PRÁCTICA N°6: MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES DEL

TRACTO GASTROINTESTINAL ENTEROBACTERIAS, Helicobacter pylori,

Vibrio cholerae
• Coprocultivo: medios de cultivo (métodos de
siembra) - identificación bioquímica y
serológica
• Reacción inflamatoria en heces
• Diagnóstico de Vibrio cholerae
• Diagnóstico de Hepatitis A y E
• Diagnóstico de Rotavirus
(Inmunocromatografía)
• Tipificación serológica.
• Técnicas de recombinación genética. Mg. JULISSA J. GARCIA MENDOZA
• Técnica reacción en cadena de la polimerasa Biólogo - Microbiólogo
(PCR).
Familia ENTEROBACTERIACEAE
BGN rectos, diámetro 0,3 a 1,5
micras, aerobios o facultativos
Patógenos oportunistas:
Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Enterobacter
aerogenes, Serratia marcescens.
Proteus spp, Providencia spp,
Citrobacter spp.
Patógenos obligados: Salmonella
spp, Shigella spp, Yersinia spp y
algunas cepas de E. coli
A excepción de Plesiomonas
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION
DX MICROBIOLÓGICO
Secreciones
MUESTRA Esputo
Ex. Directo: Orina, Heces*, otros
Coloración Gram
Agar Mc Conkey
AISLAMIENTO
SS Agar
Otros: XLD, EMB, etc.

IDENTIFICACIÓN Bioquímica presuntiva: TSI, LIA, SIM, MIO, A.

Citrato de Simons, etc
Serología, otras

PRUEBA DE
SUSCEPTIBILIDAD Antibiograma (Kirby - Bauer, CMI, Pruebas
Automatizadas, etc)

M.Stuart
30 días
Glicerofosfato de sodio 10,0 g
Tioglicolato de sodio 0,5 g
Clorhidrato de cisteína 0,5 g
Cloruro de calcio 0,1g
Azul de metileno 0,001g
Agar 5,0 g
Mediodetransporte
M.Cary - Blair
45 días
El medio de Cary Blair es una
modificación del medio de
Stuart.
Suprimieron el azul de metileno
y aumentaron el pH a 8,4.
M.Amies con carbón
60 días
El medio de AMIES es una
modificación del medio de Cary Blair,
que a su v ez lo es del de Stuart.
Cambia el glicerofosfato por un
fosfato inorgánico y el azul de
metileno por carbón vegetal neutro
farmacéutico.
PROTOCOLO DE COPROCULTIVO
 ENTEROBACTERIAS

Medios de aislamiento
primario
son

Medios Selectivos
Medios selectivos y diferenciados
 Agar TCBS
Tamaño de Prueba
Características EI agar con tiosulfato, citrato, sales
las directa con
Medio morfológicas biliares y sacarosa (TCBS) es el
colonias Esterilización material
de las colonias medio que se prefiere para el
(mm) en autoclave tomado de
aislamiento de V. cholerae y se
la placa
utiliza ampliamente en todo el
mundo.
Amarillas,
Agar TCBS 2 a 3mm NO NO
redondas,
lisas

Colonias amarillas
Agar TTG Grises, 1 a 2mm SI
SI V.cholerae
aplanadas, zona
V. alginolyticus
opaca alrededor
V. fluvialis
Agar de V. Furnisii
De incoloras 1 a 3mm SI NO
MacConkey V. metchnikovii
a rosa claro
Colonias verdes azules
Agar de MacConkey V. mimicus
EI agar taurocolato-telurito-gelatina V. hollisae
(TTG) es un agar diferencial y V.
selectivo para el aislamiento de parahaemolyticus
Vibrio cholerae. V. damsela
V. vulnificus
 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)
FÓRMULA
• Extracto de levadura (fuente de
nutrientes y vitaminas).
• Desoxicolato de sodio (agente selectivo
que inhibe los Gram positivos).
• La xilosa se incorpora en el medio dado
que la fermentan prácticamente todos
los entéricos, excepto Shigella, y esta
propiedad hace posible la diferenciación
de esta especie.
Resultados: El agar se tornará amarillo
debido a la presencia de colonias de tipo
Salmonella, aunque volverá a su rojo inicial
una vez agotada la xilosa.
• La lisina permite la diferenciación del grupo Salmonella,
dado que, sin lisina, Salmonella fermenta rápidamente
la xilosa y no se distinguiría de las especies no
patógenas. Cuando Salmonella agota el suministro de
xilosa, la lisina es atacada por la enzima lisina
descarboxilasa, lo que genera un cambio a un pH
alcalino que imita la reacción de Shigella. Para evitar el
cambio similar en los organismos coliformes positivos a
la lisina, se añaden lactosa y sacarosa para producir
ácido en exceso.
• Las colonias sospechosas de Shigella no fermentan la
xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a
amarillo el rojo fenol. Tampoco descarboxilan la lisina,
no se produce color rojo púrpura alrededor de las
colonias, al no haberse producido cadaverina. Crecen
como colonias transparentes y del mismo color que el
medio de cultivo (rojo).
 AGAR MAC CONKEY
Selectivo, diferencial

INH: cristal violeta, sales biliares

IND pH: Rojo neutro
CHO: Lactosa
Peptonas
SS Agar Plate (Salmonella – Shigella Agar)

Selectivo, diferencial
INH: verde brillante, sales biliares,
citrato de sodio
IND pH: Rojo neutro
CHO: Lactosa
Peptonas
Tiosulfato de sodio, citrato férrico
Salmonella: Colonias Lac (-)
lactosa - con H2S (+)
producción de gas
TioSulfato de sodio
incoloro (H2S), además FeS
Citrato Ferrico
precipitado negro (FeS)

Shigella: Colonias
lactosa –
TRANSPARENTES sin
producción de gas
Agar EMB (eosina
azul de metileno)
Medios selectivos y diferenciados
Inhibe el crecimiento
de las GRAM + y
algunas GRAM –
Muestra si las GRAM –
que crecen son o no
fermentadoras de
lactosa y sacarosa.

POSITIVO: colonias
metálicas (Azul y violeta)
 ENTEROBACTERIAS

Medios Diferenciales
(Pruebas Bioquímicas)

permiten

Analizar Propiedades Metabólicas

de las bacterias
Agar TSI (triple azúcar)
FÓRMULA
• Agar (medio solidificante)
• Glucosa, lactosa, sacarosa
• Citrato férrico de amonio (sal de hierro)
• Tiosulfato sódico (sal de azufre)
• Indicador: rojo de fenol
• pH 7.3 +- 0.2
• Presentación: agar inclinado color
rojo por ello la inoculación es por
picadura hasta el fondo y estría.
• Incubación 35 a 37°C por 18 a 24 horas.
Fundamento técnico:
La glucosa se encuentra en bajas
concentraciones y por ello será
consumida en las primeras horas de
incubación dando la producción de
ácidos (fermentación).
Luego se usan los sustratos Lactosa
(disacárido glucosa – galactosa) y
sacarosa, por ello habrá mayor
producción de ácidos y todo el medio se
tornará de color AMARILLO
La acidez favorece la formación del
ÁCIDO SULFHÍDRICO (H2S= gas incoloro
con olor a huevo podrido) que a partir
de la reacción entre la sal de hierro y la
sal de azufre se formará el SULFURO
FERROSO (FeS = precipitado negro
insoluble).
Fermentación bacteriana de la lactosa:
La lactosa, disacárido compuesto
por moléculas de glucosa -
galactosa unidos por un enlace β-
galactósido, se difunde a través de
la pared de la célula bacteriana
bajo la acción de la β-
galactosidasa permeasa.
Si la bacteria produce β-
galactosidasa, la lactosa es
hidrolizada para producir glucosa y
galactosa.

Fermentan lactosa. (p. ej., Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter y Serratía).

No fermentan lactosa o lo hacen lentamente (p. ej., Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia
spp)
Shigella sp
REACCIONES POSITIVAS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS:
AGAR TRIPLE AZÚCAR HIERRO
Shigella presenta la siguiente reacción sobre TSI:
- Alcalina (rojo) en la superficie inclinada.
- Ácida (amarillo) en el fondo.
- Sin producción de SH2 (sin ennegrecimiento del
fondo del tubo).
AGAR LISINA-HIERRO
Shigella presenta la siguiente reacción sobre LIA:
- Alcalina (color púrpura) en la superficie inclinada.
- Ácida (amarillo) en el fondo.
- Sin Producción de SH2 (ennegrecimiento del fondo
del tubo).
CALDO UREA
El medio urea contiene un indicador de pH que
vira a color rosa fuerte cuando la reacción es
positiva.
- Los microorganismos del género Shigella no son
capaces de utilizar urea por tanto la reacción debe
ser negativa: urea (-).
LIA: Agar lisina hierro
FÓRMULA
• Extracto de levadura DEXTROSA L-LISINA
• Citrato férrico de amonio (sal de hierro)
• Tiosulfato sódico (sal de azufre)
• Sustratos principales LISINA/GLUCOSA
• Indicador: púrpura de bromocresol
• Presentación: agar inclinado color morado por
ello la inoculación es por picadura hasta el
fondo y estría.
• Incubación 35 a 37°C por 18 a 24 horas.
 LIA: Agar lisina hierro
Fundamento técnico:
Todos los microorganismos comenzaran fermentando la glucosa , por lo tanto acidez.
1. El medio mantiene el pico de flauta (bisel) de color púrpura y el fondo amarillo.
2. La acidez favorece la descarboxilación de la LISINA (aminoácido), que al perder el
grupo carboxilo solo queda las AMINAS (la cadaverina que es ALANINA) y el medio
volverá a tornarse de color morado.
• POSITIVO el medio se vuelve turbio (biomasa) y púrpura (morado) por la
descarboxilación de la lisina y producción de H2S. Por ejem: Salmonella (+)
• NEGATIVO el medio virará a color amarillo. Por ejem: Acitrobacter (-)
❑Si es productor de gas la condición de ácido favorecerá la producción de ACIDO
SULFIDRICO (H2S) producto que a partir de la reacción del TIOSULFATO DE SODIO
(sal de azufre) con el CITRATO FÉRRICO DE AMONIO (sal de hierro) forman ese
precipitado negro insoluble que es el SULFURO FERROSO (FeS).
AGAR CITRATO DE SIMMONS
Composición: citrato de sodio, NaCl,
fosfato dipotásico, fosfato
monoamónico, sulfato de manganeso,
agar. pH final 6.9 +- 0.2
Indicador: Azul de bromotimol

POSITIVO:
• Cuando las bacterias utilizan el citrato como única fuente de CARBONO
logran desarrollarse y por ello se observa crecimiento (BIOMASA = turbidez).
• Cuando las bacterias utilizan las sales de amonio como única fuente de
NITRÓGENO, el medio se alcaliniza y se torna de color azul. Por ejemplo:
Klebsiella (+)
NEGATIVO:
• El medio mantiene su color verde. Por ejemplo: E. coli (-)
AGAR UREA Composición:
Fosfato monopotásico, fosfato dipotásico,
extracto de levadura, urea (sustrato)
Indicador: rojo de fenol

POSITIVO:
• Cuando el medio color de color naranja
se torna de color rosa (grosella – fucsia).
Por ejemplo: Klebsiella, Proteus
NEGATIVO:
• El medio mantiene su color. Por
ejemplo: E. coli, Prominencia
 PRUEBA DE MEDIO SIM (H2S, Indol, Motilidad)

Este medio no tiene pico de flauta por lo tanto la inoculación es por

puntura recta, y a la lectura si todo el medio esta turbio es POSITIVO.

Prueba de SIM (SULFURO, INDOL Y MOTILIDAD)

Prueba de SIM (SULFURO, INDOL Y MOTILIDAD)
Medio semisólido (a partir de cultivos frescos)
Inoculación en picadura RECTA (en la misma dirección)
Incubación: 35 a 37°C de 18 a 24 horas
Formulación:
• Digerido pancreático de caseína, digerido pancreático de tejido animal, sulfato ferroso de amonio,
tiosulfato sódico, agar, NO CONTIENE CARBOHIDRATOS
Fundamento técnico:
Formación del ÁCIDO SULFHÍDRICO (H2S= gas incoloro con olor a huevo podrido) a partir de la reacción
de la sales de hierro y azufre formando el SULFURO FERROSO (FeS=precipitado negro insoluble).
MOTILIDAD: Al tener flagelos se desplazaran desde el sitio de inoculación hasta el resto del medio de
cultivo observando turbidez. Si el medio es semisólido se extenderán alrededor de la picadura.
PARA LA PRODUCCIÓN DE INDOL: Cuando el microorganismo utiliza el aminoácido TRIPTOFANO
(conjunto de anillos), libera el anillo INDOL que se visualiza en un anillo color rosa al agregarle unas
gotas de REACTIVO KOVACS
 PRUEBA DE INDOL: KOVAC´S

En su composición hay sulfuro plumboso, peptona o triptona; por

ello en este medio se determina si la bacteria puede degradar el
triptófano a INDOL esto se observa al colocar gotas del reactivo de
KOVACS y si es POSITIVO se visualizara un anillo de color grosella
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA DE LA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA VOLUMEN I
Bacterias de Importancia Clínica Editores HORACIO A. LOPARDO
• Existen más de 700 tipos y serotipos
• Se basan en los Ags: O, H, K.
• Es responsable de 3 tipos de
infecciones:
• -Gastroenteritis -Infecciones del
tracto urinario -Meningitis neonatal
• Dependientes de sus factores de
virulencia.