UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDSUTRIAL

CENTRO DE BIOLOGÍA

INFORME 3

Técnicas de siembra y dilución seriada

QUINTO SEMESTRE

PARALELO 1

Dra. Magdalena Díaz

GRUPO 5

INTEGRANTES:

• MELANY BAUTISTA
• PAOLA CARRIÓN
• ALEJANDRO CASTRO
• DOMÉNICA LANDETA
• MATEO PILLAJO
• DAVID PUENTE

QUITO-ECUADOR

2020-2021
 Técnicas de siembra y dilución seriada

1. Objetivos:
• Realizar diluciones seriadas a partir de una muestra de colorante.
• Preparar un medio de cultivo sólido casero, base de posteriores experimentos.
• Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de
microorganismos.

2. Procedimiento:
2.1. Dilución seriada.
• Describa paso a paso el proceso que se realiza en el laboratorio. (tomar en
cuenta que se trabaja en condiciones presenciales)
-Se prepara la solución madre con agua y colorante, se toman 10 ml de agua y 3
ml de colorante con la pipeta, se mezcla y se homogeniza la solución
-Para las diluciones seriadas se toma un volumen especifico en cada tubo de
ensayo con la pipeta y se diluye con 9 mL de agua de la siguiente manera:
Primer tubo: 1ml de la solución madre + 9 mL de agua para diluirlo obteniendo
una dilución de 10−1
Segundo tubo: 1 mL del primer tubo + 9 mL de agua para diluirlo obteniendo
una dilución de 10−2
Tercer tubo: 1 mL del segundo tubo + 9 mL de agua para diluirlo obteniendo
una dilución de 10−3
Cuarto tubo: 1 mL del tercer tubo + 9 mL de agua para diluirlo obteniendo una
dilución de 10−4
Quinto tubo: 1 mL del cuarto tubo + 9 mL de agua para diluirlo obteniendo una
dilución de 10−5
2.2. Cultivos
Procedimiento
1.- El simulador nos muestra en que consiste la práctica, como usar una
micropipeta y los materiales que se van a usar durante la práctica y la función de
cada uno
Figura 1 “Uso Correcto de Micropipetas”

Fuente: Labxchange (2019)

Figura 2 “Reactivos de la Simulación”

Fuente: Labxchange (2019)

 Figura 3 “Equipos de la Simulación”

Fuente: Labxchange (2019)

2.- Se realizan las predicciones de los diferentes volúmenes (20, 15,7,5,2) 𝜇𝐿 que se
deben dispensar en el papel secante

Figura 4 “Predicciones de Volúmenes”

Fuente: Labxchange (2019)

3.- Se escoge el tipo de micropipeta adecuado para esta simulación (pipeta P20)
Figura 5 “Tipo de micropipeta para la simulación”

Fuente: Labxchange (2019)

4.- Se ajusta la micropipeta P20 para el primer volumen 20 𝜇𝐿

Figura 6. “Ajuste del volumen de la micropipeta”

Fuente: Labxchange (2019)

5.- A la Micropipeta P20 se le coloca una punta

 Figura 7. “Punta de la Micropipeta P20”

Fuente: Labxchange (2019)

6.- Se succiona el reactivo (tinte rojo) con la micropipeta P20, esto se realiza
presionando el botón de la micropipeta hasta el primer tope

Figura 8 “Succión del reactivo con la Micropipeta”

Fuente: Labxchange (2019)

7.- Se dispensa el primer volumen de 20 𝜇𝐿 en el papel secante, para esto presionamos
el botón de la micropipeta hasta el segundo tope

Figura 9 “Dispensión del primer Volumen”

Fuente: Labxchange (2019)

8.- Después de dispensar el volumen de la micropipeta se bota la punta ya usada en la

basura para evitar que exista contaminación en nuestra muestra

Figura 10 “Desecho de la punta de la micropipeta”

Fuente: Labxchange (2019)

9.- Se ajusta el segundo volumen de 15 𝜇𝐿 en la Micropipeta

Figura 11 “Ajuste del segundo volumen en la micropipeta”

Fuente: Labxchange (2019)

10.- Se dispensa el segundo volumen de 15 𝜇𝐿 en el papel secante, previamente se

selecciona una punta nueva para la micropipeta, se succiona el reactivo (tinte rojo)
aplastando el botón de la micropipeta hasta el primer tope y para dispensarlo se vuelve a
aplastar el botón hasta el segundo tope, después de dispensar este volumen se vuelve a
desechar la punta usada para evitar la contaminación de la muestra

Figura 12. “Dispensión del segundo volumen”

Fuente: Labxchange (2019)

11.- Se ajusta la micropipeta para el tercer volumen de 7,5 𝜇𝐿

Figura 13. “Ajuste del tercer volumen en la micropipeta”

Fuente: Labxchange (2019)

12.-Se dispensa el tercer volumen de 7,5 𝜇𝐿 en el papel secante, previamente se

selecciona una punta nueva para la micropipeta, se succiona el reactivo (tinte rojo)
aplastando el botón de la micropipeta hasta el primer tope y para dispensarlo se vuelve a
aplastar el botón hasta el segundo tope, después de dispensar este volumen se vuelve a
desechar la punta usada para evitar la contaminación de la muestra

Figura 14. “Dispension del tercer volumen”

Fuente: Labxchange (2019)

13.- Se ajusta la micropipeta para el cuarto volumen de 2 𝜇𝐿

Figura 15. “Ajuste del cuarto volumen en la micropipeta”

Fuente: Labxchange (2019)

14.-Se dispensa el cuarto volumen de 2 𝜇𝐿 en el papel secante, previamente se

selecciona una punta nueva para la micropipeta, se succiona el reactivo (tinte rojo)
aplastando el botón de la micropipeta hasta el primer tope y para dispensarlo se vuelve a
aplastar el botón hasta el segundo tope, después de dispensar este volumen se vuelve a
desechar la punta usada para evitar la contaminación de la muestra

Figura 16. “Dispensión del cuarto volumen”

Fuente: Labxchange (2019)

15.- Al final de la simulación nos presentan una comparación entre nuestras
predicciones, los resultados de la práctica que hicimos en el simulador y los resultados
reales que se deberían obtener

Figura 17. “Resultados de la Simulación”

Fuente: Labxchange (2019)

 2.3. Técnicas de siembra

a. Acondicionamiento material:
• Caja Petri: Colocar en una olla de presión, con una pequeña
cantidad de agua.
• Sellar la olla de presión, y dejar que el recipiente se esterilice
por aproximadamente 45min.
b. Elaboración de Asas de cultivo:
• Asa de Digralsky
c. Elaboración de medio de cultivo (describa paso a paso el proceso)
• Calentar aproximadamente 150 ml de agua, hasta que hierva.
• Colocar un sobre de gelatina sin sabor con tres cucharas de
agua fría y 3 cucharas de agua caliente, disolver
completamente la solución con la ayuda de una cuchara.
• Verter la solución anterior en los 150 ml de agua caliente, y
dejar que hierva.
• Añadir media cuchara de azúcar.
• Repartir el medio de cultivo en los envases (caja Petri) y tapar
rápidamente.
• Dejar enfriar el medio, hasta que se encuentre completamente
solidificado.

3. Observaciones:
- Infografías de sus procesos de esterilización, elaboración de asas y
preparación de medios de cultivo
1. Procesos de esterilización
 Figura 18. Esterilización del recipiente.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

2. Elaboración de Asas:

• Asa microbiológica
Figura 19. Asa microbiológica.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.
 • Asa de Digralsky
• Figura 20. Asa de Digralsky.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.
• Hisopo.
Figura 21. Hisopo.

.
Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de
Ingeniería Química UCE.
 3. Preparación de medios de Cultivo

1. Calentar 150 ml de agua 2.

Figura 22. Calentamiento del agua.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

2. Colocar un sobre de gelatina sin sabor

Figura 23. Gelatina sin sabor.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

3. Disolver la gelatina, pimero en agua fría, y depues en agua caliente

Figura 24. Gelatina disuelta en agua fria.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.
4. Verter gelatina disuelta en el agua caliente.
Figura 25. Vertido de gelatina disuelta en agua caliente.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

5. Colocar media cuchara de azúcar y dejar que hierva.

Figura26. Agregación de azúcar y hervido de la solución.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

6. Colocar en el recipiente rápidamente y tapar.

Figura 27. Vertido de la solución en el recipiente.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.
7. Dejar enfriar la solución.
8. Desinfectar el área de trabajo para realizar la técnica de siembra
 Figura 28. Desinfección del área de trabajo con alcohol de 72°.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

9. Esterilizar el asa de cultivo.

• Figura 29. Esterilización de Asa microbiológica.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

Figura 30. Esterilización de Asa digralsky.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.
 Figura 31. Esterilización de Hisopo.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

10. Siembra.
Figura 32. Técnica de Agotamiento por estría.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.
 Figura 33. Técnica de Extensión por Placa

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

Figura 34. Técnica de Hisopado.

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

- Transcurridas las 24 horas observar desarrollo de microorganismos en los

medios CASEROS hasta aparición de colonias (48 horas, 72 horas, etc.)
 Figura 35. Técnica de Agotamiento por estría.
Después de 24 horas:

Después de 48 horas:

Después de 72 horas:

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.
 Figura 36. Técnica de Extensión por Placa
(24 horas, 48 horas, 72 horas, izquierda a derecha)

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

Figura 37. Técnica de Hisopado.

(48 horas, 72 horas, izquierda a derecha)

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de
Ingeniería Química UCE.
 - Reportar forma color de las colonias de organismos observados
Tabla 1. Observaciones.
Agotamiento por Extensión por Hisopado
Estrías placa.

Forma Circular Circular Circular

Color Blanco Blanco/Café Blanquecino

verdoso

Aspecto Pequeños Pequeños Pequeños

microorganismos microorganismos microorganismos
circulares planos circulares planos circulares planos

Borde Entero Entero Entero

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de

Ingeniería Química UCE.

- Realizar el proceso de dilución seriada (describir el proceso en fotografías)

Figura 38 “Materiales para la dilución Seriada”

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de Ingeniería

Química UCE.
 Figura 39. “Procedimiento de Diluciones Seriadas”

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de Ingeniería

Figura 40. “Diluciones Seriadas”

Fuente: Grupo 5. Cátedra de Biotecnología Industrial de la Facultad de Ingeniería

4. Discusiones:
4.1. Dilución Seriada
En base a los resultados e imágenes obtenidas se considera que el método
cuantitativo y cualitativo utilizado fue el correcto debido a que proporciono los
mecanismos y conocimientos adecuados para dominar la técnica de dilución
seriada así como conocer la importancia de la misma en la rama de la
Biotecnología industrial, mediante esta práctica se conoció la importancia del
manejo correcto de los instrumentos volumétricos sin embargo se recomienda
realizar cuando sea posible este procedimiento en un laboratorio equipado
 adecuadamente para así verificar y comparar el funcionamiento de esta técnica tan
usada.
4.2. Técnicas de siembra
En base a los resultados obtenidos se concluye que el método cualitativo y
cuantitativo utilizado fue el correcto ya que se logró llegar al objetivo planteado
a pesar de no contar con las características requeridas para un mayor crecimiento
bacteriano , el adaptar las necesidades de la técnica de siembra con los
instrumentos que se tiene en el hogar dio buenos resultados como la fotografía
mostrada en la técnica del hisopado donde el crecimiento bacteriano fue evidente
factores como la temperatura , humedad, acidez ,nutrientes , tiempo y cantidad de
oxígeno fueron controlados en este tipo de técnica de cultivo y el crecimiento
bacteriano transcurrió favorablemente , en tanto a las otras técnicas se ve un menor
crecimiento esto debido poco control tenido sobre los factores antes
mencionados. Se recomienda realizar una lampara de alcohol para así tener un
mejor control sobre la temperatura.

5. Conclusiones:
5.1. El crecimiento bacteriano en la técnica de Hisopado fue más notorio en
comparación al del Agotamiento con estriado debido al control sobre los factores
extrínsecos mas importantes como son la humedad, temperatura, y cantidad de
oxígeno haciéndose evidente el mejor crecimiento de bacterias en cambio en la de
Agotamiento por estriado el crecimiento fue casi nulo debido a que la temperatura
no se logró controlar debido al lugar donde se realizo la siembra.
5.2. El uso de colorantes para observar la técnica de dilución seriada cumple un
papel fundamental en procedimientos de laboratorio adaptados ya que
proporciona al analista una mejor observación del fenómeno fisicoquímico
producido.
5.3. El proceso de esterilización de los recipientes donde se va a realizar la siembra
de microorganismos es importante para que el proceso se lleve a cabo de la mejor
manera debido a que se asegura la eliminación de otras sustancias químicas o
microbiológicas que puedan afectar a las que se desea observar, el colocar las
muestras en lugares estratégicos en el hogar lejos de ventanales y puertas
proporciona un control en el mantenimiento de la temperatura y humedad
constantes, cosa que es de vital importancia para el crecimiento de las bacterias.
 6. Anexos:
Fotografías o video de la actividad realizada (url del mismo)
• Siembra de Agotamiento por estría:
https://uceedu-
my.sharepoint.com/:v:/g/personal/msbautista_uce_edu_ec/EbmDDpSp4kZCv01wmN8
WTZ0BUwdVsptI00KZ7cziq791cA?e=7SnUJn
• Siembra por extensión por placa:
https://uceedu-
my.sharepoint.com/:u:/g/personal/mbpillajo_uce_edu_ec/EX5zYKSr5dpBln_hBd_fOe0
BC7CvUT-sVktPX6S3Yz_G7A?e=aTF1nK
• Siembra mediante hisopado:
https://uceedu-
my.sharepoint.com/:v:/g/personal/dfpuentel1_uce_edu_ec/EcXQU4UzD71ArSMGZxuc
_VgBWCh8NUa6GgvBWWsAdOWRQg?e=eZ0c1L

Fotografías de las observaciones

7. Cuestionario:
1. Defina con sus propias palabras los siguientes términos: desinfección,
esterilización y asepsia.
• Desinfección: Es un proceso que mata la mayor cantidad de
microorganismos sin distinción sobre una superficie u objeto.
• Esterilización: Es la eliminación de cualquier tipo de microorganismo que
esté presente en un objeto, puede ser mediante agentes químicos o físicos
• Asepsia: Son los procesos que se llevan a cabo para disminuir al mínimo la
contaminación de microorganismos en un objeto.
2. ¿Cuáles son las desventajas de emplear agentes físicos y químicos para la
esterilización?
2.1. Desventaja de los agentes físicos:
• Los instrumentos cortantes pierden filo.
• Producen corrosión en los instrumentos.
• Ciclos largos de exposición.
2.2 Desventaja de los agentes químicos:
 • Largos tiempos de exposición a los agentes químicos.
• Costos elevados.
• Elevada toxicidad.
• Pueden ser inflamables.
• Corrosión de los instrumentos.
(López & Zolia, 2013)

3. ¿Qué es un medio de cultivo?

“Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en los que
crece y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto
de aislar diferentes especies bacterianas, para identificarlas y realizar
estudios complementarios. (Espinal, 2005)”
4. ¿Cuáles son los instrumentos que se emplean para la siembra de cultivos?
• Caja Petri
• Asa de siembra o material estéril (asa de Digralsky)
• Estufa de laboratorio
• Autoclave
• Mechero Bunsen
• Agua destilada
• Rotulador permanente
• Agar
5. ¿Qué es una sustancia termolábil? y ¿Cómo se esteriliza?
Las sustancias termolábiles son sustancias las cuales son sensibles al cambio
de temperatura, lo que provoca su descomposición.
Las sustancias termolábiles de un medio se solubilizan en un pequeño
volumen de agua y se esterilizan por filtración. El resto de componentes se
disuelven en un volumen de agua suficiente para que al mezclar con la
solución estéril del componente termolábil se restablezca el volumen final
adecuado.

6. ¿Qué es una dilución seriada?

 Es un proceso en el cual se tiene una dilución patrón de la cual se va
disminuyendo la concentración de la misma de forma progresiva y constante,
mediante un factor de dilución.

7. ¿Cómo se preparan 250 ml de la dilución 10-1 a partir de una muestra de

agua?
Se prepararía la solución con 25 ml de muestra en 250 ml de dilución
obteniendo un factor de dilución de 0.1
8. ¿Queremos preparar 10 ml de la dilución 10-5 en 3 únicos pasos, ¿cómo lo
haría?
Se tomaría 5 ml de muestra de cada vaso y se diluirá la solución con 15 ml
del diluyente
9. Se requiere la dilución 10-6 de una muestra de agua, pero se dispone
únicamente de 3 tubos vacíos estériles y de 30 ml de solución salina
(diluyente) estériles ¿Cómo se prepararía esa dilución? ¿Y si tuviéramos 6
tubos Eppendorff (volumen hasta 1 ml) pero únicamente 10 ml de solución
salina?
Dilución 10-6. Se dispone únicamente de 3 tubos vacíos estériles y 30 mL de
solución salina estéril.
Se toma 0,1 mL de la muestra y se añade a 9,9 mL de la solución salina
formando una dilución 10-2, posteriormente se toma 0,1 mL de esa solución
añadiéndole 9,9 mL de solución salina formando una dilución 10-4,
finalmente se toma 0,1 mL de esa solución añadiéndole 9,9 mL de solución
salina formando una dilución 10-6.
Dilución 10-6. Se dispone de 6 tubos Eppendorff (1 mL) y de 10 mL de
solución salina.
Se toma 0,1 mL de la muestra y se añade a 0,9 mL de la solución salina
formando una dilución 10-1, posteriormente se toma 0,1 mL de esa solución
añadiéndole 0,9 mL de solución salina formando una dilución 10-2,
posteriormente se toma 0,1 mL de esa solución añadiéndole 0,9 mL de
solución salina formando una dilución 10-3, posteriormente se toma 0,1 mL
de esa solución añadiéndole 0,9 mL de solución salina formando una dilución
10-4, posteriormente se toma 0,1 mL de esa solución añadiéndole 0,9 mL de
 solución salina formando una dilución 10-5, finalmente se toma 0,1 mL de esa
solución añadiéndole 0,9 mL de solución salina formando una dilución 10-6.
10. Se necesitan preparar 150 ml de dilución 10-1 de una muestra de agua.
Realizar un esquema claro y detallado de los pasos que se deben llevar a
cabo, volúmenes transferidos, etc. ¿Y si se tuvieran que preparar 150 ml de
dilución 10-3?
150 mL de la dilución 10-1.
Se toma 15 mL de la muestra y se añade a 135 mL de diluyente formando
150 mL de una dilución 10-1.
150 mL dilución 10-3.
Se toma 1 mL de la muestra y se añade a 9 mL de diluyente obteniendo 10
mL de una dilución 10-1, se añade 1,5 mL de esa dilución a 13,5 mL de
diluyente obteniendo 15 mL de una dilución 10-2, finalmente se toma 15 mL
de esa dilución y se añade a 135 mL de diluyente obteniendo 150 mL de una
dilución 10-3.
11. Responder todas las preguntas del simulador “Soluciones para micro
pipeteo”.
1. ¿Cuál crees que es el objetivo principal de esta simulación?
Aprender la forma correcta de manipular una micropipeta en un
laboratorio
2. ¿Por qué es importante empujar el émbolo hasta el primer tope al extraer
líquido?
Si se llega hasta el segundo tope, se medirá demasiado líquido.
3. Si la ventana de una micropipeta P20 muestra los números "1 5 5" de
arriba a abajo, ¿qué volumen se medirá?
15,5 microlitros.
4. ¿Cuál es el propósito principal de las puntas desechables en una
micropipeta?
Para prevenir la contaminación entre distintas muestras.
5. ¿Por qué es importante presionar el émbolo hasta el segundo tope cuando
se expulsa líquido de una micropipeta?
Para asegurar que todo el líquido de la punta se expulse.
6. Al final de un procedimiento de micropipeta, un estudiante terminó con
menos del volumen que pretendía medir. ¿Qué pudo haber salido mal?
 Es posible que hayan extraído la muestra demasiado rápido y hayan
tenido burbujas de aire en el líquido.
7. Si no cambia las puntas entre soluciones, ¿qué puede ocurrir?
Puede contaminar de forma cruzada los líquidos que está midiendo.
8. Un estudiante le informa que puede usar la punta de una micropipeta más
de una vez al transferir soluciones a diferentes tubos. ¿Crees que esto es
una buena idea o una mala idea y por qué?
Mala idea, la punta puede contaminarse en el proceso, lo que podría
afectar negativamente al experimento.
9. Para asegurarse de que todo el líquido se expulse en su tubo, debe:
Coloque la punta en la capa superior de la solución.
10. Si necesita pipetear un volumen de 20,5 μl con una micropipeta P20,
debería:
Pipetear un volumen de 10 μl, seguido de un volumen de 10,5 μl.
8. Bibliografía:
• Espinal, G. (2005). Manual de prácticas de Microbiología. Santo
Domingo: Instituto Tecnológico de Santo Domingo. Editorial INTEC.
• López, D. & Zolia, S. (2013). Métodos de esterilización. Recuperado de:
http://uvsfajardo.sld.cu/tema-7-metodos-de-esterilizacion.
• Harvard College. (2020). LabXchange. Retrieved 22 January 2021, from
https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:4eecf5fe:lx_si
mulation:1