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ENZIMAS PCTICAS
La esterificacin de los grupos carboxilos del cido galacturnico (AG) con metanol es una
caracterstica muy importante que le confiere a la pectina sus propiedades estructurales y
funcionales. El grado de metilacin (GM) se define como los moles de metanol presentes cada 100
moles de cido galacturnico. Las pectinas con valores de GM > 50 se las denomina de alto
contenido de metoxilo (ctricos, manzanas) y, con GM<50, se denominan pectinas de bajo
metoxilo (papa, pera, receptculos de girasol).
2. 2. ENZIMAS PCTICAS
Las enzimas pcticas constituyen un grupo de enzimas que catalizan la degradacin de los
polmeros ppticos en la pared celular de las plantas. La depolimerizacin de la pectina esta
generalmente asociada con el proceso de maduracin de la fruta. Estas enzimas juegan un rol
significativo en los cambios que ocurren en el almacenamiento post-cosecha de frutas y vegetales.
Las enzimas pcticas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza, encontrndose en plantas
superiores (citrus, tomate, banana, manzana, pera, papas, uvas etc.) y en microorganismos, tanto
en bacterias, como en hongos y levaduras.
Las pectinasas microbianas son importantes desde el punto de vista industrial principalmente por
su uso en el procesamiento de frutas y vegetales (elaboracin de vinos, extraccin y clarificacin
de jugos de frutas, extraccin de aceites vegetales, maceracin de vegetales, etc).
2.2.1. Clasificacin de las enzimas pcticas
Las enzimas pcticas han sido clasificadas en dos grandes grupos: enzimas desesterificantes y
enzimas depolimerizantes.
Enzimas desesterificantes:
Pectinesterasa (PE) (EC 3.1.1.11): La enzima PE cataliza la desesterificacin de los grupos
metil-ester de los galacturonanos de las sustancias pcticas liberando cido pctico y metanol (Fig.
2). La actividad pectinesterasa puede ser medida por diferentes mtodos, usualmente se mide por
titulacin de los grupos carboxilos producidos a partir de pectina. Otros mtodos se basan en la
determinacin del metanol producido, en este mtodo el metanol puede ser destilado y medido por
oxidacin a formaldehdo, o bien se lo puede transformar en un nitrito metlico voltil que se
determina por cromatografa gas-lquido.
Enzimas depolimerizantes
Poligalacturonasas (PG):
Endopoligalacturonasas (endo-PG) (EC 3.2.1.15): Producen ruptura al azar de los enlaces
glicosdicos -1,4 del cido pctico (Fig.1), liberando monmeros de AG u oligmeros de dos o
tres restos. Las endo-PG se miden por reduccin de vioscosidad, ya que producen hasta un 50 %
de cada en la viscosidad de una solucin de pectina.
Exopoligalacturonasas (exo-PG) (EC 3.2.1.67): Hidrolizan las uniones -1,4 de los enlaces
glicosdicos a partir del extremo no reductor de la cadena de cido pctico, dando cido
galacturnico como producto mayoritario de la reaccin (Fig. 2).La actividad exo-PGasa se mide
con el mtodo colorimtrico del 3,5-dinitrosalicilico, por el incremento de los grupos reductores.
Pectinliasas (PL) (EC. 4.2.2.10): Rompen los enlaces glicosdicos -1,4 de la molcula de cido
pctico por un mecanismo de -eliminacin, descubierto por Albersheim y col., 1960, formando
un doble enlace entre los carbonos 4 y 5 por cada enlace glicosdico roto (Fig.2). Los mejores
sustratos para esta enzima son las pectinas altamente esterificadas.
El mtodo ms conveniente para medir la actividad de las pectinliasas es medir el incremento de
la absorbancia a 235 nm a partir del aumento producido por la formacin del doble enlace.
Urnido
Oligmero
PL
Pectina
PE
Ac poligalacturnico
PG
Ac. galacturnico
PG
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Extractos enzimticos: se utilizarn los extractos enzimticos producidos mediante
fermentacin en medio lquido por dos microorganismos pectinolticos aislados en la ctedra de
Biotecnologa: A. niger y Picchia anmala.
3.2. Determinacin de la actividad pectinoltica total (PT) por reduccin de viscosidad
La actividad PT (PG; PE y PL) de los extractos enzimticos se determinar por reduccin de
viscosidad de una solucin estandar de pectina, utilizando un viscosmetro de Cannon-Fenske
serie 100.
Tcnica enzimtica: Colocar el viscosmetro 8,4 ml de la solucin de pectina de citrus al 0,5 %
en buffer actico/acetato pH 5,0 y 0,6 ml del extracto enzimtico diluido apropiadamente . Incubar
la mezcla de reaccin a 37 C y medir la reduccin de viscosidad cada 5 min, hasta los 30 min.
El porcentaje de reduccin de la viscosidad (% RV) se calcular a partir de la siguiente
ecuacin:
Fs - Fm
100
%RV =
( Fs - Fb )
Donde:
Fs = tiempo de flujo en segundos de la solucin de pectina y la enzima inactivada por calor.
Fm = tiempo de flujo en segundos de la solucin de pectina y la enzima.
Fb = tiempo de flujo en segundos del buffer y la enzima inactivada trmicamente.
Una unidad de PT se define como la actividad que produce una reduccin de viscosidad del 50
% bajo las condiciones de ensayo
Resultados
Tiempo
reaccin (min)
de Tiempo de medida
%RV
de la viscosidad (seg)
5
10
15
20
25
30
Graficar -
Sacar conclusiones
3.3 Determinacin de actividad pectinoltica cualitativa por el mtodo del Hoyo (cup-plate
assay)
Tcnica del hoyo:
Se realizar un ensayo cualitativo y semi-cuantitativo para la determinacin de la actividad
pectinoltica mediante la tcnica del hoyo (cup-plate assay) de los extractos enzimticos obtenidos
a partir de cultivo en medio lquido de los microorganismos mencionados
Procedimiento:
1. Rotular los tubos correspondientes ( 2 tubos por muestra y 1 blanco de sustrato).
2. Colocar el sustrato (APG) en cada tubo, los mismos se mantendrn en bao de agua-hielo.
3. Agregar a los tubos, el extracto enzimtico (menos a los blancos).
4. Incubar los tubos a 37 C, durante 10 min.
5. Sacar los tubos del bao y colocarlos en un bao de agua-hielo.
6. Agregar a los blancos la misma cantidad del extracto enzimtico.
6
Resultados
Temp.de
Absorbancia
reaccin
Muestra
Blco.
(cido
galacturnico)
mg/l
Conclusiones
Resultados - Conclusiones