MTODOS CLSICOS DE ANLISIS

MICROBIOLGICOS. GUIN DE PRCTICAS

AGUSTN LEN ALONSO-CORTS
TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS

Normas Generales
Preparacin y manejo del material de laboratorio
Recuento de aerobios mesfilos
Recuento de enterobacterias totales
Recuento de coliformes
Recuento de estreptococos fecales
Identificacin de enterobacterias. Tira API 20 E
Tinciones

BIBLIOGRAFA

NORMAS GENERALES PARA EL ALUMNO

1.- Cada alumno asistir dentro del grupo y puesto de trabajo asignado, sin posibilidad
de cambio, pues cada puesto dispone de material en relacin con el nmero de
alumnos en l comprendidos.
2.- Las prcticas comenzarn a las horas indicadas en la convocatoria previa. Sea
puntual en beneficio de todos.
3.- El alumno vendr provisto de la bata correspondiente, as como de un rotulador
marcador en vidrio y mechero.
4.- El material de que dispone debe ser tratado con sumo cuidado. Es costoso y va a
ser utilizado tambin por sus compaeros.
5.-Va a manejar, en muchas ocasiones, productos contaminados por microorganismos
patgenos, peligrosos para Vd. y para los dems. Evite el peligro de contaminacin,
realizando el trabajo atentamente y de la forma que se indica en el manual.
6.- No se puede fumar en la zona de prcticas.
7.- Deje todo el material en el mismo orden que Vd. lo encontr.
8.- Al terminar su tarea, debe lavarse las manos antes de salir del laboratorio.
PREPARACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

Es de gran importancia en Microbiologa la limpieza de todo el material que se va a

utilizar, debido a los problemas de contaminacin que la suciedad pueda ocasionar.
Todo el material sucio especialmente las placas de Petri desechables ya utilizadas,
deben recogerse en recipientes o bolsas adecuadas para evitar la contaminacin del
laboratorio, para lo cual deben ser esterilizadas en el autoclave durante 20 minutos a
121C de temperatura.
El material de vidrio, plstico o metal utilizado debe lavarse con detergente, enjuagado
con agua destilada y secado a temperatura ambiente. Los cubre y portaobjetos una vez
que han sido lavados adecuadamente, se sumergen en mezcla crmica durante 24-28
horas. Transcurrido este tiempo, se lavan con agua destilada y se secan para su
posterior uso.
Las pipetas de vidrio reutilizables deben limpiarse y desinfectarse utilizando un lavador
de pipetas donde previamente hayamos aadido una solucin detergente, una vez
enjuagadas se disponen en paquetes de varias unidades envueltos de papel aluminio y
se esterilizan en un autoclave u horno.
Para la limpieza de los tubos de ensayo, primero se desprende el medio que contienen
ayudndose de un escobilln y a continuacin se lavan con agua y detergente, se
enjuagan con agua destilada y se dejan secar en posicin invertida. Cuando se decide
su utilizacin, se llenan con el medio de cultivo y se esterilizan en el autoclave. Antes
de introducirlos, se tapan y se colocan en cestillos apropiados.

Los frascos Erlenmeyer, matraces, etc., se taponan de igual forma que los tubos de
ensayo, con algodn graso y se esterilizan, tomando la precaucin de colocarles
previamente en una bolsa de plstico autoclavable para evitar que el posible
derramamiento de su contenido durante el tratamiento trmico ensucie o tapone los
conductos de nuestro autoclave.
Las operaciones como toma de muestra, siembras, resiembras, diluciones,
aislamientos, etc., se deben hacer de manera que se evite toda contaminacin,
trabajando en la proximidad del mechero o en cabina de flujo laminar.
Las asas y agujas que se utilizan para siembras e inoculaciones deben esterilizarse
antes y despus de su uso, calentndolos a la llama del mechero hasta el rojo. Para
evitar salpicaduras del material, el instrumento se va introduciendo gradualmente en la
llama.
Operaciones de manipulacin de tubos y placas:
En general Las placas Petri, en el momento de su uso se debern entreabrir el tiempo
mnimo requerido para la manipulacin a realizar, realizndose sta siempre bajo la
llama del mechero.

Las operaciones que se repetirn con frecuencia en el laboratorio son:

Pipeteado tubo-placa.
Pipeteado tubo-tubo.

Preparacin de un Medio de Cultivo

Los medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio para el crecimiento de
microorganismos pueden elaborarse utilizando los productos qumicos descritos en
cualquier catlogo o libro especializado con la ayuda de una balanza analtica, o bien
ser encargados en su forma deshidratada a cualquiera de las casas proveedoras
(DIFCO, API, OXOID, etc.). Es obvio que esta ltima alternativa resulta ms cara, pero
tambin es ms cmoda.
Una vez que tenemos el medio, para su preparacin, debemos seguir los pasos
indicados en la etiqueta, los cuales consisten bsicamente en hidratar una cierta
cantidad en condiciones de calentamiento y agitacin, operacin que precisa de
balanza y placa calefactora con agitacin. Una vez elaborado, se dosifica en tubos o
matraces (segn precise el anlisis), los cuales taparemos con un algodn,
colocaremos en una o varias bolsas autoclavables y esterilizaremos.
Una vez esterilizados procederemos de dos formas distintas segn la finalidad del
mismo: Dosificacin en Placas de Petri y posterior almacenamiento en frigorfico, si no
van a ser utilizadas inmediatamente. O bien, enfriamiento en bao de agua a unos
40C para una posterior siembra en masa.

Obtencin de un banco de diluciones

Mtodo que consiste en preparar diluciones de una muestra de alimento para que el
recuento o aislamiento de colonias posterior a la siembra, resulte eficaz.
Material
Alimento
Bolsa de stomacher
Stomacher
Tubos de ensayo
Agitador de tubos
Mechero
Pipetas estriles y pipeteador
Caldo de triptona o agua destilada estril

Tcnica
1.- Tomar 10 g del alimento. Pasarlo junto a 90 ml de caldo de triptona (solucin
isotnica) o agua destilada en una bolsa de stomacher.
Homogeneizar el conjunto en el Stomacher.
El resultado es una dilucin 1:10.
2.- Tomar 1 ml. de la dilucin 1:10 y pasarlo a un tubo al que previamente se le ha
aadido 9 ml. de caldo o agua destilada. Homogeneizar la solucin en un
agitador de tubos.
La dilucin que hay ahora en este tubo es 1:100
3.- De manera anloga podramos conseguir las diluciones 1:1.000; 1:10.000;
1:100.000 etc
Nota: Todos los tubos se marcarn con rotulador segn la dilucin que posean.

Siembra en masa
Tcnica de siembra fundamental para la obtencin de los recuentos microbianos
caractersticos de las principales tcnicas clsicas de anlisis microbiolgicos.
Material

Banco de diluciones de un alimento

Pipetas y pipeteador
Placas de Petri
Matraces con agar fundido en bao mara
Tcnica

Tomar 1 ml de una solucin y vertirlo en una placa Petri vaca. Vertir en la misma placa
unos 15 ml del agar fundido. Mezclar el conjunto con suave agitacin y dejar solidificar.
Las placas as sembradas ya estn listas para su incubacin en estufa. Para evitar
condensaciones de agua sobre la superficie del agar que puedan dispersar las colonias
superficiales y falsear el recuento, se suele ubicar las placas en la estufa, de forma
invertida.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS

El anlisis microbiolgico objeto de la prctica permitir estimar la flora total que porta
el alimento, la cual reflejar su calidad higinico-sanitaria.
Material
Pipetas estriles de 1 ml y pipeteador
Placas Petri
Banco de diluciones del alimento.
Bao Mara
Mechero
Medio de cultivo
agar Plate Count (PCA)
Tcnica
- Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recin esterilizado (PCA), en
un bao Mara y esperar que la temperatura descienda hasta unos 35C.
- Preparar un banco de diluciones del alimento problema y realizar una siembra en
masa por duplicado de cada una de las diluciones.
- Homogeneizar, dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 30C durante
48 -72 horas.
- Transcurrido este tiempo, elegir una dilucin (asociada a un crecimiento de un
nmero de colonias comprendido entre 30 y 300 aproximadamente) y realizar el
recuento. Multiplicando este valor por el factor de dilucin obtendremos el
resultado.

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS TOTALES

El anlisis microbiolgico de las Enterobacterias permitir predecir el grado de
contaminacin fecal que tiene un alimento. Para su anlisis se utilizar la tcnica de
recuento en medio slido.
Material
Pipetas estriles de 1 ml y pipeteador
Placas Petri estriles
Estufa de cultivo
Medio de cultivo
Agar-Cristal Violeta-Rojo Neutro-Bilis-Glucosa (VRBG - Oxoid)
Tcnica
- Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recin esterilizado (VRBG)
en un bao Mara y esperar que la temperatura descienda hasta unos 40C.
- Preparar un banco de diluciones del alimento problema.
- Realizar una siembra en masa por duplicado de las diluciones preparadas,
mezclando en placas Petri, 1 ml de cada una de las diluciones decimales con,
aproximadamente, 15 ml del medio VRBG fundido.
- Una vez que ha solidificado el medio, se recubre con una nueva capa de agar.
- Dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 37C durante 18-24 horas.
- Una vez transcurrido este tiempo se cuentan las colonias violeta rodeadas de un
precipitado rojo-violeta.

RECUENTO DE COLIFORMES
El grupo formado por las denominadas coliformes comprende aquellas Enterobacterias
capaces de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas. Niveles de coliformes
altos en un alimento indican manipulacin y elaboracin deficientes. Para alimentos no
procesados o con tratamiento insuficiente, es preferible el anlisis del grado de
contaminacin fecal mediante la evaluacin de los niveles de coliformes fecales que
mediante el anlisis de Enterobacteriaceas totales. Su anlisis se realizar utilizando
medio lquido.

Material
Banco de diluciones del alimento problema (1:10, 1:100 y 1:1000).
Tubos de ensayo con 10 ml de Caldo lactosa bilis verde brillante.
Tabla NMP
Campana Durham
Estufa incubadora
Placas de Petri
Pipetas estriles de 1 ml y pipeteador
Medio de cultivo lquido
Caldo lactosa bilis verde brillante
Tcnica
- Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilucin respectivamente. Cada
tubo ir provisto de una campana Durham para la recogida de gases.
- Incubar todos los tubos a 37 C durante 24 - 48 horas. Observar los tubos y tomar
nota de los que tengan desprendimiento de gases.
- Con ayuda de la tabla NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el nmero de
coliformes por gramo o ml de alimento.

RECUENTO DE ESTREPTOCOCOS FECALES

Los estreptococos son considerados indicadores de la contaminacin fecal de
agua y alimentos. Por ser muy resistentes a condiciones de congelacin o desecacin
se consideran buenos indicadores para valorar, las condiciones higinicas y de
conservacin de alimentos congelados o desecados. Para su determinacin se
utilizarn caldos de cultivo lquidos.
Material.
Serie de diluciones seriadas del alimento problema (1:10, 1:100 y 1:1000).
Tubos de ensayo con caldo K.A.A
Tablas NMP.

Tcnica
Prueba presuntiva.
- Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilucin respectivamente.
- Incubar a 37C durante 24 horas.
- Con ayuda de las tablas NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el nmero de
estreptococos por gramo o ml de alimento (los tubos que presenten
ennegrecimiento se considerarn como positivos)

METODOS RAPIDOS PARA LA IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS.

TIRAS API-20E.

El sistema API-20E para enterobacterias es una tira con 20 cpsulas que

permite buscar 22 caracteres bioqumicos para identificar enterobacterias al cabo de
18-24 horas.

Material

Kit API-20E Enterobacterias

Pipetas Pasteur
Aceite de parafina esteril
Tubos con 5 ml. de agua estril
Solucin co el microorganismo problema

Tcnica

- Hacer una suspensin en 5 ml de agua estril a partir de una sola colonia,

previamente separada en medio de aislamiento.

- Repartir aproximadamente 5 ml de agua en los alvolos de la cmara de

incubacin para dar el grado de humedad necesario.

- Sacar una tira API-20E y colocarla sobre la mencionada cmara.

- Aadir la suspensin bacteriana con pipeta Pasteur, con la punta apoyada sobre
lado de cada cpula y evitando que se formen burbujas de aire.

- Para los caracteres CIT, VP y GEL, llenar tubo y cpula. Para los caracteres
restantes llenar solo el tubo.

- En los caracteres ADH, LDC, ODC URE y H2S, llenar las cpulas con aceite de
parafina estril, con el fin de obtener condiciones de anaerobiosis.

- Cerrar la cmara con la tapa, e incubar a 35-37C durante18-24 h.

- Tras la incubacin, realizar la lectura de las galeras, apuntando los resultados en

la hoja de resultados.

- Si la Glucosa es positiva y/o 3 o ms test son positivos, efectuar el revelado de los

test que requieren reactivos (TDA, IND, VP, NITRATOS y NITRITOS).

- El cdigo obtenido en la hoja de resultados, nos servir para identificar el

microorganismo correspondiente a la cepa analizada.

TINCIONES

1.- Material
Portaobjetos
Asa
Pinzas portaobjetos
Suspensin de microorganismos
Mechero
Microscopio
2.- Productos
Violeta de Genciana
Fuchsina bsica o Safranina
Azul de metileno
Reactivo de Lugol
Verde de malaquita
Alcohol de 96
Aceite de inmersin

a).- Tincin Simple

1. EXTENSIN: Depositar con un asa de siembra una gota del material a examinar
en el centro de un portaobjetos limpio. Extender suavemente hasta ocupar una
superficie de 1 cm2 aproximadamente. Si se trata de observar un microorganismo
que est en un medio de cultivo slido, se pone previamente una gota de agua
destilada en el centro del portaobjetos y a continuacin se toca ligeramente la
colonia y se hace la extensin.
2. SECADO: Dejar secar la preparacin al aire o con calor suave.
3. FIJACIN: Para ello, se toma el portaobjetos con las pinzas y se pasa 3-4 veces
por la llama del mechero hasta que todo el agua quede evaporada.
4. APLICACIN DE COLORANTES: Una vez fra la preparacin, se cubre con la
solucin del colorante y se deja actuar durante un cierto tiempo, segn su
naturaleza. As, para Violeta de Genciana basta un minuto, para la Fuchsina bsica
diluida, 2-3 minutos; para el azul de metileno 3-5 minutos.
5. LAVADO: Lavar con agua destilada para arrastrar el exceso de colorante.
6. SECADO FINAL: Secar la preparacin al aire o con calor suave.
7. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

b).- Tincin de Gram

1. Extensin.
2. Desecacin.
3. Fijacin.
4. Teir con Violeta de Genciana durante un minuto.
5. Aadir el reactivo de Lugol, y dejarlo actuar durante un minuto.
6. Lavar con agua.
7. Decolorar con alcohol hasta que salga exento de colorantes. Generalmente
bastan unos 30 segundos.
8. Lavar con agua.
9. Aadir Fuchsina bsica, y dejarla actuar 1-2 minutos.
10. Lavar, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
* Los microorganismos Gram Positivos aparecen de color violeta, mientras que
los Gram Negativos se observan de color rojo o rosa.

BIBLIOGRAFIA

MARTIALAY VALLE, F. (MINISTERIO DE DEFENSA)(1988). Prontuario de tcnicas

en microbiologa de alimentos. Pd de Defensa.
PASCUAL ANDERSON, M.R. (1992). Microbiologa Alimentaria. Metodologa
Analtica para alimentos y bebidas. Ed. Diaz de Santos. Madrid.
ICMSF (1991). Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de analisis
microbiolgico. Ed. Acribia. Zaragoza.
HERNANDEZ JIMENEZ Y OTROS (1994) Anlisis microbiolgicos de alimentos y
control de los procesos de fabricacin. Instituto de Agroqumica y Tecnologa de los
alimentos de la UPV.