DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA HUMANA

MATERIA QUMICA BIOLGICA - CICLO LECTIVO 2017

TRABAJO PRCTICO
DE LABORATORIO 2

GLUCEMIA
ORINA
ELISA CHAGA TEST
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TRABAJO PRCTICO DE LABORATORIO N 2

GLUCEMIA ORINA - ELISA CHAGATEST

DETERMINACIN DE GLUCEMIA

FUNDAMENTO DEL MTODO:

Glu-oxidasa
Glucosa + O2 + H2O cido glucnico + H2O2

peroxidasa
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato quinonimina roja

PROTOCOLO

Cada grupo de trabajo determinar la glucemia de un paciente (muestra X o Z).

Para ello se realizar una curva de calibracin, midiendo la absorbancia de muestras de
concentraciones conocidas de glucosa. Paralelamente se procesar la muestra del paciente.
Luego, se realizar el correspondiente grfico de absorbancia en funcin de la concentracin de
glucosa, a partir del cual se podr calcular la concentracin de glucosa de la muestra incgnita.
(REPASAR ANEXO COLORIMETRA DEL TP DE LABORATORIO N 1)
Cada grupo de trabajo utilizar SEIS TUBOS para realizar el protocolo que se indica a
continuacin:

TUBO H2O T MUESTRA REACTIVO

(ul) (ul) (ul) (ul)
B 1000 - - 1000
T1 750 250 - 1000
T2 500 500 - 1000
T3 250 750 - 1000
T4 - 1000 - 1000
Muestra (X o Z) - - 1000 1000

A) Pipetear los reactivos correspondientes en cada tubo

B) Mezclar el contenido de los tubos sin formar espuma
C) Incubar 30 min a temperatura a temperatura ambiente
D) Ajustar con el BLANCO el cero del fotocolormetro a 500nm
1
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E) Leer las Absorbancia (500 nm) de todos los tubos

F) Realizar la curva de calibracin (grfico A vs [glucosa])
G) Interpolar el valor obtenido de la A500nm de las muestras incgnita en dicho grfico y
determinar el valor de glucemia de las muestras. Analizar el resultado del valor de la
muestra, utilizando la curva.

La concentracin del testigo es de 250 mg%. Los alumnos debern calcular la concentracin de
glucosa de cada uno de los tubos testigo.

Valores obtenidos por los docentes:

0.4

0.3
Absorbancia

0.2

0.1

0.0
0 100 200 300
Concentracin glucosa mg%
Valores obtenidos por cada grupo de alumnos.

Graficar la curva de Absorbancia en funcin de la Concentracin de Glucosa, en hoja

milimetrada, y luego obtener el valor de Glucemia del paciente X o el paciente Z. Informar este

valor a los docentes.

TUBOS CONCENTRACIN Absorbancia

DE GLUCOSA (500nm)
Blanco

Testigo 1

Testigo 2

Testigo 3

Testigo 4

2
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CONCENTRACIN DE GLUCOSA DE LA MUESTRA INCGNITA =

3
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ELISA (Chagatest de Wiener lab)

Fundamento:

1- La muestra se coloca en el soporte (cubeta o pocillo) en el que se encuentra inmovilizado el

antgeno (antgenos citoplasmticos y de membrana de Trypanosoma cruzi). Si la muestra
contiene el anticuerpo especfico se formar un complejo antgeno-anticuerpo que quedar
unido a la cubeta. Luego de la incubacin la fraccin no unida se elimina por lavado.
2- Se agrega el segundo anticuerpo (conjugado), que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina
humana conjugado con la enzima peroxidasa. Si la muestra contena anticuerpos especficos
que formaron complejo con el antgeno y quedaron adheridos a la cubeta, entonces el
anticuerpo conjugado se unir a los anticuerpos especficos. Luego de la incubacin, el exceso
de conjugado se elimina por lavado.
3- Se agrega el sustrato enzimtico. Si se uni el conjugado, entonces la peroxidasa producir
la reaccin enzimtica dando un color celeste. El sustrato es el Revelador. La reaccin se
detiene con el stopper (cido sulfrico) con lo que el color celeste vira a amarillo.

Protocolo:
1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar:
una Muestra X (paciente X)
una Muestra Z (paciente Z)

Rotular los pocillos con Nmero de GRUPO y Nmero de Muestra. Mantener cubiertos con
cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa determinacin. Si el
pocillo est rotulado, significa que ya ha sido usado.

2. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA X en uno de los pocillos previamente
rotulado como (1).

3. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA Z en uno de los pocillos previamente
rotulado como (2).

4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporacin e incubar durante 30 minutos a 37C
en bao termosttico. Fijarse que los pocillos estn en contacto con el agua, pero que no se
hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri plstica que flota en el
lquido del bao.

4
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5. Descartar el lquido de los pocillos en el recipiente de descarte. Lavar con BUFFER DE

LAVADO. Para ello, colocar un poco de este buffer en cada pocillo y despus descartar con
firmeza el lquido en el recipiente. Repetir este lavado 4 veces ms (5 lavados en total).
Despus del ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual invirtiendo los pocillos y
golpendolos varias veces sobre papel absorbente.

6. Luego, agregar 1 gota de CONJUGADO en cada pocillo.

7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a 37C en bao
termosttico.

8. Descartar el lquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO, como se
realiz anteriormente.

9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR . Mezclar con golpes laterales suaves. Puede
llevarse a 37C y esperar hasta el desarrollo de color celeste en la Muestra X (de 15 a 30 min).

10. Detener la reaccin con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo. Evaluar a
simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos.

TIRILLAS REACTIVAS DE ORINA

Se colocar una gradilla con dos tubos, uno de orina del paciente X y otro de orina del paciente Z
en las puntas de cada mesada. Cada grupo de alumnos usar la orina correspondiente a la
muestra del paciente que le toc de la glucemia.

Protocolo:

1- Familiarizarse con la forma y la direccin de cmo debe sumergirse la tirilla reactiva dentro de
la orina (NO DEBEN APOYARSE LOS DEDOS SOBRE LAS ALMOHADILLAS !!).
2- Sumergir la tirilla dentro del tubo con la orina, retirndola a los pocos segundos.
3- Esperar un minuto, apoyando la tirilla sobre un papel absorbente sobre la mesada.
4- Comparar los colores de la tirilla reactiva con los resultados de la fotocopia del kit comercial.
5- Anotar los resultados
6- Descartar las tirillas utilizadas.

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CASOS CLNICOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS EN EL TRABAJO PRCTICO

PACIENTE X

El seor O.G. de 35 aos nacido en la provincia de Chaco concurre al servicio de Clnica Mdica a
fin de realizarse un examen de rutina y serologa para Chagas por un estudio catastral que estn
realizando en la fbrica donde trabaja.
Antecedentes personales: fumador de 30 cigarrillos diarios desde hace 15 aos. Peso: 95 kg, talla:
1, 67 m.
Sin antecedentes familiares de importancia.
Al interrogatorio refiere conocer la vinchuca y provenir de un rea rural del norte de la provincia.
En la consulta se le detecta TA: 160/95.

Examen de laboratorio

Sangre Valores de Referencia

Glucemia: ______ 70-110 mg%

Proteinemia total: 7 g% 6-8 g%
Colesterol total: 260 mg% <200 mg%
Col HDL: 30 >40 mg%
Col LDL: 200 <100 mg%
TAG: 180 mg % <150 mg%
Bilirrubina total : 1 mg% 0.8-1 mg%
Bilirrubina Directa 0.15 mg % <0.2 mg%
GOAT: normal
GPT: normal
Creatininemia: 1mg % 0.6-1.4 mg%
Uremia: 25 mg% 15-45 mg%
Uricemia: 6.5 mg % <8 mg%

Chagatest por ELISA: _____

6
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Orina:

URO (Urobilingeno):
GLU (glucosa):
KET (cetonas):
BIL (bilirrubina):
PRO (protenas):
NIT (nitrito):
pH:
BLO (sangre):
SG (densidad):
LEU (leucocitos):

CUESTIONARIO:
En base a los valores indicados ms arriba y los obtenidos en el trabajo prctico, indique posibles
alteraciones metablicas presentes en este paciente.
1.- Qu caractersticas considera presentar la orina de este paciente a nivel de:
a) examen fsico, b) qumico y c) microscpico.
2.- Si el anlisis de Chagatest por ELISA diera positivo, que otra tcnica que conoce podra ser
utilizada para confirmar el diagnstico?

PACIENTE Z

Un paciente de 18 aos de edad acude al servicio de urgencias con alteracin del estado de
conciencia. Sus padres refieren que el paciente fue diagnosticado de diabetes hace 3 aos y est
siendo tratado con insulina, manteniendo un aceptable control glucmico. Cinco das antes del
ingreso haba comenzado con diarrea y malestar general, pese a lo cual fue a pasar unos das a la
costa con amigos. Durante los ltimos dos das, adems de la diarrea, present vmitos y en el
ltimo da haba dejado de ponerse la dosis de insulina de la noche.

Examen Fsico: Impresin de enfermedad aguda grave. Presenta signos de deshidratacin con
mucosas secas y signo del pliegue. Aliento cetnico. Responde a estmulos dolorosos.
Temperatura: 38C; TA: 100/60; pulso: 94/min. Pupilas normales y normorreactivas. Auscultacin
cardiopulmonar normal. Abdomen distendido, doloroso a la palpacin, sin visceromegalias, ruidos
intestinales aumentados. Peso aproximado: 60 kg

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Datos Complementarios

Sangre: Valores de Referencia

Glucemia: -------- 70-110 mg %

Proteinemia total: 9,5 g% 6-8 g %
Na: 132 mEq/l 135-155 mEq/l
K: 3.0 mEq/l 3,5- 5,5 mEq/l
Cl: 95 mEq/l 98-107 mEq/l
pH: 7.10 7,38-7,42
pCO2: 30 mmHg 32-48 mmHg
% Sat O2: 95 95-98%
CO3H: 10 mEq/l 2028 mM
leucocitos: 12500/mm3 5000-10000/mm3

Chagatest por ELISA:

Orina:
URO (Urobilingeno):
GLU (glucosa):
KET (cetonas):
BIL (bilirrubina):
PRO (protenas):
NIT (nitrito):
pH:
BLO (sangre):
SG (densidad):
LEU (leucocitos):

CUESTIONARIO:
1- Qu enfermedad tiene este paciente?
2- Analice las alteraciones metablicas presentes en sangre y orina.
3- Qu tratamiento en lneas generales le dara a este paciente?