbital in
de la reaccin del mismo modo que la actividad enzimtica PNFP 2.0 -------- 0.03 0.06 0.09 0.15 Probl
aumenta sin embargo al alcanzar determinadas nM ema
temperaturas aparecen fenmenos de desnaturalizacin de Absorba 0 0.25 0.66 1.2 1.27 0.83
la protena enzimtica y la enzima se inactiva. ncia
Transmit 0 0.04 0.08 0.12 0.2 26.6
Tampn y pH: existe el valor de pH optimo que es ancia
cuando la efectividad de la enzima es mxima.
Tabla 1. Datos para la curva de calibracin de p-
Presencia de cofactores: las coenzimas son sustancias nitrofenol.
que aumentan la actividad de la enzima y por tanto la
sensibilidad del mtodo analtico. Concentracin de la muestra problema:

Concentracin del substrato: si se mantienen constantes =

el resto de las variables, la velocidad de la reaccin Donde:
enzimtica aumentar hasta un punto determinado con
concentraciones crecientes del substrato. [1] A= Absorbancia
= Coeficiente de extincin molar
OBJETIVOS c= Concentracin

Conocer y adquirir experiencia en el manejo de

los instrumentos empleados en el laboratorio, en = [1]

especial el espectrofotmetro.
Conocer la naturaleza, caractersticas generales y
mecanismos de la regulacin de las enzimas para
entender su gran incidencia en los procesos
metablicos que tienen lugar en el organismo.
 1,4 3. Efecto del pH
Se prepararon las soluciones indicadas realizando
ABSORBANCIA 1,2
preincubacin a cada tubo durante tres minutos
1
a 37C. Cumplidos los tres minutos con una
0,8
diferencia de tiempo de un minuto entre cada
0,6
tubo se agreg 0.1 mL de la enzima FAL y se dej
0,4
incubando por otros tres minutos, Seguidamente
0,2 se anexaron los datos obtenidos en la Tabla 3.
0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Soluci TUBO (mL)
CONCENTRACIN n
blanc 1 2 3 4 5 6
o
Fig 1. Absorbancia vs concentracin Agua 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4

2. Efecto de la temperatura. Buffer 0.3 pH pH pH pH pH pH

0.3 mL 3.4 8.8 9.2 9.6 10.4 10.8
Se prepararon las siguientes soluciones PNFP -------- 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
realizando una preincubacin de cada tubo de 2.0 nM
ensayo durante tres minutos. Cumplidos los tres
minutos de preincubacin con diferencias de 1 Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
FAL
minuto entre tubo y tubo se agreg 0.1 ml de la
Absorb --- 0.16 0.32 0.32 0.43 0.23 0.12
enzima FAL, se dej incubar nuevamente por tres ancia 5 1 8 8 9 5
minutos, los datos obtenidos se muestran en la
Tabla 2.
Tabla 3. Datos del efecto del pH.
Solucin TUBO (mL)

blanco 1 2 3 4 5
0,5
Agua 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4
ABSORBANCIA

0,4
Buffer 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
0,3
pH 9.6
PNFP 2.0 -------- 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0,2
nM
25C 4C 30C 37C 50C 100C
0,1
Tempera
tura 0
Ex. 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0 5 10 15
Enzima
FAL pH
Absorba --- 0.08 0.204 0.279 0.189 0.112
ncia
405nm Fig 2. Grafica de A vs pH

Tabla 2. Datos obtenidos sobre el efecto de la RESULTADOS

Temperatura.
Tomando los valores obtenidos para la curva de
calibracin del p-nitrofenol (Tab. 1) y la ec. 1. se obtienen
0,3 los siguientes valores para la concentracin:
0,25
ABSORBANCIA

0,2 CONCENTRACIN ABSORBANCIA

0,15 BLANCO
0 0
0,1 1
0.04 0.25
0,05 2
0.08 0.66
0 3
0 50 100 150 0.12 1.2
4
TEMPERATURA 0.2 1.27

Tabla 4. Concentracin de las muestras segn

Fig 1. Grafica de A Vs Temperatura
absorbancia.
Para la Muestra Problema, se obtuvo una absorbancia de DISCUSIN DE RESULTADOS
0.83. Calculando con la le Beer-Lambert, se obtiene una
concentracin aproximada de 0.11 mM. Los resultados de la prctica experimental pese a que
fueron precisos, son susceptibles a errores; esto se debe
Para determinar la mxima actividad con variaciones del principalmente a errores humanos, dados por un inexperto
pH, se midi la absorbancia de cada tubo con pH distintos, manejo de los equipos y mala calibracin de los mismos
consignados en la siguiente tabla. por parte de los estudiantes, posibles fallas en el
espectrofotmetro debido a su tiempo de uso, posibles
ABSORBANCIA pH
errores debido a la prdida de calor al llevar el tubo del
bao de mara al instrumento y la falta de control sobre el
BLANCO 0 0,3 tiempo que pasaron las soluciones expuestas al calor. No
1 0,165 3,4 obstante, la prctica fue considerada como satisfactoria, ya
que permiti relacionar el pH y la temperatura con la
2 0,321 8,8
actividad de la fosfatasa alcalina, as como relacionarlo
3 0,328 9,2 con su efecto en el cuerpo humano.
4 0,438 9,6
En el cuerpo humano, la fosfatasa alcalina est presente
5 0,239 10,4
principalmente en las membranas plasmticas de
6 0,125 10,8 osteoblastos, clulas del hgado, rin, bazo y placenta y
su papel principal est asociado a la desfosforilacin de
Tab 5. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes pH. nucletidos y protenas. Mediante la prctica experimental
su pudo determinar que la temperatura ptima para la
Se concluye que el pH ptimo para la fosfatasa es de 9.6, fosfatasa alcalina corresponde a 37 C, lo que en el
evidenciando la actividad alcalina de la enzima. organismo del hombre se considera la temperatura normal.
Cuando dicha temperatura aumenta los niveles de esta
Al evaluar la actividad enzimtica al variar la temperatura, enzima aumentan y con ello su actividad, lo que a largo
se obtuvo una mxima absorbancia de 0.279 a una plazo puede indicar infeccin de la va biliar, neoplasia
temperatura de 37 C, valor aproximado a la temperatura heptica, tuberculosis miliar, linfoma, hipernefroma,
corporal normal. mononucleosis o citomagalovirus.

ABSORBANCIA TEMPERATURA El pH ptimo para la fosfatasa alcalina es de 9.6, ya que es

el punto donde existe la mayor absorbancia esto debido a
BLANCO 0 25
que la enzima funciona mejor en medios alcalinos, esto se
1 0,08 4 debe a la influencia del pH en el estado de ionizacin de
2 0,204 30 los grupos funcionales en la molcula de enzima y el
sustrato. El pH tiene una relacin intrnseca con el lugar
3 0,279 37
donde se encuentra la fosfatasa alcalina en el cuerpo ya
4 0,189 50 que como su nombre lo dice acta en un medio alcalino
5 0,112 100 (pH ptimo 8,6 a 9,1), est normalmente presente en la
sangre y los tejidos con cantidades ms altas de FA
Tab 6. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes abarcan el hgado, las vas biliares y los huesos.
temperaturas.
REFERENCIAS
CONCLUSIN
[1] J. Diaz, Portillo. M.T, Fernandez del barrio. F. P,
Con los resultados obtenidos durante la prctica, se Salido.Aspectos bsicos de bioqumica clnica. Madrid
observa que son satisfactorios al cumplir parcialmente con Estaa. 1997.
los valores aceptados de absorbancia para cada [2] Solrzano Martha. Prcticas de laboratorio
concentracin de p-nitrofenol, y por variar al cambio de Metabolismo. Universidad del Valle. Facultad de salud.
pH al reflejar una mxima absorbancia en un pH de 9.6. Departamento de Ciencias fisiolgicas. Cali, 2016.
Los valores de temperatura del medio en el que se [3] Lehninger,A. Principios de bioquimica- Enzimas.
encuentra la enzima y la absorbancia reflejan una Ediciones Omega, S.L., 2014
actividad enzimtica alta a los 37 C, valor cercano a la
temperatura corporal.