Determinacin de Hierro

srico bovino fetal.

Noviembre de 2016
 Objetivo:
Determinar cuantitativamente el Hierro presente en una muestra de suero bovino fetal.

Introduccin:
El Hierro es un nutriente que se encuentra en la mayora de seres vivos cumpliendo
funciones muy importantes. Dada su rapidez para cambiar de estado de oxidacin es
considerado un excelente catalizador en reacciones de xido-reduccin. Tambin es partcipe
de varios complejos de coordinacin en el organismo.

Si bien es un nutriente esencial, altas concentraciones de Hierro pueden derivar en

intoxicacin; por propiedades de xido-reduccin es capaz de generar radicales de oxgeno
nocivos para las clulas.

Fe+2 + H2O2 Fe
+3 + OH + OH : Reaccin de Fenton. (1A)

Por el contrario, su deficiencia puede ocasionar anemia ferropnica.

La existencia de Hierro inico en el organismo es prcticamente nula y transitoria. El Hierro

se presenta ligado a protenas: protenas Hemo, como son la hemoglobina y la mioglobina,
encargadas del transporte de oxgeno, contienen el 70% y 5% de Hierro corporal total,
respectivamente. Protenas no Hemo, como la ferritina y hemosiderina, encargadas del
depsito, representan el 25% de Hierro. Otras fuentes de Hierro son la peroxidasa catalasa,
citocromos y enzimas riboflavinas, todas suman menos del 1% de Hierro. (3A)

El Hierro en sangre se presenta como Hierro (III), muy poco soluble a pH fisiolgico, es por
ello que se transporta unido a la transferrina. La constante de asociacin de la tranferrina y el
Hierro es muy alta, por lo que el Hierro siempre estar formando un complejo con la
transferrina cuando se encuentre en sangre. (1B)

La anemia es un defecto de al menos 10% en en la produccin de eritrocitos comparada

con una persona de similar sexo, edad y estado de salud. Los componentes fundamentales
para la sntesis de eritrocitos son aquellos necesarios para producir hemoglobina: Hierro,
globina y heme. La deficiencia en las reservas de Hierro entonces, conllevan un dficit de
hemoglobina, y en ltima instancia, a deficiencia de eritrocitos; este tipo de anemia es
llamada: ferropnica. (3B)
Si bien la defciencia de Hierro puede provocar anemia, la cuantizacin del hierro srico no es
suficiente para diagnosticarla. El valor buscado suele ser la saturacin de hierro:

Saturacin de Hierro (%) = 100* [Fe srico] * TIBC-1

La TIBC es la capacidad total de fijacin de Hierro,

o lo que es lo mismo: la suma de la concentracin de
hierro srico y la capacidad latente de transporte
(UIBC). A partir de estos datos se es capaz de evalar
el estado del paciente en cuestin. (1)
 Fundamento Terico:
Para calcular el Hierro contenido en el suero se utilizar una tcnica espectrofotomtrica.
La preparacin de la muestra consistir en formar el complejo ferrona (fenantrolina-Fe+2),
compuesto coloro que absorbe luz con longitud de onda de aproximadamente 510nm.

El hierro en suero se presenta en la protena transferrina, la cual se encarga de transportar

al mineral a travs del corriente sanguneo. La transferrina tiene alta afinidad por el metal en
su forma oxidada, pero no es capaz de formar complejo alguno con el Fe+2; es necesario
reducirlo para poder liberarlo. Para ello se puede utilizar cido ascrbico o Vitamina C, que es
el mismo cido que suele reducir al Hierro en los intestinos para su apropiada absorcin:
cido ascrbico
Transferrina-Fe+3 Apotransferrina + Fe+2 (1D)

Para deshacerse de la turbidez de la muestra se precipitan las protenas presentes en el

suero. Esto se consigue al desnaturalizarlas en medio cido; en la prctica se utiliz cido
tricloroactico (Cl3CCOOH):

Cl3CCOOH
Protena (aq) Protena (s)

Al centrifugar se logra separar a las protenas de un sobrenadante, este ltimo contiene al

analito de inters (Fe++). (2A)

El sobrenadante producto de la centrifugacin luego es tratado con un buffer

amonio/amonaco y con fenantrolina:

La fenantrolina es
utilizada para formar el
complejo ferrona:
(fen)3Fe+2. El complejo
formado es de color
rojizo, esto permite
discriminarlo del resto de
la matriz en una
espectrofotometra. (4A)

La constante global es
log 3= 21.14, indicando
que la afinidad de la fenantrolina con el in Fe++ es alta. La formacin del complejo se ve
favorecida en valores de pH entre 3 y 9; a mayor valor de pH, mayor ser el poder quelante de
la fenantrolina. Es por ello que se trata al Hierro en pH alcalino.

A pH alcalino, la formacin de Hidrxido de hierro (II) se ve favorecida. La disociacin de

Fe(OH)2 tiene una pKps asociada de 15,1 (2B). Para evitar la formacin y precipitacin de este
compuesto se utiliza un medio conformado por el par cido-base conjugada:
amonio/amoniaco. Este buffer presenta amoniaco, el cual tiene la capacidad de acomplejar al
Fe+2; actuando de forma auxiliar evita la precipitacin de hidrxido metlico. (2C)

El analito de inters se encuentra en concentraciones traza, se debe utilizar alguna

estrategia que permita obtener una lectura apreciable. Un mtodo posible es aplicar la adicin
de patrn. La adicin de patrn consiste en aadir una cantidad de analito conocida a la
muestra, dicha adicin deber mantener un comportamiento lineal en los resultados; el
aumento de la intensidad en la lectura nos permitir deducir la cantidad de analito en la
muestra.(2D)
La adicin de patrn consistir en la adicin de sal de Mohr (II) a todas las alcuotas que se
sometan a espectrofotometra.
Aplicando la Ley de Beer se obtendr una recta, con una ordenada en el origen
correspondiente a la imagen de la concentracin del analito. Con la imagen en la recta se
calcula la pre-imagen, es decir, la concentracin de Hierro II que originalmente era Hierro (III)
en el suero.

El agua mQ presenta una resistividad de 18,2M.cm; esto es debido a la ausencia de

electrolitos que conduzcan la corriente. Es necesario usar agua de alta pureza, ya que el analito
de inters se encuentra en cantidad traza, los electrolitos del agua podran afectar a las
lecturas.

Reactivos y materiales:
Materiales
-Micropipeta Rainn 1000L
-Micropipeta Gilson 200L
-Matraz aforado 250mL
-2 Matraz aforado 50mL
-Vaso de Bohemia 100mL
-Agitador magntico y plancha
trmica
-Centrfuga
-pH-metro
-Espectrofotmetro
-Balanza analtica
-Celdas b=1cm
-11 Eppendorf
-4 Tubos Falcom

Reactivos
-Sulfato amnico ferroso hexahidratado
Biopack
(Fe(NH4)2(SO4)2.H2O)
PM =392.14g.mol-1
Pureza 99%

-cido ascrbico
Mallinckrodt
C6H8O6
 PM =176.13 g.mol-1

-cido tricloroactico
Mallinckrodt
Cl3CCOOH
PM =163.39 g.mol-1
Pureza 99%

-Cloruro de amonio
Mallinckrodt
NH4Cl
PM = 53.49g.mol-1
Pureza 99%

-Hidrxido de Sodio
ENTOX
NaOH
PM =40 g.mol-1
Pureza 99%

-Agua mQ

-o-fenantrolina
Baker Analyzed
C12H8N2

Protocolo experimental:
*Se lav todo el material y se prepararon las disoluciones con agua mQ*

1) Se prepararon las siguientes disoluciones:

-250mL de Fe++ 100g/mL,

-50mL de cido ascrbico 0.5mol/L

-50mL de cido tricloroactico 15%m/m

-100mL de buffer amoniacal 0,05mol/L, pH=10, con fenantrolina.

2) I) Se coloc en un tubo Falcom (tubo n2) 6mL de suero mediante 6 tomas de 1000L
con micropipeta.

II) Se adicion al tubo n2 1,5mL de cido ascrbico mediante dos tomas de 750L con
micropipeta. Se homogeneiz y dej en reposo por cinco minutos para dar lugar a la reduccin
del Hierro.

III) Se adicion al tubo n2 1,5mL de cido tricloroactico mediante dos tomas de 750L con
micropipeta. Se homogeneiz para precipitar las protenas.
 3) I) Se coloc en otro tubo Falcom (tubo n3) 6mL de suero mediante 6 tomas de 1000L
con micropipeta.

II) Se adicion al tubo n3 1,5mL de cido tricloroactico mediante dos tomas de 750L con
micropipeta. Se homogeneiz para precipitar las protenas.

4) Se someti a los tubos n2 y n3 al siguiente procedimiento:

-Se centrifug la muestra durante 15 minutos a 3000rpm.

-Se obtuvo un sobrenadante con turbidez.

-Se centrifug la muestra durante 15 minutos a 3000rpm.

-Se obtuvo un sobrenadante con turbidez nuevamente.

-Se extrajo el sobrenadante y se lo coloc en un nuevo tubo Falcom.

-Se centrifug la muestra durante 10 minutos a 3000rpm.

-Se obtuvo un sobrenadante turbio.

-Se centrifug la muestra durante 15 minutos a 1000G.

-Se obtuvo un sobrenadante turbio.

-Se centrifug la muestra durante 5 minutos a 2000G.

-Se obtuvo un sobrenadante turbio, con el cual se decidi hacer el experimento.

5) Del tubo n2 se extrajo un sobrenadante y se le llam: muestra 1.

6) I) Del tubo n3 se extrajo un sobrenadante.

II) Se le adicion 1,5mL de cido ascrbico mediante dos tomas de 750L con micropipeta.
III) Se llam a la muestra del tubo n3: blanco.

7) Se tom 10* eppendorf en los cuales se introdujeron reactivos como lo indica la

siguiente matriz:

Eppen Sal de Mohr Agua mQ Muestra 1 Blanco Buffer- fenantrolina

dorf (L) (L) (L) (L) (L)
1 20 80 600 0 300
2 20 80 600 0 300
3 40 60 600 0 300
4 40 60 600 0 300
5 60 40 600 0 300
6 60 40 600 0 300
7 80 20 600 0 300
8 80 20 600 0 300
9 100 0 600 0 300
10 0 100 0 600 300
*debieron ser 11, pero se perdi una de las muestras: el duplicado del eppendorf n9.
 8) Se midi la longitud de onda en la mxima absorbancia de la muestra (510nm).

9) Se registr la absorbancia del blanco: eppendorf n10.

10) Se registr la absorbancia del resto de eppendorfs corregidos al blanco.

Resultados:
-Pico de mxima absorbancia a 510nm

Absorbancia* Hierro patrn

(g/L)
0.838 0.002
0.892 0.002
1.051 0.004
1.097 0.004
1.353 0.006
1.284 0.006
1.579 0.008
1.525 0.008
1.805 0.01

V (mL) del sobrenadante de la muestra 1 = 7 mL

V (mL) del sobrenadante del blanco = 5,5mL

Procesamiento de datos:
Se ajustaron los datos por mtodo de mnimos cuadrados. El producto: una recta que
corresponde al modelo terico de la ley de Beer con un coeficiente de correlacin igual a 0,99.

La pendiente:
117,021428571429 +/-
3,83744118006982

Ordenada en el origen:
0,617214285714286 +/-
0,0235863063746001

La concentracin de
Hierro se despeja de la Ley
de Beer y se multiplica por
los coeficientes de dilucin:
 [Fe srico] = (7ml/6ml)*(1000L/600L)*( 0,617214285714286/117,021428571429)

=0.010255719g/L =1025.571901g/dL

Errores:

ia 7mL= 0.5mL
ia 6mL=0.5mL
ia 1000L= (1)^2*3)^1/2=1.44224957L
ia 600L=1L
ia pendiente=3,83744118006982
ia ordenada en el origen= 3,83744118006982

ia[Fe srico]= [Fe srico]*((0.5/7)^2+(0.5/6)^2+(1.44224957/1000)^2+(1/600)^2+

(3,83744118006982/117,021428571429)^2+(0,0235863063746001/0,617214285714286)^2)^1/2

ia[Fe srico]= 0,001238652g/L = 123.8652 g/dL

[Fe srico]= (1026 124) g/dL

Discusin:
El resultado de Hierro srico bovino fetal fue de (1026 124) g/dL, mientras que los
valores normales en bovinos adultos estn dentro del rango de 89-270 g/dL(ap. B).
Es notable que los valores experimentales sufrieron grandes errores, la siguiente es una lista
de los posibles:

-La precipitacin de protenas fue incompleta. La turbidez de la muestra 1 y el blanco

pudieron afectar a la lectura de absorbancia.
-El material volumtrico de laboratorio no fue calibrado. Los errores de precisin clave estn
estn en las micropipetas y el los tubos Falcom.
-La fenantrolina pudo haber acomplejado a otros minerales trazas presentes en el suero(ap.C).
Los complejos formados pudieron interferir en la lectura de absorbancia; ej: Ca++, Cu++, Hg++,
Zn++, etc.(ap. A)
-Agua no mQ pudo haber llegado a las alcuotas por negligencia del operario; los electrolitos
del agua no mQ formaran complejos con la fenantrolina, interfiriendo en las lecturas.
 Bibliografa:
(1): Gonzlez Hernndez, A. (2010). Principios de bioqumica clnica y patologa molecular.
Barcelona, Espaa: Elsevier Espaa, S.L..
(1A; cap.10. p117)
(1B; cap.10. p118)
(1C; cap.10 p.120)
(1D; cap.10. p120)
(1E; cap. 12 p.140)

(2): Harris, D. C. 3ra edicin (2007). Anlisis qumico cuantitativo. Barcelona, Espaa:
Revert, S.A.
(2A; cap.18. p416)
(2B; apndice F)
(2C; cap.13. p.271-272)
(2D; cap.4 p.88-89)
(2E; apndice I)

(3):Rodak, B. F. 2da edicin. (2004). Hematologa: Fundamentos y aplicaciones clnicas.

Buenos Aires, Argentina: Panamericana.
(3B; cap.16 p.202)
(3A; cap.10. p118)

(4): Skoog, West. 9na edicin. (2014). Fundamentos de qumica analtica. Mxico: CENGAGE
Learning.
(4A; cap19. p.504)

(5): Underwood, E. 4ta edicin (1997). Trace Elements in Human and Animal Nutrition.
Nedlands, Wetern Australia: Academic Press.
(5A, cap. II, p.17)
 Apndice A: Extrado de (2E)

Iones reactivos a Log1 Log2 Log3

fenantrolina
Ca++ 0.7
Cu++ 8.82 15.39 20.41
Hg++ 19.65 23.4
Zn++ 6.3 11.95 17.05
Fe++ 5.86 11.11 21.14

Apndice B: Extrado de (5A)

Apndice C: Extrado de (1E)