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ISSN 0329-5559

FABICIB
Revista de la Facultad de Bioquímica
y Ciencias Biológicas de la
Universidad Nacional del Litoral

Volumen 17, Año 2013

Santa Fe, Argentina
2 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Director:
Dra. Yolanda Ana Rosa Bolzón de Lombardo
Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - Uiversidad Nacional del Litoral

Directores asociados:
Prof. Dr. Emilio Herrera Castillón
Director Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular
Facultad de Farmacia y Medicina
Universidad San Pablo
CEU – Madrid España
Dr. Manuel Jimenez Tenorio
Dpto. de Ciencia de los Materiales e Ing. Metalúrgica y Química Inorgánica
Facultad de Ciencias
Unversidad de Cádiz- Cádiz España
Dra. Regina Wikinski
Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de Buenos Aires

Comité Editorial:
Dra. Adriana G. Chicco, FBCB-UNL
Dr. Pablo Collins, INALI- CONICET
Dra. Georgina Tonarelli, FBCB-UNL

Secretaría:
Lic. Carlos L Negro INALI-CONICET

Los manuscritos deber ser enviados a:

Comité Editor
Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas
Universidad Nacional del Litoral
Ciudad Universitaria Paraje El Pozo
CC 242 (3000) Santa Fe – Argentina
FAX # 0342-4575221
Teléfono # 0342-4575211

Comité de evaluación externo
Dr. Edmundo Abramovich (Santa Fe), Dr. Enrique
Agullo (U.N.del Sur), Dra. Elida M. de G. Alvarez
(U.N.Bs.As.), Dra. Luz Allende (U.N.Bs.As.),
Dra. Patricia Amavet (U.N.Litoral), Dra. Clara
Anzaudo (Hospital de Niños, Santa Fe), Dra.
Cristina Arregui (U.N.Litoral), Dra. Clara Elisabeth
Badler de Libman (U.N. Rosario), Lic. María E.
Bar (U.N.Nordeste), Ing. Juan Carlos Basilico
(U.N.Litoral), Dra. Laura Bengoechea (UBA), Dra.
María de los Angeles Bistoni (U.N.Córdoba), Dr
Pablo Bolcatto (U.N.Litoral), Dra. Blanca C. de
Bracalenti (U.N.Rosario), Lic. Alejandra Campisi
(U.N.Mar del Plata), Dr. Pablo Carmanchahi
(INIBIOMA-CONICET S.C. de Bariloche), Dra.
Elena Carrera (U.N.Litotal), Dr. Osvaldo Cascone
(U.N.Bs.As.), Raquel Chan (U.N.Litoral), Dr. Lucio
Cichhitti (U.N.Cuyo), Dra., Prof Elly Cordiviola
de Yuan (Inst. Nac. de Limnología, Santa Fe),
Dra. Fabiana Cuezzo (U.N.Tucumán), Dr. Diego
De Mendoza (U.N.Rosario), Dr. Julio A. Deiber
(U.N.Litoral), Dra. Ana Maria Duffard (U.N.
Rosario), Dr Ricardo Duffard (U.N. Rosario), Ing.
Gustavo Echandía (U.N.Río Cuarto), Dra. Graciela
Escandar (U.N. Rosario), Dr Martín de la Peña
(U.N.Litoral), Dr. Belisario E. Fernandez (U.N.
Bs.As.), Dra. Liliana Forzani (IMAL, Santa Fe), Dr.
Ricardo L. Furlan (U.N.Rosario), Prof. María O.
García de Emiliani (Inst. Limnología, Santa Fe),
Dr Alejandro Giraudo (Inst. Nac. de Limnología,
Santa Fe), Héctor Goicoechea (CONICET,
U.N.Litoral), Dra. Nora Gómez (Inst. ILPLA),
Dr. Daniel González (U.N.Litoral), Lic. Graciela
Giangrossi (U.L.Litoral), Dr. Carlos A. Guzman
(U.N.Córdoba), Lic. Raúl F. Itria (INTI), Dra. Susana
José de Paggi (Inst. Nac. Limnología Santa Fe),
Dr Arturo Kehr (CECOAL-CONICET Corrientes),
Dra. Kneeteman (U.L.Litoral), Dr. Ricardo Kratje
(U.N.Litoral), Dr. Rafael Lajmanovich (U.N.Litoral),
Dra. Alicia Lamarque (U.N.Córdoba), Prof. Ing. Agr.
Victor Hugo Lallana (U.N.Entre Ríos), Dra. Argelia
Lenardón (U.N.Litoral), Dra. Cecilia Locascio
(U.N.Tucumán), Ing. Eduardo Agustín Lombardo
FABICIB. Revista Anual de la Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional
del Litoral. Se encuentra en el Catálogo de Latindex. Indexada en EBSCO
3
(U.N.Litoral), Dra. Clara Eder Lopez (U.N.Rosario),
Dr. Eduardo Lorenzatti (INTEC-CONICET-UNL),
Dra. Ileana Malan Borel (U.N.Litoral), MSc.
Mercedes Marchese (Inst.Nac. de Limnología,
Santa Fe), Dra. María Cristina Marinone (U.N.Bs.
As.), Dra. Marcela Martinelli (U.N.Litoral), MSc.
Emilce Mendez (U.N.Litoral), Dr. Ovide Menin
(U.N.Rosario),Dr. Carlos Merino (Museo Cs. Nat.
La Plata), Dr Roberto Meyer (U.N.Litoral), Dra. Dora
C. Micelli (U.N.Tucumán), Psic. Juana Molinas de
Rondina (U.N.Litoral), Dra. Gladis Monasterio
de Gonzo (U.N.Salta), Dr. Edgardo Moretti (U.N.
Córdoba), Dr. Juan Carlos Oberti (U.N.Córdoba),
Dr Alejandro Olivieri (U.N.Rosario), Dr. Mariano
Ordano (CIRPON-FML- Tucumán), Prof. Juan
César Paggi (Inst. Nac. Limnología, Santa Fe),
Dr. José A. Palma (U.N.Córdoba), Ing. José
Penciero (U.N.Litoral), Dra. María A. Perrillo (U.N.
Córdoba), Dra. Haydée Pizarro (U. N.Bs.As.), Dra.
Marcela Radice (U.N.Bs.As.), Dr. Jorge Reinheimer
(U.N.Litoral), Dra. Lilia A. Retegui (U.N.Bs.As), Dra.
Lila Ricci (U.N.M.del Plata), Dra. Clelia María Riera
(U.N.Córdoba), Dr. Roberto Rivarola (U.N.Rosario),
Dr. Solidario Romero (U.N.Litoral), Dr. Germán
A. Roth (U.N.Córdoba), Dra. Amelia Rubiolo
(U.N.Litoral), Dr. Salibian (U.N. Luján), Dr. Esteban
Sandoval Luque (U.N.Córdoba), Jorge Scagnetti
(U.N.Litoral), Dr. Arturo Simonetta (U.N.Litoral),
T.O. María H. Singla (U.N.M.del Plata), Dra. Nora
Slobodianik de Gurevich (U.N. Bs.As), Dra Irma
E. Sommerfelt (U.N.Bs.As), Dr. Rubén Spies
(CONICET-CERIDE Santa Fe), Dra. María J. Tacconi
De Alaniz (U.N.La Plata), Dra. Irma Tacconi de
Gomez Dumm (U.N.La Plata), Dra. Norma L. Tamer
(U.N.Santiago del Estero), Dr. Ramón A. Torres
(U.N.Bs.As), Dr. Gabriel Vinderola (U.N.Litoral),
Lic. Carlos Virasoro (Museo Ameghino, Santa Fe),
Dra. Susana Zacchino (U.N.Rosario), Dra. Yolanda
Zalocar de Domitrovich (CECOAL-CONICET
Corrientes), Dr. Gustavo Scrocchi (Inst. M. Lillio),
Dra. María L. Zapata (U.N.Litoral), Dra. Elsa Zerbini
(CONI, Santa Fe).
4 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
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FABICIB • Año 2013 • Volumen 17

Revista de la Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas
de la Universidad Nacional del Litoral

Sumario

9 Editorial

Trabajos completos
11 Herencia de factores de resistencia asociados a fusariosis de la espiga ligados
al cromosoma 3BS de trigo (Triticum aestivum L.) • Navarro, L.; Lassaga, S.L.
23 Evaluación del funcionamiento de un sistema público de atención de discapacidad
auditiva mediante métodos multivariados • Quaglino, M.B.; Vitelleschi, M.S.;
Maldonado, L.M.
33 Inactivación de Cryptosporidium spp. en estiércol de ganado vacuno por un sistema
de compostaje • Zerbatto, MG.; Lerman de Abramovich, B.; Groppelli, E.; Pizarro,
AV.; Modini, LB.
42 Evaluación de desempeño de un test de ELISA desarrollado por el grupo ANLIS–UNL
• Simil, E.; Lottersberger, J.; Vanasco, N.B.
51 Efecto diferencial de la fuente de grasas dietarias sobre las alteraciones hepáticas
inducidas por los conjugados del ácido linoleico en ratones • Scalerandi, M.V.;
González, M.A.; Saín, J.; Reus, V.; Lavandera, J.;Bernal, C.A.
66 Modelo experimental de infección de plantas de soja por especies de cercospora •
Latorre Rapela, M.G.; Maumary, R.; Marcipar, I.; Lurá, M.C.
74 Cuantificación simultánea de colorantes en bebidas deportivas utilizando
espectroscopia visible y PLS–1 • Rodríguez, M.C.; Schenone, A.V.; Sobrero, M.S.;
Marsili, N.R.
85 Efectos de los conjugados del ácido linoleico sobre la incorporación tisular de ácidos
grasos y metabolismo lipídico en ratas deficientes en ácidos grasos esenciales •
Fariña, A.C.; González, M.A.; Latorre, M.E.; Bernal, C.A.
103 Consumo de alimentos en los kioscos de escuelas primarias públicas de la ciudad
de Santa Fe • Follonier, M.; Bonelli, E.; Walz, F.; Fortino, M.A.; Martinelli, M.
113 Dieta del gaviotín chico (Sterna supercilliaris) (aves: Sternidae) en el valle de
inundación del río Paraná Medio, Argentina • Olguín, P.F.; Beltzer, A.H.; Campana, M.
6 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Comunicación breve
121 Ley de tránsito argentina y controles viales: controversias en las determinaciones
directas e indirectas de alcohol en sangre • Walz, M.F.; Sánchez, M.L.; Cerolini,
R.R.A.; Sosa, C.; Albornoz, M.A.

Divulgación
129 Investigación en ciencias de la salud • Cantora, AM.; Corti, M.R.; Giuggia de Stratta, M.G.

Trabajo de Revisión
137 Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariotas como agentes
terapéuticos y conservantes de alimentos • Tonarelli, G.; Simonetta, A.

Resúmenes de Tesis
Doctorados
179 Expresión de receptores de hormonas esteroides: subtipos e isoformas, en la
Enfermedad Quística Ovárica Bovina • Alfaro, N.S.
181 Conservación y divergencia funcional entre miembros de la familia de factores
de transcripción HD–Zip. Análisis molecular, evolutivo y de las redes de regulación
en las que participan • Arce, A.L.
183 Toxicidad y efectos fisiológicos del insecticida Endosulfán en peces neotropicales •
Bacchetta, C.
185 Infecciones fágicas en Lactobacillus plantarum. Caracterización e implicancias
indutriales • Briggiler Marcó, M.
188 Caracterización hematológica de especies de anfibios anuros con distribución en
los ecosistemas del litoral fluvial argentino (provincias de Entre Ríos y Santa Fe).
Potencialidad de su utilización como biomarcadores • Cabagna Zenklusen, M.C.
190 Diversidad de macroparásitos en especies ícticas de la Familia Pimelodidae, de la
llanura aluvial del río Paraná Medio • Chemes, S.B.
191 Estudios agronómicos en moha perenne —Setaria Lachnea (Nees) Kunth— • Exner, E.L.
194 Caracterización funcional de genes de girasol que codifican factores de transcripción
de la familia WRKY. HaWRKY6 y su regulación por el microRNA396 • Giacomelli, J.I.
196 Impacto de xenobióticos y comunicadores químicos sobre algunos procesos
biológicos en organismos del zooplancton • Gutierrez, M.F.
198 Relaciones de estructura a función y evolución de enzimas del metabolismo del
carbono. Caracterización de enzimas del metabolismo de hidratos de carbono en
bacterias autotróficas y heterotróficas • Machtey, M.
200 Actividad bacteriostática y bactericida de antibióticos betalactámicos y glucopéptidos
frente a cepas de Staphylococcus aureus de importancia clinica. Caracterización
genotípica de aislamientos tolerantes • Méndez, E.A.
203 Tolerancia y eficiencia de Typha domingensis Pers. en la retención de metales y
nutrientes de efluentes industriales • Mufarrege, M.M.
 7

205 Efectos de metales pesados sobre invertebrados bentónicos • Pavé, P.J.

207 Diseño, síntesis y evaluación de novedosos ligandos quirales derivados de TADDOL
• Perotti, J.P.
209 Estructura y desarrollo de las inflorescencias de especies de abildgaardia, bulbostylis y
fimbristylis (cyperaceae, cyperoideae, abildgaardieae) • Reutemann, A.G.
210 Desarrollo de Sistemas Inyectables Biodegradables con Formación in situ para la
Liberación Sostenida de Drogas Veterinarias • Turino, L.N.
212 Cambios en el potencial saludable y la calidad nutricional y sensorial de frutillas
mínimamente procesadas como consecuencia de las condiciones de procesamiento,
la temperatura y el tiempo de almacenamiento • Van de Velde, F.
215 Leptospirosis humana: estudio para la obtención de herramientas de diagnóstico y
evaluación de la utilidad del serodiagnóstico en diferentes etapas de la enfermedad •
Vanasco, N.B.
217 Estudio de la expresión de Heat Shock Proteins (HSPs) en el ovario bovino normal
y en condiciones patológicas • Velázquez, M.M.L
219 Propiedades ópticas y estructurales del silicio amorfo hidrogenado con diversos grados
de cristalinidad • Rinaldi, P.A.
221 Silicio cristalino para dispositivos fotovoltaicos • Budini, N.

Maestría
223 Alfabetización Científica de Personas Adultas Manipuladoras de Alimentos • Misetich, O.R.

Premios Mullor
225 Metabolismo energético y del poder reductor en células autótrofas y heterótrofas •
Piattoni, C.V.
234 Mecanismos moleculares de expresión de componentes de los complejos respiratorios
de plantas • Comelli, R.N.
239 De sarrollo de metodologías de preconcentración/fluorescencia molecular: monitoreo
ambiental y biológico de cadmio y níquel como marcadores de exposición y/o adicción
al tabaco • Talio, M.C.

Editorial
Estimados lectores de FABICIB
Hoy estamos llevándoles el n° 17 de nues-
tra Revista de la Facultad de Bioquímica y
Ciencias Biológicas de la UNL, herramienta
de divulgación científica para investigado-
res y docentes de nuestra Universidad y
otras Universidades y centros de investiga-
ción del país y la región.
Este volumen es editado en el año del
40° aniversario de la Facultad, el que ha
transcurrido con diversas actividades aca-
démicas, científicas y sociales, que han ser-
vido para fortalecer los vínculos internos de
nuestra comunidad educativa y visibilizar
más aún a la institución en el entorno social
donde estamos insertos.
Por otro lado, estamos terminando un
nuevo proceso democrático en la Universi-
dad que cerrará con la elección de autori-
dades por octava vez consecutiva desde la
vuelta a la democracia en 1983. En el caso
de nuestra Facultad, será también la octava
vez en forma consecutiva que elijamos
autoridades desde la normalización, reno-
vando nuestro Consejo Directivo, decano,
vicedecano, ratificando de esta manera el
espíritu democrático de nuestra institución y
el espíritu reformista que nos rige.
En este sentido, FABICIB continúa esta
búsqueda de interacción con la comuni-
dad científica, es una revista que posibilita
a toda la comunidad universitaria la divulga-
9
ción de los conocimientos generados, con
altos estándares de calidad, lo que posibili-
tan su reconocimiento.
Además continuamos publicando en este
número los resúmenes de tesis doctorales
defendidas en nuestras carreras de docto-
rado, con el objetivo de dar a conocer parte
de la producción en formación de posgrado
de mayor nivel. Es importante destacar
que durante este año, tanto el Doctorado
en Ciencias Biológicas como el Doctorado
en Física han sido acreditados con la cate-
goría A por 6 años por la CONEAU, lo que
posiciona a estas dos carreras dentro de
las de mayor calidad en Argentina. Éste es
un justo reconocimiento al trabajo realizado
por los diferentes grupos de investigación,
doctorandos y directores que han llevado a
cabo sus tesis en estas carreras y que con
sus producciones de altísimo nivel posibili-
taron este reconocimiento.
Invitamos a todos los docentes–investi-
gadores a seguir trabajando y publicando
sus investigaciones en FABICIB para que
esta revista pueda seguir creciendo y sir-
viendo a la difusión del conocimiento cien-
tífico en el país y la región.
Dr. Javier Lottersberger
Decano de la Facultad de Bioquímica y Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral
Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 11 a 22 11

Trabajo completo

Herencia de factores de resistencia RECIBIDO: 21/06/2012

asociados a fusariosis de la espiga ACEPTADO: 03/10/2012

ligados al cromosoma 3BS de trigo

(Triticum aestivum L.)

Navarro, L.1 • Lassaga, S.L.2,3

1
Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química.
Universidad Nacional del Litoral – Consejo Nacional de Investiga-
ciones Científicas y Técnicas. Ruta Nac. nº 168– Paraje El Pozo. CP
3000, Santa Fe, República Argentina.
2
Facultad de Ciencias Agropecuarias, UNER, Ruta Prov. nº 11,
CC 24, Km 10,5. CP 3101, Oro Verde, Paraná, Entre Ríos. República
Argentina.
3
INTA – Estación Experimental Agropecuaria Paraná, Ruta Prov.
nº 11, CC 128, Km 12,5 CP 3101, Oro Verde, Paraná, Entre Ríos.
E–mail: lucila.navarro84@gmail.com

RESUMEN: La fusariosis de la espiga (FE) de los genotipos que no poseían ningún

es una de las enfermedades fúngicas más
importantes que afecta el cultivo del trigo
(Triticum aestivum L.). En este trabajo se
realizó un análisis fenotípico en invernáculo
mediante la técnica de inoculación puntual
y una evaluación genotípica utilizando los
cebadores para los marcadores asociados
al QTL Qfhs.ndsu–3BS (asociado a la
resistencia tipo II) y al QTL Qfhs.ifa–5A
ubicado en el cromosoma 5A (resistencia
tipo I). Se lograron identificar los genotipos
que heredaron una parte del fragmento
cromosómico del QTL Qfhs.ndsu–3BS,
y asociarlo a un nivel de resistencia. Así,
el 64,3 % de los genotipos portadores
de parte del QTL fueron clasificados
como resistentes, mientras que el 67 %
fragmento fueron clasificados como
susceptibles, excepto dos genotipos que
exhibieron porcentajes de severidad bajos
y es posible que sean portadores de otros
QTLs para este tipo de resistencia.
Palabras clave: Triticum aestivum
L., Fusarium graminearum, QTL 3BS,
Resistencia tipo II.
SUMMARY: Inheritance of resistance
factors associated with Fusarium head
blight linked to chromosome 3BS of wheat
(Triticum aestivum L.)
Fusarium head blight (FHB) is one of the
most important fungal wheat (Triticum
aestivum L.) diseases worldwide. In this
12 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
research work, a phenotypic analysis
was performed using the technique of
inoculation point under greenhouse
conditions, and the genotypic evaluation
was taken using primers associated with
QTL Qfhs.ndsu–3BS (type II resistance)
and Qfhs.ifa–5A markers (type I resistance).
Genotypes that inherited a chromosomal
fragment of Qfhs.ndsu–3BS QTL could
be identified and were associated with
a resistance level. Thus, 64.3 % of the
Introducción
El trigo pan (Triticum aestivum L.) es uno
de los cultivos de cereales más importan-
tes del mundo, con un total de producción
de más de 600 millones de toneladas anua-
les (1). Su cantidad y calidad es afectada
cada año por las enfermedades fúngicas
que son las que prevalecen por su inciden-
cia en los años y regiones húmedas. Entre
ellas se puede destacar a la fusariosis de la
espiga (FE), que ha emergido como una de
las más serias enfermedades fúngicas (2).
El principal agente etiológico de esta plaga
a escala mundial es Fusarium graminearum
Schwabe, cuya forma sexual es Gibberella
zeae Petch (3).
Este patógeno es capaz de causar una
disminución en el rendimiento del grano de
hasta un 50 % en condiciones de epidemias
severas y variedades susceptibles. Además
disminuye su calidad, que se ven afectados
en su tamaño, poder y vigor germinativo (4);
a esto se le suma la producción por el pató-
geno de micotoxinas como Deoxinivalenol
(DON), lo que imposibilita la inserción de
estos granos en el sector alimenticio por su
efecto perjudicial para la salud de las per-
sonas (5).
genotypes that were carriers of QTL were
classified as resistant, while 67 %
of the genotypes that did not have any
fragments were classified as susceptible,
except 2 genotypes that exhibited
a low percentage of severity and may be
carriers of other QTLs for this type of
resistance.
Keywords: Triticum aestivum L.,
Fusarium graminearum, QTL 3BS, Type II
resistance.
Las actuales prácticas agronómicas y
aplicaciones químicas han tenido un éxito
limitado en el control de la enfermedad, por
eso el desarrollo de genotipos resistentes
parece ser el enfoque más práctico y eco-
nómico para obtener un medio ambiente
más saludable y un control sostenible de la
plaga por largo plazo (6,7).
La resistencia genética a la FE es de
carácter cuantitativo y puede ser separada
en cinco categorías: el tipo I, resistencia a la
infección inicial; tipo II, resistencia a la pro-
pagación de la infección; tipo III; resistencia
a la infección del grano; tipo IV, tolerancia; y
tipo V, resistencia a la acumulación de mico-
toxinas. No existe disponible una resistencia
completa, pero el tipo II es el más común y
sencillo de evaluar (8). Un importante locus
de carácter cuantitativo (quantitave trait
locus o QTL) para este tipo de resistencia
deriva del cultivar chino Sumai 3 y se ubica
en el cromosoma 3BS, y se lo denomina
Qfhs.ndsu–3BS, que por sí solo sería res-
ponsable del 24,8 al 60 % de la variabilidad
existente en la resistencia a FE (9). Este QTL
se ubica entre los marcadores microsaté-
lites Xgwm533 y Xgwm493 (9), y adicional-
mente se han identificado mediante mapeo
Navarro, L. y col. • Herencia de factores de resistencia...
fino de alta resolución marcadores mole-
culares internos (10). La selección asistida
por marcadores (marker–assisted selec-
tion, MAS) ofrece las herramientas necesa-
rias para identificar, seleccionar y combinar
alelos favorables por medio de la selección
genotípica de manera de incrementar la efi-
ciencia de un programa de mejoramiento.
Los objetivos de este trabajo fueron:
a) determinar la presencia de marcado-
res moleculares asociados a factores de
resistencia, b) evaluar el comportamiento
a campo y determinar la resistencia a fusa-
riosis de la espiga tipo II en invernáculo, c)
evaluar el impacto de la enfermedad en el
rendimiento y la calidad del grano.
Materiales y métodos
• Material vegetal
Se utilizaron 27 poblaciones avanzadas
F4 obtenidas mediante el cruzamiento de la
variedad Alsen con: variedades comerciales
como PROINTA molinero, PROINTA gau-
cho, ACA 223 y Klein Don Enrique; y líneas
del programa de mejoramiento genético de
INTA.
Cabe destacar que la variedad Alsen
posee a Sumai 3 como progenitor y es
portador de un fragmento del QTL Qfhs.
ndsu–3BS, amplificando solo el marca-
dor flanqueante Xgwm533. Veinte de estas
poblaciones fueron previamente seleccio-
nadas por poseer este marcador en hete-
rocigosis; y todas fueron llevadas a campo
donde se determinó la presencia o ausen-
cia de la enfermedad por infección natural
dentro de una misma población, y se selec-
cionaron al azar 5 espigas sanas y 5 espi-
gas enfermas, provenientes de diferentes
plantas. Cada espiga se siguió en forma
individual y eso permitió separar cada uno
13
de los cruzamientos en 2 grupos: espigas
sanas y espigas enfermas.
• Evaluación del impacto en el peso y
número de granos por espiga
Para evaluar el impacto de la enferme-
dad en el rendimiento, los granos de cada
una de las 270 espigas fueron contados y
pesados; y con estos valores se determinó
el peso promedio de 1000 granos.
Los resultados fueron analizados por el
programa SAS (1989) (11) mediante el pro-
cedimiento ANOVA (Análisis de varianza) y
prueba de Duncan (test de rango múltiple).
• Análisis genotípico
Para realizar el seguimiento de los genoti-
pos previamente seleccionados, se analiza-
ron los marcadores moleculares flanquean-
tes Xgwm533 y Xgwm493, y el marcador
interno XSTS 3BS–66, para determinar con
mayor precisión el fragmento cromosómico
heredado y los posibles eventos de recom-
binación. También se evaluaron: el marca-
dor flanqueante Xgwm293 y el marcador
Xgwm129, interno al QTL Qfhs.ifa–5A ubi-
cado en el cromosoma 5A, asociado a la
resistencia tipo I.
Se realizaron extracciones de ADN de
plántulas crecidas en oscuridad por 7 días
según la metodología del CIMMYT para
extracción de ADN de trigo y maíz (12), a
la cual se le adicionó un paso de trata-
miento con ribonucleasa (ARNasa). Para
evaluar la calidad del ADN obtenido se rea-
lizaron corridas electroforéticas en geles de
agarosa al 0,8 % utilizando una cuba Wide
Mini – Sub Cell GT de Bio Rad®. Las reac-
ciones de PCR se realizaron en un volu-
men final de 10 μl. A 5 μl de ADN templado
(50–100 ng) proveniente de cada genotipo
14 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
se le adicionó 1,85 μl de agua, 1 μl buffer
PCR 1x (KCl), 0,6 μl de MgCl2 (1,5 mM),
0,8 μl dNTPs (10 mM), 0,3 μl de cada par
de cebadores (10 μM) y 0,15 μl de Taq ADN
polimerasa (5U/μl).
Se utilizó un termociclador MJ Research,
Inc. – PTC–100, empleando los cebadores
específicos Xgwm493 y Xgwm533 que flan-
quean el QTL Qfhs.ndsu–3BS y el marcador
interno XSTS3BS–66 (13). Y los cebadores
para los marcadores Xgwm129 y Xgwm293
asociados al QTL Qfhs.ifa–5A (13).
Los productos de cada amplificación fue-
ron resueltos en geles de poliacrilamida al
6 %, en una cuba de electroforesis Sequi–
Gene GT de Bio Rad® en condiciones de vol-
taje constante (1500V) durante aproximada-
mente 90 min. Una vez terminada la corrida
electroforética, se procedió a la tinción del
gel con solución de AgNO3, 1g/l y posterior
revelado con solución de Na2CO3, 30 g/l.
• Análisis fenotípico
Para evaluar la resistencia tipo II en inver-
náculo se utilizó la técnica por inoculación
puntual. El inóculo consistió de aislamien-
tos patogénicos de Fusarium graminearum,
recolectados del campo a partir de espigas
de trigo infectadas con el hongo.
Para esto se sembraron 6 semillas de los
genotipos seleccionados, una vez que alcan-
zaron el periodo de floración, cinco espigas
de cada genotipo fueron inoculadas con el
patógeno, mediante una aplicación puntual.
Una pieza de algodón embebida en una sus-
pensión de inóculo (5x104–1x105 esporos/
mL de agua destilada) fue depositada entre
la espiguilla y el raquis de la espiga de una
flor correspondiente a una espiguilla ubi-
cada a 2/3 de distancia desde la base de
la espiga. Posteriormente, las espigas fue-
ron pulverizadas con agua y cubiertas con
una bolsa de polipropileno donde también
se colocó una pieza de algodón humede-
cida con agua, con el fin de incrementar la
humedad y favorecer los primeros estadios
de colonización del hongo. Éstas fueron reti-
radas 48 horas luego y 15 días post–inocu-
lación se procede a la evaluación de sínto-
mas utilizando una escala visual de Stack
y McMullen (1993) (14). De esta manera se
determinó el porcentaje de severidad, defi-
nido como el número de espiguillas infec-
tadas con respecto al número de espigui-
llas totales por espiga. Este porcentaje fue
promediado para cada genotipo y de esta
manera las plantas fueron clasificadas como
resistentes (R: 25 %), moderadamente resis-
tentes (MR: 25 – 50 %), moderadamente sus-
ceptibles (MS: 50 – 75 %) ó susceptibles (S:
>75 %) (15).
Resultados y discusión
• Evaluación del impacto en el peso y
número de granos por espiga
La mayoría de los granos provenientes
de espigas enfermas exhibieron los sínto-
mas característicos de la enfermedad; eran
de tamaño menor, de superficie rugosa y
decolorados.
Adicionalmente, cabe destacar dos
líneas (892–1 y 897–1) que a pesar de
que las espigas fueron clasificadas como
sanas, por las observaciones realizadas a
campo, los granos presentaban los sínto-
mas característicos de la infección, como
se observa en la Fotografía 1. Esto es de
vital importancia ya que estas semillas pue-
den contener ciertos niveles de micotoxinas
y que debido a no presentar síntomas visi-
bles en la espiga se subvalore la enferme-
dad cuando se realiza una selección visual.
Navarro, L. y col. • Herencia de factores de resistencia... 15

Fotografía 1. Comparación de semillas provenientes de espigas sanas de los genotipos 892–1 (1) (a
la izquierda) y 897–1 (2) (a la derecha).

En general, la enfermedad tuvo un bajo medias significativa de espigas sanas res-

impacto sobre el número de granos por pecto de las enfermas. En la Figura 1 se
espiga, solo tres de las veintisiete líneas muestran los porcentajes de disminución
examinadas mostraron una diferencia de para cada una de las líneas evaluadas.

Figura 1. Porcentajes de disminución del número de semillas por espiga. Las barras resaltadas en
oscuro indican los valores con una diferencia de media significativa.

50

40
% de disminución

30

20

10

0
853- 1
853- 3
853- 4
853- 5
855- 1
855- 3
855- 4
855- 5
855- 6
857- 1
857- 2
857- 4
857- 5
859- 5
861- 6
862- 1
863- 3
889- 5
892- 1
893- 2
897- 1
897- 3
898- 1
899- 1
899- 2
899- 4
-10
899- 5
-20
Líneas

En cambio, al analizar los valores de gas sanas respecto de las enfermas. En la

los pesos de mil granos, se observa que Figura 2 se exhiben los porcentajes de dis-
once de las veintisiete líneas dieron una minución para este parámetro en función de
diferencia de medias significativa de espi- las líneas evaluadas.

Figura 2. Porcentajes de disminución del peso de mil granos. Las barras resaltadas en oscuro indican
los valores con una diferencia de media significativa.

50,0

40,0
% d e d is minuc ió n

30,0

20,0

10,0

0,0
853- 1
853- 3
853- 4
853- 5
855- 1
855- 3
855- 4
855- 5
855- 6
857- 1
857- 2
857- 4
857- 5
859- 5
861- 6
862- 1
863- 3
889- 5
892- 1
893- 2
897- 1
897- 3
898- 1
899- 1
899- 2
899- 4
899- 5

-10,0

Líne a s
16 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Estos resultados concuerdan con lo pub- • Evaluación genotípica y fenotípica

licado por Jiang et al. (2006) (16), que esta-
blece que la pérdida de rendimiento por
la enfermedad es debida más a una dis-
minución en el peso de las semillas que al
número de granos por espiga.
Con respecto al análisis molecular, en la
Fotografía 2 se muestran dos geles de polia-
crilamida al 6 % en los que se resuelven las
amplificaciones de los marcadores XSTS
3BS–66 (izquierda) y Xgwm533 (derecha).

Fotografía 2. Comparación de semillas provenientes de espigas sanas de los genotipos 892–1 (1) (a
la izquierda) y 897–1 (2) (a la derecha). Gel de poliacrilamida al 6 % para marcadores en Qfhs.ndsu–
3BS. Resolución de bandas de los marcadores XSTS 3BS–66 (izquierda) y Xgwm533 (derecha). A la
izquierda del marcador de peso molecular se ubica la amplificación de Sumai 3 para ambos inicia-
dores y a su izquierda, la de Alsen. Cada banda se identifica con una letra: a corresponde al locus
Xgwm533.1; b corresponde a un alelo no asociado a la resistencia; c, locus Xgwm533.2; d, marca-
dor XSTS 3BS–66; e y f, formas alélicas del marcador XSTS 3BS–66.

d
e f
a

100 pb c 100 pb

El alelo asociado a la resistencia pertene- entre 95 y 100 pb que corresponde al locus

ciente al marcador XSTS 3BS–66 tiene una
longitud de 192 pb (indicado con la letra d);
adicionalmente se observaron otras formas
alélicas, una banda de 185 pb (denotada
con la letra e) y otra de180 pb (expresada
con la letra f). Por otro lado el marcador
Xgwm533, genera un alelo asociado a la
resistencia de 145 pb correspondiente al
locus Xgwm533.1 (denotado con la letra
a); Sumai 3 también amplifica una banda
Xgwm533.2 (señalada con la letra c). Ade-
más, en algunos genotipos se produjo un
amplicón de 119 pb correspondiente a un
alelo no asociado a la resistencia (indicada
con la letra b) (9).
Ninguno de los genotipos evaluados
amplificó para el marcador Xgwm493, indi-
cando que ninguno posee el QTL en el cro-
mosoma 3BS completo. Si bien la variedad
Alsen tampoco amplifica para este marca-
Navarro, L. y col. • Herencia de factores de resistencia...
dor, se realizó esta determinación para veri-
ficar la posible procedencia de este micro-
satélite del otro progenitor involucrado en el
cruzamiento, ya que al momento de la eva-
luación no se contó con este segundo pro-
genitor.
En cuanto al marcador Xgwm533, el 77 %
del material previamente seleccionado por
poseer este microsatélite amplificó dando
la banda correspondiente al alelo de resis-
tencia. Adicionalmente, se comprobó que
todos estos genotipos también eran por-
tadores del marcador STS 3BS–66 al igual
que Alsen, indicando que existe una ele-
vada probabilidad de que el material haya
heredado todo el fragmento del QTL del
que es portador esta variedad.
La presencia de este QTL de resistencia
no determinó una diferencia entre plantas
sanas y enfermas, ya que los marcadores
se presentaron en proporciones similares
en ambos grupos. Hay que tener en cuenta
que a pesar de que los genotipos sean por-
tadores del QTL analizado pueden igual-
mente presentar ciertos niveles de infección
ya que no existe disponible en la actuali-
dad una resistencia completa para este tipo
de patología. Asimismo, cabe resaltar que
esta clasificación fue obtenida en base a la
observación de síntomas durante su evalua-
ción a campo (bajo infección natural) y que
en estos casos se ponen en juego nume-
rosos factores que hacen que aumente la
variabilidad existente en este tipo de rasgo.
También hay que tener en cuenta los posi-
bles efectos pleiotrópicos de la morfología
vegetal que le puedan conferir a la planta
un mecanismo de escape y que puedan
17
ser confundidos con una resistencia gené-
tica verdadera (16). Por estas razones se
hace necesaria una adecuada caracteriza-
ción fenotípica para lograr una mejor aso-
ciación entre la expresión de la enfermedad
y el nivel de resistencia genética.
Lamentablemente, no se lograron obtener
todos los valores de los porcentajes de seve-
ridad ya que la mayoría de las plantas pro-
venientes de semillas enfermas tuvieron difi-
cultades para desarrollarse; a pesar de que
germinaron, lo hicieron formando una plántula
muy débil y de menor vigor, razón por la cual
no pudieron generar una planta de caracte-
rísticas fisiológicas óptimas que le permitan
cumplir con un ciclo de vida completo.
En la Tabla 1 se muestran los valores pro-
medios de los porcentajes de severidad y
la presencia o no del fragmento del QTL en
el cromosoma 3BS asociado a este rasgo
fenotípico. Se puede observar que los tes-
tigos resistentes (Sumai 3 y Alsen) presen-
taron porcentajes bajos mientras que el tes-
tigo susceptible (Molinero) exhibió un valor
elevado.
Hay que destacar el caso de los geno-
tipos derivados del cruzamiento 859–5, en
los cuales no se observó una diferencia
importante en los porcentajes fenotípicos,
siendo para el caso en que no posee nin-
gún marcador un valor levemente menor
(25,8 %)(Genotipo 1) que para el caso que
posee ambos (34,2 %) (Genotipo 2). Esto
puede deberse a la presencia de otros
QTLs para resistencia tipo II que no se
encuentren asociados al cromosoma 3BS
y que debido a su carácter aditivo le haya
conferido un nivel de resistencia elevado.
18 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Tabla 1. Porcentaje de severidad y marcadores asociados a resistencia tipo II de genotipos de plantas

enfermas, plantas sanas y testigos.

Plantas enfermas
Xgwm533 +
Cruzamiento Genotipo Severidad
STS3B–66
899–1 2 10,5 Sí
899–5 1 21,6 Sí
859–5 1 25,8 No
897–3 1 32,6 Sí
855–5 1 98 No

Plantas sanas
Xgwm533 +
Cruzamiento Genotipo Severidad
STS3B–66
897–1 2 2,8 Sí
892–1 1 8,67 Sí
853–1 4 7 Sí
863–3 1 7 Sí
862–1 1 8,4 Sí
853–4 1 12,25 Sí
855–3 5 12,6 Sí
899–5 2 21,2 Sí
855–1 1 24,2 No
859–5 1 26 Sí
855–5 3 32,8 Sí
859–5 2 34,2 Sí
899–1 2 39,4 No
857–4 1 43,2 No
899–1 1 45 Sí
853–5 1 59 No
853–1 1 75,8 No
857–2 2 85,8 No
855–3 1 89,75 No
857–5 1 100 No
857–1 1 100 No

Testigos
Xgwm533 +
Tipo Variedad Severidad
STS3B–66
Susceptible MOLINERO 72,2 No
Resistente SUMAI 3 16,5 Sí
Resistente ALSEN 9,8 Sí
Navarro, L. y col. • Herencia de factores de resistencia... 19

En la Figura 3 se observan los porcen- gris claro), también se incluyeron los valores
tajes de severidad discriminando aque- de los testigos Molinero (ningún marcador),
llas líneas que poseían ambos marcadores Alsen (Xgwm533 y XSTS 3BS–66) y Sumai 3
en el cromosoma 3BS (resaltadas en gris (Xgwm533, XSTS 3BS–66 y Xgwm493).
oscuro) y las que no poseían ninguno (en

Figura 3. Porcentajes de severidades. Genotipos que no poseen marcadores (gris claro), que poseen
dos para resistencia tipo II (gris oscuro) y testigos; susceptible (Molinero) y resistentes (Alsen y Sumai 3).

Molinero
100
90
80
% de severidad

70
60
50
Sumai 3

40
30
Alsen

20
10
0
897-1 (2)
853-1 (4)
863-3 (1)
862-1(1)
892-1 (1)

899-1 (2)
853-4 (1)
855-3 (5)

899-5 (2)
899-5 (1)
855-1 (1)
859-5 (1)
859-5 (1)
897-3 (1)
855-5 (3)
859-5 (2)
899-1 (2)
857-4 (1)
899-1 (1)
853-5 (1)

853-1 (1)
857-2 (2)
855-3 (1)
855-5 (1)
857-5 (1)
857-1 (1)
Molinero
Alsen

Sumai 3

Líneas

Se puede advertir claramente una aso- severidad menor al registrado para Sumai
ciación entre la presencia del fragmento 3 a pesar de que sólo posee un fragmento
del QTL en el cromosoma 3BS y los por- del QTL, lo que hace óptima su utilización
centajes de severidad, distinguiendo que en programas de cruzamiento como fuente
aquellos genotipos que no poseían ningún de resistencia.
marcador registraban los valores más altos Para tener un mejor entendimiento del
alcanzando en los casos más extremos comportamiento de la resistencia a campo,
hasta un 100 % de severidad. De este mate- se decidió utilizar marcadores para eva-
rial que no amplificó para ningún marca- luar la resistencia a la penetración del
dor, casi el 67 % fue clasificado como sus- hongo (tipo I). Para ello, se evaluó el mar-
ceptible. Mientras que para aquellos que cador flanqueante Xgwm293 y el marcador
eran portadores de ambos marcadores se Xgwm129, interno al QTL Qfhs.ifa–5A ubi-
obtuvieron los porcentajes más bajos los cado en el cromosoma 5A.
cuales nunca superaron el 45 % de seve- En la Fotografía 3 se observa el patrón
ridad, siendo el 64,3 % de éstas clasifica- de bandas de las amplificaciones obteni-
das como resistentes y para ciertos geno- das para el marcador interno Xgwm129 a
tipos este porcentaje fenotípico fue incluso la izquierda y para el marcador flanqueante
menor al observado para la variedad Alsen. Xgwm293 a la derecha.
Asimismo, esta última exhibió un nivel de
20 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Fotografía 2. Gel de poliacrilamida al 6 % para marcadores en Qfhs.ifa–5A. Resolución de bandas

para el marcador molecular Xgwm129 (derecha), a la izquierda del marcador de peso molecular se
ubica la variedad Alsen, y Xgwm293 (izquierda). Cada amplicón fue identificado con una letra: k,
banda asociada a la resistencia; j, alelo del marcador Xgwm129 que no se encuentra asociado a la
resistencia; g, alelo de resistencia de Xgwm293 y h, alelo no asociado a la resistencia.

g
h
K
j

150 pb
150 pb

El amplicón asociado a la resistencia nación internos ubicados entre estos dos

para el marcador interno, tiene una longitud
entre 220 y 230 pb (denotado con la letra
k) y un alelo de 215 pb (representado con
la letra j). En cuanto al marcador Xgwm293,
amplifica un alelo de resistencia de 208 pb
(indicado con la letra g) además amplifica
otro alelo de 195 pb (denotado con la letra
h) no asociado a la resistencia.
El marcador molecular Xgwm129 se
encontró en la mayoría de los genotipos
evaluados, presenciándose en 250 de los
270 genotipos totales. Sin embargo no se
vio este mismo patrón para el marcador
flanqueante Xgwmn293, amplificando el
alelo de resistencia en solo cuatro líneas
que adicionalmente eran portadoras del
marcador interno.
Debido a que Alsen es portador de
ambos marcadores, se puede decir que en
esta población hubo procesos de recombi-
microsatélites. Hay que destacar que estos
resultados no concuerdan con lo publicado
por Buerstmayr et al. (2009) (17) que ase-
gura que en este sector cromosómico se
haya altamente suprimida la recombinación.
La presencia de este QTL de resisten-
cia tampoco determinó las diferencias entre
plantas sanas y enfermas, ya que los mar-
cadores se distribuyeron uniformemente
entre ambos grupos. Asimismo, no se pudo
encontrar una asociación entre la presen-
cia de estos marcadores y los porcentajes
fenotípicos para la resistencia tipo II. Esto
concuerda con lo publicado por Buerstmay
et al. (2003) (18) el cual establece que la
presencia del QTL Qfhs.ifa–5A muestra un
efecto considerablemente menor en com-
paración al observado para el QTL Qfhs.
ndsu–3BS luego de realizar el método de
inoculación puntual.
Navarro, L. y col. • Herencia de factores de resistencia...
Conclusiones
Para el material vegetal evaluado, la fusa-
riosis de la espiga tiene un mayor impacto
en el llenado del grano que en el número de
semillas por espiga.
La variedad Alsen es una buena fuente
de resistencia genética tipo II para la fusa-
riosis de la espiga. El fragmento del QTL
Qfhs.ndsu–3BS del que es portador esta
variedad explica gran parte de la resisten-
cia tipo II, constituyendo una herramienta
útil para la selección asistida por marcado-
res. Además, no se observa una recombi-
nación entre los marcadores XSTS 3BS–66
y Xgwm533.
Es posible la recombinación interna entre
los marcadores moleculares Xgwm129 y
Xgwm293 del cromosoma 5A.
Nota
1. Parte del trabajo fue publicada en: “Herencia
de factores de resistencia asociados a fusariosis
de la espiga ligados al cromosoma 3BS de trigo
(Triticum aestivum L.)”. XII Encuentro de Jóvenes
Investigadores de la UNL y III Encuentro de Jóve-
nes Investigadores de Universidades de Santa
Fe. Santa Fe, 2008.
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22 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 23 a 32 23

Trabajo completo

Evaluación del funcionamiento RECIBIDO: 27/05/2013

de un sistema público de atención ACEPTADO: 13/09/2013

de discapacidad auditiva mediante

métodos multivariados

Quaglino, M.B. • Vitelleschi, M.S. • Maldonado, L.M.

Instituto de Investigaciones Teóricas y Aplicadas de la Escuela de

Estadística. Facultad de Ciencias Económicas y Estadística. Univer-
sidad Nacional de Rosario. Bv. Oroño 1261 (2000) Rosario, Santa
Fe, Argentina.
E–mail: mvitelle@fcecon.unr.edu.ar

RESUMEN: En la Secretaria de Salud para obtener una descripción integral,

Pública de la Municipalidad de Rosario
funciona el Centro Integral de la Audición
(CeIA), donde se lleva a cabo un programa
denominado “Sistema de Atención de la
Discapacidad Auditiva” dirigido a niños
nacidos en nosocomios públicos de la
ciudad. Su objetivo es la identificación y
monitoreo de los problemas de audición
en los recién nacidos. El diagnóstico de
hipoacusia realizado tempranamente
mejora el desarrollo del lenguaje,
habilidades cognitivas, sociales y
emocionales del niño.
Con el objeto de evaluar el funcionamiento
del programa y establecer el grado
de avance en el cumplimiento de sus
objetivos, se analizó información sobre
todos los niños atendidos en el Centro
entre 1997 a 2006 (4607). Se estudió
la evolución de diferentes indicadores
univariados y se aplicó la técnica de
Análisis de Correspondencias Múltiples
considerando las interrelaciones de las
variables en estudio. Se pudo observar que
el CeIA ha mejorado su funcionamiento,
acercándose a los objetivos propuestos.
Palabras clave: Hipoacusia,
Atención primaria de la salud, Análisis de
correspondencias múltiples.
SUMMARY: The Integral Hearing Center
(CeIA), which is part of the department of
Public Health of the Municipality of Rosario,
delivers a program called “Care System for
Hearing Disabilities”. It is a care program
for children born in public hospitals of
the city that aims to identify and monitor
hearing problems in newborns. The early
diagnosis of hearing loss significantly
improves the development of language and
of the cognitive, social and emotional skills
of the child.
24 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
In order to evaluate the performance of
the program and to assess the degree
of achievement of its goals, a multiple
correspondence analysis was applied to
information from 4607 children treated at the
CeIA from January 1997 to December 2006.
The multivariate approach allowed
obtaining an integral description of the
children´s characteristics by considering
Introducción
El rastreo de los problemas de la audi-
ción en los recién nacidos brinda la oportu-
nidad de reducir la edad promedio de iden-
tificación de una pérdida auditiva y mejora
el pronóstico del niño. Las consecuencias
de una hipoacusia no detectada temprana-
mente tienen un impacto negativo en la evo-
lución del lenguaje, habilidades cognitivas,
sociales y emocionales (1).
La Secretaría de Salud Pública de la
Municipalidad de Rosario notó una falta
de respuesta a la demanda comunitaria en
relación a las hipoacusias neonatales. Tra-
tando de cubrir esta demanda se convocó
a un grupo de profesionales del área, que
presentaron un proyecto acorde con las
declaraciones de consenso sobre el tema
según la OMS y otras instituciones (2, 3, 4,
5). A partir de la convocatoria, se conformó
el Centro Integral de la Audición (CeIA),
donde se lleva a cabo un programa denomi-
nado “Sistema de Atención de la Discapa-
cidad Auditiva”, que propone la realización
de una investigación continua tendiendo a
la prevención auditiva en los niños. Para ello
se especificaron tres cursos de acción:
the interrelations between the variables
under study. It was observed that the
CeIA has improved its operation and is
approaching the fulfilment of its goals. This
encourages professionals to persevere in
the continuity of the System.
Keywords: Hearing impairment, Primary
attention of health, Multiple correspondence
analysis.
• El “Programa de Prevención Primaria”,
cuyo objetivo es disminuir la incidencia del
deterioro auditivo en la población.
• El “Programa de Detección Temprana”,
que tiene como meta la captación de la
población con riesgo de pérdida auditiva
durante el primer mes de vida y el diagnós-
tico de la hipoacusia antes del tercer mes.
El mismo está integrado por los Progra-
mas de Monitoreo y de Screening Auditivo
por Factores de Riesgo. El propósito del
Programa de Monitoreo es examinar por lo
menos al 95 % de los recién nacidos con
el fin de asegurar que no se excluyan los
niños con pérdidas auditivas significativas
de aparición tardía (6,7, 8, 9).
• El “Programa de Rehabilitación” tiene
como objetivo lograr un pronto y adecuado
equipamiento protésico e iniciar la estimula-
ción auditiva y del lenguaje antes del sexto
mes de vida.
El Centro, luego de 10 años de su crea-
ción, tuvo interés en evaluar el funciona-
miento del Sistema de Detección de la Dis-
capacidad Auditiva en relación al grado de
avance en el cumplimiento de sus objetivos y
realizar una caracterización multivariada del
grupo poblacional atendido en el mismo.
Quaglino, M.B. y col. • Evaluación del funcionamiento de un sistema público...
Material
Se estudiaron en forma retrospectiva las
historias clínicas de 4607 niños, entre 0 y
14 años, que fueron atendidos durante el
período comprendido entre enero de 1997 y
diciembre de 2006, por los profesionales del
CeIA. Dicha edad fue establecida por el Cen-
tro porque coincide con la edad de la pobla-
ción que consulta en hospitales infantiles.
Las variables que componen la base de
datos son: año de ingreso1 del niño al Sis-
tema, que corresponde al año calendario en
que se efectúa la primera consulta; sexo del
niño atendido; edad del niño a la fecha de
la primera consulta; edad del niño cuando
se confirma el diagnóstico; edad del niño
cuando se realiza la selección de la prótesis
auditiva; edad del niño al momento del equi-
pamiento auditivo; edad del niño cuando
comienza el tratamiento de habilitación y/o
rehabilitación auditiva; tiempo transcurrido
desde la primera consulta hasta el diagnós-
tico; condición de tratamiento (alta por audi-
ción normal, alta del servicio, abandono o
ausencia del sistema, seguimiento y reha-
bilitación o selección de audífono); tipo de
hipoacusia (perceptiva, conductiva, mixta,
se desconoce o no corresponde); nivel de
hipoacusia (leve, moderada, severa o pro-
funda); lado del oído afectado (unilateral,
bilateral, se desconoce o no corresponde);
existencia de factores de riesgo y diagnós-
tico (hipoacusia, audición normal o en pro-
ceso de diagnóstico).
25
Método
Se realizó una descripción univariada de
las variables en estudio utilizando frecuen-
cias, porcentajes y medianas, según el
caso. Para caracterizar a todos los niños del
Sistema, en base al conjunto de variables
consideradas, se usó la técnica de Análisis
de Correspondencias Múltiple (10,11), con
la cual es posible encontrar una represen-
tación multidimensional de la dependen-
cia entre variables categóricas representa-
das por las filas y columnas de una tabla de
contingencia. Se evaluó la capacidad diag-
nóstica de distintos indicadores de riesgo
en forma individual y conjunta a través del
cálculo de sensibilidad, especificidad y
valores predictivos positivo y negativo con
sus intervalos de confianza del 95 % (IC).
Como clasificador de hipoacusia se consi-
deró el screening por factores de riesgo, el
cual forma parte del programa y constituía
la práctica usual en el Centro en el período
bajo estudio (2).
Resultados
De los 4607 niños en estudio el 63 %
eran normoyentes, el 19 % estaban en pro-
ceso de diagnóstico a la fecha de cierre del
estudio y el 18 % presentaban algún tipo
de hipoacusia. El 55,4 % del grupo en estu-
dio fueron varones y el 44,6 % mujeres. La
mediana de la edad a la primera consulta
de los niños normoyentes fue mucho menor
que la de los niños con hipoacusia, a tra-
vés de todos los años estudiados. A su vez
la mediana de la edad de los niños en pro-
ceso de diagnóstico fue inferior a la de los
niños con audición normal. Además, las
medianas de las edades para los tres gru-
pos decrecen a partir del año 2002 con res-
pecto a los primeros años (Figura 1).
26 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Figura 1: Evolución anual de la mediana de la edad de los niños a la primera consulta al

CeIA, según diagnóstico.

El porcentaje de ausentismo de todos tes al sistema no poseía diagnóstico. Ade-

los niños disminuyó anualmente desde un más, la cobertura del Programa de Monito-
41,9 % en su primer año de funcionamiento reo de Detección Temprana aumentó en el
del Centro hasta un 5,6 % en el último año transcurso de los años, de un 67,1 % a un
del estudio. La mayoría de los niños ausen- 95,8 % (Tabla1).

Tabla 1: Cantidad de niños evaluados, ingresados y porcentaje de cobertura de moni-

toreo.

Año de Total de niños Total de niños Cobertura de

ingreso evaluados ingresados monitoreo
1997 112 167 67,1 %
1998 195 293 66,6 %
1999 269 374 71,9 %
2000 386 493 78,3 %
2001 619 723 85,6 %
2002 352 393 89,6 %
2003 566 636 89,0 %
2004 554 629 88,1 %
2005 272 350 77,7 %
2006 526 549 95,8 %
Total 3851 4607 83,6 %
Quaglino, M.B. y col. • Evaluación del funcionamiento de un sistema público...
El porcentaje de niños que se diagnos-
ticaron en el mismo día de la primera con-
Figura 2: Evolución del porcentaje de niños por tiempo transcurrido hasta el diagnós-
tico.
De los 833 niños con diagnóstico de
hipoacusia, el 59 % presentó hipoacusia
perceptiva, el 39 % hipoacusia conductiva y
el 2 % hipoacusia mixta. El 53,7 % era varón
y el 46,3 % mujer. Por otra parte, al 80,9 %
se le concedió el alta de servicio, el 12,5 %
se ausentó, el 6 % quedó en tratamiento
de rehabilitación o selección de audífono y
sólo el 0,6 % se mantuvo en seguimiento.
Dentro del grupo de niños con diagnóstico
de audición normal, al 97,8 % se le otorgó el
alta de normalidad, el 1,4 % se ausentó y el
0,8 % estaba en seguimiento, estos últimos,
aunque normoacúsicos, presentaron algún
factor de riesgo de tipo tardío, lo cual requi-
rió de controles periódicos.
27
sulta se mantuvo por encima del 70 % a tra-
vés de los años en estudio (Figura 2).
El tiempo medio que se tardó en proveer
del equipamiento auricular a los niños con
hipoacusia disminuyó de 3 meses y medio
en el año de ingreso 1997 a 1 mes en 2006.
La mediana anual del tiempo entre la pri-
mera consulta y el comienzo del tratamiento
fue inferior a los 6 meses, salvo en 2002,
que fue de 10 meses y 10 días.
El Programa de Detección Temprana
estableció entre sus objetivos que la pri-
mera consulta debería ser antes del primer
mes de vida del niño con riesgo de pér-
dida auditiva y su diagnóstico antes del ter-
cer mes, en consecuencia sería necesario
diagnosticar al niño en un tiempo menor a
2 meses. Se encontró que sólo el 4,9 % (20
28 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
de 418) de los niños con hipoacusia per-
ceptiva ingresaron al Centro antes del pri-
mer mes de vida. Sin embargo, el 74 % de
ellos fueron diagnosticados en un tiempo
menor de 2 meses.
Se estudió la incidencia de cada factor
indicador de riesgo entre los niños con diag-
nóstico (normoacúsicos e hipoacúsicos).
La Figura 3 muestra el porcentaje de niños
Figura 3: Porcentaje de niños del Sistema según indicador de riesgo y diagnóstico.
Período: 1997–2006.
Se calcularon las razones de odds de
hipoacusia para cada indicador de riesgo.
La mayor de ellas correspondió a la rubéola
(16,79 p=0,000), lo que implica que el
del Sistema según el indicador de riesgo y
diagnóstico. Para los niños con hipoacu-
sia, los cuatro factores de riesgo más fre-
cuentes, en orden de importancia, fueron:
sospecha de hipoacusia, otitis media reci-
divante, retardo del lenguaje y consumo de
ototóxicos. Para los niños con normoacusia
el factor de riesgo más frecuente fue el con-
sumo de ototóxicos.
riesgo de hipoacusia entre niños que tuvie-
ron rubéola es 17 veces más que entre los
que no la tuvieron.
Quaglino, M.B. y col. • Evaluación del funcionamiento de un sistema público...
Para cada indicador de riesgo se calcu-
laron: sensibilidad, especificidad, valor pre-
dictivo positivo (VPP) y valor predictivo nega-
tivo (VPN). La sensibilidad y especificidad
Tabla 2: Niños del sistema con indicador de riesgo presente o ausente, según diagnós-
tico. Período: 1997–2006.
Diagnóstico
Indicador de riesgo
Hipoacusia Normoacusia
Ninguno 197 970
Al menos uno 636 1925
Total 833 2895
La sensibilidad del screening por fac-
tor de riesgo (al menos 1 factor de riesgo
presente) fue de 76,35 % (IC: 73,29 –79,17)
y su especificidad del 33,51 % (IC: 31,79
– 35,26), con VPP de 24,83 % (IC: 23,18 –
26,56) y VPN de 83,12 % (IC: 80,82 – 85,20).
A través de la técnica estadística de
Análisis de Correspondencias Múltiple se
encontró que a lo largo de los distintos
años han variado las condiciones de los
niños atendidos en el Centro, respecto de
las siguientes variables: condición de trata-
miento, edad a la primera consulta, edad al
momento del diagnóstico y tiempo de diag-
nóstico. Se identificaron dos dimensiones
principales de asociaciones conjuntas entre
las variables estudiadas, que explican el
29
presentaron valores bajos (menor del 25 %)
para cada factor de riesgo individualmente,
por lo que se tuvieron en cuenta todos los
factores simultáneamente (Tabla 2).
Total
1167
2561
3728
8 % y el 6 % de la variabilidad del conjunto
de datos, respectivamente.
Las contribuciones relativas para ambas
dimensiones, en la mayoría de las catego-
rías de las variables mostraron altos por-
centajes de representatividad y, por lo tanto,
están bien representadas por las dos pri-
meras dimensiones.
La Figura 4 muestra las posiciones de las
categorías de respuestas de las variables
años de ingreso, número de factores de
riesgo, condición de tratamiento, edad a la
primera consulta, diagnóstico y tiempo de
diagnóstico, de las cuales pudo derivarse
un análisis sobre las asociaciones entre
estas variables.
30 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Figura 4: Primeras dos dimensiones del ACM. Total de niños del Sistema.
La primera dimensión explicó, especial-
mente, las características diferenciadas de
los niños normoacúsicos versus los hipoa-
cúsicos. Los normoacúsicos, se asociaron
a las edades menores a la primera consulta
y a la no presencia de factores de riesgo.
Los años de funcionamiento del Centro
se ordenaron de derecha a izquierda, a la
inversa del tiempo transcurrido desde la
primera consulta hasta el diagnóstico y la
edad del niño a la primera consulta. Esto
mostró una evolución favorable del funcio-
namiento del Centro, dado que se eviden-
ció que en los últimos años los niños fueron
evaluados más tempranamente y los diag-
nósticos se realizaron en menor tiempo, lo
cual favoreció la posibilidad de mejorar el
pronóstico de aquellos en los que se iden-
tificaron pérdida auditiva. También se evi-
denciaron asociaciones entre tiempo de
diagnóstico, factores de riesgo y condi-
ción de tratamiento, a saber: a medida que
aumentó la cantidad de factores de riesgo,
aumentó el tiempo que se tarda en llegar al
diagnóstico y de esos niños con más fac-
tores de riesgo presentes, una importante
proporción se encontraron en etapa de
rehabilitación o tratamiento.
Comentarios finales
Se han estudiado aspectos generales y
particulares de los niños, entre 0 y 14 años,
atendidos por los profesionales del CeIA en
el período de enero de 1997 a diciembre
de 2006. Los aspectos generales procura-
ron describir el grupo en estudio y caracte-
rizar a los niños con hipoacusia. En particu-
lar, se pretendió determinar el acercamiento
logrado del Sistema de la discapacidad
auditiva a los tiempos óptimos de aplica-
ción establecidos por el mismo y analizar la
asociación de los factores de riesgo con la
pérdida auditiva.
Quaglino, M.B. y col. • Evaluación del funcionamiento de un sistema público...
Por otra parte, se observó una marcada
diferenciación en todos los aspectos medi-
dos a partir del año 2002. Distintas causas
pueden haber favorecido la mejora en los
tiempos de diagnóstico y tratamiento, entre
ellas: el traslado del Centro a un espacio
físico cercano a la maternidad más impor-
tante del municipio y el trabajo de concien-
tización realizado entre los profesionales
derivantes.
Si bien el screening por factores de
riesgo ha sido la práctica usual del Centro
para el diagnóstico de la hipoacusia en el
período en estudio, existen otros mecanis-
mos de screening como el screening uni-
versal en neonatos. Estudios recientes indi-
can que 19 a 42 % de niños con profundo
compromiso de audición no serán diagnos-
ticados con screening basados en factores
de riesgo, lo que no sucede con el scree-
ning universal que cuenta con un procedi-
miento de diagnóstico similar al screening
por factores de riesgo (7, 8). El screening
universal, realiza Otoemisiones Acústicas
(OEA) para determinar si existe pérdida
de la capacidad auditiva, en caso de ser
positivo (hipoacusia) se completa el estu-
dio con Potenciales Evocados Auditivos
del Tronco Cerebral (PEATC o BERA) para
determinar el nivel y el tipo de hipoacusia. El
screening universal realiza OEA a todos los
recién nacidos, en lugar de concentrarse
en niños con indicadores de riesgos cono-
cidos como lo hace el screening por facto-
res de riesgo. Actualmente y desde el año
2008 se incorporó el screening universal en
recién nacidos como una práctica habitual
del Centro.
La técnica de Análisis de Corresponden-
cias Múltiple mostró el comportamiento
conjunto de las distintas variables analiza-
das. Se detectó que el grupo de niños con
31
hipoacusia llegan a la primera consulta más
tardíamente que los niños con normoacu-
sia. Cuanto mayor fue la edad a la primera
consulta más tiempo se tardó en llegar al
diagnóstico. Los años de ingreso está aso-
ciado con la edad a la primera consulta, ya
que en los primeros años ingresaron los
niños de mayor edad (mayores de 5 años),
más específicamente en el año 1997. Mien-
tras que en los últimos años los niños ingre-
san con menor edad (menos de 5 años).
La calidad de un programa de detección
de hipoacusia en recién nacidos va más
allá de la propia detección y debe incluir y
garantizar las fases de diagnóstico e inter-
vención temprana para su éxito. Más allá
de los problemas y recursos sanitarios,
todo programa de detección debe tener
en cuenta los recursos sociales y educati-
vos a los que ha de hacer frente, por ejem-
plo provisión de prótesis auditivas (audífo-
nos e implantes cocleares), profesionales
especializados en el diagnóstico y en el tra-
tamiento de la hipoacusia (profesores de
apoyo, logopedas); además de integración
escolar adecuada con apoyo y atención y
sostén a las familias (1, 7).
Los logros alcanzados por el Centro han
mejorado el funcionamiento y desarrollo
del sistema de atención a la discapacidad
auditiva desde que comenzó a ponerse en
práctica, ya que las tareas de seguimiento
fueron evolucionando con el tiempo permi-
tiendo actualmente, arribar a un diagnós-
tico de manera más efectiva. Por lo tanto, al
evaluar el trabajo realizado desde los oríge-
nes del Centro, se puede afirmar que se ha
acercado a los objetivos propuestos, lo cual
alienta a perseverar en la continuidad del
sistema en pos de una mejora de los resul-
tados hasta ahora obtenidos y en su difu-
sión a la comunidad.
32 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Agradecimiento
Las autoras agradecen a las fonoaudió-
logas del Centro Integral de la Audición:
María Eugenia Ares, María de los Ángeles
Lincho, Patricia Obertti y Claudia Medina,
por la información suministrada.
Nota
1
Cada niño que ingresa al programa es conside-
rado una sola vez y se lo designa por año en el
que ingresa al sistema.
Referencias bibliográficas
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2006. La importancia del diagnóstico e interven-
ción temprana para el desarrollo de los niños sor-
dos. Los programas de detección precoz de la
hipoacusia. Intervención Psicosocial. 15: 7–28.
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2000 position statement: principles and guide-
lines for early hearing detection and intervention
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3. Connolly, J.L.; Carron, J.D. y Roark, S.D., 2005.
Universal Newborn Hearing Screening: Are We
Achieving the Joint Committee on Infant Hearing
(JCIH) Objectives? Laryngoscope. 115: 232–236.
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Hipoacusia (CODEPEH), 1999. Propuesta para
la detección precoz e intervención precoz de la
hipoacusia infantil. An. Esp. Pediatr. 51: 336–344.
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en un programa de detección, diagnóstico e inter-
vención precoz de la hipoacusia en recién nacidos.
Documento oficial de la Comisión para la detección
de la hipoacusia en recién nacidos (CODEPEH).
Acta Otorrinolaringol Esp. 55: 103–106.
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52: 447–452.
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grama para la detección precoz de hipoacusia
neonatal. Acta Otorrinolaringol. Esp. 52: 668–673.
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sis de correspondencias”. Fundación BBVA. Bar-
celona.
11. Lebart, L.; Morineau, A. and Warwick, K.,
1984. “Multivariate Descriptive Statistical Análi-
sis”. John Wiley. New York.
Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 33 a 41 33

Trabajo completo

Inactivación de Cryptosporidium spp. en RECIBIDO: 18/12/2012

estiércol de ganado vacuno por ACEPTADO: 13/09/2013

un sistema de compostaje

Zerbatto, MG.1 • Lerman de Abramovich, B.1 • Groppelli, E.2 •

Pizarro, AV.1 • Modini, LB.1

1
Sección Aguas – Departamento de Ciencias Biológicas – Facul-
tad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Universidad Nacional del
Litoral.
2
Grupo de energía no convencional. Facultad de Ingeniería Química.
Universidad Nacional del Litoral.
Ciudad Universitaria, S3000ZAA, Santa Fe, Argentina.
Teléfono: 0342–4575211
E–mail: mzerbatto@fbcb.unl.edu.ar

RESUMEN: Uno de los riesgos potenciales
de contaminación de los recursos hídricos
asociado con el estiércol de ganado
vacuno es la presencia del parásito
zoonótico Cryptosporidium. Teniendo
en cuenta la resistencia del mismo a
factores ambientales y al tratamiento de
potabilización del agua, se propuso como
objetivo estudiar la inactivación de este
enteroparásito en estiércol por un sistema
de compostaje en hilera. Se trabajó con
montículos a escala laboratorio con
agregado de materiales habituales de
compostaje a escala real. Se los inoculó
con suspensiones de Cryptosporidium spp.
sometiéndolos en estufa con ventilación
forzada a temperaturas termofílicas que
imitan las que se producen con esta
tecnología aplicada en campo. El proceso
completo tuvo una duración de 21 días.
La viabilidad de los ooquistes de
Cryptosporidium al principio de las
experiencias fue superior a 94 %,
disminuyendo significativamente al final de
los ensayos a valores inferiores a 20 % (p
< 0,05).
Palabras clave: Cryptosporidium,
Compostaje, Recursos hídricos.
SUMMARY: Inactivation of Cryptosporidium
spp. in cattle manure for compost system.
One of the potential risks of water resources
contamination associated with cattle
manure is the presence of Cryptosporidium.
This zoonotic parasite is highly resistant
to environmental factors and drinking
water treatment. Objective: to study the
34 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
inactivation of this parasite in manure by a
windrow composting system. This lab–scale
composting was carried out with the same
material used in a full–scale composting.
The piles were inoculated with a suspension
of Cryptosporidium spp. and placed in
an oven. Later, the piles were submited
to thermophilic temperatures which were
similar to the ones produced in the full–
Introducción
En los últimos años se ha producido una
modificación de la cría extensiva de ganado
que caracterizaba a nuestro país. Una con-
siderable cantidad de establecimientos han
optado por la cría intensiva o feedlot. Como
consecuencia de la elevada concentración
de ganado vacuno en las áreas de confina-
miento, se acumulan grandes cantidades
de estiércol cuya disposición final requiere
especial cuidado por el efecto que puede
causar en el ambiente (1). Para evaluar la
magnitud del problema, se debe tener en
cuenta que una vaca lechera produce dia-
riamente un 8 % de su peso vivo en heces
(2). Uno de los riesgos potenciales de con-
taminación asociados con el estiércol, es la
presencia de patógenos que pueden alcan-
zar las fuentes de agua potable por escu-
rrimiento superficial o lixiviación (3). Esto es
un motivo de preocupación, debido a que
muchos de estos microorganismos pueden
ser transmitidos desde los animales a los
seres humanos (4).
Entre los microorganismos que pue-
den hallarse en el estiércol y se trasmiten
a través del agua se encuentra el parásito
zoonótico Cryptosporidium. La ingestión de
agua contaminada con ooquistes produce
scale composting. The whole process took
21 days.
At the beginning of the experiment, the
viability of the oocysts of Cryptosporidium
was over 94 %, and it was significantly
reduced to values below 20 % (p <0.05) at
the end of the experiment.
Keywords: Cryptosporidium, Composting,
Water resources.
trastornos gastrointestinales leves a seve-
ros y otras formas de presentación más
graves dependiendo del estado inmunoló-
gico del huésped. Este protozoario es de
distribución mundial y está considerado
entre las causas de diarrea por parásitos
en humanos, vacunos y otros animales (5).
En ganado vacuno afecta tanto a razas de
producción de carne como de leche, siendo
más prevalente en terneros menores de 30
días (6). En estos animales infectados, se
estima que durante el periodo de máxima
eliminación, pueden excretar entre 106–107
ooquistes por gramo de heces (7). En un
estudio realizado en la provincia de Santa
Fe (Departamento Las Colonias), se encon-
tró Cryptosporidium en 72,0 % de los tam-
bos investigados, en los cuales el 28,5 % de
terneros estaba parasitado (8).
La contaminación de las fuentes de agua
con materia fecal de ganado bovino, debe
ser considerada un riesgo para la salud
pública, ya que los métodos usuales del tra-
tamiento de agua de bebida no son com-
pletamente eficaces en la remoción o inacti-
vación de los ooquistes de Cryptosporidium
spp. La dosis de cloro utilizada en las plan-
tas de potabilización no afecta la viabilidad
de los mismos, pues se necesitan concen-
Zerbatto, M.G. y col. • Inactivación de Cryptosporidium spp. en estiércol...
traciones y tiempo de contacto muy supe-
riores para su eliminación (9). Además, la
baja dosis infecciosa, la elevada resistencia
de los ooquistes a las condiciones físicas y
químicas adversas (10, 11), y el hecho que
sean inmediatamente infectantes al salir
con las heces de su huésped (12), contri-
buirían a la persistencia y diseminación de
este parásito en el ambiente, especialmente
en el agua.
El compostaje aeróbico es un proceso
biológico utilizado para residuos orgánicos
como el estiércol, que estabiliza la mate-
ria orgánica y destruye microorganismos
patógenos, de modo de poder ser utilizado
para enmienda de suelos. Una de las téc-
nicas más usualmente utilizadas es el sis-
tema en hilera, debido a su sencillez e inver-
sión inicial y mantenimientos menores. En
el campo, el material se dispone en gran-
des montículos de 2 a 4 metros de altura,
que pueden o no estar cubiertos. La airea-
ción se lleva a cabo por convección natural
ayudada por volteos periódicos que se rea-
lizan en forma manual (pequeña escala) o
mecánica. En el compostaje en hilera la fer-
mentación puede obtenerse en tres o cua-
tro semanas (13).
Teniendo en cuenta la resistencia de los
ooquistes de Cryptosporidium, se propuso
como objetivo de este trabajo estudiar la
inactivación de estos enteroparásitos en
estiércol de ganado vacuno por un sistema
de compostaje en hilera.
Materiales y métodos
• Suspensión de ooquistes de Cryp-
tosporidium spp.
Se recolectaron heces de ganado
vacuno infectado con Cryptosporidium. Se
35
procedió a su concentración por el método
de Sheather (14), lográndose una suspen-
sión del orden de 105 ooquistes/mL de agua
destilada. La cuantificación se llevó a cabo
por el método de Breed con coloración de
Kinyoun (15). La identificación se realizó
teniendo en cuenta su tamaño, coloración y
características morfológicas.
• Técnica de compostaje en hilera a
escala de laboratorio
Preparación: materia fecal de ganado
vacuno no infectado con Cryptosporidium
fue mezclada con residuos de jardín (hojas
caídas recientemente) triturados. La propor-
ción fue la adecuada para obtener una rela-
ción Carbono/Nitrógeno (C/N) de 40, valor
comprendido en el rango 25–50, que es con-
siderado óptimo para el compostaje aeró-
bico (13). Los valores de referencia del con-
tenido de nitrógeno y C/N empleados para
determinar la proporción de cada compo-
nente se muestran en la Tabla 1. Cada mon-
tículo del material a compostar pesó apro-
ximadamente 200 g. Para la selección de la
cantidad de este material se realizaron inves-
tigaciones previas utilizando pilas con pesos
de 100; 150 y 200 g. Se comprobó que las
de menor peso (100 y 150 g), al ser some-
tidas a temperaturas termofílicas, perdían
demasiada humedad, no permitían la estabi-
lización de la materia orgánica por la acción
de los microorganismos, y podían, además,
agregar un factor adicional para la disminu-
ción de la viabilidad de los ooquistes.
Un volumen de 10 mL de la suspensión
de ooquistes, cuya viabilidad fue determi-
nada previamente, se adicionó a cada com-
postaje y luego se mezcló para homoge-
neizar. Una alícuota de la misma suspensión
se conservó a 4 ºC y se utilizó como control.
36 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Tabla 1 Contenido de nitrógeno y relación C/N del material empleado para la preparación del com-
postaje (base seca).

Material Porcentaje de N Relación C/N

Estiércol de vaca 1,7 18,0
Hojas (caídas recientemente) 1,0 40,0

Adaptado: Tchobanoglus (13).

Proceso: se utilizó un sistema de com- acuerdo a la Figura 1. Se resalta que la

postaje en hilera con volteo manual cada
dos o tres días con el objeto de introdu-
cir aire y prevenir el secado y el encostra-
miento. Los compostajes se colocaron en
una estufa con ventilación forzada y la tem-
peratura fue modificada a fin de imitar la
variación que se produce a escala real de
Fase termofílica (temperaturas superiores a
55 ºC) se mantuvo durante un período de
15 días, de acuerdo a los requerimientos de
EPA para el Control Adicional de Patógenos
(PRAP) (16). El proceso completo tuvo una
duración de 21 días.

Figura 1. Variación de temperatura típica del compost en hilera. Entre paréntesis se detallan el día
y la temperatura registrada. La zona A representa la Fase mesófila. La zona B representa la Fase ter-
mófila.

Diariamente, se controló la temperatura en ción de su contenido mediante la “prueba

el centro del montículo con un termómetro del puño”, que consiste en tomar el material
digital. A fin de mantener la humedad nece- en la mano y comprimirlo, observando que
saria para la efectividad de este sistema, se no se elimine agua y se forme un puñado
le adicionó agua, realizándose la comproba- que no se desmorone (17). Al final del pro-
Zerbatto, M.G. y col. • Inactivación de Cryptosporidium spp. en estiércol...
ceso, el material compostado se concentró
por el método de Sheather para recuperar
los ooquistes y determinar su viabilidad.
• Determinación de la viabilidad de los
ooquistes de Cryptosporidium spp.
Se llevó a cabo por una técnica de des-
enquistación in vitro. El desenquistamiento
es un proceso que se cumple en parási-
tos metabólicamente activos (viables). Ini-
cialmente se efectuó el recuento de los
ooquistes totales (viables y no viables) por
el método de Breed con coloración de Kin-
youn. El grado de desenquistamiento se
evaluó de la siguiente manera: a un volu-
men de cada suspensión de ooquistes se
le adicionó dos volúmenes de solución de
Hank (Sigma, Alemania) con 1 % de bilis y
se incubó durante 24 hs a 37 ºC en atmós-
fera con 10 % de CO2 (Oxoid, Reino Unido).
Estas son las condiciones que recrean más
ajustadamente lo que sucede in vivo con
los ooquistes en el medio intestinal (18).
Se realizó el recuento del número final de
ooquistes intactos (no viables) post desen-
quistamiento.
El porcentaje de viabilidad se calculó
mediante la Ecuación 1.
Ecuación 1
(ni – nf)
Viabilidad (%) = x 100
ni
Donde:
ni: recuento de ooquistes totales
nf: número final de ooquistes
Cada recuento se realizó por triplicado,
y se llevaron a cabo tres ensayos bajo las
mismas condiciones.
37
• Determinaciones complementarias
Para evaluar parámetros complementa-
rios a los objetivos de este trabajo, se efec-
tuaron ensayos con pilas de compostaje en
las mismas condiciones que las ya mencio-
nadas pero sin el agregado de enteropará-
sitos. El pH se midió regularmente durante
el período de la experiencia (19). Tam-
bién se determinó la presencia /ausencia
del indicador bacteriano de contaminación
Escherichia coli (20). Para evaluar la efectivi-
dad del compostaje sobre el grado de des-
composición de materia orgánica, se deter-
minaron los Sólidos Volátiles al principio y al
final de cada ensayo (20).
• Análisis estadístico
La comparación entre los parámetros
evaluados se realizó mediante la prueba t
de Student. El nivel de significación adop-
tado fue α=0,05. Los datos fueron procesa-
dos utilizando el software SPSS (v. 19.0).
Resultados y discusión
Al inicio de las experiencias, la viabilidad
de los ooquistes de Cryptosporidium fue
superior a 94 %, encontrándose al término
de las mismas valores en un rango de 18 %
hasta la reducción total, significativamente
inferiores a los iniciales (t, p < 0,05) (Figura
2). Por otra parte, durante este mismo
tiempo no se observaron cambios en la via-
bilidad de los ooquistes en la suspensión
control conservada a 4 ºC.
38 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Figura 2. Diagrama de Caja: Viabilidad inicial y final de Cryptosporidium spp. en estiércol vacuno
mediante el proceso de compostaje
Van Herk et al. (21) ensayó la viabili-
dad de Cryptosporidium en compostaje en
hilera utilizando, en una experiencia, estiér-
col vacuno mezclado con paja de cebada
y, en otra, con aserrín. La inactivación total
de los ooquistes se logró luego de 42 días
en el primer caso y a los 56 días cuando
se empleó aserrín. En el presente estudio,
en cambio, se agregaron hojas como bio-
masa para ajustar la relación C/N en la mez-
cla con materia fecal de ganado. Al término
de la experiencia se halló una disminución
significativa de la viabilidad manteniendo la
temperatura por encima de 55ºC durante 15
días acorde con lo señalado por EPA (16).
En un trabajo realizado por este equipo
de investigación (10), en el cual se some-
tieron suspensiones de ooquistes en agua
destilada durante 10 minutos a 60ºC, 65ºC
y 70ºC, temperaturas compatibles con las
alcanzadas en el compostaje, se halló que
la viabilidad se redujo 74, 77 y 86 % respec-
tivamente. Esto demuestra la importancia
de la acción de la temperatura en la inacti-
vación de los ooquistes en este tipo de tra-
tamiento.
Durante la descomposición de la mate-
ria orgánica a pH elevado se puede liberar
amoníaco, y los ooquistes quedan expues-
tos a este gas. Jenkins et al. (22) reportó
que una alta concentración de amoníaco
libre puede inactivar estos parásitos. No
obstante, los niveles de este compuesto
comúnmente halladas en el estiércol, ten-
drían sólo un efecto leve sobre los ooquis-
tes. Además, las temperaturas muy eleva-
das tenderían a enmascarar la acción del
amonio (23).
El pH se mantuvo entre 6 y 8 durante el
período del compostaje, rango considerado
apropiado para lograr una descomposición
aeróbica óptima. Se obtuvo una disminu-
ción de 30 % de Sólidos Volátiles luego del
lapso de 21 días de los ensayos. En la prác-
tica se continúa con una etapa de madura-
ción lenta (que puede llegar hasta los tres
Zerbatto, M.G. y col. • Inactivación de Cryptosporidium spp. en estiércol...
meses), con la finalidad de aumentar la
degradación de la materia orgánica más
resistente previa a su aplicación al suelo
como enmienda.
Por otra parte, al finalizar cada prueba
no se halló presencia del indicador bacte-
riano Escherichia coli. Se puede interpre-
tar este resultado, como se ha demostrado
en otros trabajos (24), que esta bacteria no
es buen indicador de la presencia o ausen-
cia de Cryptosporidium, ya que aunque se
logró una remoción satisfactoria, continua-
ban persistiendo ooquistes viables.
En cuanto a las características organo-
lépticas del compostaje, se señala que al
principio del proceso se generaron olores
fuertes y desagradables, mientras que en
la etapa final, éstos desaparecieron. Ade-
más, la textura de la mezcla fue mucho más
homogénea que al inicio, lográndose un
aspecto húmico.
Conclusión
La exposición de los ooquistes de Cryp-
tosporidium presentes en el estiércol de
ganado a temperaturas superiores a 55
ºC por el método de compostaje en hilera,
demostró ser un método efectivo para su
inactivación. La aplicación de hojas a la
materia fecal, es una opción factible a fin
de lograr un balance nutricional apropiado.
Se debe destacar que la capacidad de
supervivencia de los patógenos en el suelo
se considera un factor a tener en cuenta a
los fines de su uso como enmienda orgá-
nica. Cryptosporidium es capaz de sobrevi-
vir en el suelo hasta 50 días a temperatu-
ras inferiores a 10 ºC (25). En el agua a 4
ºC, los ooquistes pueden permanecer via-
bles por más de 4 meses (10). Si tenemos
39
presente que los procesos para potabilizar
el agua que se emplean habitualmente no
aseguran la eliminación completa de este
enteroparásito, se explica la importancia de
impedir que llegue al suelo y contamine los
recursos hídricos.
En Argentina no se han encontrado
reportes de estudios realizados para com-
probar la eficacia de la implementación del
compost en la eliminación de microorganis-
mos resistentes como Cryptosporidium, y
de este modo contribuir a su control epide-
miológico.
Es fundamental que existan regulaciones
a fin de estimular esta incipiente tecnología
en nuestro país, con los controles de cali-
dad adecuados (26).
A través de estos procesos, se transfor-
man residuos orgánicos en recursos utiliza-
bles, en búsqueda de una agricultura más
racional acorde con el respeto a la natura-
leza y más sostenible, lográndose mayor
rentabilidad a mediano y largo plazo.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Sr. Mario
Alberto Contini y a la Ing. Liliana Contini, por
su desinteresada colaboración.
Este trabajo fue realizado en el marco del
Proyecto nº PI 08–42 (CAI+D 2009 –UNL)
“Inactivación de ooquistes de Cryptospori-
dium en estiércol de ganado para la protec-
ción de los recursos hídricos”, bajo la direc-
ción de Bioq. Beatriz L de Abramovich.
Nota
1
Trabajo presentado en: XVI Encuentro de Jóve-
nes Investigadores de la UNL y VII Encuentro
de Jóvenes Investigadores de Universidades de
Santa Fe; 18 y 19 de septiembre de 2012, Santa
Fe, Argentina.
40 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 42 a 50

Trabajo completo

Evaluación de desempeño de un test de RECIBIDO: 28/06/2013

ELISA desarrollado por el grupo ANLIS– ACEPTADO: 08/10/2013

UNL

Simil, E.1 • Lottersberger, J.1 • Vanasco, N.B.1,2

1
Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas (UNL), Ciudad
Universitaria, Paraje El Pozo – CC 242, 3000, Santa Fe, Argentina.
Tel: +54–342–4575215 / 216 / 209 / 206. Fax: 342–4575221.
E–mail: edisimil@gmail.com
2
INER – Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. ANLIS;
Ministerio de Salud de la provincia de Santa Fe. Blas Parera 8260,
3000, Santa Fe, Argentina. Tel/Fax: +54–342–4892827 / 4896851.
E–mail: bibi_vanasco@hotmail.com

RESUMEN: La leptospirosis es una envejecimiento acelerado los controles

enfermedad zoonótica de amplia
distribución mundial. Las técnicas
diagnósticas de referencia, la
microaglutinación (MAT) y el aislamiento,
son complejas, anticuadas y no permiten
la detección temprana de los casos. Por
ello, es necesario desarrollar y evaluar la
utilidad de nuevos métodos diagnósticos.
El objetivo de este estudio fue evaluar el
desempeño de un enzimoinmunoensayo
(ELISA) IgG (Kit prototipo) desarrollado por
el grupo ANLIS–UNL.
La sensibilidad analítica hallada fue
≥1:3.200 y por lo tanto muy superior al
1:50 de la MAT. En la evaluación de la
especificidad analítica no se detectaron
interferencias debido a hiperlipemia,
hipergamaglobulinemia, hiperbilirrubinemia
ni hemólisis. En los estudios de
positivos fueron los únicos componentes
que se deterioran a partir de las 24hs a
37 °C, por ello el Kit debe transportarse
refrigerado y llegar a destino antes de
transcurrido este tiempo. La sensibilidad y
especificidad diagnóstica del Kit Prototipo
ELISA IgG fue buena, sumados a la gran
estabilidad, repetitividad y reproducibilidad
de sus resultados, indicarían que constituye
una nueva herramienta para el diagnóstico
de los casos de leptospirosis a ser aplicada
en éste u otros países.
Palabras clave: Leptospirosis, Test de
ELISA, Serodiagnóstico.
SUMMARY: Performance evaluation of an
ELISA test developed by the ANLIS–UNL
group
Simil, E. y col. • Evaluación de desempeño de un test de ELISA...
Leptospirosis is one of the major zoonotic
diseases worldwide. Diagnosis techniques
such as reference, microagglutination
(MAT) and isolation are complex, out–
of–date, and fail to achieve early case
detection. It is thus necessary to develop
and assess the utility of new diagnosis
methods. The goal of this study was to
assess the performance of the Enzyme–
Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
developed by the ANLIS–UNL group.
An analytic sensitivity of ≥1:3.200 was
found, hence much larger than MAT’s
1:50. No interference associated with
hyperlipidemia, hypergammaglobulinemia,
or haemolysis was detected in the
analytic specificity assessment. None
of the components decayed under top
preservation conditions and fridge (4–10
Introducción
La leptospirosis es una enfermedad
zoonótica causada por espiroquetas que
tiene una amplia distribución mundial (1).
Afecta tanto a seres humanos como a los
animales siendo el hombre un hospedero
accidental que adquiere la infección direc-
tamente por contacto de la piel o muco-
sas con orina, sangre o tejidos de anima-
les infectados. Indirectamente, puede ser,
a través del contacto con agua o suelo
húmedo, contaminado por orina de anima-
les infectados (2). Se destaca por su diver-
sidad clínica puede manifestar como una
infección asintomática, hasta desarrollar
manifestaciones hemorrágicas y asociarse
con síndrome meníngeo, ictericia e insufi-
ciencia renal (3), Adicionalmente, en los últi-
mos años existe una emergencia global del
43
ºC) until their year of production. In the
accelerated ageing studies, positive
controls were the only components to
decay after 24 hours at 37 ºC. Therefore,
the kit should remain cool while transported
and be on site before this interval is
complete. It should never be frozen since
the chromogenic substrate becomes
ineffectual, as shown in the insert. The
ELISA IgG Prototype kit diagnosis sensitivity
and specificity was good. Moreover,
the great stability, repeatability and
reproducibility of results would suggest that
it is a new leptospirosis case diagnosing
tool to be applied in this and other
countries.
Keywords: Leptospirosis, ELISA,
Serodiagnosis.
Síndrome de Hemorragia Pulmonar severa
(SHPS) cuya mortalidad supera el 50 % (4).
Aunque la enorme mayoría de los casos
de leptospirosis afectan a las provincias de
Santa Fe, Entre Ríos y Buenos Aires, en los
últimos años ya se han registrado casos en
casi todas las provincias del país, e incluso
también en la Patagonia (6, 7, 8, 9).
Un diagnóstico confiable y precoz es
imprescindible para comenzar inmediata-
mente una antibioticoterapia efectiva que
prevenga la evolución hacia formas graves
de la enfermedad (10). Las técnicas diag-
nósticas de referencia para leptospirosis,
la microaglutinación (MAT) y el aislamiento,
son complejas, anticuadas y no permiten la
detección temprana de los casos. El diag-
nóstico de leptospirosis, se basa gene-
ralmente en la MAT, éste método requiere
44 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
muestras pareadas de sueros y utilización
de microscopía de campo oscuro para la
observación de reacciones de aglutinación
con leptospiras vivas (11, 12, 13). La inefi-
ciencia de la MAT es una de las principa-
les razones de la falta de diagnóstico opor-
tuno y precoz, aunque esta técnica continúa
siendo el método patrón serológico (14).
El método de aglutinación macroscópica
con antígeno termorresistente, conocido
como TR, es una prueba género especí-
fica (detecta anticuerpos anti–leptospiras)
y su producción artesanal se realiza en
muy pocos laboratorios de referencia. En la
mayoría de los laboratorios de salud pública
de Argentina el cribado o tamiz diagnóstico
aún se realiza mediante el TR. A pesar de
la amplia utilización del TR en nuestro país
y de sus ventajas estratégicas, tiene nume-
rosas limitaciones. Una de sus desventajas
operativas es su subjetividad, no es fácil de
visualizar, y requiere de muestras límpidas y
bien conservadas.
Por todas las limitaciones de los méto-
dos disponibles es necesario desarrollar y
evaluar la utilidad de nuevos ensayos de
diagnóstico rápido que puedan realizarse
en laboratorios de baja complejidad que
puedan ser aplicados en este u otros paí-
ses. El objetivo de este estudio fue evaluar
el desempeño de un enzimoinmunoensayo
(ELISA) IgG (Kit prototipo) desarrollado por
el grupo ANLIS–UNL.
Materiales y métodos
• Diseño
Es un estudio cuantitativo de evalua-
ción. Se hizo una validación y evaluación
retrospectiva del ELISA desarrollado por
ANLIS–UNL como prueba de diagnóstico
serológico de tamiz, mediante diseños de
experimentos y análisis y mediciones de
laboratorio.
• Población y muestra
Universo o población objetivo
El universo donde se pretenden extrapo-
lar los resultados de este estudio son todos
los pacientes con sospecha de leptospiro-
sis a nivel nacional o en países de la región.
Unidad de análisis, criterios de inclu-
sión y exclusión
La variable discriminante fue el criterio de
definición de casos que se describe a con-
tinuación.
La confirmación de casos se hizo de
acuerdo a las pruebas patrón (Microagluti-
nación (MAT) y aislamiento cuando éste fue
posible) y antecedentes de laboratorio clí-
nico general, síntomas clínicos y datos epi-
demiológicos.
“Casos confirmados”: fueron los pacien-
tes con antecedentes clínicos y epidemio-
lógicos compatibles, donde fue demos-
trada: a) seroconversión a la MAT (aumento
de título en al menos cuatro veces para
un serovar) en dos el más muestras con
al menos una semana de diferencia entre
ellas, b) una única muestra positiva para
más de un serovar (co–aglutinación) con al
menos un título ≥1/200 de MAT. En ambos
casos con al menos neutrofilia >70 % y leu-
cocitosis >8000/mm3 (16).
“No casos”: población con sospecha de
leptospirosis derivados al laboratorio del
INER en los cuales NO se detectó sero-
conversión a la MAT para leptospirosis,
con neutrofilia <70 % y leucocitosis <8000/
mm3. Muestras para evaluar la reactividad
cruzada: los “No casos” incluyeron mues-
tras de casos con diagnóstico confirmado
Simil, E. y col. • Evaluación de desempeño de un test de ELISA...
de enfermedades infeccionas con simi-
lar presentación clínica que la leptospirosis
como: dengue, FHA; hantavirus y hepatitis A.
• Población accesible. Muestra. Selec-
ción y tamaño de la muestra. Análisis de
sesgos
Se trabajó con paneles de seroconver-
sión previamente tipificados. El panel incluyó
todas las muestras de casos de una pobla-
ción de pacientes con sospecha de leptospi-
rosis derivados al INER desde 1997 a 2006,
provenientes de diferentes provincias del
país que reunieron los requisitos de casos
confirmados y no casos descriptos previa-
mente. Las características clínicas y epide-
miológicas de esa población se describen
en un estudio publicado previamente (15).
De la diferencia entre la fecha de la toma
de muestra y la del inicio de los síntomas
se obtuvieron los tiempos de evolución de
la enfermedad para cada muestra y según
ellos se las agruparon en tres etapas: etapa
1 (menos de 10 días de evolución), etapa
2 (de 10 a 25 días de evolución) y etapa 3
(más de 25 días de evolución). Estos pane-
les son representativos del universo donde
se pretenden extrapolar los resultados de
este estudio, que son todos los pacien-
tes con sospecha de leptospirosis a nivel
nacional, por lo tanto no representa una
fuente de sesgos relevante.
Las variables medidas fueron las densi-
dades ópticas (DO) de los diferentes ensa-
yos realizados y con ellas posteriormente se
evaluó el desempeño del ELISA IgG ANLIS–
UNL.
• Análisis de los resultados
La sensibilidad y especificidad clínica, y
el valor de Corte de este ELISA IgG desa-
45
rrollado por el grupo ANLIS/UNL, ya fueron
evaluados en estudios previos y publica-
dos (16). El punto de corte de las pruebas
se calculó de acuerdo al método diagnós-
tico definiendo la probabilidad de la enfer-
medad a través de la comparación con el
criterio de “Definición de casos”, en pobla-
ciones de individuos “sanos o no casos”
y “enfermos o casos confirmados”. Para
determinar el punto de corte óptimo se cal-
culó el área bajo la curva ROC (Receiver
Operating Characteristics Curve) utilizando
el programa Medcalc® (17). Los resulta-
dos en los ensayos con paneles de sueros
fueron procesados en programas estadísti-
cos (MedCalc©, Statistix) para determinar
el valor de corte, sensibilidad, especificidad
e intervalos de confianza 95 %, valores pre-
dictivos positivos y negativos e índices de
Youden (18) del ELISA evaluado. Con los
resultados de los puntos anteriores de ela-
boraron los valores de referencia para el Kit.
Resultados
Se estudió la sensibilidad y especifici-
dad analítica, precisión intra e inter–ensayo
y estabilidad y condiciones de conservación
del Kit prototipo de ELISA IgG con antígeno
extractivo desarrollado por el grupo ANLIS–
UNL. Para ello se prepararon “pooles” o
mezclas de sueros positivos (PP), negativos
(PN) y débiles positivos (PDP) con muestras
de pacientes del panel preexistente en el
Laboratorio de Leptospirosis del Instituto de
Enfermedades Respiratorias (INER) E. Coni.
Los resultados obtenidos se describen a
continuación.
1. Sensibilidad analítica (o reactividad
biológica)
46 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Para determinar la sensibilidad se estu-
dió el desempeño del Kit frente a PP y tam-
bién frente a muestras individuales MAT
positivas.
a) Con mezclas de sueros: se efectuaron
diluciones seriadas al medio del PP hasta
negativización del ELISA. Se encontró que
el máximo título positivo fue (1/16). Como
para la realización de la prueba, cada
muestra de suero se diluye previamente
1/200 la sensibilidad analítica real de ELISA
fue de 1:3.200.
b) Con muestras individuales: se proce-
saron 2 muestras con títulos a la MAT de
1:400 y 1:3200. Se hicieron diluciones seria-
das al medio de éstas y resultaron positivas
hasta una dilución de 1:6.400 la primera y
>1:32.600 la segunda.
2. Reactividad cruzada (o especifici-
dad analítica o metodológica)
Se midió la reactividad cruzada debida a
potenciales fuentes de error o interferencias
presentes en el suero, excluyendo la reac-
tividad cruzada por infecciones produci-
das por otros agentes infecciosos que fue-
ron medidos en la especificad diagnóstica.
Las interferencias evaluadas fueron: hiper-
lipemia e hipergamaglobulinemia, hiperbi-
lirrubinemia y hemólisis. Para evaluarla se
emplearon dos tipos de muestras:
Controles estándar de las interferencias:
hiperlipemia (Triglicéridos: 2g/l), hiperbili-
rrubinemia (4mg/dl) y hemólisis (Hg. 8g/dl).
Para poder simular la situación más pro-
blemática y el posible efecto de las interfe-
rencias, se procesaron cada uno de estos
estándares sumados a los controles positi-
vos (CP) y negativos (CN). Se aplicó a ellos
la misma dilución que a los “pooles” y se
procesaron en forma conjunta en el mismo
pocillo.
Muestras reales con las interferencias:
muestras MAT negativas y positivas con
hiperlipemia (11,35g/L), hipergamaglobuli-
nemia (policlonal y monoclonal en proteino-
grama por electroforesis), hiperbilirrubine-
mia (13,61mg/dl) y hemólisis (4g/dl).
Después de evaluar todos los estánda-
res con los CP y CN y las muestras reales
(positivas y negativas) con las interferencias
estudiadas, ninguno modificó su resultado
de ELISA original, por lo que no se detectó
ninguna interferencia.
3. Precisión intra–ensayo del Kit proto-
tipo ELISA (reproducibilidad)
Se procesaron los 3 “pooles” (PP, PN y
PDP) con 20 repeticiones de cada uno en
un mismo ensayo por un mismo operador.
La concordancia entre los resultados fue
excelente o total obteniéndose un índice
Kappa (K) de 1.
El coeficiente de variación fue del 6,3 %
en el PP, de 9,2 % en el PDP y de un 14,3 %
en el PN.
4. Precisión inter–ensayo del Kit proto-
tipo ELISA (repetibilidad)
Se evaluó la precisión ínter–ensayo tanto
entre un mismo operador como entre dife-
rentes operadores.
a) Precisión intra–operador: se procesa-
ron los 3 “pooles” (PP, PN y PDP) por un
mismo operador repetidos 20 veces en 4
ensayos realizados en diferentes momen-
tos. Se obtuvo un k=1 y un coeficiente
de variación promedio del 8,0 % en el PP,
11,7 % en el PDP y 18,9 % en el PN
b) Precisión inter–operador: se procesa-
ron los mismos 3 pooles repetidos 20 veces
en un mismo ensayo realizado por 2 ope-
radores diferentes. El índice kappa entre
operadores fue excelente con un valor de
Simil, E. y col. • Evaluación de desempeño de un test de ELISA...
0,95 (IC95 %: 0,85–1,00). El único caso dis-
cordante fue un negativo que resultó débil
positivo para uno de los operadores. El coe-
ficiente de variación entre los 2 operadores
fue del 7,8 % en el PP, 12,5 % en el PDP y de
un 18,4 % en el PN.
5. Estabilidad y condiciones de con-
servación del Kit prototipo ELISA y de
sus componentes
Estabilidad del Kit prototipo cerrado y de
sus componentes: Envejecimiento natural
en las condiciones óptimas (heladera 4–10
ºC) en ambiente sin exceso de humedad.
Para ello se evaluaron 9 tiras escogidas
al azar (72 pocillos) del kit cerrado y conser-
vado por 6 meses y luego a los 12 meses
en heladera (entre 4º–10 ºC), probando
controles provistos por el Kit positivos (CP)
y negativos (CN) por cuadruplicado en
cada tira. Los valores de las lecturas obte-
nidos se compararon con los resultados del
control de calidad realizado al lote en su
producción 6 y 12 meses antes.
Los valores de las lecturas de los contro-
les positivos y negativos en todas las tiras
fueron comparables con los obtenidos al
momento de su producción, lo cual indica
que todos los componentes del Kit fueron
estables en condiciones óptimas de con-
servación.
Pruebas adicionales de estabilidad:
Estabilidad prolongada de las placas
sensibilizadas: se evaluaron los mismos CP
y CN en placas sensibilizadas 5 años atrás.
Los resultados obtenidos fueron compa-
rables a los registrados al momento de su
producción, lo cual significa que éstas son
estables hasta los al menos 5 años luego
de su producción.
47
Estabilidad del conjugado y solución de
lavado provisto luego de llevados a dilución
de uso: en ensayos independientes se lle-
varon a dilución de uso el conjugado y la
solución de lavado y luego: a) se usaron el
mismo día de acuerdo con las especifica-
ciones del Kit y además b) a las 24 hs, c) 48
hs y d) una semana después.
Aunque el poder discriminatorio entre los
controles del Kit no se vio alterado a medida
que fue pasando el tiempo desde que se
diluyó el conjugado y la solución de lavado
provista (mismo día hasta una semana des-
pués), la relación entre CP y CN descendió
muy levemente a expensas principalmente
de un ascenso de las lecturas de los CN
aun hasta una semana luego de diluidos.
Envejecimiento acelerado a temperaturas
extremas a las que pudiera ser sometido
el equipo, como ser debidas al trasporte o
almacenamiento.
Se evaluó el funcionamiento del Kit luego
de 24hs, 48hs y hasta 1 semana expuesto
a 37 °C en estufa y 24 hs a -20 °C. Se pro-
cesaron por cuadruplicado los controles
provistos por el Kit (CP y CN) en una tira
(8 pocillos) para cada situación. Además
para poder comparar se repitió este mismo
ensayo con todos los componentes del Kit
en condiciones óptimas de conservación.
Como se tenían conocimientos previos de
que el componente menos estable del Kit
a temperaturas elevadas eran los sueros
controles se incluyó además otro control
que consistió en procesar por duplicado
todos los componentes del Kit mantenidos
en condiciones óptimas pero con los sue-
ros controles sometidos a cada una de las
situaciones extremas.
– En estufa a 37 ºC. Luego de mantener
el Kit a esta temperatura las lecturas de los
CP bajaron un 50 % a las 24hs y un 70 %
48 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
tanto a las 48hs como a la semana, res-
pecto a las lecturas de los mismos CP man-
tenidos en condiciones óptimas. Mientras
que los resultados de los CN se mantuvie-
ron constantes y comparables a los mismos
conservados en condiciones óptimas. Nin-
guno de los otros componentes fue afec-
tado luego de 24hs, 48hs y hasta 1 semana
de expuestos a 37 ºC, cuando se estudió
cada componente expuesto a esta tempe-
ratura y el resto de los componentes man-
tenidos en condiciones óptimas. Por lo que
se hicieron tantos ensayos como compo-
nentes tenía el Kit.
– En freezer a -20 ºC. Como a las 24hs
de mantener el Kit prototipo a esta tempe-
ratura, el Cromógeno (TMB–H2O2) ya había
virado a celeste, no se realizó el ensayo
como se indica en el inserto del Kit si esto
sucede.
– El valor de corte, sensibilidad y especi-
ficidad se obtuvieron en un estudios previos
publicados por etapas de la enfermedad y
en forma global (16 y 19).
6. Valor de corte del Kit prototipo ELISA
El valor de corte o cut off hallado para el
Kit prototipo ELISA cualquiera sea la etapa
de la enfermedad fue de REL=2,3 (19).
7. Sensibilidad clínica o diagnóstica
del Kit prototipo ELISA
La Sensibilidad hallada para la etapa 2
fue de 93,2 % (IC95 %:96,1 – 99,9) (16).
8. Especificidad clínica o diagnóstica/
especificidad relativa del Kit prototipo
ELISA
La especificidad hallada para la misma
etapa 2 fue de 99,3 % (IC95 %: 96,1 – 99,9)
(16).
No se observó reactividad cruzada del Kit
frente a las muestras con diagnóstico confir-
mado de enfermedades infeccionas con simi-
lar presentación clínica que la leptospirosis.
9. Valores de referencia del Kit proto-
tipo ELISA identificados
Interpretación de los resultados en base
a ello lecturas con valores de relaciones
(REL):
1. Muestra positiva: con un valor de REL
superior a 2.3.
2. Muestra negativa: Toda muestra con
un valor de REL inferior a 2,0
3. Muestra sospechosa: Toda mues-
tra con un valor de REL igual o superior a
2.0 e igual o inferior a 2.3. Estas muestras
deben ser ensayadas nuevamente y/o soli-
citar nueva muestra.
Discusión
La sensibilidad analítica hallada para el
Kit Prototipo ELISA en este estudio fue muy
elevada de 1:3.200 a >1:32.600 y por lo
tanto muy superior al valor de corte teórico
1:50 de la MAT. En la evaluación de la reac-
tividad cruzada o especificidad analítica o
metodológica, no se detectaron interferen-
cias debido a hiperlipemia e hipergamag-
lobulinemia, hiperbilirrubinemia y hemólisis.
La posibilidad de acceder a un resultado
confiable independientemente de la calidad
de la muestra constituye una gran ventaja
respecto de los métodos de aglutinación
(como la MAT y el TR) los cuales solo son
interpretables si las muestras no tienen nin-
guna de estas interferencias.
La concordancia tanto intra–ensayo
(reproducibilidad) como inter–ensayos
(repetibilidad entre un mismo operador u
operadores diferentes) hallada fue total o
Simil, E. y col. • Evaluación de desempeño de un test de ELISA...
excelente. Esto implica que los resultados
obtenidos por este Kit serían comparables
entre diferentes laboratorios.
Ninguno de los componentes del equipo
se deterioraron cuando se conservaron en
heladera (4–10 °C), según sus especifica-
ciones, hasta al menos un año luego de
su producción. Las placas sensibilizadas
fueron estables por al menos cinco años,
lo cual implica que el vencimiento del Kit
podría ser muy superior al año inicialmente
estudiado, por lo que debería seguir siendo
evaluado en el tiempo.
Aunque el conjugado y la solución de
lavado fueron estables hasta la semana de
llevados a la dilución final de trabajo, su fun-
cionamiento fue óptimo hasta las 24hs. Esto
resalta la importancia del cumplimiento de
las especificaciones del Kit en cuanto a no
conservar estos componentes una vez lle-
vados a dilución de trabajo.
Los controles positivos fueron los únicos
componentes críticos que se deterioran refri-
gerados y llegar a destino dentro de este
período. Como el congelamiento inutiliza la
solución cromógeno e inhabilita la utilización
del Kit, debe prestarse especial cuidado a la
temperatura de la heladera y nunca conser-
varse en el freezer o congelador.
La sensibilidad y especificidad diagnós-
tica del Kit Prototipo ELISA IgG fue bueno,
sumados a la gran estabilidad, repetitividad
y reproducibilidad de sus resultados, indi-
carían que constituye una nueva e impor-
tante herramienta para el tamiz diagnóstico
de los casos de leptospirosis a ser aplicada
en éste u otros países.
• Abreviaturas y acrónimos
RNLL: Red Nacional de Laboratorios de
leptospirosis.
49
UNL: Universidad Nacional del Litoral.
INER: Instituto Nacional de Enfermeda-
des Respiratorias.
MAT: microaglutinación.
ELISA: enzimoinmunoensayo.
TR: método de aglutinación macroscó-
pica con antígeno termorresistente.
FBCB: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
PP: “pool” o mezcla de sueros positivos.
PN: “pool” o mezcla de sueros negativos.
PDP: “pool” o mezcla de sueros débiles
positivos.
IC95: Índice de Confianza de 95 %.
CP: controles positivos.
CN: controles negativos.
DO: densidad óptica.
REL: relación entre la DO de la muestra
dividida por la DO promedio de los contro-
les negativos.
Agradecimientos
A la Facultad de Bioquímica y Ciencia
Biológicas de la Universidad Nacional del
Litoral (UNL).
Al Instituto Nacional de Enfermedades
Respiratorias (INER) Dr. E. Coni (ANLIS)
Malbrán.
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ral serodiagnosis in different stages of the dise-
ase. VII Reunión de la Sociedad Internacional de
Leptospirosis, Mérida, Yucatán, México, 19 al 22
de septiembre.
Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 51 a 65 51

Trabajo completo

Efecto diferencial de la fuente de grasas RECIBIDO: 04/08/2013

dietarias sobre las alteraciones hepáticas ACEPTADO: 13/09/2013

inducidas por los conjugados del ácido

linoleico en ratones

Scalerandi, M.V.1 • González, M.A.1 • Saín, J. 1 • Reus, V.2 •

Lavandera, J.1 • Bernal, C.A.1

1
Cátedra de Bromatología y Nutrición. Departamento de Ciencias
Biológicas. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Universi-
dad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina.
2
Laboratorio de Investigación en Ciencias Biomédicas. Facultad
de Ciencias Médicas. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe,
Argentina.
E–mail: cbernal@fbcb.unl.edu.ar

RESUMEN: El objetivo fue investigar el ayudas ergogénicas y antiobesogénicas

efecto de diferentes fuentes de grasas
dietarias sobre las alteraciones hepáticas
inducidas por los Conjugados del Ácido
Linoleico (CLA) comerciales en animales
de experimentación. Para tal fin, en ratones
CF1 macho alimentados (30 días) con
dietas conteniendo aceite de oliva, maíz
y canola, suplementadas o no con CLA,
investigamos en hígado las posibles
alteraciones en tamaño, acumulación
lipídica, aspectos morfológicos y estado
lipoperoxidativo. A nivel hepático, los CLA
suplementados al aceite de oliva generaron
la mayor acumulación lipídica, al aceite de
maíz un notable estado pro–inflamatorio,
mientras que al aceite de canola efectos
deletéreos más atenuados. En virtud
del empleo de CLA comerciales como
en humanos, este trabajo podría contribuir
al conocimiento de ciertos efectos que
los mismos podrían tener en función de
interacciones metabólicas con distintas
grasas dietarias.
Palabras clave: Conjugados del ácido
linoleico, Grasas dietarias, Hígado graso, Estado
lipoperoxidativo.
SUMMARY: Differential effects of dietary fat
sources on hepatic alterations induced by
conjugated linoleic acid in mice
The aim of this work was to investigate
the effect of different dietary fat sources
on hepatic alterations induced by a
commercial mixture of conjugated linoleic
acid in experimental animals. For this
52 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
purpose, male mice CF1 were fed during
30 days on diets containing olive, corn or
canola oil supplemented or not with CLA.
In the liver of these animals we examined
hepatomegaly, lipid accumulation,
histological changes and lipoperoxidative
status. In liver, CLA added to olive oil led
to a high lipid accumulation, to corn oil
a proinflammatory tissular status, while
to canola oil, the deleterious effects
Introducción
Factores dietarios, y más específica-
mente grasas dietarias, cumplen un rol muy
importante en el desarrollo y/o prevención
de desórdenes crónicos como enferme-
dad cardiovascular, diabetes tipo 2, trastor-
nos del metabolismo de lípidos, y enferme-
dad del hígado graso no alcohólico (1–3).
Más aún, el hígado graso no alcohólico es
actualmente considerado como la manifes-
tación hepática del síndrome metabólico,
caracterizado por una amplia variedad de
condiciones clínicas, que van desde una
simple esteatosis (hígado graso) sin sig-
nos de inflamación, hasta una actividad
inflamatoria severa con necrosis y fibrosis,
daño oxidativo, e incluso progresión a cirro-
sis (2). La enfermedad del hígado graso no
alcohólico esta fuertemente asociada con
la obesidad (3) y la nutrición, y en particu-
lar, con la cantidad y tipo de grasa ingerida
que pueden ser claves en el desarrollo de
esta enfermedad crónica (4–6). Así, algu-
nos estudios sugieren que una alta ingesta
de grasa total y de ácidos grasos (AG) poli–
insaturados (AGPI) n–6 (6) resulta en alte-
raciones clínicas similares al hígado graso,
mientras que, un incremento en la ingesta
de AGPI n–3 (7, 8) ó de AG mono–insatu-
rados (AGMI) (9), puede ser benéfico en el
were attenuated to some degree. Since
commercial CLA are used in humans
as ergogenic aids as well as antiobesity
agents, this work might contribute to the
knowledge of certain differential effects that
these isomers could have depending on the
CLA–fat metabolic interactions.
Keywords: Conjugated linoleic acid, Dietary
fats, Fatty liver, Lipoperoxidative status.
tratamiento preventivo de dicha alteración.
Los conjugados del ácido linoleico (CLA)
son un grupo de isómeros posicionales y
geométricos del ácido linoleico (AL) que
han merecido un interés especial durante el
último tiempo y han sido empleados para la
producción de alimentos funcionales. Espe-
cíficamente, el uso de los CLA comerciales
conteniendo cantidades equimoleculares
de los isómeros cis–9,trans–11–CLA (ácido
ruménico) y trans–10,cis–12–CLA; como
asimismo los CLA de origen natural, enri-
quecidos en ácido ruménico, se han exten-
dido en forma notable dados sus poten-
ciales efectos benéficos (10, 11). Según el
origen de los CLA, los efectos benéficos y/o
adversos son diferentes. A los CLA comer-
ciales se les atribuye principalmente un
potencial efecto benéfico en la reducción
del peso y grasa corporal (12, 13), como
así también en el incremento de masa
magra (11); mientras que los CLA naturales
podrían ser importantes en la prevención de
cáncer y reducción de respuesta inflama-
toria (14, 15), entre otros. No obstante, los
CLA comerciales mostraron, en animales
de experimentación, ciertos efectos nega-
tivos a nivel hepático (12, 16) los cuales
dependieron de numerosos factores, entre
ellos: especie animal, condición fisiológica,
Scalerandi, M.V. y col. • Efecto diferencial de la fuente de grasas dietarias...
niveles y tipo de CLA en la dieta, como así
también de la duración de la alimentación
(17). Entre las principales alteraciones en
ratones se ha encontrado hepatomega-
lia, esteatosis y alteraciones en el metabo-
lismo lipídico (12, 16). Al menos a nuestro
conocimiento, no existen reportes bibliográ-
ficos que hayan estudiado en forma siste-
mática los efectos de estos isómeros sobre
aspectos bioquímicos, metabólicos y fisio-
lógicos, en hígado de animales alimentados
con dietas conteniendo distintas fuentes de
AG insaturados. Por lo tanto, el objetivo del
presente trabajo, fue investigar el efecto de
diferentes fuentes de grasas dietarias ricas
en AG n–9, n–6 y n–3 sobre las alteracio-
nes hepáticas en el tamaño, acumulación
lipídica, posibles daños histológicos y cam-
bios en el estado lipoperoxidativo, induci-
das por una mezcla comercial de CLA en
ratones. El modelo experimental empleado
es sensible a alteraciones hepáticas fre-
cuentemente encontradas en enfermeda-
des crónicas prevenidas o promovidas por
factores dietarios.
Materiales y métodos
• Materiales
Los nutrientes utilizados en la preparación
de las dietas, incluyendo vitaminas y minera-
les, fueron al menos grado reactivo, a excep-
ción del aceite de oliva (O) (Nucete, La Rioja,
Argentina), aceite de maíz (M) (Arcor, Cór-
doba, Argentina), aceite de canola (C) (Krol,
Entre Ríos, Argentina), sacarosa, celulosa y
almidón de maíz, los cuales fueron de grado
comestible y obtenidos de fuentes comer-
ciales locales. El aceite CLA fue donado
por Lipid Nutrition B.V. (Wormerveer, Países
Bajos). Para el período de adaptación de los
animales, se utilizó una comida estándar de
laboratorio del Grupo Pilar® (Pilar, Córdoba,
53
Argentina). Los estándares fueron adquiridos
de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Todos los solventes y reactivos utilizados para
la cuantificación de AG fueron grado croma-
tográfico, y todos los otros productos quími-
cos usados fueron al menos grado ACS.
• Dietas
La composición de las dietas se muestra
en la Tabla 1. Las mismas estuvieron basa-
das en las recomendaciones del “American
Institute of Nutrition” (AIN–93G dietas for-
muladas para las fases de crecimiento, pre-
ñez y lactación de roedores) (18). Las dietas
fueron preparadas cada tres días durante
el período experimental y almacenadas a
4 ºC. Todas fueron isoenergéticas, conte-
niendo 16,5 MJ/kg, las cuales superaron las
recomendaciones de AG esenciales y difi-
rieron en: 1) fuente de grasa dietaria: acei-
tes O, M ó C, y 2) ausencia ó presencia de
1g de aceite CLA/100g dieta. La combina-
ción de estas dos variables permitió crear
las siguientes dietas experimentales: O,
O+CLA, M, M+CLA, C, C+CLA, conte-
niendo 7 g grasa total/100g dieta. Los acei-
tes O, M y C fueron usados como fuente de
AG insaturados cis conteniendo diferentes
proporciones de ácido oleico (AO)/AL ácido
a–linolénico (ALN), en una proporción:
55,2/17,2/0,7; 32,0/51,3/0,9 y 61,1/18,4/8,6
respectivamente, mientras que el aceite
CLA contiene 39,0 % de cis–9,trans–11–
CLA y 38,8 % de trans–10,cis–12–CLA. La
composición de los AG de las grasas die-
tarias se muestra en la Tabla 2. Esta com-
posición de AG fue determinada como metil
ésteres por cromatografía gaseosa utili-
zando el equipamiento y las condiciones
previamente reportadas (19).
54 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Tablas 1. Composición de las dietas experimentales (g/Kg dieta seca)

O O+CLA M M+CLA C C+CLA

Almidón 529,5 529,5 529,5 529,5 529,5 529,5

Caseína 200 200 200 200 200 200
Sacarosa 100 100 100 100 100 100
Aceite de Oliva 70 60 - - - -
Aceite de Maíz - - 70 60 - -
Aceite de Canola - - - - 70 60
Aceite CLA - 10 - 10 - 10
Fibra 50 50 50 50 50 50
Minerales* 35 35 35 35 35 35
Vitaminas* 10 10 10 10 10 10
L-Cisteína +
3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
L-Metionina
Colina 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Energía (KJ/kg) 16569 16569 16569 16569 16569 16569

*Las mezclas de vitaminas y minerales fueron formuladas de acuerdo a Reeves y col. (18).

Tablas 2. Composición de ácidos grasos de los aceites utilizados (%)*

Aceite de Aceite de Aceite de

Aceite CLA
oliva maíz canola
14:0 0,0 0,0 0,1 0,0
16:0 17,1 12,2 4,0 5,9
cis-9-16:1 2,0 0,1 0,2 0,0
17:0 0,1 0,0 0,0 0,0
18:0 1,6 1,9 2,2 1,2
cis-9-18:1 55,2 32,0 61,1 9,1
cis-11-18:1 4,8 0,5 3,5 0,4
cis-9,cis-12-18:2 17,2 51,3 18,4 1,1
cis-9,trans-11-18:2 0,0 0,0 0,0 39,0
trans-10,cis-12-18:2 0,0 0,0 0,0 38,8
20:0 0,3 0,5 0,5 0,0
cis-11-20:1 0,2 0,3 0,9 0,0
cis-9,cis-12,cis-15-18:3 0,7 0,9 8,6 0,0
22:0 0,1 0,2 0,2 0,0
24:0 0,0 0,2 0,0 0,0
Otros 0,7 0,0 0,2 4,7

*Los valores indicados corresponden al promedio de la masa porcentual del total de los ésteres metílicos de los
ácidos grasos.
Scalerandi, M.V. y col. • Efecto diferencial de la fuente de grasas dietarias...
• Animales y protocolo experimental
Se emplearon ratones macho de la cepa
CF1 provistos por el Bioterio Central de la
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
de la Universidad de Buenos Aires, o pro-
pios reproducidos en las instalaciones de
nuestro bioterio. Los animales fueron acli-
matados durante dos semanas luego del
destete en un ambiente con luz–oscuridad
de 12 hs, a temperatura controlada (23 ±
2 ºC), con libre acceso al agua y a una dieta
estándar de laboratorio. Los animales fue-
ron distribuidos aleatoriamente en 6 grupos
experimentales y alimentados durante 30
días con alguna de las dietas anteriormente
mencionadas. Así, los grupos dietarios uti-
lizados fueron identificados, al igual que
las dietas, como: O, O+CLA, M, M+CLA,
C, C+CLA. Al finalizar el período de tra-
tamiento dietario, los animales (n=6 por
grupo) fueron anestesiados con una mez-
cla de acepromicina y ketamina (1mg +
100 mg /Kg peso, respectivamente) y sacri-
ficados entre las 9.00 y 11.00 AM. Los híga-
dos fueron inmediatamente removidos y
pesados. Una porción de hígado fue escin-
dida y congelada con una pinza enfriada
en nieve carbónica, morterizada y conser-
vada a –80ºC para la cuantificación de los
lípidos hepáticos; una segunda porción fue
inmediatamente sometida a un proceso de
fijación mediante la inmersión directa de
la muestra en formaldehído al 4 % tampo-
nado con buffer fosfato (PBS, pH 7,5) para
estudios histológicos; y la porción restante
de hígado fue lavada con solución salina,
enfriada a 4 ºC y conservada de la misma
forma indicada anteriormente, para los aná-
lisis del estado lipoperoxidativo.
55
• Determinaciones realizadas
Contenido hepático de triglicéridos (TG),
colesterol (Col) y fosfolípidos (FL) totales.
Una cantidad determinada de hígado sin
lavar conservada a -80 ºC se homogenizó
con un volumen apropiado de solución salina
fría (4 ºC), para obtener una dilución 1/20
(hígados de animales alimentados con die-
tas controles) ó 1/40 (hígados de animales
alimentados con dietas suplementadas con
CLA) para la cuantificación de TG, y una dilu-
ción 1/2 para la cuantificación de Col y FL.
El contenido de TG se determinó mediante
el método espectrofotométrico propuesto
por Laurell (20). Para la cuantificación de
Col y FL se procedió de la siguiente forma:
sobre alícuotas de los homogenatos dilui-
dos se realizó la extracción lipídica según la
técnica propuesta por Folch y col. (21). Una
cantidad conocida del extracto lipídico obte-
nido fue transferida a un tubo de extracción y
secada a 40 ºC bajo corriente de N2(g). Sobre
este extracto seco, se cuantificó el coleste-
rol total según la técnica espectrofotómetrica
de Abell y col. (22). Una segunda alícuota
del extracto lipídico original, fue transferida
a un tubo de 20 ml con tapa a rosca y lle-
vada a sequedad (40 ºC, N2(g)), para la pos-
terior cuantificación del contenido de fósforo
mediante el método estándar de reduc-
ción del complejo fosfomolibdato con ácido
ascórbico (23).
Los resultados se expresaron como mmol
de TG, Col ó FL/g tejido húmedo.
Parámetros relacionados al estado lipo-
peroxidativo
El grado de peroxidación lipídica, se eva-
luó en homogenados de hígado lavado,
preparados al 10 % (p/v) con KCl 1,15 % de
acuerdo al método de Ohkawa y col. (24),
56 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

basado en la reacción colorimétrica de los Histología hepática

peróxidos lipídicos con ácido tiobarbitúrico Se realizaron observaciones micro ana-
para formar malondialdehído (MDA). Los tómicas utilizando cortes seriados de todos
resultados se expresaron en mmol MDA/g los hígados procesados. Cada corte fue de
tejido húmedo. 5 micras de espesor, utilizando un micró-
El contenido de glutatión reducido (GSH) tomo tipo Minot y coloreados con Hema-
se cuantificó en homogenados hepáti- toxilina–Eosina (29). La observación se rea-
cos preparados en una proporción 4:1 con lizó a los aumentos de 4X, 10X y 40X con
ácido tricloroacético al 5 %. En el sobrena- microscopio óptico equipado con cámara
dante obtenido por centrifugación, se deter- fotográfica.
minó el contenido de GSH según la técnica
• Análisis estadístico
de Ellman y Lysko (25). Los resultados se
Los resultados se expresaron como
expresaron en mmol GSH/g tejido húmedo.
media + SEM y fueron analizados mediante
Se determinaron las actividades de las
el método de ANOVA de 2 variables (3 x 2),
enzimas antioxidantes hepáticas Catalasa
utilizando la fuente de grasa dietaria (O, M y
(CAT) y Glutation Peroxidasa (GSH–Px).
C) y la ausencia ó presencia de CLA como
Para tal fin, se obtuvieron homogenados
variables independientes. Las comparacio-
hepáticos al 10 % (p/v) con buffer fosfato
nes post–hoc fueron realizadas utilizando
50 mM, pH 7,0, los cuales fueron luego
el test de Tukey. En todos los casos, valo-
centrifugados a 4 ºC y 16.000 g durante 12
res de p<0,05 se consideraron estadística-
minutos. La actividad de las enzimas men-
mente significativos.
cionadas se determinó en el sobrenadante
obtenido luego de la centrifugación. La con-
centración de proteínas en el sobrenadante
Resultados
fue determinada por el método de Lowry y
Durante los 30 días de alimentación, las
col. (26). La actividad de la enzima CAT se
dietas experimentales fueron perfectamente
determinó mediante la técnica de Beers y
aceptadas por todos los animales, los cuales
Sizer (27). Dicha técnica mide la cantidad
no manifestaron ningún tipo de alteración.
de H2O2 degradada por la enzima en buffer
En la Figura 1 se muestra el peso abso-
fosfato 50 mM, pH 7,0, con Triton X–100 al
luto y relativo del hígado total. El análi-
1 %. La actividad enzimática fue expresada
sis estadístico evidencia que la presencia
como U/mg de proteína (1U = 1 mmol H2O2/
de CLA, y no la fuente de grasa dietaria,
minuto). La actividad de la enzima GSH–
afectó el peso de dicho tejido. El efecto de
Px fue determinada utilizando H2O2 como
la suplementación con CLA incrementó sig-
sustrato y la reacción fue seguida espec-
nificativamente el peso del hígado en valor
trofotométricamente mediante el consumo
absoluto (g/animal), en los grupos O+CLA
de NADPH por acción de la enzima gluta-
y C+CLA, mostrando sólo una tendencia en
tión reductasa según la técnica de Paglia y
el grupo M+CLA. En cambio, analizando el
Valentine (28). La actividad de dicha enzima
peso relativo del hígado (g/100g peso cor-
fue expresada como U/mg proteína (1U = 1
poral), se observó un aumento significativo
mmol NADPH/minuto).
de dicho tejido independientemente de la
fuente de grasa dietaria considerada.
Scalerandi, M.V. y col. • Efecto diferencial de la fuente de grasas dietarias... 57

Figura 1. Efecto de la fuente de grasa dietaria y de la suplementación con CLA sobre el peso abso-
luto y relativo del hígado

Valores expresados como media ± SEM de al menos 6 animales por grupo. Análisis estadístico: 3x2 ANOVA,
seguido del test de Tukey. Nivel de significancia: p < 0,05. Letras distintas indican diferencia estadísticamente signi-
ficativa entre los grupos.

Los niveles de TG, Col y FL hepáticos
no fueron afectados por la fuente de grasa
dietaria en ausencia de CLA. Analizando el
efecto de la suplementación con CLA sobre
dichos parámetros, se pudo observar un
efecto diferencial de estos isómeros depen-
diendo de la fuente de grasa dietaria consi-
derada . Los niveles de TG hepáticos fueron
incrementados por la suplementación con
CLA. Específicamente los CLA incrementa-
ron los TG hepáticos en los animales que
recibieron las dietas conteniendo aceites de
oliva o de maíz, siendo más acentuado en el
grupo O+CLA. Por otro lado, la suplemen-
tación con CLA, no modificó los niveles de
Col y FL en animales que recibieron aceite
de maíz o canola, mientras que un efecto
diferencial se ha observado en el grupo
O+CLA, donde los niveles de Col hepático
incrementaron, mientras que los de FL dis-
minuyeron por la presencia de CLA.

Tabla 3. Efecto de la fuente de grasa dietaria y de la suplementación con CLA sobre el contenido
hepático de TG, Col y FL

O O+CLA M M+CLA C C+CLA

TG (µmol/g) 32,5±1,6 a
55,5±3,4 b
32,7±2,2 a
43,6±2,7 c
34,0±1,9 ac
37,9±2,2ac

Col (µmol/g) 7,0±0,4a 10,0±0,9b 6,3±0,4a 6,3±0,3a 5,8±0,3a 7,7±0,8ab

FL (µmol/g) 30,3±1,5a 24,6±1,3b 27,0±0,9ab 26,0±1,1ab 27,4±1,2ab 25,5±1,1ab

Valores expresados como media ± SEM de al menos 6 animales por grupo. Análisis estadístico: 3x2 ANOVA,
seguido del test de Tukey. Nivel de significancia: p < 0,05. Letras distintas indican diferencia estadísticamente signi-
ficativa entre los grupos.
58 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
El análisis histológico de cortes represen-
tativos de hígados correspondientes a los 6
grupos dietarios se muestra en la Figura 2.
Todos los cortes de tejido hepático analiza-
dos a la luz del microscopio óptico, corres-
pondientes a los grupos O (Figura 2.a) y
C (Figura 2.c), exhibieron una morfología
compatible con un patrón tisular normal,
con área portal y lobular conservada, célu-
las hepáticas presentando un citoplasma
hepatocítico con la acidofilia característica
de los mismos, núcleos conservados con
membrana nuclear con límites definidos y
patrón de distribución cromatínico en oxi
y basi cromatina. No se observó infiltrado
inflamatorio, células apoptóticas, ni inclu-
siones lipídicas. Los cortes de hígados de
los animales del grupo M (Figura 2.b), pre-
sentaron dilatación de la vena central, hepa-
tocitos con ligera tumefacción citoplasmá-
tica y patrón nuclear conservado. Además,
se observaron focos de inflamación con
células apoptóticas en el parénquima e infil-
trado leucocitario en el espacio portal. La
suplementación con CLA generó profun-
das alteraciones en la morfología hepática,
como así también necrosis celular, focos
Figura 2. Cortes histológicos hepáticos
inflamatorios e inclusión de microvacuolas
lipídicas. El grado de dichas alteraciones
fue dependiente de la fuente de grasa dieta-
ria utilizada. Los hígados de los animales de
los grupos O+CLA (Figura 2.d) y C+CLA
(Figura 2.f) presentaron infiltrado leucoci-
tario y microvacuolas de grasa, que en el
grupo C+CLA se localizaron alrededor de
la vena central, y a pesar de que en ambos
casos se observaron células en mitosis,
degeneración balonizante del hepatocito y
tumefacción citoplasmática, estas alteracio-
nes no fueron tan exacerbadas como en el
grupo M+CLA. Así, en este grupo (Figura
2.e), se presentó dilatación de la vena cen-
tral, numerosas células en mitosis con
patrón nuclear conservado, degeneración
balonizante del hepatocito y marcada tume-
facción citoplasmática. Amerita destacar la
presencia aislada de microvacuolas lipídi-
cas dispersas en el parénquima hepático.
Además se observó necrosis y apoptosis
focal, con presencia de células apoptóticas
y núcleos picnóticos, inflamación lobulillar y
acúmulo de neutrófilos, patrón correspon-
diente a hepatitis.
Scalerandi, M.V. y col. • Efecto diferencial de la fuente de grasas dietarias... 59

a. O; b. M; c. C; d. O+CLA; e. M+CLA; f. C+CLA. Aumento 40X.

El grado de lipoperoxidación (LPO) hepá-
tica expresado como la cantidad de MDA
formado, fue menor en los animales del
grupo O que en los animales que consu-
mieron dietas enriquecidas con grasas más
insaturadas (M y C). La suplementación con
CLA tuvo un efecto diferencial en los distin-
tos grupos, donde se observó una reduc-
ción de la LPO hepática en los animales
O+CLA. No obstante, es dable destacar
que no se ha observado ningún incremento
en la LPO por efecto de la suplementación
con CLA, y cuando se observó un efecto, el
mismo fue preventivo de la LPO (Tabla 4).
Los niveles de GSH (principal compo-
nente protector no enzimático del estado
oxidativo) en ausencia de CLA, fueron
menores en los animales del grupo O que
en los de los grupos M y C. La presencia
de CLA aumentó el contenido de GSH sólo
en los animales del grupo O+CLA. Dentro
de los sistemas protectores enzimáticos, la
actividad de la enzima CAT, en ausencia de
CLA, fue mayor en los animales del grupo
O frente a aquellos de los grupos M y C. La
suplementación con CLA, redujo la activi-
dad de dicha enzima en el grupo O+CLA
frente a su respectivo control, y no mostró
ningún efecto en los otros grupos dieta-
rios. Otra enzima enmarcada en los siste-
mas protectores enzimáticos es la GSH–Px,
la cual no fue afectada ni por la fuente de
grasa dietaria, ni por la suplementación con
CLA.
60 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Tabla 4. Efecto de la fuente de grasa dietaria y de la suplementación con CLA sobre parámetros
relacionados al estado lipoperoxidativo hepático
O O+CLA
LPO
122,3±4,4a 83,4±3,1b
(µmolMDA/g)
GSH
4,6±0,3a 5,7±0,2b
(µmolGSH/g)
CAT
149,7±7,8a 93,6±7,6b
(U/mg prot)
GSH–Px
199,3±16,6 183,6±10,9
(mU/mg prot)
Valores expresados como media ± SEM de al menos 6 animales por grupo. Análisis estadístico: 3x2 ANOVA,
seguido del test de Tukey. Nivel de significancia: p < 0,05. Letras distintas indican diferencia estadísticamente signi-
ficativa entre los grupos.
Discusión
Dado el conocimiento que los CLA a nivel
hepático inducen hepatomegalia, esteato-
sis, y alteraciones en el metabolismo lipí-
dico de ratones y que los mismos depen-
den de diversas variables, entre ellas el tipo
de AG dietario, en este trabajo se investiga-
ron algunos potenciales efectos de diferen-
tes fuentes de grasas insaturadas dietarias
sobre las alteraciones hepáticas induci-
das por los CLA en hígado de animales de
experimentación.
En ausencia de CLA, los ratones ali-
mentados con dietas conteniendo diferen-
tes fuentes de grasas dietarias, si bien no
mostraron alteraciones en el tamaño, ni
en el contenido de lípidos hepáticos, pre-
sentaron diferencias en el estado lipope-
roxidativo y en su histología. Los animales
del grupo O presentaron un bajo grado de
LPO hepática sin alteraciones histológicas.
El incremento de la LPO observado en los
grupos M y C frente al O estuvo en con-
cordancia con resultados de otros autores
M M+CLA C C+CLA
181,7±10,4c 171,6±8,8c 190,9±14,4c 166,5±7,8c
5,8±0,5b 5,7±0,6b 5,7±0,4b 6,7±0,3b
112,5±10,0b 111,5±5,3b 109,9±6,5b 99,6±7,8b
172,6±18,3 166,8±17,2 175,8±14,9 164,8±16,2
(30, 31). Asimismo, este efecto estuvo aso-
ciado a una reducida actividad CAT que no
fue compensada por el incremento de los
niveles de GSH. Mientras que los hígados
de los animales de los grupo O y C exhi-
bieron una histología compatible con un
patrón normal, los hígados del grupo M
mostraron ciertas alteraciones morfológi-
cas, acompañadas de células apoptóticas,
focos inflamatorios e infiltrado leucocitario.
Estas observaciones están en concordan-
cia con los trabajos de Baumgardner y col.
(6) y Ronis y col. (4), quienes observaron
que ratas alimentadas mediante nutrición
enteral con aceite de maíz, presentaron en
una manera dosis–dependiente, un desa-
rrollo progresivo de acumulación de lípi-
dos hepáticos, infiltración de macrófagos,
estrés oxidativo, acompañado de alteracio-
nes en la expresión de marcadores inflama-
torios, como el TNF–α (Tumor Necrosis Fac-
tor–alpha). Otros autores propusieron que el
incremento en el contenido de AL y ácido
araquidónico (AA) en las fracciones de lípi-
Scalerandi, M.V. y col. • Efecto diferencial de la fuente de grasas dietarias...
dos hepáticos, favorece la producción de
eicosanoides pro–inflamatorios, contribu-
yendo al desarrollo de esteatohepatitis (32),
justificando de esta manera, la diferencia
observada en nuestras experiencias con los
animales alimentados con aceite de oliva y
de canola.
La suplementación con CLA a las dietas
en nuestro modelo experimental produjo
acumulación de TG y aumento de peso en
el hígado, asociado a alteraciones histoló-
gicas y cambios en el estado lipoperoxida-
tivo dependiente de la fuente de grasa die-
taria. La hepatomegalia y esteatosis han
sido observadas por numerosos investiga-
dores en ratones alimentados con una mez-
cla equimolecular de cis–9,trans–11–CLA y
trans–10,cis–12–CLA (33, 34) o con el isó-
mero individual trans–10,cis–12–CLA (16,
35, 36). Los mecanismos que conducen a
estas alteraciones son de carácter multifac-
torial, involucrando, incremento en la capta-
ción y síntesis de AG, alteración en la oxida-
ción de AG, y secreción insuficiente de TG
como para prevenir la acumulación de lípi-
dos (16, 35). Este fenómeno fue descripto
por Poirier y col. (12) quienes sugirieron que
el isómero trans–10,cis–12–CLA, pero no el
cis–9,trans–11–CLA, conduce a un conjunto
de alteraciones interconectadas denomina-
das “síndrome lipoatrófico”.
Estos efectos reportados dependen de
numerosos factores, y entre ellos la grasa
dietaria. En este sentido, si bien es posi-
ble postular influencias metabólicas de los
CLA sobre las diferentes familias de AG
insaturados, existen sólo algunos estudios
y no sistemáticos que abordaron la interac-
ción de estas dos variables sobre la posi-
ble atenuación o exacerbación de los efec-
tos inducidos por los CLA a nivel hepático.
La suplementación de CLA en los anima-
61
les alimentados con aceite de oliva como
fuente de grasa dietaria, produjo el mayor
incremento en los niveles de TG y Col hepá-
ticos, asociados a una hepatomegalia. En
recientes trabajos de nuestro laboratorio
(37), hemos demostrado que la suplemen-
tación con AG trans al aceite de oliva como
fuente de grasa dietaria incrementó más los
depósitos de TG hepáticos que al aceite de
maíz en ratones macho. Los mecanismos
involucrados que justificaron dichas dife-
rencias se centraron en una incrementada
actividad y expresión de enzimas lipogéni-
cas, una elevada expresión de SREBP–1a
(Sterol Regulatory Element Binding Protein),
con una normal actividad y expresión de la
enzima Carnitina Palmitoiltransferasa–1a.
Estudios de Clement y col. (16), mostraron
que la esteatosis hepática inducida por el
trans–10,cis–12–CLA en ratones es secun-
daria a la hiperinsulinemia, que genera un
aumento de la expresión del SREBP–1c y
de la lipogénesis hepática. Así, es posible
que el incremento en los niveles de TG y
Col hepático exacerbado en este grupo, se
relacione a un desequilibrio entre la lipogé-
nesis/ b–oxidación hepática favorecida por
la presencia de bajos niveles de AGPI. Pese
a esta exacerbada acumulación de lípidos
hepáticos en el grupo O+CLA, las alteracio-
nes histológicas fueron mayores en anima-
les cuyas fuentes de AG fueron más insa-
turadas. Esto pudo estar relacionado a un
cierto efecto protector observado por los
CLA en el balance entre los sistemas prooxi-
dantes/ antioxidantes celulares del grupo
O+CLA, debido al bajo grado de insatura-
ción de los AG dietarios y al incremento de
los niveles de GSH. Estos resultados están
en conformidad con los reportados por
estudios previos de nuestro laboratorio (33)
y de otros investigadores (38).
62 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
La suplementación de CLA en los ani-
males alimentados con aceite de maíz, si
bien no causó desequilibrios en el estado
oxidativo hepático, generó profundas alte-
raciones histológicas acompañadas de
un incremento en los niveles de TG. Estos
resultados parecieran estar en contradic-
ción a los observados con otros AG de la
familia n–6. En este sentido, ha sido demos-
trado que el ácido––linolénico (39) y el
AA (40) previnieron la acumulación de TG
hepáticos observados en ratones alimen-
tados con mezclas de CLA, a través de un
incremento en los niveles de prostaglan-
dina E2 (PGE2) y, probablemente, de otros
prostanoides. Estas diferencias con nues-
tra dieta rica en AL podrían ser explicadas
por la inhibición de los CLA sobre la activi-
dad de la enzima ∆6–Desaturasa (41), inhi-
biendo la metabolización de AL a ácido––
linolénico, y en consecuencia la formación
de PGE2. Es dable mencionar que la PGE2
suprime la expresión génica y la actividad
de enzimas y proteínas asociadas a la lipo-
génesis. Asimismo, estos resultados no
explican el mayor grado inflamatorio obser-
vado histológicamente en nuestra experien-
cia. Es posible prever que otros marcadores
pro–inflamatorios a nivel hepático que son
inducidos por el AL (42) serían los causales
de la exacerbación por los CLA del grado
de degeneración del hepatocito, tumefac-
ción citoplasmática, apoptosis e inflama-
ción observada histológicamente.
Finalmente, la combinación de CLA con
aceite de canola atenuó el hígado graso
inducido por el CLA en los ratones. Estos
resultados están en acuerdo con otros tra-
bajos que emplearon diferentes fuentes de
AG de la familia n–3, como aceites de pes-
cado (43), aceite de lino (44), ó DHA aislado
(45). Este efecto protector no estuvo aso-
ciado a cambios en el estado lipoperoxida-
tivo hepático y podría relacionarse a que el
aceite de canola posee los beneficios de
una alta relación AG n–3/ AG n–6, y de altos
niveles de ácido oleico. Asimismo, com-
parado con el grupo M+CLA, se observa
cierto grado de protección de los AG n–3 y
n–9 sobre las alteraciones histológicas cau-
sadas por el CLA.
Conclusiones
Los CLA, independientemente de la
grasa dietaria, producen alteraciones en el
hígado de ratones, no obstante los efec-
tos son diferentes en función de la fuente
de AG considerada. Así, a nivel hepático,
la suplementación con mezcla de CLA a
aceite de oliva generó la mayor acumula-
ción de lípidos, a aceite de maíz indujo un
notable estado pro–inflamatorio, mientras
que a aceite de canola los efectos deleté-
reos fueron más atenuados.
En virtud del empleo de la mez-
cla de CLA de síntesis como ayudas ergo-
génicas y para reducir la grasa corporal en
humanos, este trabajo podría contribuir al
conocimiento de ciertos efectos deletéreos
que los mismos podrían tener en función de
interacciones con otras grasas dietarias.
Agradecimientos
Los autores deseamos agradecer al Sr.
Walter DaRú por su asistencia técnica con
los animales de experimentación y al Sr.
Wilver Herrera Villadare por su apoyo téc-
nico histológico. Asimismo, agradecemos el
financiamiento recibido de la UNL a través
del subsidio CAI+D 2009 (PI–8–36) y del
CONICET PIP nº 112–200801–02831.
Scalerandi, M.V. y col. • Efecto diferencial de la fuente de grasas dietarias...
Nota
1
El presente trabajo ha sido parcialmente presen-
tado y discutido en los Congresos: “9th. Euro Fed
Lipid Congress Oils, Fats and Lipids for a Healthy
and Sustainable World”. Rotterdam, The Nether-
lands. Sept. 2011, y “XVI Congreso Latinoameri-
cano de Nutrición” SLAN. La Habana. Cuba. Nov.
2012. Asimismo, ha sido aceptado para su pre-
sentación en “IUNS 20th. International Congress
of Nutrition”. Granada. España. Sept., 2013.
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 66 a 73

Trabajo completo

Modelo experimental de infección RECIBIDO: 06/07/2013

de plantas de soja por especies de ACEPTADO: 13/09/2013

Cercospora

Latorre Rapela, M.G.1 • Maumary, R.2 • Marcipar, I.3 • Lurá, M.C.1

1
Cátedra de Microbiología General. Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas. Universidad Nacional del Litoral, Ciudad Universita-
ria, Paraje El Pozo, Santa Fe, Argentina.
2
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional del Litoral,
Esperanza, Argentina.
3
Laboratorio de Tecnología Inmunológica. Facultad de Bioquímica
y Ciencias Biológicas. Universidad Nacional del Litoral, Ciudad
Universitaria, Paraje El Pozo, Santa Fe, Argentina.
Email: latorrerapela@gmail.com

RESUMEN: El objetivo de este trabajo fue la enfermedad mancha ojo de rana y

la puesta a punto del modelo experimental
de infección de plantas de soja por
especies de Cercospora.
El ensayo se llevó a cabo en cámara de
crecimiento con temperatura y humedad
controladas. Las plantas se obtuvieron a
partir de semillas de muy buena calidad
y maduración. Las mismas, en estado
fenológico V3, se inocularon con: C.
kikuchii NBRC 6711; C. sojina NBRC 6715,
tres aislamientos regionales de C. kikuchii y
un aislamiento de Cladosporium sp.
Las plantas se evaluaron visualmente y
bajo lupa estereoscópica. A los 5 días post-
inoculación, todas las especies C. kikuchii,
produjeron lesiones compatibles con el
tizón de la hoja. Las plantas inoculadas
con C. sojina NBRC 6715 presentaron
Cladosporium sp. produjo una lesión
diferente a las anteriores.
Este método de inoculación artificial
permitió reproducir las enfermedades y
determinar el período de incubación.
Palabras clave: Inoculación artificial,
Cercospora kikuchii, Cercospora sojina.
SUMMARY: Experimental infection model of
soybean plants with Cercospora species
The aim of this work was to develop an
experimental model in order to infect soy
plants with Cercospora species.
An assay was carried out in a growth
chamber providing temperature and
humidity controls.
Latorre Rapela, M.G. y col. • Modelo experimental de infección de plantas de soja...
The plants, obtained from very good quality
seeds at phenological stage V3, were
inoculated with C. kikuchii NBRC 6711, C.
sojina NBRC 6715, three C. kikuchii regional
isolates and a Cladosporium sp. isolate.
Visual and stereoscopic magnifications
were used for plant examination. Five days
after inoculation, the lesions produced by
all C. kikuchii species were compatible with
soybean leaf blight. Plants inoculated with
Introducción
La soja (Glycine max L. Merr.) es uno de
los cultivos más importantes en Argentina.
En la provincia de Santa Fe, representa una
de las principales fuentes de ingreso. El
clima cálido y húmedo favorece su labranza
y es justamente este tipo de clima, propio
de la zona, el que contribuye a la aparición
de enfermedades con las consecuentes
pérdidas en la producción (1, 2). La pérdida
de rendimiento, puede llegar a tener una
alta implicancia socioeconómica para toda
la región (2).
Entre las enfermedades de final del ciclo
de la soja, se encuentran el tizón de la hoja
y la mancha púrpura de la semilla, cuyo
agente etiológico es Cercospora kikuchii
(Matsumoto & Tomoyasu) M. W. Gardner y
la mancha en “ojo de rana” (MOR) ocasio-
nada por Cercospora sojina Hara (2, 3). La
prevalencia de una u otra depende de las
condiciones de manejo del cultivo y de las
características climáticas de la zona en con-
sideración (1).
Se ha demostrado que uno de los facto-
res de patogenicidad, de los que se valen
numerosas especies de Cercospora es
una toxina de color rojo, denominada cer-
cosporina. La producción de esta toxina
67
C. sojina NBRC 6715 presented frog–eye
leaf spot and Cladosporium sp. produced a
different lesion.
This methodology allowed reproducing the
symptoms of the diseases by applying the
pathogen to healthy plants and determining
the time at which injuries occurred.
Keywords: Experimental infection, Cercospora
kikuchii, Cercospora sojina
desempeña un papel muy importante en
la infección de la soja (4). Las plantas muy
afectadas pierden gran cantidad de follaje,
lo que adelanta su maduración, sin el lle-
nado correcto de vainas y las semillas dis-
minuyen su germinación (5,6).
Para minimizar este problema, se utili-
zan diferentes estrategias entre las que se
encuentra la aplicación de fertilizantes, fun-
gicidas y herbicidas, combinada con el uso
de cultivares de mayor potencial genético,
la difusión masiva de materiales transgéni-
cos en soja y las prácticas de manejo como
la siembra directa (1, 7, 8).
La detección temprana del patógeno en
la planta, constituye una estrategia com-
plementaria para resguardar el medio
ambiente y eliminar algunos de los factores
de riesgo que afectan su rendimiento y la
salud de los seres humanos y animales (9).
Ahora bien, la eficacia de las técnicas
de detección y diagnóstico rápido se debe
comprobar no sólo a nivel de pruebas de
laboratorio sino también, en plantas desa-
rrolladas bajo condiciones controladas y,
en una 3º instancia, “a campo”, siendo los
ensayos “in vitro” un complemento nece-
sario e imprescindible de las pruebas “a
campo”(9).
68 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
En el laboratorio se pueden efectuar eva-
luaciones en condiciones controladas, de
modo de minimizar los efectos del ambiente
frente a los genotipos. La optimización de
dichas condiciones requiere el desarrollo
de un modelo de infección reproducible.
Cuando esto se logra, además de obtener
condiciones de infección estandarizadas,
los resultados se obtienen en un periodo de
tiempo mucho más corto que en el caso de
los ensayos de campo (10).
Es entonces que adquiere relevancia el
desarrollo de métodos de inoculación arti-
ficial bajo condiciones controladas. Esta
metodología ha sido una de las principa-
les prioridades en las investigaciones con
hongos fitopatógenos, ya que evita las fluc-
tuaciones típicas de los ambientes natura-
les aún cuando, en éstos, se favorezcan las
condiciones óptimas de infección (11). Ade-
más, es muy útil para caracterizar la sinto-
matología, efectuar pruebas de selección
genética y realizar estudios de epidemio-
logía (12). Otras ventajas que presenta, es
que permite un mejor control en el manejo
del organismo, mayor seguridad en la eva-
luación de los síntomas, certeza de que no
ocurrirán interferencias con otros microor-
ganismos y rapidez en evaluar el material.
El objetivo de este trabajo fue implemen-
tar y optimizar un modelo experimental de
infección de plantas de soja por especies
de Cercospora.
Materiales y métodos
Para la puesta a punto del modelo expe-
rimental de infección de plantas de soja se
utilizaron semillas de muy buena calidad
que no presentaban a simple vista, daño
mecánico alguno.
Previo a la siembra se realizó su preger-
minado, para lo cual se colocaron en ban-
dejas plásticas previamente desinfectadas
con hipoclorito de sodio al 0,5 %, conte-
niendo papel de filtro embebido en agua
sobre una capa de algodón, para mante-
ner las condiciones de humedad apropia-
das. A continuación, se incubaron en estufa
de germinación bajo condiciones de oscu-
ridad continua, a una temperatura de 25 ±
1ºC durante 96 h (13). Luego, las semillas
pregerminadas se dispusieron en mace-
tas de plástico de 300 mL, conteniendo tie-
rra–arena–vermiculita en proporción 2:1:1.
Las plantas continuaron su desarrollo en la
cámara de crecimiento (3 x 2m) disponible
en la Facultad de Ciencias Agrarias (UNL),
bajo condiciones controladas de tempera-
tura y humedad y a los 45 días se seleccio-
naron las primeras hojas trifoliadas.
• Hongos utilizados y preparación de
los inóculos
Se trabajó con las cepas pertenecien-
tes a la colección NITE Biological Resource
Center (Japón): Cercospora kikuchii NBRC
6711 y Cercospora sojina NBRC 6715 y con
aislamientos regionales de C. kikuchii, para
lo cual se seleccionaron hongos que produ-
cían cercosporina en concentraciones alta,
mediana y baja (14) disponibles en el cepa-
rio de la cátedra; también se incorporó un
aislamiento de Cladosporium sp. para el
estudio de especificidad de género (15).
Para la preparación de los respectivos inó-
culos, cada uno de los hongos se sembró en
5 tubos conteniendo APD (agar papa dex-
trosa) y se incubaron durante 4 días a 25 +
0,2ºC, bajo ciclos alternados de luz (16 h de
luz y 8 h de oscuridad). Transcurrida la incu-
bación, se agregaron 5 mL de agua desti-
lada estéril a cada tubo y se procedió a des-
Latorre Rapela, M.G. y col. • Modelo experimental de infección de plantas de soja...
prender las estructuras fúngicas con el ansa,
mediante un raspado suave de la superficie
del cultivo. La suspensión de las mismas se
cuantificó efectuando recuentos microbio-
lógicos (en placa en superficie) y se proce-
dió a ajustar el inóculo de manera de obtener
una suspensión de 105 UFC/mL (16).
Todos los ensayos se realizaron por
duplicado.
• Inoculación de las plantas
Se trabajó con 16 plantas en estado feno-
lógico V3. Las mismas se dispusieron por
grupos de a dos, de la siguiente manera:
- Plantas sanas, como control negativo
- Plantas tratadas con agua, como con-
trol de inóculo
-Plantas inoculadas con aislamientos
regionales de C. kikuchii con distintas capa-
cidades de producción de cercosporina
(según estudios efectuados y publicados
por González y col. 14)
* CK15, cepa productora de baja con-
centración de cercosporina (3,93±0,39
nmol cyl­­–1 ± SD)
* CK23, cepa productora de mediana
concentración de cercosporina
(85,07±14,88 nmol cyl­–1 ± SD)
* CK32, cepa productora de alta concen-
tración de cercosporina (148,51±3,98 nmol
cyl­­–1 ± SD)
- Plantas inoculadas con C. kikuchii
NBRC 6711, cepa productora de cercospo-
rina (243,30±11,60 nmol cyl­–1 ± SD)
- Plantas inoculadas con C. sojina NBRC
6715, cepa productora de cercosporina
(553,08±5,36 nmol cyl­–1 ± SD)
- Plantas inoculadas con Cladosporium sp.
Se seleccionaron las hojas trifoliadas
correspondientes al primer y segundo par
de hojas completamente desplegadas y
cada planta se asperjó con 2 mL del inóculo
69
correspondiente, humedeciendo ambas
caras de las hojas.
Luego las plantas se cubrieron con bol-
sas de nylon perforadas, previamente
humedecidas en su interior, para proveer
las condiciones de humedad y mojado
foliar adecuadas para estimular el proceso
de infección (17).
• Confirmación de la infección y análi-
sis de la sintomatología
Se realizó el seguimiento de los culti-
vos a diferentes intervalos de tiempo, eva-
luando visualmente la aparición de lesiones
(18). Una vez detectadas se inspecciona-
ron bajo lupa estereoscópica (10–40x), a fin
de corroborar la presencia del agente infec-
cioso.
Ante casos sospechosos, se realiza-
ron observaciones directas bajo micros-
copio óptico (100–400x), o bien se coloca-
ron folíolos con síntomas sospechosos en
“cámaras húmedas” incubadas a 26 ± 0,5
ºC, bajo ciclos alternados de luz (16 h de
luz fría y 8 h de oscuridad) a fin de confir-
mar el crecimiento de las estructuras coni-
diales (19).
Resultados y discusión
Las enfermedades de las plantas redu-
cen significativamente el rendimiento de
los cultivos impactando sobre la produc-
ción agroalimentaria. De hecho, en numero-
sas ocasiones, en la historia de la agricul-
tura, se ha relatado que enfermedades de
diversas etiologías han conmocionado a las
sociedades porque han desvastado los cul-
tivos originando, entre otros efectos, ham-
bruna en la población, elevadas pérdidas
económicas y desastres ecológicos (20).
70 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Como ya se comentó, el desarrollo de
métodos de inoculación artificial bajo condi-
ciones controladas ha sido una de las prin-
cipales prioridades en las investigaciones
con hongos fitopatógenos, pues permite
valorar cualitativa y cuantitativamente la
expresión de la resistencia sobre un deter-
minado hospedante, así como mejorar y
simplificar los procedimientos de selección
en los programas de mejoramiento gené-
tico (11).
Durante el ensayo descrito en este tra-
bajo, se comprobó que tanto los aislamien-
tos regionales como las cepas de referen-
cia fueron capaces de infectar las plantas,
mientras que en la planta tratada con agua
(control negativo) no se observó ningún tipo
de lesión.
Recién a los 5 días post-inoculación, tanto
la cepa patrón CK6711 como los aislamien-
tos regionales CK23 y CK32, produjeron
lesiones compatibles con el tizón de la hoja,
Figura 1. Plantas de soja a los 5 días post-inoculación
lo que se corroboró mediante la observación
con lupa estereoscópica. Estos hongos, bue-
nos productores de cercosporina, ocasiona-
ron en ambas caras de las hojas, lesiones
angulares o irregulares, que coalescieron
formando áreas necróticas con un halo rojo
debido a la presencia de la toxina (Fig. 1).
El aislamiento CK15, productor de baja
concentración de cercosporina, también oca-
sionó lesiones pero las mismas fueron de
tamaño pequeño y sin presencia de halo rojo
(Fig.1).
La planta inoculada con CS6715 pre-
sentó manchas de color castaño rojizo o
grisáceas oscuras, rodeada de un delgado
margen marrón rojizo, compatibles con
MOR (Fig. 1).
A mayor aumento se pudieron distinguir,
sobre la lesión, los conidióforos (Fig. 2).
Por su parte, Cladosporium sp. produjo
una lesión diferente a las anteriores (Fig. 1).
Latorre Rapela, M.G. y col. • Modelo experimental de infección de plantas de soja... 71

a: Observación de la hoja a simple vista; b: Observación de la hoja con lupa estereoscópica (40 x).
1a y 1b–planta tratada con agua; 2a y 2b–planta inoculada con CK15; 3a y 3b–planta inoculada con CK23; 4a y 4b–
planta inoculada con CK32; 5a y 5b–planta inoculada con Cercospora kikuchii NBRC 6711; 6a y 6b–planta inoculada
con Cercospora sojina NBRC 6715; 7a y 7b–planta inoculada con Cladosporium sp.

Figura 2. Planta inoculada con Cercospora sojina NBRC 6715

Observación con lupa estereoscópica (40x) de los conidióforos sobre la lesión en la hoja
72 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
En el presente trabajo, el desarrollo de
un método de inoculación artificial bajo
condiciones controladas permitió reprodu-
cir los síntomas de la enfermedad al apli-
car el patógeno en tejidos de plantas sanas
y determinar el tiempo de aparición de las
lesiones observadas a simple vista.
Coincidiendo con lo observado por
Almeida y col. (21), los síntomas comenza-
ron a hacerse visibles a simple vista sobre
las hojas de las plantas 5 días después
de la inoculación. En cuanto a las lesiones
observadas, los resultados fueron seme-
jantes a los obtenidos por otros autores
cuando inocularon plantas de soja con C.
kikuchii productores de distintas concentra-
ciones de cercosporina (4).
Conclusiones
El desarrollo de un método de inocula-
ción artificial bajo condiciones controladas
permitió reproducir los síntomas de la enfer-
medad al aplicar el patógeno en tejidos de
plantas sanas, ya que se observaron, a sim-
ple vista, lesiones compatibles con tizón de
la hoja y MOR a partir de los 5 días de efec-
tuada la inoculación.
Agradecimientos
Este trabajo se realizó en el marco de un
Proyecto CAID 2009, financiado por Univer-
sidad Nacional del Litoral, Argentina.
Notas
Resultados parciales del trabajo fueron presen-
tados en el XII Congreso Argentino de Microbio-
logía (2010) y XII Congreso Argentino de Micolo-
gía (2011).
1
según estudios efectuados y publicados por el
grupo de trabajo (González y col., 2008)
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 74 a 84

Trabajo completo

Cuantificación simultánea de colorantes RECIBIDO: 25/06/2013

en bebidas deportivas utilizando ACEPTADO: 08/10/2013

espectroscopia visible y PLS–1

Rodríguez, M.C.1 • Schenone, A.V.2 • Sobrero, M.S.3 • Marsili, N.R.

1
Cátedra de Química Analítica II
2
Cátedra de Química Analítica I
3
Cátedra de Química General, Facultad de Bioquímica y Ciencias
Biológicas, Universidad Nacional del Litoral. Ciudad Universitaria,
Paraje El Pozo S/N, 3000, Santa Fe, Argentina.
E–mail: nmarsili@fbcb.unl.edu.ar

RESUMEN: En este trabajo se propone un en bebidas comerciales en laboratorios

nuevo procedimiento para la cuantificación
de cuatro colorantes artificiales: rojo
allura, azul brillante, tartrazina y amarillo
ocaso, presentes en bebidas hidratantes
de la marca Gatorade y Powerade. Se
aplico espectroscopía visible y calibración
multivariada. Los datos fueron tratados
con el programa Matlab y la rutina MVC1
aplicando el método PLS–1. Los resultados
de las predicciones aplicando este nuevo
método, se compararon estadísticamente
con los obtenidos aplicando el método
de referencia (cromatografía líquida), en
todos los casos los resultados fueron
comparables. La desventaja es que el
amarillo ocaso no pudo ser cuantificado
por este método, aunque su presencia
no interfiere con la determinación de los
otros tres colorantes. Puede concluirse
que este método es fácilmente aplicable
para el control de calidad de colorantes
de baja complejidad, sin necesidad de
recurrir a técnicas separativas y reactivos
contaminantes.
Palabras clave: Colorantes alimentarios,
Bebidas deportivas, Espectroscopía visible y
PLS–1.
SUMMARY: Simultaneous quantification
of dyes in sport drinks using visible
spectroscopy and the PLS method
In this paper we propose a new
quantification method of four artificial
dyes: allura red, brilliant blue, tartrazine,
sunset yellow, present in two sports drinks
brands, Gatorade and Powerade. Visible
spectroscopy and multivariate calibration
were applied. The data were processed
with the Matlab program and routine MVC1
applying the PLS–1 method. The results
of applying this new prediction method
Rodríguez, M.C. y col. • Cuantificación simultánea de colorantes en bebidas deportivas...
were statistically compared with those
obtained using the reference method (liquid
chromatography). In all cases the results
were comparable. The disadvantage is
that sunset yellow could not be quantified
by this method, although its presence
does not interfere with the determination of
the other three dyes. It can be concluded
Introducción
El color es una de las primeras impre-
siones que se tienen de un alimento,
este tiende a modificar subjetivamente
otras sensaciones como el sabor y el
olor, y puede llegar a definir el éxito o fra-
caso de un producto en el mercado.
Los colorantes conforman el grupo de adi-
tivos alimentarios que se encarga de pro-
porcionar el color deseado y esperado de
cada alimento. De acuerdo con su origen
se pueden clasificar como colorantes sinté-
ticos y naturales. Existe la creencia de que
los colorantes naturales son inofensivos, sin
embargo, el agregado de todos ellos está
regulado según normas nacionales e inter-
nacionales y tienen un valor de concentra-
ción máximo aceptado, por lo que es nece-
sario controlar que tipo de colorantes fueron
adicionados a los productos comerciales y
en qué cantidad.
Cuando son agregados en concentracio-
nes mayores a las aceptadas pueden pre-
sentar riesgos para la salud humana (1,2).
Durante las tres últimas décadas, varios
estudios han demostrado que concentra-
ciones moderadas de colorantes sintéticos
en los alimentos pueden provocar hiperac-
tividad y otros desordenes en el compor-
75
that this method is readily applicable to
the quality control of commercial drinks
dyes in laboratories with low complexity,
without requiring separation techniques and
contaminant reagents.
Keywords: Food coloring, Sports drinks,
Visible spectroscopy and PLS–1.
tamiento de los niños (3,4). También en
personas con características orgánicas
especiales puede presentarse intolerancia,
intensificación de los síntomas de asma y
alergias, etc. (5). Los códigos con los que
se identifica a cada colorante deben figurar
en la etiqueta de los productos comerciales
que lo contienen. Estos son asignados por
las organizaciones internacionales, para los
colorantes estudiados, estos códigos son
los siguientes: E110 para el amarillo ocaso,
E133 para el azul brillante, E129 para el rojo
Allura y E102 para la tartrazina (6).
Según el Código Alimentario Argentino,
los colorantes en bebidas no deben exce-
der las siguientes concentraciones: tartra-
zina: 0,010 g/100g, amarillo ocaso: 0,010
g/100g, rojo allura: 0,010 g/100g y azul
brillante: 0,010 g/100 g. La ingesta diaria
máxima recomendada es de 2,5 mg / kg,
7,5 mg / kg, 7 mg / kg y 12,5 mg / kg de
peso corporal para el amarillo ocaso, tartra-
zina, rojo allura y brillante azul, respectiva-
mente (7,8).
Se encuentran publicados numerosos
trabajos sobre técnicas analíticas aplica-
das a la determinación de colorantes ali-
mentarios, en ellos se describen técni-
cas como polarografía de pulso diferencial
76 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
(9,10), espectrofotometría (11,12), volta-
metría (13), electroforesis capilar (14,15),
cromatografía de capa fina (16), y croma-
tografía líquida (HPLC) con detector UV–
VIS (17–20) y espectroscopía UV–VIS–DAD
(21). La técnica HPLC se utiliza en la mayo-
ría de los trabajos publicados como un
método de referencia, se caracteriza por su
poder de resolución en el análisis de mez-
clas complejas, pero entre las desventajas
deben considerase el alto costo del equipo,
el tiempo de análisis, y el uso de solventes
contaminantes.
Todo lo expuesto anteriormente indica
la importancia que tiene la cuantificación
de colorantes en alimentos por parte de la
industria y de los organismos oficiales, con el
fin de proteger la salud de los consumidores.
El presente trabajo surge de la necesidad
de contar con un método que permita cuan-
tificar los cuatro colorantes (amarillo ocaso,
azul brillante, rojo allura y tartrazina) simul-
táneamente, sin necesidad de utilizar pre-
viamente complejas técnicas separativas
o equipamiento sofisticado, es decir una
metodología adaptable a laboratorios con
mediana infraestructura. Se propone la uti-
lización de espectroscopia visible para la
obtención de los espectros de absorción de
las muestras y el uso de programas esta-
dísticos para el procesamiento y análisis de
los resultados.
Materiales y Métodos
• Materiales
- Espectrofotómetro UV–Vis Perkin Elmer
Lambda 20 (Waltham, Massachusetts,
EE UU), con cubetas de vidrio de 1,00 cm
camino óptico.
- Cromatógrafo líquido de alta resolución
(HPLC) Agilent 1100 Series con detector de
UV–DAD (Agilent Technologies, Waldbronn,
Alemania).
- Filtros de jeringa de poro 0,45 um
tamaño HPLC (Centro de Química).
Reactivos y soluciones
Metanol, grado HPLC y ácido acético
marca Merck; Acetato de amonio y acetato
de sodio marca Mallinckrodt; tartrazina, azul
brillante, rojo allura y amarillo ocaso marca
Sigma Aldrich.
La solución reguladora de acetato de
sodio (pH:5) se preparó una mezclando:
643 mL de solución de acetato de sodio 0.1
M preparada a partir de droga sólida, con
357 mL de solución de ácido acético 0.1 M.
preparada a partir de ácido acético concen-
trado (18 M).
Las soluciones estándar de tartrazina,
azul brillante, rojo allura y amarillo ocaso de
2000 mg L-1 se prepararon disolviendo can-
tidades apropiadas de cada compuesto en
agua Milli–Q.
Las muestras comerciales seleccionadas
fueron siete bebidas hidratantes de las mar-
cas Gatorade® (Quaker Oats Company, EE
UU) y Powerade ® (Coca–Cola Company,
EEUU), de diferentes sabores: cool blue,
green mango, frutas tropicales, naranja,
berry y lima–limón. A cada bebida se le
asigno un rótulo (ver Tabla 1).
Rodríguez, M.C. y col. • Cuantificación simultánea de colorantes en bebidas deportivas... 77

Tabla 1. Bebidas comerciales estudiadas

Bebidas comerciales Colorantes declarados

1. Gatorade® Cool Blue Azul brillante
2. Gatorade® Green Mango Azul brillante – Tartrazina
3. Gatorade® Frutas tropicales Rojo allura
4. Gatorade® Naranja Amarillo ocaso
5. Powerade® Naranja Amarillo ocaso – Tartrazina
6. Gatorade® Berry Azul brillante – Rojo allura
7. Powerade® Lima–Limón Tartrazina

Métodos rango de longitudes de onda de 350 a 750

Método de HPLC: se aplicó el método
desarrollado por Alves, Pereira. et al. (2008)
(20). La fase móvil utilizada fue una mezcla
de acetato de amonio (0,08 mol L-1) – meta-
nol puro (45:55). La columna seleccionada
fue 18–C ODS Zorbax (4,6 x 250 mm), con
5 micras de tamaño de partícula. La veloci-
dad de flujo se ajustó a 1 ml min-1 a 20 °C.
Método espectrofotométrico: para la cali-
bración se preparó un juego de diecinueve
mezclas siguiendo un diseño central com-
puesto, para cuatro componentes en cinco
niveles de concentración (entre 0,00 y 10,00
mg L-1), con tres puntos centrales.
Para la validación del método se prepara-
ron nueve mezclas de los cuatro colorantes
en tres niveles de concentración (3,20; 6,40
y 9,60 mg L-1).
En todos los casos, las soluciones
se prepararon por triplicado, se utiliza-
ron matraces aforados de 25 ml, agre-
gando un volumen apropiado de solución
estándar de cada colorante, 5 ml de solu-
ción reguladora de acetato (pH: 5), lle-
vando a volumen final con agua Milli–Q.
El registro de los espectros de absorción
de todas las muestras, se realizaron en el
nm cada 2 nm. La velocidad de barrido,
en todos los casos, fue 1920 nm.min-1.
Tratamiento estadístico de los datos: des-
pués de registrar los espectros de absor-
ción, los datos se convirtieron a formato
TXT utilizando el programa OriginPro 7.5.
Para la calibración y las predicciones se uti-
lizo el programa MATLAB, con la interfaz
MVC–1 desarrollada por Olivieri (22), apli-
cando el método PLS–1.
• Validación
Para validar la exactitud del método
desarrollado, se compararon los resultados
de las predicciones obtenidas aplicando
este nuevo método y el método de referen-
cia (HPLC), aplicando el test estadístico de
comparación de medias. Para poder aplicar
este test, es necesario primeramente aplicar
la prueba F, a fin de comparar las varianzas.
Se calcularon, los valores de t y p. Se
consideró que si p > 0,05, se aceptaba
la hipótesis nula: media 1 = media 2 y si
p < 0.05, se rechaza la hipótesis nula y se
aceptaba la hipótesis alternativa: media 1 ≠
media 2.
78 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Resultados y discusión de 0,00 a 20,00 mg L-1; los valores de absor-

• Estudio de la linealidad
Se estudio individualmente la linealidad
de cada colorante mediante la realización
de curvas de calibrado (absorbancia vs con-
centración), en un rango de concentraciones
bancia se tomaron en los picos de absor-
ción (482 nm para amarillo ocaso, 630 nm
para azul brillante, 502 nm para rojo allura y
426 nm para tartrazina) (ver Figura 1).

Figura 1. Espectros de absorción de cada uno de los cuatro colorantes puros, adquiridos entre 350
y 750 nm; en concentración igual a 10 mgL-1. Pueden observarse los picos de absorción para cada
colorante (482 nm para amarillo ocaso, 630 nm para azul brillante, 502 nm para rojo allura y 426 nm
para tartrazina).

Se estudiaron los parámetros estadís- de los colorantes estudiados, se utilizó el

ticos obtenidos aplicando regresión lineal
simple; los cuatro analitos mostraron res-
puesta lineal en el rango estudiado, ver
Figura 2 (Y1). Debido a que las absorban-
cias de las soluciones de concentraciones
mayores a 10,00 mg L-1 superaban el valor
de 1, se decidió trabajar en un rango de
0,00 a 10,00 mg L-1.
• Estudio efecto Matriz
Con el fin de estudiar la presencia, en
la matriz de la muestra, de sustancias que
podrían afectar la respuesta instrumental
método de adición estándar. Se prepararon
curvas de calibrado para cada uno de los
cuatro colorantes puros, en concentracio-
nes entre 0,00 y 8,00 mg L-1 y se compa-
raron con curvas similares a las que, ade-
más de la solución estándar, se añadió una
cantidad constante de muestra. En la Figura
2 se muestran las ecuaciones y los pará-
metros de la regresión obtenidos para las
curvas de calibración de cada uno de los
cuatro colorantes puros (Y1); además en la
figura aparecen graficadas las curvas de
adición estándar (Y2).
Rodríguez, M.C. y col. • Cuantificación simultánea de colorantes en bebidas deportivas... 79

Figura 2. Curvas de calibrado (Y1) y curvas de adición estándar (Y2) para cada uno de los cuatro
colorantes. Al pie de cada grafico figuran la ecuación de la recta de regresión, el coeficiente r2 y su
correspondiente desviación estándar.

Mediante la comparación de las pen-
dientes de las rectas estimadas, para cada
colorante, pudimos demostrar que no existe
efecto de la matriz, ya que en todos los
casos las rectas tienen pendientes aproxi-
madamente iguales.
• Calibración
Con los espectros de absorción corres-
pondientes a cada una de las diecinueve
mezclas de calibración, se construyó una
matriz de datos 19 x 201. La información se
procesó con el programa Matlab y la rutina
MVC1 aplicando del método de calibración
multivariado PLS–1. En la Tabla 2 se mues-
tran los parámetros de calibración para
cada uno de los colorantes, donde figu-
ran: número óptimo de factores (A), calcu-
lada por el método de validación cruzada
de Haaland, Thomas (23), rango de longitu-
des de onda de trabajo (∆ (nm)), error rela-
tivo de la predicción (REP), suma de cua-
drados de error de predicción (PRESS) y el
coeficiente de correlación al cuadrado (r2).
Además, se calcularon las siguientes
cifras de mérito: selectividad (SEL), sen-
sibilidad (SEN), sensibilidad analítica
(–1), límite de detección (LOD) y límite
de cuantificación (LOQ), los resulta-
dos obtenidos se muestran en la Tabla 3.
Como se puede observar en las Tablas 2 y
3, los parámetros de calibración y cifras de
80 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

mérito fueron aceptables para el azul bri-
llante, la tartrazina y el rojo allura. Pero para
el amarillo ocaso, el número de factores (A
= 5) excede el número de componentes
de las mezclas de calibración y presenta la
selectividad más baja (SEL = 0,11), lo que
indica que el método no es capaz de prede-
cir satisfactoriamente la concentración de
este colorante.

Tabla 2. Parámetros de la calibración, obtenidos al aplicar PLS–1.

Colorante A Rango optimo (nm) REP (%) PRESS r2

Amarillo ocaso 5 430 – 550 0,7 0,0202 0,9998
Azul brillante 1 680 – 700 2,4 0,2227 0,9977
Rojo allura 4 460 – 588 2,1 0,1930 0,9978
Tartrazina 4 350 – 510 1,2 0,0538 0,9994

A: número optimo de factores; REP: error relativo de la predicción (Relative error of prediction); PRESS: suma de
cuadrados de los errores de predicción (Sum of squares of prediction error); r2: coeficiente de correlación.

Tabla 3. Cifras de merito para cada uno de los cuatro colorantes.

SEL SEN γ–1 LOD LOQ

(L mg )-1
(mg L–1) (mg L-1) (mg L-1)
Amarillo ocaso 0,11 0,026 0,009 0,10 0,35
Azul brillante 1,00 0,500 0,003 0,19 0,58
Rojo allura 0,39 0,098 0,005 0,29 0,90
Tartrazina 0,28 0,074 0,008 0,18 0,54

SEL: selectividad; SEN: sensibilidad; γ–1: sensibilidad analítica; LOD: límite de detección; LOQ: límite de cuantifi-
cación.

• Validación les y las predichas, estos valores estuvieron com-

Se predijeron las concentraciones de los cua- prendidos entre 97 y 101 % (ver Tabla 4); estos
tro colorantes en las muestras de validación uti- resultados son muy satisfactorios.
lizando PLS–1, se calcularon los porcentajes de
recuperación entre las concentraciones nomina-
Rodríguez, M.C. y col. • Cuantificación simultánea de colorantes en bebidas deportivas... 81

Tabla 4. Concentraciones nominales y predichas (mg L-1) y su correspondiente porcentaje de recupe-

ración para los cuatro colorantes en las muestras de validación.

Amarillo ocaso Tartrazina

Nominal Predicha* % Rec. Nominal Predicha* % Rec.
3,2 3,12 97,6 ± 2,5 3,20 3,21 100,4 ± 0,7
6,4 6,26 97,8 ± 4,1 6,40 6,39 99,9 ± 0,2
9,6 9,56 99,6 ± 0,8 9,60 9,67 100,3 ± 0,9
Azul brillante Rojo allura
3,20 3,20 100,2 ± 1,2 3,20 3,16 98,7 ± 3,2
6,40 6,29 98,3 ± 7,5 6,40 6,42 100,4 ± 1,9
9,60 9,74 101,5 ± 0,5 9,60 9,55 99,5 ± 1,1

* promedio de tres muestras.

Rec: porcentaje de recuperación.

• Muestras comerciales

Las muestras reales mostraron turbidez concentración y los errores porcentuales.

debido a las sustancias presentes en su for-
mulación. Esta turbidez generaba un efecto
indeseable tanto para la espectroscopía
visible, como para el método de referencia
(18), por lo que las muestras se filtraron pre-
viamente dos veces con filtro de jeringa de
HPLC. Después de este procedimiento, fue
eliminada la interferencia, siendo la absor-
bancia de las soluciones debida exclusiva-
mente a la presencia de los colorantes estu-
diados.
Se predijeron las concentraciones de los
cuatro analitos aplicando el método pro-
puesto y el método de referencia. Se com-
pararon los resultados mediante el test
estadístico de comparación de medias. En
todos los casos, no se encontraron diferen-
cias significativas entre las medias, con un
nivel de confianza del 95 %.
Los resultados de las predicciones y los
valores de probabilidad se muestran en la
Tabla 5, así como los errores relativos de la
Para el azul brillante, la tartrazina y el rojo
allura los resultados de las predicciones
realizadas con ambos métodos son esta-
dísticamente comparables porque en estos
casos p > 0,05 y el error relativo porcentual
estuvo comprendido entre 1 y 5 %.
Pero, los resultados obtenidos para el
amarillo ocaso aplicando el método pro-
puesto difieren significativamente de los
valores obtenidos por HPLC, con valores
para el error relativo porcentual entre 17,5
y 48,4 %. Se aplicaron otros métodos de
calibración multivariada de primer orden
como PCR, HLA–GO y HLA–XS para prede-
cir amarillo ocaso, pero ninguno fue capaz
de mejorar las predicciones obtenidas por
PLS–1. Se llegó a la conclusión de que para
este tipo de muestras, el amarillo ocaso no
puede ser cuantificado por este método.
Aunque, su presencia no interfiere con la
cuantificación de los otros tres colorantes.
82 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Tabla 5. Concentraciones predichas mediante el método HPLC y PLS-1

Muestra Colorante declarado HPLC a PLS–1 a pb E (%)

1 Azul brillante 2,46 ± 0,05 2,51 ± 0,21 0,687508 2,0
1,81 ± 0,05 1,87± 0,03 0,113457 3,3
2 Azul brillante Tartrazina
4,98 ± 0,23 4,73 ± 0,05 0,132286 5,0
3 Rojo allura 7,48 ± 0,20 7,41 ± 0,20 0,697803 0,9
4 Amarillo ocaso 11,85 ± ,15 17,58 ± 0,28 0,000006 48,4
8,73 ± 0,07 10,26 ± 0,11 0,001518 17,5
5 Amarillo ocaso Tartrazina
1,88 ± 0,03 1,84 ± 0,04 0,899647 2,1
Azul brillante ND ND
6 1,6
Rojo allura 17,82 ± 0,11 18,11 ± 0,10 0,131918
7 Tartrazina 3,44 ± 0,24 3,40 ± 0,26 0,853964 1,1

a
media de tres valores con su correspondiente intervalo de confianza (mg L-1). ND: no detectable.
b
p: probabilidad.
E (%): error porcentual

Conclusiones
Los límites de detección obtenidos
mediante este nuevo método resultaron:
0,19 mg L-1 para azul brillante, 0,29 mg L-1
para rojo allura y 0,18 mg L-1 para tartrazina,
esto lo hace muy útil, ya que estos valores se
encuentran por debajo de los niveles tolera-
dos por los organismos oficiales.
A pesar de que el amarillo ocaso en las
bebidas estudiadas (Gatorade y Powerade)
no pudo cuantificarse por este método, los
resultados obtenidos para rojo allura, azul
brillante y tartrazina resultaron comparables
estadísticamente a los obtenidos aplicando
el método de referencia.
El método desarrollado es sencillo, solo
requiere del agregado de solución regula-
dora de acetato de sodio y equipamiento
de mediana complejidad, por lo que se pre-
senta como una alternativa fácil de aplicar
en laboratorios de control de calidad de
empresas o entes oficiales.
Agradecimientos
El presente trabajo pudo llevarse a cabo
gracias al apoyo financiero de la Universi-
dad Nacional del Litoral (Proyecto CAI+D
nº 12–61).
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 85 a 102 85

Trabajo completo

Efectos de los conjugados del ácido RECIBIDO: 02/08/2013

linoleico sobre la incorporación tisular ACEPTADO: 13/09/2013

de ácidos grasos y metabolismo lipídico

en ratas deficientes en ácidos grasos
esenciales

Fariña, A.C.1,2 • González, M.A.1 • Latorre, M.E.2 • Bernal, C.A.1,2

1
Cátedra Bromatología y Nutrición, Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, 3000, Santa Fe,
Argentina.
2
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONI-
CET), 3000, Santa Fe, Argentina.
E–mail: cbernal@fbcb.unl.edu.ar

RESUMEN: El objetivo del presente tamaño del tejido adiposo; no obstante,

estudio fue investigar si los conjugados
del ácido linoleico (CLA) podrían atenuar o
potenciar algunas alteraciones observadas
en ratas con deficiencia marginal de ácidos
grasos esenciales (AGE). Para ello, ratas
Wistar macho fueron alimentadas 60
días con dietas suficientes o deficientes
en AGE, suplementadas o no con CLA.
Los CLA presentaron distinto grado de
incorporación en los tejidos, mostrando
una alta retención en tejido adiposo y una
marcada resistencia en cerebro; asimismo
en los animales con dietas suficientes o
deficientes en AGE, los CLA modificaron en
forma diferencial los marcadores tisulares
de deficiencia de AGE. En animales
con dietas deficientes en AGE, los CLA
redujeron los triglicéridos circulantes y el
estas modificaciones y el incremento del
hígado permitirían postular una similitud
con ciertas alteraciones observadas en los
inicios de la lipodistrofia presente en otros
modelos experimentales.
Palabras clave: Deficiencia de ácidos
grasos esenciales, Conjugados del ácido
linoleico, Nutrición, Metabolismo de lípidos.
SUMMARY: Effects of conjugated linoleic
acid on tissular fatty acid incorporation and
lipid metabolism in essential fatty acid–
deficient rats
The aim of this work was to investigate
whether conjugated linoleic acid (CLA)
may attenuate or enhance some alterations
observed in rats with marginal deficiency of
86 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
essential fatty acids (EFA). For this purpose,
male Wistar rats were fed sufficient or
deficient in EFA diets, supplemented or
not with CLA, for 60 days. CLA showed
different degree of incorporation into
the tissues, showing a high retention in
adipose tissue and noticeable resistance
in brain. Moreover, independently of the
EFA deficiency, CLA differentially modified
the tissue biomarkers of EFA deficiency.
In animals with EFA deficient diets, CLA
Introducción
El ácido linoleico (AL: 9c,12c–18:2) y el
ácido α–linolénico (ALA: 9c,12c,15c–18:3)
son los dos ácidos grasos esenciales (AGE)
para el hombre, y su esencialidad se debe a
la incapacidad de los seres humanos para
añadir dobles enlaces en las posiciones n–3
y n–6 de la cadena acílica, por carecer de
las enzimas D12 y D15 desaturasas. Debido
a esto, ambos ácidos grasos (AG) deben
ser suministrados por la dieta (1). Los AGE
cumplen numerosas funciones biológi-
cas, entre ellas, determinan ciertas propie-
dades de membranas celulares y son pre-
cursores de AG poliinsaturados (AGPI) de
cadena larga (20 y 22 átomos de carbono) y
de eicosanoides que regulan diferentes pro-
cesos biológicos (2). Los AGE, y sus deri-
vados, cumplen un rol fundamental en el
crecimiento y desarrollo normal, como asi-
mismo desempeñan un importante papel en
el desarrollo y/o prevención de enfermeda-
des crónicas no transmisibles, como enfer-
medades coronarias, hipertensión, artritis,
enfermedades inflamatorias y autoinmunes,
diversos tipos de cáncer y en el control de
la homeostasis de los lípidos (3). Por con-
reduced circulating triacylglycerides and
adipose tissue weight; however, these
changes and the increased liver size would
allow postulating that a similarity with some
alterations observed in the beginning
of the lipodystrophy syndrome in other
experimental models might be present in
these rats.
Keywords: Essential fatty acid deficiency,
Conjugated linolenic acid, Nutrition, Lipid
metabolism.
siguiente, tanto en seres humanos, como
en animales de experimentación, las conse-
cuencias de la deficiencia de AGE incluyen,
entre otras (4): retraso del crecimiento, pér-
dida de la integridad cutánea, alteraciones
en la reproducción, degeneración hepática y
renal, esteatosis hepática, fragilidad capilar,
modificaciones en la composición de AG de
los lípidos tisulares y aumento de la suscep-
tibilidad a infecciones (5). Además, la defi-
ciencia de AGE puede agravar la malabsor-
ción de grasas, empeorando la carencia de
AGE (6,7). La deficiencia de AGE no es fre-
cuentemente observada; no obstante ciertos
pacientes pueden tener una deficiencia mar-
ginal de AGE que los tornan vulnerables a
trastornos metabólicos.
Por otro lado, los conjugados del ácido
linoleico (CLA) son un grupo de isóme-
ros geométricos y posicionales derivados
del AL, producidos durante la biohidroge-
nación de AGPI en el rúmen de los anima-
les poligástricos, o por procesos industria-
les. En los productos naturales prevalece
el 9c,11t–18:2 (9c,11t–CLA), mientras que
en las preparaciones comerciales que se
expenden como suplementos dietéticos
Fariña, A.C. y col. • Efectos de los conjugados del ácido linoleico...
para reducir de peso o como ayudas ergo-
génicas, se presentan principalmente y en
cantidades equimoleculares, los isómeros
9c,11t–CLA y 10t,12c–18:2 (10t,12c–CLA).
Diversos efectos benéficos han sido reporta-
dos en relación a los CLA. Entre ellos en dife-
rentes modelos animales se les han atribuido
propiedades anticancerígenas (8), antiatero-
génicas (9), antiobesogénicas (9–11), como
asimismo se ha observado que los CLA
mejoran los niveles de lípidos y lipoproteí-
nas circulantes (12) e incrementan la masa
magra corporal (13). En contraposición,
también efectos adversos han sido repor-
tados debidos a la ingesta de CLA, entre
ellos, resistencia a la insulina, hiperinsuline-
mia y esteatosis hepática masiva en ratones
(11,14,15). En general, los efectos mencio-
nados de los CLA dependen de muchos fac-
tores, como el tipo de isómero, la especie,
sexo, condición fisiológica y nutricional (16).
Dado que los CLA se incorporan en los
tejidos y podrían actuar como sustratos alter-
nativos o competir en el metabolismo de los
AGE y sus derivados (17,18), el objetivo del
presente estudio fue investigar si los CLA
podrían atenuar o potenciar algunas altera-
ciones observadas en un modelo animal de
deficiencia marginal de AGE. El estudio fue
centrado en la incorporación diferencial de
CLA en tejidos y su efecto sobre la deficien-
cia en AGE, como también sobre paráme-
tros nutricionales, niveles de lípidos plasmáti-
cos y tisulares, y algunos de los mecanismos
implicados en su regulación.
Materiales y métodos
• Materiales
La mayoría de los componentes, inclu-
yendo vitaminas y minerales para la pre-
paración de las dietas fueron al menos
87
grado químico, a excepción del aceite de
maíz (Arcor, Córdoba, Argentina), aceite de
coco hidrogenado (Castoroil, Buenos Aires,
Argentina), aceite rico en CLA (Lipid Nutrition
B.V., Wormerveer, The Netherlands), saca-
rosa, celulosa y almidón de maíz, que fueron
de grado alimenticio y se obtuvieron a partir
de fuentes locales. El aceite de maíz fue uti-
lizado como una fuente de AG insaturados;
el aceite de coco fue utilizado para produ-
cir una deficiencia moderada de AGE y el
aceite rico CLA se utilizó como fuente equi-
molecular de 9c,11t–CLA y 10t,12c–CLA. Los
estándares utilizados fueron adquiridos en
Sigma Chemical Co (St Louis, MO, EE UU).
Los solventes y reactivos utilizados para la
cuantificación de AG fueron de grado cro-
matográfico, y los demás reactivos quími-
cos utilizados fueron, al menos, de grado
reactivo analítico ACS. Los kits de pruebas
comerciales se obtuvieron de la Sociedad
de Bioquímicos (Santa Fe, Argentina).
• Animales, dietas y diseño experimental
Todos los protocolos seguidos en los
estudios fueron aprobados por el Comité
Asesor de Ética y Seguridad de Investiga-
ción de la Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas de la Universidad Nacional
del Litoral y acorde a la Guía para el Cui-
dado y Uso de Animales de Experimen-
tación en el Laboratorio (19). Ratas Wistar
macho con un peso de 70–80 g se mantu-
vieron en un bioterio bajo condiciones con-
troladas (23 ± 2 °C y ciclo de 12 hs. luz–
oscuridad). Los animales tuvieron libre
acceso a agua y dieta estándar de labora-
torio antes del período experimental. Des-
pués de alcanzar 100–120 g, fueron dividi-
dos en cuatro grupos de similar peso (n=
6 por grupo). Los animales fueron aloja-
dos en jaulas metabólicas de acero inoxi-
88 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

dable individuales y alimentados ad libitum la dieta. En la dieta DAGE, el 7 % del aceite

durante 60 días con dieta suficiente en AGE
(SAGE), dieta deficiente en AGE (DAGE),
dieta SAGE suplementada con aceite rico
CLA (SAGE+CLA) o dieta DAGE suplemen-
tada con aceite rico CLA (DAGE+CLA).
La composición de las dietas se pre-
senta en la Tabla 1, y se basó en las reco-
mendaciones del Comité del Instituto Ame-
ricano de Nutrición (AIN–93G) (20). Todas
las dietas fueron isoenergéticas, propor-
cionando teóricamente 16,6 kJ/g. La dieta
SAGE contuvo 7 % de aceite de maíz (20
% de la energía) como fuente de grasa de
de maíz fue sustituido por 7 % de aceite
de coco hidrogenado libre en AG trans. La
suplementación con CLA se logró mediante
la sustitución del 1 % de aceite de maíz
(SAGE+CLA) o del 1 % de aceite de coco
hidrogenado (DAGE+CLA) por el aceite
rico en CLA (mezcla de isómeros 9c,11t–
CLA y 10t,12c–CLA, aproximadamente
35–40 % de cada uno). Excepto por el tipo
de grasas, todas las dietas fueron idénticas
y preparadas cada 3 días durante todo el
período experimental.

Tabla 1. Composición de las dietas experimentales.

Componentes dietarios (g/kg dieta) SAGE DAGE SAGE+CLA DAGE+CLA

Almidón de maíz 529,5 529,5 529,5 529,5
Caseína 200 200 200 200
Sacarosa 100 100 100 100
Aceite de maíz 70 – 60 –
Aceite deficiente en AGE – 70 – 60
Aceite rico en CLA – – 10 10
Fibras 50 50 50 50
Mezcla de vitaminas 35 35 35 35
Mezcla de minerales 10 10 10 10
L–Cisteína–L–metionina 3,0 3,0 3,0 3,0
Colina 2,5 2,5 2,5 2,5
Energía (KJ/g) 16,6 16,6 16,6 16,6

Las dietas fueron preparadas de acuerdo con AIN–93G (20).

• Protocolo experimental la mañana del día 60, los animales se sacri-

Tres veces a la semana se registró el peso
de los animales, la ingesta de alimentos y se
recogieron las heces, a lo largo de todo el
tratamiento dietario. La ingesta de alimentos
se ajustó mediante la colección de los restos
de alimentos. Las heces se deshidrataron y
almacenaron a –80 °C hasta su análisis. En
ficaron bajo condiciones de anestesia (1 mg
de acepromacina + 100 mg de ketamina/kg
de peso corporal), el cuerpo fue desprovisto
del pelo y eviscerado.
Las carcasas fueron pesadas, tritura-
das y congeladas a –80°C hasta el análi-
sis de su composición centesimal. Otros
Fariña, A.C. y col. • Efectos de los conjugados del ácido linoleico... 89

grupos de animales fueron tratados nutri- • Composición de AG de los aceites

cionalmente y sacrificados en las mismas
condiciones que fueran detalladas con el
fin de obtener sangre y tejidos para diver-
sas determinaciones, o para llevar a cabo
diferentes experimentos in vivo. El suero
se obtuvo por centrifugación después de
la extracción de la sangre y de eliminar el
coagulo resultante. Los hígados, múscu-
los gastrocnemio, tejido adiposo epididimal
(TAE), tejido adiposo retroperitoneal (TARP)
y cerebro se pesaron y almacenaron a
–80 °C hasta su análisis.
dietarios
La composición de AG de los aceites die-
tarios (Tabla 2) se determinó por cromato-
grafía gaseosa con un cromatógrafo Shima-
dzu (GC 2014) equipado con un detector
de ionización de llama como ésteres metíli-
cos de los AG (FAME). Los derivados metíli-
cos se formaron por transesterificación con
una solución de hidróxido de potasio–meta-
nólico en una etapa intermedia antes de
la saponificación (21). Los FAME se sepa-
raron en una columna capilar CP Sil 88

Tabla 2. Composición de AG de los aceites dietarios

Aceite de coco deficiente

Ácidos grasos (%) Aceite de maíz Aceite rico en CLA
en AGE
6:0 0,00 0,49 0,00
8:0 0,00 6,76 0,00
10:0 0,00 5,64 0,00
11:0 0,00 0,02 0,00
12:0 0,00 47,67 0,00
13:0 0,00 0,02 0,00
14:0 0,03 17,46 0,00
16:0 12,21 9,21 5,85
16:1 0,12 0,00 0,00
18:0 1,93 12,53 1,20
9c-18:1 31,95 0,05 9,05
11c-18:1 0,54 0,00 0,41
9c,12c-18:2 51,26 0,01 1,08
20:0 0,50 0,14 0,00
11c-20:1 0,25 0,00 0,00
9c,12c,15c-18:3 0,88 0,00 0,00
22:0 0,16 0,00 0,35
24:0 0,15 0,00 0,00
9c,11t-CLA 0,00 0,00 38,99
11c,13t-CLA 0,00 0,00 1,54
10t,12c-CLA 0,00 0,00 38,76
∑ NI 0,00 0,00 3,11

NI: no identificado. Los valores son presentados como porcentaje de los FAME totales.
90 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
(100 m x 0,25 µm diámetro), según meto-
dologías oficiales (22). Los FAME se iden-
tificaron por comparación de sus tiempos
de retención relativos con los de estándares
comerciales u otros pertenecientes a ensayos
interlaboratorios internacionales donde nues-
tro grupo ha participado. Los valores fueron
expresados como porcentaje de los ésteres
metílicos de los ácidos grasos totales.
• Parámetros nutricionales
El contenido de proteínas corporales fue
cuantificado por el método de Kjeldahl (23),
mediante el cual el nitrógeno en los homo-
geneizados de carcasa fue convertido a
(NH4)2SO4 mediante digestión ácida. El con-
tenido de proteínas se calculó multiplicando
la cantidad de nitrógeno obtenida por el
factor 6,25 (24). El contenido de agua se
determinó mediante el secado de alícuotas
de carcasa y de comida hasta peso cons-
tante en estufa a 60°C. El contenido total de
grasa en las muestras secas de carcasa,
comidas y heces se extrajo con éter de
petróleo (23). El extracto de grasa se eva-
poró en un sistema de vacío y la grasa total
se midió gravimétricamente. El consumo de
energía se calculó multiplicando la cantidad
de alimento consumido diariamente por el
valor calórico (kJ/g) de la dieta. La eficiencia
en la ganancia de peso se estimó como el
porcentaje de la ganancia de peso (g) divi-
dido por la ingesta energética (kJ/período
experimental) durante 60 días. La absorción
aparente de la grasa dietaria, como índice
de biodisponibilidad, se evaluó como el
porcentaje de la ingesta de grasas que no
fue excretada en las heces (25).
• Biomarcadores del estado nutricional
de AGE y de la incorporación de los CLA
La deficiencia de AGE generada a par-
tir del tratamiento dietario en los gru-
pos DAGE y DAGE+CLA, y la incorpo-
ración de isómeros CLA en los grupos
SAGE+CLA y DAGE+CLA en los lípidos
totales fueron evaluados mediante el aná-
lisis de los AG: AL, ALA, 5c,8c,11c–20:3,
de la relación trieno/tetraeno (5c,8c,11c–
20:3/5c,8c,11c,14c–20:4) y del contenido
de los isómeros individuales CLA en suero,
hígado, TAE y cerebro. El análisis de AG fue
realizado mediante cromatografía gaseosa
como fuera descripto anteriormente, previa
extracción de las grasas totales (26).
• Determinación de TG en suero,
hígado y músculo gastrocnemio
La determinación de los niveles de TG
en el suero se llevo a cabo mediante un
método espectrofotométrico utilizando kits
comerciales. Los niveles de TG en hígado
y músculo se determinaron en homogena-
tos de tejidos diluidos (1:10, p/p) con agua
destilada por el método de Laurell (27).
• Velocidad de secreción hepática de
TG
Para estimar la velocidad de secreción
hepática de TG (VSTG) (28), otros grupos de
animales fueron ayunados y anestesiados
como se detalló anteriormente. Se tomaron
muestras de sangre a tiempo 0 y luego de
120 minutos de la inyección vía intravenosa
de 600 mg de Triton WR 1339 en solución
salina por Kg de peso corporal. En mues-
tras de suero correspondientes a tiempo 0 y
120 minutos posteriores a la inyección de la
solución de Triton, se valoró la concentración
de TG. La VSTG se estimó basándose en la
acumulación sérica de TG durante los 120
 Fariña, A.C. y col. • Efectos de los conjugados del ácido linoleico... 91

minutos de experiencia, el volumen plasmá- trato. La cuantificación de la actividad LPL

tico y el peso corporal como han sido previa-
mente reportados (29).
• Actividad de la lipoproteína lipasa en
tejido adiposo y músculo gastrocnemio
La actividad enzimática lipoproteína
lipasa (LPL) en tejido adiposo se cuantificó
en polvo de acetona de TAE por el método
fluorométrico de Del Prado (30). Breve-
mente, muestras de TAE fueron delipida-
das para la obtención del polvo acetónico.
Los polvos obtenidos se resuspendieron e
incubaron en solución buffer NH4Cl/NH4OH,
25 mM, pH 8,1 con 1 UI/ml de heparina. La
reacción enzimática se llevó a cabo a 37 ºC
en un medio conteniendo buffer adecuado
con di–butiril fluoresceína (DBF) como sus-
se realizó midiendo durante 5 minutos el
aumento de fluorescencia (λexcitación = 490
nm; λemisión = 530 nm) producto de la libera-
ción de fluoresceína como consecuencia de
la hidrólisis enzimática del DBF. En paralelo,
el mismo ensayo se llevó a cabo en presen-
cia de NaCl 1 M durante la incubación, para
inhibir la actividad LPL y determinar la acti-
vidad enzimática inespecífica. La actividad
de la LPL se determinó como la diferen-
cia entre la actividad lipolítica no específica
(determinada en presencia de NaCl 1 M) y
la actividad lipolítica total (determinada en
ausencia de NaCl 1 M). Los valores fueron
expresados como nmol fluoresceína libe-
rado/minuto/tejido total (nmol fluoresceína/
minuto/g).

Tabla 3. Efecto de la deficiencia de AGE y de los CLA en parámetros nutricionales y composición

corporal.

SAGE DAGE SAGE+CLA DAGE+CLA

Ingesta energética (KJ/d) 293,32±8,29 310,02±5,97 312,00±20,40 300,86±12,84
Ganancia de peso (g) 209,75±7,31 226,25±7,08 201,92±3,96 203,58±6,60
Eficiencia de la ganancia de peso (g/100 KJ) 1,20±0,06 1,22±0,05 1,10±0,07 1,13±0,05
Utilización de grasa
Grasa ingerida (g/d) 1,27±0,04 1,38±0,05 1,38±0,09 1,45±0,07
Grasa fecal (mg/d) 27,12±0,80a 18,80±1,22b 24,77±2,40a 15,59±2,86b
Grasa fecal/Grasa ingerida (%) 2,24±0,05a 1,38±0,10bc 1,82±0,09ab 1,07±0,15c
Absorción aparente (%) 97,76±0,04a 98,18±0,09ab 98,23±0,15c
Composición de carcasa (g/100 g)
Proteínas 20,85±0,83 21,75±0,28 21,44±0,26 20,33±0,81
Grasa 16,08±0,60 17,29±0,55 16,95±0,41 15,13±0,80
Agua 58,52±0,65 56,88±0,73 55,72±0,81 58,91±0,75
Peso tejidos (g/100 g )
Hígado 3,62±0,04a 3,16±0,07a 3,58±0,10a 3,99±0,09b
Músculo gastrocnemius 0,35±0,02 0,37±0,02 0,40±0,02 0,40±0,01
Tejido adiposo epididimal 2,32±0,10a 2,69±0,13a 2,34±0,09a 1,65±0,04b
Tejido adiposo retroperitoneal 2,31±0,08a 2,14±0,18a 2,14±0,18a 1,64±0,12b

Los resultados son presentados como el promedio ± SEM, n = 6 por grupo. El análisis estadístico se realizó
mediante un 2x2 ANOVA seguido del test de Scheffé. Los valores en la misma fila con diferentes supra–índices son
significativamente diferentes (p<0,05).
92 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Para evaluar la actividad LPL muscu-
lar, se homogeneizó el músculo gastroc-
nemio en buffer NH4Cl/NH4OH–heparina
(50 mmol/L, pH 8,6; conteniendo 4,0 UI/mL
de heparina) y se incubó durante 15 min a
4 ºC. La cuantificación de la actividad LPL
en músculo se realizó como se ha descripto
previamente para el tejido adiposo. La acti-
vidad medida fue expresada como nmol
fluoresceína liberado/minuto/músculo total
(nmol fluores/min/tej total).
• Análisis estadístico
Los valores fueron expresados como
la media ± error estándar de seis anima-
les por grupo. Las diferencias estadísticas
entre las medias se analizaron mediante un
2x2 ANOVA, siendo la suficiencia/deficiencia
AGE y la suplementación con CLA las varia-
bles independientes. Las comparaciones
múltiples post hoc se realizaron mediante
la prueba de rango crítico de Scheffé. Las
diferencias se consideraron estadística-
mente significativas para valores de p<0,05
(31). Para comparar la incorporación de los
CLA, se establecieron diferencias estadísti-
cas entre las medias mediante la prueba t de
Student para datos independientes.
Resultados
• Estado fisiológico y parámetros nutri-
cionales
Durante el período experimental, todos
los animales mostraron un buen estado de
salud, sin ninguna manifestación fisiológica
de la deficiencia de AGE o síntomas toxico-
lógicos debido al tratamiento con CLA. Ade-
más, no se observaron síntomas de alte-
raciones intestinales o hepatomegalia por
ninguno de los tratamientos. Sin embargo,
a pesar de ser la ingesta de grasa similar
entre los grupos, la deficiencia de AGE,
independientemente de la adición o no de
CLA, redujo la excreción de grasa fecal, lo
que condujo a un aumento en la absorción
aparente de la grasa dietaria . El consumo
promedio diario de energía no difirió entre
los grupos, como tampoco lo hicieron la
ganancia de peso corporal, ni la eficiencia
en la ganancia de peso. Sin embargo, los
CLA en deficiencia de AGE, generaron una
disminución en el peso del TAE y TARP, y un
aumento en el peso del hígado.
• Biomarcadores de la deficiencia de
AGE e incorporación de los CLA en los
lípidos totales de suero y tejidos
En la actualidad es difícil considerar un
único y específico biomarcador de defi-
ciencia de AGE, como asimismo un único
tejido donde evaluarlo. En este sentido,
y para investigar la influencia de los CLA
sobre la deficiencia de AGE, evaluamos
los niveles de AL, ALA y 5c,8c,11c–20:3,
la relación trieno/tetraeno (5c,8c,11c–
20:3/5c,8c,11c,14c–20:4), como asimismo
el contenido de los CLA en suero, hígado,
tejido adiposo y cerebro (Tabla 4). Bajo
nuestras condiciones experimentales, los
niveles de AL mostraron una reducción
significativa por la deficiencia de AGE en
los grupos suplementados o no con CLA
y este efecto fue independiente del tejido
considerado. La excepción fue el cerebro,
que mostró una resistencia a la deficien-
cia de AGE y sólo se observó una disminu-
ción de los niveles de AL estadísticamente
significativa en el grupo DAGE+CLA frente
al grupo SAGE. Además, los CLA, reduje-
ron significativamente los niveles de AL en
hígado y tejido adiposo en animales con
Fariña, A.C. y col. • Efectos de los conjugados del ácido linoleico... 93

dietas SAGE. Los niveles de ALA mostraron
un efecto diferencial en función del tejido
considerado; específicamente, en suero, no
se vieron modificados por la deficiencia de
AGE independientemente de la presencia
o no de CLA. Sin embargo, en estas mis-
mas condiciones, los niveles de ALA se vie-
ron reducidos en hígado y TAE, alcanzando
niveles no detectables en el TAE. Así como
para el AL, el cerebro mostró una alta resis-
tencia a cambios de los niveles de ALA.
Los CLA, redujeron significativamente los
niveles de ALA en hígado y TAE de anima-
les independientemente de la adecuación
o deficiencia de AGE. El 5c,8c,11c–20:3,
un AG derivado de la síntesis exacerbada
de AGPI de la familia n–9 en condiciones
de deficiencia de AGE, fue detectado en
suero, hígado y cerebro de animales defi-
cientes en AGE. Como consecuencia, la
relación trieno/tetraeno en dichos tejidos
fue incrementada por la deficiencia de AGE
independientemente de la presencia de
CLA. Cabe destacar que, en cerebro de
animales del grupo DAGE los niveles de
5c,8c,11c–20:3, fueron mayores que en el
grupo DAGE+CLA, y que en TAE dicho AG
se encontró por debajo del límite de detec-
ción. Por esta última razón, los niveles de
5c,8c,11c–20:3 y la relación trieno/tetraeno
no fueron mostrados.

Tabla 4. Efecto de la deficiencia de AGE y de los CLA sobre biomarcadores de déficit de AGE y
retención de isómeros.

SAGE DAGE SAGE+CLA DAGE+CLA

Suero
9c,12c-18:2 20,20±0,59ac 7,89±0,53b 19,91±1,15c 13,42±0,30d
9c,12c,15c-18:3 0,22±0,01 0,20±0,01 0,24±0,02 0,19±0,03
5c,8c,11c-20:3 0,00±0,00a 0,36±0,05b 0,00±0,00a 0,32±0,07b
9c,11t-CLA 0,00±0,00a 0,00±0,00a 0,74±0,10b 0,89±0,11b
10t,12c-CLA 0,00±0,00 a
0,00±0,00 a
0,55±0,06 b
0,42±0,11b
Relación: trieno/tetraeno 0,00±0,00 a
0,04±0,00 b
0,00±0,00 a
0,04±0,01b
Hígado
9c,12c-18:2 21,19±0,63a 5,13±0,20bd 15,78±1,27c 7,40±0,52d
9c,12c,15c-18:3 0,29±0,03a 0,07±0,03bcd 0,15±0,02cd 0,07±0,01d
5c,8c,11c-20:3 0,00±0,00a 0,27±0,04b 0,00±0,00a 0,22±0,03b
9c,11t-CLA 0,00±0,00 a
0,00±0,00 a
0,86±0,13 b
0,89±0,07b
10t,12c-CLA 0,00±0,00 a
0,00±0,00 a
0,33±0,04 b
0,23±0,03b
Relación: trieno/tetraeno 0,00±0,00 a
0,03±0,00 b
0,00±0,00 a
0,03±0,00b
Tejido adiposo
9c,12c-18:2 34,30±1,00a 1,86±0,08bd 28,92±1,97c 2,52±0,42d
9c,12c,15c-18:3 0,67±0,05 a
0,00±0,00 b
0,48±0,06 c
0,00±0,00b
9c,11t-CLA 0,00±0,00 a
0,00±0,00 a
2,71±0,09 b
2,39±0,10c
10t,12c-CLA 0,00±0,00 a
0,00±0,00 a
1,23±0,07 b
0,61±0,05c
94 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
SAGE
Cerebro
9c,12c-18:2 1,04±0,26a
9c,12c,15c-18:3 0,01±0,01
5c,8c,11c-20:3 0,00±0,00a
9c,11t-CLA 0,00±0,00
10t,12c-CLA 0,00±0,00
Relación: trieno/tetraeno 0,00±0,00a
Los resultados son presentados como el promedio ± SEM, n = 6 por grupo. El análisis estadístico se realizó
mediante un 2x2 ANOVA seguido del test de Scheffé. Los valores en la misma fila con diferentes supra-índices son
significativamente diferentes (p<0,05).
Los CLA dietarios fueron incorporados en
el suero, hígado y tejido adiposo, mientras
que el cerebro se mostró completamente
resistente a la incorporación de los isómeros
presentes en la dieta. Pese a que la suple-
mentación con CLA, aporta cantidades equi-
moleculares de los isómeros 9c,11t–CLA y
10t,12c–CLA, el grado de retención tisular
del primero fue superior que el del isómero
10t,12c–CLA. Por otra parte, la deficiencia de
AGE, no afectó la incorporación de los isó-
meros, excepto en tejido adiposo, donde los
niveles de 9c,11t–CLA y 10t,12c–CLA se vie-
ron reducidos en el grupo DAGE+CLA.
• Niveles y regulación de TG séricos y
tisulares
Como puede observarse en la Tabla 5,
los niveles de TG séricos fueron reduci-
dos por la deficiencia de AGE, siendo ésta
reducción más acentuada en presencia de
isómeros CLA. En hígado, la deficiencia de
AGE, redujo los niveles de TG, pero fueron
normalizados cuando se adicionaron los
DAGE SAGE+CLA DAGE+CLA
0,86±0,28ab 0,95±0,12ab 0,46±0,06b
0,02±0,01 0,03±0,01 0,02±0,01
0,40±0,02c 0,00±0,00a 0,28±0,03b
0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00
0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00
0,03±0,01b 0,00±0,00a 0,02±0,01b
CLA. Los CLA, per se no modificaron los
niveles de TG séricos ni hepáticos en ani-
males con adecuación de AGE, no obs-
tante en deficiencia de AGE los CLA redu-
jeron los niveles séricos e incrementaron los
hepáticos de TG. El contenido de TG mus-
cular no fue afectado por la deficiencia de
AGE, ni por los CLA, no obstante los nive-
les de TG en el grupo DAGE+CLA fue signi-
ficativamente menor al grupo SAGE+CLA.
La VSTG aumentó significativamente por
efecto de la deficiencia de AGE, y este
aumento, se normalizó por la adición de
CLA. Los CLA en SAGE no modificaron
dicha VSTG. La actividad de la enzima LPL
en TAE, expresada por tejido total, fue incre-
mentada significativamente por la deficien-
cia de AGE y por la suplementación con
CLA, y el efecto fue aditivo por acción con-
junta de ambas variables. La actividad de
la LPL en músculo gastrocnemio no se vio
modificada por la deficiencia de AGE ni por
la suplementación con CLA.
Fariña, A.C. y col. • Efectos de los conjugados del ácido linoleico... 95

Tabla 5. Efecto de la deficiencia de AGE y de los CLA sobre los niveles de TG y su regulación.

SAGE DAGE SAGE+CLA DAGE+CLA

Niveles de TG
Suero (g/l) 1,27±0,17a 0,82±0,06b 1,21±0,09a 0,58±0,03c
Hígado (µmol/g) 19,85±1,06 ac
14,12±1,68 b
23,04±1,72 c
19,82±1,55ac
Músculo (µmol/g) 4,63±0,44 ab
3,64±0,32 a
5,84±0,27 b
3,55±0,23a
VSTG (nmol/min.100g) 160,78±4,83 ac
240,54±11,06 b
155,62±6,18 c
169,55±10,07ac
Act. LPL en TA
0,53±0,09a 1,73±0,09bc 1,44±0,12c 3,04±0,10d
(nmol fluores/min/tej total)
Act. LPL en músculo
3,56±0,39 3,99±0,51 4,30±0,39 4,20±0,17
(nmol fluores/min/tej total)

Los resultados son presentados como el promedio ± SEM, n = 6 por grupo. El análisis estadístico se realizó
mediante un 2x2 ANOVA seguido del test de Scheffé. Los valores en la misma fila con diferentes supra-índices son
significativamente diferentes (p<0,05).

Discusión ción con la ingesta de ciertos ácidos gra-

La deficiencia de AGE o desequilibrios en
la ingesta de los mismos están asociados a
profundas alteraciones metabólicas (1–3).
Dado que deficiencias moderadas o margi-
nales sin manifestaciones clínicas son facti-
bles de ser encontradas en nuestra pobla-
ción, en el presente trabajo se empleó una
deficiencia marginal de AGE, antes de que
las manifestaciones de la deficiencia se evi-
dencien. Nuestro estudio muestra que, si
bien los CLA pueden actuar como sustratos
alternativos o competir en las vías de meta-
bolización con los AGE, la suplementación
con estos isómeros en animales con defi-
ciencia marginal de AGE tuvo diferente res-
puesta dependiendo del tejido considerado,
pero notoriamente produjo alteraciones nutri-
cionales y en el metabolismo lipídico.
En nuestro modelo experimental con
ratas, la máxima retención de CLA fue
observada en tejido adiposo, seguido de
hígado y suero, sin ser afectada por la defi-
ciencia de AGE. La elevada retención de
CLA en el tejido adiposo y su alta correla-
sos, como los AGPI e isómeros de AG (32),
ha permitido que los niveles de estos AG
en tejido adiposo, sean empleados como
biomarcadores de consumo. En cerebro,
no fueron detectados los isómeros, confir-
mando la alta resistencia y selectividad de
este tejido reportada por Shelton (33). Así,
estos resultados en su conjunto, confir-
man la incorporación preferencial de CLA
en los tejidos ricos en lípidos neutros (34).
La mayor retención del 9c,11t–CLA que la
del 10t,12c–CLA, está en concordancia
con la propuesta de Banni (35) quien con-
cluyó que diferencias en la β–oxidación
peroxisomal entre 9c,11t–CLA y 10t,12c–
CLA podrían ser responsables, al menos en
parte, de las diferencias observadas entre
estos dos isómeros en algunos sistemas
biológicos. Además, dado que deficiencias
en AGE conducen a una mayor β–oxidación
de AG (36), los niveles de ambos isómeros
fueron menores en los animales del grupo
DAGE+CLA que en los del SAGE+CLA.
Esta razón, asociada a la diferencial β–oxi-
96 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
dación de los isómeros podría justificar
la acentuada reducción de los niveles del
10t,12c–CLA en el grupo DAGE+CLA.
Los niveles de AL, ALA y 5c,8c,11c–20:3,
como así también la relación trieno/tetraeno,
indicadores de deficiencia de AGE, se
modificaron en diferente manera, en fun-
ción de la dieta recibida, del tejido y del AG
considerado. Específicamente, los niveles
de AL fueron marcadamente reducidos en
tejido adiposo, hígado y suero por la defi-
ciencia en AGE, no mostrando influencia
a nivel de cerebro. La suplementación con
CLA sólo redujo los niveles de AL en hígado
de animales con suficiencia en AGE, los
cuales podrían estar asociados a una susti-
tución del AL por los CLA y a una incremen-
tada β–oxidación, como fuera demostrado
en ratones (37,38), pero no por algunos
autores en ratas (39). Es dable mencionar,
que la velocidad de oxidación de AG hepá-
tica es mayor conforme incrementa la insa-
turación de los AG (40); así un incremento
en la β–oxidación mitocondrial y peroxiso-
mal inducida por los CLA podría conducir a
un descenso diferencial de los AGE. Noto-
riamente, los CLA en animales deficientes
en AGE mostraron un efecto dual. Si bien,
atenuaron la deficiencia de AL en suero,
condujeron a una notoria disminución de
sus niveles en cerebro. En forma seme-
jante a lo reportado en ratones por Har-
grave (41), a nivel hepático y en tejido adi-
poso, los CLA no modificaron los reducidos
niveles de AL generados por la deficiencia
de AGE. Tal como se podía esperar, la defi-
ciencia de AGE y los CLA en suficiencia de
AGE redujeron los niveles de ALA en hígado
y tejido adiposo, mientras que en suero y
cerebro no se observaron cambios por nin-
gún tipo de tratamiento. Como fuera suge-
rido para el AL, los CLA en hígado y tejido
adiposo podrían estar sustituyendo al ALA,
como asimismo incrementar la β–oxida-
ción, efecto que no ha sido observado en
suero y cerebro. Una respuesta diferente
del AL y ALA ha sido observada cuando los
animales presentaron deficiencia de AGE
suplementada con CLA en suero y cerebro,
mostrando el ALA una mayor resistencia a
cambios composicionales. Como ha sido
observado por otros autores (42), nuestros
resultados hacen sugerir que en respuesta
a la deficiencia marginal de AGE (menos
del 2 % de energía como AL), la biosínte-
sis de AGPI de cadena larga fue exacer-
bada, conduciendo así a un incremento
en la formación del ácido 5c,8c,11c–20:3
y como consecuencia de la relación trieno/
tetraeno. Ambos indicadores de deficien-
cia de AGE, presentan niveles equivalen-
tes en suero e hígado en los grupos defi-
cientes de AGE independientemente de
la suplementación con CLA; no obstante,
el ácido 5c,8c,11c–20:3 no ha sido detec-
tado en tejido adiposo. Si bien es cono-
cido que el tejido adiposo puede sinte-
tizar el 5c,8c,11c–20:3 (43), es probable
que la ausencia de dicho AG sea debida a
que, bajo niveles marginales de AL en cir-
culación, una liberación de AGPI desde el
tejido adiposo (44) hacia circulación tienda
a compensar el déficit. Es importante con-
siderar que, si bien el 5c,8c,11c–20:3 no es
un sustrato para la formación de eicosanoi-
des, el mismo puede ser liberado a circu-
lación para suplir a los AGPI de las fami-
lias n–6 y n–3 en las membranas biológicas
(44). Un efecto diferente a los anteriormente
descriptos ha sido observado en cerebro,
donde los AGPI provienen preferentemente
de una captación de AG desde circulación
(45), dado que la biosíntesis de AGPI de
cadena larga a partir de sus precursores no
Fariña, A.C. y col. • Efectos de los conjugados del ácido linoleico...
es cuantitativamente muy importante. Así,
ante la deficiencia de AGE, podemos inter-
pretar que el cerebro incorpora desde la cir-
culación al 5c,8c,11c–20:3 para funciones
estructurales de membranas. Asimismo,
podríamos postular que en cerebros de ani-
males con deficiencia en AGE suplementa-
dos con CLA, la incorporación de metaboli-
tos de los mismos isómeros compitan con
la incorporación del 5c,8c,11c–20:3, con-
duciendo a menores niveles de dicho AG
que en cerebros de animales que no fueron
suplementados con CLA. Además, los cam-
bios observados a nivel de cerebro no des-
cartan la posibilidad que otras hipótesis se
puedan presentar, por ejemplo, un recam-
bio diferencial de los AG en los lípidos tisu-
lares también podría estar involucrado (46).
Estos cambios que, en diferente grado se
produjeron en la composición de AG de los
lípidos circulantes y tisulares, fueron acom-
pañados con mecanismos compensatorios
y modificaciones nutricionales y metabóli-
cas. Así, es probable que en los animales
con dieta DAGE y DAGE+CLA, el descenso
de la excreción de grasa fecal, y en conse-
cuencia la mayor absorción de AG, sea una
respuesta tendiente a incorporar más AGE.
Esta propuesta no excluye que la mayor
absorción intestinal sea también debida a
la diferencial velocidad de absorción de los
AG constitutivos de las dietas (47). No obs-
tante, en todas las dietas la absorción apa-
rente fue muy elevada y la diferencia entre
los grupos no condujo a modificaciones en
el peso corporal de los diferentes anima-
les. Otros autores (48,49) reportaron que
los animales con dietas DAGE presentaron
una menor absorción de grasa, y conse-
cuentemente una menor ganancia de peso
corporal. Es probable que las diferencias
sean atribuidas a los diseños experimenta-
97
les, dado que en nuestro modelo las ratas
fueron sometidas a una deficiencia margi-
nal de AGE y no a una profunda deficiencia
como en otros trabajos.
Hallazgos de distintos investigado-
res, incluyendo resultados nuestros, han
demostrado que el ratón (50–51), pero no
la rata (39,52), es muy sensible a variacio-
nes en el peso, como también en la masa
grasa y magra corporal. Es notorio que en
el presente trabajo, ni la suplementación
con CLA, ni la deficiencia de AGE, modi-
ficaron estos parámetros, pero la suple-
mentación con CLA en los animales con
deficiencia en AGE condujo a ciertas alte-
raciones observadas en modelos más sen-
sibles como las descriptas en el ratón,
incluyendo reducción del tejido adiposo e
incremento del peso hepático. En este sen-
tido, la disminución del peso de los paní-
culos adiposos epididimales y retroperito-
neales observada por la suplementación
con CLA en deficiencia de AGE, probable-
mente responda a un aumento en la velo-
cidad de oxidación de AG en este tejido
inducido conjuntamente por la presencia
de CLA y la deficiencia de AGE, como tam-
bién ocurre en otros modelos experimenta-
les (41,53), y/o a una incrementada lipólisis
de TG, como sugiere Ippagunta (54). Estos
hallazgos están de acuerdo a los cambios
mencionados anteriormente en los niveles
de AL y ALA en tejido adiposo, y también es
claramente soportado por una mayor β–oxi-
dación descripta por otros autores en tejido
adiposo de ratones (10,37), siendo contro-
vertido en ratas (39,52). La marcada reduc-
ción del tejido adiposo pareciera estimular
una mayor captación de AG por el mismo, y
esto se refleja por la incrementada actividad
de la enzima LPL observada en el TAE, que
no alcanza a contrarrestar la elevada β–oxi-
98 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
dación y probablemente la mayor lipólisis.
Podemos así proponer que esta mayor acti-
vidad LPL, importante en la captación de
AG por el adipocito, pero asimismo clave
en la remoción de TG circulantes, podría
ser al mismo tiempo un factor determinante
de la reducción de los niveles de TG obser-
vada en plasma. Es de destacar que hemos
encontrado en similitud a otros autores que,
tanto la deficiencia de AGE como la suple-
mentación con CLA, aumentaron la activi-
dad LPL en tejido adiposo (55) y este efecto
se potenció con la conjunción de ambos
tratamientos. En cambio, otros autores bajo
diferentes condiciones en adipocitos ais-
lados (56,57) y en tejido adiposo (58), han
encontrado que la actividad de la enzima
LPL se encuentra disminuida por la acción
de los CLA. Relacionado a dicha actividad,
en tejido adiposo bajo diferentes modelos
experimentales, se han encontrado distintas
respuestas sobre los TG circulantes (58,59).
No obstante, en la mayoría de los estudios
en ratas normales, los CLA tienen muy poco
efecto sobre los mismos; y es notorio como
en el presente trabajo, la conjunción de la
deficiencia de AGE con la suplementación
con CLA tuvieron un efecto aditivo sobre la
actividad LPL en tejido adiposo, sin cam-
bios en la actividad LPL de músculo, con-
duciendo a una profundización de la reduc-
ción de los TG circulantes.
Otro hallazgo interesante de puntualizar,
es el incremento en el peso del hígado, sin
formación de hígado graso, comprobado en
las ratas con deficiencia marginal de AGE
suplementadas con CLA. Esta observación,
en ratas alimentadas con CLA a niveles sufi-
cientes de AGE, no ha sido hallada en la
presente experiencia pero ha sido común-
mente encontrada en ratones (15), indepen-
dientemente de la ingesta de AGE. No dis-
ponemos de evidencias experimentales que
justifiquen el incremento del peso hepático,
pero si, es dable postular que algunas alte-
raciones observadas en el síndrome lipodis-
trófico inducido por el 10t,12c–CLA en rato-
nes, se produzcan en la rata en forma más
atenuada, cuando se conjugan los efec-
tos de ingesta de CLA con déficit marginal
de AGE. Así, en caso de compartir meca-
nismos metabólicos, en la rata se debería
observar una elevación de los niveles de
insulina como se aprecia en el ratón alimen-
tado con CLA, para de este modo promover
la síntesis proteica conduciendo al incre-
mento del peso hepático. Esto no deja de
ser una hipótesis que requiere mayor grado
de investigación para así establecer una
similitud metabólica entre los efectos de
los CLA en ratones normales y en ratas con
deficiencia marginal de AGE. No obstante,
también es importante considerar que en
los ratones, la esteatosis hepática indu-
cida por los CLA está estrechamente rela-
cionada a la hiperinsulinemia, y en nuestro
modelo no hemos encontrado una acumu-
lación de lípidos en hígado. La ausencia
de dicha alteración podría deberse, entre
otras causas, a que la disminución de los
TG hepáticos inducida por la deficiencia
de AG compensa el incremento de lípidos
inducido por los CLA. Estas variaciones en
los niveles de TG hepáticos se correlacio-
naron inversamente con los cambios en la
velocidad de secreción de TG observados
en nuestras experiencias.
En numerosos estudios se ha encontrado
que las ratas son más resistentes a la acción
de los CLA sobre el metabolismo lipídico que
otras especies,, como el ratón. Alteracio-
nes semejantes a las observadas en ratones
han sido reportadas por nuestro grupo (50)
en ratas cuando los animales presentaban
Fariña, A.C. y col. • Efectos de los conjugados del ácido linoleico...
desnutrición calórico–proteica, y por Sugano
(60) en ratas bajo condiciones de estimulada
β–oxidación en tejido adiposo.
Conclusiones
Los CLA presentaron una capacidad
diferencial de incorporación a distintos teji-
dos de rata, mostrando una alta retención
en tejido adiposo y una resistencia a la
incorporación en el cerebro.
No se puede concluir que los CLA ate-
núan la deficiencia de AGE, dado que la
suplementación de CLA a ratas alimentadas
con dietas deficientes en AGE no modificó
en el mismo sentido todos los marcado-
res plasmáticos y tisulares empleados para
evaluar dicho déficit.
En animales alimentados con dietas sufi-
cientes en AGE, los CLA se incorporan en
los tejidos, sin causar cambios significati-
vos en los parámetros evaluados.
Si bien puede considerarse que la reduc-
ción de TG circulantes y la disminución del
tejido adiposo producida por los CLA en
animales alimentados con dietas deficien-
tes en AGE podrían ser efectos deseables,
es posible que la continuación en el tiempo
de este estado nutricional conduzca a pro-
fundas alteraciones, generalmente obser-
vadas en la lipodistrofia presente en otros
modelos experimentales.
Dado que la deficiencia marginal de
AGE es ocasionalmente observada en la
población y puede ser desconocida por
el individuo, más estudios deben ser rea-
lizados para dilucidar el efecto específico
que poseen los CLA de origen comercial
bajo situaciones nutricionales que puedan
potenciar ciertas alteraciones metabólicas.
99
Agradecimientos
Agradecemos al Sr. Walter DaRú y a la
Srita. Mónica Nasimbera por sus asisten-
cias técnicas. También agradecemos el
apoyo financiero recibido de la Universidad
Nacional del Litoral – Cursos de Acción para
la Investigación y Desarrollo (CAI+D 2009
PI–08–36) – Secretaría de Ciencia y Técnica
– UNL – y por el Consejo Nacional de Inves-
tigaciones Científicas y Técnicas (PIP CONI-
CET # 112–200801– 02831).
Presentación del trabajo a congresos
Los resultados del mismo han sido parcial-
mente presentados y discutidos en II Congreso de
la Federación Española de Sociedades de Nutri-
ción, Alimentación y Dietética (FESNAD). Barce-
lona, España, 2010 y XVI Congreso Latinoameri-
cano de Nutrición. SLAN. La Habana, Cuba, 2012.
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 103 a 112 103

Trabajo completo

Consumo de alimentos en los kioscos de RECIBIDO: 07/06/2013

escuelas primarias públicas de la ciudad ACEPTADO: 09/10/2013

de Santa Fe

Follonier, M.1 • Bonelli, E.1 • Walz, F.2 • Fortino, M.A.1 • Marti-

nelli, M.1

1
Departamento de Ciencias Biológicas – Facultad de Bioquímica y
Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral.
2
Departamento de Matemática – Facultad de Bioquímica y Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral.
Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad
Nacional del Litoral. Paraje El Pozo CC242. 3000ZAA, Santa Fe,
Argentina. Teléfono: +54–342–4575211.
E–mail: mmartine@fbcb.unl.edu.ar

RESUMEN: El cambio de hábitos en el significativas entre las proporciones que

tipo de colación de los escolares está
relacionado, principalmente, con las
promociones de los kioscos escolares.
Los objetivos del trabajo fueron conocer
los productos preferidos comprados en
los kioscos escolares para la colación y las
razones de su elección (en dos escuelas
primarias públicas de la ciudad de Santa
Fe) y determinar si las restricciones
y exigencias de ventas influyen en la
selección de una colación saludable.
Los datos fueron recolectados mediante
dos encuestas: áulica y en boca de kiosco.
La mitad de los niños compra la
colación en el kiosco escolar, un 35
% aproximadamente trae colación del
hogar, siendo ésta, mayoritariamente,
recomendable. Existen diferencias
eligen un alimento “recomendable” en
el kiosco escolar en ambas escuelas. El
principal motivo de selección es el gusto.
Es importante regular la venta de productos
en los kioscos escolares y educar a los
niños en la elección de los alimentos para
que realicen una colación saludable.
Palabras clave: Colación, Escolares,
Kiosco escolar.
SUMMARY: Food consumption in public
primary school kiosks in Santa Fe
Changing habits related to schoolchildren
snack selection is related to school kiosks
promotions, among other factors.
The objectives of this work were to
determine the preferred products
104 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
purchased for snacks at school kiosks
and the reasons behind the choice (in
two public primary schools in the city of
Santa Fe) and determine whether sales
restrictions and requirements influence the
selection of a healthy snack.
Data were collected through two surveys: in
class and at the kiosk.
Half the children buy their snacks at school
and aproximately 35 % of them bring it from
home, which is highly recommended. There
Introducción
La alimentación durante la infancia es
clave para el correcto desarrollo físico y psí-
quico del niño. La niñez es una etapa en
donde se conforman los hábitos, se estruc-
tura la personalidad y se pueden establecer
patrones que perduren a lo largo de la vida.
Por ello es importante que todos los involu-
crados en la educación de un niño (su fami-
lia en primer lugar) promuevan un estilo de
vida saludable: dieta equilibrada y práctica
regular de actividad física (1–3).
A medida que el niño crece adquie-
ren relevancia factores externos como la
conducta de los otros niños con los que
se relaciona y las tendencias sociales del
momento. Al ingresar en el sistema escolar,
el niño rompe con su dependencia familiar.
Algunas comidas y colaciones comienzan a
realizarse fuera de la casa; los maestros y
compañeros se convierten en un modelo a
seguir. Otro factor que influye en los hábitos
alimentarios de los niños es la publicidad y
los medios de comunicación. Los niños tie-
nen mayor credibilidad e ingenuidad frente
a la información que reciben. Esto hace que
mensajes publicitarios que pueden ser cla-
are significant differences between the
proportions that choose a recommended
kind of food at the kiosk in both schools.
The main reason for selection is taste. It
is important to regulate the selling of food
products at school kiosks and to educate
children in selecting foods constituting
healthy snacks.
Keywords: Snacks, Students, School
kiosk.
ros y veraces para un público adulto, pue-
dan resultar engañosos cuando van dirigi-
dos a la población infantil (4–6).
En la Argentina los hábitos alimentarios
han cambiado en todos los grupos etarios
(7,8). En particular, la dieta de los escola-
res argentinos se caracteriza por muy bajo
consumo de verduras frescas y frutas; pro-
gresivo reemplazo de leche por bebidas
azucaradas como las gaseosas, consumo
de carne vacuna innecesariamente alto y
exceso en la ingesta de productos con alta
concentración de azúcares y grasas (8,9).
Uno de los cambios de hábitos de con-
sumo observados en los últimos años se
relaciona con los alimentos que los niños
consumen durante la jornada escolar. Una
encuesta realizada en 2006 en escolares de
1º a 6º grado en las provincias de Chubut,
Buenos Aires, Salta y Misiones, encontró
que 84 % de los niños consumía alimentos
en la escuela, principalmente comprados
en los kioscos (10). Diversos estudios rea-
lizados en diferentes países señalan que
los escolares a la hora de elegir alimentos
a media mañana prefieren los de alta den-
sidad de energía, grasas, sal y azúcares
Follonier, M. y col. • Consumo de alimentos en los kioscos de escuelas primarias...
(11,12). Estos alimentos de bajo valor nutri-
tivo son los que más abundan en las canti-
nas escolares y los niños que los consumen
presentan generalmente mayor tendencia al
sobrepeso y obesidad (13,14).
Esta situación ha determinado que en
la Ley de Obesidad y Trastornos Alimenti-
cios se incluya un artículo que reglamenta
los alimentos que deberían venderse en los
kioscos escolares (15). En adhesión a la
Ley Nacional, la Ciudad Autónoma de Bue-
nos Aires y algunas provincias entre las que
se incluyen San Luis, La Pampa, Tierra del
Fuego, Chubut, Santiago del Estero, cuen-
tan con leyes destinadas a controlar los ali-
mentos que se venden en las escuelas (16).
En la provincia de Santa Fe, al momento, no
existe este control, sólo hay un proyecto de
ley (17).
En este estudio se plantearon como
objetivos: conocer los productos preferidos
comprados en los kioscos escolares para
la colación y las razones de su elección en
dos escuelas primarias públicas de la ciu-
dad de Santa Fe y determinar si las restric-
ciones y exigencias de ventas influyen en la
selección de una colación saludable.
Metodología
Este estudio, descriptivo, transversal y
correlacional, se llevó a cabo en los meses
abril y mayo de 2012 en dos escuelas pri-
marias públicas (DS y MM), en el turno
matutino, del área metropolitana de la ciu-
dad de Santa Fe, seleccionadas por la
Federación de Asociaciones de Coopera-
doras Escolares, según la predisposición
de los equipos directivos para llevar a cabo
la investigación. Ninguna de las escuelas
recibía asistencia alimentaria.
105
Participaron los alumnos, de 1° a 7° grado
que aceptaron voluntariamente hacerlo y
cuyos padres firmaron su consentimiento.
Se excluyeron del análisis los niños que, al
momento de la evaluación, declararon pre-
sentar alguna enfermedad aguda o crónica
que comprometiera su estado nutricional.
Los instrumentos de recolección de
datos fueron dos encuestas diferentes: una
realizada en las aulas, que permitió obte-
ner información sobre el alimento consu-
mido durante la mañana (colación escolar)
y su procedencia (casa o kiosco escolar).
La otra encuesta se llevó a cabo en boca
de kiosco (realizada durante los recreos a
lo largo de una semana, controlando la no
repetición) en la que se consideraron las
variables: Producto comprado, Motivo de la
compra e Importe destinado.
De la primera encuesta, en función de lo
ingerido durante toda la mañana, se clasi-
ficaron las colaciones realizadas por cada
niño como “recomendable” y “no recomen-
dable”. En la Tabla 1 se detallan los alimen-
tos incluidos en cada grupo.
En cuanto al Motivo de compra, se consi-
deraron las opciones cerradas: gusto, ape-
tito, precio, influencia de la TV, influencia
de los amigos, disponibilidad en el kiosco
escolar. Se incluyó una pregunta acerca de
algún otro producto que les gustaría consu-
mir en el recreo.
Se realizaron pruebas Ji–cuadrada para
contrastar evidencias de igualdad de pro-
porciones entre las escuelas para las distin-
tas variables. Se trabajó con un nivel de sig-
nificancia de 0,05. El análisis estadístico se
efectuó con el programa estadístico R ver-
sión 2.12.2. Los gráficos se realizaron con
Microsoft Excel 2010.
106 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Tabla1. Clasificación de los productos adquiridos en el kiosco escolar.
Productos recomendables
Frutas
Jugos de frutas comerciales con 50 % fruta
Cereales (tutuca, barras cereal)
Galletitas dulces simples
Turrón de maní
Galletitas de agua y de cereal, marineras, grisines
Lácteos (yogur, leche chocolatada)
Clasificación basada en el listado de alimentos confeccionado por el Ministerio de Salud de la Provincia de San
Luis (Ley mejor alimentación, más salud) (16)
Resultados
De las encuestas áulicas (n=637 en
total) se observó que, aproximadamente, el
50 % de los niños en ambas escuelas com-
pra la colación en el kiosco escolar. Entre
un 30–40 % la trae de su casa y el resto no
ingiere alimentos. La calidad de la colación
es mejor cuando la traen del hogar. De los
niños que trajeron de su casa lo que con-
sumieron en la mañana escolar, un 64 % de
los de la escuela DS realizó una colación
recomendable y de los de la escuela MM lo
hizo un 59 %. No encontrándose diferencias
estadísticas en las proporciones entre las
dos escuelas (Valor p=0,78).
Se observó que el tipo y marca de pro-
ductos que expenden los dos kioscos
investigados, en general, son similares en
cuanto a golosinas, productos de panifica-
ción, galletitas, jugos, turrones, cereales y
lácteos. En la escuela MM, por disposición
de los directivos del establecimiento, no se
comercializan gaseosas, la venta de pani-
ficados es limitada (15 facturas/día) y se
Productos NO recomendables
Gaseosas
Panificados (facturas y bizcochos)
Pebete paleta y queso
Pancho
Caramelos y chupetines
Alfajores, galletitas dulces rellenas, chocolates
Churros
Productos de copetín
debe ofrecer frutas. Por el contrario, en la
escuela DS, además de venderse gaseosas
se venden churros y panchos.
El 74 % de los niños de la escuela DS,
que declararon en la encuesta áulica que
compraron su colación en el kiosco, eligie-
ron un alimento “no recomendable”; pro-
porción significativamente mayor (Valor
p=0,02) que la de la escuela MM (35 %).
En la Figura 1 se muestran los porcenta-
jes de compras de los distintos tipos de ali-
mentos por escuela calculados de lo enun-
ciado por los alumnos en las encuestas
de boca de kiosco. De éstos, el 90 % en la
escuela DS y el 59 % en la escuela MM eli-
gieron un alimento “no recomendable”, pro-
porciones que resultaron, estadísticamente
diferentes (valor p=0,047).
En la escuela DS un 8,2 % de los niños
manifestó que les gustaría consumir frutas.
En la escuela MM (lugar donde se venden
frutas) un 20 % eligió este alimento como
posible opción.
Follonier, M. y col. • Consumo de alimentos en los kioscos de escuelas primarias... 107

Figura 1. Productos adquiridos en los kioscos escolares de ambas escuelas.

Valores expresados como proporciones de niños que compran cada producto en el kiosco escolar.

En la Figura 2 se detallan los motivos que
inducen la compra, destacándose que la
mayoría de los niños, en ambas escuelas,
manifestaron elegir lo que van a consumir
por “gusto”. El precio de los productos no
tuvo relevancia a la hora de comprar, ya que
sólo 8–10 % de los niños argumentó esta
razón. Los avisos publicitarios televisivos y
la influencia de los amigos tampoco fueron
determinantes en la compra en el kiosco
escolar.
Aproximadamente, el 75 % de los niños
en ambas escuelas disponían entre 2 y 6
pesos diarios para realizar su compra.
108 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Figura 2. Principales motivos asociados a la compra de productos en el kiosco escolar.
Resultados expresados como proporciones de niños que manifiestan elegir los alimentos en el kiosco escolar por
los motivos mencionados.
Discusión
Distintos estudios indican que los patro-
nes de consumo alimentario en la infancia
se caracterizan por una ingesta abundante
de grasas, azúcares y sodio, y deficitaria
en nutrientes esenciales como calcio, hie-
rro, zinc o vitamina C– y fibra (8, 18, 19). En
estos patrones alimentarios, las golosinas,
snacks o productos de copetín, gaseosas y
jugos artificiales tienen un lugar preponde-
rante, y en particular, a menudo se destaca
el snacking o colación durante la jornada
escolar, centrando la mirada en la oferta de
los kioscos escolares.
En el presente trabajo se observó que
casi 90 % de los niños de ambas escue-
las consume colación y la mitad de ellos la
adquiere en la escuela, datos concordantes
con lo observado en el estudio realizado en
2006 por La Asociación Argentina de Dietis-
tas y Nutricionistas Dietistas en escolares
de 1º a 6º grado en las provincias de Chu-
but, Buenos Aires, Salta y Misiones (10).
Con relación a esto, y habiendo encon-
trado diferencias significativas entre las
dos escuelas, en cuanto a la proporción
de niños que compran en el kiosco un ali-
mento “no recomendable”, hace evidente
la necesidad de que exista una reglamen-
tación que restrinja en los kioscos escolares
la venta de los productos evaluados como
no recomendables para los niños y exija
que se oferten alimentos saludables.
Es relevante destacar que cuando la
colación proviene del hogar, más de la
mitad de los niños, en ambas escuelas, trae
un producto “recomendable”, apreciándose
cierta influencia del criterio de un adulto en
la selección. Aunque, actualmente, existe
resistencia a incorporar comidas sanas,
Follonier, M. y col. • Consumo de alimentos en los kioscos de escuelas primarias...
tanto en los niños como en los padres,
ellos influyen en el consumo de alimentos
de sus hijos, a través de sus propias acti-
tudes, conductas y estilos de alimentación
(2, 3, 20).
Sin embargo, hay que entender que la
responsabilidad no sólo es de la familia,
sino, también, del medio en que nos desen-
volvemos. La sociedad, en general, empuja
hacia una actitud que privilegia el placer y
el consumo por sobre la salud y que ha lle-
vado a una descontextualización del con-
sumo de golosinas, gaseosas y productos
de alto tenor graso; los que pasaron de ser
alimentos consumidos en ocasiones espe-
ciales a alimentos de consumo habitual o
diario (21). Por lo tanto, es de vital importan-
cia mejorar las conductas relacionadas con
la alimentación, y la escuela primaria resulta
el ámbito más propicio para implementar
estrategias educativas para lograr conduc-
tas saludables en los escolares.
La cantina escolar debe ser un servicio
que proporcione alimentos nutritivos y salu-
dables a la comunidad educativa durante
los diferentes momentos del día, contribu-
yendo a los cánones educativos. En algu-
nas provincias ya se han implementado
reglamentaciones que regulan la venta de
alimentos en los kioscos escolares con
el objeto de que sean beneficiosos para
los niños en la etapa de crecimiento (16).
En Santa Fe el proyecto de ley existente,
aún, no ha sido sancionado y solo algunas
escuelas tienen iniciativas propias acerca
de la implementación de “kioscos saluda-
bles”; como es el caso de la escuela MM,
que con algunas restricciones y exigencias
ha permitido un mayor consumo de colacio-
nes recomendables en sus alumnos.
En la escuela DS se ha observado un
alto consumo de gaseosas ya que no existe
109
regulación para su venta. El creciente con-
sumo de gaseosas representa una preocu-
pación a nivel mundial (22). Se ha demos-
trado que el consumo de estas bebidas en
niños está asociado a aumento en la obe-
sidad, a reemplazo de la leche en la dieta
resultando en déficit de calcio, y aumento
en las caries dentales (22–24).
Como se ha demostrado en otros tra-
bajos, la presión social generada por los
medios de comunicación y la publicidad
que otorgan un “valor agregado” a determi-
nados productos (que no se les da ni a las
frutas ni otro alimento más saludables) influ-
yen en las preferencias alimentarias de los
niños, en las elecciones y consumo de ali-
mentos (6, 25). A pesar de este consenso,
en este estudio la elección de los alimentos
adquiridos en el kiosco escolar no parece
estar influenciada por los anuncios televisi-
vos. Probablemente esto se debe a que las
marcas de los productos comercializados,
excepto las gaseosas, no tiene anuncios en
la Tv que promocionen su consumo.
Por otra parte, hoy en día, se valora la
autonomía temprana de los niños, se les da
dinero precozmente, teniendo la posibilidad
de tomar decisiones en su alimentación. En
este estudio la mayoría de los niños que
acuden al kiosco escolar durante el recreo
disponen entre 2 y 6 pesos en coincidencia
con numerosas investigaciones (12, 26, 27).
Muchos trabajos han comprobado que los
productos saludables son más costosos y
por eso menos elegidos (12, 28, 29). Éste
no sería el caso de los alumnos que parti-
ciparon en este estudio, ya que aún con el
dinero mínimo (2 pesos) del que disponen
algunos, podrían haber comprado una fruta
o cereales u otros productos que contribu-
yan a una alimentación saludable y no lo
hicieron, lo que lleva a pensar que el dinero
110 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
disponible no sería un factor limitante en la
elección de compra de alimentos más salu-
dables en el kiosco escolar. Esto da cuenta
de la falta de orientación que reciben los
niños para seleccionar, apropiadamente, lo
que consumen en la colación. De hecho,
muy pocos niños refieren comprar los ali-
mentos porque son saludables, y entre los
que les gustaría consumir en el recreo muy
pocos manifiestan desear una fruta. En
este sentido, los directivos de las escuelas
manifestaron que muchos alumnos refieren
que les da vergüenza comer una fruta o un
yogur descremado porque son objeto de
burlas y se sienten discriminados.
La comunidad escolar (directivos, docen-
tes, cooperadora, niños/as) desempeña un
rol importante en la promoción de prácti-
cas saludables en alimentación. En Chile
han iniciado programas de educación en
alimentación saludable para escolares y
de información al consumidor (30). En este
sentido, han obtenido cambios favorables
en el patrón de consumo de alimentos en
escolares chilenos con la implementación
de “kioscos saludables” (12). Los países
nórdicos han tenido éxito en la modificación
de los hábitos de consumo de su población
a través de políticas públicas que apuntan
al incentivo del consumo de mejores ali-
mentos a través de subsidios o impuestos
a determinados productos, a políticas de
fomento de la producción y venta de estos
alimentos y campañas de educación nutri-
cional (31).
En nuestro país, en cambio, existe la Ley
Nacional de Obesidad y Trastornos Alimen-
ticios que, en el artículo 9, hace mención a
los “kioscos saludables” en las escuelas,
pero sólo algunas provincias la han imple-
mentado o han realizado reglamentaciones
propias al respecto (16).
Es importante fomentar actitudes positi-
vas que permitan a los niños, dentro de sus
capacidades, elegir responsablemente los
alimentos que consumen. Cabe destacar
que la escuela ha sido considerada siempre
un sector estratégico para estas acciones.
Si la comunidad escolar (directivos, docen-
tes, cooperadora, niños/as) decide imple-
mentar un kiosco en el establecimiento,
debería integrarse en un proyecto de pro-
moción de prácticas saludables de alimen-
tación, seleccionando los productos ofreci-
dos de manera coherente con los mensajes
educativos. En apoyo a estas acciones es
importante lograr la sanción de leyes que
establezcan como obligatorio la regulación
de la venta de alimentos y bebidas nutritiva-
mente adecuadas a la edad de crecimiento
y desarrollo.
Conclusión
La enseñanza de hábitos alimentarios
saludables en las escuelas primarias acom-
pañada de una regulación de la venta de
productos en los kioscos escolares es
indispensable para mejorar la colación de
los niños.
Agradecimientos
A Juan Villafañe, presidente de la Fede-
ración de Asociaciones de Cooperadoras
Escolares del Dpto. La Capital de Santa Fe.
A los directores, maestros y niños que nos
brindaron su tiempo para la realización de
las encuestas. A los tesinistas, pasantes y
voluntarios de la UNL.
Financiación: Universidad Nacional del
Litoral a través del Proyecto Extensión de
Interés Social (PEIS): “Promoción del desa-
yuno y colación saludables en escolares de
Follonier, M. y col. • Consumo de alimentos en los kioscos de escuelas primarias...
la ciudad de Santa Fe”, Res. Consejo Supe-
rior UNL nº: 500/11, Expte nº 571334 (Período
de ejecución: marzo 2012 – marzo 2014).
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 113 a 120
Trabajo completo
Dieta del gaviotín chico (Sterna
supercilliaris) (aves: Sternidae) en el valle
de inundación del río Paraná Medio,
Argentina
Olguín, P.F. • Beltzer, A.H. • Campana, M.
Instituto Nacional de Limnología (INALI – CONICET – UNL), Ciudad
Universitaria UNL, Paraje El Pozo s/n, 3000, Santa Fe, Argentina.
Tel./Fax: 54–342–4511645/48.
RESUMEN: Se analizaron treinta (n=
30) contenidos estomacales del gaviotín
chico común en el valle de inundación del
rio Parará Medio, Argentina. El espectro
trófico resultó integrado por 12 entidades
taxonómicas (todas fracción animal). Los
valores del IRI fueron: peces= 18.000,
crustáceos= 550 e insectos= 300. La
Hk fue de 1,52. En lo referente al ritmo
circadiano de actividad alimentaria se
observó una mayor actividad en horas del
medio día. La eficiencia alimentaria fue de
98 % en primavera, 99 % en verano, 96,5 %
en otoño y 95,9 % en invierno. El tamaño de
las presas osciló entre 20–60 mm siendo
más frecuentes los comprendidos en el
intervalo de 20–40 mm (correspondientes
a H. pequira). El índice de uso de hábitat
arrojó un valor de 0,5 para la unidad de
playa o costa–rivera. Podemos señalar
que S. supercilliaris presenta una dieta
carnívora, básicamente ictiófaga cuyo
forrajeo óptimo se vincula a la abundante
oferta de los recursos acuáticos.
113
RECIBIDO: 27/05/2013
ACEPTADO: 13/09/2013
Palabras clave: Biología alimentaria,
Gaviotín chico común, Río Paraná Medio.
SUMMARY: Diet of the Yellow–billed Tern
(Sterna supercilliaris) (Aves: sternidae) from
the floodplain of the Middle Paraná River,
Argentina
Thirty stomach–content samples (n = 30)
were analyzed belonging to the Yellow–
billed Tern from the floodplain of the Middle
Paraná River, Argentina. The trophic
spectrum was composed of 12 taxa (all
animal fractions). IRI values ​​were fish= 18
000, crustaceans = 550 and insects = 300.
The Hk was 1,52. Regarding the circadian
rhythm of feeding activity, an increased
activity was observed during midday hours.
Food efficiency was 98 % in spring, 99 %
in summer, 96,5 % in autumn, and 95,9 %
in winter. Prey size ranged from 20–60 mm,
being more frequent in the range of 20–40
mm (corresponding to H. pequira). The
habitat use index yielded a value of 0.5 for
114 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
the beach or shore unit. S. supercilliaris
presents a carnivorous diet, basically
ichthyophagous, whose optimal foraging
is linked to the abundant supply of aquatic
resources.
Introducción
El gaviotín chico común (Sterna superci-
liaris) (Vieillot, 1819), es un residente en los
cursos del río Paraná, Uruguay, Paraguay,
Bermejo, Pilcomayo y río de La Plata. Ade-
más se extiende desde Uruguay, Paraguay,
Bolivia, Brasil hasta Venezuela y Colom-
bia (Watson, 1966; Escalante, 1970; De la
Peña, 1977, 1978; De la Peña y Rumboll,
1998; Lozano, 1978; Olrog, 1979; Tuck
y Heinzel, 1980; Meyer de Schauensee,
1982; Narosky e Yzurieta, 2010). Las refe-
rencias sobre su distribución son abun-
dantes no siendo así los datos referidos a
su alimentación. En general se destaca su
preferencia por los peces y las estrategias
para su obtención, señalándose que son
aves muy activas y que se zambullen con
suma rapidez sobre las presas (Escalante,
1970; Bó, et al., 1995). Esta especie junto a
Sterna simplex son los únicas especies de
la familia Sternidae en el valle de inunda-
ción del río Paraná Medio. El conocimiento
de cómo las especies comparten y explo-
tan los recursos permite comprender su dis-
tribución, abundancia y diversidad. Varios
estudios, han demostrado la importancia
del alimento en el ensamblaje y organiza-
ción de las comunidades de aves, en dife-
rentes ecosistemas (Beltzer, 1985; Alessio
et al., 2008; Colón Quezada, 2009; Olguín
et al., 2013). Sin embargo, son escasos los
estudios que, en este sentido, se han lle-
vado a cabo en el valle de inundación del
Keywords: Feeding biology, Yellow–billed tern,
Middle Paraná River.
río Paraná Medio. Por todo lo expresado y
en la convicción de que la simple localiza-
ción de las aves en las grandes unidades
de vegetación y ambiente (GUVAS) no es
criterio suficiente para determinar el grado
de dependencia y considerando el impor-
tante papel que las aves desempeñan en
la transferencia de energía (Margalef, 1977,
1983), es fundamental dar especial aten-
ción a los estudios que definan sus nichos
ecológicos. El objetivo fue estudiar la biolo-
gía alimentaria del gaviotín chico común en
el valle de inundación del río Paraná Medio.
Material y métodos
Área de estudio. El valle de inundación
del río Paraná Medio ocupa la margen dere-
cha, baja y anegadiza del Paraná Medio, en
tanto que por la izquierda se desarrolla una
barranca casi continua que puede alcan-
zar una destacable altura. Corresponde a
la subregión Chaqueña que ocupa el norte
y centro de Argentina, sur de Bolivia, oeste
y centro de Paraguay y noroeste de Brasil
(Morrone, 2001). Las muestras fueron toma-
das en la Isla Carabajal, Santa Fe (31” 39 S
60” 42 W) (Figura 1), que pertenece a la uni-
dad geomorfológica denominada llanura de
bancos (Iriondo y Drago, 1972), donde se
destacan numerosos cuerpos de agua lení-
ticos, algunos de considerable extensión
y presenta variaciones que dependen del
ciclo hidrológico (Beltzer y Neif, 1992).
Olguín, P.F. y col. • Dieta del gaviotín chico (Sterna supercilliaris) 115

Figura 1. Área de estudio: Isla Carabajal (31°39’S, 60°42’O).

Análisis trófico. Se tomaron muestras del nes de comportamiento al momento de la

contenido alimentario de 30 individuos a tra-
vés de la realización de lavajes estomaca-
les siguiendo el criterio de Moddy (1970) y
Rosenberg y Cooper (1990), utilizando una
sonda con agua tibia con el objeto de pro-
vocar regurgitaciones. El período de mues-
treo abarcó desde el año 1999 hasta 2003.
Las capturas se hicieron con redes, las cua-
les se abrieron al amanecer mantenién-
dolas durante todo el día hasta el crepús-
culo. La lectura o control se efectuó cada
media hora aproximadamente. Se tomó el
peso del individuo, hora de captura, uni-
dad de ambiente y actividad que realizaba.
Para evitar la sobreestimación de los patro-
colecta, se consideró como actividad com-
portamental lo observado durante los cinco
minutos a partir de la identificación del ave
(Wiens, 1989). Todos los contenidos fueron
fijados en formol al 10 % para su poste-
rior análisis cuali–cuantitativo. Además fue-
ron estudiados individualmente, identificán-
dose y cuantificándose los organismos a
distintos niveles taxonómicos. Para el con-
teo de las ingestas en avanzado estado de
digestión, se consideraron como individuos
aquellas que conservaron estructuras cla-
ves para su identificación, tales como cabe-
zas, élitros, mandíbulas, etcétera.
116 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Análisis de datos. La diversidad trófica
se calculó mediante el criterio de Hurtubia
(1973) y que consiste en calcular la diver-
sidad trófica (H) para cada individuo, utili-
zando la fórmula de Brillouin (1965): H =
(I/N) (log2 N! – ∑ log2 Ni!) donde N es el
número total de entidades taxonómicas
halladas en el estómago de cada individuo
y Ni es el número total de presas de la espe-
cie i en cada estómago. Las estimaciones
individuales fueron sumadas al azar, obte-
niéndose la diversidad trófica acumulada
(Hk). Para estimar la contribución a la dieta
de cada categoría de alimento, se aplicó un
índice de importancia relativa (IRI) siguiendo
a Pinkas et al. (1971): IRI = % FO (% N
+ % V), donde FO es la frecuencia de ocu-
rrencia de cada categoría de alimento, N es
la estimación total de las diferentes catego-
rías taxonómicas y V es el volumen de las
presas que se calculó mediante el método
de desplazamiento de agua, con una preci-
sión de 0.01 ml. Con la finalidad de estable-
cer el ritmo circadiano de actividad alimen-
taria se calculó el índice medio de saciedad
(IF) medido como el volumen de los con-
tenidos estomacales en mililitros sobre el
peso corporal del ave en gramos para cada
tiempo de captura (Maule y Horton, 1984):
IF = vol. cont. (ml) / peso corp. (g) . 100.
La amplitud trófica del nicho se calculó
mediante el índice de Levins (1968): Nb =
(∑Pij2) –1 donde Pij es la probabilidad de
ítem i en la muestra j. La eficiencia alimenta-
ria fue calculada según el criterio de Acosta
Cruz et al. (1988): le = 1 – / peso cont. (g) /
x peso corporal (g) . 100. Se calculó la rela-
ción porcentual del número de presas por
tamaño. A efectos de conocer el uso del
hábitat se aplicó el índice de preferencia de
hábitat (Pi) siguiendo el criterio de Duncan
(1983): Pi = log ((Vi /Ai) + 1), donde Vi es
el porcentaje de individuos registrados en
cada unidad de ambiente (GUVA) y Ai es el
porcentaje de cobertura correspondiente a
cada unidad. Los valores superiores a 0,3
indican una alta preferencia por una deter-
minada GUVA en tanto que valores inferio-
res señalan menor selectividad.
Resultados y discusiones
Todos los estómagos analizados (n= 30)
contuvieron alimento. El espectro trófico
basado en la identificación de 192 presas
resultó integrado por 12 entidades taxonó-
micas, todas correspondientes a la fracción
animal (Tabla 1). Con la suma de las treinta
muestras la asíntota de la curva se estabi-
liza. La aplicación del Índice de Importancia
Relativa (IRI), que destaca la importancia de
cada alimento en la dieta del ave, arrojó los
siguientes valores: peces = 18 000, crus-
táceos = 550, insectos = 300. La diversi-
dad trófica acumulada (Hk) fue de 1,52. El
ítem–presa más representativo de la dieta
de esta especie fue Holoshestes pequira,
cuyo rango de tamaño de presa osciló entre
30 y 35 mm, siguiéndole ejemplares de
Astyanax sp., cuyo rango osciló entre 30 y
40 mm. y Cnesterodon decenmaculatus de
40 mm. Los crustáceos estuvieron repre-
sentados por Macrobrachium borellii, cuyo
tamaño osciló entre 40 y 65 mm. Dentro de
los insectos se identificaron dos especies
de Belostomidae: Belostoma micantulum
de 35 mm y B. elongatum de 30 mm. Otros
restos de insectos fueron hallados en avan-
zado estado de digestión, pertenecientes
al orden Coleoptera y que no se pudieron
identificar ni cuantificarse. Siguiendo el cri-
terio de Kirkonnell et al. (1992) y Canevari,
et al. (1991), el gaviotín chico común corres-
Olguín, P.F. y col. • Dieta del gaviotín chico (Sterna supercilliaris) 117

Tabla 1. Espectro trófico de Sterna supercilliaris. N= número de organismos, F= frecuencia de cap-

tura, x= no cuantificado.

  N F
Pisces
Cypriniformes
Fam Characidae
Holoshestes pequira 72 29
Astyanax sp. A 15 13
Astyanax sp B 8 5
Cheirodon sp. A 3 1
Atheriniformes
Fam. Poecilidae
Cnesterodon decenmaculatus 20 8
Insecta
Hemiptera
Fam. Belostomidae
Belostoma micantulum 31 7
Belostoma elongatum 12 3
n.i. 1 1
Coleoptera
No identificado sp. A. 2 1
No identificado sp. B 1 1
Restos no identificados x 4
Crustácea
Decapoda
Palaemonidae
Macrobrachium borelli 27 16

ponde al grupo funcional de carnívoros, ambientes dulciacuícolas (Boschi, 1981;

básicamente ictiófagos, que obtienen su ali-
mento con vuelos en picada desde el aire
o perchas, coincidiendo con lo expresado
por De la Peña (2002) para la localidad de
Loreto (San Miguel, Corrientes) e Isla Cha-
petón (Paraná, Entre Ríos). Los peces de
pequeña talla como Holoshestes pequira
son su alimento principal y se explica en el
hecho de tratarse de un pez común en el
Paraná que forma cardúmenes, como tam-
bién Macrobrachium borrellii dentro de los
crustáceos, decápodos comunes en los
Collins y Paggi, 1998). Estas apreciacio-
nes son coincidentes con lo señalado para
Sterna simplex (Beltzer, 1984). Las dos pri-
meras especies de peces (H. pequira y
Astyanax. sp.) pertenecen a la familia Cha-
racidae, habitualmente con representan-
tes muy abundantes en ambientes leníti-
cos (Bonetto, et al., 1970; Cordiviola de
Yuan, 1980, Beltzer et al., 2005; López
et al., 2006). En el caso de H. pequira se
observa una concordancia entre la frecuen-
cia y dominancia en ambientes vegetados y
118 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
de aguas abiertas, siendo una de las espe-
cies de pequeño porte más común de los
ambientes acuáticos del río Paraná Medio
(Cordiviola de Yuan y Oliveros, 1979; Belt-
zer et al., 2005). Los crustáceos estuvieron
representados por Macrobrachium borellii
cuyo tamaño osciló entre 40 y 65 mm (Bos-
chi, 1981; Collins y Paggi, 1998). En lo refe-
rente al ritmo circadiano de actividad alimen-
taria se visualizó un patrón en campana,
observándose una mayor actividad en horas
del medio día. La eficiencia alimentaria arrojó
valores que superan en todas las estaciones
el 95 %. De la aplicación del índice de prefe-
rencia de hábitat se observa que el ambiente
con mayor selectividad, tal como lo señalan
las referencias descriptivas de sus patrones
de comportamiento, ribera y playa constitu-
yen la unidad de ambiente (GUVA) con dis-
ponibilidad de perchas, desde donde loca-
lizan básicamente su alimento, ya que utiliza
la percepción visual, habiéndose obtenido
un valor de 0,5.
Conclusión
Por todo lo expuesto, con este trabajo se
brindan los primeros datos cuantificados
sobre el espectro alimentario, eficiencia ali-
mentaria y uso del hábitat sobre el gaviotín
chico, para el área del valle de inundación
del río Paraná. La abundancia de los crus-
táceos e insectos y su accesibilidad hacen
que éstos efectúen el menor aporte energé-
tico, representando para el ave su forrajeo
óptimo en el que el gasto de búsqueda es
casi nulo, por lo que los hábitos alimenticios
de Sterna superilliaris en el valle de inunda-
ción del río Paraná Medio, evidenciaron una
alimentación predominantemente ictiófaga.
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Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 121 a 128 121

Comunicación breve

Ley de tránsito argentina y controles viales: RECIBIDO: 06/07/2013

controversias en las determinaciones ACEPTADO: 25/09/2013

directas e indirectas de alcohol en sangre

Walz, M.F.1 • Sánchez, M.L.1,2 • Cerolini, R.R.A.1,2 • Sosa, C.1 •

Albornoz, M.A.2

1
Facultad de Ciencia y Tecnología – Universidad Autónoma de
Entre Ríos, Paraná, Entre Ríos, Argentina.
2
División Química Forense y Toxicología. Dirección Criminalística
Policía de Entre Ríos.
E–mail florencia.walz@gmail.com

RESUMEN: El alcoholímetro de aliento tiempo de metabolización del alcohol.

es utilizado en controles viales para
detectar conductores con niveles de
alcohol superiores a 0,5 g/L de sangre.
Sin embargo, sus determinaciones son
estimaciones del valor real de alcoholemia,
inválidas para imputar.
Objetivos: analizar concordancia entre
curvas de alcoholemia, determinadas por
espirómetro y por el método directo, bajo
dos situaciones de consumo de alcohol.
Evaluar si el mate es un interferente en lo
informado por espirómetro.
Se trabajó bajo dos situaciones de
consumo de alcohol, diferenciadas por la
ingesta de mate tras la de alcohol en una
de ellas.
Se encontró mucha variabilidad biológica
entre sujetos semejantes. No hubo
concordancia de curva a tiempos
tempranos. El mate no parece interferir
las determinaciones del espirómetro. Sí el
Este instrumento debería emplearse,
únicamente, para detectar si se ha ingerido
o no alcohol, debiéndose modificar la ley
y prohibir completamente el consumo de
alcohol en conductores.
Palabras clave: Alcoholimetría, Curvas
de alcoholemia, Sustancias interferentes.
SUMMARY: Argentina’s traffic laws and
traffic controls: controversies in direct and
indirect determinations of alcohol in blood
The breathalyzer is used in traffic controls
to detect drivers with alcohol levels over
0.5 g/L of blood. However, these values are
estimates of the real value in blood, and
therefore invalid for imputation.
Objectives: to analyze the correlation
between blood alcohol curves, determined
by spirometer and by the direct method
in two situations of alcohol consumption.
122 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Assess whether mate interferes with the
report of the spirometer.
Two situations of alcohol consumption were
studied differentiated by the complementary
intake of mate after having had wine in only
one of them.
We found great biological variability
between similar subjects. There was no
match between curves at early times. Mate
did not seem to interfere with spirometer
Introducción
La Ley 24788 prohíbe conducir autos con
una alcoholemia superior a 0,5 gramos por
litro de sangre, valor que no se superaría
con la incorporación de 300 ml de vino de
graduación alcohólica de 12 grados en per-
sonas adultas que no superen los 75 kg de
peso corporal (1). Sin embargo, esta can-
tidad —que se asume como “permitida”—
no siempre asegura el no exceder tal límite,
incluso en sujetos con las características
mencionadas.
La metabolización del alcohol y el tiempo
del proceso están muy influenciados por
la variabilidad biológica, aun considerando
individuos semejantes en aspectos físicos
(peso, género, altura, edad…) y estado de
salud, y por factores condicionantes como
la modalidad de la ingestión de la bebida
alcohólica en términos de los diferentes ali-
mentos acompañantes, el tipo de bebida, la
“cultura alcohólica” que tenga la persona,
entre otros (2, 3).
En general, la máxima concentración de
alcohol en sangre se logra entre los 30 y
60 minutos tras la ingestión alcohólica, sin
poder precisarse con exactitud debido a
que no sólo depende de todos los factores
determinations. However, it did influence
the time necessary to metabolize the
alcohol.
This instrument should be used only to
detect if alcohol has been consumed or not.
The law should be changed totally banning
consumption of alcohol in drivers.
Keywords: Alcoholometry, Alcohol curves,
Interfering substance.
enunciados con anterioridad sino, también,
del tiempo que se ha estado bebiendo. Es
decir, no existe un instante cero que pueda
tomarse como referencia porque esto sería
considerar que se bebe todo de una sola
vez, situación que rara vez ocurre. Habitual-
mente, este beber es un proceso continuo
y la curva de absorción–eliminación se pre-
senta escalonada con más de un pico (4).
El alcoholímetro de aliento es un instru-
mento que permite detectar si una persona
ha ingerido o no alcohol e informa, a través
de un método indirecto, una estimación de
la concentración de alcohol en sangre que
tiene el sujeto en el momento que sopla.
Asumiendo una correlación directa entre la
concentración de alcohol en el aire alveolar
y la concentración de alcohol en la sangre,
más precisamente, etanol. Esta suposición
se basa en la Ley de Henry, que establece
que cuando una solución acuosa de un
componente volátil alcanza un equilibrio
con el aire existe una proporción fija entre
las concentraciones de este componente
en el aire y en la disolución para una tem-
peratura determinada. En la realidad, los
supuestos generalmente no se cumplen; de
hecho, la temperatura corporal no es cons-
Walz, M.F. y col. • Ley de tránsito argentina y controles viales...
tante ni en un mismo sujeto ni entre suje-
tos, y es un factor influyente en la manten-
ción de esa proporcionalidad, como lo son
también otras propiedades inherentes a los
líquidos y gases en los que se basa la Ley
de Henry y para la cual la sangre no califica
en la definición formal de líquido, siendo la
composición celular de la misma otro fac-
tor a considerar en las observancias de
dicha Ley. También la presión atmosférica,
la humedad en el aire espirado, entre otros,
alteran este fenómeno (5).
En otros aspectos, se ha demostrado
que las prótesis dentales pueden retener
vapores de alcohol (6) que alteren la rela-
ción en el cálculo indirecto de la alcohole-
mia realizada por el espirómetro. Por otra
parte, si se efectúa una medición con este
aparato antes de cumplidos, aproximada-
mente, 10 minutos desde que se beben
uno o dos tragos de bebida alcohólica, los
gases volátiles permanecen en la boca por
este período (7) observándose en la panta-
lla del instrumento un valor altísimo que no
se condice, en absoluto, con la alcohole-
mia. Así, por ejemplo (y en base a resulta-
dos de esta investigación), hasta 10 minu-
tos después de ingerir tres tragos de vino
las marcaciones observadas en el espiró-
metro llegan a valores de 2g/L. Demostra-
ciones semejantes se han hecho, desacer-
tadamente, en programas televisivos y han
generado cierta desconfianza en la pobla-
ción respecto del instrumental.
En los controles viales que se hacen en
muchas provincias argentinas se utiliza el
espirómetro de aliento, no sólo para deter-
minar si el conductor ingirió o no alcohol
sino también para sancionar o eximir de una
penalidad a aquellos conductores con mar-
cación positiva informada por el aparato,
valoración que no es punible por ley ya que
123
la misma, claramente, establece un punto
de corte máximo permitido para alcohol en
sangre.
Generalmente, en las detenciones o
demoras a los conductores excedidos en
alcohol (según marcación instrumental) se
emplea una serie de procedimientos como:
retener al individuo por un tiempo y/o indi-
carle que se efectúe enjuagues bucales que
sólo obstruyen el contexto real y pueden
provocar conclusiones erróneas con conse-
cuencias legales.
Otra cuestión a atender en el uso del
espirómetro de aliento es la existencia de
sustancias interferentes, principalmente las
de tipo medicinales, como los puff bronquia-
les (8). Existe además la posibilidad de que
otros agentes (aún no estudiados) de natu-
raleza comestible, higiénicas o que respon-
den a costumbres regionales (mate, mas-
ticación de hojas…), pudieran alterar por
defecto o por exceso el valor medido por el
aparato. En tal sentido, y particularmente en
Entre Ríos, el consumo de mate durante la
conducción es habitual, sobre todo, en una
etapa posprandial en un viaje de largo reco-
rrido. Actualmente no existen trabajos que
tengan por objeto investigar la influencia del
matear en las mediciones informadas por el
alcoholímetro de aliento. Ni estudios especí-
ficos sobre cuestiones afines.
En esta investigación se plantearon como
objetivos: analizar la concordancia entre las
curvas de valores de alcoholemia determi-
nados por espirómetro de aliento y por el
método químico directo en dos situaciones
diferentes de consumo de alcohol (con y sin
ingesta de mate tras beber alcohol) y eva-
luar si el mate podría considerarse como
una sustancia interferente en las determina-
ciones efectuadas con el espirómetro.
124 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Metodología de trabajo
En el estudio participaron veinte jóvenes
estudiantes universitarios saludables, de
ambos géneros, con peso corporal entre
55 y 65 kg las mujeres y entre 70 y 80 kg
los hombres, con edades entre 18 y 30
años, que no padecieron ni padecían nin-
guna enfermedad con compromiso hepá-
tico (hepatitis, cirrosis…) y que, voluntaria-
mente, aceptaron por escrito, atenerse a las
intervenciones y disposiciones programa-
das para la investigación.
Primera experiencia (10 participan-
tes). Realizada a las 20 hs de un día lunes,
en ayuno de alcohol con un mínimo de 12
horas y ayuno de alimento de 3 horas. Cada
sujeto consumió 300 ml de vino tinto de gra-
duación alcohólica 12 grados, acompañán-
dolo con un alimento a base de hidratos de
carbono (sándwich de, aproximadamente,
150 g de pan francés con jamón y queso,
sin aderezo). La ingesta debió finalizar en
10 minutos exactos (tiempo cero). A los 20,
40, 60 y 90 minutos se les determinó la con-
centración de alcohol en sangre mediante
análisis bioquímicos* y cada 10 minutos a
través del espirómetro de aliento**.
Segunda experiencia (10 participan-
tes). Realizada a las 20 hs de un día jueves,
en ayuno de alcohol con un mínimo de 12
horas y ayuno de alimento de 3 horas. Se
replicó la metodología empleada en la pri-
mera experiencia hasta el tiempo cero con-
siderado en ella. Transcurridos 5 minutos
desde este tiempo inicial, los participantes
debieron comenzar a tomar mate amargo
(en 15 minutos debieron ingerir 300 ml de
infusión). Se les determinó, a los 30, 60 y
90 minutos, la concentración de alcohol en
sangre y mediante el espirómetro de aliento
cada diez minutos. Empleando los mismos
métodos utilizados con anterioridad.
* Las muestras de sangre se extrajeron
por punción venosa y se procesaron con el
método de micro difusión con posterior lec-
tura espectrofotométrica. Esta técnica pre-
senta como interferentes cualquier agente
reductor como otros alcoholes (metanol,
isopropanol), aldehídos y cetonas. Posee
un límite de detección de 0,15 g/L y un
límite de cuantificación de 0,30 g/L.
** Dispositivo de mano portátil de celda
de combustión (BAC 100). No se ve afec-
tado por la acetona, pero no distingue entre
diferentes tipos de alcoholes. El alcohol etí-
lico es el tipo de alcohol presente en las
bebidas alcohólicas, pero otros tipos de
alcohol, tales como alcohol metílico y alco-
hol isopropílico, pueden ser también detec-
tados por los alcoholímetros de células de
combustible. Sin embargo, estos otros tipos
de alcohol son muy tóxicos y su consumo
puede poner en peligro la vida.
Tales limitaciones no perturban los obje-
tivos de este estudio debido a que los par-
ticipantes no presentaban enfermedades
metabólicas de base con propensión a pro-
ducir agentes reductores, contaban con
ayuno de 3 horas de alimento y 12 horas sin
haber consumido bebidas alcohólicas. Por
otra parte, se les indicó no efectuarse lava-
dos bucales con productos a base de alco-
holes durante el día y se les solicitó garan-
tías de no haber inhalado drogas en puff,
jarabes y otras (al menos en las últimas 48
hs). Se respetó el período de recuperación
requerido por el aparato de medición de
alcohol en el aliento entre las pruebas.
Walz, M.F. y col. • Ley de tránsito argentina y controles viales... 125

Resultados valores de alcoholemia por encima de 0,5

En ambas situaciones experimentales se
encontró una gran variabilidad biológica en
el metabolismo del alcohol entre participan-
tes con características físicas semejantes
(Gráficos 1 y 2). A demás, se observaron
g/L en un 30 % de las mujeres y en un 12 %
en los varones en la situación experimental
en la que no se evaluó el mate como interfe-
rente. Las proporciones, respectivas, en la
segunda experiencia fueron: 27 % y 13 %.
126 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Resultados de la primera experiencia
A los 20 y 40 minutos, los valores medios
de alcoholemia obtenidos con cada método
resultaron ser estadísticamente diferentes
(valores p=0,03 y 0,001. Prueba de Wil-
coxon para muestras pareadas). A los 60
minutos se hallaron evidencias significativas
de igualdad de medias, permaneciendo,
así, a los 90 minutos (valores p=0,12 y
0,68. Prueba de Wilcoxon para muestras
pareadas).
Se detectó un error sistemático por exceso
en el espirómetro de aliento que resultó ser
distinto de cero en los tiempos 20 y 40 minu-
tos (Valores p<0,001), volviéndose nulo a
los 60 minutos y manteniéndose así hasta el
final del tiempo considerado.
Resultados de la segunda experiencia
En la oportunidad en la que el mate acom-
pañó la ingesta de alcohol, la igualdad de
valores medios de alcoholemia se observó,
recién, a los 90 minutos (valor p=0,34). No
resultaron ser iguales a los 30 y 60 minutos
(valores p=0,001, en ambos casos).
Se volvió a detectar un error sistemá-
tico por exceso en el espirómetro de aliento
que se mantuvo distinto de cero los 30 y
60 minutos (valores p<0,01), siendo nulo
recién a los 90 minutos.
Discusión
Esta investigación surge a raíz de un aná-
lisis de la actual Ley 24788 y la metodología
empleada en los controles viales destinados
a prevenir accidentes de tránsitos, en los que
los operarios tienen la facultad para sancio-
nar infractores basados en pruebas que no
son contundentes para la legislación actual.
Dado que la misma establece un nivel
máximo permisible de 0,5 g de alcohol por
litro de sangre, se concluye que “algo” se
puede tomar. Sin embargo, los efectos de
ese “algo” varían entre los diferentes suje-
tos. Más allá de las especulaciones que
pudieran derivarse respecto del tiempo que
se estima transcurrirá hasta ser sometido a
un control y su consecuente descenso en el
valor de alcohol, debido a que, por lo gene-
ral, estos puestos de inspección se ubican
en los mismos lugares.
A pesar de haberse restringido la mues-
tra a sujetos con ciertos aspectos físicos
semejantes, se observó una gran variabi-
lidad biológica para una misma situación
de consumo de alcohol. Incluso dentro de
los grupos de un mismo género. Esto da
cuenta de que, a pesar de que se estima
que ingiriendo 300 mL de un vino de 12 gra-
dos de graduación no se llega a una alco-
holemia superior a 0,5 g/L, pequeñas dife-
rencias en los factores intervinientes en
el metabolismo del alcohol generan noto-
rias variaciones de los valores de alcohol
en sangre a un mismo tiempo y forma de
ingestión entre personas de característi-
cas parecidas, lo que pone de manifiesto la
gran versatilidad que podría encontrarse en
los múltiples y disimiles casos que pueden
presentarse en los controles viales.
La no igualdad de medias, estadística-
mente significativa, entre los valores infor-
mados por ambos métodos hasta los 40 y
60 minutos en las dos experiencias respec-
tivas en el orden enunciado en la metodolo-
gía, evidencia una falta de concordancia que
podría resultar en una contextualización erró-
nea de la real situación de la persona que
está siendo inspeccionada. Por lo que, en
Walz, M.F. y col. • Ley de tránsito argentina y controles viales...
concordancia con otros autores (9), podría
decirse que la concentración de alcohol en el
aire pulmonar no siempre refleja la concen-
tración de alcohol en sangre.
Por otra parte, la desigualdad de medias
observada a los 60 minutos en la segunda
experiencia (en la que se ingirió mate) y no
en la primera, da cuenta de cierta interfe-
rencia en la absorción del alcohol, siendo la
dilución provocada al matear un posible cau-
sal de su enlentecimiento (4). Sin embargo,
este estudio muestra que el mate no actuaría
como una especie de enjuague bucal, como
se esperaba. En la segunda experiencia, el
valor medio de alcoholemia informado por
el espirómetro a los 30 minutos difiere sig-
nificativamente de la media obtenida por el
método directo y resulta más alta la obtenida
con el alcoholímetro, manteniéndose el error
sistemático por exceso encontrado en la pri-
mera experiencia.
Otro agravante del uso del espirómetro
para control del respeto legal es la incerti-
dumbre del momento de la ingesta alcohó-
lica por el sujeto. Esto podría evitar el reco-
nocimiento de un infractor genuino que
viene conduciendo por cierto período y
que, al momento de la prueba, su alcohole-
mia ha descendido al valor límite admisible
(por estar en el tiempo final de la metabo-
lización), lo que lo convierte en inimputa-
ble en ese instante aunque, tal vez, quince
minutos antes fuera un conductor potencial-
mente riesgoso.
La no permanencia en el tiempo del error
sistemático informado también es cau-
sal de distorsión de la realidad. Una situa-
ción particular, pero reiterada (según regis-
tros policiales), es cuando un conductor es
detenido para efectuarle la prueba y éste
127
presenta un pequeño exceso por encima
del valor límite (por ejemplo, 0,7 g/L); los
procedimientos que devienen en el proto-
colo de los inspectores es atender al error
sistemático del aparato, y esto implica
demorarlo y repetirle la prueba al cabo de
10 minutos. Este tiempo concede a un tras-
gresor, que ha ingerido bastante más de la
“cantidad permitida” y que se encuentra en
la fase final de eliminación, la chance de
ser eximido aunque viniera conduciendo la
mayor cantidad de tiempo con valores de
alcoholemia ilegales.
Conclusión
Este tipo de instrumento de medición no
debería ser empleado para determinar si
un conducto cumple o no con el nivel de
alcoholemia estipulado por la ley. Técnica-
mente, debería ser usado solamente para
comprobar si se ha ingerido o no alco-
hol. De ser positivo el resultado, debería
hacerse un estudio bioquímico de alcohole-
mia que estaría en concordancia con el res-
peto legal.
En tal sentido, bajo el escaso grado de
veracidad de la realidad que puede inferirse
de los controles viales y atendiendo a la
gran variabilidad biológica que genera dife-
rentes respuestas ante un mismo consumo
de alcohol (incluso dentro de las cantidades
supuestamente permitidas), la ley debería
ser modificada, ampliándose la prohibición
total de ingerir alcohol a los conductores de
cualquier tipo de vehículo, sin discrimina-
ción. A los efectos de esta última palabra,
se aclara que, actualmente, la ley establece
que sólo los conductores de autos pueden
llegar a un valor máximo permisible de 0,5
128 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
g/L de sangre, cuestión que no es así para
los conductores de vehículos de transpor-
tes públicos o camiones, para los cuales se
estipula que no deben tener nada de alco-
hol en sangre.
Referencias bibliográficas
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Toxicología. 4ta. ed. Ediciones Científicas y Técni-
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gies and Procedures. Road Traffic Safety Portal
Site. Disponible: junio de 2013.
8. Martínez, T. & Martínez, R., 1998. The Effect
of an Inhalation Aerosol Bronchodilator on
Breathalyzer Results in Drinking and Non-Drin-
king Subjects. Am. Proc. West. Pharmacol. Soc.
41: 51–52.
9. Trafford, D.J.H. & Makin, H.L.J., 1994. Breath
Alcohol Concentration May Not Always Reflect
the Concentration of Alcohol in Blood. Am. J. of
Analytical Toxicology. 18, 4: 225–225.
Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 129 a 136
Divulgación
Investigación en ciencias de la salud
Cantora, AM. • Corti, M.R. • Giuggia de Stratta, M.G.
Escuela Superior de Sanidad. Facultad de Bioquímica y Ciencias
Biológicas. Universidad Nacional del Litoral. Ciudad Universitaria.
Paraje El Pozo s/n, 3000, Santa Fe, Argentina.
E–mail: afilippa2011@gmail.com
mcorti@fbcb.unl.edu.ar
romastratta@fibertel.com.ar
RESUMEN: Este trabajo se inscribe en
el marco del Proyecto de Investigación
y Desarrollo (CAI+D 2009) denominado
“Ética profesional y Conocimiento en
Ciencias de la Salud”. Tiene como objetivo
conocer los criterios que utilizan los
profesionales de la salud para calificar a
la investigación científica y vincularla con
la toma de decisiones en la práctica. Es
una investigación cualitativa, se diseñó una
entrevista semiestructurada, organizada en
cinco ejes. Se analizan dos de ellos que se
refieren a “Áreas temáticas investigadas y
su vinculación con problemas locales”. Las
preguntas estuvieron orientadas a conocer
qué criterios prevalecen en las prácticas
profesionales en referencia a problemas de
salud, cómo se eligen las temáticas para la
investigación en la Facultad de Bioquímica
y Ciencias Bilógicas y en la Facultad
de Ciencias Médicas y si se perciben
las demandas en cuanto a problemas
129
RECIBIDO: 27/09/2012
ACEPTADO: 08/08/2013
relacionados a la calidad de vida,
considerando los determinantes sociales. 
Palabras clave: Ciencias de la salud,
Investigación, Problemas locales,
Determinantes sociales.
SUMMARY: Research in health sciences
This work forms part of the Research and
Development Project (CAI+D 2009) entitled
“Professional Ethics and Knowledge in
Health Sciences”. The aims of this ongoing
project are to determine the criteria used
by health professionals to qualify scientific
research and link it to decision–making
in their practice. As a qualitative study,
we designed a semistructured interview,
organized into five areas. We analyzed two
of them: “Thematic areas investigated and
their connection to local problems”. The
questions were aimed to know what criteria
take precedence over health problems,
130 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
how to choose the topics for research in
the School of Biochemistry and Biological
Sciences and in the School of Medical
Sciences, and if the demands are perceived
Introducción
“Suele pensarse que la medicina y la
ética son esferas separadas del conoci-
miento, pertenecientes a campos bien dife-
renciados. La medicina, en su concepción
moderna y occidental, es una rama de la
ciencia natural, usa el método experimental
y sus explicaciones se basan en la obser-
vación y el análisis objetivo de los hechos,
mientras que la ética es una rama de las
humanidades, su método de conocimiento
es mucho más especulativo y no tiene como
finalidad describir ni explicar los hechos,
sino valorarlos. Sin embargo, la aparición
de los determinantes sociales de la salud
está contribuyendo a difuminar esa frontera,
sobre todo en los campos de la epidemio-
logía y la justicia social. Los determinantes
sociales de la salud se refieren a los factores
sociales (clase, género, edad, etnia...) que,
respondiendo a un determinado contexto
socioeconómico y político (que incluye,
entre otros ámbitos, el mercado de trabajo,
las políticas macroeconómicas y las políti-
cas del estado de bienestar), afectan a las
desigualdades de salud” (1).
La investigación sobre los determinantes
sociales de la salud ha registrado un impor-
tante desarrollo demostrando la pertinencia
de desplazar el enfoque de los problemas
de salud desde los factores de riesgo indivi-
duales hacia los patrones sociales que con-
figuran las posibilidades de la gente de ser
saludable. No obstante y pese a la abruma-
as problems related the quality of life,
considering social determinants.
Keywords: Health sciences, Research,
Local issues, Social determinants.
dora producción bibliográfica al respecto
(2), la persistencia de los problemas de
salud relacionados con condiciones estruc-
turales injustas, tales como el hambre, la
pobreza extrema y la exclusión social (algu-
nos de los ítems que constituyen la “agenda
inconclusa” de América Latina según la
Organización Panamericana de la Salud
(3) dan cuenta de la dimensión ético–polí-
tica implicada en el desarrollo científico. Las
mayores dificultades no están en el reco-
nocimiento de estas relaciones de la salud
con los modos de vida de las poblaciones
sino en una cierta incapacidad en el plano
de la salud colectiva para generar políticas
sanitarias que den respuesta a esos proble-
mas (4).
En todo el mundo, las personas social-
mente desfavorecidas tienen menos acceso
a los recursos sanitarios básicos y al sis-
tema de salud en su conjunto. Es así como
enferman y mueren con mayor frecuencia
que aquellas que pertenecen a grupos que
ocupan posiciones sociales más privilegia-
das. Esto se hace más crítico en algunos de
los grupos más vulnerables. Estas inequida-
des han aumentado a pesar de que nunca
antes han existido en el mundo la riqueza,
los conocimientos y la sensibilidad e interés
por los temas que atañen a la salud como
en la actualidad.
“Paradójicamente, existe suficiente evi-
dencia, particularmente proveniente de paí-
ses desarrollados, de acciones posibles
Cantora, AM. • Investigación en ciencias de la salud
para disminuir dichas inequidades, prin-
cipalmente a través de la implementación
de políticas e intervenciones de salud que
actúen sobre los determinantes sociales.
En la Asamblea Mundial de la Salud cele-
brada en 2004, el director general de la
Organización Mundial de la Salud, Dr. Lee
Jong–wook, pidió que se estableciera la
Comisión sobre Determinantes Sociales de
la Salud. Esta Comisión tiene como pro-
pósito generar recomendaciones basadas
en la evidencia disponible de intervencio-
nes y políticas apoyadas en acciones sobre
los determinantes sociales que mejoren la
salud y disminuyan las inequidades sanita-
rias. “La Comisión tratará de generar una
agenda local y global para la formulación,
planificación e implementación de políticas,
planes y programas de salud basados en
intervenir sobre los determinantes sociales
que condicionan el nivel de salud” (5).
Las “redes expertas integradas por
destacados científicos, líderes sociales y
expertos” “acopiarán conocimientos sobre
intervenciones y políticas efectivas para
enfrentar los determinantes sociales de la
salud, priorizando contextos sociopolíticos
de bajos ingresos. Las redes expertas abar-
carán diversos temas: condiciones de vida
en el desarrollo temprano del niño, sistemas
de salud como determinante social, condi-
ciones de trabajo y empleo, efectos sobre
la salud de algunos procesos de globali-
zación, diseño y organización de progra-
mas de control de enfermedades priorita-
rias de salud pública, condiciones extremas
de vivienda, exclusión social y metodolo-
gías necesarias a utilizar para la evaluación
de las intervenciones y políticas sobre los
determinantes sociales en salud” (5).
Mario Albornoz, en “Situación de la ciencia
y la tecnología en las Américas”, afirma que
131
“la mayor parte de los problemas que
atañen a las sociedades de los paí-
ses latinoamericanos requieren para su
solución insumos de conocimiento cuyo
desarrollo está al alcance de los siste-
mas científicos y tecnológicos locales, a
condición de que tanto las políticas como
los estímulos, las prioridades y la propia
cultura de los investigadores estén orien-
tados hacia la percepción de los proble-
mas de las sociedades a las que perte-
necen” (6).
“Las políticas de investigación orienta-
das al mejoramiento de la calidad de
vida permiten encontrar soluciones cien-
tíficas y tecnológicas que aporten bien-
estar, democracia e igualdad y contribu-
yan al desarrollo sustentable. A partir de
la comprensión de la naturaleza social
de la investigación se puede lograr una
mirada crítica, ética y reflexiva sobre sus
impactos políticos, sociales, económicos
y ambientales. Por ello, profundizaremos
políticas de investigación sustentadas en
criterios de compromiso social y perti-
nencia” (7).
Adhiriendo a los principios enunciados
en el Plan de Desarrollo Institucional 2010–
2019 de la UNL (7), el Proyecto de Investi-
gación y Desarrollo (CAI+D 2009) (8) deno-
minado “Ética profesional y Conocimiento
en Ciencias de la Salud”, se propone cono-
cer los criterios que utilizan los profesiona-
les de la salud para calificar a la investiga-
ción y vincularla a la toma de decisiones en
la práctica.
Los ejes abordados en la investigación
son: áreas temáticas investigadas y su vin-
culación con problemas locales, papel que
juega la tecnología en la investigación, infor-
132 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
mación científicamente confiable para imple-
mentar en la práctica, responsabilidades éti-
cas y sociales de los expertos. Este artículo
refiere específicamente al primer eje.
La sociedad del conocimiento en la que
estamos viviendo, la provisoriedad de los
saberes en cuanto a la superación de los
paradigmas científicos, requiere de la edu-
cación superior un papel importante, que
posibilite un amplio acceso social a la infor-
mación así como una capacitación perso-
nal crítica que favorezca la interpretación y
la generación de nuevos aportes intentando
resolver problemáticas sociales que abran
líneas de investigación.
Justo L. refiere que
“la respuesta a la pregunta sobre quién
determina las prioridades en investiga-
ción en salud en América Latina no tiene
una respuesta sencilla ni única. La exis-
tencia de múltiples factores históricos,
sociales, culturales y económicos a ser
tenidos en cuenta al intentar explicacio-
nes al respecto, obligan a una actitud de
cautela que prescinda de explicaciones
simplistas y que busquen una causali-
dad lineal, así como el reconocimiento de
la rica heterogeneidad de nuestro conti-
nente. Lo que está en juego, básicamente
es, ¿Investigamos lo que debemos, lo que
podemos, lo que queremos o lo que nos
imponen de otros sitios? (...) la preponde-
rancia del factor económico a la hora de
fijar prioridades en investigación científica
en salud, resulta coherente con la lógica
de la empresa capitalista, cuyo objetivo es
el lucro y no la satisfacción de las necesi-
dades de la sociedad” (6).
Construir una teoría general de la salud
que tenga en cuenta todas las causas, nive-
les y consecuencias de las enfermedades,
y el tipo de respuesta social que debería
ofrecerse, requiere de un razonamiento que
combine ética y ciencia.
Materiales y métodos
El diseño responde a la investigación
cualitativa, con carácter exploratorio. El tipo
de estudio es descriptivo, transversal.
La muestra, de carácter intencional, está
constituida por graduados universitarios del
área de la salud con no menos de diez años
de ejercicio profesional en el ámbito de la
Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológi-
cas y Facultad de Ciencias Médicas de la
UNL, que registren antecedentes en la tarea
investigativa. El número de entrevistados fue
de veinte docentes investigadores, tres per-
tenecientes a la Facultad de Ciencias Médi-
cas, cuatro a la Escuela Superior de Sanidad
“Dr. Ramón Carrillo” y trece de la Facultad de
Bioquímica y Ciencias Biológicas.
El instrumento seleccionado para la reco-
lección de datos fue la entrevista no estruc-
turada en torno a los siguientes ejes: áreas
temáticas investigadas y su vinculación con
problemas locales, papel que juega la tec-
nología en la investigación, información
científicamente confiable para implementar
en la práctica, responsabilidades éticas y
sociales de los expertos.
El lugar de realización de la entrevista fue
a elección de cada participante: laborato-
rios, departamentos, cátedras.
Dado que la investigación responde a un
diseño cualitativo descriptivo, se interpreta-
ron las respuestas obtenidas en base a los
siguientes descriptores: selección de temá-
ticas, factores asociados a la elección de
los temas, y su vinculación con los determi-
nantes sociales de la salud.
Cantora, AM. • Investigación en ciencias de la salud
Resultados y discusión
Las respuestas de los entrevistados
acerca de los factores asociados a la selec-
ción de las temáticas y su vinculación con
los determinantes sociales de la salud,
fueron analizadas desde los aportes que
brinda la Psicología del Trabajo sobre el
proceso de motivación. (9)
Entendemos la motivación como el inte-
rés o fuerza intrínseca que se da en relación
a un objetivo que se quiere alcanzar, refi-
riendo a un estado subjetivo que mueve la
conducta en una dirección determinada en
un momento dado.
En la interpretación de las respuestas se
reconocen otros factores asociados con la
motivación, como por ejemplo el recono-
cimiento social, la pertenencia a un grupo
o equipo de trabajo, el status que genera
la actividad investigativa, la convicción de
estar contribuyendo a la construcción de
nuevos conocimientos, el incentivo econó-
mico y/o retribución en la demanda externa,
entre otros.
A partir de los testimonios de los entre-
vistados, se pueden inferir algunos de los
factores que condicionan la elección de los
temas:
La propia formación, los intereses acadé-
micos, los recursos humanos y financieros:
“La elección del tema es una cuestión
muy compleja y está determinada por
múltiples factores, por la propia forma-
ción, por los recursos que uno dispone, el
nivel de complejidad del laboratorio y de
los recursos humanos, entonces uno elige
tomar determinados problemas o no”.
Existencia de líneas de investigación a
nivel nacional con posibilidades de acce-
133
der a subsidios, la participación en deter-
minado grupo, como las vinculaciones inte-
rinstitucionales:
“Otro punto son las estrategias en donde
uno piensa de qué manera tiene más
posibilidades de conseguir subsidios.
Entonces dentro de lo que se elabora a
nivel nacional, lo que es de interés uno
trata de ir por ese lado para adquirir
fondo, uno trata de encajar en lo que ese
plan establece como prioritario”, “… yo
ya estoy en una línea temática…la misma
línea de investigación que vos terminas,
se te va abriendo nuevos rumbos en la
investigación”.
Prestación de servicios a determinadas
empresas que demandan respuestas a
interés regionales:
“Las líneas de investigación no sola-
mente vienen dadas por la empresa. Es
mixto, porque también se da que física-
mente coincidimos en el lugar de trabajo,
entonces hay proyectos que son sólo de
la empresa, hay otros que son en común
por el financiamiento y el interés y otros
proyectos que son pura y exclusivamente
de la universidad o que todavía no tienen
ningún vínculo con ninguna empresa”.
Desde la propia experiencia los investi-
gadores afirman la importancia de un tra-
bajo interdisciplinario atendiendo deman-
das específicas de poblaciones cercanas a
la facultad y la incidencia de sus produccio-
nes en la calidad de vida de la comunidad:
“Me baso en que lo que haga pueda
aplicarlo a la sociedad, que pueda vol-
car mi experiencia. Y después depende
134 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
del acceso que uno tenga…yo trato que,
lo que investigo sea útil (...) un diagnós-
tico justamente se puede obtener relacio-
nándose con gente que esté en contacto
directo con el problema, uno ahí puede
ir sondeado cuáles son los inconvenien-
tes o problemas o futuras soluciones que
se pueden dar, trabajar en colaboración
con otra gente. (...) Entonces, a partir de
ahí uno tiene un panorama como para
poder brindar posible solución siempre
y cuando sea en el área de la disciplina
que uno maneje”.
No siempre la elección de los temas se
originan desde los intereses estrictamente
personales, en ocasiones son los directores
de programas y/o proyectos en desarrollo
quienes los convocan: “Muchas veces tiene
que ver más con el azar que con la elec-
ción individual, un día viene el director de un
proyecto, te comenta en lo que está traba-
jando, te invita a su proyecto y uno se pone
a trabajar”.
Las respuestas de los investigadores que
constituyeron la muestra de este proyecto
respecto a la vinculación de sus investiga-
ciones con los determinantes sociales de la
salud revelan diferentes criterios.
Hay quienes expresan: “esos son los
desafíos que me tocan como investigador”.
Otros manifiestan:
“Sí, de hecho nosotros promovemos
ese enfoque en el análisis y de hecho el
proyecto de investigación que tenemos
incluye un componente más cualitativo
de exploración de determinantes. (...) En
particular en mi trabajo sí, hemos tratado
de lograrlo, pero no siempre se logra, yo
creo que debe depender del tema tam-
bién, hay temas que son puertas adentro
de investigación básica y hay temas que
permiten una interrelación con los deter-
minantes sociales”.
Independientemente de la especificidad
y complejidad de los temas investigados,
se debería comenzar a considerar la nece-
sidad de relacionar la ciencia con las condi-
ciones de vida de las poblaciones. La Uni-
versidad registra un importante desarrollo
de acciones vinculadas a la participación
pública, claro ejemplo de esto es la exten-
sión universitaria.
“Las universidades tienen condiciones
para desarrollar algunas de las varias
metodologías existentes de diálogos
entre científicos y el público sobre temas
científico–tecnológicos polémicos. Estas
metodologías no sólo propician la parti-
cipación ciudadana en temas que afec-
tan decididamente nuestras condiciones
de vida, sino que también obligan a los
investigadores y docentes a adoptar una
actitud menos hermética y elitista y esfor-
zarse para explicar, de forma accesible al
público, cuestiones científicas comple-
jas…
Estaríamos, con ello, rescatando el papel
que históricamente ha tenido la Universi-
dad de ser un ámbito para la discusión
de los grandes problemas nacionales y
dotándolo de un carácter más amplio,
incluyendo a la sociedad civil como par-
ticipante y no sólo como espectadora…
De este modo, combinando excelencia
académica con relevancia social, la uni-
versidad estará contribuyendo decisi-
vamente a mejorar la calidad de vida y
a fortalecer la organización de diversos
Cantora, AM. • Investigación en ciencias de la salud
grupos de la sociedad civil (…) aumentar
la democracia en la toma de decisiones
sobre ciencia y tecnología puede empo-
derar no sólo la sociedad, sino también
a la ciencia, al crear vínculos más estre-
chos entre los objetivos de la investiga-
ción y los objetivos sociales” (10).
Conclusiones
La UNL, en el texto de su Plan de Desa-
rrollo Institucional 2010–2019 “Hacia una
Universidad del Centenario”, afirma:
“Las políticas de investigación orienta-
das al mejoramiento de la calidad de vida
permiten encontrar soluciones científi-
cas y tecnológicas que aporten bienestar,
democracia e igualdad y contribuyan al
desarrollo sustentable.
A partir de la comprensión de la natura-
leza social de la investigación se puede
lograr una mirada crítica, ética y reflexiva
sobre sus impactos políticos, sociales,
económicos y ambientales. Por ello pro-
fundizaremos políticas de investigación
sustentadas en criterios de compromiso
social y pertinencia” (7).
Esto nos obliga a revisar posiciones–
pautas de discusión en el mundo acadé-
mico; esclarecer imaginarios sociales que
sustentan nuestras praxis: prácticas que
juegan como ordenadoras de lo social, en
una dimensión cotidiana. Resulta un desa-
fío ético–político hacia otros pensar una
educación con “otra” búsqueda significa-
tiva; ejercicio cotidiano de otra forma, otra
gestión de poder en la construcción episté-
mica vinculante a educarnos.
Nos preguntamos:
135
¿Desde qué lugar confrontamos la reali-
dad?
¿Nos pensamos en la Universidad desde
la praxis “entre” docentes investigadores
que nos orienten en esa construcción crítica
de la subjetividad, dejándonos interpelar en
la problematización de y desde las proble-
máticas sociales acuciantes que nos inclu-
yen?
¿Nos planteamos el necesario trabajo
de reconstruir un espacio público, lugar
de diversidad donde se discuta la cuestión
social, el interés común?
¿Cómo/cuál es el ejercicio que permite
estos reconocimientos?
Acordamos con Noela Invernizzi, cuando
manifiesta que
“el contexto latinoamericano pone en evi-
dencia, por un lado, que la sociedad pre-
cisa incorporarse a la discusión de temas
candentes de ciencia y tecnología. Esta
es, sin dudas, una condición fundamental
del ejercicio de la ciudadanía en el mundo
de hoy. Por otro lado, es urgente fomen-
tar el desarrollo científico–tecnológico, así
como la difusión y adaptación de cono-
cimientos para responder a necesida-
des sociales específicas. Ambas cuestio-
nes pueden ser encaminadas a través de
mecanismos de participación pública en
ciencia y tecnología” (10).
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136 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
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una oportunidad para refundar el compromiso
social de la universidad pública. Revista CTS, I,
2: 79–80.
Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 137 a 177 137

Revisión

Péptidos antimicrobianos de organismos RECIBIDO: 13/10/2013

procariotas y eucariotas como agentes ACEPTADO: 25/10/2013

terapéuticos y conservantes de alimentos

Tonarelli, G.1 • Simonetta, A.2

1
Departamento Química Orgánica. Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral. Ciudad
Universitaria. Paraje El Pozo s/n. 3000, Santa Fe, Argentina. Telé-
fono: 0342–4575206 (int. 224).
2
Dpto. de Ingeniería en Alimentos. Facultad de Ingeniería Química
de la Universidad Nacional del Litoral. Teléfono: 0342–4571164 (int.
2541).
E–mail: asimonet@fiq.unl.edu.ar
tonareli@fbcb.unl.edu.ar

RESUMEN: El uso indiscriminado de los
antibióticos ha llevado a un rápido aumento
de la resistencia de los microorganismos
a estos compuestos convencionales y,
en consecuencia, existe la necesidad
de desarrollar nuevos fármacos.
Los péptidos antimicrobianos son
componentes evolutivamente conservados
de la respuesta inmune innata, y están
presentes en bacterias, plantas y animales
vertebrados e invertebrados, y son
considerados como una nueva fuente
natural de agentes terapéuticos.
Por otra parte, las bacteriocinas han
cobrado gran importancia debido
a las posibilidades de su empleo
en la biopreservación de alimentos,
reemplazando a los conservantes
químicos. Especial interés presentan
las generadas por bacterias ácido
lácticas, dado que tanto éstas como sus
productos metabólicos son seguros para
su incorporación a diferentes matrices
alimentarias.
En este artículo se presentan los aspectos
más relevantes sobre biodiversidad,
estructura y aplicaciones en tecnologías
de alimentos y en clínica médica de los
péptidos antimicrobianos, y se consideran
sus principales ventajas y desventajas.
Palabras clave: Péptidos antimicrobianos,
Bacteriocinas, Agentes terapéuticos,
Biopreservadores alimentarios.
SUMMARY: Antimicrobial peptides of
prokaryotic and eukaryotic organisms as
therapeutic agents and food preservatives
The widespread use of antibiotics has
led to a rapid increase in the resistance of
138 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
microorganisms to conventional antibiotics,
and therefore there is a need to develop
new drugs. Antimicrobial peptides are
evolutionarily conserved components
of the innate immune response and are
present in bacteria, plants, vertebrates and
invertebrates, and are considered as a new
natural source of therapeutic agents.
Moreover, bacteriocins have gained great
importance due to their potential use in
food biopreservation, replacing chemical
preservatives. Of particular interest are
Introducción
La Organización Mundial de la Salud
(OMS) considera que la resistencia anti-
microbiana es una de las amenazas más
importantes para la salud humana, la cual
surge por mutación del microorganismo
o adquisición de genes de resistencia. Un
alto porcentaje de infecciones hospitala-
rias se deben a bacterias muy resistentes,
como Staphylococcus aureus resistente a
la meticilina. El uso inadecuado de los anti-
bióticos crea condiciones favorables a la
aparición, propagación y persistencia de
microorganismos resistentes (Organización
Mundial de la Salud, http: //www.who.int/
mediacentre/factsheets/fs194). Esto eviden-
cia la necesidad de la búsqueda de nuevas
opciones que permitan sustituir a los anti-
bióticos convencionales.
Si bien se han desarrollado nuevas tec-
nologías para el descubrimiento de fárma-
cos, la naturaleza sigue siendo el punto de
partida más importante para el desarrollo
de nuevos agentes terapéuticos (1–3).
En particular, en el caso de los antimicro-
bianos sólo el 20% de los productos comer-
those generated by lactic acid bacteria,
since they and their metabolic products
are safe for incorporation into different food
matrices. In this article we present the most
relevant aspects of biodiversity, structure
and applications in food technology and
medical clinic of antimicrobial peptides, and
their main advantages and disadvantages
are considered.
Keywords: Antimicrobial peptides,
Bacteriocins, Therapeutic agents, Food
Biopreservatives.
cializados son totalmente sintéticos, en
otras palabras no fueron inspirados en pro-
ductos naturales (4).
Los péptidos antimicrobianos (PAs) cons-
tituyen una característica universal de los sis-
temas de defensa de prácticamente todas
las formas de vida y se han encontrado en
diferentes organismos, desde bacterias,
plantas, aves, peces, insectos, anfibios y
mamíferos.
Estos compuestos contienen entre 12 y
50 aminoácidos, y no solamente destruyen
diferentes bacterias, sino también varios
hongos, parásitos y células cancerosas (5).
Son considerados importantes moléculas
efectoras del sistema inmune innato, el cual
es el principal mecanismo de defensa para
la mayoría de los organismos vivos durante
las etapas iniciales de una infección, y com-
plementan al altamente específico sistema
inmune adaptativo (6,7).
La expresión de los PAs puede ser cons-
titutiva o puede ser inducida en respuesta
a estímulos infecciosos y/o inflamatorios,
tales como bacterias o moléculas presentes
en esas bacterias que inducen la inmunidad
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
innata, como los lipopolisacáridos y las cito-
quinas proinflamatorias (8).
Como importantes moléculas efectoras
del sistema inmune innato son capaces de
aumentar la fagocitosis, estimular la libe-
ración de prostaglandinas, neutralizar los
efectos de los lipopolisacáricos (LPS) sép-
ticos, promover el reclutamiento y la acumu-
lación de diversas células inmunes en sitios
inflamatorios, promover la angiogénesis e
inducir la reparación de heridas (9–11).
Los PAs son polipéptidos codificados
por genes y sintetizados en los ribosomas,
algunos presentan aminoácidos modifica-
dos luego de la traducción. Esta definición
los distingue de algunos péptidos antibióti-
cos producidos por bacterias y hongos que
son sintetizados mediante vías metabólicas
específicas, y que generalmente incorporan
aminoácidos no naturales en sus secuen-
cias (12).
Poseen ciertas propiedades que los
hacen particularmente atractivos, tales
como su pequeño tamaño, rápida acción
y pocas posibilidades de desarrollar resis-
tencia. Por este motivo, las investigaciones
sobre los PAs se ha incrementado notable-
mente en los años recientes.
No obstante, solamente algunos pocos
PAs han sido aprobados por la FDA (Food
and Drug Administration, USA). Por tal
motivo, existe la necesidad de desarrollar
estrategias para identificar nuevos PAs que
podrían tener aplicaciones terapéuticas.
Pero además de los aspectos farmaco-
lógicos y terapéuticos hasta aquí explici-
tados, otro aspecto que ha sido tenido en
cuenta en las últimas décadas es el relativo
a la biopreservación alimentaria, o sea, la
sustitución total o parcial de los conservan-
tes químicos usados tradicionalmente por
compuestos antimicrobianos de origen bio-
139
lógico, a fin de lograr alimentos que sean
percibidos como más “naturales”.
Desde este punto de vista han cobrado
gran interés unos PAs en particular, los pro-
ducidos por bacterias y conocidos como
bacteriocinas. Éstas se definen como pép-
tidos bioactivos, simples o complejos, sin-
tetizados ribosomalmente y que ejercen
su acción de modo extracelular, inhibiendo
típicamente el crecimiento de bacterias
próximas desde el punto de vista taxonó-
mico (aunque esta característica descripta
originalmente no siempre es tan estricta)
(13–17). Entre las muchas bacteriocinas
caracterizadas, la atención se ha centrado
especialmente en las producidas por las
bacterias del ácido láctico, en función del
status de GRAS (generalmente reconocidas
como seguras para su incorporación en ali-
mentos de consumo humano) otorgado a
este amplio grupo bacteriano por la Organi-
zación Mundial de la Salud.
Algunas de estas sustancias han demos-
trado poseer un amplio espectro de acción
antibacteriana, incluyendo a especies altera-
doras de los alimentos o causantes de enfer-
medades de transmisión alimentaria, tales
como Staphylococcus aureus, Listeria mono-
cytogenes, Escherichia coli, Salmonella, Shi-
gella, Vibrio cholerae, Pseudomonas, Bacillus
cereus, Bacillus megaterium, Bacillus sub-
tilis, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium
sporogenes, etc. (15,18–20). Hoy se puede
afirmar que en todos los géneros que cons-
tituyen el núcleo central del gran grupo bac-
teriano designado bajo el nombre de bacte-
rias ácido lácticas, tales como Lactococcus,
Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Carnobacterium, Enterococcus y Pediococ-
cus, se han detectado cepas productoras de
algunas de las muchas bacteriocinas carac-
terizadas hasta el presente (15–17, 20,21).
140 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Sin embargo, en la actualidad solamente
nisina, una bacteriocina producida por
cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis,
ha sido aceptada como segura para uso
alimentario por la FAO/WHO, y más tarde
agregada a la lista europea de aditivos ali-
mentarios y también aprobada para uso ali-
mentario por la FDA.
Dada la relevancia que han tenido las
investigaciones sobre los PAs en las dos
últimas décadas, en este artículo se presen-
tan, entre otros, aspectos básicos de la quí-
mica y estructura de estas moléculas, cono-
cimientos que son necesarios para poder
interpretar sus mecanismos de acción.
Fuentes naturales
Desde que los primeros PAs, tales como
cecropinas (22), PGLa (23) y magaininas
(24) fueron identificados en insectos y anfi-
bios en la década del 80, hasta la actua-
lidad, se han identificado más de 1200
secuencias de péptidos antimicrobianos
procedentes de diferentes fuentes natura-
les, de acuerdo a datos reportados en la
base de datos “Antimicrobial Peptide Data-
base” (http://aps.unmc.edu/AP/main.php)
de la Universidad de Nebraska Medical
Center, en Omaha (USA).
En los vertebrados los PAs se localizan
en sitios donde comúnmente se encuen-
tran los agentes patógenos, tales como
las superficies mucosas y la piel, así como
dentro de los gránulos de las células inmu-
nes (11).
Considerando a las bacterias como fuen-
tes naturales de PAs, las primeras bacte-
riocinas fueron descubiertas en 1925, y las
producidas por bacterias ácido lácticas
comenzaron a estudiarse en 1928 (25). Sin
embargo, el mayor interés científico–tecno-
lógico por ellas data de la década del 70,
incrementándose notablemente desde los
90 hasta hoy, por su valor potencial como
biopreservadores alimentarios. La bac-
teriocina descubierta en 1928 era nisina,
que sigue siendo la única aceptada como
segura para uso alimentario.
En las últimas décadas se han descrito
cientos de bacteriocinas producidas por
cepas de distintas especies y subespecies
de bacterias ácido lácticas, y se han carac-
terizado algunas de ellas, que son las que
resultaron más promisorias desde el punto
de vista tecnológico alimentario. Entre éstas
se encuentra, por ejemplo, pediocina PA1,
que se comercializa en forma de fermenta-
dos que la contienen y que, como tales, se
usan en industrias de alimentos con fines
de biopreservación (16,17, 26). Al no tra-
tarse de compuestos puros sino de fermen-
tados, no son considerados como aditivos
alimentarios y por lo tanto no necesitan la
autorización para su empleo de los organis-
mos nacionales o internacionales de control
alimentario.
Clasificación de los PAs en función de
la composición en aminoácidos
• Péptidos aniónicos: representan una
parte importante del sistema inmune de ver-
tebrados, invertebrados y plantas. Son acti-
vos contra bacterias, hongos, virus y plagas
como los insectos. La carga neta varía entre
–1 y –7, contienen entre 5 y 70 aminoáci-
dos, y en varios de ellos aparecen modifica-
ciones postraduccionales que parecen ser
esenciales para la actividad antimicrobiana.
Contienen ácido glutámico (Glu) y aspártico
(Asp) y han sido aislados de ovinos, bovi-
nos y humanos.
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
La estructura de algunos péptidos anió-
nicos aislados de anfibios es helicoidal y
lineal, mientras que otros aislados de plan-
tas son cíclicos, y con varios residuos de
cisteína. Algunos parecen utilizar iones
metálicos para formar puentes salinos
catiónicos con los componentes cargados
negativamente de las membranas micro-
bianas. No obstante, en muchos casos el
mecanismo de acción de estos péptidos no
es claro o no ha sido dilucidado (27).
• Péptidos catiónicos: la mayoría de los
péptidos antimicrobianos son catiónicos. La
carga neta varía entre +2 y +9, poseen en
general un alto número de residuos de lisina
(Lys), arginina (Arg) y /o histidina (His) y
pocos o ningún residuo acídico, tales como
Glu o Asp. Los residuos hidrofóbicos como
triptófano (Trp), fenilalanina (Phe), leucina
(Leu), valina (Val) y otros representan entre
el 30–50 % del total de la secuencia del
péptido y desempeñan un rol fundamental
permitiendo la formación de una estructura
anfipática, cuando interaccionan con las
membranas.
Un análisis de la composición de pép-
tidos antimicrobianos aislados de bacte-
rias, plantas, insectos y anfibios anuros ha
demostrado que existen aminoácidos que
aparecen con mayor frecuencia. De este
modo, alanina (Ala) y glicina (Gly) son los
más abundantes en péptidos de origen
bacteriano, cisteína (Cys) y Gly son más
comunes en péptidos de plantas, Ala, Gly y
Lys se encuentran frecuentemente en pép-
tidos de insecto, y Leu, Ala, Gly y Lys apa-
recen en mayor proporción en péptidos de
anfibios. En contraste, metionina (Met) apa-
rece raramente (<1,5 %) y Lys aparece en
mayor proporción que Arg (28). Esta dis-
tribución de aminoácidos aporta también
141
información estructural, ya que la abundan-
cia de Cys en péptidos de plantas sugiere
que los puentes disulfuro son comunes, y
los residuos que predominan en los pép-
tidos de anfibios anuros se correlacionan
con la tendencia de estos polipéptidos de
adoptar estructuras α–helicoidales.
• Péptidos con alto contenido en aminoá-
cidos específicos:
Péptidos enriquecidos en prolina: poseen
un alto contenido en prolina (Pro), con resi-
duos como Arg que los hacen catiónicos y
actúan sin producir cambios extensos en la
membrana, y son activos particularmente
hacia bacterias Gram (–).
Por el hecho de haberse demostrado
que penetran en las células bacteria-
nas mediante translocación a través de la
misma, es que se estima que actúan inhi-
biendo un blanco intracelular específico,
más que produciendo la disrupción de la
membrana.
La catelicidina Bac7 es un péptido anti-
bacteriano rico en Pro, que fue aislado de
los neutrófilos bovinos, exhibe una fuerte
actividad inhibitoria frente a bacterias Gram
(–), neutraliza endotoxinas y no es tóxico
hacia células de mamíferos, aún en altas
concentraciones. Diferentes estudios han
sugerido que el modo de acción depende
de la concentración, ya que a bajas con-
centraciones Bac7 inactiva las bacterias
por un mecanismo no lítico, siendo incorpo-
rada dentro de la célula donde se une a un
blanco intracelular, mientras que a elevadas
concentraciones tiene un mecanismo mem-
branolítico. Péptidos relacionados incluyen
Bac 5 y PR–39, aislados de neutrófilos bovi-
nos y porcinos, respectivamente, y otros
aislados de oveja y cabra (29, 30).
142 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Ejemplos de péptidos antimicrobianos
enriquecidos en prolina procedentes de
insectos incluyen apidaecina aislada de
líquido linfático de abejas (Apis mellifera)
infectadas con bacterias, drosocina aislada
de Drosophila melanogaster y pirrocoricina
aislada del insecto hemíptero Pyrrhocoris
apterus. Las investigaciones sugieren que
estos péptidos actúan inhibiendo procesos
metabólicos tales como la síntesis de pro-
teínas o el plegamiento de proteínas asis-
tido por chaperonas (31–35).
• Péptidos enriquecidos en triptófano y
arginina: constituyen una subclase impor-
tante de péptidos antimicrobianos. El trip-
tófano (Trp) tiene preferencia por la región
de la interfase de las bicapas lipídicas y
arginina (Arg) es catiónico y puede formar
puentes de hidrógeno necesarios para inte-
ractuar con los fosfolípidos aniónicos, com-
ponentes abundantes de las membranas
bacterianas. En combinación, estos dos
aminoácidos participan de interacciones
catión–π, lo cual favorece las interacciones
con membranas.
Entre algunos ejemplos se encuen-
tra indolicidina, un péptido rico en Trp, de
tamaño pequeño (13 residuos aminoací-
dicos) y que está amidado en el extremo
C– terminal. Contiene 39 % de Trp en su
secuencia. Se encuentra en los neutrófilos
bovinos (36).
Otros ejemplos de péptidos ricos en trip-
tófano incluyen tripticina aislada de gránu-
los de neutrófilos porcinos, y puroindolina
aislada del endosperma de trigo (37,38).
Péptidos enriquecidos en histidina: las
histatinas son un grupo de péptidos peque-
ños, ricos en histidina y secretados en la
saliva por las glándulas parótida y subman-
dibular–sublingual. Histatina 1 e histatina 3
son codificadas por genes distintos, mien-
tras que se cree que al menos otros 50 pép-
tidos de histatina que fueron aislados a par-
tir de la saliva surgen por un procesamiento
proteolítico postranslacional (39).
Las histatinas exhiben potente actividad
antifúngica contra especies de Candida y
Cryptococcus neoformans. Dentro de éstas
histatina 5 contiene 24 aminoácidos y es la
más activa frente a Candida albicans. Los
pacientes HIV–positivos tienen niveles con-
siderablemente menores de histatina 5, lo
cual sugiere que la expresión reducida de
estos péptidos de defensa del huésped
puede contribuir a una mayor predisposi-
ción de esta población a la candidiasis oral
(40, 41).
Clasificación de péptidos antimicrobia-
nos en base a la estructura
En esta sección se describen algunos
ejemplos de PAs lineales y cíclicos que pre-
sentan estructura secundaria tipo helicoi-
dal, lámina β o giro β (β turn), y que fueron
seleccionados por su relevancia. Ya se han
mostrado ejemplos de péptidos que no pre-
sentan estructura secundaria definida, y son
aquellos donde predominan aminoácidos
específicos tales como Arg, Pro y Trp. En
la Figura 1 se muestran ejemplos de pépti-
dos antimicrobianos con diferentes tipos de
estructura.
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota... 143

Figura 1. Clases estructurales de péptidos antimicrobianos

FALTA

A: Estructura de tipo horquilla beta de tanatina (código PDB: 8TFV), contiene un puente disulfuro entre C11 y C18;
B: Estructura extendida de indolicidina (código PDB: 1G8C); C: estructura tipo lámina β de defensina HNP-3 (código
PDB: 1dfn ). D: estructura helicoidal de magainina 2 (código PDB; 2lsa); E: estructura helicoidal de melitina (código
PDB: 2mlt). Las figuras fueron preparadas empleando los programas gráficos UCSF Chimera 1.5.3. y Pymol 1.10.

• Péptidos antimicrobianos α–helicoi- Las magaininas aisladas de las secrecio-

dales lineales
Un número muy relevante de péptidos
α–helicoidales lineales han sido aislados
de las glándulas granulares de la piel y de
la mucosa del estómago de varios anuros
(ranas y sapos). La caracterización estruc-
tural de los péptidos de anfibios anuros ha
mostrado que tienen entre 10 y 48 aminoá-
cidos, y una comparación de sus secuen-
cias revela la falta de dominios conservados
que estén asociados con la actividad bioló-
gica. Estudios de las secreciones de la piel
de anfibios anuros de Sudamérica y de Aus-
tralia, pertenecientes a la familia Hylidae, y
de América del Norte y Euroasia, pertene-
cientes a la familia Ranidae han probado
ser fuentes abundantes de PAs (42, 43).
nes de la piel del Xenopus laevis constituyen
el prototipo de los péptidos antimicrobianos
helicoidales de anfibios (44). En la Figura 2
se muestra la estructura de la región 4–17
de magainina–2, donde se puede observar
la naturaleza anfipática de la región helicoi-
dal. Desde este primer reporte, numerosos
péptidos α–helicoidales aislados de otros
anfibios han sido documentados, tales
como las bombininas, dermaseptinas, cae-
rinas, maculatinas, aureinas, temporinas,
etc. Las bombininas se encuentran en el
género Bombina, mientras que las derma-
septinas fueron aisladas de especies del
género Phyllomedusa (45, 46).
144 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Figura 2. Estructura anfipática de magainina-2

La figura 2A muestra la estructura de la región 4-17 de magainina-2 (K4FLHSAKKFGKAF16), donde se pueden

observar las caras hidrofílica e hidrofóbica de la α-hélice anfipática. Momento hidrofóbico (μM: 0,558). La estruc-
tura fue obtenida del pdb: 2lsa y la representación se realizó con el software Pymol versión 1.10. La figura 2B es una
representación de la misma región como rueda helicoidal, realizada por medio del servidor web Heliquest (heliquest.
ipmc.cnrs.fr/).
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
Los mamíferos producen catelicidinas,
las que se caracterizan por tener un domi-
nio N–terminal común y conservado (cate-
lina) y un dominio C–terminal antimicro-
biano variable que puede liberarse de la
proteína precursora luego de su ruptura
por proteinasas. Los humanos tienen sola-
mente un gen de catelicidina, mientras que
en otros mamíferos se han encontrado múl-
tiples genes de catelicidina, tales como en
los cerdos que producen PR–39 y protegri-
nas, y en los bovinos y otros rumiantes que
producen indolicinas y bactenecinas (47).
LL–37 es la parte C–terminal de la única
catelicidina humana identificada hasta el
momento, y se la conoce como proteína
antimicrobiana catiónica humana (hCAP18),
la cual es expresada principalmente por los
neutrófilos y las células epiteliales. Es una
molécula multifuncional que puede mediar
varias respuestas del huésped, incluyendo
acción bactericida, quimiotaxis, angiogé-
nesis, favorecimiento de la cicatrización de
heridas epiteliales y activación de la secre-
ción de quimiocinas. Se considera que
hCAP18/LL–37 es un componente impor-
tante en la respuesta inmune antimico-
bacteriana (48). La estructura de LL–37 en
micelas de dodecilsulfato de sodio (SDS)
consiste en una hélice anfipática curvada
que se extiende entre los residuos 2–31,
seguida de una región C–terminal desorde-
nada (49).
Un pentadecapéptido interno (residuos
98–112) de la lisozima de huevo de gallina
que se obtiene después de la digestión con
clostripaína posee un amplio espectro de
actividad antimicrobiana in vitro. De interés
particular es el hecho de que el pentadeca-
péptido tiene un motivo estructural del tipo
hélice–loop–hélice (HLH) (residuos 88–114
145
y 87–115 de la lisozima de gallina y humana,
respectivamente) situado en el labio supe-
rior de la hendidura del sitio activo de la
molécula. Las estructuras tipo horquilla de
hélices, tales como las observadas en las
lisozimas se encuentran comúnmente en
las proteínas bactericidas y citolíticas for-
madoras de poros (50).
• Péptidos antimicrobianos con estruc-
tura cíclica
Los péptidos que contienen residuos de
cisteína pueden formar puentes disulfuro
intramoleculares dando lugar a molécu-
las cíclicas. En la mayoría de los casos la
conformación que adoptan estas moléculas
está relacionada con la actividad biológica
específica.
Estructuras con un puente disulfuro
Entre los PAs que contienen sólo un
puente disulfuro se encuentra la bactene-
cina, péptido catiónico que contiene 12
aminoácidos y que fue aislado de los neu-
trófilos bovinos. Estudios conformacionales
han demostrado que bactenecina presenta
una estructura β–turn tipo I, mientras que su
forma reducida y lineal adopta diferentes
conformaciones, de acuerdo con la lipofili-
cidad del ambiente en que se estudia. Este
péptido en su forma cíclica es más activo
contra bacterias Gram (–) como Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella
typhimurium que la forma lineal, reducida.
Pero los péptidos lineales muestran activi-
dad hacia bacterias Gram (+) como Sta-
phylococcus epidermidis y Enterococcus
faecalis (51).
Numerosos péptidos aislados de la piel
de especies de anfibios del género Rana
146 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
presentan un loop cíclico sobre el extremo
C–terminal, formado por 6 ó 7 aminoácidos
(conocido como Rana Box). No obstante,
el rol de este motivo estructural altamente
conservado no se conoce exactamente.
Tanto para ranalexina (52) como para gau-
regina 4 (53) el puente disulfuro no es crí-
tico para inducir la actividad formadora de
poros, mientras que para gauregina 5 (54)
el puente disulfuro es relevante para su acti-
vidad. En cambio para esculentina–1b, que
presenta también un loop cíclico similar
(CKIKGEC), se ha determinado que la acti-
vidad se centra en el fragmento 1–18, de
naturaleza catiónica y alfa–helicoidal (55).
Entre los péptidos antimicrobianos con
estructura β que son fragmentos de pro-
teínas se destaca la lactoferricina bovina
(LfcinB). Este péptido se libera por digestión
con pepsina a partir de la lactoferrina, una
glicoproteína de 80 kDa que se une al hierro
y que tiene funciones inmunológicas impor-
tantes. Lfcin contiene 25 aminoácidos y un
puente disulfuro. La estructura de LfcinB
fue determinada por RMN demostrándose
que consiste en una lámina β antiparalela
(56). Posee actividad antibacteriana y anti-
fúngica, y además actividad antiviral y anti-
tumoral. Estudios realizados con análogos
de LfcinB han evidenciado que los residuos
de Arg, conjuntamente con los de Trp son
esenciales para la actividad, mientras que
el puente disulfuro no resulta indispensable
para su actividad antimicrobiana (57,58). El
centro activo de LfcinB es un hexapéptido
que cubre la región 4 a 9. Este péptido tiene
actividad antimicrobiana similar al péptido
de 25 residuos aminoacídicos (59).
Estructuras con varios puentes disul-
furo
Las defensinas se han identificado en
mamíferos, incluyendo humanos. Contienen
entre 29 y 34 aminoácidos, son catiónicos y
abundantes en los epitelios y en los gránu-
los de las células fagocitarias. Poseen una
estructura de lámina β y están estabiliza-
das por tres puentes disulfuro intramolecu-
lares altamente conservados. De acuerdo a
la organización de los tres puentes disulfuro
se las divide en α y β–defensinas. Las α–
defensinas son producidas principalmente
por los granulocitos neutrófilos y las célu-
las de Paneth en el tracto intestinal (HNPs,
péptidos de neutrófilos humanos). HNP–1,
HNP–2 y HNP–3 son altamente homólogas
y difieren solamente en el residuo N–termi-
nal. Por otra parte, las β–defensinas son
producidas particularmente por los tejidos
epiteliales, tales como la piel, y las mucosas
de los tractos respiratorios, gastrointestinal
y urogenital (hBDs, β–defensinas humanas)
(60, 61).
En la Tabla 1 se presentan ejemplos de
péptidos antimicrobianos producidos por
bacterias y animales vertebrados e inverte-
brados, incluyendo las secuencias y el tipo
de estructura secundaria predominante.
 Características
Identificación Secuencia Origen
estructurales
KYYGNGVHCGKHSCTVDWGTAIGNIGNNAAANWATGG-
Sakacina P bacterias ácido lácticas α-helicoidal-lineal
NAGWNK
Cecropina A KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK mariposa de la seda α-helicoidal-lineal
Dermaseptina s1 ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ anfibio α-helicoidal-lineal
Magainina 1 GIGKFLHSAGKFGKAFVGWIMNS anfibio α-helicoidal-lineal
Magainina-2 GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS anfibio α-helicoidal-lineal

péptidos antimicrobianos
Buforina I AGRGKQGGKVRAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNY anfibio α-helicoidal-lineal
Buforina II TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK anfibio α-helicoidal-lineal
turn-cíclico, 1
Brevenina IE FLPLLAGLAANFLPKIFCKITRC anfibio
puente disulfuro
Melitina GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ insecto α-helicoidal-lineal

susceptibilidad a la degradación proteolítica.

extendida, rico en

PAs en fármacos son los altos costos de su

producción en gran escala, la toxicidad y la
Las mayores limitaciones para convertir
Especificidad y selectividad de los
Pirrocoricina VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN insecto
prolina
Tanatina GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM insecto loop-cíclico
cíclico, 1 puente
Bactenecina RLCRIVVIRVCR bovino
disulfuro
beta, cíclico, 2
Protegrina 1 RGGRLCYCRR RFCVCVGRX porcino
puentes S-S
fragmento de lacto-
Lactoferricina B FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF α-helicoidal
ferrina
Tabla 1. Ejemplos de péptidos antimicrobianos aislados de fuentes naturales

catelicidina LL37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES humano α-helicodal-lineal

extendida-rico
Indolicidina ILPWKWPWWPWRR bovino
en Trp
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...

α-defensina DCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC humano tres puentes S-S

PR-39 RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP porcino rico en Arg y Pro
histatina 5 DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY humano lineal, rico en His

tiene un efecto estabilizante sobre la bicapa

lípidos aniónicos y poseen colesterol, que
147

generalmente contienen menor cantidad de

las membranas de las células de mamíferos
quecidas en lípidos aniónicos, mientras que
Las membranas microbianas están enri-
148 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
lipídica, lo que podría explicar la selectivi-
dad de los PAs hacia las células de mamífe-
ros, conjuntamente con otros factores.
Estudios realizados con péptidos heli-
coidales modelos han demostrado que un
incremento en la cationicidad promueve la
actividad antimicrobiana mientras que un
aumento en la hidrofobicidad, helicidad y
anfipaticidad favorece la actividad hemo-
lítica y la pérdida de selectividad hacia las
membranas de los microorganismos (62).
Mecanismo de acción
• Interacción con membranas
A pesar de las diferencias estructura-
les, muchos PAs comparten ciertas carac-
terísticas en sus secuencias, como tener
carga neta positiva y aproximadamente un
50 % de aminoácidos hidrofóbicos, lo cual
les permite plegarse en conformaciones
anfipáticas luego de interaccionar con las
membranas bacterianas (ver Figura 2).
La interacción y la permeabilización de
las membranas de los microorganismos es
un hecho común a un gran número de pép-
tidos antimicrobianos. Dado que esta inte-
racción no implica la unión a un receptor
específico, los PAs son comúnmente acti-
vos contra microorganismos resistentes a
los antibióticos convencionales, debido a
su diferente modo de acción.
Actualmente existen varios modelos que
permiten explicar el mecanismo de acción
de los péptidos antimicrobianos. En este
artículo solamente haremos mención a los
más conocidos (ver Figura 3). En el modelo
de alfombra (carpet model) los péptidos
actúan en forma similar a un detergente,
cubriendo la superficie de la célula hasta
que se alcanza una concentración umbral
que lleva a la disrupción de la membrana,
como consecuencia de cambios en la flui-
dez por el desplazamiento de los fosfolí-
pidos. Se ha demostrado que este meca-
nismo aparece en PAs helicoidales que
son selectivos hacia las membranas de los
microorganismos (63, 64). Algunas bacte-
riocinas helicoidales actúan por este meca-
nismo, tales como Pln149a, producida por
una cepa de Lactobacillus plantarum (65).
El segundo mecanismo es el modelo de
duela de barril (barrel–stave) donde las héli-
ces anfipáticas se agrupan y agregan for-
mando poros de transmembrana con los
residuos hidrofílicos mirando hacia la luz del
poro, mientras que las superficies hidrofó-
bicas interaccionan con las cadenas hidro-
carbonadas de los fosfolípidos. De este
modo se forma un canal acuoso. Se ha
demostrado que las ceratotoxinas, pépti-
dos alfa–helicoidales y catiónicos aislados
de Ceratitis capitata (mosca de la fruta) y
el péptido Ctx–Ha aislado de Hypsiboas
albopunctatus, que presenta similitud en su
secuencia con las ceratotoxinas, actúan por
este mecanismo (66, 67). Se considera que
PAs helicoidales con propiedades citolíticas
frente a las membranas bacterianas y de
mamíferos actúan por este mecanismo (68).
En el modelo de poro toroidal (toroi-
dal pore), los péptidos se agregan sobre
la superficie de la membrana llevando a
que ésta se doble continuamente de modo
que las monocapas de lípidos involucra-
dos adquieren una curvatura positiva. A tra-
vés del poro tanto los péptidos insertados
como los grupos polares aniónicos de los
fosfolípidos se asocian (69). Se ha determi-
nado que las actividades de magainina–2 y
aureina–3,3 transcurren a través de la for-
mación de poros toroidales (70).
Por otra parte, muchos de los pépti-
dos con estructura tipo lámina–β, como
β–defensinas y protegrina, que están esta-
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota... 149

bilizados por puentes disulfuro y forman actividad antimicrobiana insertándose en la

estructuras relativamente rígidas, ejercen su bicapa lipídica formando poros toroidales.

Figura 3. Mecanismos de acción de péptidos que interaccionan con membranas

La fig.3 muestra los tres mecanismos de acción más comunes descriptos para péptidos que interaccionan con
membranas. (A) modelo duela de barrril; (B) modelo alfombra; (C) modelo poro toroidal. La figura fue adaptada del
trabajo publicado por Chan et al., 2006 (64). La parte en negro de los cilindros representa la región hidrofílica de los
péptidos y la parte en gris la región hidrofóbica.

• Acción sobre blancos intracelulares evaluados como péptidos que penetran

Además de la habilidad para interaccio-
nar con las membranas, existen evidencias
que indican que los péptidos antimicrobia-
nos pueden tener blancos intracelulares. En
este sentido, se pueden unir al ADN, al ARN
y a proteínas, inhibir la síntesis de la pared
celular, y la síntesis de los ácidos nucleicos
o de proteínas.
Se ha demostrado que muchos péptidos
con estructuras extendidas, enriquecidos
en aminoácidos específicos pueden pasar
a través de la membrana citoplasmática
sin alterarla. Varios péptidos lineales enri-
quecidos en arginina y/o prolina han sido
en las células (cell penetrating peptides,
CPP), resultando este hecho de gran interés
actual, por su relación con los sistemas de
liberación de fármacos. Los CPP más fre-
cuentemente usados son poliargininas, Tat,
penetratina y péptidos derivados de calcito-
nina, entre otros (71, 72).
Buforina I es un PA de 39 aminoácidos
que fue aislado del tejido estomacal del
Bufo bufo gargarizans. Se ha demostrado
que el mecanismo de acción de buforina
II, un péptido de 21 aminoácidos derivado
de buforina I consiste en inhibir las funcio-
nes celulares mediante su unión al ADN y
150 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
al ARN de las células, luego de penetrar las
membranas, lo cual resulta en una rápida
muerte celular. El mecanismo es diferente
al de magainina 2 a pesar de que poseen
estructuras helicoidales anfipáticas lineales
similares (73, 74).
Estudios peptidómicos para la identifi-
cación de péptidos antimicrobianos natu-
rales
Tal como ha sido comentado en párra-
fos anteriores, los péptidos antimicrobianos
han sido aislados de diversos organismos.
No obstante, estas moléculas generalmente
se encuentran en muy baja concentración,
dificultando los procedimientos de aisla-
miento e identificación.
Tradicionalmente, la secuencia de nue-
vos péptidos se ha determinado por el
método químico conocido como Degrada-
ción de Edman. El avance en nuevas tecno-
logías ha llevado a la incorporación de téc-
nicas de Espectrometría de Masas para el
secuenciamiento de péptidos.
El conocimiento de la secuencia de ami-
noácidos de los PAs permite realizar su sín-
tesis química y de este modo disponer de
suficiente cantidad de péptido para realizar
diferentes estudios. En analogía con la tec-
nología proteómica, donde todas las proteí-
nas expresadas en una célula o tejido son
analizadas, los estudios peptidómicos tie-
nen como objetivo la simultánea visualiza-
ción e identificación del peptidoma com-
pleto de una célula o tejido (75).
Estudios con membranas modelo
Debido a la complejidad estructural de
la membrana citoplasmática de las célu-
las reales, los estudios de las interacciones
péptido–membrana se realizan utilizando
sistemas modelos tales como liposomas
y micelas. Estudios espectroscópicos por
fluorescencia, dicroísmo circular y ensayos
colorimétricos realizados en sistemas mode-
los como los mencionados, permiten investi-
gar la contribución de parámetros fisicoquí-
micos y estructurales sobre las interacciones
péptido–membrana y sobre las actividades
biológicas de los péptidos (76, 77).
Recientemente hemos reportado un estu-
dio sobre la interacción de péptidos modifi-
cados de Pln149a, un análogo sintético de
la bacteriocina plantaricina 149, empleando
vesículas de PDA (polidiacetileno)–fos-
folípidos en un bioensayo colorimétrico.
Mediante estos ensayos se ha observado
una buena correlación entre los estudios de
interacción de estos péptidos con las vesí-
culas y los resultados de los ensayos bioló-
gicos, relativos a actividad antimicrobiana y
hemólisis de glóbulos rojos humanos (78).
Diseño de péptidos antimicrobianos y
de miméticos
Como candidatos a nuevos fármacos, los
PAs presentan algunas desventajas, ade-
más de su poca selectividad (comparada
con los antibióticos convencionales). Entre
estas desventajas se incluyen la reducida
actividad en presencia de sales y de catio-
nes divalentes (79), así como la susceptibi-
lidad a los cambios de pH, a las proteasas
y a otros componentes del plasma (80, 81).
En función de estas limitaciones, existe
una clara necesidad de desarrollar estrate-
gias alternativas, en particular para su uso
como agentes terapéuticos sistémicos.
El punto de partida para el desarrollo de
un nuevo fármaco generalmente es la iden-
tificación de péptidos naturales activos, y la
posterior modificación y optimización de las
secuencias. Comprender las relaciones que
existen entre la estructura y la actividad de
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
los PAs es esencial para el diseño y el desa-
rrollo de nuevos agentes antimicrobianos,
con mejores propiedades. Las actuales ten-
dencias se orientan al diseño de molécu-
las más pequeñas que contienen el farma-
cóforo antimicrobiano de los PAs naturales.
El objetivo es diseñar nuevas moléculas con
alta especificidad hacia las membranas de
las células procariotas, pero mínima toxici-
dad hacia las membranas de eucariotas.
El diseño de nuevas moléculas suele
incluir la aplicación de metodologías pro-
pias de la química combinatoria, mediante
la cual se pueden sintetizar cientos de molé-
culas a fin de evaluar, por ejemplo, el efecto
de la sustitución de aminoácidos sobre la
actividad antimicrobiana y/o la selectividad
hacia membranas (82).
Estas nuevas moléculas pueden con-
tener aminoácidos no naturales en sus
secuencias, tales como D–aminoácidos,
β–aminoácidos, N–metil–aminoácidos y
fluor–aminoácidos, o bien la estructura con-
formacional puede ser modificada por cicli-
zación, con el objetivo de mejorar la estabi-
lidad frente a las proteasas o la interacción
con las membranas de los microorganismos.
Los peptidomiméticos son secuen-
cias oligoméricas diseñadas para imitar
una estructura y/o función peptídica, cuyo
esqueleto no sólo se basa en α–aminoá-
cidos. Dentro de éstos, los peptoides son
poliglicinas N– sustituidas, que difieren de
los péptidos solamente en que las cade-
nas laterales del peptoide están unidas al
N amídico del esqueleto, en lugar de estarlo
a los carbonos α, lo que le otorga resisten-
cia a proteasas.
Se ha observado que peptoides mimé-
ticos de magainina–2 presentan estruc-
tura helicoidal anfipática y son selectivos y
potentes antibacterianos contra bacterias
151
Gram (+) y Gram (–) (83). Trabajos recien-
tes han evidenciado que ciertos peptoides
podrían ser usados para prevenir la forma-
ción de biofilms de Pseudomonas aerugi-
nosa (84).
Varios grupos han diseñados β–péptidos
construidos a partir de β–aminoácidos (con
un grupo metileno adicional en su estruc-
tura base, en relación a los α–aminoácidos)
los cuales mantienen la arquitectura anfi-
pática (85). Los β–péptidos y los peptoides
son significativamente resistentes a las pro-
teasas, lo cual les otorga importantes ven-
tajas respecto de los péptidos α–helicoida-
les. No obstante son relativamente difíciles
de sintetizar y más caros para producir en
grandes cantidades (86).
Los oligómeros de tipo arilamida son
otra clase de moléculas anfifílicas que fue-
ron diseñadas con la ayuda de simulacio-
nes por dinámica molecular, y que exhiben
un amplio espectro de actividad antimicro-
biana, con un mecanismo de acción que se
asemeja al de los péptidos antimicrobianos
nativos (87).
Los lipopéptidos son péptidos modifica-
dos por conjugación con ácidos grasos de
diferentes longitudes. Se ha reportado que
la unión de ácidos grasos a D,L–tetrapépti-
dos inertes por sí mismos, los transforma en
compuestos antimicrobianos muy potentes
hacia varios microorganismos, incluyendo
cepas resistentes a los antibióticos conven-
cionales (88).
Para mayor información sobre síntesis de
peptidomiméticos y aplicaciones se sugiere
consultar la bibliografía específica que se
cita (89–92).
Bacteriocinas
Las bacteriocinas han sido definidas
como péptidos bioactivos, simples o com-
152 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
plejos, sintetizados ribosomalmente y que
ejercen su acción de modo extracelular, inhi-
biendo típicamente el crecimiento de bac-
terias próximas desde el punto de vista
taxonómico. Sin embargo, estudios más
recientes han demostrado la existencia de
bacteriocinas que impiden la proliferación
de otras bacterias Gram (+) no relacionadas
estrechamente desde un punto de vista taxo-
nómico con la cepa productora (13–15, 18,
93–96), como así también de algunas espe-
cies de bacterias Gram (–) (13, 15–17, 20,
94, 95, 97–102).
Las primeras bacteriocinas descriptas
fueron las colicinas (1925), producidas por
cepas de Escherichia coli. Las producidas
por bacterias ácido lácticas comenzaron a
estudiarse en 1928 (25), pero el mayor inte-
rés científico–tecnológico por ellas data de
la década del 70, incrementándose notable-
mente desde los 90 hasta hoy, por su valor
potencial como biopreservadores alimen-
tarios. Esto es debido fundamentalmente
a que este grupo bacteriano ha recibido el
status de bacterias “seguras” o GRAS.
La bacteriocina descubierta en 1928 era
nisina, producida por cepas de Lactococ-
cus lactis subsp. lactis. En 1969 fue acep-
tada como segura para uso alimentario por
la FAO/WHO y más tarde fue agregada a la
lista europea de aditivos alimentarios, con
la denominación E324, y también aprobada
para uso alimentario por la FDA.
Como resultado del notable interés sus-
citado en el campo de la investigación cien-
tífico–tecnológica por este aspecto de las
bacterias lácticas, se han descrito cien-
tos de bacteriocinas producidas por cepas
seleccionadas de diversos orígenes (alimen-
tos fermentados, materias primas alimenta-
rias, medio ambiente, starters artesanales
y comerciales, intestinos de animales, etc.)
(13–15, 19, 20, 95, 97, 99, 103–115).
Como ejemplos más notables se pueden
citar nisina y lacticina 3147, ambas genera-
das por cepas del género Lactococcus; los
beneficios del uso de las cepas producto-
ras de estas dos bacteriocinas en la manu-
factura de quesos son destacados y han
sido muy bien documentados (116, 117).
De manera similar, pediocina PA1, produ-
cida por Pediococcus acidilactici, ha sido
utilizada en la elaboración de embutidos
secos fermentados (26), y muchas bacterio-
cinas producidas por Lactobacillus han sido
empleadas en la producción de embutidos y
de aceitunas fermentadas (118–120). Nisina
sigue siendo hasta hoy la única bacteriocina
aprobada para ser usada como biopreserva-
dor alimentario, a pesar de lo cual produc-
tos comerciales conteniendo pediocina PA1
y otros fermentados, son empleados actual-
mente por la industria alimentaria (16, 17).
Dado que algunas de estas sustancias
han demostrado poseer un amplio espectro
antibacteriano contra especies patógenas o
alterantes de alimentos, sumado a que son
generalmente inocuas para el consumidor,
pueden ser hidrolizadas en el tracto intesti-
nal humano, son resistentes al calentamiento,
activas a pH bajo, resistentes a la acción de
algunas enzimas y estables en los alimentos,
hace que las mismas presenten un gran inte-
rés para su utilización como “biopreservado-
res naturales” en la industria alimentaria. Ade-
más, se ha tenido especialmente en cuenta
el hecho de que, tanto las bacterias lácticas
como los productos de su metabolismo, han
sido consumidos desde tiempos inmemoria-
les a través de la ingesta de alimentos fer-
mentados, asociándoselos sólo muy rara-
mente a procesos patológicos (15, 18–20).
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota... 153

La producción de bacteriocinas por bac- Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus,

terias lácticas es un factor importante en la
acción inhibitoria frente a microorganismos
indeseables, ya sean alteradores o agentes
etiológicos de enfermedades. Las principa-
les bacteriocinas caracterizadas proceden-
tes de bacterias lácticas son producidas
por cepas pertenecientes a los géneros
Leuconostoc, Carnobacterium, Enterococ-
cus y Pediococcus.
En la Tabla 1 se detalla, a modo de ejem-
plo, un breve resumen de bacteriocinas
producidas por bacterias ácido lácticas,
caracterizadas e identificadas con nombres
propios.

Tabla 2. Breve listado de bacteriocinas producidas por cepas de bacterias ácido lácticas (extraído
de De Vuyst L.; Vandamme E., 1994) (15)

Microorganismo productor Bacteriocina

Cepas de Lactococcus lactis subsp.
lactis
Cepas de Lactococcus lactis subsp.
diacetylactis
Cepas de Lactococcus lactis subsp.
cremoris
Cepas de Lactobacillus acidophilus
Cepas de Lactobacillus brevis
Cepas de Lactobacillus casei
Cepa de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus
Cepas de Lactobacillus delbrueckii
subsp. lactis
Cepa de Lactobacillus fermentum
Cepa de Lactobacillus gasseri
Cepas de Lactobacillus helveticus
Cepas de Lactobacillus plantarum
Cepa de Lactobacillus reuteri
Cepas de Lactobacillus sake
Cepas de Carnobacterium piscicola
Cepas de Pediococcus acidilactici
Cepas de Pediococcus pentosaceus
Cepas de Leuconostoc mesenteroides
Cepa de Leuconostoc paramesente-
roides
Cepas de Streptococcus thermophilus
Cepas de Enterococcus faecalis
nisina A; nisina Z; lactostrepcina 1; lactostrepcinas 2 y 3; lac-
tostrepcina 4; Bac V, VI and VII; lacticina 481; dricina; lactococ-
cina DR
BacWM4; bacteriocina S50; lactocina 0
diplococcina; lactostrepcina 5; Bac I, II, III y IV;
lactococcina A; lactococcina A, B y M;
lactococcina G
lactocidina; acidophilina; acidolina; lactacina B;
lactacina F; bacteriocina M46; acidophilucina A;
acidocina 8912
lactobrevina; brevicina 37
caseicina 80; caseicina LHS
bulgaricana
lactobacillina; lacticina A; lacticina B
bacteriocina 466
gassericina A
lactocina 27; helveticina J; helveticina V-1829
lactolina; plantaricina SIK-83; plantacina B; plantaricina A;
plantacina BN; plantaricina S; plantaricina 406
reutericina 6
sakacina A; lactocina S; sakacina P
carnobacteriocina A, B1 y B2; piscicolina 61; carnocina UI49
pediocina AcH; pediocina PA-1; pediocina 1D; pediocina S1-1
pediocina A; pediocina N5p
mesenterocina 5; mesentericina Y105; mesenterocina 52
leuconocina S
bacteriocina STB40; bacteriocina STB78; bacteriocina St10;
thermofilina 13
bacteriocina Bc-48; enterocina 226NWC
154 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Clasificación de las bacteriocinas
Una de las clasificaciones más acepta-
das para las bacteriocinas es la que pro-
puso Klaenhammer en 1993 (121), quien
define cuatro clases diferentes de bacterio-
cinas de bacterias lácticas, las que se deta-
llan a continuación:
Clase I: lantibióticos, péptidos peque-
ños (menos de 5000 Da), como por ejemplo
nisina, lacticina 481 y lacticina S. Son ter-
moestables, con aminoácidos modificados,
de los cuales los más comunes son dehi-
droalanina (DHA) y dehidrobutirina (DHB),
originados por deshidratación postraduc-
cional de la serina y la treonina, respecti-
vamente. La condensación de los residuos
DHA y DHB con el grupo sulfhidrilo de las
cisteínas presentes en la molécula, origina
los aminoácidos lantionina y β–metil–lan-
tionina (122). Esta clase es, a su vez, sub-
dividida en lantibióticos tipo A y tipo B, de
acuerdo a sus estructuras químicas y a sus
propiedades antimicrobianas. Ejemplos
característicos de lantibióticos de tipo A son
nisina y lacticina S, y de lantibióticos de tipo
B, mersacidina y aconvenina (123).
Clase II: péptidos pequeños (menos de
10000 Da), termoestables, y sin aminoácidos
modificados en su estructura primaria. Se los
puede subdividir en cuatro subclases:
Subclase IIa: se caracterizan por ser par-
ticularmente activas frente al género Listeria.
Sus secuencias aminoacídicas muestran un
elevado grado de homología (38–55%), que
es mucho más pronunciado en la parte N–
terminal de los péptidos, la cual es altamente
hidrofílica y catiónica (124). Todos los miem-
bros de esta subclase comparten la secuen-
cia consenso N–terminal <Y–G–N–G–V–X–
C>. Esta subclase se conoce como “familia
pediocina”, en alusión a la bacteriocina más
estudiada de este grupo, la pediocina PA–1.
Subclase IIb: contiene bacteriocinas
cuya actividad requiere de la acción com-
plementaria de dos péptidos, como la lacto-
cocina G (125, 126).
Subclase IIc: incluye a las bacteriocinas
de la clase II que se transportan utilizando
un sistema sec–dependiente (por ejemplo,
enterocina P) (127).
Subclase IId: son las bacteriocinas de la
clase II que, como sucede con la lactocina
A, no se pueden clasificar en ninguno de los
subgrupos anteriores. Algunos autores han
sugerido la creación de otra subclase para
las bacteriocinas que requieren cisteínas
reducidas para su actividad, como la lacto-
cina B (128).
Clase III: proteínas termolábiles de peso
molecular superior a 30000 Da. (helveticina
J, helveticina V–1829, acidofilucina A, casei-
cina 80 y lactacinas A y B), que no poseen
aminoácidos modificados en su estructura
primaria. Estas bacteriocinas son las que
poseen un menor interés industrial en la
actualidad.
Clase IV: bacteriocinas de estructura
compleja (plantaricina S, leuconocina S,
lactocina 27 y pediocina SJ–1), que junto a
su estructura peptídica parecen presentar
un componente glucídico o lipídico esencial
para su actividad biológica. Sin embargo,
estas bacteriocinas complejas parecen
ser meros artefactos de laboratorio, ya
que cuando se purifican correctamente se
demuestra su naturaleza exclusivamente
peptídica (129).
No clasificables: grupo integrado por
aquellas que no se pueden clasificar en nin-
guna de las clases citadas, como por ejem-
plo la enterocina AS–48 (130), o las produci-
das por Enterococcus faecium L50 (131, 132).
En la actualidad, prácticamente sólo se
tienen en cuenta dos grupos de la clasifica-
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota... 155

ción original de Klaenhammer (1993) (121),
en los que se reúnen todas las bacterioci-
nas producidas por bacterias Gram (+): la
clase I, constituida por bacteriocinas con
modificación postranslacional; y la clase II,
integrada por bacteriocinas no modificadas
(133, 134).
Estructura de las bacteriocinas
Las bacteriocinas de la clase I y II (espe-
cialmente IIa) son las que han recibido mayor
atención científica debido, en parte, a que
son las de mayor interés industrial. En gene-
ral se trata de péptidos catiónicos y anfipá-
ticos compuestos por entre 12 y 45 ami-
noácidos. Sus moléculas no suelen estar
estructuradas en soluciones acuosas, pero
tienden a formar estructuras α–hélice cuando
se exponen a solventes como el trifluore-
tanol, o cuando se mezclan con membra-
nas compuestas por fosfolípidos aniónicos.
Algunas bacteriocinas poseen ciertas res-
tricciones estructurales debido a la presen-
cia de puente disulfuro (por ejemplo pedio-
cina PA–1) o anillos tioéter intramoleculares
(nisina). La estructura de diversos lantibióti-
cos ha sido elucidada mediante resonancia
magnética nuclear (123). La estructura tridi-
mensional de una bacteriocina de clase II, la
leucocina A, se ha determinado también por
este método (135).
Las bacteriocinas de la subclase IIa
poseen una carga positiva neta y sus
secuencias de aminoácidos oscilan desde
37 a 48 residuos. Todos los miembros de
esta subclase comparten la secuencia con-
senso N–terminal <Y–G–N–G–V–(x)–C(X)4–
c–(x)–v–(x)4–A>, donde X denota cualquier
aminoácido (136). Su dominio C–terminal
suele ser más variable, con características
hidrofóbicas o anfifílicas.
En las Figuras 1 y 2 se muestran, a modo
de ejemplos, la estructura primaria de la
nisina y la estructura tridimensional pro-
puesta para la pediocina en presencia de
micelas lipídicas.

Figura 4. Estructura primaria de la nisina

Ala-S-Ala representa al anillo de lantionina, Abu-S-Ala representa al anillo de β-metil-lantionina y los aminoácidos
deshidratados se indican como: Dha (dehidroalanina) y Dhb (dehidrobutirina) [extraído de Cotter et al., 2005 (133);
Cheigh et al., 2005 (219)].
156 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Figura 5. Estructura tridimensional de sakacina P en micelas lipídicas
La estructura fue determinada mediante espectroscopía RMN (extraído de Uteng et al., 2003) (220).
Biosíntesis de bacteriocinas
La mayoría de las bacteriocinas son sin-
tetizadas como prepéptidos biológicamente
inactivos que transportan un péptido señal
N–terminal, de entre 14 y 30 aminoácidos
(137), que está unido al propéptido C–ter-
minal. Para los lantibióticos, los residuos de
serina, treonina y cisteína en su propéptido,
experimentan modificaciones post–traduc-
cionales extensivas para formar lantionina
y metil–lantionina. La vía biosintética ocu-
rre según el siguiente esquema: formación
del prepéptido, reacciones de modificación,
clivaje proteolítico del péptido líder (puede
ocurrir antes, durante o luego de su expor-
tación de la célula) y translocación del pre-
péptido modificado o propéptido maduro a
través de la membrana citoplasmática.
Las bacteriocinas de clase II son sin-
tetizadas como prepéptidos que poseen
una secuencia señal N–terminal y un sitio
de procesamiento proteolítico doble gli-
cina característico, que se encuentra en el
extremo C–terminal del péptido señal (138,
139). Luego de la formación del prepéptido,
el péptido líder es removido concomitante-
mente a su exportación fuera de la célula a
través del transportador ABC dedicado y su
proteína accesoria (137, 140). Por otro lado,
las bacteriocinas de la clase IIc (acidocina
B, enterocina 31, divergicina A, enterocina
P), poseen una secuencia señal N–termi-
nal típica del tipo “sec”, y son procesadas
y secretadas a través de la vía secretoria
general (127,141–143).
Se han propuesto varias funciones que
ejercería el péptido líder. Éste serviría como
sitio de reconocimiento que dirige al pre-
péptido hacia su maduración y hacia las
proteínas de transporte; además, protege a
la cepa productora manteniendo a la bac-
teriocina en un estado inactivo e interac-
túa con el dominio propeptídico para ase-
gurar una adecuada conformación, la cual
es esencial para la interacción enzima–sus-
trato (144, 145).
Los determinantes genéticos de la biosín-
tesis de una bacteriocina se pueden locali-
zar a nivel plasmídico o cromosómico (146).
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota... 157

Además, pueden residir en transposones consta de tres componentes, como se

insertados de forma estable en el genóforo
de las células hospedadoras, como sucede
en el caso de la nisina (147).
La producción de muchos lantibióticos y
de algunas bacteriocinas de la clase II está
regulada transcripcionalmente mediante
un sistema de transducción de señal que
observa en los diagramas esquemáticos
representados en las Figuras 3 y 4:
* una proteína histidín–quinasa unida a la
membrana celular (HPK);
* un regulador de respuesta citoplasmá-
tico (RR);
* un péptido inductor (137,148, 149).

Figura 6. Diagrama esquemático de la biosíntesis de lantibióticos

(1) formación de la prebacteriocina; (2) la prebacteriocina es modificada por LanB y LanC, translocada a través
del transportador ABC dedicado LanT y procesado por LanP, resultando en la liberación de la bacteriocina madura;
(3) la proteína histidín-quinasa (HPK) sensa la presencia de la bacteriocina y se autofosforila; (4) el grupo fosforil es
subsecuentemente transferido al regulador de respuesta (RR); (5) RR activa la transcripción de los genes regulados; y
(6) inmunidad del productor mediada por proteínas de inmunidad, LanI, y proteínas del transportador ABC dedicado,
LanFEG (extraído de Chen y Hoover, 2003) (221).
158 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Figura 7. Diagrama esquemático de la biosíntesis de las bacteriocinas de clase II

(1) formación de la prebacteriocina y del prepéptido del factor de inducción (IF); (2) la prebacteriocina y el pre-
IF son procesados y translocados por el transportador ABC, desembocando en la liberación del IF y la bacteriocina
maduros; (3) la proteína histidín-quinasa (HPK) sensa la presencia del IF y se autofosforila; (4) el grupo fosforilo (P) es
transferido subsecuentemente al regulador de respuesta (RR); (5) RR activa la transcripción de los genes regulados;
y (6) inmunidad del productor (extraído de Chen y Hoover, 2003) (221).

Actualmente se sabe que una misma
cepa de origen natural puede producir más
de una bacteriocina, fenotipo que parece
relativamente común entre las bacterias
lácticas bacteriocinogénicas (137). En este
sentido, se han aislado diversas cepas
(Lactobacillus plantarum C11, Carnobacte-
rium piscicola LV17B, C. piscicola VI y Ente-
rococcus faecium T136), capaces de pro-
ducir más de una bacteriocina de la clase
II (150–153).
Mecanismo de acción de las bacterio-
cinas sobre las bacterias blanco
En general, la acción antimicrobiana de
las bacteriocinas se debe a la desestabili-
zación funcional de las membranas citopla-
máticas de las células sensibles o blanco.
Las bacteriocinas actúan sobre sus dianas
primarias, las membranas, a través de dife-
rentes mecanismos, que ya han sido descri-
tos en “Mecanismos de acción”.
Una alternativa a estos mecanismos ha
sido enunciada por Ramakrishnan et al.
en 2012 (154). Según estos investigado-
res puede darse un efecto sinérgico com-
binado entre lipasas y enterocinas pro-
ducidas por cepas de enterococos muy
lipolíticas, efecto que resulta letal frente a
bacterias Gram (–). Mediante estudios apli-
cando microscopía electrónica de barrido,
determinaron que las lipasas degradan
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
la capa externa de lipopolisacáridos de la
pared celular Gram (–), generando poros a
través de los cuales las enterocinas pueden
llegar hasta la membrana citoplasmática,
produciendo luego la muerte celular como
lo hacen frente a bacterias Gram (+).
Este mecanismo de acción explica los
resultados de muchas investigaciones que
han probado la eficacia bactericida de ente-
rocinas cuando actúan individualmente
contra bacterias Gram (–) tales como ente-
robacterias, V. cholerae, Pseudomonas, etc.
(94, 96, 98, 100, 102, 155, 156).
Propiedades bioquímicas de las bacte-
riocinas
• Tolerancia de las bacteriocinas al
calor, la acidez y las enzimas
Las bacteriocinas de bacterias lácticas
presentan una serie de propiedades bio-
químicas comunes, como lo son la sensi-
bilidad a la acción de enzimas proteolíticas
y la tolerancia a elevadas temperaturas y a
bajos valores de pH.
La termotolerancia de las bacteriocinas
de bacterias lácticas de mayor interés tec-
nológico es generalmente elevada (157–
161). La nisina purificada, por ejemplo, se
caracteriza por su elevada termoestabilidad
(100 ºC durante 10 minutos) a pH 2,0 (162).
Esta característica parece estar relacionada
con su estructura molecular, normalmente
compuesta por péptidos pequeños que no
presentan estructura terciaria.
Otras bacteriocinas, en su mayor parte
producidas por lactobacilos, son termolá-
biles; las mismas poseen un mayor peso
molecular y probablemente una estructura
molecular más compleja.
La termoestabilidad de las bacteriocinas
está íntimamente relacionada con el pH, y
se han descrito numerosas bacteriocinas
159
que son más termorresistentes a pH ácido
(131, 163, 164).
La termorresistencia generalizada de las
bacteriocinas permite que permanezcan
activas después de tratamientos térmicos
equivalentes a la pasteurización de la leche
(63ºC 30 min; 72ºC 15 s), lo que supone
una ventaja adicional para su utilización en
productos pasteurizados (97).
Las bacteriocinas de bacterias lácticas
son generalmente estables a pH ácido o
neutro (97, 156, 160, 161). La máxima solu-
bilidad y estabilidad de la nisina se logra
a pH 2,0, y se inactiva reversiblemente a
pH 7,0 (162). Sin embargo, la mayoría de
las bacteriocinas son activas en un amplio
rango de pH, generalmente entre 3,0 y 9,0
(165). También se ha descrito tolerancia a
valores de pH extremos, entre 1,0 y 2,0 y
entre 11,0 y 12,0 (108, 166).
Debido a su naturaleza proteica, todas
las bacteriocinas se inactivan por una o más
enzimas proteolíticas, incluyendo aquellas
de origen pancreático (tripsina y α–quimo-
tripsina), y algunas de origen gástrico (pep-
sina). Esta característica es bastante inte-
resante con respecto a la utilización de
bacteriocinas en productos alimentarios,
puesto que serían inactivadas durante su
paso por el tracto gastrointestinal, sin ser
absorbidas como compuestos activos y sin
causar los riesgos relacionados con el uso
de antibióticos (167).
La nisina puede ser inactivada por α–
quimotripsina (168), por pancreatina y por
determinadas enzimas específicas o nisina-
sas (169), pero no lo es por tripsina, pep-
sina, erepsina, elastasa y carboxipeptidasa
A (170).
Se han descrito otras bacteriocinas sen-
sibles a enzimas no proteolíticas, que se
inactivan por lipasas y α–amilasa (171–
160 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
173). Estas observaciones indican que la
zona activa de estas bacteriocinas presenta
una composición heterogénea (121).
Actualmente se acepta que la pronasa E y
la proteinasa K, proteasas de amplio espec-
tro, inhiben totalmente la actividad antimi-
crobiana de cualquier bacteriocina. Por ello
es que durante los ensayos de screening es
esencial su utilización para confirmar el ori-
gen proteico del inhibidor (20).
• Estabilidad
La estabilidad de las bacteriocinas dismi-
nuye a medida que aumenta su purificación
(174–176). La adición de sero–albúmina
bovina protege de la pérdida excesiva de
actividad experimentada por algunas bacte-
riocinas durante su purificación.
Influencia de factores exógenos en la
bacteriocinogénesis
La biosíntesis de bacteriocinas ocurre en
la fase logarítmica del desarrollo bacteriano
o al final de la misma, y en la mayoría de los
casos guarda relación con la biomasa pro-
ducida (97), si bien la producción máxima en
los medios de cultivo puede ocurrir en dife-
rentes fases del ciclo de crecimiento (13).
Algunos investigadores han señalado
que ciertos componentes específicos del
medio de cultivo interfieren sensiblemente
en la producción de alguna bacteriocina
individual. Así, varios trabajos indican la
necesidad de algunos nutrientes, como
extracto de levadura, aminoácidos, manga-
neso y manitol, para aumentar, disminuir o
suprimir la producción de diversas bacterio-
cinas (176–179).
Las variaciones de las condiciones de
cultivo, como por ejemplo temperatura,
tiempo y pH, ejercen un profundo efecto
en la producción de bacteriocinas activas.
Generalmente, se produce más bacterio-
cina cuando la cepa productora se cultiva
a su temperatura óptima de crecimiento y,
además, cuando el pH se mantiene cons-
tante (13). Aquellas condiciones que favo-
rezcan la alta densidad celular permitirán,
de igual modo, un aumento en el rendi-
miento de bacteriocina. Es por ello que la
utilización de fermentadores, especial-
mente del tipo batch y batch alimentado,
que admiten realizar controles constantes
de temperatura, pH y agregado de nutrien-
tes, conduce a la optimización de las condi-
ciones experimentales que posibilitan obte-
ner una máxima densidad celular y, por lo
tanto, un máximo título bacteriocinogénico.
El desarrollo de la cepa productora a tem-
peraturas elevadas puede suprimir comple-
tamente la producción de bacteriocina (176,
180), y algunas veces eliminar irreversible-
mente esta propiedad (180, 181). Schle-
gel y Slade (1973) (182) demostraron que
la producción de estreptocina es máxima
en la fase logarítmica, descendiendo algo
cuando el cultivo entra en la fase estacio-
naria. Por otro lado, Tagg et al. (1976) (13)
observaron que la producción de estrep-
tocina A se inicia al final de la fase logarít-
mica del desarrollo de la cepa productora,
y que dicha actividad disminuye lentamente
tras un período de incubación prolongado.
Otras investigaciones también han descrito
pérdidas sustanciales en la actividad de las
bacteriocinas de cultivos incubados durante
mucho tiempo. Este efecto puede deberse
a la existencia de inactivadores específicos
de las mismas, o bien a la digestión enzi-
mática o a la reabsorción de la bacteriocina
por la cepa productora, especialmente en
su membrana celular (13).
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
Aplicaciones de péptidos antimicrobia-
nos
• Potenciales aplicaciones terapéuticas
Las expectativas en las aplicaciones clí-
nicas de los PAs y miméticos radican en su
amplio espectro de actividad bactericida,
rápida acción y baja tendencia para desa-
rrollar resistencia.
Pueden ser usados como único antimi-
crobiano, en combinación con otros anti-
bióticos actuando en forma sinérgica, como
compuestos neutralizantes de endotoxinas
o como inmunomoduladores (5).
Aunque la potencia de los PAs contra los
organismos patógenos más susceptibles
normalmente es menor que la de los anti-
bióticos convencionales, una de las mayo-
res fortalezas de los PAs es su habilidad
para destruir bacterias multirresistentes, a
concentraciones similares.
El uso de péptidos actuando en forma
sinérgica con otros péptidos y antibióticos
convencionales podría contribuir a superar
algunas de las barreras que las bacterias
resistentes han creado contra los antibióti-
cos actuales.
En el caso de los pacientes con fibrosis
cística, más del 90% de las infecciones pul-
monares son ocasionadas por Pseudomo-
nas aeruginosa. Estudios in vivo utilizando
un modelo de infección pulmonar crónica
en rata, han demostrado que péptidos
pequeños inhiben el crecimiento de bacte-
rias como Staphylococcus aureus resistente
a la meticilina y Pseudomonas aeruginosa
multirresistente (183).
La producción de PAs y miméticos
en escala industrial se puede realizar
empleando técnicas de ADN recombinante
o síntesis química en solución y/o en fase
sólida. Sin embargo, su producción no es
aún económicamente competitiva, como lo
161
es la de la mayoría de los antibióticos con-
vencionales.
A continuación se presentan algunos
ejemplos de antimicrobianos peptídicos que
se están desarrollando, y los que reciente-
mente han sido aprobados por la FDA.
Empresas tales como Magainin Pharma-
ceuticals (http: www.genaera.com), Micro-
logix (Migenix, http: www.migenix.com) e
Intrabiotics (http: www.intrabiotics.com),
diseñaron PAs que difieren de los natura-
les en solamente pocos aminoácidos. Uno
de éstos fue pexiganan (MSI–78), un pép-
tido sintético derivado de magainina–2,
que es uno de los PAs mejor investigados
en términos de desarrollo de un fármaco,
y que originalmente fue aislado de la piel
del Xenopus laevis. Se emplea en el trata-
miento de infecciones de úlceras de pie dia-
bético, leves a moderadas, en forma tópica.
Estudios por RMN (Resonancia Magnética
Nuclear) revelaron que el péptido forma una
estructura helicoidal dimérica antiparalela
en micelas y bicapas, que sería la forma en
la que se inserta en la membrana (184).
A pesar de que los ensayos clínicos de
Fase III probaron que pexiganan fue efi-
ciente en la reparación de heridas, no fue
aprobado por la FDA.
Un péptido sintético correspondiente a la
región N–terminal de lactoferrina e identifi-
cado como hLF1–11(GRRRRSVQWCA), pre-
senta un amplio espectro de actividad que
incluye bacterias y hongos, siendo también
efectivo contra Staphylococcus aureus resis-
tente a la meticilina, cepas de Acinetobacter
baumannii multirresistentes y Candida albi-
cans resistente al fluconazol. La seguridad
y tolerabilidad de hLF1–11 fue probada en
voluntarios sanos y en receptores de tras-
plante de células madre hematopoyéticas,
con muy buenos resultados (185, 186).
162 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Este derivado de lactoferrina está siendo
desarrollado por la empresa AM–Pharma.
Un nuevo fármaco sintético derivado de
la indolicina bovina, conocido como Omi-
ganan (o MX–226) fue desarrollado por la
empresa Migenex para la prevención de la
contaminación de catéteres. En un estu-
dio completo de Fase III, MX–226 demostró
reducir en un 49 % las infecciones locales
de catéteres. Luego de extensivos estudios
se ha visto que Omiganan no induce resis-
tencia.
Plectasina (Novozymes Inc., http: www.
novozymes.com) es un nuevo PA con
potencial terapéutico, una defensina aislada
del hongo Pseudoplectania nigrella, que
actúa uniéndose al lípido II, precursor de la
pared celular bacteriana. Se lo produce en
forma recombinante y ha demostrado su uti-
lidad en modelos animales de peritonitis y
neumonía (187).
En lo referente a lipopéptidos, Daptomi-
cina (Cubicin ®) fue aprobada por la FDA en
el 2003, y se trata de un lipopéptido cíclico
y del primero en su tipo que se aplicó en la
clínica. Está indicado para el tratamiento de
infecciones de piel producidas por bacterias
Gram (+) resistentes a los antibióticos con-
vencionales, y para bacteriemia producida
por Staphylococcus aureus. Pertenece a la
familia de los péptidos naturales no riboso-
males, y es un producto de fermentación de
Streptomyces roseosporus (188).
Telavancina (Vibativ®) es un lipoglico-
péptido, derivado sintético de vancomicina.
Este fármaco fue aprobado por la FDA en el
año 2009 para el tratamiento de infecciones
de piel complicadas. En el corriente año se
aprobó su uso en pacientes hospitalizados
con neumonía bacteriana (189).
Oritavancina (The Medicines Company)
es también un lipoglicopéptido semisin-
tético que se encuentra en evaluación en
ensayos clínicos de Fase III para el trata-
miento de infecciones bacterianas de piel
producidas por Staphylococcus aureus
resistente a la meticilina (190).
Un aspecto muy novedoso y de reciente
aparición en la literatura especializada es el
uso de algunas bacteriocinas, específica-
mente los lantibióticos, como agentes tera-
péuticos.
Aproximadamente 50 lantibióticos se han
descrito desde 1928, año en que se descu-
brió el primero de ellos, la nisina. Los lanti-
bióticos son conocidos por ser agentes anti-
bióticos potentes, pero los intentos para
investigar su utilidad como agentes terapéu-
ticos han encontrado el inconveniente cau-
sado por la incapacidad de producir canti-
dades suficientes de cualquiera de estas
moléculas puras como para poder probar-
las en el tratamiento de enfermedades infec-
ciosas. Métodos de fermentación estándar,
tales como los utilizados para hacer una
variedad de otros antibióticos, por lo general
dan como resultado la producción de can-
tidades sólo mínimas de lantibióticos. En el
caso de la nisina, en que sí se logran obte-
ner cantidades relativamente importantes,
su estructura química única ha impedido
alcanzar la purificación necesaria requerida
para los ensayos clínicos.
MU1140 es un lantibiótico que ha demos-
trado actividad contra una amplia varie-
dad de enfermedades (típicas infecciones
intra–hospitalarias) causadas por bacterias
Gram (+), incluyendo a S. aureus metici-
lino–resistentes, enterococos vancomicina–
resistentes, Clostridium difficile, Mycobacte-
rium tuberculosis y también contra el ántrax.
La empresa Oragenics ha llevado a cabo
extensas pruebas preclínicas con MU1140,
que han demostrado un novedoso meca-
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
nismo de acción de la molécula. Con el fin
de poder producir cantidades suficientes
para los ensayos clínicos y para su poten-
cial comercialización, la empresa tiene la
intención de utilizar una versión sintética de
MU1140, conocida como MU1140–S (http://
www.oragenics.com/lantibiotics/mu1140).
Por otra parte, el lantibótico denominado
NAI–107, activo contra bacterias Gram (+)
tales como cepas de S. aureus resisten-
tes a la meticilina y cepas de enterococos
resistentes a la vancomicina, presenta una
rápida actividad bactericida in vitro. Pero
además de ello, actualmente ha sido con-
firmada su eficacia en varios modelos de
infecciones experimentales inducidas por
patógenos Gram (+) (191).
En 2011, la empresa Novacta Biosystems
comenzó ensayos clínicos en fase I con
voluntarios sanos, de un nuevo antibiótico
para tratar infecciones hospitalarias cau-
sadas por C. difficile. El nuevo compuesto,
denominado NVB302, ha resultado efectivo
contra todas las cepas ensayadas de esta
bacteria, sin causar efectos adversos sobre
la microbiota intestinal normal de los volun-
tarios. C. difficile causa infecciones intra-
hospitalarias que provocan diarreas graves
y que pueden ser potencialmente morta-
les, sobre todo para las personas mayores.
Pocos antibióticos actualmente disponibles
son eficaces contra la infección por C. diffi-
cile, y la resistencia a los mismos es una
amenaza cada vez mayor.
NVB302 se está probando actualmente
para determinar su seguridad y tolerabilidad
en voluntarios sanos. Es un lantibiótico de
tipo B, los que han mostrado un gran poten-
cial para el tratamiento de infecciones tales
como las causadas por C. difficile o por S.
aureus meticilino–resistentes. Sin embargo,
la química médica convencional no ha sido
163
aún capaz de optimizar la estructura de estos
compuestos de origen natural de modo de
alcanzar el potencial necesario para tratar
estas enfermedades a nivel humano.
Tecnologías patentadas por la empresa
Novacta han permitido la manipulación
estructural y la optimización de la actividad
antibiótica de los lantibióticos, para tratar de
alcanzar el máximo potencial de esta nove-
dosa clase de compuestos, aún sin explo-
rar (http://www.wellcome.ac.uk/News/2011/
News/WTVM053339.htm).
Aplicaciones de las bacteriocinas en
tecnologías alimentarias
El interés científico–tecnológico actual
por las bacteriocinas de bacterias lácticas
como bioconservantes alimentarios se debe
a tres características fundamentales: en pri-
mer lugar, y como ya se ha dicho, son sus-
tancias producidas por microorganismos
que gozan del status de GRAS; en segundo
lugar, a que debido a su naturaleza peptí-
dica son degradadas e inactivadas enzimá-
ticamente en el tracto digestivo, por lo que
no originan disbiosis intestinales ni trastor-
nos de tipo alérgico; y finalmente, a que la
mayor parte de las bacteriocinas de interés
industrial tienen un espectro antimicrobiano
bastante amplio y actúan sinérgicamente
con otros sistemas de conservación.
Esta última característica es particular-
mente relevante desde un punto de vista
práctico. Frecuentemente se ha observado
que la aplicación de bacteriocinas en siste-
mas alimentarios provoca reducciones típi-
cas de entre 1 y 4 ciclos logarítmicos en las
poblaciones de los microorganismos sen-
sibles (192, 193). Aunque estos niveles de
inhibición pueden considerarse inacepta-
bles como método de conservación único
o primario, resultarían muy útiles como fac-
164 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
tor de seguridad adicional en un sistema de
barreras (194). La acción sinérgica de las
bacteriocinas con otras barreras (tempera-
tura, atmósferas modificadas, NaCl, altas
presiones, nitratos, etc.), podría contribuir
tanto a la obtención de alimentos con una
calidad higiénica óptima, como a una reduc-
ción en las concentraciones de ciertos aditi-
vos químicos o en la intensidad de algunos
tratamientos tecnológicos (195–197).
La adopción de un sistema de barreras
es especialmente recomendable para evitar
la presencia en los alimentos de microor-
ganismos que, como Listeria monocytoge-
nes, son difíciles de erradicar por medio de
sistemas de conservación clásicos como la
acidificación o la refrigeración.
Nisina se comercializó por primera vez
en Inglaterra, en 1953, y actualmente es un
producto ampliamente disponible bajo el
nombre comercial de Nisaplin TM, produ-
cida por la empresa Danisco (Dinamarca),
así como bajo la forma de otras prepara-
ciones comerciales de menor difusión. Su
empleo está aceptado en más de 50 paí-
ses, existiendo notables diferencias en
cuanto a qué alimentos y en qué concentra-
ciones puede añadirse (198).
Si bien nisina sigue siendo la única bac-
teriocina aprobada para su uso como bio-
preservador alimentario, existen otros pro-
ductos como el denominado Alta 2341®
(Kerry Bioscience Carrigaline, Co. Cork,
Ireland), que contiene pediocina PA–1, y
otros fermentados que se comercializan
y se emplean en la industria alimentaria.
En Estados Unidos se ha aprobado el uso
como ingrediente alimentario de este fer-
mentado Alta 2341®, y a pesar de que la
presencia de la bacteriocina es el hecho
más remarcado publicitariamente, el pro-
ducto no está sujeto a las restricciones de
los aditivos alimentarios al comercializarse
en forma de fermentado.
Actualmente existen también algunas
patentes europeas y estadounidenses que
protegen el empleo de la pediocina PA–1
en productos lácteos (199) y cárnicos (200,
201).
Por otra parte, las empresas dedicadas a
la producción y distribución mundial de cul-
tivos iniciadores para la elaboración de ali-
mentos lácteos, cárnicos y vegetales fer-
mentados, ofrecen una amplia variedad de
estos fermentos que contienen cepas de
bacterias ácido lácticas capaces de produ-
cir diferentes bacteriocinas in situ durante el
proceso de fermentación. De igual modo,
se ofrecen fermentos adjuntos o secunda-
rios, constituidos por cepas de bacterias
lácticas que no participan del proceso fer-
mentativo de las materias primas alimenta-
rias, sino que sólo se encargan de produ-
cir distintas bacteriocinas in situ. También
existe en el mercado mundial la disponibi-
lidad de cultivos bioprotectores, los cuales
se utilizan para hacer tratamientos superfi-
ciales de alimentos no fermentados, y cuya
única función es la biopreservación de estos
alimentos por bacteriocinogénesis (17).
Formas de aplicación
Existen tres estrategias principales para
la aplicación de las bacteriocinas en la con-
servación de los alimentos (197, 202–205):
– Inoculación del alimento con la bacteria
láctica, la cual produce la bacteriocina in situ.
– Empleo de un medio previamente fer-
mentado con una cepa bacteriocinogénica
como ingrediente alimentario.
– Adición de la bacteriocina purificada o
semipurificada.
Tonarelli, G. y col. • Péptidos antimicrobianos de organismos procariotas y eucariota...
Tendencias actuales y futuras del
empleo de bacteriocinas en tecnolo-
gías alimentarias
Para eliminar o reducir los factores antes
expuestos, se aplican las estrategias que se
detallan a continuación:
Combinación de bacteriocinas
Se ha observado que una combinación
de sakacina A y nisina A inhibe el creci-
miento de L. monocytogenes de una forma
más intensa que cualquiera de las dos bac-
teriocinas por separado (204). De forma
similar, Hanlin et al. (1993) (206) demostra-
ron la mayor actividad de una combinación
de nisina A y pediocina PA–1 cuando se la
comparaba con ambas bacteriocinas por
separado. Mulet–Powell et al. (1998) (207)
también han demostrado el efecto sinérgico
de diversas combinaciones de bacterioci-
nas pertenecientes a clases distintas.
Ingeniería proteica y síntesis química
Con estrategias de ingeniería proteica se
puede introducir un gran número de modifi-
caciones en las moléculas de bacteriocinas
(208–210). Esto ha abierto la posibilidad de
producir variantes de bacteriocinas con pro-
piedades ventajosas, como una mayor acti-
vidad biológica, un mayor espectro de inhibi-
ción o una mejor estabilidad y/o solubilidad.
Alternativamente, y dado que la mayoría
de las bacteriocinas de las bacterias lácti-
cas son péptidos de pequeño tamaño, tam-
bién se pueden obtener variantes de bacte-
riocinas de composición conocida mediante
los procedimientos de síntesis química de
péptidos (211, 212).
Producción heteróloga
Se dedica mucha atención a la produc-
ción heteróloga de bacteriocinas de interés
165
tecnológico, por parte de bacterias lácticas
no bacteriocinogénicas pero bien adapta-
das al alimento en el que se desea aplicar.
Por ejemplo, los pediococos son microor-
ganismos normalmente asociados con pro-
ductos vegetales y cárnicos. Algunas cepas
de Pediococcus acidilactici producen
pediocina PA–1. Sin embargo, los pedio-
cocos están escasamente adaptados para
la colonización de alimentos en los que no
residen de forma natural (213). Por lo tanto,
no son los candidatos ideales para contro-
lar el crecimiento de L. monocytogenes en
leche y productos lácteos.
En este contexto, se han obtenido cepas
de Lactococcus lactis, un microorganismo
bien adaptado a los ambientes lácteos, que
producen pediocina PA–1 u otras bacterioci-
nas de la clase II (214–216). Adicionalmente,
se han desarrollado cepas de lactococos
capaces de producir heterólogamente nisina
A y pediocina PA–1 (217). Finalmente, tam-
bién se han desarrollado cepas de levaduras
que producen pediocina PA–1 (218). En este
caso, el objetivo es la inhibición de las bac-
terias lácticas alterantes del vino y de otras
bebidas alcohólicas obtenidas mediante
procesos fermentativos.
Conclusiones
Los péptidos antimicrobianos son molé-
culas estructuralmente diversas cuyas
características los ubican como una actual
y potencial alternativa para combatir infec-
ciones causadas por patógenos resistentes
a los antibióticos convencionales.
Por otra parte, algunos de ellos tales como
las bacteriocinas, representan una nueva
fuente de preservadores naturales a utilizar
en tecnologías alimentarias avanzadas.
166 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Agradecimientos
Las líneas de investigación en el área
péptidos antimicrobianos de los grupos
participantes han sido desarrolladas en
el marco de proyectos subsidiados por la
ANPCyT (PICT 2010, PICTO–CIN 2010) y
UNL (CAI+D 2009).
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Revista FABICIB • año 2012 • volumen 16 • PÁGS. 179 a 224
Resúmenes Tesis: Doctor en Ciencias Biológicas
Expresión de receptores de hormonas esteroides:
subtipos e isoformas, en la Enfermedad Quística Ovárica
Bovina
Natalia Soledad Alfaro
natoalfaro@hotmail.com
Director: Hugo H. Ortega.
Lugar de realización: Laboratorio, Cátedra
y/o Departamento: Laboratorio de Biolo-
gía Celular y Molecular Aplicada. Facultad:
Facultad de Ciencias Veterinarias.Universi-
dad: Universidad Nacional del Litoral. Fecha
de la defensa: 10 de octubre de 2012.
Resumen
La etiopatogenia de la enfermedad quís-
tica ovárica (COD del inglés: Cystic Ovarian
Disease) en el ganado bovino lechero es
un proceso complejo que involucra disfun-
ción en la foliculogénesis y en la ovulación,
y en el que intervienen muchos factores
tales como el estrés, manejo e infecciones.
Aunque se sabe que el desarrollo de esta
enfermedad está principalmente asociado
con una disfunción neuroendócrina a nivel
del eje hipotálamo–hipofisario–gonadal, en
la persistencia folicular también intervienen
factores intraováricos. El objetivo de la pre-
sente tesis fue examinar la localización y
expresión de receptores de las hormonas
gonadotróficas, de los receptores de hor-
monas esteroides y de las proteínas corre-
guladoras en las estructuras foliculares del
ovario de vacas con COD en comparación
con las estructuras de los ovarios de las
vacas controles. Se utilizaron muestras de
ovarios de distintas procedencias: mues-
tras obtenidas en la playa de faena de los
179
frigoríficos de la zona, animales en produc-
ción con desarrollo espontáneo de la enfer-
medad y animales sometidos a un modelo
experimental de inducción de COD por
medio de la administración de ACTH sinté-
tica. Las muestras obtenidas fueron proce-
sadas de acuerdo a las distintas técnicas
y a los fines de ser utilizadas para la eva-
luación de la expresión proteica del recep-
tor de andrógeno (RA) y de las proteínas
correguladoras: SRC–3 (del inglés: Steroid
Receptor Coactivator–3), REA (del inglés:
repressor of estrogen receptor activity) y
SMRT (del inglés: Silencing Mediator of
Retinoic acid and Thyroid hormone recep-
tors) mediante inmunohistoquímica; y para
la evaluación de la expresión del ARNm de
los receptores de hormonas gonadotró-
ficas: RLH y RFSH; de los receptores de
hormonas esteroides: estrógenos α (REα),
estrógenos β (REβ), progesterona (RP)
y RA; y de las proteínas correguladoras:
SRC–1, SRC–2, SRC–3 y LCoR (del inglés:
ligand–dependent nuclear–receptor core-
pressor) mediante RT–PCR de punto final.
Los hallazgos en este trabajo proporcionan
evidencia de que los ovarios de los anima-
les con COD inducida y espontánea mos-
traron una expresión alterada de los recep-
tores de gonadotrofinas y de los receptores
de esteroides en comparación con los ani-
males controles, así como cambios en la
expresión de las proteínas correguladoras.
Los resultados presentados en esta tesis
180 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
nos permiten llegar a las siguientes con-
clusiones: 1) los folículos quísticos espon-
táneos presentaron una baja expresión de
los receptores de las hormonas gonadotró-
ficas en las células de la granulosa, simi-
lar observación se halló en la expresión del
ARNm de los RLH en las células de la teca;
2) la inmunomarción del RA mostró varia-
ciones durante el desarrollo folicular normal,
hallándose patrones diferentes entre los folí-
culos ováricos de animales con enfermedad
quística ovárica en relación a los controles.
En cuanto a su ARNm, los folículos quísti-
cos espontáneos evidenciaron un aumento
significativo en las células de la granu-
losa; 3) los quistes foliculares provenientes
de frigorífico folículos quísticos mostraron
una mayor expresión del ARNm del REα y
una menor expresión del REβ en las célu-
las de la granulosa y de la teca; 4) en los
animales con COD espontánea se observó
un aumento significativo en la expresión de
los transcriptos que abarca las tres isofor-
mas del RP en las células de la teca y de
la isoforma B del en las células de la gra-
nulosa; 5) sabiendo que el ciclo estral nor-
mal es un proceso estrictamente regulado
por el eje hipotálamo–hipofisario–gonadal y
que las hormonas esteroides y gonadotrófi-
cas son esenciales para la función ovárica
de diversas especies, regulando el desarro-
llo, la diferenciación celular y la esteroido-
génesis cualquier cambio y/o alteración en
los mecanismos de transcripción y/o regu-
lación de los receptores de hormonas este-
roides y gonadotróficas podrían ser crucia-
les en la patogenia de esta enfermedad;
6) la expresión proteica y del ARNm de las
proteínas correguladoras fue observada en
las células de la granulosa y de la teca de
todas las categorías foliculares. La inmuno-
marcación de REA, SMRT y SRC–3 mostra-
ron diferencias entre animales controles y
animales con COD espontánea e inducida.
Un patrón diferencial del ARNm de SRC–1,
SRC–2 y SRC–3 fue demostrado en los folí-
culos quísticos espontáneos comparados
con los folículos antrales normales. No se
evidenciaron diferencias significativas en la
expresión del ARNm de LCoR entre grupos
controles y con COD espontánea; 7) las
diferencias halladas en la expresión de las
proteínas correguladoras entre las estructu-
ras foliculares normales y quísticas, consi-
derando que regulan la actividad transcrip-
cional de los receptores esteroides, podrían
provocar importantes alteraciones en la
dinámica folicular. En este sentido, podrían
intervenir en el desbalance proliferación/
apoptosis, así como en otras alteraciones
observadas en los ovarios de los animales
con la enfermedad.
Summary
Expression of Steroid Hormones Recep-
tors: Subtypes and isoforms in Bovine
Cystic Ovarian Disease
The etiopathogenia of cystic ovarian dis-
ease (COD) in dairy cattle is a complex pro-
cess that involves dysfunctions in folliculo-
genesis and ovulation, and many factors
such as stress, management and infec-
tious. The aim of the present study was to
examine the localization and expression of
steroid hormone receptors, gonadotrophic
hormone receptor, and transcription factors
that module steroid hormone receptor in
ovarian follicular structures from cows with
COD compared with ovarian structures from
control group. Samples of cows were used
and assigned to following groups: samples
from slaughterhouses; samples from cattle
with spontaneous COD; and animals sub-
Resúmenes tesis
jected to an experimental model of induction
of COD by synthetic ACTH administration.
The samples were processed to evaluate
the protein expression of androgen recep-
tor (AR) and coregulatory proteins: Steroid
Receptor Coactivator–3 (SRC–3), Repres-
sor of Estrogen receptor Activity (REA) and
Silencing Mediator of Retinoic acid and Thy-
roid hormone receptors (SMRT) by immuno-
histochemistry, and for evaluating the mRNA
expression of gonadotrophic hormone
receptor: LHR and FSHR; steroid hormone
Conservación y divergencia funcional entre miembros
de la familia de factores de transcripción HD–Zip.
Análisis molecular, evolutivo y de las redes de regulación
en las que participan
Agustín Lucas Arce
aarce@fbcb.unl.edu.ar
Director /codirector: Dra. Raquel L. Chan.
Lugar de realización: Instituto de Agrobio-
tecnología del Litoral (UNL–CONICET).
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Biotecnología del Litoral.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas. Universidad: Universidad
Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 28/03/2012.
Resumen
Las plantas poseen complejos mecanis-
mos de regulación encargados del control
preciso de la expresión génica. Los facto-
res de transcripción (FTs) son proteínas que
desempeñan una función esencial en estas
redes de regulación, uniendo el ADN en las
regiones promotoras de sus genes blanco
y alterando su transcripción. La familia de
de FTs HD–Zip está compuesta por proteí-
181
receptor: estrogen α (ER α), estrogen β (ER
β), progesterone (PR) and AR; and coreg-
ulatory proteins: SRC–1, SRC–2, SRC–3,
and Ligand–dependent nuclear–receptor
CoRepressor (LCoR) by conventional RT–
PCR. The findings of the current study pro-
vide evidence that ovaries from animals with
induced and spontaneous COD exhibited
altered steroid receptor and gonadotrophic
hormone receptor expression compared
with normal animals, as well as changes in
the expression of coregulatory proteins.
nas que unen el ADN a través del homeo-
dominio y dimerizan a través de un cierre de
leucinas. De las cuatro subfamilias en las
que es subdividida, la subfamilia I consiste
en proteínas sin otros dominios o motivos
descriptos, mientras que las proteínas de
la subfamilia II poseen un motivo de regula-
ción redox y una región conservada de fun-
ción desconocida.
Los FTs de la subfamilia I están involu-
crados en diversos procesos, muchos rela-
cionados a la fitohormona ácido abscísico
(ABA). Cuando han sido expresados bajo
la dirección del promotor fuerte y constitu-
tivo 35SCaMV generaron plantas transgéni-
cas con fenotipos diferentes. Sin embargo,
estas proteínas unen in vitro con máxima afi-
nidad la misma secuencia, CAATNATTG,
sugiriendo que habría regiones fuera del
dominio HD–Zip responsables de la diversi-
dad funcional.
182 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Esto motivó el análisis de las secuencias
de 178 proteínas de la subfamilia I de dife-
rentes especies. Una reconstrucción filo-
genética y una inspección de sus regiones
carboxilo terminales (RCTs) permitió definir
seis grupos monofiléticos con gran similitud
en estas regiones.
La búsqueda de motivos conservados
en las RCTs indicó la presencia de secuen-
cias específicas de cada grupo y de una
secuencia en la porción final con las carac-
terísticas del motivo AHA activador de la
transcripción. Además, las RCTs presenta-
ron sitios putativos de fosforilación y sumoi-
lación. Mediante ensayos de simple híbrido
en levaduras se demostró que el motivo
AHA del FT AtHB13 posee la capacidad de
transactivación.
Para investigar la funcionalidad in planta
de las RCTs, se expresó en A. thaliana una
proteína quimérica con el dominio HD–Zip
de la proteína HaHB4 y la RCT de HaHB1,
empleando el promotor 35SCaMV. Se eva-
luaron fenotipos característicos generados
por cada proteína salvaje: la insensibilidad
al etileno observada cuando se expresa
HaHB4 y el aserrado aumentado en hojas
generado por la expresión de HaHB1. Las
plantas que expresaban la proteína quimé-
rica presentaron un aumento significativo en
el aserrado de las hojas en una de las líneas
y su insensibilidad al etileno fue leve, seña-
lando que la identidad de la RCT tuvo un
efecto importante en el fenotipo generado
por la proteína.
Estos resultados permiten concluir que
los FTs HD–Zip I serían capaces de activar
la transcripción mediante el dominio AHA y
que sus RCTs serían regulados por fosforila-
ción y sumoilación. De esta forma, las regio-
nes fuera del dominio HD–Zip tendrían una
importante participación en la determina-
ción de las vías de señales en las que cada
FT de esta subfamilia es capaz de actuar.
Con el fin de estudiar estas vías de seña-
les se emplearon algoritmos de ingeniería
reversa de redes de regulación transcripcio-
nal. Se analizó la expresión de 9617 genes
en 269 ensayos de microarreglos de A. tha-
liana que involucraban diferentes tratamien-
tos de estrés abiótico, obteniéndose los
potenciales genes blanco de 25 proteínas
HD–Zip I y II.
El elemento CAATNATTG se buscó en los
promotores de estos conjuntos de genes
blanco, llamados módulos de actividad
transcripcional (MATs). Éste no se encon-
tró enriquecido sugiriendo que secuencias
similares serían reconocidas con suficiente
afinidad. Una búsqueda de novo de moti-
vos permitió hallar el elemento ABRE enri-
quecido en los promotores de genes de
los MAT. Este motivo es reconocido por FTs
involucrados en la respuesta a ABA.
Se investigó también qué proporción
de los genes de cada MAT poseía expre-
sión coordinada en las diferentes condicio-
nes de estrés. Considerando esta medición
como un indicador del grado de participa-
ción del FT en el tratamiento, se observó
que la mayoría de los FTs HD–Zip I y II tiene
una actividad importante en estrés por
calor, una función no asociada a estas pro-
teínas previamente.
Finalmente, se estudiaron las categorías
funcionales estadísticamente enriquecidas
en los genes de los MATs que. Varios de
los FTs se asociaron a funciones ya encon-
tradas por otros autores, así como a varias
categorías funcionales no descriptas que
podrían ser investigadas en el futuro.
En conclusión, la reconstrucción de una
red de regulación transcripcional posibilitó
la definición de genes blancos putativos de
Resúmenes tesis
las proteínas de las subfamilias I y II. Dife-
rentes análisis de estos conjuntos brindaron
un panorama global de las vías reguladas
por los FTs de ambas subfamilias, permi-
tiendo explorarlas desde una perspectiva
comparativa y funcional, lo que indicó la
existencia de similitudes y particularidades
en la actividad de estas proteínas.
Summary
Functional conservation and divergence
between members of the HD–Zip family of
trancription factors. A molecular, evolutive
and gene regulatory network analysis
The HD–Zip family of transcription fac-
tors (TFs) is composed of proteins that bind
DNA through a homeodomain and dimerize
through a leucine zipper. Subfamily I mem-
bers are mainly involved in ABA responses
and bind the same sequence with maximum
affinity. Nonetheless, they generate a variety
of phenotypes when expressed under the
35SCaMV promoter.
To study the source of this functional diver-
gence, a phylogenetic and functional analysis
was performed with 178 proteins, allowing the
identification of 6 clades with characteristic
C–terminal regions (CTRs) outside the HD–
Toxicidad y efectos fisiológicos del insecticida Endosulfán
en peces neotropicales
Carla Bacchetta
carlabacchetta@yahoo.com.ar
Director/codirectoras: María Julieta Parma /
Jimena Cazenave.
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Ictiología.
Facultad: Instituto Nacional de Limnología
183
Zip domain. These regions presented AHA
activation motifs and putative phosphoryla-
tion and sumoylation sites. Yeast–one hybrid
assays verified the activation capability of the
RCT of AtHB13. The overexpression in Ara-
bidopsis of chimerical proteins from HaHB1
and HaHB4 and their phenotypical analysis
showed that these regions are also functiona-
lly divergent in planta.
The reverse engineering of the transcrip-
tional regulatory networks in which HD–Zip I
and II TFs participate was also performed. A
dataset involving different abiotic treatments
in Arabidopsis was used and lists of puta-
tive targets were obtained for each TF,
called modules of transcriptional activity
(MTAs). The promoters of MTA genes pre-
sented ABRE elements, indicating a poten-
tial cross–talk with TFs from other families.
Coordinated expression of MTA genes was
observed under heat stress, suggesting a
previously unknown participation of HD–Zip
TFs in this stress. The functional characte-
rization of MTA genes revealed previously
associated and new categories.
This work improves our knowledge on
the mechanism of action of HD–Zip TFs
and generates new hypothesis for future
research.
(INALI). CONICET–UNL.
Fecha de la defensa: 01/06/2012.
Resumen
El Endosulfán (ED) es un insecticida
organoclorado utilizado ampliamente para
el control de plagas en cultivos de soja en
184 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Argentina. Comúnmente, durante las prác-
ticas agrícolas este pesticida se utiliza en
combinación con otros insecticidas, como
los piretroides. El objetivo general de la
presente Tesis Doctoral fue evaluar la toxi-
cidad aguda de una formulación comer-
cial del insecticida ED para tres especies
ícticas neotropicales (Prochilodus lineatus,
Cichlasoma dimerus y Piaractus mesopo-
tamicus), y detectar cambios subletales en
marcadores de estrés en peces expuestos
a ED en forma individual, y en una mezcla
con el insecticida piretroide λ–cialotrina.
El valor de las CL50–96h del ED para P.
mesopotamicus, P. lineatus y C. dimerus
fue 3,6, 3,7, 17,7 µg∙L–1, respectivamente.
Los resultados mostraron que concentra-
ciones subletales de ED produjeron cam-
bios en los biomarcadores hematológicos,
enzimáticos y de estrés oxidativo en dife-
rentes órganos de P. lineatus y C. dimerus.
Las concentraciones más altas de ED alte-
raron el contenido de hemoglobina (Hb), y
aumentaron significativamente el conteo
de glóbulos blancos (CGB). El conteo dife-
rencial de leucocitos (CDL) también resultó
alterado, aunque los cambios observados
fueron diferentes en ambas especies. En P.
lineatus aumentaron el porcentaje de trom-
bocitos (Tr) y monocitos (Mo), y disminu-
yeron los linfocitos (Li) y neutrófilos (Ne),
mientras que en C. dimerus sólo se observo
un aumento en la proporción de Ne. Con
respecto a los biomarcadores de daño tisu-
lar, se observó una disminución en la activi-
dad de las enzimas alanino aminotranferasa
(ALT) y aspatarto aminotranferasa (AST) en
hepatopáncreas de C. dimerus expuestos a
6,8 µg∙L–1. En la concentración más alta de
ED, se observó un aumento significativo de
los niveles de peroxidación lipídica (LPO) en
hígado, intestino y cerebro de P. lineatus, y
en branquias, hepatopáncreas y cerebro de
C. dimerus.
Por otro lado, P. mesopotamicus expues-
tos a una combinación de ED (1,1 μg∙L–
1) y λ–cialotrina (0,7 μg∙L–1) mostraron un
aumento significativo del índice hepato–
somático (IHS), que no se observó en los
expuestos a los pesticidas de modo indi-
vidual. Por otro lado, el ED produjo cam-
bios significativos en los peces expuestos,
en algunas variables hematológicas de la
serie roja (disminución del CGR y Hb) y el
CDL, debido a una disminución del porcen-
taje de Ne en los peces expuestos. El pire-
troide λ–cialotrina también produjo cam-
bios, que consistieron en un aumento de
la glucosa (GL) y disminución de las proteí-
nas totales (PT). La mezcla de ambos pes-
ticidas produjo un aumento del CGB, así
como también una marcada alteración de
los componentes leucocitarios, represen-
tada principalmente por una disminución en
el porcentaje de Li. Los cambios en las tran-
saminasas consistieron en un incremento
de su actividad en el riñón de los peces
expuestos a ED y λ–cialotrina de modo indi-
vidual, y una disminución en el hígado de
los expuestos a la mezcla de ambos pestici-
das. La respuesta antioxidante y el daño oxi-
dativo en P. mesopotamicus, variaron según
el tratamiento y órgano analizado. En gene-
ral, los peces expuestos a ED y λ–cialotrina
de modo individual mostraron alteraciones
en la actividad de las enzimas antioxidantes
en todos los órganos, sin registrarse cam-
bios en los niveles de LPO. Por otro lado, la
mezcla de ambos pesticidas produjo, una
inducción enzimática en todos los órganos,
acompañada por un aumento significativo
en los niveles de LPO en hígado, riñón y
cerebro de P. mesopotamicus.
Resúmenes tesis
Los resultados obtenidos en la presente
Tesis Doctoral mostraron que la exposi-
ción a concentraciones subletales de ED de
modo individual y en mezcla con otro insec-
ticida, produjo cambios hematológicos
sobre todo relacionados al sistema inmune,
alteración en enzimas metabólicas y antio-
xidantes, e inducción de daño oxidativo en
órganos vitales de las especies ícticas neo-
tropicales P. lineatus, C. dimerus y P. meso-
potamicus.
Summary
Toxicity and physiological effects of the
insecticide Endosulfan on neotropical fish
The organochlorine Endosulfan (ED) is
one of the compounds used most exten-
sively for pest–control in Argentinean crops.
During agricultural practices, this pesticide
Infecciones fágicas en Lactobacillus plantarum.
Caracterización e implicancias indutriales
Mariángeles Briggiler Marcó
mbriggi@fiq.unl.edu.ar
Director/codirectores: Andrea Quiberoni /
Jorge Reinheimer.
Lugar de realización: Instituto de Lactología
Industrial (UNL–CONICET).
Facultad: Facultad de Ingeniería Química.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 06/03/2012.
Resumen
Este trabajo tuvo como objetivo la carac-
terización fenotípica y genotípica de 2 fagos
de colección (B1 y B2) y de 2 fagos aislados
previamente de gránulos de kéfir (FAGK1 y
FAGK2) de Lb. plantarum. Adicionalmente,
185
is commonly used in combination with other
insecticides such as pyrethroids. This Doc-
toral Thesis was aimed at evaluating acute
toxicity of a ED commercial formulation for
three neotropical fish species (Prochilodus
lineatus, Cichlasoma dimerus, and Piaractus
mesopotamicus); and detecting sublethal
changes of stress markers in fish exposed
to ED alone, and combined with the pyre-
throid λ–cyalothrin. The results obtained in
the present Doctoral Thesis showed that
exposure to sublethal ED concentrations,
used individually and in combination with
another insecticide, produced hematolog-
ical changes which are primarily related to
the immune system, alteration in metabolic
and antioxidants enzymes, and induction of
oxidative damage in vital organs of the neo-
tropical fish species P. lineatus, C. dimerus
and P. mesopotamicus.
se llevó a cabo el estudio de su interacción
con cepas sensibles.
El tamaño del genoma fue de 38 kb (fago
B1) y 80 kb (fago B2) mientras que el meca-
nismo de empaquetamiento fue del tipo
pac (fago B1) y del tipo cos (fago B2). Para
el fago B1 fueron asociadas 13 proteínas
estructurales mientras que para el fago B2
fueron identificadas 9. Adicionalmente, en el
genoma del fago B2 fueron encontrados 6
ARNt. Ambos fagos forman parte de la fami-
lia Siphoviridae.
Los 4 fagos evidenciaron elevada infec-
tividad en un rango de pH de 4 a 11 y aun
a temperaturas de 50 °C. Por otro lado, se
observó que a –80 °C se obtuvo la mayor
186 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
conservación de la viabilidad fágica. La lisis
celular de Lb. plantarum ATCC 8014 ocurrió
aún en ausencia de iones divalentes, aun-
que en presencia de calcio fue más veloz.
En medio agarizado, la presencia de calcio
facilitó la visualización de placas de lisis y la
obtención de mayores títulos fágicos. Con
respecto a la determinación del espectro
de hospedadores, la mayoría de las cepas
resultó sensible al fago B2. En cuanto a
los parámetros de multiplicación fágica, se
observaron períodos de latencia de entre 20
y 40 min, tiempos de burst de entre 80 y 90
min y burst sizes de entre 11 y 39 UFP/cen-
tro de infección (para los fagos B1, FAGK1
y FAGK2) y de 133 UFP/centro de infección
para el fago B2. Para algunos sistemas, se
evidenció la presencia de mecanismos de
fagorresistencia del tipo R/M. La etapa de
adsorción de los 4 fagos sobre la cepa sen-
sible Lb. plantarum ATCC 8014 sería un pro-
ceso irreversible y fue escasamente afec-
tada por la presencia de calcio, aunque se
redujo a temperaturas de 50°C y valores de
pH de 9 y 10. Por otro lado, el tratamiento
térmico aplicado sobre las células produjo
una disminución en las tasas de adsorción
aunque el tratamiento de las células con
cloranfenicol no afectó la adsorción de las
partículas fágicas sobre la superficie celular.
Los receptores fágicos presentarían natu-
raleza hidrocarbonada aunque los ensa-
yos de inhibición con diversos azúcares, los
estudios de competencia y desorción así
como también los experimentos utilizando
lectinas no permitieron obtener resultados
concluyentes en cuanto a la identificación
de los azúcares presentes en los recepto-
res fágicos.
Los 4 fagos de Lb. plantarum evidencia-
ron resistencia a los procesos de pasteuri-
zación. Sin embargo, el tratamiento a 90 °C
durante 5 min produjo la eliminación com-
pleta de las partículas fágicas. De los agen-
tes químicos estudiados, el ácido pera-
cético fue el más eficiente ya que logró la
inactivación completa de los fagos en cor-
tos tiempos (< 5 min). Por otro lado, los
alcoholes (etanol e isopropanol) no fueron
eficientes en la destrucción viral mientras
que el hipoclorito de sodio eliminó las par-
tículas fágicas en una concentración de 800
ppm. La eficiencia de procesos fotocatalí-
ticos (UV–TiO2) en la inactivación de fagos
de diversas especies de bacterias lácti-
cas, fue fago–dependiente. Los fagos más
sensibles forman parte de las especies Lb.
plantarum y St. thermophilus mientras que
los más resistentes pertenecen a Lb. hel-
veticus y Lb. delbrueckii. En particular, para
los fagos de Lb. plantarum, la fotocatálisis
resultó más efectiva que la aplicación de
radiación UV (sin catalizador) ya que sólo
en el primer caso se observó la eliminación
total de las partículas.
Finalmente, se aislaron 81 mutantes
fagorresistentes a partir de las cepas Lb.
plantarum ATCC 8014 y PLN, utilizando los
fagos B1 y B2, ya sea de manera individual
o conjunta (cócteles de fagos). En gene-
ral, el método en medio agarizado fue más
eficiente para el aislamiento de los mutan-
tes que el método de cultivo secundario.
El nivel de fagorresistencia de las varian-
tes estudiado a través del EOP (Efficiency of
plaquing) fue muy bueno. Sin embargo, los
niveles de estabilidad de la fagorresisten-
cia fueron variables. En cuanto a la identi-
ficación de mecanismos involucrados en la
resistencia fágica de los mutantes, en algu-
nos casos fue posible evidenciar liberación
espontánea de partículas fágicas, aunque
no fue un fenómeno repetitivo. En gene-
ral, los mutantes aislados presentaron un
Resúmenes tesis
mecanismo de resistencia asociado al blo-
queo de la adsorción. Los perfiles RAPD–
PCR de los mutantes revelaron una elevada
homología genética con su cepa madre.
Las variantes fagorresistentes fueron capa-
ces de desarrollar en un medio de cultivo a
base de leche, alcanzando bajos valores de
pH y elevada acidez a las 24 hs. En parti-
cular, un mutante seleccionado fue capaz
de resistir la presencia de cócteles de fagos
durante la elaboración de leche fermentada
y posterior almacenamiento refrigerado del
producto.
Los resultados obtenidos en este estu-
dio permiten profundizar los conocimientos
referidos a infecciones fágicas en Lb. plan-
tarum, los cuales serían necesarios si esta
especie bacteriana es utilizada en el desa-
rrollo de alimentos funcionales. Por otro
lado, este trabajo demostró que es posible
el aislamiento de variantes fagorresistentes
con adecuadas propiedades tecnológicas.
Summary
Phage infections in Lactobacillus planta-
rum. Characterization and industrial impli-
cations
In this thesis, a molecular characterization
(including DNA packaging mechanisms,
genome sequencing and structural protein
identification) of two Lactobacillus planta-
rum collection phages (ATCC 8014–B1 and
ATCC 8014–B2) was carried out. In addition,
the phage morphology was studied.
187
On the other hand, phage viability through-
out storage at different pH and temperature
was determined for collection phages and
for phages FAGK1 and FAGK2 (isolated from
kefir grains). To characterize the interaction
between phages and their sensitive strains,
the following aspects were studied: influence
of divalent cations during the lytic cycle, host
spectrum, one step growth curves, char-
acterization of the adsorption step, phage
receptors and presence of restriction–modi-
fication (R/M) systems.
In the second chapter of this Thesis,
the behavior of phages subjected to ther-
mal (63, 72 and 90 ºC), chemical (alco-
hols, sodium hypochlorite and peracetic
acid) and photocatalytic treatments, used to
diminish the frequency of phage infections,
was studied. In particular, the efficiency of
photocatalysis on phage inactivation was
studied for phages infecting diverse species
of lactic acid bacteria. Also, phage–resistant
mutants of Lb. plantarum were isolated. The
phage resistance phenotype of the mutants
as well as their technological performance
were studied.
Results obtained in this Thesis significantly
contributed to improve the knowledge about
phage infections on Lb. plantarum, which
would be useful if this bacterial species is
used in the manufacture of functional foods.
On the other hand, this work demonstrated
that the assayed methodologies are efficient
for obtaining spontaneous phage–resistant
mutants from Lb. plantarum strains with ade-
quate technological properties.
188 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Caracterización hematológica de especies de anfibios

anuros con distribución en los ecosistemas del litoral
fluvial argentino (provincias de Entre Ríos y Santa Fe).
Potencialidad de su utilización como biomarcadores

Bioq. Mariana C. Cabagna Zenklusen hemograma y la morfología de las células

mcabagna@fbcb.unl.edu.ar
Director/codirector: Dr. Rafael Lajmanovich /
Dr. Rafael Althaus.
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento: Cá-
tedra de Ecotoxicología – Escuela Superior
de Sanidad; cátedra de Morfología Normal.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 01/10/2012.
Resumen
Entre los distintos biomarcadores no
destructivos utilizados, los análisis hemato-
lógicos, hemograma y determinaciones quí-
micas en plasma o suero, son unos de los
más usados para la prevención, diagnós-
tico, pronóstico y tratamiento de las enfer-
medades en los seres humanos y en otras
especies animales. Sin embargo, un incon-
veniente para su uso en los anfibios como
herramienta de diagnóstico ambiental es
la falta de información sobre la hematolo-
gía de la mayoría de estas especies. Por lo
tanto, el objetivo general de esta tesis fue
caracterizar las células sanguíneas de las
especies de anfibios anuros, adultos y lar-
vas, de las familias más representativas de
los ecosistemas del litoral fluvial de Argen-
tina y determinar la posibilidad de utilizar
estos parámetros como biomarcadores de
contaminación ambiental. De esta forma,
se presentan y discuten los resultados de
sanguíneas obtenidos de muestras de san-
gre provenientes de individuos de quince
especies de anfibios anuros, provenientes
de zonas de las provincias de Entre Ríos
(departamentos Paraná y Gualeguaychú) y
Santa Fe (departamento La Capital), Argen-
tina, no relacionadas con actividades agro-
industriales. En el caso de los especíme-
nes adultos de Odontophrynus americanus,
las mediciones se realizaron en extendidos
sanguíneos provenientes de la colección
herpetológica de la Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales (Universidad Nacional
de Río Cuarto).
Para determinar la posibilidad de utili-
zar estos parámetros como biomarcadores
de contaminación ambiental y los anfibios
como especies indicadoras, se eligieron
zonas relacionadas con las actividades pro-
ductivas más representativas de la región
en la que está emplazada nuestra Facultad:
la industria, la agricultura y la actividad fru-
tihortícola.
A través de la evaluación hematoló-
gica de anfibios anuros, en larvas de tres
especies, distintas de anuros expuestas a
efluentes industriales y en cultivos de arroz
(Odontophrynus americanus, Scinax squa-
lirostris y Leptodactylus mystacinus), se
observó incremento de granulocitos eosi-
nófilos, leucocitos considerados como un
signo de protección frente a agentes tóxi-
cos. En adultos expuestos a agroquímicos,
Resúmenes tesis
se registraron disminución del hematocrito
y la concentración de hemoglobina, con lin-
focitosis y aumento del recuento de leucoci-
tos, cambios semejantes a los observados
en estudios llevados a cabo con insectici-
das y herbicidas en laboratorio, en distintas
especies animales. Por lo tanto, a pesar que
la evaluación hematológica puede ser com-
pleja, es uno de los métodos más sencillos
y menos invasivos que permiten la detec-
ción de cambios fisiológicos y patológicos
de las poblaciones silvestres, relacionados
con factores ambientales.
Summary
Hematological characterization of amphib-
ian anuran species distributed in the eco-
systems from the Argentinean fluvial littoral
zone (Entre Rios and Santa Fe provinces):
Their potential use as biomarkers
Among different non destructive bio-
markers used, the hematological analysis
(blood count and chemical determinations
in plasma or serum) is one of the most com-
mon practice for the prevention, diagno-
sis, assessment and treatment of illnesses
either in human or animal wildlife. However,
one disadvantage for its use in amphibi-
ans as a tool for environmental diagnosis is
the lack of hematological information avail-
able on most of these species. For this rea-
son, the general aim of own doctoral thesis
was to characterize blood cells of anuran
species, both adults and larvae, belonging
to the most representative families found
in ecosystems in the littoral zone in Argen-
tina. Moreover, based on this characteriza-
tion I determined the possibility of using
these parameters as biomarkers for environ-
mental contamination. Blood count results
and morphology of blood cells obtained
189
from samples taken from fifteen species
of anuran located in the Provinces of Entre
Ríos (Paraná and Gualeguaychú) and
Santa Fe (La Capital) are presented and
discussed. These areas are not related to
agro industrial activities. In the case of adult
specimen of Odontophrynus americanus,
relevant measurements were made in blood
slides taken from the herpetological collec-
tion belonging to the Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales (Universidad Nacional
de Río Cuarto).
In order to settle the possibility of using
these parameters as biomarkers of envi-
ronmental contamination and amphibian as
indicator species, we selected areas related
located within or surrounded by anthropo-
genic activities such as industry, agriculture
and fruit–horticulture.
Through the hematological evaluation
of anuran amphibians, I observed in larvae
of three different species (Odontophrynus
americanus, Scinax squalirostris y Lepto-
dactylus mystacinus) that were exposed to
industrial waste and rice fields, an increase
of eosinophilic granulocytes, which are leu-
kocytes considered as a sign of protec-
tion against toxic agents. In adults that
were exposed to agrochemicals, I recorded
a decrease of hematocrit and hemoglo-
bin concentration, with lymphocytes and a
rise of leucocytes count, similar changes
to those observed in studies carried out in
different species with insecticides and her-
bicides in laboratory worldwide. Therefore,
and in spite of the fact that the hematologi-
cal evaluation can be complex, it is one of
the simplest and less invasive methods that
allow the detection of physiological and
pathological changes in the wild popula-
tions related to environmental factors.
190 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Diversidad de macroparásitos en especies ícticas
de la Familia Pimelodidae, de la llanura aluvial del río
Paraná Medio
Silvina Beatriz Chemes
schemes@fhuc.unl.edu.ar
Director/codirectora: Dr. Ricardo M. Take-
moto / MSc. María Julieta Parma.
Lugar de realización: Laboratorio del Dpto.
Ciencias Naturales, Facultad de Humani-
dades y Ciencias (UNL) y Laboratorio de
Ictiología, Instituto Nacional de Limnología
(CONICET–UNL).
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 25/10/12.
Resumen
Con el objetivo de conocer la diversidad
de macroparásitos de peces de la Fami-
lia Pimelodidae de la llanura aluvial del río
Paraná Medio, se capturaron 129 ejempla-
res de las especies Luciopimelodus pati,
Pimelodus albicans, P. maculatus y Pseu-
doplatystoma corruscans. Estas se desta-
can por ser componentes importantes de
la fauna autóctona y por constituir especies
de alto valor ecológico, comercial y depor-
tivo. Las capturas se realizaron en ambien-
tes leníticos y lóticos de los ríos Coronda,
Salado y San Javier (Santa Fe). Luego de
registrar medidas de talla y peso de los
peces, se practicaron las técnicas usuales
de disección, hallándose 2068 ictioparási-
tos, que fueron preparados según protoco-
los de rutina para cada grupo taxonómico.
Se determinaron los descriptores parasitoló-
gicos, luego se aplicaron índices ecológicos
y estadísticos sobre la información obtenida
de peces y parásitos, analizando la interac-
ción ecológica desde diferentes puntos de
vista. Los resultados muestran que existe
una elevada diversidad parasitaria en el Sis-
tema Paraná Medio, dada por 49 taxones
de 8 grupos zoológicos de macroparásitos.
En orden decreciente por su riqueza, estos
pertenecieron a Monogenea (14), Nema-
toda (10), Eucestoda y Digenea (6 en cada
caso), Acanthocephala (5), Copepoda (4),
Branchiura (3) y Annelida (1). Se registran
3 especies aún no descriptas, se amplía
la distribución geográfica de la mayoría de
los taxones y se hallan nuevos hospedado-
res para parásitos citados en otros peces
de la región neotropical. Se analizan con
mayor profundidad las comunidades com-
ponentes de P. albicans y P. maculatus. Las
interacciones hospedador-parásito estu-
diadas responden a algunos de los princi-
pios de la Teoría de Biogeografía de Islas,
según los que el Sistema Paraná Medio
estaría actuando como corredor biológico,
los peces como islas de hábitats coloniza-
bles y su comportamiento favoreciendo la
colonización. La estructura general de estas
comunidades se conformó por Monogenea
en primer lugar; luego Digenea, Acantho-
cephala, Nematoda y el resto de los taxo-
nes. No se encontraron asociaciones sig-
nificativas entre el estado de desarrollo de
los peces y sus parásitos, tampoco entre el
estado de condición de los hospedadores
y los parásitos. En Monogenea, la disposi-
ción de los parásitos en sus hospedadores
fue agregada, hallándose variaciones en el
Resúmenes tesis
nivel de agregación en el resto de los taxa.
Se discuten los resultados, postulando la
importancia del conocimiento de las comu-
nidades de parásitos para evaluar los siste-
mas acuáticos y comprender el rol de todos
los componentes del ecosistema.
Summary
Diversity of macroparasites in fish of the
Pimelodidae Family from the floodplain of
the Middle Paraná River
In order to know the diversity of macropara-
sites in fish of the Pimelodidae family from
the floodplain of the Middle Paraná River,
129 specimens of Lucio-pimelodus pati,
Pimelodus albicans, P. maculatus and Pseu-
doplatystoma corrus-cans were captured.
Captures were made in environments in
the Coronda, Salado and San Javier Rivers
(Santa Fe). Length and weight was measure
and then dissection was performed to all
fish: 2068 ichthyoparasites were found. Par-
asitological descriptors were determined,
and then ecological indices and statistical
analysis applied. Results show that there
Estudios agronómicos en moha perenne —Setaria
Lachnea (Nees) Kunth—
Eliana de Luján Exner
eexner@fca.unl.edu.ar
Director: José Francisco Pensiero.
Lugar de realización: Facultad de Bioquí-
mica y Ciencias Biológicas.
Cátedra: Botánica Sistemática Agronómica,
Departamento: de Biología Vegetal.
Facultad: Facultad de Ciencias Agrarias.
191
is a high diversity of ichthyoparasites in the
Middle Paraná system, including 49 taxa of
8 different groups of macroparasites. In a
decreasing order of richness, they belong
to Monogenea (14), Nematoda (10), Euces-
toda and Digenea (6 in each case), Acan-
thocephala (5), Copepoda (4), Branchiura
(3) and Annelida (1). Within these 49 taxa,
3 species have not been described yet. The
geographical distribution of most of the taxa
is expanded, and new hosts for ichthyopara-
sites from the neotropical region have been
found. The host-parasite interactions are
consistent with the Theory of Island Bioge-
ography, which propose that the Paraná sys-
tem would act as a biological corridor, fish
species as habitat island for colonization,
and their behavior promoting colonization.
General structure of these communities is
made up of Monogenea at first place, follow-
ing by Digenea, Acanthocephala, Nematoda
and the others taxa. In view of these results,
we highlight the importance of knowing par-
asite communities in aquatic systems and
understanding the role of all components of
the ecosystem.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 30/08/2012.
Resumen
Setaria lachnea (“moha perenne”) es una
gramínea nativa, perenne, de ciclo prima-
vero–estivo–otoñal, de amplia distribución en
Argentina, que constituye un recurso forra-
192 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
jero valioso de los pastizales de nuestro país.
Ha sido recomendada su conservación e
inclusión en planes de domesticación.
La presente tesis tuvo por finalidad el
estudio de las variaciones en caracteres de
interés agronómico, citogenético y molecu-
lar en poblaciones procedentes de un gra-
diente latitudinal y altitudinal del noroeste
de Argentina (capítulo I, poblaciones 6221,
6227 y 6242); y la caracterización agronó-
mica de una población considerada promi-
soria desde el punto de vista forrajero (capí-
tulo II, población 6234–38).
En el estudio de la fenología de la flo-
ración para las poblaciones 6221, 6227
y 6242, no se hallaron variaciones para la
variable inicio de floración, aunque si dife-
rencias significativas intrapoblacionales.
Los genotipos de la población 6234–38,
resultaron tener una floración más tardía.
El éxito reproductivo, expresado a tra-
vés del porcentaje de fructificación, mos-
tró variabilidad inter e intrapoblacional (en
las procedencias 6221, 6227 y 6242), des-
tacándose los genotipos de la población
6221 por su mayor fructificación. Para la
población 6234–38, los genotipos corres-
pondientes al tratamiento cortes presenta-
ron los mayores porcentajes de fructifica-
ción. El número de panojas por planta fue
elevado en todas las poblaciones analiza-
das, por lo que no resultaría un factor limi-
tante para el éxito reproductivo.
El peso promedio de 1000 cariopsis para
la población 6234–38 fue de 0,39 gr, regis-
trándose diferencias significativas entre
genotipos y tratamientos. Los genotipos
correspondientes al tratamiento cortes pre-
sentaron los mayores pesos de semillas.
Los ensayos sobre el comportamiento
germinativo permitieron reafirmar la exis-
tencia de dormición seminal, pues si bien
se obtuvo escasa a nula germinación, las
semillas presentaron elevados valores de
viabilidad. La técnica de escarificado ensa-
yada no permitió mejorar la germinación.
Por otra parte, temperaturas constante de
27 ºC y alternancia 27–37 ºC permitieron
mejorar la germinación con respecto a tem-
peraturas constantes 17 °C.
La técnica empleada no permitió hallar,
en los materiales analizados, tolerancia a
las altas temperaturas, ni a las bajas tem-
peraturas.
La productividad forrajera evaluada en la
población 6234–38 mostró diferencias sig-
nificativas tanto entre genotipos como trata-
mientos. Los valores de digestibilidad halla-
dos en genotipos de la población 6234–38
(64,3 % en promedio) son importantes para
una gramínea megatérmica.
Del análisis de correlación entre las varia-
bles evaluadas correspondientes a la feno-
logía de la floración y al éxito reproductivo
se infiere que los genotipos de las pobla-
ciones 6221, 6227 y 6234–38 cuanto antes
inician su floración mayor es el número de
panojas producidas, incrementándose así
la producción potencial de semillas.
El análisis de correlaciones en los genoti-
pos de la población 6234–38 reveló que las
variables asociadas a la producción de MS
(materia seca) se correlacionaron positiva-
mente entre ellas y con la altura al momento
de corte, y con el perímetro de mata inicial
y final bajo corte; y negativamente con el
inicio y mitad de la floración. No se halla-
ron correlaciones entre las variables asocia-
das a la producción de MS y las vinculadas
a la producción de semillas, tampoco entre
el peso de semillas y la germinación de las
mismas.
Los recuentos cromosómicos indican
que las poblaciones analizadas están cons-
Resúmenes tesis
tituidas por individuos con un único citotipo
tetraploide (2n =4x= 36 cromosomas). El
tamaño medio de los cromosomas es de
4,25 mm. Se halló un cariotipo simétrico con
una fórmula cariotípica de 14 m + 4 sm.
El análisis de la meiosis mostró que las
asociaciones cromosómicas más frecuentes
fueron bivalentes con segregación normal,
ausencia de cromosomas rezagados y micro-
núcleos, sugiriendo un origen aloploide.
El análisis molecular solo agrupó a las
poblaciones según su origen geográfico.
Summary
Agronomic studies in moha perenne –
Setaria lachnea (Nees) Kunth–
Setaria lachnea (“moha perenne”) is
a perennial native grass, of spring–sum-
mer–fall cycle, widely distributed in Argen-
tina, which constitutes a valuable forage
resource.
The variations in agronomic characters,
cytogenetic and molecular was studied from
latitudinal and altitudinal gradient in north-
western Argentina.
In flowering phenology (populations 6221,
6227 and 6242) although significant differ-
ences within populations were. The 6234–38
genotypes, turned out to have a late flowering.
Reproductive success, (percentage fruit
set), showed inter and intra variability (6221,
6227 and 6242), highlighting the genotypes
of the 6221 population.
193
The average weight of 1000 caryopses
(6234–38) was 0,39 g, showing significant
differences between genotypes and treat-
ments. The genotypes for the court treat-
ment showed the highest seed weights and
reproductive success.
The tests reaffirmed the existence of seed
dormancy. The scarifying tested technique
did not allow to improve germination. Con-
stant temperatures of 27° C and of 27–37° C
alternating improved the germination.
Evaluated forage productivity (6234–38)
showed significant differences between
genotypes and treatments.
The digestibility values found (6234–38
population) was 64,3 %.
The variables associated with the produc-
tion of DM were positively correlated among
themselves and negatively with the beginning
and mid–flowering (population 6234–38).
Chromosome counts indicate individuals
with a single tetraploid cytotypes (2n = 4x =
36 chromosomes). The average size of the
chromosomes is 4.25 microns with symmet-
rical karyotype: 14 m + 4 sm.
The most frequent chromosome associa-
tions were bivalent with normal segregation,
absence of lagging chromosomes and micro-
nuclei, all suggesting an aloploide origin.
The molecular analysis only grouped pop-
ulations according to their geographical ori-
gin.
194 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Caracterización funcional de genes de girasol que
codifican factores de transcripción de la familia WRKY.
HaWRKY6 y su regulación por el microRNA396
Jorge Ignacio Giacomelli
jorgegiacomelli@gmail.com
Director/codirector: Dra. Raquel L. Chan.
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Biotecnología Vegetal.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 12/04/12.
Resumen
En primer lugar, encaramos análisis
bioinformáticos que nos permitieron identi-
ficar 97 miembros WRKY. Éstos se pudieron
clasificar dentro de los grupos ya conocidos
de FTs en otras especies más estudiadas.
Sin embargo, además de los grupos filoge-
néticos conocidos, algunos miembros de la
familia se resolvieron en los árboles como
un clado novel, al que llamamos WKKY. Los
miembros de este grupo poseen algunas
características compartidas con los del sub-
grupo IId, y otras particulares. Los análisis
de los patrones de expresión de un miem-
bro seleccionado de cada grupo indicaron
que la expresión de estos genes está regu-
lada por heridas, tratamientos estresantes y
hormonas, sugiriendo que en esta especie
también participarían en variadas respues-
tas de estrés.
De los genes seleccionados para el estu-
dio de su expresión, HaWRKY5 fue el único
que mostró un comportamiento diferencial
entre dos cultivares de girasol, uno suscepti-
ble y otro moderadamente resistente a Scle-
rotinia sclerotiorum. La expresión de este gen
se encuentra aumentada en condiciones
basales en el cultivar resistente comparada
con el sensible, y además, la infección con el
hongo genera una inducción adicional. Este
resultado indicaría que HaWRKY5 podría con-
vertirse en un marcador molecular asociado
a la resistencia a Sclerotinia. Las medidas
de expresión realizadas para estos genes
de girasol se correlacionaron con datos de
microarreglos de Arabidopsis; las observa-
ciones realizadas nos permitieron relacio-
nar genes de ambas especies que podrían
ser ortólogos funcionales. Luego de la iden-
tificación de todos los miembros de la fami-
lia, decidimos abocarnos a la caracterización
de HaWRKY6, un miembro atípico del grupo
IIa. Se expresó el dominio de unión corres-
pondiente en forma recombinante y la pro-
teína resultante unió el mismo elemento W–
box que sus homólogas de otras especies
en ensayos de retardo en geles. La expre-
sión de este gen fue muy débil en todos los
tejidos analizados pero aumentó significati-
vamente en raíces y hojas de plantas some-
tidas a estreses. Por otro lado, se obtuvie-
ron plantas transgénicas de Arabidopsis que
expresaban el gen reportero GUS controlado
por el promotor de HaWRKY6. Las tinciones
histoquímicas de estas plantas se observa-
ron en raíces y meristemas apicales.
También se obtuvieron plantas de Arabi-
dopsis transformadas con la construcción
35S::HaWRKY6. Estas plantas mostraron
mayor insensibilidad al ABA y al etileno que
Resúmenes tesis
sus controles en ensayos de inhibición de
la germinación. Sin embargo, no fue posible
observar otro fenotipo diferencial. El análi-
sis del transcriptoma de discos de hojas de
girasol que sobreexpresan HaWRKY6 indicó
un rol de este gen en la regulación de genes
relacionados con respuestas de estrés.
Los niveles de expresión observados en
las plantas transgénicas 35S::HaWRKY6
fueron muy bajos en todas las líneas anali-
zadas (más de sesenta), a pesar de que su
expresión estaba controlada por el promo-
tor constitutivo 35SCaMV. El análisis de la
secuencia nucleotídica de HaWRKY6 mos-
tró que posee un sitio de reconocimiento
putativo para el miR396, un miRNA muy
conservado en las plantas verdes, que nor-
malmente regula a una familia de factores
de transcripción (FTs) conocida como GRF.
Los FTs GRF están involucrados en el desa-
rrollo. Por otro lado, las proteínas homólo-
gas de HaWRKY6 en Arabidopsis no están
reguladas por el miR396, por lo que esta
regulación representa un evento nuevo de
adquisición de un gen blanco, por parte de
un miRNA antiguo.
Logramos identificar en las bases de
datos la existencia de un gen de girasol que
codificaría un homólogo del ath–miR396,
han–miR396. Al caracterizar la expresión
de han–miR396 en ensayos de Northern,
observamos que su expresión es alta en
tejidos adultos, al igual que la de sus homó-
logos de Arabidopsis, ath–miR396a/b. Ade-
más, HaWKRY6 y han–miR396 muestran
patrones de expresión opuestos en plantas
sometidas a altas temperaturas o tratamien-
tos con SA. Se realizó una construcción
resistente al miRNA y se utilizó para trans-
formar plantas de Arabidopsis. Las mismas
presentaron un fenotipo diferencial, siendo
más sensibles a los tratamientos con altas
195
temperaturas que las plantas de Arabidop-
sis salvajes o transformadas con la versión
de no resistente de HaWRKY6.
Summary
Functional characterization of sunflower
genes encoding transcription factor WRKY
family. HaWRKY6 and its regulation by the
microRNA396
Phylogenetic trees constructed with
WRKY domains resolved the same 7 groups
assigned to Arabidopsis and additionally, a
novel clade with traits apparently specific
to Asteraceae. Members of the novel clade
share some features with those of group IId
and others unique to this clade, indicating
that Asteraceae WRKY family has suffered
a diversification. Expression patterns of one
selected member of each group indicated
that these genes were regulated by biotic
and abiotic stresses as well as by stresses–
associated hormones. Among sunflower
WRKY encoding genes, HaWRKY6, from
group IIa, appeared as a good candidate
for a deeper characterization, due to its par-
ticular structural features. A segment of the
promoter region was isolated and cloned
directing GUS expression and Arabidopsis
plants transformed with this construct. GUS
expression was very strong in roots, petioles
and apical meristems. Transcriptome analy-
sis of sunflower leaf discs transformed with
35S::HaWRKY6 indicated a role of this gene
in stress responses.
Surprisingly, none of the large number
of independent transgenic lines analyzed
exhibited detectable HaWRKY6 transcript
levels. HaWRKY6 and han–miR396 shown
opposite expression patterns in plants sub-
jected to high temperatures or SA. More-
over, in Arabidopsis young tissues in which
196 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
the mir396 is low or not expressed at all,
35S:HaWRKY6 plants showed a differential
germination phenotype. A miR396–resistant
HaWRKY6 construct was performed and
Arabidopsis plants stably transformed with
it. These plants were more sensitive to high
Impacto de xenobióticos y comunicadores químicos
sobre algunos procesos biológicos en organismos
del zooplancton
María Florencia Gutierrez
fgutierrez@inali.unl.edu.ar
Director/codirector: Juan Cesar Paggi / Ana
María Gagneten.
Lugar de realización: Instituto Nacional de
Limnología (CONICET-UNL).
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Plancton.
Fecha de la defensa: 28/02/2012
Resumen
La necesidad de obtener herramientas
metodológicas adecuadas y representati-
vas que permitan medir el impacto de los
xenobióticos y el efecto de ciertos estresan-
tes naturales, como son los comunicado-
res químicos (infoquímicos) indicadores de
depredación sobre los integrantes del zoo-
plancton, promovió el desarrollo de la pre-
sente tesis.
Dado que el comportamiento repre-
senta una respuesta integrada y de relevan-
cia ecológica para los organismos frente
a diversas situaciones ambientales, se ha
considerado un parámetro de potencial
significancia, tanto para estudios ecológi-
cos como ecotoxicológicos. Este paráme-
temperatures compared with plants trans-
formed with the wild–type version, revealing
how a recently acquired miRNA target motif
in HaWRKY6 gene contributes to tempera-
ture response.
tro permitiría reconocer respuestas rápidas
y no destructivas a diversos estresantes y
estimar posibles consecuencias poblacio-
nales a largo plazo.
Partiendo de estas premisas, se pro-
puso la hipótesis de que los contaminantes
y los infoquímicos indicadores de depreda-
ción son capaces de modificar el compor-
tamiento de los microcrustáceos del zoo-
plancton, y que dichas modificaciones
constituyen biomarcadores sensibles y tem-
pranos.
Para ello se realizaron numerosos traba-
jos experimentales bajo condiciones contro-
ladas de laboratorio utilizando tres especies
de cladóceros (Daphnia magna, Cerioda-
phnia dubia, Pseudosida variabilis) y dos
de copépodos (Argyrodiaptomus falcifer y
Notodiaptomus conifer). Los experimentos
se realizaron en tres etapas que compren-
dieron ensayos de toxicidad aguda, de ciclo
de vida y de comportamiento. Para estos
últimos se diseñaron dispositivos espe-
cíficos que permitieron evaluar la migra-
ción vertical diaria (MVD) y la capacidad
de escape de los organismos menciona-
dos. En ambos casos se realizaron nume-
Resúmenes tesis
rosos experimentos previos que permitieron
definir los patrones “normales” de compor-
tamiento. Posteriormente se analizaron las
respectivas respuestas ante la presencia
de diferentes concentraciones de metales
(cromo y cobre), un insecticida comercial
(cuyo componente activo es el endosulfán)
e infoquímicos de un pez zooplanctófago,
Cnesterodon decemmaculatus.
Los resultados demostraron que los
organismos estudiados son sensibles a
los infoquímicos. Esto se observó en la
gran plasticidad fenotípica registrada en el
ciclo de vida del copépodo N. conifer y en
las modificaciones etológicas de las cinco
especies, luego de la exposición al medio
con dichos comunicadores.
Considerando los efectos de los xeno-
bióticos, en general los parámetros repro-
ductivos constituyeron los indicadores de
efecto más sensibles en los estudios de
ciclo de vida. Sin embargo, las alteraciones
en la habilidad de escape y los movimientos
migratorios resultaron ser mejores biomar-
cadores de los contaminantes utilizados,
permitiendo detectar el impacto a concen-
traciones menores que las que generaron
respuestas negativas tanto en los ensayos
agudos como en los crónicos.
Dada la importancia del comportamiento
en la distribución y éxito evolutivo de los
organismos en la naturaleza, las posibles
alteraciones en dicho parámetro podrían
generar serias consecuencias negativas, no
sólo para el zooplancton sino también para
los eslabones tróficos vinculados a ellos.
Finalmente, la elevada sensibilidad de
N. conifer y P. variabilis (al compararlas con
otros microcrustáceos utilizados en estu-
dios ecotoxicológicos) y su gran represen-
tatividad de los ambientes neotropicales,
197
permiten sugerirlas como especies muy
adecuadas para futuros trabajos en esta
línea de investigación.
Summary
Impact of xenobiotics and chemical com-
municators in some biological processes
in zooplankton organisms
This thesis was designed to ananlyze
weather pollutants as well as some infoche-
micals, indicating risk of predation, are able
to modify zooplankton microcrustaceans
behaviour. From an ecotoxiological pers-
pective, we hypothesized that such changes
could be used as sensitive and earlier bio-
markers. To test this, numerous experimen-
tal works were carried out using three clado-
cerans (Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia
and Pseudosida variabilis) and two cope-
pods (Argyrodiaptomus falcifer and Notodiap-
tomus conifer) species as test organisms.
The metals chromium and copper and the
insecticide endosulfan were used as pollu-
tants. The infochemicals indicating predation
were obtained from the zooplanktivorous fish
Cnesterodon decemmaculatus.
Results showed that two important beha-
viours for zooplankton: the ability to escape
and diel vertical migration, as well as many
life cycle parameters were disturbed at low
concentrations of both substances, the
natural infochemicals and the pollutants.
Taking into account that behaviour is one
of the most important traits of an organism’s
life cycle because it promotes their distribu-
tion and evolutive success, we concluded
that the alteration on this parameter would
produce serious consequences not only to
zooplankton species but also to the asso-
ciated throphic levels.
198 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
In addition to this, we showed that the
ability to escape and diel vertical migration
can be considered sensitive biomarkers for
the studied organisms. Finally, due to the
high sensitivity of N. conifer and P. variabi-
Relaciones de estructura a función y evolución de
enzimas del metabolismo del carbono. Caracterización
de enzimas del metabolismo de hidratos de carbono en
bacterias autotróficas y heterotróficas
Machtey Matías
matimach@gmail.com
Director/codirector: Alberto Álvaro Iglesias.
Lugar de realización: Santa Fe, Santa Fe,
Argentina.
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Enzimología Molecular.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 14/12/2012.
Resumen
En este trabajo se profundiza en el estu-
dio comparativo del metabolismo de los
hidratos de carbono entre organismos
heterótrofos y autótrofos. Para tal caso,
se abordó el estudio in vitro de las enzi-
mas que conforman las rutas biosintéticas
del glucógeno en dos bacterias: Prevote-
lla intermedia (quimioorgano–heterótrofo) y
Nitrosomonas europaea (quimiolito–autó-
trofo). Para esta última, además se profun-
dizó en la comprensión del metabolismo de
la sacarosa, usualmente ausente en orga-
nismos procariotas no fotosintéticos.
P. intermedia es una bacteria pertene-
ciente al phylum Bacteroidetes, que par-
lis, and their high representativity in neotro-
pical environments, it is suggested that they
would be appropriate species to future stu-
dies in this investigation line.
ticipa de la patología periodontitis. Como
otros organismos evolutivamente cercanos,
como el caso de P. briantii y P. nigrescens,
P. intermedia acumula glucógeno durante
las situaciones transitorias donde abundan
fuentes de carbono y energía externa. En
este trabajo se clonó, purificó y caracterizó
la enzima recombinante glucógeno sintasa
(GSasa). Ésta posee una secuencia con un
largo intermedio entre las GSasas procario-
tas y de hongos (y mamíferos) pero mayor
similitud de secuencia con estas últimas.
Además, la especificad por el sustrato mos-
tró un orden de preferencia de ADP–Glc >
dTDP–Glc > UDP–Glc. Si bien la enzima fue
capaz de utilizar el sustrato UDP–Glc, como
proponen trabajos publicados, la enzima
fue capaz de utilizar con mayor eficiencia
catalítica ADP–Glc y dTDP–Glc. Prevotella
spp. no posee en su genoma un gen puta-
tivo para ADP–Glc pirofosforilasa (ADPGlc
PPasa, corroborado in vivo en otros tra-
bajos) ni UDP–Glc pirofosforilasa, pero sí
una dTDP–glucosa pirofosforilasa (TDPGlc
PPasa). En este trabajo expresamos, purifi-
camos y caracterizamos la enzima TDPGlc
PPasa recombinante siendo activa tanto
con el sustrato dTTP y UTP, pero no con
Resúmenes tesis
ATP. Esta enzima no mostró ser regulada
alostéricamente por metabolitos intermedia-
rios del metabolismo del carbono. A partir
de este panorama, planteamos que en Pre-
votella spp. la síntesis de glucógeno podría
llevarse a cabo por una variante de la pro-
puesta para procariotas, en la que la Glc–
1P se activaría como dTDP–Glc a través de
la acción de la TDPGlc PPasa y éste sus-
trato se utilizaría para elongar glucógeno a
través de la enzima GSasa. Bacteroidetes
parecería ser un phylum particular respecto
a la síntesis de glucógeno en bacterias y
resulta atractivo profundizar la investiga-
ción, para teorizar sobre el origen evolutivo
de esta variante evolutiva.
N. europaea, en cambio, es un organis-
mos quimiolito–autótrofo facultativo (incor-
pora preferencialmente carbono autotrófica-
mente, aunque también heterotróficamente
en ciertas condiciones) obteniendo ener-
gía a partir de la oxidación de amonio.
Dicho organismo presenta codificado en
su genoma las enzimas correspondientes
a las rutas metabólicas tanto para el glucó-
geno como para la sacarosa (Suc). En este
trabajo se estudiaron las enzimas recombi-
nantes: ADPGlc PPasa, GSasa, sacarosa
sintasa (Suc Sasa) y la sacarosa fosfato sin-
tasa (SucP Sasa). Respecto de la primera,
que coordina la síntesis de ADP–Glc y el
punto metabólico clave de regulación de la
síntesis de glucógeno en bacterias y plan-
tas (con el almidón), resultó ser activada por
piruvato, oxaloacetato y fosfoenolpiruvato e
inhibida por AMP. Además, mostró promis-
cuidad por el uso de los cofactores metá-
licos divalentes esenciales (Mg2+, Mn2+,
Co2+ y Cd2+) y, según el metal utilizado, la
enzima mostró promiscuidad variable por el
uso de los nucleótidos trifosfato y el azúcar–
199
1P. Si bien fisiológicamente sea el Mg2+ el
cofactor más relevante por su abundancia
en la naturaleza, el uso de otros metales
podría ser un factor a considerar tecnológi-
camente para producir bibliotecas de NDP–
azúcar en lo que se denomina glycorandi-
mization; como también ser de utilidad para
el estudio de la estructura/función por técni-
cas espectroscópicas. Por otro lado, deter-
minamos que la GSasa, la NeuSuc Sasa y
la NeuSucP Sasa (que posee, además, un
dominio sacarosa fosfato fosfatasa, SucP
Pasa) utilizaron preferentemente como sus-
trato dador de residuo glucosilo a la ADP–
Glc. La enzima GSasa, mostró ser especí-
fica por el sustrato ADP–Glc, mientras que
el dominio SucP Sasa pudo utilizarlo con
similar eficiencia catalítica que con UDP–
Glc, aunque presentó mayor afinidad apa-
rente por este último. El dominio SucP Pasa
mostró ser activo y especifico por el disa-
cárido fosforilado Suc–6P. En base a estos
resultados in vitro, pareciera que la sín-
tesis de Suc, vía SucP Sasa tipo II (domi-
nios fusionados: SucP Sasa y SucP Pasa),
podría llevarse a cabo tanto a partir de
ADP–Glc como UDP–Glc. Sin embargo, la
secuencia de la UDPGlc PPasa de N. euro-
paea aparece trunca hacia el N–terminal.
En dicho organismo unicelular la Suc puede
estar cumpliendo un rol como fuente de
carbono transitoria, como así también como
osmoprotector. Bajo este panorama pare-
ciera que la fracción citosólica de ADP–Glc
puede pivotar entre la síntesis de glucógeno
y la Suc, y esta última a diferencia de lo que
ocurre en plantas y cianobacterias puede
degradarse como ADP–Glc a partir de ADP;
la ADP–Glc así generada podría ser utili-
zada para sintetizar glucógeno o bien movi-
lizar carbono dentro de la célula.
200 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Summary
In this work we performed the in vitro
study of enzymes involved in the glyco-
gen biosynthetic pathways of two bacte-
ria: Prevotella intermedia (chemo–organo–
heterotroph) and Nitrosomonas europaea
(chemo–litho–autotroph). For the latter,
we also deepened in understanding the
sucrose (Suc) metabolism, usually absent
in non–photosynthetic prokaryotes. P. inter-
mediate is a bacterium belonging to the
phylum Bacteroidetes, involved in periodon-
tal diseases. We propose that in Prevotella
spp. glycogen synthesis could be carried
out by a variation of that established for
prokaryotes; Glc–1P could be activated as
dTDP–Glc through the action of the TDPGlc
pyrophosphorylase and next be used as
substrate by glycogen synthase to elon-
Actividad bacteriostática y bactericida de antibióticos
betalactámicos y glucopéptidos frente a cepas
de Staphylococcus aureus de importancia clinica.
Caracterización genotípica de aislamientos tolerantes
Emilce de los Ángeles Méndez
emendez@fbcb.unl.edu.ar
Director/codirectora: Dra. Emma Sutich /
Dra. María Cristina Lurá.
Lugar de realización: Santa Fe.
Cátedra: Bacteriología Clínica.
Facultad: Bioquímica y Ciencias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 22/11/2012.
Resumen
El género Staphylococcus comprende
numerosas especies, presentes en la
gate glycogen. Bacteroidetes appears to
be a particular phylum with respect to glyco-
gen synthesis in bacteria, and is attractive to
perform further analysis to about the origin
of this evolutionary variant, as well as, esta-
blish molecular targets for pharmacological
purpose. N. europaea, however, is a faculta-
tive chemo–litho–autotrophic organism obtai-
ning energy from the oxidation of ammonia.
We constructed a putative metabolic scena-
rio where the fixed–carbon flows to a cyto-
solic fraction of ADP–Glc, which can pivot
between glycogen and Suc synthesis. The
disaccharide, unlike what happens in plants
and cyanobacteria, can be degraded again
to ADP–Glc from ADP, mediated by a particu-
lar prokaryotic sucrose synthase. This ADP–
Glc can be further used to glycogen synthe-
sis or to carbon mobilization within the cell.
mucosa y piel de humanos y de otros
mamíferos y aves. Son cocos gram positi-
vos que se presentan aislados o en racimos
irregulares. La especie de mayor impor-
tancia clínica es Staphylococcus aureus
subsp. aureus, denominado Staphylococ-
cus aureus (SA). Produce desde infeccio-
nes cutáneas localizadas o en tejidos pro-
fundos provocando osteomielitis, sepsis y
endocarditis. Su historia incluye la evolución
de la bacteria y cambios en su impacto clí-
nico debido a diferentes factores de virulen-
cia, mecanismos de defensa y capacidad
de generar resistencia a los antimicro-
Resúmenes tesis
biano (AM) útiles para su tratamiento. La
detección de la sensibilidad AM constituye
un desafío para el laboratorio. Los méto-
dos usados son: Concentración Inhibito-
ria Mínima (CIM), Concentración Bacteri-
cida Mínima (CBM) y estudios de cinética
de muerte (CM). Esta tesis se dividió en dos
partes: 1) se estudiaron SA meticilino sensi-
bles (SAMS) y, 2) se trabajó con SA metici-
lino resistentes (SAMR). Los objetivos para
la 1º parte (SAMS) fueron: a) detectar las
actividades bacteriostática y bactericida de
cefalotina (CEF); b) diferenciar cepas tole-
rantes según distintos criterios; c) estudiar
genotípicamente SAMS tolerantes y d) pro-
poner una metodología sencilla para detec-
tar la CBM de CEF. Se recolectaron 109 ais-
lamientos de SAMS, consecutivos y únicos
de muestras obtenidas de pacientes del
Hospital J. M.Cullen – Santa Fe. Para deter-
minar la CIM y la CBM de CEF de todos los
aislamientos se aplicó el método de macro-
dilución en caldo según el CLSI. A los ais-
lamientos con CBM/CIM≥ 8 se les efectua-
ron CM, realizando recuentos de colonias a
las 0, 3, 6 y 24 horas de incubación a 35
ºC. A los 4 aislamientos que resultaron tole-
rantes por esta metodología, se les deter-
minó la presencia de los genes mecA, hlg
y pvl. Las CIM50/90 de CEF resultaron 0,5 y 1
µg/mL, respectivamente y las CBM50/90 fue-
ron 1 y 8 µg/mL, respectivamente. Según
la relación CBM/CIM, 6 SAMS (5,5 %) fue-
ron tolerantes y CEF resultó bactericida
para 84 (77,1 %). Además se detectaron 25
SAMS con CBM/CIM de CEF ≥ 8 y cuatro
SA resultaron tolerantes por CM. La bacte-
ricidia de CEF según CM fue 99,1 %. Nin-
guna de las 4 cepas tolerantes por CM,
resultó portadora de mecA, lo que permitió
corroborar que se trataba de SAMS y uno
de ellos portó el gen pvl. La actividad bac-
201
tericida de CEF frente a SAMS, mediante la
puesta a punto de una técnica sencilla, se
realizó con 42 SAMS. Se utilizaron discos
de CEF, oxacilina (OXA) y cefoxitina (FOX)
inactivados con solución de betalactamasa
(SBL) obtenida en el laboratorio. El disco de
OXA resultó mejor que CEF y FOX ya que
logró discriminar mayor cantidad de aisla-
mientos con CBM/CIM de CEF > 8.
Los objetivos para la 2ª parte (SAMR)
fueron: a) detectar actividades bacteriostá-
tica y bactericida de vancomicina (VAN); b)
diferenciar cepas tolerantes según distintos
criterios; c) investigar el polimorfismo genó-
mico de SAMR tolerantes a VAN; d) compa-
rar, en aislamientos SAMR adquiridos en la
comunidad (SAMR–AC), la actividad bacte-
ricida de VAN con la portación de la leucoci-
dina de Panton–Valentine (LPV) y e) estudiar
la actividad sinérgica de VAN con cipro-
floxacina, gentamicina, rifampicina e imi-
penem por CM frente a SAMR tolerantes a
VAN. Se estudiaron 112 SAMR. Las CIM50/90
de VAN resultaron 0,5 y 1 µg/mL, respectiva-
mente y la CBM50/90 fueron 1 y 8 µg/mL, res-
pectivamente. Según la relación CBM/CIM
la bactericidia fue del 65,2% y se detecta-
ron 12 (10,7 %) cepas tolerantes. Las CM se
efectuaron a 39 SAMR (CBM/CIM de VAN ≥
8). Para el 96,4 %, VAN resultó bactericida,
mientras que 4 aislamientos resultaron tole-
rantes (3,6 %). El estudio del polimorfismo
en los 4 SAMR tolerantes, permitió diferen-
ciarlos en 2 clones: 3 pertenecieron al clon
A y el restante al clon B. Se demostró que la
bactericidia de VAN en SAMR–AC fue efec-
tiva en el 96% de los aislamientos, indepen-
dientemente de la presencia LPV, pero las
cepas LPV (+) redujeron más lentamente el
número de UFC/mL a las 6 horas. Todas las
asociaciones fueron sinérgicas, pero VAN +
GEN y VAN+ RFA y/o IMI lograron sinergia
202 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
a las 6 horas, mientras que VAN+CIPRO
se logró a las 24 horas. Se concluye que:
CEF y VAN pueden ser utilizadas en el Hos-
pital Dr. J. M. Cullen de Santa Fe, para tra-
tamiento de infecciones por SAMS y SAMR,
respectivamente. Se recomienda efectuar
CM para detectar actividad bactericida de
un AM. VAN resultó bactericida para SAMR–
AC, independientemente de la producción
de LPV. La combinación de AM para tra-
tar infecciones por SAMR tolerantes a VAN,
fueron muy eficaces. La técnica de discos
goteados con betalactamasa, preparada en
el laboratorio y puesta a punto en esta tesis,
resultó fácil y accesible para un laboratorio
de microbiología clínica.
Summary
Bacteriostatic and bactericidal activities
of betalactams and glycopeptides against
S. aureus strains of clinical significance.
genotypical characterization of tolerant
isolates
Staphylococcus aureus (SA) is an impor-
tant human pathogen. Tests to study anti-
microbial susceptibility are: Minimum
Inhibitory Concentration(MIC), Minimum
Bactericidal Concentration(MBC) and
Time–kill studies(TKS). This thesis analy-
zed: 1) 109 methicillin–susceptible (MSSA)–
(2006–2007) and 2) 112 methicillin–resistant
(MRSA)–(2006–2008) from patients atten-
ding Cullen Hospital at Santa Fe–Argentina.
MSSA: detect cephalotin (CEP) inhibitory
and bactericidal activities (BA), distinguish
tolerant strains according to different cri-
teria; analyze mecA, hlg and pvl genes by
PCR in tolerant MSSA and propose a simple
technique to determine CEPBA. MIC and
MBC were studied by broth macrodilution;
isolates showing CEPMBC/MIC≥8 were stu-
died by TKS. CEPMIC50/90 and CEPMBC50/90
were 0,5/1 and 1/8 µg/mL. According MBC/
MICratio: 6 tolerant, CEPBA 77,1 %. TKS: 4
tolerant mecA negative and CEPBA 99,1 %.
By simple methodology using CEP, oxacillin
and cefoxitin disks dropped with at–house
betalactamase solution, oxacillin resul-
ted the best one. MRSA: detect VAN bac-
teriostatic and BA, distinguish tolerant stra-
ins according different criteria, investigate
genomic polimorfism among VAN–tolerant–
MRSA, study VANBA against community–
acquired–MRSA and its relationship with
PVL production, study VAN synergical acti-
vity with ciprofloxacin, gentamicin, rifampin
and imipenem against VAN–tolerant–MRSA.
VANMIC50/90 and VANMBC50/90 were 0,5/1
and 1/8 µg/mL. According MBC/MICratio:
12 tolerant, VANBA 65,2 %. TKS: 4 tolerant
and VANBA 96,4 %. The four VAN–tolerant–
MRSA belonged to 2 clones. VANBA in CA–
MRSA was 96 % independently from PVL
production but PVL(+) strains reduce more
slowly initial inoculum at 6 hours by TKS. All
antimicrobial combinations were synergis-
tics. Conclusion: CEP and VAN may conti-
nue to be used in Cullen Hospital – Santa Fe
– Argentina and VANBA against CA–MRSA
was independent from PVL presence.
Resúmenes tesis
Tolerancia y eficiencia de Typha domingensis Pers. en la
retención de metales y nutrientes de efluentes industriales
Mufarrege, María de las Mercedes
Correo electrónico: mmufarrege@fiq.unl.
edu.ar
Director / Co-Director: Maine, María Alejan-
dra/ Hadad, Hernán Ricardo.
Lugar de realización: Santa Fe
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Cátedra de Química Analítica
Facultad: Facultad de Ingeniería Química.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral
Fecha de la defensa: 29/02/2012
Resumen
Se construyó un wetland para trata-
miento de efluentes que contienen Cr, Ni,
Zn, (efluente industrial), P y N (efluente cloa-
cal), además de elevados pH y salinidad.
Después de un período de dominancia de
especies flotantes, T. domingensis resultó
ser la especie dominante por varios años
hasta la actualidad tolerando las condicio-
nes del sistema. Por esta razón, en esta
tesis se estudió su tolerancia a las condicio-
nes del sistema y su eficiencia en la reten-
ción de los contaminantes. En experiencias
de invernadero, se evaluó su respuesta al
ser expuesta a condiciones extremas de
pH y/o salinidad y a diferentes concentra-
ciones de metales. Finalmente, se evaluó
la capacidad de biosorber metales de sus
hojas secas. Paralelamente, se monitoreó el
humedal construido, determinando metales
y nutrientes en diferentes órganos vegeta-
les, en los efluentes y en el sedimento de la
zona de entrada y de salida, así como tam-
bién la tolerancia de las plantas a las con-
203
diciones del sistema. Respecto de la salini-
dad y el pH, se comprobó que las plantas
del humedal construido adquirieron adapta-
ciones fisiológicas y morfológicas para tole-
rar elevados valores. Las adaptaciones de
las plantas del humedal construido fueron
demostradas por una mayor tasa de creci-
miento relativo y un incremento en la con-
centración de clorofila, en comparación
con los obtenidos en plantas provenientes
de un humedal natural que fueron expues-
tas a las mismas condiciones. Contraria-
mente, las plantas del humedal construido
mostraron estrés cuando fueron expues-
tas a condiciones de pH y salinidad que
son generalmente encontradas en aguas
de humedales naturales. Respecto de la
exposición a metales, cuando T. domingen-
sis se sometió a concentraciones combina-
das de metales se observó que las raíces
disminuyeron sus áreas transversales y su
número de vasos metaxilemáticos, aumen-
tando estos últimos su área. Cuando T.
domingensis fue sometida a altas concen-
traciones de metales, las hojas alcanzaron
concentraciones similares a las de raíces,
determinándose que esto se debió a que
las partes basales de las hojas que estuvie-
ron en contacto directo con la solución sor-
bieron los metales. En los tratamientos con
concentraciones de 500 mg L-1 de metales
por separado y de metales combinados
se observó una menor remoción en agua,
por lo que se concluyó que T. domingensis
toleró esa concentración de metales debido
a que dejó de acumularlos, posiblemente
204 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
para evitar que estas condiciones causen
daños irreversibles. Por otro lado, las partes
sumergidas de las hojas fueron un compar-
timiento muy eficiente para la acumulación
de metales y P, debido a que estos tejidos
se encuentran en contacto directo con la
solución experimental. Las plantas no tole-
raron la exposición a 100 mg L-1 Ni y 500 mg
L-1 Ni y la combinación de 500 mg L-1 Cr +
500 mg L-1 Ni + 500 mg L-1 Zn y tampoco a
los tratamientos de 600 mg L-1 Ni y 600 mg L-1
Cr + 600 mg L-1 Ni + 600 mg L-1 Zn. Además,
se realizaron experimentos para evaluar la
eficiencia de remoción de metales de agua
por hojas secas de T. domingensis. La alta
eficiencia de remoción de metales alcanzada
en soluciones multimetales permitiría propo-
ner que cuando las hojas de T. domingensis
sean cosechadas durante las operaciones
de mantenimiento de un wetland construido,
podrían ser utilizadas como un material bio-
sorbente eficiente, dándole una disposición
final a estos residuos. Respecto del estu-
dio del humedal construido, se observó
que el mismo presentó diferentes etapas de
cobertura de T. domingensis debido a even-
tos de depredación por animales herbívo-
ros y a acciones de manejo, aún así, el sis-
tema siempre mostró una buena eficiencia.
T. domingensis demostró una alta eficiencia
en la retención de metales y nutrientes y una
elevada tolerancia a las condiciones de los
efluentes tratados debido a su capacidad
de adaptación.
Summary
Tolerance and efficiency of Typha domin-
gensis Pers. in the retention of metals and
nutrients from industrial effluents.
The tolerance and efficiency of Typha
domingensis in the retention of metals and
nutrients from industrial effluents were stu-
died. At greenhouse experiments the res-
ponses to extreme conditions to pH and
salinity and to different metal concentrations
were evaluated. The capacity of metal bio-
sorption by dry leaves was evaluated. Besi-
des, a constructed wetland was monitored
by determining metals and nutrients in diffe-
rent plant organs, and in effluents and sedi-
ments of the inlet and outlet zones, as well
as, the plant tolerance to the conditions of
the system was studied. Regarding salinity
and pH, it was probed that the plants from
the constructed wetland acquired physio-
logical and morphological adaptations to
tolerate high values. The adaptations of the
plants from the constructed wetland were
demonstrated by a higher relative growth
rate and an increase in the chlorophyll con-
centration in comparison with the values
obtained in plants from a natural wetland
exposed to the same conditions. The high
efficiency in metal removal achieved in mul-
timetal solutions would propose that when
the leaves of T. domingensis are harvested
during the maintenance of a constructed
wetland, this material could be used as an
efficient biosorbent, giving a final disposal
of these wastes. Regarding the construc-
ted wetland study, it was observed different
stages of T. domingensis cover due to pre-
dation events by herbivores, even so, the
system always showed a good efficiency.
T. domingensis proved a high efficiency in
the nutrient and metal retention and a high
tolerance to the conditions of the treated
effluents due to its adaptation ability.               
Resúmenes tesis
Efectos de metales pesados sobre invertebrados
bentónicos
Paola Judith Pavé
paolapave@yahoo.com.ar
Director: Dra. Mercedes Rosa Marchese
Co-Director: Dra. María Alejandra Maine
Lugar de realización: Instituto Nacional de
Limnología (INALI, CONICET-UNL). Santa
Fe, Argentina.
Laboratorio: Bentos
Fecha de la defensa: 04/12/2012
Resumen
La cuenca del río Salado del Norte, en
su tramo inferior (provincia de Santa Fe), es
receptora de diversos contaminantes como
resultado directo o indirecto de las activi-
dades humanas que se desarrollan en la
zona. Entre ellos se encuentran los metales
pesados, que son vertidos al río por efluen-
tes provenientes principalmente de cur-
tiembres e industrias manufactureras del
cuero, las cuales emplean sales de cromo
como agente curtiente, o efluentes prove-
nientes de galvanoplastias, naftas, resi-
duos domésticos y agrícolas que contie-
nen Cu, Cr y Pb. Los principales objetivos
de esta tesis fueron: (1) Evaluar el grado de
perturbación que presenta el río Salado del
Norte, determinando cómo la contamina-
ción por metales pesados afecta el ensam-
ble de invertebrados bentónicos y estable-
cer qué especies actúan como mejores
indicadores de la salud ambiental. (2) Com-
plementar el estudio de campo con bioen-
sayos para evaluar los efectos del Cr y Cu,
sobre distintos puntos finales en macroin-
vertebrados bentónicos: Chironomus gr.
205
decorus (Diptera, Chironomidae) y Limno-
drilus udekemianus (Oligochaeta, Naidi-
dae). Para el primer objetivo, se realizaron
dos muestreos (uno en el período de aguas
altas y otro en aguas bajas) en dos zonas:
San Justo (SJ, considerada como de refe-
rencia) y Esperanza (E, considerada como
problema), tanto en el centro del cauce
principal, como en su llanura de inundación.
La caracterización de cada zona se realizó
a través de la medición de los parámetros
físicos y químicos, de las concentraciones
de metales pesados (Cr, Cu y Pb) en agua
y sedimentos de fondo y del análisis de los
macroinvertebrados bentónicos. Además
se analizaron en humedales del mismo río
y aledaños, las concentraciones de metales
más abundantes (Cr y Cu) en hepatopán-
creas de Pomacea canaliculata (Mollusca,
Gastropoda), con el fin de evaluar la capa-
cidad de acumulación por parte de dicha
especie. En cuanto al segundo objetivo, se
eligieron para los bioensayos a C. gr. deco-
rus y L. udekemianus por ser taxa claves en
los ensamble de macroinvertebrados ben-
tónicos de los ambientes analizados y por
ser reconocidos mundialmente como orga-
nismos test en estudios con sedimentos
contaminados. En C. gr. decorus se evaluó
la capacidad de acumulación del Cu en sus
tejidos y por otro lado, las posibles malfor-
maciones en las cápsulas cefálicas y altera-
ciones del ciclo de vida (sobre el desarrollo
larval y emergencia) producidas por el Cu y
Cr, en experiencias a escala de microcos-
mos. En L. udekemianus se evaluó el efecto
206 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
del Cr sobre la reproducción (escala micro-
cosmos), y se determinó además la capa-
cidad de acumulación y eliminación del Cr
por esta especie, a escala de mesocosmos.
Los resultados del estudio en el río Salado
revelaron que tanto SJ como E presentan
altas concentraciones de Cr, Cu y Pb y junto
a las variables físicas y químicas analizadas
en agua y sedimentos de fondo, diferen-
ciaron claramente el estado de calidad del
agua entre el cauce principal y los ambien-
tes de la llanura de inundación de ambas
zonas. Por lo tanto, SJ no constituyó una
adecuada zona de referencia. Las concen-
traciones de metales en agua en todas las
estaciones analizadas, fueron mayores a los
estándares permitidos. En cuanto al análisis
de los macroinvertebrados bentónicos, se
determinaron diferencias en la composición
de los ensambles entre el cauce principal y
la llanura de inundación de ambas zonas,
presentando mayor simplificación en E, y en
el cauce del río de ambas zonas, respecto a
los de la llanura. Del resto de los análisis del
bentos, solo la relación densidad de oligo-
quetos versus densidad total, y densidad de
quironómidos versus densidad total, permi-
tió diferenciar a SJ de E. Dichos resultados
demostraron que, E tendría peor calidad
del agua debido, principalmente, por los
oligoquetos. Los resultados del análisis de
metales en P. canaliculata demostraron que
dicha especie respondió como buen acu-
mulador, indicando su utilidad en biomoni-
toreos de contaminación por Cr y Cu. En los
bioensayos con C. gr. decorus, se encon-
tró que concentraciones ≥ 0,75 mg l-1 Cu,
afectó el desarrollo larval, la emergencia y
produjo malformaciones en las cápsulas
cefálicas. Estas últimas pueden ser consi-
deradas como un buen indicador de conta-
minación para biomonitoreos. Mientras que
C. gr. decorus no fue un buen acumulador
de Cu en sedimentos contaminados, pero
sí lo fue en el medio acuoso. En los bioen-
sayos con L. udekemianus y Cr, se demos-
tró que dicho metal afectó negativamente
la reproducción y que esta especie tiene la
capacidad de acumular el metal, según las
concentraciones testeadas, lo que permite
considerarla también (al igual que P. cana-
liculata) como un buen bioacumulador en
ambientes contaminados por Cr. Los resul-
tados obtenidos en esta tesis, permitieron
concluir que el monitoreo conjunto de los
metales pesados, parámetros físicos y quí-
micos y de los macroinvertebrados bentó-
nicos permitió reflejar el grado de perturba-
ción antrópica por metales (Cr, Cu y Pb) que
presenta la cuenca del río Salado del Norte
en los tramos estudiados.
Summary
Heavy metals effects on benthic inverte-
brates
The general aims of this doctoral the-
sis were: (1) To evaluate the perturbation
degree of Salado del Norte River (Santa Fe,
Argentina) determining whether the heavy
metal contamination affects the benthic
invertebrate assemblages and establish the
species that are the best indicators of envi-
ronmental health. (2) To evaluate the effects
of heavy metals (Cr and Cu) on different end
points in benthic macroinvertebrates: Chiro-
nomus gr. decorus (Diptera, Chironomidae)
and Limnodrilus udekemianus (Oligochaeta,
Naididae) in experimental conditions.
For the first objective, two sampling were
carried out (in high and low water levels
periods) in San Justo (as reference area)
and in Esperanza (as disturbed area) areas.
The characterization of each area was per-
Resúmenes tesis
formed determining physical and chemical
variables; concentrations of Cr, Cu and Pb
(in water and bottom sediments) and by the
benthic macroinvertebrates assemblages.
Also, concentrations of Cr and Cu were deter-
mined in the pancreas of Pomacea canali-
culata (Mollusca, Gastropoda) sampled in
wetlands associated to the river in order to
evaluate its accumulation capacity. In relation
to the second objective, the Cr accumulation
capacity of C. gr. decorus was evaluated and
the possible deformities in the head capsules
and life cycle alterations produced by Cu and
Diseño, síntesis y evaluación de novedosos ligandos
quirales derivados de TADDOL
Jesica Paola Perotti
Correo electrónico: jesiperotti@gmail.com
Director / Co-Director: Dr. Santiago Vaillard/
Prof. Dr. Ricardo J. A. Grau†
Lugar de realización: INTEC I - Predio CCT
Santa Fe.
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Química Fina.
Facultad: Bioquímica y Ciencias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 2 de marzo de 2012.
Resumen
La síntesis asimétrica consiste en la pre-
paración enantioselectiva de moléculas qui-
rales. La quiralidad es una propiedad de
simetría de los objetos tridimensionales.
Muchos compuestos pueden obtenerse de
dos formas diferentes en donde las estruc-
turas moleculares constitucionales son
idénticas pero difieren en el ordenamiento
tridimensional de los átomos, de tal manera
207
Cr concentrations were analyzed in experien-
ces at microcosms scale. The effect of Cr on
the reproduction of L. udekemianus (micro-
cosms scale) was studied and Cr accumu-
lation and elimination capacity was determi-
ned at mesocosmos scale. In summary, the
results obtained in this study demonstrated
that simultaneous monitoring of the heavy
metal concentrations, chemical and physical
parameters and benthic community allowed
to reflect the degree of human disturbance
by heavy metals concentrations in the sec-
tions studied of Salado River North basin.
que son imágenes especulares recíprocas.
Estas moléculas que no se pueden super-
poner, se denominan quirales y son enan-
tiómeros una de la otra. Los enantióme-
ros deben considerarse como compuestos
químicos diferentes, particularmente para
propósitos biológicos. Existen numerosos
métodos para preparar un compuesto de
forma enantioselectiva, entre los que encon-
tramos a la resolución de mezclas racémi-
cas, el método controlado por sustrato y la
síntesis asimétrica. La forma más sofisti-
cada actualmente, consiste en la utilización
de catalizadores quirales formados por un
metal de transición y un ligando quiral.
El objetivo de esta tesis fue diseñar y pre-
parar ligandos quirales de fósforo derivados
de análogos de TADDOL para su uso en la
reacción asimétrica de adición conjugada
de dietilzinc a sustratos α,β-insaturados.
El análogo de TADDOL, el compuesto
DIMPTH(OH)2, posee dos grupos metilos
208 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
en el carbinol, y sólo se conoce un caso
donde se emplearon derivados de fósforo
de esta estructura como ligandos quirales.
Además, el comportamiento químico de
DIMPTH(OH)2 es diferente del de TADDOL,
por lo que decidimos diseñar y preparar fos-
fitos, fosfonitos y fosforamiditos derivados
de DIMPTH(OH)2. Asimismo, no se conocen
ligandos de fósforo derivados de la estruc-
tura rígida bis-DIMPTH(OH)2, por lo que nos
propusimos preparar ligandos derivados de
ésta. Finalmente se obtuvieron siete ligan-
dos, cuatro de los cuales son derivados de
DIMPTH(OH)2, dos de bis-DIMPTH(OH)2 y
uno deriva de TADDOL. Se obtuvo la amina
quiral derivada de TADDOL, pero no se
lograron ligandos derivados de ella.
Los ligandos nuevos obtenidos fue-
ron evaluados en la reacción de adición
conjugada asimétrica de dietilzinc a eno-
nas cíclicas α,β-insaturadas, a enonas ací-
clicas α,β-insaturadas y a nitroalquenos
α,β-insaturados. Se evaluaron los ligan-
dos en la adición de dietilzinc a las enonas
2-ciclohexenona y 2-ciclopentenona, repre-
sentativas de las enonas α,β-insaturadas
cíclicas. Se obtuvieron bajos excesos enan-
tioméricos, excepto con el ligando quiral
que posee el sustituyente mentol. Se eva-
luaron los ligandos obtenidos en la adición
de dietilzinc a enonas α,β-insaturadas ací-
clicas, donde los ligandos demostraron
ser mas reactivos y selectivos que con las
enonas cíclicas. Se evaluaron los ligandos
en la adición de dietilzinc a nitroalquenos,
aunque no se observaron los resultados
esperados con este tipo de sustratos. Los
ligandos dieron excesos enantioméricos de
bajos a moderados y fueron muy reactivos
en casi todos los casos.
Summary
Design, Synthesis And Evaluation Of
Novel Chiral Ligands Derived From TADDOL
Enantioselective preparation of chiral
molecules is known as asymmetric synthe-
sis. The molecules that can not overlap
are called chiral enantiomers and should
be considered as different chemical com-
pounds, particularly for biological purposes.
Several methods for preparing a compound
in an enantioselective way are reported,
among which we find asymmetric synthesis.
Currently, the most sophisticated form is the
use of chiral catalysts consisting of a transi-
tion metal and a chiral ligand.
The goal of this thesis was to design and
prepare chiral phosphorus ligands derived
from TADDOL analogues for their use in the
asymmetric conjugate addition reaction of
diethylzinc to alpha,beta-unsaturated subs-
trates. There is only one known case where
phosphorus derivatives used DIMPTH(OH)2
as chiral ligands. In addition, the chemical
behavior of DIMPTH(OH)2 is different from
TADDOL, so we decided to design and pre-
pare phosphites, phosphonites and phos-
phoramidites derived from it. Moreover,
the phosphorus ligands derived from rigid
structure bis- DIMPTH(OH)2 are not known,
so we decided to prepare derivatives of this
structure. Ligands were evaluated in the
addition of diethylzinc to 2-ciclohexenone
and 2-pentenone, where low enantiomeric
excesses were achieved, except with the
chiral ligand derived from menthol. Ligands
were assessed in the addition of diethyl-
zinc to alpha,beta -unsaturated acyclic eno-
nes being more reactive and selective than
with cyclic enones. Finally, ligands obtained
were used in the addition of diethylzinc to
nitroalkenes. The ligands gave low to mode-
rate enantiomeric excesses and were very
reactive in almost all cases.
Resúmenes tesis
Estructura y desarrollo de las inflorescencias de especies
de abildgaardia, bulbostylis y fimbristylis (cyperaceae,
cyperoideae, abildgaardieae)
Andrea Guadalupe Reutemann
Correo electrónico: areutemann@fca.unl.
edu.ar
Director / Co-Director: Dr. Abelardo Carlos
Vegetti / Dr. Raúl Pozner
Lugar de realización: Esperanza, Santa Fe
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento: IAL-
CONICET
Facultad: Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad: Universidad Nacional del Litoral
Fecha de la defensa: 14/V/2012
Resumen
Abildgaardia, Bulbostylis y Fimbristylis
resultan géneros conflictivos tanto para
establecer límites entre y dentro de los mis-
mos, como para hipotetizar acerca de sus
relaciones. La elevada simplicidad que
presentan sus especies en relación a sus
estructuras vegetativas, determina que una
reevaluación morfológica detallada de los
mismos deba realizarse sobre caracteres
reproductivos, siendo las inflorescencias,
por su complejidad y variación, estructuras
potencialmente valiosas para una sistemá-
tica morfológica. La terminología empleada
en la caracterización de estos vástagos flo-
ríferos ha sido hasta ahora siempre utilizada
desde el punto de vista descriptivo, resul-
tando muchas veces ambigua, y no refle-
jando estructuras homólogas útiles para
establecer comparaciones entre taxones.
Caracterizaciones de las transformaciones
que ocurren durante el desarrollo de dichas
estructuras, que contribuyan a una mejor
209
interpretación de la diversidad morfoló-
gica, tampoco han sido llevadas a cabo. Es
por esto que en esta obra se lleva a cabo
un estudio de la morfología de las inflores-
cencias, espiguillas y flores de especies de
Abildgaardia, Bulbostylis y Fimbristylis desde
el punto de vista tipológico y de desarrollo,
como forma de contribuir a la sistemática
de estos géneros. Los resultados obtenidos
apoyan la existencia de una relación más
estrecha entre Abildgaardia y Fimbristylis,
respecto a Bulbostylis. Entre estos datos se
destacan principalmente la presencia exclu-
siva de producciones profilares en las inflo-
rescencias de Bulbostylis, como así también
las similitudes observadas entre Abildgaar-
dia y Fimbristylis en caracteres tales como la
forma del MAV, y por ende la filotaxis similar
en la región del trofotagma, el desarrollo del
estilo y la anatomía de la estilobase.
Summary
Structure and development of the inflo-
rescences in abildgaardia, bulbostylis
y fimbristylis (cyperaceae, cyperoideae,
abildgaardieae)
Abildgaardia, Bulbostylis and Fimbristylis
are morphologically very similar; their taxo-
nomical circumscription and phylogenetic
relationship are hard to discern. Vegetative
structures of their species are simple and
uniform, and therefore only a re-evaluation
of the reproductive structures may help to
understand the taxonomical/phylogenetic
210 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
relationships based on morphology. Among
reproductive characters of Abildgaardia,
Bulbostylis and Fimbristylis, the inflores-
cence is a promising structure for morpho-
logical systematics because of its complex-
ity and diversity. However, inflorescences
of these genera have been described from
a general, descriptive point of view; those
descriptions are ambiguous and not useful
to establish primary homologies, and conse-
quently taxonomical/phylogenetic relation-
ships. In addition, as developmental studies
in other families (i.e. Poaceae) have shown
that similar mature inflorescence structures
may arise from radically different origins and
Desarrollo de Sistemas Inyectables Biodegradables con
Formación in situ para la Liberación Sostenida de Drogas
Veterinarias
Ludmila Noelia Turino
lturino@intec.unl.edu.ar
Director/codirector: Dr. Julio A. Luna; Dr.
Ricardo J.A. Grau; Dra. Ma. Inés Cabrera.
Lugar de realización: Laboratorio de Quí-
mica Fina – INTEC I (UNL – CONICET) –
CCT CONICET Santa Fe.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 27/03/2012.
Resumen
La problemática de la sincronización
y control del ciclo estral en vacas de pro-
ducción lechera fue la base para el estudio
de liberación controlada de progesterona
a partir de matrices poliméricas precipita-
das In situ. Esta tecnología se basa en la
viceversa, this PhD research focuses in a
detailed analysis of the inflorescence, spike-
let and flower structure and development in
selected species of Abildgaardia, Bulbosty-
lis and Fimbristylis, looking for a source of
new morphological characters to support
phylogenetic relationships and taxonomical
boundaries among these genera. Results
support a closer relationship between
Abildgaardia and Fimbristylis. Among those
supporting data are: MAV shape, phyllotaxy
of the trophotagma, style development, and
anatomy stylar base. The production of pro-
hyllar spikelets may be an autapomorphy of
Bulbostylis.
administración intramuscular o subcutánea
de una emulsión fluida, cuya fase dispersa
contiene disuelto el polímero y la droga. Al
entrar en contacto con los fluidos fisiológi-
cos, el polímero precipita por intercambio
de solventes en forma de microesferas, al
conservar la forma de los microglóbulos de
la emulsión, y entrampando la droga en su
matriz. Esto ocurre gracias a que el polí-
mero, en nuestro caso poli–(lactico–co–gli-
cólico) (PLGA), es insoluble en agua. Si sólo
la fase dispersa de la emulsión es inyec-
tada como una solución homogénea, el
producto precipitado toma la forma del sitio
de inyección, es decir, un implante. Una vez
precipitado el sistema, la droga se libera
lentamente a través de dos mecanismos
principales: difusión de la droga y degrada-
ción/erosión del polímero. Las ventajas de
Resúmenes tesis
los sistemas formados In situ incluyen: su
fácil aplicación, la bicompatibilidad y biode-
gradación del PLGA, por lo tanto, la ausen-
cia de una intervención quirúrgica para
remover el material precipitado al término
de la liberación, y la posibilidad de contro-
lar los tiempos de liberación/degradación
variando las propiedades fisicoquímicas del
polímero, entre las más destacadas.
En el Capítulo 1, se realizó una descrip-
ción teórica de los aspectos más importan-
tes de la problemática y de los sistemas de
liberación controlada estudiados en el pre-
sente trabajo de tesis.
En el Capítulo 2, se caracterizó la farma-
cocinética de la droga a liberar, progeste-
rona, en vacas raza Holando de alta y baja
producción lechera con el objeto de cono-
cer los parámetros metabólicos más impor-
tantes y su relación con el nivel de produc-
ción láctea. También, se realizó un estudio
preliminar sobre las diferencias en el meta-
bolismo entre esta raza, Jersey y cruza
HolandoxJersey.
En el Capítulo 3, se caracterizaron exci-
pientes comúnmente utilizados en formu-
laciones de administración parenteral y se
realizó una selección de los mismos para
conformar emulsiones O/O y O/W. Luego
de analizar la distribución de tamaños de
microesferas formadas In vitro, su morfo-
logía y eficiencias de entrampamiento, se
determinó que las emulsiones O/W son
las más recomendadas para el entrampa-
miento de progesterona.
En el Capítulo 4, se obtuvieron perfiles de
liberación In vitro de emulsiones O/W; estos
fueron ajustados con modelos de variada
complejidad para dilucidar los mecanis-
mos de liberación involucrados en cada for-
mulación. Una emulsión, seleccionada en
base a su mayor estabilidad en el tiempo,
211
fue inyectada intramuscularmente en vacas
raza Holando de baja producción lechera,
obteniéndose un perfil de liberación in vivo.
Se evaluó la capacidad de predicción de
un modelo de base fisiológica basado en la
ecuación de liberación in vitro y el metabo-
lismo in vivo de la progesterona obtenido en
el Capítulo 2.
Finalmente en el Capítulo 5, se caracteri-
zaron implantes formados In situ, evaluando
su eficiencia de entrampamiento, morfolo-
gía y perfiles de liberación in vitro. Se evaluó
la capacidad de ajuste de los perfiles por
parte de modelos de base difusivos. Estos
permitieron analizar los fenómenos invo-
lucrados en la liberación de progesterona
a partir de implantes. Dos formulaciones
fueron seleccionadas en base a su libera-
ción in vitro para ser inyectadas intramus-
cularmente en vacas. Los resultados fueron
comparados con los obtenidos in vitro en
busca de una correlación.
Summary
Development of Inyectable and Biodegra-
dable in situ Formed Systems for the Con-
trolled Release of Veterinary Drugs
Estrus control in milk producer cows was
the platform for the study of progesterone
controlled release from In situ formed poly-
meric matrix. This technology is based in the
intramuscular or subcutaneous administra-
tion of a fluid emulsion, of which disperse
phase has the polymer and the drug both
dissolved. Once this emulsion makes con-
tact with physiological fluids, it precipitates
by the exchange of solvents in the spe-
cific form of microspheres, having the drug
entrapped in its matrix. This occurs because
the polymer poly–(lactic–co–glycolic) acid
is insoluble in water. If the disperse phase
212 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
of emulsion is only injected as a homoge-
neous solution, the precipitated product
acquires the form of the site of injection; in
other words: an implant is formed. In Chap-
ter1, we performed a theoretical description.
In Chapter2, we characterized the pharma-
cokinetics of progesterone in Holstein cows
were high and low milk production and Jer-
sey cows and crosses HolandoxJersey. In
Chapter3, we selected excipients to form
O/O and O/W, determining that the O/W
Cambios en el potencial saludable y la calidad nutricional
y sensorial de frutillas mínimamente procesadas como
consecuencia de las condiciones de procesamiento,
la temperatura y el tiempo de almacenamiento
Franco Van de Velde
fvandevelde@fiq.unl.edu.ar
Director/codirector: Daniel R. Güemes y
María E. Pirovani.
Lugar de realización: Instituto de Tecnología
de Alimentos.
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Conservación de Alimentos II.
Facultad: Facultad de Ingeniería Química.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 12/12/2012.
Resumen
Las frutillas son frutas de amplio con-
sumo popular que representan una fuente
relevante de compuestos bioactivos debido
a sus altos niveles de vitamina C y com-
puestos fenólicos, los cuales presentan
efectos antioxidantes beneficiosos para
el mantenimiento de la salud. La introduc-
ción en el mercado de los vegetales míni-
mamente procesados (VMP), es una forma
emulsions are highly recommended for
the entrapment of progesterone. In Chap-
ter4, were obtained in vitro release profiles
of O/W and elucidated the mechanisms of
release. Also, we assessed the predicta-
bility of in vivo profiles of a physiologically
based model. In Chapter5, were character-
ized in situ formed implants, evaluating the
efficiency of entrapment, morphology and
release profiles in vitro and in vivo.
de incrementar el consumo de frutas y hor-
talizas dentro de la población, debido a su
atractiva apariencia, sabor, y comodidad
para el consumidor. El cortado y lavado
del producto vegetal son algunas de las
etapas del mínimo procesamiento que
podrían modificar el aporte de nutrientes
y compuestos bioactivos en los VMP. Sin
embargo, los daños producidos por estas
operaciones, favorecerían la síntesis de
compuestos fenólicos, con un consecuente
aumento en la capacidad antioxidante de
estos productos. Por otra parte, el lavado–
desinfección usando ácido peracético
(APA) como sanitizante está siendo promo-
cionado en la industria de los VMP debido a
que, a diferencia de los productos clorados,
no causa la formación de compuestos halo-
genados cancerígenos.
El objetivo general fe la presente tesis fue
el estudio y la optimización de tecnologías
de procesamiento y conservación en la ela-
Resúmenes tesis
boración de frutillas frescas cortadas, con el
fin de evitar pérdidas de compuestos bio-
activos, como así también, de aumentar su
potencial saludable para brindar al consu-
midor un producto natural con un posible o
ampliado efecto protector sobre su salud.
Se realizó un estudio de los cambios en
la calidad nutricional, compuestos bioac-
tivos y calidad microbiológica de frutillas
frescas cortadas en cuartos como conse-
cuencia de la operación de lavado–desin-
fección con APA, variando la concentración
del agente activo, el tiempo de exposición
y la temperatura de la solución de lavado.
Se empleó la Metodología de Superficie
de Respuesta, usando un diseño de Box–
Behnken de 15 corridas experimentales.
En el diseño de lavado–desinfección N°
1 se lavaron frutillas variedad Camarosa en
las condiciones: 0 – 80 mg L-1 APA, 4 – 40
°C, y 10 – 60 s; siendo las respuestas estu-
diadas: porcentajes de retención (% R) de
ácido ascórbico (AA), vitamina C (Vit C),
antocianinas totales (Ant T), fenoles totales
(FT), capacidad antioxidante (CA), sólidos
solubles (SS), cambios en la acidez total,
pH y parámetros de color. Los resultados
indicaron que las variables del proceso y
los niveles utilizados en la operación afec-
taron la retención de AA, lo que pudo cuan-
tificarse con el modelo predictivo obtenido.
Ampliando el espacio experimental (0 – 100
mg L-1APA, 4 – 40 °C, y 10 – 120 s), en el
diseño N° 2, el lavado–desinfección se estu-
dió sobre dos cultivares de frutillas (Cama-
rosa y Selva). En este caso se agregó como
respuesta la reducción de microorganismos
aerobios mesófilos totales (red FAM). Los
% R de AA, Ant T, FT, y CA se vieron afec-
tados por las variables del proceso, princi-
palmente por la concentración de APA y el
213
tiempo. Al no observarse diferencias entre
los cultivares para estos atributos, los resul-
tados se modelaron conjuntamente. Las
variables de la operación afectaron el % R
Vit C y los cambios de color solo en la varie-
dad Selva. Por otra parte, la red FAM fue
afectada por las variables del proceso en
ambos cultivares de manera diferente y se
obtuvieron modelos predictivos para cada
uno de ellos.
Una optimización simultánea de las res-
puestas del diseño n° 2, usando la ecuación
deseabilidad de Derringer, permitió encon-
trar condiciones de lavado en dos escena-
rios: a) maximizando red FAM con 90 % de
retención en los compuestos bioactivos:
100 mg L-1 PAA, 50 s, and 24 °C y b) maxi-
mizando la retención de compuestos bioac-
tivos con una aceptable red FAM: 20 mg L-1
APA, 52 s, and 18 °C. Experiencias adicio-
nales de validación demostraron la eficacia
de los modelos obtenidos.
Por otra parte se estudió el efecto del
corte y la temperatura de almacenamiento
de frutillas frescas sobre la retención de AA,
ácido deshidroascórbico (ADHA); Vit C, Ant
T, FT, CA, SS, pH y parámetros de color.
Las frutillas se cortaron como enteras des-
pedunculadas (ED), cortadas en mitades
(CM) y cortadas en cuartos (CC), almace-
nándose a 2, 6, 13 y 20 °C, por un periodo
de 15, 10, 8–9 y 2–3 días, respectivamente.
La evolución de los atributos ADHA, SS,
pH y color en función del tiempo pudo ser
modelada con cinéticas de orden cero. La
dependencia de las constantes de reacción
con la temperatura mostró un buen ajuste
con la ecuación de Arrhenius. Las energías
de activación para los atributos mostraron
una mayor sensibilidad a la temperatura de
las frutillas frescas cortadas que las ED. El
214 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
efecto del corte provocó la acumulación de
compuestos fenólicos en las frutillas fres-
cas cortadas. Los mayores aumentos (23 %
del basal) se dieron en las frutillas CC, las
de mayor grado de injuria. Por lo tanto, se
podrían preparar frutillas frescas CC y con-
servarse a temperaturas bajas (2 °C), obte-
niéndose de este modo productos con un
potencial bioactivo aumentado.
Summary
Changes in the health potential, nutri-
tion and sensory quality of minimally pro-
cessed strawberries as result of process-
ing conditions, temperature and storage
time
A study of changes in nutritional quality,
bioactive compounds and microbiological
quality of fresh–cut strawberries into quar-
ters was performed as a consequence of
washing–disinfection with peracetic acid
(APA) at different concentration, contact
times and temperatures. Furthermore, the
effect of cutting and storage temperature on
strawberries bioactive compounds retention
was also studied. Response Surface Meth-
odology was used to study washing–disin-
fection using a Box–Behnken design in 15
runs. Camarosa and Selva strawberries were
washed under variable conditions: 0 – 100
mg L-1 APA, 4 – 40 °C, and 10 – 120 s. The
responses were: retention percentages of
ascorbic acid (AA), vitamin C (Vit C), total
anthocyanins (Ant T) and phenols (FT), anti-
oxidant capacity (CA), soluble solids (SS),
total acidity, pH, color and microbial count
reduction. Simultaneous optimization in two
scenarios (OP 1 and OP 2) allowed finding
conditions of variables which satisfied dif-
ferent criteria. OP 1 conditions (100 mg L-1
APA, 50 s, and 24 °C) were obtained when
microbial reduction was maximized with 90
% bioactive compounds retention. OP 2
conditions (20 mg L-1 APA, 52 s, and 18 °C)
were obtained when bioactive compounds
retention was maximized with an accept-
able microbiological reduction. Confirma-
tory experiments showed good agreement
between experimental results and predicted
responses at both optimization scenarios.
Otherwise, cutting strawberries experiences
into quarters, induced an increase in FT with
a consequent increment in their CA; and that
increase happened quickly when increas-
ing storage temperature. Therefore, fresh–
cut strawberries with an enhanced bioactive
potential can be prepared into quarters and
stored at low temperatures.
Resúmenes tesis
Leptospirosis humana: estudio para la obtención
de herramientas de diagnóstico y evaluación de la utilidad
del serodiagnóstico en diferentes etapas
de la enfermedad
Vanasco Norma Bibiana
bibi-vanasco@hotmail.com
Director/codirector: Héctor Dante Tarabla.
Lugares de realización: Laboratorio de
Leptospirosis – FBCB – UNL y Laboratorio
Nacional de Referencia de Leptospirosis –
INER “Dr. E. Coni” – Administración Nacio-
nal de Laboratorios e Institutos de Salud
(ANLIS).
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Leptospirosis – FBCB –
UNL, Metodología de la Investigación.
Facultad: Bioquímica y Ciencias Biológicas
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 14/09/2012.
Resumen
La leptospirosis humana es la zoonosis
más ampliamente distribuida en el mundo.
Sin embargo, la información publicada sobre
las características clínicas y epidemiológi-
cas de la enfermedad en Argentina es muy
escasa. Por otra parte, dado que las técni-
cas diagnósticas de referencia no permiten
la detección temprana de casos, es necesa-
rio desarrollar y evaluar nuevas pruebas.
Los Objetivos Generales de esta tesis
fueron: 1. Desarrollar ELISAs IgG para
detectar anticuerpos antileptospiras en
muestras de suero humano; 2. Evaluar el
error sistemático global y en diferentes eta-
pas de la evolución de la enfermedad y el
error aleatorio de los ELISAs desarrollados
y de la macroaglutinación (TR); 3. Evaluar
215
la presentación clínica y epidemiológica de
los casos de leptospirosis e identificar fac-
tores de riesgo para la adquisición de la
enfermedad.
Se obtuvieron 11 antígenos extractivos
mediante cultivo y lisado de cepas patrón
de Leptospira interrogans y biflexa. Se rea-
lizó un mapeo de epitopes de LipL32 y
LipL41 de L. interrogans serovar Copenha-
geni, identificándose dos regiones antigé-
nicas (P1 y P2) en la LipL32. Se diseñaron
y obtuvieron dos péptidos sintéticos y tres
proteínas recombinantes. Posteriormente se
desarrollaron cuatro ELISAs para la detec-
ción de anticuerpos IgG en muestras de
suero sanguíneo utilizando cuatro antíge-
nos elegidos en base a su capacidad dis-
criminatoria: uno con antígeno extractivo
(serovares Pyrogenes y Tarassovi), dos con
péptidos sintéticos (P1–ELISA y P2–ELISA)
y uno con el recombinante conteniendo
la secuencia de ambos péptidos (REC–
ELISA). El criterio de definición de casos
incluyó los resultados de la Microaglutina-
ción (MAT) y los antecedentes clínicos y de
laboratorio general. Los tiempos de evolu-
ción se dividieron en tres etapas: 1 (<10
días), 2 (de 10 a 25 días) y 3 (>25 días).
El ELISA desarrollado con antígeno
extractivo permitió en la etapa 1 mayor
detección de casos que el TR, la MAT y
los otros tres ELISAs, haciéndolo desde el
cuarto día de evolución de la enfermedad.
En la etapa 2 evidenció la mayor sensibili-
216 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
dad 95,6 % (89,1; 98,8), especificidad 95,7
% (89,2; 98,8), VPP 95,7 % (89,2; 98,8), VPN
97,7 % (91,9; 99,7) y AUC 0,974 (0,938;
0,992). En la etapa 3 y en la evaluación glo-
bal mostró mayor AUC 0,943 (0,840; 0,988)
que los otros ELISAs y una concordan-
cia excelente entre sus resultados. Estos
hallazgos indican que en el caso de selec-
cionar un solo antígeno, el extractivo sería la
mejor opción.
La baja sensibilidad del TR en la primera
etapa, su baja especificidad y su variabili-
dad intra e inter–operador, indicarían que
no es conveniente su utilización como única
prueba tamiz.
Las AUCs de los cuatro ELISAs fueron
mayores en las etapas 2 (de 0,974 a 0,787)
y 3 (de 0,943 a 0,818) debido principal-
mente a la baja sensibilidad en la etapa 1.
En coincidencia, el meta–análisis identificó
que las pruebas de ELISA presentan mayor
eficacia cuando se aplican en individuos en
fase convaleciente.
Por lo expuesto, ningún método sero-
lógico sería capaz de resolver individual y
completamente el diagnóstico en los pri-
meros 9 días de la enfermedad. En esta
primera etapa, la RT–PCR fue el método
que permitió la mayor detección de casos,
seguido del ELISA extractivo. Estos resulta-
dos avalan la conclusión de que un método
directo, como la RT–PCR, detecta los casos
de leptospirosis de forma más temprana
que los métodos serológicos. Se concluye
entonces en primer lugar, que RT–PCR sería
el mejor método para la detección precoz
de casos en muestras de hasta seis días
de evolución. Luego una combinación de
RT–PCR y ELISA extractivo resolvería el
problema del diagnóstico en esta etapa
en forma global. Finalmente si las mues-
tras son de entre 6 y 9 días de evolución el
ELISA extractivo sería la mejor opción.
El serogrupo presumiblemente infec-
tante más frecuente fue Icterohaemorrhagie
seguido de Pomona, Ballum y Canicola. La
mayoría de los casos ocurrieron en adultos
de sexo masculino durante los meses cáli-
dos y lluviosos, con fiebre, dolor de cabeza
y mialgia. La inyección conjuntival se mani-
festó en el 55 % de los casos confirmados
y en el 43 % de los No casos. Aunque el
trabajo rural continúa siendo un factor de
riesgo en Argentina (OR= 3,41; 1,45– 8,06),
el contacto prolongado con inundaciones
fue el factor más importante (OR= 4,49;
1,17–17,25).
Summary
Human leptospirosis: study to obtain
diagnostic tools and assessment of the
utility of serodiagnosis in different stages
of the disease.
In this work antigenic regions were iden-
tified (P1 and P2) in LipL32. Synthetic pep-
tides and recombinant proteins were desig-
ned and obtained. Using four of these
antigens ELISAs were then developed to
detect IgG antibodies in serum samples.
Three stages of the disease were conside-
red: 1 (<10 days), 2 (10 to 25 days) and 3
(> 25 days).
In Stage 1, extractive antigen detec-
ted more cases than TR, MAT and any of
the other three antigens. In Stages 2 and
3 and in overall evaluation extractive anti-
gen showed higher efficacy than the others
and an excellent agreement. The low sensi-
tivity of TR in the first stage, its low specifi-
city and high intra and inter operator varia-
bility indicate that it is not convenient to use
Resúmenes tesis
TR the sole screening test. Meta–analysis
identified that ELISAs were most effective
when applied to patients in the convales-
cent phase.
In this initial period, RT–PCR is the best
method for early detection of cases in sam-
ples taken up to day six of disease evolu-
tion. A combination of RT–PCR and extrac-
tive ELISA would be a good choice to solve
the problem of diagnosis in this first Stage.
Estudio de la expresión de Heat Shock Proteins (HSPs)
en el ovario bovino normal y en condiciones patológicas
Melisa María del Luján Velázquez
melisavel@gmail.com
Director/codirectora: Hugo H. Ortega /
Natalia R. Salvetti.
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Biología Celular y Molecular
Aplicada.
Facultad: Facultad de Ciencias Veterinarias.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 13/03/2012.
Resumen
Los procesos reproductivos, para tener
éxito, deben estar en armonía y sincroni-
zados con el medio ambiente. Las condi-
ciones desfavorables como: temperaturas
extremas, disminución de los nutrientes,
exposición a sustancias nocivas inducen
estrés en los organismos y reprimen la
reproducción a través de vías hormonales y
nerviosas. Se ha demostrado que las altas
temperaturas pueden afectar los distintos
eventos reproductivos a través de altera-
ciones en la proliferación y la apoptosis de
células ováricas, así como también inducir
la hipersecreción de hormonas esteroideas.
217
The most common presumed infec-
ting serogroup was Icterohaemorrhagiae,
followed by Pomona. Most cases occurred
in adult males during the warm and rainy
season, showing fever, headache and myal-
gia. Although rural labor remains to be a risk
factor in Argentina (OR= 3.41, 1.45; 8.06),
prolonged contact with flood was the most
important single factor (OR= 4.49, 1.17:
17.25).
Asimismo, se ha identificado al estrés como
posible factor etiológico de la enfermedad
quística ovárica (COD, del inglés Cystic Ova-
rian Disease) y de hecho se ha encontrado
una relación estrecha entre los mecanismos
neuroendócrinos de respuesta al estrés, la
actividad del sistema simpático y la activa-
ción celular de la expresión de HSPs.
La COD se presenta frecuentemente
en vacas lecheras de alta producción. Se
caracteriza por la presencia de estructuras
foliculares de un diámetro mayor al ovula-
torio que permanecen en el tiempo ocasio-
nando trastornos en la funcionalidad ová-
rica. Su manifestación lleva a prolongar el
intervalo parto–concepción, provocando
grandes pérdidas a la producción pecuaria
general.
En el presente estudio, se han des-
cripto y evaluado los niveles proteicos y de
ARNm de algunas proteínas de golpe tér-
mico (HSPs) con el objeto de relacionarlos
con la foliculogénesis normal y la COD en
la especie bovina. Se trabajó con muestras
de ovarios de distintas procedencias: ani-
males sometidos a un modelo experimental
218 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
de inducción de COD; animales en produc-
ción con desarrollo espontáneo de la enfer-
medad, y muestras obtenidas en frigorífico.
Los resultados de esta tesis y su relación
con los reportes de otros autores permitie-
ron arribar a las siguientes conclusiones: 1–
Hsp27 y Hsp70, proteínas implicadas en la
inhibición de los mecanismos de apopto-
sis, estuvieron sobreexpresadas en estruc-
turas quísticas espontáneas. Para el caso
de Hsp60 los ensayos a partir de ovarios
obtenidos en frigorífico permitieron confir-
mar que la proteína se expresa mayormente
en quistes, mientras que su ARNm está
elevado en granulosa de folículos antra-
les medianos confirmando lo hallado pre-
viamente por otros autores. Por su parte,
la inmunodetección de Hsp90 mostró simi-
litudes a lo encontrado para Hsp70. 2– de
Hsp10 se observó que los mayores niveles
de mensajeros fueron encontrados en folí-
culos antrales respecto de lo observado
en estructuras quísticas; lo que se condice
con los hallazgos de otros autores en folícu-
los de humanos y de ratón. Los niveles de
ARNm correspondientes a Hsp27, Hsp40 y
Hsp70 en granulosa de quistes fueron infe-
riores a los encontrados en folículos antra-
les pequeños y medianos; y para el caso
de Hsp60, la expresión de su ARNm se
correspondió con los elevados niveles pro-
teicos encontrados en quistes espontáneos
en células de la teca. Para las isoformas
de Hsp90 ( y ) la expresión de mensaje-
ros estuvo disminuida en quistes folicula-
res provenientes de frigorífico para Hsp90
mientras que fue notable el aumento de
Hsp90. 3– Hsp27, Hsp70, Hsp40 podrían
estar involucradas en el desbalance de los
eventos de proliferación/apoptosis des-
cripto en las estructuras quísticas, inhi-
biendo a diferentes niveles la muerte celular
programada y favoreciendo de esta manera
la persistencia de las mismas. Las isofor-
mas Hsp90/Hsp90 estuvieron en directa
relación con los niveles de expresión de los
RE y RE, lo que denotó su implicancia en
la foliculogénesis normal y en alteraciones
de la misma. 4– El modelo experimental uti-
lizado permitió el estudio y conocimiento
de aspectos difíciles de abordar trabajando
con muestras provenientes de animales fae-
nados. La alta variabilidad de dichas mues-
tras y la falta de información en relación a
estos animales podrían explicar las diferen-
cias observadas entre el modelo utilizado y
los casos espontáneos de los que provinie-
ron estas muestras. El trabajo con anima-
les que desarrollen la enfermedad espon-
táneamente y de los cuales se conozca la
historia podría ayudar a establecer y fijar
más variables en relación al estado corpo-
ral, balance energético, tratamientos pre-
vios, que se relacionen con la patogenia de
la enfermedad quística ovárica en el bovino.
Summary
Study of the expression of Heat Shock
Proteins in normal bovine ovary and in
pathological conditions
Adverse conditions suppress reproduction
through stress–related substances. These
anomalies induce changes in the expres-
sion of numerous genes, including genes
encoding Heat Shock Proteins. Stress has
been identified as etiological factor of Cys-
tic Ovarian Disease (COD) and recently
found a close relationship between the neu-
roendocrine mechanisms of stress response
and HSPs expression. The COD has been
defined as the presence of one or more follic-
ular structures in the ovary, with a diameter of
at least 20 mm, which persist for more than
Resúmenes tesis
10 days in the absence of luteal tissue, inter-
rupting the normal reproductive cycle.
In the present study, we described the
ovarian protein and mRNA levels of HSP in
order to relate them to normal folliculogen-
esis and to COD. We worked with animals
subjected to an experimental model of induc-
tion of COD; dairy cows with spontaneous
COD and ovary samples from abattoir.
The protein levels of Hsp27, Hsp60,
Hsp70 and Hsp90 were clearly detectable in
all stages of follicular development. Levels
of Hsp10, Hsp27, Hsp40, Hsp60, Hsp70,
Hsp90 and Hsp90 mRNAs showed dif-
Propiedades ópticas y estructurales del silicio amorfo
hidrogenado con diversos grados de cristalinidad
Pablo Andrés Rinaldi.
rpabloa@gmail.com
Director/codirector: Dr. Roberto Koropecki /
Dr. Román Buitrago.
Lugar de realización: INTEC.
Laboratorio, Cátedra o Departamento:
Laboratorio de semiconductores.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de defensa: 09/03/2012.
Resumen
El silicio amorfo hidrogenado (a–Si:H)
posee una estructura de tipo “red conti-
nua aleatoria” con defectos, que mantiene
el orden de corto alcance. La presencia de
hidrógeno saturando enlaces colgantes en
el a–Si:H reduce la densidad de defectos
electrónicos dentro de la banda prohibida
del material. A diferencia del silicio crista-
lino, la pérdida de periodicidad rompe las
219
ferences related to expression between
normal and cystic follicular structures.
The differences between the experimental
model and the cyst samples from slaughter-
house, could be explained by the high vari-
ability of these samples and the absence
of information about these animals. Work-
ing with animals that developed the dis-
ease spontaneously and the knowledge of
the clinical story could help to establish vari-
ables such as body condition, energy bal-
ance, previous treatments, relating to the
pathogenesis of cystic ovarian disease in
cattle.
reglas de selección, favoreciendo la absor-
ción de fotones en la región infrarroja del
espectro. Por este motivo el a–Si:H es útil
para la fabricación de celdas fotovoltaicas
en película delgada, aunque con la desven-
taja de la inestabilidad frente a la exposi-
ción a la luz (efecto Staebler–Wronski) que
produce un decaimiento de la eficiencia en
las celdas. La solución planteada aquí es
utilizar la mayor velocidad de preparación
posible de las películas delgadas, aunque
el material presente propiedades optoelec-
trónicas pobres, y luego proceder a la cris-
talización buscando un tamaño de grano
aceptable y una pequeña influencia por
parte de los bordes de grano.
En esta tesis se estudia paso a paso,
mediante técnicas de caracterización óptica
y estructural, la cristalización del a–Si:H
depositado sobre vidrio mediante PECVD
(deposición química en fase vapor asistida
por plasma). Las técnicas de reflectancia
220 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
en UV, rayos X, Raman, y espectrometría
fotoacústica (PAS) son usadas para ana-
lizar la transición desde el estado amorfo
al cristalino usando la técnica de recocido
escalonado hasta los 600 ºC, este proce-
dimiento conduce a un silicio nanocrista-
lino. Las transmitancias en la región visi-
ble e infrarrojo cercano son utilizadas para
obtener constantes ópticas y mediante el
modelo teórico de Hu et al. se calculó la
difusividad térmica del a–Si:H a partir de las
señales fotoacústicas en muestras recoci-
das a temperaturas correspondientes a la
máxima efusión de cada hidruro. Se encon-
tró que existe un ascenso en la señal fotoa-
cústica en las muestras recocidas a tempe-
raturas inferiores a 500ºC, que representa
una transición vítrea, esto es, un descenso
abrupto en la capacidad calorífica, que se
manifiesta en la difusividad térmica, y a una
temperatura crítica de ~425 ºC. Esta transi-
ción, que no es detectada por las otras téc-
nicas mencionadas, es producida por un
reacomodamiento de enlaces Si–H. La con-
ductividad térmica se mantiene constante
dado que las temperaturas menores a 500
ºC se apartan mucho de las correspondien-
tes a la nucleación y cristalización. Se con-
cluye además que en las medidas de PAS
el efecto térmico del sustrato de vidrio es
despreciable.
Summary
Optical and structural properties of hydro-
genated amorphous silicon with varying
degrees of crystallinity
Hydrogenated amorphous silicon (a–
Si:H) has a structure with defects favoring
the absorption of photons in the infrared
region. For this reason the a–Si:H is use-
ful for the photovoltaic thin film solar cells,
but with the disadvantage of instability from
exposure to light (Staebler–Wronski effect)
that causes a decline in the efficiency of the
cells.
The solution proposed in this thesis is a
step by step study of the crystallization of
a–Si:H is performed by using techniques of
optical and structural characterization. The
semiconductor is deposited on glass by
PECVD (Plasma Assisted Chemical Vapor
Deposition). UV reflectance, X–ray, Raman,
and photoacoustic spectroscopy (PAS)
techniques are used to analyze the tran-
sition from amorphous to crystalline state
using the technique of stepwise annealing
up to 600ºC, this procedure leads to nano-
crystalline silicon. The thermal diffusivity of
a–Si:H has been obtained from the pho-
toacoustic signals in samples annealed at
temperatures corresponding to the largest
effusion of each hydride. A jump has been
observed in the photoacoustic signal for
samples annealed at temperatures below
500 °C, which correspond to a glass transi-
tion, i.e. a sharp drop in heat capacity, which
is manifested in the thermal diffusivity, and
a critical temperature ~425 °C. This transi-
tion, not detected by the other techniques
mentioned, is produced by a rearrangement
of Si–H bonds. The thermal conductivity is
constant for annealing temperatures lower
than 500 ºC, far from the corresponding to
the nucleation and crystallization temperatu-
res. We conclude that in our photoacoustic
experiment, the thermal effect of the glass
substrate is negligible.
Resúmenes tesis 221

Silicio cristalino para dispositivos fotovoltaicos

Nicolás Budini SPC afecta considerablemente al tamaño

nicolas.budini@ifis.unl.edu.ar / budinense@ de grano final, obteniéndose un material
gmail.com nanocristalino con tamaño de grano menor
Director/codirector: Dr. Roberto Delio Arce / a 1 µm. Por el contrario, mediante la cris-
Dr. Javier Alejandro Schmidt. talización por NIC se obtuvieron películas
Lugar de realización: Instituto de Desarro- de pc–Si intrínsecas sobre vidrio con alta
llo Tecnológico para la Industria Química cristalinidad y con tamaños de grano por
(UNL–CONICET). encima de los 100 µm. Se encontró que el
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:  dopaje leve con boro (tipo p−) no afecta
Grupo de Física de Semiconductores y Dis- al proceso de cristalización ni al tamaño
positivos Fotovoltaicos. de grano final de las películas, mientras
Facultad: Facultad de Bioquímica y Ciencias que el dopaje elevado con boro (tipo p+) o
Biológicas / Facultad de Ingeniería Química. con fósforo (tipo n+) influye fuertemente en
Universidad: Universidad Nacional del Litoral. el mecanismo de cristalización en perjui-
Fecha de la defensa: 09/03/2012. cio de la calidad del material resultante. Se
demostró además que mediante el proceso
Resumen de cristalización por NIC de películas dopa-
En esta tesis doctoral se exponen los das tipo p, depositadas en estructura p+/
resultados obtenidos durante la investiga- p−, pueden obtenerse capas policristalinas
ción desarrollada sobre la cristalización de con tamaños de grano considerable. Estas
películas delgadas de silicio amorfo hidro- películas pueden actuar como capas semi-
genado (a–Si:H) con el objetivo de obtener lla para inducir la cristalización epitaxial en
capas de silicio policristalino (pc–Si) aptas fase sólida de capas de a–Si:H depositadas
para la aplicación a dispositivos fotovoltai- sobre ellas. De esta manera podrían obte-
cos. Se investigaron diferentes aspectos de nerse celdas solares policristalinas com-
la cristalización en fase sólida (SPC) y de la pletas, de estructura vidrio/p+/p−/n+ y gran
cristalización inducida por níquel (NIC) de tamaño de grano. Se investigó también la
a–Si:H intrínseco y dopado, depositado a posibilidad de obtener celdas solares de
altas velocidades por deposición química estructura vidrio/n+/p−/p+, para lo cual se
desde la fase vapor asistida por plasma desarrolló un proceso de cristalización epi-
(PECVD), con la finalidad de mejorar la cali- taxial sobre una capa semilla tipo n+. Este
dad cristalina del material resultante. A lo proceso involucra el dopaje externo de una
largo de la investigación se buscó optimizar película intrínseca previamente cristalizada
el proceso de cristalización en función de mediante NIC, de tal manera de subsanar
obtener el mayor tamaño de grano posible. las dificultades que introduce el fósforo en
Se encontró que la presencia de hidrógeno la cristalización. Se mostró también que las
durante la cristalización de las películas por condiciones de vacío durante la cristaliza-
222 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
ción por NIC de a–Si:H influyen considera-
blemente en la etapa de nucleación, previa
a la cristalización, permitiendo reducir con-
siderablemente el tiempo necesario para
lograr la cristalización completa de las pelí-
culas. Además de esto se observó una dis-
minución del tamaño de grano final que, de
todas maneras, sigue siendo relativamente
grande (~30 µm) y apto para la aplicación
de estas películas a dispositivos fotovoltai-
cos. Se llevaron a cabo simulaciones sim-
ples para caracterizar el proceso de crista-
lización por NIC de a–Si:H, desde el punto
de vista de la teoría clásica de cristalización
para procesos de nucleación y crecimiento.
Los resultados obtenidos durante este tra-
bajo representan una contribución impor-
tante al campo de la cristalización de pelí-
culas de a–Si:H, al conocimiento sobre el
proceso de cristalización por NIC para la
obtención de películas de pc–Si y a la apli-
cación de las mismas en dispositivos foto-
voltaicos de bajo costo. La principal ventaja
del pc–Si radica en que, teóricamente, per-
mitiría lograr eficiencias de conversión de
alrededor del 15 % en celdas solares con
espesores en el orden de 10 µm.
Summary
Polycrystalline silicon for photovoltaic
devices
This thesis exposes the results obtained
during a research on crystallization of hydro-
genated amorphous silicon thin films for
obtaining polycrystalline films suitable for
photovoltaic devices. Several aspects of
the solid phase crystallization (SPC) and
nickel induced crystallization (NIC) of intrin-
sic and doped films, deposited by plasma
enhanced chemical vapor deposition, were
addressed in order to improve the crystal-
line quality and the grain size of the result-
ing material. The presence of hydrogen dur-
ing SPC was found to considerably affect
the grain size, giving sizes below 1 micron.
In counterpart, intrinsic polycrystalline films
with grain sizes above 100 microns were
obtained with the NIC method. Slight boron
(p–) doping levels neither affect the crystalli-
zation process nor the final grain size of the
films, while high boron (p+) or phosphorous
(n+) doping levels are detrimental for the
resulting material. Starting from a stacked
p+/p– doped structure, large–grained poly-
crystalline layers were also obtained. These
films can act as seed layers, inducing epi-
taxial crystallization of amorphous films
deposited on top. In this way, complete
polycrystalline solar cells with large grains
could be obtained. It was demonstrated
that vacuum conditions during NIC strongly
influence the nucleation stage, and reduce
the required time to achieve full crystalli-
zation. However, a smaller final grain size
is obtained but, anyway, it is still relatively
large (30 microns) and suitable for photo-
voltaic applications. Simple computer sim-
ulations were performed to characterize the
NIC process, from the viewpoint of classical
theory of crystallization involving nucleation
and growth phenomena.
Resúmenes tesis
Resúmenes Tesis: Maestría en Didáctica
de las Ciencias Exprimentales
Alfabetización Científica de Personas Adultas
Manipuladoras de Alimentos
Omar Ramón Misetich
omisetich@gmail.com
Director/codirector: Oscar Héctor Pliego /
Cristina Susana Rodríguez.
Lugar de realización: zona de influencia de
la ciudad de Santa Fe.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa:  31/10/12.
Resumen
Se informa acerca de un estudio reali-
zado con la participación de seis personas
adultas manipuladoras de alimentos.
La investigación comenzó realizando un
pre test, en octubre de 2007, para indagar
en estas personas sus conocimientos pre-
vios conceptuales y procedimentales, y sus
actitudes hacia la aplicación de fundamen-
tos científicos.
Luego se planteó una propuesta didác-
tica para aplicación inmediata de los resul-
tados de la capacitación a su vida diaria y
consistió en un cursado total de 18 horas,
durante noviembre y diciembre de 2007,
distribuidas en 6 semanas, dictando 2 cla-
ses semanales de 90 minutos cada una.
En febrero de 2008, se realizó un pos test
sobre los mismos ítems consultados en el
pre test, pero planteados a casos concretos
de la actividad laboral que desempeñan.
223
Finalmente, de ambos resultados se hizo
una comparación de cada ítem, lo cual per-
mitió estimar una mejora en sus conoci-
mientos y actitudes hacia el uso de concep-
tos científicos.
Los instrumentos, tanto en los pre como
en los pos test, fueron cuestionarios de múl-
tiple elección para los contenidos cogniti-
vos y procedimentales, mientras que para
evaluar los contenidos actitudinales fueron
utilizadas escalas de Likert.
Se considera que la mejora encontrada
en estas personas, en cuanto a su forma-
ción básica con fundamentos científicos,
les permitirá desempeñarse laboralmente
con mayor idoneidad y, teniendo en cuenta
el impacto que dicha actividad laboral tiene,
lo harán con mayor responsabilidad social.
Summary
Scientific literacy of adults food handlers 
It reports a study conducted with the par-
ticipation of six adults food handlers.
The investigation began in october 2007
with a pre test, in order to inquire in these
adults about their previous conceptual and
procedural knowledges, and their attitudes
toward the application of scientific principles.
After it, a didactic proposal of 18 hours
was made in november and december 2007
for immediate application of the results to
224 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
the daily life of this persons, that was distri-
buted in 6 weeks, with 2 weekly classes of
90 minutes each.
A pos test on the same items consulted
in the pre test was made in february 2008,
but applied on specific cases of their labor
activity.
Finally, a comparison about each
item from both results was made, which
allowed to estimate an improvement in their
knowledges and attitudes toward the use of
scientific concepts.
The instruments, both in the pre as in the
pos test, were multiple choice questionnai-
res to evaluate their cognitive and proce-
dural contents, while to evaluate attitudinal
contents was used Likert scale.
An improvement was found in these per-
sons, in regard to their basic training with
scientific principles, which will allow them
to work professionally with greater compe-
tence and, taking into account the impact
that this labor activity has, will allow do so
with greater social responsibility.
Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17 • PÁGS. 225 a 242
Premio Mullor
Metabolismo energético y del poder reductor en células
autótrofas y heterótrofas
Claudia Vanesa Piattoni
piattoni@fbcb.unl.edu.ar
Director/codirector: Dr. Alberto Álvaro Igle-
sias / Dr. Sergio Adrián Guerrero.
Lugar de realización: Instituto de Agrobio-
tecnología del Litoral (IAL, CONICET–UNL).
Laboratorio, Cátedra y/o Departamento:
Laboratorio de Enzimología Molecular.
Facultad: Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas.
Universidad: Universidad Nacional del Litoral.
Fecha de la defensa: 23/03/2010.
Resumen
En la naturaleza existe una gran diversi-
dad de organismos que provienen de un
largo proceso evolutivo, el cual ha llevado
a un ancestro común a diferenciarse y así
adaptarse a distintos ambientes generando
la aparición de nuevas especies. La teoría
de la evolución fue expuesta por Charles
Darwin en su obra “El origen de las espe-
cies” publicada el 24 de noviembre de 1859.
Sin embargo, no fue sino hasta el siglo XX
cuando pudo llegar a apreciarse cabal-
mente el genio de Darwin, ya que la gené-
tica, la observación de campo y la investi-
gación de laboratorio nos han demostrado
el poder explicativo de sus teorías. Ha
quedado claro que el trabajo de Darwin y
la obra de Gregor Mendel sobre la gené-
tica (publicada en 1866) donde explicaba
la teoría de la herencia, ofrecen un cuadro
coherente e inteligible sobre el cambio evo-
225
lutivo. A lo largo de la evolución los orga-
nismos procariotas unicelulares se fueron
diferenciando de tal manera, que luego de
procesos de endosimbiosis dieron lugar a
la aparición de organismos eucariotas uni-
celulares. Las células eucariotas pudieron,
a su vez, asociarse y dar lugar a la forma-
ción de organismos pluricelulares con sub-
grupos de células especializados organiza-
dos en distintos tipos de tejidos y órganos.
La evolución de los organismos vivos fue
actuando en forma iterativa, modificando el
medioambiente (desde uno estrictamente
anaeróbico a uno aeróbico) que en estre-
cha relación con estos, permitió el desarro-
llo de formas de vidas más avanzadas (1).
Las plantas son organismos pluricelu-
lares estrictamente aeróbicos, compues-
tos por diferentes tipos de tejidos y células
especializados en determinadas funciones
pero que trabajan de manera coordinada.
De acuerdo a sus características tróficas
hacia el carbono, los tejidos y órganos de
una planta pueden clasificarse como foto-
sintéticos o autótrofos y como no–fotosin-
téticos o heterótrofos. Estos tejidos com-
parten ciertas vías metabólicas, pero son
funcional y metabólicamente distintos y
es por eso que las vías que comparten se
encuentran reguladas en forma diferencial
y acorde a sus necesidades metabólicas
(Figura I).
La glucólisis es una vía metabólica cen-
tral y ubicua, que en plantas tiene la carac-
226 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

terística de que puede ocurrir en paralelo
en dos compartimentos separados, el cito-
sol y los plástidos. La partición de las vías
metabólicas a nivel subcelular es un reflejo
de cómo los organismos han evolucionado
para llevar a cabo, en forma simultánea y
coordinada, vías metabólicas que compi-
ten por los mismos sustratos teniendo un
control adecuado y evitando la ocurren-
cia de ciclos fútiles. La vía glucolítica, que
permite durante la oxidación de las hexo-
sas obtener ATP, poder reductor, piruvato
y los sustratos necesarios para las reac-
ciones anabólicas, es sumamente impor-
tante en plantas debido a que la respiración
mitocondrial utiliza el piruvato (y raramente
a los ácidos grasos) como fuente principal
de energía. Además, las células heterotró-
ficas dependen de la glucólisis para obte-
ner energía y fuentes de carbono a partir
del almidón almacenado o de la sacarosa
provista por los tejidos fotosintéticos. Por
su parte, la glucólisis del citosol en células
vegetales es una red particularmente com-
pleja que presenta reacciones enzimáticas
paralelas a nivel de varios intermediarios
tales como la fructosa–6–fosfato (Fru6P),
el gliceraldehído–3–fosfato (Ga3P) y el fos-
foenolpiruvato (PEP). Dada esta particula-
ridad, resulta relevante dilucidar qué roles
cumplen cada una de las enzimas, cómo es
su regulación y cuál es la importancia rela-
tiva de cada paso alternativo frente a modi-
ficaciones de las demandas metabólicas a
lo largo del desarrollo o frente a situaciones
de estrés (1, 2).

Figura I. Esquema simplificado de la partición de carbono en distintos tipos de tejidos vegetales.

Principales destinos metabólicos de las triosas–P generadas en el proceso de fotosíntesis en los teji-
dos autótrofos durante el periodo diurno (superior) y en tejidos no–fotosintéticos (inferior). En los teji-
dos heterótrofos la sacarosa transportada desde los tejidos autótrofos mediante el floema, es la fuente
de carbono y energía cuyo metabolismo permite satisfacer las necesidades metabólicas básicas o el
almacenamiento de compuestos de reserva. En ambos casos se resalta el paso de oxidación del Ga3P
de la vía glucolítica citosólica. Las dos enzimas que pueden catalizar esta reacción son objeto de estu-
dio del presente trabajo.
Premio Mullor
En esta tesis nos centramos en el estu-
dio de las enzimas involucradas en la oxi-
dación del Ga3P a 3–fosfoglicerato (3PGA),
que en el citosol de células de plantas
puede ocurrir a través de dos caminos dis-
tintos. Siguiendo la vía glucolítica clásica
actúan dos enzimas, primero la Ga3P des-
hidrogenasa fosforilante (Ga3PDHasa, EC
1.2.1.12) dependiente de NAD+, convierte
el Ga3P utilizando ortofosfato (Pi) y gene-
rando NADH, en 1,3bisPGA. Este último es
luego convertido a 3PGA por la fosfoglice-
rato quinasa, en una reacción que genera
una molécula de ATP. Esta ruta representa
un paso clave de la vía glucolítica ya que es
el único que genera un enlace de alto con-
tenido energético a partir de Pi y es el primer
paso de la vía glucolítica que permite con-
servar energía al sintetizarse ATP por fosfo-
rilación a nivel de sustrato. El camino alter-
nativo de oxidación del Ga3P involucra a la
Ga3PDHasa no–fosforilante, dependiente
de NADP+ (np–Ga3PDHasa, EC 1.2.1.9),
que cataliza la hidrólisis irreversible del
Ga3P a 3PGA generando NADPH (Figura
I). Esta bifurcación no es trivial para la ener-
gética celular, ya que dependiendo de qué
227
enzima catalice la oxidación del Ga3P la
célula va a obtener ATP y NADH o NADPH
(2, 3). Las plantas, con su estilo de vida
sésil, monitorean e integran constantemente
estímulos internos y externos para optimi-
zar así su crecimiento, y uno de los facto-
res decisivos para mantener el desarrollo y
la supervivencia es el control del balance de
energía. Es por esto relevante avanzar en la
comprensión de cómo las células vegeta-
les pueden regular la partición del Ga3P (así
como la de otros metabolitos) en el citosol
celular, a fin de modificar los rendimientos
de energía o poder reductor acorde a las
necesidades metabólicas de cada tipo de
tejido vegetal.
Para avanzar en el análisis comparativo
de las propiedades regulatorias, cinéticas
y estructurales de las dos Ga3PDHasas
citosólicas presentes en células vegetales,
nos propusimos estudiar principalmente la
Ga3PDHasa y la np–Ga3PDHasa de Triti-
cum aestivum. Las enzimas se produjeron
en forma recombinante luego de haber clo-
nado los genes, gapN y gapC, correspon-
dientes a cada enzima de trigo y expre-
sado convenientemente cada uno de ellos
228 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
en células de Escherichia coli. Las proteínas
obtenidas, como polipéptidos fusionados a
una etiqueta de histidinas, presentaron acti-
vidad enzimática y pudieron purificarse a
homogeneidad electroforética por croma-
tografía de metal inmovilizado. La caracte-
rización cinética permitió corroborar que las
enzimas recombinantes presentaban pro-
piedades cinéticas similares a las descrip-
tas para las proteínas purificadas a partir de
sus fuentes naturales, haciéndolas adecua-
das para continuar con el análisis de sus
propiedades regulatorias.
Los estudios de regulación nos permi-
tieron identificar modificaciones postraduc-
cionales que afectan en forma diferencial a
ambas Ga3PDHasas ante la alteración del
estado redox intracelular. La actividad de
las dos enzimas mostró ser afectada por
agentes oxidantes relacionados a las espe-
cies reactivas del oxígeno (H2O2) y del nitró-
geno (·NO y GSNO), así también como
otros compuestos (GSSG). Las determina-
ciones de la cinética de oxidación indicaron
que: mientras la np–Ga3PDHasa fue igual-
mente oxidada por H2O2, ·NO y GSNO, la
oxidación de la Ga3PDHasa fue catalizada
con mayor rapidez y en el siguiente orden:
H2O2>>·NO>GSNO>>GSSG (este último
prácticamente no modificó la actividad de
la np–Ga3PDHasa). La reacción de oxida-
ción de la np–Ga3PDHasa y de la Ga3PD-
Hasa, fue cinéticamente menos favorable
en presencia de los sustratos específicos,
NADP+ y NAD+, respectivamente. Ade-
más, la sobre–oxidación indujo la forma-
ción de agregados proteicos y la precipi-
tación de la Ga3PDHasa, pero no así en el
caso de la np–Ga3PDHasa. Los resultados
sugieren que en función de las propieda-
des exhibidas por la Ga3PDHasa frente a
la oxidación, ésta tendría un rol fisiológico
en plantas, probablemente asociada a: (i)
la transducción de señales relacionadas
al estrés oxidativo o (ii) a la muerte celular
programada por mecanismos apoptóticos
luego de la exposición prolongada de las
células a compuestos oxidantes, en forma
similar a los roles adicionales descriptos
para la enzima en mamíferos (4). La pér-
dida de actividad de las dos Ga3PDHasas
causada por oxidación con H2O2 pudo ser
recuperada en forma eficiente por reduc-
ción con concentraciones micromolares de
tiorredoxina–h (TRX–h), lo cual es indicativo
de una probable regulación redox in vivo de
estas dos enzimas. Mientras que la reduc-
ción de la np–Ga3PDHasa con TRX–h fue
posible independientemente del tiempo de
oxidación, la reducción de la Ga3PDHasa
con TRX–h, GSH y DTT fue haciéndose
menos efectiva a medida que aumentaba el
tiempo de exposición al oxidante de dicha
enzima o la concentración del mismo. Los
resultados obtenidos nos permiten propo-
ner la hipótesis de que la regulación redox
de la np–Ga3PDHasa ocurriría fundamen-
talmente por formación de un puente disul-
furo y posterior reducción por la TRX–h;
mientras que para la Ga3PDHasa podría
formarse tanto el puente disulfuro como
los ácidos sulfénico, sulfínico y sulfónico,
dependiendo del grado de modificación por
oxidación. La reducción de la Ga3PDHasa
por TRX–h sería posible sólo cuando se
forma el puente disulfuro (y tal vez el ácido
sulfénico pudiera ser reducido) (Figura II).
Premio Mullor 229

Figura II: Esquema propuesto para la regulación redox de las dos Ga3PDHasas que se repar-
ten el metabolismo del Ga3P en el citosol de las células vegetales, ante la presencia de H2O2. En
gris se marca la ruta alternativa que involucra a la Ga3PDHasa y que se encontraría disminuida, ante el
efecto del H2O2 que causa su oxidación. Con flechas en negro se indican las rutas que se mantendrán
activas: para generar el NADPH, por oxidación del Ga3P a través de la np–Ga3PDHasa; en la oxida-
ción por H2O2 y en la reducción de las dos Ga3PDHasas mediante el sistema de las TRXs. La flecha
discontinua significa que se discute si tal reacción puede o no ocurrir.

A partir de los resultados de los estudios limentaría el proceso al mantener en su

de regulación redox las dos Ga3PDHasas
citosólicas de trigo proponemos la ocurren-
cia de un escenario redox que modularía la
partición citosólica del Ga3P entre las dos
vías alternativas (Figura I). Ante el incre-
mento de los niveles de H2O2 se favore-
cería la síntesis de NADPH en lugar de la
de ATP, dada la mayor velocidad de reac-
ción del H2O2 con la Ga3PDHasa que con
la np–Ga3PDHasa, lo que incrementaría el
poder reductor que podría ser utilizado por
los sistemas antioxidantes para enfrentar el
estrés oxidativo. También, la TRX–h retroa-
estado reducido a la np–Ga3PDHasa (Parte
de estos resultados fueron publicados en el
International Journal of Molecular Sciences
(2013) 14, 8073–8092). Los resultados de
los estudios in vitro están de acuerdo con
los obtenidos anteriormente en la caracte-
rización de plantas mutantes deficientes en
alguna de las dos Ga3PDHasas (5, 6), así
como los informados sobre la caracteriza-
ción de cómo el estrés oxidativo afecta los
niveles de la enzima np–Ga3PDHasa en la
hoja (7) (Figura II).
230 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Por otra parte, en trabajos anteriores se
había demostrado que la np–Ga3PDHasa
está fosforilada en células heterotróficas de
plantas superiores, forma en la que interac-
ciona con proteínas regulatorias 14–3–3.
La consecuencia cinética de esto último es
que la enzima es menos activa y más sensi-
ble a cambios en los niveles de los nucleóti-
dos de adenina y de PPi (8, 9). Continuando
con la caracterización de esta regulación,
los resultados obtenidos en este Trabajo de
Tesis nos permitieron determinar que la fos-
forilación de la np–Ga3PDHasa es catalizada
específicamente por proteínas quinasas de
la familia SnRK1 que requieren Mg2+ o Mn2+,
pero que son independientes de Ca2+, y que
estarían presentes sólo en tejidos heterotró-
ficos (endosperma) de trigo. Por estudios
de mutagénesis pudimos determinar que la
fosforilación ocurre en el residuo de Ser404
de la enzima, el que se encuentra dentro de
un dominio conservado para los sitios de
fosforilación establecidos para las SnRK1.
Encontramos además, que la Ga3PDHasa
es también fosforilada en células vegetales,
principalmente en endosperma de trigo. Su
fosforilación ocurre en el residuo de Ser205
presente en un dominio similar al de la np–
Ga3PDHasa y es catalizada preferentemente
por el mismo tipo de quinasas (SnRK1). Ade-
más, la fosforilación no modificó los paráme-
tros cinéticos de la np–Ga3PDHasa y afectó
levemente las propiedades catalíticas de la
Ga3PDHasa. La fosforilación y la oxidación
de ambas enzimas no exhibieron afectarse
recíprocamente.
Para comprender con mejor detalle el
sistema que regula por fosforilación a las
enzimas en estudio, se purificó parcial-
mente la SnRK1 que fosforila a las dos
Ga3PDHasas a partir de endosperma
de trigo. Con la quinasa purificada pudi-
mos determinar que su actividad es inhi-
bida por Rib5P (I0,5 0.094 mM) y en menor
medida por Fru1,6bisP (I0,5 3,9 mM) y 3PGA
(I0,5 5,2 mM), en condiciones cercanas a las
fisiológicas; mientras que la Glc6P (prin-
cipal efector de las SnRK1 de hojas de
espinaca) exhibió una modesta inhibición
(I0,5 >10 mM). Por ensayos de MALDI–TOF
se identificó que la enzima sacarosa sintasa
(SuSy) co–purifica con las SnRK1 de endos-
perma de trigo, quien además fosforila a la
primera. Parte de los resultados obtenidos
en esta parte del trabajo fueron publicados
en Plant Physiology (2011) July; Vol. 156,
pp. 1337–1350.
Premio Mullor 231

Figura III: Esquema que ubica dentro del contexto metabólico de una célula heterotrófica a los meta-
bolitos que inhiben la actividad de la SnRK1 de endosperma de trigo. En la figura se remarcan en rojo
los compuestos efectores, los cuales son intermediarios de vías metabólicas consideradas centrales
dentro del metabolismo primario de los hidratos de carbono. Se representa también la fosforilación de
las enzimas que son objeto de estudio en el presente trabajo, cuya fosforilación (en condiciones nor-
males) ocurre específicamente en tejidos heterotróficos.

Teniendo presente los antecedentes en de las hexosas–P hacia el interior de los

el tema, sumados a los aportes de este
Trabajo de Tesis nos permiten plantear la
hipótesis de que la fosforilación de la np–
Ga3PDHasa y de la Ga3PDHasa ocurri-
ría durante el periodo de acumulación de
reservas en semillas de trigo en desarro-
llo (Figura IV). Tal escenario es compa-
tible con el metabolismo de la sacarosa
mediante la SuSy y con el direccionamiento
plástidos, donde mayoritariamente son uti-
lizadas para la síntesis de almidón. Se ha
demostrado que este periodo es en el cual
las SnRK1 presentan su máxima actividad y
se encargan de regular y coordinar el meta-
bolismo de los hidratos de carbono en res-
puesta a sus disponibilidades y atendiendo
la demanda de energía y los niveles de oxí-
geno dentro de las células (10, 11).
232 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17

Figura IV: Representación esquemática para las distintas fases del desarrollo de la semilla y la regu-
lación por fosforilación. (A) Cuadro que resume las principales características de las distintas fases del
desarrollo (traducido de Weber, 2005). (B) Esquema para el metabolismo de la sacarosa durante la
etapa de proliferación celular, controlado por las invertasas. (C) Esquema para el metabolismo de la
sacarosa durante la etapa de acumulación de reservas, controlado por la SuSy. Los detalles y referen-
cias de los esquemas se indican en el texto.
Premio Mullor
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ment. Annu. Rev. Plant. Biol., 56: 253–279.
Summary
Energetic and reducing power metabo-
lism in autotrophic and heterotrophic cells
Plants are obligate aerobic organisms
composed by photosynthetic (autotrophic)
and non photosynthetic (heterotrophic) tis-
sues that work coordinately. Even when the
tissues have similarities, they are functional
and metabolically different, turning critic its
precise metabolic regulation. Glycolysis is
a central and ubiquitous metabolic pathway
that in plants oddly occurs in parallel in two
separately compartments, the cytosol and
the plastids. Furthermore, in plants, cyto-
solic glycolysis is a particularly complex
network with alternative enzymatic reac-
tions at different intermediate levels (Fru6P,
Ga3P and PEP). Consequently, is relevant
elucidate the roles, regulation, and relative
importance of the alternative reactions of
cytosolic glycolysis in plant cell of different
tissues. This Thesis is centered in the study
of two different enzymes converting glyce-
raldehyde–3–phosphate (Ga3P) into 3–
phosphoglycerate (3–PGA). We found diffe-
rential redox regulation (by reactive oxygen
species) of the phosphorylating Ga3P dehy-
drogenase (Ga3PDHase, EC 1.2.1.12) [that
together with 3–PGA kinase derives triose–
P to the synthesis of ATP and NADH], and
the non–phosphorylating enzyme (np–
Ga3PDHase; EC 1.2.1.9) [instead produ-
cing NADPH]. The Ga3PDHase was signifi-
234 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
cantly more sensitive to thiol oxidants than
np–Ga3PDHase, while reduced thioredoxin–h
differently but effectively reversed the oxida-
tion. Results support a fine–tuning of triose–
P fate under changeable redox conditions,
rerouting Ga3P toward NADPH synthesis. We
also found that both Ga3PDHases are phos-
Premio Mullor (Primera mención)
Mecanismos moleculares de expresión de componentes
de los complejos respiratorios de plantas
Raúl Nicolás Comelli
piattoni@fbcb.unl.edu.ar
Director: Dr. Daniel H. González
Lugar de realización: Laboratorio de Inves-
tigación de la Cátedra de Biología Celular y
Molecular. Facultad de Bioquímica y Cien-
cias Biológicas (FBCB – UNL).
Fecha de la defensa: 13/12/2010.
Resumen
La biogénesis de la maquinaria respi-
ratoria mitocondrial de plantas requiere la
síntesis y el ensamblado en forma coor-
dinada de los productos de más de cien
genes localizados en el núcleo y dentro
de la organela. Uno de los factores que
regula la expresión de los genes nucleares
en la disponibilidad de carbohidratos. La
regulación de este proceso opera a nivel
de la transcripción a través de elementos
presentes en las regiones promotoras de los
genes codificantes para componentes de la
cadena respiratoria. La citocromo c oxidasa
(COX), enzima terminal de la cadena respi-
ratoria mitocondrial, está compuesta por al
menos diez polipéptidos diferentes, tres de
phorylated in wheat seeds. By characteriza-
tion of enzymes phosphorylation we iden-
tify each phosphorylation site in vitro, and the
SnRK1 protein kinase family (and its regula-
tion) as responsible of the posttranslational
modification. We hypothesized that phospho-
rylation would be related to metabolic chan-
ges occurring during seed development.
ellos codificados en el genoma mitocon-
drial y los restantes en el genoma nuclear.
Entonces, es lógico asumir que el correcto
ensamblado de COX requiere la expresión
coordinada de los genes codificantes para
las diferentes subunidades de la mencio-
nada enzima, o al menos de la mayoría de
ellos (1-5).
En este Trabajo de Tesis, se ha carac-
terizado la expresión de los dos genes
nucleares de Arabidopsis codificantes para
la subunidad 5b de la citocromo c oxidasa
(COX5b-1 y COX5b-2), la subunidad de
codificación nuclear más conservada.
En el primer capítulo se describe el
análisis de la región de promotor de
COX5b-1 (At3g15640) necesaria para
su expresión e inducción por sacarosa,
mediante la utilización de plantas transfor-
madas en forma estable con fragmentos
mutados de promotor fusionados al gen
reportero gus. La expresión del promotor es
absolutamente dependiente de un elemento
G-box (CACGTG) situado en el nucleótido
-228 desde el sitio de inicio de la traducción.
Una región localizada por encima de este
elemento (-333/-259) contiene secuencias
Premio Mullor
con el núcleo ATCATT y secuencias simi-
lares al elemento distalB (CCACTTG), las
cuales son requeridas para la expresión del
gen en tejidos vegetativos. Estas secuencias
son capaces de unir diferentes proteínas
presentes en extractos nucleares y participan
en la inducción por sacarosa y otros carbo-
hidratos (secuencias ATCATT) o potencian
la respuesta a la hormona ABA (secuencias
similares al elemento distalB). Además, un
elemento reportado como sitio de unión al
factor de transcripción PHR1 (GTATATGC),
presente en la misma región que las secuen-
cias mencionadas con anterioridad, actúa
como elemento regulador negativo de la
expresión del gen principalmente en raíces.
El promotor de COX5b-1 se induce también
por el tratamiento de las plantas con fosfato
inorgánico, H2O2, citoquininas, giberelinas y
ACC (precursor de etileno).
En el segundo capítulo se analizan las
secuencias en el promotor de COX5b-2
(At1g80230) requeridas para la expresión
del gen, utilizando plantas transformadas en
forma estable con formas mutadas o dele-
cionadas del mencionado promotor fusio-
nadas al gen gus. Un fragmento de 1000
pb del promotor dirigió la expresión del gen
reportero en meristema apical del vástago,
meristema de raíz, ápice de cotiledones y
hojas y en anteras. El análisis de las dele-
ciones del extremo distal del promotor indicó
la presencia de elementos regulatorios posi-
tivos y negativos. Un elemento G-box regu-
latorio localizado entre -660 y -620 desde el
ATG inicial fue identificado mediante análisis
de mutación puntual. Este elemento se
encuentra en la región codificante del gen
adyacente en el genoma de Arabidopsis.
La mutación del elemento G-box incrementa
la expresión de COX5b-2 en cotiledones y
en la lámina de las hojas y, además, anula
235
completamente la inducción del gen por
luz UV, estímulo que probablemente opera
removiendo el factor de transcripción inhi-
bitorio capaz de unir el elemento G-box.
Los elementos regulatorios positivos iden-
tificados incluyen un elemento site II típico
(TGGGCC), un elemento de secuencia
TGGGTC similar al site II y cuatro elementos
Iniciadores (YTCANTYY, Y = C o T). La muta-
ción de estos elementos en forma conjunta
anuló completamente la expresión del gen
COX5b-2. Los elementos site II también se
encuentran involucrados en la respuesta
a sacarosa. El promotor de COX5b-2 se
induce, además, por el tratamiento de las
plantas con fosfato inorgánico, H2O2, auxinas
y ACC (precursor de etileno).
En el siguiente capítulo se presentan los
factores de transcripción capaces de inte-
raccionar con algunos de los elementos
regulatorios presentes en los promotores
de COX5b-1 y -2, identificados mediante
ensayos de simple híbrido en levaduras.
Los elementos G-box influencian la trans-
cripción de los genes estudiados mediante
caminos diferentes, ninguno de ellos rela-
cionado con la respuesta a carbohidratos.
Consecuentemente, estos elementos
mostraron diferentes preferencias de unión
por factores de transcripción pertenecientes
a las familias ABF (ABRE-binding factor) y
GBF (G-box binding factor) de factores con
dominios de unión al ADN de tipo bZIP. En
COX5b-1, las secuencias con el núcleo
ATCATT fueron reconocidas por factores
de transcripción pertenecientes a las fami-
lias HD-ZIP I y GT, mientras que las secuen-
cias similares al elemento distalB fueron
unidas por una proteína perteneciente a la
familia AP2/ERF de factores de transcrip-
ción. Además, ensayos de doble híbrido
en levaduras permitieron identificar interac-
236 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
ciones físicas entre algunos de los factores
de transcripción mencionados.
En el último capítulo se analiza la
presencia en el genoma de Arabidopsis de
los dos genes estudiados en función de las
hipótesis planteadas por el modelo DDC de
duplicación de genes. Los genes COX5b-1 y
-2 mostraron diferentes patrones de expre-
sión y respuesta a varios compuestos, pero
compartieron la inducción por sacarosa y
otros carbohidratos. Los resultados comen-
tados en los capítulos previos implican
que COX5b-2 retuvo las características de
expresión presentes en la mayoría de los
genes codificantes para componentes de
la cadena respiratoria mitocondrial, pero
estos mecanismos de expresión han diver-
gido respecto a los observados en COX5b-1.
Se propone que el promotor de este último
habría adquirido nuevos mecanismos regu-
latorios durante la evolución posterior al
evento de duplicación. Estos nuevos meca-
nismos habrían permitido la diversificación
de los patrones de expresión, pero también
la conservación de algunas respuestas
que, como la inducción por sacarosa, son
compartidas por COX5b-1 y numerosos
genes codificantes para componentes de
la maquinaria respiratoria mitocondrial. La
conservación de estas respuestas podría ser
un requisito previo para la exitosa incorpo-
ración de elementos regulatorios nuevos en
esta clase de genes.
Los resultados comprendidos en
este Trabajo de Tesis fueron publicados
en revistas internacionales con referato
estricto, comprendiendo cinco artículos
originales aceptados [6-10] y uno actual-
mente en revisión [11]. Además, se presen-
taron en seis reuniones científicas (cuatro
nacionales y dos internacionales) durante el
período 2005-2010.
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Cytc-2 gene, encoding an isoform of cy-tochrome
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Premio Mullor
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HD-Zip proteins and a B-3 AP2/ERF transcription
factor interact with promoter elements required
for expression of the Arabidopsis cytochrome c
oxidase 5b-1 gene”. Plant Molecular Biology, en
revisión.
Summary
Molecular mechanisms of expres-
sion of components of plant respiratory
complexes
The biogenesis of the plant mitochon-
drial respiratory chain needs the coor-
dinated synthesis and assembly of the
products of more than 100 genes located
in the nucleus and within the organelle. One
of the factors that regulate the expression of
nuclear genes is the availability of carbohy-
drates. This regulation operates at the trans-
criptional level through elements present in
the promoter regions of respiratory chain
component genes. Cytochrome c oxidase
(COX), the terminal enzyme of the mito-
chondrial respiratory chain, is composed of
at least ten different polypeptides encoded
either in the mitochondrial genome or
the nuclear genome. Then, it is logical to
assume that correct COX assembly requires
the coordinated expression of the genes
that encode its different subunits, or at least
most of them.
In this thesis we have characterized the
expression of the two Arabidopsis nuclear
genes encoding cytochrome c oxidase
subunit 5b (COX5b), the most conserved
nuclear-encoded subunit.
237
In the first chapter, a promoter region
required for expression and induction by
sucrose of the COX5b-1 gene (At3g15640)
was analyzed using plants stably transformed
with mutagenized promoter fragments fused
to the gus reporter gene. Expression is abso-
lutely dependent on a G-box present at -228
from the translation start site. A region located
upstream of the G-box (-333/-259) contains
elements with the core sequence ATCATT
and distalB-like sequences (CCACTTG)
that are required for expression in vegeta-
tive tissues. These sequences bind diffe-
rent sets of proteins present in plant nuclear
extracts and participate in induction by
sucrose (ATCATT) and abscisic acid (distalB-
like) of the COX5b-1 promoter. In addition,
an element described as a binding site of
the PHR1 transcription factor (GTATATGC)
present in the same region that contains
the sequences mentioned above acts as a
negative regulatory element, mainly in roots.
The COX5b-1 promoter is also induced by
treatment of plants with Pi, H2O2 and the
hormones BAP (cytokinin), GA and the
ethylene precursor ACC.
In the second chapter, we analyzed the
promoter sequences required for expres-
sion of the COX5b-2 gene (At1g80230)
using plants transformed with deleted
and mutagenized forms of the promoter
fused to gus. A 1000-bp promoter frag-
ment produced expression in root and
shoot meristems, leaf and cotyledon tips,
and anthers. Deletion analysis indicated the
presence of positive and negative regula-
tory elements. A regulatory element located
between -660 and -620 from the translation
start site was identified as a G-box by muta-
genic analysis. Mutation of the G-box, that
is present within the coding region of the
preceding gene in the genome, increases
expression of COX5b-2 in cotyledon and
238 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
leaf lamina and abolishes induction by UV
light, which presumably acts through the
removal of an inhibitory factor. Identified
positive regulatory elements include a site II
element (TGGGCC), a related element with
the sequence TGGGTC and four Initiator
elements (YTCANTYY) that completely
abolish expression when mutated in combi-
nation. Site II elements are also involved
in the response to sucrose. The COX5b-2
promoter is also induced by treatment of
plants with Pi, H2O2 and the hormones IAA
(auxin) and the ethylene precursor ACC.
In the next chapter, transcription factors
able to interact with some regulatory
sequences present in the COX5b-1 and
COX5-2 promoter regions were identified
using yeast one-hybrid assays. The G-boxes
influence transcription of both genes but in
rather different ways, none of them related
with the response to carbohydrates. Accor-
dingly, these elements have different prefe-
rences for transcription factors from the
ABRE-binding factor (ABF) and G-box
binding factor (GBF) classes. For COX5b-1,
elements with the core sequence ATCATT
were recognized by transcription factors
from the HD-Zip and GT families, while
distalB-like sequences (CCACTTG) were
able to interact with a transcription factor
from the AP2/EFR family. In addition, yeast
two-hybrid assays indicated the existence of
physical interactions between some of the
mentioned factors.
In the last chapter, we analyzed if the
presence in the Arabidopsis genome of the
two COX5b genes could be explained by
the DDC model for gene duplication. The
COX5b-1 and COX5b-2 genes have diffe-
rent expression patterns and respond to
several compounds, but share induction
by sucrose and other carbohydrates. The
results described in previous chapters imply
that the COX5b-2 gene has retained expres-
sion characteristics presented by most
respiratory chain component genes, but
the expression mechanisms have diverged
for COX5b-1. We propose that the COX5b-1
promoter has acquired novel regulatory
mechanisms during evolution after gene
duplication. These novel mechanisms have
allowed the diversification of expression
patterns, but also the conservation of some
responses that, as induction by sucrose,
are shared by COX5b-1 and other genes
encoding components of the mitochondrial
respiratory chain. Conservation of these
responses may be a pre-requisite for the
successful incorporation of new regulatory
elements in this class of genes.
Premio Mullor
Premio Mullor (Segunda mención)
Desarrollo de metodologías de preconcentración/
fluorescencia molecular: monitoreo ambiental y biológico
de cadmio y níquel como marcadores de exposición y/o
adicción al tabaco
Bqca. María Carolina Talio
piattoni@fbcb.unl.edu.ar
Director: Dra. Liliana Patricia Fernández
Co-Directora: Dra. Adriana Noemí Masi1
Lugar de realización: Universidad Nacional
de San Luis. Facultad de Química, Bioquí-
mica y Farmacia. Área de Química Analítica.
Instituto de Química de San Luis (INQUISAL-
CONICET).
Fecha de la defensa: 28/10/2011.
Resumen
En la actualidad, el consumo de tabaco
constituye la primera causa evitable de
morbi-mortalidad en el mundo, ocasio-
nando 5 millones de defunciones por año.
De mantenerse las pautas actuales de taba-
quismo, su consumo provocará aproxima-
damente 10 millones de defunciones en el
2020 (1-3). Sin embargo, la distribución no
será mundialmente uniforme; en los países
desarrollados el número de defunciones
aumentará el 50% (de 2 a 3 millones de
muertes) mientras que para el resto de los
países el aumento será del 700% (de 1 a 7
millones de muertes por año) (1, 4).
La prevalencia del consumo de tabaco
en Argentina muestra un progresivo y
lento aumento (35 al 40%) principalmente
entre los grupos de menores recursos,
las mujeres y los adolescentes (5, 6). Este
hecho ocasiona más de 40.000 muertes
239
cada año, y se gastan aproximadamente
20 millones de pesos por día para atender
enfermedades relacionadas con el consumo
de cigarrillos (2, 7).
La Organización Mundial de la Salud
ha declarado que el consumo crónico de
tabaco constituye para la mayoría de los
consumidores una adicción, causando
más muertes por año que las producidas
en forma conjunta por SIDA, tuberculosis,
alcoholismo, accidentes de tránsito, drogas
de abuso, homicidios y suicidios, a nivel
mundia (2).
El humo de tabaco constituye una
mezcla compleja de más de 4.000 sustan-
cias químicas conocidas entre las que
se encuentran numerosos tóxicos metá-
licos. Un cigarrillo contiene entre 1 y 2 mg
de cadmio que se libera como óxido de
cadmio; el 10% del óxido de cadmio inha-
lado se deposita en los tejidos pulmonares
(8-10). El cadmio ocasiona contaminación
ambiental e industrial y, en el ser humano
actúa inhibiendo enzimas encargadas de
los procesos de reparación del ADN; es
un irritante local, inhibe la absorción intes-
tinal de calcio impidiendo su depósito en
los tejidos óseos y se acumula en distintos
órganos, principalmente en riñón, hígado,
placenta y eritrocitos. Tiene una vida media
prolongada, de aproximadamente 20 a
30 años (11). Por otro lado, la exposición
crónica a compuestos de níquel puede
240 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
ocasionar las siguientes patologías: aler-
gias, rinitis, sinusitis, enfermedades respi-
ratorias, cáncer en la cavidad nasal, de
pulmón y de otros órganos (12-15). En
particular, los fumadores están expuestos
a compuestos de este metal en cantidades
que fluctúan entre 2 a 6,2 μg/cigarrillo (16).
Aproximadamente del 10 al 20 % es libe-
rado en el humo de cigarrillo y puede ser
inhalado como carbonilo de níquel (17).
En el presente trabajo de Tesis Doctoral
se desarrollaron metodologías para la
determinación de los analitos propuestos,
cadmio y níquel, empleando fluorescencia
molecular, precedida de etapas de precon-
centración/separación/sensibilización. Las
mismas fueron satisfactoriamente apli-
cadas a muestras biológicas, ambientales
y en humo de tabaco, representando una
alternativa a los métodos convencionales
de análisis de metales a niveles de vesti-
gios, en las áreas de análisis clínico y moni-
toreo ambiental, empleando un instrumental
accesible en laboratorios de control.
Las concentraciones de cadmio (18) y
níquel (19-21) halladas en orina y saliva
fueron significativamente superiores en
fumadores que en no fumadores; a su vez
los fumadores pasivos mostraron concen-
traciones intermedias de ambos metales
y la mayor exposición se relacionó con el
hábito de masticar tabaco.
Los parámetros clínicos anormales y/o
patológicos identificados en las mues-
tras biológicas no interfirieron en la deter-
minación de los metales. Las metodolo-
gías desarrolladas pudieron ser aplicadas
al total de las muestras biológicas, confir-
mando la robustez de las mismas. Los estu-
dios de correlación nos permiten aseverar
que la exposición al humo de tabaco consti-
tuye un riesgo para la salud.
Las concentraciones de cadmio halladas
en muestras de agua de la región, desti-
nadas a consumo humano, fueron inferiores
a los niveles permitidos por la legislación
nacional, concluyéndose que las mismas
no constituyen una fuente de exposición al
tóxico metálico (22).
La metodología desarrollada para la
cuantificación de níquel en la corriente prin-
cipal de humo de cigarrillos (23), resultó
apropiada para el control de este metal en
productos de tabaco debido a su adecuada
selectividad y elevada sensibilidad. Las
concentraciones de níquel halladas en
humo de cigarrillos mostraron una buena
correlación con las de níquel urinario de
fumadores de las diversas marcas de ciga-
rrillos analizadas. Se concluye que el hábito
de fumar constituye una severa exposición
a este tóxico metálico, independientemente
del tipo de tabaco que se consuma. No se
obtuvo información concluyente respecto
de la incidencia de las microperforaciones
del filtro sobre los niveles de níquel en el
humo de la corriente principal.
En base a los resultados obtenidos en el
presente Trabajo de Tesis Doctoral, se puede
concluir que la exposición de los fumadores
a cadmio y níquel es severa. Por lo tanto, los
organismos de control y agentes de salud
deben aunar esfuerzos para desalentar el
consumo de cigarrillos y generar ambientes
100% libres de humo de tabaco.
Como las conclusiones a las que se
han arribado en este trabajo involucran un
riesgo para la salud de la comunidad, se
tomó la determinación de realizar talleres de
prevención y concientización en Colegios
Secundarios de San Luis, aportando argu-
mentos científicos genuinos y propios que
orienten a nuestros jóvenes hacia una libre
y conciente elección en este tema.
Premio Mullor
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synthesis, characterization and analytical quality.
Journal of Life Sciences, USA 5: 1072-1077.
21. Talio, M.C., Luconi, M.; Fernández, L.; 2012.
New silver nanosensor for nickel traces. Part ii:
urinary nickel determination associated to smok-
ing addiction. Journal of Life Sciences, USA. 6:
36-40.
22. Talio, M.C., Luconi, M.; Masi, A.; Fernández,
L.; 2009. Determination of cadmium at ultra-trace
levels by CPE-molecular fluorescence combined
methodology. J. Hazard. Mater 170: 272-277.
23. Talio, M.C., Luconi, M.; Fernández, L.; 2011.
Determination of nickel in cigarettes smoke by
molecular fluorescence. Microchem. J. 99: 486-491.
Summary
Development of preconcentration/mole-
cular fluorescence methodologies: envi-
ronmental and biological monitoring of
cadmium and nickel as exposure markers
and/or tobacco addiction.
Analytical methodologies were developed
for cadmium and nickel determination by
molecular fluorescence coupled to precon-
centration / separation / sensitization strate-
gies and they were satisfactorily applied to
biological and environmental samples, and
tobacco smoke.
Found concentrations of urinary and
salivary toxics were significantly superior
for smokers that non-smokers; passive
smokers showed intermediate concentra-
tions. The highest exposure was related with
the tobacco chewing habit.
Cadmium concentrations in regional
water samples destined to human
consumption were lower than the permitted
levels for national legislation; so, it can be
concluded that waters do not represent a
source of exposure to this metal.
The developed methodology for nickel
determination in mainstream of cigarette
smoke resulted appropriate for quanti-
fying this metal in tobacco product, for its
adequate selectivity and elevated sensiti-
vity. Found nickel concentrations in cigarette
smokes can be correlated with urinary nickel
contents of smoker of different analyzed
cigarette brands.
Taking into account the results, it can
be concluded that smoker’s exposure to
cadmium and nickel is severe. Hence,
control agencies and health agencies must
join efforts to discourage smoking and
generates environment 100% smoke-free
snuff.
Prevention and awareness workshops
have been realized in Secondary Schools
of San Luis, providing genuine and proper
scientific arguments to guide our youth
toward a free and conscious choice in this
matter.
Nota
1
Fallecida el 5 de agosto de 2010.

Oferta de Carreras de Posgrado
Doctorados
Doctorado en Ciencias Biológicas
Acreditada por CONEAU Cat. A, Res.
Nº 735/13; reconocida por Ministerio
de Educación Res. Nº 580/09
Doctorado en Física
Acreditada por CONEAU Cat. A, Res.
Nº 783/13; reconocida por Ministerio
de Educación Res. Nº 784/08
Doctorado en Educación en Ciencias
Experimentales
Reconocimiento en trámite por CONEAU
y Ministerio de Educación
Especializaciones
Especialización en Bacteriología Clínica
Acreditada por CONEAU Cat. A, Res.
Nº 307/08; reconocida por Ministerio
de Educación Res. Nº 182/10
243
Especialización en Administración
de la salud con orientación en Auditoría
Bioquímica Integral
Acreditada por CONEAU Cat. B, Res.
Nº 408/09; reconocida por Ministerio
de Educación Res. Nº 580/10
Especialización en Vinculación y Gestión
Tecnológica
Acreditada en forma provisoria por
CONEAU Res. Nº 920/09
Maestrías
Maestría en Salud Ambiental
Acreditada por CONEAU Cat. Bn, Res.
Nº 209/09; reconocida por Ministerio
de Educación Res. Nº 676/09
Maestría en Didáctica de la Ciencias
Experimentales
Acreditada por CONEAU Cat. A, Res.
Nº 182/07; reconocida por Ministerio
de Educación Res. Nº 255/09
Maestría en Física
Cuenta con reconocimiento del Ministerio
de Educación (Res. en trámite)
244 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Reglamento de publicación
Objetivos
La Revista de la Facultad de Bioquímica y
Ciencias Biológicas (FABICIB) tiene como
objetivos: a- Divulgar trabajos científicos ori-
ginales, así como de revisión por invitación
a expertos en los temas y de divulgación,
de autores pertenecientes a la Universidad
Nacional del Litoral, otras Universidades
e Instituciones Científicas Nacionales y/o
Extranjeras vinculadas con diferentes áreas
temáticas de la ciencia : básica, bioquímica
aplicada, pedagógica (esta última relacio-
nada con trabajos de experimentación o
campo), etc.
I. Presentación
Todo manuscrito se presentará en hojas
numeradas correlativamente, a doble espa-
cio, en papel tamaño IRAM (21 x 29,7 cm.),
con márgenes de 2,5 cm en original y dos
copias impresas de alta calidad o calidad
láser y cd. En el cd las figuras deberán estar
en archivos separados en formato JPG
y de alta resolución. Se cuidará que ten-
gan la misma cantidad de renglones, de la
misma extensión, para facilitar los cálculos
de imprenta.
En la primera hoja figurarán:
a. Título del trabajo y subtítulo, si lo
hubiera.
b. Apellido e iniciales de nombre del
autor o autores.
c. Institución a la que pertenecen, ciudad,
provincia, país, dirección postal completa,
teléfono, FAX, e-mail.
No se establecerán límites arbitrarios. Los
manuscritos deberán ser originales, inéditos,
breves y precisos en la medida de lo posi-
ble, y adaptados a la índole de la publica-
ción.
Los trabajos se recibirán entre el 1º de
enero y 31 de mayo de cada año.
II. Ordenamiento de los textos
Se considerará conveniente ordenar las
colaboraciones de la siguiente manera:
Trabajos Científicos y Técnicos:
a. Título: deberá ser lo suficientemente
claro y preciso y en lo posible ubicará al lec-
tor en el contenido del artículo. Se deberán
evitar abreviaturas.
b. Autores: Apellido/s e iniciales del nombre.
c. Nombre y dirección del Estableci-
miento donde el trabajo fue realizado.

d. Nombre, dirección postal completa,
número de teléfono y FAX del autor a quien
pueda enviarse pruebas y correspondencia.
e. Resumen analítico: deberá ser lo sufi-
cientemente preciso como para dar amplia
idea del contenido del artículo. Además res-
petará las siguientes disposiciones:
•No deberá exceder las 150 palabras.
•Deberá poner de relieve los aspectos
fundamentales del artículo, por ejemplo: los
elementos nuevos que aporta y sus conclu-
siones.
•Deberá estar redactado de modo que
el lector quede capacitado para decidir si
el contenido del artículo tiene interés sufi-
ciente como para ser leído en forma com-
pleta.
•Agregar no más de 4 palabras claves.
En hoja aparte se acompañará su traduc-
ción al idioma inglés, encabezado por la
palabra SUMMARY incluyendo título, y los
autores. Al finalizar el mismo se citarán la
palabras claves (no más de cuatro).
f. Introducción: se deberá incluir en este
apartado el propósito del trabajo y su rela-
ción con estudios similares sobre el tema.
g. Materiales y Métodos: se presentará
un informe breve y concreto.
h. Resultados y Discusión: deberá conte-
ner los resultados obtenidos, en los cuales
se discutirán sus posibles correlaciones con
otros trabajos realizados con anterioridad.
i. Conclusiones: versará fundamental-
mente sobre el aporte que el trabajo pre-
sentado hace a los ya existentes y las posi-
bilidades que el mismo brinda.
j. Referencias Bibliográficas:
•Referencias en el texto
Las referencias consignadas en el texto
de los trabajos se efectuarán mencionando
245
entre paréntesis el número correlativo corres-
pondiente al orden de aparición.
•Referencias al final del trabajo
Las referencias completas se harán al
final del trabajo con todos los detalles y res-
ponderán a las siguientes normas:
Cuando se trate de libros, se mencio-
nará: nombre del autor o autores, año de
edición, título completo del libro entre comi-
llas, casa editora, ciudad de edición entre
paréntesis, volumen en números romanos
en negrita, número de página inicial y final.
Por ejemplo: Bronk, J.R., 1980. “Biología
Química” Compañía Editorial Continental
S.A. (México), I. 178 – 199.
Cuando se trate de capítulos de libro
se indicará: nombre del autor del capítulo,
año, título del capítulo. En: nombre de edi-
tores, nombre del libro entre comillas, Edi-
torial, país de edición, páginas del capítulo.
Por ejemplo: Bronch, J. R., 1980. Química
de la membrana celular. En: Bronch, J. R.
(Ed.), “Biología Química”. Compañía Edito-
rial Continental S.A. (México), I 178-199.
Cuando se cite un artículo publicado por
una revista, se seguirá el siguiente orden:
nombre del autor o autores, año de edi-
ción, título completo del artículo en idioma
original, nombre de la revista abreviado,
volumen en negrita, número de la revista,
página inicial y final. Por ejemplo: Perez, J.;
Rodriguez, L.; Sanchez, P., 1971. Hiperten-
sión in diabetes and obesity. Am. J. Physiol.
4, 29: 12 – 19.
Cuando se trate de página de internet
citar: dominio y fecha de acceso.
k. Agradecimientos: Se escribirán en hoja
aparte.
l. Nota: Si el trabajo ha sido parcial o
totalmente presentado a un congreso se
adjuntarán los datos del mismo.
246 Revista FABICIB • año 2013 • volumen 17
Actualizaciones bibliográficas
y conferencias:
Versarán sobre temas de gran interés,
con una amplia revisión bibliográfica y sus
autores deberán ser especialistas en la
materia.
Temas de divulgación y demás trabajos:
De acuerdo con el plan del autor.
III. Nomenclatura
Deberá utilizarse la nomenclatura de
acuerdo a las normas recomendadas por
los Comités Internacionales.
IV. Tablas e ilustraciones
Todas las tablas e ilustraciones deberán
ser citadas en su orden de aparición en el
texto usando números arábigos.
Las tablas llevarán un encabezamiento del
tipo: Tabla 1. Debajo del cual se colocará el
título correspondiente. Las leyendas de las
mismas se confeccionaran en la misma hoja.
Las ilustraciones llevarán referencias
que expliquen claramente su contenido
sin necesidad de recurrir al texto, deberán
ser realizadas en papel de alta calidad, ser
claras, nítidas y de elevado contraste para
poder reducir su tamaño sin inconveniente.
Llevarán numeraciones corridas y estarán
confeccionadas en una sola escala para
facilitar su reproducción. En hoja separada
se consignarán los títulos y referencias,
como así también las indicaciones respecto
de su ubicación en el texto (lugar aproxi-
mado). Convendrá marcar con una flecha la
posición arriba de la ilustración.
Deberán enviar las figuras en un archivo
separado en formato JPG de buena calidad
de imagen (600 dpi)
Las fotografías deberán ser en blanco y
negro, claras y contrastadas, para facilitar
su reproducción. No se aceptarán diaposi-
tivas, las que deberán reproducirse sobre
papel fotográfico. Las leyendas de las foto-
grafías deberán escribirse en página aparte.
Todos los artículos presentados serán
evaluados por al menos 2 especialistas en
el tema, integrantes y/o invitados especiales
del Comité de Evaluación Externo.
Revista FABICIB • año 2010 • suplemento 1 • volumen 14 247

Lista de autores

Albornoz, M.A. Gutierrez, M.F. Quaglino, M.B.

Alfaro, N.S. Lassaga, S.L. Reus, V.
Arce, A.L. Latorre, M.E. Reutemann, A.G.
Bacchetta, C. Latorre Rapela, M.G. Rinaldi, P.A.
Briggiler Marcó, M. Lavandera, J. Rodríguez, M.C.
Bernal, C.A. Lerman de Abramovich, B. Saín, J.
Beltzer, A.H. Lottersberger, J. Sánchez, M.L
Bonelli, E. Lurá, M.C. Scalerandi, M.V.
Budini, N. Machtey, M. Schenone, A.V.
Cabagna Zenklusen, M.C. Maldonado, L.M. Simil, E.
Campana, M. Marcipar, I. Simonetta, A.
Cantora, AM. Marsili, N.R. Sobrero, M.S.
Cerolini, R.R.A. Martinelli, M. Sosa, C.
Chemes, S.B. Maumary, R. Talio, M.C.
Comelli, R.N. Méndez, E.A. Tonarelli, G.
Corti, M.R. Misetich, O.R. Turino, L.N.
Exner, E.L. Modini, LB. Vanasco, N.B.
Fariña, A.C. Mufarrege, M.M. Van de Velde, F.
Follonier, M. Navarro, L. Velázquez, M.M.L
Fortino, M.A. Olguín, P.F. Vitelleschi, M.S.
González, M.A. Pavé, P.J. Walz, M.F.
Groppelli, E. Perotti, J.P. Zerbatto, MG.
Giacomelli, J.I. Piattoni, C.V.
Giuggia de Stratta, M.G. Pizarro, AV.;
FABICIB se diagramó y compuso en
y se terminó de imprimir en Docuprint, Tacuarí 123,
CABA, Buenos Aires, Argentina. Diciembre de 2013.