FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y

BIOQUÍMICAS
UNIDAD DE POSGRADO

DIPLOMADO EN TÉCNICAS
CROMATOGRÁFICAS (HPLC Y GC) Y
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
ANALÍTICOS EN ANÁLISIS
FARMACÉUTICOS

Myriam Lina Trigo Orsini, M.Sc.

Agosto 2021

1
 INSTRUMENTACIÓN
Bomba isocrática
Recomendada para ...
•Análisis de rutina en labora-
torios de control de calidad
•Análisis de mezclas simples
•FM isocrática cromatografía
por exclusión por tamaño para
análisis de polímeros
•Trabajos semi-preparativos
Características/Beneficios
• Diseño probado para una operación confia-
ble
• Amplio rango de flujo para múltiples apli-
caciones - 0.5 a 10 ml/min. Utilizando colum-
nas de 4.0, 4.6 y 8.0 mm de DI
• Pistón dual y amortiguador pulsado para
flujo sin pulsos
• Válvulas mejoradas para una mayor vida
útil y menor costo de reposición
• Fácil mantenimiento y reparación
• Completo con botellones para solvente,
filtro, cabina de solventes, válvula de purga, y
tuberías para una inicialización rápida
• Adaptable a gradiente cuaternario
• Con desgasificador de vacío para una más
alta prestación con columnas de 2.1 mm2 de DI
 INSTRUMENTACIÓN
Diseño de mezclas de alta presión
y baja presión en bombas de multi
solventes
Sistemas de bombeo de Multi-solventes

Según la manera de lograr

el solvente

Diseños de mezcla Sistemas de mezcla

a baja presión a alta presión
3
 INSTRUMENTACIÓN
Diseño de mezclas de baja presión
en bombas de multi solventes
Encontrado en bombas cuaternarias
Una sola bomba extrae fases móviles desde una
válvula dosificadora de cuatro puertos
El microprocesador controla la bomba y la composición
del disolvente
La mezcla de disolventes se produce dentro de la
bomba en baja presión
Desgasificación efectiva es obligatoria en este diseño
para evitar la desgasificación durante la mezcla

4
 INSTRUMENTACIÓN
Diseño de mezclas de baja presión
en bombas de multi solventes
En un diseño de mezcla de baja presión, la cabeza de
la bomba, el pulso amortiguador, válvula de drenaje,
filtro, y transductor de presión contribuyen a la carga de
volúmenes de líquidos internos o volúmenes que moran
(dwell volume)

Una gran ventaja de mezclar solventes con bombas de

baja presión es la simplicidad de usar una única bomba
para aplicaciones Multisolventes.

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 BOMBA
MEZCLA A BAJA PRESIÓN/DOBLES
PISTONES EN SERIE
Válvula de salida Control de presión
Válvula de Válvula de purga
Solvente Entrada
A activada Al inyector
B Filtro de solvente
C
D Lavador Desecho
de sellos
Válvula de Pistón I
gradiente Pistón II

Engranaje

6
 INSTRUMENTACIÓN
Bomba cuaternaria
Recomendado para ...
•El uso con columnas de 2, 4 y
8 mm de DI
•Flujos desde 0.2 a 10 ml/min.
•Un amplio rango de aplicacio-
nes de rutina y de investigación
Características/Beneficios
Baja presión de mezclado de hasta 4
solventes para una programación versá-
til isocrática o gradiente
Conveniente desgasificación por va-
cío para una operación confiable y sin
costo de helio que siempre se incluye
Válvulas mejoradas para una mayor
vida útil y menor costo de reposición
Lavador de sello opcional para opera-
ciones con fases móviles de alto conte-
nido salino
7
INSTRUMENTACIÓN
Bomba cuaternaria
LAVADOR DE SELLO OPCIONAL

4 Botellones de Lavador
solvente
Cabina de solvente Sello
Desgasificador de Sello de
vacío soporte
Bomba cuaternaria

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 INSTRUMENTACIÓN
Detalles de bomba
cuaternaria
Volumen Muerto: 800 - 1100 uL, dependiendo de la
presión de retroceso
Materiales en Contacto con la fase móvil
⚫ Cabezal de la bomba: Oro, zafiro, cerámica
⚫ Válvula activa de entrada: Titanio, oro, zafiro, rubí, cerámica,
PTFE
⚫ Válvula de salida: Titanio, oro, zafiro, rubí, tantalio
⚫ Adaptador: Oro
⚫ Válvula de purga: Titanio, oro, PTFE, cerámica
⚫ Amortiguador de pulsos: Oro

9
 INSTRUMENTACIÓN
Detalles de bomba
cuaternaria

Cuerpo de
la válvula

Frita de PTFE
Sello de oro
Tapa plástica

10
 INSTRUMENTACIÓN
Sistema de mezclas de alta presión
en bombas de multi solventes

11
 INSTRUMENTACIÓN
Sistema de mezclas de alta presión
en bombas de multi solventes

Dos o más bombas separadas se utilizan para mezclar

disolventes a altas presiones
Un controlador separado es a menudo necesario para
cambiar las tasas de flujo de cada bomba para generar
diferentes mezclas o perfiles de gradiente
La desventaja de sistemas de mezcla de alta presión
son los requisitos de coste y mantenimiento de dos o
más bombas en un sistema Multisolvente

12
 INSTRUMENTACIÓN
Sistema de mezclas de alta presión
en bombas de multi solventes

La gran ventaja es la disminución del volumen de

permanencia para aplicaciones que utilizan columnas
de pequeño diámetro

En los sistemas modernos de bomba binaria de alta

presión, cada bomba está conectada a dos reservorios
de solventes a través de una válvula automatizada para
incrementar a cuatro la selección del disolvente
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 INSTRUMENTACIÓN
Bomba binaria
•Recomendado para ...
•Usar con columnas de 1, 2
y 4 mm de DI
•Flujos de 0.05 a 5 ml/min.
•Mapeo de péptidos y otras
aplicaciones que requieran
gradiente de elución a muy
bajo flujo
Características/Beneficios
Mezclado a alta presión para una
alta prestación sin desgasificación
Con desgasificador de vacío
opcional para una alta prestación con
columnas de 1.0 mm de DI (50
μl/min.)
Mezclador opcional para un menor
ruido de línea de base con fases
móviles que absorben al UV
Selección de solvente opcional para
cambio automático de solvente
Lavador de sello opcional para una
operación libre de problemas con fases
móviles de alta salinidad
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 SISTEMA DE SUMINISTRO DE
SOLVENTES
Formación de gradiente

GRADIENTE A BAJA GRADIENTE A ALTA

PRESIÓN PRESIÓN
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 INSTRUMENTACIÓN
Bombas

Bombas de desplazamiento: grandes

cámaras como una jeringa, equipadas
con un émbolo que se activa por un
mecanismo de tornillo accionado
mediante un motor de pasos.
Producen un flujo independiente de la
viscosidad y la contrapresión.

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 INSTRUMENTACIÓN
Bombas

Bombas Neumáticas: son más simples,

la fase móvil se encuentra en un
contenedor plegable colocado en un
recipiente que puede presurizarse
mediante gas comprimido.

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 INSTRUMENTACIÓN
Bombas (Problemas)
Cuidados de las bombas.
Reproducibilidad de flujo
⚫ Variaciones en los tiempos de retención.
Línea Base
⚫ Línea base con fluctuaciones
⚫ La solución inmediata es la purga del sistema
Cabezales
⚫ Sellos de pistones dañados, pistón dañado o
válvulas de check dañadas.

18
INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de Inyección

19
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de Inyección

20
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de Inyección

21
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección
El objetivo es introducir la muestra en la
columna sin pérdida de presión para no
alterar el flujo constante o no dañar el
empaque de la columna .
La introducción de la muestra puede
realizarse por:
⚫ Inyección manual
⚫ Inyección automática

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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección manual

Un inyector de HPLC se utiliza para introducir

la muestra a la columna a alta presión.
Consta de una válvula de seis puertos con un
rotor, un loop de muestra, y un Bomba

puerto de aguja

Columna
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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección manual
La inyección por jeringa-loop o válvulas
inyectoras o bucles, es la técnica que
ha alcanzado mayor popularidad debido
a su versatilidad, fácil operación y
Bomba
durabilidad.

24
Columna
VISTA FRONTAL
Loop de muestra

VISTA POSTERIOR
Carga
Inyección

INYECCION
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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección manual
Bucle de muestra

Mango

Puerto de aguja Cuerpo de la válvula

Sample plug

Puerto de aguja
Sample plug
Puerto de aguja

POSICION POSICION DE
DE CARGA INYECCION 26
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección manual

Para la inyección manual se utiliza una jeringa con

una aguja de punta roma
Tiene la función de introducir una alícuota precisa de
la muestra en el loop de muestra en la posición de la
carga
La muestra se entrega a la columna mediante la
conmutación de la válvula a la posición de la
inyección

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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección manual
De la bomba Solvente CARGA DE MUESTRA
Entrada
Salida Entrada de muestra
A la columna

De la bomba Solvente
INYECCION DE MUESTRA
Entrada
Entrada de muestra
Salida
A la columna 28
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección manual

Resisten presiones altas (7000 psi)

Se construyen solamente de material
inerte como acero inoxidable y de teflón

29
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática

Un muestreador automático permite la

inyección de muestras automáticamente
desde viales de muestra o Microplacas
de 96 pocillos
Un muestreador automático reduce los
costes laborales y aumenta la
productividad y la prueba de precisión

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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática
Solenoides
Válvula de
inyección Jeringa Fluido de
muestreadora solvente

Y Z
Bandeja de Aguja de
muestras muestreo
X
P
Plataforma u
de control e
r
t Viales de muestra de la
Válvula del inyector bandeja
motorizado o

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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática
Consta de una válvula de inyección motorizada y una
aguja de muestreo en movimiento
El conjunto de la aguja de muestreo está montado en
una plataforma que permite el movimiento en las
direcciones "XY" de las muestras o de la válvula de
inyección y arriba y abajo en la dirección "Z"
Está conectado a una jeringa de muestreo impulsado
por un motor preciso
La jeringa puede tomar muestras o disolventes
dependiendo de las posiciones de las válvulas de
solenoide
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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática
La secuencia de inyección imita la operación de una
inyección manual
En primer lugar, la aguja se limpia en el solvente y
desemboca en el puerto de drenaje
A continuación, se mueve a la muestra vial, retira
una alícuota precisa de la muestra, y la entrega a la
válvula del inyector
El motor gira entonces la válvula para inyectar la
muestra
Un microprocesador diseña los movimientos precisos
de la secuencia de inyección
33
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática

Otro diseño popular es el inyector automático

de circuito integrado, donde una aguja de
muestreo fija forma parte del loop
Los viales de muestra son llevados a la aguja
de muestreo por un conjunto de brazos
robóticos o con un sistema de carrusel con
plato giratorio

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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática

PRE-INYECCIÓN
Motor por Pasos

Desde la
Jeringa Válvula de 6 vías Bomba

A la Columna

Desechos
35
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática

FASE I
Motor por Pasos
Jeringa

Desde la
Válvula de 6 vías Bomba

A la Columna

Desechos
36
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática

5 μL FASE II
Motor por Pasos

Desde la
Válvula de 6 vías Bomba

A la Columna

Desechos
37
 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática

FASE III
Motor por Pasos

Desde la
Válvula de 6 vías Bomba

A la Columna

Desechos
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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática

CICLO
COMPLETO

Desde la
Válvula de 6 vías Bomba

A la Columna

Desechos
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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección automática
Recomendado para ...
•Inyección automático desde 0.1
μl a 1.5 ml
•Análisis sin atención de hasta
100 muestras
•Pre-tratamiento automatizada
de la muestra
Características/Beneficios
Volumen de inyección reproducible para alta
precisión cuantitativa (típicamente < 0.5%
RSD)
Amplio volumen dinámico de inyección
Purga continua por pasaje de flujo y limpieza
de aguja opcional para contaminación mínima
Bajo volumen de muestreo para cantidades de
muestra limitadas
Diseño completamente eléctrico, no necesita
aire
Compatible con un amplio rango de tamaños
de vial
Programa de inyección versátil para pre-
tratamiento automatizado de la muestra (ej.
derivatización)
Mínimo volumen muerto utilizando bypass
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 INSTRUMENTACIÓN
Sistemas de inyección
Problemas en la inyección
⚫ Volumen de inyección
⚫ Inyector obstruido

⚫ Tiempo de retención
Bomba

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Columna
INSTRUMENTACIÓN
Columnas

42
INSTRUMENTACIÓN
Columnas

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 INSTRUMENTACIÓN
Columnas
La columna es el corazón del sistema
de HPLC
Es la fase estacionaria que proporciona
la retención diferencial de los
componentes de la muestra

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 INSTRUMENTACIÓN
Columnas
Construidas con un tubo de acero
inoxidable de diámetro interno uniforme.
Lleno de pequeñas partículas
empacadas usadas para la separación
de la muestra

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