Traduccin Capitulo 8 kiernan, mtodos para tejido conectivo (Traduccin por Francisca

Crcamo Ulloa, TM morfofisiopatologia y citodiagnstico USS 2017)

Mtodos para tejido conectivo

Se utiliza una tincin de tejido conectivo para identificar y estudiar los diversos elementos fibrosos
extracelulares de tejidos animales. Las fibras musculares lisas y estriadas, los eritrocitos y los
citoplasmas de otros tipos de clulas tambin se muestran claramente por las mismas tcnicas.
Los ncleos se tien comnmente en la misma seccin, para facilitar la correlacin de la imagen
histolgica multicolor con la apariencia ms familiar obtenida con un mtodo de supervisin tal
como haemalum y eosina. Sin embargo, la sustancia fundamental amorfa del tejido conectivo se
demuestra ms fcilmente mediante mtodos histoqumicos para proteoglicanos (Captulo 11).

Las tcnicas histolgicas para los tejidos conectivos se dividen en tres categoras: las basadas en
mezclas de colorantes aninicos que imparten diferentes colores al colgeno y al citoplasma, los
mtodos para la reticulina (que son de naturaleza histoqumica) y una variedad de mtodos para
la elastina.

8.1 Colgeno, reticulina y elastina

Los dos principales tipos de fibras que se encuentran en el tejido conectivo son el colgeno y la
elastina. Aparte de sus caractersticas morfolgicas (para las cuales se consulta un libro de texto de
histologa), estas fibras tienen ciertas propiedades fsicas y qumicas que les permiten ser teidos
selectivamente.

Colgeno

El colgeno es una familia de glicoprotenas bsicas que contienen altas proporciones de glicina,
Hidroxiprolina y prolina. Otro aminocido, la hidroxilisina, aunque presente en c antidades ms
pequeas, se encuentra slo en el colgeno. La conformacin del molecular de colgeno se
mantiene por enlace de hidrgeno entre grupos peptdicos (como en todas las proteininas) y las
cadenas peptdicas se unen entre s mediante diversos tipos de enlace covalente formados por
condensacin de hidroxilisina con lisina (vase Bailey, 2003). Esto da lugar a la formacin de
cables, cada uno de los cuales consiste en una triple hlice de hebras de polipptido. Los
componentes de carbohidratos son en su mayor parte residuos de a-D-glucosilo y a-D-galactosilo,
unidos principalmente a hidroxilisina. Las hlices triples estn unidas de extremo a extremo y de
lado a lado por enlaces de hidrgeno, atracciones electrostticas, visibles en el microscopio
electrnico como fibrillas de colgeno (ver Kuhn, 1987, Kucharz, 1992). Las fibras de colgeno
vistas con el microscopio ptico son haces de fibrillas alineadas.

Una fibra de colgeno es birrefringente, principalmente debido a la alineacin paralela de sus

molculas de protena sustitutivas, y tal vez en parte tambin debido a la disposicin de
macromolculas de carbohidratos asociadas con las fibras (Kiraly et al., 1997). Por lo tanto, es
posible ver las fibras de colgeno mediante el examen de secciones sin manchas en un
microscopio con polares cruzados. Aparecen como lneas brillantes sobre un fondo oscuro. Ciertos
mtodos de tincin, notablemente rojo picro-sirius, aumentan notablemente la birrefringencia de
las fibras de colgeno.

Aproximadamente 20 tipos de colgeno, identificados por nmeros romanos, se reconocen en

base a secuencias de aminocidos, propiedades fsicas e inmunolgicas, y ultraestructura
fibrilariana.

Los colgenos comunes de los tejidos de mamferos (Montes y Junqueira, 1991) son los siguientes:

- Tipo I Fibrillas gruesas ensambladas en haces paralelos. Este es el colgeno principal del
hueso, la fascia y los tendones.
- Tipo II Fibras finas; En cartlago hialino.
- Tipo III Fibras finas. Ocurre en piel y msculo, y tambin en membranas basales.
- Tipo IV Las molculas de colgeno forman una red en lugar de fibrillas. En consecuencia, el
colgeno tipo IV no es birrefringente. Este es el colgeno principal de todas las
membranas basales, donde est ntimamente asociado con otra protena, laminina, y un
glucosaminoglicano, sulfato de heparn.

Para obtener informacin sobre otros tipos de colgeno, vase Mayne y Burgeson (1987),
Kornblihtt y Gutman (1988) y Ricard-Blum et al. (2000).

Como glicoprotena, el colgeno se tie, aunque no fuertemente, por el mtodo peridico cido-
Schiff (Captulo 11). Mediante el uso de reactivos que son ms sensibles que los de Schiff es
posible detectar grupos de aldehdo libre en colgeno (Davis y Janis, 1966). Estos pueden surgir de
la desaminacin oxidativa de las cadenas laterales de la lisina, como en la elastina inmadura (vase
ms adelante).

El trmino reticulina incluye las membranas basales de epitelios y capilares sanguneos y fibras
muy finas (incluidas las inmaduras) que contienen principalmente colgeno Tipo III. Ambos tipos
de reticulina contienen ms carbohidratos que el colgeno ordinario. En el microscopio
electrnico, la fibrilla reticular muestra el patrn de bandas caracterstico del colgeno. Los
mtodos de tincin de la reticulina demuestran probablemente una matriz que contiene
carbohidratos en la que las fibrillas colgenas estn incrustadas, en lugar de las mismas fibrillas
(Puchtler y Waldrop, 1978).

Elastina:
Alrededor del 90% del volumen de las fibras elsticas y las lminas elsticas consiste en elastina,
una protena diferente del colgeno y la reticulina. El 10% restante es una glicoprotena que forma
microfibrillas dentro de la matriz de elastina en gran parte amorfa (Franzblau y Faris, 1981;
Chadwicke y Goode, 1995).

Las fibras de oxialano, presentes alrededor de las races de los dientes, son estructuras atpicas
que contienen elastina en las que las microfibrillas estn predestinadas (Seccin 8.4.3).
La elastina es una protena hidrfoba, rica en glicina, alanina y valina. Contiene notablemente
pocos aminocidos con cadenas laterales que pueden formar iones. Las hebras de pptido de
elastina no forman fibrillas, sino que se unen mediante enlaces desmosina e isodesmosina para
formar un material con un aspecto predominantemente amorfo en el microscopio electrnico. Un
puente de desmosina se forma a partir de cuatro cadenas laterales de lisina (vase Bailey, 2003).
Tres de ellos son desaminados oxidativamente para dar aldehdos, que luego se unen, junto con
una cadena lateral de lisina no oxidada, para formar un anillo aromtico similar al de la piridina:

En elastina inmadura, la formacin de desmosina es incompleta y los aldehdos libres pueden ser
detectados histoqumicamente (Nakao y Angrist, 1968; MacCallum, 1973). La elastina es resistente
a la digestin por la mayora de las enzimas proteolticas. Con mtodos de tincin ordinarios es
acidfilo pero contrasta mal con otros componentes del tejido. Las fibras y lminas elsticas son
autofluorescentes (excitacin ultravioleta o azul), y se observan comnmente en secciones
examinadas por microscopa de fluorescencia para otros fines. Tambin contienen iones de
magnesio y pueden teirse con reactivos que forman complejos fluorescentes o de color con Mg2
+ (Muller y Firsching, 1991), pero este mtodo no es de uso general. Los mtodos de tincin
habituales para la elastina hacen uso de colorantes que son preferentemente retenidos en el
entorno hidrfobo del material.

Traduccion Kiernan por Francisca Crcamo Ulloa

8.2. Mtodos usando colorantes aninicos
Numerosas tcnicas estn disponibles para la tincin con mezclas de tintes, pero la mayora son
variantes de uno de los dos grupos principales. En el primer grupo, tipificado por el mtodo de van
Gieson, una mezcla de dos tintes aninicos imparte un color al colgeno y otro al citoplasma,
incluyendo el de las fibras musculares y los eritrocitos. El segundo grupo abarca los
procedimientos tricrmicos en los que se usan dos, tres, o raramente cuatro tintes aninicos en
combinacin con cido fosfotungstico o fosfomolibdico. El colgeno, el citoplasma (del msculo y
la mayora de las dems clulas) y los eritrocitos estn todos dife - rentemente coloreados, y otros
elementos como el cartlago, la fibrina y los grnulos secretorios tambin adquieren colores
caractersticos.

Mtodo de van Gieson: principios

Despus de una tincin nuclear negra con una hierro-hematoxilina, las secciones se sumergen en
una solucin de fuchsina cida en una solucin acuosa picrica saturada o casi saturada.

El colgeno se tie de rojo (fuchsine cido), y el citoplasma es amarillo. En tcnicas relacionadas,

otro colorante aninico (ms frecuentemente anilina azul o sirius rojo F3B) se sustituye por cido
fuchsina y ocasionalmente se usa un tercer colorante, ya sea como un paso adicional o mezclado
con los otros dos.

En todos estos mtodos, la mezcla de colorantes aninicos es muy fuertemente cido, con un pH
de 1,0-2,0 (vase Lillie y Fullmer, 1976, Clark, 1981, para ms detalles). Otras manchas nucleares
resistentes a los cidos pueden reemplazar a la hierro-hematoxilina (Captulo 6).

Una mezcla de picro-fuchsina tambin se puede aplicar como contra-tincin despus de cualquier
otro mtodo histolgico o histoqumico que produzca productos resistentes al cido con colores
contrastantes. Por ejemplo, funciona bien despus de los mtodos de reduccin de plata (Captulo
18). Es fcil manchar un gran nmero de secciones por el mtodo de Van Gieson y sus
modificaciones. Estas son excelentes manchas micro-anatmicas, pero no revelan muchos detalles
dentro del citoplasma teido con palidez.

La coloracin diferencial del colgeno y del citoplasma se puede obtener con muchos otros pares
de tintes; El colgeno est siempre manchado por las partculas coloreadas ms grandes mientras
que los iones ms pequeos del tinte manchan el citoplasma; La separacin del peso inico es
mayor que 200 en pares de tintes que dan tincin selectiva de colgeno y citoplasma (Horobin y
Flemming, 1988). Ahora se discutirn los mecanismos fsicos y qumicos que contribuyen a la
selectividad de estos mtodos de tincin tcnicamente sencillos.

El teido diferencial no puede ser explicado simplemente. Se debe en parte a las propiedades
fsicas del colgeno y del citoplasma, en parte a las diferentes maneras en que los iones de
colorante grandes y pequeos se unen a los sustratos, y en parte a las diferencias en la
composicin de aminocidos del colgeno y las protenas citoplsmicas. Diferentes observaciones
y experimentos indican que cada uno de estos tres mecanismos es esencial. Debe concluirse que
todos son operativos, aunque no pueden contribuir igualmente al efecto de tincin resultante.

Baker (1958) revis estudios anteriores que explicaron la tincin diferencial de este tipo
enteramente sobre la base de los diferentes tamaos de los aniones de los tintes utilizados.
Sugiri que cuando dos tintes aninicos se aplicaran simultneamente a una seccin, existira
competencia entre ellos para los sitios de unin catinicos sobre las molculas protenicas del
tejido. El colorante con iones ms pequeos y de difusin ms rpida penetrara rpidamente en
una matriz proteica fuertemente tejida. All ocupara los sitios de unin (se supone que son grupos
protonados de amino y guanidino de protena) y excluye el colorante cuyas partculas eran
mayores. Sin embargo, este ltimo tinte entrara en el componente de tejido flojo, de textura floja
y ms fcilmente permeable, de colgeno. Puede que no se adhiera inmediatamente a los grupos
catinicos en el colgeno, porque estos ya estaran ocupados por los aniones del primer colorante
que se difunde ms rpidamente. Sin embargo, los iones de colorante ms grandes tienen una
mayor afinidad por su sustrato debido a su tamao (Horobin y Flemming, 1988) y su mayor
nmero de grupos de cido sulfnico cargado negativamente (Reid etai, 1993), por lo que
compiten satisfactoriamente contra los ms pequeos Tinte. Adems, cuando la seccin se lava en
agua o alcohol, los iones de tinte pequeos son los primeros en abandonar el tejido, debido a su
menor tamao y menor afinidad, y se puede esperar que se difundan primero de las regiones ms
porosas. En consecuencia, slo los iones de colorante ms grandes permanecen unidos a los sitios
de unin catinicos vacos. Las pruebas tempranas en apoyo de la hiptesis de permeabilidad y
difusin procedan de experimentos en los que los geles de gelatina estaban teidos por mezclas
de eosina Y (peso inico 646) y azul de metilo (peso inico 754, con tendencia a formar
agregados). Los geles concentrados estaban coloreados de rojo por la eosina y los diluidos azules
por el azul de metilo (vase Mann, 1902, Baker, 1958).

Se supone en esta hiptesis que el citoplasma fijo es de alguna manera menos poroso a los iones
de tinte que el colgeno fijo, aunque no hay evidencia ms que la derivada del comportamiento de
los tintes para apoyar o refutar tal asercin. En una variante del mtodo de Van Gieson (ver Lillie y
Fullmer, 1976) las secciones se tien con FCF verde rpido, un colorante con iones ms grandes
que el cido picrico o la fuchsina cida, antes de la inmersin en la mezcla de van Gieson. Colgeno
es de color rojo, eritrocitos verde, y el citoplasma del msculo verde amarillento. De la hiptesis
de Baker, se podra haber esperado colgeno verde, eritrocitos amarillos y probablemente
msculo rojo. (Se podra argumentar, despus de saber el resultado, que los tintes de van Gieson
desplazan el FCF verde rpido de todas las partes del tejido excepto los eritrocitos manchados,
que tienen una textura tan densa que no pueden ser penetrados ni siquiera por iones picrato).
Otro paradjico La observacin es an ms fcil de hacer. Cuando las secciones se tien slo con la
mezcla de van Gieson (sin tincin nuclear previa), los ncleos son de color amarillo por el cido
picrico. Sin embargo, el mtodo de eosina-metil azul de Mann da ncleos azules (Captulo 6). As,
con un par de tintes, los ncleos de las clulas muestran afinidad por los aniones ms pequeos, y
con otro par toman los aniones ms grandes. Estas observaciones no pueden ser explicadas por
argumentos basados nicamente en el control de la tincin por diferentes velocidades de difusin
y unin al tinte en diferentes partes del tejido.

Lillie (1964) busc una explicacin qumica para el teido diferencial de colgeno y citoplasma. l
someti las secciones a varios pretratamientos antes de la tincin y encontr que:

a. El tratamiento con cido nitroso aboli toda la tincin por colorantes aninicos ordinarios
tales como eosina y biebrich escarlata, pero no impidi la coloracin roja del colgeno por
el mtodo de Van Gieson y algunos procedimientos similares. (El cido nitroso elimina los
grupos amino: -NH2 es probablemente reemplazado por -OH, vase el captulo 10.)

b. El tratamiento con una mezcla de anhdrido actico, cido actico y cido sulfrico elimin
toda la acidofilia, incluyendo la afinidad del colgeno por la fuchsina cida en la mezcla de
van Gieson. Las estructuras anteriormente acidfilas se convirtieron en basfilos, una
propiedad atribuible a la formacin de grupos -NHSO3 con aminas primarias y de grupos -
0S03 con -OH (Captulo 10). Estos cambios podran ser invertidos por hidrlisis
(eliminacin) de los steres de sulfato en una mezcla de metanol y cido sulfrico.

Los reactivos utilizados para la desaminacin y la acetilacin-sulfatacin tienen pequeas

molculas y se puede suponer razonablemente que atacan cualquier parte del tejido que sea
accesible a los iones cidos de fuchsina. Como mecanismo de la tincin del colgeno, Lillie (1964)
sugiri tentativamente la atraccin inica entre los grupos sulfonato de colorante y las cadenas
laterales de arginina (que no estn afectadas por el cido nitroso) y la unin de hidrgeno de
grupos hidroxi de serina, treonina e hidroxilisina A los tomos de nitrgeno del colorante. Su
argumento fue apoyado por Puchtler y Sweat (1964a), quienes encontraron que muchos
colorantes directos de algodn eran sustitutos efectivos de la fuchsina cida en mezclas del tipo
van Gieson. Tales colorantes se unen a la celulosa ya otros materiales mediante mecanismos no
inicos, aunque la aparicin de enlaces de hidrgeno entre tintes y sustratos en un medio acuoso
es cuestionable (Captulo 5 y Horobin, 1982). La adsorcin simple de los colorantes podra explicar
su concentracin en el colgeno, y las molculas de colorante y de protena estrechamente unidas
son probablemente unidas por fuerzas de van der Waals e interacciones hidrofbicas (Puchtler,
Meloan y Waldrop, 1988). Prento (1993, 2001) atribuy la tincin de colgeno en gran medida al
enlace de hidrgeno, ya que podra ser bloqueado aadiendo urea a la mezcla de colorantes, pero
no mediante tratamiento previo o simultneo con dodeclatos de sodio (SDS), lo que suprime las
interacciones hidrfobas entre molculas grandes. Ecules

Tambin hay pruebas de que las atracciones inicas contribuyen significativamente a la tincin del
colgeno. Junqueira et al. (1979) descubrieron que la desaminacin con cido nitroso redujo en
aproximadamente 30% la cantidad de sirius rojo F3B absorbida por el colgeno drmico de una
solucin del colorante en cido picrico. Esto aparentemente no est de acuerdo con la observacin
de Lillie (1964) citada anteriormente. Es posible que la absorcin del colorante no se haya
reducido lo suficiente como para causar una tincin cualitativamente menos intensa del colgeno.
Sin embargo, Nielsen et al. (1998) observaron que la destruccin oxidativa de las cadenas laterales
de aminocidos bsicos redujo en gran medida la intensidad de la tincin de colgeno, y Prento
(1993) observ una supresin moderada tanto del colgeno como de la tincin citoplsmica por el
mtodo van Gieson en presencia de aniones sulfato o fosfotungstate, Que se pensaba compiten
con tintes aninicos para sitios de unin catinicos.

La tincin del citoplasma y eritrocitos por el cido pcrico ha recibido menos atencin que la
tincin del colgeno por la fuchsina cida. El tamao molecular es significativo porque otros tintes
con molculas pequeas, como el amarillo de Martius y la tartrazina, se utilizan como manchas
citoplsmicas en otras tcnicas; Estos colorantes no tienen grupos capaces de formar enlaces de
hidrgeno (Horobin y Hemming 1988; Dapson, 2005a). El componente amarillo de la tincin de
van Gieson es evitado por SDS, lo que indica que la interaccin hidrfoba es un factor importante
que sirve para retener el cido pcrico en el citoplasma (Prento, 1993).

Este es el mtodo ms simple de su tipo, y funciona bien despus de cualquier fijador, pero no
demuestra las fibras de colgeno ms delgadas. El agua utilizada para enjuagar despus de la
aplicacin de la mancha van Gieson (o mezclas similares) est ligeramente acidificada. Esto
asegura que los grupos amino de la protena sern protonados, minimizando de ese modo la
extraccin de aniones de tinte unidos del tejido.

Soluciones requeridas

A. Hematoxilina ferrica o de Weigert

Esto se hace a partir de dos soluciones comunes, que se pueden guardar durante 3-5 aos. La
modificacin de Lillie de la hematoxilina de hierro de Weigert (Captulo 6) puede ser utilizada en
su lugar. Vase la Nota 2 a continuacin para dos alternativas a la hierro-hematoxilina.

Solucin A

Hematoxilina (C.I. 75290): 5 g

Etanol al 95%: 500 ml

Solucin B.

Cloruro frrico (FeCl _ {3} 6H _ {2} O): 5,8 g

Agua: 495 ml

cido clorhdrico concentrado: 5 ml

Solucin de trabajo

Mezcle volmenes iguales de A y B. Coloque A en el recipiente de tincin o el tanque primero para

una mezcla ms rpida. La mezcla debe hacerse justo antes de usar. Puede ser reutilizado muchas
veces, y puede mantenerse durante 2 das a temperatura ambiente o durante 10-14 das a 4C. Las
soluciones ms antiguas tien los ncleos marrones o gris azulado en lugar de negros.

B. Van Gieson solucin:

Fucsina cida (Cl 42685): 0,5 g

Acido acuoso saturado acuoso: 500 ml

Opcionalmente, aadir 2,5 ml de cido clorhdrico concentrado (vase la Nota 3 ms adelante).

Esta mezcla puede ser reutilizada muchas veces, y conserva su poder de tincin por ms de 5 aos.

C. Agua acidificada

Aadir 5 ml de cido actico (glacial) a 1 l de agua (gotear o destilar).

Procedimiento

1. Secciones de parafina de cera y hidrato.

2. Mancha en solucin de trabajo de la hematoxilina de Weigert durante 5 min (puede
necesitar 10 min si la solucin tiene ms de 4 o 5 das de edad).
3. Lavar con agua corriente del grifo. Compruebe la seccin hmeda con un microscopio
para asegurar que los ncleos se tien selectivamente. (Vase la Nota 1 a continuacin).
4. Mancha en solucin de van Gieson, 2-5 min. El tiempo no es crtico.
5. Lavar en dos cambios de agua acidificada.
6. Deshidrate rpidamente en tres cambios de etanol al 100%. Esta etapa tambin diferencia
el cido pcrico.
7. Limpiar en xileno y montar en un medio resinoso (ver Nota 4 a continuacin).

Resultado

Ncleos negros. Colgeno rojo. Citoplasma (especialmente msculo liso y estriado), queratina y
eritrocitos amarillos.
Notas

a) Si no se obtiene una tincin nuclear selectiva, se necesitarn medidas correctivas. Vea la

explicacin ms detallada de la tincin nuclear de hierro-hematoxilina en el Captulo 6.
b) Una tincin nuclear alternativa es el hierro-alum-cromoxano cianina R (Captulo 6). Si se
utiliza, los ncleos sern de color azul o azul verdoso.

Se obtiene una gama ms amplia de colores si se reemplaza la Etapa 2 por una tincin de 5
min en azul de toluidina (Captulo 6), seguido de lavado en agua e insolubi - lizacin del
colorante por inmersin de los portaobjetos durante 5 min en 5 % Molibdato de amonio
acuoso. Los ncleos azules de toluidina y el ARN azul citoplsmico; Cartlago, grnulos de
mastocitos y otros materiales metacromticos rojo-morado. Se forma un color verde en
los citoplasmas de muchas clulas epiteliales y secretoras, presumiblemente como
consecuencia de la tincin tanto por los tintes azules como amarillos.

c) Debido a los contenidos variables de colorante de diferentes lotes de fuchsina cida, una
mezcla de van Gieson puede actuar de manera insatisfactoria. Esto no debe ser un
problema con lotes certificados del colorante, que han sido probados en la tcnica de van
Gieson y otras (Penney et al., 2002).

Si las secciones teidas son demasiado rojas (por ejemplo, fibras de msculo naranja),
aadir 2,5 ml de cido clorhdrico concentrado a los 500 ml de la mezcla de van Gieson
(Solucin B anterior). Esto casi siempre corrige los colores, pero si el rojo es todava
excesivo tirar alrededor de un cuarto de la mezcla y completar los tres trimestres restantes
con el volumen original con cido picrico acuoso saturado. Si el rojo es demasiado dbil
(coloracin inadecuada del colgeno), agregue otros 0.1 g de fuchsine cido. Una vez que
la mezcla ha sido ajustada para dar una tincin correcta, conservar sus propiedades
durante varios aos.

d) La fuchsina cida y la fuchsina bsica tienen reputacin inmerecida de desvanecimiento.

En mi experiencia las secciones manchadas por los mtodos de tricromo de Van Gieson y
Cajal no muestran deterioro despus de 15-20 aos. Posiblemente los colorantes se
desvanecen en las preparaciones montadas en el blsamo canadiense, que contiene
sustancias reductoras y cidas (aunque no acuosas) (Captulo 4, y tambin Lillie y Fullmer,
1976).

8.2.4 Mtodos tricrmicos: principios

El nombre tricrmico identifica tcnicas de tincin en las que se utilizan dos o ms tintes aninicos
junto con un heteropolicido: cido fosfomolbdico o cido fosfotngstico. Estos cidos son
compuestos cristalinos solubles en agua y en alcohol.

Pueden incluirse en soluciones de colorantes o aplicarse a las secciones secuencialmente, entre

tratamientos con diferentes colorantes. Cualquiera que sea la tcnica empleada, el resultado es
una coloracin selectiva del colgeno por uno de los colorantes. El cartlago y algunas secreciones
mucosas adquieren el mismo color que el colgeno, pero su intensidad de tincin suele ser menor.
Si se aplica otro colorante, mancha ncleos, citoplasma y eritrocitos.

Si se utilizan otros dos colorantes, uno imparte su color a los eritrocitos y el otro tie los
citoplasmas de otros tipos de clulas y tambin los ncleos celulares. Los grnulos secretores se
tien de diversas maneras: a veces del mismo color que el colgeno, a veces del mismo color que
los ncleos o eritrocitos.

Las tcnicas tricrmicas revelan fibras colgenas y reticulares, membranas basales

Y los grnulos secretores, tpicamente con un color ms fuerte y una mayor claridad de lo que es
posible con el mtodo de van Gieson. Con la mayora de las tcnicas de tricromo la tincin es lo
suficientemente intensa como para oscurecer el detalle estructural en secciones de ms de 5 pm
de espesor, van Gieson y otros mtodos de dos tintes funcionan bien en secciones tan gruesas
como 15 pm.

8.2.4.1. Los heteropolicidos y sus efectos sobre la tincin

El cido fosfomolbdico (PMA) y el cido fosfotngstico (PTA) se conocen como heteropolicidos.

Se forman mediante la coordinacin de iones molibdato o tungstato con cido fosfrico. Se

venden como cristales hidratados, que son libremente solubles en agua para dar soluciones
fuertemente cidas:

El nmero de oxidacin de Mo y W en estos compuestos es +6.

Los heteropolicidos son descompuestos por lcalis para dar molibdato o tungstato (W042-) y
iones fosfato dibsico. En soluciones acuosas, PTA forma aniones complejos, [P04 (W03) | 2] 3-
como se muestra arriba, pero estos se descomponen si el pH aumenta por encima de 2,0, para dar
[(PO5) 2 (WO3) Y [P06 (\ NO ^) u] 7 ~ (Rieck, 1967). Los pesos inicos de estos aniones inorgnicos
(2877, 4163 y 2677 respectivamente) son todos mayores que los de los colorantes; El ms grande
de 436 iones de colorante revisado por Dapson (2005a) pes en 1681. Los iones heteropolicidos
tienen estructuras aproximadamente esfricas; Diferentes de los grandes aniones de colorantes
directos de algodn, que pueden asumir configuraciones planas.

Los heteropolicidos son capaces de unirse a los tejidos a partir de soluciones acuosas o
alcohlicas.

Baker (1958) los llam 'colorantes aninicos incoloros'. Los sitios de unin de PMA son Fcilmente
demostrado por el tratamiento subsiguiente de las secciones con ultravioleta

Radiacin o un agente reductor qumico tal como cloruro estannoso. Una mezcla azul

De xidos insolubles de Mo (V) y Mo (VI), con composiciones tales como MoO2 (0H) y Mo02 5
(OH) o.5. Se conoce como azul de molibdeno. Tambin se puede producir un azul de tungsteno
correspondiente, pero de color menos intenso, formulado como W027. Los sitios de unin de PTA
a los tejidos han sido estudiados bajo el microscopio electrnico, con el cual los depsitos que
contienen electrones de tungsteno pueden ser localizados con precisin.

(1) Los estudios qumicos indican que la PTA se une a protenas y aminocidos, pero no a los
carbohidratos. Ambos heteropolicidos se utilizan como precipitantes para protenas, aminocidos
y alcaloides. Los aniones heteropolicidos se mantienen por atraccin inica a grupos amino y
guanidino protonados de protenas.

(2) Aplicada a pH <1,5, la PTA imparte densidad de electrones a estructuras que contienen
carbohidratos, pero a pH> 1,5 se une a protenas. PTA puede oxidar grupos hidroxilo carbohidrato
a aldehdos, por lo que los depsitos densos de electrones resultantes de tincin a pH <1,5 pueden
ser compuestos insolubles en los que el estado de oxidacin del tungsteno es menor que +6.

(3) Las fibras de colgeno unen grandes cantidades de PMA. El citoplasma se une a cantidades ms
pequeas. Los ncleos de clulas tienen muy poca afinidad por PMA. PTA se comporta de manera
similar.

(4) La afinidad para PMA y PTA se deprime o se suprime si los grupos amino en el tejido

Se eliminan primero por tratamiento con cido nitroso o se esterifican mediante reaccin con
anhdrido actico o cloruro de benzolo. En microscopa ptica no hay evidencia de unin de PMA
o PTA a carbohidratos oa grupos hidroxilo de aminocidos.

(5) La metilacin de las secciones da como resultado una unin aumentada de PMA a todas las
partes del tejido, incluyendo eritrocitos. Los agentes metilantes aaden grupos metilo a tomos de
nitrgeno amina (aumentando su basicidad) ya tomos de oxgeno hidroxilo (formando teres o
glucsidos).

(6) Las estructuras que se han unido a PMA o PTA se pueden teir mediante colorantes catinicos.

Este cambio se explota en la variante de Twort de Monroe y Frommer (1967) (vase el captulo 6,
seccin 6.4.2).]

(7) El tratamiento con PMA o PTA afecta la capacidad de tincin mediante colorantes aninicos.
Los efectos son

variable:

(A) Hay una supresin considerable de la tincin de todas las partes del tejido por algunos
colorantes aninicos, incluyendo aquellos con molculas pequeas, tales como cido pcrico,
amarillo Martius, eosina, naranja G y escarlata biebrich. La cantidad de supresin es mayor en el
colgeno que en el citoplasma.

(B) Hay una supresin similar de tincin citoplsmica por colorantes que tienen molculas grandes,
incluyendo azul de anilina, SF verde claro, FCF verde rpido y fuchsina cida, pero el colgeno se
tie con slo ligeramente reducida intensidad por estos colorantes despus del tratamiento de las
secciones Con un heteropolicido.

(C) El tratamiento de secciones con PMA o PTA antes o al mismo tiempo que la tincin con azul
anilina, SF verde claro o FCF verde rpido tiene el efecto de impedir la unin de estos colorantes a
materiales distintos del colgeno, matriz de cartlago, Y ciertos productos secretores que
contienen carbohidratos.

D) Si las secciones se tratan con PTA, se tien con azul de anilina y despus se exponen a urea 6 M,
un reactivo que altera los enlaces de hidrgeno, se elimina el colorante, pero el PTA permanece
unido al colgeno en el tejido.

Sin embargo, el tratamiento con urea no puede ser una prueba especfica para la unin de
hidrgeno.

(E) La congelacin y descongelacin antes de la fijacin de un tejido cambia los colores impartidos
por los mtodos de tincin con tricromo, de manera que los citoplasmas de algunas clulas son
teidos atpicamente por el colorante con las molculas ms grandes.

8.2.4.2. Cmo funcionan los mtodos tricromticos?

Se han propuesto tres hiptesis para explicar la coloracin diferencial de los tejidos por los
colorantes aninicos utilizados en asociacin con los heteropolicidos.

En la primera teora, defendida por Baker (1958) y confirmada por Horobin (1982, 1988) como un
ejemplo de tincin controlada por la velocidad, se sostiene que los aniones de los colorantes y de
los heteropolicidos compiten entre s por la tincin catinica Y que las texturas de los diversos
componentes estructurales de un tejido determinan su penetracin por molculas de diferente
tamao. Se supone que los aniones PMA y PTA son de tamao intermedio entre los de los
colorantes generalmente usados como manchas citoplasmticas y los que manchan colgeno. Los
iones de colorantes grandes existen en solucin como agregados, por lo que esta es una
suposicin razonable a pesar de que los pesos inicos de PMA y PTA son mayores que los de los
iones de colorantes grandes. Los aniones de tinte ms pequeos entraran y se uniran a la red
supuestamente densa de hemoglobina y otras molculas de protena que forman el estroma de
los eritrocitos, que no seran penetradas por el heteropolicido.
La fibra de colgeno se considera ms porosa y capaz de acomodar los iones de PMA o PTA y los
de un colorante con molculas grandes tales como SF anilina o verde claro. Los iones de tinte
pequeos tambin podran penetrar las fibras de colgeno, pero, debido a que difunden
rpidamente, entraran y saldran libremente. Las partculas ms grandes y ms lentamente
difusoras de los heteropoliadatos y de tales colorantes como azul anilina permaneceran en el
colgeno y se uniran a sitios catinicos all. Los colorantes con molculas de tamao intermedio
(por ejemplo, fuchsina cida) competiran con PMA o PTA para sitios de unin en el citoplasma de
fibras musculares y otras clulas. Estas molculas de colorante seran demasiado grandes para
introducir eritrocitos en presencia de colorantes con molculas pequeas, pero seran lo
suficientemente pequeas como para escapar de las fibras de colgeno ms rpidamente que las
molculas de colorantes ms grandes. Bulmer (1962) demostr que los heteropolicidos estaban
unidos a los tejidos slo cuando estos ltimos contenan grupos amino protonados, pero estaban
de acuerdo con Baker (1958) en atribuir los efectos de tincin del tricromo a la permeabilidad
diferencial del citoplasma y el colgeno a molculas grandes y pequeas.

Un mecanismo similar postulado se discuti anteriormente en relacin con la tincin diferencial de

citoplasma y colgeno en Van Gieson y mtodos relacionados.

Las objeciones planteadas tambin se aplican a la aplicacin de esta hiptesis a las tcnicas
tricrmicas. Adems, es difcil, en trminos de esta teora, explicar el hecho

Que el tratamiento con heteropolicidos induce basofilia, as como afinidad selectiva aunque
deprimida por ciertos colorantes aninicos, en el colgeno. El control de la tincin por diferentes
velocidades de difusin recibe cierto apoyo de la tincin atpica de las clulas por colorantes de
alto peso molecular en especmenes previamente congelados y descongelados (Allison y Tanswell,
1993). Se puede esperar que pequeos agujeros hechos por cristales de hielo provoquen una
mayor porosidad en el citoplasma.

La segunda hiptesis es adecuada para la basofilia producida por el tratamiento del colgeno con
PMA o PTA. Puchtler e Isler (1958) propusieron que los tintes catinicos fueran atrados por los
grupos libres cargados negativamente de los iones del heteropolicido unidos a colgeno. Por
ejemplo:

As, una funcin similar a la de un mordiente clsico (Captulo 5) se atribuye al heteropolicido.

Puchtler e Isler sealaron que los tintes utilizados para colorear el colgeno en las tcnicas
tricrmicas eran todos anfteros. Sugirieron que estos colorantes estaban unidos por fuerzas
inicas a la PMA o PTA, la cual estaba por s misma unida electrovalentemente a grupos amino y
guanidino protonados de colgeno. Las manchas citoplasmticas utilizadas en las tcnicas
tricrmicas son tintes totalmente aninicos, por lo que no se uniran a los sitios libres cargados
negativamente de las molculas heteropoliadidas unidas.

Se pueden hacer varias objeciones a esta hiptesis. La tincin del colgeno se atribuye

A su contenido de aminocidos con cadenas laterales bsicas: lisina, arginina e histidina.

La hemoglobina, la protena principal de los eritrocitos, tiene una mayor proporcin de estos
aminocidos bsicos que el colgeno, pero los eritrocitos no se tien de manera similar en los
procedimientos tricrmicos. Se espera que el mordiente clsico por PMA o PTA resulte en una
intensificacin de la tincin por medio de colorantes anfteros: dos molculas de colorante se
unirn a cada uno de los aniones unidos (trivalentes) del heteropolicido.

Sin embargo, todos los investigadores estn de acuerdo en que el pretratamiento con PMA o PTA

Reduce la intensidad de la tincin con colorantes de anilina azul y similares, incluso en colgeno
(Baker, 1958). La matriz del cartlago y los grnulos de los mastocitos, aunque estn compuestos
de proteoglicanos fuertemente cidos (captulo 11), no son generalmente manchados
fuertemente por tintes anfotricos tales como fuchsina cida y anilina azul, por lo que estos
colorantes no se comportan como si fueran Catinico. Por ltimo, el efecto de la urea 6 M en las
secciones tricromescadas indica que el colorante est unido al colgeno por fuerzas no inicas,
mientras que el heteropolicido se mantiene en su lugar por una fuerza diferente y ms fuerte,
probablemente la atraccin inica propuesta por Puchtler e Isler (1958) .

Everett y Miller (1974) ofrecieron una tercera explicacin de las acciones de la PMA y la PTA en los
tricromas, que proporcionaron evidencia de dos modos diferentes de unin de estos cidos a los
tejidos. Se cree que la atraccin inica de los iones heteropolicidos a protenas citoplsmicas
inhibe all la unin de colorantes aninicos. Se crea que la unin de los heteropolicidos al
colgeno era no inica, de modo que no se evitaba la tincin con colorantes aninicos. Las
objeciones principales a esta hiptesis son que no tiene en cuenta ni el hecho de que la PMA no
puede ser eliminado del colgeno por 6 M de urea o el hecho de que la tincin del colgeno
despus del tratamiento con PMA o PTA puede ser efectuada por algunos colorantes aninicos
pero no por otros.

En resumen, hay muchas pruebas que apoyan la idea de que la mancha de los tejidos

Est determinada por las velocidades de difusin dentro de partes del tejido que son permeables
de manera diferente a aniones grandes y pequeos, pero este mecanismo propuesto no explica
cmo los tintes y la PMA o PTA estn unidos al citoplasma y al colgeno.

El segundo y el tercero de los mecanismos postulados no pueden explicar por completo la tincin
diferencial obtenida con los mtodos tricrmicos, pero arrojan algo de luz sobre la accin de los
heteropolicidos, que evidentemente se mantienen a las protenas tisulares por atraccin
electrosttica, Colorantes al colgeno, lo que parece ser por medio de fuerzas no inicas, que
pueden incluir enlaces de hidrgeno y fuerzas de van der Waals.

8.2.5. Cinco mtodos tricrmicos: instrucciones

Las tcnicas de Masson, Mallory y Heidenhain se realizan por etapas. Esto permite cierto control
de la intensidad del color en el citoplasma y el colgeno. Dos procedimientos de un solo paso
(Cason y Gabe) tambin se describen aqu. Son tcnicamente ms simples que los tricromos
clsicos, pero no siempre funcionan tan bien. Vase Luna (1968),

Gabe (1976), Clark (1981) y Bancroft and Gamble (2002) para obtener instrucciones tcnicas
detalladas para estos y otros mtodos tricrmicos.

El fijador para tejidos que deben ser teidos por cualquier mtodo tricrmico

No debe ser una simple solucin de formaldehdo sin otros ingredientes activos, y no debe
containglutaraldehyde. No se recomiendan fijadores no acuosos. Las mezclas que contienen
mercurio como SUSA dan excelentes resultados, y Bouin tambin es satisfactoria. Si ha utilizado un
fijador que contenga mercurio, no olvide tratar las secciones con yodo y tiosulfato antes de teir
(Captulo 4, Seccin 4.4.1). Segn Churukian et al.

(2000), el zinc-formalina (Captulo 2) es tambin un fijador satisfactorio para la tincin con

tricromo.

Las propiedades de tincin del tejido fijado con formaldehdo neutro, especialmente del
citoplasma, se pueden mejorar sumergiendo secciones de parafina hidratada durante la noche en
soluciones fijadoras

Tales como Bouin, Zenker o zinc-formalina, ya sea durante la noche a temperatura ambiente o
durante 10-15 minutos a 55-60C. El cido pcrico acuoso saturado es tan eficaz como Bouin
(observaciones no publicadas). Yu y Chapman (2003) tratados previamente con una solucin de
yodo (0,33% de l2 en 0,67% de Kl acuoso) o un tampn de citrato a pH 4 antes de la tincin por el
mtodo de Masson. Los mecanismos de accin de los pretratamientos que mejoran la tincin
tricrmica necesitan investigacin.

Los ncleos son teidos por el colorante con molculas de tamao intermedio (rojo en los
mtodos que siguen), pero a menudo es deseable teirlos en negro, con una hierro-hematoxilina
(Captulo 6). Esto se hace siempre con la tcnica de Masson. La tincin nuclear previa reduce el
brillo de los colores en el citoplasma y el colgeno, pero a menudo mejora la claridad morfolgica
global de la preparacin teida.

8.2.5.1. Tricromo de Masson

Este es el tricrmico ms simple, ya que slo se utilizan dos tintes aninicos, Despus de teir los
ncleos con hierro-hematoxilina.

Existen muchas variantes de este mtodo, utilizando diferentes colorantes o una solucin de
heteropolicido diferente (ver Nota ms abajo). La siguiente versin es la de Luna (1968).

Soluciones requeridas

A. Yoduro y tiosulfato sdico

Para eliminar los depsitos de mercurio (Captulo 4).

B. cido-alcohol

Puede ser necesario para la diferenciacin de la mancha nuclear.

Etanol (95% 100%): 140 ml

cido clorhdrico concentrado: 1 ml

Agua: para hacer 200 ml

Mezcle antes de usar y use slo una vez.

C. Agua acidificada

Se trata de agua con aproximadamente 5 ml de cido actico glacial aadido a cada litro.

D. La hematoxilina de hierro de Weigert o Lillie

Consulte el Captulo 6.

E. Biebrich escarlata-cido fuchsina

Biebrich escarlata (Cl. 26905): 4,5 g

Fucsina cida (Cl 42685): 0,5 g

Agua: 495 ml

Acido actico glacial: 5 ml

Se mantiene durante varios meses y puede utilizarse repetidamente. Filtrar antes de usar.

F. Solucin PMA - PTA

cido fosfomolbdico (tambin conocido como

cido molibdofosfrico): 5 g

El cido fosfotngstico (tambin conocido como

Tungstofosfrico): 5 g

Agua: 200 ml

Se mantiene durante unos 5 aos, y contina trabajando a pesar de un cambio de color de

amarillo a verde.
G. Rpido FCF verde, 2%

Fast FCF verde (C.l. 42053): 4,0 g

Agua: 195 ml

Acido actico glacial: 2,0 ml

Se mantiene durante varios aos y puede utilizarse repetidamente.

Procedimiento

(1) De-cera secciones y llevar a 70% de alcohol. Los siguientes dos pasos son necesarios si el fijador
contena cloruro de mercurio. De lo contrario, se pueden omitir.

(2) Eliminar los depsitos de mercurio por inmersin en yodo de Gram (1% de l2 en Kl acuoso al
2%) durante 30 s. (Como alternativa, use yodo al 0,5% en alcohol al 70%, que necesita 3 min.)

(3) Eliminar la tincin de yodo por inmersin en solucin de tiosulfato sdico al 5% hasta que las
secciones ya no sean amarillas o marrones (aproximadamente 15 s). Contine con el paso 5.

(4) Si el fijador no contiene cido pcrico o cloruro mercrico, coloque los portaobjetos en cido
acuoso acuoso saturado o fluido de Bouin o una solucin fijadora de cinc-formalina. La duracin
del pretratamiento puede ser durante la noche a temperatura ambiente o 2 h a 55-60C.

(5) Lavar en agua del grifo (3 cambios, o agua corriente durante 2 min), luego en agua destilada, 3
0 -60 s. (Si el fijador no contena cloruro mercrico, y se omiti el tratamiento con yoduro-
tiosulfato, simplemente se coloc en agua destilada durante 1 minuto con agitacin durante los
primeros 30 s).

(6) Manchar los ncleos en un trabajo de hierro-hematoxilina (Solucin D) durante 3 min.

Enjuague en agua del grifo y revise la lmina hmeda bajo un microscopio. Slo los ncleos deben
ser manchados. Vase el captulo 6 para que se tomen medidas si la tincin nuclear no es
satisfactoria.

(7) Lavar en agua corriente del grifo durante 1 min.

(8) Mancha durante 4 min en biebrich escarlata-cido fuchsina (Solucin E).

(9) Enjuague con agua ligeramente acidificada (solucin C) para eliminar el exceso de colorante.

(10) Sumergir en PMA-PTA (Solucin F) durante 10 min. Enjuague en agua acidificada y revise una
diapositiva bajo un microscopio para asegurarse de que el colorante rojo se ha eliminado del
colgeno. Volver a la solucin PMA-PTA durante otros 5 min si es necesario.

(11) Mancha durante 4 min en FCF verde rpido de 2% (Solucin G).

(12) Sumerja en 2 cambios de agua ligeramente acidificada, cada uno durante aproximadamente
30 s. (Un tiempo ms largo en el segundo cambio no hace dao.)
(13) Deshidratar en 3 cambios de alcohol al 100%, limpiar en xileno y aplicar cubreobjetos, usando
un medio de montaje resinoso.

Resultado

Ncleos negros. Citoplasma en tonos de rosa, rojo y marrn. Eritrocitos, queratina y mielina
escarlata. Las fibras de colgeno son de color azul intenso. Verde moco ms claro.

Nota

Masson (1929) utiliz una mancha nuclear de hierro-hematoxilina ms complicada. Para tintes
rojos utiliz una mezcla de fuchsina aadida con un tinte azo que probablemente fue ponceau 2R
(Cl. 16150).

Utiliz 1% de PMA para el heteropolicido y anilina azul o verde claro para la mancha de colgeno.
En la presente variante, siguiendo a Lillie (1945), se usa FCF verde rpido en lugar de verde claro
porque este ltimo se desvanece con el tiempo (Captulo 5).

8.3. Mtodos para la reticulina

Los mtodos para la tincin selectiva de la reticulina, que se basan en la reduccin de sales de oro
o plata, se explican en el captulo 18. Las fibras reticulares tambin se muestran por el mtodo
rojo picro-sirius, con el que muestran birrefringencia verde. Con benzo azul BB en lugar de sirius
rojo F3B el color birrefringencia de las fibras reticulares es amarillo (Seccin 8.2.3.3).

8.4. Mtodos para la elastina

No existe una explicacin completamente satisfactoria de los modos de accin de los diversos
mtodos de tincin de la elastina

Unin del colorante a las fibras elsticas

Los tintes no son atrados por la elastina por las fuerzas electrostticas (vase Baker, 1958 y
Horobin, 1982 para la revisin de la evidencia). Los estudios termodinmicos, basados en la
medicin de los tiempos de media tincin con orcena a diferentes temperaturas, indican que las
fibras elsticas tienen baja permeabilidad a este colorante (que las mancha selectivamente), pero
que hay un gran nmero de ligantes dbiles (no inicos) Sitios por unidad de volumen de sustrato
(Friedberg y Goldstein, 1969). En un principio se supona que el enlace de hidrgeno estaba
principalmente involucrado (vase Pearse, 1968b).
Sin embargo, Horobin y James (1970) mostraron que las fibras elsticas podran ser coloreadas por
colorantes incapaces de formar enlaces de hidrgeno. Estos investigadores encontraron que la
nica caracterstica mantenida en comn por todos un gran nmero de tintes que tean elastina
era la presencia de al menos cinco anillos aromticos o quinonoides en la molcula. Los mtodos
de bloqueo qumico para muchos grupos reactivos no redujeron apreciablemente la tincin de la
elastina por tales colorantes, y la prevencin del enlace de hidrgeno caus slo una ligera
inhibicin. Horobin y James propusieron que las grandes molculas de colorantes se unen al tejido
elstico de la misma manera que se piensa que estn unidas a algunas fibras textiles: a saber, las
fuerzas de van der Waals o las interacciones hidrofbicas. Estos tipos de atraccin intermolecular
se han explicado en el captulo 5. Otras pruebas de la unin hidrfoba de los colorantes a la
elastina fueron obtenidas por Horobin y Flemming (1980), que correlacionaron varias
caractersticas estructurales de las molculas de colorantes con la capacidad de unirse a las fibras
elsticas. Los colorantes ms eficaces fueron aquellos cuyas molculas tenan las cadenas ms
largas de enlaces conjugados (enlaces simples y dobles alternantes, vase el captulo 5) y el mayor
nmero de grupos hidrfobos. Debe recordarse que los colorantes directos son aninicos, y
tambin colorean todos los componentes acidfilos de un tejido, aunque no tan intensamente
como elastina, cuando se aplican a partir de soluciones acuosas.

Los tintes aninicos con molculas ms pequeas, como la eosina, manchan elastina ligeramente.

Los colorantes sintticos de estructura conocida, como los investigados por Horobin y sus colegas,
no se usan en los mtodos tradicionales de elastina.

Los agentes de tincin todava ms frecuentemente empleados son los siguientes:

(A) Resorcin-fuchsina de Weigert, un compuesto hecho por ebullicin de fuchsina bsica con
resorcinol y cloruro frrico.

B) Orcena, una mezcla de colorantes de oxazina, producida por la accin del oxgeno y el
amonaco sobre el orcinol (captulo 5).

(C) mancha de Verhoeff, una mezcla de hematoxilina, cloruro frrico, yodo y yoduro de potasio.
Esto tambin mancha los ncleos y las vainas de mielina de las fibras nerviosas.

(D) Aldehdo-fuchsina, producida por reaccin de pararosanilina con acetaldehdo.

El producto resultante colorea las fibras elsticas y las lminas y tambin se une a grupos cido
fuerte (sulfnico o sulfato-ster), y grupos aldehdo en el tejido.

La resorcin-fuchsina contiene compuestos dimricos y trimricos formados por acoplamiento

oxidativo (Proctor y Horobin, 1983). Los componentes de orcena contienen 4 6 anillos
conjugados de seis miembros, con cadenas laterales de metilo y fenlicas (vase Beecken et al.,
2003). Es probable que estos grandes colorantes manchen la elastina en virtud de las fuerzas de
van der Waals que actan en mltiples sitios hidrfobos y el enlace de hidrgeno a los enlaces
peptdicos (Prento, 2001). La mancha de Verhoeff y la aldehdo-fuchsina se consideran en las dos
secciones siguientes del captulo.

Manchas Verhoeff

Parte del Fe3 + en la solucin de tincin oxida la hematoxilina a la hematina, que forma complejos
negros con iones de hierro. Las acciones de yodo y yoduro permanecen oscuras. Puchtler y
Waldrop (1979) realizaron experimentos con mezclas de composicin variable, que encontraron
que el aumento de la concentracin de yodo aumentaba la estabilidad de la solucin, pero reduca
la intensidad de la tincin de la elastina. El yodo en una solucin acuosa que contiene yoduro est
presente en forma de iones trioduro (13-2). En algunas variantes del mtodo de Verhoeff (por
ejemplo Clark, 1981) se omite el yodo, aunque algunos deben formarse a partir de la oxidacin de
iones yoduro por Fe3 +.

Puchtler y Waldrop sugieren que los iones de yoduro sirven como ligandos que unen entre s los
tomos de hierro que estn complejados con las molculas de hematina. Los complejos
resultantes seran grandes molculas coloreadas y se podra esperar que se unieran a la elastina
por fuerzas de van der Waals.

Como una mezcla de hierro-hematoxilina, la mancha de Verhoeff imparte su color negro tambin
a los ncleos de las clulas ya las fibras nerviosas mielinizadas. Otros componentes del tejido son
de color gris, a menos que se aplique un contraste opuesto.

El mtodo siguiente es el de Musto (1981). Se puede utilizar cualquier fijador.

Soluciones requeridas

Las soluciones madre (A, B, C) son todas estables durante al menos un ao. La solucin de trabajo
(D) se hace antes de usar y se usa una sola vez.

A. Hematoxilina

2% en etanol al 95%

B. Cloruro frrico acidificado

FeCl _ {3}: 6H20:

Agua:

HCl concentrado:
C. Yodo

2 / o l2 en yoduro de potasio acuoso al 4% (Kl)

D. Solucin de trabajo

Solucin A:

Solucin B:

Solucin C:

E. Counterstain

Si las lminas elsticas y las fibras son el nico objeto de inters, no se necesita ninguna otra
mancha.

Usado solo, la hematoxilina de Verhoeff tambin tie los ncleos celulares y da un fondo gris
claro. Si se necesita una preparacin ms informativa, aplicar un counterstain, siguiendo los
principios explicados en el captulo 6. El mtodo de Van Gieson (seccin 8.2.2) tambin es
adecuado.

Procedimiento

(1) Secciones de parafina de cera y hidrato. (Vase la nota a continuacin si la muestra se fij en
una solucin que tena formaldehdo como nico ingrediente activo).

(2) Mancha en la solucin de trabajo (D) durante aproximadamente 45 min. La tincin es

progresiva y debe comprobarse a intervalos. Para hacer esto, enjuague una diapositiva en el agua
y utilice un microscopio para buscar lminas elsticas en las paredes de las arterias.

(3) (Opcional) Aplique un colorante adecuado.

Resultado

Las fibras elsticas, los ncleos y las vainas de mielina (si estn presentes) son negras. El
citoplasma y el colgeno estn coloreados por el contracolor.

Nota

Musto (1981) recomend un pretratamiento con la solucin de Bourn durante 10 min a 55 C (o

durante la noche a temperatura ambiente) para secciones de material fijado con formalina. Si esto
se hace, los portaobjetos se deben lavar en agua corriente hasta que las secciones ya no sean
amarillas.

Orcena

Este es uno de los ms antiguos, y probablemente el mtodo ms fcil para la elastina, pero el
color es menos intenso que el impartido por el mtodo de Verhoeff o por aldehdo-fuchsina.

Orcena ligada no se extrae fcilmente, por lo que puede ser seguido por casi cualquier
counterstain de ncleos, citoplasma o colgeno. Sin embargo, si los ncleos estn manchados con
una hierro-hematoxilina, esto debe hacerse antes de teir las fibras elsticas con orcena. Clark
(1981) da instrucciones para varias tcnicas de mltiples tintes que incluyen orcena. Como con los
otros mtodos para la elastina, se puede usar casi cualquier fijacin.

Solucin de tincin

Orcena: 1 g

70% alcohol: 100 ml

Calentar hasta aproximadamente 60 C, con agitacin. Guay. Aadir 1 ml de cido clorhdrico

concentrado y filtrar para eliminar cualquier material no disuelto. Se mantiene durante varios
meses. Se utiliza a 37 C.

Procedimiento

(1) Tome las secciones al 70% de alcohol.

(2) Mancha en la solucin de orcena durante 3 0 -60 min a 37 C.

(3) Enjuague en alcohol al 70% y examine. Si hay un fondo marrn (en colgeno y ncleos),
diferencie en cido-alcohol (1 ml de cido clorhdrico concentrado en 99 ml de alcohol al 70%).
Esto generalmente slo toma unos segundos.

(4) Lavar en agua corriente del grifo, por lo menos 30 s

(5) Contracolorear segn sea necesario, deshidratar, limpiar y cubrir.

Resultado

Fibras elsticas y lminas marrones.

Nota

Para fotografas en color de tincin por varias tcnicas usando orcena, ver Henwood (2003).