1

Gel de Electroforesis
En la mayora de ensayos Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-
PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reduccin, las
protenas cargadas negativamente, cuando se someten a un campo elctrico, migran al electrodo positivo.
Debido a que el SDS iguala la carga en todas las protenas, la tasa de migracin viene determinada por su
peso molecular. Las molculas ms pequeas migran ms rpidamente que aquellas con pesos
moleculares mayores.





Preparacin de la Muestra

El mtodo elegido depender del tipo de
muestra de partida, de la localizacin sub celular de
la protena y de las condiciones ptimas que
requiera el anticuerpo para reconocer el eptopo
proteico. En la tabla 1 se resumen los mtodos
mecnicos que habitualmente se utilizan en la
extraccin de protenas para inmunotransferencia.

A menudo, en muestras tisulares de
animales, se requiere el uso de un proceso
mecnico para la disrupcin de la compleja matriz
celular. Disrupcin mecnica que suele preceder a
un proceso qumico de lisis celular, mediante el uso
de solucin tampn que contiene detergentes,
dirigida a enriquecer la protena de inters dentro del
extracto final. Las clulas en cultivo, frecuentemente,
se suelen lisar utilizando una solucin tampn con
detergente y sin la aplicacin de mtodos
mecnicos.


2

La estructura qumica de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las
protenas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar segn las
caractersticas del grupo polar: inicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa, no inicos si no
poseen carga o zwiterinicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0.

La eleccin de la substancia detergente, depende en parte de la localizacin, dentro de la clula, de
la protena de inters, citoplasmtica, unida a la membrana, dentro de orgnulos celulares como el ncleo y
las mitocondrias, etc. Las protenas citoplasmticas se pueden unir a las protenas del citoesqueleto,
afectando as a los procesos de fraccionamiento subcelular. En la tabla 2 se clasifican las soluciones
tampn y detergentes, ms utilizados habitualmente, segn el tipo de protena y localizacin subcelular.

Con la rotura celular, se liberan enzimas
proteasas que pueden degradar la protena de
inters. Por tanto, es importante evitar, durante la
preparacin de la muestra, cualquier actividad
protesica. La siguiente estrategia ayuda a evitar
la degradacin de protenas:
Evitar excesivos ciclos de
congelacin/descongelacin.
Trabajar rpido y mantener las
muestras en fro durante todo el proceso.
Aadir inhibidores de la proteasa
en el tampn de lisis.











Adems de inhibir la actividad de la proteasa, puede ser
interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina, en
particular en estudios de fosforilacin. En la tabla 3 se muestran
los inhibidores de proteasa y fosfatasa de uso ms habitual.






3

Tampn de carga de muestras

Los componentes del tampn de carga varan, dependiendo de las condiciones deseadas. Los ingredientes
tpicos de un tampn de carga para detectar protenas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se
describen en la Tabla 5. No se utilizarn ni SDS, -mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan condiciones no
desnaturalizantes /no reductoras. Previamente a la carga del gel, las muestras se someten a una incubacin a
95C durante 5-10 minutos, para asegurar que la desnaturalizacin/reduccin es total. En condiciones no
desnaturalizantes/no reductoras, esta incubacin no es necesaria.




















Materiales
Extraccin de Protenas
Tubos eppendorf de 2 ml y 600 l
Centrfuga a 13000 rpm durante 10 min a 4C
Juego de micropipetas
Hielo
Cmara multipozos o gradilla para eppendorf

Para realizar electroforesis
Cmara de electroforesis
Fuente de poder
Bao Mara 95C.
Tubos eppendorf de 1000, 600, 200 l.

4

Para realizar el Western Blot
Cmara de transferencia
Cajas de plstico para contener los geles, lavar membrana, contener agua y soluciones.
Fuente de poder

Reactivos

Preparacin de Geles PAGE (electroforesis en gel de poliacrilmaida)
Solucin Acrilamida-Bis
Acrilamida 14.6 g
Bis-acrilamida 0.4 g
Agua desionizada 50 ml

Solucin 1.5 M tris-HCl pH 8.8
Tris-base 18.5 g
Agua desionizada 100 ml
Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4 C

Solucin 0.5 M tris-HCl pH 6.8
Tris-base 6 g
Agua desionizada 100 ml
Ajustar a pH 6.8 con HCl Almacenar a 4 C

Persulfato de Amonio al 10%
Persulfato de amonio 1g
Agua destilada 10 ml
(Preparar slo lo necesario o guardar por 10
das a 4C)

SDS al 10 %
SDS 10 g
Agua desionizada 100 ml Almacenar a TA

Mtodo de Laemmli

Gel Separador
0.375 M Tris-HCl ph 8.8
Cantidad
8% 10% 12% 15%
Agua Desionizada 1.71 ml 1.38 ml 1.05 ml 0.54 ml
1M tris-HCl ph 8.0 1.87 ml 1.87 ml 1.87 ml 1.87 ml
SDS 10% 50 l 50 l 50 l 50 l
Acrilamida/Bis (29.2% -0.8%) 1.33 ml 1.66 ml 2 ml 2.5 ml
Persulfato de Amonio 10% 25 l 25 l 25 l 25 l
TEMED 2.5 l 2.5 l 2.5 l 2.5 l

Monmero total 5 ml



Nota: Preparar el minigel SDS-PAGE de 0.75 mm con
concentracin de 8 a 15% de acuerdo al tamao de
partcula. Utilizar el isobutanol para eliminar burbujas
del gel separador.



Gel Alineador
0.125 M Tris-HCl ph 6.8 4%
Agua Desionizada 2 ml
0.5 M tris-HCl ph 6.8 0.83 ml
SDS 10% 33 l
Acrilamida/Bis (29.2% -0.8%) 444 l
Persulfato de Amonio 10% 17 l
TEMED 3.30 l

Monmero total 3.33 ml
5

Buffer para muestras 4X
Preparacin de las muestras de protenas
Tris-HCl pH=6.8 (0.5 M) 0.6 ml del de 1.5 M
Glicerol 0.8 ml
SDS al 10 % 1.6 ml del de 20%
Azul de bromofenol 0.05 % 0.4 ml
-mercaptoetanol 0.4 ml
Agua desionizada 4.2 ml
Almacenar a T ambiente. 8 .0 ml


Buffer de corrida

Electroforesis
1X 10 X
Tris Base 3 g 30 g
Glicina 1.44 g 14.4 g
SDS 1 g 10 g
Agua desionizada 1 L 1 L


Western Blot

TBS
2.42 g de Tris-HCl (20 mM)
8 g de NaCl (137 mM)
Ajustar el pH a 7.6 Aforar a 1 litro

Leche al 5 % (Solucin Bloqueadora)
TBS 1X 10 ml
Tween 20 (0.1%) 0.01 ml
Leche descremada 0.5 g
Nota: se prepara fresca justo antes de utilizarse.

Marcador de Peso Molecular (MPM)

Membrana de Nitrocelulosa o PVDF

Rojo de Punceau al 0.4%
Opcional para membrana de nitrocelulosa

Solucin de Quimioluminiscente (partes iguales)
Solucin estabilizadora de Peroxidasa
Solucin de Luminol/Amplificador

Agua ultrapura
Se hidratan las membranas por 15-30 segundos
Buffer de transferencia

Tris-base 3.03 g
Glicina 14.4 g
Metanol 200 ml
SDS 0.5 g
Aforar a 1 litro H2O ajustar a pH= 8.3.
TBS-Tween 20 0.05%
1.0 ml Tween 20 en 1000 ml de TBS.
6

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La especificidad de la PCR depende, fundamentalmente, de la temperatura empleada en la fase de
hibridacin y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reaccin (adems de depender de la
secuencia de los cebadores). Por una parte, cuanto mayor sea la temperatura utilizada en la fase de
hibridacin, ms especfica es la reaccin. Esto se debe a que a mayor temperatura ms dificultada se ve
la unin entre el cebador y la cadena molde; en condiciones de temperaturas de hibridacin elevadas el
cebador slo se unir a la cadena molde si son complementarios en todos sus nucletidos. Por otra parte,
en un determinado rango, incrementos en la concentracin de MgCl2 hacen disminuir la especificidad de la
reaccin; los iones facilitan la unin del cebador a la cadena molde y permiten la incorporacin de los
nucletidos a la cadena creciente.

Reactivos























Tabla 1. Concentraciones de almacenamiento, concentraciones empleadas en la reaccin y
volumen a aadir de los principales componentes de una PCR considerando un volumen total de 25
l
Componente Concentracin a la que
se conserva
Concentracin final en
la reaccin
Volumen a aadir
Tampn 10X 1X 2.5
MgCl2 25 mM 1 mM 1
Cebador 10 M 0.4 M 1
dNTPS 10 mM 0.4 mM 1
Taq polimerasa 5 unidades/l 1 unidad/25 l 0.2