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Tema 5 - Procesamiento de las muestras en

microbiologia clnica
(protocolos de siembra)
Normas bsicas generales (antes de proceder al procesamiento de la muestra):
1. Volante de peticin debe estar bien cumplimentada (filiacin y datos administrativos
del
paciente,
datos clnicos,
datos
de
la
muestra, teraputica seguida, determinacin solicitada)
2. Tener constancia de que la obtencin de la muestra ha sido realizada correctamente,
siguiendo las normas y criterios establecidos por el laboratorio, as como su recogida,
transporte y conservacin.
3. La siembra de dicha muestra se har en los medios idneos para cada caso, bien en
placa, por agotamiento y/o mtodo cuantitativo, o bien en tubo.
Procesamiento de las muestras
1. Orinas (debe llegar al laboratorio en contenedor estril y ha de conservarse a 4C
en menos de 24 horas)
[a]
Agar
sangre,
chocolate
o
Cled/Cystine-Lactose-ElectrolyteDeficient (medios general y especifico para orinas) => se siembra en 3
direcciones/ cubrir totalmente la superficie (cuantitativa en Cled o AS - para contar
colonias; realizar antibiograma); crecern todo tipo de germenes: cocos
Gram+, bacilos Gram-, levaduras; en Cled/AS no crecen cocos
Gram- (Neisseria,
Moraxella,
Chlamydia);
en
AS
se
comprueba las caractersticas hemolticas o no de las bacterias e.j. Stafilococcus
aureus (B hemoltico) y en Cled, las caracterstica lactosa (+) => amarillas o lactosa
(-) sin cambio de color => azul verdosas.
[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por
agotamiento en cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo
para ayudar a la identificacin de E.coli (sensible a colistina - comn en
orinas); crecenbacilos Gram- => Enterobacterias y tambin Pseudomonas;
observaremos las caractersticas de lactosa (+) => colonias rojas y lactosa (-) sin
cambio de color => rosa.
[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra
enla lengeta del tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras
decitrato (+) => vira a azul y las que no, permanece verde; se usa para la diferenciacin
deEnterobacterias (para diferenciar entre coliformes y coliformesfecales. Los

coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni


a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes no
fecales como Enterobacter
aerogenes o Salmonella
enteritidis podan
utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina) en base a su capacidad de
utilizar el citrato (mediante citrato permeasa)
Los grmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se
identifican especies):
- E. coli (el mas frecuente) => bacilo Gram-, mvil, sensible a Colistina, lactosa (+),
indol (+)
- Streptococcus faecalis => coco Gram+, catalasa (-), oxidasa (-).
- Proteus spp (todas) => bacilo mvil Gram-, resistente a Colistina, lactosa (-),
oxidasa (-), Triptfano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardo.
- Stafilococcus aureus => coco Gram+, catalasa (+), coagulasa (+), B hemoltico,
oxidasa(-).
- Candidas spp (todas) => morfologa de levaduras (parece como hemates)
- Klebsiella spp => bacilo Gram-, inmvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias
mucosas, lactosa (+), tardo.
- Pseudomonas spp => bacilo Gram-, mvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa
(+)
2. Coprocultivos (contenedor especifico para coprocultivo "Cary y Blair" / bote de
orina;conservada a 4C, procurar procesarla en <24H; se siembran por agotamiento en
cuadrantes).
[a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecern el
generoSalmonella y Shigella; en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias
lactosas (-), verdosas y pueden ser SH2/sulfihidrogeno/ acido sulfidrico (+) con fondo
negro, sonbacilos mviles, sensible a Colistina; las Shigellas spp => lactosas (-) , SH2
(-),bacilos inmviles en fresco y sensibles a Colistina; las colonias lactosas (+) en este
medio sern amarillas;
en SS las Salmonellas y Shigella sern el del medio (caramelo) y tambin con el
fondo negro (Salmonellas SH+ y lactosa- ); colonias lactosa (+) => rojizas; las colonias
lactosas+ no son patgenas (coliformes fecales) y no se investigan.
[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa
clarito- Yersinia
pestis, Yersinia
enterocolitica y Yersinia
pseudotuberculosis.) que aparece como lactosa (+), sensible a Colistina y bacilos
Gram- e mviles, fermentador de manitol. La inhibicin selectiva de organismos
gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal violeta (inhibidor de

Gram+), desoxicolato sdico (inhibidor de Gam+) y los agentes antimicrobianos:


cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de S.epidermidis).

[c] Agar Campylosel => crecer Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos)
como
colonias
pequeas
translucidas, sensibles
a Nalidixico
(especies C.
coli y C.jejuni)resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S,
ureasa (+) oxidasa (+)catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+)
y C.coli (-); P. hipurato=> un procedimiento cualitativo para determinar la
capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente (hipuricasa) el hipurato
sdico que da lugar a acido benzoico y glicina un compuesto de color morado.

[d]
Caldo
Selenito =>
caldo
enriquecido
para
los
gneros Salmonella y Shigella. el selenito de sodio inhibe la flora Gram+ y la
mayora de la flora entrica excepto Salmonella spp.

[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecern como
colonias
rojas
por
ser
lactosas
(+);
no
es
necesario???
[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) =>
aparecen colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Grampleomrficos; el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrgeno y las
vitaminas. El citrato sdico, el tiosulfato sdico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte
inhiben los organismos Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayora de
las entero-bacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este
organismo essensible a los entornos cidos. La alta concentracin de sodio favorece el
crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras
especies de Vibrio, cuya mayora es haloflica. La sacarosa (+) es un carbohidrato
fermentable, y el cloruro sdico estimula el crecimiento. El tiosulfato sdico es una
fuente de azufre y acta con el citrato frrico como indicador para detectar la
produccin de cido sulfhdrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son
indicadores de pH. En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).

3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se


siembra
por
agotamiento
en
cuadrantes).
[a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del
grupo B (S.agalactiae), que aparecern como colonias pequeas translucidas con un
halo de B hemlisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-),
anaerobio
facultativo,
prueba
de
ltex
(+).
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeas
grisceas que crecen bien por ser grmenes exigentes en su crecimiento que requieren
factor X y/o V (proceden de la degradacin de la Hb); tambin podemos colocar discos
de factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmviles, Gram-;
oxidasa
y
catalasa
variable.

[c]
Agar
Thayer
Martin
o
New
York =>
buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitisque aparecern como colonias de color
gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que fermentan la glucosa pero no
el
resto
de
los
azucares.
[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias Bhemolticas y al fresco como bacilo pequeo, Gram variable, anaerobio facultativo,
oxidasa (-) y catalasa (-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las
especies estudiadas, ya que producen -hemlisis alrededor de las colonias. La hemlisis en agar con sangre humana es altamente indicativa de presencia
de G.vaginalis. Los antibiticos incluidos en el medio inhiben la mayora de los
contaminantes Gram- y de las levaduras.

[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp)
yTrichomonas (protozoo unicelular flagelado).

[f]

Agar

[g] Medio

Sabouraud (se
de

puede
deteccin

incluir

para

detectar Candidas

spp)

de Micoplasmas y Chlamydias

4. Semen - la muestra llegara en contenedor estril/ bote de orina; se siembra por


agotamiento en cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate,
Thayer Martin o New York, Roiron, y cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los
mismos
grmenes
que
en
el
caso
del
exudado
vaginal.
5. Esputo - la muestra ha de llegar en contenedor esteril y conservarse menos de 24H
a 4C; antes de sembrar se observa por el microscopio si la muestra es valida/ no esta
contaminada por saliva; se siembra por agotamiento en cuadrantes; solo se siembra
cuando en el Gram, el cociente leucocitos/ celulas epiteliales sea > 2,5 (recuento en
fresco/al microscopio); si es < a 1,5 es dudoso. Cuando sean muestras de UCI o
provenientes
de
neumonas
se
siembran
siempre.
[a]
Agar
Sangre =>
buscamos
colonias
de Streptococcus
pneumoniae oBranhamella catharralis; S.pneumoniae >> colonias verdosas
(alfa hemlisis) y al fresco como coco Gram+, catalasa (-), sensible a la
Optoquina; Branhamella catarralis >> colonias blanco-grisceas y al fresco como
cocos Gram-, oxidasa (+), catalasa (+) que no utiliza ningn azucar (no es
fermentadora), pero reduce los nitratos a nitritos/ nitratasa+(lo que le diferencia del
genero Neisseria que ademas es fermentadora de glucosa y maltosa).
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes
translucidas, que al fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar
chocolate polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de
ladegradacin
de
Hb)
[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-.
[d]
Medio
de
Lowestein-Jensen
(o
Coletsos) =>
para
rescatar Mycobacterium tuberculosis, bacilos acido alcohol resistente (Zhiel
Neelsen+) de crecimiento muy lento; los niveles bajos de la penicilina y el cido

nalidxico tambin estn presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de lo


Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento de especies de micobacterias
solamente. Presencia de verde malaquita en el medio inhibe las floras mayora
acompaante; que se desinfecta y se solidifica mediante un proceso de espesamiento;
el Glicerol
mejora
el
crecimiento
de
Mycobacterium
tuberculosis.
[e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo
Gram- (en realidad, se tie muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta
ni oxida los azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato+ => un
procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar
enzimticamente (hipuricasa) el hipurato sdico; necesita L-cisteina para crecer y
tambin iones frricos Fe. La inhibicin del crecimiento de las bacterias Gram+, la
mayora de las bacterias Gram-, levaduras y mohos, a travs de una combinacin
optimizada de 3 antibiticos. Las colonias que crecen en medio Agar Legionella y no
crecen en medio AS deben considerarse, con alta probabilidad, colonias de Legionella.

6. Cepillado bronquial (la muestra vendr en el cepillo y se conservara a 4C < de


24H); se siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) aadiendo
ademas: agar sangre anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicinavancomicina), selectivo para bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides (bacilo Gram-,
anaerobio
estricto).
7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por
agotamiento
en
cuadrante).
[a] Agar sangre => crecera todo tipo de grmenes (medio general enriquecido)
[b]
Agar
chocolate =>
crecera
todo
tipo
de
grmenes
[c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco
exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para
Gram+/ inhibe los Gram- => para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos,
Enterococcus
y
Staphylococcus??

[e]

Agar

Sabouraud (solo

en

orales)

=>

deteccion

de Candidas

spp.

8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en


cuadrantes. La muestra ha de llegar en tubo estril y se conservara a 4C menos de
24H.
[a]
Agar
sangre =>
crecer
todo
tipo
de
grmenes
[b]
Agar
chocolate =>
idem
[c] Agar Mac Conkey => crecern las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco
exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para
Gram+/ inhibidor Gram- => crecern bien los Steptococcus B-hemolticos.
[e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque tambin puede utilizarse
agarAKV, agar sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos
Gramanaerobios
(estrictos)
y Bacteroides.
[f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias;
permite el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los
nutricional-mente exigentes. Adems, se observa que las bacterias estrictamente
aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las anaerobias facultativas o
anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio.

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO En


base a la relacin de las bacterias con el oxgeno, estas se pueden clasificar en :
1. Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxgeno como
aceptador terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxgeno equivalente o
mayor de una atmsfera de aire (oxgeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente
respiratorio de metabolismo (Mycobacterium tuberculosis, Bacillus).
2. Anaerobio o Aerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en
ausencia del oxgeno y en la presencia de un nivel de oxgeno equivalente a una
atmsfera del aire (oxgeno de 21%) => Enterobacterias, Vibrio spp,
Haemophilus
spp..
3. Microaeroflico (anaerobio aerotolerante): Un organismo que es capaz de un
crecimiento oxgeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del
oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de <21%) => Campylobacter

fetus,
Pseudomonas
y
Neisseria.
4. Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxgenodependiente y no puede crecer en la presencia de una concentracin de oxgeno
equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de 21% - nada de O2). (Clostridium
botulinum).
5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o sin oxgeno pero su
metabolismo
es
siempre
fermentativo
(Lactobacillus)

9. Liquido cefalorraqudeo - se siembra por agotamiento en cuadrante del


sedimento del tubo centrifugado a 1500 rpm a 3000 rpm durante 20 minutos, si en el
tubo hay mas de 1 ml de muestra. Sino, vortear el tubo. La muestra se ha de procesar
de
inmediato
y
si
no
es
posible,
conservarse
a
37C.
[a] Agar sangre => buscamos Neisseria meningitidis, como pequeas colonias
no hemolticas y al fresco se ve como diplococos, Gram-, oxidasa (+), catalasa (+),
fermentador de glucosa y maltosa (la fermentacin de este azucar le diferencia del
gonococo; tambin puede crecer Streptococcus pneumoniae (neumococo) que
aparecen como colonias verdosas (Alfa hemolisis) y al fresco como cocos Gram+,
catalasa
(-),
sensible
a
la
optoquina.
[b] Agar chocolate => dem y ademas pueden crecer Haemophilus spp como
colonias puntiformes translucidas, que al fresco aparecer, como coco-bacilos, Gram-,
catalasa
y
oxidasa
variable.
[c] Agar Thayer-Martin => medio selectivo para Neisserias, crecern bien los
meningococos
/N.meningitidis.
[d] Medio tioglicolato (caldo) => medios para anaerobios y aerobios.
(f)
Ademas
se
har
una
extensin
para
Gram.
10. Otros lquidos estriles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por
agotamiento; la muestra ha de llegar en tubo estril y su conservacin no se ha de
demorar
mas
de
24H
a
4C.
[a] Agar sangre => crecern casi todo tipo de microorganismos, con caractersticas
hemolticas
de
algunos
de
ellos.
[b] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, sobre todo exigentes.
[c] Agar McConkey => crecern Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco
exigentes.
[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo
para
Gram
(+)
[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios

yBacteroides.
11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la tcnica de Maki (rodamiento del
cateter)
[a] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, y podrn crecer bien
algunos
exigentes
como
el
Haemophillus.
[b] Agar sangre => crecern bien casi todo tipo de grmenes y podr verse sus
caractersticas
hemolticas
si
las
tuvieran.
[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se har un pase por Agar
chocolate.
[d] Tambin
puede ponerse
en una
placa
de agar MacConkey.
12. Hemocultivos - la muestra se introduce en el vial de hemocultivos, conservando
a 37C en el Bactec (detecta CO2) hasta su identificacin.

Tema 6 - Medios de Cultivo en bacteriologa


clnica (Clasificacin y Preparacin)
Medios de cultivo - compuesto por distintos nutrientes requeridos para cultivar
grmenes como las bacterias, hongos y parsitos segn sus necesidades nutricionales
de cada uno; en funcin de sus requerimientos, existen grandes diferencias entre los
medios de cultivo que nos sirven para diferenciar cada tipo de microorganismo que
podr
crecer
en
unos
medios
de
cultivo
y
no
en
otros.
Funcin
de
medios
cultivo:
- separar y aislar distintas especies microbiales presentes en una muestra.
- paso previo para el estudio de identificacin de un microorganismo problema.
- conocer el metabolismo en funcin del nutriente o sustrato que utiliza (lactosa) o
metabolito
que
produce
(indol).
- estudios macroscpicos => visualizar las caractersticas de las colonias en medios
slidos.
- realizar antibiogramas determinando la sensibilidad (mayor/menor) de la bacteria
problema
a
distintos
antibiticos.
pruebas
de
CMI
(concentracin
minima
inhibitoria)
conservar
las
especies
microbiales
o
muestras.
Requerimientos energticos y no energticos de los medios de
cultivo - fuente de energia (fuente de carbono y de nitrogeno) y fuente no
energtica (azufre, fsforo, iones metlicos, factores de crecimiento, f. de arranque y

inhibidores) necesarios para el desarrollo (crecimiento) de cultivos microbiales; fuente


de carbono => acido acetico, alcohol, citrato sdico, azucares (mono o disacridos
incluso almidn => glucosa, lactosa, maltosa), CO2 (bacterias fotosintetizantes y
quimiolitotrofas); conocer el tipo de azucar utilizado => til para su identificacin
bioqumica y clasificacin taxonmica; fuente de nitrgeno (menos energtica) =>
protenas completas (gelatina - determinar actividad proteoltica/gelatinasa; extractos
de carne y sales de amonio), pptidos/polipeptidos (peptonas - extractos de levadura,
casena - trpsica de casena/triptfano => formacin de indol) o aminocidos y otros
=> nitratos, nitrogeno organico, amoniaco, sales de amonio, aminoacidos; conocer la
fuente nitrogenada => util para clasificacin taxonmica; fuente de azufre => sulfatos,
tiosulfatos, aminoacidos (metionina, cisteina, tiamina); fuente de fosforo =>
fosfatos; iones metalico => hierro, potasio, sodio, magnesio y en concentraciones mas
bajas
=>
cinc,
manganeso,
cobre,
cobalto,
etc;
Otros
requerimientos
no
energticos:
Factores de crecimiento => componentes que muchas bacterias no son capaces de
fabricar por si solas para su crecimiento (aminocidos => cisteina; factor X y factor V
procedente de la degradacin Hb; vitaminas, bases puricas y pirimidicas); factores
de arranque => sustancias que permite a la bacteria salir de su fase de latencia y
comenzar su fase de crecimiento exponencial (fuentes de energa => glucosa; iones
metlicos que estimula el crecimiento); factores inhibidores => componentes que
bloquar el proceso metablicos de algun microbio; muy tiles para la identificacin y
tipificacin
bioqumica
de
las
bacterias
(azida sodica => impide Gram-; antibiticos => inhibidores y destructores; colorantes
laeosina azul de metileno utilizado por medio Levine; cristal violeta en medio MacConkey
=>
impide
Gram+).
Condiciones
que
ha
de
cumplir
un
medio
de
cultivo:
1. Una composicin de nutrientes adecuada (requerimientos energticos y no
energticos)
2.
Condiciones
fsico-qumicas
apropiadas:
- Temperatura
optima/ideal (segn la
especie
microbiana
=> psicrfilas <20C;mesfilas 18-45C; termfilas > 45C; las bacterias patgenas del
hombre 35-37C; fuera de estas no crecen o crecen mucho mas despacio;)
e.j.: Yersinia 22C, Campylobacter45C
(los
dos
son
gastrointestinales)
- Grado de humedad (cantidad de agua que necesita para crecer)
- pH adecuado es en general cercano a la neutralidad +/- 7(estabilizante de pH =>
buffers o tampones que facilitan el crecimiento); pH acido => Tiobacilos (cerca a
0); pH alcalino => bacilos ureasa positivo/ Proteus (en torno a 8) y Vibrio
cholerae (pH
9)

- Presin osmtica en
general isotnia (300
miliosmoles)
- Presencia o ausencia de oxigeno; la mayora de las bacterias aerobias y
anaerobias son facultativos que se desarollan bien con y sin O2; existen pocos
anaerobios estrictos; bacterias microaeroflica => produce mas CO2.
Principales
tipos
de
medios
de
cultivo
- segn su proporcin de agua / su consistencia (slidos, lquidos, caldo)
- segn su uso / su utilizacin (para aislamiento, crecimiento en general /recuento,
identificacion,
mantenimiento
de
cepas,
para
antibiogramas)
- segn su origen del que proceden (naturales, sintticos y semi-sintticos, complejos)
- segn su presentacin (deshidratados o liofilizados, slidos en placa petri, slidos en
tubo, lquidos en tubo, semi-slidos en tubo, doble fase en frasco o tubo).
Medios
de
cultivo segn su proporcin en
agua:
- Medios slidos > 15% de agar; para aislamiento, identificacin, elaboracin de
antibiogramas) =>1881 Koch utiliza la gelatina (inconveniente => se funde a 24oC y
existen bacterias gelatinasa positiva que destruiran tal medio); posteriormente Hesse
su
alumno
usa
el
agar (medio
inerte).
- Medios lquidos/caldos => contiene agua, fuente de carbono, sales minerales y
algunos lleva factores de crecimiento, vitaminas, peptonas y aminocidos.
- Medios
semisolidos =>
agar
semi-slidos
(<5%
de
agar)
Medios
de
cultivo segn su
uso
o utilizacin:
- Medios para aislamiento => {a} medios enriquecidos (componentes basicos +
caseina soja, triptofano para microorganismo exigente; e.j. agar sangre/chocolate
{b}medios selectivos (componentes basicos + componentes que impiden el crecimiento
de algn tipo bacteriano para seleccionar) e.j. medio Rothe (para aislar Streptococcus
faecalis/Gram+) contiene azida sdica que impide Gram-; la mayoria de medios
selectivos son tambin medios diferenciales {c} medios diferenciales (= medios
selectivos + sustancias resalta las caracteristicas microbiales de algunas; e.j.
medio Levine (contiene eosina y azul de metileno que inhibe Gram+ y algunas Gram-,
facilita
a
las
enterobacterias
y lactosa(para
las
fermentadoras)
- Medios para crecimiento en general => liquida o solida sirve para el
crecimiento de la mayor parte de las bacterias (componentes basicos + sales y agua) ;
e.j. el caldo comun (contiene extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro sodico y
agua);
el
caldo
Tioglicolato.
- Medios
de identificacin (= medios
diferenciales)
=>
sirve
para
clasificar taxonmica-mente el microoganismo; e.j. agua peptonada = indol
positivo; caldo Stuart urea-indol = ureasa; glucosa = fermentacin de glucosa
(sacarolitico
=
sacarosa
positivo).

- Medios de mantenimiento de cepas => mantener las cepas vivas durante


periodos de tiempo relativamente largos a temperaturas bajas para impedir su
crecimiento;
e.j.leche
descremada
congelada
- Medios para antibiogramas; e.j. Proctor (antibiogramas fungicas), Mueller
Hinton(a.b.bacterianas), Wilkins-Chapman (a.b.
bacteriana
anaerobicas).
Medios
de
cultivo segn su
origen
- Medios naturales => poco utilizados, se preparan artesanalmente, constituidos
por ciertos tejidos, liquidos organicos (leche, huevo, patata, suero sanguineo)
- Medios semi-sintticos => parte de su composicion son extractos
naturales(levadura, malta, patata, sagre, leche) + constituyentes sintticos
- Medios sintticos => estructuras sintticas mas o menos puras y qumicamente
definidas disueltas en agua destilada (los mas utilizados en bacteriologia y en general);
contiene: fuente de carbono o azucar, fuente de nitrgeno inorgnica como iones NO3, NH+4 o orgnica como peptona, aminocidos, aminas, etc., compuestos minerales
como oligoelementos, factores de crecimiento (vitaminas, aminoacidos, bases puricas o
pirimidnicas).
- Medios complejos => son los primeros que se utilizaron en bacteriologa; en
actualidad se uss mas en parasitologa y virologa; se preparan de forma compleja
(tejidos animales/carne de musculo, higado, corazon, yema de huevo, azucares,
pepetonas,
vegetales,
etc.
Medios
de
cultivo
segun
su
presentacion
Medios
deshidratados
o
liofilizados
Medios
ya
preparados
Medios
solidos
en
placa
Petri
Medios
solidos
en
tubo
Medios
liquidos
en
tubo
Medios
semisolidos
en
tubo
Medios
de
doble
fase
en
frasco
Principales
medios
utilizados
en
microbiologa
1. Agua peptonada (peptona en medio acuoso con pH 7 a 37C 24-48 horas) =>
determinacin de la produccin de indol debido a su alto contenido en triptfano; tras
laadicin de 5/6 gotas de reactivo Kovacs en hidrxido potsico (KOH 40%) => anillo
rojo en la superficie indicara indol positivo.

2. Medio
Chapman (selectivo
y
diferencial)
=>
aislamiento
de Staphylococcus (halfilos)S.aureus (coagulasa+); Comp: alto contenido de cloruro
sdico 75 gr (agar manitol salado); 15 gr de D-manitol (diferencial => azucar utilizado
por algunos estafilococos), 25 gr de rojo fenol (indicador positivo de pH a 37C 24-48
horas => amarillo dorado); es orientativa, se debe completar la prueba con pruebas
bioqumicas (coagulasa/latex); S.epidermidis no fermentan el manitol, por tanto el
color sigue rojizo o purpureo.

3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de
muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos
(Neisseria); Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y
aminocidos) + VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina => inhibe
los coliformes /Gram-,anfotericina => antifngico, trimetropinsulfametroxazol =>
antibitico de amplio espectro).

4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la


mayora de bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex

(vitaminas y aminocidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida


adenina dinucletido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.

5. Medio base Christensen (lquidos y slidos) => para la prueba de la ureasa;


ureasa+ de rojo => rosa; grmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory

6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de
energa) para la investigacin de bacilos Gram- (la diferenciacin entre coliformes y
coliformes fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el
citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los
coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan
utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina); Comp: citrato
sdico, azul de bromotimol(indicador pH, de que el citrato esta consumido /se
alcalina; verde => azul); grmenes con citrato permeasa => Klebsiella pneumoniae,
Salmonella, Enterobacter aerogenes.

7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias


medianteprueba de Voges-Proskauer (produccin de acetona/ acetil metil carbinol =>
por reduccin a 2,3 butanodiol o por oxidacin a diacetilo); y prueba de Rojo de
Metilo(acidificacin del medio con pH <4,5 y cambio de color a rojo); grmenes
con VP+ =>Klebsiella
pneumoniae y Enterobacter
aerogenes;
grmenes
con RM+ => Proteus, E.coli y Salmonella.

8. Medio Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (solido) => recuento e


identificacin de grmenes en las vas urinarias; Comp: lactosa en alta cantidad, azul
de bromotimol (indicador del consume lactosa verde => amarillo); las colonias mas
frecuente => E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-), Klebsiella (amarilla azulada y muy
mucosa (L+), Pseudomonas aeruginosa (verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla
L+),Staphylococcus aereus (amarilla L+).

9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar)
=>investigacin de microorganismos hemolticos (consume hemates); es un medio
general enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero =>
estriles y desfibrinadas; alfa hemlisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso
alrededor de la colonia; beta hemlisis/ Streptococcus B-hemoltico y Staphylococcus
aureus que
causan
anginas
(total)
=>
halo
transparente;
gamma
hemlisis/ Pseudomona causa gastro intestinales (no hemolizar) => sin halo.

10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y
diferencial, para aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter,
Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador
fermentadora), eosina azul de metileno (indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las
floras de Gram- fastidiosas).

11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de enterobacterias patgenas Gram-; Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de
L+ => amarillo/naranja) sacarosa, peptona, tiosulfato sdico y citrato frrico
amoniacal(indicador de la produccin SH2/H2S => puntos negro), azul de
bromotimol, fuschsina cida (indicadores de pH); en condicin normal es verde =>
fermentacion de lactosa/acidificacin => vira a amarillo/naranja (caractersticas
de fermentadora L+Escherichia, Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y Vibrio
cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se acidifican primero, y despus se
basifican) => verde; cuando se consume azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y
la colonia se vuelve negro (caracterstica de Salmonella y Proteus vulgaris).

12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo);
muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy
utilizado para la identificacin de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y
SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato frrico amoniacal y
tiosulfato sdico (componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los
grmenes productor de SH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores
del gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.

13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificacin de enterobacterias


Gram-/
poco
exigentes;
Comp: sales
biliares (inhibidor
Gram+), lactosa (indicador L+), cloruro sodico, rojo neutro, cristal violeta (inhibidor
los cocos de Gram+); L+ (consumidor de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter
aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella, Shigella y Pseudomonas; Gramexigentes => Neisseria, Haemophyllus.

14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el
mtodo de Bauer-Kirby

15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) =>


identificacin de la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para
descarboxilar la ornitina(orinitina descarboxilasa /est dada por un color prpura/
alcalinidad del medio y laproduccin de indol (al aadir reactivo de Kovacs); La
movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que
difunde mas all de la lnea de inoculacin; el germen que da resultado positivo de los
3 pruebas => E.coli.

16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el
aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sdico (inhibidor de flora Gram+ y
Gram- excepto Salmonella); despus tambin se hace cultivo con agar SS.

17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patgenas
importantes Salmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de
L),tiosulfato sdico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde
brillante(inhibidor bacillos Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (tpico de Shigella); Ly SH2+con la precipitacin de hierro => negro (tpico de Salmonella).

18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el


aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos Gram-, especialmente del
gnero Salmonella y
especialmente Shigella (entero-bacterias
patgenas);
Comp.: xilosa (la
fermentan
los entricos menos Shigella),
sacarosa
y
lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+); se puede utilizar para la identificacin
de lactasa+, lisina descarboxilasa+ =>Salmonella que alcaliniza el medio y SH2+
(tiosulfato sdico + citrato de hierro amoniacal).

19. Medio

caldo

Columbia =>

caldos

para hemocultivos.

20. Medio Castaeda (caldo y solido) => bsqueda de grmenes Brucella,


Vibrios
y
Pasteurella en
sangre
(hemocultivos).
21. Medio de Lowenstein-Jensen (selectivo) => cultivo de Mycobacterium
tuberculosis y otras micobacterias; Comp: fcula de patata, verde malaquita =>
inhibidor de la mayora de grmenes; la prueba se confirma con tincin de acido
alcohol resistencia(Con la tincin de Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan como
bacilos de color rojo);micobacterias patgenas crecen muy lenta (+ 7 das); los niveles
bajos de la penicilina y el cido nalidxico tambin estn presentes en el medio de LJ
para inhibir el crecimiento de Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento
=> nico de micobacterias.

22. Medio Sabouraud => para el aislamiento e identificacin de hongos micelares y


levaduriformes.
23. Medio Sabouraud gentamicina tetrazolium => para el aislamiento
eidentificacin de Candida (levaduriformes); La gentamicina inhibe el crecimiento de
la mayora de las bacterias Gram- y Gram+.

24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo

deanaerobios (estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el


extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3 y la adicin de sangre de
cordero permite el crecimiento incluso de las especies ms exigentes.
El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentracin de dextrosa en el medio
favorecen
el
crecimiento
de especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides.
25. Medio CPS cromognico (agar/ solido) => es un medio de aislamiento y
de identificacin destinado a las muestras urinarias; permite realizar (1) el recuento
microbiano (mtodo de inoculacin estandarizado); (2) identificacin de: Escheri
chia coli, Enterococcus del grupo D, KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Proteeae
(Proteus, Providencia, Morganella); la concentracin elevada de agar evita el
crecimiento invasivo de Proteus; el medio se inocua directamente a partir de la orina,
respetando tcnicas adecuadas de toma de muestras y su transporte; permite la
identificacion
directa
de:
a. E.coli => coloracin espontanea (rosa a burdeos) de las colonias productores de
B-glucuronidasa (B-GUR) y coloracin azul revelada por el reactivo indol cuando la
cepa
genera triptofanasa.
b. Enterococcus y KES => coloracin espontanea azul-verde de
las
cepas
queproducen
B-glucosidasa (B-GLU).
c. Proteeae => coloracin marrn revelada por el reactivo TDA cuando la cepa
genera triptfano desaminasa (sin
reactivo
es
incoloro).
Modo operativo - dejar atemperar las placas a temperatura ambiente; inocular la
muestra con el asa calibrada de 10ul => sumergir el asa en la orina, mantenerlo
verticalmente; descargar el asa al realizar una estra sobre un radio de la placa;
realizar estras perpendiculares muy apretadas sobre toda la superficie de la placa;
incubar en la estufa con la tapa hacia abajo a 37C en aerobiosis; se examinan los
cultivos despus de
24
horas
de incubacin.
Lectura
e interpretacin:
Recuento - estimar la concentracin bacteriana comparando la densidad de las
colonias presentes sobre la mitad superior de la placa con la del esquema; <1000
(negativo), entre 1000 - 100.000 (dudoso), mas de 100.000 (positivo)
Identificacin observar
las
colonias
(1) Colonias de color rosa a burdeos o translucidas con centro rosa a
burdeos=> presuncin de E.coli; confirmar mediante una deteccin de indol (depositar
una colonia sobre un disco de papel previamente embebido de una gota de reactivo R1
del envase ID Indol TDA) => indol+ da una coloracin azul (E.coli); la ausencia de
color
azul
(indol-)
se
debe
proceder
a
la
pruebas
de
API.
(2) Colonias de color azul-verdoso y observacin de cocos Gram+ mediante examen
directo => Enterococcus; si no cumple esta condicin, se debe proceder a las

pruebas
de
API.
(3) Colonias de color azul-verdoso y observacin de bacilos Gram- mediante examen
directo
=> grupo
KES;
la identificacin se
debe
proseguir
mediante
pruebas bioqumicas
(ureasa+ =>
Klebsiella; ornitina
descarboxilasa+ =>
Enterobacter; gelatinasa+ =>
Serratia).
(4) Colonias incoloras a marrn-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas
colonias idnticas, una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar
la coloracin despus de unos 30 segundos => TDA+ da una coloracin marrn +/oscuro; efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia o
Morganella); ausencia de coloracin azul es indol- (Proteus mirabilis); TDA- da
una coloracin amarilla y la identificacin se debe proceder a las pruebas de API.

Tema 7 - Metodos de Siembra (cultivo de las


cepas)
Sembrar - cultivar la muestra utilizando tcnica y medios adecuados para conseguir
el
objetivo
(identificar
el
microorganismo).
Preparacin
de
inculos (pequea
parte
de
muestra)
- Muestras viscosas o concentradas (anlisis cuantitativo) => suspender un cultivo
joven y puro o un producto patolgico (muestra biolgica) en 5 ml de solucin
diluyente (caldo de cultivo, suero fisiolgico estril o agua destilada estril.
- Ajustar con la escala con un gradiente de turbidez (tecnica de Kirby-Bauer) => tubos
numerados como patrn de referencia segn la concentracin de microorganismos; se
ajusta mediante comparacin visual aproximada o mediante la absorbancia de
espectrofotometra; escala de Mcfarland => una serie de tubos con precipitacin
blanco de sulfato de bario por reaccin de acido sulfrico + cloruro de bario (escala 0,5

= 1,5 x 10.6/ml de microorganismos en el inoculo; escala 1 = 3 x 10.6 /ml; escala 2 = 6


x10.6./ml.

Metodos
de
inoculacin
y
aislamiento
de
microorganismos
1. Metodos
de
siembra
inoculacin:
{a} En medio liquido; con asa => se sumerge el asa cargada en el medio y se agita; con
pipeta => se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se
homogeneiza;
con
escobilln
=
con
asa.
{b} En
medio
solido (en
placa):
- Inoculacin previa al vertido en placa (tcnica de Barry - no se utiliza mucho) => 0,1
ml de inoculo + 25 ml de medio cultivo => fundido/ atemperado a 45-55C para no
esterilizar
=>
homogeneizar
=>
verter
en
la
placa
de
Petri.
- Inoculacin sobre la superficie del medio solidificado (tcnica de Kirby-Bauer) => se
prepara el inoculo en un tubo estril; se introduce un escobilln estril impregnando;
se elimina el exceso presionando el escobilln con movimiento de rotacin contra las
paredes del tubo; se siembra la placa emplenando la tcnica de los tres giros
distribuyendo uniformemente el inoculo; se deja secar la placa 4-5 minutos en posicion
semiabierta e invertida, quedando lista para ser utilizada (en los antibiogramas).
{c} En
medio
solido (en
tubo):
- Siembra por estria en superficie inclinada => se toma la muestra con el asa /hisopo;
se introduce en el tubo que contiene el medio; desde el fondo y en progresin
ascendente se desliza el asa en movimiento de zig-zag (se utiliza para pruebas
bioqumicas
y
renovar
cepas).
- Siembra en picadura (para ver la movilidad de los grmenes en la zona de puncin +
pruebas bioqumicas) => se toma la muestra con la aguja o hilo; se punciona en el
centro del medio introduciendo la punta de la aguja hasta 2-3 mm del fondo del tubo;
se extrae la aguja por la misma linea que se introdujo; medio solido inclinado
=> puede realizarse tambien una siembra en estra por la superficie del medio con la
misma aguja; agar semi-solido => puede usar el asa en lugar de la aguja.

2. Metodos de siembra - aislamiento (para obtener cepas puras/ bien aisladas) :


{a} Siembra en estria o zig-zag => se deposita el inoculo en el extremo superior de la
placa; se siembra con el asa o con hisopo, a partir del inoculo, con un movimiento en
zig-zag cada vez mas amplio de lado a lado de la placa; el estriado ha de hacerse sin
presionar el medio, suavemente, sin levantar el asa y sin flamearla; las colonias mas
aisladas las obtendremos en la zona mas distal del inoculo, es decir al acabar la
siembra.
{b} Siembra en tres direcciones => se deposita el inoculo en el extremo superior de la
placa dejando deslizar hacia el centro para ello inclinaremos la placa (tambin se
puede arrastras con el asa); mediante asa o escobilln, haremos movmientos laterales
de un lado a otro de la placa, dejando las estrias muy juntas; giramos la placa 90 y
realizamos la misma operacin, sin flamear o cambiar de asa; volvemos a girar la placa
haciendo lo mismo; al final nos queda una placa muy bien tapizada. Se realiza en
urinocultivos
para
el
contaje
de
las
colonias.
{c} Siembra en estra multiple => se deposita el inoculo en un extremo de la placa; con
el asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa; entre cada tramo se
ha de flamear o cambiar el asa; los segmentos seguidos describen un poliedro regular y
el ultimo tramo se efectua hacia el interior en el que se obtendran colonias aisladas.
{d} Tcnica por agotamiento en cuadrantes (lo que usamos) => es muy similar a la
anterior pero sin flamear el asa y estriando mas los cuadrantes, aprovechando mas la
placa.
{e} Tcnica de los 4 cuadrantes => se divide la placa en 4 cuadrantes (pueden rotularse
por la parte posterior); se deposita el inoculo en el extremo superior de uno de los
cuadrantes y se siembra en estra; sin flamear el asa, se realiza la misma operacion
sucesivamente en los otros 3 cuadrantes; en cada uno de ellos se sembrara el inoculo
que queda adherido al asa, tras la siembra del anterior; en el ultimo de los cuadrantes
sembrado,
se
encuentran
las
colonias
aisladas.
{f} Tcnica de los tres giros => se siembra en estra la mitad de la placa; flamear el asa;
se gira la placa 90, sembrando en estra la mitad superior de la misma; se repite la

operacin, es decir se ha de flamear el asa, se gira la placa y se estra; la colonia


aisladas aparecer en la zona sembrada en ultimo lugar.

Tema 8 - Caractersticas biolgicas de la


bacteria
(Morfologa)
Bacterias - organismos unicelulares de tamao 0,2-2 um, relativamente sencillos,
cuyamaterial gentico no esta rodeado por una membrana nuclear especial
(procariotas).
Estructura - constituidos por elementos obligados (presentes en todas las
bacterias eindispensables para su vida => pared celular, membrana plasmtica,
citoplasma, ribosomas y la regin nuclear); elementos facultativos (son elementos
de supervivencia y virulencia que pueden estar o no presentes en la bacteria =>
capsula, flagelos, pelos/pilis, endosporas e inclusiones citoplsmicas)

Pared celular - es el limite externo de la clula con estructura rgida, parecida a la


pared celular de las clulas vegetales; funciones => protegerse de cambios externos
adversos,mantener la morfologa de la clula, proporciona la resistencia a los
antibiticos, dar unpaso selectivo de algunas sustancias, proporciona la especificidad
de grupo y de tipo (clasificacin), implicada en la patogenicidad; dar el color en la
tincin de Gram, violeta oscuro => Gram+ y color rosa => Gram-.

Estructura y composicion de la pared celular - Gram+ => mono-estratificada y


gruesa, compuesta por mureina (peptidoglicano - mono-capa, 50% peso seco/mucha
cantidad), polisacridos, protenas y cidos teicoicos; Gram- => biestratificada y
fina (1 capa es mureina en poca cantidad y 2 capa formada por polisacridos
protenas, fosfolipidos y lpidos, no tiene cidos teicoicos); las bacterias que no son
sensibles a la tincin de Gram => BAAR/ acido alcohol resistentes (micobacterias); las
que sin pared celular => los de genero mycoplasma/ patgenas; la que tienen (formas
S), pero la pierden (formas L).

Membrana plasmtica - estructura delgada que se extiende por dentro de la pared


celular, encerrando al citoplasma; funciones => acta como barrera selectiva,
interviene en la degradacin de nutrientes y produccin de energa, en algunas se
encuentran pigmentos y enzimas para la fotosntesis; estructura y composicin =>
fosfolpidos, protenas y glicolpidos; mesosomas => plegamientos hacia dentro de la
membrana plasmtica, irregulares (no existen en las celulas eucariticas), se encargan
de dirigir la duplicacin del ADN bacteriano y realizar la respiracin.
Citoplasma - es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmtica; funcin =>
engloba los orgnulos celulares (regin nuclear, ribosomas, inclusiones/depsitos de
reserva, vacuolas); no tienen ni aparato golgi, ni retculo endotelial plasmtica, ni
mitocondria; composicion => 80% de agua, enzimas, iones y principios inmediatos.
Regin nuclear - una zona en el interior del citoplasma donde se acumula el acido
nucleico; funciones => el acido nucleico transmite la informacin gentica de la clula
sobre estructuras y funciones celulares; estructura y composicion => es un ncleo
difuso que contiene 1 molcula ADN bicatenario, formando N cromosomas (enroscada
en forma de anillo); plsmidos => estructuras que pueden existir ademas de ADN
cromosmico (formadas por moleculares de ADN extra-cromosmico bicatenario,
pueden estar libres o unidos al ADN cromosmico /episomas), se replican
independientemente, se transmite por conjugacin, portan genes muy importantes que
determinan la resistencia a antibiticos, tolerancia a metales txicos y sntesis de

enzima.
Ribosomas - son orgnulos celulares muy abundantes (presentes en eucariotas y
procariotas) dan aspecto granuloso a su citoplasma; funciones = > sntesis de
protenas;estructura y composicion => en grupos de 3 o 4 unidos por un filamento de
ARN mensaje (polirribosomas), cada ribosoma tiene 2 subunidades de 30 y 50
Svedberg (velocidad relativa de sedimentacin), procariotas - 70S y eucariotas - 80S;
comp:
60%ARNr
y
40%
protenas.
Elementos facultativos (algunos no tienen - variables) - son elementos de
supervivencia
y
virulencia
Inclusiones citoplsmicas - aparecen en el citoplasma y no tienen una estructura
uniforme; funciones => depsitos de reserva e intervienen en funciones de regulacin;
Tipos: (1) Grnulos de reserva => lipdicos, corpsculos metacromticos (fosfato
inorgnico), polisacridos (glucgeno y almidn), grnulos de azufre; (2) Vacuolas =>
acmulos de gases o lquidos rodeados de membrana (donde se fija CO2).
Flagelos - largos apndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia
es rara); funciones => responsable de la movilidad (elementos patognico: facilitar la
difusin
de
las
bacterias
a
traves
de
las
membranas); estructura =>
tres
partes
(filamento,
codo
y
corpsculo
basal); tipos =>montricas (1 solo flagelo en un extremo), loftricas (2 o mas en un
extremo), anftricos(un grupo de flagelos en un extremo y otro grupo en el otro
extremo), pertricos (flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria);
Pelos /pilis o fimbrias - elementos rgidos constituidos por una protena (pilina);
cortos, muy numerosos, distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram- que
en Gram+; funciones => capacidad de fijacin a superficies (pelos comunes),
proporcionan pelos comunes y sexuales (son morfolgicamente iguales), sistema
de intercambio de informacin gentica por conjugacin (pelos sexuales).
Endosporas - solo en bacilos (Bacillus aerobio estricto y Clostridium anaerobio
estricto); una forma de resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones
adversas (deficiencia nutricional, desecacin, frio, temperaturas elevadas, agentes
qumicos); se forman por un proceso de esporulacin /esporognesis, pueden
permanecer latentes durante cientos de aos y volver a una forma vegetativa por un
proceso germinacin;localizacin => zona central, subterminal o terminal (depende de
su tamao, pueden o no deformar el bacilo); la espora => clula en reposo con
capacidad de resistencia a la desecacin, calor y agentes qumicos; esporulacin => la
produccin de estructuras, enzimas y metabolitos nuevos y la desaparicin de muchos

componentes celulares; Morfolgicamente comienza con el aislamiento del ncleo y


elementos energticos mediante el crecimiento en vaginante de la membrana; los
elementos esenciales para la vida quedan protegidos en esa nueva estructura
(endosporas); la bacteria queda en estado latente esperando una condicin externas
favorables
para
resurgir.
Capsula - estructura que rodea la pared bacteriana; se visualiza con tincin negativa
(tinta china); funciones => regula el intercambio de agua, iones y nutrientes, sirve
comoalmacn externo de nutrientes, defensa frente a Acs, fagos y celulas
fagocticas (elemento virulencia), protege de la desecacin (contiene agua), formacin
de colonias(habitualmente engloba mas de una bacteria); estructura y composicin =>
polisacridos y protenas.

Tamao y Morfologa de las Bacterias - 0,2 - 2 um; es preciso utilizar el


microscopio ptico; la morfologa => informacin primaria sobre el tipo de bacteria,
pero no de forma concluyente (viene dada por la rigidez de la pared; formas =>
esfrica/coco, coco-bacilo, bastoncillo/cilndrica/bacilo, helicoidal/espirilo, en
coma/vibrio, espiral/espiroqueta, estrella y cuadrangular /forma de hifas de hongos
(actinomyces/
streptomyces
productor
de
muchos
ATB,
ATF
y
inmunosupresores); agrupacin
de
los
cocos => aislados,
en
parejas/diplococos (granos de cafe - tpico de neisserias/meningitis), en
cadenas/estreptococos,
tetradas
o tretacocos (4
celulas
=>
micrococcus/micrococacceae), en racimos/estafilococos, en formas cubicas de 8
elementos/sarcinas (sarcinas
ventriculi
tolerancia
al
medio
cida/
estomago);agrupacin de los bacilos => aislados, en parejas/diplobacilos, en
cadena/estreptobacilos, algunos se parecen a cocos/cocobacilos (E.coli), en
formaempalizada/letra china (corynebacterium - algunos son saprofitos de la piel y
tambin
causante
de
difteria).
Aroma tpicos => Pseudomonas aureginosa (olor a jabn); Haemophyllus (olor
asemen/yeso); Citrobacter (olor a ftido); Proteus (olor a amoniacal); Klebsiella y E.
coli(olor a levadura de pan).

Tema

10

Fisiologa

de

las

bacterias

Morfologa macroscpica - estudio de la forma y estructura de las colonias (masas


constituidas por muchos millones de bacterias, se aprecian a simple vista y originadas
a partir de una bacteria en el medio solido); reconocible en funcin de
=> 1. caractersticas o tipo de medio de cultivo solido donde se ha desarrollado (un
microorganismo puede dar lugar a distintos tipos de colonias) 2. tipo de
microorganismo (mayor movilidad => colonias extendidas y planas); la verificacin de
las colonias (siempre en medios slidos sembrndolo por estra) => en placa y en tubo
con
agar
inclinado.
Las
colonias
en
placa
sembrndolo
por
estra
El tamao y el aspecto de cada colonia son bastante constante para cada genero y
especies, hecho que se puede utilizar como caracterstica diferencial; tamao => 1-2
mm (E.coli); 4-6mm (stafilococcus en agar sangre); extendidas en forma de velo
invadiendo toda la superficie del medio (Proteus en AS); puntiformes +/- 0,5 mm o
inferiores (stafilococos en AS); forma => segn el espesor (planas, elevadas,
semiconvexas, cncavas semicncavas, semiesfricas, en meseta); segn los bordes
(lobuladas, onduladas, rizoides, redondeadas, filamentosas, especuladas); superficie
de la colonia/ elevacin/ aspecto => lisa, rugosa (con capsulas), plana,
acuminada, umbilicada, mucosa, seca; consistencia de la colonia => duras,
viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas; transparencia y coloracin =>
debido a la elaboracin de algn tipo de pigmento, formacin de alguna sustancia por
parte de la bacteria o la utilizacin de algn sustrato del medio que se acidifique o
basifique; la presencia o no de halos de transparencia => generado por la
prueba de la gelatinasa (+) en placa y tambin por la actividad hemoltica de ciertas
bacterias con hemolisinas (estreptococos hemolticos tipo alfa, beta y gamma).

Las colonias en tubo, con agar inclinado - sembrndolo por estra


Las colonias presentan las mismas caractersticas que en placa, pero su visualizacin es
mucho peor (menor superficie); aspecto => filiforme, rizoide, arborescente,
filamentoso, difuso, perlado, equinulada, arrosariada.

Morfologa microscpica - estudio de la estructura fina de las bacterias


1. Estudio
de
su
forma
como
clula
procariota
individual:
oval/esfrica => coco/cocoidea; cilndrica/bastn => bacilo; espiral/helicoidal =>
espirilo/sacacorchos /espiroquetas; filamentosa/forma de hifas de hongos =>
filamentosas (actinomyces/ streptomyces), formas intermedias => vibrio, coco-bacilos;
bacterias helicoidales => Borrelia (poca espiras y amplitud), Treponema (tiene mas
espiras)
y
Leptospira
(muy
apretadas
y
enroladas).
2. Estudio de su agrupacin bacteriana (no todas las formas bacterianas se
agrupan, p.ej. los espirilos y los actinomicetos) => los mas frecuentes son las formas
cocoideas y las bacilares son menos frecuentes; las cocoideas => diplococos (parejas
/granos de caf => neisserias y neumococos); estreptococos (paralelos/cadenas =>
streptococcus); tetradas o tretacocos (4 celulas => micrococcus/micrococacceae);
estafilococos (racimos => staphylococcus/ micrococcus); sarcinas (cuboidales de 8
celulas o mas; sarcina ventriculi y tambin stafilococcus); las bacilares =>
diplobacilos/parejas,
estreptobacilos/
cadenas
y
formas
irregulares/en
empalizada/letra
china
(corinebacterium).

TAXONOMA
CLASIFICACIN
DE
LAS
BACTERIAS
La clasificacin definitiva de las bacterias esta aun por establecer; los que se utilizan
actualmente deben considerarse como provisionales o transitiva; la mas utilizada
suelen ser recogidas de las manuales BERGEY'S en la 9 edicin de Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology de 1994, se agrupan a las bacterias en 35 grupos, situados
en
4
categoras
mayores:
1. Eubacterias Gram- (bacterias verdaderas) con 16 grupos; en esta categora
se incluyen a la mayor parte de las bacterias que provocan a la patologa humana.
Espiroquetas:
Familia Leptospiraceae (genero
- Leptospira)
Familia Spirochaetaceae (genero
- Borrelia,
Treponema)
Helicoidales /vibrioides aerobias - microaerfilas mviles (crecen mejor a
bajas
presiones
de
oxgeno):
Familia Campylobacteriaceae (genero
- Campylobacter,
Helicobacter)
Bacilos y cocos aerobios - microaerfilos (crecen mejor a bajas presiones de
oxgeno):
- Familia Pseudomonadaceae (genero - Pseudomonas, Stenotrophomonas)
- Familia Alcaligenaceae (genero - Bordetella) => bacilos y coco-bacilos
Familia Legionellaceae (genero
- Legionella)
Familia Neisseriaceae (genero
- Neisseria)
=>
diplococos
Familia Moraxellaceae /
Familia Branhamaceae (genero
- Moraxella,
Branhamella)
=>
diplococos
Otros
generos
=> Brucella (cocobacilos)
Bacilos
anaerobios
y
facultativos:
- Familia Enterobacteriaceae (genero - Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,
Klebsiella, Serratia, Hafnia [coliformes] Morganella, Proteus, Providencia,
Salmonella,
Shigella,
Yersinia/peste)
Familia Vibrionaceae (genero
- Vibrio,
Aeromonas,
Plesiomonas)
Familia Pasteurellaceae (genero
- Haemophilus)
Otros
generos
=> Gardnerella
Cocos
Gramanaerobios =>
genero
- Veillonella
- Familia Rickettsiaceae (genero Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia) - son parsitos
intercelulares
obligados,
altamente
pleomrficas
cocos/bacilos/hilos
- Familia Chlamydiaceae (genero Chlamydia) - son parsitos intercelulares
obligados
de
forma
esfrica.
2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan
patologia
humana
(la
mayoria).
Cocos =>
genero
- Staphylococcus
y
Streptococcus

Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio)


Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria
Bacilos
irregulares
no
esporulados:
Familia Corynebacteriaceae (genero
- Corynebacterium)
Micobacterias:
Familia Mycobacteriaceae (genero
- Mycobacterium)
3. Micoplasmas (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30);
dentro
de
este
grupo,
los
que
provocan
patologa
humana
=>
genero Mycoplasma/Mycoplasma
pneumoniae y Ureaplasma.
4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); todas las bacterias de este grupo no
provocan patologia humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/
termogenas)
Taxonoma => la ciencia de la clasificacin que agrupa y separa los organismos de
acuerdo con su caractersticas fenotpicas, estructurales o genticas para facilitar su
estudio; la misin => construir un esquema racional, para clasificar y nombrar los
organismos; el sistema jerrquico de la taxonoma se ha formado gradualmente a
partir del sistema binomial / binominal / binaria de nomenclatura genero y
especie establecida por Linneo en 1758 (un botnico); la taxonoma no es una ciencia
esttico, goza de gran dinamismo y esta en la relacion con los avances de los
procedimientos empleada para su estudio; el termino de sistemtica se utiliza como
sinnimo de taxonoma; los grupos de taxonoma van de dominio - imperio - reino tribu - divisin - clase - orden - familia - genero y especie.
Para la asignacin de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el cdigo
internacional de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido
publicado por el Intl Journal of Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien
dentro de los sistemas en las listas de las bacterias aprobadas que incluyen sus
nmeros; una especie bacteriana, viene definida por un nombre genrico de un
nombre especifico latinizado o helenizado y concuerdan gramaticalmente; la inicial de
genero va con letra maysculas y el de especie con minsculas; tanto el nombre de
genero o especie se escriben con letra cursiva/ italica o en su defecto, subrayado; en la
denominacin de un especie, la palabra que define genero puede ser abreviada a su
inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de las bacterias no se
eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej. Staphilococcus
aureus (cocos en forma de racimos - dorados); o pueden dar homenaje a un autor p.ej.
Pasteurella, Bacilo de Koch, tambin puede dar referencia a un acontecimiento p.ej.
Legionella; el nombre generico es nico; para referirse a un especie o varios especies

no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de las categoras taxonomia


superiores, se forman aadiendo las palabras que las asignan distintas terminaciones,
p.ej. aceae; para el orden => ales (sufijo) p.ej. Mycoplasmatales; todas las categoras
taxonoma
se
expresa
en
cursiva
o
itlica.
FLORAS
BACTERIANAS
Flora Normal de la especie humana => la poblacin de microorganismos
comensales que normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las
personas adultas sanas; la piel y las mucosas colonizadas por microorganismos
dinmicos => cambios cualitativos y cuantitativos constantemente; 2 poblaciones:
1. La flora residente (FR) => un numero relativamente fijo de especies de
microorganismos (comensales y oportunistas) en una zona definida (si se producen
alteraciones, suelen ser temporales); permanecen intactas; encuentran condiciones
fisiolgicas y nutritivas adecuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente
beneficiosa (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorcin de nutrientes
y impide la colonizacin de microorganismos potencialmente patgenos.
2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patgenos o potencialmente
patgenos, que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene poca
importancia, pero si la flora residente se altera, la flora transitoria puede multiplicarse
y
producir
infecciones.
La supresin de FR => vaci ecolgico => ocupacin de microorganismos ambientales
o
de
otras
zonas
de
cuerpo
=>
infecciones.
FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estriles; algunos ejemplos:
- Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, si
alcanza el torrente sanguneo => si vlvula cardaca daada => posible endocarditis;
- Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada =>
posible
peritonitis
o
bacterimia.
- Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cncer, leucemias,
linfomas,
SIDA)
- E.coli es comensal del colon => lugar estril (o no habitual) a traves de uretra =>
infeccin
urinaria
Las causas de las interpretaciones errneas => no se toma en cuenta al
microorganismo como patgeno o se le descarta (como mero contaminante); la
omisin o inclusin de una especie en una de las categoras no implica que no pueda
ser aislada en otra zona del cuerpo o que en condiciones especiales, pueda producir
enfermedad.
Flora

normal

de

la

piel,

boca

vas

respiratorias

superiores

- Las
principales (en
faringe
y
traquea)
=> Staphylococcus
epidermiditis (coagulasa-),Staphylococcus
aureus (coagulasa+)
en
pequeas
cantidades, Micrococcus spp, Neisseriade especies no patgenas, Estreptococos Ahemolticos y
no
hemolticos,
las
anaerobias
facultativas, Candidas.
- FT/no residente se elimina o se disminuye => pH acido, los cidos grasos de las
secreciones sebceas, lisozima, el sudor y el lavado diario con jabones desinfectantes;
se disminuye de forma temporal => la repoblacin es muy rpida.
- Al nacer => la boca y faringe son estriles; tras 12 horas => Streptococcus
viridas (las mas abundantes en la boca), posteriormente => estafilococos
(S.epidermiditis), diplococos Gram-, difteroides (Corynebacterium); salida de
dientes => espiroquetas de Bacteroides, Fusobacterium e Actynomicetes, vibrios
anaerobios, Lactobacilos y levaduras; Adulto normal => las principales (mira arriba!!)
Los
bronquios,
bronquiolos
y
alvolos
suelen
ser
estriles.
Flora
normal
del
tracto
intestinal
- Al nacer => estril, posteriormente => colonizado por microorganismos de los
alimentos dependiendo de la dieta (p.ej. la leche materna => Estreptococos y
Lactobacilosy
el
bibern
=> flora
mixta con
menos
Lactobacilos)
.
- Adulto normal => el esfago contiene lo que previenen de la saliva y comida; en el
estomago hay poco (pH acido protegen la clera y salmonelosis - excepto Helicobacter
pilori que puede causar ulcera pptida, tiene ureasa que alcalina/neutralizar el acidez:
degradar la urea => amoniaco); el intestino delgado superior contiene Lactobacilos y
enterococos; intestino delgado inferior (leon y ciego) contiene la flora fecal; el
coloncontiene >100 especies 96-99% anaerobios facultativo y estricto => Bacteroides
spp, Fusobacterium spp, Lactobacilos/ Bifidobacterium spp, Clostridium spp, cocos
Gram+
anaerobios
(Peptostreptococcus
spp).
- La utilidad/beneficio => sintetiza la vitamina K, transformacin de los pigmentos
biliares en cidos biliares, absorcin y metabolismo primario de nutrientes.
- La administracin de anti-microbianos orales => la posible proliferacin de
cepas resistentes al anti-microbiano administrado y pueden ser diseminada.
- La administracin de ATB por va parenteral en una ciruga intestinal => necesario
para reducir al mnimo posible el numero de microorganismo, evitar trauma en el acto
quirrgico
y
infeccin
peritoneal
e
diseminada.
Flora
normal
de
la
uretra
- Los mas frecuentes son estafilococos, enterococos, Corynebacterias, Neisserias no
patgenas, enterobacterias (la mayora son pobladores de la piel que recubre esta
zona).
- En los cultivos de orina, se deben limpiar con cuidado la zona perineal antes de tomar
una
muestra.

Flora
normal
de
la
vagina
- Al nacer, esta colonizada por Lactobacilos aerobios (produce pH acido),
posteriormente el pH acido se convierte en neutro y aparece flora mixta de cocos y
bacilos,
hasta
la
pubertad.
- En la pubertad esta colonizada por Lactobacilos aerobios y anaerobios que produce
cidos por su metabolismo de hidratos de carbono => cambio a pH acido (proteccin a
los
otros
microorganismos
potencialmente
patgenos.
- En la mujer adulta esta colonizada ademas de los anteriores (Lactobacillus
acidophillus - aerobios y anaerobios), estreptococos anaerobios (hemoliticos o no
hemoliticos) y otros; el moco cervical contiene lisozima con actividad bactericida.
- En la menopausia la flora vaginal cambia, aparece de nuevo una flora mixta de cocos
y
bacilos.
- La administracin de antibiticos de amplio espectro, puede eliminar las especies
protectoras, producindose una multiplicacin excesiva en la vagina de levaduras
(candidas)
u
otras
causantes
de
vaginitis.
Flora
normal
de
la
conjuntiva
del
ojo
Predomina los difteroides (Corynebacterium xerosis), Staphylococcus epidermidis y
estreptococos no hemolticos; pueden estar presentes otras especies; el control de la
flora lo ejercen las lagrimas, por su contenido en lisozima.

Tema 11 - Examen Microscpico (observacin


de microorganismos vivos)
Nociones
de
microscopia
(repasar
apuntes
de
1
curso)
Microscopio instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o de un
ser pequeo (micros: pequeo y scopein: ver); inventado 1610 por Galileo, el primer
cientfico italiano observando el exterior de una abeja o Jansen, el holands.
Fundamento Si se sita entre el ojo y el objeto un sistema ptico capaz de
aumentar el angulo visual, se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad. El
sistema de lentes - produce una imagen aumentada de una muestra diminuta. El
objetivo - pequea lente de proyeccin que aumenta y proyecta la imagen primaria del
objeto hacia el extremo superior del tubo del microscopio (imagen area). El ocular
(lupa) - aumentando la imagen area. La imagen final - se forma en la retina del ojo. La
imagen virtual (el ojo percibe la imagen final en el plano virtual).
Aumento es el numero de veces que se ve el tamao de un objeto por encima de su

valor real. En el microscopio ptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento


individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40,
x100.
Aumento
ptico
ocular
x5,
x10
Resolucin la capacidad del microscopio para mostrar los detalles ms finos de un
objeto. Poder de resolucin (limite de resolucin o distancia resoluble) la distancia
minima entre dos puntos que permite distinguirlos como tales (la capacidad de
microscopio para distinguir 2 puntos separados aunque estn muy prximos entre si).
Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolucin = aumentar la
apertura numrica (AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada =
aumentar el ngulo alpha en el espacio objeto = aumentar el ndice de refraccin (IR)
en el espacio objeto (rellenar el espacio existente entre la muestra y el objetivo con una
sustancia
de
mayor
ndice
de
refraccin,
como
aceite).
Numero de campo dimetro de la imagen observada a travs del ocular (en mm).
Profundidad de foco el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por
completo
><
aumento
y
AN
(apertura
numrica)
de
la
lente.
El contraste para mejorarlo, disminuye el cono de iluminacin (se controla
mediante
el
diafragma
de
apertura)
procedente
del
condensador.
Partes
de
un
microscopio
ptico
compuesto:
Parte mecnica sistema de soporte o esttico (pie, brazo, cabezal); sistema de
ajuste (anillo de ajuste de las dioptras, tornillo de fijacin del cabezal, tornillos
reguladores de la platina, tornillo de elevacin del condensador, tornillos de centrado
del condensador, tornillo de seguridad del condensador, control del diafragma de
apertura del condensador, anillos de enfoque macro-mtrico y micromtrico, control
de
ajuste
de
la
claridad/
la
luz).
Parte ptica sistema de iluminacin (fuente de luz - lampara halogena de
intensidad graduable; condensador - dispositivo que contiene una lente que concentra
la luz, generada en la lampara, hacia la preparacin; diafragma de apertura - el control
adecuado del cono de iluminacin que atraviesa la muestra y entra en el objetivo = se
ajusta AN); lentes (objetivos - generan imagen real, invertida y aumentada del objeto;
oculares - captan la imagen formada por el objetivo y la amplian)

Material necesario para la visualizacin microscpica portaobjetos


esmerilado y biselado, cubreobjetos 22x22, lquido de inmersin (se usa sin
cubreobjetos) es imprescindible cuando se observa muestra desecada con objetivo de
100x (tradicionalmente aceite de madera de cedro, actualmente aceites sinttico)
Tipos
de
microscopios:
Microscopio de campo oscuro si dentro de la muestra hay elementos
transparentes, con un indice de refraccin diferente al del medio que los circunda, la
luz es difractada e incide sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la
observacin de seres microscpicos transparentes y no teidos (Treponema pallidum
preparacin
en
fresco).
Microscopio de fluorescencia consta de una fuente de luz muy intensa (lmpara
de Hg a alta presin), emite una radiacin que puede incidir en la muestra desde abajo,
tras atravesar un condensador de campo oscuro (iluminacin transmitida); se emplea
un
tipo
especial
de
liquido
de
inmersin
(glicerina); Tipos
de
fluorescencia: Fluorescencia primaria - fluorescencia natural (auto fluorescencia) vitamina A-tiamina, vitamina B-riboflavina; Fluorescencia secundaria - colorantes
fluorescentes: auramina (demostrar la presencia del bacilo de Koch en esputos),
naranja de acridina (detectar Gardnerella vaginalis en los exudados
vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijacin del fluorocromo
(colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac
marcado).
Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz
fluorescente
de
exitacion
(UV)
Observador
Microscopios electrnicos de transmisin (TEM) una gran amplificacin y
permite la observacin de elementos que son demasiado pequeos como para ser

vistos en un microscopio ptico, pero no sirve para observar elementos vivos, a causa
del vaco que ha de establecerse dentro del tubo y es muy costoso (solo se usa en lab de
investigacin). El poder de resolucion en microscopio electronico es x1000 > que
microscopio ptico; emplean electrones en lugar de unas fotones; microscopio ptico <
200
nm
fotones:
400
700
nm
longitud
de
onda.
Microscopio electrnico de barrido (MEB) no tiene tanto poder de resolucin
como el de transmisin, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de
campo y genera unas imgenes que producen una gran sensacin de tri
dimensionalidad. 1973 se comercializo el 3 modelo que une las caracteristicas de los 2
anteriores (la gran resolucion de los TEM y la gran definicion y contraste de los MEB.
Examen en fresco de bacterias vivas (Gota pendiente) - para conocer la
movilidad y la disposicin bacteriana en una muestra se debe observar los grmenes
vivos a partir de cultivos jovenes (lleva pocas horas), que permiten visualizar mejor su
movilidad
y
su
preparacin
en
fresco.
Condiciones
que
debe
cumplir
para
este
fin:
cantidad
de
muestra
adecuada
(ni
mucho
ni
poco)
la
muestra
recogida
en
condiciones
de
esterilidad
- adecuadamente distribuida en el portaobjetos (amplia y homognea)
cantidad
de
agua
o
colorante
adecuada
- para la fijacin por calor => no debe calentarse demasiado (no quemar el dorso de la
mano
y
la
gota
+/-consumida)
=>
para
hacer
tincion
- seguir el mtodo o tcnica adecuada, se trabaja con limpieza y orden, evitando
cualquier
contaminacin.
Tcnicas para observar los microorganismos vivos - examen en fresco, entre
portaobjetos y cubreobjetos, sobre gota pendiente en porta excavado (no lo hacemos) y
con
tincin
vital.
Examen en fresco - suspender el microorganismo en agua destilada o SSF
colocandolo en un portaobjetos y posteriormente visualizarlo por microscopio su
morfologa (cocos o bacilos), disposicin/agrupacin y motilidad; Material =>
portaobjetos, microscopio, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de siembra,
mechero Bunsen o de alcohol (para flamear el asa de siembra), muestra de
microorganismo
problema,
agua
destilada
estril,
vaselina
(opcional).
Tcnica - Mtodo de examen en fresco entre portaobjetos y cubreobjetos:
preparar
portaobjetos
y
cubreobjetos
limpios
y
desengrasados
- depositar una gota de agua estril en el portaobjetos (50ul/lambdas)
- con el asa de siembra esterilizada por flameado, tomar un poco de muestra del

microorganismo
y
suspenderla
en
la
gota.
- homogeneizar la muestra, colocar con cuidado sobre la suspensin un cubreobjetos,
evitando que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensin.
observar
al
microscopio
con
objetivo
de
40
aumentos.
Mtodo de examen en fresco sobre gota pendiente en porta excavado:
- colocar en el centro de un cubreobjetos una gota de la suspensin microbiana con una
asa
de
siembra
estril.
- colocar vaselina en los bordes del pocillo del porta excavado
- invertir el cubre sobre el porta excavado, colocandolo encima del rea cncava del
portaobjetos.
- la vaselina adherir el cubre al porta formando una cmara evitando su evaporacin y
corrientes
de
aire.
se
invertir
la
preparacin
observar
al
microscopio
con
objetivo
de
40
aumentos.
Resultados - es importante no confundirlos con los movimientos brownianos que se
producen cuando se desplaza el medio liquido y hace que todos las bacterias siga dicha
corriente en dicha direccin; el sellado con vaselina evita este problema.
Coloracin vital - es una tcnica intermedia entre los exmenes en fresco y las
tcnicas de tincin despus de fijacin previa???; consiste en teir las muestras
bacterianas con colorantes muy diluidos, permite al microorganismo acumular
parcialmente dichos colorantes; la dilucin debe ser muy altas para que no resulten
toxicas para las bacterias, evitando la muerte de tales grmenes; material =>
microscopio, asa de siembra estril, portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de
filtro,
una
suspensin
de
muestra
problema,
aceite de inmersin, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo
neutro en solucin acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solucin
acuosa
al
1:1.000
o
1:500).
Tcnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos
limpio y desengrasado una gota de suspensin muestra junto con otra gota del
colorante diluido utilizado; mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el
cubre objetos con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire; observar al
microscopio con objetivo de inmersin; resultados => los microorganismos se
visualizaran vivos y ligeramente coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como
colorante el rojo neutro o de color azul si se utiliza el azul de metileno.

Tema 12 - Las tinciones en bacteriologa

La morfologa bacteriana (es incolora) puede ser


microorganismos => vivos sin teir (observar
mediante colorantes con una concentracin que
observar su movilidad, pero mejora notablemente
estructuras.

estudiada por visualizacin de los


su posible movilidad) y teidos
matan la bacteria y no permiten
la visualizacin de su morfologa y

Ventajas
de
las
tcnicas
de
tincin:
- observar mas adecuadamente su morfologa y permite diferenciar entre los distintos
tipos
- dar informacin complementaria de sus estructuras internas y/o externas que no se
observa
en
fresco.
- al conocer sus caractersticas tintoriales, nos orienta hacia un grupo u otro en la
clasificacin
bacteriana.
Factores
que
afectan
a
toda
tcnica
de
tincin:
- pureza del colorante (a + impurezas => + error y - calidad en la tincin).
- concentracin del colorante (valores ideales oscilan entre 0,2 y 2%)
- pH del colorante (en general son neutro +/- 7 o entre 6,8-7,4)
conservacin
del
colorante
elaboracin
(no
lo
hacemos
/vienen
preparadas)
- tcnica empleada (material limpios y seguir los pasos de la tcnica)
temperatura
(en
general
la
ambiental)
cantidad
de
muestra
(representativa
y
homognea)
- realizar correctamente el frotis (fijarlo bien, en general por calor => coagula las
proteinas bacterianas, para que no se arrastre con el colorante mordientes y
decolorantes)
- soluciones mordientes (ayudar a fijar el colorante a las estructuras microbianas, p.ej.
lugol
en
la
Gram)
tiempos
de
tincin
(segn
el
colorante
que
usemos)
Principales tcnicas de coloracin - clasificacin de colorantes => [1] segn su
origen (naturales y artificiales) [2] segn su comportamiento qumico (cidos, bsicos
y
neutros).
Colorantes naturales - extrado de plantas como la hematoxilina (del tronco de una
planta que por oxidacin produce hematena; el azul de ndigo (de una
leguminosa);extrado de animales como el carmin (de una cochinilla)
Colorantes artificiales - preparados artificiales y obtenidos de alquitrn de
hulla(colorantes anilina cidos, bsicos y neutros en forma de sales) p.ej. cristal violeta,
violeta de genciana, fucsina bsica, acido pcrico, azul de metileno, etc.

Colorantes segn su comportamiento qumico - se unir de forma mas estable


a la estructura que tie, dependiendo de su estructura fsico-qumica; constituido por
un anillo bencnico que unen distintos radicales => radical cromforo; a+ numero de
radicales
=>
+poder
colorante
de
la
solucin;
[1] colorantes cidos o aninicos: la carga del radical colorante es (-) =>
colorantes citoplasmticos que son bsicos (los componentes citoplasmticos captan
muy bien los colorantes cidos) => las eosinas, las auraminas.
[2] colorantes bsicos o catinicos: la carga del ion cromforo es (+) =>
colorantes de la zona nuclear que son cidas o ligeramente cidas => fucsina bsica,
cristal violeta o violeta de genciana, azul de toloudina, azul de metileno o las tioninas.
[3] colorantes neutros: es una sal compuesta de un colorante acido y un colorante
bsico => el eosina azul de metileno; es hidro-solubles (posee las propiedades de
colorantes
cidos
y
bsicos).
[4] colorantes indiferentes: insolubles en agua y solubles en alcohol, no predomina
ni la carga+ ni (-), pero tampoco es de carcter neutro => colorantes de los lpidos
comoSudan
III,
Negro
Sudan,
etc.
En bacteriologa es frecuente la utilizacin de => fucsina fenicada, violeta de genciana,
azul de metileno (son colorantes bsicos) y de aadir un mordiente que ayude a fijar
dicho colorante; los colorantes cidos se utiliza como un contraste y los colorante
neutros e indiferente como coloraciones particulares; el proceso de tincin => reaccin
de intercambio de iones entre colorante y sitios activos de la superficie o del interior de
la clula (los iones teidos/colorantes reemplazan iones de los componentes celulares)
y esto permite contrastar mucho mas el germen con respecto al medio que le rodea.
Preparacin de un frotis - realizar una extensin y fijar la muestra problema para
posterior coloracin y visualizacin al microscopio; poner en un portaobjetos, a traves
de un asa de siembra una cantidad de microorganismo problema suspendido en medio
liquido estril, extendindolo adecuadamente hasta formar una fina pelcula
homognea que posteriormente se fijara generalmente con calor cuando sea requerido,
segn el mtodo de tincin que se utilizara posteriormente; material => portaobjetos,
asa de siembra o platino, agua estril, muestra problema; tcnica => pequea cantidad
de la muestra liquida se deposita y se extiende homogneamente en el centro del
portaobjetos con el asa de siembra para tener una capa fina (segn la viscosidad, se
puede diluir con unas gotas de agua estril); si la muestra es solida (una colonia), se
deposita primero una gota de agua estril y se aade con el asa de siembra una
pequea cantidad de la colonia, se extiende homogneamente; dejar secar al aire; se
fija mediante el flameado (en algunos casos se podr hacer con alcohol) para coagular
las
protenas
y
los
grmenes
quedan
adheridos
al
portaobjetos.

Tcnica
de
tincin
los
pasos:
-realizar un frotis y fijacin por calor (generalmente), con la intensidad de calor
adecuada
que
soporte
el
dorso
de
la
mano.
-coloracin segun el tipo de tincion (generalmente con colorantes basicos que tien
estructura
acida)
-decoloracin que permite diferenciar distintos grupos bacterianos (genero
Micobacterium son resistentes a la decoloracion cida/BAAR); Gram- decoloradas con
el alcohol 96/alcohol acetonas, alcohol acido, acidoclorhidrico => micobacterias
-lavado siempre entre paso y paso con agua destilada para evitar interferencias entre
un
producto
y
otro.
-coloracin de contraste (generalmente cido), se aplican al final para las estructuras
decoloradas
con
el
decolorante,
p.ej.
safranina.
-observacin
al
microscopio
Tipos
de
tinciones
bacterianas:
(1) Tincin simple => fijacin previa, se utiliza 1 solo colorante, permite la
visualizacin de la morfologa y la agrupacin bacteriana; clasificacin => tinciones
simples con colorantes bsicos, cidos y neutros; se basa en => la afinidad de los
colorantes que suelen ser de tipo bsico (azul de metileno, violeta de genciana, azul de
toloudina => 1-2 minutos, dan color azul a las celulas o fucsina fenicada diluida => da
color
rojo
a
los
componentes
celulares.
(2) Tincin negativa => es un tincin simple (1 solo colorante => tinta china o
solucin acuosa de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijacin previa (no
mata las bacterias), permite observar caractersticas estructurales de la bacteria
ademas de su morfologa sobre un fondo oscuro, como es la presencia de capsulas p.ej.
los neumococos;se basa en => colorante acido cargado negativamente, los
microorganismos no se tien (se quedan claros y brillantes sobre un fondo teido
oscuro); para obtener una capa fina (para dejar pasar el paso de luz del microscopio y
evitar a formarse grietas al secarse el colorante) se puede hacer una extensin con el
borde de otro portaobjetos; resultado => se observan las capsulas (si las tienen) en
forma de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la bacteria.

(3) Tinciones diferenciales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza 2
colorantes (el ultimo es de contraste), permite visualizar su morfologa y caractersticas
estructurales (composicion de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloracin
cida
(t.Gram
y
t.ZhielNeelsen).
(4) Tinciones estructurales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza al
menos 2 colorantes, nos permite observar su morfologa y caractersticas estructurales
como esporas, flagelos, cilios, capsulas, corpsculos metacromticos (utiliza 1 solo
colorante???).
Tincin diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando
trabajaba con material de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tincin diferencial;
es mas empleado en bacteriologa, para clasificar 2 grandes grupos (Gram+ y Gram-);
distinto comportamiento debido a la distinta composicion de la pared de las celulas
bacterianas; se emplea como el primer colorante bsico (cristal violeta o violeta de
genciana) que teir de color azul violeta todas las bacterias, posteriormente
un mordiente el lugol que aumenta la afinidad del primer colorante a las celulas (lo
fijara), finalmente unagente decolorante que decolora solamente un tipo de bacterias
(Gram-) que sern teidas con el colorante de contraste o segundo colorante (la
safranina) de color rosa-rojo; si se quedan con el color azul violeta sern Gram+.

Material de la tincin Gram => portaobjetos, pinzas de madera, asa de siembra,

mechero de Bunsen, pipeta Pasteur, asa de tincin (punte), frasco lavador, muestra
problema, aceite de inmersin, colorantes para la tincin de Gram.
Tcnica:
- realizar la preparacin de frotis => extender 1 gota de agua destilada estril + una
colonia de la bacteria problema por la superficie de la portaobjeto
fijacin
por
el
calor,
pero
no
quemar
las
bacterias
- aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2
minutos
- lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante
- aadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solucin iodoiodura de potasio con
OH
de
96
o
con
acetona
a
5/1
o
con
OH
50%)
vuelve
a
lavar
con
agua
el
exceso
decolorar
con
solucin
decolorante
(alcohol
90)
lavar
abundantemente
con
agua
cubrir
el
portaobjetos
con
la
safranina
durante
1
minuto
- lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar al aire
observar
con
objetivo
de
inmersin
(100x).
Tincin de grmenes del acido alcohol resistentes (BAAR + criptococo)
A. Tincin
de
Ziehl-Neelsen
Este mtodo fue desarrollado por Ehrlich en 1882 trabajando con bacilo de Koch y
mejorado posteriormente por Ziehl-Neelsen; objetivo => diferenciar del resto, las
bacterias tipos BAAR (bacterias acido alcohol resistentes, p.ej. Mycobacterium), debido
a su gran cantidad de componentes miclicos (lipoideos y cereos/cera) que forman
parte de la pared de este tipo de bacteria (los colorantes convencionales no penetran en
el interior de estas bacterias); De ah se necesitan colorantes altamente concentrados y
la presencia de calor que facilite su penetracin al interior de dichas bacterias; una vez
teidas, su decoloracin posterior no es posible (resiste incluso a decoloraciones
cidas); dicha tincin se emplea principalmente para el diagnostico y estudio de
enfermedades
como
tuberculosis
y
la
lepra.
Material => es el mismo que esta descrito en la tincin simple, pero en cuanto los
reactivos: 1 colorante - solucin fenicada de fucsina bsica (carbo fucsina), 2
colorante de contraste - solucin hidro-alcohlica de azul de metileno fenicado, 3
decolorante alcohol
acido
al
3% (97%
alcohol).
Tcnica => preparacin de frotis y fijacin calor; cubrir el frotis con fucsina fenicada
bsica 5 minutos aplicando en este tiempo calor, hasta la emisin de vapores, evitando
que se caliente demasiado o que se seque el colorante; lavar abundantemente con agua
destilada hasta arrastrar el colorante; decolorar con alcohol acido para arrastrar restos
del colorante (10-30 segundos); lavar abundantemente con agua destilada; cubrir el
frotis concolorante de contraste /azul de metileno fenicado 30 segundos sin necesidad

de calentar, para teir aquellas bacterias que no son resistentes a la decoloracin (se
han decolorado) y resaltar el color rojo de los BAAR+; lavar, secar, rotular y observar
con
objetivo
de
inmersin.
Resultados => con el 1 colorante, BAAR- y BAAR+ (ambas) se tien de rojo; con el
decolorante, BAAR- se decoloran y BAAR+ no se decoloran; con el 2 colorante (de
contraste), BAAR- setien de azul y BAAR+ permanecen de color rojo/ acido alcohol
resistencia+
(bacilos
Mycobacterium
y
algunos
Nocardia)
B. Mtodo de Kin Youw modificado (coloracin en fri) Reactivos => 1
colorante: fucsina fenicada (con fenol) de KinYouw, decoloracin a 3%, 2 colorante:
azul de metileno fenicado (con fenol); tcnica => idntica, salvo para la fucsina de KY,
dejamos actuar 5 minutos sin calentamiento; existen otras tcnicas de tincin de los
BAAR => tincin de auramina o de rodamina que usan microscopio de fluorescencia.
Tincin
de
espiroquetas
(para
las
espiroquetas)
Tincin estructurales => tincin de esporas, de flagelos, de cilios (similar a flagelos,
pero corto y se extiende por todo el cuerpo, como pilis), de corpsculos
metacromticos
y
de
capsulas.
Tincin especiales => tincin de auramina y de naranjo de acridina.

Tema 13 - Pruebas bioqumicas para la


deteccin del metabolismo hidrocarbonado de
las bacterias.
Metabolismo - conjunto de reacciones qumicas que tiene lugar en las celulas vivas;
necesitan energa que se obtiene por oxidacin (perdida de electrones) de sustancias
introducidas en forma de alimentos; la gran mayora de las bacterias (hetertrofas) se
nutren de sustancias orgnicas que proceden de otros seres vivos y otras (auttrofas
- cianobacterias) se nutren de sustancias orgnicas que sintetizan ellas mismas a partir
de
sustancias
inorgnicas; 3
etapas
en
metabolismo =>
1-catabolismo/hidrlisis/degradacin de sustancias nutritivas => compuestos mas
sencillos
+
energa
en
forma
de
ATP
(adenosin
trifosfato)
2-anfibolismo/metabolismo intermedio del producto del catabolismo => compuestos
de
bajo
peso
molecular
3-anabolismo/metabolismo biosinttico de sustancias simples => biosntesis de
macromolculas
/moleculas
complejas
+
gasto
de
energa.
Enzima - catalizadores biolgicos (protenas); cada enzima afecta solo a un sustrato
especifico.

Reduccin =>

captan

electro

nes.

Catabolismo de hidratos de carbono - oxidacin de azucares para obtener la


energa es muy importante, aunque tambin se catabolizan lpidos y protenas; la 1
etapa de la degradacin de la glucosa => oxidacin de esta para formar acido pirvico
(gluclisis); 2 procesos => la respiracin (necesita O2) o la fermentacin (no necesita
O2); la gluclisis (no precisa O2) se produce en 3 vas, en funcin de la dotacin
enzimtica.
1 va glucoltico/ ruta de Embden-Meyerhof Parna (EMP) fue descubierto
porPasteur => se obtiene 2 moleculas de ATP mediante fosforilacin por cada
molcula de glucosa que se oxida; este proceso se puede realizar en presencia o no de
O2; a partir de la formacin de acido pirvico, las bacterias que usan esta va,
normalmente utilizan la va fermentativa para acabar transformando este acido
pirvico en cidos mixtos;degradacin/ hidrlisis de glucosa (6C) => acido pirvico +
2 ATP (fosforilacin) => cidos mixtos (fermentacion); son 9-10 reacciones qumicas
con un enzima diferente en cada una; utilizados por las bacterias fermentadoras que
poseen
deshidrogenasas(Clostridium,
Enterobacter,
Salmonella)
2 va de las pentosas fosfato /va fosfoglucnica (va HMP) - es una ruta
mixta y va alternativa; este ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas
y tambin glucosa,mediante
sucesivas
reacciones y
produce
=> pentosas
intermedias (precursores de sntesis de cidos nucleicos y ciertos aminocidos) de gran
utilidad para las celulas; ademas de la gluclisis via EMP, muchas bacterias utilizan
HMP como una va alternativa para la oxidacin de la glucosa => produce acido lctico
o acido mixto + 1ATP (p.ej.Enterobacterias/ E.coli); esta va es un hbrido de la va ED
y la EMP, ya que en las primeras etapas, la oxidacin de la glucosa es similar a la via
ED y en las etapas posteriores es similar a la va EMP, es decir: proporcionan a las
bacterias no oxidativas un medio de oxidar la glucosa a acido pirvico puro, porque no
tienen las enzimas necesarios para comenzar la va EMP, apareciendo en los sistemas
analticos
como
fermentadoras.
3 va de Entner-Doudoroff (va ED/ va aerobia => requiere O2) - es otra va
por la cual la glucosa se oxida a acido pirvico; por cada molcula de glucosa se
producen 1 molcula de ATP para ser utilizada por la clula en reacciones biosintticas; esta varequiere enzimas especficos y solo los microorganismos que las
poseen pueden utilizarla sin seguir la va de las pentosas fosfato ni la gluclisis; los
microorganismos que la utilizan son Pseudomonas y Neisseria (aerobio estricto),
por carecer de las deshidrogenasas necesarias para oxidar el acido pirvico al acido
lctico u otros cidos; los hidrogeniones se transfieren al ciclo de Krebs y se acabaran

obteniendo agua; oxidacin de glucosa => acido pirvico + 1ATP (no producen acido
lctico
ni
acido
mixto)
Respiracin - es un proceso fosforilacin oxidativa de generacin de ATP y se
caracteriza por el aceptor final de electrones generalmente es una molcula inorgnica
(O2); la glucosa se degrada => acido pirvico se sigue oxidando por la va de la
respiracin o la fermentacin (en funcin del sistema enzimtico que tienen) => ATP +
CO2 + H2O; durante la respiracin, cualquier molcula orgnica puede ser
degradada /oxidada con un mayor rendimiento que en la fermentacin.
Respiracin aerbica - cuando el aceptor final de Hidrgenos (electrones) es el O2;
en la respiracin, el acido pirvico producido por la gluclisis se escinde en 2 partes:
una parte se unen con CoA => forman acetil CoA que entra en el ciclo de Krebs donde
se liberan electrones y protones (H+); la otra parte para biosntesis???
Cadena de transporte de electrones (se encuentra en la membrana citoplasmtica de
las celulas procariticas y en las membranas internas de las mitocondrias en las celulas
eucariticas) - los electrones se mueven desde los coenzimas reducidos hasta una
molcula inorgnica como O2 en la respiracin aerbica o hasta una molcula
inorgnica diferente del oxigeno NO3- ion nitrato, SO2-4 ion sulfato, etc.; las
moleculas transportadoras de electrones son 3 tipos => [1] flavoprotenas realizan reacciones de oxidacin reduccin, [2] citocromos - protenas con un grupo
prostticos (Fe) en forma oxidada, [3]ubiquinonas o coenzima Q - transportadores no
proteicos
de
bajo
peso
molecular.
Respiracin anaerbica - cuando el aceptor final de electrones (H-) es una
sustancia inorgnica distinta del O2, tal como iones nitratos NO-3, sulfatos SO2-4,
carbonatos
CO2-3.
(Pseudomonas
y
Bacillus)
Fermentacin - proceso que se inicia a partir de acido pirvico formado en la
gluclisis de EMP /HMP, en cual el aceptor final de los electrones es un compuesto
orgnico y no requiere O2; caractersticas principales => (1) no precisa O2, pero
se puede ocurrir en su presencia, (2) no necesita el ciclo de Krebs ni cadena
transportadora de electrones,(3) utiliza 1 molcula orgnica como aceptor final de
electrones, (4) libera energa a partir de azucares y otras moleculas orgnicas
(aminocidos, cidos orgnicos, purinas, pirimidinas), (5) libera solamente 2
moleculas de ATP por cada molcula del sustrato inicial, (6) los productos finales
pueden ser acido lctico, etanol y CO2, acido propinico, acido actico, CO2 y agua,
acido butrico, etc. (compuesto orgnico); cuando el aceptor final de electrones es el
lactato, se producir acido lctico y en general cuando el aceptor final sean otras sales
orgnicas, se formaran cidos mixtos p.ej. acido succnico, que son responsables de la
cada de pH en las pruebas empleadas, para la identificacin bacteriana; ademas, las

bacterias que tienen la dotacin enzimtica apropiada, pueden seguir degradando


estos cidos mixtos hasta CO2 y otros compuestos orgnicos; es til el anlisis de los
productos finales para identificar as los microorganismos; la mayor parte de la energa
producida en la fermentacin queda almacenada en los productos finales; las
fermentadoras => Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonella,
Enterobacter.
Prueba de la B-D Galactosidasa (ONPG) - se basa en la capacidad que tienen los
microorganismos de fermentar lactosa, mediante 2 enzimas => Lactosa
Permeasa (esta en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a traves de
ella) y B-D-Galactosidasa (esta en el interior de la clula y es capaz de desdobla la
lactosa
en
glucosa
y
galactosa).
Clasificacin de los microorganismos segun su capacidad de fermentar o
no
la
lactosa:
- fermentadores activos de lactosa en 24 horas (poseen ambos enzimas)
- no fermentadores de lactosa (carecen de ambos enzimas, no degradan la lactosa, no
penetra
en
la
clula)
- fermentadores tardos de lactosa (poseen el enzima B-D-Galactosidasa, permeabilizar
la lactosa ligeramente cuando la concentracin es alta en 2-15 das).

La
aplicacin
fundamental
es
la
diferenciacin
de
Enterobacteriaceae =>Escherichia (+) es fermentadora activo, Proteus (-) es no
fermentadora y Klebsiella (+) es una fermentadora tarda de lactosa, es decir lactosa (-)
y ONPG (+); para detectar la enzima B-D-Galactosidasa => se utiliza un compuesto
similar a la lactosa (orto-nitrofenol): al liberarse al medio alcalino por la accin de
BDG
produce
un
color
amarillo.
Material => 1 tubo de ensayos estriles, bao mara o estufa a 37C, asa de siembra,
solucin fisiolgica esteril, discos de ONPG, microorganismo problema
Tcnica => una suspensin densa (con muchas colonias) de un cultivo puro en 0,5 ml
de suero fisiologico estril se aade un disco de ONPG y mezclar durante unos
segundos, incubar a 37C durante 30-60 minutos (en general se vira antes de 30

minutos)
Resultados => en ONPG+ se produce una coloracin amarillo y en ONPG- no se
produce color (incoloro).

Tema 14 - Pruebas bioqumicas para la


deteccin del metabolismo proteico de las
bacterias
Principal productor de energa => catabolismo de la glucosa y las oxidaciones de
proteinas y lpidos (estan relacionados entre si); la hidrlisis de protenas/
protena+agua (mediante enzimas proteolticos extracelulares, secretadas por ciertas
bacterias que sirve para su tipificacin/tipacin) => polipptidos y aminocidos; las
pruebas bioqumicas investigan fundamentalmente la capacidad de un
microorganismo de producir la hidrlisis de la gelatina; catabolismo de protenas/
protelisis se realiza mediante proteinasas/proteasas y peptidasas (desaminacin) para
obtener => ion amonio NH4+ (+) acido orgnico; acido orgnico entrar al ciclo de
Krebs
y
ion
amonio
NH4+
es
secretado
de
la
clula.
Produccin de acido sulfhdrico - tcnica con indicador incorporado al tubo/a la
placa => algunos microorganismos actan metabolizando protenas con aminocidos
azufrados (cistina, cisteina) y liberan azufre en forma de gas acido sulfhdrico SH2; el
gas es detectado a traves del medio que contiene fuente de hidrgeno (azucar) fuente
de azufre(tiosulfato sodio, cistina, cisteina) y un indicador de pH (sales de hierro
/citrato frrico amoniacal) => un precipitado negro); se observara la liberacin del gas
SH2 por algunos microorganismo que poseen enzimas desulfurasas (activada por la
fermentacin de la glucosa => acidifica/produce cidos/baja el pH) que actan sobre
los aminocidos azufrados; la temperatura de incubacin (estufa) tiene que oscilar
entre 35-36C (superior a 37 se inhibira la produccin de SH2).

Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y
asas de siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de
cultivo
(Hektoen
y
SS);

Tcnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se


tomara una muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con
agotamiento en cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la tcnica se
realiza conBrucella (microaerofila), se debe incubar con una atmsfera de CO2.
Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la linea
de inoculacin ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y Shigella) no se
ennegrece
el
medio.
Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentacin de azucar) +
indicador de pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH =>
precipitado
negro
insoluble/
puntos
negros
(FeS)
Prueba de las descarboxilasas - enzimas que actan sobre el grupo carbxilo de
los aminocidos Lisina, Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y se
desprende CO2 (el proceso se realiza en anaerobiosis) => se realiza mediante el
sistema multiprueba (API - buscar el cdigo en el libro); estas pruebas se aplican para
la identificacin de Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinizacin del medio
inicialmente de color purpura, se observara el viraje del color del indicador del pH; la
presencia del enzima investigado supondr la alcalinizacin del medio (sigue el mismo
color como el inicio); cada pocillo contiene indicador de pH y amino acido
correspondiente al enzima a investigar; cada descarboxilasa acta sobre un aminocido
especifico; en cada reaccin se desprende CO2 y se alcaliniza el medio:
L-lisina
+
LDC/lisina
descarboxilasa
=>
Cadaverina
+
CO2
- L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2
- L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilacin) =>
Putrescina +CO2

Material =>
pruebas
de
API,
pipeta
Pasteur.
Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequea cantidad en su
composicion una pequea cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y
purpura de bromo cresol, pH6); aminocidos ensayados en forma L, muestra de
problema
y
papel
parafina.

Tcnica => se aade una gota del inoculo (suspensin microbiana) en cada pocillo de
la
prueba
de
API;
se
incuba
a
35C
durante
18-24
horas.
Resultados => durante las primeras horas de incubacin, el caldo vira a amarillo, por
la fermentacin de glucosa que lleva el medio; pero si el aminocido es descarboxilado,
el pH vuelve a subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura
(descarboxilasa+); si se queda amarillo sera descarboxilasa-; grmenes con
descarboxilasa+ (Escherichia no es 100% descarboxilasa+ de Lisina, Arginina y
Ornitina):
- Lisina => Klebsiella,
Serratia,
Salmonella
- Ornitina => Serratia,
Proteus,
Salmonella
- Arginina => Salmonella, Pseudomonas

Tema 15 - Pruebas bioqumicas para la


deteccin de la actividad enzimtica de las
bacterias
Pruebas oxidasa - esta denominacin se le da de forma genrica al enzima
citocromo oxidasa que participa en la transferencia de electrones en la cadena
respiratoria hacia el oxigeno; oxidasa => enzima que cataliza la transferencia de
electrones del sustrato al oxigeno; los aerobios o anaerobios facultativos obtienen su
energa por la respiracin y la almacenan en forma de ATP, el oxigeno es reducido a
partir de un sustrato orgnico que procede de la nutricin con la intervencin de un
sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, producindose
agua o perxido de hidrgeno segn la especie microbiana; los citocromos son hemoprotenas que contiene Fe y actan como ultimo eslabn de la
cadena respiratoria aerobio, transferindo H+ al O2 con formacin de H2O; este
sistemase encuentra en los organismos aerobios y anaerobios facultativos,
carenciandolo de ello los anaerobios estrictos; se observara el cambio de color de un
indicador de pH incoloro cuando esta reducido (p-fenilendiamina=> formar indofenol
de
color
violeta
oscuro)
y
coloreado
cuando
se
oxida;
Aplicacin => detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo oxidasa;
diferenciar entre Enterobacteriaceas (oxi-) de Pseudomonadacea (oxid+); diferencia
entre gneros Moraxella (oxi+), Neisseria (oxi+) de Acinetobacter (oxi-).

Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plstico, papel de
filtro,
porta,
reactivo
oxidasa
de
Kovacs.
Tcnica => mezclar una pequea muestra pura con el reactivo en el papel de filtro
que se sita por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible
cambio de color; otra manera: se aade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs
sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre y tambin en otro medio; si son
oxidasa positivo toman un color marrn y en seguida pasan a negro parduzco.
Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el
color a los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, despus de 60" es
negativo; oxidasa-no
se
produce
color.
Pruebas
de
catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayora de los microorganismos
aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental
que acta sobre el perxido de hidrgeno /H2O2 (es un producto final de la
degradacin aerobica oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos
grmenes moriran; fundamento: si el microorganismo tiene el enzima catalasa y se
pone en contacto con H2O2 => se descompone en H2O + O2; aplicacin =>
diferenciacin deStreptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Micrococcus (+);

Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plstico (las de platino
catalizar
la
reaccin)
Reactivo =>
H2O2/
agua
oxigenada,
microorganismo
de
problema
Tcnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto,
simultneamente, con una asa se aade una colonia del cultivo del microorganismo de
12-24
horas,
homogeneizar
y
observar.
Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no
aparecen burbujas; se podrn observar falsos positivos si se utilizaran medios de
cultivo agar sangreo otros que lleven hemates (los hemates contiene catalasa).
Pruebas de Nitrato reductasa o Nitratasa (se realiza con multiprueba de API)

La nitratasa (nitrato reductasa) es el enzima que cataliza el proceso en cual el nitratos


son reducidos a nitritos (presentes en algunos microorganismos anaerobios o
anaerobios facultativos que utilizan nitrgeno como ultimo aceptor de electrones en el
proceso metablico/ respiracin anaerbica); depende de la especie bacteriana se
trate, se pueden producir diversos productos finales; reaccin: nitrato/NO-3 +
nitratasa => nitrito/NO-2=> N2 (nitrgeno molecular/ gas nitrgeno) o otros =>
amoniaco / oxido ntrico / oxido nitroso / hidroxil amina; la prueba detecta los
productos finales liberados al medio mediante un reactivo colorimtrico API;
aplicacin => diferenciacin de especies deHaemophilus y Neisserias; cuando no se
forma color (rojo) al aadir los reactivos, puede significar => [1] no se ha
reducido el nitrato, se comprueba aadiendo polvo de zinc que acta como reductor y
si hay un cambio al rojo, es nitratasa (-) y si no hay cambio de color, sera nitratasa
(+); [2] la reduccin de nitratos ha sido llevada hasta la formacin de N2, se observa
con la aparicin de grietas o burbujas; [3] la reduccin de nitratos ha formado otros
productos nitrogenados (oxido ntrico, amoniaco, hidroxil-amina, etc.);

Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo,
microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es
productor de H2S (acido sulfhdrico) este impide la formacin de color; tcnica =>
hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el
medio; incubar a 37C durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B,
observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rpido, ya que el
color puede desaparecer); si no se forma color, se aade al tubo un poco de polvo de
Zinc;resultados => hay 2 posibilidades de que sean Nitratasa+ (Haemophilus y
Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o rosado fuerte al aadir el
reactivo A y B que indica la reduccin de nitratos a nitritos; [2] al aadir polvo de zink
no se desarrolla color indica formacin de otros productos nitrogenados; Nitratasa- =>
cuando se forma color rojo o rosado al aadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.

Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de
la ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinizacin de un medio
liquido; la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea => carbonato amnico, que sube el
pH, con lo que el medio se alcaliniza; aplicacin => diferenciar Proteus (+) de
otras Enterobacteriaceas / E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;

Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o bao mara.
Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color mbar) y microorganismo de
problema
Tcnica => con el asa estril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24
horas; inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar
37C; la
reaccin
se
produce
entre
1-4
horas
Resultados => en ureasa (+) el caldo de color mbar vira a rosa fuerte durante el
tiempo de reaccin (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de
Klebsiella,
Enterobacter,
Brucella,
requieren
6
das
de
incubacin.
Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa)
- observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitacin al ponerse en
contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la
coagulasa es un enzima producido por microorganismos capaz de coagular en
plasma;aplicacin => diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram+, catalasa+,
beta hemoltico + y coagulasa+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el
germen es coco Gram+, catalasa+, beta hemoltico +; tcnica => (usando el kit
comercial /prueba de ltex) seguir la instruccin de la casa comercial que hacen el
reactivo; resultados =>coagulasa+ se observa en forma de grumos (si se utiliza un
plasma como reactivo => se observara la formacin de un hilo de fibrina en la
reaccin) y en coagulasa- no se forma grumos.

Prueba de Triptfano Desaminasa (TDA) - se basa en la capacidad que tienen


algunas bacterias de desaminar el triptfano por la accin de TDA, produciendo =>
acido indol pirvico que reacciona con citrato frrico amoniacal y el cloruro frrico que
lleva el medio produciendo un color marrn (determina la presencia de la enzima
TDA);tcnica => en un medio liquido de TDA (color mbar); se puede utilizar el
reactivo urea-indol; aadimos 1 sola colonia de un cultivo puro y 1 gota de reactivo
TDA del API, incubar a 37C entre 18-24 horas, y leer; resultado => el color
marrn/caf indica la presencia deTDA+ y sera negativo si no hay cambio de color; los
gneros que tienen TDA+ => Proteus, Providencia y Morganella.

Tema 16 - Pruebas bioqumicas simultaneas


(macro-tcnicas, micro-tcnicas, sistemas
rpidos, otros mtodos)
Macrotcnicas - sistemas multiprueba que permiten realizar varias pruebas
bioquimicas simultneamente, facilitando notablemente la identificacin del
microorganismos:
Kliger
Iron
Agar
(KIA)
Triple
Sugar
Iron
(TSI)
- Agar Sulfuro Indol Motilidad (ASIM) Motility Indol Agar (MIA)
IMVIC
Lisina
Iron
Agar
(LIA)
Motilidad
Indol
Ornitina
(MIO)
KIA (Kligler Iron Agar) - se pueden realizar 3 pruebas a la vez:
- utilizacin de azucares (fermentacion glucosa 0,1% y lactosa 1%)
produccin
de
gas
(CO2)
produccin
de
acido
sulfhdrico
(SH2)
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por
medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio
cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que
reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de
hierro
de
color
negro.
Fundamento => cuando el microorganismo fermenta los azucares, se acidifica el
medio porque se forman cidos orgnicos; si el medio no tienen azucares como fuente
de hidratos de carbono, utilizara protenas que alcalinizan el medio por la formacin de
aminas; las protenas en condiciones de aerobiosis (en el pico) se metabolizan mejor
por la va de descarboxilacin oxidativa de los aminocidos que en anaerobiosis (en el

fondo); la glucosa se metaboliza mejor que lactosa (la molcula es mas


pequea/sencilla); para metabolizar la lactosa, el microorganismo debe tener B-D
galactosidasa
y
lactosa
permeasa.
Material => tubos de cultivo, asa y aguja de siembra, estufa de cultivo
Reactivo => tubo con agar KIA en pico de flauta (color rojo anaranjado),
microorganismo
Tcnica => es importante tener un tubo de control; se recoge una colonia puro y
joven con un aguja; inocular por picadura y estra un tubo de cultivo con medio KIA en
pico de flauta; incubar 18-24 horas a 37C; la reaccin se ha de observar justo despus
de terminar el periodo de incubacin (suficiente tiempo para la fermentacin del
azucar); si se lee despus de 24 horas, se puede dar un falso alcalino, porque el germen
habra utilizado la peptona y el medio se alcaliniza; el pH esta ajustado a 7,4 (neutro) e
indicador rojo fenol a 6,8 (cualquier cambio de pH va a virar el medio);
Resultados => se observaran los 3 parmetros: cambios de pH/color, produccin de
gas CO2 (grietas en el medio/ se desplaza) y produccin de acido sulfhdrico SH2
(precipitado negro); siempre se compara con un tubo de control no inoculado.

Cambios de pH - [a] resultado final de la fermentacin solo de la


glucosa => K/A zona superficial roja (reaccin alcalina de las aminas) y zona profunda
amarillo (reaccion cida); despus de la fermentacin de la glucosa, el medio de cultivo
inicialmente es amarillo entero, pero posteriormente la parte del pico se
alcalina/rojo (haba poca cantidad de glucosa) por la descarboxilacin oxidativa de los
aminocidos (que forman la peptona) que se produce mejor en aerobiosis; la
fermentacin de glucosa en el pico es inicialmente mediante la va EMP, utiliza tanto
para los aerobiosis y anaerobiosis, dando un intermedio clave (acido pirvico), que a su
vez el acido pirvico es degradado mediante el ciclo de Krebs por los aerobiosis o
anaerobiosis facultativos dando CO2 + H2O y ATP; en cambio, en el fondo, el acido
pirvico es degradado hacia acido lctico y acido mixtos que mantiene el pH acido de
manera
estable.;
son
caractersticas
de Morganella,
Providencia
y
Shigella; tambin P.mirabilis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.flexneri.
[b] en la fermentacin de glucosa y lactosa => A/A zona superficial y profunda son
amarillas
(caractersticas
de E.coli
y
K.pneumoniae);
[c] no metabolizan ni lactosa ni glucosa (pero si la peptona) => K/K todo el tubo es de
color rojo (si se trata de anaerobiosis) o si se trata de aerobiosis, la zona profunda es de

color naranja (se alcalina mas la zona con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa)
[d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el
tubo
(grmenes
inertes).
Produccin de gas CO2 - aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del
medio del fondo del tubo, debido a la formacin de hidrgeno y de anhdrido carbnico
(CO2)
Produccin de acido sulfhdrico SH2 - se manifiesta por el color negro de la capa
profunda o un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda o un
precipitado negro en la capa profunda (que puede enmascarar la acidificacin del
medio => fermentacin de la glucosa activa la desulfurasas); SH2+ => Proteus y
Salmonella.
TSI (Triple Sugar Iron) - identificacin de Yersinia enterocolitica como sacaroltica
(tambin Proteus, Lactobacillus y Clostridium), ya que el medio lleva el 3er hidrato de
carbono (sacarosa al 1%); los fundamentos y la interpretacin de los resultados son los
mismos que en el mtodo anterior, pero es imposible saber si el azucar utilizado es uno
u otro o ambos.

Agar sulfuro-indol-motilidad/ ASIM o motility-indol-agar (MIA) - tal como


indica su nombre, sirve para determinar la motilidad de los microorganismos, la
produccion de indol y la formacion de acido sulfhidrico; la forma de realizarla es la
siguiente => se siembra en picadura y se incuba a 37C durante 18-24 horas; la
motilidad se vera por la zona del inoculo con un zig-zag (en la picadura); la produccion
de indol se vera con un cambio de color a violeta purpura (el medio es de color violeta
clarito); la produccion de SH2 se vera por un cambio a negro.

IMVIC (Indol - Motilidad - rojo de Metilo - Voges-Proskauer - Citrato) - se


emplean en la identificacin de la familia enterobacteriaceas; se hacen de una en una y
conjuntamente;
Prueba de indol => estudia el metabolismo proteico/ la capacidad de degradar el
triptfano (aminocido) y de formar segn la bacteria: indol y productos indlicos
(escatol, acido indol-actico), mediante triptofanasa (enzima intracelular).
Material => tubos de ensayo, asa de siembra, pipeta Pasteur, estufa de cultivo,
mechero.
Reactivo => caldo urea-indol de la casa Biomerieux, reactivo indol de Kovacs,
microorganismo.
Tcnica => Mtodo de Kovacs: en el tubo con 500 lambdas de reactivo urea-indol, se
siembra el microorganismo problema, incubar a 37C durante 4 horas, aadir al
cultivo 2 gotas de reactivo indol de Kovacs (debe ser siempre fresco), agitar
suavemente
el
tubo
y
dejar
unos
segundos
en
reposo.
Resultado => en indol+, aparece un anillo rojo en la superficie del medio (E.coli);
enindol-, no hay cambio de color (Klebsiella pneumoniae)

Prueba de rojo de Metilo => muchas enterobacteriaceas con importancia clnica


(E.coli, Proteus mirabilis, Yersinia, Salmonella typhimurium, Citrobacter
freundii, Sighella, Vibrio) son anaerobios facultativos, que para tener energa para sus

reacciones metablicas, utilizan la fermentacin acido-mixta de los hidratos de


carbono producindose => acido succnico, acido actico, alcohol etlico (cidos
mixtos); en RM positivo, aparecen un color rojo fuerte en la superficie y en RM
negativo,
no
hay
cambio
en
la
superficie
del
medio.
Material =>
igual
que
anterior
Reactivo => Medio de Clark y Lubs en tubo (liquido amarillo), solucin de rojo de
metilo
y
microorganismo
Tcnica => (a) en el tubo del medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo
problema (b) actualmente se utiliza la modificacin de Barry que es poner un inoculo
abundante en 0,5 ml de reactivo de Clark y Lubs y dejar incubar entre 18-24 horas (c) a
este cultivo se le aaden unas 5 gotas de indicador rojo de metilo que es rojo a pH 4,5 y
amarillo a pH 6,3; el medio cambiara de color cuando el pH sea inferior a 4,5.
Resultados => RM+ superficie del medio rojo fuerte y RM- => color amarillo en la
superficie del medio

Prueba de Voges Proskauer (2 microbilogos) - lo podemos hacer en el API =>


la fermentacin butanodilica/ butilengliclica/ acetonica (acetil metil carbinol) que
es una va alternativa de metabolismo de acido pirvico, se produce => un metabolito
neutro (producto intermediario), en presencia de aire y hidrxido potsico 40%/KOH
(por oxidacin) se forma => diacetilo y aadiendo alfa naftol, se forma un complejo
rojo;
por
reduccin,
la
acetona
forma
=>
2,3
butanodiol;
Material =>
multiprueba
API
y
resto
igual
Reactivo => Medio de Clark y Lubs (liquido amarillo), solucin de alfa naftol
(VP2),solucin de hidrxido potsico al 40% o hidroxilo sdico al 40% (KOH),
microorganismo
problema.
Tcnica => en un tubo de ensayo que contenga un medio de Clark y Lubs se siembra
el microorganismo problema, se incuba 24 horas a 37C, se aade 0,2 ml (200
lambdas) solucin KOH 40%, luego 0,6 ml de la solucin alfa naftol, agitar e inclinar
casi horizontalmente el tubo para que se favorezca la oxidacin de la acetona, reposar
el
tubo
10
minutos e
interpretar
los
resultados.
Resultados =>
en VP
positiva
(+),
p.ej. Klebsiella
pneumoniae
y
Enterobacter aerogenes, antes de 1 hora aparece coloracin rojo rosada en la superficie

del medio; VP negativa (-)p.ej. E.coli y Proteus, la superficie del medio queda de color
amarillento o cobrizo (la reaccin de los reactivos al mezclarse); la mayora
de enterobacteriaceas en VP dan reacciones opuestas a la reaccin de RM (VP+ =>
RM- o VP- => RM+); las bacterias VP+ producen menor cantidad de cidos mixtos que
sern insuficientes para bajar pH del medio con rojo metilo, por ello, cuando una
bacteria es RM- => VP+.

Prueba del Citrato => se investiga la capacidad del microorganismo de utilizar el


citrato como nica fuente de carbono y sales de amonio inorgnicas como fuente de
nitrgeno, por el crecimiento de colonias y el viraje de color del indicador incorporado
en el medio causado por la alcalinizacin; los microorganismos que utilizan el citrato,
tambin utilizan las sales de amonio; citrato sdico es una sal de acido ctrico que es
uno de los metabolitos del ciclo de Krebs y algunas bacterias pueden obtener energa
por una va diferente a la de la fermentacion de los hidratos de carbono, utilizando al
citrato como nica fuente de carbono; la alcalinizacin del medio es producido por la
formacin de amoniaco a partir de las sales de amonio que haba y la formacin de
carbonatos y bicarbonatos se debe a la degradacin del citrato.
Material =>
igual
que
anterior
Reactivos => medio solido de Citrato de Simmons en tubo con azul de bromotimol
(agar
inclinado)
y
microorganismo
de
problema

Tcnica => inocular un tubo de Citrato de Simmons con microorganismo mediante


escobilln, solo la lengeta y guardar otro tubo que sirve de control negativo; incubar
24-48 horas a 37C dejando los tubos destapados para que se desprenda el CO2, leer
los
resultados
a
las
18-24
horas
de
incubacin.
Resultados => en Citrato (+) p.ej. Enterobacter aerogenes, aparece color azul
intenso en la superficie del medio y crecimiento de colonias en la lengeta; en Citrato
(-)p.ej. E.coli, no aparece cambio de color (verde) ni crecimiento.

Micro-tcnicas
1. Sistema
en
Tiras
(API
Biomerieux)
El material y reactivos necesarios para la realizacin de estas pruebas se encuentran
comercializados en kits; fundamento => los medios deshidratados en micro-tubos se
re-hidratan mediante una suspensin de 5 ml de agua estril con 1 colonia bacteriana y
se incuban; el proceso metabolismo del microorganismo, genera cambios del color en
el medio de cultivo o al aadir reactivos y esos cambios se interpretan mediante tablas
de lectura o ordenadores (se deben seguir rigurosamente las instrucciones del
fabricante); principalmente se utiliza para la deteccin de Enterobacteriaceas,
bacterias aerobios no-fermentativas, anaerobios, levaduras, estafilococos; despus de
utilizar todo debe ser incinerado o descontaminado en autoclave o sumergido en un
germicida.

2. Sistemas
en
Tubos
(entero-Tube
BBL)
Se
utiliza
para
identificacin
de
Enterobacteriaceas
y
otras
aplicaciones; fundamento => un tubo en forma de lpiz con numerosos
compartimentos (normalmente son 8 con diferentes medios, donde pueden leer hasta
11 caractersticas); este tubo se inocula (con 1 colonia del medio y alambre de la
inoculacin atraviesa todas las cmaras) y se incuba, produce cambios de color en cada
compartimento; mediante un cdigo numrico o colorimtrico, se puede identificar al
microorganismo.

3. Sistema
rpidos
metodos
automatizados
Cuando las muestras son procesadas a traves de metodos automatizados se logran
excelentes resultados en tiempo muy cortos (se deben seguir las normas dadas por los
fabricantes);
- Para deteccin primaria del crecimiento (espectrofotometra infrarroja) => detecta
los
niveles
de
anhdrido
carbnico
(CO2),
p.ej. BACTEC
- Para identificacin (fotometra) => VITECK (crecimiento, identificacin y
antibiograma)

Tema 17 - Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos


Antibiograma - estudio de la sensibilidad del microorganismo patolgico a los
antimicrobianos; se debe hacer antes de establecer el tto de una infeccin microbiana;
diferentes metodos de antibiograma => (1) por difusin que daran resultados
cualitativos de resistencia, sensibilidad o intermedios a los diferentes ATB (2) por
dilucin nos dar resultados cuantitativos en base a 2 conceptos (CMI/ Concentracin
Mnima Inhibitoria y CMB/ CM Bactericida) (3) por deteccin enzimtica, consiste en
detectar la enzima del germen que confiere resistencia a los ATB p.ej. deteccin
debetalactamasa,
adenilasa,
acetilasa,
etc.
Clasificacin
de
las
sustancias
anti-microbianas:
(a) un microorganismo es sensible => cuando ATB alcanza niveles plasmticos => a
CMI en el lugar de la infeccin; CMI => la mnima cantidad de ATB capaz de inhibir el
crecimiento de un germen; CMB => la mnima cantidad de ATB que matara al

germen; normalmente CMI es suficiente para combatir una infeccin y los mecanismos
inmunitarios se encargan de eliminar el microorganismo, siendo por tanto la CMI es el
termino
mas
utilizado.
(b) un microorganismo es resistente => cuando la concentracin mxima de ATB que
se puede localizar en el lugar de la infeccin no es suficiente para eliminar el germen,
es decir,la concentracin de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar
mas
por
efectos
txicos secundarios.
(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis
normales de ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la
infeccin sin llegar a dosis que produzcan efectos txicos, puede eliminar el germen.

Casos clnicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es


resistente a casi todos los ATB, se dar una dosis toxico o una combinacin de ATB por
va
endovenosa.
Normas bsicas => no efectuar un antibiograma directamente del producto
patolgico, ni tampoco utilizar mezclas de grmenes (se debe realizar un aislamiento
por agotamiento en placa), excepto para muestras de orina ambulatoria (normalmente
es una infeccin mono-microbiana); para elegir un ATB se deber ensayar aquellos que
son tiles clnicamente y se encuentran disponibles en el mercado farmacutico.
Factores a tener en cuenta => (1) caractersticas tintoriales del germen
(Gram+o-) (2)lugar de la infeccin (especialmente las vas urinarias y meningitis); es
importante porque es necesario que la CMI sea alcanzable en los lquidos corporales
para
que
sea
efectivo (3)bacteria
investigada.
La seleccin de ATB representativo de cada grupo para realizar las
pruebas
de
sensibilidad
Normalmente se selecciona un ATB representativo de cada grupo para realizar las
pruebas de sensibilidad; habitualmente se acepta que no es necesario hacer pruebas de

sensibilidad para un ATB cuando no se han descrito resistencias en esas especies,


p.ej.Streptococcus pyogenes.

1. Betalactmicos => todo el grupo tiene en comn que presenta un anilla


betalactmicoy el mecanismo de accin consiste en inhibir la formacin de
peptidoglicano
de
la
pared
celular;
son bactericidas.
a. Penicilinas - tiene espectro desigual => aveces es mas efectivo a uno pero no a otro.
* Penicilina
G
sodica la
forma
oral
es
P
V
* Amoxicilina - infeccin del tracto respiratorio inferior: bronquitis aguda y crnica,
neumonas
bacterianas
y
bronconeumona, producidas
por
estreptococo, estafilococosensible, neumococo y H.influenzae. Gastrointestinal: fiebre
tifoidea o paratifoidea.Genitourinaria: cistitis, uretritis, pielonefritis, bacteriuria,
gonorrea, aborto sptico, sepsis puerperal. De piel y tejido blando (incluida infeccin
de
herida
quirrgica),
porestreptococo, estafilococo sensible
y E.
coli.
* Amoxicilina + acido clavulanico (es un inhibidor de las betalactmasas producida
por
algunas
bacterias)
b. Cefalosporinas - actualmente se ha desarrollado la 4 generacin (semisintticos; bacteriostticas frente
a cocos
Gram+
y
bacilos
Gram-)
* Cefotaxima (indicado para gonorrea; profilaxis quirrgica; epiglotitis y meningitis
porHaemophilus)
* Cefuroxima (efectividad contra Neisseria gonorrheae y otras bacterias productoras
de penicilinasa; es activa contra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus
epidermidis y estreptococo
beta-hemoltico;
son
susceptibles Escherichia
coli,
Klebsiella
pneumoniae,
Proteus
mirabilis)
2.

Derivados

de

betalactmicos:

* Aztreonam - se utiliza comnmente frente a las infecciones causadas


por Pseudomonas
aeruginosa,
pero
su
espectro
abarca
a
las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como p.ej. Klebsiella, Haemophilus,
Citrobacter
y
Proteus.
3. Aminoglicosidos => en general su mecanismo de accin es la inhibicin de la
sntesis de protena en diferentes fases segn el ATB; en general derivan de los
hongos y son potentes bactericidas; son de amplio espectro y provocan toxicidad
renal y audio vestbular en alta dosis o a las personas susceptible.
* Estreptomicina (tratamiento de infecciones causadas por grmenes sensibles,
como:Mycobacterium
tuberculosis,
Salmonellas, enterococos,
estreptococos,
neumococos y algunos Gram- como Haemophilus influenzae; es eficaz en infecciones
del
tracto
respiratorio)
* Gentamicina (Acta sobre bacterias Gram- aerobias, incluyendo enterobactericeas,Pseudomonas y Haemophilus. Acta tambin sobre estafilococos (S.aureus y
S.epidermidis)
* Tobramicina (Infecciones del tracto respiratorio inferior como neumona,
bronconeumona y bronquitis aguda causadas por P.aeruginosa, Klebsiella sp.,
Enterobacter
sp.,
Serratia
sp.,
E.coli
y
S.aureus)
* Neomicina (es activo in vitro contra Escherichia coli, Klebsiella y contra flora
anaerbica
intestinal)
4.
Lincosamidas => inhibe
la
sntesis
proteica
* Clindamicina (es un buen ATB frente anaerobios) - Su actividad antibacteriana
essimilar a la de eritromicina (macrolidos) en contra de estafilococos y estreptococos;
adems es efectiva en contra de anaerobios, en especial Bacteroides fragilis.
5. ATB polipeptdicos y glucopeptdicos => su mecanismo de accin es inhibir la
formacin
de
peptido
glicano
de
la
pared
celular (bactericidas)
a.
Activos
frente
a
Gram+
* Bacitracina - es utilizado para la identificacin del estreptococo del grupo A a cual
es sensible; es bactericida; se utiliza tpicamente para infecciones cutneas (por su
efecto de nefrotoxicidad) acta sobre cocos y bacilos Gram+ (Neisseria y Treponema
pallidum)
* Vancomicina - por su alta toxicidad renal y ptica, se reservan
para infecciones de Gram+ resistentes; es bactericida; tiene accin ante cocos Gram+ y
bacilos
Gram+
b. Activos frente a Gram- => ambas (polimixinas) se usan tpicamente sobre
Gram-, tambin se usa como ATB de identificacin; tienen accin ante enterobacterias (excepto Proteus, Providencia y Serratia), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio,

Pasteurella, Haemophillus y Bordetella; son ATB de segunda eleccin (para bacilos


Gramresistentes
a
otros
ATB)
* Polimixina
B
* Polimixina
E
(Colistina)
c.
Activos
frente
a
Mycobacterium
tuberculosis

6.
Otros
* Fosfomicina - es un ATB de origen espaol de un amplio espectro que acta sobre
la
pared
celular (se
usa
en infeccin
urinaria)
* Acido fucsidico - acta sobre la sntesis proteica y destaca su accin
sobreStaphylococcus
aureus.
7. Tetraciclinas - son bacteriostticas y su mecanismo de accin es inhibir la sntesis
de las protenas; no se deben administrar a menores de 8 aos por tener efecto
secundarios sobre la denticin y los huesos; tambin pueden producir toxicidad
sobre el tracto gastrointestinal y el higado; son de amplio espectro; origen biolgico o
semi-sinttico;activas frente a cocos y bacilos Gram+ y Gram- aerobios;
son frmacos de eleccin en
brucelosis, clera,
granuloma
inguinal (ETS).
* Tetraciclina
* Doxiciclina - es el tratamiento de fiebre tifus, fiebre Q, erupciones
pustulosas porRicketsias y fiebre de las montaas rocosas por Ricketsias, infecciones
del tracto respiratorio causadas por Mycoplasma pneumoniae; el tratamiento de
infecciones causadas por Gram-: chancroide causado por Haemophilus ducreyi, plaga
debida a Yersinia pestis (anteriormente Pasteurella pestis), tularemia debida a Francisella tularensis (anteriormente Pasteurella tularensis), clera causada por Vibrio
cholerae (anteriormente Vibrio comma), infecciones por Campylobacter en fetos
causadas por Campylobacter fetus (anteriormente Vibrio fetus), brucelosis causada
por
especies
de Brucella (junto
con
estreptomicina), bartonelosis causada
por Bartonella bacilliformis, granuloma inguinal causado por Calymmatobacterium
granulomatis.
8. Cloranfenicol - es de amplio espectro; inhibe la sntesis proteica y es toxica a
nivel medular; es de origen sinttico, bacteriosttico, acta frente a Gram+ y (especialmenteHaemophilus
influenzae y Salmonella)
9. Macrolidos y similares - inhiben la sntesis proteica; amplio espectro; se
dan cuando es alrgica a penicilina; son bacteriostticos y bactericidas en alta dosis.
a. Eritromicina (un buen ATB frente neumnia atpica, legionelosis, difteria, tos
ferina)

b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la
bronquitis; neumona; enfermedades de transmisin sexual (ETS); y las infecciones en
los odos, pulmones, piel y garganta; no tienen ningn efecto sobre los resfriados, la
gripe
y
otras
infecciones
virales.
c. Claritomicina - interfiere la sntesis de protenas en las bacterias sensibles;
faringitis, amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, reagudizacin de bronquitis crnica,
neumona bacteriana (adquirida en la comunidad), infeccin de piel y tejidos blandos
leve-moderada, foliculitis, celulitis, erisipela, infeccin localizada o diseminada
porMycobacterium avium o M.intracellulare, infeccin localizada por M.chelonae, M.
fortuitum y M.kansaii. Prevencin de infeccin diseminada por M.avium complex en
pacientes
con
VIH
de
alto
riesgo
10.
Quimioterpicos
de
sntesis
a. Sulfamidas (es bacteriosttico, de origen sintetico; inhibe la sntesis de acido flico;
activo
frente
Gram+
y
-,
Clamidias,
Nocardia)
b. Trimetropin+sulfametoxazol (cotrimoxazol) - inhibe la sntesis de acido flico;
elimina las bacterias que provocan infecciones, incluyendo las infecciones que afectan
las
vas
urinarias,
los
pulmones
(neumona),
odos
e
intestinos
c. Quinolonas (6) - inhiben la replicacion del ADN bacteriano son buenos ATB de
amplio
espectro,
pero
se
ha
abusado
mucho.
d. Norfloxacina - infecciones de las vas urinarias y la prstata; inhibe
la replicacin del ADN bacteriano. La norfloxacina pertenece a una clase de
antibiticos llamadosfluoroquinolonas; tomar norfloxacina aumenta el riesgo de que
desarrolle
tendinitis.
e. Ciprofloxacina - inhibe la replicacin del ADN bacteriano; para tratar o prevenir
determinadas infecciones bacterianas, tambin se usa para tratar o prevenir el
ntrax (una infeccin grave que se puede propagar en forma intencional como parte de
un ataque bioterrorista) en quienes han estado expuestos a los grmenes del ntrax
suspendidos en el aire; tomar ciprofloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle
tendinitis.
11.
Quimioterapia
antituberculosa actualmente
se
emplea:
* Rifampicina - ATB sistmico, antituberculoso, bactericida. Inhibe la sntesis de ARN
bacteriano.
Tuberculosis
en
todas
sus
formas
(asociado
a
otros
tuberculostticos).Brucelosis. Erradicacin
de
meningococos
en
portadores
asintomticos, no enfermos. Alrgicos o con contraindicaciones a otros antibiticos o
quimioterpicos. Infecciones causadas por estafilococos (S.aureus, S.epidermidis,
cepas
polirresistentes)
y
porenterococos (S.faecalis,
S.faecium).
* Isoniacida - para tratar la tuberculosis, y para prevenirla en personas que han tenido
contacto con las bacterias de la tuberculosis. Elimina slo las bacterias activas (en

crecimiento). Debido a que las bacterias pueden estar en un perodo de incubacin (sin
crecimiento) durante largos perodos, la terapia con isoniazida (y otros medicamentos
para evitar la tuberculosis) debe hacerse durante mucho tiempo (por lo general entre 6
y
12
meses).
* Etambutol - el tratamiento de tuberculosis pulmonar; debe ser usado en conjuncin
con
otros
frmacos
antituberculosos.
12.
*
*
*
*

Quimioterapia

Amfotericina

antimictica:
Nistatina
Miconazol
B.
Fluconazol

13.
Quimioterapia
anti-viral
* Aciclovir - antiviral activo frente al virus herpes humano, inhibe la replicacin de
ADN
viral,
interfiriendo
con
el
ADN
polimerasa
viral.
* Ribavirina - La ribavirina se utiliza con un medicamento interfern, para tratar la
hepatitis C en personas que no han sido tratadas con interfern antes. La ribavirina
pertenece a una clase de medicamentos antivirales llamados anlogos de nuclesidos.
Esta acta impidiendo que el virus que provoca la hepatitis C se propague dentro del
cuerpo.

Pruebas de sensibilidad anti-microbiana - tcnicas que investigan la actividad


anti-microbiana de distintos quimioterpicos frente al microorganismo estudiado; sus
principales
aplicaciones:
- contribuir a la identificacin de los microorganismos (p.ej. sensibilidad del
neumococo/S.pneumonia a la optiquina; del S.pyogenes a la Bacitracina)
- constituye una base fundamental para la instauracin de una terapia adecuada.
Son tcnicas estandarizadas y se ha demostrado que existe un paralelismo entre los
resultados de sensibilidad obtenidos in vitro con los efectos teraputicos in vivo; la
prueba mas utilizada es la difusin en medio solido a excepcin de los grandes
laboratorios que utilizan sistemas multiprueba o mtodos automatizados (Vitec,

Pasco...)
Antibiticos - un grupo de compuestos qumicos teraputicamente muy tiles y
queantao se
caracterizaban
por
ser subproductos
metablicos
de
un
microorganismo siendo casi siempre letal para otros grmenes (p.ej. a los hongos);
actualmente la mayora son sintetizados en el laboratorio; uno de los primeros
es descubierto en 1927, cuandoAlexander Flemming descubri la penicilina
extrayendo-lo de un hongo (Penicillium notatum) siendo en 1929 cuando efectu los
primero ensayos de sensibilidad anti-microbiana (se contaminaron las placas sin
querer por un hongo); en 1939 Rose y Miller intentaron estandarizar las mltiples
variantes de los anlisis de sensibilidad microbiana por difusin en placa y
posteriormente en los aos 50, Kirby-Bauer y Anderson estandarizaron la tcnica que
se utiliza actualmente por difusin en medio solido o en placa.
Los
principales
pruebas
para
hacer
un
antibiograma:
a.
Manuales
1.
Prueba
de
dilucin
en
medio
solido
y
liquido
2.
Prueba
de
elucin
en
disco
3.
Prueba
de
deteccin
enzimtica
4.
Prueba
de
difusin
en
medio
solido
(de
Kirby-Bauer)
b. Automatizadas